JPH11100328A

JPH11100328A - 抗ストレス剤及び機能性食品

Info

Publication number: JPH11100328A
Application number: JP9262422A
Authority: JP
Inventors: Akihiro Masuyama; 明弘増山; Toshiaki Takano; 俊明高野
Original assignee: Calpis Co Ltd
Current assignee: Asahi Soft Drinks Co Ltd
Priority date: 1997-09-26
Filing date: 1997-09-26
Publication date: 1999-04-13
Anticipated expiration: 2017-09-26
Also published as: PL339348A1; KR100379819B1; KR20010024277A; PT1018341E; ID25635A; WO1999016461A1; DE69823369D1; AU728565B2; EP1018341B1; PL192873B1; SK285148B6; DK1018341T3; DE69823369T2; AU5780198A; EP1018341A1; ATE264687T1; CZ298848B6; TWI231213B; KR20030005137A; CZ20001083A3

Abstract

(57)【要約】【課題】日常的に連用可能で、安全性の問題を含まな
い、ストレスにより生じる精神的・身体的症状を軽減及
び予防できる抗ストレス剤及び機能性食品を提供する。【解決手段】アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有す
るトリペプチド（特にＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ及び／又
はＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）及び／又はその塩を有効成
分として含有する抗ストレス剤、並びに前記抗ストレス
剤を含む機能性食品。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ストレスにより生
じる精神的・身体的症状を予防及び軽減する効果を有す
る抗ストレス剤及び機能性食品に関する。

【０００２】

【従来の技術】現代社会は、科学技術が高度化・複雑化
し、社会情勢も激動する環境下になっており、人々は様
々なストレスにさらされている。特に、国際化された社
会においては、複雑な人間関係が形成されており、精神
的ストレスが起因となって引き起こされる様々な症状に
ついて報告がなされている。

【０００３】精神的ストレスは、循環系、免疫系等に大
きな影響を及ぼすとされている。しかし、ストレスの科
学的概念及び定義は未だ明確でない点もあり、更に方法
論的困難性も相俟って、ストレスの評価に関しては多く
の問題が残されているが、近年、医学的見地からの検討
がなされている。

【０００４】例えば、ストレスを受けるとアンジオテン
シンＩＩ等が増加し、ナトリウム再吸収による体内ナト
リウムが過剰となり、血圧の上昇を引き起こすことが報
告されている（茂原治ら：代謝，２８，２，３２３，１
９９１）。さらに、このような知見を基に、高血圧治療
薬として使用されているアンジオテンシン変換酵素阻害
剤であるエナラプリル及びアラセプリルのストレスによ
る高血圧に対する効果が研究されている(The American
Journal of Cardiology; 68, 15, 1362(1991),Internal
Medicine; 32, 9, 691 (1993))。しかし、ストレスの
負荷は血圧の上昇を引き起こすのみではなく、様々な因
子に影響を与え、高血圧の他に消化性潰瘍、虚血性心疾
患、脳血管障害、高脂血症等の要因ともなると考えられ
ている。従って、ストレスは高血圧の原因因子の一つで
あるとは考えられているが、逆に単に血圧の上昇を抑制
させることによって抗ストレス効果が得られるとは考え
られていない。

【０００５】現在ストレスにより生じる精神的・身体的
症状の軽減及び予防剤としては、精神安定剤、抗不安剤
及び睡眠薬等の化学合成薬剤が使用されている。しか
し、これらの薬剤は、習慣性や副作用の問題があり、ス
トレスにより生じる精神的、身体的症状予防の目的で日
常的に使用するのは好ましくない。そこで、日常的に連
用可能で、安全性の問題を含まない、ストレスにより生
じる精神的・身体的症状の軽減及び予防効果を示す抗ス
トレス剤が求められ、開発が進められている。例えば、
茶葉に含まれるＬ−テアニンを含む抗ストレス剤（特開
平６−１００４４２号公報）、アンセリン、バレニン、
ｎ−メチルヒスチジン、τ−メチルヒスチジン等のイミ
ダゾール化合物を含む抗ストレス組成物（特開平９−２
０６６０号公報）、及びグルタチオンと抗酸化物質との
組成物を含むストレス改善食品（特開平８−２７５７５
２号公報）等が提案されている。また、香りによるスト
レス解消効果についての報告（ＦＲＡＧＲＡＮＣＥＪ
ＯＵＲＮＡＬ：１９９１−１１，ｐ４４−４９）もなさ
れている。しかし、トリペプチドを用いることによる、
ストレスにより生じる精神的・身体的症状軽減及び予防
効果を有するという報告は、これまで認められていな
い。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、前記
の社会的要請に対応し得る日常的に連用可能で、安全性
の問題を含まない、ストレスにより生じる精神的・身体
的症状を軽減及び予防できる抗ストレス剤及び機能性食
品を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、アンジ
オテンシン変換酵素阻害活性を有するトリペプチド及び
／又はその塩を有効成分として含有する抗ストレス剤が
提供される。

【０００８】また、本発明によれば、前記トリペプチド
が、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ及び／又はＶａｌ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏであることを特徴とする前記抗ストレス剤が提
供される。

【０００９】さらに、本発明によれば、前記抗ストレス
剤を含む機能性食品が提供される。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の抗ストレス剤は、アンジ
オテンシン変換酵素阻害活性を有するトリペプチド及び
／又はその塩を有効成分として含有する。

【００１１】前記トリペプチドとしては、アンジオテン
シン変換酵素阻害活性を有するトリペプチドであるＩｌ
ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（以下こ
れらのトリペプチドをそれぞれＩＰＰ、ＶＰＰと略
す）、及びこれらの混合物を好ましく挙げることができ
る。

【００１２】前記トリペプチドの塩としては、薬理学上
許容される塩類、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の
無機酸塩、及びクエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸
塩、酒石酸塩、乳酸塩等の有機酸塩等を挙げることがで
きる。

【００１３】前記トリペプチドを得る方法としては、微
生物による発酵法、酵素加水分解法又は化学的合成法等
を用いることができる。

【００１４】前記微生物による発酵法は、前記トリペプ
チドに対応するアミノ酸配列、例えば配列Ｉｌｅ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ等を含むペプチド
及び／又は蛋白質を含む培地中で乳酸菌を培養すること
により行うことができる。

【００１５】前記培地としては、前記トリペプチドに対
応するアミノ酸配列を含むペプチド及び／又は蛋白質を
含む食品素材を含むものを挙げることができる。前記食
品素材としては、乳及び／又は乳カゼイン、とうもろこ
し、コーンタンパク、小麦、小麦タンパク、大豆、脱脂
大豆、大豆蛋白等を挙げることができる。さらに、前記
培地は必要に応じて酵母エキス、ビタミン類、ミネラル
類等の他の成分を含むことができる。

【００１６】前記乳酸菌としては、ラクトバチルス属の
乳酸菌を用いることができる。例えば、ラクトバチルス
・ヘルベチカス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバ
チルス・デルブルキィ・サブスピーシーズ・ブルガリカ
ス(Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus)、ラ
クトバチルス・アシドフィラス(Lactobacillus acidoph
ilus)、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillu
s fermentum)、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシ
ーズ・カゼイ(Lactobacillus casei subsp. casei)等の
乳酸菌を挙げることができる。具体的には、ラクトバチ
ルス・ヘルベチカスＡＴＣＣ５５７９６、ラクトバチ
ルス・デルブルキィ・サブスピーシーズ・ブルガリカス
ＡＴＣＣ１１８４２、ラクトバチルス・アシドフィラ
スＡＴＣＣ４３５６、ラクトバチルス・ファーメンタ
ムＡＴＣＣ１４９３１、ラクトバチルス・カゼイ・サ
ブスピーシーズ・カゼイＡＴＣＣ３９３等の菌株を挙
げることができる。

【００１７】前記培養は、前記培地を加熱殺菌し所定の
培養温度まで冷却後に、予め前培養しておいた乳酸菌ス
ターターを添加することにより行うことができる。乳酸
菌スターターの接種量は、培地１ｇ当り乳酸菌数１０⁵
−１０⁷個とするのが好ましい。培養温度は２０−５０
℃、好ましくは３０−４５℃、培養時間は３−４８時
間、好ましくは６−２４時間の範囲で行うことができ
る。乳酸菌数が１０⁸個／ｇ以上及び乳酸酸度が１以上
となった時点で、培養を終了することができる。得られ
た培養液中には、培地原料及び組成によるが、通常、Ｉ
ＰＰ及び／又はＶＰＰが約１００−３０００μｇ／ｋｇ
含まれる。

【００１８】前記培養液は、そのまま、乳酸菌が生きて
いる状態で本発明の抗ストレス剤として使用することが
できる。また、前記培養液を８０℃達温等の条件にて加
熱殺菌することにより、殺菌された状態で用いることも
できる。さらに、凍結乾燥、噴霧乾燥、ドラムドライヤ
ー乾燥等により粉末化した状態で使用することもでき
る。

【００１９】また、前記培養液は、トリペプチド成分を
濃縮し精製してから本発明の抗ストレス剤として使用す
ることができる。前記濃縮及び精製の方法としては、遠
心された前記培養液の上清を取る方法が挙げられる。ま
た取られた上清を、さらに電気透析、イオン交換樹脂処
理、中空糸膜透析、逆浸透圧処理、疎水性カラムクロマ
トグラフィー等、又はこれらの組み合わせた処理に供す
ることにより、さらに濃縮し精製された前記トリペプチ
ドを得ることができる。

【００２０】前記トリペプチドを得るための前記酵素加
水分解法は、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ等の前記トリペプチドに対応するアミノ酸配列
を含むペプチド及び／又は蛋白質を含む食品素材を、プ
ロテイナーゼで処理し、さらにカルボキシペプチダーゼ
で処理することにより行うことができる。前記プロテイ
ナーゼとしては、微生物由来のプロテイナーゼ、植物由
来のプロテイナーゼ、動物由来のプロテイナーゼ等の各
種のものを使用することができる。これらのプロテイナ
ーゼは、公知の方法で調製することができる。また、前
記カルボキシペプチダーゼとしては、微生物由来のカル
ボキシペプチダーゼ、植物由来のカルボキシペプチダー
ゼ、動物由来のカルボキシペプチダーゼ等の各種のもの
を使用することができる。これらのカルボキシペプチダ
ーゼは、公知の方法で調製することができる。

【００２１】前記トリペプチドを得るための化学的合成
法は、公知の有機化学合成法により行うことができる。
例えば、トリペプチドを構成するアミノ酸のアミノ基を
フルオレニルメトキシカルボニル基で保護した後に、順
次アミノ酸配列に従ってフルオレニルメトキシカルボニ
ル基で保護したアミノ酸を常法に従い反応させてトリペ
プチド結合樹脂を得、さらに常法に従い樹脂を切り離し
てトリペプチドを精製することにより、前記トリペプチ
ドを得ることができる。

【００２２】本発明の抗ストレス剤中の前記トリペプチ
ドの含有割合は、後述する有効投与量のトリペプチドを
投与しうる含有割合である限りにおいて特に限定されな
いが、０．００１〜１重量％とすることができる。

【００２３】本発明の抗ストレス剤は、前記トリペプチ
ドの他に、糖類、蛋白質、脂質、ビタミン、ミネラル、
香料、色素等の他の添加剤を含むことができる。

【００２４】本発明の抗ストレス剤は、ヒト又は動物に
投与することができる。投与経路は、経口、静注等を挙
げることができるが、経口投与が好ましい。

【００２５】本発明の抗ストレス剤の有効投与量は、ヒ
トにおいてストレス軽減、予防等の本発明の効果を得る
ためには、前記トリペプチドとして、例えば経口投与の
場合は通常０．１−４０ｍｇ／体重ｋｇ・日の範囲とす
ることができるが、これを超える量を投与してもよい。

【００２６】本発明の抗ストレス剤を被検者に投与した
場合、ストレスの負荷に応答して発生する血圧上昇、免
疫機能の低下等の様々な生理的な指標の変化が、非投与
時に比べて小さくなり、これらの指標がストレスが負荷
されない場合の値に近いものとなる。このことより、本
発明の抗ストレス剤は、被検者のストレスを低減する効
果があると考えられる。

【００２７】本発明の機能性食品は、前記抗ストレス剤
を含む。

【００２８】本発明の機能性食品中の前記抗ストレス剤
の含有割合は、特に限定されないが、０．００１〜０．
１重量％とすることができる。

【００２９】本発明の機能性食品の摂取量は、通常前記
トリペプチドとして０．１−４０ｍｇ／体重ｋｇ・日の
範囲とすることにより、好ましい本発明の効果を得るこ
とができるが、これを超える量を摂取してもよい。

【００３０】本発明の機能性食品は、ヨーグルト、乳性
乳酸菌飲料、チーズ、酸乳配合の加工飲食品、健康食
品、粉末及び顆粒状食品、錠剤等の形態とすることがで
きる。

【００３１】本発明の抗ストレス剤及び機能性食品の有
効成分である前記トリペプチドは、長年にわたり飲食さ
れ、食経験されているものであり、既に安全性は証明さ
れていると考えてよい。

【００３２】

【発明の効果】本発明の抗ストレス剤及び機能性食品
は、前記トリペプチドを含むので、安全性が高く、毎日
連続摂取することにより各種のストレスにより生じる精
神的・身体的症状を軽減及び予防できる抗ストレス剤及
び機能性食品として有用である。

【００３３】

【実施例】以下実施例によりさらに詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

【００３４】

【実施例１】脱脂粉乳９ｇを水１００ｇに溶解し、１１
５℃、２０分間殺菌した後、室温まで冷却してラクトバ
チルス・ヘルベティカスＡＴＣＣ−８２０５を１白金耳
接種し、３７℃で２４時間培養を行って、１次スタータ
ー（乳酸菌数５×１０⁸個／ｍｌ、ｐＨ３．５）を調製
した。次いで、９０℃達温殺菌した脱脂乳（固形分９重
量％）２ｋｇに、１次スターターを８０ｇ接種した後
に、３７℃、２４時間培養を行い、これを２次スタータ
ーとした。次に、脱脂粉乳４．５ｋｇを水５０ｋｇに溶
解し、９０℃達温殺菌した後室温まで冷却して、前記２
次スターターを２ｋｇ接種し、３７℃で２４時間培養を
行い、発酵乳５６ｋｇを得た。得られた発酵乳中には、
全量中の含有量としてＩＰＰが５．４ｍｇ、ＶＰＰが
９．５ｍｇの割合で含有されていた。

【００３５】

【実施例２】実施例１にて得られた発酵乳６ｋｇを１０
Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．３に調整し
た後、イオン交換樹脂（商品名Amberlite XAD-2、オル
ガノ社製）１リットルを加え、更に蒸留水を加えて全量
を２０ｋｇとした。撹拌器にて９０分間撹拌後、吸引濾
過器により樹脂を濾別し、濾過器フィルター上の樹脂を
蒸留水２０ｋｇにて洗浄した後に樹脂を回収した。この
回収樹脂にメタノール０．８ｋｇを加えて撹拌器にて３
０分間撹拌した。次にナイロンウール（２００メッシ
ュ）を用いて濾過し、さらに硬質濾紙で吸引濾過後、濾
液をエバポレーターにて５５℃、減圧濃縮し精製濃縮液
２００ｇを得た。この精製濃縮液にイオン交換樹脂（商
品名Amberlite IRA-400(OH型)、オルガノ社製）２５０
ｍｌを加え、１０分間撹拌した後に、硬質濾紙にて吸引
濾過して得られた濾液を１Ｎ塩酸溶液にてｐＨ７に調整
後、真空凍結乾燥した。得られた精製乾燥物を５ｍｌの
蒸留水にて均一に溶解し、カラム（商品名Sephadex G-2
5、ファルマシア社製）に供し、蒸留水にて溶出し、ト
リペプチド溶出画分を回収し、真空凍結乾燥してトリペ
プチド精製画分粉末５０ｍｇを得た。この精製画分粉末
５０ｍｇ中には、ＩＰＰが０．６ｍｇ、ＶＰＰが１．０
ｍｇ含有されていた。

【００３６】

【実施例３】ＩＰＰ、ＶＰＰを以下に示す有機化学合成
法により合成した。合成は島津製作所製のペプチド自動
合成装置（ＰＳＳＭ−８型）を用いた固相法によって行
った。固相担体としてベンジルオキシベンジルアルコー
ルタイプのポリスチレン樹脂であって、アミノ基をフル
オレニルメトキシカルボニル基（以下Ｆｍｏｃと略す）
で保護されたプロリンが結合した樹脂２０μｍｏｌを使
用した。前記アミノ酸配列に従って、アミノ基がＦｍｏ
ｃ基で保護されたＦｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ
及びＦｍｏｃ−Ｖａｌを１００μｍｏｌづつ、常法に従
い、ペプチド配列通り順次反応させてペプチド結合樹脂
を得た。次にこのペプチド結合樹脂を１ｍｌの反応液
（１重量％エタンジチオール、５重量％アニソール、９
４重量％トリフルオロ酢酸）に懸濁し、室温で２時間反
応させてペプチドを樹脂から切離し、同時に側鎖保護基
を外した。次に反応混合液をガラスフィルターで濾過し
た後、無水エーテル１０ｍｌを加えて精製したペプチド
を沈殿させて、３０００回転、５分間遠心して分離し
た。その沈殿を無水エーテルにて数回洗浄した後、窒素
ガスを吹き付けて乾燥した。このようにして得られた未
精製の合成ペプチド全量を、０．１Ｎ塩酸水溶液２ｍｌ
に溶解した後に、全量を、以下の条件に従いＣ₁₈の逆層
カラムを用いたＨＰＬＣで、以下の条件に従って精製し
た。

【００３７】ポンプ：形式Ｌ６２００インテリジェント
ポンプ（日立製作所）検出機：形式Ｌ４０００ＵＶ検出器（日立製作所）にて
２１５ｎｍの紫外部吸収を検出カラム：マイクロボンダスフェアー５μＣ₁₈（ウォータ
ーズ社製）溶出液：Ａ液；０．１重量％ＴＦＡ水溶液、Ｂ液；０．
１重量％ＴＦＡ入りアセトニトリル（Ｂ／Ａ＋Ｂ）×１００（％）：０→４０％（６０分）流速：１ｍｌ／分最大吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥す
ることにより目的とする合成ペプチドＩＰＰ及びＶＰＰ
をそれぞれ２．１ｇ、０．９ｍｇ得た。精製ペプチドを
全自動タンパク質一次構造分析装置（形式ＰＰＳＱ−１
０、島津製作所製）により、ペプチドのＮ末端から分析
し、さらにアミノ酸分析装置（形式８００シリーズ、日
本分光社製）にて分析した結果、設計通りであることが
確認できた。

【００３８】

【実施例４】雄ウィスター系ラット（体重３００ｇ程
度）２４匹を、１週間予備飼育した。予備飼育期間中及
び実験期間中は、固形飼料（商品名ＣＥ−２、日本クレ
ア製）を制限食として与え、水は自由摂取とした。

【００３９】予備飼育終了後、ラットを（１）ストレス
無負荷−生理食塩水投与群、（２）ストレス負荷−生理
食塩水投与群、（３）ストレス負荷−ＶＰＰ、ＩＰＰ投
与群の３群に分け（各群８匹）、（２）群及び（３）群
の動物に、低温室（４℃）に１日につき４時間入れる寒
冷ストレスを９日間負荷した。

【００４０】１０日目に、試料として、（１）及び
（２）群のラットには生理食塩水１ｍｌを、（３）群に
は実施例３の方法により合成したＩＰＰ及びＶＰＰを各
３ｍｇ／ｋｇ体重の濃度になるように溶解した生理食塩
水１ｍｌを、経口ゾンデにて胃内に強制投与した。投与
後、（２）群及び（３）群のラットに４時間の寒冷スト
レスを負荷し、ストレス負荷終了の２時間後に、無加
温、非観血値的ラット血圧計（形式：ＰＥ−３００型、
シーエスアイ社製）を用いてtail-cuff法にて、各群の
ラットの血圧を測定した。

【００４１】血圧の測定結果を表１に示す。表１に示す
ように、ストレスを負荷した（２）群では、ストレスを
負荷していない（１）群に比べ、収縮期血圧、拡張期血
圧共に高くなっていた。ＶＰＰ及びＩＰＰを投与した
（３）群では、生理食塩水を投与した（２）群に比べ、
収縮期血圧、拡張期血圧共に低くなっており、血圧の値
がストレスを負荷していない（１）群に近くなってい
た。

【００４２】

【表１】

【００４３】寒冷ストレス負荷前後の血圧の変動を表２
に示す。表２に示すように、ストレスを負荷した（２）
群では、ストレスを負荷していない（１）群に比べ、収
縮期血圧、拡張期血圧共に有意に上昇していた。ＶＰＰ
及びＩＰＰを投与した（３）群では、生理食塩水を投与
した（２）群に比べ、収縮期血圧、拡張期血圧共に上昇
が抑制されており、収縮期血圧では有意差が認められ
た。以上の結果から、ＩＰＰ及びＶＰＰを投与すること
により、ストレス負荷後における血圧上昇を抑制する効
果が得られることが確認された。

【００４４】

【表２】

【００４５】

【実施例５】雄ウィスター系ラット（体重３００ｇ程
度）２４匹を１週間予備飼育した。予備飼育期間中及び
実験期間中においては、固形試料（ＣＥ−２、日本クレ
ア製）を制限食にて与え、水は自由摂取とした。

【００４６】予備飼育終了後、ラットを（１）生理食塩
水投与群、（２）ＶＰＰ投与群及び（３）ＩＰＰ投与群
の３群に分けた（各群８匹）。（１）群−（３）群のラ
ットを、実施例４と同様に低温室（４℃）に１日につき
４時間入れ、９日間寒冷ストレスを負荷した。

【００４７】１０日目に、試料として、（１）群は生理
食塩水１ｍｌを、並びに（２）群及び（３）群にはそれ
ぞれ実施例３の方法により合成したＶＰＰ３ｍｇ／ｋ
ｇ体重又はＩＰＰ３ｍｇ／ｋｇ体重となるよう溶解し
た生理食塩水１ｍｌを、経口ゾンデにて胃内に強制投与
した。投与後、（１）群−（３）群のラットについて、
実施例４と同様に４時間の寒冷ストレスを負荷し、血圧
を測定した。

【００４８】血圧の測定結果を表３に示す。表３に示す
ように、トリペプチドを投与した（２）及び（３）群で
は、生理食塩水を投与した（１）群に比べ、収縮期血
圧、拡張期血圧共に有意に低くなっており、トリペプチ
ドを投与することによりストレス負荷後における血圧上
昇を抑制する効果が得られることが認められた。

【００４９】

【表３】

【００５０】

【実施例６】試料として、（１）群は生理食塩水２ｍｌ
を、並びに（２）群及び（３）群にはそれぞれ実施例１
で得た発酵乳５ｍｌ／ｋｇ体重又は実施例２で得たトリ
ペプチド精製画分粉末１５０ｍｇ／ｋｇを生理食塩水に
溶解し２ｍｌとしたものを用いた他は実施例５と同様に
試験を行い、試料投与、ストレス負荷後に血圧を測定し
た。

【００５１】血圧の測定結果を表４に示す。表４に示す
通り、発酵乳を投与した（２）群及びトリペプチド精製
画分粉末を投与した（３）群と、生理食塩水を投与した
（１）群とを比べると、収縮期血圧、拡張期血圧ともに
（１）群より（２）群及び（３）群の方が低くなってお
り、発酵乳及びトリペプチド精製画分を投与することに
より、ストレス負荷後における血圧上昇を抑制する効果
が得られることが認められた。

【００５２】

【表４】

【００５３】

【実施例７】雄ウィスター系ラット（体重３００ｇ程
度）２４匹を１週間予備飼育した。予備飼育期間中は、
固形飼料（商品名ＣＥ−２、日本クレア製）を制限食と
して与え、水は自由摂取とした。

【００５４】予備飼育終了後、ラットを（１）ストレス
無負荷−生理食塩水投与群、（２）ストレス負荷−生理
食塩水投与群、（３）ストレス負荷−ＶＰＰ、ＩＰＰ投
与群の３群に分け（各群８匹）、（２）群及び（３）群
の動物に、金網拘束ケージに入れ呼吸ができるように頭
部が水面から出るようにして頭部より下を２５℃の水槽
に浸すことにより、水浸拘束ストレスを１日について６
時間、５日間連続して負荷した。ストレス負荷期間中
は、固形飼料（商品名ＣＥ−２、日本クレア製）及び水
を自由摂取させた。

【００５５】各ラットには、ストレス負荷開始日より負
荷終了日まで５日間連続して試料を投与した。試料とし
ては、（１）及び（２）群には生理食塩水１ｍｌを、
（３）群には実施例３の方法により合成したＩＰＰ及び
ＶＰＰを各３ｍｇ／ｋｇ体重の濃度になるように溶解し
た生理食塩水１ｍｌを、経口ゾンデにて胃内に強制投与
した。

【００５６】ストレス負荷２日目から３日目にかけて代
謝ケージにて尿を採取し、尿中のカテコールアミン、イ
ンドールアミンをＨＰＬＣを用いて分析した。カラムは
日本分光社製シリカ逆層カラム（商品名「カテコールパ
ック」）を、検出装置はｅｓａ社製電気化学検出器（商
品名「クーロケム」）を使用した。

【００５７】ストレス負荷最終日のストレス負荷終了
後、断頭によりマウスを屠殺し血液を採取し、胸腺及び
脾臓を摘出した。血清については、アミノ酸分析装置
（形式８００シリーズ、日本分光社製）にてアミノ酸組
成を測定し、Fischer比（分枝鎖アミノ酸／芳香族アミ
ノ酸のモル比）を算出した。胸腺及び肝臓は重量を測定
し、脾臓については以下の方法により脾臓細胞を調製
し、脾臓細胞のインターロイキン２産生能及びマイトジ
ェン反応性を測定した。

【００５８】（脾臓細胞の調製）摘出した脾臓をホモジ
ェナイザーで細かく破砕し、低張処理することによって
赤血球を除去し、２％牛胎児血清（ＦＣＳ）含有ＭＥＭ
で洗浄後、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭ１６４０培地に細胞
数が１×１０⁷となるように浮遊させ、遊離浮遊細胞液
を作成した。

【００５９】（インターロイキン２産生能の測定）調製
した前記脾臓細胞２．５×１０⁶個、コンカナバリンＡ
（ＣｏｎＡ）５μｇ／ｍｌ、及び１０％ＦＣＳを含むＲ
ＰＭ１６４０培地を調製し、２４時間培養し、その上清
中のインターロイキン２量を測定した。インターロイキ
ン２量はインターロイキン２反応性細胞株の増殖を指標
としたバイオアッセイにより測定した。

【００６０】（マイトジェン反応性）ＣｏｎＡ又はポー
クウィートマイトジェン（ＰＷＭ）をマイトジェンと
し、これらのいずれか一方の５μｇ／ｍｌ、調製した前
記脾臓細胞５×１０⁶個、及び１０％ＦＣＳを含むＲＰ
Ｍ１６４０培地を調製し、２４時間培養し、２４時間後
の細胞数をＭＴＴ（3-(4,5-dimethylthiazoil-2-yl)-2,
5-diphenyltetrazoliumbromide)の取り込みを指標とし
た吸光度により測定し、マイトジェンを含まない時の細
胞数に対する比率で表した。

【００６１】表５にストレス負荷２日目から３日目の尿
中ノルアドレナリン、ドーパミンの排泄量を示す。表５
に示すように、ストレスを負荷した（２）群ではストレ
スを負荷していない（１）群に比べ、尿中ノルアドレナ
リン、ドーパミンの排泄量が有意に低下していた。トリ
ペプチドを投与した（３）群では、生理食塩水を投与し
た（２）群に比べ、尿中ノルアドレナリン、ドーパミン
排泄量共に低下が抑えられる傾向にあった。従って、Ｉ
ＰＰ、ＶＰＰはストレス負荷した後の尿中ノルアドレナ
リン、ドーパミン排泄量の低下を抑制する効果を有する
ことが認められた。

【００６２】

【表５】

【００６３】表６に屠殺後の血清アミノ酸のFischer比
を示す。表６に示すように、ストレスを負荷した（２）
群ではストレスを負荷していない（１）群に比べ、Fisc
her比が有意に低くなっていたが、トリペプチドを投与
した（３）群では、生理食塩水を投与した（２）群に比
べ、Fischer比が有意に高くなっていた。

【００６４】

【表６】

【００６５】表７に屠殺後の胸腺及び脾臓の重量を示し
た。ストレスを負荷した（２）群ではストレスを負荷し
ていない（１）群に比べ、胸腺、脾臓共に重量が大きく
低下していた。トリペプチドを投与した（３）群では、
若干ではあるが胸腺重量及び脾臓重量が生理食塩水を投
与した（２）群に比べ高い傾向を示した。

【００６６】

【表７】

【００６７】表８に脾臓細胞のマイトジェン反応性を、
表９に脾臓細胞のインターロイキン２産生能を示す。ス
トレスを負荷した（２）群ではストレスを負荷していな
い（１）群に比べ、マイトジェン反応性の低下とインタ
ーロイキン２産生能の低下傾向が認められたが、トリペ
プチドを投与した（３）群では、生理食塩水を投与した
（２）群に比べ、マイトジェン反応性の上昇とインター
ロイキン産生能が上昇傾向が認められた。

【００６８】

【表８】

【００６９】

【表９】

【００７０】これらの結果より、ＩＰＰ、ＶＰＰの投与
は、ストレスの負荷による血中アミノ酸のバランス(Fis
cher比）の変化、胸腺や脾臓の萎縮、脾臓細胞反応性の
低下等の免疫機能指標の低下に対し抑制効果を有するこ
とが認められた。

【手続補正書】

【提出日】平成１０年６月１５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３４】

【実施例１】脱脂粉乳９ｇを水１００ｇに溶解し、１１
５℃、２０分間殺菌した後、室温まで冷却してラクトバ
チルス・ヘルベティカスＡＴＣＣ−８２０５を１白金耳
接種し、３７℃で２４時間培養を行って、１次スタータ
ー（乳酸菌数５×１０⁸個／ｍｌ、ｐＨ３．５）を調製
した。次いで、９０℃達温殺菌した脱脂乳（固形分９重
量％）２ｋｇに、１次スターターを８０ｇ接種した後
に、３７℃、２４時間培養を行い、これを２次スタータ
ーとした。次に、脱脂粉乳４．５ｋｇを水５０ｋｇに溶
解し、９０℃達温殺菌した後室温まで冷却して、前記２
次スターターを２ｋｇ接種し、３７℃で２４時間培養を
行い、発酵乳５６ｋｇを得た。得られた発酵乳中には、
１ｋｇ中の含有量としてＩＰＰが５．４ｍｇ、ＶＰＰが
９．５ｍｇの割合で含有されていた。 ─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１０年６月１８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１７】前記培養は、前記培地を加熱殺菌し所定の
培養温度まで冷却後に、予め前培養しておいた乳酸菌ス
ターターを添加することにより行うことができる。乳酸
菌スターターの接種量は、培地１ｇ当り乳酸菌数１０⁵
−１０⁷個とするのが好ましい。培養温度は２０−５０
℃、好ましくは３０−４５℃、培養時間は３−４８時
間、好ましくは６−２４時間の範囲で行うことができ
る。乳酸菌数が１０⁸個／ｇ以上及び乳酸酸度が１以上
となった時点で、培養を終了することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:225）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有
するトリペプチド及び／又はその塩を有効成分として含
有する抗ストレス剤。
【請求項２】前記トリペプチドが、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏ及び／又はＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏであることを
特徴とする請求項１記載の抗ストレス剤。
【請求項３】請求項１又は２記載の抗ストレス剤を含
む機能性食品。