BR112019021036A2 - Nova cepa com atividade de reduzir produtos finais de gicação avançada, composição, produto fermentado, método para inibir produtos finais de glicação avançada - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se a uma nova cepa com a atividade de reduzir produtos finais da glicação avançada e seu uso, mais particularmente, a uma cepa de lactococcus lactis kf140 (número de acesso kccm11673p), uma cepa de bacillus subtilis kf11 (número de acesso kccm11981p), uma cepa de lactobacillus pentosus kf8 (número de acesso kccm11997p) ou uma cepa de lactobacillus paracasei kf00816 (número de acesso kccm11998p), que são todas cepas novas; um lisado do mesmo; ou uma composição de alimento com a atividade de reduzir produtos finais de glicação avançada e uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença causada por produtos finais de glicação avançada, cada composição compreendendo uma cultura da cepa como ingrediente ativo. além disso, a presente invenção refere-se a uma composição para controle de funções intestinais, uma composição probiótica, uma composição de alimentação e um produto fermentado, cada um dos quais compreende a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo como um ingrediente ativo.
Description
NOVA CEPA COM A ATIVIDADE DE REDUZIR PRODUTOS FINAIS DE GLICAÇÃO AVANÇADA, COMPOSIÇÃO, PRODUTO FERMENTADO, MÉTODO PARA INIBIR PRODUTOS FINAIS DE GLICAÇÃO AVANÇADA E USO DA COMPOSIÇÃO Área técnica
[001] A presente invenção refere-se a uma nova cepa tendo a atividade de reduzir produtos finais de glicação avançada e uma utilização dos mesmos.
Antecedentes
[002] A reação da glicação não enzimática de proteínas refere-se à reação de Maillard que ocorre entre um grupo de aminoácidos de uma proteína, como resíduo de lisina, e um açúcar redutor sem ação enzimática, o que leva à formação de produtos finais da glicação avançada (AGEs). A reação de glicação não enzimática de proteínas é uma reação na qual um grupo amino livre de uma proteína, como lisina ou arginina, reage com um grupo carbonil de um açúcar redutor para formar um produto inicial da reação de glicação, a base Schiff e os compostos formados a partir dele continuamente produzir um composto marrom (melanoidina) através de uma série de reações complexas, como condensação, rearranjo, oxidação, divagem, ciclização, o que leva à formação de produtos finais de glicação avançada irreversível em conceito geral.
[003] O produto final da glicação avançada é um produto de reação irreversível. Portanto, mesmo que o nível de glicose no sangue seja recuperado normalmente, o produto formado uma vez não é decomposto e se acumula nos tecidos durante a vida útil da proteína, resultando em uma alteração anormal da estrutura e função dos tecidos. A reação de glicação ocorre facilmente em um
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2/44 colágeno com meia-vida relativamente longa, e os produtos finais da glicação avançada formados formam uma ligação cruzada com um colágeno para resultar em uma alteração físico-química anormal da estrutura do corpo, outras proteínas do tecido conjuntivo, e similar. Além disso, é reconhecido por um receptor específico para vários tipos de células, o que leva à causa de doenças, como diabetes, complicações do diabetes, como retinopatia diabética, neuropatia diabética, catarata diabética, nefropatia diabética, doença renal crônica, coração doença, doença vascular e envelhecimento.
[004] Portanto, estudos estão em andamento para inibir a produção desses produtos finais de glicação avançada. Um dos produtos farmacêuticos sintéticos representativos é a aminoguanidina, uma hidrazina nucleofílica, que é ligada a um produto de reação de condensação para inibir a produção de produtos finais da glicação avançada, resultando na prevenção do desenvolvimento de complicações. Além disso, a aminoguanidina é o produto farmacêutico mais promissor para a prevenção e tratamento de complicações do diabetes e, portanto, foi estudada em um ensaio clínico de fase 3. No entanto, verificou-se que havia um problema de toxicidade induzido pela administração prolongada de aminoguanidina, o que requer uma necessidade do desenvolvimento de produtos farmacêuticos mais seguros.
[005] Assim, é necessário o desenvolvimento de um novo ingrediente que possa inibir e reduzir os produtos finais da glicação avançada e que não garanta efeitos colaterais ao corpo e à estabilidade humana.
[006] Neste aspecto, a presente invenção foi completada isolando e identificando as novas cepas que podem reduzir
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3/44 notavelmente os produtos finais da glicação avançada e identificando a atividade das novas cepas.
Descrição detalhada da invenção
Problema técnico
[007] É, portanto, um objetivo da presente invenção fornecer uma nova cepa com a atividade de reduzir produtos finais da glicação avançada (AGEs), caracterizada por ser selecionada do grupo que consiste em uma cepa de Lactococcus lactís KF140 (número de acesso KCCM11673P), um Bacillus subtilis KF11 (número de acesso KCCM11981P), uma cepa de Lactobacillus pentosus KF8 (número de acesso KCCM11997P) e uma cepa de Lactobacillus paracasei KF00816 (número de acesso KCCM11998P).
[008] É outro objetivo da presente invenção fornecer uma composição alimentar com a atividade de reduzir produtos finais da glicação avançada, compreendendo a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo como ingrediente ativo.
[009] É outro objetivo da presente invenção fornecer uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença relacionada a produtos finais da glicação avançada, compreendendo a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo como ingrediente ativo.
[010] É outro objetivo da presente invenção fornecer uma composição para regulação intestinal, compreendendo a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo como ingrediente ativo.
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[Oil] É outro objetivo da presente invenção fornecer uma composição probiótica compreendendo a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo como ingrediente ativo.
[012] É outro objetivo da presente invenção fornecer uma composição de alimentação que compreende a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo como ingrediente ativo.
[013] É outro objetivo da presente invenção fornecer um produto fermentado compreendendo a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo como ingrediente ativo.
[014] Além disso, é outro objetivo da presente invenção fornecer um método para inibir produtos finais da glicação avançada, utilizando a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo.
Solução para o Problema
[015] A presente invenção fornece uma nova cepa com a atividade de reduzir produtos finais da glicação avançada (AGEs), caracterizada por ser selecionada do grupo que consiste em uma cepa de Lactococcus lactís KF140 (número de acesso KCCM11673P), um Bacillus subtilis KF11 (número de acesso KCCM11981P), uma cepa de Lactobacillus pentosus KF8 (número de acesso KCCM11997P) e uma cepa de Lactobacillus paracasei KF00816 (número de acesso KCCM11998P).
[016] Em uma forma de realização da presente invenção, os produtos finais da glicação avançada (AGEs) como descrito acima
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5/44 podem ser produtos finais de glicação avançada não fluorescentes.
[017] Além disso, a presente invenção fornece uma composição de alimentos com a atividade de reduzir produtos finais da glicação avançada, compreendendo a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo como ingrediente ativo.
[018] Em uma forma de realização da presente invenção, a composição acima pode prevenir ou melhorar diabetes, doença renal crônica, doença cardíaca, doença vascular, retinopatia diabética, neuropatia diabética, catarata diabética ou nefropatia diabética, que pode ser causada por produtos finais da glicação avançada.
[019] Além disso, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença relacionada a produtos finais da glicação avançada, compreendendo a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo como ingrediente ativo.
[020] Em uma forma de realização da presente invenção, a doença acima pode ser selecionada do grupo que consiste em diabetes, doença renal crônica, doença cardíaca, doença vascular, retinopatia diabética, neuropatia diabética, catarata diabética e nefropatia diabética.
[021] Além disso, a presente invenção fornece uma composição para regulação intestinal, compreendendo a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo como ingrediente ativo.
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[022] Além disso, a presente invenção fornece uma composição probiótica compreendendo uma nova cepa, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo como ingrediente ativo.
[023] Além disso, a presente invenção fornece uma composição de alimentação que compreende a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo como ingrediente ativo.
[024] Além disso, a presente invenção fornece um produto fermentado compreendendo a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo como ingrediente ativo.
[025] Além disso, a presente invenção fornece um método para inibir produtos finais da glicação avançada, utilizando a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo.
Efeito da invenção
[026] A presente invenção tem isolado e identificado um Lactococcus lactis (número de acesso KCCM11673P) cepa KF140, um Bacillus subtílís KF11 (número KCCM11981P adesão) cepa, um Lactobacillus pentosus KF8 (número de acesso KCCM11997P) cepa, e um Lactobacillus paracasei KF00816 (número de acesso KCCM11998P) cepa, que são todos novos, e a presente invenção investigou um novo uso dessas cepas. A cepa acima isolada e identificada na presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo tem a atividade de reduzir efetivamente os produtos finais de glicação avançada. Portanto, existe o efeito de poder ser utilizado na preparação de um alimento funcional e de um produto farmacêutico para prevenir ou tratar uma doença causada por produtos finais de glicação avançada e, além disso, pode ser
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7/44 utilizado na preparação de uma composição para produtos intestinais, regulação, uma composição probiótica, uma composição alimentar e um produto fermentado.
Breve descrição dos desenhos
[027] A Fig. 1 mostra os produtos probióticos comercialmente disponíveis usados como um grupo de controle em um exemplo da presente invenção.
[028] A Fig. 2 mostra o resultado da análise comparativa da atividade de redução da LMC, em que uma cepa de Lactococcus lactís KF140 da presente invenção e outras bactérias de ácido láctico são usadas como sujeito.
[029] A Fig. 3 mostra o resultado da análise comparativa da atividade de redução de LMC, em que uma cepa de Bacillus subtilis KF11 da presente invenção e outras bactérias de ácido lático são usadas como sujeito.
[030] A Fig. 4 mostra o resultado da análise comparativa da atividade de redução de LMC, em que uma cepa de Lactobacillus paracasei KF00816 da presente invenção e outras bactérias de ácido lático são usadas como sujeito.
[031] A Fig. 5 mostra o resultado da análise comparativa da atividade de redução de LMC, em que uma cepa de Lactobacillus pentosus KF8 da presente invenção e outras bactérias de ácido lático são usadas como sujeito.
[032] A Fig. 6 mostra o resultado da análise da atividade de redução da LMC dos produtos probióticos disponíveis comercialmente.
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[033] A Fig. 7 mostra o resultado da análise comparativa da atividade de redução de LMC para a forma padrão de LMC e as novas cepas isoladas e identificadas na presente invenção.
[034] A Fig. 8 mostra o resultado da análise do efeito da redução da LMC no sangue de acordo com a ingestão da nova cepa da presente invenção, em que camundongos que ingerem um alimento com alta LMC são usados como sujeito.
Melhor Forma de Realização Para Trabalhar a Invenção
[035] A presente invenção é caracterizada por isolar e identificar uma cepa de Lactococcus lactís KF140 (número de acesso KCCM11673P), uma cepa de Bacillus subtilis KF11 (número de acesso KCCM11981P), uma cepa de Lactobacillus pentosus KF8 (número de acesso KCCM11997P) e uma cepa de Lactobacillus paracasei KF00816 (número de acesso KCCM11998P), que são todos novos, e a presente invenção primeiro investigou sua atividade de inibir a produção de produtos finais de glicação avançada.
[036] O produto final de glicação avançada é um produto de reação irreversível. Portanto, mesmo que o nível de glicose no sangue seja recuperado normalmente, o produto formado uma vez não é decomposto e se acumula nos tecidos durante a vida da proteína, resultando em uma alteração anormal da estrutura e função dos tecidos, o que leva à causa de várias doenças, tais como a diabetes, complicações da diabetes, doença renal crônica, doença cardíaca, doença vascular, ou envelhecimento. Portanto, várias doenças derivadas de produtos finais de glicação avançada podem ser prevenidas, melhoradas ou tratadas inibindo ou reduzindo a produção de produtos finais de glicação avançada.
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[037] Enquanto isso, um tipo de produto final de glicação avançada inclui substâncias fluorescentes, como pentosidina ou argpirimidina, e substâncias não fluorescentes, como Ncarboximetil-lisina (CML), N-carboxieltil-lisina (CEL). Até agora, estudos têm se relacionado principalmente a produtos finais de glicação avançada de substâncias fluorescentes, como pentosidina ou argpirimidina.
[038] Assim, os presentes inventores isolaram e identificaram uma nova cepa que pode inibir efetivamente a produção de produtos finais de glicação avançada não fluorescente enquanto estudavam para encontrar um novo material que podia efetivamente inibir produtos finais de glicação avançada não fluorescente e os presentes inventores confirmaram que essas cepas têm a atividade de inibir produtos finais de glicação avançada não fluorescentes.
[039] Como uma nova cepa com a atividade de inibir a produção de produtos finais de glicação avançada, que foi isolada e identificada na presente invenção, os presentes inventores isolaram e identificaram uma cepa de Lactococcus lactís KF140 e a depositaram no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (KCCM), que é uma autoridade depositária internacional e foi atribuído um número de acesso KCCM 11673P; isolaram e identificaram uma cepa de Bacillus subtílís KF11 e a depositaram em 24 de fevereiro de 2017, no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (KCCM), que é uma autoridade depositária internacional, e foi atribuído um número de acesso KCCM 11981P; isolaram e identificaram uma cepa de Lactobacillus paracasei KF00816 e a depositaram em 24 de março de 2017, no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), que é uma autoridade
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10/44 depositária internacional, e foi atribuído um número de acesso KCCM 11998P; isolaram e identificaram uma cepa de Lactobacillus pentosus KF8 e a depositaram em 24 de março de 2017, no Centro de Cultura Coreana de Microrganismos (KCCM), que é uma autoridade depositária internacional, e foi atribuído um número de acesso KCCM 11997P.
[040] Além disso, a fim de analisar a atividade de redução de produtos finais de glicação avançada das novas cepas isoladas e identificadas na presente invenção, os presentes inventores trataram as amostras contendo produtos finais de glicação avançada com cada uma das novas cepas da presente invenção e a comparação cepas e, em seguida, mediram o conteúdo de produtos finais de glicação avançada no meio de cultura. O resultado indicou que as novas cepas da presente invenção mostraram o efeito notavelmente melhor da redução de produtos finais de glicação avançada, em comparação com as cepas convencionais pertencentes ao mesmo gênero e os produtos probióticos disponíveis comercialmente.
[041] Além disso, os presentes inventores revalidaram o efeito de reduzir os produtos finais de glicação avançada da cepa acima através de experiências com animais, em que o alimento contendo CML, um dos produtos finais de glicação avançada não fluorescente, e camundongos machos com 6 semanas de idade o ingeriram, e a concentração de CML no sangue foi medida no indivíduo que ingeriu a nova cepa identificada na presente invenção e no grupo que não ingeriu a nova cepa.
[042] O resultado confirmou que o teor de CML em sangue foi notavelmente reduzido no grupo ingestão de cada um dos um
Lactococcus lactis (número de acesso KCCM11673P) cepa KF140, um
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Bacillus subtilis KF11 (número de acesso KCCM11981P) cepa, um Lactobacillus pentosus KF8 (número de acesso KCCM11997P) ou uma cepa de Lactobacillus paracasei KF00816 (número de acesso KCCM11998P), que é a nova cepa da presente invenção, em comparação com o grupo que não ingeriu a nova cepa.
[043] Assim, os presentes inventores descobriram que as novas cepas isoladas e identificadas no presente invento podem ser utilmente utilizadas para preparar vários produtos para reduzir produtos finais da glicação avançada.
[044] Portanto, a presente invenção pode fornecer um Lactococcus lactis (número de acesso KCCM11673P) cepa KF140, um Bacillus subtilis KF11 (número de acesso KCCM11981P) cepa, um Lactobacillus pentosus KF8 (número de acesso KCCM11997P) cepa, ou um Lactobacillus paracasei KF00816 (número de acesso KCCM11998P) cepa, que é a nova variedade. Além disso, a presente invenção pode fornecer uma composição alimentar com a atividade de reduzir produtos finais de glicação avançada, compreendendo a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo como ingrediente ativo.
[045] Na presente invenção, os produtos finais de glicação avançada descritos acima são produtos finais de glicação avançada não fluorescentes, em que os produtos finais de glicação avançada não fluorescentes podem incluir N-carboximetil-lisina (CML) ou N-carboxietil-lisina (CEL).
[046] A composição alimentar da presente invenção inclui todas as formas de alimento funcional, suplemento nutricional, alimento natural, aditivos alimentares, etc. A composição alimentar do tipo acima pode ser fabricada de várias formas, de
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12/44 acordo com os métodos convencionais conhecidos na técnica. Por exemplo, como alimento natural, pelo menos um do grupo da nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo e uma cultura da cepa acima podem ser embebedados pela fabricação em forma de chá, suco e bebida, e pode ser ingerido por granulação, encapsulamento e pulverização. Além disso, pelo menos um do grupo da nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo, e uma cultura do mesmo podem ser fabricados na forma de uma composição por mistura com uma substância conhecida ou um ingrediente ativo conhecido por ter o efeito de reduzindo produtos finais de glicação avançada. Além disso, um alimento funcional pode ser fabricado adicionando pelo menos um do grupo da nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo e uma cultura do mesmo a bebidas (incluindo bebidas alcoólicas), frutas e seus alimentos processados (por exemplo , uma fruta enlatada, uma fruta engarrafada, geleia, geleia, etc.), peixe, carne e seus alimentos processados (por exemplo, presunto, carne enlatada, etc.), pães e macarrão (por exemplo, udon, macarrão de trigo sarraceno) , ramen, espaguete, macarrão, etc.), suco de frutas, bebidas diversas, biscoitos, caramelo, laticínios (por exemplo, manteiga, queijo, etc.), óleo e gordura vegetal comestível, margarina, proteína vegetal, retorta, congelados comida, vários temperos (por exemplo, pasta de feijão, molho de soja, molho, etc.), etc.
[047] O teor preferível da nova cepa da presente invenção, um lisado e uma cultura da mesma, etc. na composição alimentar da presente invenção é de 0,01 a 50% em peso em um alimento finalmente fabricado, mas não limitado a ele. Além disso, para usar na forma de aditivos alimentares, pelo menos um selecionado
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13/44 do grupo que consiste na nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo e uma cultura do mesmo como ingrediente ativo pode ser fabricado na forma de pó ou concentrado.
[048] Além disso, a presente invenção pode fornecer uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença causada por produtos finais de glicação avançada, compreendendo uma cepa de Lactococcus lactís KF140 (número de acesso KCCM11673P), uma cepa de Bacillus subtilis KF11 (número de acesso KCCM11981P), uma cepa de Lactobacillus pentosus Cepa KF8 (número de acesso KCCM11997P) , ou uma cepa Lactobacillus paracasei KF00816 (número de acesso KCCM11998P), que são as novas cepas da presente invenção; um lisado do mesmo; ou uma cultura da mesma como ingrediente ativo, em que a doença acima pode incluir, mas não está limitada a, diabetes, doença renal crônica, doença cardíaca, doença vascular, retinopatia diabética, neuropatia diabética, catarata diabética e nefropatia diabética.
[049] Com relação à retinopatia diabética descrita acima, de acordo com o resultado da pesquisa relatada, no caso de retinopatia diabética, verificou-se que o nível de expressão da LMC aumenta mais do que o nível normal ao comparar o nível de LMC de pacientes com retinopatia diabética e o nível de LMC de pessoas normais, e a LMC pode ser direcionada para agentes terapêuticos da retinopatia diabética. É relatado que a retinopatia diabética pode ser tratada pela inibição da LMC.
[050] Além disso, sabe-se que o nível de LMC em pacientes com catarata diabética aumenta mais alto do que o nível de LMC em pacientes com catarata não diabética. Verificou-se que a LMC é a principal causa de catarata diabética. O nível de LMC aumenta
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14/44 quando ocorre uma doença nefropática diabética. Assim, sabe-se que a LMC é um fator que causa uma doença nefropatia diabética.
[051] Além disso, verificou-se que o nível de LMC aumenta mais quando comparado ao nível normal, quando ocorre doença renal crônica. Assim, sabe-se que o nível aumentado de LMC pode ser usado como um fator que indica uma ocorrência de doença renal crônica, e o inibidor da LMC pode ser um agente terapêutico da doença renal crônica.
[052] Além disso, sabe-se que a LMC é um fator de risco para neuropatia diabética. No resultado da pesquisa, é relatado que o nível de LMC de pacientes com neuropatia diabética aumenta notavelmente em comparação com o nível de LMC de pacientes normais.
[053] Portanto, essas doenças podem ser tratadas inibindo produtos finais de glicação avançada não fluorescentes, como a LMC.
[054] A composição farmacêutica da presente invenção pode conter apenas um sal farmaceuticamente aceitável ou ainda pode conter pelo menos um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável. Um veículo farmaceuticamente aceitável pode incluir, por exemplo, um veículo para administração oral ou um veículo para administração parentérica. Um veículo para administração oral pode incluir lactose, amido, derivados de celulose, estearato de magnésio, ácido esteárico, etc. Além disso, um veículo para administração parenteral pode incluir água, óleo adequado, solução salina, glicose aquosa, glicol, etc., e pode ainda incluem um estabilizador e um conservante. Um estabilizador adequado inclui um antioxidante,
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15/44 como hidrogenossulfito de sódio, sulfito de sódio ou ácido ascórbico. Um conservante adequado inclui cloreto de benzalcônio, metil- ou propil-parabeno e clorobutanol. Outro veiculo farmaceuticamente aceitável pode ser referido ao descrito na literatura seguinte (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995) .
[055] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por qualquer método a um mamífero incluindo um humano. Por exemplo, pode ser administrado por via oral ou parentérica. Um método de administração parenteral inclui, mas não está limitado a administração intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intracardíaca, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, intestinal, tópica, sublingual ou intracolônica. De preferência, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por via oral ou por via transdérmica.
[056] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulada em uma formulação para administração oral ou em uma formulação para administração parentérica pela via de administração, como descrito acima.
[057] No caso de uma formulação para administração oral, a composição da presente invenção pode ser formulada utilizando os métodos conhecidos na técnica em pó, grânulos, comprimidos, pílulas, comprimidos revestidos com açúcar, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões , etc. Por exemplo, uma formulação para administração oral pode ser obtida como comprimidos ou drágeas misturando um ingrediente ativo com um excipiente sólido, moendo-os, adicionando um adjuvante adequado e depois processando em uma mistura de grânulos. Exemplos de
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16/44 excipientes adequados podem incluir açúcares, como lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, etc., amidos, como amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, etc., celulose, como celulose, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, hidroxipropilmetilcelulose, etc., cargas como gelatina, polivinilpirrolidona, etc. Além disso, em alguns casos, polivinilpirrolidona reticulada, ágar, ácido alginico, alginato de sódio, etc. podem ser adicionados como um desintegrante. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode ainda compreender anticoagulantes, lubrificantes, agentes umectantes, agentes aromatizantes, emulsificantes, anti-sépticos, etc.
[058] A formulação para administração parentérica pode ser formulada na forma de injeções, cremes, loções, pomadas externas, óleos, hidratantes, géis, aerossóis e inaladores nasais, usando os métodos conhecidos na técnica. Estas formulações encontram-se descritos na literatura (Pharmaceutical Science de Remington, 15a Edição, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Capítulo 87: Blaug, Seymour), que é um formulário geralmente conhecido por todos os produtos farmacêuticos e química.
[059] A quantidade efetiva total da nova cepa da presente invenção, seu lisado e uma cultura da cepa acima, etc., podem ser administradas a um paciente como uma dose única e podem ser administradas por protocolo de tratamento fracionado, que é uma administração a longo prazo de doses múltiplas. A composição farmacêutica da presente invenção pode variar o conteúdo do ingrediente ativo, dependendo da gravidade da doença. A dose total preferida da cepa da presente invenção, um lisado do mesmo
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17/44 e uma cultura do mesmo pode ser de cerca de 0,01 a 1.000 mg, mais preferencialmente de 0,1 a 100 mg por 1 kg de peso corporal do paciente por dia. No entanto, a dose da cepa da presente invenção em si, um lisado do mesmo e uma cultura da cepa acima, etc., é determinada mediante consideração de vários fatores, como idade do paciente, peso, condição de saúde, sexo, gravidade de doenças, dieta, taxa de excreção, etc., bem como vias de administração da composição farmacêutica e o número de vezes em tratamento, para determinar a dosagem eficaz para o paciente. Assim, ao considerar tais aspectos, uma pessoa versada na técnica seria capaz de determinar uma dosagem eficaz apropriada de acordo com o uso certo da cepa da presente invenção, um lisado do mesmo e uma cultura do mesmo como um sistema imunológico potenciador. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção não está particularmente limitada às formulações, vias de administração e métodos de administração, desde que o efeito da presente invenção mostre.
[060] Além disso, a presente invenção fornece uma composição para regulação intestinal, uma composição probiótica, uma composição alimentar, compreendendo pelo menos um selecionado do grupo que consiste na nova cepa, um lisado do mesmo e uma cultura do mesmo como ingrediente ativo. A nova cepa da presente invenção é uma cepa com a atividade de reduzir produtos finais de glicação avançada e, portanto, pode ser usada para melhorar a saúde de humanos e animais, isto é, como uma composição para regulação intestinal, uma composição probiótica ou uma composição de alimentação. A composição acima pode compreender a própria cepa acima, um lisado do mesmo e uma cultura da cepa acima, etc., como ingrediente ativo, e pode ainda compreender um excipiente
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18/44 ou um veiculo. A composição acima inclui um meio de cultura em si cultivado em um meio líquido, um filtrado (sobrenadante centrifugado) , em que uma cepa é removida por filtração ou centrifugação do meio de cultura acima, etc. 0 conteúdo da cepa da presente invenção na composição pode variar dependendo do uso e formulação da composição.
[061] A composição para regulação intestinal ou a composição probiótica de acordo com a presente invenção pode ser preparada e administrada em várias formulações e métodos. Por exemplo, a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo e uma cultura do mesmo podem ser preparadas e administradas na forma de comprimidos, trociscos, cápsulas, elixires, xaropes, pós, suspensões, grânulos, etc., misturando-se com veículos e agentes aromatizantes convencionalmente utilizados no campo farmacêutico.
[062] Ligantes, deslizantes, desintegrantes, excipientes, solubilizadores, dispersantes, estabilizadores, agentes de suspensão, etc. podem ser usados como transportador. A maneira de administração pode usar o método oral, parenteral ou de aplicação, e a administração oral é preferida. Além disso, a dosagem pode ser adequadamente selecionada, dependendo da taxa de absorção, da taxa de inativação e da velocidade de excreção do ingrediente ativo no corpo, da idade da pessoa administrada, do sexo, da condição etc. Além disso, a composição da alimentação de acordo com para a presente invenção pode ser preparado na forma de um alimento fermentado, um alimento de fórmula, uma forma de pellet, uma silagem, etc.
[063] A alimentação fermentada acima pode ser preparada fermentando o material orgânico adicionando a nova cepa da
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19/44 presente invenção e várias cepas ou enzimas microbianas, e a alimentação da fórmula acima pode ser preparada misturando a cepa da presente invenção com vários tipos de alimentação. A alimentação na forma de grânulos pode ser preparada formulando a ração fermentada acima ou a fórmula alimentada com granulador, e a silagem pode ser preparada fermentando a forragem verde com a cepa de acordo com a presente invenção.
[064] Além disso, a presente invenção fornece um produto fermentado compreendendo pelo menos um selecionado do grupo que consiste na nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo e uma cultura do mesmo como ingrediente ativo. O método de preparação do produto fermentado consiste tipicamente nas etapas de preparação da matéria-prima, adição de bactérias do ácido lático, fermentação, recuperação do produto acabado, etc. A etapa de preparação da matéria-prima é uma etapa da preparação de um material que está sujeito a fermentação e a preparação das condições de fermentação de modo que a fermentação seja bem executada. A adição de bactérias do ácido láctico é a adição de uma quantidade adequada de bactérias de acordo com a quantidade do sujeito da fermentação, em que na presente invenção, é caracterizada por a nova cepa da presente invenção ser usada. A fermentação deve ser realizada de acordo com as condições convencionais de fermentação das bactérias da fermentação, em que é realizada preferencialmente a 37°C a 43°C por 4 a 168 horas. A recuperação do produto acabado inclui todos os processos habituais de processamento para facilitar o armazenamento, transporte, embalagem, etc., além de remover os subprodutos indesejáveis ou os materiais não fermentados dos fermentos. O produto fermentado preparado seguindo o método descrito acima
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20/44 pode ser de preferência uma bebida, em que a bebida se refere, por exemplo, ao produto preparado cultivando a cepa da presente invenção para sujeitá-la a fermentação com ácido lático, diluindo-a adicionando água esterilizada adicionando açúcares, agentes aromatizantes etc. e depois enchendo um recipiente com os mesmos. Como a bebida geralmente contém bactérias do ácido láctico que estão vivas, pode-se esperar a atividade de controlar as funções intestinais no intestino após beber.
[065] Além disso, a presente invenção pode fornecer um método para inibir produtos finais de glicação avançada, usando a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo. O método acima de acordo com a presente invenção pode incluir as etapas de tratamento de uma amostra contendo produtos finais de glicação avançada com a nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura da mesma, em que o conteúdo de produtos finais da glicação avançada dos itens acima a amostra pode ser reduzida através das etapas.
[066] Além disso, o método acima pode incluir as etapas de administração da nova cepa da presente invenção, um lisado do mesmo ou uma cultura do mesmo para um sujeito em necessidade do mesmo, em que o sujeito acima pode ser um mamífero incluindo um humano.
[067] Na presente invenção, o conteúdo de produtos finais de glicação avançada no soro de camundongo pode ser reduzido alimentando-o com uma dieta contendo a nova cepa da presente invenção.
Melhor método para trabalhar a invenção
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[068] A seguir, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos seguintes exemplos. Pretende-se que estes exemplos ilustrem a presente invenção em mais detalhes e o escopo da presente invenção não se limite a esses exemplos.
<Exemplo 1>
Isolamento e identificação de uma nova cepa com atividade de redução de produtos finais de glicação avançada <1-1> Isolamento e identificação de um Lactococcus lactis KF140, uma nova cepa
[069] Os presentes inventores realizaram as seguintes experiências, a fim de isolar a nova cepa tendo a atividade de reduzir os produtos finais de glicação avançada do kimchi. O Kimchi foi suspenso em solução salina fisiológica a 0,85%, uma parte da suspensão foi banhada em meio sólido MRS e, em seguida, foi cultivada a 37 °C. As colônias formadas após a cultura foram colhidas, elas foram cultivadas por raias em um meio MRS, e as colônias únicas puras não contaminadas foram obtidas. A análise de sequenciamento foi realizada após o isolamento do rDNA 16S da cepa obtida.
[070] Como resultado da análise de sequenciamento, uma vez que a sequência base do rDNA 16s da cepa acima mostrou uma homologia de 99% com a cepa convencional Lactococcus lactis NCDO604 (T) , a cepa identificada na presente invenção foi considerada uma cepa pertencente a Lactococcus lactis, em que a sequência base do 16s rDNA foi mostrada na SEQ ID NO: 1. Depois disso, a cepa isolada foi cultivada usando um meio MRS, em que a condição de cultura era pH 6,5 ±0,2, temperatura 37°C e 48 horas estacionárias cultura e necessidade de oxigênio era
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22/44 anaeróbio facultativo, a cepa foi preservada através da preservação por liofilização ou congelamento por suspensão celular. Posteriormente, os presentes inventores designaram a cepa isolada como um Lactococcus lactís KF140, que foi depositado no Centro de Cultura Coreano de Microorganismos (KCCM), uma autoridade depositária internacional e um número de acesso KCCM 11673P.
<l-2> Isolamento e identificação de Bacillus subtilis KF11, uma nova cepa
[071] As seguintes experiências foram realizadas a fim de isolar a nova cepa tendo a atividade de reduzir produtos finais de glicação avançada a partir da pasta de feijão. A pasta de feijão foi suspensa em solução salina fisiológica a 0,85%, uma parte da suspensão foi banhada em meio sólido TSB e, em seguida, foi cultivada a 37 °C. As colônias formadas após a cultura foram colhidas, elas foram cultivadas em meio de TSB e as colônias únicas puras não contaminadas foram obtidas. A análise de sequenciamento foi realizada após o isolamento do rDNA 16S da cepa obtida.
[072] Como resultado da análise de seqüenciamento, uma vez que a sequência base do rDNA 16s da cepa acima mostrou uma homologia de 99% com a cepa convencional Bacillus subtilis KCTC 13429 (T) , a cepa identificada na presente invenção foi considerada uma cepa pertencente a um Bacillus subtilis, em que a sequência base de 16s rDNA foi mostrada na SEQ ID NO: 2. Depois disso, a cepa isolada foi cultivada usando um meio TSB sob a condição de cultura de pH 7,0 ±0,2, temperatura 37°C e 24 horas com agitação, a necessidade de oxigênio era anaeróbio
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23/44 facultativo e a cepa foi preservada através da preservação por liofilização ou congelamento por suspensão celular.
[073] Posteriormente, os presentes inventores designaram a cepa isolada como Bacillus subtilis KF11, que foi depositada no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (KCCM), uma autoridade depositária internacional, em 24 de fevereiro de 2017, e um número de acesso KCCM 11 981 P foi fornecido.
<l-3> Isolamento e identificação de um Lactobacillus paracasei KF00816
[074] Uma cepa de Lactobacillus paracasei KF00816 foi isolada a partir do kimchi e identificada, em que o kimchi preparado de maneira tradicional foi suspenso em solução salina fisiológica a 0,85%, uma parte da suspensão foi banhada em meio sólido MRS e, em seguida, foi cultivada a 37 ° C. As colônias formadas após a cultura foram colhidas, elas foram cultivadas por raias em um meio MRS, e as colônias únicas puras não contaminadas foram obtidas. A análise de sequenciamento foi realizada após o isolamento do rDNA 16S da cepa obtida.
[075] Como resultado da análise, uma vez que a sequência base do rDNA 16s da cepa acima mostrou uma homologia de 99% com o Lactobacillus paracasei ATCC 25302 (T) convencional, a cepa identificada na presente invenção foi considerada uma cepa pertencente a uma Lactobacillus paracasei, em que a sequência de bases analisada do rDNA 16s foi mostrada na SEQ ID NO: 3. Depois disso, a cepa isolada foi cultivada usando um meio MRS, em que a condição de cultura era pH 6,5 ±0,2, temperatura 37°C e 48 horas estacionárias. Na cultura, a necessidade de oxigênio era anaeróbio facultativo e a cepa foi preservada através da
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24/44 preservação por liofilização ou congelamento por suspensão celular.
[076] Posteriormente, os presentes inventores designaram a cepa isolada como um Lactobacillus paracasei KF00816, que foi depositado no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (KCCM), uma autoridade depositária internacional, em 24 de março de 2017, e um número de acesso KCCM 11998P foi fornecido.
<l-4> Isolamento e identificação de uma cepa de Lactobacillus pentosus KF8
[077] Uma cepa de Lactobacillus pentosus KF8 com a atividade de reduzir produtos finais de glicação avançada foi isolada de um molho de soja tradicional, em que o molho de soja tradicional foi suspenso em solução salina fisiológica a 0,85%, uma parte da suspensão foi banhada em meio sólido MRS e, em seguida, foi cultivado a 37°C. As colônias formadas após a cultura foram colhidas, elas foram cultivadas em um meio MRS e as colônias únicas puras não contaminadas foram obtidas. A análise de sequenciamento foi realizada após o isolamento do rDNA 16S da cepa obtida.
[078] Como resultado da análise de sequenciamento, uma vez que a sequência base do rDNA 16s da cepa acima mostrou uma homologia de 97% com o Lactobacillus pentosus DSM 20314 (T) convencional, a cepa identificada na presente invenção foi considerada uma cepa pertencente ao Lactobacillus pentosus, em que a sequência de bases analisada do rDNA 16s foi mostrada na SEQ ID NO: 4. Posteriormente, a cepa isolada foi cultivada usando um meio MRS, em que a condição de cultura era pH 6,5 ± 0,2, temperatura 37°C e 48 horas. Na cultura estacionária, a
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25/44 necessidade de oxigênio era anaeróbia facultativo e a cepa foi preservada através da preservação por liofilização ou congelamento por suspensão celular.
[079] Posteriormente, os presentes inventores designaram a cepa isolada como um Lactobacillus pentosus KF8, que foi depositado no Centro de Cultura Coreano de Microrganismos (KCCM), uma autoridade depositária internacional, em 24 de março de 2017, e um número de acesso KCCM 11997P foi fornecido.
<Exemplo 2>
Análise da eficácia da redução de produtos finais de glicação avançada das novas cepas da presente invenção
[080] Para analisar se cada uma das quatro novas cepas isoladas e identificadas no Exemplo 1 descrito acima tem a eficácia de reduzir produtos finais de glicação avançada, os presentes inventores confirmaram o grau de atividade de redução de produtos finais de glicação avançada contidos no leite pelos métodos a seguir.
<2-l> Preparação de um alimento contendo produtos finais de glicação avançada
[081] O alimento contendo CML foi preparado para analisar se as novas cepas da presente invenção têm a atividade de reduzir uma CML (Νε- (Carboximetil) -L-lisina) , um tipo de produto final de glicação avançada não fluorescente. Ou seja, caseína, proteína do leite e lactose, açúcar do leite, foram usadas para reduzir a LMC produzida durante o processo de tratamento térmico do leite, em que o caseinato de sódio e a D-lactose foram comprados da ES FOOD e da Sigma-Aldrich, respectivamente. Ao considerar uma proporção de caseína para lactose no leite, uma
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26/44 proteína do leite (caseína) e um açúcar do leite (lactose) foram misturados na proporção de 1: 7 e reagiram à temperatura de 140°C por 80 minutos, e foram utilizados para determinar a eficácia redutora de CML da nova cepa da presente invenção. Em que o conteúdo de LMC pela reação de Maillard de caseína e lactose foi de 8,24 pg/mL.
<2-2> Cepa usada para analisar a atividade redutora de CML
[082] A eficácia redutora de CML da nova cepa de acordo com a presente invenção foi analisada usando as outras cepas descritas na Tabela 1 abaixo e os produtos probióticos comercializados como um grupo de controle. As outras cepas usadas como grupo de controle na Tabela 1 abaixo foram compradas no Traditional Food Microorganism Strain Bank, Korea Food Research Institute, os produtos probióticos foram utilizados como produtos disponíveis comercialmente, nos quais os produtos probióticos foram mostrados na Fig. 1. Em Além disso, os meios de cultura das cepas usadas no experimento abaixo foram adquiridos da Difco, um ágar Lactobacilli MRS e um caldo Lactobacilli MRS para cultura de cepas de bactérias do ácido lático, e TSA (ágar tríptico de soja) e TSB (caldo de soja tríptico) foram utilizados como meio de cultura das linhagens do gênero Bacillus. O meio M9 mínimo (célula MB) foi utilizado na cultura para redução da LMC das bactérias do ácido lático e da bactéria Bacillus, em que foram adicionadas glicose de 2 g/L, CaC12 de 0,015 g/L, MgSO4 de 0,5 g/L para preparar ο M9 médio.
[Tabela 1]
| Cepa | Nome da cepa | Meio | Temperatura |
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| Cepa da presente invenção | Lactococcus lactís KF140 | SRA | 37°C |
| Cepa da presente invenção | Bacillus subtilis KF11 | SRA | 37°C |
| Bactérias do ácido lático do grupo controle | Enterococcus faecium KF74216 | SRA | 37°C |
| Enterococcus faecium KF825 | SRA | 37°C | |
| Lactobacillus sklO | SRA | 37°C | |
| Lactobacillus brevis KF877 | SRA | 37°C | |
| Lactobacillus brevis ski | SRA | 37°C | |
| Lactobacillus brevis sk2 | TSA | 37°C | |
| Bacillus subtilis gl2 | TSA | 37°C | |
| Cepa da presente invenção | Lactobacillus pentosus KF8 | SRA | 37°C |
| Bactérias do ácido lático do grupo controle | Lactobacillus pentosus KF448 | SRA | 37°C |
| Lactobacillus pentosus KF480 | SRA | 37°C | |
| Lactobacillus brevis sk2 | SRA | 37°C | |
| Lactobacillus plantarum subsp. p lantarum KF144-1 | SRA | 37°C | |
| Cepa da presente invenção | Lactobacillus paracasei KF00816 | SRA | 37°C |
| Lactobacillus paracasei KF702 | SRA | 37°C |
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| Bactérias do ácido lático do grupo controle | Lactobacillus brevis sk2 | SRA | 37°C |
| Lactobacillus brevis KF877 | SRA | 37°C | |
| Lactobacillus plantarum subsp. p lantarum KF144-1 | SRA | 37°C | |
| 0 grupo de controlo disponíveis comercialmen te probióticos | DR. PROBA BABY (produto comercial-01) | ||
| LACPIDO PREMIUM (produto comercial-02) | |||
| Bactérias lácticas vivas do LACTO-FIT GOLD (produto comercial-03) | |||
| Família ProsLab (produto comercial-04) | |||
| Superbióticos (produto comercial-06) | |||
| Bactérias lácticas PROBIOTICS VSL # 3 (produto comercial-07) | |||
| BIOTICS FORTE (produto comercial- 05) |
<2-3> Análise do conteúdo da CML
[083] Após a cultura das bactérias do ácido lático e dos produtos probióticos da Tabela 1 acima em um meio de cultura contendo CML por 24 horas, a quantidade alterada de Νε(carboximetil) lisina (LMC) foi medida usando o kit CML ELISA (CircuLex, Ina, Nagano, Japão). O sobrenadante ou amostra padrão
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29/44 e o anticorpo monoclonal aduto anti-CML foram adicionados a 96 poços pré-revestidos com CML-BSA e reagiram à temperatura ambiente por 1 hora. Após lavagem quatro vezes com tampão de lavagem, o anticorpo de detecção conjugado com HRP de 100 μΐ foi adicionado e reagiu por 1 hora e depois lavado quatro vezes com tampão de lavagem, e uma solução contendo 100 substratos de 100 μΐ foi adicionada e reagiu sob condições de luz proteção por 20 minutos e, em seguida, foi adicionada uma solução inativa de 100 μΐ, a absorbância foi medida a 450 nm usando um leitor de microplacas e o resultado foi mostrado na tabela abaixo. Em que, o grupo controle negativo (CON; controle) na Tabela 2 abaixo foi o grupo contendo LMC medido pela reação de Maillard acima <2-l> acima, com um conteúdo de 8,24 ug/mL, no qual não foram adicionadas bactérias do ácido lático, e o resultado foi medido com base no conteúdo de CML do grupo de controle negativo de 100% .
[Tabela 2]
| Cepa | Nome da cepa | Conteúdo (Unidade:% controle) | CML de | |
| Nova cepa | da | Lactococcus lactís KF140 | 6.2 | |
| presente | Bacillus subtilis KF11 | 10, 6 | ||
| invenção | Lactobacillus pentosus KF8 | 13, 6 | ||
| Lactobacillus paracasei KF00816 | 20,2 | |||
| Grupo | de | - | 100 | |
| controle | ||||
| negativo |
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| Bactérias do ácido lático do grupo controle | Enterococcus faecíum KF74216 | 76,7 |
| Enterococcus faecíum KF825 | 90, 9 | |
| Lactobacillus sklO | 96, 7 | |
| Lactobacillus brevis KF877 | 69,9 | |
| Lactobacillus brevis ski | 98,5 | |
| Lactobacillus brevis sk2 | 72,4 | |
| Bacillus subtilis gl2 | 63,4 | |
| Lactobacillus pentosus KF448 | 91,1 | |
| Lactobacillus pentosus KF480 | 76,7 | |
| Lactobacillus brevis sk2 | 72,4 | |
| Lactobacillus plantarum subsp. pla ntarum KF144-1 | 93, 0 | |
| Lactobacillus paracasei KF702 | 88,4 | |
| Lactobacillus brevis sk2 | 72,4 | |
| Lactobacillus brevis KF877 | 69,9 | |
| Lactobacillus plantarum subsp. pla ntarum KF144-1 | 93, 0 | |
| Grupo de controle probióticos disponíveis comercialmente | DR. PROBA BABY (produto comercial- 01) | 102,0 |
| LACPIDO PREMIUM (produto comercial-02) | 67,2 | |
| Bactérias lácticas vivas do LACTO- FIT GOLD (produto comercial-03) | 86,0 |
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31/44
| Família ProsLab (produto comercial-04) | 80, 9 | |
| Superbióticos (produto comercial- 06) | 106, 1 | |
| Bactérias lácticas PROBIOTICS VSL # 3 (produto comercial-07) | 104,9 | |
| BIOTICS FORTE (produto comercial- 05) | 100, 9 |
[084] Como resultado da análise, com base no produto da reação de Maillard de caseina e lactose contendo CML em uma concentração de 8,24 ug/mL, que foi preparado para analisar a eficácia de redução da CML no Exemplo <2-l> acima, cada um de ácido lático bactérias da Tabela 1 acima e Fig. 1 foram inoculadas no meio de cultura e, em seguida, o conteúdo de LMC foi medido. O resultado indicou que o conteúdo de CML foi notavelmente reduzido nos grupos inoculados com as novas cepas da presente invenção em comparação com os outros grupos de controle. Este resultado também pode ser encontrado através do resultado das figuras 2 a 6.
<Exemplo 3>
Verificação da eficácia da redução de produtos finais de glicação avançada das novas cepas de acordo com a presente invenção utilizando a forma padrão CML
[085] Através do resultado do exemplo acima, os presentes inventores confirmaram que as novas cepas da presente invenção tinham a eficácia notavelmente excelente de reduzir a CML em
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32/44 comparação com as cepas convencionais e os produtos comerciais com a atividade de reduzir a CML. Consequentemente, para revalidar a eficácia da redução da CML, a Νε-(1-carboximetil)L-lisina (CAS: 5746-04-3), que é o produto final de glicação avançada não fluorescente mais representativo entre os produtos finais de glicação avançada, foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology, e sua atividade redutora foi analisada mais uma vez. Foi utilizada a forma padrão de CML com uma pureza de 99% e a análise de redução de CML foi analisada da mesma maneira que no Exemplo 2 acima.
[086] O resultado da análise, como mostrado na Fig. 7, indicou que o conteúdo de 100% da CML foi notavelmente inibido pelo tratamento das novas cepas da presente invenção, em particular, uma cepa de Lactococcus lactís KF140 mostrou ter a atividade de redução da CML de cerca de 73%, uma cepa de Bacillus subtilis KF11 demonstrou ter alta atividade redutora de CML de cerca de 72%, uma cepa de Lactobacillus paracasei KF00816 demonstrou ter alta atividade de redução de CML de cerca de 75,4% e uma Lactobacillus pentosus KF8 a cepa demonstrou ter alta atividade redutora de CML de cerca de 80%. Portanto, através deste resultado, os presentes inventores reconfirmaram que as novas cepas acima isoladas e identificadas na presente invenção tinham a excelente atividade de redução da CML.
<Exemplo 4>
Análise da eficácia da redução da CML no sangue das novas cepas da presente invenção através de experiências com animais
[087] Além disso, os presentes inventores realizaram as experiências para determinar se reduz diretamente o conteúdo de
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CML no sangue ao usar as novas cepas da presente invenção através de experiências com animais. Para esse fim, os alimentos com alta CML pela reação de Maillard da caseína, um ingrediente proteico incluído no leite, e a lactose, um ingrediente açucarado incluído no leite, foram preparados pelo método descrito no exemplo acima; foram ingeridos por camundongos SD (6 semanas de idade, do sexo masculino) e, em seguida, foi confirmada a alteração do conteúdo de CLM no sangue, em que cada uma das novas cepas da presente invenção foi ingerida em quantidade de 50 mg/kg por uma semana, a alta CML a comida foi ingerida por camundongos em jejum de 12 horas e, após 8 horas, a concentração de LMC no sangue foi medida. Além disso, o grupo que ingeriu apenas alimentos com alto teor de CML e não ingeriu as novas cepas da presente invenção foi usado como grupo de controle negativo.
[Tabela 3]
Resultado do conteúdo de CML no sangue de ratos
| Grupo Experimental | Conteúdo da CML (%) |
| média | |
| Grupo de ingestão de dieta normal (NOR) | 100,00 |
| Grupo de alta ingestão de alimentos com LMC (LMC) | 230.13 |
| Novo grupo de ingestão de cepas KF140 | 155,58 |
| Novo grupo de ingestão de cepas KF00816 | 179,35 |
| Novo grupo de ingestão de cepas KF8 | 87, 11 |
| Novo grupo de ingestão de cepas KF11 | 56, 27 |
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34/44
[088] O resultado da análise, conforme mostrado na Tabela 3 acima e na Fig. 8, confirmou que a concentração de CML no sangue aumentou 2,3 vezes em média no grupo de camundongos que ingeriu alimentos com alto teor de CML apenas em comparação ao grupo de experimentos que não ingeriu o alimento com alta CML, enquanto que o teor de CML no sangue aumentada pela ingestão de alimentos com alta CML foi eficazmente reduzido no grupo que ingeriu KF140, KF00816, KF8 , e KF11, as novas cepas da presente invenção .
[089] Conforme apresentado nos resultados acima, os presentes inventores confirmaram que uma cepa de Lactococcus lactis KF140, a nova cepa isolada e identificada na presente invenção tinha a atividade de reduzir efetivamente os produtos finais de glicação avançada e, portanto, os presentes inventores descobriram que a cepa podería ser útil na preparação de produtos farmacêuticos e alimentos funcionais contra várias doenças causadas por produtos finais de glicação avançada.
[090] Como descrito acima, a presente invenção foi descrita principalmente com base nos exemplos principais. Uma pessoa versada na técnica seria capaz de entender que a presente invenção pode ser implementada de uma forma modificada dentro do escopo que não se desvia das características essenciais da presente invenção. Portanto, os exemplos mostrados acima devem ser considerados de um ponto de vista explicativo, não de um ponto de vista limitado. O escopo da presente invenção é definido pelas reivindicações, não a descrição anterior, e todas as diferenças dentro do escopo equivalente a ela devem ser interpretadas para serem incluídas no escopo da presente invenção.
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35/44
[091] A presente patente é o resultado de uma tarefa correspondente ao número de identificação de tarefa E016440103, nome do ministério: Ministério da Ciência e TIC, agência profissional de gerenciamento de pesquisa: Instituto de Pesquisa em Alimentos da Coréia, departamento: Instituto de Pesquisa em Alimentos da Coréia, nome do projeto de pesquisa: Coréia Projeto principal do Food Research Institute, titulo da tarefa de pesquisa: análise do principal fator de inicio das complicações do diabetes e desenvolvimento técnico de sua redução, periodo de pesquisa: 1 de janeiro de 2016 a 31 de dezembro de 2018; e uma tarefa correspondente ao número de identificação da tarefa E0170601-02, nome do ministério: Ministério da Ciência e TIC, agência profissional de gerenciamento de pesquisas: Instituto de Pesquisa em Alimentos da Coréia, departamento administrativo: Instituto de Pesquisa em Alimentos da Coréia, nome do projeto de pesquisa: projeto principal do Instituto de Pesquisa em Alimentos da Coréia, titulo da tarefa de pesquisa: pesquisa de alimentos e medicamentos para melhoria da doença metabólica mediada por microrganismos intestinais, periodo da pesquisa: 1 de janeiro de 2017 a 31 de dezembro de 2025, que foram conduzidas como parte do projeto nacional da tarefa de pesquisa.
[092] [Número de adesão]
[093] Nome da autoridade depositária: Korean Culture Center of Microrganisms (pais estrangeiro)
| 094] | Número | de acesso: | KCCM11997P |
| 095] | Data do | depósito : | 24 de março de 2017 |
| 096] | Nome da | autoridade | : depositária: Korean Culture Center |
of Microrganisms (pais estrangeiro)
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36/44
[097] Número de acesso: KCCM11998P
[098] Data do depósito: 24 de março de 2017
[099] Nome da autoridade depositária: Korean Culture Center of Microrganisms (país estrangeiro)
[100] Número de acesso: KCCM11673P
[101] Data do depósito: 6 de março de 2015
[102] Nome da autoridade depositária: Korean Culture Center of Microrganisms (país estrangeiro)
[103] Número de acesso: KCCM11981P
[104] Data do depósito: 24 de fevereiro de 2017
TRATADO DE BUDAPESTE NO RECONHECIMENTO INTERNACIONAL
DE DEPÓSITO DE MICRORGANISMOS
PARA FINS DE PROCEDIMENTO DE PATENTE
FORMULÁRIO INTERNACIONAL
Instituto de Pesquisa em RECIBO EM CASO DE DEPÓSITO
Alimentos da Coréia ORIGINAL
Anyangpangyo-ro 1201 beon-gil Emitida de acordo com a Regra
Ί ό c cL
Bundang-gu, Seongnam-si ' , -locon AUTORIDADE DEPOSITÁRIA
Gyeonggi-do 13539
INTERNACIONAL
República da Coréia
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I. IDENTIFICAÇÃO DO MICRORGANISMO
| Referência de identificação | Número de acesso fornecido |
| fornecida pelo | pelo |
| DEPOSITANTE: | AUTORIDADE DEPOSITÁRIA |
| Lactobacillus pentosus KF8 | INTERNACIONAL: |
| KCCM11997P |
II DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
O microrganismo identificado em I acima foi acompanhado por:
□ uma descrição científica □ uma designação taxonômica proposta
III RECEBIMENTO E ACEITAÇÃO
Esta Autoridade Depositária Internacional aceita o microrganismo identificado em I acima, que foi recebido em 24 de março de 2017 (data do depósito original). 1
| IV AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL | |
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| Nome: Centro de Cultura Coreana de Microrganismos Endereço: 120-861, 45, Hongjenae 2ga-gil Seodaemun-gu, Seul República da Coréia | Assinatura (s) de pessoa (s) com poderes para representar a Autoridade Depositária Internacional ou de funcionário (s) autorizado (s) : Data: 24 de março de 2017 |
1 Quando a regra 6.4 (d) se aplica, essa data é a data em que o status da autoridade depositária internacional foi adquirido.
Formulário BP/4
TRATADO DE BUDAPESTE NO RECONHECIMENTO INTERNACIONAL
DE DEPÓSITO DE MICRORGANISMOS
PARA FINS DE PROCEDIMENTO DE PATENTE
FORMULÁRIO INTERNACIONAL
| Instituto de Pesquisa em | RECIBO EM CASO DE DEPÓSITO |
| Alimentos da Coréia | ORIGINAL |
| Anyangpangyo-ro 1201beon-gil | emitida de acordo com a |
| Bundang-gu, Seongnam-si | Regra 7.1 pela |
| Gyeonggi-do 13539 | AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL |
República da Coréia
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39/44 identificado na parte inferior desta página
I. IDENTIFICAÇÃO DO MICRORGANISMO
| Referência de identificação | Número de acesso fornecido |
| fornecida pelo | pelo |
| DEPOSITANTE: | AUTORIDADE DEPOSITÁRIA |
| Lactobacillus paracasei KF00816 | INTERNACIONAL: |
| KCCM11998P |
II DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
O microrganismo identificado em I acima foi acompanhado por:
□ uma descrição cientifica □ uma designação taxonômica proposta
III RECEBIMENTO E ACEITAÇÃO
Esta Autoridade Depositária Internacional aceita o microrganismo identificado em I acima, que foi recebido em 24 de março de 2017 (data do depósito original). 1
| IV AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL | |
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| Nome: Centro de Cultura Coreana de Microrganismos Endereço: 120-861, 45, Hongjenae 2ga-gil Seodaemun-gu , Seul República da Coréia | Assinatura (s) de pessoa (s) com poderes para representar a Autoridade Depositária Internacional ou de funcionário (s) autorizado (s) : Data: 24 de março de 2017 |
1 Quando a regra 6.4 (d) se aplica, essa data é a data em que o status da autoridade depositária internacional foi adquirido.
Formulário BP/4
TRATADO DE BUDAPESTE NO RECONHECIMENTO INTERNACIONAL
DE DEPÓSITO DE MICRORGANISMOS
PARA FINS DE PROCEDIMENTO DE PATENTE
FORMULÁRIO INTERNACIONAL
Instituto de Pesquisa em RECIBO EM CASO DE DEPÓSITO
Alimentos da Coréia ORIGINAL
Anyangpangyo-ro 1201beon-gil emitida de acordo com a Regra
Ί ό c cL
Bundang-gu, Seongnam-si '
Gyeonggi-do 463-746
Petição 870190115728, de 11/11/2019, pág. 45/56
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República da Coréia AUTORIDADE DEPOSITÁRIA
INTERNACIONAL identificado na parte inferior desta página
I. IDENTIFICAÇÃO DO MICRORGANISMO
| Referência de identificação | Número de acesso fornecido |
| fornecida pelo | pelo |
| DEPOSITANTE: | AUTORIDADE DEPOSITÁRIA |
| Lactococcus lactís KF140 | INTERNACIONAL: |
| KCCM11673P | |
| II DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU | DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA |
O microrganismo identificado em I acima foi acompanhado por:
□ uma descrição científica □ uma designação taxonômica proposta
III RECEBIMENTO E ACEITAÇÃO
Esta Autoridade Depositária Internacional aceita o microrganismo identificado em I acima (KCCM11673P), que foi recebido por ela em 6 de março de 2015 (data do depósito original). 1
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| IV AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL | |
| Nome: | Assinatura (s) de pessoa (s) |
| Centro de Cultura Coreana de | com poderes para representar |
| Microrganismos | a Autoridade Depositária |
| Internacional ou de | |
| funcionário (s) autorizado | |
| Endereço: | (s) : |
| 120-861, 45, Hongjenae 2ga-gil | |
| Seodaemun-gu, Seul | Data: 6 de março de 2015 |
| República da Coréia |
1 Quando a regra 6.4 (d) se aplica, essa data é a data em que o status da autoridade depositária internacional foi adquirido.
Formulário BP/4
TRATADO DE BUDAPESTE NO RECONHECIMENTO INTERNACIONAL
DE DEPÓSITO DE MICRORGANISMOS
PARA FINS DE PROCEDIMENTO DE PATENTE
FORMULÁRIO INTERNACIONAL
Instituto de Pesquisa em RECIBO EM CASO DE DEPÓSITO
Alimentos da Coréia ORIGINAL
Anyangpangyo-ro 1201beon-gil
Petição 870190115728, de 11/11/2019, pág. 47/56
43/44
| Bundang-gu, Seongnam-si | emitida de acordo com a Regra |
| Gyeonggi-do 463-746 | 7.1 pela |
| República da Coréia | AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificado na parte inferior desta página |
I. IDENTIFICAÇÃO DO MICRORGANISMO
| Referência de identificação | Número de acesso fornecido |
| fornecida pelo | pelo |
| DEPOSITANTE: | AUTORIDADE DEPOSITÁRIA |
| Bacillus subtilis KF11 | INTERNACIONAL: KCCM11981P |
II DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
O microrganismo identificado em I acima foi acompanhado por:
□ uma descrição cientifica □ uma designação taxonômica proposta
III RECEBIMENTO E ACEITAÇÃO
Esta Autoridade Depositária Internacional aceita o microrganismo identificado em I acima ( KCCM11981P ) , que
Petição 870190115728, de 11/11/2019, pág. 48/56
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| foi recebido por ela em 24 de fevereiro de 2017 (data do depósito original). 1 | |
| IV AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL | |
| Nome: Centro de Cultura Coreana de Microrganismos Endereço: 120-861, 45, Hongjenae 2ga- gil Seodaemun-gu, Seul República da Coréia | Assinatura (s) de pessoa (s) com poderes para representar a Autoridade Depositária Internacional ou de funcionário (s) autorizado (s) : Data: 24 de fevereiro de 2017 |
1 Quando a regra 6.4 (d) se aplica, essa data é a data em que o status da autoridade depositária internacional foi adquirido.
Claims (13)
1. Nova cepa com a atividade de reduzir produtos finais de glicação avançada (AGEs) caracterizada por ser selecionada do grupo que consiste em uma cepa de Lactococcus lactís KF140 (número de acesso KCCM11673P), uma cepa de Bacillus subtilis KF11 (número de acesso KCCM11981P), uma cepa de Lactobacillus pentosus KF8 (número de acesso KCCM11997P) e uma cepa de Lactobacillus paracasei KF00816 (número de acesso KCCM11998P).
2. Nova cepa com a atividade de reduzir produtos finais de glicação avançada (AGEs), de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por os AGEs serem produtos finais de glicação avançada não fluorescentes.
3. Composição de alimento com a atividade de reduzir produtos finais de glicação avançada caracterizada por compreender a nova cepa conforme definida na reivindicação 1, um lisado da mesma ou uma cultura da mesma como ingrediente ativo.
4. Composição de alimento, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a composição pode prevenir ou melhorar diabetes, doença renal crônica, doença cardíaca, doença vascular, retinopatia diabética, neuropatia diabética, catarata diabética ou nefropatia diabética, que podem ser causadas por produtos finais de glicação avançada.
5. Composição farmacêutica caracterizada por a composição compreender a nova cepa conforme definida na reivindicação 1, um lisado da mesma ou uma cultura da mesma como ingrediente ativo para prevenir ou tratar uma doença relacionada a produtos finais de glicação avançada.
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2/3
6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por a doença ser selecionada do grupo que consiste em diabetes, doença renal crônica, doença cardíaca, doença vascular, doença vascular, retinopatia diabética, neuropatia diabética, catarata diabética e nefropatia diabética.
7. Composição caracterizada por a composição compreender a nova cepa conforme definida na reivindicação 1, um lisado da mesma ou uma cultura da mesma como ingrediente ativo para regulação intestinal.
8. Composição probiótica caracterizada por compreender a nova cepa conforme definida na reivindicação 1, um lisado da mesma ou uma cultura da mesma como ingrediente ativo.
9. Composição de alimentação caracterizada por compreender a nova cepa conforme definida na reivindicação 1, um lisado da mesma ou uma cultura da mesma como ingrediente ativo.
10. Produto fermentado caracterizado por compreender a nova cepa conforme definida na reivindicação 1, um lisado da mesma ou uma cultura da mesma como ingrediente ativo.
11. Método para inibir produtos finais de glicação avançada caracterizado por usar a nova cepa conforme definida na reivindicação 1, um lisado da mesma ou uma cultura da mesma.
12. Uso da composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 5 caracterizado por o referido uso ser para o preparo de um medicamento para prevenir ou tratar uma doença relacionada a produtos finais de glicação avançada, em que a doença é selecionada do grupo que consiste em diabetes, doença renal crônica, doença cardíaca, doença vascular, doença
Petição 870190115728, de 11/11/2019, pág. 51/56
3/3 vascular, retinopatia diabética, neuropatia diabética, catarata diabética e nefropatia diabética.
13. Uso da composição conforme definida na reivindicação 7 caracterizado por o referido uso ser para o preparo de um medicamento para regulação intestinal.
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