CZ20001083A3

CZ20001083A3 - Prostředek proti stresu a funkční potraviny

Info

Publication number: CZ20001083A3
Application number: CZ20001083A
Authority: CZ
Inventors: Akihiro Masuyama; Toshiaki Takano
Original assignee: Calpis Co., Ltd.
Priority date: 1997-09-26
Filing date: 1998-02-05
Publication date: 2001-01-17
Also published as: PL339348A1; DE69823369T2; BG64692B1; DK1018341T3; EP1018341B1; AU728565B2; ATE264687T1; TWI231213B; CN1198641C; US6410685B1; CN1279614A; TR200000863T2; PL192873B1; SK4362000A3; KR20030005137A; JP4727770B2; ES2219868T3; DE69823369D1; KR100379819B1; ID25635A

Description

Prostředek proti stresu a funkční potraviny

2W0-/0S3

Oblast techniky:

i Tento vynález se týká prostředku proti stresu a funkčních potravin, které zabraňují a zmírňují duševní a', tělesné příznaky způsobené stresem.

Dosavadní stav techniky,

V moderní společnosti jsou lidé vystavováni různým ^druhům stresu, které jsou způsobeny vysoce vyspělými a složitými vědeckými technologiemi a také drastickými:

změnami sociálního prostředí. Zejména v kosmopolitní společnosti jsou vytvářeny komplikované lidské vztahy, které zapříčiňují duševní stres. Byla popsána řada příznaků, kterými se duševní stres projevuje.

I

Připouští se, že duševní stres má velký vliv na: 'oběhový a imunitní systém. Protože dosud nebyla dobře stanovena vědecká koncepce a definice stresu, v oblasti' jeho hodnocení existuje ještě mnoho problémů spojených .s metodologickými obtížemi. V poslední době byly: publikovány studie zabývající se stresem z medicínského pohledu .1 'Například je popisováno, že když je jedinec vystaven iStresu, roste u něj hladina angiotenzinu II, a také u něj ivzrůstá hladina nitrotělního sodíku, který je uvolňován :resorpcí, což má za následek vzrůst krevního tlaku (Osaka^:Mobara a kol.: Taisha, 28, 2, 323, 1991).. Na základě těchto .zjištění byly prováděny studie, jejichž cílem bylo zjistit vliv enalaprilu a alaceprilu, které jsou inhibitory enzymu přeměňujícího angiotenzin a jsou užívány jako.

• · • · · · ♦ · • · α · · · * « « · · · · · · · • •e ···· ··· «· ** ·· .antihypertonika při léčbě hypertenze zapříčiněné stresem!

(The American Journal of Cardiology; 68, 15, 1362 (1991), ilnternal Medicine; 32, 9, 691 (1993). Má se za to, že tento (stres nezpůsobuje pouze nárůst krevního tlaku, ale že také ovlivňuje různé faktory, které mají vliv na vznik;

žaludečních vředů, ischemické choroby srdeční, cerebrovaskulárních onemocnění, hyperlipémie a podobně.! Proto ačkoli je stres považován za jednu z příčin , •hypertenze, nepředpokládá se, že antistresového účinku by! bylo dosaženo pouze potlačením růstu krevního tlaku.

V současné době se používají jako prostředky ki (zabránění nebo zmírnění duševních a tělesných příznaků _;způsobených stresem chemicky syntetizovaná léčiva, jako( jsou sedativa, prostředky proti úzkosti a prášky na spaní. Avšak tato léčiva jsou návyková a mají vedlejší účinky, proto není výhodné, aby byly denně užívány za účelem zabránění duševních a tělesných příznaků způsobených· (stresem. Z tohoto důvodu jsou požadovány, a proto jsou i vyvíjeny prostředky proti stresu, které se mohou užívat! denně bez jakýchkoliv problémů se zdravotní závadností, a které mohou zmírnit či zabránit duševním a tělesným; příznakům způsobených stresem. Například existuje návrhy, , ,aby prostředek proti stresu obsahoval jako účinnou složkou· (L-theanin, který je obsažen v listech čaje (japonská •zveřejněná patentová přihláška č. 6-100442), dále byla! navržena kompozice proti stresu obsahující imidazolové ^sloučeniny, jako jsou anserin, valenin, n-methylhistidin' nebo τ-methyihistidin (japonská zveřejněná patentová ^přihláška č. 9-20660), a „antistresové potraviny! .obsahující kompozici složenou z glutathionu a antioxidantu (japonská zveřejněná patentová přihláška č. 8-275752) .(

Jeden článek také pojednává o vlivu vůní na snížení stresu (Fragrance Journal: 1991-11, s. 44 - 49. Dosud však nebylo • 9 • · ♦ · · » • · · · · · • · · · · · · • · · · · · ·· ·♦ ·* popsáno, že tripeptid má vliv na zmírnění nebo zabránění: duševních nebo tělesných příznaků zapříčiněných stresem.

Podstata vynálezu:

jCílem tohoto vynálezu je poskytnout prostředek proti stresu a funkční potravinu, které mohou splnit výše zmíněný: společenský požadavek, které mohou být opakovaně a denně .užívány bez jakýchkoliv problémů se zdravotní závadností a’, které mohou zmírnit či zabránit duševním a tělesným příznakům způsobených stresem/

JPředložený vynález poskytuje prostředek proti stresu, který obsahuje jako účinnou složku tripeptid a/nebo jeho· sůl mající inhibiční účinek na enzym konvertující angíotenzin i Předložený vynález také poskytuje prostředek proti _;stresu, kde tímto tripeptidem je Ile-Pro-Pro a/nebo Val^:Pro-Pro.

\Předložený vynález dále poskytuje užití tohoto , tripeptidu a/nebo jeho soli pro výrobu prostředku proti· stresu.

i Předložený vynález také poskytuje potravinu mající _;antistresový účinek, která obsahuje tento prostředek proti: stresu.

:Předložený vynález dále poskytuje užití tohoto tripeptidu a/nebo jeho soli pro výrobu potravin majících; antistresový účinek.

:Předložený vynález dále poskytuje způsob výroby těchto potravin majících antistresový účinek, který zahrnuje ;fermentaci média obsahujícího peptid a/nebo protein obsahující sekvenci Ile-Pro-Pro a/nebo Val-Pro-Pro za· přítomnosti bakterií mléčného kvašení za podmínek, které jsou vhodné, aby ve fermentačním médiu vznikal tripeptid) Ile-Pro-Pro a/nebo Val-Pro-Pro.

,· Předložený vynález také poskytuje způsob, jak snížit istres, který zahrnuje orální podávání účinného množství tripeptidu a/nebo jeho soli mající inhibiční účinek na) ;enzym konvertuj ící angiotenzin.

Výhodné provedení vynálezu i Prostředek proti stresu podle předloženého vynálezu .obsahuje jako účinnou složku tripeptid a/nebo jeho sůl^:mající inhibiční účinek na enzym konvertující angiotenzin.

V předloženém vynálezu „antistresový účinek označuje) .působení, které způsobuje přiblížení stavů subjektu ke stavům, kdy tento subjekt není vystaven stresu, to je) například působení na snížení systolického a diastolického krevního tlaku, které se zvyšovaly kvůli stresu, a působení na zamezení nebo předcházení snižování immunologických jčinností zapříčiněných stresem, jako je snížení odezvy' islezinných buněk.

)Tento tripeptid může být výhodně vybrán ze skupiny .tvořené Ile-Pro-Pro, Val-Pro-Pro (dále v textu označováno) jako IPP a VPP) a jejich směsí, kjeré mají inhibiční účinek na enzym konvertuj ící angiotenzin .i

Mezi soli tohoto tripeptidu mohou být zahrnuty ifarmakologicky přijatelné soli jak anorganické, jako je) ihydrochlorid, síran, fosforečnan, tak i organické, jako je citrát, malát, fumarát, vinan a iaktát.í )Tento tripeptid může být vyráběn například fermentací za použití mikroorganismů, enzymovou hydrolýzou nebo) chemickou syntézou.

, Fermentace za použití mikroorganismů může být) iprováděna kultivováním bakterií mléčného kvašení v médiu • 0 • 0 »0 0 « ·

složeném z potravinového materiálu obsahujícího peptid! !a/nebo protein, který zahrnuje aminokyselinovou sekvenci odpovídající tomuto tripeptidu, jako je sekvence Ile-Pro-! Pro a/nebo Val-Pro-Pro.

Médiem je výhodně potravinový materiál obsahující! peptid a/nebo protein, který zahrnuje aminokyselinovou sekvenci odpovídající těmto tripeptidům. Potravinovým! materiálem může být mléko, mléčný kasein, kukuřice, kukuřičný protein, pšenice, pšeničný protein, sojové boby,! .odtučněné sojové boby nebo sojový protein. Médium může dále _;obsahovat jiné složky, jako je kvasničný extrakt, vitamíny’ a minerály, pokud je to nezbytné.

Jako bakterie mléčného kvašení mohou být použity! {bakterie mléčného kvašení rodu Lactobacillus. Například mohou být použity Lactobacillus helveticus, Lactobacillus' delbruekii, subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus feriaentum nebo Lactobacillus casei subsp.\ .casei. Konkrétně mohou být použity Lactobacillus helveticus ATCC55796, Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus) ATCC11842, Lactobacillus acidophilus ATCC4356,

Lactobacillus fermentum ATCC14931 nebo Lactobacillus casei) .subsp. casei ATCC393.

{Fermentace může být provedena tepelnou sterilizací média, ochlazením média na požadovanou kultivační teplotu a! !poté zaočkováním média předkultivovaným zákysem bakterií mléčného kvašení. Inokulační množství zákysu bakterií! mléčného kvašení:je výhodně 10⁵ až 10⁷ buněk bakterií mléčného kvašení na 1 g média. Kultivační teplota se může! pohybovat v rozsahu 20 až 50°C a výhodně v rozsahu 30 až !45 °C. Kultivační doba se může pohybovat v rozsahu 3 až 48_;hodin a výhodně 6 až 24 hodin. Kultivace může být ukončena! až počet buněk bakterií mléčného kvašení dosáhne hodnoty 10⁸ buněk/g nebo více a kyselost mléčné kyseliny dosáhne:

te · hodnoty 1 nebo více. Výsledné kultivační médium obvykle obsahuje 0,1 až 100 pg/g IPP a/nebo VPP, přestože to závisí na materiálu a složení média.

Samotné kultivační médium obsahující živé bakterie mléčného kvašení může být užito jako prostředek proti stresu podle tohoto předloženého vynálezu. Alternativně může být užito kultivační médium po tepelné sterilizaci, například až na 80 °C. Dále kultivační médium může být zpracováno lyofilizaci, sušením v rozprašovací sušárně nebo sušením v bubnové sušárně na prášek.

Kultivační médium může být koncentrováno, aby byl tripeptid přečištěn před použitím jako prostředek proti stresu podle tohoto vynálezu. Koncentrace a purifikace může být prováděna tak, že kultivační médium je odstředěno a je odebrán supernatant z odstřeďované kapaliny. Za účelem získání více koncentrovaného a purifikovaného tripeptidu může být supernatant dále zpracováván elektrodialýzou, iontoměničovou pryskyřicí, dialýzou na membráně z dutých vláken, reverzní osmózou, hydrofobní kolonovou chromatografií nebo jejich kombinací.

Příprava tripeptidu enzymovou hydrolýzou může zahrnovat postupné působení proteinas a karboxypeptidas na potravinový materiál obsahující peptid a/nebo protein obsahující aminokyselinovou sekvenci odpovídající těmto tripeptidům, jako je Ile-Pro-Pro a Val-Pro-Pro.

Proteinasami mohou být proteinasy získané z mikroorganismů, .rostlin nebo živočichů, a mohou být připraveny obecně známými metodami. Karboxypeptidasami mohou být •karbxypeptidasy získané z mikroorganismů, rostlin neboživočichů, které mohou být připraveny obecně známými metodami.( i

(Příprava tripeptidu chemickou syntézou může zahrnovat obecně známé organické syntézy. Tripeptid může být;

• · ··· ···» «······ ··· «· · * · · například získán tak, že se připraví aminokyseliny, které) jsou složkami konečného tripeptidů, aminoskupiny každé .aminokyseliny se chrání fluorenylmethoxykarbonylovou) skupinou, následně se aminokyseliny chráněné fluorenylmethoxykarbonylovou skupinou ponechají zreagovat) jakoukoliv běžnou metodou podle sekvence aminokyselin konečného tripeptidů za vzniku tripeptidů vázaného na) .pryskyřici a poté se tato pryskyřice odstraní jakýmkoliv běžným způsobem a tripeptid se přečistí.) )Obsah tripeptidů v prostředku proti stresu podle předloženého vynálezu není nijak zvláště omezen, pokud to) umožňuje podávání účinného množství tripeptidů, a bude , .diskutován později. Obsah tripeptidů v tomto prostředku! může obvykle být 0,001 až 1 hmotn. %.

Prostředek proti stresu podle předloženého vynálezu) )může obsahovat kromě tripeptidů a/nebo jeho soli také jiné .přísady, jako jsou cukry, proteiny, lipidy, vitaminy,) minerály, aromatiza.ční prostředky a barviva.

Prostředek proti stresu podle předloženého vynálezu) může být aplikován lidem nebo zvířatům. Aplikace může být prováděna orálně nebo intravenózně, přičemž orální aplikace) je výhodnější.

SÚčinné množství prostředku proti stresu podle tohoto ivynálezu vhodné pro aplikaci se může obvykle pohybovat v rozsahu od 0,1 do 40 mg/kg tělesné hmotnosti*den tripeptidů! pro orální aplikaci, aby bylo dosaženo výše popsaného účinku, t.j. zmírnění nebo zabránění stresu u lidí. Tento) prostředek proti stresu může být avšak aplikován v množství, které převyšuje uvedený rozsah.) ) Při aplikaci prostředku proti stresu podle předloženého vynálezu pacientovi dochází ke změnám různých) fyziologických ukazatelů, které jsou ovlivněny stresem, jako je vzrůst krevního tlaku a snížení imunologických)

·· «* • · · » « · · * • » · · « · · * © < *♦ funkcí. Tyto fyziologické ukazatele jsou nižší než:

v případě, kdy není prostředek podáván, a přibližují se hodnotám, kdy pacient není vystaven stresuj !Funkční potraviny podle tohoto vynálezu obsahují prostředek proti stresu. Konzumace těchto funkčních', potravin zabraňuje stresu nebo zmírňuje stres.

Obsah prostředku proti stresu ve funkčních potravinách: podle tohoto vynálezu není zvláště limitován za .předpokladu, že tripeptid a/nebo jeho sůl ve funkčních: potravinách jsou v koncentračním rozsahu umožňujícím dosažení antistresového účinku. Funkční potraviny mohou: .obvykle obsahovat takové množství prostředku proti stresu,_;.aby obsah tripeptidu a/nebo jeho soli ve funkční potravině! :byl v rozsahu od 0,001 do 0,1 hmotn. %.

Konzumací funkčních potravin podle tohoto vynálezu vj množství pohybujícím se v rozsahu od 0,1 do 40 mg tripeptidu na kg tělesné hmotnosti a den může být dosaženo! výhodných účinků, které jsou popsány v tomto vynálezu. .Funkční potraviny mohou být konzumovány i v množství, které: přesahuje uvedený rozsah.

i Funkční potraviny podle tohoto vynálezu mohou:

'.zahrnovat jogurt, mléčné zakysané nápoje, sýr, potraviny a· nápoje obsahující fermentované kyselé mléko nebo potraviny, ipro zdravou výživu, a mohou být v pevné formě, jako je prášek, granule a tablety, nebo tekuté formě, jako je: pasta, gel a kapalina.

Tripeptid, účinná složka prostředku proti stresu a: :funkční potraviny podle tohoto vynálezu, může být připraven .fermentací potravin za pomoci bakterií mléčného kvašení, z^!, .tohoto důvodu je zcela bezpečný.

, Protože prostředek proti stresu a funkční potraviny!

podle tohoto vynálezu obsahují tripeptid, jsou zcela » » · · · · * · * ······* ·· · «♦ · · ·* bezpečné, a jejich opakované a každodenní užívání může; zmírnit příznaky nebo zabránit duševním a _;tělesným příznakům způsobeným různými druhy stresuj (Příklady provedení vynálezu

Předložený vynález bude podrobněji vysvětlen v! (následu j i cích příkladech, ale tento vynález se neomezuje pouze na ně.

Příklad 1 i 9 g Práškové smetany bylo rozpuštěno v 100 g vody. .Výsledný roztok byl sterilizován při teplotě 115 °C po dobu (20 minut, ochlazen na pokojovou teplotu, zaočkován jedním ^platinovým očkem Lactobacillus helveticus ATCC-8205 a( (kultivován při 37 °C po dobu 24 hodin, tímto postupem byl připraven primární zákys (5 χ 10⁸ buněk/ml, pH 3,5). Poté'; byly zaočkovány 2 kg smetany (obsahující 9 hmotn. % sušiny) sterilizované zahřátím na teplotu 90 °C 80 g primárního/ zákysu a kultivovány při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin,) (tímto postupem byl připraven sekundární zákys. Nakonec

4,5 kg práškové smetany bylo rozpuštěno v 50 kg vody.) /Výsledný roztok byl sterilizován zahřátím na teplotu 90 °C, (ochlazen na pokojovou teplotu, zaočkován 2 kg sekundárního (zákysu a kultivován při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin, tímto postupem bylo připraveno 56 kg zakysaného mléka.) (Obsah IPP a VPP v takto připraveném zakysaném mléce byl 5,4 mg IPP a 9,5 mg VPP na litr.í (Příklad 2 (U 6 kg zakysaného mléka připraveného podle příkladu 1 bylo upraveno pH na hodnotu 7,3 pomoci 10 N vodného roztoku

• -i ·	•		9 ·		4 4
• · ·	• ·	9	9	4	»	•
• ·	•	9	9	•	•	4
• ·	•	9	9	•	•	4
• β 4 4 4 4	44 9		• 4		4 *

hydroxidu sodného, k takto upravenému zakysanému mléku byli (přidán 1 litr iontoměničové pryskyřice (obchodní značka „Amberlite XAD-2, výrobce ORGANO CORP.) a dále byla! (přidána destilovaná voda tak, aby celková hmotnost výsledné směsi byla 20 kg. Tato směs byla míchána míchadlem (po dobu 90 minut a poté filtrována na odsávacím filtračním .zařízení, aby byla odseparována pryskyřice. Pryskyřice na( (filtru byla promyta 20 kg destilované vody a poté byla .promyta pryskyřice shromážděna. Shromážděná pryskyřice byla (smíchána s 0,8 kg methanolu a byla míchána po dobu 30 minut míchadlem. Výsledná směs byla filtrována přes nylonovou! vlnu (200 mesh) a poté přes tvrdý filtrační papír na odsávacím zařízení. Získaný filtrát byl zahuštěn na vakuové ^odparce při teplotě 55 °C. Tímto postupem bylo připraveno (200 g koncentrované kapaliny. K této kapalině byla přidáno . .250 ml iontoměničové pryskyřice (obchodní značka „Amberlite (IRA-400 (typ OH), výrobce ORGANO CORP.), směs byla míchána_:.po dobu 10 minut a filtrována přes tvrdý filtrační papír na (odsávacím zařízení. U filtrátu bylo upraveno pH na hodnotu .7 pomocí 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové a poté byl; (lyofilizován. Takto přečištěný a vysušený produkt byl jednotně rozpouštěn v 5 ml destilované vody, aplikován na( (kolonu (obchodní značky „Sephadex G-25, výrobce PHARMACIA CO.) a eluován destilovanou vodou za účelem zachycení; (tripeptidové frakce. Lyofilizací této frakce bylo získáno _:50 mg práškové formy přečištěné tripeptidové frakce. 50 mg( (práškové formy přečištěné tripeptidové frakce obsahovalo 0, 6 mg IPP a 1,0 mg VPP.i (Příklad 3 (IPP a VPP byly syntetizovány následující organickou .syntézou. Tato syntéza byla prováděna metodou na pevné fázi (za použití přístroje pro automatickou syntézu peptidu (typ

PSSM-8), výrobce SHIMADZU CO. Jako nosiče pevné fáze bylo; (použito 20 pinol polystyrénové pryskyřice (benzyloxybenzyl.alkoholového typu), na kterou byl navázán prolin mající; (aminoskupinu chráněnou fluorenylmethoxykarbonylovou skupinou (dále označovanou jako Fmoc). Peptid navázaný na! (pryskyřici byl připraven tak, že podle aminokyselinové sekvence byly postupně běžnou metodou navázány jednotlivé! (aminokyseliny. Každá aminokyselina byla přidána do reakční směsi v množství 100 pmol a měla aminoskupinu chráněnou:

(Fmoc skupinou, t.j. do reakční směsi bylo přidáno Fmoc-Ile, .Fmoc-Pro a Fmoc-Val. Tento peptid navázaný na pryskyřici:

byl suspendován v 1 ml reakční kapaliny (obsahující 1 hmotn. % ethandithiolu, 5 hmotn. % anisolu a 94 hmotn. %; (trifluoroctové kyseliny), reakce probíhala po dobu 2 hodin .při pokojové teplotě za účelem oddělení peptidu z( (pryskyřice a odstranění ochranných skupin z postranních řetězců těchto peptidů. Tato reakční směs byla filtrována; přes skleněný filtr, smíchána s 10 ml bezvodého etheru, aby _:byl vysrážen purifikovaný peptid, který byl dále odstředěni (při 3000 ot./min. po dobu 5 minut za účelem oddělení .precipitátu. Precipitát byl promyt několikrát bezvodým! (etherem a poté byl sušen v proudu dusíku. Všechny takto .získané surové syntetizované peptidy byly rozpuštěny v 2 ml( (0,1 N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a nakonec .byly purifikovány na HPLC s reverzní kolonou Cis za těchto; (podmínek:

(Pumpa: typ L6200, výrobce HITACHI, LTD.

Detektor: typ L4000 UV detektor pro měření UV absorbance! (při 215 nm, výrobce HITACHI, LTD.

Kolona: MICROBONDASPHERE 5μ C₁₈, výrobce WATERS INC.i (Eluent: kapalina A; 0,1 hmotn. % vodný roztok TFA kapalina B; acetonitril obsahující 0,1 hmotn. % TFAi (B/A+B)xlOO(%) : O —» 40 % (60 minutý (Průtok: 1 ml/min.

(Při maximální absorbanci byly jímány eluční frakce, •které byly dále lyofilizovány za účelem získání! požadovaných syntetizovaných peptidů, t.j., 2,1 g IPP a .0,9 mg VPP. Purifikované peptidy byly analyzovány od jejich) (N-konce plně automatickým analyzátorem proteinové primární _;struktury (typ PPSQ-10, výrobce SHIMADZU CO.) a) (analyzátorem aminokyselin (typ 800, výrobce NIHON BUŇKOU KOUGYO CO.). Bylo zjištěno, že tyto peptidy odpovídají výše) (uvedené specifikaci.

Příklad 4 i (24 Krysích samců druhu Wister (o tělesné hmotnosti asi .300 g) bylo přípravně krmeno jeden týden. Během přípravného) (krmení a doby trvání pokusu byly krysy krmeny pouze komerční dietou (obchodní značka „CE-2, výrobce NIHON CREA CO.), vodu mohly pít podle chuti.

Po týdenním přípravném krmení byly krysy rozděleny do) (tří skupin (8 v každé skupině), a to následovně:

.1. skupina - nebyla vystavena stresu a byl jí podáván) .fyziologický roztok

2. skupina - byla vystavena stresu a byl jí podáván) (fyziologický roztok (3. skupina - byla vystavena stresu a byl jí podáván VPP a IPP. Zvířata z 2. a 3. skupiny byla vystavena stresu po) (dobu 9 dnů, když každý den byla ponechána 4 hodiny v chladné místnosti (4 °C) .( (Desátý den byl krysám z 1. a 2. skupiny podán prostřednictvím orální sondy do žaludku 1 ml fyziologického (roztoku a krysám z 3. skupiny byl podán fyziologický roztok, který obsahoval 3 mg/kg tělesné hmotnosti zvířete) • «Φ ·0· 0 »

0 0 0

0 0 00 0 0

0« «0

0 0 ·

0 0 «

0 0 *

0 0 0 >0 ·«

IPP a VPP syntetizovaného v příkladu 3. Po této aplikaci'; (byly krysy z 2. a 3. skupiny vystaveny chladovému stresu po dobu 4 hodin. Dvě hodiny po skončení zátěže byl měřeni (krevní tlak u krys ze všech tří skupin za použití bezohřevového neinvazivního krysího sfygmomanometru (typ! (PE-300, výrobce CSI CO.) tím způsobem, že měřící manžeta byla připevněna na ocas. Tyto výsledky jsou shrnuty v( (tabulce 1.

(Výsledky krevního tlaku jsou shrnuty v tabulce 1.

Z tabulky 1 je zřejmé, že jak systolický, tak i diastolickýl (krevní tlak byl vyšší u 2. skupiny, která byla vystavena , stresu, ve srovnání s 1. skupinou, která nebyla vystavena, stresu. Naopak u krys 3. skupiny, které byl podáván VPP a ,IPP, byl jak systolický, tak i diastolický krevní tlak! (nižší, než u krys 2. skupiny, které byl podáván fyziologický roztok, a přibližuje se hodnotám 1. skupiny,!

(ve které krysy nebyly vystaveny stresu.

Tabulka 1(

Experimentální skupiny	Systolický krevní tlak (mmHg)	Diastolický krevní tlak (mmHg)
1.- nevystavena stresu, podáván fyziologický roztok	121	97
2.- vystavena stresu, podáván fyziologický roztok	136*	107
3.- vystavena stresu, podáván VPP a IPP	129	101

* významný rozdíl oproti 1. skupině na hladině významnosti, 5 % (Změny krevního tlaku před a po chladovém stresu jsou shrnuty v tabulce 2. Jak je vidět v tabulce 2, jak!

systolický, tak i diastolický krevní tlak byl významně vyšší u 2. skupiny, která byla vystavena stresu, vel • fcfc · «· · · · · ♦ · · • β · · • · · ······· fc·· fcfc ·» ·· • fc · » · · • * · · fc ♦ fc fc · · · · · fcfc · · * · •fc fcfc fcfc srovnání s 1. skupinou, která nebyla vystavena stresu.! ÍNárůst jak systolického, tak i diastolického krevního tlaku byl potlačen u 3. skupiny, které byl podáván VPP a IPP, ve! isrovnání s 2. skupinou, která obdržela fyziologický roztok. Zejména potlačení nárůstu systolického krevního tlaku bylo! ‘významné. Tyto výsledky potvrdily, že podávání IPP a VPP má .za následek potlačení nárůstu krevního tlaku vyvolaného!

!stresem.

Tabulka 2i

Experimentální skupiny	Systolický krevní tlak (Δ mmHg)	Diastolický krevní tlak (Δ mmHg)
1.- nevystavena stresu, podáván fyziologický roztok	-2,2	-2,5
2.- vystavena stresu, podáván fyziologický roztok	11,2*	6,1*
3.- vystavena stresu, podáván VPP a IPP	3,7 #	-0,6

_: * významný rozdíl oproti 1. skupině na hladině významnosti! 5 % # významný rozdíl oproti 2. skupině na hladině významnosti 5 %!

!Přiklad 5 i 24 Krysích samců druhu Wister (o tělesné hmotnosti asi. _:300 g) bylo přípravně krmeno jeden týden. Během přípravného! !krmení a doby trvání pokusu byly krysy krmeny pouze komerční dietou (obchodní značka „CE-2, výrobce NIHON CREA! ;C0.) vodu mohly pít podle libosti.

Po týdenním přípravném krmení byly krysy rozděleny do!

!tří skupin (8 v každé skupině), a to následovně: 1. skupině byl podáván fyziologický roztok, 2. skupině byl podáván VPP!

!a 3. skupině byl podáván IPP. Krysy ze všech tří skupin • · .byly vystaveny stresu po dobu 9 dnů, stejně jako v příkladu; (4, kdy každý den _;byly ponechány 4 hodiny v chladné místnosti (4 °C)i i Desátý den byl krysám z 1. skupiny podán prostřednictvím orální sondy do žaludku 1 ml fyziologického; (roztoku a krysám z 2, a 3. skupiny byl podán 1 ml fyziologického roztoku, který obsahoval 3 mg/kg tělesné; (hmotnosti zvířete IPP nebo 3 mg/kg tělesné hmotnosti .zvířete VPP, které byly syntetizovány v příkladu 3. Po( .této aplikaci byly krysy ze všech tří skupin vystaveny .chladovému stresu po dobu 4 hodin a poté byl u nich stejným; (způsobem jako v příkladu.4 měřen krevní tlak. Tyto výsledky jsou shrnuty v tabulce 3.;

(Výsledky krevního tlaku jsou shrnuty v tabulce 3. J.ak .je zřejmé z tabulky 3, jak systolický, tak i diastolický; (krevní tlak byl významně nižší u 2. a 3. skupiny, kterým .byly podávány tripeptidy, ve srovnání s 1. skupinou, které; (byl podáván fyziologický roztok. Bylo potvrzeno, že . podávání tripeptidů má za následek potlačení nárůstu; (krevního tlaku vyvolaného stresem.

Tabulka 3;

Experimentální skupiny	Systolický krevní tlak (mmHg)	Diastolický krevní tlak (mmHg)
1.- podáván fyziologický roztok	138	110
2.- podáván VPP	131*	101*
3.- podáván IPP	130*	102* .

* významný rozdíl oproti 1. skupině na hladině významnosti; 5 % i- 16

Příklad 6’i ! Tento test byl prováděn stejným způsobem jako v .příkladu 5 s tou výjimkou, že 1. skupině krys byly podávány! \2 ml fyziologického roztoku, 2. skupině krys bylo podáváno 5 ml/kg tělesné hmotnosti zakysaného mléka připraveného! !podle příkladu 1, a 3. skupině krys byly podávány 2 ml_;.fyziologického roztoku obsahujícího 150 mg/kg práškové! (purifikované tripeptidové frakce připravené podle příkladu 2. Po této aplikaci vzorků byly krysy vystaveny stresu a u! (každé z nich byl změřen krevní tlak.

: Výsledky krevního tlaku jsou shrnuty v tabulce 4. Jak) (je uvedeno v tabulce 4, když je porovnána 2. skupina, které bylo podáváno zakysané mléko a 3. skupina, které byla! (podávána prášková purifikované frakce tripeptidu s 1. .skupinou, které byl podáván fyziologický roztok, je zřejmé,! (že jak systolický, tak i diastolický krevní tlak je u 2. a . 3. skupiny nižší než u 1. skupiny. Tímto bylo potvrzeno, žeí (podávání zakysaného mléka a purifikované tripeptidové _;Trakce má za následek potlačení nárůstu krevního tlaku! (vyvolaného stresem.

Tabulka 4¾

Experimentální skupiny	Systolický krevní tlak (mmHg)	Diastolický krevní tlak (mmHg)
1,- podáván fyziologický roztok	135	106
2.- podáváno zakysané mléko	132	99*
3.- podávána purifikované tripeptidové frakce	128*	101*

* významný rozdíl oproti 1. skupině na hladině významnosti! 5 % >- 17 •tt · ·· tttt ·· tt · tttttttt tt tttttt • ··· ···· tttt tttt ··· tttt · • tt·· »··» tttttttt tttt· tttt tttt ··

Přiklad 7!

!24 Krysích samců druhu Wister (o tělesné hmotnosti asi, ,300 g) bylo přípravně krmeno jeden týden. Během přípravného! Skrmení byly krysy krmeny pouze komerční dietou (obchodní .značka „CE-2, výrobce NIHON CREA CO.), vodu mohly pít! podle libosti.

! Po tomto přípravném krmení byly krysy rozděleny do tří _;skupin (8 v každé skupině), a to následovně:! jl. skupina - nebyla vystavena stresu a byl jí podáván .fyziologický roztok!

Í2. skupina - byla vystavena stresu a byl jí podáván .fyziologický roztok!

!3. skupina - byla vystavena stresu a byl jí podáván VPP a IPP.!

Zvířata z 2. a 3. skupiny byly vystaveny stresu, který , .byl vyvolán ponořením do vody po dobu 6 hodin během jednoho! Sdne. Během pokusu, který trval 5 dní, byla zvířata dána do drátěné klece, kde byla zadržována a ponořována do vodní! ,!lázně 25 °C, tím způsobem, že měly hlavy nad vodní ihladinou, aby mohly dýchat. Během stresové zátěže mohly , _;krysy konzumovat komerční dietu (obchodní značka „CE-2,5 výrobce NIHON CREA CO.), vodu mohly pít podle libosti.

. Krysám byly podávány vzorky během pěti po sobě!

'.následujících dní, ve kterých byly vystaveny stresové .zátěži. Jako vzorek byl krysám z 1. a 2. skupiny podáván!

!1 ml fyziologického roztoku, 3. skupině krys byl podáván, ,1 ml fyziologického roztoku obsahujícího 3 mg/kg tělesné! !hmotnosti IPP a 3 mg/kg tělesné hmotnosti VPP, které byly .syntetizovány v příkladu 3. Vzorky byly krysám podávány! ^prostřednictvím orální sondy do žaludku.

. Mezi 2. a 3. dnem stresové zátěže byla sbírána moč! !pokusných krys z metabolických klecí, která byla dále analyzována metodou HPLC pro stanovení koncentrací!

v ·· 0 00 00 ··

0 · ·0 · · 000*

0 000 0000

00 00 000 00 0

000 «000

000 0·0· 000 ·· ·· ·· (- 18 _:katecholaminu a indolaminu. Analýza byla prováděna nai (koloně s reverzní fází (obchodní značky „Catecholpack), .výrobce NIHON BUŇKOU KOUGYO CO. a látky byly detekovány; íelektrochemickým detektorem (obchodní značky „Coulochem, výrobce esa CO.!

i Po posledním vystavení stresové zátěži 5. den byly _:.krysy usmrceny dekapitací, byla z nich vyňata slezina a (thymus a byly odebrány vzorky krve. Složení sérových aminokyselin bylo stanoveno analyzátorem aminokyselin (typ: (800, výrobce NIHON BUŇKOU KOGYO CO.) z důvodu výpočtu Tischerova poměru (molární poměr rozvětvených!

(aminokyselin/aromatické aminokyseliny). Byla stanovena hmotnost thymu a jater. Ze sleziny byly připraveny slezinné! (buňky, u kterých byla stanovena produkce interleukinu 2 a reakce na mitogen podle následujících postupů.!

((Příprava slezinných buněk)

Slezina byla jemně rozemleta v homogenizátoru, poté! (byla vystavena hypotonickému působení za účelem odstranění, hemocytů, poté byly buňky promyty MEM, který obsahoval 2 %( ifetálního telecího séra (FCS) a suspendovány v mediu ,RPN ,1640 obsahujícím 10 % FCS za účelem přípravy suspenze! (volných buněk, jejichž koncentrace byla 1 χ 10⁷.

((Stanovení produkce interleukinu 2)

Bylo připraveno medium RPN 1640 obsahující 2,5 (χ 10⁶' (volných slezinných buněk podle postupu popsaného výše, ,5 pg/ml konkanavalinu A (ConA) a 10% FCS. Toto médium bylo! ‘kultivováno 24 hodin. Množství interleukinu 2 v ^supernatantu kultivovaného média bylo měřeno biostanovením! (užívajícím reaktivního buněčného kmenu jako ukazatele proliferace interleukinu 2.( • ·········* • · · · · · · · · ··» ···< ··· ·· ·· ·· (Reakce na mitogen)!

(Bylo připraveno medium RPN 1640 obsahující buď 5 ,pg/ml ikonkanavalinu A (ConA) nebo „pokeweed mitogenu (PKW) /5 χ 10⁶ volných slezinných buněk podle postupu popsaného ivýše a 10 % fetálního telecího séra. Toto médium bylo .kultivováno 24 hodin. Počet buněk po 24 hodinách byl určení iz naměřené absorbance, přičemž byl užit příjem MTT (3-(4,,5,dimethylthiazoil-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid) jako! (ukazatel, který představuje poměr buněk bez mitogenu.

Množství noradrenalinu a dopaminu vylučovaného v moči! (mezi druhým a třetím dnem stresového zatížení je, uveden v .tabulce 5. Jak je zřejmé z tabulky 5, vylučováni! (noradrenalinu a dopaminu v moči bylo u 2. skupiny, která byla vystavena stresu, významně menší než u 1. skupiny,! (která nebyla vystavena stresu. U 3. skupiny, které by,ly .podávány tripeptidy, byl potlačen pokles vylučovaného! '.adrenalinu a dopaminu ve srovnání s 2. skupinou, které byl , .podáváván fyziologický roztok. Takto bylo prokázáno, že IPP! ía VPP potlačují stresem indukovaný pokles při vylučování noradrenalinu a dopaminu v moči.!

Tabulka 5

Experimentální skupiny	Noradrenalin (mg/den)	Dopamin (mg/den)
1.- nevystavena stresu, podáván fyziologický roztok	0,296	0,466
2.- vystavena stresu, podáván fyziologický roztok	0,168*	0,287*
3.- vystavena stresu, podáván VPP a IPP	0,231*#	0,396*#

* významný rozdíl oproti 1. skupině na hladině významnosti! 5 % # významný rozdíl oproti 2. skupině na hladině významnosti 10 »444

4

4 4 4 4 4

V tabulce 6 je uveden Fischerův poměr sérových: ^aminokyselin po usmrcení krys. Jak je uvedeno v tabulce 6, .Fischerův poměr byl u 2. skupiny, která byla vystavena; ístresu, významně nižší ve srovnání s 1. skupinou, která .nebyla vystavena stresu. Naproti tomu byl Fischerův poměr: ívýznamně vyšší u 3. skupiny, které byly podávány .tripeptidy, než u 2. skupiny, které byl podáván:

^fyziologický roztok.

Tabulka 6

Experimentální skupiny	Fischerův poměr
1.- nevystavena stresu, podáván fyziologický roztok	3,34
2.- vystavena stresu, podáván fyziologický roztok	2,97*
3.- vystavena stresu, podáván VPP a IPP	3,27#

* významný rozdíl oproti 1. skupině na hladině významnosti.

i 5 % i# významný rozdíl oproti 2. skupině na hladině významnosti 5 %i iV tabulce 7 jsou shrnuty hmotnosti thymu a sleziny po ..usmrcení krys. Hmotnost thymu a sleziny byla u 2. skupiny,: ikterá byla vystavena stresu, nižší než u 1. skupiny, která .nebyla vystavena stresu. Hmotnost thymu a sleziny u 3. iskupiny, které byly podávány tripeptidy, je mírně větší než u 2. skupiny, které byl podáván fyziologický roztok.:

•ft ·· ·· • · · · · · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · • ·· ·· ·· i- 21

Tabulka 7\

Experimentální skupiny	Hmotnost thymu (mg)	Hmotnost sleziny (mg)
1.- nevystavena stresu, podáván fyziologický roztok	433	769
2.- vystavena stresu, podáván fyziologický roztok	202*	453*
3.- vystavena stresu, podáván VPP a IPP	226*	495*

* významný rozdíl oproti 1. skupině na hladině významnosti; 5 % !Reakce na mitogen u slezinných buněk je shrnuta v Tabulce 8. Produkce interleukínu 2 u slezinných buněk je; íshrnuta v tabulce 9. U 2. skupiny, která byla vystavena ,stresu, bylo prokázáno, že se snižuje reakce na mitogen ai produkce interleukínu 2 ve srovnání s 1. skupinou, která , _;nebyla vystavena stresu. Naproti tomu bylo prokázáno, že u) !3. skupiny, které byly podávány tripeptidy, vzrůstá reakce ,na mitogen a produkce interleukínu 2 ve srovnání s 2/ jskupinou, které byl podáván fyziologický roztok.

Tabulka 8;

Experimentální skupiny	Reakce na mitogen ConA PWM
1.- nevystavena stresu, podáván fyziologický roztok	1,91	1,45
2.- vystavena stresu, podáván fyziologický roztok	1,56*	1,26*
3.- vystavena stresu, podáván VPP a IPP	1,80#	1,37#

* významný rozdíl oproti 1. skupině na hladině významnosti; 5 % .# významný rozdíl oproti 2. skupině na hladině významnosti; |5 %

Tabulka 9;

Experimentální skupiny	Produkce interleukinu 2 (Jednotek/ml)
1.- nevystavena stresu, podáván fyziologický roztok	6094
2.- vystavena stresu, podáván fyziologický roztok	4431
3.- vystavena stresu, podáván VPP a IPP	7086#

# významný rozdíl oproti 2. skupině na hladině významnosti': 10 %

ÍTyto výsledky potvrzují, že podávání IPP a VPP může , .potlačit pokles ukazatelů imunologických funkcí vyvolaných; ístresem, jako je změna v rovnováze krevních aminokyselin i(Fischerův poměr), atrofie fhymu a sleziny a pokles reaktivity slezinných buněk.)

2£Ο€>-^23

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY)

11. Prostředek proti stresu vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou složku tripeptid a/nebo jeho!

(sůl mající inhibiční účinek na enzym konvertující angiotenzin.!

12. Prostředek proti stresu podle nároku 1, vyznačující se tím, že tímto tripeptidem je Ile-Pro-Pro a/nebo!

!Va 1-Pro-Pro.

(3. Použití tripeptidu a/nebo jeho soli mající

Únhibiční účinek na enzym konvertující angiotenzin pro!

(výrobu prostředku proti stresu.
4. Potraviny mající antistresový účinek, vyznačující se!

(tím, že pbsahují prostředek proti stresu podle nároku 1.( (
5. Použití tripeptidu a/nebo jeho soli mající inhibiční účinek na enzym konvertujeící angiotenzin pro!

'(výrobu potravin majících antistresový účinek.
6. Způsob výroby potravin majících antistresový!

(účinek podle nároku 4, vyznačující se tím, že , zahrnuje fermentaci média obsahujícího peptid a/nebo!

(protein obsahující sekvenci Ile-Pro-Pro a/nebo Val-Pro-Pro , za přítomnosti bakterií mléčného kvašení za podmínek, které!

(jsou vhodné, aby ve fermentačním médiu byl produkován tripeptid Ile-Pro-Pro a/nebo Val-Pro-Pro.!

(7. Způsob snížení stresu, vyznačující se tím, že zahrnuje orální aplikaci účinného množství!

'(tripeptidu a/nebo jeho soli mající inhibiční účinek na enzym konvertující angiotenzin.!