KR102256507B1 - 내산성 및 내담즙성이 우수하며 이상지질혈증의 예방 또는 치료 효과를 가지는 신규 비피도박테리움 브레베 idcc 4401 균주 및 이의 사균체 id-bbr4401 - Google Patents

내산성 및 내담즙성이 우수하며 이상지질혈증의 예방 또는 치료 효과를 가지는 신규 비피도박테리움 브레베 idcc 4401 균주 및 이의 사균체 id-bbr4401 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내산성 및 내담즙성이 우수하며 이상지질혈증의 예방 또는 치료 효과를 가지는 신규 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP) 및 이의 사균체 ID-BBR4401에 관한 것으로, 본 발명의 신균주 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP)는 우수한 체내 콜레스테롤 감소 효과를 가질 뿐만아니라, 기존에 공지된 B. breve들과는 달리 매우 높은 수준의 내산성 및 내담즙성을 가지기 때문에 동물(특히, 인간)의 소화관 내에서 균주가 가지는 기능성을 잘 나타내며 생육하는 능력이 우수하여, 지속적이고 효과적인 체내 콜레스테롤 감소 기능성을 제공한다. 또한 상기 균주에 열처리하여 제조한 사균체(ID-BBR4401)는 콜레스테롤 결합능이 생균과 동등한 수준 내지 그 이상으로 우수할 뿐만아니라 담즙산과도 높은 수준의 결합능을 보유하여 담즙산의 체외 배출에 현저한 효능을 보인다. 이로부터 본 발명의 ID-BBR4401는 체내 콜레스테롤, 특히 LDL-콜레스테롤의 저감 효과가 매우 뛰어날 뿐만아니라 체내 중성 지방의 감소 효과가 현저하므로 이상지질혈증의 예방 및 치료에 있어서 우수한 효능을 보인다.

Description

내산성 및 내담즙성이 우수하며 이상지질혈증의 예방 또는 치료 효과를 가지는 신규 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주 및 이의 사균체 ID-BBR4401{Novel Bifidobacterium breve IDCC 4401 strain having high resistance ability of acid and bile salt and effect of preventing or treating dyslipidemia, and their killed form ID-BBR4401}
본 발명은 내산성 및 내담즙성이 우수하며 이상지질혈증의 예방 또는 치료 효과를 가지는 신규 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP) 및 이의 사균체 ID-BBR4401에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 신규 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주 또는 이의 사균체 ID-BBR4401의 이상지질혈증의 예방, 개선 및 치료 용도와 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 정장용 조성물, 생균제 조성물, 사료용 조성물 및 발효제품에 관한 것이다.
이상지질혈증이란 혈중에 총콜레스테롤, 저밀도지단백(low density lipoprotein, LDL) 콜레스테롤, 중성지방이 증가된 상태거나, 고밀도지단백(High density lipoprotein, HDL) 콜레스테롤이 감소된 상태를 말한다. 이상지질혈증은 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증을 모두 포함하는 광의의 질환명이며, 이 중 고콜레스테롤혈증은 혈중에 콜레스테롤이 증가된 상태로 총콜레스테롤과 저밀도지단백 콜레스테롤이 높게 나타나는 질환을 말한다. 콜레스테롤의 대사장애 내지 콜레스테롤의 과잉섭취로 인해서 혈청 중의 콜레스테롤이 최고치가 된 경우에 고콜레스테롤 혈증이라고 한다.
콜레스테롤은 인체에 필수적인 성분이지만 그의 대사 이상은 성인병, 특히 동맥경화증의 발증에 크게 관계된다. 성인에서는 약 140g의 콜레스테롤이 존재하는 것으로 알려져 있는데 그의 약 1%가 매일 대사되며 중요한 대사산물은 담즙산이다. 담즙산은 단순히 콜레스테롤의 대사산물이라는 것에 그치지 않고 소화관 내에서 콜레스테롤을 포함하는 지질과 micelle을 형성하여 그의 흡수를 촉진하는 작용을 가지고 있다. 이러한 micelle 형성에는 담즙산이 불가결하기 때문에 담즙산이 없으면 지질이나 비타민 등의 지용성 물질의 흡수에 지장을 일으킨다. 분비된 담즙산은 장관으로부터 흡수되어 간으로 되돌아오고 다시 담즙 중에 분비되는 장-간 순환을 나타낸다. 이러한 순환 시에 담즙산이 재흡수 되지 못하고 배설되면, 새로운 담즙산을 생합성하기 위해 전구체인 콜레스테롤의 요구량 또한 증가되어 체내 콜레스테롤 수치가 낮아지는 것으로 알려졌다.
일반적으로 혈청(혈장) 중 콜레스테롤 농도가 220~250㎎/dL 이상이거나, 저밀도지단백 콜레스테롤의 농도가 160㎎/dL 이상인 경우를 고콜레스테롤 혈증이라고 판단한다. 고콜레스테롤 상태가 장시간 이어지면 동맥벽에 침착해서 죽상경화를 일으키고 심근경색이나 뇌혈전증의 원인이 된다. 또한 결합조직에 침작해서 황색종을 발생시키거나, 콜레스테린 결석을 포함한 담석증을 일으키기 쉽다.
일부 고콜레스테롤 혈증 환자들의 경우 그 증상의 정도에 따라 약물 치료를 사용하기도 하는데, 가장 많이 사용되는 것은 스타틴 계열의 약들이다. 스타틴 계열의 약물은 HMG-CoA 환원효소 저해제로서 콜레스테롤의 합성을 저해하는 효과가 있다(한기훈 et al., 스타틴 임상연구의 근거, 한국지질동맥경화학회 치료지침위원회(2010) pp.14~15). 스타틴은 저밀도 지단백 콜레스테롤과 중성지방을 용량 의존적으로 감소시키며 고밀도 지단백 콜레스테롤을 일부 증가시킨다. 이런 스타틴의 부작용은 소화불량, 두통, 피곤함, 관절통 등이 있으며, 근육병의 위험성이 있기 때문에 근육 증상이 있으면 혈액검사를 받아야 하며, 간기능 장애 유발 가능성 있어 간기능검사를 약물 처방전에, 복용 2-3개월 후, 그 후 1년 간격으로 검사해야 한다.
따라서 부작용이 없고 보다 안전한 소재들에 대한 연구가 이루어지고 있으며, 최근에는 식이요법과 병행할 수 있는 기능성 식품 등에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 이에 맞춰 고콜레스테롤 혈증을 개선하고자 하는 노력의 일환이 프로바이오틱스 균주를 사용한 연구 분야에서도 시도되고 있다.
한편, 유산균 사균체는 생균의 반대되는 개념으로서 발효를 통해 얻어진 생균 및 대사산물들을 열처리 등에 의해 균의 성장이 일어나지 못하도록 한 형태이다(Jae-Gu Seo, et al., Development of Probiotic Products and Challenges, KSBB Journal 2010. 25: 303~310). 실제 생균의 경우 구강투여 후 장에 도달했을 시 많은 수가 죽게 된다. 이는 특히 상기 균이 내산성 및 내담즙성과 같은 소화기관 내부 환경에 저항성이 없을 때 두드러진다. 체내 소화기관의 환경 등에 의하여, 일반적인 방식으로 생균이 사균화되면 생균이 가지고 있던 여러 활성 중 일부 또는 전부에 변화를 초래할 수 있다. 따라서 목적하는 특정 생리활성의 이점을 기대하여 생균을 투여할 시에, 목적하는 구체적 생리활성의 종류와 균에 따라서 기대치만큼 체내에서 안정적으로 해당 활성을 달성하지 못할 수 있다. 이는 과도한 투여량으로 이어질 수 있으며, 이에 따른 부작용 등의 문제점을 낳을 수 있다. 또한 보관 시 생균은 온도에 따라 균체가 변질될 수 있기 때문에 보존성 면에 있어서 생균제제의 활성의 안정성 유지가 문제된다고 할 수 있다.
이러한 생균 제제들의 문제점을 극복하고자 사균체를 이용하는 기술들이 보고되고 있지만. 실질적으로 사균을 이용하는 기술에 있어서 얻고자하는 생리활성의 종류에 따라서 구체적 균체의 종류, 사균화 방법 등의 다양한 요인에 따라 고도의 특이성을 요한다.
이에 본 발명자들은 체내 도입 시 안정적이고 높은 수준으로 콜레스테롤 저하능을 나타내는 유산균 소재 제제를 연구하던 중, 콜레스테롤 결합능이 뛰어난 신균주 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP)를 발굴하고, 상기 균이 내산성 및 내담즙성이 매우 뛰어날 뿐만아니라 이로부터 제작된 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주의 사균체(즉, ID-BBR4401)가 이상지질혈증 동물 모델에서 생균 이상의 높은 수준으로 콜레스테롤 저하 효능을 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 내산성 및 내담즙성을 가지며 이상지질혈증의 예방 또는 치료 효과를 가지는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP) 또는 이의 사균체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP), 이의 배양물 또는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 사균체 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 이상지질혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP), 이의 배양물 또는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 사균체 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 이상지질혈증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 정장용 조성물, 생균제 조성물, 사료용 조성물 및 발효제품을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 내산성 및 내담즙성을 가지며 이상지질혈증의 예방 또는 치료 효과를 가지는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP) 또는 이의 사균체를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP), 이의 배양물 또는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 사균체 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 이상지질혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP), 이의 배양물 또는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 사균체 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 이상지질혈증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 정장용 조성물, 생균제 조성물, 사료용 조성물 및 발효제품을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 내산성 및 내담즙성을 가지며 이상지질혈증의 예방 또는 치료 효과를 가지는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP) 또는 이의 사균체를 제공한다.
본 발명에서 용어‘이상지질혈증’은 혈중에 총콜레스테롤, 저밀도지단백(low density lipoprotein, LDL) 콜레스테롤, 중성지방이 증가된 상태거나, 고밀도지단백(High density lipoprotein, HDL) 콜레스테롤이 감소된 상태를 의미하는 것으로, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증 등을 모두 포함하는 의미이다. 바람직하게 본 발명에서 상기 이상지질혈증은 고콜레스테롤혈증 일 수 있다.
비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주는 콜레스테롤 자체에 대한 흡착능이 뛰어날 뿐만아니라, BSH 활성을 보유하고, 콜레스테롤을 전구체로 하는 담즙산과의 결합능도 우수한 것이 특징이다. 이에 따라 우수한 체내 콜레스테롤 감소(저하)의 기능성을 가질 뿐만 아니라, 우수한 내산성 및 내담즙성을 갖는 것을 특징으로 한다. 이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 신균주 B. breve IDCC 4401이 기존에 콜레스테롤 결합능이 있는 것으로 나타난 다른 균종 및 동일 균종들과 비교하여 월등히 우수한 콜레스테롤 결합능이 있는 것을 확인하였으며,
다른 일 실시예에서는 본 발명의 신균주 B. breve IDCC 4401이 pH2.5의 높은 산성 환경에서도 다른 B. breve 균들과 비교하여 우수한 생육능력을 가질 뿐만아니라. 0.5%의 고농도 담즙 환경에서도 우수한 생육능력을 보임을 확인하였다. 일반적으로 소장에서 담즙 농도가 0.06%로 알려진 것을 고려하면, 본발명의 신균주는 매우 우수한 내담즙성을 가지는 것이다.
상기 '비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주'는 배양 배지로부터 수득된 생균 그 자체뿐만 아니라, 당업자에게 알려진 유산균에 대한 임의의 가공형태(특히 생균의 가공형태)를 포함하는 것으로 예를 들어 건조물, 동결물 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기‘비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주의 사균체’는 본 명세서에서‘ID-BBR4401’로도 지칭될 수 있으며, 본 발명의 사균체는 열처리를 포함하는(열처리에 의한) 사균화 방식으로 제조되는 것일 수 있다. 상기 열처리는 배양액으로부터 분리 수득한 생균체만을 대상으로 수행되는 것일 수 있고, 또는 상기 생균체를 포함하고 있는 배약액을 대상으로 수행되는 것 일 수 있다. 상기 열처리 온도는 균체의 성상을 유지하고 다른 일반세균들이 멸균되는 조건이라면 그 온도조건이 특별히 제한되지 않으나, 80℃ 내지 150℃로 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게 80℃ 내지 110℃로 수행되는 것일 수 있다.
상기 열처리 시간은 상기 온도조건을 고려하여 당업자가 목적하는 제조품질을 수득할 수 있는 조건이라면 그 시간이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 1시간 내지 2시간으로 진행할 수 있다. 1시간 미만으로 가열시 균이 완전히 죽지 않을 수 있으며, 2시간을 초과하여 장시간 가열 시 균의 표면에 변성이 일어나게 되어 목표하는 효과가 나타나지 않을 수 있다.
상기 사균체 제조를 위한 열처리 공정 중, 당업자는 본 발명 사균의 콜레스테롤 감소능에 영향을 주지 않는 선에서 제조 효율을 위하여 임의의 전처리 또는 추가 조건을 부가 할 수 있다. 일례로 상기 열처리 전 생균체에 증류수를 투입 및 혼합할 수 있다. 증류수의 양이 균체의 중량 보다 적거나 넣어주지 않을 때에는 가열 시 열의 영향을 많이 받게 되어 원료의 색이 진해지게 되는 반면, 균체 중량의 1 내지 2배 이상의 양을 넣어주었을 때는 원료의 색이 변질되지 않아 관능적으로 우수해진다.
가장 바람직하게 본 발명의 사균체는, 생균체를 수(水)중에서 80℃ 내지 90℃로 가열하여 제조되는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로 상기 사균체는, 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주의 배양액을 원심분리하여 생균체와 배양여액으로 분리하고, 상기 분리된 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 생균체의 중량 대비 1 내지 2배의 증류수를 넣고 현탁한 뒤 80℃ 내지 90℃로 가열하여 제조되는 것일 수 있다.
상기 사균화된 균체들은 사균제제(제형)의 제조를 위한 임의의 추가 공정을 거칠 수 있으며, 일례로 농축, 건조 등을 수행할 수 있다. 상기 건조는 당업계에서 유산균의 건조에 사용하는 방법이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 열(풍)건조, 동결건조 방법일 수 있다.
상기 본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주의 사균체(ID-BBR4401)는 안정적이고 높은 수준으로 콜레스테롤 저하효능을 보이는 것이 그 특징이다. 특히 본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주는 다른 B. breve 균주들과는 달리 열처리하여 사균화하여도, (생균의 경우 배양 기간 동안 균체수가 증가함을 고려하였을 때) 콜레스테롤과의 결합능력이 생균과 동등한 수준으로 우수한 것이 특징이다. 뿐만 아니라 상기 사균체(ID-BBR4401)는 담즙산과도 높은 수준의 결합능을 보유하여 담즙산의 체외 배출에 현저한 효능을 보인다. ID-BBR4401은 conjugated bile acid와도 결합하여 체외로 배출된다는 사실은 기존에 콜레스테롤 저하능이 있는 것으로 알려진 유산균 생균제들이 BSH(bile salt hydrolase) 활성을 통하여 소장으로 분비된 담즙산을 deconjugation시켜 유리 bile acid로 전환하고 이러한 유리된 bile acids는 conjugated bile acids보다 재흡수력이 떨어지므로써 체외로 배출되는 기작을 가지는 것과는 다르게 구별된다.
이로부터 본 발명의 사균체(ID-BBR4401)는 체내 콜레스테롤, 특히 LDL-콜레스테롤의 저감 효과가 매우 뛰어날 뿐만아니라 체내(특히 간에서) 중성 지방의 감소 효과가 현저하므로 이상지질혈증의 예방 및 치료에 있어서 우수한 효능을 보인다.
이는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 기존에 콜레스테롤 저하 효과가 있다고 알려져 있는 B. breve 균주들과 본원 발명의 IDCC 4401 균주의 생균을 동일한 방법으로 열처리하여 사균화 한 후, 이들의 콜레스테롤 저하능(콜레스테롤 부착능)을 측정하였다. 그 결과, 생균의 경우 배양기간 동안 생장을 하여 상대적으로 균체수가 사균에 비해 많아지는 것을 고려하여, 동일한 균체 단위수 당 잔여 콜레스테롤이 가장 낮은 것은 본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 사균체(ID-BBR4401)로서, 나머지 B. breve 사균체와 비교하여 월등히 우수한 콜레스테롤 저하능(콜레스테롤 부착능)을 보임을 확인하였으며, 특히 본 발명의 ID-BBR4401는 다른 B. breve 균주들의 생균과 비교하여도 콜레스테롤 저하능이 매우 현저하게 우수한 것으로 나타났다.
본 발명의 다른 일 실시예에서는 상기 사균체(ID-BBR4401)의 이상지질혈증(고지혈증) 동물 모델에 대한 효과를 확인하였다. 그 결과 본 발명의 ID-BBR4401는 체내 콜레스테롤(TC), 특히 LDL-콜레스테롤의 감소 효과를 나타내는 것을 확인하였고, 뿐만아니라 간에서 중성지방(TG) 수준을 감소시키는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명은 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP), 이의 배양물 또는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 사균체 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 이상지질혈증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 '배양'이란 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육시키기 위하여 수행하는 모든 행위를 의미하며, 본 발명에서 '발효'를 포함하는 개념으로서 상기 용어‘배양물’은‘발효물’을 포함하는 의미이고, 배지에서 배양한 배양액 자체(즉, 균을 포함하고 있는 배양액 자체), 또는 상기 배양액에 열처리를 가한 가공물 등 배양액 자체로부터 파생되는 가공물을 포함한다. 바람직하게 본 발명의 배양물은 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균을 포함하고 있는 배양액 또는 상기 배양액에 열처리를 가한 가공물일 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물은 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401(기탁번호: KCTC13169BP), 이의 배양물 또는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 사균체가 포함되는 어떠한 형태의 조성물도 포함될 수 있으며, 바람직하게 상기 조성물은 식품 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물이 식품 조성물일 경우, 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401(기탁번호: KCTC13169BP), 이의 배양물 또는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 사균체를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함하는 것으로서, 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 이상지질혈증의 개선 또는 치료 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
예를 들면, 건강기능식품으로는 본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 또는 이의 사균체가 포함된 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 또는 이의 사균체를 이상지질혈증의 예방, 개선 또는 치료 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부당 0.01~0.3 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100mL당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식품 조성물 중 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 생균 또는 이의 사균체의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일례로, 본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 생균 또는 이의 사균체를 식품 또는 음료의 제조 시에 상기 특정식품 소재 1g(또는 ㎖) 당 본 발명의 균을 1 x 105 내지 1 x 1011 개(균수) 첨가하고, 바람직하게는 1 x 106 내지 1 x 1010 개의 양으로 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 생균 또는 이의 사균체가 포함된 식품 조성물의 1일 섭취량은 균체수 기준으로 1×105 내지 1×1010 CFU/kg, 바람직하게는 1×106 내지 1×109 CFU/kg이고, 섭취는 하루에 한 번 섭취할 수도 있고, 수회 나누어 섭취할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에서 균주의 유효용량은 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
본 발명에서 상기 조성물이 약학적 조성물일 경우, 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401(기탁번호: KCTC13169BP), 이의 배양물 또는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 사균체를 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다. 경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의 정제물를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 또는 이의 사균체의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 또는 이의 사균체의 바람직한 전체 용량은 고형분 함량 기준으로 1 일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01ug 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ug 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 또는 이의 사균체의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 해당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 균주 및 이의 사균체를 이상지질혈증의 예방, 개선 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따라 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
또한 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 정장용 조성물, 생균제 조성물, 사료용 조성물 및 발효제품을 제공한다. 상기 조성물이 정장용 또는 사료용으로 제공되는 경우에는, 본 발명의 상기 균주는 생균 뿐만아니라 사균체 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주는 인간 및 동물의 건강 증진을 위한 용도, 즉, 정장용, 생균제 또는 사료용 조성물로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 상기 균주 자체, 또는 이의 배양물 등을 유효성분으로 포함하며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 조성물 내 상기 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 따른 정장용 또는 생균제 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주 또는 이의 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제 (tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제 (powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다.
투여방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 사료용 조성물은 발효사료, 배합 사료, 펠렛형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료 는 본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주와 여러 가지 미생물 균 또는 효소들을 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조될 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반 사료와 본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주를 혼합 하여 제조될 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기로 제형화하여 제조될 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명에 따른 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주로 발효시킴으로서 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주 또는 이의 배양물은 김치, 음료, 이유식 등의 식품에 대한 식품첨가제로 사용될 수 있다. 아울러, 본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주는 발효제품 제조를 위한 스타터(starter)로 사용될 수 있다. 상기‘발효제품’은 본 명세서에서 용어‘발효식품’과 혼용되어 지칭될 수 있다. 상기 발효제품은 제조시 발효공정이 필요한 식품으로서 당업계에 알려진 것이라면 그 종류가 제한되지 않으나, 예를 들어 치즈, 요거트, 버터, 크림, 아이스크림, 유산균 음료, 캐피어, 발효유, 김치, 발효생식제품 등을 포함한다. 본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주를 이용한 발효제품은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 발효제품의 제조방법은 통상적으로 원료의 준비, 유산균의 첨가, 발효, 완성된 제품의 회수 등의 과정으로 이루어진다. 원료의 준비 단계는 발효 대상이 되는 재료를 준비하고, 발효가 잘 이루어지도록 발효 조건을 준비하는 단계이다. 유산균의 첨가는 발효 대상의 양에 따라 적량의 균을 첨가하는 것으로, 본 발명에서는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주를 사용 하는 것을 특징으로 한다. 발효는 통상의 발효균의 발효조건에 따라 수행되는 것으로 예를 들어 20℃ 내지 40℃에서 1 내지 168시간 동안 수행될 수 있다. 완성된 제품의 회수는 발효물에서 불필요한 부산물이나 미발효된 재료를 제거하는 것에서부터 저장, 운반을 용이하게하기 위한 모든 후처리과정 및 포장 등을 포함한다.
구체적 일례로 본 발명에 따른 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주는 유산균 음료를 제조하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주를 배양하여 젖산 발효시킨 것에 살균수를 가해서 희석하고 당분, 향료 등을 가한 다음 용기에 충전한 제품을 일 수 있다. 이러한 음료에는 일반적으로 유산균이 살아 있는 채로 함유되어 있으므로, 음용 후 장(腸) 안에서의 정장작용을 기대할 수 있다.
또한, 현미와 율무 등의 곡류 분말에 본 발명에 따른 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주 또는 이를 포함하는 2-3종의 혼합 유산균을 처리하여 적정 온도에서 발효시킨 후, 백태, 찹쌀, 수수 등의 다양한 농산물을 영양적인 균형과 기호성이 우수하도록 적절히 배합하여 발효 생식제품을 제조할 수 있다.
본 발명의 신균주 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP)는 우수한 체내 콜레스테롤 감소 효과를 가질 뿐만아니라, 기존에 공지된 B. breve들과는 달리 매우 높은 수준의 내산성 및 내담즙성을 가지기 때문에 동물(특히, 인간)의 소화관 내에서 균주가 가지는 기능성을 잘 나타내며 생육하는 능력이 우수하여, 지속적이고 효과적인 체내 콜레스테롤 감소 기능성을 제공한다.
또한 상기 균주뿐만 아니라 이에 열처리하여 제조한 사균체(ID-BBR4401)는 콜레스테롤 결합능이 생균과 동등한 수준으로 우수할 뿐만 아니라 담즙산과도 높은 수준의 결합능을 보유하여 담즙산의 체외 배출에 현저한 효능을 보인다. 이로부터 본 발명의 균주 또는 이의 사균체 ID-BBR4401는 체내 콜레스테롤, 특히 LDL-콜레스테롤의 저감 효과가 매우 뛰어날 뿐만아니라 체내(특히 간에서) 중성 지방의 감소 효과가 현저하므로 이상지질혈증의 예방 및 치료에 있어서 우수한 효능을 보인다.
도 1은 본 발명의 신균주를 포함한 다양한 균종에 대하여, 이들 생균의 콜레스테롤 특이적 결합능을 비교평가한 결과를 나타낸다.
도 2는 고콜레스테롤혈증 개선 효과를 가진 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 사균체인, ID-BBR4401의 원료 사진이다.
도 3은 고콜레스테롤 혈증 개선 효과를 가진 ID-BBR4401의 주사 전자 현미경 사진이다.
도 4는 콜레스테롤과 결합한 ID-BBR4401의 주사 전자 현미경 사진이다.
도 5는 본 발명의 신균주를 포함한 다양한 균종의 콜레스테롤 감소능을 비교하여 평가한 결과이다.
도 6은 본 발명의 신균주를 포함한 다양한 균종의 담즙산 감소능을 비교하여 평가한 결과이다.
도 7은 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 사균체인 ID-BBR4401이 이상지질혈증(고지혈증) 동물 모델에서 혈중 내 지질에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.
도 8은 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 사균체인 ID-BBR4401이 이상지질혈증(고지혈증) 동물 모델에서 간의 지질에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.
도 9는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401의 사균체인 ID-BBR4401이 이상지질혈증(고지혈증) 동물 모델에서 분변 내 담즙산 양에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 신균주의 분리 및 동정
유산균주의 개발을 위하여, 본 발명자들은 유아 분변을 식염수를 이용하여 십진 희석법으로 순차적 희석하여, MRS 배지(BD, 288210)에 도말하고 37℃에서 2일간 혐기 배양하며 균을 관찰하고, 생성된 콜로니들에 대한 균들을 분리 및 확인하였다.
분리된 다수의 균주 중, IDCC 4401 균주를 최종 선발하여 동정 분석하였다. API 50 CH 동정 kit (bioMerieux Vitex, Inc, France)을 사용하여 선발균주의 탄수화물 발효 패턴을 결정하였고, 16S rRNA gene 서열을 바탕으로 상기 균주를 동정하였다.
IDCC 4401 균주의 탄수화물 발효 패턴은 하기 표 1과 같았으며, 16S rRNA 분석결과 서열번호 1의 서열로 이루어진 것을 확인하고 Bifidobacterium breve와 99% 상동성을 나타내어 동일종으로 동정하였다. 상기 동정된 본 발명의 신규한 미생물은 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 위치한 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures)에 2016년 12월 2일자로 “Bifidobacterium breve IDCC 4401”으로 기탁하였다(KCTC 13169BP).
Figure 112020068022273-pat00001
실시예 2: 콜레스테롤 저하 효과 우수 균주의 선발
콜레스테롤 저하 효과가 우수한 균주를 선발하기 위해 상기 실시예 1에서 동정한 균주를 포함하여, 일동제약에서 보유하고 있는 프로바이오틱스 20종을 대상으로 콜레스테롤 결합능을 1차적으로 확인하였다. 그 중 콜레스테롤 결합능이 있는 것으로 확인된 8종의 프로바이오틱스에 한하여 2차 시험을 진행하였다(하기 표 2 및 도 1 참조).
하기 표 2에 기재된 균 제제들의 콜레스테롤 저하 효과는 다음과 같은 방법으로 측정되었다. 먼저 콜레스테롤을 10% 함유한 MRS 배지(BD, MRS broth) 10ml에 각각의 균(실험군)을 1%(v/v)씩 접종하였다. 접종 48hr 후에 원심 분리하여 상등액만 회수하여, 각각의 잔여 콜레스테롤 농도를 측정하였다.
실험결과 도 1에서 보는 바와 같이, 잔여 콜레스테롤이 가장 낮은 것은 상기 실시예 1에서 동정된 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 생균 실험군이었다. 각 균주별 콜레스테롤 잔여율 측정 결과는 표 2와 같다.
Figure 112020068022273-pat00002
실시예 3: 사균체 제조 공정
콜레스테롤 결합능이 우수한 최적의 비피도박테리움 브레베 IDCC4401 사균체(ID-BBR4401)를 제조하기 위해 가열(70 ~ 110℃) 조건에 대한 실험을 진행하였다. 원심분리한 균체 무게 대비 1~2 배의 증류수를 넣고 현탁한 뒤 하기 표 3과 같은 각각의 온도 조건에서 1시간 가열을 진행하고 그 후 동결건조를 수행하여 각 조건별 사균체를 제조하였다. 이로부터 사균화의 최적 조건은 혈구계수기를 통해 측정한 균수와 일반 세균 검사를 통해 선정하였으며, 측정 결과는 하기 표 3과 같다.
Figure 112020068022273-pat00003
실험 결과, 상기 표 3에서보는 바와 같이 일반세균이 제거되면서도 본 발명의 B. breve IDCC4401가 높은 수준으로 균질한 성상을 유지하는 조건으로서 80 내지 90℃에서 가열 조건이 가장 적합한 것을 확인하였다. 상기 80 내지 90℃에서 가열로 제작되는 사균체를 본 명세서에서 ID-BBR4401로 칭한다.
이렇게 선발된 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 사균을‘ID-BBR4401’으로 칭하였으며(도 2 참조), 이의 주사전자 현미경 촬영 이미지를 도 3에서 보여준다. 또한 ID-BBR4401이 콜레스테롤과 결합한 모습을 주사전자 현미경을 통해 촬영한 결과를 도 4에서 보여준다.
실시예 4: 동일한 균종 간의 콜레스테롤 감소(저하)능 효과 비교
본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 생균 및 사균체(ID-BBR4401)의 우수한 콜레스테롤 저하 효과를 확인하기 위해, 기존에 콜레스테롤 저하 효과가 있다고 알려져 있는 동일 균종의 서로 다른 균주들과 콜레스테롤 결합능에 대한 비교 실험을 진행하였다. 구체적으로 하기 표 4 및 도 5에서 보는 바와 같이 총 5종의 균주들을 대상으로 실험하였으며, 각 균들에 균체 무게 대비 1~2 배의 증류수를 넣고 현탁한 뒤 80 내지 90℃에서 1시간 가열을 진행하고 그 후 동결건조를 수행하는 방식으로 사균화 시킨 뒤 생균 및 상기 사균의 효과를 평가하였다. 콜레스테롤 저하 효과는 상기 실시예 2과 동일한 방법으로 확인하였다. 콜레스테롤을 함유한 MRS 배지 10ml에 각 균주의 생균 및 사균을 1%(v/v)씩 접종하였다. 접종 48시간 뒤에 원심 분리하여 상등액만 회수하여, 각각의 잔여 콜레스테롤 농도를 측정하였다.
Figure 112020068022273-pat00004
실험결과, 각 균주별 콜레스테롤 잔여율 측정 결과는 상기 표 4와 같다. 사균의 경우 균체수가 최초 투입 시 수준을 유지하나 생균의 경우 배양기간 동안 생장을 하여 상대적으로 균체수가 사균에 비해 많아지기 때문에 수치적으로 콜레스테롤 잔여량이 약간 더 낮게 나타날 수 있는 것을 고려하였을 때, 동일한 균체 단위수 당 잔여 콜레스테롤이 가장 낮은 것은 본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 사균체(ID-BBR4401)였으며 다른 균주들과 상당한 수준으로 유의적인 차이가 있음을 확인하였다.
더욱이 B. breve NCIMB8807 균주의 경우에는 사균화할 경우에 생균에 비하여 콜레스테롤 결합능이 상당히 저하된 것으로 나타났다. 이에 반해 본원 발명의 B. breve IDCC 4401 사균체(ID-BBR4401)는 이의 생균과 동일한 수준 또는 더욱 증가된 수준으로 더 좋은 콜레스테롤 결합능을 보여주었으며, 특히 본 발명의 ID-BBR4401는 다른 B. breve 균주들의 생균과 비교하여도 콜레스테롤 저하능이 매우 현저하게 우수한 것으로 나타났다. 따라서 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 생균 및 사균(ID-BBR4401) 제제가 가장 우수한 콜레스테롤 결합능을 보유함을 확인하였으며, 또한 안정성이 우수한 것으로 사료되었다.
실시예 5: 동일한 균종 간의 담즙산 감소(저하)능 효과 비교
본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 생균 및 사균체(ID-BBR4401)의 우수한 담즙산 저하 효과를 확인하기 위해 동일 균종의 서로 다른 균주들과 비교 실험을 진행하였다. 총 5종의 균주들을 모두 사균화 시킨 뒤 각 균주의 생균 및 상기 사균의 효과를 평가하였다. 담즙산을 함유한 MRS 배지 10ml에 각 균주를 10%(v/v)씩 접종하였다. 접종 24시간 뒤에 원심 분리하여 상등액만 회수하여, 각각의 잔여 담즙산 농도를 측정하였다. 실험결과, 각 균주별 담즙산 잔여율 측정 결과는 하기 표 5 및 도 6과 같다. 생균 및 사균 모두에서 잔여 담즙산이 가장 낮은 것은 본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401였으며 다른 균주들과 유의적인 차이가 있음을 확인하였다.
Figure 112020068022273-pat00005
실시예 6: 내산성 및 내담즙성 특성 확인
본 발명의 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401이 산성과 담즙산에 의해 영향을 받지 않는 다는 것을 확인하기 위해 내산성 및 내담즙성 실험을 진행하였다. 생균이 받는 위산과 담즙산의 영향이 적다면, 사균 상태에서도 위산과 담즙산으로부터 받는 영향이 적을 것이다. 따라서 실험에는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 생균을 사용하였으며, 하기 표 6 및 표 7에서 보는 바와 같이 동일 균종의 서로 다른 균주들과 비교평가 하였다.
내산성 실험에는 염산으로 각각 pH 2.5, pH 3.0 및 pH 7.0로 조정한 MRS 배지들에 10ml에 균주를 1%(v/v)씩 접종하였다. 접종 24시간 후에 각 배양액의 균수를 확인하여 그 차이를 비교하였다. 측정 결과는 하기 표 5와 같다.
내담즙성은 Oxgall을 각각 0.1~0.5%(w/v)넣은 MRS 배지 10ml에 균주를 1%(v/v)씩 접종하였다. 접종 24시간 후에 각 배양액의 균수를 확인하여 그 차이를 비교하였다. 측정 결과는 하기 표 6 및 표 7과 같다.
Figure 112020068022273-pat00006
Figure 112020068022273-pat00007
상기 표 6 및 표 7에서 보는바와 같이 본원 발명의 B. breve IDCC4401 균주는, 다른 균들과 대조적으로 높은 수준의 내산성 및 내담즙성을 보임을 확인하였다.
실시예 7: 열안정성 확인 시험
콜레스테롤 결합능이 우수한 비피도박테리움 브레베 IDCC4401 사균체인 ID-BBR4401 조성물을 여러 온도의 환경에서 장기간 보관하였을 때, 조성물이 함유하고 있는 균수의 변화와 콜레스테롤과 결합하는 활성에 변화가 있는지에 대한 실험을 진행하였다. 균수 측정은 혈구계수기를 통해 하였으며, 기간별로 측정한 균수를 비교하였다. 활성은 실시예 2와 동일한 방법으로 콜레스테롤 저하 효과 시험을 진행하여 그 잔여율을 통해 비교하였다. 그 결과는 하기 표 8과 같다.
Figure 112020068022273-pat00008
실험 결과 상기 표 6에서 보는 바와 같이, 본 발명의 ID-BBR4401는 장기간 안정성 및 열안정성이 우수한 것을 확인하였다.
실시예 8: 이상지질혈증 동물 모델에서의 효능평가
8-1) 이상지질혈증(고지혈증) 동물 모델 확립
5주령 수컷 SD rat(오리엔트바이오사)을 구입하여 1주일 순화기간을 거친 후 사용하였다. 본 실험은 항온 (22±2℃), 항습 (50~60%)을 유지하였고 광주기(08:00~20:00) 및 암주기 (20:00~08:00)를 12시간 간격으로 유지되는 동물실에서 수행하였다. 시험 동물은 각 군당 3마리씩 한 사육 케이지에 수용하여 멸균된 사료 및 1차 증류수를 자유 공급하였다. 시험물질 각 군당 9마리씩 6군으로 실험하여 총 54마리를 사용하였고, 각 군은 normal(ND), vehicle(고지방 식이만 한 군, HCD), 양성대조군(Rosuvastatin 10mg/kg/2mL 투여, HCD+R), ID-BBR4401 1x106 cells/rat투여군(HCD+L), ID-BBR4401 1x107cells/rat 투여군(HCD+M), ID-BBR4401 1x108cells/rat 투여군(HCD+H)이다. 고콜레스테롤혈증 유발을 위한 사료로서, 사료의 식이 구성 중 총 칼로리의 43%를 지방으로 구성하고 콜레스테롤이 1.25%, cholic acid가 0.5% 첨가된 high cholesterol diet(HCD) 사료를 시험기간 동안 제공하였다. 식이는 일주일에 2회 공급하며 식이가 부족하지 않도록 제공하였다.
8-2) 이상지질혈증(고지혈증) 동물 모델 시험
HCD를 공급하는 기간 동안 양성대조군에는 Rosuvastatin 10mg/kg/dau을 투여하고, 실험군에는 ID-BBR4401을 각각 1x106 cells/rat/day, 1x107cells/rat/day, 1x108 cells/rat/day로 조제하여 주 5회(월~금), 6주간 경구 투여하였다. 6주간의 약물 투여가 완료된 동물을 부검 12시간 전 절식 한 후, ether로 흡입 마취하여 복대정맥에서 혈액을 획득하였다. 이후, 15ml cornical tube 에 넣고 3,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리 후 serum을 획득하였다. 또한, 간을 분리하여 무게를 측정하고 일부를 떼어 액체질소에서 동결시킨 후 -70 ℃에서 보관하였다.
8-3) 혈액 지질지표 측정
혈액 지질 지표는 triglyceride(TG), total cholesterol(TC), high density lipoprotein cholesterol(HDL-C), low density lipoprotein cholesterol(LDL-C)를 확인하였다. 혈액 지질 수치는 부검 시 획득한 serum을 이용하였다. 혈액지표는 TG, TC, HDL-C kit(아산제약) 을 사용하여 kit protocol에 따라 측정하였고, LDL-C의 경우 kit를 이용해 측정한 TG, TC, HDL-C 결과 수치를 Fridewald 공식(LDL-C = TC - HDL-C - (TG/5))을 이용하여 계산하였다.
혈중 지질 측정 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 ID-BBR4401 1x107 cells/rat/day(HCD+M) 및 1x108 cells/rat/day투여 군(HCD+H)은 vehicle 투여 군에 비해 혈중 TC와 LDL-C를 유의적으로 감소시킴으로써 고지혈증 및 고콜레스테롤혈증 개선에 우수한 효과를 보이는 것을 확인하였다.
8-4) 간 지질지표 측정
간 지질지표는 hepatic triglyceride(hepatic-TG), hepatic total cholesterol(hepatic-TC)를 확인하였다. 부검시 획득한 간 조직은 chloroform: methanol (2:1)용액을 간 조직 중량의 10배 volume 으로 첨가하고 homogenizer 를 이용하여 파쇄 한 후 생리 식염수(0.9% NaCl)를 methanol 과 동량 첨가하여 1분간 vortexing 한 후 centrifuge 를 이용해(2000rpm, 20min) chloroform 층을 획득하였다. 획득한 chloroform 층에 chloroform: methanol: 3mM sodium cholate (3:24:25)를 동량 첨가하여 1분간 vortexing 한 후 centrifuge 를 이용해 chloroform 층을 분리하였다. 획득한 chloroform 층을 80℃ water bath 에서 30분간 증발 시켜 lipid extract를 획득하였다. 획득한 lipid 의 TG, TC는 아산제약사의 TG, TC kit를 사용하여 kit protocol에 따라 측정하였다.
간 지질 측정 결과, 도 8에서 보는 바와 같이 간 hepatic-TC은 ID-BBR4401 투여 군 중 ID-BBR4401 1x107 cells/rat/day(HCD+M) 및 1x108 cells/rat/day투여 군(HCD+H)에서 유의적으로 감소함으로써 고콜레스테롤 혈증 개선 효과를 확인하였다. 뿐만아니라, 본 발명의 ID-BBR4401 투여 군에서는 hepatic-TG(중성지방)의 양이 투여 농도 의존적으로 감소되었으며, 특히 1x108 cells/rat/day투여 군에서 가장 좋은 hepatic-TG 감소 효과를 나타내었다.
8-5) 분변 담즙산 지표 측정
시험 종료 3일전 각 개체 별로 분변을 받아 중량을 측정하고 냉동하였다. 냉동된 분변은 동결건조를 통해 수분을 제거하였다. 건조된 분변으로부터 상기 실시예 7-4와 동일한 방법으로 lipid extract를 획득하였다. 획득한 lipid는 담즙산 측정 kit(Rat Total Bile Acids Assay Kit, Crystal Chem)를 사용하여 kit protocol에 따라 측정하였다.
실험결과 도 9에서 보는 바와 같이 각 실험군에서 분변으로부터의 담즙산 함량은, ID-BBR4401 투여 군 모두에서 vehicle에 비해 담즙산의 양이 증가하였으며, Rosuvastatin 투여군과 비교하여도 높은 수치를 나타내었으며 농도의존적으로 담즙산 양이 증가하여 1x108 cells/rat/day투여 군(HCD+H)에서 가장 많은 담즙산이 배출된 것으로 나타났다. 따라서 ID-BBR4401은 콜레스테롤을 전구체로 하는 담즙산과 특이적으로 결합하여 체외로 배출시킴으로써 체내 콜레스테롤 수치를 감소시킨다는 것을 확인하였다. 이러한 사실은 기존에 콜레스테롤 저하능이 있는 것으로 알려진 유산균 생균제들이 BSH(bile salt hydrolase) 활성을 통하여 소장으로 분비된 담즙산을 deconjugation시켜 유리 bile acid로 전환하고 이러한 유리된 bile acids는 conjugated bile acids보다 재흡수력이 떨어지므로써 체외로 배출되는 기작을 가지는 것과 구별된다. 사균제제인 본 발명의 ID-BBR4401은 BSH 활성이 없기 때문에, 상기 데이터들은 본 발명의 ID-BBR4401 제제가 담즙산과의 결합능력이 매우 우수함을 보여준다.
전술한 실시예들을 통하여 본 발명의 ID-BBR4401 사균 제제는 이의 생균 이상의 수준으로 콜레스테롤을 흡착하는 능력이 있을 뿐만아니라 담즙산과의 결합능력이 우수한 것이 그 특징으로서 이에 따라 체내 콜레스테롤(특히, LDL-콜레스테롤)의 감소능이 매우 현저하며, 뿐만아니라 체내(특히, 간) 중성지방을 감소시키는 효과가 현저하여 이상지질혈증의 예방 및 치료에 우수한 효능을 나타냄을 확인하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 내산성 및 내담즙성이 우수하며 이상지질혈증의 예방 또는 치료 효과를 가지는 신규 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP) 및 이의 사균체 ID-BBR4401에 관한 것으로, 본 발명의 신균주 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP)는 우수한 체내 콜레스테롤 감소 효과를 가질 뿐만아니라, 기존에 공지된 B. breve들과는 달리 매우 높은 수준의 내산성 및 내담즙성을 가지기 때문에 동물(특히, 인간)의 소화관 내에서 균주가 가지는 기능성을 잘 나타내며 생육하는 능력이 우수하여, 지속적이고 효과적인 체내 콜레스테롤 감소 기능성을 제공한다. 또한 상기 균주에 열처리하여 제조한 사균체(ID-BBR4401)는 콜레스테롤 결합능이 생균과 동등한 수준 내지 그 이상으로 우수할 뿐만아니라 담즙산과도 높은 수준의 결합능을 보유하여 담즙산의 체외 배출에 현저한 효능을 보인다. 이로부터 본 발명의 ID-BBR4401는 체내 콜레스테롤, 특히 LDL-콜레스테롤의 저감 효과가 매우 뛰어날 뿐만아니라 체내 중성 지방의 감소 효과가 현저하므로 이상지질혈증의 예방 및 치료에 있어서 우수한 효능을 보이므로, 의약 및 건강기능 식품 등의 관련 분야에서 산업상 이용가능성이 높다.
한국생명공학연구원 KCTC13169BP 20161202
<110> IL DONG PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Novel Bifidobacterium breve IDCC 4401 strain having high resistance ability of acid and bile salt and effect of preventing or treating dyslipidemia, and their killed form ID-BBR4401 <130> NP20-0043 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1402 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA sequence of Bifidobacterium breve IDCC 4401 <400> 1 tgcagtcgaa cgggatccat cgggctttgc ctggtggtga gagtggcgaa cgggtgagta 60 atgcgtgacc gacctgcccc atgcaccgga atagctcctg gaaacgggtg gtaatgccgg 120 atgctccatc acaccgcatg gtgtgttggg aaagcctttg cggcatggga tggggtcgcg 180 tcctatcagc ttgatggcgg ggtaacggcc caccatggct tcgacgggta gccggcctga 240 gagggcgacc ggccacattg ggactgagat acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt 300 ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagcgac gccgcgtgag ggatggaggc 360 cttcgggttg taaacctctt ttgttaggga gcaaggcact ttgtgttgag tgtacctttc 420 gaataagcac cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt gcaagcgtta 480 tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgta ggcggttcgt cgcgtccggt gtgaaagtcc 540 atcgcttaac ggtggatccg cgccgggtac gggcgggctt gagtgcggta ggggagactg 600 gaattcccgg tgtaacggtg gaatgtgtag atatcgggaa gaacaccaat ggcgaaggca 660 ggtctctggg ccgttactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat 720 accctggtag tccacgccgt aaacggtgga tgctggatgt ggggcccgtt ccacgggttc 780 cgtgtcggag ctaacgcgtt aagcatcccg cctggggagt acggccgcaa ggctaaaact 840 caaagaaatt gacgggggcc cgcacaagcg gcggagcatg cggattaatt cgatgcaacg 900 cgaagaacct tacctgggct tgacatgttc ccgacgatcc cagagatggg gtttcccttc 960 ggggcgggtt cacaggtggt gcatggtcgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1020 agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgccccg tgttgccagc ggattatgcc gggaactcac 1080 gggggaccgc cggggttaac tcggaggaag gtggggatga cgtcagatca tcatgcccct 1140 tacgtccagg gcttcacgca tgctacaatg gccggtacaa cgggatgcga cagcgcgagc 1200 tggagcggat ccctgaaaac cggtctcagt tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg 1260 aaggcggagt cgctagtaat cgcgaatcag caacgtcgcg gtgaatgcgt tcccgggcct 1320 tgtacacacc gcccgtcaag tcatgaaagt gggcagcacc cgaagccggt ggcctaaccc 1380 cttgcgggag ggagccgtct aa 1402

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  6. 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP), 이의 배양물 또는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 사균체 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 이상지질혈증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 균주(기탁번호: KCTC13169BP), 이의 배양물 또는 비피도박테리움 브레베 IDCC 4401 사균체 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 이상지질혈증의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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