JP6913670B2 - キメラポリペプチドアセンブリーならびにそれを作製および使用する方法 - Google Patents

キメラポリペプチドアセンブリーならびにそれを作製および使用する方法 Download PDF

Info

Publication number
JP6913670B2
JP6913670B2 JP2018510735A JP2018510735A JP6913670B2 JP 6913670 B2 JP6913670 B2 JP 6913670B2 JP 2018510735 A JP2018510735 A JP 2018510735A JP 2018510735 A JP2018510735 A JP 2018510735A JP 6913670 B2 JP6913670 B2 JP 6913670B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cancer
antigen
chimeric polypeptide
cells
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2018510735A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2018533909A (ja
JP2018533909A5 (ja
Inventor
フォルカー シェレンバーガー,
フォルカー シェレンバーガー,
ファン ヤン,
ファン ヤン,
デジレー セイヤー,
デジレー セイヤー,
ビー−チェン シム,
ビー−チェン シム,
チア−ウェイ ワン,
チア−ウェイ ワン,
Original Assignee
アムニクス ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド
アムニクス ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アムニクス ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド, アムニクス ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド filed Critical アムニクス ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド
Publication of JP2018533909A publication Critical patent/JP2018533909A/ja
Publication of JP2018533909A5 publication Critical patent/JP2018533909A5/ja
Priority to JP2021115243A priority Critical patent/JP2021178831A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6913670B2 publication Critical patent/JP6913670B2/ja
Priority to JP2024065385A priority patent/JP2024105275A/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00Antineoplastic agents
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602Vertebrate cells
    • C12N5/0693Tumour cells; Cancer cells
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55Fab or Fab'
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565Complementarity determining region [CDR]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622Single chain antibody (scFv)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/01Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/01Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/20Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/30Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/31Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/50Fusion polypeptide containing protease site
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00Culture process characterised by temperature

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

多くの認可されたがん治療薬は、正常細胞ならびに腫瘍細胞を殺傷する細胞傷害薬である。これらの細胞傷害薬の治療的利益は、正常細胞よりも感受性が高い腫瘍細胞に依存し、それによって、許容されない副作用をもたらさない用量を使用して臨床応答を達成することができる。しかしながら、これらの非特異的薬物の本質的に全てが、正常組織に対する重大ではないとしてもいくらかの損傷をもたらし、処置の好適性を制限することが多い。
二特異的抗体は、それらが免疫エフェクター細胞にがん細胞を殺傷するように指令する点で、細胞傷害薬とは異なる手法を提供する。二特異的抗体は、単一の組成物中で2つのモノクローナル抗体に由来する異なる結合特異性の利益を組み合わせ、単一特異的抗体を用いた場合には不可能である適用範囲の手法または組合せを可能にする。この手法は、二特異的抗体の一方のアームの、腫瘍関連抗原またはマーカーへの結合に依拠するが、他方のアームは、T細胞上のCD3分子に結合する際に、TNF−α、IFN−γ、インターロイキン2、4および10、パーフォリン、ならびにグランザイムなどのエフェクター分子の放出によってその細胞傷害活性を誘発する。抗体工学における進歩は、ブリナツモマブなどのBi−specific T−cell Engager(BiTE(登録商標))を含む、エフェクター細胞を腫瘍標的に向け直すためのいくつかの二特異的抗体形式および組成物の開発をもたらした。BiTEは、腫瘍部位でT細胞のポリクローナル集団を動員および活性化することによって機能し、共刺激または従来のMHC認識を必要とすることなくそのように機能する。しかしながら、BiTE組成物が非常に短い半減期を有し、治療効果を達成するのに十分な時間治療濃度域内にBiTEを維持するためには4〜8週間の連続注入を必要とするという事実に加えて、数あるサイトカインの中でも、特にTNF−αおよびIFN−γの放出によって媒介される「サイトカインストーム」または「サイトカイン放出症候群」(Lee DWら、Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome.、Blood. 2014年、124巻(2号):188〜195頁)と呼ばれる深刻な副作用を経験するある特定の患者の二重の問題が依然として残っている。
Lee DWら、Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome.、Blood. 2014年、124巻(2号):188〜195頁
そのような二特異的抗体形式の薬理学的利点を提供するが、低頻度の投薬または単回注射による投薬のみを要するなど、安全性の増加、副作用の減少、選択性の増大、および/または薬物動態特性の増強を示す代替的な治療薬のかなりの必要性が依然として残っている。
本発明は、限定されるものではないが、がん、自己免疫、および炎症障害を含む疾患の処置または防止において有用なキメラポリペプチドアセンブリーを開示する。第1の態様では、本開示は、切断性キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。切断性キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、満たされない必要性に対処し、使用中の従来の二特異的抗体調製物と比較して終末半減期の増強、標的化された送達、および健康な組織に対する毒性の低下を含む1つまたは複数の態様において優れている。
対象のポリペプチドアセンブリーは、典型的には、第1の部分、第2の部分、および第3の部分を含み、前記第1の部分は、(i)標的細胞マーカーに対する結合特異性を有する第1の結合ドメイン;および(ii)エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第2の結合ドメインを含み;前記第2の部分は、1つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼにより切断され得るペプチジル放出セグメント(RS)を含み;前記第3の部分は、バルキング部分を含み;前記バルキング部分は、前記第2の部分に対する前記哺乳動物プロテアーゼの作用によって前記第1の部分から放出され得る。
対象のキメラポリペプチドアセンブリー中の様々な構成成分を、様々な異なる順序で構成させることができる。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーは、N末端からC末端に向かって構成され、第1の部分は第2の部分に連結され、次いで、第2の部分は第3の部分に連結されている。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーは、N末端からC末端に向かって構成され、第3の部分は第2の部分に連結され、次いで、第2の部分は第1の部分に連結されている。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーは、融合タンパク質である。別の実施形態では、第2および第3の部分は融合タンパク質であり、第1の部分は第2の部分にコンジュゲートされている。化学的にコンジュゲートされたポリペプチドアセンブリー組成物の一実施形態では、第1の部分のポリペプチドのC末端を、マレアミドまたは当技術分野で公知の他の架橋剤などの薬剤による架橋を受けやすいシステインまたは他の好適なアミノ酸を介して、第2の部分のポリペプチドのN末端にコンジュゲートさせることができる。別の実施形態では、第1の部分および第2の部分はモノマー融合タンパク質であり、第3の部分は第2の部分に化学的にコンジュゲートされている。
任意選択で、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、組成物の反対側の末端に連結された第2の放出セグメントによって組成物に連結されたさらなるバルキング部分を含んでもよく、それによって、第1および第2の部分を封入する。
第1および第2の結合ドメインは、一般的には、モノクローナル抗体に由来する抗体断片である。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第1の部分の第1および第2の結合ドメインは、scFvであるか、またはダイアボディとして構成される。他の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第1の部分の第1および第2の結合ドメインは、Fv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、線状抗体、単一ドメイン抗体、非抗体足場、および単一ドメインラクダ抗体からなる群から選択される。他の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第1の部分の第1および第2の結合ドメインは、ペプチド、アンチカリン、アドネクチン、フィノマー、アフィリン、アフィボディ、センチリン、DARPinなどの非抗体足場の群から選択される。他の実施形態では、腫瘍細胞標的のための結合ドメインは、腫瘍細胞によって過剰発現されるタンパク質のペプチド断片を搭載しているMHCに結合するように操作されたT細胞受容体の可変ドメインである。
キメラポリペプチドアセンブリーの一実施形態では、第1の部分の第1の結合ドメインは、標的細胞マーカーに対する結合親和性を有する。標的細胞は、外胚葉、中胚葉または内胚葉起源のものなどの真核生物の任意の細胞型を含む。特に興味深いものは、腫瘍細胞および腫瘍細胞によって発現されるマーカーである。腫瘍細胞は、間質細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、グリア細胞、上皮細胞、脂肪細胞、リンパ球細胞、血管細胞、平滑筋細胞、間葉細胞、乳房組織細胞、前立腺細胞、腎臓細胞、脳細胞、結腸細胞、卵巣細胞、子宮細胞、膀胱細胞、皮膚細胞、胃細胞、尿生殖路細胞、頸部細胞、子宮細胞、小腸細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、胆嚢細胞、胆管細胞、食道細胞、唾液腺細胞、肺細胞、および甲状腺細胞からなる群から選択される細胞から生じてもよい。一部の場合では、腫瘍特異的マーカーとしては、アルファ4インテグリン、Ang2、B7−H3、B7−H6、CEACAM5、cMET、CTLA4、FOLR1、EpCAM、CCR5、CD19、HER2、HER2 neu、HER3、HER4、HER1(EGFR)、PD−L1、PSMA、CEA、MUC1(ムチン)、MUC−2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16 βhCG、Lewis−Y、CD20、CD33、CD38、CD30、CD56(NCAM)、CD133、ガングリオシドGD3;9−O−アセチル−GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、GD2、炭酸脱水酵素IX、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue−1、形質細胞抗原1、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、CCR8、前立腺の6回膜貫通上皮抗原(STEAP)、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、Ly−6、デスモグレイン4、胎児アセチルコリン受容体(fnAChR)、CD25、がん抗原19−9(CA19−9)、がん抗原125(CA−125)、ミュラー管抑制物質受容体II型(MISIIR)、シアル化Tn抗原(s TN)、線維芽細胞活性化抗原(FAP)、エンドシアリン(CD248)、上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)、腫瘍関連抗原L6(TAL6)、SAS、CD63、TAG72、Thomsen−Friedenreich抗原(TF抗原)、インスリン様増殖因子I受容体(IGF−IR)、Cora抗原、CD7、CD22、CD70、CD79a、CD79b、G250、MT−MMP、F19抗原、CA19−9、CA−125、アルファ−フェトタンパク質(AFP)、VEGFR1、VEGFR2、DLK1、SP17、ROR1、およびEphA2が挙げられる。キメラポリペプチドアセンブリーの別の実施形態では、第1の部分の第1の結合ドメインは、炎症マーカーである標的細胞マーカーに対する結合親和性を有する。
一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第1の部分の第1の結合ドメインは、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する特異的結合親和性を有するVHおよびVL領域を含む。前述の一実施形態では、第1の結合ドメインVHおよびVLは、表2に記載される配列対の群から選択されるモノクローナル抗体VHおよびVLに由来する。第1および第2の結合ドメインのVHおよびVL領域を、N末端からC末端の順序に関して、異なる順序で構成させることができる。一実施形態では、第1の結合ドメインVHおよびVL領域は、順序VH−VLに配置される。別の実施形態では、第1の結合ドメインVHおよびVL領域は、順序VL−VHに配置される。他の場合では、第1の結合ドメインは、CDR−H1領域、CDR−H2領域、CDR−H3領域、CDR−L1領域、CDR−L2領域、およびCDR−H3領域を含み、前記領域のそれぞれは、表2に記載される配列群から選択されるモノクローナル抗体配列に由来する。VHおよびVL領域の様々な構成ならびにそこに含有されるCDRは、典型的には、意図される標的細胞マーカーに対する所望の結合特異性を保持する。
キメラポリペプチドアセンブリーの他の実施形態では、第1の部分の第2の結合ドメインは、エフェクター細胞に対する結合親和性を有する。必要に応じて、エフェクター細胞は、限定されるものではないが、形質細胞、T細胞、B細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞(CIK細胞)、マスト細胞(master cell)、樹状細胞、調節性T細胞(RegT細胞)、ヘルパーT細胞、骨髄性細胞、およびNK細胞を含む免疫細胞であってもよい。第2の結合ドメインは、典型的には、エフェクター細胞によって発現される抗原に対する結合特異性を示す。一部の実施形態では、抗原は、エフェクター細胞の細胞表面上に発現される。別の実施形態では、第2の結合ドメインは、T細胞上に発現されるエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する。非限定的な例示的なエフェクター細胞抗原としては、CD3、CD4、CD8、αβTCR、CD25、CD45RO、CD69、CD127、およびCD196(CCR6)が挙げられる。特に興味深いものは、ヒトCD3に特異的に結合するモノクローナル抗体に由来するVHおよびVL領域を有するscFv構成を採用する第2の結合ドメインである。一実施形態では、第2の結合ドメインVHおよびVLは、表1に記載される配列群から選択されるモノクローナル抗体VHおよびVLに由来する。別の実施形態では、第2の結合ドメインは、ヒトCD3εに結合することができるモノクローナル抗体に由来するVHおよびVL領域を含む。
結合ドメインのscFvのVHおよびVLを、得られる組成物の有用性に影響を及ぼすことなく、異なる構成に配置することができる。一実施形態では、第2の結合ドメインscFvは、N末端からC末端の方向に、VH−VLまたはVL−VHの順序に配置されるVHおよびVL領域を含む。結合ドメインを、CDR領域から作出することもできる。一実施形態では、第2の結合ドメインは、CDR−H1領域、CDR−H2領域、CDR−H3領域、CDR−L1領域、CDR−L2領域、およびCDR−H3領域を含み、それぞれ、表1のモノクローナル抗体に由来する。段落の前述の実施形態では、VHおよびVL領域ならびに第1の結合ドメインおよび第2の結合ドメインは、表8および表9に記載される配列群から選択される可撓性ポリペプチドリンカーによって連結されている。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第1の部分は、表13の配列からなる群から選択される配列に対する少なくとも約90%、または91%、または92%、または93%、または94%、または95%、または96%、または97%、または98%、または99%の同一性を有する配列を有する。
対象のキメラポリペプチドアセンブリーの1つの利点は、インタクトな組成物を、哺乳動物プロテアーゼが存在する標的組織またはある特定の細胞環境の近くで活性化させ、その活性が最も望ましい部位で第1の部分の結合ドメインを放出することができる、プロドラッグの形態でそれが集合させられるということである。例えば、第1の部分の結合ドメインは、インタクトなアセンブリー中に存在する場合、バルキング部分の遮蔽効果のため、より低い結合親和性を有する。標的組織、例えば、腫瘍組織中で優先的に発現される哺乳動物プロテアーゼによるRSの切断を介する放出時に、第1の部分の結合ドメインは、バルキング部分によって遮蔽されることなく、「活性化される」ようになる。別の実施形態では、本発明は、RSを切断することができる哺乳動物プロテアーゼが炎症組織中で優先的に発現される、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーは、RSを含み、RSは、表4に記載される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。必要に応じて、RSは、配列LSGRSDNHSPLGLAGS、SPLGLAGSLSGRSDNH、SPLGLSGRSDNH、LAGRSDNHSPLGLAGS、LSGRSDNHVPLSLKMG、SPLGLAGS、GPLALARG、LSGRSDNH、VPLSLTMG、VPLSLKMG、VPLSLSMG、EPLELVAG、EPLELRAG、EPAALMAG、EPASLMAG、RIGSLRTA、RIQFLRTA、EPFHLMAG、VPLSLFMG、EPLELPAG、およびEPLELAAGからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。必要に応じて、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の放出セグメントは、配列LSGRSDNHSPLGLAGSのアミノ酸配列を含む。RSの実施形態では、RSは、表3に記載されるプロテアーゼからなる群から選択される1つまたは複数のプロテアーゼによって切断され得るアミノ酸配列を含む。
別の態様では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第3の部分は、バルキング部分を含む。例示的なバルキング部分としては、限定されるものではないが、延長組換えポリペプチド(XTEN)、アルブミン結合ドメイン、アルブミン、IgG結合ドメイン、プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド;脂肪酸、ELPバイオポリマー、Fcドメイン、ポリエチレングリコール(PEG)、PLGA、ならびにヒドロキシエチルデンプンが挙げられる。一実施形態では、バルキング部分は、XTEN配列である。必要に応じて、第3の部分のXTENは、表5に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
別の態様では、対象のキメラポリペプチドアセンブリーは、エフェクター細胞および標的細胞に結合し、連結する能力を示し、それによって、エフェクター細胞が標的細胞特異的様式でその生物学的効果を媒介することができるような免疫学的シナプスを形成する。例えば、対象のキメラポリペプチドアセンブリーは、(1)腫瘍特異的マーカーなどの標的細胞マーカーに特異的に結合する、および(2)エフェクター細胞上に発現される抗原(例えば、T細胞によって発現される抗原)に特異的に結合する能力を有する。T細胞と腫瘍細胞とに同時に結合することは、腫瘍細胞の殺傷、損傷、および/または溶解を媒介する。一実施形態では、1つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼによって第2の部分が切断され、第1の部分が放出されると、第1の部分は、T細胞と腫瘍細胞との両方を含むin vitroアッセイにおいて、ヒトCD3抗原を担持するT細胞および腫瘍特異的マーカーを担持する腫瘍細胞に同時に結合することができる。本発明の組成物に特徴的な例示的な設計において、第2の部分のRSが切断されて、前記キメラポリペプチドアセンブリーから第1の部分および第3の部分が放出されると、放出された第1の部分は、第3の部分の1/2、1/3、1/4、または1/5以下である分子量を有し、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーよりも少なくとも20%、または少なくとも30%、または少なくとも40%、または少なくとも50%、または少なくとも60%低い分子量を有する。ある実施形態では、第2の部分のRSが切断されると、前記キメラポリペプチドアセンブリーから放出された前記第1の部分は、第2の部分が切断されていないキメラ結合アセンブリーと比較して、CD3抗原を担持するエフェクターT細胞および/または腫瘍細胞マーカーに対する結合親和性が増大している。ヒトCD3抗原を担持するT細胞および/または腫瘍細胞マーカーに対する放出された第1の部分の増大した結合親和性は、RSが切断されていないヒトCD3抗原を担持するT細胞または腫瘍細胞マーカーに対するキメラポリペプチドアセンブリーの結合親和性と比較して、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍高い。別の実施形態では、第2の部分のRSが切断され、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第1の部分が放出されると、第1の部分がT細胞と腫瘍細胞とに同時に結合することにより、T細胞および腫瘍細胞の集団を含むin vitroアッセイにおいて腫瘍細胞に対する細胞傷害活性が生じる。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーの放出された第1の部分は、in vitroアッセイにおいてインタクトなキメラ結合アセンブリーと比較して、腫瘍細胞のより多い量の細胞溶解を行うことができる。例えば、キメラポリペプチドアセンブリーの放出された第1の部分により行われる細胞溶解の量は、in vitroアッセイにおいてインタクトなキメラ結合アセンブリーと比較して少なくとも10倍多い、または少なくとも30倍、または少なくとも100倍、または少なくとも300倍、または少なくとも1000倍多い。一実施形態では、腫瘍細胞の細胞傷害活性および/または細胞溶解は、T細胞の標的特異的活性化によって媒介され、キメラポリペプチドアセンブリーの放出された第1の部分によって行われるT細胞の活性化の量は、インタクトなキメラ結合アセンブリーと比較して、少なくとも10倍多い、または少なくとも30倍、または少なくとも100倍、または少なくとも300倍、または少なくとも1000倍多い。キメラ結合アセンブリーのRSを、細胞傷害性の最大比較差を決定するために、in vitro細胞傷害アッセイ中にRSの部分的切断を供することができるため、アセンブリーのRSを、非切断性ポリペプチドと置換し、放出された第1の部分の試料と比較してアッセイすることができる。必要に応じて、in vitroアッセイは、細胞膜完全性アッセイ、混合細胞培養アッセイ、FACSベースヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルー流入アッセイ、測光酵素放出アッセイ、放射測定51Cr放出アッセイ、蛍光ユーロピウム放出アッセイ、CalceinAM放出アッセイ、測光MTTアッセイ、XTTアッセイ、WST−1アッセイ、アラマーブルーアッセイ、放射測定3H−Thd取込みアッセイ、細胞分裂活性を測定するクローン形成アッセイ、ミトコンドリア膜貫通勾配を測定する蛍光ローダミン123アッセイ、FACSベースホスファチジルセリン曝露によりモニタリングされるアポトーシスアッセイ、ELISAベースTUNEL試験アッセイ、サンドイッチELISA、カスパーゼ活性アッセイ、細胞ベースLDH放出アッセイ、および細胞形態学アッセイ、もしくはその任意の組合せから選択されるアッセイ、または本明細書の以下の実施例に記載される方法によるものであってもよい。
別の態様では、本発明は、i)エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第2の結合ドメイン;およびii)腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する結合特異性を有する第1の結合ドメインを含む第1の部分、哺乳動物プロテアーゼによって切断され得る第1の放出セグメント(RS)を含む第2の部分、前記第2の部分に対する前記哺乳動物プロテアーゼの作用によって前記第1の部分から放出され得る第1のバルキング部分を含む第3の部分、第2の部分のRSと同じであってもよく、または異なっていてもよい放出セグメント(RS)を含む第4の部分、ならびに前記第4の部分に対する前記哺乳動物プロテアーゼの作用によって前記第1の部分から放出され得る、第3の部分と同じであってもよく、または異なっていてもよい第2のバルキング部分を含む第5の部分を含む、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。前述の一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第2の放出セグメントは、表4に記載される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。前述の別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第2の放出セグメントは、配列LSGRSDNHSPLGLAGS、SPLGLAGSLSGRSDNH、SPLGLSGRSDNH、LAGRSDNHSPLGLAGS、LSGRSDNHVPLSLKMG、SPLGLAGS、GPLALARG、LSGRSDNH、VPLSLTMG、VPLSLKMG、VPLSLSMG、EPLELVAG、EPLELRAG、EPAALMAG、EPASLMAG、RIGSLRTA、RIQFLRTA、EPFHLMAG、VPLSLFMG、EPLELPAG、およびEPLELAAGからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。前述の別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第2の放出セグメントは、表3に記載されるプロテアーゼ群から選択されるプロテアーゼによって切断され得るアミノ酸配列を含む。前述の別の実施形態では、組成物の第5の部分のバルキング部分は、XTEN;アルブミン結合ドメイン;アルブミン;IgG結合ドメイン;プロリン、セリン、およびアラニンからなる少なくとも350個のアミノ酸残基のポリペプチド;脂肪酸;ならびにFcドメインからなる群から選択される。前述の別の実施形態では、組成物の第5の部分のバルキング部分は、XTENである。前述の別の実施形態では、組成物のバルキング部分は、最適にアラインさせた場合、表5に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むXTENである。一実施形態では、本発明は、最適にアラインさせた場合、表10に記載されるような、シグナルペプチドを含まないアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、最適にアラインさせた場合、表12に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、図36または図37に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、図36または図37に記載されるような配列からなる群から選択されるポリペプチド配列を有するアミノ酸配列からなるキメラポリペプチドアセンブリーを提供する。
キメラポリペプチドアセンブリー組成物の例示的な特徴では、第1の部分の結合ドメインの放出後に標的細胞の細胞溶解を行う能力(インタクトな組成物と比較した)は、インタクトな組成物のものと比較して放出された第1の部分の標的細胞マーカーに対する増大した結合親和性よりも比例して高い。この特徴の一実施形態では、in vitroアッセイにおけるKdのlogとして表される結合親和性と比較して、EC50整数として表される相対的細胞傷害性は、少なくとも約2:1、または少なくとも10:1、または少なくとも50:1、または少なくとも100:1、または少なくとも300:1、または少なくとも500:1、または少なくとも1000:1である。別の実施形態では、in vitroアッセイにおける、キメラポリペプチドアセンブリーの放出された第1の部分の、細胞傷害性(例えば、EC50整数として表される)と結合親和性(例えば、Kのlogとして表される)との比は、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約30倍、少なくとも約50倍、または少なくとも約100倍大きい。
一部の実施形態では、a)(i)T細胞と標的細胞マーカーを担持する腫瘍細胞との両方を含むin vitroアッセイにおける標的腫瘍細胞に対する放出された第1の部分の細胞傷害性と、(ii)1〜約10個のアミノ酸の非切断性ペプチドによって連結されている、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第1の部分と、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第3の部分とを含む組成物の細胞傷害性との比として測定される相対的細胞傷害性;およびb)(i)エフェクター細胞抗原に対する放出された第1の部分の結合親和性と、(ii)1〜約10個のアミノ酸の非切断性ペプチドによって連結されている、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第1の部分と、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第3の部分とを含む組成物のエフェクター細胞抗原に対する結合親和性との比として測定される、エフェクター細胞抗原に対する相対的結合親和性の比較において、相対的細胞傷害性と相対的結合親和性との比は、少なくとも3:1、10:1より大きい、または少なくとも30:1より大きい、または少なくとも50:1より大きい、または少なくとも100:1より大きい、または少なくとも300:1より大きい、または少なくとも500:1より大きい、または少なくとも1000:1より大きい。前述の一実施形態では、非切断性ペプチドは配列グリシン−セリン、セリン−グリシン、またはいずれかのジペプチドの複数単位を有し、エフェクター細胞抗原はCD3である。一実施形態では、a)(i)T細胞と標的細胞マーカーを担持する腫瘍細胞との両方を含むin vitroアッセイにおける標的腫瘍細胞に対する放出された第1の部分の細胞傷害性と、(ii)1〜約10個のアミノ酸の非切断性ペプチドによって連結されている、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第1の部分と、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第3の部分とを含む組成物の細胞傷害性との比として測定される相対的細胞傷害性;およびb)(i)標的細胞マーカーに対する放出された第1の部分の結合親和性と、(ii)1〜約10個のアミノ酸の非切断性ペプチドによって連結されている、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第1の部分と、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第3の部分とを含む組成物の標的細胞マーカーに対する結合親和性との比として測定される、標的細胞マーカーに対する相対的結合親和性の比較において、相対的細胞傷害性と相対的結合親和性との比は、少なくとも3:1、10:1より大きい、または少なくとも30:1より大きい、または少なくとも50:1より大きい、または少なくとも100:1より大きい、または少なくとも300:1より大きい、または少なくとも500:1より大きい、または少なくとも1000:1より大きい。前述の一実施形態では、非切断性ペプチドは配列グリシン−セリン、セリン−グリシン、またはいずれかのジペプチドの複数単位を有し、エフェクター細胞抗原はCD3である。別の実施形態では、a)(i)T細胞と標的細胞マーカーを担持する腫瘍細胞との両方を含むin vitroアッセイにおける標的腫瘍細胞に対する放出された第1の部分の細胞傷害性と、(ii)1〜約10個のアミノ酸の非切断性ペプチドによって連結されている、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第1の部分と、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第3の部分とを含む組成物の細胞傷害性との比として測定される相対的細胞傷害性;b)(i)エフェクター細胞抗原に対する放出された第1の部分の結合親和性と、(ii)1〜約10個のアミノ酸の非切断性ペプチドによって連結されている、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第1の部分と、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第3の部分とを含む組成物の結合親和性との比として測定される、相対的エフェクター細胞抗原結合親和性;およびc)(i)標的細胞マーカーに対する放出された第1の部分の結合親和性と、(ii)1〜約10個のアミノ酸の非切断性ペプチドによって連結されている、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第1の部分と、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第3の部分とを含む組成物の標的細胞マーカーに対する結合親和性との比として測定される、標的細胞マーカーに対する相対的結合親和性の比較において、標的細胞マーカーに対する相対的結合親和性で乗算した、相対的細胞傷害性と相対的エフェクター細胞抗原結合親和性との比は、少なくとも3:1、10:1より大きい、または少なくとも30:1より大きい、または少なくとも50:1より大きい、または少なくとも100:1より大きい、または少なくとも300:1より大きい、または少なくとも500:1より大きい、または少なくとも1000:1より大きい。前述の一実施形態では、非切断性ペプチドは配列グリシン−セリン、セリン−グリシン、またはいずれかのジペプチドの複数単位を有し、エフェクター細胞抗原はCD3である。
一実施形態では、本発明は、T細胞と、標的細胞マーカーを担持する腫瘍細胞との両方を含むin vitro細胞傷害性アッセイにおけるキメラポリペプチドアセンブリー組成物の放出された第1の部分のEC50値が、5000pg/ml以下、さらにより好ましくは、1000pg/ml以下、さらにより好ましくは500pg/ml以下、さらにより好ましくは350pg/ml以下、さらにより好ましくは250pg/ml以下、さらにより好ましくは100pg/ml未満、さらにより好ましくは50pg/ml以下、さらにより好ましくは10pg/ml未満、最も好ましくは、5pg/ml以下である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、in vitroアッセイにおけるキメラポリペプチドアセンブリー組成物の放出された第1の部分のEC50値は、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物のEC50値の1/10以下、または1/20以下、または1/30以下、または1/40以下、または1/50以下、または1/60以下、または1/70以下、または1/80以下、または1/90以下、または1/100以下、または1/120以下である。
一部の場合では、腫瘍特異的マーカーに対する放出された第1の部分の第1の結合ドメインの結合親和性は、CD3抗原に対する放出された第1の部分の第2の結合ドメインの結合親和性と比較して高い。一実施形態では、in vitroアッセイにおいてK定数によって測定される、標的細胞に対する放出された第1の部分の第1の結合ドメインの結合親和性は、CD3抗原に対する第2の結合ドメインの結合親和性と比較して少なくとも一桁高い。他の実施形態では、in vitro結合アッセイにおいてK定数によって測定される、標的細胞に対する放出された第1の部分の第1の結合ドメインの結合親和性は、10−5〜10−9Mの間であり、第2の結合ドメインのKは10−5〜10−9Mの間である。結合親和性を、標準的な細胞ベースアッセイ、ELISA、本明細書の実施例に記載のアッセイ、または当技術分野で公知の他のin vitroアッセイによって決定することができる。
別の態様では、本発明は、対象に投与した場合のキメラポリペプチドアセンブリーの特性の増強に関する。放出セグメントを含むインタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物は、放出された第1の部分の構成成分と比較して、低い細胞傷害性および/または前炎症性サイトカインの産生を惹起する低下した能力を示すことが具体的に企図される。一実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリーを含む組成物の対象への投与の際、またはその後に、アセンブリーの第2の部分が、RSを切断することができるプロテアーゼを発現する腫瘍の近くで切断される、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。前記哺乳動物プロテアーゼによって第2の部分が切断され、アセンブリーから第1の部分が放出されると、第1の部分は、対象においてヒトCD3抗原を担持するT細胞と、腫瘍特異的マーカーを担持する腫瘍細胞とに同時に結合することができる。一実施形態では、放出された第1の部分が、CD3抗原を担持するT細胞と、腫瘍細胞マーカーを担持する腫瘍細胞とに同時に結合することにより、T細胞由来エフェクター分子が放出される。前述において、エフェクター分子は、TNF−α、IFN−γ、インターロイキン2、パーフォリン、およびグランザイム、または当技術分野で公知の他のT細胞エフェクター分子からなる群の1つまたは複数のエフェクター分子から選択される。エフェクター細胞と標的細胞とに同時に結合した結果として、T細胞およびエフェクター分子による標的細胞の溶解を行う、免疫学的シナプスが作出される。
別の態様では、本発明は、終末半減期およびバルキング部分、例えば、XTENにより付与される他の特性が増大したキメラポリペプチドアセンブリー組成物に関する。一実施形態では、本発明は、インタクトな組成物が、同等用量で対象に投与された際またはその後の前記第2および第3の部分に連結されていない第1の部分の半減期と比較して、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍長い、対象に投与された際またはその後の半減期を示す、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーを対象に投与し、第2の部分が切断され、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第1の部分および前記第3の部分が放出された際またはその後に、前記第1の部分は、対象におけるインタクトなキメラポリペプチドアセンブリーと比較して1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9または1/10以下である半減期を有する。関連する実施形態では、キメラポリペプチド組成物を対象に単回投与した際またはその後の放出された第1の部分の血漿Cmax濃度は、約0.01ng/ml、または約0.1ng/ml、または約1ng/ml、または約10ng/ml、または約100ng/mlを超えない。別の関連する実施形態では、インタクトなキメラポリペプチド組成物を対象に単回投与した際またはその後の放出された第1の部分の血漿Cmax濃度は、同じ対象へのインタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの血漿Cmax濃度の1/3以下、または1/10以下、または1/30以下、または1/100以下である。本明細書に記載の方法または当技術分野で公知の従来の方法を使用して、対象のキメラポリペプチドアセンブリーを投与される対象に由来する血漿試料を使用して、薬物動態パラメーターを測定することができる。別の実施形態では、対象に投与された際またはその後に、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーは、RSが切断され、第1の部分および第3の部分を放出するキメラポリペプチドアセンブリーと比較して、対象における血液循環系からの溢出の減少を示す。この段落の前述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サル、イヌ、およびヒトであってもよい。
別の態様では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリーの医薬組成物に関する。一実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるキメラポリペプチドアセンブリーのいずれかのキメラポリペプチドアセンブリーと、1つまたは複数の薬学的に好適な賦形剤、および任意選択で、1つまたは複数の担体または安定剤とを含む医薬組成物を提供する。別の実施形態では、医薬組成物は、皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、髄腔内、または筋肉内投与のために製剤化されている。別の実施形態では、医薬組成物は、液体形態である。関連する実施形態では、液体形態の医薬組成物は、単回注射のためのプレフィルドシリンジ中に供給される。他の実施形態では、医薬組成物は、投与前に復元される凍結乾燥粉末として製剤化されている。
別の態様では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリーまたはキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の方法および使用に関する。一実施形態では、本発明は、対象における疾患の処置のための医薬の調製のための、キメラポリペプチドアセンブリーまたはキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物を提供する。関連する実施形態では、医薬は、癌腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、ER/PR+乳がん、Her2+乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、悪性腹水を伴う結腸がん、粘液腫瘍、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん(gastric cancer)、胃がん(stomach cancer)、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、男化腫瘍、腺癌、肉腫、およびB細胞由来慢性リンパ性白血病からなる群から選択される疾患において使用される。
別の態様では、本発明は、限定されるものではないが、がんを含む疾患を有する対象にキメラポリペプチドアセンブリーまたは医薬組成物を投与することを含む、対象における疾患を処置する方法における使用のためのキメラポリペプチドアセンブリーまたはキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物に関する。必要に応じて、方法は、それを必要とする対象に、キメラポリペプチドアセンブリーと1つまたは複数の賦形剤とを含む治療有効用量の医薬組成物を投与することを含む。処置方法の一実施形態では、疾患は、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん(gastric cancer)、食道がん、胃がん(stomach cancer)、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病を含む原発性血液悪性腫瘍、骨髄増殖性新生物障害、または骨髄異形成障害、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群からなる群から選択される。処置方法の別の実施形態では、医薬組成物は、対象に週2回、週1回、2週毎、3週毎、または毎月投与される1つまたは複数の治療有効用量として投与される。処置方法の別の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも2週、または少なくとも1カ月、または少なくとも2カ月、または少なくとも3カ月、または少なくとも4カ月、または少なくとも5カ月、または少なくとも6カ月の期間にわたって1つまたは複数の用量として対象に投与される。処置方法の別の実施形態では、用量は、皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、髄腔内、または筋肉内に投与される。処置方法の別の実施形態では、用量は、最大の安全性および効能のために忍容されるように、ボーラス用量として、または5分〜96時間の注入によって投与される。処置方法の別の実施形態では、用量は、少なくとも約0.005mg/kg、少なくとも約0.01mg/kg、少なくとも約0.02mg/kg、少なくとも約0.04mg/kg、少なくとも約0.08mg/kg、少なくとも約0.1mg/kg、少なくとも約0.12mg/kg、少なくとも約0.14mg/kg、少なくとも約0.16mg/kg、少なくとも約0.18mg/kg、少なくとも約0.20mg/kg、少なくとも約0.22mg/kg、少なくとも約0.24mg/kg、少なくとも約0.26mg/kg、少なくとも約0.27mg/kg、少なくとも約0.28mg/kg、少なくとも0.3mg/kg、少なくとも0.4mg/kg、少なくとも約0.5mg/kg、少なくとも約0.6mg/kg、少なくとも約0.7mg/kg、少なくとも約0.8mg/kg、少なくとも約0.9mg/kg、少なくとも約1.0mg/kg、少なくとも約1.5mg/kg、または少なくとも約2.0mg/kgからなる群から選択される。処置方法の別の実施形態では、初期用量は、少なくとも約0.005mg/kg、少なくとも約0.01mg/kg、少なくとも約0.02mg/kg、少なくとも約0.04mg/kg、少なくとも約0.08mg/kg、少なくとも約0.1mg/kgからなる群から選択され、その後の用量は、少なくとも約0.1mg/kg、少なくとも約0.12mg/kg、少なくとも約0.14mg/kg、少なくとも約0.16mg/kg、少なくとも約0.18mg/kg、少なくとも約0.20mg/kg、少なくとも約0.22mg/kg、少なくとも約0.24mg/kg、少なくとも約0.26mg/kg、少なくとも約0.27mg/kg、少なくとも約0.28mg/kg、少なくとも0.3mg/kg、少なくとも0.4mg/kg、少なくとも約0.5mg/kg、少なくとも約0.6mg/kg、少なくとも約0.7mg/kg、少なくとも約0.8mg/kg、少なくとも約0.9mg/kg、少なくとも約1.0mg/kg、少なくとも約1.5mg/kg、または少なくとも約2.0mg/kgからなる群から選択される。処置方法の別の実施形態では、対象への治療有効用量の医薬組成物の投与は、少なくとも約3日間、少なくとも約7日間、少なくとも約10日間、少なくとも約14日間、または少なくとも約21日間、対象において少なくとも約0.1ng/mL〜少なくとも約2ng/mLまたはそれよりも多くのキメラポリペプチドアセンブリーの血漿濃度をもたらす。
別の実施形態では、本発明は、治療有効用量を使用する1つまたは複数の連続用量を含む処置レジメンに従って、疾患を有する対象に医薬組成物を投与することを含む、疾患の処置のための方法における使用のための医薬組成物を提供する。疾患の処置のための方法における使用のための医薬組成物の一実施形態では、疾患は、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん(gastric cancer)、食道がん、胃がん(stomach cancer)、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病を含む原発性血液悪性腫瘍、骨髄増殖性新生物障害、または骨髄異形成障害、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群からなる群から選択される。疾患の処置における使用のための医薬組成物の別の実施形態では、処置レジメンは、特定の処置サイクルの一部であり、特定の処置サイクルは、各処置サイクルあたり、週2回、毎週、10日毎、2週毎、3週毎、または毎月の医薬組成物の投与を含む。一実施形態では、処置レジメンは、対象における疾患と関連する臨床パラメーターまたは評価項目の改善をもたらし、臨床パラメーターまたは評価項目は、完全、部分または不完全奏効としての腫瘍縮小;無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答;無増悪生存期間;無病生存期間;再発までの期間;転移までの期間;全生存期間;生活の質の改善;および症状の改善からなる群の1つまたは任意の組合せから選択される。方法の前述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、医薬組成物を含むキットに関する。一実施形態では、本発明は、本明細書に開示される実施形態のいずれか1つに記載の医薬組成物、容器、および容器上の、またはそれに付随するラベルまたは添付文書を含むキットを提供する。別の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される実施形態のいずれか1つに記載の医薬組成物を含有するプレフィルドシリンジ、およびシリンジ上の、またはそれに付随するラベルまたは添付文書を含むキットを提供する。
別の態様では、本発明は、インタクトな切断されたキメラポリペプチドアセンブリー組成物の特徴および効果の差異に関する。一実施形態では、本発明は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラポリペプチドアセンブリーであって、無傷であるキメラポリペプチドアセンブリーが、アセンブリーに連結されていないアセンブリーの対応する第1の部分と比較して、エフェクター細胞からのTh1サイトカインの産生を行う能力が1/10以下、または1/20以下、または1/30以下、または1/40以下、または1/50以下、または1/60以下、または1/70以下、または1/80以下、または1/90以下、または1/100以下、または1/1000以下であり、前記アセンブリーが、エフェクター細胞および標的細胞と接触している、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。一実施形態では、Th1サイトカインの産生は、PBMCまたはCD3+T細胞ならびにアルファ4インテグリン、Ang2、B7−H3、B7−H6、CEACAM5、cMET、CTLA4、FOLR1、EpCAM、CCR5、CD19、HER2、HER2 neu、HER3、HER4、HER1(EGFR)、PD−L1、PSMA、CEA、MUC1(ムチン)、MUC−2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16 βhCG、Lewis−Y、CD20、CD33、CD38、CD30、CD56(NCAM)、CD133、ガングリオシドGD3;9−O−アセチル−GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、GD2、炭酸脱水酵素IX、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue−1、形質細胞抗原1、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、CCR8、前立腺の6回膜貫通上皮抗原(STEAP)、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、Ly−6、デスモグレイン4、胎児アセチルコリン受容体(fnAChR)、CD25、がん抗原19−9(CA19−9)、がん抗原125(CA−125)、ミュラー管抑制物質受容体II型(MISIIR)、シアル化Tn抗原(s TN)、線維芽細胞活性化抗原(FAP)、エンドシアリン(CD248)、上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)、腫瘍関連抗原L6(TAL6)、SAS、CD63、TAG72、Thomsen−Friedenreich抗原(TF抗原)、インスリン様増殖因子I受容体(IGF−IR)、Cora抗原、CD7、CD22、CD70、CD79a、CD79b、G250、MT−MMP、F19抗原、CA19−9、CA−125、アルファ−フェトタンパク質(AFP)、VEGFR1、VEGFR2、DLK1、SP17、ROR1、およびEphA2からなる群から選択される腫瘍特異的マーカー抗原を有する標的細胞を含むin vitroアッセイにおいてアッセイされる。前述の実施形態では、Th1サイトカインは、IL−2、TNF−アルファ、およびIFN−ガンマからなる群から選択される。別の実施形態では、Th1サイトカインの産生は、キメラポリペプチドアセンブリーに連結されていない対応する第1の部分を投与された対象と比較して、キメラポリペプチドアセンブリーを投与された対象に由来する血液または流体試料を使用してアッセイされ、その結果、無傷であるキメラポリペプチドアセンブリーは、Th1サイトカインの産生を行う能力が1/10以下、または1/20以下、または1/30以下、または1/40以下、または1/50以下、または1/60以下、または1/70以下、または1/80以下、または1/90以下、または1/100以下、または1/1000以下である。前述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群から選択される。
他の場合、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラポリペプチドアセンブリーは、無傷であるキメラポリペプチドアセンブリーが、同等用量で対象に投与された場合のキメラポリペプチドアセンブリーに連結されていない第1の部分と比較して、対象に投与された場合の循環から溢出する能力が1/10以下、または1/20以下、または1/30以下、または1/40以下、または1/50以下、または1/60以下、または1/70以下、または1/80以下、または1/90以下、または1/100以下であるという特徴を示す。
別の態様では、本発明は、対象組成物をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、(a)本明細書に開示される実施形態のいずれか1つに記載のキメラポリペプチドアセンブリーをコードするポリヌクレオチド、または(b)(a)のポリヌクレオチドの相補体から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。別の実施形態では、本発明は、表10または表14に記載されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態のポリヌクレオチド配列と、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結した組換え調節配列とを含む発現ベクターを提供する。別の実施形態では、本発明は、前述の発現ベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。一実施形態では、宿主細胞はE.coliである。
別の実施形態では、本発明は、T細胞結合組成物およびそれらをコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、表7に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むモノマー融合タンパク質であって、T細胞のCD3抗原に対する結合親和性を示す、モノマー融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、本発明は、(a)前述のT細胞結合組成物の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、(b)表7に記載されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列;または(c)(a)もしくは(b)のポリヌクレオチドの相補体から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。
別の実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるキメラポリペプチドアセンブリーの実施形態のいずれか1つに記載のキメラポリペプチドアセンブリーをコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法であって、先に開示のT細胞結合組成物の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに読み枠を合わせて、本明細書に開示されるか、または表2に記載される標的群から選択される標的細胞マーカーに対する結合親和性を有するscFvをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結することを含む、方法において前述のT細胞結合組成物の融合タンパク質をコードする核酸の使用方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、前述のポリヌクレオチド配列と、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結した組換え調節配列とを含む発現ベクターを提供する。本発明はまた、宿主細胞がE.coliである、発現ベクターを含む単離された宿主細胞も提供する。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に開示されるキメラポリペプチドアセンブリーの実施形態を産生する方法に関する。一実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるキメラポリペプチドアセンブリーを産生する方法であって、宿主細胞を、キメラポリペプチドアセンブリーをコードする発現ベクターで形質転換すること、形質転換された宿主細胞中でのキメラポリペプチドアセンブリーの発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養すること、およびキメラポリペプチドアセンブリーを可溶性融合タンパク質として単離することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、発現される融合タンパク質の第1および第2の結合ドメインの少なくとも70%、または少なくとも80%、または少なくとも90%、または少なくとも95%、または少なくとも97%、または少なくとも99%が正確に折り畳まれる。
他の場合、本発明は、標的細胞の死を誘導する方法を提供する。方法は、典型的には、前記標的細胞を、本明細書に開示される実施形態のキメラポリペプチドアセンブリーおよびエフェクター細胞と接触させることを含む。ある実施形態では、接触は、限定されるものではないが、膜完全性の喪失、核濃縮、核崩壊、アポトーシスの内因性経路の誘導、アポトーシスの外因性経路の誘導、アポトーシス、細胞溶解、および細胞死を含む標的細胞中での効果をもたらす。
細胞死をもたらす細胞傷害性(例えば、壊死またはアポトーシス)を、限定されるものではないが、処置の前後で細胞を計数すること、または生細胞もしくは死細胞と関連するマーカーのレベルを測定することを含む、任意の好適な方法によって決定することができる。細胞死の程度を、任意の好適な方法によって決定することができる。一部の実施形態では、細胞死の程度は、出発条件に関して決定される。例えば、個体は、出発細胞塊または既知のサイズの腫瘍または既知の濃度の循環標的細胞などの、既知の出発量の標的細胞を有してもよい。別の例では、別の組成物(例えば、バルキング部分に連結されたキメラポリペプチドアセンブリーおよびバルキング部分に連結されていないキメラポリペプチドアセンブリー)に関して、ある組成物により誘導される細胞死の程度を比較することができる。そのような場合、細胞死の程度を、処理後の生存細胞と出発細胞集団との比として表すことができる。一部の実施形態では、細胞死の程度を、好適な細胞死アッセイによって決定することができる。一部の実施形態では、細胞死の程度を、経時的な腫瘍サイズの測定によって決定することができる。様々な細胞死アッセイが利用可能であり、様々な検出方法論を利用することができる。検出方法論の例としては、限定されるものではないが、細胞染色、顕微鏡観察、フローサイトメトリー、細胞選別、およびこれらの組合せの使用が挙げられる。細胞死アッセイのさらなる非限定的な例は、参照により本明細書に組み込まれるWO2011131472A1およびUS20130052160に記載されている。
前述の一実施形態では、方法は、標的細胞とエフェクター細胞との混合集団、ならびに標的細胞およびエフェクター細胞の抗原に対する結合親和性を有する有効量のキメラポリペプチドアセンブリーを含む、in vitro細胞ベースアッセイにおいて用いられる。アッセイでは、標的細胞は、限定されるものではないが、アルファ4インテグリン、Ang2、B7−H3、B7−H6、CEACAM5、cMET、CTLA4、FOLR1、EpCAM、CCR5、CD19、HER2、HER2 neu、HER3、HER4、HER1(EGFR)、PD−L1、PSMA、CEA、MUC1(ムチン)、MUC−2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16 βhCG、Lewis−Y、CD20、CD33、CD38、CD30、CD56(NCAM)、CD133、ガングリオシドGD3;9−O−アセチル−GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、GD2、炭酸脱水酵素IX、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue−1、形質細胞抗原1、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、CCR8、前立腺の6回膜貫通上皮抗原(STEAP)、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、Ly−6、デスモグレイン4、胎児アセチルコリン受容体(fnAChR)、CD25、がん抗原19−9(CA19−9)、がん抗原125(CA−125)、ミュラー管抑制物質受容体II型(MISIIR)、シアル化Tn抗原(s TN)、線維芽細胞活性化抗原(FAP)、エンドシアリン(CD248)、上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)、腫瘍関連抗原L6(TAL6)、SAS、CD63、TAG72、Thomsen−Friedenreich抗原(TF抗原)、インスリン様増殖因子I受容体(IGF−IR)、Cora抗原、CD7、CD22、CD70、CD79a、CD79b、G250、MT−MMP、F19抗原、CA19−9、CA−125、アルファ−フェトタンパク質(AFP)、VEGFR1、VEGFR2、DLK1、SP17、ROR1、およびEphA2を含む腫瘍特異的マーカー抗原を発現し、エフェクター細胞はT細胞であり、エフェクター細胞抗原はCD3である。他の実施形態では、標的細胞の死を誘導する方法は、標的細胞の集団を含むがんを有する対象において用いられ、方法は、治療有効量のキメラポリペプチドアセンブリーを対象に投与することを含む。前述の一実施形態では、方法は、キメラポリペプチドアセンブリーと、1つまたは複数の賦形剤とを含む医薬組成物の1つまたは複数の連続投与される治療有効用量としてキメラポリペプチドアセンブリーを投与することを含む。前述の別の実施形態では、方法は、がんを有する対象において治療効果を達成するのに必要とされる医薬組成物の量を決定し、1つまたは複数の連続用量としての量を対象に投与するレジメンを含む。対象において標的細胞の死を誘導する方法では、標的細胞はがん細胞であり、がんは、癌腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、ER/PR+乳がん、Her2+乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、悪性腹水を伴う結腸がん、粘液腫瘍、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん(gastric cancer)、胃がん(stomach cancer)、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、男化腫瘍、腺癌、肉腫、およびB細胞由来慢性リンパ性白血病であってもよい。がんを有する対象における本発明の方法の使用により、方法は、全生存期間、症状評価項目、無病生存、客観的奏功率、完全奏効、奏効期間、無増悪生存期間、無増悪期間、治療成功期間、腫瘍測定、腫瘍サイズ、腫瘍応答率、転移までの時間、およびバイオマーカー濃度であってもよい、臨床パラメーターまたは評価項目の改善をもたらす。他の場合、がんを有する対象における本発明の方法の使用は、キメラポリペプチドアセンブリーの第1の部分を含み、第2の部分および第3の部分を含まない組成物の、同等の対象へのmmol/kgの同等用量の投与と比較して、対象における診断的に関連する副作用の頻度、持続期間、または重症度の減少をもたらし、副作用は、以下:IL−2の血漿レベルの増大、TNF−アルファの血漿レベルの増大、IFN−ガンマの血漿レベルの増大、敗血症、発熱性好中球減少症、神経毒性、痙攣、脳症、サイトカイン放出症候群、言語障害、平衡障害、発熱、頭痛、混乱、低血圧、好中球減少症、悪心、意識障害、見当識障害、および肝酵素の増加の1つまたは複数であってもよい。
さらに他の場合、本発明は、腫瘍特異的マーカーを含む腫瘍細胞に治療剤を送達する方法であって、標的細胞に、本明細書に開示される実施形態のいずれか1つに記載のキメラポリペプチドアセンブリーを投与することを含み、治療剤が、腫瘍特異的マーカーに特異的に結合する第1の部分の第1の結合ドメインを介して標的細胞に送達される、方法を提供する。前述において、腫瘍特異的マーカーは、アルファ4インテグリン、Ang2、B7−H3、B7−H6、CEACAM5、cMET、CTLA4、FOLR1、EpCAM、CCR5、CD19、HER2、HER2 neu、HER3、HER4、HER1(EGFR)、PD−L1、PSMA、CEA、MUC1(ムチン)、MUC−2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16 βhCG、Lewis−Y、CD20、CD33、CD38、CD30、CD56(NCAM)、CD133、ガングリオシドGD3;9−O−アセチル−GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、GD2、炭酸脱水酵素IX、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue−1、形質細胞抗原1、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、CCR8、前立腺の6回膜貫通上皮抗原(STEAP)、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、Ly−6、デスモグレイン4、胎児アセチルコリン受容体(fnAChR)、CD25、がん抗原19−9(CA19−9)、がん抗原125(CA−125)、ミュラー管抑制物質受容体II型(MISIIR)、シアル化Tn抗原(s TN)、線維芽細胞活性化抗原(FAP)、エンドシアリン(CD248)、上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)、腫瘍関連抗原L6(TAL6)、SAS、CD63、TAG72、Thomsen−Friedenreich抗原(TF抗原)、インスリン様増殖因子I受容体(IGF−IR)、Cora抗原、CD7、CD22、CD70、CD79a、CD79b、G250、MT−MMP、F19抗原、CA19−9、CA−125、アルファ−フェトタンパク質(AFP)、VEGFR1、VEGFR2、DLK1、SP17、ROR1、およびEphA2からなる群から選択される。必要に応じて、腫瘍特異的マーカーは、アルファ4インテグリン、Ang2、CEACAM5、CD19、CD20、CD33、CD38、cMET、CTLA4、EpCAM、EphA2、FOLR1、HER1(EGFR)、HER2、HER3、HER1(EGFR)/HER3、HER2/3、メソテリン、MUC1、PD−L1、PSMA、TAG−72、VEGFR1、VEGFR2からなる群から選択される。方法の一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーは、表12の配列からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも90%、または少なくとも91%、または少なくとも92%、または少なくとも93%、または少なくとも94%、または少なくとも95%、または少なくとも96%、または少なくとも97%、または少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。方法の別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーは、図36または図37に記載される配列からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも90%、または少なくとも91%、または少なくとも92%、または少なくとも93%、または少なくとも94%、または少なくとも95%、または少なくとも96%、または少なくとも97%、または少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。前述の方法のある実施形態では、腫瘍細胞は対象における腫瘍中に存在し、対象はマウス、ラット、サル、イヌ、およびヒトであってもよい。
別の態様では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の物理的特徴および対象に投与された場合の得られる特性に関する。本明細書に開示されるキメラポリペプチドアセンブリーの実施形態に関して、キメラポリペプチドアセンブリーの第2の部分も第3の部分も、第1の部分に対する特異的結合親和性を有さない。本明細書に開示される各キメラポリペプチドアセンブリーの実施形態について、第1の部分は、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの分子量の50%未満を占める。別の実施形態では、本明細書に開示されるキメラポリペプチドアセンブリーの実施形態の第1の部分は、見かけの分子量係数がサイズ排除クロマトグラフィーによって評価される場合、キメラポリペプチドアセンブリーの見かけの分子量係数の30%未満、または40%未満、または50%未満を占める。さらに、第2の部分が切断され、本明細書に開示されるいずれかのキメラポリペプチドアセンブリーの実施形態から前記第1の部分および前記第3の部分が放出されると、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって評価される場合、放出された第1の部分の流体力学半径は、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの流体力学半径の約30%未満、または約40%未満、または約50%未満である。一実施形態では、本発明は、第2の部分が切断され、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第1の部分および前記第3の部分が放出されると、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される場合、放出された第1の部分の流体力学半径が、約5nm未満、または約4nm未満、または約3nm未満である、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。したがって、放出された第1の部分は、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーと比較して、腫瘍組織に浸透する高い能力を有する。別の実施形態では、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される場合、本明細書に開示されるインタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの流体力学半径は、約8nmより大きい、または約9nmより大きい、または約10nmより大きい。したがって、腫瘍を有する対象に投与されたインタクトなキメラポリペプチドアセンブリーは、腫瘍の血管系から溢出する能力と比較して、対象の正常組織の血管系から溢出する能力が低い。
キメラポリペプチドアセンブリー組成物の実施形態は、本明細書に開示される特性の1つもしくは複数またはその任意の組合せを示してもよいことが具体的に企図される。さらに、処置方法は、本明細書に開示される特性の1つもしくは複数またはその任意の組合せを示してもよいことが具体的に企図される。
参照による組込み
本明細書に記載される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されたのと同程度で参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の特徴および利点は、以下の詳細な説明および例示的な実施形態を記載する添付の図面を参照することによってさらに説明されうる。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
(項目1)
第1の部分、第2の部分、および第3の部分を含むキメラポリペプチドアセンブリーであって、
a.前記第1の部分が、
i.標的細胞マーカーに対する結合特異性を有する第1の結合ドメイン;および
ii.エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第2の結合ドメインを含み;
b.前記第2の部分が、1つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼにより切断され得るペプチジル放出セグメント(RS)を含み;
c.前記第3の部分が、バルキング部分を含み;
前記バルキング部分が、前記第2の部分に対する前記哺乳動物プロテアーゼの作用によって前記第1の部分から放出され得る、キメラポリペプチドアセンブリー。
(項目2)
N末端からC末端に向かって、前記第1の部分が前記第2の部分に連結され、次いで、前記第2の部分が前記第3の部分に連結されている、項目1に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目3)
N末端からC末端に向かって、前記第3の部分が前記第2の部分に連結され、次いで、前記第2の部分が前記第1の部分に連結されている、項目1に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目4)
前記標的細胞マーカーが腫瘍特異的マーカーである、項目1から3のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目5)
前記標的細胞マーカーが炎症マーカーである、項目1から3のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目6)
前記哺乳動物プロテアーゼが、腫瘍組織中で優先的に発現される、項目1から4のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目7)
前記哺乳動物プロテアーゼが、炎症組織中で優先的に発現される、項目1から3および5のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目8)
モノマー融合タンパク質である、項目1から7のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目9)
(i)前記第2の部分および前記第3の部分がモノマー融合タンパク質であり、前記第1の部分が前記第2の部分に化学的にコンジュゲートされている;または(ii)前記第1の部分および前記第2の部分がモノマー融合タンパク質であり、前記第3の部分が前記第2の部分に化学的にコンジュゲートされている、項目1から7のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目10)
前記第1の結合ドメインおよび前記第2の結合ドメインがそれぞれscFvである、先行する項目のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目11)
前記第1の結合ドメインおよび前記第2の結合ドメインが単鎖ダイアボディであるか、またはそれぞれ単一ドメイン抗体であるか、またはそれぞれ単一ドメインラクダ抗体であるか、またはそれぞれ非抗体足場である、項目1から9のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目12)
第2の結合ドメインが、形質細胞、T細胞、B細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞(CIK細胞)、マスト細胞、樹状細胞、調節性T細胞(RegT細胞)、ヘルパーT細胞、骨髄性細胞、およびNK細胞からなる群から選択されるエフェクター細胞上で発現されるエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する、先行する項目のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目13)
前記エフェクター細胞がT細胞である、項目12に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目14)
前記エフェクター細胞抗原がCD3である、項目12または13に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目15)
前記エフェクター細胞抗原がCD3εである、項目12または13に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目16)
前記第2の結合ドメインが、ヒトCD3に結合することができるモノクローナル抗体に由来するVHおよびVL領域を含む、項目14に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目17)
前記第2の結合ドメインVHおよびVLが、表1に記載される配列群から選択されるVHおよびVLに由来する、項目14に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目18)
前記第2の結合ドメインが、ヒトCD3εに結合することができるモノクローナル抗体に由来するVHおよびVL領域を含む、項目15に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目19)
前記第2の結合ドメインscFvが、N末端からC末端の方向に、VH−VLまたはVL−VHの順序に配置されるVHおよびVL領域を含む、項目16または17のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目20)
前記第2の結合ドメインが、それぞれ、表1のモノクローナル抗体に由来する、CDR−H1領域、CDR−H2領域、CDR−H3領域、CDR−L1領域、CDR−L2領域、およびCDR−H3領域を含む、項目14または項目15に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目21)
前記第1の結合ドメインが、前記腫瘍特異的マーカーに結合することができるモノクローナル抗体に由来するVHおよびVL領域を含む、先行する項目のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目22)
前記第1の結合ドメインVHおよびVL領域が、表2に記載される配列群から選択されるモノクローナル抗体VHおよびVLに由来する、項目21に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目23)
前記腫瘍特異的マーカーが腫瘍細胞によって発現される、先行する項目のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目24)
前記腫瘍細胞が、間質細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、グリア細胞、上皮細胞、脂肪細胞、リンパ球細胞、血管細胞、平滑筋細胞、間葉細胞、乳房組織細胞、前立腺細胞、腎臓細胞、脳細胞、結腸細胞、卵巣細胞、子宮細胞、膀胱細胞、皮膚細胞、胃細胞、尿生殖路細胞、頸部細胞、子宮細胞、小腸細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、胆嚢細胞、胆管細胞、食道細胞、唾液腺細胞、肺細胞、および甲状腺細胞からなる群から選択される細胞から生じる、項目21に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目25)
前記腫瘍特異的マーカーが、アルファ4インテグリン、Ang2、B7−H3、B7−H6、CEACAM5、cMET、CTLA4、FOLR1、EpCAM、CCR5、CD19、HER2、HER2 neu、HER3、HER4、HER1(EGFR)、PD−L1、PSMA、CEA、MUC1(ムチン)、MUC−2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16、βhCG、Lewis−Y、CD20、CD33、CD38、CD30、CD56(NCAM)、CD133、ガングリオシドGD3;9−O−アセチル−GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、GD2、炭酸脱水酵素IX、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue−1、形質細胞抗原1、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、CCR8、前立腺の6回膜貫通上皮抗原(STEAP)、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、Ly−6、デスモグレイン4、胎児アセチルコリン受容体(fnAChR)、CD25、がん抗原19−9(CA19−9)、がん抗原125(CA−125)、ミュラー管抑制物質受容体II型(MISIIR)、シアル化Tn抗原(s TN)、線維芽細胞活性化抗原(FAP)、エンドシアリン(CD248)、上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)、腫瘍関連抗原L6(TAL6)、SAS、CD63、TAG72、Thomsen−Friedenreich抗原(TF抗原)、インスリン様増殖因子I受容体(IGF−IR)、Cora抗原、CD7、CD22、CD70、CD79a、CD79b、G250、MT−MMP、F19抗原、CA19−9、CA−125、アルファ−フェトタンパク質(AFP)、VEGFR1、VEGFR1、VEGFR2、DLK1、SP17、ROR1、およびEphA2からなる群から選択される、項目21または項目22に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目26)
前記第1の結合ドメインが、VH−VLまたはVL−VHの形態でN末端からC末端に向かって配置されるVHおよびVL領域を含むscFvである、項目21から25のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目27)
前記第1の結合ドメインが、CDR−H1領域、CDR−H2領域、CDR−H3領域、CDR−L1領域、CDR−L2領域、およびCDR−H3領域を含み、前記領域のそれぞれが、表2に記載される配列群から選択されるモノクローナル抗体配列に由来する、項目1から20のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目28)
前記第1の結合ドメインおよび前記第2の結合ドメインが、表8および表9に記載される配列群から選択される可撓性ポリペプチドリンカーによって連結されている、先行する項目のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目29)
前記RSが表4に記載される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、先行する項目のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目30)
前記RSが、配列LSGRSDNHSPLGLAGS、SPLGLAGSLSGRSDNH、SPLGLSGRSDNH、LAGRSDNHSPLGLAGS、LSGRSDNHVPLSLKMG、SPLGLAGS、GPLALARG、LSGRSDNH、VPLSLTMG、VPLSLKMG、VPLSLSMG、EPLELVAG、EPLELRAG、EPAALMAG、EPASLMAG、RIGSLRTA、RIQFLRTA、EPFHLMAG、VPLSLFMG、EPLELPAG、およびEPLELAAGからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、先行する項目のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目31)
前記RSが、表3に記載されるプロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼによって切断され得るアミノ酸配列を含む、先行する項目のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目32)
前記バルキング部分が、延長組換えポリペプチド(XTEN);アルブミン結合ドメイン;アルブミン、IgG結合ドメイン;プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド;脂肪酸;ELPバイオポリマー;Fcドメイン;ポリエチレングリコール(PEG)、PLGA;ならびにヒドロキシエチルデンプンからなる群から選択される、先行する項目のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目33)
前記バルキング部分がXTENである、項目32に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目34)
前記XTENが、表5に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目33に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目35)
前記キメラポリペプチドアセンブリーの前記第1の部分が、表13に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行する項目のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目36)
前記哺乳動物プロテアーゼによって前記第2の部分が切断され、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第1の部分が放出されると、前記第1の部分が、ヒトCD3抗原を担持するT細胞と前記腫瘍特異的マーカーを担持する腫瘍細胞との両方を含むin vitroアッセイにおいて、前記T細胞と前記腫瘍細胞とに同時に結合することができる、項目13から35のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目37)
前記第2の部分が切断されて、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第1の部分および前記第3の部分が放出されると、前記放出された第1の部分が、前記第3の部分の1/2、1/3、1/4、または1/5以下である分子量を有する、項目36に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目38)
前記第2の部分が切断されると、前記キメラポリペプチドアセンブリーから放出された前記第1の部分が、前記第2の部分が切断されていないキメラ結合アセンブリーと比較して、前記CD3抗原を担持する前記T細胞または前記腫瘍細胞マーカーに対する増大した結合親和性を有する、項目36に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目39)
前記ヒトCD3抗原を担持する前記T細胞または前記腫瘍細胞マーカーに対する前記放出された第1の部分の結合親和性が、前記RSが切断されていない、前記ヒトCD3抗原を担持する前記T細胞または前記腫瘍細胞マーカーに対する前記キメラポリペプチドアセンブリーの結合親和性と比較して少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍高い、項目36に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目40)
前記第1の部分が前記T細胞と前記腫瘍細胞とに同時に結合することにより、前記in vitroアッセイにおいて前記腫瘍細胞に対する細胞傷害活性が生じる、項目36に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目41)
前記キメラポリペプチドアセンブリーの前記放出された第1の部分が、前記in vitroアッセイにおいてインタクトなキメラ結合アセンブリーと比較して前記腫瘍細胞のより多い量の細胞溶解を行うことができる、項目36に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目42)
前記キメラポリペプチドアセンブリーの前記放出された第1の部分によって行われる細胞溶解の量が、前記in vitroアッセイにおける前記インタクトなキメラ結合アセンブリーと比較して少なくとも10倍多い、または少なくとも30倍、または少なくとも100倍、または少なくとも300倍、または少なくとも1000倍多い、項目36に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目43)
前記腫瘍細胞の前記細胞傷害活性および/または細胞溶解が、前記T細胞の標的特異的活性化によって媒介される、項目40から42のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目44)
前記キメラポリペプチドアセンブリーの前記放出された第1の部分によって行われる前記T細胞の活性化の量が、前記インタクトなキメラ結合アセンブリーと比較して少なくとも10倍多い、または少なくとも30倍、または少なくとも100倍、または少なくとも300倍、または少なくとも1000倍多い、項目43に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目45)
a)(i)前記エフェクター細胞抗原を担持する前記エフェクター細胞と、前記標的細胞マーカーを担持する腫瘍細胞との両方を含むin vitroアッセイにおける前記腫瘍細胞に対する前記放出された第1の部分の細胞傷害性と、(ii)1〜約10個のアミノ酸の非切断性ペプチドによって連結されている、前記キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第1の部分と、前記キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第3の部分とを含む組成物の細胞傷害性との比として測定される相対的細胞傷害性;および
b)前記エフェクター細胞抗原に対するa(i)の前記放出された第1の部分の前記第2の結合ドメインの結合親和性と、前記エフェクター細胞抗原に対するa(ii)の前記組成物の結合親和性との比として測定される、相対的結合親和性
の比較において、前記相対的細胞傷害性と前記相対的結合親和性との比が、少なくとも10:1より大きい、または少なくとも30:1より大きい、または少なくとも50:1より大きい、または少なくとも100:1より大きい、または少なくとも300:1より大きい、または少なくとも500:1より大きい、または少なくとも1000:1より大きい、項目40から44のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目46)
前記非切断性ペプチドが配列グリシン−セリンを有し、前記エフェクター細胞抗原がCD3である、項目45に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目47)
前記in vitroアッセイが、細胞膜完全性アッセイ、混合細胞培養アッセイ、FACSベースヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルー流入アッセイ、測光酵素放出アッセイ、放射測定51Cr放出アッセイ、蛍光ユーロピウム放出アッセイ、CalceinAM放出アッセイ、測光MTTアッセイ、XTTアッセイ、WST−1アッセイ、アラマーブルーアッセイ、放射測定3H−Thd取込みアッセイ、細胞分裂活性を測定するクローン形成アッセイ、ミトコンドリア膜貫通勾配を測定する蛍光ローダミン123アッセイ、FACSベースホスファチジルセリン曝露によりモニタリングされるアポトーシスアッセイ、ELISAベースTUNEL試験アッセイ、サンドイッチELISA、カスパーゼ活性アッセイ、細胞ベースLDH放出アッセイ、および細胞形態学アッセイ、またはその任意の組合せからなるアッセイ群から選択される、項目36から46のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目48)
前記腫瘍特異的マーカーに対する前記放出された第1の部分の前記第1の結合ドメインの結合親和性が、前記CD3抗原に対する前記放出された第1の部分の前記第2の結合ドメインの結合親和性と比較して高い、項目36に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目49)
前記in vitroアッセイにおいてK 定数によって測定された場合、前記標的細胞に対する前記第1の結合ドメインの結合親和性が、前記CD3抗原に対する前記第2の結合ドメインのより高い結合親和性と比較して、少なくとも一桁低い、項目36に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目50)
前記キメラポリペプチドアセンブリーの前記第1の結合ドメインの前記K 定数が、10 −5 〜10 −9 Mであり、前記第2の結合ドメインのK が10 −5 〜10 −9 Mである、項目36に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目51)
前記キメラポリペプチドアセンブリーを含む組成物を対象に投与した後、前記キメラポリペプチドアセンブリーの前記第2の部分が、前記キメラポリペプチドアセンブリーが対象に投与された場合、前記RSを切断することができるプロテアーゼを発現する腫瘍の近くで切断される、項目1から35のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目52)
前記哺乳動物プロテアーゼによって前記第2の部分が切断され、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第1の部分が放出されると、前記第1の部分が、前記ヒトCD3抗原を担持するT細胞と、前記腫瘍特異的マーカーを担持する腫瘍細胞とに同時に結合することができる、項目51に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目53)
前記第1の部分が、前記CD3抗原を担持するT細胞と、前記腫瘍細胞マーカーを担持する前記腫瘍細胞とに同時に結合することにより、T細胞由来エフェクター分子が放出される、項目52に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目54)
前記エフェクター分子が、TNF−α、IFN−γ、インターロイキン2、パーフォリン、およびグランザイムからなる群の1つまたは複数のエフェクター分子から選択される、項目53に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目55)
前記第1の部分が、前記ヒトCD3抗原を担持するT細胞と、前記腫瘍特異的マーカーを担持する腫瘍細胞とに同時に結合すると、前記腫瘍細胞の溶解が前記T細胞によって行われる、項目52に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目56)
同等用量で対象に投与された後の前記第2および第3の部分に連結されていない前記第1の部分の半減期と比較して少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍長い、対象に投与された後の半減期を示す、項目51から55のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目57)
前記キメラポリペプチドアセンブリーを対象に投与し、前記第2の部分が切断され、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第1の部分および前記第3の部分が放出された後に、前記第1の部分が、前記対象における前記インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーと比較して1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、または1/10以下である半減期を有する、項目51から56のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目58)
前記キメラポリペプチドアセンブリーを含む組成物を前記対象に単回投与した後の前記放出された第1の部分の血漿Cmax濃度が、約0.01ng/ml、または約0.1ng/ml、または約1ng/ml、または約10ng/ml、または約100ng/mlを超えない、項目51から57のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目59)
前記キメラポリペプチドアセンブリーを含む組成物を前記対象に単回投与した後の前記放出された第1の部分の血漿Cmax濃度が、同じ対象における前記インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの1/3以下、または1/10以下、または1/30以下、または1/100以下である、項目51から57のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目60)
前記インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーが、前記RSが切断され、前記第1の部分および前記第3の部分を放出する前記キメラポリペプチドアセンブリーと比較して、対象における血液循環系からの溢出の減少を示す、項目51から59のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目61)
前記対象が、マウス、ラット、サル、イヌ、およびヒトからなる群から選択される、項目51から60のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目62)
先行する項目のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリーと、1つまたは複数の薬学的に好適な賦形剤とを含む医薬組成物。
(項目63)
皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、髄腔内、または筋肉内投与のために製剤化されている、項目62に記載の医薬組成物。
(項目64)
液体形態である、項目62に記載の医薬組成物。
(項目65)
単回注射のためのプレフィルドシリンジ中にある、項目64に記載の医薬組成物。
(項目66)
投与前に復元される凍結乾燥粉末として製剤化されている、項目62に記載の医薬組成物。
(項目67)
対象における疾患の処置のための医薬の調製における項目1から61のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリーの使用。
(項目68)
前記疾患が、癌腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、ER/PR+乳がん、Her2+乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、悪性腹水を伴う結腸がん、粘液腫瘍、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん(gastric cancer)、胃がん(stomach cancer)、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、男化腫瘍、腺癌、肉腫、およびB細胞由来慢性リンパ性白血病からなる群から選択される、項目67に記載の使用。
(項目69)
対象における疾患を処置する方法であって、それを必要とする前記対象に、項目1から68のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリーまたは前記キメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の治療有効用量を投与することを含む方法。
(項目70)
前記疾患が、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん(gastric cancer)、食道がん、胃がん(stomach cancer)、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病を含む原発性血液悪性腫瘍、骨髄増殖性新生物障害、または骨髄異形成障害、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群からなる群から選択される、項目69に記載の方法。
(項目71)
前記医薬組成物が、前記対象に週2回、週1回、2週毎、3週毎、または毎月投与される1つまたは複数の治療有効用量として投与される、項目69または70に記載の方法。
(項目72)
前記医薬組成物が、前記対象に少なくとも2週、または少なくとも1カ月、または少なくとも2カ月、または少なくとも3カ月、または少なくとも4カ月、または少なくとも5カ月、または少なくとも6カ月の期間にわたって1つまたは複数の用量として投与される、項目69から71のいずれか一項に記載の方法。
(項目73)
前記用量が、皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、髄腔内、または筋肉内に投与される、項目69から72のいずれか一項に記載の方法。
(項目74)
前記用量が、最大の安全性および効能のために忍容されるように、ボーラス用量として、または5分〜96時間の注入によって投与される、項目69から73のいずれか一項に記載の方法。
(項目75)
前記用量が、少なくとも約0.005mg/kg、少なくとも約0.01mg/kg、少なくとも約0.02mg/kg、少なくとも約0.04mg/kg、少なくとも約0.08mg/kg、少なくとも約0.1mg/kg、少なくとも約0.12mg/kg、少なくとも約0.14mg/kg、少なくとも約0.16mg/kg、少なくとも約0.18mg/kg、少なくとも約0.20mg/kg、少なくとも約0.22mg/kg、少なくとも約0.24mg/kg、少なくとも約0.26mg/kg、少なくとも約0.27mg/kg、少なくとも約0.28mg/kg、少なくとも0.3mg/kg、少なくとも0.4mg/kg、少なくとも約0.5mg/kg、少なくとも約0.6mg/kg、少なくとも約0.7mg/kg、少なくとも約0.8mg/kg、少なくとも約0.9mg/kg、少なくとも約1.0mg/kg、少なくとも約1.5mg/kg、または少なくとも約2.0mg/kgからなる群から選択される、項目69から74のいずれか一項に記載の方法。
(項目76)
初期用量が、少なくとも約0.005mg/kg、少なくとも約0.01mg/kg、少なくとも約0.02mg/kg、少なくとも約0.04mg/kg、少なくとも約0.08mg/kg、少なくとも約0.1mg/kgからなる群から選択され、その後の用量が、少なくとも約0.1mg/kg、少なくとも約0.12mg/kg、少なくとも約0.14mg/kg、少なくとも約0.16mg/kg、少なくとも約0.18mg/kg、少なくとも約0.20mg/kg、少なくとも約0.22mg/kg、少なくとも約0.24mg/kg、少なくとも約0.26mg/kg、少なくとも約0.27mg/kg、少なくとも約0.28mg/kg、少なくとも0.3mg/kg、少なくとも0.4mg/kg、少なくとも約0.5mg/kg、少なくとも約0.6mg/kg、少なくとも約0.7mg/kg、少なくとも約0.8mg/kg、少なくとも約0.9mg/kg、少なくとも約1.0mg/kg、少なくとも約1.5mg/kg、または少なくとも約2.0mg/kgからなる群から選択される、項目69から74のいずれか一項または組合せに記載の方法。
(項目77)
前記対象への前記投与が、少なくとも約3日間、少なくとも約7日間、少なくとも約10日間、少なくとも約14日間、または少なくとも約21日間、前記対象において少なくとも約0.1ng/mL〜少なくとも約2ng/mLまたはそれよりも多くの前記キメラポリペプチドアセンブリーの血漿濃度をもたらす、項目69から74のいずれか一項または組合せに記載の方法。
(項目78)
前記対象が、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群から選択される、項目69から77のいずれか一項に記載の方法。
(項目79)
任意選択で、治療有効用量を使用する1つまたは複数の連続用量を含む処置レジメンに従って、前記疾患を有する対象に前記医薬組成物または前記キメラポリペプチドアセンブリーを投与することを含む、前記疾患の処置のための方法における使用のための、項目62から65のいずれか一項に記載の医薬組成物または項目1から61のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目80)
前記疾患が、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん(gastric cancer)、食道がん、胃がん(stomach cancer)、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病を含む原発性血液悪性腫瘍、骨髄増殖性新生物障害、または骨髄異形成障害、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、およびグッドパスチャー症候群からなる群から選択される、項目79に記載の使用のための医薬組成物またはキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目81)
前記処置レジメンが特定の処置サイクルの一部である、項目79または項目80に記載の使用のための医薬組成物またはキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目82)
前記特定の処置サイクルが、各処置サイクルあたり、週2回、毎週、10日毎、2週毎、3週毎、または毎月の前記医薬組成物の投与を含む、項目82に記載の使用のための医薬組成物またはキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目83)
前記処置レジメンが、前記対象における前記疾患と関連する臨床パラメーターまたは評価項目の改善をもたらす、項目79から81のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物またはキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目84)
前記臨床パラメーターまたは評価項目が、完全、部分または不完全奏効としての腫瘍縮小;無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答;無増悪生存期間;無病生存期間;再発までの期間;転移までの期間;全生存期間;生活の質の改善;および症状の改善からなる群の1つまたは任意の組合せから選択される、項目83に記載の使用のための医薬組成物またはキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目85)
項目62から65のいずれか一項に記載の医薬組成物、容器、および前記容器上の、またはそれに付随するラベルまたは添付文書を含むキット。
(項目86)
ペプチジルRSを含む第4の部分と、バルキング部分を含む第5の部分とをさらに含む、項目32から35のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目87)
前記第4の部分のRSが、表4に記載される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目86に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目88)
前記第4の部分のRSが、配列LSGRSDNHSPLGLAGS、SPLGLAGSLSGRSDNH、SPLGLSGRSDNH、LAGRSDNHSPLGLAGS、LSGRSDNHVPLSLKMG、SPLGLAGS、GPLALARG、LSGRSDNH、VPLSLTMG、VPLSLKMG、VPLSLSMG、EPLELVAG、EPLELRAG、EPAALMAG、EPASLMAG、RIGSLRTA、RIQFLRTA、EPFHLMAG、VPLSLFMG、EPLELPAG、およびEPLELAAGからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目89)
前記RSが、表3に記載されるプロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼによって切断され得るアミノ酸配列を含む、項目86に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目90)
前記バルキング部分が、XTEN;アルブミン結合ドメイン;アルブミン;IgG結合ドメイン;プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド;脂肪酸;Fcドメイン;ならびにエラスチン様タンパク質からなる群から選択される、項目86に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目91)
前記バルキング部分がXTENである、項目90に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目92)
前記XTENが、表5に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目91に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目93)
表10または表12に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目94)
インタクトな前記アセンブリーが、前記アセンブリーに連結されていないアセンブリーの対応する第1の部分と比較して、エフェクター細胞からのTh1サイトカインの産生を行う能力が1/10以下、または1/20以下、または1/30以下、または1/40以下、または1/50以下、または1/60以下、または1/70以下、または1/80以下、または1/90以下、または1/100以下、または1/1000以下であり、前記アセンブリーが、前記エフェクター細胞および標的細胞と接触している、項目1から35および93のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目95)
前記Th1サイトカインの産生が、PBMCまたはCD3+T細胞ならびにアルファ4インテグリン、Ang2、B7−H3、B7−H6、CEACAM5、cMET、CTLA4、FOLR1、EpCAM、CCR5、CD19、HER2、HER2 neu、HER3、HER4、HER1(EGFR)、PD−L1、PSMA、CEA、MUC1(ムチン)、MUC−2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16 βhCG、Lewis−Y、CD20、CD33、CD38、CD30、CD56(NCAM)、CD133、ガングリオシドGD3;9−O−アセチル−GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、GD2、炭酸脱水酵素IX、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue−1、形質細胞抗原1、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、CCR8、前立腺の6回膜貫通上皮抗原(STEAP)、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、Ly−6、デスモグレイン4、胎児アセチルコリン受容体(fnAChR)、CD25、がん抗原19−9(CA19−9)、がん抗原125(CA−125)、ミュラー管抑制物質受容体II型(MISIIR)、シアル化Tn抗原(s TN)、線維芽細胞活性化抗原(FAP)、エンドシアリン(CD248)、上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)、腫瘍関連抗原L6(TAL6)、SAS、CD63、TAG72、Thomsen−Friedenreich抗原(TF抗原)、インスリン様増殖因子I受容体(IGF−IR)、Cora抗原、CD7、CD22、CD70、CD79a、CD79b、G250、MT−MMP、F19抗原、CA19−9、CA−125、アルファ−フェトタンパク質(AFP)、VEGFR1、VEGFR2、DLK1、SP17、ROR1、およびEphA2からなる群から選択される腫瘍特異的マーカー抗原を有する標的細胞を含むin vitroアッセイにおいてアッセイされる、項目94に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目96)
前記Th1サイトカインが、IL−2、TNF−アルファ、およびIFN−ガンマからなる群から選択される、項目94に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目97)
前記Th1サイトカインの産生が、前記アセンブリーに連結されていない対応する第1の部分を投与された対象と比較して、前記アセンブリーを投与された対象に由来する血液または流体試料を使用してアッセイされる、項目94または項目96に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目98)
前記対象が、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群から選択される、項目97に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目99)
インタクトな前記キメラポリペプチドアセンブリーが、同等用量で対象に投与された場合の前記アセンブリーに連結されていない前記第1の部分と比較して、対象に投与された場合の循環から溢出する能力が1/3以下、または1/10以下、または1/20以下、または1/30以下、または1/40以下、または1/50以下、または1/60以下、または1/70以下、または1/80以下、または1/90以下、または1/100以下である、項目1から35および93のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目100)
(a)項目1から61および86から99のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリーをコードするポリヌクレオチド、または(b)(a)のポリヌクレオチドの相補体から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
(項目101)
表10または表13に記載されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
(項目102)
項目94または項目101に記載のポリヌクレオチド配列と、前記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結した組換え調節配列とを含む発現ベクター。
(項目103)
項目102に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
(項目104)
E.coliである、項目103に記載の単離された宿主細胞。
(項目105)
表7に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むモノマー融合タンパク質。
(項目106)
(a)項目105に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、(b)表7に記載されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列;または(c)(a)もしくは(b)のポリヌクレオチドの相補体から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
(項目107)
項目1から61および86から99のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリーまたはその相補体をコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法における、項目106に記載の核酸の使用。
(項目108)
項目106に記載のポリヌクレオチド配列と、前記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結した組換え調節配列とを含む発現ベクター。
(項目109)
項目108に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
(項目110)
E.coliである、項目109に記載の単離された宿主細胞。
(項目111)
項目1から61および86から99のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリーを産生する方法であって、宿主細胞を項目102または項目108に記載の発現ベクターで形質転換すること、形質転換された前記宿主細胞中での前記キメラポリペプチドアセンブリーの発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養すること、および前記キメラポリペプチドアセンブリーを可溶性ポリペプチドとして単離することを含む方法。
(項目112)
標的細胞の死を誘導する方法であって、前記標的細胞を、項目1から61および85から98のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリーならびにエフェクター細胞と接触させることを含み、前記接触が、膜完全性の喪失、核濃縮、核崩壊、アポトーシスの内因性経路の誘導、アポトーシスの外因性経路の誘導、アポトーシス、細胞溶解、および細胞死からなる群から選択される前記標的細胞中での効果をもたらす、方法。
(項目113)
前記標的細胞と前記エフェクター細胞との混合集団、ならびに前記標的細胞および前記エフェクター細胞の抗原に対する結合親和性を有する有効量の前記キメラポリペプチドアセンブリーを含むin vitroでの細胞ベースアッセイにおいて用いられる、項目112に記載の方法。
(項目114)
前記標的細胞が、アルファ4インテグリン、Ang2、B7−H3、B7−H6、CEACAM5、cMET、CTLA4、FOLR1、EpCAM、CCR5、CD19、HER2、HER2 neu、HER3、HER4、HER1(EGFR)、PD−L1、PSMA、CEA、MUC1(ムチン)、MUC−2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16 βhCG、Lewis−Y、CD20、CD33、CD38、CD30、CD56(NCAM)、CD133、ガングリオシドGD3;9−O−アセチル−GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、GD2、炭酸脱水酵素IX、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue−1、形質細胞抗原1、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、CCR8、前立腺の6回膜貫通上皮抗原(STEAP)、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、Ly−6、デスモグレイン4、胎児アセチルコリン受容体(fnAChR)、CD25、がん抗原19−9(CA19−9)、がん抗原125(CA−125)、ミュラー管抑制物質受容体II型(MISIIR)、シアル化Tn抗原(s TN)、線維芽細胞活性化抗原(FAP)、エンドシアリン(CD248)、上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)、腫瘍関連抗原L6(TAL6)、SAS、CD63、TAG72、Thomsen−Friedenreich抗原(TF抗原)、インスリン様増殖因子I受容体(IGF−IR)、Cora抗原、CD7、CD22、CD70、CD79a、CD79b、G250、MT−MMP、F19抗原、CA19−9、CA−125、アルファ−フェトタンパク質(AFP)、VEGFR1、VEGFR2、DLK1、SP17、ROR1、およびEphA2からなる群から選択される腫瘍特異的マーカー抗原を有し、前記エフェクター細胞がT細胞であり、前記エフェクター細胞抗原がCD3である、項目112に記載の方法。
(項目115)
前記標的細胞の集団を含むがんを有する対象において用いられ、前記対象に治療有効量の前記キメラポリペプチドアセンブリーを投与することを含む、項目114に記載の方法。
(項目116)
前記キメラポリペプチドアセンブリーと、1つまたは複数の賦形剤とを含む医薬組成物の1つまたは複数の連続的に投与される治療有効用量として、前記キメラポリペプチドアセンブリーを投与することを含む、項目115に記載の方法。
(項目117)
前記がんを有する前記対象において治療効果を達成するのに必要とされる医薬組成物の量を決定し、1つまたは複数の連続用量としての前記量を前記対象に投与するレジメンを含む、項目116に記載の方法。
(項目118)
前記がんが、癌腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、ER/PR+乳がん、Her2+乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、悪性腹水を伴う結腸がん、粘液腫瘍、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん(gastric cancer)、胃がん(stomach cancer)、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、男化腫瘍、腺癌、肉腫、およびB細胞由来慢性リンパ性白血病からなる群から選択される、項目115から117のいずれか一項に記載の方法。
(項目119)
全生存期間、症状評価項目、無病生存期間、客観的奏功率、完全奏効、奏効期間、無増悪生存期間、無増悪期間、治療成功期間、腫瘍測定、腫瘍サイズ、腫瘍奏効率、転移までの期間、およびバイオマーカー濃度からなる群から選択される臨床パラメーターまたは評価項目の改善をもたらす、項目115から118のいずれか一項に記載の方法。
(項目120)
前記方法が、前記キメラポリペプチドアセンブリーの前記第1の部分を含み、前記第2の部分および第3の部分を含まない組成物の、同等の対象へのmmol/kgの同等用量の投与と比較して、前記対象における診断的に関連する副作用の頻度、持続期間、または重症度の減少をもたらし、前記副作用が、IL−2の血漿レベルの増大、TNF−アルファの血漿レベルの増大、IFN−ガンマの血漿レベルの増大、敗血症、発熱性好中球減少症、神経毒性、痙攣、脳症、サイトカイン放出症候群、言語障害、平衡障害、発熱、頭痛、混乱、低血圧、好中球減少症、悪心、意識障害、見当識障害、および肝酵素の増加からなる群から選択される、項目115から119のいずれか一項に記載の方法。
(項目121)
腫瘍特異的マーカーを含む腫瘍細胞に治療剤を送達する方法であって、標的細胞に、項目1から61および86から99のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリーを投与することを含み、前記治療剤が、前記腫瘍特異的マーカーに特異的に結合する前記第1の部分の前記第1の結合ドメインを介して前記標的細胞に送達される、方法。
(項目122)
前記腫瘍特異的マーカーが、アルファ4インテグリン、Ang2、B7−H3、B7−H6、CEACAM5、cMET、CTLA4、FOLR1、EpCAM、CCR5、CD19、HER2、HER2 neu、HER3、HER4、HER1(EGFR)、PD−L1、PSMA、CEA、MUC1(ムチン)、MUC−2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16 βhCG、Lewis−Y、CD20、CD33、CD38、CD30、CD56(NCAM)、CD133、ガングリオシドGD3;9−O−アセチル−GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、GD2、炭酸脱水酵素IX、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue−1、形質細胞抗原1、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、CCR8、前立腺の6回膜貫通上皮抗原(STEAP)、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、Ly−6、デスモグレイン4、胎児アセチルコリン受容体(fnAChR)、CD25、がん抗原19−9(CA19−9)、がん抗原125(CA−125)、ミュラー管抑制物質受容体II型(MISIIR)、シアル化Tn抗原(s TN)、線維芽細胞活性化抗原(FAP)、エンドシアリン(CD248)、上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)、腫瘍関連抗原L6(TAL6)、SAS、CD63、TAG72、Thomsen−Friedenreich抗原(TF抗原)、インスリン様増殖因子I受容体(IGF−IR)、Cora抗原、CD7、CD22、CD70、CD79a、CD79b、G250、MT−MMP、F19抗原、CA19−9、CA−125、アルファ−フェトタンパク質(AFP)、VEGFR1、VEGFR2、DLK1、SP17、ROR1、およびEphA2からなる群から選択される、項目121に記載の方法。
(項目123)
前記腫瘍特異的マーカーが、アルファ4インテグリン、Ang2、CEACAM5、CD19、CD20、CD33、CD38、cMET、CTLA4、EpCAM、EphA2、FOLR1、HER1(EGFR)、HER2、HER3、HER1(EGFR)/HER3、HER2/3、メソテリン、MUC1、PD−L1、PSMA、TAG−72、VEGFR1、VEGFR2からなる群から選択される、項目121に記載の方法。
(項目124)
キメラポリペプチドアセンブリーが、表12の配列からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも90%、または少なくとも91%、または少なくとも92%、または少なくとも93%、または少なくとも94%、または少なくとも95%、または少なくとも96%、または少なくとも97%、または少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目123に記載の方法。
(項目125)
キメラポリペプチドアセンブリーが、図36または図37に記載される配列からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも90%、または少なくとも91%、または少なくとも92%、または少なくとも93%、または少なくとも94%、または少なくとも95%、または少なくとも96%、または少なくとも97%、または少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目123に記載の方法。
(項目126)
前記腫瘍細胞が、対象における腫瘍中に存在する、項目121から125のいずれか一項に記載の方法。
(項目127)
前記対象が、マウス、ラット、サル、イヌ、およびヒトからなる群から選択される、項目126に記載の方法。
(項目128)
前記第2の部分も前記第3の部分も前記第1の部分に対する特異的結合親和性を有さない、項目1から61のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目129)
前記第1の部分が、前記キメラポリペプチドアセンブリーの分子量の50%未満を占める、項目1から61のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目130)
見かけの分子量係数がサイズ排除クロマトグラフィーによって評価される場合、前記第1の部分が、前記キメラポリペプチドアセンブリーの見かけの分子量係数の30%未満、または40%未満、または50%未満を占める、項目1から61のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目131)
前記第2の部分が切断され、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第1の部分および前記第3の部分が放出されると、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって評価される場合、前記放出された第1の部分の流体力学半径が、前記インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの流体力学半径の約30%未満、または約40%未満、または約50%未満である、項目36に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目132)
前記第2の部分が切断され、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第1の部分および前記第3の部分が放出されると、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される場合、前記放出された第1の部分の流体力学半径が、約5nm未満、または約4nm未満、または約3nm未満である、項目36に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目133)
前記放出された第1の部分が、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーと比較して、腫瘍組織に浸透する高い能力を有する、項目132に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目134)
流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される場合、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの流体力学半径が、約8nmより大きい、または約9nmより大きい、または約10nmより大きい、項目1から35のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目135)
腫瘍を有する対象に投与されたインタクトなキメラポリペプチドアセンブリーが、前記腫瘍の血管系から溢出する能力と比較して、前記対象の正常組織の血管系から溢出する能力がより低い、項目1から35のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目136)
表10または表12に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目137)
図36または図37に記載される配列からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも90%、または少なくとも91%、または少なくとも92%、または少なくとも93%、または少なくとも94%、または少なくとも95%、または少なくとも96%、または少なくとも97%、または少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドアセンブリー。
(項目138)
図36または図37に記載される配列からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも90%、または少なくとも91%、または少なくとも92%、または少なくとも93%、または少なくとも94%、または少なくとも95%、または少なくとも96%、または少なくとも97%、または少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるキメラポリペプチドアセンブリー。
図1は、様々な図面で使用される様々な概略図を、それらが表す説明と共に描写する。
図2は、非切断「プロ」型、および腫瘍関連プロテアーゼによる作用を受けた後の切断された状態であるProTIA組成物(本明細書においてキメラポリペプチドアセンブリーとしても記載される)を描写する。図はまた、組成物の両方の型の非限定的な特性の一部も記載する。
図3は、図3Aに非切断「プロ」型および図3Bに切断型を示し、非切断型を、それぞれ細胞表面抗原と共にエフェクター細胞および腫瘍関連細胞の近位に描写する。しかし、図3Aの非切断型は、標的化(または結合)ドメインのバルキング部分の立体妨害および遮蔽効果のために2つの細胞に同時に結合することができないが、図3Bの切断型は、標的化ドメインが放出され、2つの細胞が同時に結合することを可能にし、エフェクター細胞による標的の腫瘍関連細胞に対する免疫活性化を可能にする。
図4は、放出断片およびバルキング部分がエフェクター細胞結合部分または腫瘍抗原結合部分のいずれかに付着することができることを例証する、ProTIA組成物の2つの構成の略図を示す。
図5は、2つの放出断片と2つのバルキング部分が結合部分に連結されている、ProTIA組成物の2つの構成の略図を示す。図5Aの場合、1つのRSとバルキング部分がエフェクター細胞結合部分に連結され、他のRSとバルキング部分が腫瘍抗原結合部分に連結され、組成物はscFvの構成であろう。図5Bの場合、RSとバルキング部分の両方がエフェクター細胞結合部分(左側)または腫瘍抗原結合部分(右側)のいずれかに付着し、結合部分は、ダイアボディの構成であろう(このため、組成物を組換え型で産生することができる)。
図6A〜6Dは、バルキング部分がXTENポリペプチドであり、RSとバルキング部分がエフェクター細胞結合部分(左側)に連結され、またはRSとバルキング部分が腫瘍抗原結合部分(右側)に連結されている、いずれかのProTIA組成物の2つの構成の略図を示す。
図7は、2つの放出断片と2つのXTENが結合部分に連結されている、ProTIA組成物の2つの構成の略図を示す。図7Aの場合、1つのRSと1つのXTENが、エフェクター細胞結合部分に連結され、他のRSとバルキング部分が腫瘍抗原結合部分に連結され、組成物は、scFvの構成であろう。図7Bの場合、RSとXTENの両方が、エフェクター細胞結合部分(右側)または腫瘍抗原結合部分(左側)のいずれかに付着し、結合部分はダイアボディの構成であろう(このため、組成物を組換え型で産生することができる)。
図8は、RSとバルキング部分が、エフェクター細胞結合部分(左側)または腫瘍抗原結合部分(右側)のいずれかに連結されている、ProTIA組成物の2つの構成の略図を示す。図8Aは、XTENとしての結合部分を描写する。図8Bは、アルブミンとしての結合部分を描写する。図8Cは、Fc断片としての結合部分を描写する。
図9は、2つの放出断片と2つのバルキング部分が結合部分に連結されている、ProTIA組成物の構成の略図を示す。図9Aの場合、2つのRSとXTENが、エフェクター細胞結合部分および腫瘍抗原結合部分の両方(左側)に、腫瘍抗原結合部分(中央)に、またはエフェクター細胞結合部分(右側)に連結されている、3つの構成を描写する。図9Bは、1つのRSとXTENが、エフェクター細胞結合部分に連結され、なおかつ1つのRSとアルブミンが、腫瘍抗原結合部分に連結されている(左上側)、1つのRSとXTENが腫瘍抗原結合部分に連結され、なおかつ1つのRSとアルブミンがエフェクター細胞結合部分に連結されている(右上側)、RSとXTENおよびRSとアルブミンの両方が腫瘍抗原結合部分に連結されている(左下側)、ならびにRSとXTENおよびRSとアルブミンの両方がエフェクター細胞結合部分に連結されている(右下側)、4つの構成を描写する。図9Cは、1つのRSとXTENがエフェクター細胞結合部分に連結され、なおかつ1つのRSとFcが腫瘍抗原結合部分に連結され(左上側)、1つのRSとXTENが腫瘍抗原結合部分に連結され、なおかつ1つのRSとFcがエフェクター細胞結合部分に連結され(右上側)、RSとXTENおよびRSとFcの両方が腫瘍抗原結合部分に連結され(左下側)、RSとXTENおよびRSとFcの両方がエフェクター細胞結合部分に連結されている(右下側)、4つの構成を描写する。
図10は、腫瘍組織(左側)および正常組織(右側)の近位のProTIAの略図を示し、腫瘍組織におけるより透過性の血管系により、ProTIAを組織内に溢出させ、組織内で腫瘍関連プロテアーゼがRSに作用して、RSを切断して結合部分を放出することができ、次に結合部分がエフェクター細胞と腫瘍関連細胞に同時に結合することができる。正常組織の場合、溢出は、より堅固な血管系障壁によって遮断されるか、またはProTIAが溢出する場合は、ProTIAは、「プロ」型のままで、エフェクター細胞に結合することができ、腫瘍細胞が存在しないか、または存在しても、存在するプロテアーゼが結合部分を放出させるには不十分で、真の影響は、免疫シナプスが形成されないことである。
図11は、それぞれVH/VL対がリンカーによって接合された、タンデムフォーマットのエフェクター細胞結合部分、腫瘍抗原結合部分のscFvの構成の略図を示す。
図12は、それぞれVH/VL対がリンカーによって接合された、エフェクター細胞結合部分、腫瘍抗原結合部分のダイアボディの構成の略図を示す。
図13Aは、一般的な構築物設計の略図を示す。図13Bおよび13Cは、エフェクター細胞結合部分および腫瘍抗原結合部分が様々な順序で、scFvの構成で存在する(図13B)[可変重鎖(VH)および可変軽鎖(VL)ドメインが分子内長鎖リンカー(L)または分子内短鎖リンカー(I)のいずれかによって連結されている]、およびダイアボディの構成で存在する(図13C)[VHおよびVLドメインが長鎖リンカー(L)または分子内短鎖リンカー(I)のいずれかによって連結されている]、ProTIA組成物の略図を示す。
図14は、実施例2に記載される、発酵培地からの非切断AC1278の精製を示す。図14Aは、発酵培地からのAC1278のIMAC捕獲の例示的なSDS−PAGEを示す。図14Bは、HIC研磨ステップの画分のSDS−PAGE分析を示す。図14Cは、ImpRes−Q研磨ステップの画分のSDS−PAGE分析を示す。
図15は、実施例2に記載される、非切断AC1278のロット放出分析を示す。図15Aは、XTENの長さの標準物質(破線)に対する非切断AC1278(実線)のロット放出分析的SECクロマトグラフィーを示す。図15Bは、非切断AC1278のロット放出SDS−PAGEを示す。
図16は、実施例2に記載される、非切断AC1278を使用する切断型ProTIA−Aの調製を示す。図16Aは、MMP−9消化反応混合物のSDS−PAGE分析を示す。図16Bは、切断されたXTEN断片を除去するためのMMP−9消化混合物のIMAC精製のSDS−PAGE分析を示す。
図17は、実施例2に記載される、切断AC1278のロット放出分析を示す。図17Aは、球状タンパク質標準物質(破線)に対する切断AC1278(実線)のロット放出分析的SECクロマトグラフィーを示す。図17Bは、切断AC1278のロット放出SDS−PAGEを示す。
図18は、実施例3に記載される、発酵培地からの非切断AC1476の精製を示す。図18Aは、発酵培地からのAC1476のIMAC捕捉の例示的なSDS−PAGEを示す。図18Bは、HIC研磨ステップの画分のSDS−PAGE分析を示す。図18Cは、ImpRes−Q研磨ステップの画分のSDS−PAGE分析を示す。
図19は、実施例3に記載される、非切断AC1476のロット放出分析を示す。図19Aは、XTENの長さの標準物質(破線)に対する非切断AC1476(実線)のロット放出分析的SECクロマトグラフィーを示す。図19Bは、クマシー染色による非切断AC1476のロット放出SDS−PAGEを示す。図19Cは、銀染色による非切断AC1476のロット放出SDS−PAGEを示す。
図20は、実施例3に記載される、非切断AC1476のさらなるロット放出分析を示す。図20Aは、非切断AC1476のロット放出ESI−MSを示す。図20Bは、非切断AC1476のロット放出カチオン交換クロマトグラフィーを示す。
図21は、実施例3に記載される、非切断AC1476を使用する切断型ProTIA−Aの調製を示す。図21Aは、MMP−9消化反応混合物のSDS−PAGE分析を示す。図21Bは、切断基質ならびに切断XTEN断片を除去するためのMMP−9消化混合物のアニオン交換画分のSDS−PAGE分析を示す。
図22は、実施例3に記載される切断AC1476のロット放出分析を示す。図22Aは、球状タンパク質標準物質(破線)に対する切断AC1476(実線)のロット放出分析的SECを示す。図22Bは、クマシー染色による切断AC1476のロット放出SDS−PAGEを示す。図22Cは、銀染色による切断AC1476のロット放出SDS−PAGEを示す。
図23は、実施例3に記載される切断AC1476のさらなるロット放出分析を示す。図23Aは、切断AC1476のロット放出ESI−MSを示す。図23Bは、切断AC1476のロット放出カチオン交換クロマトグラフィーを示す。
図24は、実施例4に記載される、プロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの、リガンドに対する結合を示す。
図25は、実施例6に記載される、プロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのin vitro活性を決定する実験の結果を描写する。
図26は、実施例6に記載される、抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのin vitro特異性を決定する実験の結果を描写する。
図27は、実施例6に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのin vitro活性を決定する実験の結果を描写する。
図28は、実施例9に記載される、プロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのPKを決定する実験の結果を描写する。
図29は、T細胞結合組成物のN末端からC末端に逆向きの構成の略図を示す。図29Aは、エフェクター細胞結合部分(ECBM)の後に放出部位断片(RS)およびXTENが続く構成を示し、図29Bは、XTENの後にRS断片およびその後にECBMが続く構成を示す。
図30は、実施例6に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのSK−OV3におけるin vitro活性を決定する実験の結果を描写する。
図31は、実施例10に記載される、プロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの抗腫瘍効果を決定する実験の腫瘍体積の結果を描写する。
図32は、実施例10に記載される、プロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの抗腫瘍効果を決定する実験の体重の結果を描写する。
図33は、実施例12に記載される、プロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのサイトカインプロファイルを決定する実験の結果を描写する。図33Aは、IL−2を検出するアッセイの結果を示し、図33Bは、IL−4を検出するアッセイの結果を示す。
図34は、実施例12に記載される、プロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのサイトカインプロファイルを決定する実験の結果を描写する。図34Aは、IL−6を検出するアッセイの結果を示し、図34Bは、IL−10を検出するアッセイの結果を示す。
図35は、実施例12に記載される、プロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのサイトカインプロファイルを決定する実験の結果を描写する。図35Aは、IFN−ガンマを検出するアッセイの結果を示し、図35Bは、TNF−アルファを検出するアッセイの結果を示す。
図36は、AC1476 aEpCAM−aCD3 ProTIAのアミノ酸配列である。
図37は、AC1489 aEpCAM−aCD3 ProTIAのアミノ酸配列である。
図38は、実施例13に記載される、抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、および非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの抗腫瘍効果を決定する実験のHCT−116腫瘍体積の結果を描写する。
図39は、実施例13に記載される、抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、および非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの抗HCT−116腫瘍効果を決定する実験の体重の結果を描写する。
図40は、実施例14に記載される、ヒト精製CD3陽性T細胞の存在下での、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのSK−OV−3におけるin vitro活性を決定する実験の結果を描写する。
図41は、実施例14に記載される、ヒト精製CD3陽性T細胞の存在下での、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのOVCAR−3におけるin vitro活性を決定する実験の結果を描写する。
図42は、実施例8に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる、PBMCおよびSK−OV−3細胞の同時培養におけるCD8およびCD4細胞におけるCD69の活性化を測定する実験の結果を描写する。図42Aは、CD8細胞におけるCD69の活性化を描写し、図42Bは、CD4細胞におけるCD69の活性化を描写する。
図43は、実施例8に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる、PBMCおよびSK−OV−3細胞の同時培養におけるCD8およびCD4細胞におけるCD69およびCD25両方の活性化を測定する実験の結果を描写する。図43Aは、CD8細胞におけるCD69およびCD25両方の活性化を描写し、図43Bは、CD4細胞におけるCD69およびCD25両方の活性化を描写する。
図44は、実施例8に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる、精製CD3+細胞およびSK−OV−3細胞の同時培養におけるCD8およびCD4細胞におけるCD69の活性化を測定する実験の結果を描写する。図44Aは、CD8細胞におけるCD69の活性化を描写し、図44Bは、CD4細胞におけるCD69の活性化を描写する。
図45は、実施例8に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる、精製CD3+細胞およびSK−OV−3細胞の同時培養におけるCD8およびCD4細胞におけるCD69およびCD25両方の活性化を測定する実験の結果を描写する。図45Aは、CD8細胞におけるCD69およびCD25両方の活性化を描写し、図45Bは、CD4細胞におけるCD69およびCD25両方の活性化を描写する。
図46は、実施例8に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる、精製CD3+細胞およびOVCAR3細胞の同時培養におけるCD8およびCD4細胞におけるCD69の活性化を測定する実験の結果を描写する。図46Aは、CD8細胞におけるCD69の活性化を描写し、図46Bは、CD4細胞におけるCD69の活性化を描写する。
図47は、実施例8に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる、精製CD3+細胞およびOVCAR3細胞の同時培養におけるCD8およびCD4細胞におけるCD69およびCD25両方の活性化を測定する実験の結果を描写する。図47Aは、CD8細胞におけるCD69およびCD25両方の活性化を描写し、図47Bは、CD4細胞におけるCD69およびCD25両方の活性化を描写する。
図48は、実施例8に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる、PBMCおよびOVCAR3細胞の同時培養におけるCD8およびCD4細胞におけるCD69の活性化を測定する実験の結果を描写する。図48Aは、CD8細胞におけるCD69の活性化を描写し、図48Bは、CD4細胞におけるCD69の活性化を描写する。
図49は、実施例8に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる、PBMCおよびOVCAR3細胞の同時培養におけるCD8およびCD4細胞におけるCD69およびグランザイムB両方の活性化を測定する実験の結果を描写する。図49Aは、CD8細胞におけるCD69およびグランザイムB両方の活性化を描写し、図49Bは、CD4細胞におけるCD69およびグランザイムB両方の活性化を描写する。
図50は、実施例15に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる、精製CD3+細胞およびSK−OV−3細胞の同時培養におけるサイトカインIL−2およびIL−4の放出を測定する実験の結果を描写する。図50Aは、放出されたIL−2の濃度を描写し、図50Bは、放出されたIL−4の濃度を描写する。
図51は、実施例15に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる、精製CD3+細胞およびSK−OV−3細胞の同時培養におけるサイトカインIL−6およびIL−10の放出を測定する実験の結果を描写する。図51Aは、放出されたIL−6の濃度を描写し、図51Bは、放出されたIL−10の濃度を描写する。
図52は、実施例15に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる、精製CD3+細胞およびSK−OV−3細胞の同時培養におけるサイトカインTNF−アルファおよびIFN−ガンマの放出を測定する実験の結果を描写する。図52Aは、放出されたTNF−アルファの濃度を描写し、図52Bは、放出されたIFN−ガンマの濃度を描写する。
図53は、実施例16に記載される、CD3εδリガンドに対するプロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、および非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの結合曲線を示す。
図54は、実施例17に記載される、rhEpCAMリガンドに対するプロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの結合特異性を示す。
図55は、実施例18に記載される、抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、および非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの抗腫瘍効果を決定する実験のSW480腫瘍体積の結果を描写する。
図56は、実施例18に記載される、抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、および非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの抗SW480腫瘍効果を決定する実験の体重の結果を描写する。
図57は、実施例23に記載される、ヒトPBMCの存在下でのSKOV3におけるプロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのin vitro活性を決定する実験の結果を描写する。
図58は、実施例23に記載される、ヒトPBMCの存在下でのOVCAR3におけるプロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのin vitro活性を決定する実験の結果を描写する。
図59は、実施例23に記載される、ヒトPBMCの存在下でのHCT116におけるプロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのin vitro活性を決定する実験の結果を描写する。
図60は、実施例23に記載される、ヒトPBMCの存在下でのSW480におけるプロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのin vitro活性を決定する実験の結果を描写する。
本発明の実施形態を説明する前に、そのような実施形態は単に例示の目的で提供されており、本明細書で説明されている本発明の実施形態に対する様々な代替を本発明の実施で用い得ることを理解されたい。本発明から逸脱することなく、これより当業者は多くの変更、変形および置換を想到するだろう。
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書で説明されているものと類似のまたは等価の方法および物質を本発明の実施または試験で使用することができるが、適切な方法および物質を以下で説明する。矛盾する場合は、定義を含む本特許明細書が支配する。加えて、物質、方法および例は単なる例示であり、限定することを意図するものではない。本発明から逸脱することなく、これより当業者は多くの変更、変形および置換えを想到するだろう。
定義
本出願の文脈では、別途明記しない限り、以下の用語はこれらの用語に帰する意味を有する。
本明細書および本特許請求の範囲の全体を通して使用される場合、用語「a」、「an」および「the」を、後に上限が具体的に述べられている場合を除いて、これらの用語が「少なくとも1つ」、「少なくとも第1」、「1または複数」または「複数」の参照される構成要素またはステップを意味しているという意味で使用される。したがって、「切断配列」は、本明細書で使用される場合、「少なくとも第1の切断配列」を意味するが複数の切断配列を含む。組合せの作動可能な限界およびパラメーターは、任意の単剤の量と同様に、本開示を踏まえて当業者に公知であるだろう。
本明細書では、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用される。このポリマーは直鎖であってもよいし分枝していてもよく、改変アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により中断されていてもよい。これらの用語はまた、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作(例えば標識成分とのコンジュゲーション)により改変されているアミノ酸ポリマーも包含する。
用語「単量体」は、ポリペプチドに適用される場合、このポリペプチドの状態が、同一または異なる配列の1つもしくは複数の追加のポリペプチドを実質的に伴わない単一の連続したアミノ酸配列であることを指す。このポリペプチドの単量体状態を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、分子量が同一である単一のタンパク質性実体として確認することができる。
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、D型光学異性体もしくはL型光学異性体の両方を含むがこれらに限定されない、天然のおよび/または非天然のもしくは合成のアミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体のいずれかを指す。アミノ酸を、標準的な1文字コードまたは3文字コードを使用して指定することができる。
用語「天然L−アミノ酸」または「L−アミノ酸」は以下のL型光学異性体形態を意味する:グリシン(G)、プロリン(P)、アラニン(A)、バリン(V)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、システイン(C)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)、ヒスチジン(H)、リシン(K)、アルギニン(R)、グルタミン(Q)、アスパラギン(N)、グルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)、セリン(S)およびトレオニン(T)。
用語「天然には存在しない」は、配列に適用される場合および本明細書で使用される場合、哺乳動物で見出される野生型のまたは天然に存在する配列に対するカウンターパートを有しない、この配列に対して相補的ではないまたはこの配列との高度の相同性を有しないポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、天然には存在しないポリペプチドまたは断片は、適切にアラインさせた場合に天然配列と比較して99%、98%、95%、90%、80%、70%、60%、50%以下またはさらに低いアミノ酸配列同一性を共有し得る。
用語「親水性」および「疎水性」は、物質が有する水に対する親和性の程度を指す。親水性物質は水に対して強い親和性を有し、水に溶解する傾向、水と混合する傾向または水に濡れる傾向があり、疎水性物質は、水に対する親和性を実質的に欠いており、水をはじいて吸収しない傾向がありかつ水に溶解しない傾向または水と混合しない傾向または水に濡れない傾向がある。アミノ酸を、その疎水性に基づいて特徴付けることができる。いくつかの尺度が開発されている。一例は、Levitt, Mら、J Mol Biol (1976年)104巻:59頁により開発された尺度であり、この尺度は、Hopp, TPら、Proc Natl Acad Sci U S A (1981年)78巻:3824頁で列挙されている。「親水性アミノ酸」の例は、アルギニン、リシン、トレオニン、アラニン、アスパラギンおよびグルタミンである。特に興味深いのは、親水性アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸およびセリンおよびグリシンである。「疎水性アミノ酸」の例は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンである。
「断片」とは、生物学的に活性なタンパク質(抗体ではない)に適用される場合、治療上活性なおよび/または生物活性の少なくとも一部を保持する生物学的に活性なタンパク質のトランケート型のことである。「バリアント」とは、生物学的に活性なタンパク質に適用される場合、生物学的に活性なタンパク質の治療活性および/または生物活性の少なくとも一部を保持する生物学的に活性な天然タンパク質に対する配列相同性を有するタンパク質のことである。例えば、バリアントタンパク質は、生物学的に活性な参照タンパク質と比較して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%のアミノ酸配列同一性を共有することができる。本明細書で使用される場合、用語「生物学的に活性なタンパク質バリアント」は、例えば部位特異的変異誘発、コード遺伝子の合成、挿入により故意に改変され、または変異により偶然に改変され、活性を保持するタンパク質を含む。
用語「配列バリアント」は、1つもしくは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換により天然のまたは元々の配列と比較して改変されているポリペプチドを意味する。挿入は、タンパク質のどちらかのまたは両方の末端に位置していてもよく、アミノ酸配列の内部領域内に位置してもよい。非限定的な例は、異なるアミノ酸によるXTEN中でのアミノ酸の置換である。欠失バリアントでは、本明細書で説明されているポリペプチド中の1つまたは複数のアミノ酸残基が除去されている。したがって、欠失バリアントは、説明されているポリペプチド配列の全ての断片を含む。置換バリアントでは、ポリペプチドの1つまたは複数のアミノ酸残基が除去されて代替残基で置換されている。一態様では、この置換は本質的に保存的であり、この種の保存的置換は当技術分野で周知である。
用語「部分」は、より大きな構成物の一成分を意味するか、またはより大きな構成物に組み込まれることが意図されていること、例えば、より大きなポリペプチドに連続的なまたは非連続的な配列として接合されるタンパク質性部分を意味する。より大きな構成物の部分は所望の機能を付与することができる。例えば、バルキング部分は、このバルキング部分が会合している、結果として得られるより大きな構成物の分子量および/または半減期を増加させる機能を付与することができる。
用語「放出セグメント」または「RS」は、1つまたは複数のプロテアーゼにより認識されて切断され得る構成物中の切断配列であって、この構成物から1つまたは複数の位置または部分を放出させる切断配列を指す。本明細書で使用される場合、「哺乳動物プロテアーゼ」は、体液、細胞、組織中に通常存在しかつ哺乳動物のある特定の標的組織または細胞中、例えば疾患組織(例えば、腫瘍)中において高レベルで見出され得るプロテアーゼを意味する。RS配列は、対象における標的組織中に存在するかもしくはこの標的組織に近位である、またはin vitroアッセイにおいて導入される様々な哺乳動物プロテアーゼまたは多数の哺乳動物プロテアーゼにより切断されるように操作され得る。規定された切断部位を認識することが可能である他の等価のプロテアーゼ(内因性または外因性)を利用することができる。RS配列は、利用されるプロテアーゼに対して調節されかつ調整され得、リンカーアミノ酸を組み込んで隣接ポリペプチドに接合され得ることが具体的に企図される。
用語「内」は、第2のポリペプチドに連結されている第1のポリペプチドに言及する場合、第1または第2のポリペプチドのN末端をそれぞれ第2または第1のポリペプチドのC末端に接続する追加の成分の連結または融合、ならびに第2のポリペプチドの配列中への第1のポリペプチドの挿入を包含する。例えば、RS成分がキメラポリペプチドアセンブリー「内」で連結されている場合、このRSは、XTENポリペプチドのN末端、C末端に連結され得るか、またはこのXTENポリペプチドの任意の2つのアミノ酸間に挿入され得る。
「活性」は、本明細書で提供される組成物の形態に適用される場合、in vitro、ex vivoまたはin vivoアッセイにより測定されるか臨床効果により測定されるかにかかわらず、この組成物のエフェクター成分に関する、受容体結合、アンタゴニスト活性、アゴニスト活性、細胞性のもしくは生理的な応答、細胞溶解、細胞死、または当技術分野で一般に公知の効果を含むがこれらに限定されない、作用または効果を指す。
「エフェクター細胞」は、本明細書で使用される場合、標的細胞に影響を及ぼし得る任意の真核細胞を含む。例えば、エフェクター細胞は、標的細胞の膜の完全性、核濃縮、核崩壊、アポトーシス、溶解および/または死滅の喪失を誘導することができる。別の例では、エフェクター細胞は、標的細胞の分裂、増殖、分化を誘導することができ、またはその他の方法で標的細胞のシグナル伝達を変化させることができる。エフェクター細胞の非限定的な例として、形質細胞、T細胞、CD4細胞、CD8細胞、B細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞(CIK細胞)、マスト細胞、樹状細胞、調節性T細胞(RegT細胞)、ヘルパーT細胞、骨髄性細胞、マクロファージおよびNK細胞が含まれる。
「エフェクター細胞抗原」は、エフェクター細胞により発現される分子を指し、タンパク質、糖タンパク質またはリポタンパク質等の細胞表面分子が含まれるがこれに限定されない。例示的なエフェクター細胞抗原として、CD3複合体またはT細胞受容体(TCR)、CD4、CD8、CD25、CD38、CD69、CD45RO、CD57、CD95、CD107およびCD154のタンパク質と、エフェクター分子、例えば、エフェクター細胞に関連するサイトカイン、エフェクター細胞に結合するサイトカイン、エフェクター細胞内で発現されるサイトカイン、またはエフェクター細胞により発現されて放出されるサイトカインとが含まれる。エフェクター細胞抗原は、対象キメラポリペプチド会合体の結合ドメインの結合カウンターパートとして機能することができる。対象組成物が結合し得るエフェクター細胞抗原の非限定的な例として、細胞表面上の抗原、例えば、CD3、CD4、CD8、CD25、CD38、CD69、CD45RO、CD57、CD95、CD107およびCD154と、IL2、IL10、IL12、IFNγおよびTNFαから選択されるTh1サイトカインが含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「ELISA」は、本明細書で説明されているまたは当技術分野で公知の酵素結合免疫吸着アッセイを指す。
「宿主細胞」は、外因性核酸が導入されている、本明細書で説明されているもの等の対象ベクターのレシピエントであり得るまたはレシピエントである個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は単一宿主細胞の子孫を含む。この子孫は、天然の、偶発的なまたは意図的な変異に起因して、元の親細胞に対して(形態においてまたは全DNA相補体のゲノムにおいて)必ずしも完全に同一である必要はないかもしれない。宿主細胞として、本発明のベクターによりin vivoでトランスフェクトされた細胞が含まれる。
「単離された」は、本明細書で開示されている様々なポリペプチドを説明するために使用される場合、(例えばタンパク質精製中に)その天然環境の成分またはより複雑な混合物から同定されて分離されているおよび/または回収されているポリペプチドを意味する。その天然環境の夾雑成分は、概してポリペプチドの診断的なまたは治療的な使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性のまたは非タンパク質性の溶質を含み得る。当業者には明らかであるように、天然には存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片は、その天然に存在するカウンターパートから区別するための「単離」を必要としない。加えて、「濃縮された」、「分離された」または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片は、体積当たりの分子の濃度または数が概してその天然に存在するカウンターパートの場合と比べて大きいという点で、その天然に存在するカウンターパートと区別可能である。一般に、組換え手段により作製されて宿主細胞中で発現されたポリペプチドは、「単離されている」と見なされる。
「単離された核酸」とは、同定されかつこのポリペプチドコード核酸の天然源中において通常関連する少なくとも1種の夾雑核酸分子から分離されている核酸分子のことである。例えば、単離されたポリペプチドコード核酸分子は、それが天然で見出される形態または状況以外で存在する。したがって、単離されたポリペプチドコード核酸分子は、それが天然細胞中に存在する場合には特定のポリペプチドコード核酸分子と区別される。しかしながら、単離されたポリペプチドコード核酸分子は、通常はポリペプチドを発現する細胞に含まれるポリペプチドコード核酸分子を含み、例えば、この核酸分子は、天然細胞の場合とは異なる染色体または染色体外の位置に存在する。
「キメラ」タンパク質またはポリペプチドは、天然に存在する場合とは配列中の位置が異なる少なくとも1つの領域を含む少なくとも1つの融合ポリペプチドを含む。これらの領域は、通常は別個のタンパク質に存在し得、かつ融合ポリペプチド中で一緒になるか、または通常は同一のタンパク質中に存在し得るが融合ポリペプチド中では新たな配置に置かれる。例えば、化学合成により、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドの作成および翻訳により、キメラタンパク質を作成することができる。
「融合した」および「融合」は本明細書において互換的に使用され、2つまたはそれよりも多くのペプチドまたはポリペプチド配列を組換え手段により一緒に接合することを指す。「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」は、自然界では天然に連結されない第2のアミノ酸配列に連結された第1のアミノ酸配列を含む。
「XTEN化」は、組換え手段によるか化学的架橋手段によるかにかかわらず、1つまたは複数のXTENポリペプチド(以下に記載する)のペプチドまたはポリペプチドへの連結または融合により改変されているペプチドまたはポリペプチドを示すために使用される。
「作動可能に連結された」は、連結されるDNA配列が連続しておりかつ読取り相中に存在するかまたはインフレームであることを意味する。「インフレーム融合」は、元のORFの正しいリーディングフレームを維持する方法で、連続するより長いORFを形成するための2つまたはそれよりも多くのオープンリーディングフレーム(ORF)の接合を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがポリペプチド配列の転写に影響を及ぼす場合、このプロモーターまたはエンハンサーはポリペプチドのコード配列に作動可能に連結されている。そのため、結果として得られる組換え融合タンパク質は、元のORFによりコードされるポリペプチドに対応する2つまたはそれよりも多くのセグメント(これらのセグメントは通常、自然界ではそのように接合されていない)を含む単一タンパク質である。
「架橋する」、「コンジュゲートする」、「連結」、「連結する」および「接合される」は本明細書では互換的に使用され、化学反応による2つの異なる分子の共有結合的な接合を指す。架橋は、当技術分野で公知であるように、1つまたは複数の化学反応で起こり得る。
用語「コンジュゲーションパートナー」は、本明細書で使用される場合、コンジュゲーション反応で連結され得るまたは連結されている個々の成分を指す。
用語「コンジュゲート」(名詞として使用される)は、コンジュゲーションパートナー同士を共有結合的に連結する結果として形成された異種分子を指すように意図されており、例えば、放出セグメントに共有結合的に連結された結合ドメインを指すように意図されている。
「架橋剤(cross-linker)」および「架橋剤(cross-linking agent)」は、使用される化学的実体が2つまたはそれよりも多くの実体に共有結合的に接合されることを意味するために、互換的にかつその最も広い文脈で使用される。例えば、架橋剤は、2つ、3つ、4つもしくはそれよりも多くのペプチドをXTENに接合させるか、または1つのペプチドをXTENに接合させる。架橋剤が、反応物の架橋後に残存する共有結合した反応生成物を指すことができることを当業者は理解するだろう。架橋剤はまた、まだ反応していないが別の実体を反応することができる1つまたは複数の反応物を含むこともできる。
ポリペプチドの文脈では、「直鎖配列」または「配列」とは、この配列中で互いに隣接する残基がポリペプチドの一次構造で連続しているカルボキシル末端(N末端からC末端への)方向へのアミノでのポリペプチド中のアミノ酸の順序のことである。「部分配列」とは、ポリペプチドにおいて一方または両方の方向で追加の残基を含むことが公知である部分の直鎖配列のことである。
「異種」は、比較される実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、天然コード配列から除去されかつこの天然配列以外のコード配列に作動可能に連結されたグリシンリッチ配列は、異種グリシンリッチ配列である。用語「異種」は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される場合、このポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、比較される実体の残りのものとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は互換的に使用される。これらは任意の長さのヌクレオチドを指し、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかの単一の核酸および複数の核酸を包含する。ポリヌクレオチドは任意の3次元構造を有することができ、かつ公知または未知の任意の機能を実行することができる。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である:遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義された遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、およびプライマー。メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体等のポリヌクレオチドは改変ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への改変をポリマーの組立ての前後に付与することができる。ヌクレオチドの配列が非ヌクレオチド成分で中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより、重合後にさらに改変されてもよい。
用語「ポリヌクレオチドの相補体」は、完全な忠実度で参照配列とハイブリダイズすることができるように、参照配列と比較して相補的な塩基配列および逆配向を有するポリヌクレオチド分子を示す。
「組換え」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、このポリヌクレオチドが、クローニング、制限および/またはライゲーションステップを含み得る組換えステップと宿主細胞中で組換えタンパク質の発現をもたらす他の手順との様々な組合せの産物であることを意味する。
用語「遺伝子」および「遺伝子断片」は本明細書では互換的に使用される。これらは、転写および翻訳の後に特定のタンパク質をコードすることができる少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子または遺伝子断片は、ポリヌクレオチドが少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含む限りにおいてゲノムまたはcDNAであり得、このオープンリーディングフレームはコード領域全体またはそのセグメントを包含し得る。「融合遺伝子」とは、一緒に連結されている少なくとも2つの異種ポリヌクレオチドで構成されている遺伝子のことである。
本明細書で使用される場合、「コード領域」または「コード配列」とは、ポリヌクレオチドにおいてアミノ酸へと翻訳可能なコドンからなる部分のことである。「終止コドン」(TAG、TGAまたはTAA)は概してアミノ酸へと翻訳されないけれどもコード領域の一部であると考えられ得るが、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン等はコード領域の一部ではない。コード領域の境界は概して、5’末端での開始コドンであって、結果として得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする開始コドンと、3’末端での翻訳終止コドンであって、結果として得られるポリペプチドのカルボキシ末端をコードする翻訳終止コドンとにより決定される。本発明の2つまたはそれよりも多くのコード領域は、単一のポリヌクレオチド構築物中、例えば単一ベクター上にまたは別個のポリヌクレオチド構築物中、例えば別個の(異なる)ベクター上に存在することができる。したがって、単一ベクターは単一のコード領域のみを含むことができ、または2つもしくはそれよりも多くのコード領域を含むことができ、例えば、単一ベクターは、以下で説明する結合ドメインAと結合ドメインBとを別個にコードすることができる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明の結合ドメインをコードする核酸に融合しているまたは融合していない異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域は、分泌シグナルペプチドもしくは異種機能ドメイン等の特殊なエレメントまたはモチーフが含むがこれらに限定されない。
用語「下流」は、参照ヌクレオチド配列に対して3’に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、下流ヌクレオチド配列は、転写の開始点に後続する配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写の開始部位の下流に位置する。
用語「上流」は、参照ヌクレオチド配列に対して5’に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、上流ヌクレオチド配列は、コード領域または転写の開始点の5’側に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは転写の開始部位の上流に位置する。
「相同性」または「相同の」は、2つもしくはそれよりも多くのポリヌクレオチド配列の間のまたは2つもしくはそれよりも多くのポリペプチド配列の間の配列の類似性または互換性を指す。BestFit等のプログラムを使用して2つの異なるアミノ酸配列の間の配列の同一性、類似性または相同性を決定する場合、デフォルトの設定を使用してもよいし、適切なスコアリングマトリックス、例えばblosum45もしくはblosum80を選択して同一性、類似性または相同性のスコアを最適化してもよい。好ましくは、相同であるポリヌクレオチドは、本明細書で定義されているストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、この配列と比較して少なくとも70%の、好ましくは少なくとも80%の、より好ましくは少なくとも90%の、より好ましくは95%の、より好ましくは97%の、より好ましくは98%の、さらにより好ましくは99%の配列同一性を有する。相同であるポリペプチドは、比較可能な長さの配列全体にわたり最適にアラインさせた場合に、少なくとも70%であり、好ましくは少なくとも80%であり、さらにより好ましくは少なくとも90%であり、さらにより好ましくは少なくとも95〜99%同一である配列同一性を好ましくは有する。
「ライゲーション」は、ポリ核酸に適用される場合、2つの核酸断片または遺伝子の間にホスホジエステル結合を形成し、それらを一緒に連結するプロセスを指す。DNA断片または遺伝子を一緒にライゲートするために、DNAの末端は互いに適合しなければならない。場合によっては、これらの末端は、エンドヌクレアーゼ消化後に直接適合する。しかしながら、一般にエンドヌクレアーゼ消化後に生じる突出末端を平滑末端へと最初に変換して、これらの末端をライゲーションに適合させることが必要であり得る。
用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ポリヌクレオチドが、他の配列と比べて検出可能に大きな程度(例えばバックグラウンドの少なくとも2倍)にその標的配列にハイブリダイズする条件への言及を含む。一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、洗浄ステップが実行される温度および塩濃度を参照して部分的に表現される。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約1.5M未満のNaイオンであり、概してpH7.0〜8.3で約0.01〜1.0M Naイオン濃度(または他の塩)であり、かつ温度が、短いポリヌクレオチド(例えば10〜50個のヌクレオチド)の場合には少なくとも約30℃であり、長いポリヌクレオチド(例えば50個よりも多いヌクレオチド)の場合には少なくとも約60℃である条件であり、例えば、「ストリンジェントな条件」は、37℃にての50%ホルムアミド、1M NaCl、1%SDSでのハイブリダイゼーションと、60℃〜65℃にての0.1×SSC/1%SDSでのそれぞれ15分にわたる3回の洗浄とを含むことができる。あるいは、約65℃、60℃、55℃または42℃の温度を使用してもよい。SSC濃度は約0.1〜2×SSCで変動してもよく、SDSは約0.1%で存在する。そのような洗浄温度は概して、定義されたイオン強度およびpHで特定の配列に対する熱融点と比べて約5℃〜20℃低いように選択される。Tmとは、標的配列の50%が完全に一致したプローブにハイブリダイズする(定義されたイオン強度およびpHでの)温度のことである。核酸ハイブリダイゼーションのTmおよび条件を算出するための方程式は周知であり、Sambrook, J.ら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001年で見出すことができる。典型的には、ブロッキング試薬を使用して非特異的ハイブリダイゼーションをブロックする。そのようなブロッキング試薬は、例えば、剪断されたおよび変性したサケ精子DNAを約100〜200μg/ml含む。RNA:DNAハイブリダイゼーション等の特定の状況下では、約35〜50体積/体積%の濃度でのホルムアミド等の有機溶媒を使用してもよい。これらの洗浄条件についての有用な変形は当業者に容易に明らかであるだろう。
用語「パーセント同一性」、「配列同一性の百分率」および「%同一性」は、ポリヌクレオチド配列に適用される場合、標準化されたアルゴリズムを使用してアラインした少なくとも2つのポリヌクレオチド配列の間での一致する残基の百分率を指す。そのようなアルゴリズムは、標準化されかつ再現可能な方法で、比較される配列にギャップを挿入して2つの配列間のアラインメントを最適化することができ、したがって、これら2つの配列のより有意義な比較を達成する。パーセント同一性を、定義されたポリヌクレオチド配列全体の長さにわたり測定してもよいし、またはより短い長さにわたり測定してもよく、例えば、より大きな定義されたポリヌクレオチド配列から取り出した断片、例えば、少なくとも45個の、少なくとも60個の、少なくとも90個の、少なくとも120個の、少なくとも150個の、少なくとも210個のまたは少なくとも450個の連続した残基の断片の長さにわたり測定してもよい。そのような長さは単なる例示であり、本明細書では表、図面または配列表に示される配列により支持される任意の断片長を使用して、百分率同一性が測定され得る長さを説明し得ることが理解される。配列同一性の百分率を、比較ウィンドウ上の2つの最適にアラインした配列を比較すること、一致した位置(同一残基が両方のポリペプチド配列中に生じる)の数を決定すること、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数(すなわちウィンドウサイズ)で除算すること、およびこの結果に100を乗算して配列同一性の百分率を得ることにより算出する。異なる長さの配列を比較する場合、最短の配列が比較ウィンドウの長さを定義する。配列同一性を算出する場合には保存的置換は考慮されない。
本明細書で同定されているポリペプチド配列に関する「パーセント(%)配列同一性」を、配列をアラインさせ、最大パーセント配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入し、配列同一性の一部としてあらゆる保存的置換を考慮せず、それにより最適なアラインメントを得た後に、比較可能な長さまたはその一部の第2の参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一であるクエリー配列中のアミノ酸残基の百分率として定義する。パーセントアミノ酸配列同一性を決定することを目的とするアラインメントを、当技術分野の技術内である様々な方法で達成することができ、例えば、BLAST、BLAST−2、ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができ、このパラメーターは、比較される配列の全長にわたり最適なアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む。パーセント同一性を、定義されたポリペプチド配列全体の長さにわたり測定してもよいし、あるいはより短い長さにわたり測定してもよく、例えば、より大きな定義されたポリペプチド配列から取り出した断片、例えば、少なくとも15個の、少なくとも20個の、少なくとも30個の、少なくとも40個の、少なくとも50個の、少なくとも70個または少なくとも150個の連続した残基の断片の長さにわたり測定してもよい。そのような長さは単なる例示であり、本明細書では表、図面または配列表に示される配列により支持される任意の断片長を使用して、百分率同一性が測定され得る長さを説明し得ることが理解される。
ポリヌクレオチド配列の文脈で使用される「反復性」は、例えば所与の長さの同一ヌクレオチド配列の頻度等の配列における内部相同性の程度を指す。反復性を、例えば同一配列の頻度を分析することにより測定することができる。
用語「発現」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えばRNAまたはポリペプチドを産生するプロセスを指す。発現として、ポリヌクレオチドのメッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、小ヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)または任意の他のRNA産物への転写、およびmRNAのポリペプチドへの翻訳が含まれるがこれらに限定されない。発現により「遺伝子産物」が産生される。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写により産生されるメッセンジャーRNAまたは転写物から翻訳されるポリペプチドのどちらかであることができる。本明細書で説明されている遺伝子産物として、転写後修飾、例えばポリアデニル化もしくはスプライシングを有する核酸、または翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合もしくはタンパク分解性切断を有するポリペプチドがさらに含まれる。
「ベクター」または「発現ベクター」は互換的に使用され、好ましくは適切な宿主中で自己複製する核酸分子を指し、挿入されている核酸分子を宿主細胞中へとおよび/または宿主細胞間で移動させる。この用語には、DNAまたはRNAの細胞中への挿入のために主に機能するベクター、DNAまたはRNAの複製のために主に機能するベクターの複製、ならびにDNAまたはRNAの転写および/または翻訳のために機能する発現ベクターが含まれる。また、上記機能のうちの複数を提供するベクターも含まれる。「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞中に導入された場合に、転写されてポリペプチドへと翻訳され得るポリヌクレオチドのことである。「発現系」は通常、所望の発現産物を生じるように機能し得る発現ベクターで構成される適切な宿主細胞を含意する。
「血清分解耐性(Serum degradation resistance)」は、ポリペプチドに適用される場合、このポリペプチドの血液中でのまたはその成分中での分解に耐える能力を指し、この血液またはその成分は概して、血清中のまたは血漿中のプロテアーゼを含む。概して約37℃で概して数日間(例えば0.25日、0.5日、1日、2日、4日、8日、16日)にわたりタンパク質とヒト(または必要に応じてマウス、ラット、イヌ、サル)の血清または血漿とを組み合わせることにより、血清分解耐性を測定することができる。これらの時点での試料をウェスタンブロットアッセイで泳動させることができ、タンパク質を抗体で検出する。この抗体は、このタンパク質中のタグを目的とすることができる。このタンパク質のサイズが注入したタンパク質のサイズと同一であり、このタンパク質がウェスタン上で単一のバンドを示す場合、分解は生じていない。この例示的な方法では、ウェスタンブロットまたは等価の技術により判断される、タンパク質の50%が分解される時点が、このタンパク質の血清分解半減期または「血清半減期」である。
用語「t1/2」、「半減期」「終末半減期」、「排出半減期」および「循環半減期」は本明細書において互換的に使用され、本明細書で使用される場合、ln(2)/Kelとして算出される終末半減期を意味する。Kelは、時間曲線に対するログ濃度の終末相線形部分の線形回帰により算出された終末相排出速度定数である。半減期は概して、生体中に蓄積された投与物質の量の半分が、正常な生物学的プロセスにより代謝されるのにまたは排出されるのに必要な時間を指す。所与のポリペプチドのクリアランス曲線が時間の関数として構築される場合、この曲線は通常、迅速なα相とより長いβ相とを有する二相性である。ヒトにおけるヒト抗体の典型的なβ相半減期は21日である。半減期は、体液由来の時間が計測された試料を使用して測定され得るが、最も典型的には血漿試料中で測定される。
用語「分子量」は一般に、分子中の構成原子の原子量の合計を指す。分子中の構成原子の原子質量を加算することにより、分子量を理論的に決定することができる。ポリペプチドの文脈で適用される場合、アミノ酸組成物に基づいて、この組成物中の各タイプのアミノ酸の分子量を加算することにより、またはSDS電気泳動ゲル中の分子量標準との比較からの推定により、分子量を算出する。分子の算出された分子量は分子の「見かけの分子量」と異なり得、このことは一般に、1つまたは複数の分析技術により決定される分子の分子量を指す。「見かけの分子量係数」および「見かけの分子量」は関連する用語であり、ポリペプチドの文脈で使用される場合、これらの用語は、特定のアミノ酸配列またはポリペプチド配列により示される見かけの分子量の相対的な増加または減少の測度を指す。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を使用して、または「見かけのkD」単位で測定した場合に球状タンパク質標準と比較することによる類似の方法を使用して、見かけの分子量を決定することができる。見かけの分子量係数とは見かけの分子量と「分子量」との間の比のことであり、後者は、上記で説明されているアミノ酸組成物に基づいて足し算することにより、またはSDS電気泳動ゲル中の分子量標準との比較からの推定により、算出される。見かけの分子量および見かけの分子量係数の決定は米国特許第8,673,860号で説明されている。
用語「流体力学的半径」または「ストークス半径」とは、溶液を通って動く本体でありかつ溶液の粘度により抵抗を受けると仮定することにより測定される、溶液中の分子の有効半径(R、nm)のことである。本発明の実施形態では、XTENポリペプチドの流体力学的半径の測定値は、より直感的な測度である「見かけの分子量係数」と相関する。タンパク質の「流体力学的半径」は、水溶液中でのこのタンパク質の拡散速度と、このタンパク質の巨大分子のゲル中で移動する能力とに影響を及ぼす。タンパク質の流体力学的半径は、このタンパク質の分子量ならびに、形状およびコンパクトさを含む、このタンパク質の構造により決定される。流体力学的半径を決定する方法は当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第6,406,632号および同第7,294,513号で説明されているようにサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)の使用による。ほとんどのタンパク質は、タンパク質が最小の流体力学的半径を有し得る最もコンパクトな3次元構造である球状構造を有する。一部のタンパク質は、ランダムかつオープンな非構造化構造または「直鎖」構造を採用し、結果として、類似の分子量の典型的な球状タンパク質と比較してはるかに大きい流体力学的半径を有する。
「拡散係数」は、面外の単位濃度勾配当たりの表面を通るモル流束(molar flux)の大きさを意味する。希薄種輸送(dilute species transport)では、拡散に起因する流束は、溶質の溶媒との相互作用の単一の性質(拡散係数)にのみ依存するFickの第1の法則により与えられる。
「生理的条件」は、生きている宿主中の一連の条件、ならびに生きている対象のそれらの条件を模倣する、温度、塩濃度、pHを含む、in vitroでの条件を指す。in vitroアッセイで使用するための宿主の生理的に関連する条件が確立されている。一般に、生理的緩衝液は生理的濃度の塩を含み、約6.5〜約7.8、好ましくは約7.0〜約7.5の範囲の中性pHに調整される。様々な生理的緩衝液がSambrookら(2001年)で列挙されている。生理的に関連する温度は約25℃〜約38℃、好ましくは約35℃〜約37℃の範囲である。
用語「結合ドメイン」は、本明細書で使用される場合、標的抗原またはリガンドに対する特異的結合親和性を有する抗体または抗体断片のカテゴリーを含むことが具体的には意図されており、この標的抗原またはリガンドとして、細胞表面の受容体もしくは抗原もしくは糖タンパク質、オリゴヌクレオチド、酵素基質、抗原決定基、または標的組織もしくは標的細胞の表面中にもしくは表面上に存在し得る結合部位が挙げられる。
用語「抗体」は、本明細書では最も広い意味で使用され、かつ様々な抗体構造を包含し、この抗体構造として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体(例えば二特異的抗体)、および所望の抗原結合活性を示す限り抗体断片が含まれるがこれらに限定されない。完全長抗体は、例えばモノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体であることができる。
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、この集団を含む個々の抗体は同一であり、および/または同じエピトープに結合し、ただし、例えば天然に存在する変異を含むまたはモノクローナル抗体調製物の製造中に生じる想定されるバリアント抗体は除外され、そのようなバリアントは一般に小量で存在する。異なる決定基(エピトープ)を対象とする異なる抗体を概して含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。そのため、修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に同種の集団から得られる抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体を様々な技術により作製することができ、この技術として、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法が含まれるがこれらに限定されず、そのような方法およびモノクローナル抗体を作製する他の例示的な方法は当技術分野で公知であり、または本明細書で説明されている。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を含み、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Fv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、二特異性抗体、直鎖抗体(linear antibody)、単一ドメイン抗体、単一ドメインラクダ抗体(single domain camelid antibody)、一本鎖抗体分子(scFv)、および抗体断片から形成される多特異的抗体が含まれるがこれらに限定されない。
「scFv」または「一本鎖断片可変」は、短い柔軟なペプチドリンカーにより一緒に接合されている、重鎖(「VH」)および軽鎖(「VL」)の可変領域またはVH鎖もしくはVL鎖の2つのコピーを含む抗体断片のフォーマットを指すために本明細書において互換的に使用される。scFvは実際には抗体の断片ではないが免疫グロブリンの重鎖(VH)および軽鎖(VL)の可変領域の融合タンパク質であり、E.coli中において機能する形態で容易に発現され得る。
用語「抗原」、「標的抗原」および「免疫原」は、抗体、抗体断片または抗体断片をベースとする分子が結合するか特異性を有する構造または結合決定基を指すために本明細書において互換的に使用される。
用語「エピトープ」は、抗体、抗体断片または結合ドメインが結合する抗原分子上の特定の部位を指す。エピトープとは、抗体または抗体断片のリガンドのことである。
本明細書で使用される場合、「CD3」または「分化のクラスター3」はT細胞表面抗原CD3複合体を意味しており、個々の形態でまたは独立して組み合わされた形態で、全ての公知のCD3サブユニット、例えばCD3イプシロン、CD3デルタ、CD3ガンマ、CD3ゼータ、CD3アルファおよびCD3ベータを含む。CD3イプシロン、ガンマおよびデルタの細胞外ドメインは免疫グロブリン様ドメインを含み、したがって免疫グロブリンスーパーファミリの一部と見なされる。
用語「特異的結合」または「特異的に結合する」または「結合特異性」は、本明細書では、結合ドメインのその対応する標的に対する高度の結合親和性を指すために互換的に使用される。典型的には、本明細書で開示されているアッセイのうちの1つまたは複数により測定される特異的結合は、約10−6M未満の解離定数またはKを有するであろう。
「親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総和の強さを指す。別途示さない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体および抗原)間の1:1の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。一般に、ある分子XのそのパートナーYに対する親和性を解離定数(K)により表すことができる。本明細書で使用される場合、「より大きい結合親和性」は、より低いK値を意味しており、例えば、1×10−9Mは1×10−8Mとより結合親和性が大きい。
「阻害定数」または「Ki」は互換的に使用され、酵素−阻害剤複合体の解離定数または酵素に対する阻害剤の結合親和性の逆数を意味する。
「解離定数」または「K」は互換的に使用され、リガンド「L」とタンパク質「P」との間の親和性、すなわち、特定のタンパク質にリガンドがどのくらい堅く結合するかを意味する。式K=[L」「P」/「LP」を使用して算出することができ、この式中、「P」、「L」および「LP」はそれぞれ、タンパク質、リガンドおよび複合体のモル濃度を表す。用語「kon」は、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知である抗体/抗原複合体を形成する抗原に対する抗体の会合速度定数onを指すように意図されている。用語「koff」は、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知である抗体/抗原複合体からの抗体の解離速度定数offを指すように意図されている。
用語「アンタゴニスト」は、本明細書で使用される場合、本明細書で開示されている天然ポリペプチドの生物活性を部分的にまたは完全にブロックするか、阻害するか、または中和するあらゆる分子を含む。ポリペプチドのアンタゴニストを特定する方法は、天然ポリペプチドと候補アンタゴニスト分子とを接触させること、およびこの天然ポリペプチドと通常関連する1つまたは複数の生物活性の検出可能な変化を測定することを含むことができる。本発明の文脈では、アンタゴニストとして、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、または生物学的に活性なタンパク質の効果を減少させる任意の他の分子を含むことができる。
「標的細胞マーカー」は標的細胞により発現される分子を指し、細胞表面の受容体、抗原、糖タンパク質、オリゴヌクレオチド、酵素基質、抗原決定基、または抗体のリガンドとして機能し得る、標的組織または標的細胞の表面中にもしくは表面上に存在し得る結合部位が含まれるがこれらに限定されない。
「標的組織」は、これらに限定されないが、がんまたは炎症状態等の疾患状態の原因またはこの疾患状態の一部である組織を指す。罹患した標的組織の起源として、身体器官、腫瘍、がん細胞、もしくはマトリックスを形成するがん細胞の集団が含まれる、またはこの起源は、疾患状態の一因となるサイトカインもしくは因子を産生するがん細胞、骨、皮膚、細胞の集団と関連して見出される。
「合成培地」は、この培地の成分が公知であるように、培養物中での細胞の生存および/または増殖に必要な栄養要件およびホルモン要件を含む培地を指す。従来、合成培地は、増殖および/または生存に必要な栄養および増殖因子の付加により製剤化されている。典型的には、合成培地は、以下のカテゴリーのうちの1つまたは複数からの少なくとも1つの成分を提供する:a)全ての必須アミノ酸、および通常は20種のアミノ酸プラスシステインの基本セット;b)エネルギー源、通常はグルコース等の炭水化物の形態;c)ビタミンおよび/または低濃度で必要とされる他の有機化合物;d)遊離脂肪酸;ならびにe)微量元素、この場合微量元素は、非常に低濃度、通常はマイクロモル範囲で概して必要とされる無機化合物または天然に存在する元素として定義される)。合成培地は、以下のカテゴリーのうちのいずれかからの1つまたは複数の成分が任意選択で補充されてもよい:a)1つまたは複数の分裂促進剤;b)塩および緩衝剤、例えばカルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩;c)ヌクレオシドおよび塩基、例えばアデノシンおよびチミジン、ヒポキサンチン:ならびにd)タンパク質および組織加水分解物。
用語「アゴニスト」は最も広い意味で使用され、本明細書で開示されている天然ポリペプチドの生物活性を模倣するあらゆる分子を含む。適切なアゴニスト分子として、アゴニスト抗体または抗体断片、天然ポリペプチド、ペプチド、有機小分子等の断片またはアミノ酸配列バリアントが具合的に含まれる。天然ポリペプチドのアゴニストを同定する方法は、天然ポリペプチドと候補アゴニスト分子とを接触させること、およびこの天然ポリペプチドと通常関連する1つまたは複数の生物活性の検出可能な変化を測定することを含むことができる。
本明細書で使用される場合、「処置」または「処置する」または「緩和する」または「寛解させる」は本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、治療上の利益および/または予防上の利益を含むがこれらに限定されない有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療上の利益は、処置される基礎障害の根絶または寛解を意味する。また、治療上の利益は、生理的症状のうちの1つもしくは複数の根絶もしくは寛解または基礎障害に関連する1つもしくは複数の臨床パラメーターの改善により達成され、その結果、対象が依然として基礎障害に罹患しているかもしれないのにもかかわらず対象において改善が観測される。予防上の利益のために、本組成物を、特定の疾患を発症するリスクがある対象に投与してもよいし、または疾患の診断がなされていない場合であっても、この疾患の生理的症状のうちの1つもしくは複数を報告する対象に投与してもよい。
「治療効果」または「治療上の利益」は、本明細書で使用される場合には生理的効果を指し、生物学的に活性なタンパク質により有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の、本発明のポリペプチドの投与により生じるヒトまたは他の動物における疾患の緩和、寛解もしくは予防または基礎障害に関連する1つもしくは複数の臨床パラメーターの改善、または別の方法でヒトもしくは動物の身体的なもしくは精神的な健康を強化することが含まれるがこれらに限定されない。予防上の利益のために、本組成物を、特定の疾患、その疾患の再発、この疾患の状態もしくは症状を発症するリスクがある対象に投与してもよいし、または疾患の診断がなされていない場合であっても、この疾患の生理的症状のうちの1つもしくは複数を報告する対象に投与してもよい。
用語「治療有効量」および「治療有効用量」は、本明細書で使用される場合、1回の投与または反復投与で対象に投与される場合に、病態または状態の任意の症状、態様、測定されたパラメーターまたは特徴に対して任意の検出可能な有益な効果を有し得る、単独またはポリペプチド組成物の一部としてのいずれかでの、薬物または生物学的に活性なタンパク質の量を指す。そのような効果は必ずしも有益である必要はない。治療有効量の決定は、本明細書に記載されている詳細な開示に特に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
用語「治療上有効なかつ非毒性の用量」は、本明細書で使用される場合、対象において深刻な毒性効果を伴うことなくまたは本質的に伴うことなく、腫瘍またはがん細胞の枯渇、腫瘍消失、腫瘍縮小または疾患の安定化を引き起こすのに十分に高い、本明細書で定義される組成物の忍容される用量を指す。そのような治療上有効なかつ非毒性の用量は、当技術分野で説明されている用量漸増研究により決定され得、かつ深刻で有害な副作用を誘発する用量未満でなければならない。
用語「用量レジメン」は、本明細書で使用される場合、組成物の連続的に投与される複数回(すなわち、少なくとも2回またはそれよりも多い)の用量のスケジュールを指し、この用量は、病態または状態の任意の症状、態様、測定されたパラメーター、評価項目または特徴への持続した有益な効果をもたらすために治療有効量で投与される。
用語「がん」および「がん性」は、制御されていない細胞の成長/増殖により概して特徴付けられる、哺乳動物における生理的状態を指す、またはこの生理的状態を説明する。がんの例として、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん(gastric cancer)、食道がん、胃がん(stomach cancer)、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病を含む原発性血液悪性腫瘍、骨髄増殖性新生物障害、または骨髄異形成障害、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群が含まれるがこれらに限定されない。
「腫瘍特異的マーカー」は、本明細書で使用される場合、正常な細胞または組織と比較してがん細胞中でまたはがん細胞上でより高い数で見出され得るが必ずしもそうではない、がん細胞上でまたはがん細胞中で見出される抗原を指す。
「標的細胞」は、対象組成物の抗体または抗体断片のリガンドを有し、かつがん細胞、腫瘍細胞および炎症細胞を含む疾患もしくは病的状態と関連しているまたはこれらの疾患もしくは病的状態を引き起こす細胞を指す。標的細胞のリガンドは、本明細書では「標的細胞マーカー」または「標的細胞抗原」と称され、細胞表面の受容体または抗原、サイトカイン、MHCタンパク質、および外因的に呈示されるサイトゾルタンパク質またはペプチドが含まれるがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、「標的細胞」はエフェクター細胞を含まない。
I).一般技術
本発明の実践は、特に示していない限り、当業者の範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム学、および組換えDNAに関する従来の技術を使用する。全体が参照により本明細書に組み込まれている、Sambrook, J.ら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001年;「Current protocols in molecular biology」、F. M. Ausubelら編、1987年; the series 「Methods in Enzymology」、Academic Press, San Diego, CA.;「PCR 2: a practical approach」、M.J. MacPherson、B.D. HamesおよびG.R. Taylor編、Oxford University Press, 1995年;「Antibodies, a laboratory manual」、Harlow, E.およびLane, D.編、Cold Spring Harbor Laboratory、1988年;「Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics」、第11版、McGraw-Hill、2005年;およびFreshney, R.I.、「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique」、第4版、John Wiley & Sons、Somerset、NJ、2000年を参照されたい。
宿主細胞は、多様な培地において培養することができる。Ham’s F10(Sigma)、最小基本培地(MEM,Sigma)、RPMI−1640(Sigma)、およびダルベッコ改変イーグル培地(DMEM,Sigma)などの市販の培地は、真核細胞を培養するために適している。加えて、動物細胞は、血清を欠如するが、特定の細胞タイプの生存および/または増殖にとって必要なホルモン、増殖因子、または他の任意の因子を補給した合成培地で増殖させることができる。細胞の生存を支持する合成培地は、生存率、形態、代謝能、およびおそらく細胞分化能を維持するが、細胞の増殖を促進する合成培地は、細胞増殖または複製にとって必要な全ての化学物質を提供する。in vitroでの哺乳動物細胞の生存および増殖を支配する一般的なパラメーターは、当技術分野で十分に確立されている。異なる細胞培養系において制御されうる物理化学パラメーターは、例えば、pH、pO、温度、および浸透圧である。細胞の栄養必要条件は、通常、最適な環境を提供するように開発された標準的な培地処方で提供される。栄養は、いくつかのカテゴリーに分類することができる:アミノ酸およびその誘導体、炭水化物、糖、脂肪酸、複合脂質、核酸誘導体、およびビタミン。細胞の代謝を維持するための栄養を除き、ほとんどの細胞は、以下の群の少なくとも1つからの1つまたは複数のホルモンも必要とする:無血清培地中で増殖させるための、ステロイド、プロスタグランジン、増殖因子、下垂体ホルモン、およびペプチドホルモン(Sato, G. H.ら、「Growth of Cells in Hormonally Defined Media」、Cold Spring Harbor Press、N.Y.、1982年)。ホルモンに加えて、細胞は、in vitroでの生存および増殖のために、トランスフェリン(血漿鉄輸送タンパク質)、セルロプラスミン(銅輸送タンパク質)、および高密度リポタンパク質(脂質担体)などの輸送タンパク質を必要としうる。最適なホルモンまたは輸送タンパク質の組は、それぞれの細胞タイプに関して異なる。これらのホルモンまたは輸送タンパク質のほとんどは、外から添加されているか、またはまれな場合では、特定の因子を必要としない変異体細胞株が見出されている。当業者は、過度の実験を行うことなく、細胞培養を維持するために必要な他の要因を承知しているであろう。
原核宿主細胞を増殖させるための増殖培地には、栄養ブロス(液体栄養培地)またはLB培地(Luria Bertani)が含まれる。適した培地は、合成培地および非合成培地を含む。一般的に、培地は、細菌の増殖に必要なグルコースなどの炭素源、水、および塩を含む。培地はまた、アミノ酸源および窒素源、例えばビーフエキスもしくは酵母エキス(非合成培地)、または既知量のアミノ酸(合成培地)を含みうる。一部の実施形態では、増殖培地は、LBブロス、例えばLB MillerブロスまたはLB Lennoxブロスである。LBブロスは、ペプトン(カゼインの酵素消化産物)、酵母エキスおよび塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、抗生物質を含む選択培地を使用する。この培地では、抗生物質に対して耐性を有する所望の細胞のみが増殖する。
II).キメラポリペプチドアセンブリー組成物
本発明は、部分的には、限定されるものではないが、がん、自己免疫、または炎症障害を含む疾患の処置、寛解、または防止において有用なキメラポリペプチドアセンブリー組成物(「ProTIA」とも呼ばれる)に関する。
第1の態様では、本開示は、典型的には、第1の部分、第2の部分、および第3の部分を含むキメラポリペプチドアセンブリーであって、前記第1の部分が、(i)標的細胞マーカーに対する結合特異性を有する第1の結合ドメイン;および(ii)エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第2の結合ドメインを含み;前記第2の部分が、1つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼにより切断され得るペプチジル放出セグメント(RS)を含み;ならびに前記第3の部分が、バルキング部分を含み;前記バルキング部分が、前記第2の部分に対する前記哺乳動物プロテアーゼの作用によって前記第1の部分から放出され得る、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。理論によって束縛されるものではないが、本開示の例示的なポリペプチドアセンブリーは、1つまたは複数の以下の特色:1)アセンブリーがエフェクター細胞と標的細胞とに同時に結合する能力を有する少なくとも2つの結合ドメインを含むこと;2)アセンブリーがi)組成物が例えば、立体障害によって無傷である場合に結合ドメインを遮蔽し、標的抗原に対する結合親和性を低下させる、ii)対象に投与された場合に組成物の半減期の増強を提供する、および/またはiii)疾患組織(例えば、腫瘍)と比較して正常な組織および臓器における血管系からの組成物の溢出を減少させ、臨床試験において同時に使用または評価される二特異的細胞傷害性抗体治療薬と比較して安全性プロファイルの増大をもたらすバルキング部分を含むこと;ならびに3)アセンブリーが、腫瘍または炎症組織などの疾患組織の近くにある場合、1つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼによって切断され得ることによって、第1の部分の結合ドメインを放出して、結合ドメインがアセンブリーから切断されていない場合の状態と比較して高い親和性で、結合ドメインが標的細胞マーカーおよびエフェクター細胞抗原に結合することができること、を示す。対象のアセンブリーは、治療部分(例えば、標的細胞とエフェクター細胞を一緒に持って行くことができる第1の部分)が、プロテアーゼが正常組織と比較して優先的に発現される疾患組織の部位で放出される点で、「プロドラッグ」として有利に作用することができる。対象のアセンブリーは、BiTE(登録商標)を含む現行の二特異的抗体のいくつかの大きな欠点に対処する。対象のアセンブリーは、典型的には、従来の二特異的抗体に固有の副作用を緩和しながら、BiTE(登録商標)などの二特異的抗体によって行われる腫瘍縮小の公知の治療利益を保持する。ある実施形態では、本発明は、第1の部分が単鎖形式の2つの結合ドメインを含み、組成物が二特異性であるように、第1の結合ドメインが腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する結合特異性を有し、第2の結合ドメインが、エフェクター細胞上の受容体またはその中のリガンドなどのエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。
一部の実施形態では、対象組成物の設計は、プロテアーゼの作用が対象組成物の放出セグメント(RS)を切断し、組成物から結合ドメインおよびバルキング部分を放出するようなものである。組成物からの放出の際に、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する結合特異性を有する第1の結合ドメインおよびエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第2の結合ドメインは、インタクトな組成物よりも高い結合親和性で同時に結合し、エフェクター細胞を標的細胞と一緒に連結して、免疫学的シナプスを形成することができ、その結果、非常に低いエフェクター対標的(E:T)比で、標的細胞が、細胞間の免疫学的シナプス中にエフェクター細胞によって放出されるエフェクター分子によって作用し、限定されるものではないが、標的細胞のパーフォリン媒介性溶解、グランザイムB誘導性細胞死および/またはアポトーシスを含む損傷をもたらす。一部の実施形態では、対象の組成物の放出された第1の部分は、それが対象中のエフェクター細胞である細胞傷害性Tリンパ球と、腫瘍細胞上の予め選択された表面抗原とに同時に結合する能力を有するような結合特異性と共に設計され、それによって、標的腫瘍に対する放出されたサイトカインおよびエフェクター分子の免疫学的シナプスならびに選択的、指向的、および局在的効果をもたらし、その結果、腫瘍細胞は損傷されるか、または破壊され、対象に対する抗腫瘍活性および治療利益をもたらす。他の実施形態では、放出された第1の部分により結合されるエフェクター細胞は、形質細胞、B細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞(CIK細胞)、マスト細胞、樹状細胞、調節性T細胞(RegT細胞)、ヘルパーT細胞、骨髄性細胞、およびNK細胞からなる群から選択される細胞である。
別の態様では、本発明は、第1の部分、第2の部分、第3の部分、第4の部分、および第5の部分を含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物であって、第1の部分が、第1および第2の結合ドメイン(以下により完全に記載される)を含み、第2の部分が、放出セグメント(RS)を含み、第3の部分が、バルキング部分(以下により完全に記載される)を含み、第4の部分が、第2の部分のRSと同じであっても、異なっていてもよい放出セグメント(RS)を含み、第5の部分が、第3のバルキング部分と同じであっても、異なっていてもよいバルキング部分を含み、アセンブリープロテアーゼによって作用されるまで本質的にはプロドラッグ形態にある組成物を提供する。
組成物は、対象組成物が当技術分野で公知の二特異的抗体組成物と比較して改善された治療指数を有するように、一度、標的組織または疾患により不健康になった組織と関連して見出されるプロテアーゼによって切断されたら、より高い選択性、より長い半減期を有し、低毒性および少ない副作用をもたらす二特異的治療薬を提供する長く放置されてきた必要性に対処する。そのような組成物は、限定されるものではないが、がんを含むある特定の疾患の処置において有用である。
1.結合ドメイン
本発明の目的は、標的細胞マーカー(例えば、腫瘍特異的マーカー)に対する結合特異性を有する少なくとも第1の結合ドメインと、エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第2の結合ドメインとを含む第1の部分を含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供することである。一部の実施形態では、結合ドメインは、標的細胞マーカーと、エフェクター細胞抗原とに対する二特異的結合特異性を示す単鎖として連結される。
別の態様では、本発明の目的は、第1の部分の結合ドメインが切断配列を含む短いペプチド放出セグメントによってバルキング部分に連結されている構成で設計された切断性キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供することである。この例示的な構成では、結合ドメインは、組成物の意図される標的ではない非疾患組織または細胞との非特異的相互作用および結合を減少させるか、または排除するために近位のバルキング部分構成成分によって遮蔽され、それによって、望ましくない毒性または副作用を軽減する。さらに、遮蔽しているバルキング部分は、疾患組織で優先的に発現されるプロテアーゼ(以下により完全に記載される)によって放出セグメントが切断されると標的部位(例えば、疾患組織)で放出される。次いで、放出された第1の部分は、標的細胞マーカーおよびエフェクター細胞マーカーを含む、それぞれのリガンドにより自由に、またはより熱心に結合するその能力を取り戻す。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、対象のキメラポリペプチドアセンブリーは、第1の部分の二特異的結合ドメインのみを有する組成物のmmol/kgの同等用量の投与の際またはその後の副作用と比較して、投与頻度の減少、治療効果の持続期間の増大、および対象における診断的に関連する副作用の重症度の低下に関して治療薬として多様な利点を付与する。対象組成物の使用によって回避または軽減される副作用の非限定的な例としては、IL−2、TNF−アルファ、IFN−ガンマ、肝酵素の血漿レベル、ならびに/または敗血症、発熱性好中球減少症、神経毒性、痙攣、脳症、サイトカイン放出症候群、言語障害、平衡障害、発熱、頭痛、混乱、低血圧、好中球減少症、悪心、意識障害、および見当識障害の発生率の望ましくない増加が挙げられる。
本発明は、限定されるものではないが、エフェクター細胞およびがん、腫瘍、または他の悪性組織である疾患組織または細胞の抗原と関連するリガンドまたは受容体に結合することができるFv、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、線状抗体、単一ドメイン抗体、単一ドメインラクダ抗体、単鎖抗体分子(scFv)、およびダイアボディなどの、対象組成物における使用のための単鎖結合ドメインの使用を企図する。他の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第1の部分の第1および第2の結合ドメインは、アンチカリン、アドネクチン、フィノマー、アフィリン、アフィボディ、センチリン、DARPinなどの非抗体足場であってもよい。他の実施形態では、腫瘍細胞標的のための結合ドメインは、腫瘍細胞によって過剰発現されるタンパク質のペプチド断片を搭載したMHCに結合するように操作されたT細胞受容体の可変ドメインである。本発明の組成物は、広い治療濃度域を提供するために、標的組織プロテアーゼの位置ならびに標的化されることが意図されていない健康な組織中での同プロテアーゼの存在、ならびに健康な組織中での標的リガンドの存在であるが、不健康な標的組織中でのリガンドのより多い存在を考慮して設計される。「治療濃度域」とは、所与の治療組成物に関する最小有効用量と最大許容用量との最も大きい差異を指す。広い治療濃度域を達成するのを助けるために、組成物の第1の部分の結合ドメインは、バルキング部分(例えば、XTEN)の近くで遮蔽され、一方または両方のリガンドに対するインタクトな組成物の結合親和性が、哺乳動物プロテアーゼによって切断された組成物と比較して低下し、それによって、バルキング部分の遮蔽効果から第1の部分を放出する。
単鎖結合ドメインに関して、十分確立されたように、Fvは完全な抗原認識および結合部位を含有し、非共有的会合にある1つの重鎖(VH)と1つの軽鎖可変ドメイン(VL)とのダイマーからなる最小抗体断片である。各VHおよびVL鎖内には、VH−VLダイマーの表面上の抗原結合部位を規定するように相互作用する3つの相補性決定領域(CDR)がある;結合ドメインの6つのCDRは、抗体または単鎖結合ドメインに対する抗原結合特異性を付与する。一部の場合、それぞれが、各結合ドメイン内に3、4または5つのCHRを有するscFvが作出される。CDRに隣接するフレームワーク配列は、種間で天然の免疫グロブリンにおいて本質的に保存されている三次構造を有し、フレームワーク残基(FR)は、その適切な方向にCDRを保持するように働く。定常ドメインは結合機能にとって必要ではないが、VH−VL相互作用を安定化するのを助けることができる。本発明のポリペプチドの結合部位のドメインは、同じか、または異なる免疫グロブリンのいずれかのVH−VL、VH−VHまたはVL−VLドメインの対であってもよいが、一般的には、親抗体に由来するそれぞれのVHおよびVL鎖を使用して単鎖結合ドメインを作製することが好ましい。ポリペプチド鎖内のVHおよびVLドメインの順序は、本発明にとって限定的ではない;所与のドメインの順序を、通常は機能を喪失することなく逆転させることができるが、VHおよびVLドメインは、抗原結合部位が適切に折り畳むことができるように配置されることが理解される。かくして、対象組成物の二特異的scFv実施形態の単鎖結合ドメインは、順序(VL−VH)1−(VL−VH)2(ここで、「1」および「2」は、それぞれ、第1および第2の結合ドメインを表す)、または(VL−VH)1−(VH−VL)2、もしくは(VH−VL)1−(VL−VH)2、もしくは(VH−VL)1−(VH−VL)2にあってもよく、ここで、対になった結合ドメインは本明細書の以下に記載されるポリペプチドリンカーによって連結される。
したがって、本明細書に開示される例示的な二特異的単鎖抗体中での結合ドメインの配置は、第1の結合ドメインが第2の結合ドメインに対してC末端に位置するものであってもよい。V鎖の配置は、VH(標的細胞表面抗原)−VL(標的細胞表面抗原)−VL(エフェクター細胞抗原)−VH(エフェクター細胞抗原)、VH(標的細胞表面抗原)−VL(標的細胞表面抗原)−VH(エフェクター細胞抗原)−VL(エフェクター細胞抗原)、VL(標的細胞表面抗原)−VH(標的細胞表面抗原)−VL(エフェクター細胞抗原)−VH(エフェクター細胞抗原)またはVL(標的細胞表面抗原)−VH(標的細胞表面抗原)−VH(エフェクター細胞抗原)−VL(エフェクター細胞抗原)であってもよい。第2の結合ドメインが第1の結合ドメインに対してN末端に位置する配置については、以下の順序が可能である:VH(エフェクター細胞抗原)−VL(エフェクター細胞抗原)−VL(標的細胞表面抗原)−VH(標的細胞表面抗原)、VH(エフェクター細胞抗原)−VL(エフェクター細胞抗原)−VH(標的細胞表面抗原)−VL(標的細胞表面抗原)、VL(エフェクター細胞抗原)−VH(エフェクター細胞抗原)−VL(標的細胞表面抗原)−VH(標的細胞表面抗原)またはVL(エフェクター細胞抗原)−VH(エフェクター細胞抗原)−VH(標的細胞表面抗原)−VL(標的細胞表面抗原)。本明細書で使用される場合、「N末端に」または「C末端に」およびその文法的変形は、二特異的単鎖抗体の絶対的なNまたはC末端での配置ではなく、一次アミノ酸配列内の相対的位置を指す。したがって、非限定的な例として、「第2の結合ドメインに対してC末端に位置する」第1の結合ドメインは、第1の結合が二特異的単鎖抗体内の第2の結合ドメインのカルボキシル側に位置することを示し、さらなる配列、例えば、His−タグ、または放射性同位体などの別の化合物が二特異的単鎖抗体のC末端に位置する可能性を排除しない。
一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、第1の結合ドメインと第2の結合ドメインとを含み、前記結合ドメインのそれぞれがscFvであり、各scFvが1つのVLおよび1つのVHを含む、第1の部分を含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、第1の結合ドメインと第2の結合ドメインとを含み、前記結合ドメインがダイアボディの構成にあり、各ドメインが1つのVLドメインと1つのVHとを含む、第1の部分を含む。前述の実施形態では、第1のドメインは、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する結合特異性を有し、第2の結合ドメインは、エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する。前述の一実施形態では、エフェクター細胞抗原は、エフェクター細胞上で、またはその中で発現される。一実施形態では、エフェクター細胞抗原は、CD4+、CD8+、またはナチュラルキラー(NK)細胞などのT細胞上で発現される。別の実施形態では、エフェクター細胞抗原は、B細胞、マスト細胞、樹状細胞、または骨髄性細胞上で発現される。一実施形態では、エフェクター細胞抗原は、細胞傷害性T細胞の分化3抗原のクラスターであるCD3である。前述の一部の実施形態では、第1の結合ドメインは、腫瘍細胞と関連した腫瘍特異的マーカーに対する結合特異性を示す。一実施形態では、結合ドメインは、腫瘍細胞が限定されるものではないが、間質細胞腫瘍、線維芽細胞腫瘍、筋線維芽細胞腫瘍、グリア細胞腫瘍、上皮細胞腫瘍、脂肪細胞腫瘍、免疫細胞腫瘍、血管細胞腫瘍、および平滑筋細胞腫瘍由来の細胞を含んでもよい、腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する。一実施形態では、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原は、アルファ4インテグリン、Ang2、B7−H3、B7−H6、CEACAM5、cMET、CTLA4、FOLR1、EpCAM、CCR5、CD19、HER2、HER2 neu、HER3、HER4、HER1(EGFR)、PD−L1、PSMA、CEA、MUC1(ムチン)、MUC−2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16 βhCG、Lewis−Y、CD20、CD33、CD38、CD30、CD56(NCAM)、CD133、ガングリオシドGD3;9−O−アセチル−GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、GD2、炭酸脱水酵素IX、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue−1、形質細胞抗原1、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、CCR8、前立腺の6回膜貫通上皮抗原(STEAP)、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、Ly−6、デスモグレイン4、胎児アセチルコリン受容体(fnAChR)、CD25、がん抗原19−9(CA19−9)、がん抗原125(CA−125)、ミュラー管抑制物質受容体II型(MISIIR)、シアル化Tn抗原(s TN)、線維芽細胞活性化抗原(FAP)、エンドシアリン(CD248)、上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)、腫瘍関連抗原L6(TAL6)、SAS、CD63、TAG72、Thomsen−Friedenreich抗原(TF抗原)、インスリン様増殖因子I受容体(IGF−IR)、Cora抗原、CD7、CD22、CD70、CD79a、CD79b、G250、MT−MMP、F19抗原、CA19−9、CA−125、アルファ−フェトタンパク質(AFP)、VEGFR1、VEGFR2、DLK1、SP17、ROR1、およびEphA2からなる群から選択される。一実施形態では、CD70に対する結合親和性を示す第1の結合ドメインは、抗体断片ではなく、その天然リガンドであるCD27である。別の実施形態では、B7−H6に対する結合親和性を示す第1の結合ドメインは、抗体断片ではなく、その天然リガンドであるNkp30である。
本発明の対象組成物のscFv実施形態は、VLおよびVHドメインが、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原、およびエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体に由来する、第1の結合ドメインと第2の結合ドメインとを含むことが想定される。他の場合、第1および第2の結合ドメインは、それぞれ、腫瘍特異的マーカーおよびエフェクター細胞抗原などの標的細胞マーカーに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体に由来する6つのCDRをそれぞれ含む。他の実施形態では、対象組成物の第1の部分の第1および第2の結合ドメインは、各結合ドメイン内に3、4または5ではなくのCHRを有してもよい。他の実施形態では、本発明の実施形態は、CDR−H1領域、CDR−H2領域、CDR−H3領域、CDR−L1領域、CDR−L2領域、およびCDR−H3領域をそれぞれ含み、前記領域のそれぞれが、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原と、エフェクター細胞抗原とに結合することができるモノクローナル抗体に由来する、第1の結合ドメインと第2の結合ドメインとを含む。一実施形態では、本発明は、第2の結合ドメインが、ヒトCD3に結合することができるモノクローナル抗体に由来するVHおよびVL領域を含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、scFvの第2の結合ドメインが、VHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域が、表1から選択される抗CD3抗体の対になったVLおよびVH配列に対して少なくとも約90%、もしくは91%、もしくは92%、もしくは93%、もしくは94%、もしくは95%、もしくは96%、もしくは97%、もしくは98%、もしくは99%の同一性を示すか、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の態様では、本発明の第2のドメインの実施形態は、CDR−H1領域、CDR−H2領域、CDR−H3領域、CDR−L1領域、CDR−L2領域、およびCDR−H3領域を含み、前記領域のそれぞれは、表1に記載される抗体群から選択されるモノクローナル抗体に由来する。前述の実施形態では、VHおよび/またはVLドメインを、scFv、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、または単一ドメインラクダ抗体として構成させることができる。
他の実施形態では、対象組成物の第2のドメインは、表1に記載される抗体群から選択される抗CD3抗体に由来する。前述の一実施形態では、対象組成物の第2のドメインは、表1に記載される抗体群から選択される抗CD3抗体の対になったVLおよびVH領域配列を含む。別の実施形態では、本発明は、第2の結合ドメインがVHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域が、表1のhuUCHT1抗CD3抗体の対になったVLおよびVH配列に対して少なくとも約90%、もしくは91%、もしくは92%、もしくは93%、もしくは94%、もしくは95%、もしくは96%、もしくは97%、もしくは98%、もしくは99%の同一性を示す、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。前述の実施形態では、VHおよび/またはVLドメインを、scFv、ダイアボディの一部、単一ドメイン抗体、または単一ドメインラクダ抗体として構成させることができる。
他の実施形態では、組成物の第1のドメインのscFvは、表2に記載される抗体群から選択される抗腫瘍細胞抗体に由来する。別の実施形態では、本発明は、第1の結合ドメインがVHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域が、表2から選択される抗腫瘍細胞抗体の対になったVLおよびVH配列に対して少なくとも約90%、もしくは91%、もしくは92%、もしくは93%、もしくは94%、もしくは95%、もしくは96%、もしくは97%、もしくは98%、もしくは99%の同一性を示す、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。前述の一実施形態では、列挙される組成物の第1のドメインは、本明細書に開示される抗腫瘍細胞抗体の対になったVLおよびVH領域配列を含む。前述の実施形態では、VHおよび/またはVLドメインを、scFv、ダイアボディの一部、単一ドメイン抗体、または単一ドメインラクダ抗体として構成させることができる。
別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第1の部分は、表13の配列からなる群から選択される配列に対する少なくとも約90%、または91%、または92%、または93%、または94%、または95%、または96%、または97%、または98%、または99%の同一性を有する配列を有する。
別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、第1の結合ドメインと第2の結合ドメインとを含む第1の部分を含み、前記結合ドメインは、ダイアボディの構成にあり、前記結合ドメインのそれぞれは、1つのVLドメインと1つのVHドメインとを含む。一実施形態では、本発明のダイアボディ実施形態は、第1の結合ドメインと第2の結合ドメインとを含み、VLおよびVHドメインは、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原、およびエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体に由来する。別の実施形態では、本発明のダイアボディ実施形態は、第1の結合ドメインと第2の結合ドメインとを含み、それぞれ、CDR−H1領域、CDR−H2領域、CDR−H3領域、CDR−L1領域、CDR−L2領域、およびCDR−H3領域を含み、前記領域のそれぞれは、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞抗原、およびエフェクター細胞抗原に結合することができるモノクローナル抗体に由来する。本発明のダイアボディ実施形態は、第1の結合ドメインと第2の結合ドメインとを含み、VLおよびVHドメインは、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞抗原、およびエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体に由来することが想定される。別の態様では、本発明のダイアボディ実施形態は、第1の結合ドメインと第2の結合ドメインとを含み、それぞれ、CDR−H1領域、CDR−H2領域、CDR−H3領域、CDR−L1領域、CDR−L2領域、およびCDR−H3領域を含み、前記領域のそれぞれは、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞抗原、およびエフェクター細胞抗原に結合することができるモノクローナル抗体に由来する。一実施形態では、本発明は、ダイアボディの第2の結合ドメインが、ヒトCD3に結合することができるモノクローナル抗体に由来する対になったVHおよびVL領域を含む、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、ダイアボディの第2の結合ドメインがVHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域が、表1から選択される抗CD3抗体の対になったVLおよびVH配列に対して少なくとも約90%、もしくは91%、もしくは92%、もしくは93%、もしくは94%、もしくは95%、もしくは96%、もしくは97%、もしくは98%、もしくは99%の同一性を示す、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、ダイアボディの第2の結合ドメインがVHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域が、表1から選択されるhuUCHT1抗体のVLおよびVH配列に対して少なくとも約90%、もしくは91%、もしくは92%、もしくは93%、もしくは94%、もしくは95%、もしくは96%、もしくは97%、もしくは98%、もしくは99%の同一性を示す、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。他の実施形態では、組成物のダイアボディの第2のドメインは、本明細書に記載の抗CD3抗体に由来する。別の実施形態では、本発明は、ダイアボディの第1の結合ドメインがVHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域が、表2から選択される抗腫瘍細胞抗体のVLおよびVH配列に対して少なくとも約90%、もしくは91%、もしくは92%、もしくは93%、もしくは94%、もしくは95%、もしくは96%、もしくは97%、もしくは98%、もしくは99%の同一性を示す、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。他の実施形態では、組成物のダイアボディの第1のドメインは、本明細書に記載の抗腫瘍細胞抗体に由来する。
VLおよびVHおよびCDRドメインを対象組成物のために誘導することができる治療モノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。そのような治療抗体としては、限定されるものではないが、リツキシマブ、IDEC/Genentech/Roche(例えば、米国特許第5,736,137号を参照されたい)、多くのリンパ腫、白血病、および一部の自己免疫障害の処置において使用されるキメラ抗CD20抗体;慢性リンパ球性白血病のための使用について認可され、GlaxoSmithKlineにより開発されている、濾胞性非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、関節リウマチおよび再発寛解型多発性硬化症について開発中である抗CD20抗体であるオファツムマブ;非ホジキンまたはホジキンリンパ腫についてNovartisにより開発された抗CD40抗体であるルカツムマブ(HCD122)(例えば、米国特許第6,899,879号を参照されたい)、非ホジキンリンパ腫を処置するためのCD20を発現する細胞に結合する、Applied Molecular Evolutionにより開発された抗体であるAME−133、免疫性血小板減少性紫斑病を処置するためのCD20を発現する細胞に結合する、Immunomedics,Inc.により開発された抗体であるベルツズマブ(hA20)、低悪性度B細胞リンパ腫の処置のためのIntracelにより開発されたHumaLYM、および関節リウマチの処置のための抗CD20モノクローナル抗体である、Genentechにより開発されたオクレリズマブ(例えば、米国特許出願第20090155257号を参照されたい)、Genentechにより開発された、乳がんを処置するために認可されたヒト化抗Her2/neu抗体であるトラスツズマブ(例えば、米国特許第5,677,171号を参照されたい);前立腺がん、乳がん、および卵巣がんの処置における、Genentechにより開発された抗HER2ダイマー化阻害剤抗体であるペルツズマブ(例えば、米国特許第4,753,894号を参照されたい);ImcloneおよびBMSにより開発された、上皮増殖因子受容体(EGFR)を発現するKRAS野生型転移性結腸直腸がんおよび頭頸部がんを処置するために使用される抗EGFR抗体であるセツキシマブ(米国特許第4,943,533号;PCT WO96/40210を参照されたい);転移性結腸直腸がんの処置のためにAmgenにより現在上市されている、EGF受容体、EGFR、ErbB−1およびHER1としても公知である上皮増殖因子受容体に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体であるパニツムマブ(米国特許第6,235,883号を参照されたい);頭頸部の扁平上皮癌の処置のために上皮増殖因子受容体(EGFR)に対するものである、Genmabにより開発された完全ヒトIgG1モノクローナル抗体であるザルツムマブ(例えば、米国特許第7,247,301号を参照されたい);頭頸部の扁平上皮癌、鼻咽腔がんおよびグリオーマの処置における、Biocon,YM Biosciences、CubaおよびOncosciences、Europeにより開発されたEGFRに対するキメラ抗体であるニモツズマブ(例えば、米国特許第5,891,996号;米国特許第6,506,883号を参照されたい);慢性リンパ球性白血病(CLL)、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)およびT細胞リンパ腫の処置のためにBayer Schering Pharmaにより上市されたCD52に対するヒト化モノクローナル抗体であるアレムツズマブ;臓器移植患者における急性拒絶を軽減するために投与される免疫抑制生物製剤として使用される、Ortho Biotech/Johnson & Johnsonにより開発された抗CD3抗体であるムロモナブ−CD3;一部の形態のB細胞非ホジキンリンパ腫のための処置としてIDEC/Schering AGにより開発された抗CD20モノクローナル抗体であるイブリツモマブチウキセタン;急性骨髄性白血病を処置するために使用される、Celltech/Wyethにより開発された、放射性同位体が付着した細胞傷害性キレーターであるチウキセタンに連結された抗CD33(p67タンパク質)抗体であるゲムツズマブオゾガマイシン;Abgenixにより開発された抗CD147抗体であるABX−CBL;Abgenixにより開発された抗IL8抗体であるABX−IL8、Abgenixにより開発された抗MUC18抗体であるABX−MA1、Antisomaにより開発中である抗MUC1であるペンツモマブ(R1549、90Y−muHMFG1)、Antisomaにより開発された抗MUC1抗体であるTherex(R1550)、Antisomaにより開発されたAngioMab(AS1405)、Antisomaにより開発されたHuBC−1、Antisomaにより開発されたThioplatin(AS1407)、Biogenにより開発された抗アルファ−4−ベータ−1(VLA4)およびアルファ−4−ベータ−7抗体であるANTEGREN(ナタリズマブ)、Biogenにより開発された抗VLA−1インテグリン抗体であるVLA−1 mAb、Biogenにより開発された抗リンホトキシンベータ受容体(LTBR)抗体であるLTBR mAb、Cambridge Antibody Technologyにより開発された抗TGF−β2抗体であるCAT−152、Cambridge Antibody TechnologyおよびAbbottにより開発された抗IL−12抗体であるJ695、Cambridge Antibody TechnologyおよびGenzymeにより開発された抗TGFβ1抗体であるCAT−192、Cambridge Antibody Technologyにより開発された抗エオタキシン1抗体であるCAT−213、Cambridge Antibody TechnologyおよびHuman Genome Sciences Inc.により開発された抗Blys抗体であるLYMPHOSTAT−B、Cambridge Antibody TechnologyおよびHuman Genome Sciences,Inc.により開発された抗TRAIL−R1抗体であるTRAIL−R1mAb;Genentechにより開発された抗HER受容体ファミリー抗体であるHERCEPTIN;Genentechにより開発された抗組織因子抗体である抗組織因子(ATF);Genentechにより開発された抗IgE抗体であるXOLAIR(オマリズマブ)、GenentechおよびMillennium Pharmaceuticalsにより開発されたMLN−02抗体(以前はLDP−02);Genmabにより開発された抗CD4抗体であるHUMAX CD4(登録商標);Chugaiにより開発されたトシリズマ、および抗IL6R抗体;GenmabおよびAmgenにより開発された抗IL15抗体であるHUMAX−IL15、GenmabおよびMedarexにより開発されたHUMAX−Inflam;GenmabおよびMedarexおよびOxford GlycoSciencesにより開発された抗ヘパラナーゼI抗体であるHUMAX−Cancer;GenmabおよびAmgenにより開発されたHUMAX−Lymphoma、Genmabにより開発されたHUMAX−TAC;IDEC Pharmaceuticalsにより開発された抗CD40L抗体であるIDEC−131;IDEC Pharmaceuticalsにより開発された抗CD4抗体であるIDEC−151(クレノリキシマブ);IDEC Pharmaceuticalsにより開発された抗CD80抗体であるIDEC−114;IDEC Pharmaceuticalsにより開発された抗CD23であるIDEC−152;Imcloneにより開発された抗KDR抗体、Imcloneにより開発された抗flk−1抗体であるDC101;Imcloneにより開発された抗VEカドヘリン抗体;Immunomedicsにより開発された抗癌胎児性抗原(CEA)抗体であるCEA−CIDE(ラベツズマブ);メラノーマの処置におけるBristol−Myers Squibbにより開発された抗CTLA4抗体であるYervoy(イピリムマブ);Immunomedicsにより開発された抗CD22抗体であるLumphocide(登録商標)(エプラツズマブ)、Immunomedicsにより開発されたAFP−Cide;Immunomedicsにより開発されたMyelomaCide;Immunomedicsにより開発されたLkoCide;Immunomedicsにより開発されたProstaCide;Medarexにより開発された抗CTLA4抗体であるMDX−010;Medarexにより開発された抗CD30抗体であるMDX−060;Medarexにより開発されたMDX−070;Medarexにより開発されたMDX−018;MedarexおよびImmuno−Designed Moleculesにより開発された抗HER2抗体であるOSIDEM(IDM−1);MedarexおよびGenmabにより開発された抗CD4抗体であるHUMAX(登録商標)−CD4;MedarexおよびGenmabにより開発された抗IL15抗体であるHuMax−IL15;MorphoSysにより開発された抗細胞間接着分子−1(ICAM−1)(CD54)抗体MOR201;Pfizerにより開発された抗CTLA−4抗体であるトレメリムマブ;Protein Design Labsにより開発された抗CD3抗体であるビシリズマブ;Protein Design Labsにより開発された抗α5β1インテグリン;Protein Design Labsにより開発された抗IL−12;Xomaにより開発された抗Ep−CAM抗体であるING−1;ならびにXomaにより開発された抗ベータ2インテグリン抗体であるMLN01が挙げられる;本段落における上記の抗体の参照は全て、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。上記抗体の配列を、公共的に利用可能なデータベース、特許、または参考文献から得ることができる。さらに、抗CD3抗体に由来するモノクローナル抗体ならびにVHおよびVL配列の非限定的な例は表1に提示され、がん、腫瘍、または標的細胞マーカーに対するモノクローナル抗体ならびにVHおよびVL配列の非限定的な例は表2に提示される。
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
本発明の対象組成物の結合親和性および/または他の生物活性を測定する方法は、本明細書に開示されるもの、または当技術分野で一般に公知の方法であってもよい。例えば、Kとして示される、結合対(例えば、抗体と抗原)の結合親和性を、限定されるものではないが、放射性結合アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動および表面プラズモン共鳴(SPR、Biacore)などの非放射性結合アッセイ、ならびに酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、動的除外アッセイ(KinExA(登録商標))を含む様々な好適なアッセイを使用して、または実施例に記載のように決定することができる。例えば、バルキング部分が付着したキメラポリペプチドアセンブリーと比較した、バルキング部分を除去するように切断されたキメラポリペプチドアセンブリーの結合親和性の増加または減少を、バルキング部分を含む、および含まないその標的結合パートナーに対するキメラポリペプチドアセンブリーの結合親和性を測定することによって決定することができる。
対象キメラアセンブリーの半減期の測定を、様々な好適な方法によって実施することができる。例えば、物質を対象に投与し、生物試料(例えば、血液または血漿または腹水などの生物学的流体)を定期的にサンプリングして、試料中のその物質の濃度および/または量を経時的に決定することによって、物質の半減期を決定することができる。生物試料中の物質の濃度を、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、イムノブロット、ならびに高圧液体クロマトグラフィーおよび高速タンパク質液体クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー技術を含む様々な好適な方法を使用して決定することができる。一部の場合、物質を、放射性タグまたは蛍光タグなどの検出可能なタグで標識することができ、これを使用して、試料(例えば、血液試料または血漿試料)中の物質の濃度を決定することができる。次いで、結果から様々な薬物動態パラメーターを決定し、SoftMax Proソフトウェアなどのソフトウェアパッケージを使用して、または当技術分野で公知の手動での計算によって、これを行うことができる。
さらに、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の物理化学的特性を測定して、溶解度、構造および安定性の保持を確認することができる。結合解離定数(K、KonおよびKoff)、リガンド−受容体複合体の解離の半減期、ならびに遊離リガンドと比較した隔離されたリガンドの生物活性を阻害する結合ドメインの活性(IC50値)を含む、リガンドに対する結合ドメインの結合特性の決定を可能にする対象組成物のアッセイを行う。用語「IC50」とは、リガンドアゴニストの最大生物応答の半分を阻害するのに必要とされる濃度を指し、一般的には、競合結合アッセイによって決定される。用語「EC50」とは、活性物質の最大生物応答の半分を達成するのに必要とされる濃度を指し、一般的には、本明細書に記載される実施例の方法を含む、ELISAまたは細胞ベースアッセイによって決定される。
(i)抗CD3結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、T細胞に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、第2の部分の結合ドメインは、CD3の抗原に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。別の実施形態では、結合ドメインは、CD3イプシロンおよびCD3デルタに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CD3 neuに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。CD3に対するモノクローナル抗体のVLおよびVH配列の例示的な非限定的な例は、表1に提示される。一実施形態では、本発明は、表1に記載された抗CD3 VLおよびVH配列を含む、CD3に対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、表1に記載された抗CD3イプシロンVLおよびVH配列を含む、CD3イプシロンに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、第1の部分のscFvの第2の結合ドメインがVHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域が、表1のhuUCHT1抗CD3抗体の対になったVLおよびVH配列に対して少なくとも約90%、もしくは91%、もしくは92%、もしくは93%、もしくは94%、もしくは95%、もしくは96%、もしくは97%、もしくは98%、もしくは99%の同一性を示す、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含み、それぞれが表1に記載されたそれぞれの抗CD3 VLおよびVH配列に由来する、CD3に対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含み、CDR配列がRASQDIRNYLN、YTSRLES、QQGNTLPWT、GYSFTGYTMN、LINPYKGVST、およびSGYYGDSDWYFDVである、CD3に対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。
CD3複合体は、T細胞抗原受容体(TCR)と会合し、TCRの細胞表面発現およびペプチド:MHCリガンドがTCRに結合する時に始まるシグナル伝達カスケードにおいて機能する細胞表面分子の群である。典型的には、抗原がT細胞受容体に結合する時、CD3は細胞膜を介してT細胞の内部の細胞質にシグナルを送信する。これはT細胞の活性化を引き起こし、急速に分裂して、TCRが曝露された特定の抗原を攻撃するように感作された新しいT細胞を産生する。CD3複合体は、4つの他の膜に結合したポリペプチド(CD3−ガンマ、−デルタ、−ゼータ、および−ベータ)と共に、CD3イプシロン分子で構成される。ヒトにおいては、CD3−イプシロンは、第11染色体上のCD3E遺伝子によってコードされる。CD3鎖のそれぞれの細胞内ドメインは、T細胞受容体に会合すると細胞内シグナル伝達機構のための核形成点として働く免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)を含有する。
いくつかの治療戦略は、TCRシグナリング、特に、免疫抑制レジームにおいて臨床的に広く使用されている抗ヒトCD3モノクローナル抗体(mAb)を標的化することによって、T細胞免疫を調節する。CD3特異的マウスmAb OKT3は、ヒトにおける使用について初めてライセンス付与されたmAb(Sgro, C. Side-effects of a monoclonal antibody, muromonab CD3/orthoclone OKT3: bibliographic review、Toxicology 105巻:23〜29頁、1995年)であり、移植(Chatenoud、Clin. Transplant 7巻:422〜430頁(1993年);Chatenoud、Nat. Rev. Immunol. 3巻:123〜132頁(2003年);Kumar、Transplant. Proc. 30巻:1351〜1352頁(1998年))、1型糖尿病、および乾癬における免疫抑制剤として臨床的に広く使用されている。重要なことに、抗CD3 mAbは、部分的なT細胞シグナリングおよびクローンアネルギーを誘導することができる(Smith, JA、Nonmitogenic Anti-CD3 Monoclonal Antibodies Deliver a Partial T Cell Receptor Signal and Induce Clonal Anergy J. Exp. Med. 185巻:1413〜1422頁(1997年))。OKT3は、T細胞分裂促進因子ならびに強力なT細胞キラーとして文献に記載されている(Wong, JT. The mechanism of anti-CD3 monoclonal antibodies. Mediation of cytolysis by inter-T cell bridging. Transplantation 50巻:683〜689頁(1990年))。特に、Wongの研究は、CD3 T細胞と標的細胞とを架橋することにより、標的の殺傷を達成することができること、およびFcR媒介性ADCCも補体固定化も、二価抗CD3 MABが標的細胞を溶解するのに必要でないことを証明した。
OKT3は、時間依存的様式で分裂促進活性とT細胞殺傷活性との両方を示す;サイトカイン放出をもたらすT細胞の初期の活性化の後、さらなる投与時に、OKT3は後に全ての公知のT細胞機能を遮断する。OKT3が、同種移植組織拒絶の軽減またはさらには廃止のための治療レジメンにおける免疫抑制薬としてそのような広い用途がわかったことは、T細胞機能のこの後の遮断に起因するものである。CD3分子に特異的な他の抗体は、Tunnacliffe、Int. Immunol. 1巻(1989年)、546〜50頁に開示されており、WO2005/118635およびWO2007/033230は、抗ヒトモノクローナルCD3イプシロン抗体を記載し、米国特許第5,821,337号は、マウス抗CD3モノクローナルAb UCHT1(muxCD3、Shalabyら、J. Exp. Med. 175巻、217〜225頁(1992年))およびこの抗体のヒト化バリアント(hu UCHT1)のVLおよびVH配列を記載し、米国特許出願第20120034228号は、ヒトおよび非チンパンジー霊長類のCD3イプシロン鎖のエピトープに結合することができる結合ドメインを開示する。
(ii)抗EpCAM結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーEpCAMに対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、EpCAMに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。EpCAMに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。EpCAMモノクローナル抗体ならびにそのVLおよびVH配列の例示的な非限定的な例は、表2に提示される。一実施形態では、本発明は、表2に記載された抗EpCAM VLおよびVH配列を含む腫瘍特異的マーカーEpCAMに対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、第1の部分の第1の結合ドメインがVHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域が、表2の4D5MUCB抗EpCAM抗体の対になったVLおよびVH配列に対して少なくとも約90%、もしくは91%、もしくは92%、もしくは93%、もしくは94%、もしくは95%、もしくは96%、もしくは97%、もしくは98%、もしくは99%の同一性を示す、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含み、それぞれが表2に記載されたそれぞれのVLおよびVH配列に由来する、腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。
上皮細胞接着分子(EpCAM、17−1A抗原としても公知)は、ある特定の上皮中で、および多くのヒト癌腫上で発現される314アミノ酸から構成される40kDaの膜統合型糖タンパク質である(Balzar、The biology of the 17-1A antigen (Ep-CAM)、J. Mol. Med. 1999年、77巻:699〜712頁を参照されたい)。EpCAMは、結腸癌細胞を有するマウスの免疫化によって生成されたマウスモノクローナル抗体17−1A/エドレコロマブの使用によって最初に発見された(Goettlinger、Int J Cancer. 1986年;38巻、47〜53頁およびSimon、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990年;87頁、2755〜2759頁)。その上皮細胞起源のため、原発性、転移性、および播種性非小細胞肺癌細胞(Passlick, B.ら、The 17-1A antigen is expressed on primary, metastatic and disseminated non-small cell lung carcinoma cells. Int. J. Cancer 87巻(4号):548〜552頁、2000年)、胃(gastric)および胃食道接合部腺癌(Martin, I.G.、Expression of the 17-1A antigen in gastric and gastro-oesophageal junction adenocarcinomas: a potential immunotherapeutic target? J Clin Pathol 1999年;52巻:701〜704頁)、ならびに乳がんおよび結腸直腸がん(Packeisen Jら、Detection of surface antigen 17-1A in breast and colorectal cancer. Hybridoma. 1999年、18巻(1号):37〜40頁)の大部分を含む、多くの癌腫に由来する腫瘍細胞は、その表面上にEpCAMを発現し(正常で健康な細胞よりももっと)、したがって、免疫療法アプローチのための魅力的な標的である。実際、EpCAMの発現の増加は、上皮増殖の増加と相関する;乳がんにおいては、腫瘍細胞上でのEpCAMの過剰発現は、生存の予測因子である(Gastl、Lancet. 2000年、356巻、1981〜1982頁)。その上皮細胞起源のため、多くの癌腫に由来する腫瘍細胞は、その表面上にEpCAMを依然として発現し、腫瘍細胞上のEpCAMを標的とし、CD3結合領域も含有する二特異的ソリトマブ単鎖抗体組成物は、原発性子宮および卵巣CS細胞系に対する使用について提唱されている(Ferrari Fら、Solitomab, an EpCAM/CD3 bispecific antibody construct (BiTE(登録商標)), is highly active against primary uterine and ovarian carcinosarcoma cell lines in vitro. J Exp Clin Cancer Res. 2015年、34巻:123頁)。
EpCAMに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。EpCAMモノクローナルING−1、3622W94、アデカツムマブおよびエドレコロマブが、ヒト患者において試験されていると記載されている(Munz, M. Side-by-side analysis of five clinically tested anti-EpCAM monoclonal antibodies Cancer Cell International、10巻:44〜56頁、2010年)。EpCAMに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、2つのハイブリドーマOKT3および9.3のいずれかと融合することにより、2つの異なる二特異的抗体の構築物を含む、EpCAMに対する、およびCD3に対する二特異的抗体も記載されている(Moller, SA、Reisfeld, RA、Bispecific-monoclonal-antibody-directed lysis of ovarian carcinoma cells by activated human T lymphocytes. Cancer Immunol. Immunother. 33巻:210〜216頁、1991年)。EpCAMに対する二特異的抗体の他の例としては、BiUII、(抗CD3(ラット)x抗EpCAM(マウス))(Zeidler、J. Immunol.、1999年、163巻:1247〜1252頁)、scFv CD3/17−1A二特異的(Mack, M. A small bispecific antibody composition expressed as a functional single-chain molecule with high tumor cell cytotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci.、1995年、92巻:7021〜7025頁)、ならびに抗CD3および抗EpCAM特異性を有する部分ヒト化二特異的ダイアボディ(Helfrich, W. Construction and characterization of a bispecific diabody for retargeting T cells to human carcinomas. Int. J. Cancer、1998年、76巻:232〜239頁)が挙げられる。
一実施形態では、EpCAMに特異的な結合ドメインと、CD3に特異的な結合ドメインとを有する第1の部分を含む二特異的キメラポリペプチドアセンブリー組成物が本明細書で提供される。解決しようとする技術的課題は、腫瘍疾患の有効な処置およびまたは寛解のための良好に許容され、より好都合の医薬(低頻度の投薬)の特性を示す改善された組成物の生成のための手段および方法を提供することであった。前記技術的課題の解決は、本明細書に開示される実施形態によって達成され、特許請求の範囲に特徴付けられる。
したがって、一部の実施形態では、本発明は、少なくとも2つの結合ドメインを含み、前記ドメインのうちの一方がCD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合し、第2のドメインがEpCAM抗原に結合し、前記結合ドメインがEpCAMに特異的なVLおよびVHならびにヒトCD3抗原に特異的なVLおよびVHを含む、二特異的単鎖抗体組成物を含む第1の部分を含む、キメラポリペプチドアセンブリー組成物に関する。好ましくは、実施形態では、EpCAMに特異的な前記結合ドメインは、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。前述の一実施形態では、結合ドメインは、scFv形式にある。前述の別の実施形態では、結合ドメインは、単鎖ダイアボディ形式にある。
(iii)抗CCR5結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーCCR5に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、CCR5に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CCR5に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗CCR5 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCCR5に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(iv)抗CD19結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーCD19に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、CD19に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CD19に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。VLおよびVH配列の例示的な、非限定的な例は、表2に提示される。一実施形態では、本発明は、表2に記載される抗CD19 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCD19に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、scFvの第2の結合ドメインがVHおよびVL領域を含み、各VHおよびVL領域が、表2のMT103抗CD19抗体のVLおよびVH配列対に対して少なくとも約90%、もしくは91%、もしくは92%、もしくは93%、もしくは94%、もしくは95%、もしくは96%、もしくは97%、もしくは98%、もしくは99%の同一性を示すか、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表2に記載されるそれぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(v)抗HER−2結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーHER−2に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、HER−2に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。HER−2に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。VLおよびVH配列の例示的な、非限定な例は、表2に提示される。一実施形態では、本発明は、表2に記載される抗HER−2 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーHER−2に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表2に記載されるそれぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(vi)抗HER−3結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーHER−3に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、HER−3に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。HER−3に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。VLおよびVH配列の例示的な、非限定な例は、表2に提示される。一実施形態では、本発明は、表2に記載される抗HER−3 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーHER−3に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表2に記載されるそれぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(vii)抗HER−4結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーHER−4に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、HER−4に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。HER−4に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗HER−4 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーHER−4に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(viii)抗EGFR結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーEGFRに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、EGFRに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。EGFRに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。VLおよびVH配列の例示的な、非限定な例は、表2に提示される。一実施形態では、本発明は、表2に記載される抗EGFR VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーEGFRに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表2に記載されるそれぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(ix)抗PSMA結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーPSMAに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、PSMAに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。PSMAに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。VLおよびVH配列の例示的な、非限定な例は、表2に提示される。一実施形態では、本発明は、表2に記載される抗PSMA VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーPSMAに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表2に記載されるそれぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表2に記載されるそれぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(x)抗CEA結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーCEAに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、CEAに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CEAに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。VLおよびVH配列の例示的な、非限定な例は、表2に提示される。一実施形態では、本発明は、表2に記載される抗CEA VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCEAに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表2に記載されるそれぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xi)抗MUC1結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーMUC1に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、MUC1に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。MUC1に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。VLおよびVH配列の例示的な、非限定な例は、表2に提示される。一実施形態では、本発明は、表2に記載される抗MUC1 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーMUC1に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表2に記載されるそれぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xii)抗MUC2結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーMUC2に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、MUC2に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。MUC2に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗MUC2 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーMUC2に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xiii)抗MUC3結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーMUC3に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、MUC3に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。MUC3に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗MUC3 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーMUC3に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xiv)抗MUC4結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーMUC4に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、MUC4に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。MUC4に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗MUC4 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーMUC4に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xv)抗MUC5AC結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーMUC5ACに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、MUC5ACに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。MUC5ACに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗MUC5AC VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーMUC5ACに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xvi)抗MUC5B結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーMUC5Bに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、MUC5Bに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。MUC5Bに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗MUC5B VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーMUC5Bに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xvii)抗MUC7結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーMUC7に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、MUC7に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。MUC7に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗MUC7 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーMUC7に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xviii)抗βhCG結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーβhCGに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、βhCGに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。βhCGに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗βhCG VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーβhCGに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xix)抗Lewis−Y結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーLewis−Yに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、Lewis−Yに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。Lewis−Yに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、表2に記載される抗Lewis−Y VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーLewis−Yに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xx)抗CD20結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーCD20に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、CD20に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CD20に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。VLおよびVH配列の例示的な、非限定な例は、表2に提示される。一実施形態では、本発明は、表2に記載される抗CD20 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCD20に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表2に記載されるそれぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxi)抗CD33結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーCD33に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、CD33に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CD33に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。VLおよびVH配列の例示的な、非限定な例は、表2に提示される。一実施形態では、本発明は、表2に記載される抗CD33 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCD33に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表2に記載されるそれぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxii)抗CD30結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーCD30に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、CD30に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CD30に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。VLおよびVH配列の例示的な、非限定な例は、表2に提示される。一実施形態では、本発明は、表2に記載される抗CD30 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCD30に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表2に記載されるそれぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxiii)抗ガングリオシドGD3結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーガングリオシドGD3に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ガングリオシドGD3に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。ガングリオシドGD3に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ガングリオシドGD3 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーガングリオシドGD3に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxiv)抗9−O−アセチル−GD3結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー9−O−アセチル−GD3に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、9−O−アセチル−GD3に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。9−O−アセチル−GD3に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗9−O−アセチル−GD3 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカー9−O−アセチル−GD3に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxv)抗Globo H結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーGlobo Hに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、Globo Hに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。Globo Hに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗Globo H VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーGlobo Hに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxvi)抗フコシルGM1結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーフコシルGM1に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、フコシルGM1に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。フコシルGM1に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗フコシルGM1 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーフコシルGM1に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxvii)抗GD2結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーGD2に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、GD2に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。GD2に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗GD2 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーGD2に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxviii)抗炭酸脱水酵素IX結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー炭酸脱水酵素IXに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、炭酸脱水酵素IXに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。炭酸脱水酵素IXに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗炭酸脱水酵素IX VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカー炭酸脱水酵素IXに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxix)抗CD44v6結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーCD44v6に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、CD44v6に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CD44v6に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗CD44v6 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCD44v6に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxx)抗Sonic Hedgehog結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーSonic Hedgehogに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、Sonic Hedgehogに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。Sonic Hedgehogに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗Sonic Hedgehog VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーSonic Hedgehogに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxxi)抗Wue−1結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーWue−1に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、Wue−1に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。Wue−1に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗Wue−1 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーWue−1に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxxii)抗形質細胞抗原1結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー形質細胞抗原1に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、形質細胞抗原1に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。形質細胞抗原1に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗形質細胞抗原1 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカー形質細胞抗原1に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxxiii)抗メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーメラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカンVLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーメラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxxiv)抗CCR8結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーCCR8に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、CCR8に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CCR8に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗CCR8 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCCR8に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxxv)抗STEAP結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー前立腺の6回膜貫通上皮抗原(STEAP)に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、STEAPに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。STEAPに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗STEAP VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーSTEAPに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxxvi)抗メソテリン結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーメソテリンに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、メソテリンに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。メソテリンに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗メソテリンVLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーメソテリンに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxxvii)抗A33抗原結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーA33抗原に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、A33抗原に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。A33抗原に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗A33抗原VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーA33抗原に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxxviii)抗PSCA結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー前立腺幹細胞抗原(PSCA)に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、PSCAに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。PSCAに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗PSCA VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーPSCAに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xxxix)抗Ly−6結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーLy−6に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、LY−6に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。LY−6に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗LY−6 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーLY−6に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xl)抗SAS結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーSASに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、SASに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。SASに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗SAS VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーSASに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xli)抗デスモグレイン4結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーデスモグレイン4に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、デスモグレイン4に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。デスモグレイン4に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗デスモグレイン4 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーデスモグレイン4に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xlii)抗胎児アセチルコリン受容体結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー胎児アセチルコリン受容体に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、胎児アセチルコリン受容体に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。胎児アセチルコリン受容体に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗胎児アセチルコリン受容体VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカー胎児アセチルコリン受容体に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xliii)抗CD25結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーCD25に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、CD25に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CD25に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知であり、例えば、ダクリズマブがある。一実施形態では、本発明は、抗CD25 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCD25に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xliv)抗がん抗原19−9結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーがん抗原19−9(CA19−9)に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、CA19−9に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CA19−9に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗がん抗原19−9 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCA19−9に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xlv)抗CA−125結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーがん抗原125(CA−125)に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、CA−125に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CA−125に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗CA−125 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCA−125に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xlvi)抗MISIIR結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーミュラー管抑制物質II型受容体(MISIIR)に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、MISに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。MISIIRに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗MISIIR VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーMISIIRに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xlvii)抗シアル化Tn抗原結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーシアル化Tn抗原に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、シアル化Tn抗原に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。シアル化Tn抗原に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗シアル化Tn抗原VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーシアル化Tn抗原に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xlviii)抗FAP結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー線維芽細胞活性化抗原(FAP)に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、FAPに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。FAPに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗FAP VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーFAPに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(xlix)抗CD248結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーエンドシアリン(CD248)に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、CD248に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CD248に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗CD248 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCD248に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(l)抗EGFRvIII結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、EGFRvIIIに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。EGFRvIIIに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。VLおよびVH配列の例示的な、非限定な例は、表2に提示される。一実施形態では、本発明は、表2に記載される抗EGFRvIII VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーEGFRvIIIに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表2に記載されるそれぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(li)抗TAL6結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原L6(TAL6)に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、TAL6に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。TAL6に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗TAL6 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーTAL6に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(lii)抗SAS結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原SASに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、SASに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。SASに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗SAS VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーSASに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(liii)抗CD63結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原CD63に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、CD63に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CD63に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗CD63 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCD63に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(liv)抗TAG72結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原TAG72に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、TAG72に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。TAG72に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。VLおよびVH配列の例示的な、非限定な例は、表2に提示される。一実施形態では、本発明は、表2に記載される抗TAG72 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーTAG72に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表2に記載されるそれぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(lv)抗TF抗原結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原Thomsen−Friedenreich抗原(TF抗原)に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、TF抗原に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。TF抗原に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗TF抗原VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーTF抗原に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(lvi)抗IGF−IR結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原インスリン様増殖因子I受容体(IGF−IR)に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、IGF−IRに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。IGF−IRに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗IGF−IR VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーIGF−IRに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(lvii)抗Cora抗原結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原Cora抗原に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、Cora抗原に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。Cora抗原に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗Cora抗原VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCora抗原に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(lviii)抗CD7結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原CD7に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、CD7に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CD7に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗CD7 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCD7に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(lix)抗CD22結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原CD22に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、CD22に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CD22に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗CD22 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCD22に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(lx)抗CD79a結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原CD79aに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、CD79aに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CD79aに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗CD79a VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCD79aに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(lxi)抗CD79b結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原CD79bに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、CD79bに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。CD79bに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗CD79b VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーCD79bに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(lxii)抗G250結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原G250に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、G250に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。G250に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗G250 VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーG250に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(lxiii)抗MT−MMP結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原MT−MMPに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、MT−MMPに対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。MT−MMPに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗MT−MMP VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーMT−MMPに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(lxiv)抗F19抗原結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原F19抗原に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、F19抗原に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。F19抗原に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗F19抗原VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーF19抗原に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
(lxv)抗EphA2受容体結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原EphA2受容体に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインと、CD3抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第2の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、EphA2受容体に対するモノクローナル抗体に由来するVLおよびVHを含む。EphA2受容体に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗EphA2受容体VLおよびVH配列を含む、腫瘍特異的マーカーEphA2受容体に対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのVLおよびVH配列に由来する、CDR−L1領域、CDR−L2領域、CDR−L3領域、CDR−H1領域、CDR−H2領域、およびCDR−H3領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第1の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mより高いK値を有する。
キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、バリアントが記載される抗原に対する結合特異性を示す限り、前述の結合ドメインのいずれか1つまたはそれらの配列バリアントを含んでもよいことが具体的に企図される。一実施形態では、配列バリアントを、VLまたはVH配列中のアミノ酸の、異なるアミノ酸との置換によって作出することができる。欠失バリアントでは、本明細書に記載のVLまたはVH配列中の1つまたは複数のアミノ酸残基が除去される。したがって、欠失バリアントは、結合ドメインポリペプチド配列の全ての断片を含む。置換バリアントでは、VLまたはVH(またはCDR)ポリペプチドの1つまたは複数のアミノ酸残基が除去され、代替残基で置き換えられる。一態様では、置換は天然では保存的であり、この型の保存的置換は、当技術分野で周知である。さらに、本明細書に開示される第1および第2の結合ドメインを含む組成物を、本明細書に開示される方法のいずれかにおいて用いることができることが具体的に企図される。
2.放出セグメント
別の態様では、本発明は、1つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼにより切断され得る放出セグメント(RS)ペプチド配列を組み込むキメラポリペプチドアセンブリー組成物に関し、プロテアーゼ(または複数のプロテアーゼ)へのRSの曝露の際に、RSが切断され、二特異的結合ドメインが組成物から放出される。対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物の二特異的結合ドメインおよび遮蔽バルキング部分の放出の際に、バルキング部分の遮蔽効果の喪失のため、エフェクターT細胞およびがん、腫瘍または標的細胞に同時に結合するその完全な能力は、がん、腫瘍または標的細胞の損傷または細胞溶解をもたらす。
ある特定の実施形態では、本発明は、二官能性結合ドメイン部分、XTENなどの結合部分、および標的組織と関連する1つまたは複数のプロテアーゼのための基質である組み込まれたペプチドRSを含む単一の融合タンパク質を含み、RSがバルキング部分の末端に組換えによって連結され、RSが第1および第2の結合ドメインを含む第1の部分に組換えによって連結されており、かくして、RSが第1の部分と、XTENまたは他のバルキング部分との間に位置する、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。
実施形態では、本発明は、対象における疾患標的組織と関連するプロテアーゼのための基質である1つまたは複数のRSを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する;その非限定的な例は、がん、腫瘍、または増殖性障害もしくは炎症疾患に関与する組織もしくは臓器である。RSを含む組成物が標的化された組織関連プロテアーゼの近くにある場合に、結合ドメインが組成物から放出されるように、二特異的結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物における使用のために特に構成されたRSを提供することが、本発明の目的である。キメラポリペプチドアセンブリー組成物の設計は、結合ドメインを含む得られる放出構成成分が、得られる断片の分子質量の減少によるにしろ、または切断除去される隣接するバルキング部分(例えば、XTEN)による立体障害の低下によるにしろ、標的組織に溢出し、付着し、または浸透する増強された能力を有するようなものである。
ヒト癌腫における間質は、細胞外マトリックスと、白血球、内皮細胞、線維芽細胞、および筋線維芽細胞などの様々な型の非癌腫細胞とからなる。腫瘍と関連する間質は、新血管形成、ならびに並置された癌腫細胞の増殖および侵襲を刺激することにより、腫瘍増殖を活発に支援する。がん関連線維芽細胞(CAF)と呼ばれることが多い間質線維芽細胞は、細胞外マトリックス(ECM)の組成を動的に改変し、それによって、腫瘍細胞侵襲およびその後の転移性定着を容易にするその能力のため、腫瘍進行において特に重要な役割を有する。特に、プロテアーゼは、腫瘍血管形成、侵襲、細胞外マトリックスリモデリング、および転移を含む悪性進行に寄与する重要な構成成分であり、タンパク質分解的相互作用の広範囲の多方向的ネットワークの一部として機能することが当技術分野で公知である。悪性腫瘍の要件は、周囲の正常組織に浸透し、遠隔部位に播種するための血管系を獲得するその能力であるため、腫瘍は、複数の酵素クラスに由来する細胞外エンドプロテアーゼ、例えば、メタロプロテアーゼ(MMP)ならびにセリン、トレオニン、システインおよびアスパラギン酸プロテアーゼの発現の増加に大きく依拠する。プロテアーゼの役割は、組織侵襲および血管形成に限定されないが、これらの酵素は、増殖因子活性化、細胞接着、細胞生存および免疫監視においても主要な役割を有している。例えば、MMPは、増殖因子、細胞表面受容体、細胞接着分子、またはケモカインを切断するその能力の結果として、腫瘍細胞挙動に影響することができる。集合的に、腫瘍関連プロテアーゼの作用は、がんの表現型進化における重要な力を表す。
正常組織と腫瘍組織との間での多くのそのようなタンパク質分解酵素の示差的発現を証明するかなりの証拠が存在するため、この示差的発現を、腫瘍の近くにある対象組成物を活性化するための手段として利用することができることが具体的に企図される。これに関して、特に、セリンおよびメタロプロテアーゼは、細胞外腫瘍環境におけるその活性の上昇と、RSの短いペプチド配列を選択的かつ特異的に切断して、腫瘍での高レベルの活性な対象組成物の第1の部分および正常で健康な組織における低レベルのインタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物をもたらすその能力との両方のため、対象組成物の標的化された示差的薬物送達のための候補である。キメラポリペプチドアセンブリー組成物の選択的送達の結果として、これらの薬剤の必要とされる活性または用量の同時的低下と、肝臓、心臓および骨髄を含む正常組織に対する毒性の低下との両方が存在し、それによって、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の治療指数を大きく改善する。開示される組成物は、他の特性の中でも、切断されていない状態で、それらがそのそれぞれのリガンドに対する結合親和性の低下を示し、それらが正常で健康な組織での溢出の減少を示すが、切断時に良好に溢出し、腫瘍に浸透し、そのそれぞれのリガンドに対するより高い結合親和性を有することができる点で、このプロドラッグ概念の有益な特性を有することが具体的に企図される;これらは全て、治療指数の増強および対象組成物の副作用の軽減に寄与する。
一部の実施形態では、本発明は、組成物が標的化された組織関連プロテアーゼによって切断された場合、第1の部分の結合ドメインを含む断片を放出し、断片が、切断されない組成物と比較して、少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも4倍、または少なくとも5倍高い濃度で、腫瘍などの前記標的化された組織内に浸透することができる、RSを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む。他の実施形態では、本発明は、組成物が標的化された組織関連プロテアーゼによって切断された場合、第1の部分の結合ドメインを含む断片を放出し、第1の部分の結合ドメインを含む断片が、RSを含まない組成物と比較して、少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも4倍、または少なくとも5倍速い速度で、前記組織内に浸透することができる、RSを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む。一実施形態では、本発明は、組成物が標的化された組織関連プロテアーゼによって切断された場合、第1の部分の結合ドメインを含む断片を放出し、切断された第1の部分の断片が、プロテアーゼによって切断されないインタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物よりも少なくとも20%小さい、または少なくとも30%小さい、または少なくとも40%小さい、または少なくとも50%小さい、または少なくとも60%小さい、または少なくとも70%小さい、または少なくとも80%小さい得られる分子量を有する、RSを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む。別の実施形態では、本発明は、組成物が標的化された組織関連プロテアーゼによって切断された場合、第1の部分の結合ドメインを含む断片を放出し、切断された第1の部分の断片が、プロテアーゼによって切断されないインタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物よりも少なくとも20%小さい、または少なくとも30%小さい、または少なくとも40%小さい、または少なくとも50%小さい、または少なくとも60%小さい、または少なくとも70%小さい、または少なくとも80%小さい得られる流体力学半径を有する、RSを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む。対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物実施形態において、組織関連プロテアーゼによる切断は、インタクトな組成物と比較して断片のサイズの減少のため、腫瘍などの組織により効果的に浸透し、標的細胞の膜に対する損傷、アポトーシスの誘導、細胞溶解または死を含んでもよい、前記組織または細胞内の結合ドメインの組合せについて当技術分野で公知の薬理学的効果をもたらすことができる第1の部分の結合ドメインを含む断片をもたらすことが具体的に企図される。また、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のRSは、標的組織または細胞により産生されることが公知の特異的プロテアーゼを用いて特定の組織を標的化することが意図される組成物中での使用のために設計されることも具体的に企図される。一実施形態では、RSは、がんである組織と関連するプロテアーゼのための基質であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、RSは、がん性腫瘍と関連するプロテアーゼのための基質であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、RSは、白血病などのがんと関連するプロテアーゼのための基質であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、RSは、増殖性障害と関連するプロテアーゼのための基質であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のRSは、炎症疾患と関連するプロテアーゼのための基質であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、RSは、メタロプロテイナーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、およびセリンプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも1つのプロテアーゼのための基質である。別の実施形態では、RSは、メプリン、ネプリリシン(CD10)、PSMA、BMP−1、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ(ADAMs)、ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17(TACE)、ADAM19、ADAM28(MDC−L)、トロンボスポンジンモチーフを有するADAM(ADAMTS)、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、MMP−1(コラゲナーゼ1)、MMP−2(ゼラチナーゼA)、MMP−3(ストロメリシン1)、MMP−7(マトリリシン1)、MMP−8(コラゲナーゼ2)、MMP−9(ゼラチナーゼB)、MMP−10(ストロメリシン2)、MMP−11(ストロメリシン3)、MMP−12(マクロファージエラスターゼ)、MMP−13(コラゲナーゼ3)、MMP−14(MT1−MMP)、MMP−15(MT2−MMP)、MMP−19、MMP−23(CA−MMP)、MMP−24(MT5−MMP)、MMP−26(マトリリシン2)、MMP−27(CMMP)、レグマイン、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンK、カテプシンL、カテプシンS、カテプシンX、カテプシンD、カテプシンE、セクレターゼ、ウロキナーゼ(uPA)、組織型プラスミノゲン活性化因子(tPA)、プラスミン、トロンビン、前立腺特異的抗原(PSA、KLK3)、ヒト好中球エラスターゼ(HNE)、エラスターゼ、トリプターゼ、II型膜貫通セリンプロテアーゼ(TTSP)、DESC1、ヘプシン(HPN)、マトリプターゼ、マトリプターゼ−2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4(CAP2)、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、カリクレイン関連ペプチダーゼ(KLKファミリー)、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、およびKLK14からなる群から選択される1つまたは複数のプロテアーゼのための基質である。一部の実施形態では、RSは、ADAM17のための基質である。一部の実施形態では、RSは、BMP−1のための基質である。一部の実施形態では、RSは、カテプシンのための基質である。一部の実施形態では、RSは、システインプロテアーゼのための基質である。一部の実施形態では、RSは、HtrA1のための基質である。一部の実施形態では、RSは、レグマインのための基質である。一部の実施形態では、RSは、MT−SP1のための基質である。一部の実施形態では、RSは、メタロプロテイナーゼのための基質である。一部の実施形態では、RSは、好中球エラスターゼのための基質である。一部の実施形態では、RSは、トロンビンのための基質である。一部の実施形態では、RSは、II型膜貫通セリンプロテアーゼ(TTSP)のための基質である。一部の実施形態では、RSは、TMPRSS3のための基質である。一部の実施形態では、RSは、TMPRSS4のための基質である。一部の実施形態では、RSは、uPAのための基質である。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のRSは、MMP−2、MMP−9、uPA、およびマトリプターゼからなる群から選択される少なくとも2つのプロテアーゼのための基質である。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のRSは、MMP−2、MMP−9、uPA、およびマトリプターゼプロテアーゼのための基質である。
一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のRSは、限定されるものではないが、表3のプロテアーゼを含む標的組織により分泌される細胞外プロテアーゼのための基質であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のRSは、限定されるものではないが、表3のプロテアーゼを含む、細胞内に位置する細胞プロテアーゼのための基質であるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、本発明は、表4に記載される配列群から選択される少なくとも第1の切断配列を含む対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物における使用を意図されるRS組成物を提供する。一部の実施形態では、対象組成物のRS配列は、LSGRSDNHSPLGLAGS、SPLGLAGSLSGRSDNH、SPLGLSGRSDNH、LAGRSDNHSPLGLAGS、LSGRSDNHVPLSLKMG、SPLGLAGS、GPLALARG、LSGRSDNH、VPLSLTMG、VPLSLKMG、VPLSLSMG、EPLELVAG、EPLELRAG、EPAALMAG、EPASLMAG、RIGSLRTA、RIQFLRTA、EPFHLMAG、VPLSLFMG、EPLELPAG、およびEPLELAAGからなる配列群から選択される。必要に応じて、対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物のRS配列は、LSGRSDNHSPLGLAGSである。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のRSは、表4のBSRS1の配列を含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のRSは、表4のBSRS1の配列からなる。
別の実施形態では、切断コンジュゲート組成物のRSは、第1の切断配列と、前記第1の切断配列とは異なる第2の切断配列とを含み、各配列は、表4に記載される配列群から選択され、第1および第2の切断配列は、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンから選択される1〜6個のアミノ酸によって互いに連結されている。別の実施形態では、切断コンジュゲート組成物のRSは、第1の切断配列、前記第1の切断配列とは異なる第2の切断配列、および第3の切断配列を含み、各配列は、表4に記載される配列群から選択され、第1および第2および第3の切断配列は、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンから選択される1〜6個のアミノ酸によって互いに連結されている。他の実施形態では、本発明は、1、2または3個のRSを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。キメラポリペプチドアセンブリー組成物の複数のRSを繋いで、複数のプロテアーゼによって切断され得るユニバーサル配列を形成させることができることが具体的に意図される。そのような組成物は、複数のプロテアーゼを発現する疾患標的組織によってより容易に切断され、その結果、結合ドメインを担持する得られる断片は標的組織により容易に浸透し、結合ドメインの薬理学的効果を発揮することが企図される。
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
3.バルキング部分
別の態様では、本発明は、少なくとも第1のバルキング部分を含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物に関する。一部の実施形態では、本発明は、バルキング部分を含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。バルキング部分の非限定的な例としては、延長組換えポリペプチド(本明細書の以下に記載されるXTEN);アルブミン結合ドメイン;アルブミン;IgG結合ドメイン;プロリン、セリン、およびアラニンからなる少なくとも350個のアミノ酸残基のポリペプチド;脂肪酸;エラスチン様タンパク質(ELP)(ELPの個々のサブユニットまたは構成要素は、WO2016081884に記載されるような、ELPバイオポリマーを形成するように複数回繰り返されるヒトタンパク質エラスチンに見出される5個のアミノ酸モチーフに由来する)、Fcドメイン、ポリエチレングリコール(PEG)、PLGA、およびヒドロキシルエチルデンプンが挙げられる。別の実施形態では、バルキング部分は、XTEN;アルブミン結合ドメイン;アルブミン;IgG結合ドメイン;プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド;脂肪酸;Fcドメイン、ポリエチレングリコール(PEG)、PLGA、およびヒドロキシルエチルデンプンからなる群から選択される2つの異なるバルキング部分を含み、2つのバルキング部分は互いに、次いで、組成物の放出セグメントに連結されている。好ましい実施形態では、対象組成物のバルキング部分は、1つまたは複数の分子のXTENである。別の好ましい実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、表5に記載される配列群から選択される同等の長さのXTEN配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するバルキング部分配列を含む。実施形態では、XTENポリペプチドは、組成物の第2の部分の放出セグメント(RS)に組換えによって連結される。
理論によって束縛されるものではないが、バルキング部分の組込みは、ある特定の重要な特性を付与するために対象組成物の設計に組み込まれた;i)組成物が無傷である場合に、結合ドメインを遮蔽し、標的抗原およびエフェクター細胞抗原に対する結合親和性を低下させるバルキング部分を有するキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する、ii)対象に投与された場合に半減期の増強を提供するバルキング部分を有するキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する、iii)正常な組織および臓器での溢出を減少させるが、血管系中でより大きい孔径を有する疾患組織(例えば、腫瘍)での溢出度を許容し、ある特定の哺乳動物プロテアーゼの作用によって組成物から放出され得ることによって、組成物の結合ドメインが、疾患組織により容易に浸透し、エフェクター細胞および腫瘍細胞上の標的抗原に同時に結合することができるバルキング部分を有するキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。これらの必要性を満たすために、本発明は、バルキング部分が得られる組成物に対して質量および流体力学半径の増大を提供するキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましい実施形態では、バルキング部分は、それが質量および流体力学半径の増大を提供するだけでなく、その可撓性の非構造的特徴が組成物の第1の部分の結合ドメインを超える遮蔽効果を提供することによって、標的抗原および/またはエフェクター細胞抗原を発現しない、または低下したレベルのそれを発現する正常組織または正常組織の血管系中の抗原に結合する可能性を減少させ、scFvの溶解性および適切なフォールディングを増強する対象組成物の設計におけるある特定の利点を提供する、XTENポリペプチドである。
(i)XTEN
ある特定の実施形態では、本発明は、組成物に組換えによって連結された1つまたは複数の分子のXTENを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。
本明細書で使用される「XTEN」は、生理的条件下で低い程度の二次もしくは三次構造、を有する、または二次もしくは三次構造を有さない、ならびに以下の段落に記載されるさらなる特性を有する、天然には存在しない、実質的に非反復性の配列を有するポリペプチドである。XTENは、典型的には、少なくとも約100個〜少なくとも約1000個またはそれよりも多くのアミノ酸、より好ましくは、少なくとも約200個〜少なくとも約900個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも約400個〜約866個のアミノ酸を有し、その大部分または全部が小さい親水性のアミノ酸である。本明細書で使用される場合、XTENは、具体的には、全抗体または抗体断片(例えば、単鎖抗体およびFc断片)を含まない。XTENポリペプチドは、それらが様々な役割を果たし、例えば、本明細書に記載の対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第1の部分の二特異的結合ドメインを含む組成物に連結された場合、ある特定の望ましい特性を付与する点で、融合パートナーとしての有用性を有する。得られる組成物は、XTENに連結されていない対応する結合ドメインと比較して、薬物動態特性、物理化学特性、薬理学特性の増強、ならびに毒性学的特性および薬学的特性の改善などの、増強された特性を有し、当技術分野で公知である結合ドメインが使用されるある特定の状態の処置においてそれらを有用なものにする。
XTENの非構造的特徴および物理化学特性は、部分的には、4〜6つの型の親水性アミノ酸に偏って限定される全体的なアミノ酸組成、定量可能な、実質的に非反復的設計でのアミノ酸の連結から、ならびにXTENポリペプチドの得られる長さおよび/または構成から生じる。XTENに共通であるが、天然ポリペプチドには共通でない有利な特色では、本明細書に開示されるXTENの特性は、変化する長さの範囲内で、類似する特性を有し、それらが連結される組成物に対して増強された特性を付与し、その多くが実施例で実証される、表5の例示的な配列の多様性によって証明されるように、絶対的な一次アミノ酸配列に拘束されない。実際、本発明の組成物は、表5に具体的に列挙されるXTENに限定されないが、むしろ、実施形態は、それらが以下に記載されるXTENの特性を示すため、表5の配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有する配列を含むことが具体的に企図される。そのようなXTENは、タンパク質よりも非タンパク質性の、親水性ポリマー(ポリエチレングリコール、または「PEG」など)のような特性を有することが確立されている。本発明のXTENは、1つまたは複数の以下の有利な特性:規定の均一な長さ(所与の配列について)、立体構造的可撓性、二次構造の減少または欠如、高度のランダムコイル形成、高度の水溶解性、高度のプロテアーゼ抵抗性、低い免疫原性、哺乳動物受容体への低い結合、規定の程度の電荷、および流体力学(またはStokes)半径の増大;それらを融合パートナーとして特に有用にするある特定の親水性ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール)と類似する特性を示す。
対象融合タンパク質のXTEN構成成分は、ポリマーの伸長した長さにも拘わらず、生理学的条件下で変性したペプチド配列のように振る舞うように設計される。「変性した」は、ペプチド骨格の大きなコンフォメーション自由によって特徴付けられる溶液中のペプチドの状態を記載する。多くのペプチドおよびタンパク質は、高濃度の変性剤の存在下または高温では変性したコンフォメーションを採る。変性したコンフォメーションにあるペプチドは、例えば、特徴的な円偏光二色性(CD)スペクトルを有し、NMRにより決定された場合、長距離相互作用の欠如によって特徴付けられる。「変性したコンフォメーション」および「非構造的コンフォメーション」は、本明細書では同義的に使用される。一部の実施形態では、本発明は、生理的条件下で二次構造を実質的に欠く変性した配列と、生理的条件下で類似するXTEN配列を含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。本文脈で使用される「実質的に欠く」とは、XTEN配列のXTENアミノ酸残基の少なくとも約80%、または約90%、または約95%、または約97%、または少なくとも約99%が、アルゴリズムまたは分光測光アッセイを含む本明細書に記載の方法によって測定または決定された場合、二次構造に寄与しないことを意味する。
対象XTENの物理化学特性を決定および確認するための様々な十分に確立された方法およびアッセイが当技術分野で公知である。そのような特性としては、限定されるものではないが、二次または三次構造、溶解性、タンパク質凝集、安定性、絶対および見かけの分子量、純度および均一性、融解特性、夾雑物および水の含量が挙げられる。そのような特性を測定する方法としては、分析的遠心分離、EPR、HPLC−イオン交換、HPLC−サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、HPLC−逆相、光散乱、キャピラリー電気泳動、円偏光二色性、示差走査熱量測定、蛍光、HPLC−イオン交換、HPLC−サイズ排除、IR、NMR、Raman分光法、屈折率測定、およびUV/可視光分光法が挙げられる。特に、二次構造を、分光測光的に、例えば、「遠UV」スペクトル領域(190〜250nm)での円偏光二色性分光法によって測定することができる。アルファ−ヘリックスおよびベータ−シートなどの二次構造エレメントは、それぞれ、CDスペクトルの特徴的な形状および規模を生じさせ、これらの構造エレメントの欠如も同様である。米国特許出願公開第20030228309A1号に記載されたような、周知のChou−Fasmanアルゴリズム(Chou, P. Y.ら(1974年)Biochemistry、13巻:222〜45頁)およびGarnier−Osguthorpe−Robsonアルゴリズム(「Gorアルゴリズム)(Garnier J、Gibrat JF、Robson B.(1996年)、GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence. Methods Enzymol 266巻:540〜553頁)などの、ある特定のコンピュータープログラムまたはアルゴリズムにより、ポリペプチド配列に関する二次構造を予測することもできる。所与の配列について、アルゴリズムは、例えば、アルファ−ヘリックスもしくはベータ−シートを形成する配列の残基の合計および/もしくは百分率、またはランダムコイル形成(二次構造を欠く)をもたらすと予測される配列の残基の百分率として表される、いくつかの二次構造が存在するか、または二次構造が全く存在しないかを予測することができる。例えば、fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1のワールドワイドウェブ上のサイトを使用するChou−Fasmanアルゴリズムおよびnpsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.htmlのGorアルゴリズム(両方とも2012年9月5日にアクセスした)を使用して、ポリペプチド配列を分析することができる。コンフォメーション依存的に鎖長を用いてスケーリングする固有粘度測定(Tanford, C.、Kawahara, K.およびLapanje, S.(1966年)、J. Biol. Chem. 241巻、1921〜1923頁)を使用することによる、ならびにサイズ排除クロマトグラフィー(Squire, P. G.、Calculation of hydrodynamic parameters of random coil polymers from size exclusion chromatography and comparison with parameters by conventional methods. Journal of Chromatography、1981年、5巻、433〜442頁)によるなど、様々な方法により、ランダムコイルを決定することができる。さらなる方法は、Arnauら、Prot Expr and Purif(2006年)、48巻、1〜13頁に開示されている。
一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のXTEN配列は、Chou−Fasmanアルゴリズムによって決定された場合、0%〜約5%未満の範囲のアルファ−ヘリックスの百分率および0%〜約5%未満の範囲のベータ−シートの百分率を、GORアルゴリズムによって決定された場合、少なくとも約90%のランダムコイル形成を有する。別の実施形態では、開示される組成物のXTEN配列は、Chou−Fasmanアルゴリズムによって決定された場合、約2%未満のアルファ−ヘリックスの百分率および約2%未満のベータ−シートの百分率を、GORアルゴリズムにより決定された場合、少なくとも約90%のランダムコイル形成を有する。別の実施形態では、組成物のXTEN配列は、円偏光二色性により測定された場合、二次構造を実質的に欠いている。
絶対一次配列ではなく、XTENにおいて優位である特定の型のアミノ酸と共に、本発明の対象組成物において用いられるXTENの非反復的特徴は、XTENおよび得られるキメラポリペプチドアセンブリー組成物の1つまたは複数の増強された物理化学的および生物学的特性を付与することが確立されている。したがって、表5の配列は例示的であるが、表5の配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有する配列はXTENの増強された特性を示すため、それらは限定的であると意図されない。これらの増強された特性としては、XTENに連結されていない結合ドメインと比較して、宿主細胞中でのキメラポリペプチドアセンブリー組成物融合タンパク質の高度の発現、対象組成物のXTEN部分をコードする遺伝子のより高い遺伝的安定性、凝集する傾向が低い得られるキメラポリペプチドアセンブリー組成物上でのより高い溶解性を付与するXTEN、および得られるキメラポリペプチドアセンブリー組成物の増強された薬物動態が挙げられる。これらの増強された特性は、より効率的な製造、最終産物のより高い均一性、より低い製品コストを可能にする、および/または極端に高いタンパク質濃度の、一部の場合、100mg/mlを超える、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を含有する医薬調製物の製剤化、ならびに得られる組成物の、以下により完全に記載される、改善された安全性プロファイルおよび減少した投薬間隔を容易にする。
一部の実施形態では、本発明のキメラポリペプチドアセンブリー組成物中で使用されるXTEN配列は、AE144、AE144_1A、AE144_2A、AE144_2B、AE144_3A、AE144_3B、AE144_4A、AE144_4B、AE144_5A、AE144_6B、AE288_1、AE288_2、AE144A、AE144B、AE180A、AE216A、AE252A、AE288A、AE324A、AE360A、AE396A、AE432A、AE468A、AE504A、AE540A、AE576A、AE612A、AE648A、AE684A、AE720A、AE756A、AE792A、AE828A、AE869、AE144_R1、AE288_R1、AE432_R1、AE576_R1、AE864_R1、AE712、AE864_R2、AE912、AM923、AE948、AE1044、AE1140、AE1236、AE1332、AE1428、AE1524、AE1620、AE1716、AE1812、AE1908、AE2004A、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一である。US2010−0239554A1を参照されたい。特定の一実施形態では、XTENは、AE144、AE288、AE576、AE864、AE865、もしくはAE866、またはそれらの任意の組合せから選択される配列を含む。
一部の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物中のXTENのアミノ酸の100%未満がグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、グルタミン酸(E)およびプロリン(P)から選択される場合、または配列の100%未満が表5のXTEN配列からなる場合、XTENの残りのアミノ酸残基は、他の14種のL−アミノ酸のいずれかから選択されるが、XTEN配列が少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の親水性アミノ酸を含有するような親水性アミノ酸から優先的に選択される。キメラポリペプチドアセンブリー組成物中で利用されるXTEN中の疎水性アミノ酸の含量は、5%未満、または2%未満、または1%未満の疎水性アミノ酸含量であってもよい。XTENの構築においてあまり好ましくない疎水性残基としては、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、およびメチオニンが挙げられる。さらに、XTEN配列は、5%未満もしくは4%未満もしくは3%未満もしくは2%未満もしくは1%未満の下記アミノ酸を含有するか、または下記アミノ酸を全く含有しなくてもよい:メチオニン(例えば、酸化を回避するため)、またはアスパラギンおよびグルタミン(脱アミド化(desamidation)を回避するため)。
本発明のキメラポリペプチドアセンブリー実施形態において利用されるある特定のXTEN配列に関するアミノ酸配列を、表5に示す。
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
本発明は、表5のものに対して中間の長さのXTEN、ならびに12アミノ酸のモチーフがキメラポリペプチドアセンブリー中に組み込まれた表5のXTENのNまたはC末端に付加されたより長い長さのXTENを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を企図する。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、表6に記載されるモチーフ群から選択される1つまたは複数のモチーフの1つまたは複数のコピーが付加された表5のXTENを含む。
Figure 0006913670
本発明に従って使用することができるXTEN配列のさらなる例は、米国特許出願公開第2010/0239554A1号、第2010/0323956A1号、第2011/0046060A1号、第2011/0046061A1号、第2011/0077199A1号、もしくは第2011/0172146A1号、または国際特許出願公開第WO2010091122A1号、第WO2010144502A2号、第WO2010144508A1号、第WO2011028228A1号、第WO2011028229A1号、第WO2011028344A2号、第WO2014/011819A2号、もしくは第WO2015/023891号に開示されている。
4.T細胞結合組成物
別の態様では、本発明は、第1の部分、第2の部分、および第3の部分を含み、前記第1の部分が可撓性リンカーによって接合された抗CD3結合ドメインのVLおよびVH配列を含み、前記第2の部分が哺乳動物プロテアーゼによって切断され得る第1の放出セグメント(RS)を含み、第3の部分がXTEN配列を含む第1のバルキング部分を含み、前記バルキング部分および第1の部分が前記第2の部分上の前記哺乳動物プロテアーゼの作用によって組成物から放出され得る、モノマー融合タンパク質を提供する。前述の一部の実施形態では、対象組成物の第1の部分のVLおよびVH配列は、表1に記載される配列群から選択されるモノクローナル抗体VLおよびVHに由来する。必要に応じて、対象組成物のVLおよびVHは、表1のhuUCHT1モノクローナル抗体に由来する。図29に図示されるように、N末端からC末端の順序に関して、組成物を異なる順序で構成させることができることが具体的に企図される。一実施形態では、組成物は、結合ドメイン−RS−XTENのN末端からC末端に向かう方向で構成され、別の実施形態では、部分は、XTEN−RS−結合ドメインの順序で構成される。
T細胞結合組成物の一部の実施形態では、抗CD3結合ドメインは、表1のVHおよびVL配列を含み、第2の部分のRSは、表4に記載される配列からなる群から選択され、第3の部分のXTENは、表5に記載される配列からなる群から選択される。
他の実施形態では、本発明は、最適にアラインさせた場合、表7に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択される配列に対して少なくとも約90%の配列同一性、もしくは少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有する、またはそれと100%同一であるT細胞結合組成物融合タンパク質を提供する。一実施形態では、T細胞結合組成物は、表7のTCB−1のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、T細胞結合組成物は、表7のTCB−2のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、T細胞結合組成物は、表7のTCB−3のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、T細胞結合組成物は、表7のTCB−4のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、T細胞結合組成物は、表7のTCB−5のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、T細胞結合組成物は、表7のTCB−6のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、T細胞結合組成物は、表7のTCB7のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、T細胞結合組成物は、表7のTCB−8のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、T細胞結合組成物は、表7のTCB−9のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、T細胞結合組成物は、表7のTCB−10のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、T細胞結合組成物は、表7のTCB11のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、T細胞結合組成物は、表7のTCB−12のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、T細胞結合組成物は、表7のTCB−13のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、T細胞結合組成物は、表7のTCB−14のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、T細胞結合組成物は、表7のTCB−15のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、T細胞結合組成物は、表7のTCB−16のアミノ酸配列を有する。さらに他の実施形態では、本発明は、表7に記載される配列に対して少なくとも約90%の配列同一性、もしくは少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有する、またはそれと100%同一であるT細胞結合組成物融合タンパク質と、任意選択で、担体、安定剤および/または賦形剤の好適な製剤とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、表7のT細胞結合組成物融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。一実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチド配列が、最適にアラインさせた場合、表7に記載されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択される配列またはその相補体に対して少なくとも約90%の配列同一性、もしくは少なくとも約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有する、またはそれと100%同一である、T細胞結合融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
関連する態様では、本発明は、T細胞結合コントラクト組成物をコードするポリヌクレオチドを利用してキメラポリペプチドアセンブリー組成物を作製し、標的細胞抗原に対する親和性を有する結合ドメインをコードするポリヌクレオチド配列をライゲートする方法に関する。一実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を作製する方法であって、T細胞結合コントラクト組成物をコードする表7のポリヌクレオチドを利用した後、第2の結合ドメインをコードする遺伝子とリンカーとを組換えによって付加することを含み、第2の結合ドメインが腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する結合特異性を有し、得られる遺伝子を、プロモーターおよびリンカーの制御下で好適な発現ベクター中に導入し、次いで、得られる発現ベクターを使用して、好適なE.coli宿主細胞を形質転換し、次いで、キメラポリペプチドアセンブリー融合タンパク質の発現にとって好適な条件下で成長させ、次いで、本明細書に記載の、または当技術分野で公知の精製方法によって単離する、方法を提供する。以下の実施例1および2は、前述の方法の実施のための例示的な方法を提供する。前述の一部の実施形態では、第2の結合ドメインは、第2の結合ドメインのVHおよびVLが表2に記載される対になったモノクローナル抗体VHおよびVL配列の群から選択される、scFvである。前述実施形態は、抗CD3可変配列のコード配列および第2の結合ドメインのコード配列を、T細胞結合組成物のコード配列に組換えによって融合し、キメラポリペプチドアセンブリーの所望の融合タンパク質産物を発現させるために利用することができる複数の個々の遺伝子を作出する能力をもたらすことによって、本明細書に記載の様々な第2の結合ドメインをコードするポリヌクレオチドと共に容易に利用することができるT細胞結合組成物をコードする遺伝子のモジュラー性質を利用するものである。キメラポリペプチドアセンブリー組成物を調製するためのT細胞結合組成物をコードする遺伝子の使用は、本明細書に記載のキメラポリペプチドアセンブリー組成物をコードするポリヌクレオチドに限定されないが、得られる発現融合タンパク質の細胞傷害効果を受けやすい目的の任意の標的組織または細胞に対する親和性を有する結合ドメインをコードする遺伝子と併せて利用することができることが具体的に企図される。
別の態様では、表7のT細胞結合組成物は、抗CD3抗体調製物が、限定されるものではないが、臓器移植拒絶および急性移植片拒絶、クローン病、潰瘍性大腸炎ならびに1型糖尿病などの、臨床利益をもたらすことが証明されている対象におけるある特定の疾患または状態の処置における治療的免疫抑制剤として、ならびに免疫寛容を誘導するのに有用である。
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
5.可撓性リンカー
別の態様では、本発明は、対象組成物のそれぞれの結合ドメインを接合するための可撓性リンカーを提供する。一部の実施形態では、本発明は、各scFvのVLおよびVHが表8に記載される配列から選択される親水性アミノ酸の長いリンカーによって一緒に連結され、scFvが表9に記載される配列群から選択される親水性アミノ酸の短いリンカーによって一緒に連結されている、第1のscFvおよび第2のscFvを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、VLとVHを連結するための使用される長いリンカーは、表8のL7であり、2つのscFvを連結する分子間リンカーは、表9のS−1である。別の実施形態では、本発明は、フォールディング後に、第1のドメイン(VLまたはVH)が最後のドメイン(VHまたはVL)と対形成して、1つのscFvを形成し、中央の2つのドメインが対形成して、第1および第2のドメイン、ならびに第3および最後のドメインが、表9に記載される配列から選択される親水性アミノ酸の短いリンカーによって一緒に連結され、第2および第3の可変ドメインが表8から選択される長いリンカーによって連結される他のscFvを形成する単鎖ダイアボディを含む、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。当業者であれば理解できるように、短いリンカーと長いリンカーの選択は、隣接する可変ドメインの不正確な対形成を防止することによって、ダイアボディ構成の形成を容易にすることである。
Figure 0006913670
Figure 0006913670
6.キメラポリペプチドアセンブリー構成
本発明の目的は、ある特定の構造的、活性、薬学的および薬理学的特性を付与するためにプロドラッグ形態で設計および作出されるキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供することである。対象組成物の設計は、少なくとも3つの重要な特性;1)エフェクター細胞を標的細胞に同時に結合させる能力を有する二特異的結合ドメインを有する組成物を提供し、免疫学的シナプスの形成を得ること;2)i)結合ドメインを遮蔽し、組成物がインタクトなプロドラッグ形態にある場合に標的抗原に対する結合親和性を低下させる、ii)対象に投与した場合の半減期の増強を提供する、iii)疾患組織(例えば、腫瘍)と比較して、正常な組織および臓器における溢出を減少させる、ならびにiv)従来の二特異的細胞傷害抗体治療薬と比較して増大した安全性プロファイルを有するバルキング部分を含む組成物を提供すること;ならびに3)疾患組織の近くにある場合、1つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼによって切断された時に活性化され、それによって、二特異的結合ドメインを放出し、それが標的抗原に対するその完全な結合親和性能力を取り戻すことができること、によって駆動された。対象組成物の設計は、XTENおよびペプチド放出セグメント(RS)構成成分の特性を利用し、第1の部分の二特異的結合ドメインに対するその配置が前述の特性を達成する。
特定の理論に束縛されるものではないが、上記の二特異的結合ドメイン形式を使用して、放出された結合ドメインは、予備および/または同時刺激を必要とすることなく、細胞傷害性エフェクター細胞の動員によって標的細胞を殺傷することができると考えられる。さらに、エフェクター細胞の予備および/または同時刺激からの独立は、放出された結合ドメインによって媒介される例外的に高い細胞傷害性に実質的に寄与し得る。一部の実施形態では、放出された第2の結合ドメインは、それが、細胞傷害性エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞(CIK細胞))を、対象中の腫瘍細胞上の予め選択された表面抗原に標的化する能力を有するような結合特異性を有するように設計されるが、第1の結合ドメインは、腫瘍細胞と関連する腫瘍マーカー抗原に対する結合特異性を有するように設計され、それによって、免疫学的シナプスならびに標的腫瘍に対する放出されたサイトカインおよびエフェクター分子の選択的、指向的、および局在的効果をもたらし、その結果、腫瘍細胞は損傷または破壊され、対象に対する抗腫瘍活性および治療利益をもたらす。一実施形態では、放出された第2の結合ドメインは、エフェクター細胞の1つまたは複数の機能を調節することができるエフェクター細胞抗原に結合し、標的腫瘍細胞に対する細胞溶解効果をもたらすか、またはそれに寄与する。エフェクター細胞抗原を、エフェクター細胞または他の細胞によって発現させることができる。一部の実施形態では、エフェクター細胞抗原は、エフェクター細胞の細胞表面上に発現される。非限定的な例は、CD3、CD4、CD8、CD25、CD38、CD69、CD45RO、CD57、CD95、CD107、およびCD154である。他の実施形態では、エフェクター細胞抗原は、IL2、IL10、IL12、IFNγ、およびTNFαから選択されるTh1サイトカインである。かくして、当業者であれば、対象組成物の構成は、組成物が投与される対象中の健康な組織または健康な細胞と比較して、標的腫瘍組織またはがん細胞に活性形態の組成物を選択的に、または偏って送達すると共に、治療利益が得られることが意図されることを理解できる。前述から明らかなように、本発明は、所望の特性をもたらすための設計された構成における大きいファミリーのポリペプチドを提供する。
バルキング部分としてのXTENの場合、いくつかのユニークで有益な物理化学的および薬理学的特性が、XTEN化された対象組成物に対して付与される。対象組成物の増強された特性の非限定的な例としては、全体の溶解性および代謝安定性の増大、循環中のタンパク質分解に対する感受性の低下、免疫原性の低下、皮下または筋肉内投与された場合の吸収速度の低下、腎臓によるクリアランスの低下、毒性の低下、RSの切断によって放出されるまでの第1の部分の結合部分に対するXTENの遮蔽効果、および薬物動態特性の増強が挙げられる。特に、対象組成物は、それらがプロドラッグ形態の第1の部分の結合ドメインにわたる、遮蔽効果と、結合親和性に対するXTENの立体障害との組合せによって達成される、治療指数の増強および毒性または副作用の低下を有するが、RSが基質であるプロテアーゼを産生する標的組織(例えば、腫瘍)の近くに、またはその中に二特異的結合ドメインを放出することができる(RS組成物中へのペプチジル切断配列の含有によって達成される)ように設計されることが具体的に企図される。
一態様では、XTENは、組成物中の担体として使用され、本発明は、非反復的、非構造的ポリペプチドの長さの増大がXTENの非構造的性質を増強し、それに応じて、XTEN担体を含む組成物の物理化学的および薬物動態的特性を増強するという発見を利用するものである。一般に、組成物中に組み込まれる累積長さが約400残基より長いXTENは、より短い、例えば、約290残基より短い累積長さと比較して長い半減期をもたらす。特定の理論によって束縛されないが、XTENは、XTEN中の組み込まれた荷電残基の個々の電荷間の静電反発力のため、ならびに二次構造を付与する能力を欠く配列中の特定の親水性アミノ酸によって与えられる固有の可撓性のため、開いたコンフォメーションを採ることができる。その結果、対象のXTENは、部分的には、それらが得られる組成物に対して、XTENを含まない組成物と比較して、XTEN化された組成物に対して対応する増加した見かけの分子量を付与する特性である、高い流体力学半径を付与するため、有用である。XTEN化は、XTENに連結されていないタンパク質と比較して、増大した流体力学半径、増大した見かけの分子量、および増大した見かけの分子量係数を有する組成物をもたらす。例えば、XTENは、約3〜5nmの糸球体孔径(約70kDaの見かけの分子量に対応する)を超えて組成物の流体力学半径を効果的に拡大し(Caliceti. 2003年. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates. Adv Drug Deliv Rev 55巻:1261〜1277頁)、終末半減期の対応する増加と共に、循環タンパク質の腎クリアランスの減少をもたらすことができる。XTENにより与えられる流体力学半径の増大はまた、5〜12nmの平均孔径を有する正常で健康な組織のエリア中の循環系からのインタクトなプロドラッグ形態のキメラポリペプチドアセンブリー組成物の溢出を減少させるが、血管中のインタクトな組成物分子の退出を許容し、上皮細胞接合部がより多孔性である腫瘍に組成物分子が浸透する。正常血管よりも高い血管透過性などの、腫瘍血管系の様々な機能が損傷されることが長らく公知であった(Duran-Reynals, F. Studies on the localization of dyes and foreign proteins in normal and malignant tissue. Am J Cancer 35巻:98〜107頁(1939年);Babson AL、Winnick T. Protein transfer in tumor-bearing rats. Cancer Res 14巻:606〜611頁(1954年))。これらの損傷した機能は、正常組織中よりも腫瘍組織中で検出される高濃度の血漿タンパク質に寄与していた;現象は、それを、腫瘍血管の透過性の増大と、腫瘍中の機能的リンパ管のクリアランス速度の低下との組合せの結果生じ、その正味の結果として、大分子が腫瘍中に蓄積する、透過性および保持効果の増強として記載した、Maedaおよび共同研究者(Matsumura Y、Maeda H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res 46巻:6387〜6392頁(1986年);Maeda H、Matsumura Y. Tumoritropic and lymphotropic principles of macromolecular drugs. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 6巻:193〜210頁(1989年))によって解明された。非内因性大分子の通過に対する多くの非洞様毛細血管の毛細血管壁における孔径の生理学的上限は、5〜12nmの間の範囲であることが一般に公知である(Hemant Sarin. Physiologic upper limits of pore size of different blood capillary types and another perspective on the dual pore theory of microvascular permeability. J Angiogenes Res. 2010年;2巻:14頁)が、脳腫瘍と末梢腫瘍の両方の血液−腫瘍関門における内皮細胞間のギャップは、直径40nm〜200nmの範囲の間またはそれより大きいと報告されている(Sarin, H.ら、Physiologic upper limit of pore size in the blood-tumor barrier of malignant solid tumors. J. Translational Medicine 2009年、7巻:51頁)。本発明の目的において、対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、正常組織におけるインタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの溢出は減少するが、腫瘍血管系または他の炎症エリアの漏れやすい環境では、インタクトなアセンブリーが溢出し、腫瘍環境中のプロテアーゼによって活性化され、結合ドメインを含む第1の部分を、エフェクターおよび標的細胞に放出することができるような、バルキング部分、例えば、XTENの付加によってこの孔径差を利用するように設計された。キメラポリペプチドアセンブリーのRSの場合、設計は、キメラポリペプチドアセンブリーが1つまたは複数のプロテアーゼを産生する疾患組織、例えば、腫瘍の近くにある場合、腫瘍によって発現される1つまたは複数のプロテアーゼに対する感受性が高いRS配列が、プロテアーゼ(上記により完全に記載されている)によって切断され得る状況を利用する。プロテアーゼの作用は、組成物の放出セグメント(RS)を切断し、組成物から第1の部分の結合ドメインを放出し、放出された第1の部分の二特異的結合ドメインの分子量および流体力学半径を減少させる。理解されるように、組成物の分子量および流体力学半径の減少はまた、放出された第1の部分の二特異的結合ドメインが溶液中でより自由に移動し、組織および腫瘍中でより小さい孔空間を通って移動し、より大きい孔の腫瘍血管系から腫瘍中により容易に溢出し、エフェクター細胞および腫瘍細胞の付着および連結をもたらすことができる特性も付与する。そのような特性を、様々なアッセイによって測定することができる。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーのRSは、切断され、前記組成物から第1の部分の二特異的結合ドメインおよび第3の部分が放出されると、哺乳動物プロテアーゼによって切断され、前記第1の部分は、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物と比較して少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、または100倍大きい、リン酸緩衝生理食塩水中での拡散係数を有する。別の実施形態では、インタクトな組成物の見かけの分子量は、見かけの分子量がサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって決定される場合、哺乳動物プロテアーゼによるRSの切断によって放出された第1の部分よりも少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍大きい。別の実施形態では、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物の流体力学半径は、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって決定される場合、哺乳動物プロテアーゼによるRSの切断によって放出された第1の部分よりも少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも4倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍大きい。別の実施形態では、本発明は、第2の部分が切断されて、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第1の部分および前記第3の部分が放出されると、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって評価される場合、放出された第1の部分の流体力学半径が、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの流体力学半径の約30%未満、または約40%未満、または約50%未満である、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、第2の部分が切断されて、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第1の部分および前記第3の部分が放出されると、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される場合、放出された第1の部分の流体力学半径が、約5nm未満、または約4nm未満、または約3nm未満である、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される場合、約5nm未満、または約4nm未満、または約3nm未満の流体力学半径を有する放出された第1の部分が、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーと比較して、腫瘍組織に浸透するより高い能力を有する、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される場合、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの流体力学半径が、約8nmより大きい、または約9nmより大きい、または約10nmより大きく、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーが、腫瘍組織の血管系と比較して対象の正常組織の血管系から溢出する能力がより低い、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。
対象組成物は、その設計およびXTENへの連結により、XTENに連結されていない対応する第1の部分の結合ドメインと比較して、対象に投与した場合に増強された薬物動態特性を有することが企図される。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、組成物に連結されていない対応する第1の部分と比較して、対象への投与の際、またはその後に、少なくとも約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、または100倍増加した対象中での終末半減期を示す。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、組成物に連結されていない対応する第1の部分と比較して、対象への投与の際、またはその後に、少なくとも25%、50%、100%、200%、または少なくとも300%またはそれより多い、増加した曲線下面積(AUC)を示す。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、組成物に連結されていない対応する第1の部分と比較して、対象への投与の際、またはその後に、少なくとも25%低い、または50%、または100%、または200%、または少なくとも300%低い分布容量を示す。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、対象への投与後、少なくとも約20時間、または少なくとも約30時間、または少なくとも約32時間、または少なくとも約48時間、または少なくとも約72時間、または少なくとも約96時間、または少なくとも約120時間、または少なくとも約144時間、または少なくとも約7日間、または少なくとも約10日間、または少なくとも約14日間の終末半減期を示す。別の態様では、限定されるものではないが、腫瘍などの疾患組織と関連するプロテアーゼによって優先的に活性化される対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物の設計のため、対象の循環中での放出された第1の部分の濃度は低く、それによって、保護的なバルキング部分および放出セグメントを有さない二特異的組成物と比較して改善された安全性プロファイルおよびより低い副作用の発生率に寄与することが具体的に企図される。一実施形態では、本発明は、対象へのキメラポリペプチド組成物の単回投与の際またはその後に放出された第1の部分の血漿Cmax濃度が約0.01ng/ml、または約0.03ng/ml、または約0.1ng/ml、または約0.3ng/ml、または約1ng/ml、または約10ng/ml、または約100ng/mlを超えない、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、対象へのキメラポリペプチド組成物の単回投与の際またはその後に、放出された第1の部分の血漿Cmax濃度が、同じ対象中でのインタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの血漿レベルの1/3以下、または1/10以下、または1/30以下、または1/100以下である、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。段落の前述の実施形態では、対象は、マウス、またはラット、またはイヌ、またはサル、またはヒトである。
別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、Cmaxが少なくとも25%、50%、100%、200%、または少なくとも300%低く、次いで、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の有害効果の軽減をもたらし、集合的に、対象に投与されたコンジュゲーション組成物が長期間にわたって治療活性を提供するか、または保持するように、組成物に連結されていない対応する第1の部分と比較して、対象における皮下または筋肉内注射の後により遅い吸収を示す。
別の態様では、対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物のXTENは、組成物の第1の部分の結合ドメインに関する立体障害と遮蔽効果の両方を提供し、その結果、インタクトなプロドラッグ形態のエフェクター細胞結合構成成分と標的細胞結合構成成分の両方が、そのそれぞれのリガンドと相互作用する能力が低下するが、プロテアーゼによってRSが切断され、XTENが放出され、プロドラッグ形態のアセンブリーが活性化形態に変換されると、放出された二特異的結合構成成分の最適な結合能力が回復することが具体的に企図される。かくして、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物のXTENは、プロテアーゼによるRSの切断によって放出された結合ドメインと比較して、腫瘍特異的マーカーもしくは標的細胞抗原の抗原(例えば、EpCAMまたはHER2)および/またはエフェクター細胞抗原(例えば、CD3 T細胞抗原)への結合ドメインの結合を阻害する。逆に、プロテアーゼの作用によって組成物から放出された第1の部分の結合ドメインは、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物の結合ドメインと比較してそのそれぞれのリガンドに対する高い結合親和性を有する。本発明の目的は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物から放出された第1の部分の各結合ドメインの結合親和性は、本明細書に記載のin vitro結合アッセイにおいてアッセイされた場合など、インタクトな組成物の結合ドメインと比較してそれぞれの標的リガンドについてより高いということである。一実施形態では、プロテアーゼによるRSの切断によって組成物から放出されたエフェクター細胞結合ドメインの結合親和性は、前記細胞の細胞表面上に前記エフェクター細胞抗原を有するエフェクター細胞を用いるin vitro細胞アッセイまたはエフェクター細胞抗原が結合したELISAにおいて測定された場合、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物のエフェクター細胞結合ドメインと比較して、エフェクター細胞抗原について少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも4倍、または少なくとも5倍、または少なくとも6倍、または少なくとも7倍、または少なくとも8倍、または少なくとも9倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍高い。一実施形態では、エフェクター細胞抗原は、CD3である。他の実施形態では、プロテアーゼによるRSの切断によって組成物から放出された腫瘍細胞結合ドメインの結合親和性は、前記細胞の細胞表面上に前記抗原を有する腫瘍細胞を用いるin vitro細胞アッセイまたはエフェクター細胞抗原が結合したELISAにおいて測定された場合、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物の腫瘍細胞結合ドメインと比較して、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞抗原について少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも4倍、または少なくとも5倍、または少なくとも6倍、または少なくとも7倍、または少なくとも8倍、または少なくとも9倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍高い。前述の一実施形態では、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原は、アルファ4インテグリン、Ang2、B7−H3、B7−H6、CEACAM5、cMET、CTLA4、FOLR1、EpCAM、CCR5、CD19、HER2、HER2 neu、HER3、HER4、HER1(EGFR)、PD−L1、PSMA、CEA、MUC1(ムチン)、MUC−2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16 βhCG、Lewis−Y、CD20、CD33、CD38、CD30、CD56(NCAM)、CD133、ガングリオシドGD3;9−O−アセチル−GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、GD2、炭酸脱水酵素IX、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue−1、形質細胞抗原1、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、CCR8、前立腺の6回膜貫通上皮抗原(STEAP)、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、Ly−6、デスモグレイン4、胎児アセチルコリン受容体(fnAChR)、CD25、がん抗原19−9(CA19−9)、がん抗原125(CA−125)、ミュラー管抑制物質受容体II型(MISIIR)、シアル化Tn抗原(s TN)、線維芽細胞活性化抗原(FAP)、エンドシアリン(CD248)、上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)、腫瘍関連抗原L6(TAL6)、SAS、CD63、TAG72、Thomsen−Friedenreich抗原(TF抗原)、インスリン様増殖因子I受容体(IGF−IR)、Cora抗原、CD7、CD22、CD70、CD79a、CD79b、G250、MT−MMP、F19抗原、CA19−9、CA−125、アルファ−フェトタンパク質(AFP)、VEGFR1、VEGFR2、DLK1、SP17、ROR1、およびEphA2からなる群から選択される。XTENの遮蔽効果は、インタクトなプロドラッグ形態のキメラポリペプチドアセンブリーの前述の実施形態の両結合ドメインに適用され、RSの切断によってキメラポリペプチドアセンブリー組成物からXTENが放出されると、それぞれの結合ドメインの完全な結合能力が回復することが、段落の実施形態において具体的に企図される。
本発明の目的は、組成物へのバルキング部分の付加が、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物における遮蔽効果をもたらし、T細胞と標的組織への結合の同時的減少が、対象に投与された場合、全身曝露中のTh1 T細胞関連サイトカインまたは他の前炎症性メディエーターの産生の減少をもたらし、その結果、XTENなどの結合部分に連結されていない二特異的結合組成物と比較して、全体の副作用および安全性プロファイルが改善されるということである。細胞性免疫の重要な構成成分として、IL−2、TNF−アルファ、およびIFN−ガンマの産生は、Th1応答(Romagnani S. T-cell subsets (Th1 versus Th2). Ann Allergy Asthma Immunol. 2000年、85巻(1号):9〜18頁)、特に、抗CD3によって刺激されるT細胞(Yoon, S.H.、Selective addition of CXCR3+CCR4-CD4+ Th1 cells enhances generation of cytotoxic T cells by dendritic cells in vitro. Exp Mol Med. 2009年、41巻(3号):161〜170頁)での特質であり、IL−4、IL−6、およびIL−10も、二特異的抗体組成物のための細胞傷害応答において重要な前炎症性サイトカインである(Zimmerman, Z.ら、Unleashing the clinical power of T cells: CD19/CD3 bi-specific T cell engager (BiTE(登録商標)) antibody composition blinatumomab as a potential therapy. Int. Immunol.(2015年)、27巻(1号):31〜37頁)。一部の実施形態では、インタクトな切断されていないキメラポリペプチドアセンブリー組成物は、in vitro細胞ベース刺激サイトカインアッセイにおけるプロテアーゼ処理されたキメラポリペプチドアセンブリー組成物の対応する放出された第1の部分の結合ドメインにより刺激されたサイトカインレベルと比較して、前記アセンブリーがin vitro細胞ベースサイトカイン刺激アッセイ(以下の実施例に記載されるものなど)においてエフェクター細胞および標的細胞と接触する場合、Th1および/または前炎症性サイトカインの産生をもたらす、1/2以下、または1/3以下、または1/4以下、または1/5以下、または1/6以下、または1/7以下、または1/8以下、または1/9以下、または1/10以下、または1/20以下、または1/30以下、または1/50以下、または1/100以下、または1/1000以下に減少した能力を示し、ここで、サイトカインは、IL−2、IL−4、IL−6、IL−10、TNF−アルファおよびIFN−ガンマからなる群から選択される。前述の一実施形態では、Th1サイトカインの産生は、PBMCまたはCD3+T細胞などのエフェクター細胞と、アルファ4インテグリン、Ang2、B7−H3、B7−H6、CEACAM5、cMET、CTLA4、FOLR1、EpCAM、CCR5、CD19、HER2、HER2 neu、HER3、HER4、HER1(EGFR)、PD−L1、PSMA、CEA、MUC1(ムチン)、MUC−2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16 βhCG、Lewis−Y、CD20、CD33、CD38、CD30、CD56(NCAM)、CD133、ガングリオシドGD3;9−O−アセチル−GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、GD2、炭酸脱水酵素IX、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue−1、形質細胞抗原1、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、CCR8、前立腺の6回膜貫通上皮抗原(STEAP)、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、Ly−6、デスモグレイン4、胎児アセチルコリン受容体(fnAChR)、CD25、がん抗原19−9(CA19−9)、がん抗原125(CA−125)、ミュラー管抑制物質受容体II型(MISIIR)、シアル化Tn抗原(s TN)、線維芽細胞活性化抗原(FAP)、エンドシアリン(CD248)、上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)、腫瘍関連抗原L6(TAL6)、SAS、CD63、TAG72、Thomsen−Friedenreich抗原(TF抗原)、インスリン様増殖因子I受容体(IGF−IR)、Cora抗原、CD7、CD22、CD70、CD79a、CD79b、G250、MT−MMP、F19抗原、CA19−9、CA−125、アルファ−フェトタンパク質(AFP)、VEGFR1、VEGFR2、DLK1、SP17、ROR1、およびEphA2からなる群から選択される腫瘍特異的マーカー抗原を有する標的細胞を含むin vitroアッセイにおいてアッセイされる。前述の別の実施形態では、サイトカインは、IL−2である。前述の別の実施形態では、サイトカインは、TNFアルファである。前述の別の実施形態では、サイトカインは、IFN−ガンマである。別の実施形態では、アセンブリーの放出された第1の部分の結合ドメインによって結合させることができる抗原と共に腫瘍を有する対象に投与されるインタクトな切断されていないキメラポリペプチドアセンブリー組成物は、腫瘍を有する同等の対象におけるプロテアーゼ処理されたキメラポリペプチドアセンブリー組成物の対応する放出された結合ドメインによって産生されるサイトカインレベルと比較して、対象におけるTh1および/または前炎症性サイトカインの産生をもたらす、1/2以下、または1/3以下、または1/4以下、または1/5以下、または1/6以下、または1/7以下、または1/8以下、または1/9以下、または1/10以下、または1/20以下、または1/30以下、または1/50以下、または1/100以下、または1/1000以下に減少した能力を示す。前述の実施形態では、サイトカインを、対象から取り出された血液、流体、または組織試料から評価することができる。前述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サル、およびヒトであってもよい。しかしながら、対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物の利点において、組成物の細胞溶解特性がサイトカインによる予備刺激を必要としないこと;第1の部分の結合ドメインにより標的細胞に結合したエフェクター細胞の免疫学的シナプスの形成が標的細胞中での細胞溶解またはアポトーシスを行うのに十分であることが発見された。それにも拘わらず、前炎症性サイトカインの産生は、in vitroアッセイによるものであっても、腫瘍を有する対象の処置のモニタリングにおいても、対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物の効力または効果を評価するための有用なマーカーである。
上記の結合ドメイン実施形態によれば、腫瘍細胞マーカー抗原を認識する結合部位が、高い効率で破壊される標的細胞を捕捉するために高い結合親和性を有する場合、それは有利である。本発明のキメラポリペプチドアセンブリー組成物は、好ましい実施形態では、標的細胞結合ドメインがin vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−7〜10−10Mの範囲のK値を有する親和性を有するため、腫瘍細胞を殺傷するためにそれらを数回使用することができるという利点を有する。標的腫瘍抗原に結合するための二特異的結合ドメインの親和性が高すぎる場合、組成物は、発現する腫瘍細胞に結合し、その表面上に残り、それを放出し、別の細胞に結合することができないようにする。一実施形態では、対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物のエフェクター細胞結合ドメインは、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−5〜10−7Mの間の結合定数を有し、その詳細な例は、以下の実施例に記載される。別の実施形態では、対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物のエフェクター細胞結合ドメインは、in vitro結合アッセイにおいて決定された場合、10−5〜10−10Mの間の結合定数を有する。
一態様では、キメラポリペプチドアセンブリーのRSが標的細胞の環境中で哺乳動物プロテアーゼによって切断され、切断され前記組成物から第1の部分の二特異的結合ドメインおよび第3の部分が切断されると、プロドラッグ形態から活性化形態に変換される場合、前記第1の部分が、エフェクター細胞抗原、例えば、CD3を担持するT細胞と、エフェクター細胞が活性化される際に、第1の結合ドメインによって標的化される腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原を担持する腫瘍細胞とに同時に結合することが設計された組成物の特色である。一部の実施形態では、アセンブリーがRSの切断によって活性化される場合、次いで、エフェクター細胞と標的細胞とに同時に結合することにより、エフェクター細胞の少なくとも3倍、または10倍、または30倍、または100倍、または300倍、または1000倍、活性化され、活性化は、in vitro細胞ベースアッセイにおいて評価される、サイトカイン、細胞溶解タンパク質の産生、または標的細胞の溶解によって評価される。別の実施形態では、放出された第1の部分の結合ドメインによる、ヒトCD3抗原を担持するT細胞と、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原を担持する腫瘍細胞とに同時に結合することにより免疫学的シナプスが形成され、その結合により、腫瘍細胞を溶解することができるT細胞由来エフェクター分子が放出される。エフェクター細胞活性化および/または細胞溶解を測定するためのin vitroアッセイの非限定的な例としては、細胞膜完全性アッセイ、混合細胞培養アッセイ、FACSベースヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルー流入アッセイ、測光酵素放出アッセイ、ELISA、放射測定51Cr放出アッセイ、蛍光ユーロピウム放出アッセイ、CalceinAM放出アッセイ、測光MTTアッセイ、XTTアッセイ、WST−1アッセイ、アラマーブルーアッセイ、放射測定3H−Thd取込みアッセイ、細胞分裂活性を測定するクローン形成アッセイ、ミトコンドリア膜貫通勾配を測定する蛍光ローダミン123アッセイ、FACSベースホスファチジルセリン曝露によりモニタリングされるアポトーシスアッセイ、ELISAベースTUNEL試験アッセイ、カスパーゼ活性アッセイ、および細胞形態学アッセイ、またはサイトカイン、細胞溶解タンパク質、もしくは細胞の溶解のアッセイのための当技術分野で公知の他のアッセイ、または以下の実施例の方法が挙げられる。
当業者であれば、対象組成物を使用する対象の処置の文脈において、キメラポリペプチドアセンブリーがプロドラッグ形態で存在し、細胞環境と共局在化されるプロテアーゼの作用によってある特定の細胞環境に進入する場合により活性な形態に変換されることを理解する。標的組織中でのプロテアーゼの作用による組成物からの放出の際に、エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第2の結合ドメインおよび腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する結合特異性を有する第1の結合ドメインは、エフェクター細胞を標的細胞に同時に結合し、一緒に連結するその完全な能力を取り戻し、免疫学的シナプスを形成する。免疫学的シナプスの形成により、エフェクター細胞は活性化されるようになり、様々なシグナル経路が新しい遺伝子転写を開き、エキソサイトーシスにより、その小胞のエフェクター分子内容物を放出する。エフェクター細胞の型に応じて、様々なサイトカインおよびリンホカインが放出される;例えば、1型ヘルパーT細胞(Th1)は、IFN−γおよびTNF−βのようなサイトカインを放出するが、2型ヘルパーT細胞(Th2)は、B細胞を刺激するIL−4、IL−5、IL−10、およびIL−13のようなサイトカインを放出し、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)は、標的を殺傷するパーフォリンおよびグランザイムのような細胞傷害分子(集合的に、「エフェクター分子」)を放出する。非常に低いエフェクター対標的(E:T)比で、キメラポリペプチドアセンブリーの第1の部分の放出された二特異的結合ドメインが、エフェクター細胞と標的腫瘍細胞とに同時に結合し連結すると、腫瘍細胞は、エフェクター細胞によって細胞間の免疫学的シナプス中に放出されたエフェクター分子によって作用し、腫瘍細胞の損傷、パーフォリン媒介性溶解、グランザイムB誘導性細胞死および/またはアポトーシスをもたらすことが具体的に企図される。かくして、別の態様では、キメラポリペプチドアセンブリーが腫瘍を有する対象に投与された場合、プロドラッグ形態が正常組織における循環系には残存するが、プロドラッグ形態のアセンブリーが腫瘍と共局在化するプロテアーゼによって活性化され、放出された第1の部分の第2の結合ドメインが、エフェクター細胞が活性化され、腫瘍細胞の溶解が行われる際に、エフェクター細胞(例えば、T細胞のCD3抗原)と、組成物の第1の結合ドメインによって標的化される腫瘍特異的マーカーを発現する腫瘍細胞とに同時に結合するように、腫瘍のより透過性が高い血管系に溢出することができることが、設計された組成物の特色である。前述の一実施形態では、腫瘍細胞とエフェクター細胞とに同時に結合した対象の腫瘍中の放出された第1の部分は、対応するインタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物と比較して、少なくとも10倍、または少なくとも30倍、または少なくとも100倍、または少なくとも200倍、または少なくとも300倍、または少なくとも400倍、または少なくとも500倍、または少なくとも1000倍のエフェクター細胞を活性化する増大した能力を示す。前述の別の実施形態では、腫瘍細胞とエフェクター細胞とに同時に結合した対象の腫瘍中の放出された第1の部分は、対応するインタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物と比較して、少なくとも10倍、または少なくとも30倍、または少なくとも100倍、または少なくとも200倍、または少なくとも300倍、または少なくとも400倍、または少なくとも500倍、または少なくとも1000倍の腫瘍細胞を溶解する増大した能力を示す。前述実施形態では、エフェクター細胞活性化および/または細胞傷害性は、活性化されたエフェクター細胞のサイトメトリー測定、サイトカインのアッセイ、腫瘍サイズの測定などの、当技術分野で公知の従来の方法によって、または組織病理学によってアッセイされる。前述実施形態では、対象は、マウス、ラット、イヌ、サル、およびヒトであってもよい。
前述から明らかであるように、本発明は、特定の式が本明細書に提供される、所望の特性を実行するための設計された構成のポリペプチドの大きいファミリーを提供する。一実施形態では、本発明は、第1の結合ドメインと第2の結合ドメインとを含む第1の部分、放出セグメントを含む第2の部分、およびバルキング部分を含む第3の部分を有するキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。実施形態では、本発明は、式Iの構成を有する組成物(N末端からC末端に向かって記載される):
(第1の部分)−(第2の部分)−(第3の部分) I
(式中、第1の部分は、第1の結合ドメインが腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する特異的結合親和性を有し、第2の結合ドメインがエフェクター細胞に対する特異的結合親和性を有する2つのscFvを含む二特異的であり;第2の部分は、哺乳動物プロテアーゼによって切断され得る放出セグメント(RS)を含み;および第3の部分は、バルキング部分である)
を提供する。前述の実施形態では、第1の部分の結合ドメインは、順序(VL−VH)1−(VL−VH)2(ここで、「1」および「2」は、それぞれ、第1および第2の結合ドメインを表す)、または(VL−VH)1−(VH−VL)2、または(VH−VL)1−(VL−VH)2、または(VH−VL)1−(VH−VL)2であってもよく、対になった結合ドメインは、本明細書の以下に記載されるポリペプチドリンカーによって連結される。一実施形態では、第1の部分のVLおよびVHは、表1および2から選択される;RSは表4に記載される配列群から選択される;ならびにバルキング部分は、XTEN;アルブミン結合ドメイン;アルブミン;IgG結合ドメイン;プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド;脂肪酸;Fcドメイン;ポリエチレングリコール(PEG)、PLGA;ならびにヒドロキシルエチルデンプンからなる群から選択される。必要に応じて、バルキング部分は、表5に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するXTENである。前述の実施形態では、組成物は、組換え融合タンパク質である。別の実施形態では、部分は、化学的コンジュゲーションによって連結される。式Iの組成物構成の略図を、図6に提示する。
別の実施形態では、本発明は、式IIの構成を有する組成物(N末端からC末端に向かって記載):
(第3の部分)−(第2の部分)−(第1の部分) II
(式中、第1の部分は、第1の結合ドメインが腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する特異的結合親和性を有し、第2の結合ドメインがエフェクター細胞に対する特異的結合親和性を有する2つのscFvを含む二特異的であり;第2の部分は、哺乳動物プロテアーゼによって切断され得る放出セグメント(RS)を含み;および第3の部分は、バルキング部分である)
を提供する。前述の実施形態では、第1の部分の結合ドメインは、順序(VL−VH)1−(VL−VH)2(ここで、「1」および「2」は、それぞれ、第1および第2の結合ドメインを表す)、または(VL−VH)1−(VH−VL)2、または(VH−VL)1−(VL−VH)2、または(VH−VL)1−(VH−VL)2であってもよく、対になった結合ドメインは、本明細書の以下に記載されるポリペプチドリンカーによって連結される。一実施形態では、第1の部分のVLおよびVHは、表1および2から選択される;RSは表4に記載される配列群から選択される;ならびにバルキング部分は、XTEN;アルブミン結合ドメイン;アルブミン;IgG結合ドメイン;プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド;脂肪酸;ならびにFcドメインからなる群から選択される。必要に応じて、バルキング部分は、表5に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するXTENである。前述の実施形態では、組成物は、組換え融合タンパク質である。別の実施形態では、部分は、化学的コンジュゲーションによって連結される。式Iの組成物構成の略図を、図6に提示する。
別の実施形態では、本発明は、式IIIの構成を有する組成物(N末端からC末端に向かって記載):
(第5の部分)−(第4の部分)−(第1の部分)−(第2の部分)−(第3の部分) III
(式中、第1の部分は、第1の結合ドメインが腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する特異的結合親和性を有し、第2の結合ドメインがエフェクター細胞に対する特異的結合親和性を有する2つのscFvを含む二特異的であり;第2の部分は、哺乳動物プロテアーゼによって切断され得る放出セグメント(RS)を含み;第3の部分は、バルキング部分であり;第4の部分は、第2の部分と同一であるか、または異なっていてもよい哺乳動物プロテアーゼによって切断され得る放出セグメント(RS)を含み;および第5の部分は、第3の部分と同一であるか、または異なっていてもよいバルキング部分である)
を提供する。前述の実施形態では、第1の部分の結合ドメインは、順序(VL−VH)1−(VL−VH)2(ここで、「1」および「2」は、それぞれ、第1および第2の結合ドメインを表す)、または(VL−VH)1−(VH−VL)2、または(VH−VL)1−(VL−VH)2、または(VH−VL)1−(VH−VL)2であってもよく、対になった結合ドメインは、本明細書の以下に記載されるポリペプチドリンカーによって連結される。前述の実施形態では、RSは表4に記載される配列群から選択される。前述の実施形態では、バルキング部分は、XTEN;アルブミン結合ドメイン;アルブミン;IgG結合ドメイン;プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド;脂肪酸;ならびにFcドメインからなる群から選択される。必要に応じて、バルキング部分は、表5に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するXTENである。前述の実施形態では、組成物は、組換え融合タンパク質である。別の実施形態では、部分は、化学的コンジュゲーションによって連結される。
対象組成物は、その設計および特定の構成成分に基づいて、対象組成物が当技術分野で公知の二特異的抗体組成物と比較して改善された治療指数を有するように、一度、それらが標的組織または疾患によって不健康にされた組織と関連して見出されるプロテアーゼによって切断されたら、より高い選択性、より長い半減期を有し、より低い毒性およびより少ない副作用をもたらす二特異的治療薬を提供する長く放置されてきた必要性に対処する。そのような組成物は、限定されるものではないが、がんを含むある特定の疾患の処置において有用である。当業者であれば、本発明の組成物が、結合ドメインを嵩高いXTEN分子に配置することによる立体障害、組成物に係留されることにより、長い可撓性XTENポリペプチドの可撓性の非構造的特徴が結合ドメインを振動させ、その周囲を移動し、組成物と組織または細胞との間の遮断を提供することができる立体障害、ならびに個々の結合ドメインのサイズと比較して、大きい分子量(XTENの実際の分子量と、非構造的XTENの大きい流体力学半径のためとの両方によって寄与される)に起因する細胞または組織に浸透するインタクトな組成物の能力の低下を含む、機構の組合せによって非特異的相互作用のこの減少を達成することを理解する。しかしながら、組成物は、RSを切断することができるプロテアーゼを担持もしくは分泌する標的組織もしくは細胞の近くにある場合、または結合ドメインがリガンドに結合した時に標的細胞もしくは組織に内在化された場合、二特異的結合ドメインがプロテアーゼの作用によってXTENの塊から遊離し、立体障害の障壁を除去し、その薬理学的効果をより自由に発揮するように設計される。対象組成物は、細胞、組織または臓器への治療的二特異的抗体組成物の選択的送達が望ましい様々な状態の処置において使用を見出す。一実施形態では、標的組織は、がんであり、それは白血病、リンパ腫、または臓器もしくは系の腫瘍であってもよい。
III).医薬組成物
本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、キメラポリペプチドアセンブリーと1つまたは複数の薬学的に許容される担体とを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか1つのキメラポリペプチドアセンブリーと、任意選択で、担体、安定剤、および/または賦形剤の適した製剤とを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか1つのT細胞結合組成物と、任意選択で、担体、安定剤、および/または賦形剤の適した製剤とを含む。適した賦形剤および許容可能な担体には、緩衝剤、例えばクエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム、またはリン酸ナトリウム;保存剤;共溶媒;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;キレート剤、例えばEDTA;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質複合体);ポリマー、例えばポリエステル、ポリオキシエチレン−ステアリン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えばポリオキシエチレンモノラウリルエーテル、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル(Triton−X)、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、およびポリエチレン(polethylene)グリコール;塩形成対イオン、例えばナトリウム、多価糖アルコール;アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、アスパラギン、2−フェニルアラニン、およびトレオニン;糖または糖アルコール、例えばトレハロース、スクロース、オクタスルフェート、ソルビトールまたはキシリトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ミオイノシトール(myoinisitol)、ポリソルベート、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール(例えば、イノシトール);硫黄含有還元剤、例えばグルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、[アルファ]−モノチオグリセロール、およびチオ硫酸ナトリウム;低分子量タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン;ならびに親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンが含まれる。
本発明の医薬組成物は、それによってポリペプチドが薬学的に許容される担体ビヒクル、例えば水溶液もしくは緩衝液、薬学的に許容される懸濁液、および乳液と共に混合して組み合わされる、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化することができる。非水性溶媒の例には、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール、および植物油が含まれる。医薬組成物の治療製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol, A.編(1980年)に記載されるように、所望の程度の純度を有する活性成分を、任意選択の生理的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合して、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で保存するために調製される。さらに、医薬組成物はまた、他の薬学的に活性な化合物または複数の本発明の組成物も含みうる。
本発明の組成物は、多様な賦形剤を使用して製剤化されうる。適した賦形剤には、微結晶セルロース(例えば、Avicel PH102、Avicel PH101)、ポリメタクリル酸エステル、ポリ(アクリル酸エチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸トリメチルアンモニオエチルクロリド)(Eudragit RS−30Dなど)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(Methocel K100M、Premium CR Methocel K100M、Methocel E5、Opadry(登録商標))、ステアリン酸マグネシウム、タルク、クエン酸トリエチル、エチルセルロース水性分散剤(Surelease(登録商標))、および硫酸プロタミンが含まれる。徐放剤はまた、担体を含んでもよく、担体は、例えば溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤を含みうる。薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩などの無機酸塩、ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩などの有機酸の塩もまた、これらの徐放剤に使用することができる。組成物はまた、水、食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体、ならびに湿潤剤、乳化剤、またはpH緩衝剤などの物質を含みうる。リポソームもまた、担体として使用してもよい。
医薬組成物は、非経口(皮下、注入ポンプによる皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、および皮内を含む)、硝子体内、髄腔内、腹腔内、腹部内、および肺を含む任意の適した経路によって、治療のために投与されうる。同様に、好ましい経路は、レシピエントの状態および年齢、ならびに処置される疾患によって異なると認識される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物は、疾患を処置する方法において使用され、方法は、治療有効用量を使用する1つまたは複数の連続用量を含む処置レジメンに従って疾患を有する対象に医薬組成物を投与することを含む。処置レジメンは、特定の処置サイクルの一部である。一実施形態では、特定の処置サイクルは、それぞれの処置サイクルあたり、週に2回、毎週、10日毎、2週間毎、3週間毎、または1カ月毎の、医薬組成物の投与を含む。別の実施形態では、処置レジメンによって、対象における疾患に関連する臨床パラメーターまたは評価項目の改善が得られ、臨床パラメーターまたは評価項目は、完全、部分、または不完全奏効としての腫瘍縮小;無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答;無増悪生存期間;無病生存期間;再発までの期間;転移までの期間;全生存期間;生活の質の改善;および症状の改善からなる群のうちの1つまたは任意の組合せから選択される。他の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物は、対象における疾患を処置するための医薬として調製される。この段落の前述の実施形態では、疾患は、癌腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、ER/PR+乳がん、Her2+乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、悪性腹水を伴う結腸がん、粘液腫瘍、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん(gastric cancer)、胃がん(stomach cancer)、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、男化腫瘍、腺癌、肉腫、およびB細胞由来慢性リンパ性白血病でありうる。一実施形態では、医薬は、非経口経路によって(動脈内または静脈内経路によって)対象に投与するために調製される。別の実施形態では、医薬は、皮下経路によって対象に投与するために調製される。別の実施形態では、医薬は、皮内経路によって対象に投与するために対象における疾患の処置のために調製される。望ましければ、本明細書に記載の実施形態のキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物は、腫瘍および/または腹腔中の腹水の処置のために腹部内または腹腔内経路によって投与される、対象における疾患の処置のための医薬として調製される。
別の態様では、本発明は、医薬組成物の製剤に関する。一実施形態では、医薬組成物は、投与前に復元される凍結乾燥粉末として供給されうる。一実施形態では、医薬組成物は、投与のために、生理食塩水、D5水、乳酸加リンゲル液等を使用して復元される凍結乾燥粉末として供給されうる。別の実施形態では、組成物はまた、患者に直接投与することができる液体形態で供給されうる。一実施形態では、医薬組成物は、単回注射のためのプレフィルドシリンジ中の液体として供給される。一実施形態では、医薬組成物は、バイアル中の液体として供給される。別の実施形態では、医薬組成物は、バイアル中の凍結乾燥粉末として供給される。医薬組成物の実施形態の液体製剤の場合、所望の特性は、製剤が静脈内、筋肉内、関節内、または皮下投与のための針の中を通過することができる形態で供給されることである。一実施形態では、医薬組成物は液体形態である。別の実施形態では、医薬組成物は、単回注射として使用するためのプレフィルドシリンジ中に存在する。一実施形態では、医薬組成物は、少なくとも1μM、または少なくとも10μM、または少なくとも100μM、または少なくとも1mM、または少なくとも2mM、または少なくとも3mM、または少なくとも4mM、または少なくとも5mM、または少なくとも6mM、または少なくとも7mM、または少なくとも8mM、または少なくとも9mM、または少なくとも10mMの濃度で、食塩水緩衝液溶液中で製剤化され、そのような溶液は、本発明の皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、髄腔内、または筋肉内投与のための25、26、27、28、29、30、31、または32ゲージ針の中を通過することができる。注射筒ポンプもまた、本発明の医薬組成物を送達するために使用することができる。そのような装置は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第4,976,696号;第4,933,185号;第5,017,378号;第6,309,370号;第6,254,573号;第4,435,173号;第4,398,908号;第6,572,585号;第5,298,022号;第5,176,502号;第5,492,534号;第5,318,540号;および第4,988,337号に記載されている。当業者は、本発明の開示およびこれらの他の特許の開示の両方を考慮することによって、本発明の組成物の持続的放出のための注射筒ポンプを産生することができる。
IV).キメラポリペプチドアセンブリー組成物の方法および使用
本発明は、切断可能なキメラポリペプチドアセンブリー組成物またはProTIA(プロテアーゼ誘発免疫活性化因子)、および医学的状況、例えば本発明において、ある特定のがん、腫瘍、または炎症疾患の予防、処置、および/または改善において特に有用であるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物を提供する。
免疫抑制レジメンにおいて臨床的に広く使用されている抗ヒトCD3モノクローナル抗体のVLおよびVH部分を特に使用して、TcRシグナリングを標的化することによるT細胞応答のモジュレーションを含む、がん性疾患を有する対象を処置する方法に使用するためのキメラポリペプチドアセンブリー組成物を設計するために、多数の治療戦略が使用されている。CD3特異的モノクローナルOKT3は、ヒトにおいて使用が承認されたそのような最初のモノクローナル(Sgro、Toxicology、105巻(1995年)、23〜29頁)であり、移植における免疫抑制剤として臨床で広く使用されている(Chatenoud L: Immunologic monitoring during OKT3 therapy. Clin Transplant、7巻:422〜430頁、1993年)。その上、抗CD3モノクローナルは、部分的なT細胞シグナリングおよびクローンアネルギーを誘導することができる(Smith、J. Exp. Med. 185巻(1997年)、1413〜1422頁)。OKT3は、急性拒絶において主要な役割を果たす全てのT細胞の機能をおそらく遮断することによって、同種異系組織拒絶を逆転させる。OKT3は、シグナル伝達にとって必須であるT細胞の抗原認識構造(TCR)に会合する、T細胞の膜のCD3複合体と反応してその機能を遮断する。これらおよび他のそのようなCD3特異的抗体は、サイトカイン産生(Von Wussow、「Human gamma interferon production by leukocytes induced with monoclonal antibodies recognizing T cells」、J. Immunol.、127巻:1197〜1200頁(1981年))、増殖、およびサプレッサーT細胞誘導を含む様々なT細胞応答を誘導することができる。状態に応じて、CD3特異的モノクローナル抗体は、細胞傷害性を阻害または誘導することができる(Kimball JA,ら、「The OKT3 Antibody Response Study: a multicentre study of human anti-mouse antibody (HAMA) production following OKT3 use in solid organ transplantation」、Transplant Immunol. 3号:212〜221頁(1995年))。がんにおいて、がん細胞を溶解するために細胞傷害性T細胞を利用する試みがなされている。標的細胞溶解をもたらすために、細胞傷害性T細胞は、直接の細胞間接触を必要とし、細胞傷害性T細胞におけるTCRは、標的細胞における適切な抗原を認識して係合しなければならない。これによって免疫シナプスが作製され、次に、細胞傷害性T細胞内のシグナリングカスケードを開始させ、T細胞活性化ならびに多様な細胞傷害性サイトカインおよびエフェクター分子の産生を引き起こす。パーフォリンおよびグランザイムは、活性化細胞傷害性T細胞に常在する予め形成された顆粒内に保存される毒性の強い分子である。標的細胞の認識後、係合した細胞傷害性T細胞の細胞質顆粒は、細胞傷害性T細胞の膜に向かって遊走し、最終的に膜に融合し、その内容物を免疫シナプスの方向に放出して、標的細胞の膜内で孔を形成し、腫瘍細胞の細胞膜を破壊する。作製された孔は、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するセリンプロテアーゼファミリーであるグランザイムの流入点として作用する。これらおよび他のエフェクター分子は、上記でより十分に説明されている。本発明は、標的細胞の溶解を開始して、上記の機序によって有益な治療転帰をもたらすために、エフェクター細胞に加えて、腫瘍などの広範な悪性細胞を標的とするように遺伝子操作されている二特異的組成物の使用方法を企図する。組成物は、1つの結合ドメインがCD3に結合して係合し、細胞傷害性T細胞を活性化するように設計されるが、第2の結合ドメインは、特定の悪性疾患の特徴である多様な異なる標的細胞抗原を標的として、それらを共に架橋して免疫シナプスを作製するように設計することができる。設計の特定の利点として、細胞傷害性エフェクター細胞とがん細胞の物理的結合により、抗原のプロセシング、MHCI/β2−ミクログロブリン、ならびに共刺激分子の必要がなくなる。重要な腫瘍細胞マーカーの例には、多数の固形腫瘍において発現される細胞表面糖タンパク質である、上皮細胞接着分子(Ep−CAM)が含まれる。別の例はHER2/neuであり、これも乳がんなどのいくつかの固形腫瘍において発現される。本発明のキメラポリペプチドアセンブリー組成物の結合ドメインを作製するために利用することができる他のがん細胞マーカーおよび代表的なVLおよびVH配列を表2に記載するか、または本明細書において説明する。対象の組成物抗体の様々な実施形態に遺伝子操作することができる腫瘍特異的マーカー(上記でより広範に説明した)の範囲が広いことから、得られた組成物は、固形腫瘍および血液腫瘍を含む多様ながんに対して有用性を有すると認識される。一実施形態では、本発明は、腫瘍を有する対象を処置する方法を提供する。処置される腫瘍は、間質細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、グリア細胞、上皮細胞、脂肪細胞、リンパ球細胞、血管細胞、平滑筋細胞、間葉細胞、乳房組織細胞、前立腺細胞、腎細胞、脳細胞、結腸細胞、卵巣細胞、子宮細胞、膀胱細胞、皮膚細胞、胃細胞、尿生殖器官細胞、子宮頸部細胞、子宮細胞、小腸細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、胆嚢細胞、胆管細胞、食道細胞、唾液腺細胞、肺細胞、および甲状腺細胞からなる群より選択される細胞から生じる腫瘍細胞を含みうる。組成物のさらなる利点において、細胞傷害性エフェクター細胞は、1つの標的細胞の溶解を引き起こした後、架橋された標的がん細胞の損傷/破壊の際に消費されないことから、活性化エフェクター細胞は局所組織の中に放出されて他の標的がん細胞に向かって移動し、標的抗原に結合し、さらなる細胞溶解を開始することができる。さらに、固形腫瘍のような局所環境で、パーフォリンおよびグランザイムなどのエフェクター細胞分子の放出によって、二特異的結合ドメインの所定の分子に隣接するが結合しない腫瘍細胞に対して損傷を引き起こし、それによって腫瘍の増殖の停滞または縮小が起こると企図される。
したがって、本発明の有用性は、本明細書に記載のキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の治療有効用量を、標的細胞マーカーを有するがんまたは腫瘍を有する対象に投与後、がんまたは腫瘍細胞に会合したプロテアーゼによって組成物を作用させることができ、標的細胞とエフェクター細胞とを連結させることによって免疫シナプスを作製することができるように二特異的の第1の部分結合ドメインを放出し、その結果、標的細胞を溶解することができるエフェクター細胞由来エフェクター分子が、シナプスに放出されて、標的のがんまたは腫瘍細胞のアポトーシス、細胞溶解、または死が起こることであると理解される。さらに、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の使用により、放出された結合ドメインがエフェクター細胞および標的がん細胞に結合することによってひとたび免疫シナプスが形成されると、「1回死滅させる」より持続的でより一般的な有益な治療効果が得られうることは、当業者によって認識されるであろう。
一態様では、本発明は、がんまたは炎症障害などの対象における疾患を処置する方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、対象における疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載のキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。医薬組成物の治療有効量は、個体の疾患の状態、年齢、性別、および体重、ならびに抗体または抗体部分が個体において所望の応答を誘発する能力などの要因に従って変化しうる。治療有効量はまた、対象組成物のいかなる毒性または有害な効果も治療上有益な効果が上回る量である。予防有効量は、所望の予防効果を達成するために必要な期間、必要とされる医薬組成物の量を指す。
対象における疾患を処置する方法の一実施形態では、処置される疾患は、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん(gastric cancer)、食道がん、胃がん(stomach cancer)、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病を含む原発性血液悪性腫瘍、骨髄増殖性新生物障害、または骨髄異形成障害、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群でありうる。治療有効量は、がんまたは腫瘍を処置する(例えば、治癒するまたは重症度を低減する)または予防する(例えば、再発の可能性を低減させる)のを助けるために有益な効果を生じることができる。対象における疾患を処置する方法の別の実施形態では、医薬組成物は、対象に週2回、週1回、2週毎、3週毎、または毎月投与される1つまたは複数の治療有効用量として投与される。方法の別の実施形態では、医薬組成物は、対象に少なくとも2週、または少なくとも1カ月、または少なくとも2カ月、または少なくとも3カ月、または少なくとも4カ月、または少なくとも5カ月、または少なくとも6カ月の期間にわたって1つまたは複数の用量として投与される。方法の別の実施形態では、最初の低プライミング用量を対象に投与した後、1つまたは複数のより高用量の維持用量を少なくとも2週間、または少なくとも1カ月、または少なくとも2カ月、または少なくとも3カ月、または少なくとも4カ月、または少なくとも5カ月、または少なくとも6カ月の投薬スケジュールにわたって対象に投薬する。投与される初回プライミング用量は、少なくとも約0.005mg/kg、少なくとも約0.01mg/kg、少なくとも約0.02mg/kg、少なくとも約0.04mg/kg、少なくとも約0.08mg/kg、少なくとも約0.1mg/kgからなる群から選択され、投与される1つまたは複数のその後の維持用量は、少なくとも約0.1mg/kg、少なくとも約0.12mg/kg、少なくとも約0.14mg/kg、少なくとも約0.16mg/kg、少なくとも約0.18mg/kg、少なくとも約0.20mg/kg、少なくとも約0.22mg/kg、少なくとも約0.24mg/kg、少なくとも約0.26mg/kg、少なくとも約0.27mg/kg、少なくとも約0.28mg/kg、少なくとも0.3mg/kg、少なくとも0.4.mg/kg、少なくとも約0.5mg/kg、少なくとも約0.6mg/kg、少なくとも約0.7mg/kg、少なくとも約0.8mg/kg、少なくとも約0.9mg/kg、少なくとも約1.0mg/kg、少なくとも約1.5mg/kg、または少なくとも約2.0mg/kgからなる群から選択される。方法の別の実施形態では、医薬組成物は、対象に皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、髄腔内、または筋肉内に投与される。方法の別の実施形態では、医薬組成物は、最大の安全性および効能に関して忍容される、1つもしくは複数の治療上有効なボーラス用量または5分〜96時間の注入によって対象に投与される。方法の別の実施形態では、医薬組成物は、1つもしくは複数の治療上有効なボーラス用量または5分〜96時間の注入によって対象に投与され、用量は、少なくとも約0.005mg/kg、少なくとも約0.01mg/kg、少なくとも約0.02mg/kg、少なくとも約0.04mg/kg、少なくとも約0.08mg/kg、少なくとも約0.1mg/kg、少なくとも約0.12mg/kg、少なくとも約0.14mg/kg、少なくとも約0.16mg/kg、少なくとも約0.18mg/kg、少なくとも約0.20mg/kg、少なくとも約0.22mg/kg、少なくとも約0.24mg/kg、少なくとも約0.26mg/kg、少なくとも約0.27mg/kg、少なくとも約0.28mg/kg、少なくとも0.3mg/kg、少なくとも0.4.mg/kg、少なくとも約0.5mg/kg、少なくとも約0.6mg/kg、少なくとも約0.7mg/kg、少なくとも約0.8mg/kg、少なくとも約0.9mg/kg、少なくとも約1.0mg/kg、少なくとも約1.5mg/kg、または少なくとも約2.0mg/kgからなる群から選択される。方法の別の実施形態では、医薬組成物は、1つもしくは複数の治療上有効なボーラス用量または5分〜96時間にわたる注入によって対象に投与され、対象への投与によって、対象において少なくとも約3日、少なくとも約7日、少なくとも約10日、少なくとも約14日、または少なくとも約21日維持される、少なくとも約0.1ng/mL〜少なくとも約2μg/mLまたはそれを超えるキメラポリペプチドアセンブリーの血漿中濃度が得られる。方法の前述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サル、およびヒトでありうる。
特に、キメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物は、上皮がん、好ましくは腺癌、または微小残存病変、より好ましくは初期固形腫瘍、進行固形腫瘍、または転移固形腫瘍を処置するために使用することができる。さらに、本発明において提供されるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物は、肉腫の処置において有用である。さらに、本発明において提供されるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物は、急性または慢性リンパ球性白血病、急性または慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性新生物障害、または骨髄異形成障害、B細胞障害、例えばB細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽種、B細胞由来慢性リンパ球性白血病(B−CLL)などを含む、原発性血液悪性疾患を含む、リンパ腫および白血病、ならびに/また重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群などのB細胞関連自己免疫疾患の処置において有用である。さらに、本発明において提供されるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物は、尿生殖器官がん、卵巣がん、悪性腹水を有する卵巣がん、癌性腹膜炎、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮がん、腹膜中皮腫、膵臓がん、結腸がん、悪性腹水を有する結腸がん、および胃がんを含む、腹水が起こるがんの処置において有用である。
一態様では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む医薬組成物の投与によって媒介される、がんまたは腫瘍における有益な効果を達成するための方法を提供する。方法の一実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の1つの結合ドメインがエフェクター細胞CD3抗原に結合する親抗体に由来し、第2の結合ドメインが、アルファ4インテグリン、Ang2、B7−H3、B7−H6、CEACAM5、cMET、CTLA4、FOLR1、EpCAM、CCR5、CD19、HER2、HER2 neu、HER3、HER4、HER1(EGFR)、PD−L1、PSMA、CEA、MUC1(ムチン)、MUC−2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16 βhCG、Lewis−Y、CD20、CD33、CD38、CD30、CD56(NCAM)、CD133、ガングリオシドGD3;9−O−アセチル−GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、GD2、炭酸脱水酵素IX、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue−1、形質細胞抗原1、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、CCR8、前立腺の6回膜貫通上皮抗原(STEAP)、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、Ly−6、デスモグレイン4、胎児アセチルコリン受容体(fnAChR)、CD25、がん抗原19−9(CA19−9)、がん抗原125(CA−125)、ミュラー管抑制物質受容体II型(MISIIR)、シアル化Tn抗原(s TN)、線維芽細胞活性化抗原(FAP)、エンドシアリン(CD248)、上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)、腫瘍関連抗原L6(TAL6)、SAS、CD63、TAG72、Thomsen−Friedenreich抗原(TF抗原)、インスリン様増殖因子I受容体(IGF−IR)、Cora抗原、CD7、CD22、CD70、CD79a、CD79b、G250、MT−MMP、F19抗原、CA19−9、CA−125、アルファ−フェトタンパク質(AFP)、VEGFR1、VEGFR2、DLK1、SP17、ROR1、およびEphA2からなる群から選択されるエフェクター細胞標的抗原に結合する親抗体に由来する治療有効量の医薬組成物を投与することによって、それを必要とする対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法におけるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の使用を提供する。方法の一実施形態では、治療有効量の医薬組成物の投与によって、基礎となるがんまたは腫瘍障害の根治または改善が起こり、対象はなおも基礎障害に罹患しうるにもかかわらず、対象において改善が観察される。
別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の1つの結合ドメインが表1の抗体からなる群から選択されるエフェクター細胞に対する親抗体に由来し、第2の結合ドメインが、表2の抗体からなる群から選択される標的細胞標的抗原に結合する親抗体に由来する、治療有効量の医薬組成物を投与することによって、対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法におけるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の1つの結合ドメインが、表1に記載の配列の群から選択されるエフェクター細胞に対する親抗体に由来するVLおよびVH配列を含み、第2の結合ドメインが、表2の抗体からなる群から選択される標的細胞抗原に対する親抗体に由来するVLおよびVH配列の対を含む、治療有効量の医薬組成物を投与することによって、対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法におけるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の1つの結合ドメインが、エフェクター細胞に対する親抗体に由来するVLおよびVH配列を含み、第2の結合ドメインが、標的細胞抗原に対する親抗体に由来するVLおよびVH配列の対を含み、連結された結合ドメインが、表13に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、治療有効量の医薬組成物を投与することによって、対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法におけるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、表10または表12に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドアセンブリーを含む治療有効量の医薬組成物を投与することによって、対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法におけるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の使用を提供する。一実施形態では、方法の医薬組成物の用量は、ボーラス用量として投与される。別の実施形態では、方法の医薬組成物の用量はそれぞれ、静脈内注入によって投与される。別の実施形態では、方法の医薬組成物の用量はそれぞれ、腹部内注入によって投与される。別の実施形態では、方法の医薬組成物の用量はそれぞれ、動脈内注入によって投与される。別の実施形態では、方法の医薬組成物の用量はそれぞれ、皮下注射によって投与される。別の実施形態では、方法の医薬組成物の用量はそれぞれ、筋肉内注射によって投与される。別の実施形態では、方法の医薬組成物の用量はそれぞれ、腹部内注入によって投与される。この段落の前述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、イヌ、サル、およびヒトからなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、処置レジメンに従って対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法に関する。一実施形態では、本発明は、対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法であって、本明細書において開示されるキメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む医薬組成物の治療有効量の1つまたは複数の連続用量を含む処置レジメンに従って疾患を有する対象に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、本発明は、対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法であって、キメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の治療有効量の1つまたは複数の連続用量を含む処置レジメンに従って疾患を有する対象に投与することを含み、医薬組成物の治療有効量の対象への投与によって有益な治療効果が得られる方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法であって、キメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の治療有効量の1つまたは複数の連続用量を含む処置レジメンに従って疾患を有する対象に投与することを含み、処置レジメンによって、対象における疾患に関連する臨床パラメーターまたは評価項目の改善が起こる、方法を提供する。前述において、臨床パラメーターまたは評価項目は、完全、部分、または不完全奏効としての腫瘍縮小;無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答;無増悪生存期間;無病生存期間;再発までの期間;転移までの期間;全生存期間;生活の質の改善;および症状の改善からなる群の1つまたは任意の組合せから選択される。
別の態様では、本発明は、処置レジメンが特定の処置サイクルの一部である使用方法に関する。方法の一実施形態では、処置レジメンの特定の処置サイクルは、それぞれの処置サイクルに関して、週に2回、毎週、10日毎、2週間毎、3週間毎、または1カ月毎にキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の投与を含む。方法の別の実施形態では、処置レジメンは、疾患の処置に使用され、疾患は、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん(gastric cancer)、食道がん、胃がん(stomach cancer)、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病を含む原発性血液悪性腫瘍、骨髄増殖性新生物障害、または骨髄異形成障害、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群からなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を利用して、がん細胞などの標的細胞の死を誘導する改善された方法であって、標的細胞または組織に死をもたらすまたはアポトーシスを誘導するが、毒性および副作用が低減された方法に関する。本発明の方法の特定の利点において、組織および細胞に標的化送達されること、および薬物動態特性が増強されたことの両方により、優れた治療指数、すなわち毒性が低減され、効能の改善が得られることから、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の特性の増強により、用量の低減、投薬間隔の短縮、および優れた投薬レジメンを使用する、低用量医薬製剤または処置方法が可能となる。その結果、対象組成物は、RSが切断され、二特異的第1の部分結合ドメインが放出されるとがんまたは腫瘍組織への浸透および結合の増強を可能にしながら、付着したバルキング部分が健康な組織に対する非特異的結合を低減させる能力および健康な組織の循環系からの溢出を防止する能力を有することから、組成物の切断時にプロドラッグ型と放出された第1の部分との異なる区画化が起こり、RSおよびバルキング部分に連結していない対応する第1の部分結合ドメインと比較して優れた効能および安全性を有しうる。一実施形態では、本発明は、標的細胞およびエフェクター細胞を、本明細書に記載のキメラポリペプチドアセンブリーと接触させることを含む、標的細胞の死を誘導する方法であって、接触によって、膜の完全性の喪失、核濃縮、核崩壊、アポトーシスの内在性経路の誘導、アポトーシスの外因性経路の誘導、アポトーシス、細胞溶解、および細胞死からなる群から選択される標的細胞中での効果をもたらす、方法を提供する。効果は、標的細胞とエフェクター細胞の混合集団と、標的細胞およびエフェクター細胞の抗原に対して結合親和性を有する有効量のキメラポリペプチドアセンブリーとを含むin vitro細胞ベースのアッセイにおいて決定することができる。標的細胞抗原の非限定的な例には、アルファ4インテグリン、Ang2、B7−H3、B7−H6、CEACAM5、cMET、CTLA4、FOLR1、EpCAM、CCR5、CD19、HER2、HER2 neu、HER3、HER4、HER1(EGFR)、PD−L1、PSMA、CEA、MUC1(ムチン)、MUC−2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16 βhCG、Lewis−Y、CD20、CD33、CD38、CD30、CD56(NCAM)、CD133、ガングリオシドGD3;9−O−アセチル−GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、GD2、炭酸脱水酵素IX、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue−1、形質細胞抗原1、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、CCR8、前立腺の6回膜貫通上皮抗原(STEAP)、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、Ly−6、デスモグレイン4、胎児アセチルコリン受容体(fnAChR)、CD25、がん抗原19−9(CA19−9)、がん抗原125(CA−125)、ミュラー管抑制物質受容体II型(MISIIR)、シアル化Tn抗原(s TN)、線維芽細胞活性化抗原(FAP)、エンドシアリン(CD248)、上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)、腫瘍関連抗原L6(TAL6)、SAS、CD63、TAG72、Thomsen−Friedenreich抗原(TF抗原)、インスリン様増殖因子I受容体(IGF−IR)、Cora抗原、CD7、CD22、CD70、CD79a、CD79b、G250、MT−MMP、F19抗原、CA19−9、CA−125、アルファ−フェトタンパク質(AFP)、VEGFR1、VEGFR2、DLK1、SP17、ROR1、およびEphA2からなる群から選択される腫瘍特異的マーカー抗原が含まれるがこれらに限定されるわけではなく、エフェクター細胞はT細胞であり、エフェクター細胞抗原はCD3である。
他の実施形態では、本発明は、標的細胞集団を含むがんを有する対象において標的細胞の死を誘導する方法を提供する。方法の一実施形態では、方法は、キメラポリペプチドアセンブリーを含む治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。方法の別の実施形態では、方法は、医薬組成物の1つまたは複数の連続的に投与される治療有効用量としてキメラポリペプチドアセンブリーを投与することを含む。方法の別の実施形態では、方法は、がんを有する対象において治療効果を達成するのに必要とされるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の量を決定すること、および1つまたは複数の連続用量としての量を対象に投与することを含む。前述の方法において、がんは、癌腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、ER/PR+乳がん、Her2+乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、悪性腹水を伴う結腸がん、粘液腫瘍、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん(gastric cancer)、胃がん(stomach cancer)、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、男化腫瘍、腺癌、肉腫、およびB細胞由来慢性リンパ性白血病からなる群から選択される。方法の別の実施形態では、方法は、キメラポリペプチドアセンブリーを含む治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含み、方法によって、臨床パラメーターまたは評価項目の改善が起こる。例示的な臨床パラメーターまたは評価項目は、全生存期間、症状評価項目、無病生存期間、客観的奏効率、完全奏効、奏効期間、無増悪生存期間、無増悪期間、治療成功期間、腫瘍測定、腫瘍サイズ、腫瘍奏効率、転移までの期間、およびバイオマーカー濃度でありうる。方法の別の実施形態では、方法は、キメラポリペプチドアセンブリーを含む治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含み、方法によって、キメラポリペプチドアセンブリーの第1の部分を含むが第2の部分および第3の部分を含まない組成物の同等のmmole/kgでの用量を同等の対象に投与する場合と比較して、対象において診断的に関連する副作用の頻度、期間、または重症度の低減が起こり、副作用は、IL−2の血漿レベルの増大、TNF−アルファの血漿レベルの増大、IFN−ガンマの血漿レベルの増大、敗血症、発熱性好中球減少症、神経毒性、痙攣、脳症、サイトカイン放出症候群、言語障害、平衡障害、発熱、頭痛、混乱、低血圧、好中球減少症、悪心、意識障害、見当識障害、および肝酵素上昇からなる群から選択される。
一実施形態では、方法は、キメラポリペプチドアセンブリーを含む治療有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、それによって、二特異的第1の部分結合ドメインによって媒介される、少なくとも1つのパラメーター、評価項目、生理状態、または臨床転帰の改善が起こる。方法は、皮内、皮下、筋肉内、腹部内、または静脈内を含む、処置される疾患、障害、または状態に関して適切な任意の経路による医薬組成物の投与を企図する。
本発明の方法は、所望のパラメーターまたは臨床効果を達成および/または維持するために十分な期間、医薬組成物の治療有効量の連続用量を投与することを含んでもよく、治療有効量のそのような連続用量は、医薬組成物に関する治療有効用量レジメン、すなわち、連続的に投与される用量のスケジュールを確立し、用量は、本明細書に記載のがんおよび腫瘍を含むがこれらに限定されるわけではない、がんの疾患状態または病態の任意の臨床兆候、または症状、態様、測定されたパラメーターまたは特徴に対して持続的な有益な効果が起こる治療有効量で与えられる。
本発明の方法に関して、患者の利便性を改善するために、投薬間隔を延長させるために、および持続的な効果を得るために必要な薬物の量を低減させるために、長時間作用するキメラポリペプチドアセンブリー組成物またはキメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む医薬組成物が好ましい。一実施形態では、処置方法は、それを必要とする対象にキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の治療有効用量を投与することを含み、それによって融合タンパク質に連結されていない、同等用量で対象に投与される対応する標的化成分と比較して、医薬組成物の標的化成分に関して確立された治療濃度域内に留まる時間の増加が起こる。一部の場合において、治療濃度域内に留まる時間の増加は、融合タンパク質に連結されていない、対象に同等用量で投与される対応する標的化成分と比較して、少なくとも約3倍、または少なくとも約4倍、または少なくとも約5倍、または少なくとも約6倍、または少なくとも約8倍、または少なくとも約10倍、または少なくとも約20倍、または少なくとも約40倍、または少なくとも約50倍、または少なくとも約100倍大きい。方法はさらに、それを必要とする対象に治療有効用量レジメンを使用して投与される医薬組成物の複数の連続用量の投与によって、融合タンパク質に連結されていない対応する標的化成分と比較して、組成物の血中レベルに関して連続するCmaxピークおよび/またはCmin谷の間の時間の増加が起こりうることを提供する。前述の実施形態では、連続するCmaxピークおよび/またはCmin谷の間に留まる時間の増加は、融合タンパク質に連結されていない、標的化成分に関して確立された同等用量レジメンを使用して投与される対応する標的化成分と比較して、少なくとも約3倍、または少なくとも約4倍、または少なくとも約5倍、または少なくとも約6倍、または少なくとも約8倍、または少なくとも約10倍、または少なくとも約20倍、または少なくとも約40倍、または少なくとも約50倍、または少なくとも約100倍大きい。本明細書においてこの段落で先に記載した実施形態では、融合タンパク質または医薬組成物の投与によって、融合タンパク質に連結されていない、同等の単位用量または用量レジメンで対象に投与される対応する標的化成分と比較して、融合タンパク質のモルでのより低い単位用量を使用して、対象のがんまたは腫瘍を評価するために有用であることが公知である少なくとも1つのパラメーターの改善が起こりうる。
一実施形態では、対象のキメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む医薬組成物の投与によって、同じアッセイを使用して決定された、または測定された臨床パラメーターもしくは評価項目に基づいて、組成物の第2および第3の部分に連結されていない第1の部分の投与によって達成されるより大きい臨床、生化学または生理的パラメーターのうちの1つの改善が起こりうる。別の実施形態では、医薬組成物の投与によって、それぞれが、異なる標的化部分のうちの1つによって媒介される2つまたはそれより多くの臨床または代謝関連パラメーターまたは評価項目の改善が起こり、それによって同じアッセイを使用してまたは測定された臨床パラメーターに基づいて決定した場合に、XTENに連結していない標的化部分成分と比較して全体として増強された効果が起こりうる。一実施形態では、医薬組成物の対象への投与によって、完全、部分、または不完全奏効としての腫瘍縮小;無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答;無増悪生存期間;無病生存期間;再発までの期間;全生存期間;生活の質の改善;症状の改善;および転移までの期間からなる群の1つまたは任意の組合せから選択される臨床パラメーターまたは評価項目の改善が起こる。別の実施形態では、医薬組成物の投与によって、組成物の第2および第3の部分に連結していない第1の部分の活性より少なくとも20%長く持続する、または少なくとも30%、または少なくとも40%、または少なくとも50%、または少なくとも60%、または少なくとも70%、または少なくとも80%、または少なくとも90%、または少なくとも100%長く持続する、前述の臨床パラメーターのうちの1つまたは複数の改善が起こりうる。
別の態様では、本発明は、治療剤を腫瘍細胞に送達する方法に関する。一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのキメラポリペプチドアセンブリーを標的細胞に投与することを含む、腫瘍特異的マーカーを含む腫瘍細胞に治療剤を送達する方法であって、治療剤が、腫瘍特異的マーカーに特異的に結合する第1の部分の第1の結合ドメインを介して標的細胞に送達される、方法を提供する。方法の一実施形態では、腫瘍細胞特異的マーカーは、アルファ4インテグリン、Ang2、B7−H3、B7−H6、CEACAM5、cMET、CTLA4、FOLR1、EpCAM、CCR5、CD19、HER2、HER2 neu、HER3、HER4、HER1(EGFR)、PD−L1、PSMA、CEA、MUC1(ムチン)、MUC−2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16 βhCG、Lewis−Y、CD20、CD33、CD38、CD30、CD56(NCAM)、CD133、ガングリオシドGD3;9−O−アセチル−GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、GD2、炭酸脱水酵素IX、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue−1、形質細胞抗原1、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、CCR8、前立腺の6回膜貫通上皮抗原(STEAP)、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、Ly−6、デスモグレイン4、胎児アセチルコリン受容体(fnAChR)、CD25、がん抗原19−9(CA19−9)、がん抗原125(CA−125)、ミュラー管抑制物質受容体II型(MISIIR)、シアル化Tn抗原(s TN)、線維芽細胞活性化抗原(FAP)、エンドシアリン(CD248)、上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)、腫瘍関連抗原L6(TAL6)、SAS、CD63、TAG72、Thomsen−Friedenreich抗原(TF抗原)、インスリン様増殖因子I受容体(IGF−IR)、Cora抗原、CD7、CD22、CD70、CD79a、CD79b、G250、MT−MMP、F19抗原、CA19−9、CA−125、アルファ−フェトタンパク質(AFP)、VEGFR1、VEGFR2、DLK1、SP17、ROR1、およびEphA2からなる群から選択される。キメラポリペプチドアセンブリーを標的細胞に投与することを含む、腫瘍細胞に治療剤を送達する方法の別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーは、表12の配列からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも90%、または少なくとも91%、または少なくとも92%、または少なくとも93%、または少なくとも94%、または少なくとも95%、または少なくとも96%、または少なくとも97%、または少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。キメラポリペプチドアセンブリーを標的細胞に投与することを含む、腫瘍細胞に治療剤を送達する方法の別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーは、図36または図37に記載のポリペプチド配列と少なくとも90%、または少なくとも91%、または少なくとも92%、または少なくとも93%、または少なくとも94%、または少なくとも95%、または少なくとも96%、または少なくとも97%、または少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。治療剤を腫瘍細胞に送達する方法の別の実施形態では、腫瘍細胞は、対象の腫瘍内に常駐し、対象は、マウス、ラット、サル、イヌ、およびヒトからなる群から選択される。
V).本発明の核酸配列
別の態様では、本発明は、ポリペプチドキメラポリペプチドアセンブリー組成物をコードする単離ポリヌクレオチド配列、およびポリペプチドキメラポリペプチドアセンブリー組成物をコードするポリヌクレオチド分子と相補的な配列に関する。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のキメラポリペプチドアセンブリー組成物の実施形態をコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチド配列の相補体を提供する。他の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの第1の部分、または第2の部分、または第3の部分をコードする単離ポリヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチド配列の相補体を提供する。一実施形態では、本発明は、表10もしくは表12に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるキメラポリペプチドアセンブリー融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチド配列の相補体を提供する。一実施形態では、本発明は、表10または表14に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する、キメラポリペプチドアセンブリー組成物をコードする単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
別の実施形態では、本発明は、表7に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する配列からなるT細胞結合組成物をコードする単離ポリヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチド配列の相補体を提供する。
別の態様では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の実施形態をコードするポリヌクレオチド配列、またはその相同な変種を含むポリヌクレオチド配列と相補的な配列を産生する方法、ならびにポリヌクレオチド配列によって発現される融合タンパク質を発現させる方法に関する。一般的に、方法は、タンパク質様キメラポリペプチドアセンブリー組成物成分をコードするポリヌクレオチド配列を産生すること、得られた遺伝子産物を発現させること、成分をコードするヌクレオチドをアセンブルすること、成分をインフレームでライゲーションすること、コード遺伝子を宿主細胞にとって適切な発現ベクターに組み込むことを含む。コードされるキメラポリペプチドアセンブリーの融合タンパク質を産生する場合、方法は、適切な宿主細胞を発現ベクターによって形質転換すること、得られた融合タンパク質を形質転換宿主細胞において発現させるまたは発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養して、それによって融合タンパク質ポリペプチドを産生し、これを本明細書に記載の方法または当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製方法によって回収することを含む。分子生物学における標準的な組換え技術を使用して、本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを作製する。
本発明に従って、キメラポリペプチドアセンブリー組成物(またはその相補体)をコードする核酸配列を使用して、適切な宿主細胞において発現を指示する組換えDNA分子を作製する。いくつかのクローニング戦略が本発明の実施にとって適しており、その多くは、本発明の組成物をコードする遺伝子またはその相補体を含む構築物を作製するために使用される。一実施形態では、クローニング戦略を使用して、組成物を発現させるための宿主細胞を形質転換するために使用されるキメラポリペプチドアセンブリーをコードするヌクレオチドを含むキメラポリペプチドアセンブリー構築物をコードする遺伝子を作製する。本明細書においてこの段落で先に記載した前述の実施形態では、遺伝子は、本明細書において開示される構成の結合部分、放出断片、およびバルキング部分をコードするヌクレオチドを含みうる。
1つのアプローチにおいて、キメラポリペプチドアセンブリー構築物に対応するDNA配列を含む構築物を最初に調製する。そのような構築物を調製するための例示的な方法を実施例に記載する。次に、構築物を使用して、キメラポリペプチドアセンブリー構築物の発現および回収のための原核宿主細胞などの宿主細胞を形質転換するために適した発現ベクターを作製する。望ましければ、宿主細胞は、E.coliである。発現ベクターの作製、宿主細胞の形質転換、ならびにXTENの発現および回収のための例示的な方法を実施例に記載する。
キメラポリペプチドアセンブリー構築物をコードする遺伝子は、全合成により、または実施例により十分に説明する方法を含む、制限酵素媒介クローニング、PCR、およびオーバーラップ伸長などの、酵素的プロセスと組み合わせた合成のいずれかによって、1つまたは複数のステップで作製することができる。本明細書において開示される方法は、例えば、所望の長さおよび配列の様々な成分(例えば、結合ドメイン、リンカー、放出断片、およびXTEN)遺伝子をコードするポリヌクレオチドの配列をライゲーションするために使用することができる。キメラポリペプチドアセンブリー組成物をコードする遺伝子は、標準的な遺伝子合成技術を使用してオリゴヌクレオチドからアセンブルされる。遺伝子の設計は、キメラポリペプチドアセンブリーの産生に利用されるE.coli宿主細胞にとって適切なコドン使用およびアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを使用して実施することができる。本発明の1つの方法において、構築物の成分をコードするポリヌクレオチドのライブラリを作製した後、上記のようにアセンブルする。次いで得られた遺伝子をアセンブルし、得られた遺伝子を使用して、宿主細胞を形質転換し、本明細書に記載のその特性の評価のために、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を産生および回収する。
次に、キメラポリペプチドアセンブリー配列をコードする得られたポリヌクレオチドを、発現ベクターに個々にクローニングすることができる.多様な技法によって、核酸配列をベクターに挿入する。一般的に、DNAを、当技術分野で公知の技術を使用して、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ベクター成分は一般的に、シグナル配列のうちの1つまたは複数、複製開始点、1つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終止配列の1つまたは複数を含むがこれらに限定されるわけではない。これらの成分のうちの1つまたは複数を含む、適したベクターの構築は、当業者に公知である標準的なライゲーション技術を使用する。そのような技術は当技術分野で周知であり、科学文献および特許文献に十分に記載されている。様々なベクターが公的に利用可能である。ベクターは、例えば、組換えDNA技法に簡便に供することができるプラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態でありうるが、ベクターの選択はしばしば、ベクターが導入される宿主細胞に依存する。このため、ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、染色体外の実体として存在し、その複製が染色体の複製とは無関係であるベクター、例えばプラスミドでありうる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と共に複製されるベクターでありうる。
本発明は、宿主細胞と適合性で、宿主細胞によって認識され、ポリペプチドの制御発現のためにポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結されている、複製および制御配列を含むプラスミド発現ベクターの使用を提供する。ベクターは通常、複製部位、ならびに形質転換細胞において表現型の選択を提供することができるタンパク質をコードする配列を有する。そのようなベクター配列は、多様な細菌、酵母、およびウイルスに関して周知である。使用することができる有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体、および合成DNA配列の断片を含む。「発現ベクター」は、適した宿主においてポリペプチドをコードするDNAの発現をもたらすことができる、適した制御配列に作動可能に連結されたDNA配列を含むDNA構築物を指す。必要条件は、ベクターが、選択された宿主細胞において複製可能で生存可能であることである。望ましければ、低いまたは高いコピー数のベクターを使用してもよい。
適したベクターには、SV40の誘導体およびpcDNA、ならびに、col EI、pCRl、pBR322、pMal−C2、pET、Smithら、Gene 57巻:31〜40頁(1988年)に記載されるpGEX、pMB9およびその誘導体、RP4等のプラスミド、NM989などのファージIの多数の誘導体などのファージDNA、ならびにM13および糸状一本鎖ファージDNAなどの他のファージDNAなどの公知の細菌プラスミド;2ミクロンプラスミドまたは2mプラスミドの誘導体ならびにセントロメアおよび組込み型酵母シャトルベクターなどの酵母プラスミド;昆虫または哺乳動物細胞において有用なベクターなどの真核細胞において有用なベクター;プラスミドおよびファージDNAの組合せに由来するベクター、例えばファージDNAまたは発現制御配列を使用するように改変されているプラスミドなどが含まれるがこれらに限定されるわけではない。本発明において同様に使用することができる酵母発現系には、非融合pYES2ベクター(Invitrogen)、融合体pYESHisA、B、C(Invitrogen)、pRSベクター等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。ベクターの制御配列は、転写をもたらすためのプロモーター、そのような転写を制御するための任意選択のオペレーター配列、適したmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終止を制御する配列を含む。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示し、宿主細胞に対して同種または異種のいずれかであるタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる任意のDNA配列でありうる。原核細胞宿主の場合に発現ベクターにおいて使用するために適したプロモーターには、その全てがCFXTENポリペプチドをコードするDNAに作動可能に連結されている、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム[Changら、Nature、275巻:615頁(1978年);Goeddelら、Nature、281巻:544頁(1979年)]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーターシステム[Goeddel、Nucleic Acids Res.、8巻:4057頁(1980年);欧州特許第36,776号]、ならびにtacプロモーターなどのハイブリッドプロモーター[deBoerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、80巻:21〜25頁(1983年)]が含まれる。細菌システムにおいて使用するためのプロモーターはまた、キメラポリペプチドアセンブリーポリペプチドをコードするDNAに作動可能に連結された、シャイン−ダルガルノ(S.D.)配列を含みうる。
VI).本発明の組成物を作製する方法
別の態様では、本発明は、E.coli宿主細胞を使用して機能的タンパク質の高い発酵発現レベルでキメラポリペプチドアセンブリー組成物を作製する方法、ならびに高い発現レベルで細胞傷害性の活性なポリペプチド構築物組成物を産生する方法において有用な構築物をコードする発現ベクターを提供する方法に関する。
一実施形態では、方法は、1)本明細書において開示される実施形態のうちのいずれかのキメラポリペプチドアセンブリー融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製するステップと、2)生物系における高レベルタンパク質発現のために適切な転写および翻訳配列の制御下のプラスミドまたは他のベクターでありうる発現ベクターに、ポリヌクレオチドをクローニングするステップと、3)発現ベクターによって適切なE.coli宿主細胞を形質転換するステップと、4)キメラポリペプチドアセンブリー組成物の発現にとって適した条件下で通常の栄養培地中で宿主細胞を培養するステップとを含む。望ましければ、E.coli宿主細胞は、BL21 Goldである。方法によって、キメラポリペプチドアセンブリー融合タンパク質の発現は、宿主細胞の粗発現産物の成分として発現された融合タンパク質の少なくとも0.1g/L、または少なくとも0.2g/L、または少なくとも0.3g/L、または少なくとも0.5g/L、または少なくとも0.6g/L、または少なくとも0.7g/L、または少なくとも0.8g/L、または少なくとも0.9g/L、または少なくとも1g/Lの発酵力価をもたらし、発現された融合タンパク質の第1および第2の結合ドメインの少なくとも70%、または少なくとも80%、または少なくとも90%、または少なくとも95%、または少なくとも97%、または少なくとも99%が正確にフォールディングされる。本明細書において使用される用語「正確にフォールディングされる」は、結合ドメインタンパク質がその標的リガンドに対して特異的結合能を有することを意味する。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を産生する方法であって、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を発酵反応において、発酵反応が波長600nmで少なくとも130の光学密度に達した場合に、前記ポリペプチドの約10ミリグラム超/グラム乾燥重量宿主細胞(mg/g)、または少なくとも約250mg/g、または約300mg/g、または約350mg/g、または約400mg/g、または約450mg/g、または約500mg/gの濃度でポリペプチド産物を発現するために有効な条件で培養するステップを含み、発現された融合タンパク質の第1および第2の結合ドメインが正確にフォールディングされる、方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を産生する方法であって、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を発酵反応において、発酵反応が波長600nmで少なくとも130の光学密度に達した場合に、前記ポリペプチドの約10ミリグラム超/グラム乾燥重量宿主細胞(mg/g)、または少なくとも約250mg/g、または約300mg/g、または約350mg/g、または約400mg/g、または約450mg/g、または約500mg/gの濃度でポリペプチド産物を発現するために有効な条件で培養するステップを含み、発現されたポリペプチド産物が可溶性である、方法を提供する。
以下は、本発明の組成物、方法、および処置レジメンの例である。上記の一般的説明を考慮して、他の様々な実施形態を実施してもよいと理解される。
(実施例1)放出断片およびXTENを有する抗EpCAM抗CD3−XTENを有するProTIA構築物の構築
抗EpCAM/抗CD3タンデムscFvの後に多特異的放出断片配列(BSRS−1、アミノ酸配列LSGRSDNHSPLGLAGS)の1つが続く配列をコードする遺伝子を、Genescriptで合成し、pBR322−XTEN864デスティネーションベクターにおけるNdeIおよびBsaI制限部位と適合性であるNdeIおよびBsaI部位を導入した。抗EpCAM/抗CD3タンデムscFvおよびBSRS−1を含む制限消化遺伝子断片を、T4 DNAリガーゼを使用してpBR322−XTEN864ベクターにライゲーションして、BL21 Gold細胞(New England Biolabs)に形質転換した。形質転換体を、DNAミニプレップによってスクリーニングして、所望の構築物をDNAシークエンシングによって確認した。最終ベクターは、以下の成分(N末端からC末端の順):抗EpCAM−抗CD3二特異的タンデムscFvに放出断片としてのBSRS−1が続き、これにPhoAプロモーターの制御下でXTEN_864遺伝子が融合し、およびSTII分泌リーダー、を有するProTIA分子をコードする。得られた構築物はAC1278であり、DNA配列およびコードされるアミノ酸配列を表10に提供する。
AC1476と呼ぶ、放出断片を有し、DNA配列およびコードされるアミノ酸配列を表10に同様に提供する別の抗EpCAM抗CD3−XTENを、類似の方法で骨格ベクターpYS0044−XTEN864−H6骨格ベクターに構築した。
下線で示す配列はシグナルペプチドを表し、これは分泌の際に切断され、最終の成熟タンパク質には存在しない。
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
(実施例2)E.coli発酵培養物からの非切断型および切断型His8−aEpCAM−aCD3−BSRS1−XTEN864の産生
1)E.coli発酵培養物からのHis(8)−aEpCAM−aCD3−BSRS1−XTEN_AE864の発現および精製
融合タンパク質AC1278(MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA−His(8)−aEpCAM−aCD3−BSRS1−XTEN_AE864)を、Amunix所有のE.coliAmE098株において発現させた。10L発酵培養物を37℃で増殖させて、塩の供給を枯渇させた後、温度を26℃にシフトさせた。採取の間、発酵ブロス全体を遠心分離して細胞を沈降させた。上清を収集して、次に酸凝集沈殿を使用して、エンドトキシンおよび宿主細胞タンパク質夾雑物を低減させた。1M酢酸を使用して、上清のpHを徐々にpH4.5に低下させ、室温で30分間インキュベートした。次に、2M NaOHを使用してpHをpH7.5に上昇させ戻し、4℃で一晩保った。翌日、3M LifeAssureフィルターカプセルを使用して、上清を0.20μmで濾過した。
HisアフィニティタグのN末端の完全性を確保するために、固定化金属アフィニティクロマトグラフィーを最初の捕捉ステップとして使用した。5個の10−mL RedisepRf 25Gカラムハウジング(Teledyne Isco)に、ToyoPearl−AF−キレート650M樹脂(TOSOH Biosciences)10mLを充填した。カラムを0.5M NaOHで消毒し、蒸留水で十分にすすいだ後、0.1M NiSOを充填し、平衡緩衝液(20mM Tris、250mM NaCl、pH 7.5)の5カラム容量(CV)で平衡にした。Triton X−114の曇点が23°Cであることから、Triton洗浄緩衝液(20mM Tris、100mM NaCl、0.1%Triton X−114、pH 7.5)および洗浄2緩衝液(20mM Tris、100mM NaCl、pH 7.5)を予め調製して4°Cで保存し、使用時は氷上で維持した。カラムを平衡にした後、上清をカラムにロードした。追跡としての平衡緩衝液3CVの後、カラムを冷Triton洗浄緩衝液の10CVで洗浄して、エンドトキシンを低下させ、その後、冷洗浄2緩衝液の10CVによってTriton X−114を除去した。タンパク質を、溶出緩衝液(20mM Tris、100mM NaCl、150mMイミダゾール、pH 7.5)の3CVによってカラムから溶出させて、1CVの画分(10 mL)を収集した。タンパク質の酸化を低減させるために、5mM EDTAを、各溶出液に添加した。ロード、フロースルー、および溶出液を非還元4〜12% Bis−Tris SDS−PAGEおよびクマシー染色によって分析した。ゲルに基づき、溶出液CV1およびCV2をさらなる処理のために残しておいた(図14A)。
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)をその後の研磨ステップとして選択した。2個の20−mL RedisepRf 25Gカラムハウジング(Teledyne Isco)に、Toyopearl−フェニル−650M樹脂(TOSOH Biosciences)20mLを充填した。カラムを0.5M NaOHで消毒し、蒸留水で十分にすすぎ、緩衝液A(20mM Tris、1M (NHSO、pH 7.5)の5CVで平衡にした。75%緩衝液A、50%緩衝液A、および25%緩衝液Aの溶出緩衝液を、緩衝液Aと緩衝液B(20mM Tris、pH 7.5)の適当量を混合することによって予め調製した。IMAC溶出液CV1および2を、先のカラムステップから共にプールし、硫酸アンモニウムを最終濃度1Mで添加した後、予め平衡にしたフェニルカラムにロードした。ローディングおよび緩衝液Aの3CVによる追跡後、カラムを75%緩衝液A、50%緩衝液A、25%緩衝液A、および0%緩衝液Aのそれぞれ3CVによって溶出した。ロード、フロースルー、および溶出液を、非還元4〜12%Bis−Tris SDS−PAGEおよびクマシー染色によって分析した。ゲルに基づき、洗浄液および750mM (NHSO(枠内)での溶出液CV1〜2をさらなる処理のためにプールした(図14B)。
XTENのC末端の完全性を確保するため、およびエンドトキシンをさらに低下させるために、アニオン交換クロマトグラフィーを最終研磨ステップとして選択した。AKTApurifier上のXK16カラムハウジングに、Capto Q Impress樹脂(GE Healthcare)5mLを充填して、0.5M NaOHで消毒し、蒸留水で十分にすすぎ、緩衝液B(20mM Tris、500mM NaCl、pH 7.5)の2CVでストリッピングを行い、緩衝液A(20mM Tris、pH 7.5)の5CVで平衡にした。HIC溶出液プールを4倍希釈した後、カラムにロードした。次に、カラムを30%緩衝液Bの3CVで洗浄し、30%〜70%緩衝液Bの勾配の15CVによって溶出した。溶出液を、1/2CV(2.5mL)画分に収集した。次にロード、フロースルー、および溶出液を、非還元SDS−PAGEおよびクマシー染色によって分析し、製剤に関してプールする画分を決定した(図14C)。
2)製剤および特徴付け
所望の溶出画分(図14Cの枠内)を濃縮して、50mM Tris、150mM NaCl、pH 7.5に緩衝液交換した。製剤化した産物を0.2μmで濾過滅菌した。産物の品質を決定するためのロット放出は、サイズ排除クロマトグラフィー分析およびSDS−PAGE分析を伴った。SEC分析の場合、製剤化産物10μgを、分析的SECカラムに注入して、95%超の単量体産物を確認した(図15A)。SDS−PAGE分析は、製剤化産物5μgを4〜12%Bis−Trisゲルにロードして、クマシーブルーで染色することによって実施した。産物の純度は90%超(図15B)であった。
3)酵素の活性化および保存
組換えマウスMMP−9は、R&D Systemsから酵素前駆体として供給され、酢酸4−アミノフェニル水銀(APMA)による活性化を必要とした。APMAを最初に0.1M NaOHに最終濃度10mMとなるように溶解した後、0.1N HClを使用してpHを中性へと再調節した。APMA保存液の2.5mMへのさらなる希釈は、50mM Tris、150mM NaCl、10mM CaCl、pH7.5中で行った。プロMMPを活性化するために、1mM APMAおよび100ug/mLプロMMP−9を37℃で3時間インキュベートした。最終濃度50%のグリセロールに添加した活性化酵素は、その後、−20℃で数週間保存することができた。
4)His(8)−aEpCAM−aCD3−BSRS1−XTEN864のMMP−9消化
切断型aEpCAM−aCD3 ProTIA−Aを産生するために、製剤化したHis(8)−aEpCAM−aCD3−BSRS1−XTEN864(ProTIA−X)9.12mgを、10mM CaClおよび酵素の基質に対するモル比1:2237の活性組換えマウスMMP−9(R&D Systems)を含む反応混合物中、37℃で2時間インキュベートした。BSRS1での特異的消化を確認するため、非消化およびMMP−9消化産物5μgを4〜12%Bis−Tris SDS−PAGEで泳動させた後、クマシーブルーによって染色した。クマシーブルー染色を使用することにより、MMP−9消化前の完全長のHis8−aEpCAM−aCD3−BSRS1−XTEN864(ProTIA−X)、およびMMP−9消化後のHis8−aEpCAM−aCD3切断断片(ProTIA−A)が可視化された(図16A)。
5)MMP−9消化後の切断型His(8)−aEpCAM−aCD3 ProTIA−Aの精製
BSRS1でのMMP−9消化の確認後、固定化金属アフィニティクロマトグラフィーを使用して、MMP−9を除去した。5−mLポリプロピレンカラムハウジング(ThermoScientific)に、ToyoPearl−AF−キレート650M樹脂(TOSOH Biosciences)2mLを充填した。カラムを、平衡緩衝液(20mM Tris、250mM NaCl、pH 7.5)の5CVによって平衡にした。次に、消化混合物をカラムにロードした。ローディングおよび平衡緩衝液の1CVによる追跡後、カラムを平衡緩衝液の3CVで洗浄した。タンパク質を溶出緩衝液(20mM Tris、100mM NaCl、150mMイミダゾール、pH 7.5)の3CVによってカラムから溶出し、1CVの画分(2mL)を収集した。ロード、フロースルー、および溶出液を非還元4〜12%Bis−Tris SDS−PAGEおよびクマシー染色によって分析し、ProTIA−Aを含む溶出液を決定した(図16B)。
6)切断型His(8)−aEpCAM−aCD3の製剤および特徴付け
所望の溶出液(図16Bの枠内)を濃縮して、50mM Tris、150mM NaCl、pH 7.5に緩衝液交換した。産物の品質を決定するためのロット放出は、サイズ排除クロマトグラフィー分析およびSDS−PAGE分析を伴った。SEC分析に関して、産物10μgを分析的SECカラムに注入して、95%超の単量体産物を確認した(図17A)。SDS−PAGE分析に関して、産物5μgを、4〜12%Bis−Trisゲルで泳動させ、90%超の産物純度を確認した(図17B)。
(実施例3):E.coli発酵培養物からの非切断型および切断型AC1476 aEpCAM−aCD3−BSRS1−XTEN_AE864−His(6)の産生
1) E.coli発酵培養物からのAC1476 aEpCAM−aCD3−BSRS1−XTEN_AE864−His(6)の発現および精製
融合タンパク質AC1476(MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA−aEpCAM−aCD3−BSRS1−XTEN_AE864−His(6))を、Amunix所有のE.coli AmE097株において発現させた。発酵培養物10Lを37℃で増殖させて、塩の供給の枯渇後、温度を28°Cにシフトさせた。採取の間、全発酵ブロスを遠心分離して細胞を沈降させた。上清を、3M LifeAssureフィルターカプセルを使用して0.20μmで濾過した。XK50ハウジングカラムにToyopearl−AF−キレート−650M樹脂(TOSOH Biosciences)100mLを充填して、4℃で蠕動ポンプに接続した。カラムを0.5M NaOHで消毒して、蒸留水で十分にすすぎ、0.1M NiSOを充填し、平衡緩衝液(20mM Tris、250mM NaCl、pH 7.5)5CVによって平衡にした。カラムの平衡後、上清をカラムにロードして、Triton洗浄液、洗浄液2が続き、実施例2−1において上記のプロセスと類似の溶出を行った。溶出液を、1/4CV(25mL)画分で収集して、EDTAを最終濃度5mMとなるように添加して、遊離のニッケルをキレート化した。ロード、フロースルー、および溶出液を、非還元4〜12%Bis−Tris SDS−PAGEおよびクマシー染色によって分析した。ゲルに基づき、溶出液2−5(枠内)をさらなる処理のために残した(図18A)。
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)をその後の研磨ステップとして選択した。AKTApurifier上のXK24ハウジングカラムに、Toyopearl−フェニル−650M樹脂(TOSOH Biosciences)50mLを充填した。カラムを0.5M NaOHで消毒し、蒸留水で十分にすすぎ、緩衝液A(20mM Tris、1M (NHSO、pH 7.5)の5CVで平衡にした。所望のIMAC溶出液を前のカラムステップの溶出液と共にプールして、硫酸アンモニウムを最終濃度1Mとなるように添加した後、カラムにローディングした。溶出液を、100%〜50%緩衝液Aの勾配の10CVによって1/2CV(25mL)画分に収集した。ロード、フロースルー、および溶出液を、非還元4〜12%Bis−Tris SDS−PAGEおよびクマシー染色によって分析した。ゲルに基づき、枠内の溶出液をさらなる処理のためにプールした(図18B)。
アニオン交換クロマトグラフィーを最終研磨ステップとして選択した。XK24ハウジングカラムに、Capto Q Impress樹脂(GE Healthcare)30mLを充填し、0.5M NaOHで消毒し、蒸留水で十分にすすぎ、緩衝液B(20mM Tris、500mM NaCl、pH 7.5)の2CVでストリッピングを行い、緩衝液A(20mM Tris、pH 7.5)の5CVで平衡にした。溶出液のプールを、透過液の伝導率が8ms/cmとなるまで、Pellicon XL限外濾過モジュールBiomax 10 kDaを通して20mM Tris pH 7.5に緩衝液交換した。透過液を、Capto Q Impressカラムにロードして、次にカラムを10%および20%緩衝液Bの3CVで洗浄した。溶出液を、20%〜70%緩衝液Bの勾配の10CVによって、1/4CV(7.5 mL)画分に収集した。ロード、フロースルー、および溶出液を、非還元4〜12%Bis−Tris SDS−PAGEおよびクマシー染色によって分析した。ゲルに基づき、選択した溶出液(枠内)を製剤に関してプールした(図18C)。
2)aEpCAM−aCD3−BSRS1−XTEN864−His(6)の製剤および特徴付け
所望の溶出液を濃縮して、50mM Tris、150mM NaCl、pH 7.5に緩衝液交換した。産物の品質を決定するためのロット放出を、SEC分析(図19A)およびSDS−PAGE(図19B)に関して実施例2で確立したプロトコールに従って実施した。さらに、2μgを、4〜12%Bis−Tris非還元SDS−PAGEゲルにロードして、その後銀染色を行った(図19C)。SECの結果もまた使用して、aEpCAM−aCD3−BSRS1−XTEN864−His(6)の見かけの分子量および見かけの分子量係数(実際の分子量と比較して)ならびに流体力学的半径を決定した。決定された見かけの分子量は、1.7MDaであり、これによって見かけの分子量係数は12.3であり、計算された流体力学的半径は10.8nmであった。
分子の同一性をさらに証明するために、エレクトロスプレーイオン化質量分析法(ESI−MS)を実施し、実験的質量は、138,652Daであると決定され、理論的分子量138,651Daと比較するとΔMassは+1Daであった(図20A)。分析的カチオン交換クロマトグラフィーに関して、試料10μgをAgilent Bio SCX NP3にロードし、移動相Aは20mM酢酸ナトリウム、pH4.5であり、移動相Bは20mM酢酸ナトリウム、1M塩化ナトリウム、pH4.5であった。0〜100%Bの線形勾配を20分間にわたって適用し、1つのみの単一の主ピークを検出した(図20B)。
4)aEpCAM−aCD3−BSRS1−XTEN864−His(6)のMMP−9消化
実施例2に記載したMMP−9活性化および消化プロトコールの後、酵素の基質に対するモル比わずか1:6000モル濃度で活性組換えマウスMMP−9を使用したが、aEpCAM−aCD3−BSRS1−XTEN864−His(6)(ProTIA−X)20mgを消化した。非消化および消化産物をSDS−PAGE(図21A)によって分析した。
5)MMP−9消化後の切断型aEpCAM−aCD3−BSRS1−XTEN864−His(6)の精製
BSRS1でのMMP−9消化の確認後、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して、切断型の遊離のXTENおよび非切断型ProTIA−Xを除去した。2個の5−mlポリプロピレンカラムハウジング(ThermoScientific)に、MacroCap Q樹脂(GE Healthcare)各3mLを充填し、CIP(0.5M NaOH、1M NaCl)で消毒し、蒸留水で十分にすすいで、緩衝液B(20mM Tris、500mM NaCl、PH 7.5)の2CVによるストリッピングを行い、緩衝液A(20mM Tris、pH 7.5)の5CVによって平衡にした。消化混合物をカラムにロードした。ローディングおよび緩衝液Aの1CVによる追跡後、カラムを、150mM、200mM、250mM、300mM、および500mM NaClの各2CVによって溶出した。ロード、フロースルー、および溶出液を、4〜12%Bis−Tris SDS−PAGEおよびクマシー染色によって分析し、ProTIA−Aを含む画分を決定した(図21B)。
6)切断型aEpCAM−aCD3の製剤および特徴付け。所望のProTIA−A画分を濃縮して、50mM Tris、150mM NaCl、pH 7.5に緩衝液交換した。産物の品質を決定するためのロット放出を、SEC分析(図22A)およびSDS−PAGE(図22B)に関して実施例2で確立したプロトコールに従って実施した。さらに、2μgを、4〜12%Bis−Tris非還元SDS−PAGEゲルにロードし、その後銀染色した(図22C)。SECの結果を同様に使用して、aEpCAM−aCD3の見かけの分子量および見かけの分子量係数(実際の分子量と比較して)ならびに計算された流体力学的半径を決定した。決定された見かけの分子量は、39.8kDaであり(後者は、上記のインタクトな構築物のそれより約23倍小さい)、これは見かけの分子量係数0.7(後者は、上記のインタクトな構築物のそれより約17倍小さい)および流体力学的半径2.3nm(後者は、上記のインタクトな構築物のそれより約5倍小さい)を与えた。
分子の同一性をさらに証明するために、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI−MS)を実施し、実験的質量は、58,071Daであると判定され、理論的分子量58,067Daと比較すると、ΔMassは+4Daであった(図23A)。2)に既に記載したプロトコールを使用する分析的カチオン交換クロマトグラフィー(図23B)も同様に、試料の均一性を確認した。
(実施例4):抗−EpCAM×抗−CD3プロテアーゼ誘発免疫活性化因子(ProTIA)組成物のEpcam結合アッセイ
抗EpCAM×抗CD3 ProTIA組成物の結合能を、EpCAM/ペルオキシダーゼコンジュゲートプロテイン−LサンドイッチELISAによって確認した。ELISA結合アッセイにおいて、組換えヒトEpCAM(rhEpCAM)(Sino BiologicalR&D Systems、カタログ番号10694−H08H960−EP−50)を、96ウェル平底プレートに0.1μg/100μLの濃度でコーティングした。4℃で一晩インキュベーションした後、アッセイプレートを洗浄して、3%ウシ血清アルブミン(BSA)によって室温で1時間ブロックした。プレートを再度洗浄した後、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(すなわち、放出断片切断配列を有しないProTIAおよび、AC1484、ProTIAキメラポリペプチドアセンブリー組成物)ならびにプロテアーゼ処置およびプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1476)の用量範囲を導入した。非切断性ならびにプロテアーゼ処置および非処置ProTIAに利用した用量範囲は、0.0006〜5nMであり、開始濃度5nMから1:6倍連続希釈スキームによって得た。プレートを室温で1時間振盪させながらインキュベートして、非切断性、プロテアーゼ切断型、および非切断型ProTIAを、プレート上にコーティングされたrhEpCAMに結合させた。非結合成分を洗浄ステップで除去し、ペルオキシダーゼコンジュゲートプロテインL(PierceThermoFisher Scientific、カタログ番号32420)を添加した。プロテインLをscFvのカッパ軽鎖に結合させる適切なインキュベーション期間の後、任意の非結合試薬を洗浄ステップによって除去した後、テトラメチルベンジジン(TMB)基質を各ウェルに添加した。TMBは、ペルオキシダーゼの色素形成基質である。所望の色強度に達成した後、0.2N硫酸を添加して反応を停止させ、分光光度計を使用して450nmで吸光度(OD)を測定した。色の強度は、rhEpCAM/プロテインLサンドイッチELISAによって捕捉された非切断性、プロテアーゼ処置、および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの濃度に比例する。産生された色(測定されたOD)の強度をタンパク質濃度に対してプロットして、半最大応答(EC50)を生じる非切断性、プロテアーゼ切断型および非切断型抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの濃度を、GraphPad prismソフトウェアを使用して4パラメーターロジスティック回帰式によって誘導した。
図24に示されるように、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3二特異的ProTIA分子と類似の結合活性を有し、それぞれ、320nMpMおよび280nMpMのEC50を有する。プロテアーゼ処置ProTIAは、インタクトなプロテアーゼ非処置二特異的分子または非切断性ProTIA分子と比較して、rhEpCAMリガンドに関してEC50が120nMpMで、最も強い結合活性を有する。データは、XTEN864の存在により、そのリガンドに関する抗EpCAM部分の結合が少なくとも2.3倍妨害されたことを示唆している。
(実施例5)フローサイトメトリーによって評価した細胞結合
抗EpCAM×抗CD3 ProTIA組成物の二特異的結合をまた、CD3陽性ヒトJurkat細胞、ならびにSW480、HCT−116、Kato III、MDA−MB−453、MCF−7、MT3、SK−Br−3、SK−OV−3、OVCAR−3、およびPC3から選択されるEpCAM陽性ヒト細胞を利用して、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)ベースのアッセイによって評価する。CD3およびEpCAM細胞を、非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、ならびに抗CD3 scFvおよび抗EpCAM scFv陽性対照の用量範囲と共に、1%BSAおよび0.05%アジ化ナトリウムを有するPBSを含むFACS緩衝液において4℃で30分間インキュベートする。FACS緩衝液中で数回洗浄して、非結合試験材料を除去した後、細胞をFITCコンジュゲート抗Hisタグ抗体(Abcam、カタログ番号ab 1206)と共に4℃で30分間インキュベートした。非結合FITCコンジュゲート抗体をFACS緩衝液によって数回洗浄することによって除去し、細胞をFACS緩衝液に再懸濁して、FACS Caliburフローサイトメーター(Becton Dickerson)または同等の機器で獲得する。フローサイトメトリーデータは全て、FlowJoソフトウェア(FlowJo LLC)または同等のもので分析する。
抗EpCAM scFvは、Jurkat細胞に結合しないと予想されることから、抗CD3 scFv、非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAおよびプロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは全て、FITCコンジュゲート抗Hisタグ抗体単独と共にインキュベートしたJurkat細胞と比較して、蛍光強度の増加によって示されるように、Jurkat細胞に結合すると予想される。同様に、抗EpCAM scFv、プロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは全て、EpCAM陽性細胞に結合すると予想されるが、抗CD3 scFvは、EpCAM陽性細胞に結合しないと予想される。これらのデータは、抗EpCAM×抗CD3 ProTIA組成物が、JurkatおよびEpCAM発現ヒト細胞株のパネルにおいてそれぞれ発現されるCD3およびEpCAM抗原の両方を認識する二特異的結合能を反映すると予想される。さらに、表面結合に何らかの妨害をもたらすXTENポリマーにより、非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、CD3およびEpCAM抗原の両方に対してプロテアーゼ処置ProTIAより低い親和性で結合すると予想される。
(実施例6)抗EpCAM×抗CD3プロテアーゼ誘発免疫活性化因子(ProTIA)組成物の細胞傷害性アッセイ
抗EpCAM×抗CD3 ProTIA組成物の細胞傷害性のリダイレクトを、エフェクターとしてのヒト末梢血単核球(PBMC)および標的としてのSW480結腸細胞等のEpCAM陽性ヒト癌細胞(またはHCT−116、Kato III、NCI−N87、MKN45、MDA−MB−231、MDA−MB−453、MCF−7、MT3、SK−Br−3、SK−OV−3、OVCAR3、およびPC3から選択される)を使用することによって評価した。PBMCを、スクリーニングした健康なドナーからFicoll密度勾配遠心分離によって、全血または現地の血液バンクもしくはBioreclamation IVTから得たリンパ球に富むバフィーコート調製物から単離した。PBMCを、以下に考察するように、RPMI−1640/10%FCS/25mmol/mL HEPES中に適切な細胞密度で再懸濁して、37℃、5%CO湿潤インキュベータ内で使用するまで培養した。非切断性抗EpCAM×抗CD3組成物(例えば、AC1484)、プロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3切断性ProTIA組成物(例えば、AC1278&AC1476)の細胞溶解活性を決定するために3つの異なるタイプの細胞傷害性アッセイ、すなわち乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出アッセイ、カスパーゼ3/7アッセイ、およびFACSベースの分析を使用する。
51Cr放出細胞傷害性アッセイの非放射活性代替として、LDH放出アッセイは、51Crが放射活性アッセイにおいて放出されるのと全く同じように細胞溶解時に放出される安定な細胞質酵素LDHを定量的に測定する。テトラゾリウム塩を赤色のホルマザン産物に変換し、形成された色の量が溶解細胞数に比例する酵素アッセイによって、培養上清に放出されたLDHを測定する。
SW480におけるプロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA組成物の細胞傷害性能を以下のように分析した:SW480およびPBMCの細胞密度を最初に、フェノールレッド不含RPMIおよび5%FCS(フェノールレッド不含培地および5%FCSは、Promega CytoTox 96非放射活性細胞傷害性アッセイキット(カタログ番号G1780)を使用する際にバックグラウンド吸光を最小限にするために使用した)で構成されるアッセイ培地中でそれぞれ、2.5×10細胞/mLおよび1×10細胞/mLに調節した。エフェクターの標的に対する比5:1を達成するために、PBMCの100μLアリコートを、96ウェル丸底プレートのアッセイウェルあたりSW480細胞の80μLアリコートと同時培養した。プロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3組成物試料を、アッセイ培地で所望の用量濃度となるように希釈して20μLをそれぞれの実験ウェルに添加し、アッセイ全量を200μLとした。プロテアーゼ切断型ProTIAを、440nMで開始する12ポイントの5倍連続希釈用量濃度として、0.000005〜44nMの最終用量範囲を得て評価した。非処置非切断型ProTIA組成物を、184nMで開始する12ポイントの5倍連続希釈用量濃度として、0.000002〜18.4nMの最終用量範囲を得て分析した。エフェクターおよび標的細胞が放出する自然発生LDH;標的細胞が放出する最大LDH;溶解溶液の添加による容量補正対照、および培養培地バックグラウンドを含むアッセイ対照も同様にこの時点で設定した。標的が放出する自然発生LDHの場合、SW480細胞を、任意のプロテアーゼ処置または非処置組成物の非存在下、アッセイ培地200μL中でインキュベートした。エフェクターが放出する自然発生LDHの場合、PBMCを、任意のプロテアーゼ処置または非処置組成物の非存在下、アッセイ培地200μL中でインキュベートした。標的細胞が放出する最大LDHは、10倍溶解溶液20μLをSW480(全量220μL)に添加して、溶解溶液の存在下で標的細胞を45分間インキュベートし、その後LDH測定のために上清を採取することによって決定した。容量補正対照は、10倍溶解溶液20μLをアッセイ培地200μLに添加することによって得て、一方培養培地バックグラウンドはアッセイ培地200μLをインキュベートすることによって得た。プロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA組成物の実験ウェルならびに全てのそれぞれのアッセイ対照を含むプレートを、全て2回の反復で試験し、次に37℃、5%CO湿潤インキュベータ内で一晩インキュベートした。
細胞溶解の結果として上清に放出されたLDHの量を、Promega CytoToxアッセイキットを使用して、製造元の説明書に従って測定した。簡単に説明すると、アッセイプレートの各ウェルの上清50μLを平底酵素用プレートの対応するウェルに移した。酵素用プレートの各ウェルに、復元された基質50μLを添加した。次にプレートに蓋をして遮光し、室温で30分間インキュベートした。所望のインキュベーション期間の後、停止溶液50μLを各ウェルに添加して、490nmでの吸光度を記録した。
次にデータ解析を以下のように実施した:
1.実験、E:T比5:1(平均)−培養培地バックグラウンド(平均)
SW480標的の自然放出(平均)−培養培地バックグラウンド(平均)
PBMCエフェクターの自然放出(平均)−培養培地バックグラウンド(平均)
2.SW480標的の最大放出(平均)−容量補正対照(平均)
3.%特異的溶解=[(実験−SW480標的の自然放出−PBMCエフェクターの自然放出)/(SW480標的の最大放出−SW480標的の自然放出)]×100
4.次にプロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの用量濃度を%特異的溶解に対してプロットし、半最大応答を生じるタンパク質濃度(EC50)を、Graphpad prismソフトウェアを使用して、4パラメーターロジスティック回帰式から誘導した。
図25に示すように、PBMCの存在下で、プロテアーゼ処置ProTIAおよび非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA組成物にSW480細胞を曝露すると、濃度依存的細胞傷害性用量曲線が得られ、プロテアーゼ処置ProTIAはインタクトな非処置ProTIAより活性が48倍高かった(EC50はそれぞれ、2.5pM対120pM)。
抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの特異性を、LDHアッセイにおいてプロテアーゼ処置およびプロテアーゼ非処置ProTIAの細胞傷害活性を非コンジュゲート単一特異的抗EpCAM scFvおよび単一特異的抗CD3 scFvの細胞傷害活性と比較することによってさらに評価した。簡単に説明すると、PBMCおよびSW480細胞を、上記の96ウェル丸底プレートにおいてアッセイ培地中、エフェクター対標的比5:1で同時培養した。プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、プロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、および非コンジュゲート単一特異的抗EpCAM scFvプラス単一特異的抗CD3 scFv試料を全て、最終用量範囲0.00005〜45nMの12ポイントの5倍連続希釈液として、アッセイ全量200μLで評価した。実験ウェルと共に、上記の全ての関連するアッセイ対照も同様にアッセイプレートに含めて、プレートを37℃、5%CO湿潤インキュベータ内で一晩インキュベートした。
細胞溶解の結果として上清に放出されたLDHの量を、Promega CytoToxアッセイキットを使用して測定し、結果を上記のように分析した。
予想されるように、SW480細胞をPBMCの存在下でプロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAに曝露すると、非処置ProTIAと比較して細胞傷害性の増強を示す。重要なことに、SW480標的細胞およびPBMCの存在下で単一特異的抗EpCAM scFvと単一特異的抗CD3 scFvを組み合わせても、いかなる細胞傷害活性も起こらなかった(図26)。データは、標的化aEpCAM部分を二特異的分子の形態でaCD3エフェクター部分に連結させることが、細胞傷害性の誘導のために標的細胞の近位にCD3陽性細胞を積極的に動員するために必要であることを示している。
本発明者らはまた、抗EpCAM×抗CD3 ProTIAに存在する放出断片切断配列がそれ自身、腫瘍細胞によってまたは活性化CD3陽性T細胞によって放出されるプロテアーゼ(例えば、グランザイム)による切断に対して感受性がありうるという仮説を立てた。この仮説に取り組むために、放出断片を有しない非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1357)を構築し、プロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1278)と共に評価した。3つ全てのProTIAを、PBMCのSW480に対する比5:1を使用して、5倍連続希釈スキームで得られた0.00005〜45nMの12ポイント用量濃度範囲で試験するLDHアッセイにおいて分析した。
図27に示すように、非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ処置ProTIAより活性が32倍低い(EC50は、288pM対8.9pM)。興味深いことに、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(すなわち、放出断片切断配列を有しないProTIA)は、プロテアーゼ切断型ProTIAより活性が371倍低い(EC50は、3300pM対8.9pM)。結果は、切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIA分子内に含まれる放出断片が、腫瘍細胞および/または活性化CD3陽性T細胞によっておそらく放出されるプロテアーゼによる何らかの切断に対して感受性があることを示唆している。
放出断片を有しない非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1484)ならびにプロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1476)を、卵巣起源のヒト細胞株においても評価した。この実験において、PBMCをSK−OV−3卵巣細胞と共に5:1の比で混合し、3つ全てのProTIA分子を上記のようにLDHアッセイにおいて12ポイントの5倍連続希釈用量曲線で試験した。予想されるように、SK−OV−3卵巣細胞株においてプロファイルを調べた3つのProTIA分子の活性の傾向は、SW480結腸直腸細胞株において観察された傾向と類似であることが見出された。SK−OV−3細胞において、非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ処置ProTIAより活性が45倍低く(EC50は、136pM対3pM)、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ切断型ProTIAより活性が600倍低かった(EC50は、1793pM対3pM)(図30)。
(実施例7)フローサイトメトリーによって評価した細胞溶解
フローサイトメーターによる24時間後の細胞溶解の分析に関して、EpCAM陽性SK−OV−3標的細胞(またはHCT−116、Kato III、MDA−MB−453、MCF−7、MKN45、MT3、NCI−N87、SK−Br−3、SW480、OVCAR3、およびPC3細胞株から選択される標的細胞)を、蛍光膜色素CellVue Maroon色素(Affymetrix/eBioscience、カタログ番号88−0870−16)によって、製造元の説明書に従って標識する。あるいは、PKH26(Sigma、カタログ番号MINI26およびPKH26GL)も同様に使用することができる。簡単に説明すると、SK−OV−3細胞をPBSで2回洗浄後、CellVue Maroon標識キットに提供された希釈剤Cの0.1mL中で2×10個の細胞に再懸濁する。別個の試験管で、CellVue Maroon色素2アイクロLを希釈液C 0.5mLと混合した後、0.1mLをSK−OV−3細胞懸濁液に添加する。細胞懸濁液およびCellVue Maroon色素を混合して、室温で2分間インキュベートした。次にFCS 0.2mLを添加して標識反応を停止させる。標識細胞を完全細胞培養培地(10%FCSを含むRPMI−1640)で2回洗浄し、生存細胞の総数をトリパンブルー排除によって決定する。ウェルあたり全量200μLでエフェクター対標的比5:1の場合、96ウェル丸底プレートにおいてウェルあたり1×10個のPBMCを2×10個のCellVue Maroon標識SK−OV−3細胞と共に、プロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA試料の表記の用量範囲濃度の非存在下または存在下で同時培養する。24時間後、細胞をAccutase(Innovative Cell Technologies、カタログ番号AT104)によって採取して、2%FCS/PBSで洗浄した。Guava easyCyteフローサイトメーター(Millipore)で細胞を獲得する前に、生細胞(7−AAD陰性)と死細胞(7−AAD陽性)とを識別するために、細胞を、2.5μg/mL 7−AAD(Affymetrix/eBioscience、カタログ番号00−6993−50)を添加した2%FCS/PBS 100μL中に再懸濁する。FACSデータを、guavaSoftソフトウェア(Millipore)によって分析し、7−AAD陽性/CellVue Maroon陽性細胞数をCellVue Maroon陽性細胞の総数で除算することによって、死滅した標的細胞の百分率を計算する。
ProTIA濃度に対する細胞傷害性百分率の用量応答死滅曲線を、GraphPad Prismを使用して4パラメーターロジスティック回帰式によって分析し、半最大細胞傷害性百分率を誘導するProTIAの濃度をこのように決定する。
フローサイトメトリーを利用する細胞傷害性の結果は、LDHアッセイで得られた結果と一致すると予想される。SK−OV−3細胞を、PBMCの非存在下でプロテアーゼ切断型および非切断型抗EpCAM×抗CD3 ProTIA組成物に曝露しても、効果を有しないと予想される。同様に、PBMCは、標的細胞がなければProTIAの存在下で活性化されないと予想される。これらの結果は、細胞傷害活性に関してPBMCを刺激するためには、ProTIA組成物が標的細胞の表面上に集合する必要があることを示すと予想される。PBMCおよび標的細胞の存在下では、プロテアーゼによって前処置したまたは非処置のProTIAによる濃度依存的細胞傷害効果が存在するであろう。さらに、PBMCの存在下で非処置ProTIA(プロテアーゼなし)にSK−OV−3細胞を曝露すると、プロテアーゼ切断型ProTIA組成物と比較して細胞傷害性の低減を示すことを、結果が示すと予想される。
細胞傷害性実験の上記の組を、抗CD19×抗CD3 ProTIA組成物および抗HER2×抗CD3 ProTIA組成物などの他の二特異的ProTIA組成物について実施する。これらの例では、CD19およびHER2陽性標的細胞を、EpCAM陽性細胞の代わりに使用する。CD19発現細胞の例としての細胞株には、NAML−6、Blin−1、SKW6.4、Raji、Daudi、およびBJABが含まれるがこれらに限定されるわけではない。抗HER2標的化の場合、SK−BR−3、BT474、HCC−1954、MDA−MB−453、SK−OV−3、NCI−N87、JIMT−1、HCT−116などのHER2陽性細胞株を使用する。
(実施例8)抗EpCAM×抗CD3プロテアーゼ誘発免疫活性化因子(ProTIA)組成物のT細胞活性化マーカーアッセイ
抗EpCAM×抗CD3 ProTIA誘導活性化マーカー(CD69およびCD25)を測定するために、アッセイウェルあたり、1×10個のPBMCまたは精製CD3+細胞を、2×10個のSK−OV−3またはOVCAR3細胞(すなわち、エフェクター対標的比5:1)と共に、抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの存在下、10%FCSを含むRPMI−1640中で96ウェル丸底プレートにおいて最終全量200μLで同時培養した。37℃、5%CO湿潤インキュベータ内で20時間インキュベーション後、細胞を、FACS緩衝液(1%BSA/PBS)中のPECy5−コンジュゲート抗CD4、APC−コンジュゲート抗CD8、PEコンジュゲート抗CD25、およびFITCコンジュゲート抗CD69(抗体は全てBioLegendから得た)によって4℃で染色し、FACS緩衝液で2回洗浄し、FACS緩衝液に再懸濁して、Guava easyCyteフローサイトメーター(Millipore)で獲得した。
予想されるように、SK−OV−3卵巣細胞株においてプロファイルを調べた3つのProTIA分子のT細胞活性化マーカーの発現傾向は、LDH細胞傷害性アッセイによって観察されたものと類似であることが見出された。SK−OV−3細胞を使用して、非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによるPBMCのCD8およびCD4集団におけるCD69の活性化は、プロテアーゼ処置ProTIAより活性が約70倍低く(EC50は、CD8+に関して540pM対6.7pM、EC50は、CD4+に関して430pM対6.3pM)、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ切断型ProTIAより活性が約1000倍低かった(EC50は、CD8+に関して8700pM対6.7pM、EC50は、CD4+に関して6000pM対6.3pM)(図42)。
同様に、非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによるPBMC細胞のCD8およびCD4集団におけるCD69およびCD25両方の活性化は、プロテアーゼ処置ProTIAより活性が約60倍低く、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ切断型ProTIAより活性が約1300倍低かった(図43)。
作用機序がCD3+細胞を介することを確認するために、SK−OV−3細胞を標的細胞として使用して、非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる精製CD3+細胞のCD8およびCD4集団におけるCD69の活性化は、プロテアーゼ処置ProTIAより活性が約100倍低く(EC50は、CD8+に関して260pM対2.4pM、EC50は、CD4+に関して240pM対2.2pM)、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ切断型ProTIAより活性が約2000倍低かった(EC50は、CD8+に関して5000pM対2.4pM、EC50は、CD4+に関して5000pM対2.2pM)(図44)。非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる精製CD3+細胞のCD8およびCD4集団におけるCD69およびCD25両方の活性化は、プロテアーゼ処置ProTIAより活性が約100倍低く、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ切断型ProTIAより活性が約2000倍低かった(図45)。
OVCAR3細胞を使用して、非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる精製CD3+細胞のCD8およびCD4集団におけるCD69の活性化は、プロテアーゼ処置ProTIAより活性が約10倍低く(EC50は、CD8+に関して14pM対1.8pM、EC50は、CD4+に関して16pM対1.9pM)、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ切断型ProTIAより活性が約1000倍低かった(EC50は、CD8+に関して2000pM対1.8pM、EC50は、CD4+に関して1500pM対1.9pM)(図46)。非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる精製CD3+細胞のCD8およびCD4集団におけるCD69およびCD25両方の活性化もまた、プロテアーゼ処置ProTIAより活性が約10倍低く、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAもまた、プロテアーゼ切断型ProTIAより活性が約1000倍低かった。これらの結果は、非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAが、アッセイの際に、SK−OV−3細胞と比較してOVCAR3細胞の存在下ではより大きい程度に切断されたことを示唆している(図47)。
標的細胞の存在下で抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによるT細胞の活性化のさらなる証拠として、CD69およびグランザイムBの誘導を測定した。PBMC(1×10個)を、アッセイウェルあたり2×10個のOVCAR3細胞と共に(すなわち、エフェクター対標的比5:1)、96ウェル丸底プレートにおいて最終全量200μL中、抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの存在下で同時培養した。37℃、5%CO湿潤インキュベータ内で20時間インキュベーション後、細胞をFACS緩衝液(1%BSA/PBS)中で、PECy5コンジュゲート抗CD4、APCコンジュゲート抗CD8、およびFITCコンジュゲート抗CD69(抗体は全てBioLegendから得た)によって4℃で染色した。細胞を固定して0.1%Triton X−100/PBSによって透過性にした後、FACS緩衝液中でPEコンジュゲート抗グランザイムB(ThermoFisher、カタログ番号MHGB04)によって染色した。細胞をFACS緩衝液によって洗浄した後、FACS緩衝液に再懸濁して、Guava easyCyteフローサイトメーターで獲得した。
予想されるように、CD69およびグランザイムBの両方が、OVCAR3細胞の存在下でProTIA活性化T細胞において発現される。さらに、CD4+細胞と比較してより大きい画分のCD8+細胞が、グランザイムBを発現する(図48および49)。
(実施例9)抗EpCAM×抗CD3プロテアーゼ誘発免疫活性化因子(ProTIA)組成物の薬物動態特性
抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの薬物動態特性をC57BL/6マウスにおいて分析した。群1のマウス3匹に4mg/kgのプロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1278)を静脈内に注射し、群2のマウス3匹に非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1278)を静脈内注射した。適切な時点で、血液をヘパリンリチウム処理試験管に収集して、血漿へと処理した。プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA動物に関して、血漿の収集時点は、投薬前、2分、15分、30分、2時間、4時間、8時間、および24時間であった。非処置ProTIAマウスに関して、血漿の収集時点は、投薬前、4時間、8時間、24時間、2日、4日、6日、および7日であった。プロテアーゼ処置ProTIAの血漿中濃度を、プロテアーゼ切断型ProTIAを標準物質としてrhEpCAM/ビオチン化抗HisタグサンドイッチELISAによって定量し、非処置ProTIAの血漿中濃度は、非切断型ProTIAを標準物質としてrhEpCAM/ビオチン化抗XTENサンドイッチELISAによって定量した。
簡単に説明すると、ELISAプレート(Nunc Maxisorp、カタログ番号442404)を、0.1μg/100μL/ウェルのrhEpCAM(R&D Systems、カタログ番号EHH104111)によってコーティングした。4℃で一晩インキュベーション後、ELISAプレートを洗浄して、3%BSAによって室温で1時間ブロックした。プレートを再度洗浄後、プロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA標準物質の用量範囲、適切な品質対照、および血漿試験試料を適切に添加した。プレートを室温で1時間振盪させながらインキュベートして、ProTIA標準物質、品質対照、および試験試料を、プレート上にコーティングされたrhEpCAMに結合させた。非結合成分を数回の洗浄によって除去した。プロテアーゼ切断型ProTIAの検出に関して、ビオチン化抗Hisタグ抗体(R&D Systems、カタログ番号BAM050)を、0.2μg/100μLで添加して、プレートを室温で1時間インキュベートした。プロテアーゼ非処置ProTIAを検出するために、ビオチン化抗XTEN抗体(Amunix所有の抗体)を、0.1μg/100μLで添加して、プレートを室温で1時間インキュベートした。非結合のビオチン化試薬を洗浄して除去した後、ストレプトアビジン−HRP(Thermo Scientific、カタログ番号21130)を、1:30,000希釈で添加して、プレートを室温で1時間インキュベートした。数回洗浄後、TMB基質をそれぞれのウェルに添加した。望ましい色の強度に達した後、0.2N硫酸を添加して反応を停止させ、分光光度計を使用して450nmでの吸光度(OD)を測定した。色の強度は、それぞれのrhEpCAM/ビオチン化抗HisタグおよびrhEpCAM/ビオチン化抗XTENサンドイッチELISAによって捕捉されたプロテアーゼ処置および非処置ProTIAの濃度に比例する。血漿試料に存在するProTIAの濃度は、SoftMax Proソフトウェアを使用して、適切なプロテアーゼ処置または非処置ProTIA標準曲線に対して決定した。プロテアーゼ切断型および非切断型抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの終末半減期(T1/2)の薬物動態計算は、GraphPad Prismによって実施した。
予想と一致して、プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、約3.5時間の短い消失半減期(T1/2)を有するが、プロテアーゼ非処置ProTIA(XTEN付着)は、32時間のより長いT1/2(図28)を有し、インタクトなProTIA分子が、切断型分子より有意に長い半減期(少なくとも9倍長い)を有することを確認する。
(実施例10)早期処置SW40モデルにおける抗EpCAM×抗CD3プロテアーゼ誘発免疫活性化因子(ProTIA)組成物の抗腫瘍特性
TおよびB細胞の欠損、ならびにナチュラルキラー細胞の障害によって特徴付けられる免疫欠損NOD/SCIDマウスにおいてin vivo効能実験を実施した。マウスを無菌的な標準的な環境条件で維持し、US Institutional Animal Care Association for Assessment and Use Committee(IACUCAccreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC))ガイドラインに従って実験を実施した。プロテアーゼ処置およびプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1278)の効能を、ヒトSW480癌異種移植モデルを使用して評価した。簡単に説明すると、0日目に、1群5匹のNOD/SCIDマウスの6個のコホートに、1×10個のヒトPBMCを1×10個のSW480細胞と混合して右脇腹に皮下注射した。SW480/PBMCの接種の1時間後、コホート1にビヒクル(PBS+0.05%Tween80)、コホート2および3にそれぞれ、0.04mg/kgおよび0.4mg/kgプロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、コホート4および5に、0.1mg/kgおよび1mg/kgプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、ならびにコホート6に1mg/kgプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAを注射した。コホート1〜5に1日目から4日目まで毎日、さらなる4用量を投与したが、コホート6には行わなかった。
腫瘍を、予定される35日の間、キャリパーを使用して2つの垂直方向の径によって週に2回測定し、腫瘍の体積を(幅×長さ)/2の式に当てはめて計算した。体重、全身の外観、ならびに急発作、震え、無気力、過敏反応、立毛、努力呼吸/頻呼吸、体色変化、および腫瘍の潰瘍化、ならびに死亡などの臨床観察も同様に、処置関連毒性の測定として厳密にモニターした。試験の評価項目は、腫瘍体積12002000mmまたは3536日生存のどちらか早いほうとして定義された。腫瘍増殖阻害指数の百分率(%TGI)を、式((PBSビヒクル対照の平均腫瘍体積−ProTIA処置の平均腫瘍体積)/PBSビヒクル対照の平均腫瘍体積)×100に当てはめて処置群のそれぞれに関して計算した。%TGIが60%以上の処置群は、治療的に活性であると考えられる。
26日目に、ヒトエフェクター細胞の存在下でPBSビヒクルによって処置したコホート1のマウスは、腫瘍進行を阻害せず、ヒトエフェクター細胞単独がそれ自体、抗腫瘍効果を誘発できないことを証明した。ヒトエフェクター細胞の存在下でのプロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの0.04mg/kgおよび0.4mg/kgによる処置(それぞれ、コホート2および3)は、腫瘍増殖の抑制に関して明白な用量依存的応答を示し、0.4mg/kg用量群(%TGI=8584%)は、0.04mg/kg用量群(%TGI=6478%)より大きい保護を提供した。重要なことに、ヒトエフェクター細胞の存在下での抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの1mg/kg(コホート5)による処置もまた、モル等量の0.4mg/kgプロテアーゼ処置ProTIA(コホート3)とほぼ同程度に腫瘍の増殖を阻害した(%TGI=7883%)。データは、1mg/kgで、十分な抗EpCAM×抗CD3 ProTIAが、in vivo腫瘍環境でプロテアーゼによって、より活性な非XTEN化抗EpCAM×抗CD3部分へと有効に切断され、観察された効能を生じたことを示唆している。0.1mg/kgプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのコホート4において腫瘍退縮がなかったこと(%TGI=58%)は、この用量では、顕著な腫瘍退縮を誘導するには不十分な非XTEN化抗EpCAM×抗CD3部分が放出されたことを示唆した。抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの1回の1mg/kg用量を供されたコホート6は、対照群と比較して抑制された腫瘍増殖を示したにもかかわらず、治療活性の閾値(%TGI=4652%)に達しなかった(図31)。結果は、抗EpCAM×抗CD3 ProTIAが、SW480の腫瘍環境で有効に切断されて腫瘍の進行を阻害できること、および薬物濃度プラス曝露されることが薬物の効能を決定するための重要な要因であることを示唆している。
特に、全てのProTIA処置群およびビヒクル対照において有意な体重減少が観察されず、このことは全ての処置が良好に忍容されることを示した(図32)。
抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの抗腫瘍活性の特異性を、上記の試験と非常に類似しているが、処置群あたりのマウスを8匹にしてSW480/PBMCを接種したNOD/SCIDマウスにおいて実施する。この試験において、PBSビヒクル対照、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1357またはAC1484)、二特異的陰性対照ProTIA(CD3に対して結合活性を有するがEpCAMに対しては有しない)、抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、またはプロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる早期処置を、SW480/PBMC接種後1時間で開始する。上記の試験で決定したプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの1mg/kg用量濃度をこの試験で使用して、二特異的陰性対照ProTIA、非切断性およびプロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA試験物質を全て、等モル濃度で静脈内投与する。腫瘍の体積、体重、および臨床観察を35日間、週に2回モニターする。
ヒトエフェクター細胞の存在下でのPBSビヒクルおよび二特異的対照ProTIAによる処置は、抗腫瘍効果を誘導しないと予想され、ヒトエフェクター細胞単独または非EpCAM標的化部分のいずれも抗腫瘍効果を誘発できないことを証明する。これら両方の処置群のマウスは、試験評価項目(35日または腫瘍体積2000mm)を満たすと予想される。ヒトエフェクターの存在下でのプロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの毎日5回投薬は、腫瘍増殖の抑制を誘導すると予想される。非切断性ProTIAの等モル濃度による処置は、腫瘍の増殖を遅らせると予想されるが、それがプロテアーゼ切断の基質を含まないことから、その程度は、放出断片を担持する非処置ProTIAによって示されるより非常に小さいと予想される。
(実施例11)確立された結腸直腸腫瘍モデルにおける抗EpCAM×抗CD3プロテアーゼ誘発免疫活性化因子(ProTIA)組成物の抗腫瘍特性
確立された結腸直腸腫瘍モデルにおいて、SW480およびHCT−116腫瘍細胞を、0日目にNOG(NOD/Shi−scid/IL−2Rγnull)またはNSG(NOD.Cg−Prkdcscid.IL2rgtm1Wjl/SzJ)マウスに個別に移植する。(NOGまたはNSGマウスは、IL−2Rγ変異を担持するNOD/SCIDマウスであり、それによってマウスにT、B、およびNK細胞の欠如、マクロファージの機能障害、樹状細胞の機能障害、および補体活性の低減がもたらされる)。次に、ヒトPBMCを、3〜10日の間のいずれかに静脈内または腹腔内に導入する。SW480およびHCT−116腫瘍の体積が150mmに達すると、プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、インタクトなプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、および非切断性型抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる処置を毎日5回用量または1回用量として開始する。プロテアーゼ切断型およびプロテアーゼ非処置ProTIA(例えば、AC1476)の両方によって、確立されたSW480およびHCT−116腫瘍の低減または根治が起こり、プロテアーゼ非処置ProTIAは経時的に良好な治療的曝露を与え、その結果プロテアーゼ処置ProTIAより有効な抗腫瘍効果およびより良好な安全性プロファイルが得られると予想される。
非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1484)は、腫瘍の増殖を遅らせると予想されるが、それが腫瘍環境内でプロテアーゼ切断のための基質配列を含まないことから、その程度は、放出断片を担持するプロテアーゼ非処置ProTIAによって示されるより非常に小さいと予想される。
(実施例12)刺激された正常で健康なヒトPBMCならびにインタクトなおよびプロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAを使用する、ヒトTh1/Th2サイトカインの細胞測定ビーズアレイ分析
細胞ベースのin vitroアッセイにおいてT細胞関連サイトカインの放出を刺激する能力を、インタクトな抗EpCAM×抗CD3 ProTIA対切断型抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの能力の安全性評価として、IL−2、IL−4、IL−6、IL−10、TNF−アルファ、IFNガンマを含むサイトカインパネルを、プロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA試料によって刺激した培養ヒトPBMCの上清に関して、細胞測定ビーズアレイ(CBA)を使用して分析した。抗ヒトCD3抗体、OKT3を陽性対照として使用し、非処置ウェルを陰性対照とした。
簡単に説明すると、OKT3(0、10nM、100nM、および1000nM)、ならびにプロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1278、10nM、100nM、1000nM、および2000nM)を、96ウェル平底プレート上で、ウェルをバイオセーフティフード内で一晩蒸発させることによって、ドライコーティングした。次に、ウェルをPBSで1回軽く洗浄し、1×10個のPBMC 200μLを各ウェルに添加した。次にプレートを37℃、5%COで24時間インキュベートした後、組織培養上清を各ウェルから収集して、バリデートされた市販のCBAキット(BD CBAヒトTh1/Th2サイトカインキット、カタログ番号551809)を使用して、フローサイトメトリーによって製造元の説明書に従って、放出されたサイトカインに関して分析した。
結果
検出されたサイトカインレベルの未加工データを表11に提示し、図33〜3にグラフで描写する。
Figure 0006913670
予想されたように、OKT3は、評価した全てのサイトカイン(IL−2、IL−4、IL−6、IL−10、TNF−アルファ、IFN−ガンマ)の強い分泌を誘導したが、非処置ウェルは誘導せず、これによりCBAサイトカインアッセイの成績を確認した。プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによる刺激は、特に試験したサイトカインの全てに関して100nMより高い濃度で有意なサイトカイン発現を誘発した。これに対し、IL−2、IL−6、IL−10、TNF−アルファ、およびIFN−ガンマのベースラインレベルは、インタクトな非切断型抗EpCAM×抗CD3 ProTIA分子が10〜2000nMの濃度範囲で刺激剤であったときに検出された。プロテアーゼ非処置ProTIAによって誘導すると、適切なレベルのIL−4が検出されたが、IL−4レベルは、プロテアーゼ処置ProTIAについて観察されたレベルほど高くなかった(図33〜35)。これらのデータは、EpCAM×抗CD3部分が組成物から放出されているプロテアーゼ処置ProTIAと比較して、インタクトなProTIA組成物のXTENポリマーが、かなりの遮蔽効果をもたらし、PBMC刺激サイトカイン応答を妨害することを示唆している。
(実施例13)早期処置HCT−116モデルにおける抗EpCAM×抗CD3プロテアーゼ誘発免疫活性化因子(ProTIA)組成物の抗腫瘍特性
In vivo効能実験を、TおよびB細胞の欠損、ならびにナチュラルキラー細胞の障害を特徴付けられる、免疫欠損NOD/SCIDマウスにおいて実施した。マウスを、無菌的な標準的な環境条件で維持し、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC)ガイドラインに従って実験を実施した。プロテアーゼ処置およびプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1476)の効能を、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(すなわち、放出断片切断配列を有しないProTIA、その例はAC1484である)と共に、ヒトHCT−116結腸直腸癌異種移植モデルを使用して評価した。簡単に説明すると、0日目に、1群5匹のNOD/SCIDマウスの4つのコホートに、5×10個のヒトPBMCを、5×10個のHCT−116細胞と混合して右脇腹に皮下注射した。HCT−116/PBMC接種の1時間後、等モル投薬に基づいて、コホート1に、ビヒクル(PBS+0.05%Tween80)、コホート2に0.21mg/kgプロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、コホート3に、0.5mg/kgプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、およびコホート4に0.49mg/kg非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAを注射した。コホート1〜4に全て、1〜4日まで毎日投与される4つのさらなる用量を供した。
腫瘍を、予定される35日の間、キャリパーを使用して2つの垂直方向の径によって週に2回測定し、腫瘍の体積を(幅×長さ)/2の式に当てはめて計算した。体重、全身の外観、ならびに急発作、震え、無気力、過敏反応、立毛、努力呼吸/頻呼吸、体色変化、および腫瘍の潰瘍化、ならびに死亡などの臨床観察も同様に、処置関連毒性の測定として厳密にモニターした。試験の評価項目は、腫瘍体積12002000mmまたは35日での生存のどちらか早いほうとして定義された。腫瘍増殖阻害指数の百分率(%TGI)を、式((PBS対照の平均腫瘍体積−ProTIA処置の平均腫瘍体積)/PBS対照の平均腫瘍体積)×100に当てはめて処置群のそれぞれに関して計算した。%TGIが60%以上の処置群は、治療的に活性であると考えられた。
1835日目に、ヒトエフェクター細胞の存在下でビヒクルによって処置したコホート1のマウスは、腫瘍進行を阻害せず、試験終了時の群の平均腫瘍体積は1823mmであり、ヒトエフェクター細胞単独がそれ自体、抗腫瘍効果を誘発できないことを証明した。ヒトエフェクター細胞の存在下でのプロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの0.21mg/kg(コホート2)による処置は、腫瘍増殖の強い抑制を示し、5匹中2匹のマウスが、18日目で測定可能な腫瘍体積を示さず、完全な腫瘍退縮を示した。しかし、このコホートでは腫瘍の再増殖および進行が25日目以降に観察され、試験終了時に5匹のマウス全てが腫瘍の負荷を担持し、平均腫瘍体積は296mmであった。重要なことに、ヒトエフェクター細胞の存在下でインタクトな抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの0.5mg/kg(コホート3)による処置もまた、強い腫瘍増殖の阻害を与えた。実際にコホート3のマウス5匹中4匹が18日目に完全な腫瘍退縮を示した。一方でマウス2匹は35日目になおも完全な縮小を保持し、試験終了時のコホートの平均腫瘍体積は48mmであった。重要なことに、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの0.49mg/kg用量を供したコホート4は、コホート2および3ほど有効に腫瘍進行のいかなる持続的な阻害も誘導せず、このコホートではマウス5匹中5匹が有意な腫瘍負荷を残した。コホート4は、18.35日で試験を終了し、群の平均腫瘍体積は748mmであった。プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの0.21mg/kg(コホート2)およびインタクトな抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの0.5mg/kg(コホート3)の両方がそれぞれ、84%および97%のTGIを有し、治療的に活性であると考えられる。非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、TGI 59%であり、治療的に不活性であると考えられる。予想されるように、インタクトな抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの群の平均腫瘍体積は、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAコホートの体積とは有意に異なることが見出されている(studentのt検定、p=0.0016)。明らかに、インタクトな抗EpCAM×抗CD3 ProTIAコホートの群の平均腫瘍体積はまた、プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAコホートとも有意に異なることが見出されている(p=0.002)。結果は、0.5mg/kgでは、抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの有意な量が、in vivoのHCT−116腫瘍環境に存在するプロテアーゼによって有効に切断されて非常に活性な非XTEN化抗EpCAM×抗CD3部分となり、顕著な腫瘍退縮が観察されたことを示唆している。この仮説は、放出断片基質を欠如する非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIA分子では持続的な腫瘍退縮特性がなかったことにより、大いに裏付けされる(図38)。重要なことに、データはまた、抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによって、プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAより良好な治療的曝露が得られ、したがってより持続的な腫瘍退縮効果が報告されたことを示唆する。
注目すべきは、全てのProTIA処置群およびビヒクル対照に、有意な体重減少が観察されず、全ての処置が全体的に良好に忍容されたことを示した(図39)。
(実施例14)精製CD3陽性T細胞の存在下での抗EpCAM×抗CD3プロテアーゼ誘発免疫活性化因子(ProTIA)組成物の細胞傷害性アッセイ
ProTIA分子の細胞傷害活性がCD3陽性T細胞によって媒介されることを証明するために、放出断片を有しない非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1484)、ならびにプロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1476)を、精製ヒトCD3陽性T細胞の存在下でSK−OV−3およびOVCAR−3ヒト卵巣細胞株においてさらに評価した。精製ヒトCD3陽性T細胞は、BioreclamationIVTから購入し、MagCellectヒトCD3+T細胞単離キットを使用して健康なドナーの全血から陰性選択により単離した。この実験において、精製ヒトCD3陽性T細胞を、SK−OV−3またはOVCAR−3卵巣細胞と5:1の比で混合して、3つ全てのProTIA分子を、上記のLDHアッセイにおいて、12ポイントの5倍連続希釈用量曲線で試験した。予想されるように、SK−OV−3でプロファイルを調べた3つのProTIA分子の活性の傾向は、PBMCの存在下でのSK−OV−3の分析で観察されたものと類似であることが見出された(図30)。ヒトCD3陽性T細胞によるSK−OV−3卵巣細胞の細胞傷害性死滅において、非処置EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ処置ProTIAより活性が56倍低く(EC50は、134pM対2.4pM)、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ切断型ProTIAより活性が1000倍超低い(EC50は、2660pM対2.4pM)(図40)。ヒトCD3陽性T細胞によるOVCAR−3卵巣細胞の細胞傷害性死滅において、非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ処置ProTIAより活性がわずか2倍低く(EC50は、0.7pM対0.3pM)、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ切断型ProTIAより活性が287倍低い(EC50は、86pM対0.3pM)(図41)。結果は、ProTIA分子の細胞傷害活性が実際に、CD3陽性T細胞によって媒介されること、およびアッセイ混合物における腫瘍細胞および/または活性化CD3陽性T細胞から放出されると仮定されるプロテアーゼに対する、切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIA分子内に含まれる放出断片の感受性が、細胞株の間で異なる可能性があることを証明した。
(実施例15)抗EpCAM×抗CD3プロテアーゼ誘発免疫活性化因子(ProTIA)組成物のT細胞活性化マーカーおよびサイトカイン放出アッセイ
サイトカインの抗EpCAM×抗CD3 ProTIA誘導発現を測定するために、アッセイウェルあたり1×10個の精製CD3+細胞を、2×10個のSK−OV−3細胞(すなわち、エフェクター対標的比5:1)と共に、96ウェル丸底プレートにおいて最終全量200μLで抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの存在下で同時培養した。37℃、5%CO湿潤インキュベータ内で20時間インキュベーション後、細胞上清をサイトカイン測定のために採取した。このアッセイはまた、HCT−116、Kato III、MDA−MB−453、MCF−7、MKN45、MT3、NCI−N87、SK−Br−3、SW480、OVCAR3、およびPC3細胞株から選択される他の標的細胞ならびに精製CD3+細胞の代わりにPBMCについても実施することができる。
細胞培養上清に分泌されたインターロイキン(IL)−2、IL−4、IL−6、IL−10、腫瘍壊死因子(TNF)−アルファおよびインターフェロン(IFN)−ガンマのサイトカイン分析を、ヒトTh1/Th2サイトカイン細胞測定ビーズアレイ(CBA)キット(BD Biosciences、カタログ番号550749)を使用して、製造元の説明書に従って定量した。ProTIAの非存在下では、精製CD3+細胞からバックグラウンドを超えるサイトカイン分泌は予想されない。EpCAM陽性標的細胞および精製CD3+細胞の存在下でのProTIAは、T細胞を活性化して、IFN−ガンマおよびTNF−アルファなどのTh1サイトカインの比率が高いT細胞サイトカインパターンを分泌すると予想される。
予想されるように、抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、評価した全てのサイトカイン(IL−2、IL−4、IL−6、IL−10、TNF−アルファ、IFN−ガンマ)の強い分泌を誘導した(図50〜52を参照されたい)。SK−OV−3細胞およびプロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAによって精製CD3+細胞を刺激すると、特に試験したサイトカインの全てに関して20pMより高い濃度で有意なサイトカイン発現を誘発した。これに対し、IL−2、IL−4、IL−6、IL−10、TNF−アルファおよびIFN−ガンマのベースラインレベルは、インタクトな非切断型抗EpCAM×抗CD3 ProTIA分子を8〜200pM(EC50は4.3nM)の濃度範囲で使用した場合に検出された。さらに、試験した全てのサイトカインのベースラインレベルは、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIA分子を40pM〜1nMの濃度範囲で使用した場合に検出された。これらのデータは、インタクトなProTIA組成物のXTENポリマーが、かなりの遮蔽効果をもたらし、EpCAM×抗CD3部分が組成物から放出されるプロテアーゼ処置ProTIAと比較してCD3+T細胞刺激サイトカイン応答を妨害することを示唆する。
(実施例16)抗EpCAM×抗CD3プロテアーゼ誘発免疫活性化因子(ProTIA)組成物のCD3結合特異性
ProTIAは二特異的標的化組成物であることから、抗EpCAM×抗CD3 ProTIA組成物の結合能をヒトCD3に対する結合親和性に関しても評価した。これは、CD3εδ/ペルオキシダーゼコンジュゲートプロテインLサンドイッチELISAによって決定した。このELISAにおいて、組換えヒトCD3(rhCD3εδ)(Creative BioMart、カタログ番号CD3E&CD3D−219H)を96ウェル平底プレートに0.025μg/100μLの濃度でコーティングした。4℃で一晩インキュベーション後、アッセイプレートを洗浄して、3%ウシ血清アルブミン(BSA)によって室温で1時間ブロックした。プレートを再度洗浄後、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1484)、プロテアーゼ処置およびプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1476)の用量範囲を導入した。3つ全てのバージョンのProTIAに関して利用した用量範囲は、開始濃度100nMから1:6倍連続希釈スキームによって達成される0.002〜100nMであった。プレートを室温で1時間振盪させながらインキュベートして、非切断性、プロテアーゼ切断型、およびプロテアーゼ非処置ProTIAを、プレート上にコーティングしたrhCD3εδに結合させた。非結合成分を洗浄ステップで除去して、ペルオキシダーゼコンジュゲートプロテインL(ThermoFisher Scientific、カタログ番号32420)の0.05μg/100μLを添加した。適切なインキュベーション期間の後、任意の非結合試薬を洗浄ステップによって除去した後、テトラメチルベンジジン(TMB)基質を各ウェルに添加した。所望の色強度に達した後、0.2N硫酸を添加して反応を停止させ、分光光度計を使用して450nmでの吸光度(OD)を測定した。色の強度は、rhCD3εδ/プロテインLサンドイッチELISAによって捕捉された非切断性、プロテアーゼ処置、および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの濃度に比例する。産生された色の強度(測定されたOD)をタンパク質濃度に対してプロットし、半最大応答を生じる非切断性、プロテアーゼ切断型、および非切断型抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの濃度(EC50)を、GraphPad prismソフトウェアを使用して4パラメーターロジスティック回帰式から誘導した。
結果:図53に示すように、プロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、非切断性抗EpCAM×抗CD3二特異的ProTIA分子と類似の結合活性を有し、それぞれ、1800pMおよび2200pMのEC50を担持した。プロテアーゼ処置ProTIAは、インタクトなプロテアーゼ非処置二特異的分子または非切断性ProTIA分子と比較してrhCD3εδリガンドに関して310pMのEC50で最も強い結合活性を有した。XTEN864ブロッキング部分が抗CD3scFv部分の直後に位置することから、XTEN864は、そのリガンドに対する非切断型抗CD3実体の結合に、ProTIAの切断型および放出された抗CD3scFv部分のCD3リガンドへの結合と比較して約5.8倍の妨害をもたらす。
(実施例17)抗EpCAM×抗CD3プロテアーゼ誘発免疫活性化因子(ProTIA)組成物の結合特異性
抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1476)の結合特異性を、標的抗原/ビオチンコンジュゲートプロテインLサンドイッチELISAにおいて、対照ProTIA組成物抗CEA×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1432)および抗HER2×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1408)と共に評価した。抗CEA×抗CD3 ProTIA(AC1432)および抗HER2×抗CD3 ProTIA(AC1408)は両方とも、標的化成分が異なるにもかかわらず、抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(AC1476)と同じ抗CD3scFv成分を担持する。ELISA結合アッセイにおいて、組換えヒトEpCAM(rhEpCAM)(R&D Systems、カタログ番号960−EP−50)、組換えヒトCEA(Abcam、カタログ番号ab742)、および組換えヒトHER2(AcroBiosystems、カタログ番号HE2−H525)を0.1μg/100μLの濃度で96ウェル平底プレートにコーティングした。4℃で一晩インキュベーション後、アッセイプレートを洗浄して、3%ウシ血清アルブミン(BSA)によって室温で1時間ブロックした。プレートを再度洗浄後、プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1476)の用量範囲(0.0007〜0.5nM、0.5nMの開始濃度から1:3倍連続希釈スキームによって達成される)を、EpCAMコーティングウェル、CEAコーティングウェル、およびHER2コーティングウェルに導入した。対照として、プロテアーゼ処置抗CEA×抗CD3 ProTIA(AC1432)をCEAコーティングウェルに類似の用量範囲で導入し、プロテアーゼ処置抗HER2×抗CD3 ProTIA(AC1408)も同様に、HER2コーティングウェルに類似の用量範囲で導入した。プレートを室温で1時間振盪させながらインキュベートし、様々なプロテアーゼ切断型ProTIAを、プレート上にコーティングしたそれぞれの抗原に結合させた。非結合成分を洗浄ステップで除去して、ビオチンコンジュゲートプロテインL(ThermoFisher Scientific、カタログ番号29997)を0.05μg/100μLで添加した。適切なインキュベーション期間の後、任意の非結合試薬を洗浄ステップで除去した後、テトラメチルベンジジン(TMB)基質を各ウェルに添加した。所望の色強度に達した後、0.2N硫酸を添加して反応を停止させ、分光光度計を使用して450nmで吸光度(OD)を測定した。色の強度は、プレート上にコーティングした適切な抗原によって捕捉されたそれぞれのプロテアーゼ処置ProTIAの濃度に比例する。産生された(測定されたOD)色の強度をProTIA濃度に対してプロットして、それぞれの用量曲線を、GraphPad prismソフトウェアを使用して4パラメーターロジスティック回帰式によって誘導した。
結果:図54(および図24の結果と同等)に示すように、プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プレート上にコーティングしたrhEpCAMに用量依存的に結合して、110pMのEC50を生じる。同様に、プロテアーゼ処置抗CEA×抗CD3 ProTIAは、プレート上にコーティングしたCEA抗原に用量依存的に結合し、70pMのEC50を生じ、プロテアーゼ処置抗HER2×抗CD3 ProTIAは、プレート上にコーティングしたHER2抗原に用量依存的に結合し、47pMのEC50を生じる。重要なことに、プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAに関して、プレート上にコーティングしたCEAおよびHER2抗原の両方への結合対する用量依存的結合は観察されず、プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAがEpCAMに特異的に結合するがCEAまたはHER2抗原には結合しないことを示している。このように、組成物は、その標的リガンドに対する特異的結合親和性を示し、非特異的結合を示さなかった。
(実施例18)早期処置SW480モデルにおいてインタクトな抗EpCAM×抗CD3 ProTIA対非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの抗腫瘍特性
腫瘍環境における抗EpCAM×抗CD3 ProTIA分子(例えば、AC1476)に遺伝子操作された放出断片(RS)のプロテアーゼ感受性をまた、SW480/PBMC接種NOD/SCID異種移植片モデルにおいて、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1484)、プロテアーゼ処置およびプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1476)と共にin vivoで評価した。実施例10および13に記載される試験と同様に、SW480/PBMC接種(0日目とする)の1時間後に、コホート1のマウスにビヒクル(PBS_0.05%Tween80)、コホート2に0.21mg/kgプロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、コホート3に0.5mg/kgインタクトな抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、およびコホート4に0.49mg/kg非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAを注射した。全てのコホート(すなわち、1〜4)を、1日目〜4日目まで1日に投与される追加の4用量によってさらに処置した。腫瘍の体積、体重、および臨床観察を目標の35日間に週に2回モニターする。
図55に示すように、プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの0.21mg/kg(コホート2)、インタクトな抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの0.5mg/kg(コホート3)、および非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの0.49mg/kg(コホート4)は全て治療的に活性であると決定され、腫瘍増殖阻害指数(%TGI)はそれぞれ、93%、95%、および80%である。このように、等モル濃度で投薬すると、インタクトな抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、腫瘍濃縮プロテアーゼによって、高度に活性な放出された抗EpCAM×抗CD3(XTEN部分に連結していない)へと有効に切断され、プロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAと同等の腫瘍退縮効能を示す。予想されるように、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、腫瘍進行の阻害において有効であるが、インタクトな抗EpCAM×抗CD3 ProTIAほど有効ではなく、放出断片の存在が、抗EpCAM×抗CD3結合ドメインの放出を可能にすることによって、組成物の治療効能を改善することを示している。
図56に示すように、SW480異種移植片モデルにおいて何らかの体重減少がコホート2および3において観察され、何らかの起こりうる毒性を示唆した。最少有効用量、投薬回数の低減、および確立された腫瘍モデルにおける評価を評価するさらなる実験は、この最初の知見をさらに解明するであろう。
(実施例19)OVCAR−3卵巣モデルにおける抗EpCAM×抗CD3プロテアーゼ誘発免疫活性化因子(ProTIA)組成物の抗腫瘍特性
抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのin vivo効能をまた、重度免疫欠損のNSG(NOD.Cg−Prkdcscid.IL2rgtm1Wjl/SzJ)またはNOG(NOD/Shi−scid/IL−2Rγnull)マウスに腹腔内に移植したヒト卵巣OVCAR−3細胞株を使用して評価する。NOGおよびNSGマウスは、T、B、NK細胞の欠損ならびにマクロファージ、樹状細胞、および補体系の機能障害を特徴付けられる。簡単に説明すると、0日目に、1群あたりNOGまたはNSGマウス5匹の7つのコホートに、5〜10×10個のOVCAR−3細胞を腹腔内に移植した後、5〜10×10個のPBMCを14日目に静脈内に導入した。16日目に処置を開始し、コホート1にビヒクル(PBS+0.05%Tween80)を毎日5用量(qdx5)、コホート2に0.21mg/kgプロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAをqdx5、コホート3に1.05mg/kgプロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAを週に1回(qw)、コホート4に0.5mg/kgプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAをqdx5、コホート5に2.5mg/kgプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAをqw、コホート6に0.49mg/kg非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAをqdx5、およびコホート7に2.45mg/kg非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAをqwで注射する。全てのコホートを、翌週に別の処置サイクルに供する。マウスを行動および生存に関して毎日モニターし、体重および腹部膨満に関して週に2回モニターする。腫瘍発達の兆候としてCA125を決定するために血液を、30日、40日、50日、および60日目に収集した。動物の体重が0日目から30%増加すると、動物は、試験評価項目を満たすと定義され、屠殺して剖検する。
OVCAR−3腫瘍の増殖は、体重の増加、腹部直径の増加、および循環中のCA125レベルの増加によってモニターする腹腔内の腹水の発生によって証明する。プロテアーゼ切断型およびプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1476)の両方によって、生存が改善し、腹水形成の非存在または遅延が起こると予想される。同様に、プロテアーゼ非処置ProTIAは、プロテアーゼ処置ProTIAより良好な治療的曝露を有し、それによってより有効な抗腫瘍効果およびより良好な安全性プロファイルが得られると予想される。非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAはまた、腫瘍の増殖を遅らせるが、その程度は、放出断片を担持するプロテアーゼ非処置およびプロテアーゼ処置ProTIAによって証明されるより非常に小さいと予想される。
(実施例20)OVCAR−3卵巣モデルにおける抗EpCAM×抗CD3プロテアーゼ誘発免疫活性化因子(ProTIA)組成物のPK特性
プロテアーゼ切断型、プロテアーゼ非処置および非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのPKおよび生体分布プロファイルを、OVCAR−3腫瘍を担持するBALB/cヌードマウスにおいて独立して金属標識した分子の混合物として評価する。それぞれの放射線照射BALB/cヌードマウスに対して、1000万個のOVCAR−3細胞を0日目に腹腔に注射する。腹部膨満が肉眼で観察されると、および/または動物の体重が0日目から10〜15%増加すると、処置を開始する。OVCAR−3腫瘍を担持する20匹のマウスのうち、18匹を選択して、個々の体重に従って、1群あたり動物9匹の2群に無作為化する。1群のマウス9匹に金属1標識プロテアーゼ切断型抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、金属2標識プロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA、および金属3標識非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの等モル濃度を含む混合物1.5mg/kgを静脈内注射する。他の群の動物9匹に同じProTIA混合物1.5mg/kgを腹腔内投与する。
同じ群(すなわち、静脈内および腹腔内投与群)の動物間で交替して採取することにより、血液を頸静脈/上顎静脈穿刺によってヘパリンリチウム試験管に、試験物質の投与後0.5時間、4時間、8時間、24時間、48時間、3日、5日、および7日目に収集する。血液を1300g、4℃で10分間遠心分離することによって血漿に処理し、分析するまで−80℃で保存する。
腹水を静脈内および腹腔内投与群の両方から、同じ群の動物で交替して採取することにより、試験物質の投与後4時間、8時間、24時間、48時間、3日、5日、および7日目に収集する。腹水試料を直ちに300g、4℃で10分間遠心分離して、液体成分を分析するまで−80℃で凍結する。
各群3匹のマウスは、3、5、および7日目に終了する。臓器(脳、心臓、肝臓、肺、脾臓、および膵臓)および腹腔中の腫瘍の結節を採取して、重量を測定し、瞬間凍結して、分析を実施するまで−80℃で保存する。
全ての試料(血液、腹水、正常な臓器および腫瘍組織)を、ICP−MS(誘導結合プラズマ質量分析法)によって分析する。静脈内アームでは、3つ全てのProTIAの少量が腹水に検出されると予想される。血漿成分において、金属2標識プロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAおよび金属3標識非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、金属1標識プロテアーゼ切断型抗EpCAM×抗CD3 ProTIAより長い全身半減期を証明すると予想される。腹腔内アームでは、3つ全てのProTIAバージョンが腹水中に検出可能であると予想され、金属2標識プロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAおよび金属3標識非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、金属1標識プロテアーゼ切断型抗EpCAM×抗CD3 ProTIAと比較して腹腔中でより長い保持時間を有すると予想される。同様に、金属2標識プロテーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、腫瘍が負荷された腹腔内環境に見出されるプロテアーゼによる切断により、金属3標識非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAより短い腹腔内半減期を有すると予想される。金属2標識プロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAおよび金属3標識非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、初期の時点では血漿中にほとんど検出されず、腹腔内投与された分子の全身循環への漏出がほとんどないことを示している。3つ全てのProTIAバージョンは、腹腔から摘出された腫瘍結節に存在するが正常な臓器には存在しないと予想される。
(実施例21)SK−OV−3卵巣モデルにおける抗EpCAM×抗CD3プロテアーゼ誘発免疫活性化因子(ProTIA)組成物の抗腫瘍特性
抗EpCAM×抗CD3 ProTIAのin vivo効能をまた、重度免疫欠損NSG(NOD.Cg−Prkdcscid.IL2rgtm1Wjl/SzJ)またはNOG(NOD/Shi−scid/IL−2Rγnull)マウスの腹腔内に移植したヒト卵巣SK−OV−3細胞株を使用して評価する。NOGおよびNSGマウスは、T、B、およびNK細胞の欠損、ならびにマクロファージ、樹状細胞、および補体系の機能障害によって特徴付けられる。簡単に説明すると、0日目に、1群あたり5匹のNOGまたはNSGマウスの7つのコホートに、5〜10×10個のSK−OV−3細胞を腹腔内に移植した後、5〜10×10個のPBMCを5日目に腹腔内に導入する。7日目に処置を開始し、コホート1にビヒクル(PBS+0.05%Tween80)を毎日5用量(qdx5)、コホート2に0.21mg/kgプロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAをqdx5、コホート3に1.05mg/kgプロテアーゼ処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAを週に1回(qw)、コホート4に0.5mg/kgプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAをqdx5、コホート5に2.5mg/kgプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAをqw、コホート6に0.49mg/kg非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAをqdx5、およびコホート7に2.45mg/kg非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAをqwで注射した。マウスを行動および生存に関して毎日、体重および腹部膨満に関して週に2回モニターする。動物の体重が0日目から30%増加すると、動物は、試験評価項目を満たすと定義され、屠殺して剖検する。
SK−OV−3の増殖は、体重の増加および腹部直径の増加によってモニターする腹腔内の腹水の発生によって証明する。プロテアーゼ切断型およびプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA(例えば、AC1476)の両方によって、生存が改善し、腹水が存在しないかまたは腹水形成が遅れると予想される。同様に、プロテアーゼ非処置ProTIAは、プロテアーゼ処置ProTIAより良好な治療的曝露、より有効な抗腫瘍効果およびより良好な安全性プロファイルを与えると予想される。非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAもまた、腫瘍の増殖を遅らせるが、その程度は、放出断片を担持するプロテアーゼ非処置ProTIAおよびプロテアーゼ処置ProTIAによって示されるより非常に小さいと予想される。
(実施例22)ヒト悪性腹水試料中の抗EpCAM×抗CD3プロテアーゼ誘発免疫活性化因子(ProTIA)組成物の成績
ヒト悪性腹水を、進行、再発、または難治性の卵巣(腺癌および膠様)、結腸直腸、胃、胆管/胆管細胞癌、ファーター膨大部、膵臓癌および非明細胞腎臓癌患者を含むがこれらに限定されるわけではない、原発性腹腔内EpCAM陽性上皮悪性疾患を有する患者から収集する。試料収集前30日以内に化学療法、免疫療法、生物および/またはコルチコステロイド療法を受けている患者は除外する。悪性腹水を300〜400g、室温で10分間遠心分離して、液体および沈降成分を採取した。液体成分中のMMP−9、MMP−2、マトリプターゼおよびuPAを含むがこれらに限定されるわけではないヒトプロテアーゼの濃度を、市販のELISAキット(ヒトMMP−9、Invitrogenカタログ番号KHC3061または同等物;ヒトMMP−2、Invitrogenカタログ番号KHC3081または同等物;ヒトマトリプターゼ、Enzo、カタログ番号ADI−900−221;およびヒトuPA、Abcam、カタログ番号119611)を使用して、製造元の説明書に従って定量する。腹水液に見出されるプロテアーゼによるインタクトな抗EpCAM×抗CD3(例えば、AC1476)の切断速度を、既知濃度のProTIAを腹水液成分に添加して、37℃で混合物をインキュベートし、表記の時点、0.5時間、2時間、4時間、8時間、24時間、48時間、3日、4日、5日、および7日にアリコートを採取することによって決定する。それぞれの時点に存在するインタクトな抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの量を、標準物質としてインタクトな抗EpCAM×抗CD3によるrhEpCAM/ビオチン化抗XTENサンドイッチELISAによって分析する。
簡単に説明すると、ELISAプレート(Nunc Maxisorp、カタログ番号442404)を、ウェルあたり0.1μg/100μLのrhEpCAM(R&D Systems、カタログ番号EHH104111)でコーティングする。4℃で一晩インキュベーション後、ELISAプレートを洗浄して、3%BSAによって室温で1時間ブロックする。プレートを再度洗浄後、インタクトなプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIA標準物質の用量範囲、適切な品質対照、およびProTIA添加腹水試験試料を適切に添加する。プレートを室温で1時間振盪させながらインキュベートして、ProTIA標準物質、品質対照、および試験試料を、プレート上にコーティングしたrhEpCAMに結合させる。非結合成分を数回の洗浄によって除去する。ビオチン化抗XTEN抗体(Amunix所有の抗体)を、0.1μg/100μLで添加して、プレートを室温で1時間インキュベートした。非結合のビオチン化試薬を洗浄して除去した後、ストレプトアビジン−HRP(ThermoFisher Scientific、カタログ番号21130)を1:30,000希釈で添加し、プレートを室温で1時間インキュベートする。数回洗浄後、TMB基質を各ウェルに添加する。所望の色強度に達した後、0.2N硫酸を添加して反応を停止させ、分光光度計を使用して450nmで吸光度(OD)を測定する。色の強度は、rhEpCAM/ビオチン化抗XTENサンドイッチELISAによって捕捉されたインタクトなProTIAの濃度に比例する。腹水試験試料中に存在するインタクトなProTIAの濃度を、SoftMax Proソフトウェアを使用してインタクトなProTIA標準曲線に対して決定する。rhEpCAM/ビオチン化抗XTENサンドイッチELISAにおいて検出されたインタクトなProTIAの減少速度(すなわち、半減期)を、Graphpad prismを使用して決定する。
腹水の沈降物を、EpCAM、CD3、CD4、CD8、CA125、およびCD56発現に関して表現型を決定する。EpCAMおよびCD3に関して試験陽性である悪性腹水試料を、プロテアーゼ処置およびプロテアーゼ非処置ProTIAの細胞傷害性の分析に使用する。簡単に説明すると、1×10個の腹水細胞を、適当量の腹水液で復元して、24ウェルプレートにおいて3回の反復で24時間接着させる。細胞を、プロテアーゼ処置およびインタクトな抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの用量濃度で48時間処置した後、製造元の指示通りに(Promega Caspase−Glo 3/7、カタログ番号G8091)発光性カスパーゼ3/7基質を使用してカスパーゼ3/7の定量を行う。発光シグナルはカスパーゼ3/7活性に比例することから、プロテアーゼ処置および非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの用量濃度を、次に発光シグナルに対してプロットして、半最大応答を生じるタンパク質濃度(EC50)を、GraphPad prismソフトウェアを使用して4パラメーターロジスティック回帰式によって誘導する。進行、再発、および難治性EpCAM陽性がん患者に由来するヒト悪性腹水は、インタクトな抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの、強い細胞傷害活性を発揮する非XTEN化抗EpCAM×抗CD3部分への切断およびその後の活性化にとって全ての必要な成分を含むことが予想される。腫瘍除去の兆候としてのEpCAM陽性細胞の数の減少およびT細胞活性化を反映するCD69およびグランザイムなどのT細胞活性化マーカーの増加も同様に予想される。
(実施例23)抗EpCAM×抗CD3プロテアーゼ誘発免疫活性化因子(ProTIA)組成物のカスパーゼ3/7アッセイ
抗EpCAM×抗CD3 ProTIA組成物のリダイレクト細胞傷害性も同様に、アポトーシス細胞のカスパーゼ3/7活性によって評価した。上記のLDH細胞傷害性アッセイと同様に、PBMCまたは精製CD3陽性T細胞を、SW480、SK−OV−3、およびOVAR−3細胞などのEpCAM陽性腫瘍標的細胞とエフェクター5対標的1、HCT−116と10:1の比で混合し、3つ全てのProTIAバージョンを、上記のようにLDHアッセイにおいて12ポイントの5倍連続希釈の用量濃度で試験した。
細胞の溶解時、培養上清に放出されたカスパーゼ3/7を、「グロータイプ」の発光シグナルを生成するカスパーゼ3/7による発光性のカスパーゼ3/7基質切断量によって測定した(Promega Caspase−Glo 3/7、カタログ番号G8091)。発光の量はカスパーゼ活性の量に比例する。
予想されるように、SK−OV−3、OVCAR−3、HCT−116、およびSW480腫瘍細胞株においてプロファイルを調べたプロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、および非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAの活性の傾向は、LDHアッセイ分析で観察された活性と一致することが見出された。ヒトPBMCによるSK−OV−3卵巣細胞の細胞傷害性死滅において、非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ処置ProTIAより活性が12倍低く(EC50は、140pM対12pM)、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ切断型ProTIAより活性が390倍低い(EC50は、4700pM対12pM)(図57)。PBMCによるOVCAR−3卵巣細胞の細胞傷害性死滅において、プロテアーゼ非切断型抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ処置ProTIAより活性が4倍低く(EC50は、9.8pM対2.5pM)、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ切断型ProTIAより活性が420倍低い(EC50は、1043pM対2.5pM)(図58)。PBMCによるHCT−116結腸直腸細胞の細胞傷害性死滅において、プロテアーゼ処置およびインタクトなプロテアーゼ非処置抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、ほぼ類似の活性を有し(EC50は、1.8pM対3.6pM)、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ切断型ProTIAより活性が130倍低い(EC50は、240pM対1.8pM)(図59)。PBMCによるSW480結腸直腸細胞の細胞傷害性死滅において、プロテアーゼ処置およびプロテアーゼ非切断型抗EpCAM×抗CD3 ProTIAもまた、類似の活性を証明し(EC50は、2pM対1pM)、非切断性抗EpCAM×抗CD3 ProTIAは、プロテアーゼ切断型ProTIAより活性が70倍低い(EC50は、148pM対2pM)(図60)。結果は、非切断性ProTIAが、非XTEN化抗EpCAM×抗CD3部分より一貫して活性が低いことを証明した。使用した細胞株に応じて、インタクトなプロテアーゼ非処置ProTIAの活性は、プロテアーゼ切断型ProTIAと比較して類似から12倍低い活性までの範囲で変化し、アッセイ混合物において腫瘍細胞および/または活性化CD3陽性T細胞から放出されると仮定されるプロテアーゼに対する放出断片の感受性の程度の差を示唆している。
(実施例24)様々なプロテアーゼを使用した、AC1476 aEpCAM−aCD3−BSRS1−XTEN_AE864−His(6)のタンパク質溶解切断
実験は、実施例3に既に記載したaEpCAM−aCD3−BSRS1−XTEN_AE864−His(6) AC1476が、MMP−2、MMP−9、および好中球エラスターゼを含む多数の腫瘍関連プロテアーゼによってin vitroで切断されうることを証明するために実施した。
1.酵素の活性化
使用した酵素は全て、R&D Systemsから得た。組換え好中球エラスターゼおよび組換えヒトマトリプターゼは、活性化酵素として提供され、使用するまで−80℃で保存した。組換えマウスMMP−2および組換えマウスMMP−9は、酵素前駆体として供給され、酢酸4−アミノフェニル水銀(APMA)による活性化を必要とした。APMAを最初に、0.1M NaOHに、最終濃度10mMとなるように溶解後、pHを0.1N HClを使用して中性に再調節した。APMA保存液の2.5mMへのさらなる希釈は、50mM Tris、150mM NaCl、10mM CaCl2、pH 7.5中で行った。プロMMPを活性化するために、1mM APMAおよび100μg/mLプロMMPを37℃で1時間(MMP−2)または3時間(MMP−9)インキュベートした。グリセロールを、最終濃度50%となるように活性化酵素に添加して、その後それぞれを−20℃で保存した。
2.酵素の消化
酵素のパネルを使用して、AC1476 aEpCAM−aCD3−BSRS1−XTEN_AE864−His(6) ProTIA組成物を消化した。10μMの基質組成物を、それぞれの酵素と共に以下の酵素対基質モル比:MMP−2(1:200)、MMP−9(1:2000)、マトリプターゼ(1:12.5)および好中球エラスターゼ(1:1000)で個々にインキュベートした。反応を37℃で2時間インキュベートした後、ゲルローディング色素および80℃での加熱によって消化を停止させた。
3.切断の分析
非消化および消化材料5μgをSDS−PAGEにロードして、クマシーブルーで染色することにより試料の分析を実施した。BSRS−1放出断片でそれぞれのプロテアーゼによって処置すると、基質は、SDS−PAGEゲルにおいて検出可能な2つの断片を生じ、小さい断片はaEpCAM−aCD3(結合ドメインを有する活性化第1の部分の形態)を含み、他方は放出されたXTENバルキング部分を含み、インタクト型よりSDS−PAGE上でわずかに低い見かけの分子量で移動する。放出されたXTENを同様に消化する好中球エラスターゼに関して、活性化型ならびに他のより小さい断片がゲルにおいて観察されたが、後者は配列に沿った様々な位置でのXTENの切断が原因であった。結果は、試験した全てのプロテアーゼが、意図されるように構築物を切断し、結合ドメインを放出させたことを確認する。
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670
Figure 0006913670

Claims (12)

  1. 第1の部分、第2の部分、3の部分、第4の部分および第5の部分を含むキメラポリペプチドアセンブリー構築物であって、
    a.前記第1の部分が、
    i.標的細胞特異的マーカーに対する結合特異性を有する第1の結合ドメイン;および
    ii.エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第2の結合ドメインを含み;
    b.前記第2の部分が、1つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼにより切断され得るペプチジル放出セグメント(RS)を含み;
    c.前記第3の部分が、バルキング部分を含み、前記バルキング部分は、表5に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有することを特徴とする延長組換えポリペプチドであり;
    前記第3の部分のバルキング部分が、前記第2の部分に対する前記哺乳動物プロテアーゼの作用によって前記第1の部分から放出され得、
    d.前記第4の部分が、1つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼにより切断され得るペプチジルRSを含み;
    e.前記第5の部分が、バルキング部分を含み、前記第5の部分のバルキング部分は、表5に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有することを特徴とする延長組換えポリペプチドであり;
    前記キメラポリペプチドアセンブリー構築物が、N末端からC末端に向かって以下の構造:
    (第5の部分)−(第4の部分)−(第1の部分)−(第2の部分)−(第3の部分)
    を有する、キメラポリペプチドアセンブリー構築物
  2. 前記第1の結合ドメインおよび前記第2の結合ドメインがそれぞれscFvである、請求項1に記載のキメラポリペプチドアセンブリー構築物。
  3. 前記第1の結合ドメインが、前記標的細胞特異的マーカーに結合することができるモノクローナル抗体に由来するVHおよびVL領域を含み、
    前記標的細胞特異的マーカーが、アルファ4インテグリン、Ang2、B7−H3、B7−H6、CEACAM5、cMET、CTLA4、FOLR1、EpCAM、CCR5、CD19、HER2、HER2 neu、HER3、HER4、HER1(EGFR)、PD−L1、PSMA、CEA、MUC1(ムチン)、MUC−2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16、βhCG、Lewis−Y、CD20、CD33、CD38、CD30、CD56(NCAM)、CD133、ガングリオシドGD3;9−O−アセチル−GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、GD2、炭酸脱水酵素IX、CD44v6、Sonic Hedgehog(Shh)、Wue−1、形質細胞抗原1、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、CCR8、前立腺の6回膜貫通上皮抗原(STEAP)、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、Ly−6、デスモグレイン4、胎児アセチルコリン受容体(fnAChR)、CD25、がん抗原19−9(CA19−9)、がん抗原125(CA−125)、ミュラー管抑制物質受容体II型(MISIIR)、シアル化Tn抗原(s TN)、線維芽細胞活性化抗原(FAP)、エンドシアリン(CD248)、上皮増殖因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)、腫瘍関連抗原L6(TAL6)、SAS、CD63、TAG72、Thomsen−Friedenreich抗原(TF抗原)、インスリン様増殖因子I受容体(IGF−IR)、Cora抗原、CD7、CD22、CD70、CD79a、CD79b、G250、MT−MMP、F19抗原、CA19−9、CA−125、アルファ−フェトタンパク質(AFP)、VEGFR1、VEGFR2、DLK1、SP17、ROR1、およびEphA2からなる群から選択される、請求項1又は2に記載のキメラポリペプチドアセンブリー構築物
  4. 前記第1の結合ドメインおよび前記第2の結合ドメインが、表8および表9に記載される配列群から選択される可撓性ポリペプチドリンカーによって連結されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー構築物。
  5. 前記第2の部分のRSが、表3に記載されるプロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼによって切断され得るアミノ酸配列を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー構築物。
  6. 前記第2の部分のRSが、MMP−11によって切断され得るアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー構築物。
  7. 前記第2の部分のRSが、MMP−2、MMP−9、uPA、およびマトリプターゼからなる群から選択される少なくとも2つのプロテアーゼのための基質である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー構築物。
  8. 前記第2の部分のRS配列が、複数の哺乳動物プロテアーゼにより複数の切断部位で切断されるように操作されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー構築物。
  9. 前記標的細胞特異的マーカーに対する前記第1の結合ドメインの結合親和性が、前記エフェクター細胞抗原に対する前記第2の結合ドメインの結合親和性と比較して、in vitroアッセイにおいてK d 定数によって測定された場合に、少なくとも一桁大きい、請求項1〜のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー構築物
  10. 前記第1の結合ドメインが、VL領域およびVH領域を有するscFvを含み、前記VL領域が、前記VH領域のN末端に位置している、請求項1〜9のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー構築物。
  11. 前記第2の結合ドメインが、VL領域およびVH領域を有するscFvを含み、前記VL領域が、前記VH領域のN末端に位置している、請求項1〜10のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー構築物。
  12. 疾患を処置する方法にて使用するための、請求項1〜11のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー構築物を含む医薬組成物であって、
    前記方法が、治療有効用量を使用する1つまたは複数の連続用量を含む処置レジメンに任意選択で従って、前記疾患を有する対象に前記医薬組成物または前記キメラポリペプチドアセンブリー構築物を投与する工程を含み、
    前記疾患が、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん(gastric cancer)、食道がん、胃がん(stomach cancer)、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性新生物障害、または骨髄異形成障害を含む原発性血液悪性腫瘍、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、およびグッドパスチャー症候群からなる群から任意選択的に選択される、医薬組成物
JP2018510735A 2015-08-28 2016-08-26 キメラポリペプチドアセンブリーならびにそれを作製および使用する方法 Active JP6913670B2 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021115243A JP2021178831A (ja) 2015-08-28 2021-07-12 キメラポリペプチドアセンブリーならびにそれを作製および使用する方法
JP2024065385A JP2024105275A (ja) 2015-08-28 2024-04-15 キメラポリペプチドアセンブリーならびにそれを作製および使用する方法

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562211532P 2015-08-28 2015-08-28
US62/211,532 2015-08-28
US201562263319P 2015-12-04 2015-12-04
US62/263,319 2015-12-04
US201662278755P 2016-01-14 2016-01-14
US62/278,755 2016-01-14
US201662338285P 2016-05-18 2016-05-18
US62/338,285 2016-05-18
US201662363046P 2016-07-15 2016-07-15
US62/363,046 2016-07-15
US201662379673P 2016-08-25 2016-08-25
US62/379,673 2016-08-25
PCT/US2016/049137 WO2017040344A2 (en) 2015-08-28 2016-08-26 Chimeric polypeptide assembly and methods of making and using the same

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021115243A Division JP2021178831A (ja) 2015-08-28 2021-07-12 キメラポリペプチドアセンブリーならびにそれを作製および使用する方法

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2018533909A JP2018533909A (ja) 2018-11-22
JP2018533909A5 JP2018533909A5 (ja) 2019-10-03
JP6913670B2 true JP6913670B2 (ja) 2021-08-04

Family

ID=58188147

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018510735A Active JP6913670B2 (ja) 2015-08-28 2016-08-26 キメラポリペプチドアセンブリーならびにそれを作製および使用する方法
JP2021115243A Pending JP2021178831A (ja) 2015-08-28 2021-07-12 キメラポリペプチドアセンブリーならびにそれを作製および使用する方法
JP2024065385A Pending JP2024105275A (ja) 2015-08-28 2024-04-15 キメラポリペプチドアセンブリーならびにそれを作製および使用する方法

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021115243A Pending JP2021178831A (ja) 2015-08-28 2021-07-12 キメラポリペプチドアセンブリーならびにそれを作製および使用する方法
JP2024065385A Pending JP2024105275A (ja) 2015-08-28 2024-04-15 キメラポリペプチドアセンブリーならびにそれを作製および使用する方法

Country Status (16)

Country Link
US (4) US11713358B2 (ja)
EP (2) EP3341009A4 (ja)
JP (3) JP6913670B2 (ja)
KR (1) KR20180038560A (ja)
CN (1) CN108135968A (ja)
AU (2) AU2016315656A1 (ja)
CA (1) CA2992306A1 (ja)
CL (1) CL2018000543A1 (ja)
EA (1) EA038329B1 (ja)
HK (1) HK1257218A1 (ja)
IL (2) IL307276A (ja)
MX (1) MX2018002226A (ja)
PE (1) PE20181275A1 (ja)
TW (2) TWI835006B (ja)
WO (1) WO2017040344A2 (ja)
ZA (2) ZA201800570B (ja)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112016018100A2 (pt) 2014-02-07 2018-02-20 Univ Mcmaster acoplador antigênico de células t trifuncional, métodos e usos do mesmo
CA2992306A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Amunix Operating Inc. Chimeric polypeptide assembly and methods of making and using the same
WO2017211278A1 (en) * 2016-06-06 2017-12-14 Asclepiumm Taiwan Co., Ltd Antibody fusion proteins for drug delivery
CA3068056A1 (en) * 2017-06-22 2018-12-27 Development Center For Biotechnology Asymmetric heterodimeric fc-scfv fusion anti-globo h and anti-cd3 bispecifc antibody and uses thereof in cancer therapy
JP7227630B2 (ja) 2017-10-12 2023-02-22 マックマスター ユニバーシティー Y182t突然変異を有するt細胞-抗原カプラおよびその方法ならびに使用
AU2018393111A1 (en) * 2017-12-21 2020-07-23 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Release segments and binding compositions comprising same
CN113195544A (zh) * 2018-06-07 2021-07-30 库利南肿瘤股份有限公司 多特异性结合蛋白及其使用方法
US10640562B2 (en) 2018-07-17 2020-05-05 Mcmaster University T cell-antigen coupler with various construct optimizations
US11110123B2 (en) 2018-07-17 2021-09-07 Triumvira Immunologics Usa, Inc. T cell-antigen coupler with various construct optimizations
AR117628A1 (es) 2018-07-31 2021-08-18 Amgen Inc Formulaciones y composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de unión a antígeno enmascarada
SG11202105093RA (en) * 2018-12-21 2021-06-29 Hoffmann La Roche Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
BR112021026089A2 (pt) * 2019-06-26 2022-03-22 Amunix Pharmaceuticals Inc Fragmentos de ligação ao antígeno de cd3 e composições compreendendo os mesmos
WO2020264208A1 (en) * 2019-06-26 2020-12-30 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Egfr antigen binding fragments and compositions comprising same
US20210040174A1 (en) * 2019-08-08 2021-02-11 Navrogen, Inc. Composition and Use of Humoral Immune Suppressor Antagonists for the Treatment of Humoral Immune Suppressed Diseases
EP3819312A1 (en) * 2019-11-10 2021-05-12 Amgen, Inc Dosing regimen for anti-dll3 agents
EP4085077A4 (en) 2019-12-31 2024-01-17 Beijing QL Biopharmaceutical Co., Ltd. FUSION PROTEINS FROM GLP-1 AND GDF15 AND CONJUGATES THEREOF
WO2021139744A1 (en) 2020-01-11 2021-07-15 Beijing Ql Biopharmaceutical Co., Ltd. Conjugates of fusion proteins of glp-1 and fgf21
CN115956089A (zh) * 2020-05-04 2023-04-11 加利福尼亚大学董事会 抑制性抗enpp1抗体
KR20230042014A (ko) * 2020-06-25 2023-03-27 아뮤닉스 파마슈티컬스, 인크. 시토카인 접합체
MX2023001788A (es) 2020-08-11 2023-04-26 Janux Therapeutics Inc Composiciones y metodos de enlazadores escindibles.
EP4222176A4 (en) 2020-09-30 2024-02-28 Beijing QL Biopharmaceutical Co., Ltd. POLYPEPTIDE CONJUGATES AND METHODS OF USE
US20240009239A1 (en) * 2020-11-04 2024-01-11 Fred Hutchinson Cancer Center Therapeutic targeting of mesothelin in acute myeloid leukemia with chimeric antigen receptor t cell therapy
US20230399408A1 (en) * 2020-11-16 2023-12-14 Ab Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
AU2021388650A1 (en) * 2020-11-27 2023-06-22 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Cldn18.2 antibody and use thereof
AU2021396172A1 (en) 2020-12-09 2023-07-06 Janux Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to tumor activated antibodies targeting psma and effector cell antigens
WO2022179562A1 (en) * 2021-02-24 2022-09-01 Hangzhou Qihan Biotechnology Co., Ltd. Chimeric antigen receptors in immune cells
WO2022178751A1 (en) * 2021-02-25 2022-09-01 Shanghai Allygen Biologics Co., Ltd. Targeting conjugates comprising effector molecules and uses thereof
CA3173810A1 (en) 2021-06-01 2022-12-01 Andreas Bader Claudin 18.2 t cell-antigen couplers and uses thereof
EP4347655A1 (en) * 2021-06-04 2024-04-10 Amgen Inc. Anti-ccr8 antibodies and uses thereof
US11453723B1 (en) 2021-06-25 2022-09-27 Mcmaster University BCMA T cell-antigen couplers and uses thereof
CN113481169B (zh) * 2021-08-11 2023-06-16 南方医科大学南方医院 一种细胞激活依赖性分泌系统及应用
AU2023226005A1 (en) 2022-02-23 2024-08-29 Bright Peak Therapeutics Ag Activatable il-18 polypeptides
WO2024130032A1 (en) * 2022-12-14 2024-06-20 Evolveimmune Therapeutics, Inc. Bispecific antibody fusion molecules and methods of use thereof
WO2024150174A1 (en) 2023-01-11 2024-07-18 Bright Peak Therapeutics Ag Conditionally activated immunocytokines and methods of use
WO2024150175A1 (en) 2023-01-11 2024-07-18 Bright Peak Therapeutics Ag Conditionally activated proteins and methods of use

Family Cites Families (153)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
US4398908A (en) 1980-11-28 1983-08-16 Siposs George G Insulin delivery system
US4435173A (en) 1982-03-05 1984-03-06 Delta Medical Industries Variable rate syringe pump for insulin delivery
US4753894A (en) 1984-02-08 1988-06-28 Cetus Corporation Monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US4933185A (en) 1986-09-24 1990-06-12 Massachusetts Institute Of Technology System for controlled release of biologically active compounds
US4976696A (en) 1987-08-10 1990-12-11 Becton, Dickinson And Company Syringe pump and the like for delivering medication
US5270176A (en) 1987-11-20 1993-12-14 Hoechst Aktiengesellschaft Method for the selective cleavage of fusion proteins with lysostaphin
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
JP2717808B2 (ja) 1988-08-10 1998-02-25 テルモ株式会社 シリンジポンプ
US6225449B1 (en) 1991-10-04 2001-05-01 Washington University Hormone analogs with multiple CTP extensions
US5017378A (en) 1989-05-01 1991-05-21 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Intraorgan injection of biologically active compounds contained in slow-release microcapsules or microspheres
US5599907A (en) 1989-05-10 1997-02-04 Somatogen, Inc. Production and use of multimeric hemoglobins
US5298022A (en) 1989-05-29 1994-03-29 Amplifon Spa Wearable artificial pancreas
US5492534A (en) 1990-04-02 1996-02-20 Pharmetrix Corporation Controlled release portable pump
US5318540A (en) 1990-04-02 1994-06-07 Pharmetrix Corporation Controlled release infusion device
US5176502A (en) 1990-04-25 1993-01-05 Becton, Dickinson And Company Syringe pump and the like for delivering medication
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
JPH11507535A (ja) 1995-06-07 1999-07-06 イムクローン システムズ インコーポレイテッド 腫瘍の成長を抑制する抗体および抗体フラグメント類
SI0932399T1 (sl) 1996-03-12 2006-10-31 Pg Txl Co Lp Vodotopna paklitakselna predzdravila
US6441025B2 (en) 1996-03-12 2002-08-27 Pg-Txl Company, L.P. Water soluble paclitaxel derivatives
CA2273194C (en) 1996-12-03 2011-02-01 Abgenix, Inc. Transgenic mammals having human ig loci including plural vh and vk regions and antibodies produced therefrom
AT405516B (de) 1997-02-27 1999-09-27 Immuno Ag Faktor x-analoge mit modifizierter proteasespaltstelle
US20020173629A1 (en) 1997-05-05 2002-11-21 Aya Jakobovits Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
DE69838526T2 (de) 1998-02-05 2008-07-03 Biosense Webster, Inc., Diamond Bar Gerät zum Freisetzen eines Medikaments im Herzen
US6406632B1 (en) 1998-04-03 2002-06-18 Symyx Technologies, Inc. Rapid characterization of polymers
CZ302070B6 (cs) 1998-04-21 2010-09-29 Micromet Ag Jednoretezcový multifunkcní polypeptid, polynukleotid, vektor obsahující tento polynukleotid, bunka transfekovaná tímto polynukleotidem, prostredek obsahující tento polypeptid, polynukleotid nebo vektor a jejich použití a zpusob identifikace aktiváto
US7090976B2 (en) 1999-11-10 2006-08-15 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising Renilla GFP
US20030190740A1 (en) 1998-10-13 2003-10-09 The University Of Georgia Research Foundation, Inc Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis, and use
US7666400B2 (en) 2005-04-06 2010-02-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. PEGylation by the dock and lock (DNL) technique
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
US20030109428A1 (en) 1999-12-01 2003-06-12 John Bertin Novel molecules of the card-related protein family and uses thereof
US20050287153A1 (en) 2002-06-28 2005-12-29 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US20030228309A1 (en) 2000-11-08 2003-12-11 Theodora Salcedo Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US20030049689A1 (en) 2000-12-14 2003-03-13 Cynthia Edwards Multifunctional polypeptides
PE20020908A1 (es) 2001-03-21 2002-10-26 Cell Therapeutics Inc Produccion recombinante de polimeros polianionicos y uso de de los mismos
US7595378B2 (en) 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
BRPI0210405B8 (pt) 2001-06-13 2021-05-25 Genmab As anticorpo monoclonal humano, molécula biespecífica, método in vitro para inibir o crescimento de uma célula expressando egfr, para induzir a citólise de uma célula expressando egfr, e para detectar a presença de antígeno egfr ou uma célula expressando egfr em uma amostra, e, vetor de expressão
KR100407467B1 (ko) 2001-07-12 2003-11-28 최수봉 리모컨 방식의 인슐린 자동주사기
AU2002322394A1 (en) 2001-07-30 2003-02-17 Eli Lilly And Company Method for treating diabetes and obesity
US7125843B2 (en) 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
US20080167238A1 (en) 2001-12-21 2008-07-10 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
US20030216551A1 (en) 2002-03-08 2003-11-20 Diabetogen Biosciences Inc. Fully human anti-CD3 monoclonal antibodies
US7294513B2 (en) 2002-07-24 2007-11-13 Wyatt Technology Corporation Method and apparatus for characterizing solutions of small particles
EP1400534B1 (en) 2002-09-10 2015-10-28 Affimed GmbH Human CD3-specific antibody with immunosuppressive properties
EP2301966A1 (en) 2002-12-16 2011-03-30 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
JP4629046B2 (ja) 2003-05-14 2011-02-09 ダニスコ・ユーエス・インコーポレーテッド 反復配列タンパク質ポリマー活性剤結合体、方法および使用
US20070161087A1 (en) 2003-05-29 2007-07-12 Wolfgang Glaesner Glp-1 fusion proteins
US7919089B2 (en) 2003-05-31 2011-04-05 Micromet Ag Pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody for EpCAM
EP1629012B1 (en) 2003-05-31 2018-11-28 Amgen Research (Munich) GmbH Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd3, anti-cd19 antibody constructs for the treatment of b-cell related disorders
ATE455127T1 (de) 2003-05-31 2010-01-15 Micromet Ag Humane anti-humane cd3-bindungsmoleküle
US7498024B2 (en) 2003-06-03 2009-03-03 Cell Genesys, Inc. Compositions and methods for enhanced expression of immunoglobulins from a single vector using a peptide cleavage site
US20050152979A1 (en) 2003-09-05 2005-07-14 Cell Therapeutics, Inc. Hydrophobic drug compositions containing reconstitution enhancer
BRPI0414539B8 (pt) 2003-09-19 2021-05-25 Novo Nordisk As composto, composição farmacêutica, e, uso de um composto
AU2004283850C1 (en) 2003-10-16 2011-11-03 Amgen Research (Munich) Gmbh Multispecific deimmunized CD3-binders
EP1682106A4 (en) 2003-10-30 2008-06-11 Univ Emory MODIFIED FVIII FACTOR WITH REDUCED IMMUNOGENICITY THROUGH MUTAGENESIS OF A2 AND C2 EPITOPES
US20060026719A1 (en) 2004-01-14 2006-02-02 Kieliszewski Marcia J Methods of producing peptides/proteins in plants and peptides/proteins produced thereby
EP1729795B1 (en) 2004-02-09 2016-02-03 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US8076288B2 (en) 2004-02-11 2011-12-13 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides having glucose lowering activity
SG188175A1 (en) 2004-06-03 2013-03-28 Novimmune Sa Anti-cd3 antibodies and methods of use thereof
SI1771482T1 (sl) 2004-07-22 2014-12-31 Genentech, Inc. Sestavek HER2 protitelesa
DK2332977T3 (en) 2004-07-23 2016-02-29 Acceleron Pharma Inc ActRII receptor polypeptides
CA2580796C (en) 2004-09-24 2013-03-26 Amgen Inc. Modified fc molecules having peptides inserted in internal loop regions
EP1841787A2 (en) 2005-01-25 2007-10-10 Cell Therapeutics, Inc. Conjugates of biologically active proteins having a modified in vivo half-life
KR100727466B1 (ko) 2005-02-07 2007-06-13 주식회사 잉크테크 유기 은 착체 화합물, 이의 제조방법 및 이를 이용한박막형성방법
US8263545B2 (en) 2005-02-11 2012-09-11 Amylin Pharmaceuticals, Inc. GIP analog and hybrid polypeptides with selectable properties
JP2009507838A (ja) 2005-09-12 2009-02-26 ノビミューン エスアー 抗cd3抗体製剤
US7846445B2 (en) 2005-09-27 2010-12-07 Amunix Operating, Inc. Methods for production of unstructured recombinant polymers and uses thereof
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
EP3178850B1 (en) * 2005-10-11 2021-01-13 Amgen Research (Munich) GmbH Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
CA2633594C (en) 2005-12-16 2021-10-26 Micromet Ag Means and methods for the treatment of tumorous diseases
EP1971355B1 (en) 2005-12-20 2020-03-11 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
EP1996937A4 (en) 2006-03-06 2009-04-08 Amunix Inc GENETIC PACKS AND USES THEREOF
US7683158B2 (en) 2006-03-31 2010-03-23 Baxter International Inc. Pegylated factor VIII
WO2008049711A1 (en) 2006-10-27 2008-05-02 Novo Nordisk A/S Peptide extended insulins
AU2007317333A1 (en) * 2006-11-02 2008-05-15 Seattle Genetics, Inc. Methods of treating neoplastic, autoimmune and inflammatory diseases
KR101589759B1 (ko) 2007-04-03 2016-01-29 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 종간 특이적 cd3―입실론 결합 도메인
WO2008119567A2 (en) 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific cd3-epsilon binding domain
WO2008119566A2 (en) 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
DK2369005T3 (da) 2007-06-21 2013-06-24 Univ Muenchen Tech Biologisk aktive proteiner med forøget stabilitet in vivo og/eller in vitro
AU2008287340A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Amunix, Inc. Compositions and methods for modifying properties of biologically active polypeptides
EP2190861A4 (en) 2007-08-22 2011-03-30 Univ California ACTIVE BINDING POLYPEPTIDES AND METHOD FOR THEIR IDENTIFICATION AND USE
WO2009158704A2 (en) 2008-06-27 2009-12-30 Duke University Therapeutic agents comprising elastin-like peptides
PT2352763E (pt) 2008-10-01 2016-06-02 Amgen Res (Munich) Gmbh Anticorpos biespecíficos de cadeia única com especificidade para antigénios-alvo com elevado peso molecular
EP2370467B1 (en) 2008-10-01 2016-09-07 Amgen Research (Munich) GmbH Cross-species-specific pscaxcd3, cd19xcd3, c-metxcd3, endosialinxcd3, epcamxc d3, igf-1rxcd3 or fapalpha xcd3 bispecific single chain antibody
PT2356153T (pt) 2008-10-01 2016-07-15 Amgen Res (Munich) Gmbh Anticorpo biespecífico, de cadeia única, amepxcd3, específico interespécies
US10981998B2 (en) 2008-10-01 2021-04-20 Amgen Research (Munich) Gmbh Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
CN106995495A (zh) 2009-01-12 2017-08-01 希托马克斯医疗有限责任公司 修饰抗体组合物及其制备和使用方法
CN102348715B (zh) 2009-02-03 2017-12-08 阿穆尼克斯运营公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
US8703717B2 (en) 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
US8680050B2 (en) 2009-02-03 2014-03-25 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same
LT3912643T (lt) 2009-02-13 2023-02-10 Immunomedics Inc. Imunokonjugatai su ląstelės viduje skaldoma jungtimi
US9849188B2 (en) 2009-06-08 2017-12-26 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
CN106916229A (zh) 2009-06-08 2017-07-04 阿穆尼克斯运营公司 生长激素多肽及其制备和使用方法
NZ596778A (en) 2009-06-08 2013-11-29 Amunix Operating Inc Glucose-regulating polypeptides and methods of making and using same
AU2010290077C1 (en) 2009-08-24 2015-12-03 Bioverativ Therapeutics Inc. Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same
WO2011028344A2 (en) 2009-08-25 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Interleukin-1 receptor antagonist compositions and methods of making and using same
CN102711825A (zh) * 2009-09-18 2012-10-03 米克罗麦特股份公司 用于施用EpCAMxCD3双特异性抗体的给药方案
US20110312881A1 (en) 2009-12-21 2011-12-22 Amunix, Inc. Bifunctional polypeptide compositions and methods for treatment of metabolic and cardiovascular diseases
JP6066732B2 (ja) 2010-03-05 2017-01-25 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー 標的免疫調節抗体および融合タンパク質に基づく組成物および方法
TWI653333B (zh) 2010-04-01 2019-03-11 安進研究(慕尼黑)有限責任公司 跨物種專一性之PSMAxCD3雙專一性單鏈抗體
WO2011123830A2 (en) 2010-04-02 2011-10-06 Amunix Operating Inc. Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same
EP3372617B1 (en) 2010-04-02 2024-07-24 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same
US8828944B2 (en) 2010-04-22 2014-09-09 Institut Gustave Roussy Compounds and uses thereof to induce an immunogenic cancer cell death in a subject
JP6400470B2 (ja) 2011-05-16 2018-10-03 ジェネロン(シャンハイ)コーポレイション リミテッド 多重特異性Fab融合タンパク質および使用法
SI2717898T1 (sl) * 2011-06-10 2019-07-31 Bioverativ Therapeutics Inc. Spojine prokoagulantov in metode za njihovo uporabo
EP3431098A1 (en) 2011-09-12 2019-01-23 Amunix Operating Inc. Glucagon-like peptide-2 compositions and methods of making and using same
RS63870B1 (sr) 2012-02-15 2023-01-31 Bioverativ Therapeutics Inc Sastavi faktora viii i postupci za pravljenje i upotrebu istih
WO2013130684A1 (en) 2012-02-27 2013-09-06 Amunix Operating Inc. Xten-folate conjugate compositions and methods of making same
GB201203442D0 (en) * 2012-02-28 2012-04-11 Univ Birmingham Immunotherapeutic molecules and uses
JP6407726B2 (ja) * 2012-03-01 2018-10-24 アムゲン リサーチ (ミュンヘン) ゲーエムベーハーAMGEN Research(Munich)GmbH 長寿命ポリペプチド結合分子
SG11201406943XA (en) 2012-04-27 2014-12-30 Cytomx Therapeutics Inc Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
KR20150021072A (ko) 2012-06-05 2015-02-27 아뮤닉스 오퍼레이팅 인코포레이티드 성장 호르몬 결핍의 치료에 있어서 hgh-xten 융합 단백질 및 이의 용도
US11180572B2 (en) 2012-07-06 2021-11-23 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
KR102403545B1 (ko) * 2012-07-11 2022-05-30 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. Xten 및 폰 빌레브란트 인자 단백질과의 viii 인자 복합체 및 이의 용도
US9487590B2 (en) 2012-09-25 2016-11-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind interleukin-6 receptor and methods of use thereof
US10087250B2 (en) 2012-10-08 2018-10-02 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
EP2968451A4 (en) 2013-03-11 2017-01-04 Amunix Operating Inc. Treatment of pediatric growth hormone deficiency with human growth hormone analogues
KR102182485B1 (ko) 2013-05-28 2020-11-25 카오슝 메디칼 유니버시티 단백질 약물의 불활성화를 위한 항체 로커
TW201536811A (zh) 2013-05-31 2015-10-01 Biogen Idec Inc 嵌合fvii-xten分子及其用途
US11161906B2 (en) 2013-07-25 2021-11-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
EP3033097B1 (en) * 2013-08-14 2021-03-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
US20160257748A1 (en) 2013-09-25 2016-09-08 Amgen Inc. V-c-fc-v-c antibody
US9540440B2 (en) 2013-10-30 2017-01-10 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind epidermal growth factor receptor and methods of use thereof
AU2014343636A1 (en) 2013-11-04 2016-06-02 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Production of T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins
EP4176896A1 (en) 2014-01-31 2023-05-10 Cytomx Therapeutics Inc. Matriptase and u-plasminogen activator substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
CA2945861C (en) 2014-04-22 2019-08-20 Vestas Wind Systems A/S Alignment tool, system and method for the connection of wind turbine tower segments
CA2955947A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
EP2982693A1 (en) 2014-08-07 2016-02-10 Affimed Therapeutics AG CD3 binding domain
WO2016036937A1 (en) 2014-09-05 2016-03-10 Janssen Pharmaceutica Nv Cd123 binding agents and uses thereof
JP2017529853A (ja) 2014-09-25 2017-10-12 アムジエン・インコーポレーテツド プロテアーゼにより活性化可能な二重特異性タンパク質
WO2016077505A2 (en) 2014-11-11 2016-05-19 Amunix Operating Inc. Targeted xten conjugate compositions and methods of making same
EP3220936A4 (en) 2014-11-21 2018-08-22 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Elp fusion proteins for controlled and sustained release
WO2016109823A1 (en) 2015-01-02 2016-07-07 Amunix Operation Inc. Treatment of pediatric growth hormone deficiency with human growth hormone analogues
UA120286C2 (uk) 2015-01-08 2019-11-11 Ґенмаб А/С Біспецифічне антитіло проти cd3 і cd20
MA41374A (fr) 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
WO2016179003A1 (en) 2015-05-01 2016-11-10 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
EP3291836A4 (en) 2015-05-06 2018-11-14 Janssen Biotech, Inc. Prostate specific membrane antigen (psma) bispecific binding agents and uses thereof
JOP20160154B1 (ar) 2015-07-31 2021-08-17 Regeneron Pharma أجسام ضادة مضاد لل psma، وجزيئات رابطة لمستضد ثنائي النوعية الذي يربط psma و cd3، واستخداماتها
CA2992306A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Amunix Operating Inc. Chimeric polypeptide assembly and methods of making and using the same
EP3387013B1 (en) 2015-12-07 2022-06-08 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and psma
EA201891753A1 (ru) 2016-02-03 2019-01-31 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкции антител к psma и cd3, вовлекающие т-клетки
KR20240118898A (ko) 2016-02-03 2024-08-05 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 Bcma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물
TWI781108B (zh) 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗gprc5d抗體、結合gprc5d與cd3之雙特異性抗原結合分子及其用途
JP7215997B2 (ja) 2016-11-23 2023-01-31 ハープーン セラピューティクス,インク. 前立腺特異的膜抗原(psma)を標的とする三重特異性タンパク質と使用方法
WO2018097307A1 (ja) 2016-11-28 2018-05-31 中外製薬株式会社 抗原結合ドメインおよび運搬部分を含むポリペプチド
AU2019233523A1 (en) 2018-03-12 2020-10-01 Genmab A/S Antibodies
JP7384835B2 (ja) 2018-05-23 2023-11-21 ファイザー・インク Cd3に特異的な抗体及びその使用
PE20210132A1 (es) 2018-05-24 2021-01-19 Janssen Biotech Inc Anticuerpos anti-cd3 y usos de estos

Also Published As

Publication number Publication date
MX2018002226A (es) 2018-03-23
EP3341009A4 (en) 2019-05-01
IL256785A (en) 2018-03-29
IL256785B1 (en) 2023-11-01
JP2018533909A (ja) 2018-11-22
JP2024105275A (ja) 2024-08-06
TWI835006B (zh) 2024-03-11
HK1257218A1 (zh) 2019-10-18
AU2023201227A1 (en) 2023-05-25
EA038329B1 (ru) 2021-08-10
CA2992306A1 (en) 2017-03-09
PE20181275A1 (es) 2018-08-03
EA201890294A1 (ru) 2018-07-31
ZA201800570B (en) 2022-04-28
WO2017040344A2 (en) 2017-03-09
US11981744B2 (en) 2024-05-14
EP4129327A1 (en) 2023-02-08
CL2018000543A1 (es) 2019-01-18
KR20180038560A (ko) 2018-04-16
US20230295334A1 (en) 2023-09-21
TWI744247B (zh) 2021-11-01
IL307276A (en) 2023-11-01
US11713358B2 (en) 2023-08-01
US20240018260A1 (en) 2024-01-18
AU2016315656A1 (en) 2018-02-01
TW201722986A (zh) 2017-07-01
WO2017040344A3 (en) 2017-04-20
ZA202110393B (en) 2024-05-30
IL256785B2 (en) 2024-03-01
US20190153115A1 (en) 2019-05-23
JP2021178831A (ja) 2021-11-18
CN108135968A (zh) 2018-06-08
WO2017040344A8 (en) 2017-09-14
TW202229326A (zh) 2022-08-01
US20240279354A1 (en) 2024-08-22
EP3341009A2 (en) 2018-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6913670B2 (ja) キメラポリペプチドアセンブリーならびにそれを作製および使用する方法
US12060424B2 (en) Release segments and binding compositions comprising same
JP2021525243A (ja) Nk細胞による標的細胞の殺傷を増進するための組成物および方法
US20210054077A1 (en) Cd3 antigen binding fragments and compositions comprising same
JP7497351B2 (ja) チェックポイント分子に対する多重特異性結合性構築物およびその使用
US20230312729A1 (en) Egfr antigen binding fragments and compositions comprising same
TW202436342A (zh) 嵌合多肽組合體以及其製備及使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190826

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190826

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200915

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20201214

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20201214

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20201215

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210312

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20210513

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20210610

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20210712

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6913670

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150