KR20220002114A - 프로바이오틱 균주로 발효한 식용 곤충 발효물 및 이의 용도 - Google Patents

프로바이오틱 균주로 발효한 식용 곤충 발효물 및 이의 용도 Download PDF

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김민지
박자원
장현아
정승원
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단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
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Abstract

본 발명은 프로바이오틱 균주로 발효하여 제조한 식용 곤충 발효물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 KCTC13928BP로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 MKHA15 (Lactobacillus plantarum MKHA15) 균주로 쌍별귀뚜라미를 발효시켜 수득한 쌍별귀뚜라미 발효물, 이의 제조방법 및 상기 발효물을 포함하는 대사질환 예방 또는 치료 조성물을 제공한다.
상기 발효물은 항산화, 항당뇨, 항콜레스테롤 활성을 동시에 가지는 바, 이를 이용하여 비만, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병과 같은 대사 질환을 보다 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

프로바이오틱 균주로 발효한 식용 곤충 발효물 및 이의 용도{Edible insect fermentation products fermented using probiotic strain and uses thereof}
본 발명은 프로바이오틱 균주로 발효하여 제조한 항산화, 항당뇨, 항콜레스테롤 활성을 동시에 갖는 식용 곤충 발효물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 식용 곤충 발효물은 비만, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병과 같은 대사증후군의 예방, 개선 또는 치료에 효과적인 바, 대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품으로 이용될 수 있다.
최근 영양상태가 좋아지고 성인병이 늘어감에 따라 전 세계적으로 비만, 당뇨, 고지혈증 환자가 늘고 있으며, 이에 따른 질병부담감도 높아지고 있다.
당뇨병(diabetes mellitus)이란, 고혈당을 특징으로 하는 일련의 대사질환을 통칭하며, 특히 제2형 당뇨병은 인슐린 저항성과 인슐린 분비 감소를 특징으로 한다고 알려져 있다. 우리나라에서 당뇨병은 2017년 기준 사망 원인 6위로, 전체 사망률의 17.9%를 차지하고 있어 당뇨병의 예방과 관리 및 합병증 예방이 매우 중요한 실정이다. 건강보험심사평가원에 따르면, 우리나라의 당뇨병 환자 수는 2014년 240만 명에서 2018년 303만 명으로 여전히 증가하고 있으며, 당뇨병으로 인한 요양급여비용 또한 2014년 6247억 원에서 2018년 8605억 원으로 가파르게 증가하고 있다.
당뇨병의 약물적 치료로는 환자에게 인슐린을 투여하는 방법(제1형 당뇨병)과 경구 혈당강하제(제2형 당뇨병)를 복용하여 혈당을 조절하는 방법이 있으며, 구체적으로 경구 혈당강하제에는 설폰요소제, 비구아니드, 알파글루코시다제 저해제를 주로 사용하고 있다. 섭취한 음식물에 포함된 탄수화물은 알파아밀라아제, 글루코아밀라아제, 슈크라제, 알파글루코시다제 등과 같은 여러 탄수화물 분해효소에 의해 포도당과 같은 단당류로 분해되며, 혈액 내로 흡수되어 혈당을 높인다.
최근 연구에 따르면, 산화성 스트레스는 제2형 당뇨병의 요인이 될 수 있으며, 항산화 활성 물질의 섭취를 통해 활성산소를 제거하여 당뇨병 위험을 감소할 수 있음을 밝힌 바 있다.
아울러, 우리나라는 만 30세 이상에서 고콜레스테롤혈증 유병률은 2014년 이후 지속적으로 증가하여 2017년 남녀 모두 20%를 증가하였다. 고지혈증은 높은 농도의 콜레스테롤이 혈액에서 유지되는 현상으로, 혈청 내 콜레스테롤 및 중성지질의 증가가 고지혈증의 가장 일반적인 원인으로 취급되고 있는데 과다한 지방질의 축적으로 혈액순환장애 및 미세순환 부전을 일으킨다.
콜레스테롤은 동물의 지질 중에서 중요한 종류의 분자로서 스테로이드 호르몬, 담즙산 및 비타민 D의 전구체이다. 콜레스테롤은 물에 녹지 않기 때문에 혈장에서 단백질과 복합체(lipoprotein)를 이루어 전송된다. 이 복합체는 지질단백질인데 밀도에 따라 VLDL(very low density lipoprotein), IDL(intermediate density lipoprotein), LDL(low density lipoprotein) 및 HDL(high density lipoprotein)로 구분된다.
LDL-콜레스테롤의 농도가 증가하면 동맥경화나 관상동맥 심장질환의 위험이 높아진다. 반대로 HDL 콜레스테롤의 농도가 증가하면 동맥경화나 관상동맥 심장질환의 위험이 낮아진다. HDL이 아 콜레스테롤과 LDL의 농도가 증가하는 이유는, 섭취 식품, 비만, 유전적 요인(예를 들어, LDL 수용체 변이로 인한 유전적 고지혈증 환자), 당뇨병 및 갑상선 기능부진 등의 결과로 보인다.
한편, 식용 곤충(edible insects)은 소량의 사료와 물로도 생육할 수 있으며, 가축보다 저렴하게 양질의 단백질을 제공하여 식품공급의 한계를 극복하기 위한 중요한 대체 식품으로 주목받고 있다. 2020년 기준 한국에서 식품의약품안전처의 인정을 받아 식용할 수 있는 곤충은 갈색거저리 유충, 흰점박이꽃무지 유충, 장수풍뎅이 유충, 쌍별귀뚜라미 성충, 백강잠, 식용누에, 메뚜기, 아메리카왕거저리 유충으로 총 8종이 있다.
더불어, 유산균, 효모 등과 같은 유익한 미생물을 이용한 발효 연구는 새로운 생리 활성을 부여하며, 기존의 효능으로부터 다양한 유용 성분을 증가시키는 등의 이점을 가져 이와 관련한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 프로바이오틱스 균주는 정상적인 장관 미생물 균총의 유지 및 혈중 콜레스테롤 감소, 항암작용, 면역 증강작용 등의 유익한 효과를 지니는 것으로 알려져 있다.
이러한 프로바이오틱 균주를 이용하여, 당뇨병 개선 및 콜레스테롤 저하에 효과적인 기능성 식품 발굴의 중요성이 점차 강조되고 있다.
1. 한국등록특허 제10-1835383호 (2018.02.28)
본 발명의 목적은 우수한 생리활성을 가진, 프로바이오틱 균주로 발효한 식용 곤충 발효물 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 식용 곤충 발효물을 포함하는 대사 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KCTC13928BP로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 MKHA15 (Lactobacillus plantarum MKHA15) 균주로 쌍별귀뚜라미를 발효시켜 수득한 쌍별귀뚜라미 발효물을 제공한다.
본 발명은 상기 발효물을 유효성분으로 함유하는 대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 쌍별귀뚜라미 분말, 당 및 물을 넣어 혼합물을 제조하는 단계; 및 상기 혼합물을 멸균한 후, KCTC13928BP로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 MKHA15 (Lactobacillus plantarum MKHA15) 균주로 발효시키는 단계;를 포함하는 쌍별귀뚜라미 발효물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따라 프로바이오틱 균주에 의해 발효된 쌍별귀뚜라미 발효물은 우수한 항산화 활성, α-글루코시다제 및 α-아밀라아제에 대한 강력한 저해 활성으로 항당뇨 효과를 지님과 동시에, HMG-CoA 환원 효소 저해 활성이 우수하여 혈중 콜레스테롤 저감 효과를 함께 가질 수 있다.
이에, 상기의 발효물을 이용하여, 비만, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병과 같은 대사 질환을 보다 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예 따른 식용 곤충 발효물의 제조과정을 나타낸 것이다.
도 2는 도 1에 따라 제조된 식용 곤충 발효물의 소화 효소 저해 활성을 나타낸 그래프로, (a)는 α-글루코시다제(α-Glucosidase) 억제 활성, (b)는 α-아밀라아제(α-amylase) 억제 활성을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명자는 콜레스테롤에 의한 고지혈증 등의 질환을 예방 및/또는 개선하기 위한 제품에 적용 가능한 균주를 이용한 식용 곤충 발효물을 연구하던 중, 프로바이오틱 균주를 이용하여 식용 곤충을 발효한 경우, 항당뇨, 항산화, 항콜레스테롤 활성을 동시에 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 균주로 발효한 식용 곤충 발효물을 제공한다.
상세하게는, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 MKHA15 (Lactobacillus plantarum MKHA15; KCTC13928BP), 락토바실러스 플란타럼 KCTC3103 (Lactobacillus plantarum KCTC3103), 바실러스 아밀로리크페이션스 MKSK J1 (Bacillus amyloliquefaciens MKSK J1) 및 바실러스 아밀로리크페이션스 MKSE (Bacillus amyloliquefaciens MKSE)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 균주로 식용 곤충을 발효시켜 수득한 식용 곤충 발효물을 제공한다.
상기 식용 곤충은 갈색거저리 유충, 흰점박이꽃무지 유충, 장수풍뎅이 유충, 쌍별귀뚜라미, 백강잠, 식용누에, 메뚜기, 및 아메리카왕거저리 유충으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 본 발명은 KCTC13928BP로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 MKHA15 균주로 쌍별귀뚜라미를 발효시켜 수득한 쌍별귀뚜라미 발효물을 제공한다.
상기 발효물은 항산화, 항당뇨 또는 항콜레스테롤 활성을 가질 수 있고, 특히, 상기 MKHA15 균주로 발효시켜 수득한 쌍별귀뚜라미 발효물은 우수한 항산화, 항당뇨 및 항콜레스테롤 활성을 동시에 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 발효물은 우수한 항산화 활성뿐만 아니라, α-글루코시다제(α-Glucosidase) 또는 α-아밀라아제(α-amylase)에 대한 강력한 억제 활성을 나타내어, 우수한 항당뇨 효과를 가짐을 확인할 수 있다.
또한, 상기 발효물은 HMG-CoA(hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A) 환원 효소에 대해 강력한 저해 활성을 나타내어, 우수한 항콜레스테롤 효과를 가짐을 확인할 수 있다.
상기와 같은 효과를 가진 발효물은 대사 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 활용할 수 있다.
본 발명은 상기 발효물을 유효성분으로 함유하는, 대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 항산화, 항당뇨 및 항콜레스테롤 활성을 동시에 가질 수 있어, 대사 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
상기 대사 질환은 비만, 지방간, 당뇨, 고혈압, 고콜레스테롤혈증 및 동맥경화로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 쌍별귀뚜라미 발효물의 활성 및 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.
상기 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 보다 상세하게는 통상의 방법에 따라 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 비경구형 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 경구형 제형 중 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 겔제, 캡슐제 등의 형태로, 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 만니톨, 셀룰로오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함될 수 있다. 또한, 캡술제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 경구형 제형 중 액상 제형은 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 비경구 제형은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 치료 효능의 증진을 위해 칼슘이나 비타민 등을 더 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.
상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 대사 질환이 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여할 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피부 도포, 호흡기내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere-broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 대사 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물치료 등과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 발효물을 유효성분으로 함유하는, 대사 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 항산화, 항당뇨 및 항콜레스테롤 활성을 동시에 가질 수 있어, 대사 질환의 예방 또는 개선에 유용하게 활용될 수 있다.
상기 대사 질환은 상기 대사 질환은 비만, 지방간, 당뇨, 고혈압, 고콜레스테롤혈증 및 동맥경화로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품은 대사 질환의 예방 또는 개선 목적으로, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가될 수 있다.
상기 건강기능식품은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 음료 및 각종 드링크, 과실 및 그의 가공식품(과일통조림, 잼 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(햄, 베이컨 등), 빵류 및 면류, 쿠키 및 스낵류, 유제품(버터, 치즈 등) 등이 가능하며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함할 수 있다. 또한, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 식품학적으로 허용 가능한 식품 첨가제(식품 첨가물) 및 적절한 기타 보조 성분을 더 포함하여 제조될 수 있다. 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정할 수 있다. 상기 '식품첨가물공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초 추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
상기 기타 보조 성분은 예를 들어, 향미제, 천연 탄수화물, 감미제, 비타민, 전해질, 착색제, 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 특히, 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있으며, 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품에 함유된 상기 쌍별귀뚜라미 발효물의 유효 용량은 대사 질환의 예방 또는 개선 등 그 사용 목적에 따라 적절하게 조절될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 식품을 원료로 하여 일반 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 대사 질환의 예방 또는 개선을 위한 보조제로 섭취될 수 있다.
또한, 본 발명은 식용 곤충 발효물의 제조방법을 제공한다.
상세하게는, 상기 제조방법은 쌍별 귀뚜라미 분말, 당 및 물을 넣어 혼합물을 제조하는 단계; 및 상기 혼합물을 멸균한 후, 락토바실러스 플란타럼 MKHA15 (Lactobacillus plantarum MKHA15; KCTC13928BP), 락토바실러스 플란타럼 KCTC3103 (Lactobacillus plantarum KCTC3103), 바실러스 아밀로리크페이션스 MKSK J1 (Bacillus amyloliquefaciens MKSK J1) 및 바실러스 아밀로리크페이션스 MKSE (Bacillus amyloliquefaciens MKSE)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 균주로 발효시키는 단계;를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 발효시키는 단계는 KCTC13928BP로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 MKHA15 (Lactobacillus plantarum MKHA15) 균주로 발효시키는 것일 수 있다.
상기 당은 글루코스(glucose), 수크로스(sucrose), 말토오스(maltose), 갈락토오스(galactose), 락토스(lactose), 만노스(mannose), 말토올리고당(maltooligosaccharide), 프럭토올리고당(fructooligosaccharide), 전분(starch) 및 덱스트린(dextrin)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상일 수 있고, 바람직하게는 글루코스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 발효물은 항산화, 항당뇨 또는 항콜레스테롤 활성을 가질 수 있고, 특히, 상기 MKHA15 균주로 발효시켜 수득한 쌍별귀뚜라미 발효물은 항산화, 항당뇨 및 항콜레스테롤 활성을 동시에 가질 수 있다.
이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 제조예 1> 식용 곤충 발효물 제조
발효 종균으로 프로바이오틱 락토바실러스 플란타럼 MKHA15 (Lactobacillus plantarum MKHA15; KCTC13928BP), 락토바실러스 플란타럼 KCTC3103 (Lactobacillus plantarum KCTC3103) 및 바실러스 아밀로리크페이션스 MKSK J1 (Bacillus amyloliquefaciens MKSK J1; KCTC18452P)과 프로바이오틱 활성이 없는 바실러스 아밀로리크페이션스 MKSE (Bacillus amyloliquefaciens MKSE; KCTC18753P)를 사용하여 도 1에 따른 제조과정에 따라 식용 곤충 발효물을 제조하였다.
발효 종균은 접종 전, 락토바실러스 플란타럼은 MRS 배지에 바실러스 아밀로리크페이션스는 NB 배지에 35℃에서 24시간 키워서 사용하였다. 쌍별 귀뚜라미 분말 100g을 2.5% 포도당(glucose)이 함유된 액체에 1:5의 비율로 넣은 후 121℃, 15 psi에서 20분간 멸균하였다. 그 후 35℃까지 식힌 후 발효 종균을 5% 각각 접종한 후 35℃, 130 rpm에서 24시간 동안 배양하였다. 발효액은 4,000 g에서 5분간 원심분리 후 상등액을 실험에 사용하였다.
< 실시예 1> 식용 곤충 발효물의 생리 활성 확인
하기 표 1은 프로바이오틱 락토바실러스 플란타럼 MKHA15 및 바실러스 아밀로리크페이션스 MKSK J1의 생균 및 생리적 특성을 비교한 것이다.
MKHA15 MKSK-J1

Acid and bile salt tolerance
 Survival rate to pepsin (%)
96.30 ± 0.101)
91.85 ± 4.98
Survival rate to bile salt (%)
53.56 ± 5.86
90.31 ± 0.44

Safety test
 γ-hemolysis γ-hemolysis
β-glucuronidase negative
N.D.2)

Enzymatic characteristics
Amylase		 Negative (qualitative) 1.37 ± 0.63
(U/mL)

Protease
N.D.		 23.22 ± 0.21
(U/mL)

Antioxidant
activity		 DPPH radical scavenging activity (%)
100.53 ± 6.91
7.69 ± 2.71
SOD-like activity (%)
56.62 ± 1.77
28.10 ± 2.04
Reducing power
(% ascorbic acid)
98.76 ± 7.12
41.36 ± 0.63

Anti-diabetic activity		 α-amylase inhibitory activity (%)
69.68 ± 2.38
None
α-glucosidase inhibitory activity (%)
99.25 ± 4.74
7.24

Anti-cholesterol activity		 HMG-CoA reductase inhibitory activity (%)
65.81 ± 6.50
-6.04 ± 7.70
1) Values are mean ± standard error (n = 2).
2) N.D. = not determined
하기 표 2는 식용곤충을 발효하는 동안 생존하는 세균 수 및 pH의 변화를 나타낸 것이다.
Viable Cell Counts (log CFU /mL)
0 h 1) 24 h
CON 0.00 ± 0.00 b 8.53 ± 0.19 a
SKGB 5.40 ± 0.14 b 8.88 ± 0.17 a
SEGB 6.11 ± 0.00 b 8.72 ± 0.17 a
HAGB 8.22 ± 0.13 b 9.52 ± 0.17 a
LPGB 7.85 ± 0.00 b 9.25 ± 0.03 a
pH
0 h 24 h
CON 7.08 a 6.32 ± 0.21 b
SKGB 7.05 a 6.27 ± 0.01 b
SEGB 6.72 a 5.72 ± 0.00 b
HAGB 6.67 a 3.97 ± 0.02 b
LPGB 6.37 a 4.27 ± 0.00 b
1) Fermentation time. Values are mean ± standard error (n = 2). Means with different superscripts in a row (a,b) are significantly different by Fisher’s least significant difference test (p < 0.05).

- CON : 종균 접종을 하지 않은 쌍별귀뚜라미
- SKGB : Bacillus amyloliquefaciens MKSK-J1로 발효한 쌍별귀뚜라미
- SEGB : Bacillus amyloliquefaciens MKSE로 발효한 쌍별귀뚜라미
- HAGB : Lactobacillus plantarum MKHA15로 발효한 쌍별귀뚜라미(탄소원:글루코스)
- LPGB : Lactobacillus plantarum KCTC3103으로 발효한 쌍별귀뚜라미 (이하 동일)
발효 종균을 접종하지 않은 CON은 24시간 발효 후 최대 8.53 log CFU/mL까지 미생물 성장을 나타내었다. 미생물의 형태 및 생물학적 분석을 통해 바실러스로 확인이 되었다. 해당 바실러스 균은 고온고압 멸균 과정에서 내생포자를 생성한 후 배양기간 동안 성장했을 수 있다.
본 실시예에서 모든 발효 종균은 24시간 동안 8.5 log CFU/mL 이상 생균수를 보였으며, 이는 프로바이오틱 식품에서 프로바이오틱스 치료 효과를 얻기 위해 최소 필요한 생균수인 6 log CFU/mL (Xiao et al. 2015)을 충족하였다. 24시간 발효 후 모든 샘플은 pH가 낮아졌으며, 젖산균인 MKHA15와 KCTC3103으로 발효한 HAGB와 LPGB는 모두 pH가 약 4 정도로 낮아졌다.
< 실시예 2> 식용 곤충 발효물의 항산화 활성 확인
하기 실험들을 통해 식용 곤충 발효물의 항산화 활성을 확인하고자 하였다.
2-1. DPPH 라디칼 소거능 ( DPPH radical scavenging activity)
시료 100μL과 0.2 mM DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 1.2 mL을 혼합하여 암실에서 30분 반응 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 발효 상등액 대신 메탄올(methanol)을 100μL 첨가하고, blank는 DPPH 대신 메탄올을 1.2 mL 첨가하여 측정하였으며, 양성 대조군으로는 아스코르브산(ascorbic acid, 1 mg/mL)을 사용하였다. 샘플 농도별 활성을 측정하여 EC 50 value (mg/mL)를 계산하였으며, % 활성 계산식은 하기 식 1과 같다.
<식 1>
Figure pat00001
- Abs sample = 시료의 흡광도
- Abs blank = blank의 흡광도
- Abs control = 대조구의 흡광도 (이하 동일)
2-2. SOD 유사 활성 (SOD like activity)
시료 100μL과 0.05 M Tris-HCl buffer 1.5 mL, 7.2mM 피로갈롤(pyrogallol) 100μL을 혼합하여 10분 실온에 방치 후, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 발효 상등액을 넣지 않고, 0.05M Tris-HCl buffer 1.6 mL을 첨가하여 측정하였고, blank는 Pyrogallol을 넣지 않고, Tris-HCl buffer 1.6 mL을 첨가하여 측정하였다. 샘플 농도별 활성을 측정하여 IC 50 value (mg/mL)를 계산하였으며, % 활성 계산식은 하기 식 2와 같다.
<식 2>
Figure pat00002
2-3. 환원력 (Reducing power)
시료 250μL에 0.2 M 인산나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer, pH 6.6) 250μL 및 1% 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide) 250μL을 넣어 50℃에서 20분 반응시킨 후 10% TCA로 반응을 종료하였다. 반응액을 10,000 rpm에서 5분 원심분리한 후 증류수 500μL과 0.1% 염화제2철(ferric chloride) 100μL을 넣어 700 nm에서 흡광도 측정하였다. 양성 대조군으로 아스코르브산 (1 mg/mL)을 사용하였다. 샘플 농도별 활성을 측정하여 EC 50 value (mg/mL)를 계산하였으며, % 활성 계산식은 아스코르브산의 Abs (at 700nm)를 100%로 하여, 상대적인 활성을 하기 식 3과 같이 계산하였다.
<식 3>
Figure pat00003
- Abs positive control = 양성 대조군(ascorbic acid)의 흡광도
2-4. 총 폴리페놀( TPC ) 함량
TPC 함량은 Folin-Ciocaltue 방법(Obanda and Owor, 1997)의 방법에 따라 측정하였고, 갈산(gallic acid)을 표준용액으로 사용하였다.
하기 표 3은 상기 방법에 따라 확인한 식용 곤충 발효물의 항산화 활성을 나타낸 것이다.
하기 표 3을 참조하면, EC50으로 표현된 DPPH 라디칼 소거 활성은 SKGB 및 SEGB (8.21 및 8.88 mg/mL)에서 현저히 낮았으며, LPGB (12.71 mg/mL), HAGB (17.05 mg /mL) 및 CON (19.60 mg)이 그 뒤를 이었다. 또한, 환원력의 EC50은 SKGB (0.29 mg/mL)에서 현저히 낮았고, HAGB (0.69 mg/mL), SEGB (0.88 mg/mL), LPGB (0.94 mg/mL) 및 CON (2.06 mg/mL) 순이었다. SOD-유사 활성의 IC50 값은 HAGB (22.37 mg/mL)이 현저히 낮았고, 그 다음으로 LPGB (30.51 mg/mL), SEGB (46.41 mg/mL), SKGB (49.79 mg/mL), 및 CON (67.34 mg/mL) 순 이었다.
DPPH Radical Scavenging Activity
(EC50 mg/mL)
SOD-Like Activity
(IC50 mg/mL)
Reducing Power
(EC50 mg/mL)
TPC
(mg GAE/g)
CON 19.60 ± 3.94 a 67.34 ± 8.22 a 2.06 ± 0.30 a 91.30 ± 24.18 c
SKGB 8.21 ± 0.24 c 49.79 ± 6.85 a,b 0.29 ± 0.02 c 367.50 ± 3.13 a,b
SEGB 8.88 ± 1.80 c 46.41 ± 2.64 b,c 0.88 ± 0.03 b 393.21 ± 30.81 a
HAGB 17.05 ± 1.10 a,b 22.37 ± 0.54 d 0.69 ± 0.04 b 329.40 ± 7.64 b
LPGB 12.71 ± 0.82 b,c 30.51 ± 3.06 c,d 0.94 ± 0.00 b 409.00 ± 16.00 a
Values are mean ± standard error (n = 2). Means with different superscripts in a column (a-d) are significantly different in terms of Fisher’s least significant difference test (p < 0.05).
발효 과정에서 종균은 바이오 컨버젼을 통해 단백질, 탄수화물, 폴리페놀 등을 원료에서 분해하여 항산화 활성과 같은 특정 기능을 향상시킬 수 있다. 또한, 바실러스 균은 다양한 가수 분해 효소를 분비하여 고분자량 물질을 분해하여 저분자 기능성 화합물이나 펩티드를 생산하는 능력이 뛰어나다. 반면에 락토바실러스 균은 호기적 조건에서 배양시 산소와의 반응에 의해 생성된 자유 라디칼을 제거하는 SOD 유사 효소를 가지고 있다. 또한, 젖산균이 생산하는 세포외 분비 복합탄수화물(exopolysaccharide)은 SOD와 같은 항산화 활성을 가지고 있는 것으로 보고된 바 있다.
발효된 쌍별귀뚜라미의 총 페놀 함량(TPC)은 CON (91.30 mg GAE/g)보다 종균 접종하여 발효한 쌍별귀뚜라미 (329.40-409.00 mg GAE/g)가 유의적으로 많았다.
< 실시예 3> in-vitro 소화(digestion)에 따른 항산화 활성 증가 확인
발효 소재의 소화에 따른 항산화 활성 측정을 위해서 인공 위장관 모델을 이용하여 분석하였다. 간략하게 α-아밀라아제(α-amylase)(75 units/mL)와 혼합하여 37℃에서 2분 동안 반응시킨 후, 15 mL의 위액(gastric juice)과 혼합하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. pH를 6.9로 조정한 후, 10 mL의 장액(intestinal juice)를 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 후, 100℃에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화시킨 뒤, 20분 동안 6,000 rpm 및 4℃ 조건에서 원심분리한 후 상등액의 항산화 활성을 측정하였다.
하기 표 4는 식용 곤충 발효물의 in-vitro 소화(digestion)에 따른 항산화 활성 및 총 페놀 함량을 나타낸 것이다.
하기 표 4를 참조하면, SKGB와 HAGB에서는 소화 후 TPC가 7배 이상 크게 증가하였다. 또한, SKGB와 HAGB에서 in vitro 소화 후에도 환원력이 크게 증가하였다. 여러 연구에 따르면 소화 과정은 생리 활성 화합물을 방출하여 유익한 효과를 발휘할 수 있으며, 단백질의 효소 소화에 의해 얻은 추출물, 발효 제품 또는 펩타이드의 페놀 화합물로 인해 항산화 활성도 증가한다고 보고한 바 있다. 전반적으로 프로바이오틱 종균(MKHA15 및 MKSK-J1)를 사용하여 발효된 쌍별귀뚜라미는 소화 후 전반적으로 높은 항산화 활성을 나타내었다.
DPPH Radical Scavenging Activity (%) SOD-Like Activity (%) Reducing Power
(% Ascorbic Acid)
 TPC
(mg GAE/mL)
Before After Before After Before After Before After
CON 28.88 ± 4.73 A,a 13.58 ± 3.53 A,b 9.61 ± 1.94 A,b 13.84 ± 2.40 A,c 39.15 ± 2.78 B,b 60.33 ± 0.71 A,b 9.13 ± 2.42 A,a 10.54 ± 0.86 A,b
SKGB 28.55 ± 4.20 A,a 17.77 ± 0.33 A,b 17.13 ± 3.34 A,a 15.34 ± 1.40 A,b,c 46.47 ± 0.68 B,a 86.06 ± 0.91 A,a 1.28 ± 0.03 B,c 12.48 ± 0.00 A,a
SEGB 1.92 ± 0.87 B,c 30.49 ± 1.15 A,a 9.75 ± 3.63 A,b 7.00 ± 1.79 A,d 37.71 ± 0.07 A,b 37.36 ± 0.04 B,d 5.51 ± 0.24 A,b 2.38 ± 0.27 B,d
HAGB 12.42 ± 1.32 A,b 5.62 ± 1.39 B,c 9.60 ± 2.15 B,b 21.18 ± 2.47 A,a 29.28 ± 0.08 B,c 43.08 ± 0.19 A,c 0.64 ± 0.02 B,c 7.99 ± 0.79 A,c
LPGB 2.36 ± 1.76 B,c 15.97 ± 0.78 A,b 10.70 ± 2.11 B,b 19.11 ± 0.50 A,a,b 23.65 ± 0.56 A,c 24.73 ± 0.17 A,e 4.73 ± 0.04 A,b 1.10 ± 0.07 B,d
Ascorbic acid
(1mg/mL)
97.41 ± 1.94
72.15 ± 4.98

100

N.D.
Values are mean standard error (n = 2). Means with different superscripts in a row (A,B) and a column (a-e) are significantly different in terms of Fisher’s least significant difference test (p < 0.05).
N.D. = not determined.
< 실시예 4> 소화 효소 저해 활성 확인
탄수화물 소화효소의 저해활성은 다음과 같이 수행하였다.
4-1. α- 글루코시다제 (α- Glucosidase ) 저해 활성
시료 50μL에 0.02 M sodium phosphate buffer (SPB, pH 6.8) 50μL, p-nitropheyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) 200μL 및 α-glucosidase solution 50μL을 첨가한 후 37℃에서 40분간 배양하였다. 0.1 M Na2CO3 1.5 mL 첨가하여 반응을 정지한 후 UV/Visible Spectrophotometer를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 SPB를 첨가하였고, blank는 α-glucosidase와 pNPG 대신 SPB를 첨가하여 측정하였다. 양성 대조군으로는 아카보즈(acarbose)(1 mg/mL)를 사용하였으며, 저해 활성 계산식은 하기 식 4와 같다.
<식 4>
Figure pat00004
4-2. α-아밀라아제(α-amylase) 저해 활성
시료 50μL에 0.02 M SPB (pH 7.0) 50μL, 1% soluble starch solution 200μL, α-amylase enzyme 50μL을 혼합하여 37℃ water bath에서 40분 반응하였다. 이후, DNS solution 1 mL을 첨가하여 95℃ water bath에서 5분 반응 후, 증류수를 3 mL 첨가하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 SPB를 첨가하였고, blank는 α-glucosidase와 pNPG 대신 SPB를 첨가하여 측정하였다. 양성 대조군으로는 acarbose (1 mg/mL)를 사용하였으며 저해 활성 계산식은 하기 식 5와 같다.
<식 5>
Figure pat00005
탄수화물 가수 분해 효소의 억제는 2형 당뇨병을 치료하는 방법 중 하나이다. 식용 곤충 발효물의 탄수화물 소화 효소의 저해 활성을 확인한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, HAGB의 알파 글루코시다제(α-Glucosidase) 저해 활성은 농도 의존적으로 유의하게 증가하여 강한 억제 활성을 나타냈다 (30 mg/mL에서 96%). LPGB의 알파 글루코시다제 저해 활성은 50 mg/mL에서 39.61%까지 증가한 반면, CON, SKGB 및 SEGB는 50 mg/mL (12.36-14.64%)에서도 매우 낮았다.
HAGB의 알파 아밀라아제(α-amylase) 저해 활성은 농도가 증가함에 따라 크게 증가하여 50 mg/mL에서 68.48%의 저해를 나타내었다. 한편, 다른 발효 쌍별귀뚜라미는 알파 아밀라아제 억제에 영향을 미치지 않았다. MKHA15 균주의 알파 글루코시다제 및 알파 아밀라아제 저해 활성은 각각 99.25% 및 69.68%이다 (표 1). MKHA15의 탄수화물 효소 저해 활성은 쌍별귀뚜라미 발효 후에도 강하게 유지되어 HAGB가 우수한 항당뇨 활성을 나타냈다. 반면, LPGB의 알파 글루코시다제 저해 활성은 39.61%이고 알파 아밀라아제 저해 활성에는 영향을 주지 않아 HAGB와 같은 강력한 항당뇨 작용을 나타내지는 않았다. HAGB는 동일한 L. plantarum 종으로 발효된 LPGB 보다 훨씬 높은 항당뇨 활성을 가질 수 있다.
< 실시예 5> HMG - CoA 환원 효소 저해 활성 확인
HMG-CoA reductase assay kit (Sigma Aldrich, USA)를 사용하여 측정하였다. 시료 1μL, 1X buffer 182μL, HMG-CoA 12μL, 니코틴아마이드-아데닌-디뉴클레오타이드 포스페이트(Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH) 4μL와 HMG-CoA reductase 2μL을 순서대로 혼합하여 340 nm에서 10분간 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 고지혈증 치료제로 사용되는 스타틴 계열 약물인 아토르바스타틴(atorvastatin, 100 mM)을 사용하였으며, 계산식은 하기 식 6과 같다.
<식 6>
Figure pat00006
하기 표 5는 식용 곤충 발효물의 HMG-CoA 환원 효소 저해 활성을 나타낸 것이다.
HMG-CoA Reductase Inhibitory Activity (%)
CON 2.91 ± 6.02 d
SKGB 45.50 ± 5.99 c
SEGB 37.90 ± 2.88 c
HAGB 120.89 ± 0.42 a
HAGB-S 83.68 ± 6.60 a
LPGB 103.24 ± 9.11 b
Atorvastatin (100 mM) 111.24 ± 8.60
Values are mean ± standard error (n = 2). Means with different superscripts in a column (a-d) are significantly different in terms of Fisher’s least significant difference test (p < 0.05).
HAGB-S : Lactobacillus plantarum MKHA15로 발효한 쌍별귀뚜라미(탄소원:수크로스)
종균으로 발효한 모든 쌍별귀뚜라미의 HMGRI 활성은 CON (2.91 %)보다 유의적으로 높았다. 특히 HAGB는 양성 대조군으로 사용된 아토르바스타틴 (111.24%)과 LPGB (103.24%)보다 훨씬 강한 HMGRI 활성 (120.89 %)을 보였다. SKGB (45.50 %)와 SEGB (37.90 %)는 유사한 HMGRI 활동성을 보였다. MKSK-J1은 HMGRI 활성이 없었지만 (표 1), 쌍별귀뚜라미 발효 후 45.5%로 증가하였다. 이는 발효 과정에서 쌍별귀뚜라미와 종균 사이의 상호 작용에 의해 생성되는 다양한 생리 활성 물질에 의해 발생하는 것으로 생각된다. HMGRI 활성 결과에 대해 주목해야 할 또 다른 점은 CON에 대한 억제 활성이 없다는 것이다.
또한, 탄소원으로 글루코스(glucose)를 사용한 MKHA15 발효 쌍별귀뚜라미 발효물 HAGB와 탄소원으로 수크로스(sucrose)를 사용한 MKHA15 발효 쌍별귀뚜라미 발효물 HAGB-S의 HMGRI 활성을 비교하면, 글루코스를 사용한 경우에 수크로스를 사용한 경우 보다 HMGRI 활성이 우수함을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
한국생명공학연구원 KCTC13928BP 20190827

Claims (8)

  1. KCTC13928BP로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 MKHA15 (Lactobacillus plantarum MKHA15) 균주로 쌍별귀뚜라미를 발효시켜 수득한 쌍별귀뚜라미 발효물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 발효물은,
    항산화, 항당뇨 및 항콜레스테롤 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 쌍별귀뚜라미 발효물.
  3. 제 1 항에 따른 발효물을 유효성분으로 함유하는, 대사 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 조성물은,
    항산화, 항당뇨 및 항콜레스테롤 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 대사 질환은,
    비만, 지방간, 당뇨, 고혈압, 고콜레스테롤혈증 및 동맥경화로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  6. 제 1 항에 따른 발효물을 유효성분으로 함유하는, 대사 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  7. 쌍별귀뚜라미 분말, 당 및 물을 넣어 혼합물을 제조하는 단계; 및
    상기 혼합물을 멸균한 후, KCTC13928BP로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 MKHA15 (Lactobacillus plantarum MKHA15) 균주로 발효시키는 단계;를 포함하는, 쌍별귀뚜라미 발효물의 제조방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 발효물은,
    항산화, 항당뇨 및 항콜레스테롤 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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