CN114570444B - 一种高选择性一步检测复杂介质中疾病标志物的光电化学装置及方法 - Google Patents

一种高选择性一步检测复杂介质中疾病标志物的光电化学装置及方法 Download PDF

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Abstract

一种高选择性一步检测复杂介质中疾病标志物的光电化学装置及方法。将微流控技术、目标物诱导光电流极性转换技术和磁性辅助捕获技术进行有机组合，提出了一种高选择性、高灵敏、一步快速检测复杂介质中疾病标志物的光电化学装置及方法。在液相流动过程中，具有良好光电性能的磁性捕获单元Fe3O4@CdS‑Ab1与目标物和信号单元Ab2‑CuO快速完成免疫夹心反应。利用磁辅助分离技术将免疫夹心复合物快速引入到磁性工作电极表面，同时实现清洗步骤，实现光电化学检测。在一定浓度范围内，目标物浓度越大，光电流极性翻转响应越明显。基于该装置与方法，实现了复杂介质中疾病标志物的高灵敏、高选择性、一步快速检测。与传统检测装置与方法相比，本发明方法具有操作简单、高效率、高灵敏度和特异性强等特点，对多类抗原检测具有一定的普适性。

Description

一种高选择性一步检测复杂介质中疾病标志物的光电化学装 置及方法
技术领域
本发明涉及一种光电化学免疫检测装置及方法，尤其是涉及一种高选择性一步检测复杂介质中疾病标志物的光电化学装置及方法，属于功能生物材料和生物传感技术领域。
背景技术
疾病相关生物标志物的高度灵敏和高选择性检测是疾病早期诊断、监测和预后的关键挑战。常见的疾病标志物检测策略是使用多个连续的步骤，例如，样品稀释、亲和捕获、洗涤、标记以及化学或生化扩增。多步策略的缺点是每增加一步都会增加时间、试剂、操作并引入可变性。尽管多步分析可以实现高灵敏度检测，但通常需要数小时才能完成，且需使用昂贵的试剂，有时还需要复杂的设备。因此，尝试构思和开发一种能够实现一步法检测目标物的装置及方法，将极少量的检测试剂直接加入血清等复杂样品中，检测目标物的存在诱导检测信号发生变化。这种通过一个步骤就可以实现复杂介质中目标物的检测方法是目前生物标志物检测所亟需实现的。
光电化学(PEC)技术具有简单、经济和小型化等优点，并且由于其低背景信号和较高的灵敏度而受到了极大的关注。PEC免疫分析是一种基于特异性抗原-抗体识别和光电效应的有力技术，受益于其免疫分子的特异性生物亲和性和未来诊断的潜在应用。为了提高PEC检测方法的灵敏度，在过去的几十年里，已经开发了一系列基于位阻、能量转移效应、生物催化沉淀和电子供体/受体的原位消耗/产生的PEC传感器。另一方面，为了提高PEC方法的选择性，PEC传感界面通常引入一些有机分子或生物分子如巯基己醇、牛血清白蛋白和肽类等，以防非特异性吸附。但是，以上这些方法仅放大PEC响应电流或降低其背景电流，而不会改变光电流方向，无法避免由于氧化或还原性干扰物和非氧化还原活性生物分子共存而可能出现的假阳性或假阴性信号。为了提高检测的灵敏度，并且从根本上避免假阳性或假阴性信号以提高检测的特异性，目标物引入诱导光电流极性改变无疑是较为理想的选择。
本发明利用磁性复合光电材料Fe3O4@CdS标记疾病标志物抗原的一抗(Ab1)得到磁性捕获单元Fe3O4@CdS-Ab1，并用可以使Fe3O4@CdS光电流极性发生翻转的p型半导体CuO标记目标物的二抗(Ab2)得到信号单元Ab2-CuO，将捕获单元、检测物及信号单元加入同一个容器中，利用微流控技术，控制加样速度，在液相流动过程中完成免疫夹心反应，最后利用磁性吸附将磁性颗粒和免疫夹心复合物引入到磁性工作电极表面并同步完成清洗步骤，光照检测光电流极性翻转后的信号变化，实现目标物的高选择性、高灵敏检测。目前，国内外还没有公开任何一种高选择性一步检测复杂介质中疾病标志物的光电化学装置及方法。
发明内容
本发明的目的是提出一种高选择性一步检测复杂介质中疾病标志物的光电化学装置及方法。此装置及方法首次将微流控技术、目标物诱导光电流极性转换技术和磁性辅助捕获技术组合到一起，实现高选择性一步检测复杂介质中疾病标志物。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种高选择性一步检测复杂介质中疾病标志物的光电化学装置及方法，具体步骤如下：
(1)捕获单元制备
a.制备多孔磁性Fe3O4纳米颗粒：将氯化铁(5～30mmol)和1,4-苯二甲酸(5～30mmol)溶解在50～200mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并通过微波辐射加热混合物(300～800W)，在150℃下持续10～25min，获得铁基金属有机骨架材料(Fe-MOFs)。将获得的Fe-MOFs用DMF和甲醇洗涤2～4次，在60℃下真空干燥。然后，将制备的Fe-MOFs在氮气气氛下以1～15℃/min的升温速率在400～800℃下加热1～3.5h，最终合成多孔磁性Fe3O4纳米颗粒；
b.制备磁性光电复合材料Fe3O4@CdS：将5～20mg多孔磁性Fe3O4纳米颗粒分散在0.01～0.2M四水合硝酸铬的甲醇溶液中0.5～2min，用甲醇洗涤，随后分散在0.01～0.2M九水合硫化钠的甲醇/水(1:1，v/v)溶液中0.5～2min并用甲醇洗涤。经过2～8次以上操作后，将获得的磁性光电复合材料Fe3O4@CdS用甲醇和超纯水洗涤，利用磁性分离将多余的分散液除去，并在60℃下真空干燥；
c.制备捕获单元Fe3O4@CdS-Ab1：将1～10mg Fe3O4@CdS分散到3-巯基丙酸溶液中，于4℃冰箱缓慢摇晃6～12h。而后利用磁分离将羧基化的Fe3O4@CdS用水洗涤2～5次。然后，加入0.2～2mL含10～100mmol/L 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1～10mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液缓慢摇晃30～60min。利用磁分离洗掉多余的EDC/NHS后，加入0.01～1mL浓度为1～3mg/mL的一抗Ab1并缓慢摇晃30～60min，然后洗涤除去多余的Ab1，最后加入0.01～1mL BSA(1～5wt.％)并缓慢摇晃30～60min。磁性分离清洗并用磷酸盐(PBS)缓冲液(10mM，pH 7.4)定容至1mL，即得捕获单元溶液。
(2)信号单元制备
a.制备氨基化氧化铜多面体CuO-NH2：将含有11～80mg三水合硝酸铜、5～40mg 1,3,5-苯三甲酸和含有1.5～3.0g月桂酸的5～20mL正丁醇溶液转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中，并在140℃下保持3～5h。通过离心获得沉淀，并用超纯水或乙醇洗涤。将得到的多面体蓝色粉末在60℃下真空干燥后，在管式炉中300～400℃(氩气气氛下)和450～550℃(空气中)下分别再煅烧30～60min，得到CuO多面体。将CuO(1～5mg)分散在乙醇/水溶液(1～5mL，v/v，19/1)中。然后，CuO悬浮液中加入60～300μL 3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)，超声20min。之后，将其在60～80℃下加热0.8～1.9h。接着将悬浮液离心，乙醇洗涤2～5次，60℃烘干，得到CuO-NH2。
b.制备信号单元：为了制备信号单元Ab2-CuO，将氨基化的CuO(0.5～4mg)分散在0.4～3.5mL PBS缓冲液(10mM，pH 7.4)中。然后，将60～500μL戊二醛溶液(5wt.％)加入上述溶液中并在室温下缓慢摇动4～8h。然后，将沉淀物洗涤数次并重新分散在1mL含有Ab2(0.5～3mg/mL)的PBS缓冲液(10mM，pH 7.4)溶液中。在缓慢摇动下，混合物反应0.7～1.8h后，用PBS缓冲液(10mM，pH 7.4)洗涤并离心以除去多余的Ab2。最后，将Ab2-CuO与1～5wt.％BSA一起孵育30min。分离和洗涤后，将获得的Ab2-CuO分散在1mL PBS缓冲液(10mM，pH 7.4)中，即得信号单元溶液，并在4℃下储存备用。
(3)一步法检测疾病标志物
取直径为0.025～2mm的多重U型微流管在一端处嵌入加样池，另一端嵌入光电化学检测池(见附图1)。加样池、管道和检测池依次用NaOH水溶液(0.1M)、蒸馏水和PBS缓冲液(0.1M,pH 7.4)冲洗。使用前采用四通道高精度注射泵将加样池、管道和检测池内用注射泵通过通道1注满PBS缓冲液(10mM，pH 7.4)。通过样品池的另外3个加样口以100～2000μL/min的流速将100～1000μL捕获探针(通道2)、100～1000μL信号探针(通道3)和20～100μL不同浓度的抗原标准溶液/人血清溶液(通道4)注入到加样池中。然后，继续以同一流速通过通道1注入PBS缓冲溶液(10mM，pH 7.4)以驱动溶液。将磁性工作电极插入光电化学检测池中，磁性捕获单元/目标物/信号单元组成的免疫夹心复合物及磁性捕获单元能够吸附到磁性工作电极表面。多余的液体(含有多余的信号单元等)通过检测池的排出口排出(见附图1)。采用铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，构成三电极体系，启动光电化学检测，测量光电化学信号强度；获得一系列不同浓度的疾病标志物溶液对应的光电化学信号值，建立光电化学信号值与疾病标志物溶液浓度之间的定量关系；根据这个定量关系可以检测样品中疾病标志物的未知浓度。
所述的光电化学检测的条件如下：计时电流法，电压：-0.1V；给光时间：10秒。
所述的疾病标志物为：甲胎蛋白(AFP)、糖类抗原199(CA199)、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原724(CA724)、糖类抗原15-3(CA15-3)、糖类抗原125(CA125)、前列腺特异性抗原(PSA)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)。
发明原理：本发明中的捕获单元Fe3O4@CdS-Ab1不仅具有良好的磁性，可以在均相体系中进行充分生物识别，并通过磁性分离清洗，操作简单；CdS自身具有良好的光电化学性能，通过离子吸附法制备并同步附载在Fe3O4上，大大简化了材料合成步骤；Fe3O4@CdS可以与巯基丙酸通过Cd-S键结合，轻松在材料表面引入羧基，以便附载大量第一抗体Ab1，用于特异性识别疾病标志物。CuO是光电性能良好的p型半导体，可以使Fe3O4@CdS的阳极光电流翻转为阴极光电流；氨基化的CuO表面附载大量的二抗，可以特异性识别抗原，与捕获单元、抗原形成免疫夹心复合物。因此，利用磁性吸附就可以将免疫夹心复合物轻松引入磁性电极表面。显然，在一定浓度范围内，目标物浓度越大，光电流极性翻转响应越明显。实验结果表明，光电流翻转信号的大小与目标物的浓度在一定范围内呈线性关系，可实现对目标物的高选择性高灵敏检测。其优点在于：
(1)高灵敏度，本发明使用的CdS和CuO，均是光电性能良好的光电材料，极低浓度的目标物引入就可以引起明显的光电流信号输出。
(2)高特异性，常见其他疾病标志物、电活性小分子对目标物检测均无干扰。原因在于：一方面，本发明是基于目标物抗体与目标物之间的特异性识别与结合而构建的光电免疫方法，常见其他疾病标志物并不能与抗体结合；另一方面，目标物与相应抗体结合引发光电流极性翻转，但常见其他疾病标志物在检测电极上的非特异性吸附及电活性小分子的存在，仅会引起光电流的减弱或增强，不能使光电流极性发生改变。故均对目标物检测无干扰。
(3)结果准确，与商业ELISA试剂盒类比，结果基本一致。
(4)制备与检测方法简单、快速。将捕获单元、待测物和信号单元放进同一个容器中，通过在微管内流动，实现识别及快速形成免疫夹心复合物，待流经检测池时，通过磁辅助快速分离，即可检测得到即时的光电化学极性翻转信号，实现目标物定量、高选择性快速检测。
(5)此方法具有普适性，只需更换特异性识别抗体，即可实现对不同疾病标志物抗原的检测。
综上所述，本发明将微流控技术、光电流信号极性翻转技术和磁性辅助快速捕获技术有机组合，用于复杂介质中疾病标志物的一步法检测，具有高灵敏度、高特异性、简单、快速、易于操作等优点，可以实现对超低浓度疾病标志物的高选择性检测，具有良好的临床和即时检测应用前景。
附图说明
图1为本发明的疾病标志物检测原理图；
图2为本发明的可行性实验图；
图3为本发明对不同浓度CYFRA21-1光电化学响应的半对数校准曲线图；
图4为本发明的疾病标志物选择性和特异性检测图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1捕获单元和信号单元的制备
(1)捕获单元制备
a.制备多孔磁性Fe3O4纳米颗粒：将氯化铁(10mmol)和1,4-苯二甲酸(10mmol)溶解在100mL DMF中，并通过微波辐射加热混合物(400W)，在150℃下持续12min，获得Fe-MOFs。将获得的Fe-MOFs用DMF和甲醇洗涤4次，在60℃下真空干燥。然后，将制备的Fe-MOFs在氮气气氛下以2℃/min的升温速率在550℃下加热1.5h，最终合成多孔磁性Fe3O4纳米颗粒；
b.制备磁性光电复合材料Fe3O4@CdS：将12mg多孔磁性Fe3O4纳米颗粒分散在0.05M四水合硝酸镉的甲醇溶液中0.8min，用甲醇洗涤，随后分散在0.05M九水合硫化钠的甲醇/水(1:1，v/v)溶液中0.8min，并用甲醇洗涤。经过3次以上操作后，将获得的磁性光电复合材料Fe3O4@CdS用甲醇和超纯水洗涤，利用磁性分离将多余的分散液除去，并在60℃下真空干燥；
c.制备捕获单元Fe3O4@CdS-Ab1：将5mg Fe3O4@CdS分散到3-巯基丙酸溶液中，于4℃冰箱缓慢摇晃8h。而后利用磁分离将羧基化的Fe3O4@CdS用水洗涤3次。然后，加入2mL含50mmol/L 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和5mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液缓慢摇晃40min。利用磁分离洗掉多余的EDC/NHS后，加入0.5mL浓度为2mg/mL的一抗Ab1缓慢摇晃40min，然后洗涤除去多余的Ab1，最后加入0.11mL BSA(2wt.％)缓慢摇晃30min。磁性分离清洗并用缓冲液定容至1mL，即得捕获单元溶液。
(2)信号单元制备
a.制备氨基化氧化铜多面体CuO-NH2：将含有12mg三水合硝酸铜、20mg 1,3,5-苯三甲酸和含有1.8g月桂酸的12mL正丁醇溶液转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中，并在140℃下保持4h。通过离心获得沉淀，并用超纯水或乙醇洗涤。将得到的多面体蓝色粉末在60℃下真空干燥后，在管式炉中350℃(氩气气氛下)和400℃(在空气中)下分别煅烧60min，得到CuO多面体。将CuO(5mg)分散在乙醇/水溶液(2mL，v/v，19/1)中。然后，CuO悬浮液中加入100μL APTES，混合悬浮液超声20min。之后，将其在70℃下加热1.5h。接着将悬浮液离心，乙醇洗涤4次，60℃烘干，得到CuO-NH2。
b.制备信号单元：为了制备信号单元Ab2-CuO，将氨基化的CuO(2mg)分散在1mLPBS缓冲液(10mM，pH 7.4)中。然后，将100μL戊二醛溶液(5wt.％)加入上述溶液中并在室温下缓慢摇动6h。然后，将沉淀物洗涤数次并重新分散在1mL含有Ab2(2mg/mL)的PBS缓冲液(10mM，pH 7.4)溶液中。在缓慢摇动下，混合物反应1h后，用PBS缓冲液洗涤并离心以除去多余的Ab2。最后，将Ab2-CuO与2wt.％BSA一起孵育30min。分离和洗涤后，将获得的Ab2-CuO分散在1mL PBS缓冲液中，并在4℃下储存。
实施例2一步法检测标准样品和人血清样品
基于实施例1制备的捕获单元和信号单元，取直径为0.1mm的多重U型微流管在一端处嵌入加样池，另一端嵌入检测池。加样池-微流管-检测池系统依次用0.1M NaOH水溶液、蒸馏水和PBS缓冲液(10mM，pH 7.4)冲洗。使用前采用四通道高精度注射泵将加样池、管道和检测池内用注射泵通过通道1注满PBS缓冲液。通过样品池的另外3个加样口以100μL/min的流速将500μL捕获探针(通道2)、500μL信号探针(通道3)和50μL不同浓度的抗原标准溶液/人血清溶液(通道4)注入到加样池中。然后，继续以同一流速通过通道1注入PBS缓冲溶液(10mM，pH 7.4)以驱动溶液。将磁性工作电极插入光电化学检测池中，免疫夹心复合物及磁性捕获单元快速吸附到工作电极表面。多余的液体通过检测池的排出口排出(见附图1)。采用铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，构成三电极体系，启动光电化学检测，测量光电化学信号强度，检测原理如图1。通过获得一系列不同浓度的疾病标志物溶液对应的光电化学信号值，建立光电化学信号值与疾病标志物溶液浓度之间的定量关系；根据这个定量关系检测样品中疾病标志物的未知浓度。
实施例3可行性实验
为了证明本发明的检测方法可以实现对疾病标志物抗原的检测，按照实施例1和实施例2步骤，以CYFRA21-1为目标物，在制备捕获单元和信号单元时分别标记CYFRA21-1的一抗和二抗。结果如图2，有CYFRA21-1存在时，光电流信号极性翻转电流明显，而无CYFRA21-1存在时，光电流信号并没有出现极性变化，证明该免疫方法可用于肿瘤疾病标志物CYFRA21-1的检测。
实施例4CYFRA21-1检测
为了证明本发明的检测方法可以实现对疾病标志物抗原的检测，按照实施例1和实施例2步骤，以CYFRA21-1为目标物，在制备捕获单元和信号单元时分别标记CYFRA21-1的一抗和二抗，记录在加入不同CYFRA21-1标准浓度(0,0.001,0.004,0.01,0.04,0.1,0.4,1,4,10,40ng/mL)下的光电流响应曲线。如图3所示，随着CYFRA21-1浓度的增加，光电流信号极性翻转强度随之增加，极性翻转后的光电流响应值对CYFRA21-1浓度对数值呈现良好的线性关系，线性相关方程为I＝-395.5lg[CYFRA21-1]–119.6,R2＝0.9931，线性范围为0.001–4ng/mL，检测限为0.3pg/mL。说明传感器对CYFRA21-1浓度可实现高灵敏高选择性检测。通过上述实验结果，说明我们建立的分析方法具有用于疾病标志物检测的应用价值。
实施例5选择性和抗干扰实验
选择性和特异性实验中CYFRA21-1及其他抗原的浓度相同，所用到的其他抗原的缩写如下：其他物质如癌胚抗原(CEA)、糖类抗原15-3(CA15-3)、糖类抗原125(CA125)、前列腺特异性抗原(PSA)。按上述实施例1、实施例2和实施例3的步骤，用其他相同浓度的抗原代替CYFRA21-1用于选择性检测，将其他相同浓度的抗原与CYFRA21-1混合用于抗干扰性检测。结果如图4所示，与CYFRA21-1对比，其他抗原的引入并未引起光电流信号极性变化，基本接近空白信号，说明本发明装置与方法对CYFRA21-1的检测显示较好的选择性。此外，其它抗原与CYFRA21-1混合后，并未影响光电流的极性翻转，说明本发明装置与方法对目标物CYFRA21-1的检测显示较好的抗干扰性能。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。

Claims (3)

1.一种高选择性一步检测复杂介质中疾病标志物的光电化学方法，包括如下步骤：
1）捕获单元制备
a.制备多孔磁性Fe3O4纳米颗粒：将5～30 mmol氯化铁和5～30 mmol 1,4-苯二甲酸溶解在50～200 mL N,N-二甲基甲酰胺中，并通过以300～800 W微波辐射加热混合物，在150℃下持续10～25 min，获得铁基金属有机骨架材料Fe-MOFs，将获得的Fe-MOFs用DMF和甲醇洗涤2～4次，在60 ℃下真空干燥，然后，将制备的Fe-MOFs在氮气气氛下以1～15 ℃/min的升温速率在 400～800 ℃下加热1～3.5 h，最终合成多孔磁性Fe3O4纳米颗粒；
b.制备磁性光电复合材料Fe3O4@CdS：将5～20 mg多孔磁性Fe3O4纳米颗粒分散在0.01～0.2 M四水合硝酸铬的甲醇溶液中0.5～2 min，用甲醇洗涤，随后分散在0.01～0.2 M九水合硫化钠的甲醇/水溶液中0.5～2 min，甲醇/水溶液的体积比为1:1，并用甲醇洗涤，经过2～8次操作后，将获得的磁性光电复合材料Fe3O4@CdS用甲醇和超纯水洗涤，利用磁性分离将多余的分散液除去，并在60 ℃下真空干燥；
c.制备捕获单元Fe3O4@CdS-Ab1：将1～10 mg Fe3O4@CdS分散到3-巯基丙酸溶液中，于4℃冰箱缓慢摇晃6～12 h，而后利用磁分离将羧基化的Fe3O4@CdS用水洗涤2～5次，然后，加入0.2～2 mL含10～100 mmol/L 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐EDC和 1～10 mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合溶液缓慢摇晃30～60 min，利用磁分离洗掉多余的EDC/NHS后，加入0.01～1 mL浓度为1～3 mg/mL的一抗Ab1并缓慢摇晃30～60 min，然后洗涤除去多余的Ab1，最后加入0.01～1 mL 1～5 wt.% BSA并缓慢摇晃30～60 min，磁性分离清洗并用10 mM pH为7.4的磷酸盐PBS缓冲液定容至1 mL，得到捕获单元溶液；
2）信号单元制备
a. 制备氨基化氧化铜多面体CuO-NH2：将含有11~80 mg三水合硝酸铜、5～40 mg 1, 3,5-苯三甲酸和含有1.5～3.0 g月桂酸的5～20 mL正丁醇溶液转移到衬有聚四氟乙烯的高压釜中，并在140℃下保持3～5 h，通过离心获得沉淀，并用超纯水或乙醇洗涤，将得到的多面体蓝色粉末在60 ℃下真空干燥后，在管式炉中氩气气氛下300～400 ℃和空气中450～550 ℃下分别再煅烧30～60 min，得到CuO多面体，将1～5 mg CuO分散在1～5 mL乙醇/水溶液中，乙醇/水溶液中，乙醇与水的体积比为19：1，然后，向CuO悬浮液中加入60～300 μL3-氨丙基三甲氧基硅烷APTES，超声20 min，之后，将其在60～80 ℃下加热0.8～1.9 h，接着将悬浮液离心，乙醇洗涤2～5次，60 ℃烘干，得到 CuO-NH2；
b.制备信号单元Ab2-CuO：将0.5～4 mg氨基化的CuO分散在0.4～3.5 mL 10 mM pH为7.4的PBS缓冲液中，然后，将60～500 μL 5 wt.%戊二醛溶液加入上述溶液中并在室温下缓慢摇动4～8 h，然后，将沉淀物洗涤数次并重新分散在1 mL含有0.5～3 mg/mL Ab2的PBS缓冲液溶液中，PBS缓冲液的浓度为10 mM、pH为 7.4，在缓慢摇动下，混合物反应0.7～1.8 h后，用10 mM pH为7.4的PBS缓冲液洗涤并离心以除去多余的Ab2，最后，将Ab2-CuO与1～5wt.% BSA一起孵育 30 min，分离和洗涤后，将获得的Ab2-CuO分散在1 mL 10 mM pH为7.4的PBS缓冲液中，得到信号单元溶液，并在 4 ℃下储存备用；
3）一步法检测疾病标志物
取直径为0.025～2 mm的多重U型微流管，在一端处嵌入加样池，另一端嵌入光电化学检测池，加样池、管道和检测池依次用0.1 M NaOH水溶液、蒸馏水和0.1 M pH为7.4的PBS缓冲液冲洗，使用前采用四通道高精度注射泵将加样池、管道和检测池内用注射泵通过通道1注满10 mM pH为7.4的PBS缓冲液，以100～2000 μL/min 的流速将100～1000 μL步骤1）得到的捕获单元溶液经通道2、100～1000 μL步骤2）得到的信号单元溶液经通道3和 20～100μL不同浓度的抗原标准溶液/人血清溶液经通道4注入到加样池中，然后，继续以同一流速通过通道1注入10 mM pH为7.4的PBS缓冲溶液，以驱动溶液；将磁性工作电极插入光电化学检测池中，磁性捕获单元/目标物/信号单元组成的免疫夹心复合物及磁性捕获单元吸附到磁性工作电极表面，多余的液体包括多余的信号单元通过检测池的排出口排出；
采用铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，构成三电极体系，启动光电化学检测，测量光电化学信号强度；获得一系列不同浓度的疾病标志物溶液对应的光电化学信号值，建立光电化学信号值与疾病标志物溶液浓度之间的定量关系；根据这个定量关系可以检测样品中疾病标志物的未知浓度。
2.根据权利要求1所述的高选择性一步检测复杂介质中疾病标志物的光电化学方法，其特征在于，所述的光电化学检测采用的方法为计时电流法，电压为-0.1 V，给光时间为10秒。
3.根据权利要求1所述的高选择性一步检测复杂介质中疾病标志物的光电化学方法，其特征在于，所述的疾病标志物为甲胎蛋白、糖类抗原199、癌胚抗原、糖类抗原724、糖类抗原15-3、糖类抗原125、前列腺特异性抗原、细胞角蛋白19片段中的任意一种。
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