JP2018533909A - キメラポリペプチドアセンブリーならびにそれを作製および使用する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、切断された場合、エフェクターＴ細胞を、標的化された腫瘍またはがん細胞と同時に結合させ、腫瘍細胞またはがん細胞の細胞溶解を行うことができる切断性放出セグメントによって結合ドメインに連結されたバルキング部分を含む二特異的キメラポリペプチドアセンブリー組成物に関する。本発明はまた、切断性キメラポリペプチドアセンブリー組成物を作製および使用する組成物および方法も提供する。本発明は、限定されるものではないが、がん、自己免疫、および炎症障害を含む疾患の処置または防止において有用なキメラポリペプチドアセンブリーを開示する。

Description

多くの認可されたがん治療薬は、正常細胞ならびに腫瘍細胞を殺傷する細胞傷害薬である。これらの細胞傷害薬の治療的利益は、正常細胞よりも感受性が高い腫瘍細胞に依存し、それによって、許容されない副作用をもたらさない用量を使用して臨床応答を達成することができる。しかしながら、これらの非特異的薬物の本質的に全てが、正常組織に対する重大ではないとしてもいくらかの損傷をもたらし、処置の好適性を制限することが多い。
二特異的抗体は、それらが免疫エフェクター細胞にがん細胞を殺傷するように指令する点で、細胞傷害薬とは異なる手法を提供する。二特異的抗体は、単一の組成物中で２つのモノクローナル抗体に由来する異なる結合特異性の利益を組み合わせ、単一特異的抗体を用いた場合には不可能である適用範囲の手法または組合せを可能にする。この手法は、二特異的抗体の一方のアームの、腫瘍関連抗原またはマーカーへの結合に依拠するが、他方のアームは、Ｔ細胞上のＣＤ３分子に結合する際に、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、インターロイキン２、４および１０、パーフォリン、ならびにグランザイムなどのエフェクター分子の放出によってその細胞傷害活性を誘発する。抗体工学における進歩は、ブリナツモマブなどのＢｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ（ＢｉＴＥ（登録商標））を含む、エフェクター細胞を腫瘍標的に向け直すためのいくつかの二特異的抗体形式および組成物の開発をもたらした。ＢｉＴＥは、腫瘍部位でＴ細胞のポリクローナル集団を動員および活性化することによって機能し、共刺激または従来のＭＨＣ認識を必要とすることなくそのように機能する。しかしながら、ＢｉＴＥ組成物が非常に短い半減期を有し、治療効果を達成するのに十分な時間治療濃度域内にＢｉＴＥを維持するためには４〜８週間の連続注入を必要とするという事実に加えて、数あるサイトカインの中でも、特にＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの放出によって媒介される「サイトカインストーム」または「サイトカイン放出症候群」（Lee DWら、Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome.、Blood. ２０１４年、１２４巻（２号）：１８８〜１９５頁）と呼ばれる深刻な副作用を経験するある特定の患者の二重の問題が依然として残っている。
Lee DWら、Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome.、Blood. ２０１４年、１２４巻（２号）：１８８〜１９５頁
そのような二特異的抗体形式の薬理学的利点を提供するが、低頻度の投薬または単回注射による投薬のみを要するなど、安全性の増加、副作用の減少、選択性の増大、および／または薬物動態特性の増強を示す代替的な治療薬のかなりの必要性が依然として残っている。
本発明は、限定されるものではないが、がん、自己免疫、および炎症障害を含む疾患の処置または防止において有用なキメラポリペプチドアセンブリーを開示する。第１の態様では、本開示は、切断性キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。切断性キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、満たされない必要性に対処し、使用中の従来の二特異的抗体調製物と比較して終末半減期の増強、標的化された送達、および健康な組織に対する毒性の低下を含む１つまたは複数の態様において優れている。
対象のポリペプチドアセンブリーは、典型的には、第１の部分、第２の部分、および第３の部分を含み、前記第１の部分は、（ｉ）標的細胞マーカーに対する結合特異性を有する第１の結合ドメイン；および（ｉｉ）エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第２の結合ドメインを含み；前記第２の部分は、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼにより切断され得るペプチジル放出セグメント（ＲＳ）を含み；前記第３の部分は、バルキング部分を含み；前記バルキング部分は、前記第２の部分に対する前記哺乳動物プロテアーゼの作用によって前記第１の部分から放出され得る。
対象のキメラポリペプチドアセンブリー中の様々な構成成分を、様々な異なる順序で構成させることができる。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって構成され、第１の部分は第２の部分に連結され、次いで、第２の部分は第３の部分に連結されている。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって構成され、第３の部分は第２の部分に連結され、次いで、第２の部分は第１の部分に連結されている。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーは、融合タンパク質である。別の実施形態では、第２および第３の部分は融合タンパク質であり、第１の部分は第２の部分にコンジュゲートされている。化学的にコンジュゲートされたポリペプチドアセンブリー組成物の一実施形態では、第１の部分のポリペプチドのＣ末端を、マレアミドまたは当技術分野で公知の他の架橋剤などの薬剤による架橋を受けやすいシステインまたは他の好適なアミノ酸を介して、第２の部分のポリペプチドのＮ末端にコンジュゲートさせることができる。別の実施形態では、第１の部分および第２の部分はモノマー融合タンパク質であり、第３の部分は第２の部分に化学的にコンジュゲートされている。
任意選択で、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、組成物の反対側の末端に連結された第２の放出セグメントによって組成物に連結されたさらなるバルキング部分を含んでもよく、それによって、第１および第２の部分を封入する。
第１および第２の結合ドメインは、一般的には、モノクローナル抗体に由来する抗体断片である。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第１の部分の第１および第２の結合ドメインは、ｓｃＦｖであるか、またはダイアボディとして構成される。他の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第１の部分の第１および第２の結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、線状抗体、単一ドメイン抗体、非抗体足場、および単一ドメインラクダ抗体からなる群から選択される。他の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第１の部分の第１および第２の結合ドメインは、ペプチド、アンチカリン、アドネクチン、フィノマー、アフィリン、アフィボディ、センチリン、ＤＡＲＰｉｎなどの非抗体足場の群から選択される。他の実施形態では、腫瘍細胞標的のための結合ドメインは、腫瘍細胞によって過剰発現されるタンパク質のペプチド断片を搭載しているＭＨＣに結合するように操作されたＴ細胞受容体の可変ドメインである。
キメラポリペプチドアセンブリーの一実施形態では、第１の部分の第１の結合ドメインは、標的細胞マーカーに対する結合親和性を有する。標的細胞は、外胚葉、中胚葉または内胚葉起源のものなどの真核生物の任意の細胞型を含む。特に興味深いものは、腫瘍細胞および腫瘍細胞によって発現されるマーカーである。腫瘍細胞は、間質細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、グリア細胞、上皮細胞、脂肪細胞、リンパ球細胞、血管細胞、平滑筋細胞、間葉細胞、乳房組織細胞、前立腺細胞、腎臓細胞、脳細胞、結腸細胞、卵巣細胞、子宮細胞、膀胱細胞、皮膚細胞、胃細胞、尿生殖路細胞、頸部細胞、子宮細胞、小腸細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、胆嚢細胞、胆管細胞、食道細胞、唾液腺細胞、肺細胞、および甲状腺細胞からなる群から選択される細胞から生じてもよい。一部の場合では、腫瘍特異的マーカーとしては、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２ ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６ βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ１３３、ガングリオシドＧＤ３；９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原１、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、胎児アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、ＣＤ２５、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ミュラー管抑制物質受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、シアル化Ｔｎ抗原（ｓ ＴＮ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＡＧ７２、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原）、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｇ２５０、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＤＬＫ１、ＳＰ１７、ＲＯＲ１、およびＥｐｈＡ２が挙げられる。キメラポリペプチドアセンブリーの別の実施形態では、第１の部分の第１の結合ドメインは、炎症マーカーである標的細胞マーカーに対する結合親和性を有する。
一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第１の部分の第１の結合ドメインは、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する特異的結合親和性を有するＶＨおよびＶＬ領域を含む。前述の一実施形態では、第１の結合ドメインＶＨおよびＶＬは、表２に記載される配列対の群から選択されるモノクローナル抗体ＶＨおよびＶＬに由来する。第１および第２の結合ドメインのＶＨおよびＶＬ領域を、Ｎ末端からＣ末端の順序に関して、異なる順序で構成させることができる。一実施形態では、第１の結合ドメインＶＨおよびＶＬ領域は、順序ＶＨ−ＶＬに配置される。別の実施形態では、第１の結合ドメインＶＨおよびＶＬ領域は、順序ＶＬ−ＶＨに配置される。他の場合では、第１の結合ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、ＣＤＲ−Ｈ３領域、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含み、前記領域のそれぞれは、表２に記載される配列群から選択されるモノクローナル抗体配列に由来する。ＶＨおよびＶＬ領域の様々な構成ならびにそこに含有されるＣＤＲは、典型的には、意図される標的細胞マーカーに対する所望の結合特異性を保持する。
キメラポリペプチドアセンブリーの他の実施形態では、第１の部分の第２の結合ドメインは、エフェクター細胞に対する結合親和性を有する。必要に応じて、エフェクター細胞は、限定されるものではないが、形質細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ細胞）、マスト細胞（master cell）、樹状細胞、調節性Ｔ細胞（ＲｅｇＴ細胞）、ヘルパーＴ細胞、骨髄性細胞、およびＮＫ細胞を含む免疫細胞であってもよい。第２の結合ドメインは、典型的には、エフェクター細胞によって発現される抗原に対する結合特異性を示す。一部の実施形態では、抗原は、エフェクター細胞の細胞表面上に発現される。別の実施形態では、第２の結合ドメインは、Ｔ細胞上に発現されるエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する。非限定的な例示的なエフェクター細胞抗原としては、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、αβＴＣＲ、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６９、ＣＤ１２７、およびＣＤ１９６（ＣＣＲ６）が挙げられる。特に興味深いものは、ヒトＣＤ３に特異的に結合するモノクローナル抗体に由来するＶＨおよびＶＬ領域を有するｓｃＦｖ構成を採用する第２の結合ドメインである。一実施形態では、第２の結合ドメインＶＨおよびＶＬは、表１に記載される配列群から選択されるモノクローナル抗体ＶＨおよびＶＬに由来する。別の実施形態では、第２の結合ドメインは、ヒトＣＤ３εに結合することができるモノクローナル抗体に由来するＶＨおよびＶＬ領域を含む。
結合ドメインのｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬを、得られる組成物の有用性に影響を及ぼすことなく、異なる構成に配置することができる。一実施形態では、第２の結合ドメインｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順序に配置されるＶＨおよびＶＬ領域を含む。結合ドメインを、ＣＤＲ領域から作出することもできる。一実施形態では、第２の結合ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、ＣＤＲ−Ｈ３領域、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含み、それぞれ、表１のモノクローナル抗体に由来する。段落の前述の実施形態では、ＶＨおよびＶＬ領域ならびに第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、表８および表９に記載される配列群から選択される可撓性ポリペプチドリンカーによって連結されている。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第１の部分は、表１３の配列からなる群から選択される配列に対する少なくとも約９０％、または９１％、または９２％、または９３％、または９４％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％の同一性を有する配列を有する。
対象のキメラポリペプチドアセンブリーの１つの利点は、インタクトな組成物を、哺乳動物プロテアーゼが存在する標的組織またはある特定の細胞環境の近くで活性化させ、その活性が最も望ましい部位で第１の部分の結合ドメインを放出することができる、プロドラッグの形態でそれが集合させられるということである。例えば、第１の部分の結合ドメインは、インタクトなアセンブリー中に存在する場合、バルキング部分の遮蔽効果のため、より低い結合親和性を有する。標的組織、例えば、腫瘍組織中で優先的に発現される哺乳動物プロテアーゼによるＲＳの切断を介する放出時に、第１の部分の結合ドメインは、バルキング部分によって遮蔽されることなく、「活性化される」ようになる。別の実施形態では、本発明は、ＲＳを切断することができる哺乳動物プロテアーゼが炎症組織中で優先的に発現される、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーは、ＲＳを含み、ＲＳは、表４に記載される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。必要に応じて、ＲＳは、配列ＬＳＧＲＳＤＮＨＳＰＬＧＬＡＧＳ、ＳＰＬＧＬＡＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ、ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＮＨ、ＬＡＧＲＳＤＮＨＳＰＬＧＬＡＧＳ、ＬＳＧＲＳＤＮＨＶＰＬＳＬＫＭＧ、ＳＰＬＧＬＡＧＳ、ＧＰＬＡＬＡＲＧ、ＬＳＧＲＳＤＮＨ、ＶＰＬＳＬＴＭＧ、ＶＰＬＳＬＫＭＧ、ＶＰＬＳＬＳＭＧ、ＥＰＬＥＬＶＡＧ、ＥＰＬＥＬＲＡＧ、ＥＰＡＡＬＭＡＧ、ＥＰＡＳＬＭＡＧ、ＲＩＧＳＬＲＴＡ、ＲＩＱＦＬＲＴＡ、ＥＰＦＨＬＭＡＧ、ＶＰＬＳＬＦＭＧ、ＥＰＬＥＬＰＡＧ、およびＥＰＬＥＬＡＡＧからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。必要に応じて、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の放出セグメントは、配列ＬＳＧＲＳＤＮＨＳＰＬＧＬＡＧＳのアミノ酸配列を含む。ＲＳの実施形態では、ＲＳは、表３に記載されるプロテアーゼからなる群から選択される１つまたは複数のプロテアーゼによって切断され得るアミノ酸配列を含む。
別の態様では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第３の部分は、バルキング部分を含む。例示的なバルキング部分としては、限定されるものではないが、延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）、アルブミン結合ドメイン、アルブミン、ＩｇＧ結合ドメイン、プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド；脂肪酸、ＥＬＰバイオポリマー、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＧＡ、ならびにヒドロキシエチルデンプンが挙げられる。一実施形態では、バルキング部分は、ＸＴＥＮ配列である。必要に応じて、第３の部分のＸＴＥＮは、表５に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
別の態様では、対象のキメラポリペプチドアセンブリーは、エフェクター細胞および標的細胞に結合し、連結する能力を示し、それによって、エフェクター細胞が標的細胞特異的様式でその生物学的効果を媒介することができるような免疫学的シナプスを形成する。例えば、対象のキメラポリペプチドアセンブリーは、（１）腫瘍特異的マーカーなどの標的細胞マーカーに特異的に結合する、および（２）エフェクター細胞上に発現される抗原（例えば、Ｔ細胞によって発現される抗原）に特異的に結合する能力を有する。Ｔ細胞と腫瘍細胞とに同時に結合することは、腫瘍細胞の殺傷、損傷、および／または溶解を媒介する。一実施形態では、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼによって第２の部分が切断され、第１の部分が放出されると、第１の部分は、Ｔ細胞と腫瘍細胞との両方を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ヒトＣＤ３抗原を担持するＴ細胞および腫瘍特異的マーカーを担持する腫瘍細胞に同時に結合することができる。本発明の組成物に特徴的な例示的な設計において、第２の部分のＲＳが切断されて、前記キメラポリペプチドアセンブリーから第１の部分および第３の部分が放出されると、放出された第１の部分は、第３の部分の１／２、１／３、１／４、または１／５以下である分子量を有し、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーよりも少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％低い分子量を有する。ある実施形態では、第２の部分のＲＳが切断されると、前記キメラポリペプチドアセンブリーから放出された前記第１の部分は、第２の部分が切断されていないキメラ結合アセンブリーと比較して、ＣＤ３抗原を担持するエフェクターＴ細胞および／または腫瘍細胞マーカーに対する結合親和性が増大している。ヒトＣＤ３抗原を担持するＴ細胞および／または腫瘍細胞マーカーに対する放出された第１の部分の増大した結合親和性は、ＲＳが切断されていないヒトＣＤ３抗原を担持するＴ細胞または腫瘍細胞マーカーに対するキメラポリペプチドアセンブリーの結合親和性と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高い。別の実施形態では、第２の部分のＲＳが切断され、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第１の部分が放出されると、第１の部分がＴ細胞と腫瘍細胞とに同時に結合することにより、Ｔ細胞および腫瘍細胞の集団を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて腫瘍細胞に対する細胞傷害活性が生じる。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーの放出された第１の部分は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてインタクトなキメラ結合アセンブリーと比較して、腫瘍細胞のより多い量の細胞溶解を行うことができる。例えば、キメラポリペプチドアセンブリーの放出された第１の部分により行われる細胞溶解の量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてインタクトなキメラ結合アセンブリーと比較して少なくとも１０倍多い、または少なくとも３０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも３００倍、または少なくとも１０００倍多い。一実施形態では、腫瘍細胞の細胞傷害活性および／または細胞溶解は、Ｔ細胞の標的特異的活性化によって媒介され、キメラポリペプチドアセンブリーの放出された第１の部分によって行われるＴ細胞の活性化の量は、インタクトなキメラ結合アセンブリーと比較して、少なくとも１０倍多い、または少なくとも３０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも３００倍、または少なくとも１０００倍多い。キメラ結合アセンブリーのＲＳを、細胞傷害性の最大比較差を決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害アッセイ中にＲＳの部分的切断を供することができるため、アセンブリーのＲＳを、非切断性ポリペプチドと置換し、放出された第１の部分の試料と比較してアッセイすることができる。必要に応じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、細胞膜完全性アッセイ、混合細胞培養アッセイ、ＦＡＣＳベースヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルー流入アッセイ、測光酵素放出アッセイ、放射測定５１Ｃｒ放出アッセイ、蛍光ユーロピウム放出アッセイ、ＣａｌｃｅｉｎＡＭ放出アッセイ、測光ＭＴＴアッセイ、ＸＴＴアッセイ、ＷＳＴ−１アッセイ、アラマーブルーアッセイ、放射測定３Ｈ−Ｔｈｄ取込みアッセイ、細胞分裂活性を測定するクローン形成アッセイ、ミトコンドリア膜貫通勾配を測定する蛍光ローダミン１２３アッセイ、ＦＡＣＳベースホスファチジルセリン曝露によりモニタリングされるアポトーシスアッセイ、ＥＬＩＳＡベースＴＵＮＥＬ試験アッセイ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、カスパーゼ活性アッセイ、細胞ベースＬＤＨ放出アッセイ、および細胞形態学アッセイ、もしくはその任意の組合せから選択されるアッセイ、または本明細書の以下の実施例に記載される方法によるものであってもよい。
別の態様では、本発明は、ｉ）エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第２の結合ドメイン；およびｉｉ）腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する結合特異性を有する第１の結合ドメインを含む第１の部分、哺乳動物プロテアーゼによって切断され得る第１の放出セグメント（ＲＳ）を含む第２の部分、前記第２の部分に対する前記哺乳動物プロテアーゼの作用によって前記第１の部分から放出され得る第１のバルキング部分を含む第３の部分、第２の部分のＲＳと同じであってもよく、または異なっていてもよい放出セグメント（ＲＳ）を含む第４の部分、ならびに前記第４の部分に対する前記哺乳動物プロテアーゼの作用によって前記第１の部分から放出され得る、第３の部分と同じであってもよく、または異なっていてもよい第２のバルキング部分を含む第５の部分を含む、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。前述の一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第２の放出セグメントは、表４に記載される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。前述の別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第２の放出セグメントは、配列ＬＳＧＲＳＤＮＨＳＰＬＧＬＡＧＳ、ＳＰＬＧＬＡＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ、ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＮＨ、ＬＡＧＲＳＤＮＨＳＰＬＧＬＡＧＳ、ＬＳＧＲＳＤＮＨＶＰＬＳＬＫＭＧ、ＳＰＬＧＬＡＧＳ、ＧＰＬＡＬＡＲＧ、ＬＳＧＲＳＤＮＨ、ＶＰＬＳＬＴＭＧ、ＶＰＬＳＬＫＭＧ、ＶＰＬＳＬＳＭＧ、ＥＰＬＥＬＶＡＧ、ＥＰＬＥＬＲＡＧ、ＥＰＡＡＬＭＡＧ、ＥＰＡＳＬＭＡＧ、ＲＩＧＳＬＲＴＡ、ＲＩＱＦＬＲＴＡ、ＥＰＦＨＬＭＡＧ、ＶＰＬＳＬＦＭＧ、ＥＰＬＥＬＰＡＧ、およびＥＰＬＥＬＡＡＧからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。前述の別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第２の放出セグメントは、表３に記載されるプロテアーゼ群から選択されるプロテアーゼによって切断され得るアミノ酸配列を含む。前述の別の実施形態では、組成物の第５の部分のバルキング部分は、ＸＴＥＮ；アルブミン結合ドメイン；アルブミン；ＩｇＧ結合ドメイン；プロリン、セリン、およびアラニンからなる少なくとも３５０個のアミノ酸残基のポリペプチド；脂肪酸；ならびにＦｃドメインからなる群から選択される。前述の別の実施形態では、組成物の第５の部分のバルキング部分は、ＸＴＥＮである。前述の別の実施形態では、組成物のバルキング部分は、最適にアラインさせた場合、表５に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＸＴＥＮである。一実施形態では、本発明は、最適にアラインさせた場合、表１０に記載されるような、シグナルペプチドを含まないアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、最適にアラインさせた場合、表１２に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、図３６または図３７に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、図３６または図３７に記載されるような配列からなる群から選択されるポリペプチド配列を有するアミノ酸配列からなるキメラポリペプチドアセンブリーを提供する。
キメラポリペプチドアセンブリー組成物の例示的な特徴では、第１の部分の結合ドメインの放出後に標的細胞の細胞溶解を行う能力（インタクトな組成物と比較した）は、インタクトな組成物のものと比較して放出された第１の部分の標的細胞マーカーに対する増大した結合親和性よりも比例して高い。この特徴の一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおけるＫｄのｌｏｇとして表される結合親和性と比較して、ＥＣ５０整数として表される相対的細胞傷害性は、少なくとも約２：１、または少なくとも１０：１、または少なくとも５０：１、または少なくとも１００：１、または少なくとも３００：１、または少なくとも５００：１、または少なくとも１０００：１である。別の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける、キメラポリペプチドアセンブリーの放出された第１の部分の、細胞傷害性（例えば、ＥＣ５０整数として表される）と結合親和性（例えば、Ｋｄのｌｏｇとして表される）との比は、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍大きい。
一部の実施形態では、ａ）（ｉ）Ｔ細胞と標的細胞マーカーを担持する腫瘍細胞との両方を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける標的腫瘍細胞に対する放出された第１の部分の細胞傷害性と、（ｉｉ）１〜約１０個のアミノ酸の非切断性ペプチドによって連結されている、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第１の部分と、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第３の部分とを含む組成物の細胞傷害性との比として測定される相対的細胞傷害性；およびｂ）（ｉ）エフェクター細胞抗原に対する放出された第１の部分の結合親和性と、（ｉｉ）１〜約１０個のアミノ酸の非切断性ペプチドによって連結されている、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第１の部分と、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第３の部分とを含む組成物のエフェクター細胞抗原に対する結合親和性との比として測定される、エフェクター細胞抗原に対する相対的結合親和性の比較において、相対的細胞傷害性と相対的結合親和性との比は、少なくとも３：１、１０：１より大きい、または少なくとも３０：１より大きい、または少なくとも５０：１より大きい、または少なくとも１００：１より大きい、または少なくとも３００：１より大きい、または少なくとも５００：１より大きい、または少なくとも１０００：１より大きい。前述の一実施形態では、非切断性ペプチドは配列グリシン−セリン、セリン−グリシン、またはいずれかのジペプチドの複数単位を有し、エフェクター細胞抗原はＣＤ３である。一実施形態では、ａ）（ｉ）Ｔ細胞と標的細胞マーカーを担持する腫瘍細胞との両方を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける標的腫瘍細胞に対する放出された第１の部分の細胞傷害性と、（ｉｉ）１〜約１０個のアミノ酸の非切断性ペプチドによって連結されている、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第１の部分と、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第３の部分とを含む組成物の細胞傷害性との比として測定される相対的細胞傷害性；およびｂ）（ｉ）標的細胞マーカーに対する放出された第１の部分の結合親和性と、（ｉｉ）１〜約１０個のアミノ酸の非切断性ペプチドによって連結されている、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第１の部分と、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第３の部分とを含む組成物の標的細胞マーカーに対する結合親和性との比として測定される、標的細胞マーカーに対する相対的結合親和性の比較において、相対的細胞傷害性と相対的結合親和性との比は、少なくとも３：１、１０：１より大きい、または少なくとも３０：１より大きい、または少なくとも５０：１より大きい、または少なくとも１００：１より大きい、または少なくとも３００：１より大きい、または少なくとも５００：１より大きい、または少なくとも１０００：１より大きい。前述の一実施形態では、非切断性ペプチドは配列グリシン−セリン、セリン−グリシン、またはいずれかのジペプチドの複数単位を有し、エフェクター細胞抗原はＣＤ３である。別の実施形態では、ａ）（ｉ）Ｔ細胞と標的細胞マーカーを担持する腫瘍細胞との両方を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける標的腫瘍細胞に対する放出された第１の部分の細胞傷害性と、（ｉｉ）１〜約１０個のアミノ酸の非切断性ペプチドによって連結されている、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第１の部分と、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第３の部分とを含む組成物の細胞傷害性との比として測定される相対的細胞傷害性；ｂ）（ｉ）エフェクター細胞抗原に対する放出された第１の部分の結合親和性と、（ｉｉ）１〜約１０個のアミノ酸の非切断性ペプチドによって連結されている、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第１の部分と、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第３の部分とを含む組成物の結合親和性との比として測定される、相対的エフェクター細胞抗原結合親和性；およびｃ）（ｉ）標的細胞マーカーに対する放出された第１の部分の結合親和性と、（ｉｉ）１〜約１０個のアミノ酸の非切断性ペプチドによって連結されている、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第１の部分と、キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第３の部分とを含む組成物の標的細胞マーカーに対する結合親和性との比として測定される、標的細胞マーカーに対する相対的結合親和性の比較において、標的細胞マーカーに対する相対的結合親和性で乗算した、相対的細胞傷害性と相対的エフェクター細胞抗原結合親和性との比は、少なくとも３：１、１０：１より大きい、または少なくとも３０：１より大きい、または少なくとも５０：１より大きい、または少なくとも１００：１より大きい、または少なくとも３００：１より大きい、または少なくとも５００：１より大きい、または少なくとも１０００：１より大きい。前述の一実施形態では、非切断性ペプチドは配列グリシン−セリン、セリン−グリシン、またはいずれかのジペプチドの複数単位を有し、エフェクター細胞抗原はＣＤ３である。
一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞と、標的細胞マーカーを担持する腫瘍細胞との両方を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイにおけるキメラポリペプチドアセンブリー組成物の放出された第１の部分のＥＣ５０値が、５０００ｐｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは、１０００ｐｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは５００ｐｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは３５０ｐｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは２５０ｐｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは１００ｐｇ／ｍｌ未満、さらにより好ましくは５０ｐｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは、５ｐｇ／ｍｌ以下である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおけるキメラポリペプチドアセンブリー組成物の放出された第１の部分のＥＣ５０値は、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物のＥＣ５０値の１／１０以下、または１／２０以下、または１／３０以下、または１／４０以下、または１／５０以下、または１／６０以下、または１／７０以下、または１／８０以下、または１／９０以下、または１／１００以下、または１／１２０以下である。
一部の場合では、腫瘍特異的マーカーに対する放出された第１の部分の第１の結合ドメインの結合親和性は、ＣＤ３抗原に対する放出された第１の部分の第２の結合ドメインの結合親和性と比較して高い。一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＫｄ定数によって測定される、標的細胞に対する放出された第１の部分の第１の結合ドメインの結合親和性は、ＣＤ３抗原に対する第２の結合ドメインの結合親和性と比較して少なくとも一桁高い。他の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいてＫｄ定数によって測定される、標的細胞に対する放出された第１の部分の第１の結合ドメインの結合親和性は、１０−５〜１０−９Ｍの間であり、第２の結合ドメインのＫｄは１０−５〜１０−９Ｍの間である。結合親和性を、標準的な細胞ベースアッセイ、ＥＬＩＳＡ、本明細書の実施例に記載のアッセイ、または当技術分野で公知の他のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって決定することができる。
別の態様では、本発明は、対象に投与した場合のキメラポリペプチドアセンブリーの特性の増強に関する。放出セグメントを含むインタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物は、放出された第１の部分の構成成分と比較して、低い細胞傷害性および／または前炎症性サイトカインの産生を惹起する低下した能力を示すことが具体的に企図される。一実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリーを含む組成物の対象への投与の際、またはその後に、アセンブリーの第２の部分が、ＲＳを切断することができるプロテアーゼを発現する腫瘍の近くで切断される、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。前記哺乳動物プロテアーゼによって第２の部分が切断され、アセンブリーから第１の部分が放出されると、第１の部分は、対象においてヒトＣＤ３抗原を担持するＴ細胞と、腫瘍特異的マーカーを担持する腫瘍細胞とに同時に結合することができる。一実施形態では、放出された第１の部分が、ＣＤ３抗原を担持するＴ細胞と、腫瘍細胞マーカーを担持する腫瘍細胞とに同時に結合することにより、Ｔ細胞由来エフェクター分子が放出される。前述において、エフェクター分子は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、インターロイキン２、パーフォリン、およびグランザイム、または当技術分野で公知の他のＴ細胞エフェクター分子からなる群の１つまたは複数のエフェクター分子から選択される。エフェクター細胞と標的細胞とに同時に結合した結果として、Ｔ細胞およびエフェクター分子による標的細胞の溶解を行う、免疫学的シナプスが作出される。
別の態様では、本発明は、終末半減期およびバルキング部分、例えば、ＸＴＥＮにより付与される他の特性が増大したキメラポリペプチドアセンブリー組成物に関する。一実施形態では、本発明は、インタクトな組成物が、同等用量で対象に投与された際またはその後の前記第２および第３の部分に連結されていない第１の部分の半減期と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍長い、対象に投与された際またはその後の半減期を示す、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーを対象に投与し、第２の部分が切断され、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第１の部分および前記第３の部分が放出された際またはその後に、前記第１の部分は、対象におけるインタクトなキメラポリペプチドアセンブリーと比較して１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９または１／１０以下である半減期を有する。関連する実施形態では、キメラポリペプチド組成物を対象に単回投与した際またはその後の放出された第１の部分の血漿Ｃｍａｘ濃度は、約０．０１ｎｇ／ｍｌ、または約０．１ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ、または約１０ｎｇ／ｍｌ、または約１００ｎｇ／ｍｌを超えない。別の関連する実施形態では、インタクトなキメラポリペプチド組成物を対象に単回投与した際またはその後の放出された第１の部分の血漿Ｃｍａｘ濃度は、同じ対象へのインタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの血漿Ｃｍａｘ濃度の１／３以下、または１／１０以下、または１／３０以下、または１／１００以下である。本明細書に記載の方法または当技術分野で公知の従来の方法を使用して、対象のキメラポリペプチドアセンブリーを投与される対象に由来する血漿試料を使用して、薬物動態パラメーターを測定することができる。別の実施形態では、対象に投与された際またはその後に、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーは、ＲＳが切断され、第１の部分および第３の部分を放出するキメラポリペプチドアセンブリーと比較して、対象における血液循環系からの溢出の減少を示す。この段落の前述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サル、イヌ、およびヒトであってもよい。
別の態様では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリーの医薬組成物に関する。一実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるキメラポリペプチドアセンブリーのいずれかのキメラポリペプチドアセンブリーと、１つまたは複数の薬学的に好適な賦形剤、および任意選択で、１つまたは複数の担体または安定剤とを含む医薬組成物を提供する。別の実施形態では、医薬組成物は、皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、髄腔内、または筋肉内投与のために製剤化されている。別の実施形態では、医薬組成物は、液体形態である。関連する実施形態では、液体形態の医薬組成物は、単回注射のためのプレフィルドシリンジ中に供給される。他の実施形態では、医薬組成物は、投与前に復元される凍結乾燥粉末として製剤化されている。
別の態様では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリーまたはキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の方法および使用に関する。一実施形態では、本発明は、対象における疾患の処置のための医薬の調製のための、キメラポリペプチドアセンブリーまたはキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物を提供する。関連する実施形態では、医薬は、癌腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、ＥＲ／ＰＲ＋乳がん、Ｈｅｒ２＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、悪性腹水を伴う結腸がん、粘液腫瘍、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（gastric cancer）、胃がん（stomach cancer）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、男化腫瘍、腺癌、肉腫、およびＢ細胞由来慢性リンパ性白血病からなる群から選択される疾患において使用される。
別の態様では、本発明は、限定されるものではないが、がんを含む疾患を有する対象にキメラポリペプチドアセンブリーまたは医薬組成物を投与することを含む、対象における疾患を処置する方法における使用のためのキメラポリペプチドアセンブリーまたはキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物に関する。必要に応じて、方法は、それを必要とする対象に、キメラポリペプチドアセンブリーと１つまたは複数の賦形剤とを含む治療有効用量の医薬組成物を投与することを含む。処置方法の一実施形態では、疾患は、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（gastric cancer）、食道がん、胃がん（stomach cancer）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病を含む原発性血液悪性腫瘍、骨髄増殖性新生物障害、または骨髄異形成障害、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群からなる群から選択される。処置方法の別の実施形態では、医薬組成物は、対象に週２回、週１回、２週毎、３週毎、または毎月投与される１つまたは複数の治療有効用量として投与される。処置方法の別の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも２週、または少なくとも１カ月、または少なくとも２カ月、または少なくとも３カ月、または少なくとも４カ月、または少なくとも５カ月、または少なくとも６カ月の期間にわたって１つまたは複数の用量として対象に投与される。処置方法の別の実施形態では、用量は、皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、髄腔内、または筋肉内に投与される。処置方法の別の実施形態では、用量は、最大の安全性および効能のために忍容されるように、ボーラス用量として、または５分〜９６時間の注入によって投与される。処置方法の別の実施形態では、用量は、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される。処置方法の別の実施形態では、初期用量は、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇからなる群から選択され、その後の用量は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される。処置方法の別の実施形態では、対象への治療有効用量の医薬組成物の投与は、少なくとも約３日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、または少なくとも約２１日間、対象において少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬ〜少なくとも約２ｎｇ／ｍＬまたはそれよりも多くのキメラポリペプチドアセンブリーの血漿濃度をもたらす。
別の実施形態では、本発明は、治療有効用量を使用する１つまたは複数の連続用量を含む処置レジメンに従って、疾患を有する対象に医薬組成物を投与することを含む、疾患の処置のための方法における使用のための医薬組成物を提供する。疾患の処置のための方法における使用のための医薬組成物の一実施形態では、疾患は、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（gastric cancer）、食道がん、胃がん（stomach cancer）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病を含む原発性血液悪性腫瘍、骨髄増殖性新生物障害、または骨髄異形成障害、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群からなる群から選択される。疾患の処置における使用のための医薬組成物の別の実施形態では、処置レジメンは、特定の処置サイクルの一部であり、特定の処置サイクルは、各処置サイクルあたり、週２回、毎週、１０日毎、２週毎、３週毎、または毎月の医薬組成物の投与を含む。一実施形態では、処置レジメンは、対象における疾患と関連する臨床パラメーターまたは評価項目の改善をもたらし、臨床パラメーターまたは評価項目は、完全、部分または不完全奏効としての腫瘍縮小；無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答；無増悪生存期間；無病生存期間；再発までの期間；転移までの期間；全生存期間；生活の質の改善；および症状の改善からなる群の１つまたは任意の組合せから選択される。方法の前述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、医薬組成物を含むキットに関する。一実施形態では、本発明は、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つに記載の医薬組成物、容器、および容器上の、またはそれに付随するラベルまたは添付文書を含むキットを提供する。別の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つに記載の医薬組成物を含有するプレフィルドシリンジ、およびシリンジ上の、またはそれに付随するラベルまたは添付文書を含むキットを提供する。
別の態様では、本発明は、インタクトな切断されたキメラポリペプチドアセンブリー組成物の特徴および効果の差異に関する。一実施形態では、本発明は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラポリペプチドアセンブリーであって、無傷であるキメラポリペプチドアセンブリーが、アセンブリーに連結されていないアセンブリーの対応する第１の部分と比較して、エフェクター細胞からのＴｈ１サイトカインの産生を行う能力が１／１０以下、または１／２０以下、または１／３０以下、または１／４０以下、または１／５０以下、または１／６０以下、または１／７０以下、または１／８０以下、または１／９０以下、または１／１００以下、または１／１０００以下であり、前記アセンブリーが、エフェクター細胞および標的細胞と接触している、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。一実施形態では、Ｔｈ１サイトカインの産生は、ＰＢＭＣまたはＣＤ３＋Ｔ細胞ならびにアルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２ ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６ βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ１３３、ガングリオシドＧＤ３；９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原１、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、胎児アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、ＣＤ２５、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ミュラー管抑制物質受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、シアル化Ｔｎ抗原（ｓ ＴＮ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＡＧ７２、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原）、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｇ２５０、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＤＬＫ１、ＳＰ１７、ＲＯＲ１、およびＥｐｈＡ２からなる群から選択される腫瘍特異的マーカー抗原を有する標的細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてアッセイされる。前述の実施形態では、Ｔｈ１サイトカインは、ＩＬ−２、ＴＮＦ−アルファ、およびＩＦＮ−ガンマからなる群から選択される。別の実施形態では、Ｔｈ１サイトカインの産生は、キメラポリペプチドアセンブリーに連結されていない対応する第１の部分を投与された対象と比較して、キメラポリペプチドアセンブリーを投与された対象に由来する血液または流体試料を使用してアッセイされ、その結果、無傷であるキメラポリペプチドアセンブリーは、Ｔｈ１サイトカインの産生を行う能力が１／１０以下、または１／２０以下、または１／３０以下、または１／４０以下、または１／５０以下、または１／６０以下、または１／７０以下、または１／８０以下、または１／９０以下、または１／１００以下、または１／１０００以下である。前述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群から選択される。
他の場合、本明細書に開示される実施形態のいずれかのキメラポリペプチドアセンブリーは、無傷であるキメラポリペプチドアセンブリーが、同等用量で対象に投与された場合のキメラポリペプチドアセンブリーに連結されていない第１の部分と比較して、対象に投与された場合の循環から溢出する能力が１／１０以下、または１／２０以下、または１／３０以下、または１／４０以下、または１／５０以下、または１／６０以下、または１／７０以下、または１／８０以下、または１／９０以下、または１／１００以下であるという特徴を示す。
別の態様では、本発明は、対象組成物をコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、（ａ）本明細書に開示される実施形態のいずれか１つに記載のキメラポリペプチドアセンブリーをコードするポリヌクレオチド、または（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補体から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。別の実施形態では、本発明は、表１０または表１４に記載されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態のポリヌクレオチド配列と、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結した組換え調節配列とを含む発現ベクターを提供する。別の実施形態では、本発明は、前述の発現ベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。一実施形態では、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。
別の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞結合組成物およびそれらをコードする核酸に関する。一実施形態では、本発明は、表７に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むモノマー融合タンパク質であって、Ｔ細胞のＣＤ３抗原に対する結合親和性を示す、モノマー融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、本発明は、（ａ）前述のＴ細胞結合組成物の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）表７に記載されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列；または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドの相補体から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。
別の実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるキメラポリペプチドアセンブリーの実施形態のいずれか１つに記載のキメラポリペプチドアセンブリーをコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法であって、先に開示のＴ細胞結合組成物の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに読み枠を合わせて、本明細書に開示されるか、または表２に記載される標的群から選択される標的細胞マーカーに対する結合親和性を有するｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結することを含む、方法において前述のＴ細胞結合組成物の融合タンパク質をコードする核酸の使用方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、前述のポリヌクレオチド配列と、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結した組換え調節配列とを含む発現ベクターを提供する。本発明はまた、宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、発現ベクターを含む単離された宿主細胞も提供する。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に開示されるキメラポリペプチドアセンブリーの実施形態を産生する方法に関する。一実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるキメラポリペプチドアセンブリーを産生する方法であって、宿主細胞を、キメラポリペプチドアセンブリーをコードする発現ベクターで形質転換すること、形質転換された宿主細胞中でのキメラポリペプチドアセンブリーの発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養すること、およびキメラポリペプチドアセンブリーを可溶性融合タンパク質として単離することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、発現される融合タンパク質の第１および第２の結合ドメインの少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９９％が正確に折り畳まれる。
他の場合、本発明は、標的細胞の死を誘導する方法を提供する。方法は、典型的には、前記標的細胞を、本明細書に開示される実施形態のキメラポリペプチドアセンブリーおよびエフェクター細胞と接触させることを含む。ある実施形態では、接触は、限定されるものではないが、膜完全性の喪失、核濃縮、核崩壊、アポトーシスの内因性経路の誘導、アポトーシスの外因性経路の誘導、アポトーシス、細胞溶解、および細胞死を含む標的細胞中での効果をもたらす。
細胞死をもたらす細胞傷害性（例えば、壊死またはアポトーシス）を、限定されるものではないが、処置の前後で細胞を計数すること、または生細胞もしくは死細胞と関連するマーカーのレベルを測定することを含む、任意の好適な方法によって決定することができる。細胞死の程度を、任意の好適な方法によって決定することができる。一部の実施形態では、細胞死の程度は、出発条件に関して決定される。例えば、個体は、出発細胞塊または既知のサイズの腫瘍または既知の濃度の循環標的細胞などの、既知の出発量の標的細胞を有してもよい。別の例では、別の組成物（例えば、バルキング部分に連結されたキメラポリペプチドアセンブリーおよびバルキング部分に連結されていないキメラポリペプチドアセンブリー）に関して、ある組成物により誘導される細胞死の程度を比較することができる。そのような場合、細胞死の程度を、処理後の生存細胞と出発細胞集団との比として表すことができる。一部の実施形態では、細胞死の程度を、好適な細胞死アッセイによって決定することができる。一部の実施形態では、細胞死の程度を、経時的な腫瘍サイズの測定によって決定することができる。様々な細胞死アッセイが利用可能であり、様々な検出方法論を利用することができる。検出方法論の例としては、限定されるものではないが、細胞染色、顕微鏡観察、フローサイトメトリー、細胞選別、およびこれらの組合せの使用が挙げられる。細胞死アッセイのさらなる非限定的な例は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１１３１４７２Ａ１およびＵＳ２０１３００５２１６０に記載されている。
前述の一実施形態では、方法は、標的細胞とエフェクター細胞との混合集団、ならびに標的細胞およびエフェクター細胞の抗原に対する結合親和性を有する有効量のキメラポリペプチドアセンブリーを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベースアッセイにおいて用いられる。アッセイでは、標的細胞は、限定されるものではないが、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２ ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６ βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ１３３、ガングリオシドＧＤ３；９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原１、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、胎児アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、ＣＤ２５、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ミュラー管抑制物質受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、シアル化Ｔｎ抗原（ｓ ＴＮ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＡＧ７２、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原）、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｇ２５０、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＤＬＫ１、ＳＰ１７、ＲＯＲ１、およびＥｐｈＡ２を含む腫瘍特異的マーカー抗原を発現し、エフェクター細胞はＴ細胞であり、エフェクター細胞抗原はＣＤ３である。他の実施形態では、標的細胞の死を誘導する方法は、標的細胞の集団を含むがんを有する対象において用いられ、方法は、治療有効量のキメラポリペプチドアセンブリーを対象に投与することを含む。前述の一実施形態では、方法は、キメラポリペプチドアセンブリーと、１つまたは複数の賦形剤とを含む医薬組成物の１つまたは複数の連続投与される治療有効用量としてキメラポリペプチドアセンブリーを投与することを含む。前述の別の実施形態では、方法は、がんを有する対象において治療効果を達成するのに必要とされる医薬組成物の量を決定し、１つまたは複数の連続用量としての量を対象に投与するレジメンを含む。対象において標的細胞の死を誘導する方法では、標的細胞はがん細胞であり、がんは、癌腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、ＥＲ／ＰＲ＋乳がん、Ｈｅｒ２＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、悪性腹水を伴う結腸がん、粘液腫瘍、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（gastric cancer）、胃がん（stomach cancer）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、男化腫瘍、腺癌、肉腫、およびＢ細胞由来慢性リンパ性白血病であってもよい。がんを有する対象における本発明の方法の使用により、方法は、全生存期間、症状評価項目、無病生存、客観的奏功率、完全奏効、奏効期間、無増悪生存期間、無増悪期間、治療成功期間、腫瘍測定、腫瘍サイズ、腫瘍応答率、転移までの時間、およびバイオマーカー濃度であってもよい、臨床パラメーターまたは評価項目の改善をもたらす。他の場合、がんを有する対象における本発明の方法の使用は、キメラポリペプチドアセンブリーの第１の部分を含み、第２の部分および第３の部分を含まない組成物の、同等の対象へのｍｍｏｌ／ｋｇの同等用量の投与と比較して、対象における診断的に関連する副作用の頻度、持続期間、または重症度の減少をもたらし、副作用は、以下：ＩＬ−２の血漿レベルの増大、ＴＮＦ−アルファの血漿レベルの増大、ＩＦＮ−ガンマの血漿レベルの増大、敗血症、発熱性好中球減少症、神経毒性、痙攣、脳症、サイトカイン放出症候群、言語障害、平衡障害、発熱、頭痛、混乱、低血圧、好中球減少症、悪心、意識障害、見当識障害、および肝酵素の増加の１つまたは複数であってもよい。
さらに他の場合、本発明は、腫瘍特異的マーカーを含む腫瘍細胞に治療剤を送達する方法であって、標的細胞に、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つに記載のキメラポリペプチドアセンブリーを投与することを含み、治療剤が、腫瘍特異的マーカーに特異的に結合する第１の部分の第１の結合ドメインを介して標的細胞に送達される、方法を提供する。前述において、腫瘍特異的マーカーは、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２ ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６ βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ１３３、ガングリオシドＧＤ３；９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原１、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、胎児アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、ＣＤ２５、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ミュラー管抑制物質受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、シアル化Ｔｎ抗原（ｓ ＴＮ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＡＧ７２、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原）、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｇ２５０、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＤＬＫ１、ＳＰ１７、ＲＯＲ１、およびＥｐｈＡ２からなる群から選択される。必要に応じて、腫瘍特異的マーカーは、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＦＯＬＲ１、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）／ＨＥＲ３、ＨＥＲ２／３、メソテリン、ＭＵＣ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２からなる群から選択される。方法の一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーは、表１２の配列からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。方法の別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーは、図３６または図３７に記載される配列からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。前述の方法のある実施形態では、腫瘍細胞は対象における腫瘍中に存在し、対象はマウス、ラット、サル、イヌ、およびヒトであってもよい。
別の態様では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の物理的特徴および対象に投与された場合の得られる特性に関する。本明細書に開示されるキメラポリペプチドアセンブリーの実施形態に関して、キメラポリペプチドアセンブリーの第２の部分も第３の部分も、第１の部分に対する特異的結合親和性を有さない。本明細書に開示される各キメラポリペプチドアセンブリーの実施形態について、第１の部分は、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの分子量の５０％未満を占める。別の実施形態では、本明細書に開示されるキメラポリペプチドアセンブリーの実施形態の第１の部分は、見かけの分子量係数がサイズ排除クロマトグラフィーによって評価される場合、キメラポリペプチドアセンブリーの見かけの分子量係数の３０％未満、または４０％未満、または５０％未満を占める。さらに、第２の部分が切断され、本明細書に開示されるいずれかのキメラポリペプチドアセンブリーの実施形態から前記第１の部分および前記第３の部分が放出されると、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって評価される場合、放出された第１の部分の流体力学半径は、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの流体力学半径の約３０％未満、または約４０％未満、または約５０％未満である。一実施形態では、本発明は、第２の部分が切断され、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第１の部分および前記第３の部分が放出されると、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される場合、放出された第１の部分の流体力学半径が、約５ｎｍ未満、または約４ｎｍ未満、または約３ｎｍ未満である、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。したがって、放出された第１の部分は、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーと比較して、腫瘍組織に浸透する高い能力を有する。別の実施形態では、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される場合、本明細書に開示されるインタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの流体力学半径は、約８ｎｍより大きい、または約９ｎｍより大きい、または約１０ｎｍより大きい。したがって、腫瘍を有する対象に投与されたインタクトなキメラポリペプチドアセンブリーは、腫瘍の血管系から溢出する能力と比較して、対象の正常組織の血管系から溢出する能力が低い。
キメラポリペプチドアセンブリー組成物の実施形態は、本明細書に開示される特性の１つもしくは複数またはその任意の組合せを示してもよいことが具体的に企図される。さらに、処置方法は、本明細書に開示される特性の１つもしくは複数またはその任意の組合せを示してもよいことが具体的に企図される。
参照による組込み
本明細書に記載される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されたのと同程度で参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の特徴および利点は、以下の詳細な説明および例示的な実施形態を記載する添付の図面を参照することによってさらに説明されうる。
図１は、様々な図面で使用される様々な概略図を、それらが表す説明と共に描写する。
図２は、非切断「プロ」型、および腫瘍関連プロテアーゼによる作用を受けた後の切断された状態であるＰｒｏＴＩＡ組成物（本明細書においてキメラポリペプチドアセンブリーとしても記載される）を描写する。図はまた、組成物の両方の型の非限定的な特性の一部も記載する。
図３は、図３Ａに非切断「プロ」型および図３Ｂに切断型を示し、非切断型を、それぞれ細胞表面抗原と共にエフェクター細胞および腫瘍関連細胞の近位に描写する。しかし、図３Ａの非切断型は、標的化（または結合）ドメインのバルキング部分の立体妨害および遮蔽効果のために２つの細胞に同時に結合することができないが、図３Ｂの切断型は、標的化ドメインが放出され、２つの細胞が同時に結合することを可能にし、エフェクター細胞による標的の腫瘍関連細胞に対する免疫活性化を可能にする。
図４は、放出断片およびバルキング部分がエフェクター細胞結合部分または腫瘍抗原結合部分のいずれかに付着することができることを例証する、ＰｒｏＴＩＡ組成物の２つの構成の略図を示す。
図５は、２つの放出断片と２つのバルキング部分が結合部分に連結されている、ＰｒｏＴＩＡ組成物の２つの構成の略図を示す。図５Ａの場合、１つのＲＳとバルキング部分がエフェクター細胞結合部分に連結され、他のＲＳとバルキング部分が腫瘍抗原結合部分に連結され、組成物はｓｃＦｖの構成であろう。図５Ｂの場合、ＲＳとバルキング部分の両方がエフェクター細胞結合部分（左側）または腫瘍抗原結合部分（右側）のいずれかに付着し、結合部分は、ダイアボディの構成であろう（このため、組成物を組換え型で産生することができる）。
図６Ａ〜６Ｄは、バルキング部分がＸＴＥＮポリペプチドであり、ＲＳとバルキング部分がエフェクター細胞結合部分（左側）に連結され、またはＲＳとバルキング部分が腫瘍抗原結合部分（右側）に連結されている、いずれかのＰｒｏＴＩＡ組成物の２つの構成の略図を示す。
図７は、２つの放出断片と２つのＸＴＥＮが結合部分に連結されている、ＰｒｏＴＩＡ組成物の２つの構成の略図を示す。図７Ａの場合、１つのＲＳと１つのＸＴＥＮが、エフェクター細胞結合部分に連結され、他のＲＳとバルキング部分が腫瘍抗原結合部分に連結され、組成物は、ｓｃＦｖの構成であろう。図７Ｂの場合、ＲＳとＸＴＥＮの両方が、エフェクター細胞結合部分（右側）または腫瘍抗原結合部分（左側）のいずれかに付着し、結合部分はダイアボディの構成であろう（このため、組成物を組換え型で産生することができる）。
図８は、ＲＳとバルキング部分が、エフェクター細胞結合部分（左側）または腫瘍抗原結合部分（右側）のいずれかに連結されている、ＰｒｏＴＩＡ組成物の２つの構成の略図を示す。図８Ａは、ＸＴＥＮとしての結合部分を描写する。図８Ｂは、アルブミンとしての結合部分を描写する。図８Ｃは、Ｆｃ断片としての結合部分を描写する。
図９は、２つの放出断片と２つのバルキング部分が結合部分に連結されている、ＰｒｏＴＩＡ組成物の構成の略図を示す。図９Ａの場合、２つのＲＳとＸＴＥＮが、エフェクター細胞結合部分および腫瘍抗原結合部分の両方（左側）に、腫瘍抗原結合部分（中央）に、またはエフェクター細胞結合部分（右側）に連結されている、３つの構成を描写する。図９Ｂは、１つのＲＳとＸＴＥＮが、エフェクター細胞結合部分に連結され、なおかつ１つのＲＳとアルブミンが、腫瘍抗原結合部分に連結されている（左上側）、１つのＲＳとＸＴＥＮが腫瘍抗原結合部分に連結され、なおかつ１つのＲＳとアルブミンがエフェクター細胞結合部分に連結されている（右上側）、ＲＳとＸＴＥＮおよびＲＳとアルブミンの両方が腫瘍抗原結合部分に連結されている（左下側）、ならびにＲＳとＸＴＥＮおよびＲＳとアルブミンの両方がエフェクター細胞結合部分に連結されている（右下側）、４つの構成を描写する。図９Ｃは、１つのＲＳとＸＴＥＮがエフェクター細胞結合部分に連結され、なおかつ１つのＲＳとＦｃが腫瘍抗原結合部分に連結され（左上側）、１つのＲＳとＸＴＥＮが腫瘍抗原結合部分に連結され、なおかつ１つのＲＳとＦｃがエフェクター細胞結合部分に連結され（右上側）、ＲＳとＸＴＥＮおよびＲＳとＦｃの両方が腫瘍抗原結合部分に連結され（左下側）、ＲＳとＸＴＥＮおよびＲＳとＦｃの両方がエフェクター細胞結合部分に連結されている（右下側）、４つの構成を描写する。
図１０は、腫瘍組織（左側）および正常組織（右側）の近位のＰｒｏＴＩＡの略図を示し、腫瘍組織におけるより透過性の血管系により、ＰｒｏＴＩＡを組織内に溢出させ、組織内で腫瘍関連プロテアーゼがＲＳに作用して、ＲＳを切断して結合部分を放出することができ、次に結合部分がエフェクター細胞と腫瘍関連細胞に同時に結合することができる。正常組織の場合、溢出は、より堅固な血管系障壁によって遮断されるか、またはＰｒｏＴＩＡが溢出する場合は、ＰｒｏＴＩＡは、「プロ」型のままで、エフェクター細胞に結合することができ、腫瘍細胞が存在しないか、または存在しても、存在するプロテアーゼが結合部分を放出させるには不十分で、真の影響は、免疫シナプスが形成されないことである。
図１１は、それぞれＶＨ／ＶＬ対がリンカーによって接合された、タンデムフォーマットのエフェクター細胞結合部分、腫瘍抗原結合部分のｓｃＦｖの構成の略図を示す。
図１２は、それぞれＶＨ／ＶＬ対がリンカーによって接合された、エフェクター細胞結合部分、腫瘍抗原結合部分のダイアボディの構成の略図を示す。
図１３Ａは、一般的な構築物設計の略図を示す。図１３Ｂおよび１３Ｃは、エフェクター細胞結合部分および腫瘍抗原結合部分が様々な順序で、ｓｃＦｖの構成で存在する（図１３Ｂ）［可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインが分子内長鎖リンカー（Ｌ）または分子内短鎖リンカー（Ｉ）のいずれかによって連結されている］、およびダイアボディの構成で存在する（図１３Ｃ）［ＶＨおよびＶＬドメインが長鎖リンカー（Ｌ）または分子内短鎖リンカー（Ｉ）のいずれかによって連結されている］、ＰｒｏＴＩＡ組成物の略図を示す。
図１４は、実施例２に記載される、発酵培地からの非切断ＡＣ１２７８の精製を示す。図１４Ａは、発酵培地からのＡＣ１２７８のＩＭＡＣ捕獲の例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図１４Ｂは、ＨＩＣ研磨ステップの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図１４Ｃは、ＩｍｐＲｅｓ−Ｑ研磨ステップの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
図１５は、実施例２に記載される、非切断ＡＣ１２７８のロット放出分析を示す。図１５Ａは、ＸＴＥＮの長さの標準物質（破線）に対する非切断ＡＣ１２７８（実線）のロット放出分析的ＳＥＣクロマトグラフィーを示す。図１５Ｂは、非切断ＡＣ１２７８のロット放出ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
図１６は、実施例２に記載される、非切断ＡＣ１２７８を使用する切断型ＰｒｏＴＩＡ−Ａの調製を示す。図１６Ａは、ＭＭＰ−９消化反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図１６Ｂは、切断されたＸＴＥＮ断片を除去するためのＭＭＰ−９消化混合物のＩＭＡＣ精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
図１７は、実施例２に記載される、切断ＡＣ１２７８のロット放出分析を示す。図１７Ａは、球状タンパク質標準物質（破線）に対する切断ＡＣ１２７８（実線）のロット放出分析的ＳＥＣクロマトグラフィーを示す。図１７Ｂは、切断ＡＣ１２７８のロット放出ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
図１８は、実施例３に記載される、発酵培地からの非切断ＡＣ１４７６の精製を示す。図１８Ａは、発酵培地からのＡＣ１４７６のＩＭＡＣ捕捉の例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図１８Ｂは、ＨＩＣ研磨ステップの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図１８Ｃは、ＩｍｐＲｅｓ−Ｑ研磨ステップの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
図１９は、実施例３に記載される、非切断ＡＣ１４７６のロット放出分析を示す。図１９Ａは、ＸＴＥＮの長さの標準物質（破線）に対する非切断ＡＣ１４７６（実線）のロット放出分析的ＳＥＣクロマトグラフィーを示す。図１９Ｂは、クマシー染色による非切断ＡＣ１４７６のロット放出ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図１９Ｃは、銀染色による非切断ＡＣ１４７６のロット放出ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
図２０は、実施例３に記載される、非切断ＡＣ１４７６のさらなるロット放出分析を示す。図２０Ａは、非切断ＡＣ１４７６のロット放出ＥＳＩ−ＭＳを示す。図２０Ｂは、非切断ＡＣ１４７６のロット放出カチオン交換クロマトグラフィーを示す。
図２１は、実施例３に記載される、非切断ＡＣ１４７６を使用する切断型ＰｒｏＴＩＡ−Ａの調製を示す。図２１Ａは、ＭＭＰ−９消化反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図２１Ｂは、切断基質ならびに切断ＸＴＥＮ断片を除去するためのＭＭＰ−９消化混合物のアニオン交換画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
図２２は、実施例３に記載される切断ＡＣ１４７６のロット放出分析を示す。図２２Ａは、球状タンパク質標準物質（破線）に対する切断ＡＣ１４７６（実線）のロット放出分析的ＳＥＣを示す。図２２Ｂは、クマシー染色による切断ＡＣ１４７６のロット放出ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図２２Ｃは、銀染色による切断ＡＣ１４７６のロット放出ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
図２３は、実施例３に記載される切断ＡＣ１４７６のさらなるロット放出分析を示す。図２３Ａは、切断ＡＣ１４７６のロット放出ＥＳＩ−ＭＳを示す。図２３Ｂは、切断ＡＣ１４７６のロット放出カチオン交換クロマトグラフィーを示す。
図２４は、実施例４に記載される、プロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの、リガンドに対する結合を示す。
図２５は、実施例６に記載される、プロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を決定する実験の結果を描写する。
図２６は、実施例６に記載される、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ特異性を決定する実験の結果を描写する。
図２７は、実施例６に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を決定する実験の結果を描写する。
図２８は、実施例９に記載される、プロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのＰＫを決定する実験の結果を描写する。
図２９は、Ｔ細胞結合組成物のＮ末端からＣ末端に逆向きの構成の略図を示す。図２９Ａは、エフェクター細胞結合部分（ＥＣＢＭ）の後に放出部位断片（ＲＳ）およびＸＴＥＮが続く構成を示し、図２９Ｂは、ＸＴＥＮの後にＲＳ断片およびその後にＥＣＢＭが続く構成を示す。
図３０は、実施例６に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのＳＫ−ＯＶ３におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を決定する実験の結果を描写する。
図３１は、実施例１０に記載される、プロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの抗腫瘍効果を決定する実験の腫瘍体積の結果を描写する。
図３２は、実施例１０に記載される、プロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの抗腫瘍効果を決定する実験の体重の結果を描写する。
図３３は、実施例１２に記載される、プロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのサイトカインプロファイルを決定する実験の結果を描写する。図３３Ａは、ＩＬ−２を検出するアッセイの結果を示し、図３３Ｂは、ＩＬ−４を検出するアッセイの結果を示す。
図３４は、実施例１２に記載される、プロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのサイトカインプロファイルを決定する実験の結果を描写する。図３４Ａは、ＩＬ−６を検出するアッセイの結果を示し、図３４Ｂは、ＩＬ−１０を検出するアッセイの結果を示す。
図３５は、実施例１２に記載される、プロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのサイトカインプロファイルを決定する実験の結果を描写する。図３５Ａは、ＩＦＮ−ガンマを検出するアッセイの結果を示し、図３５Ｂは、ＴＮＦ−アルファを検出するアッセイの結果を示す。
図３６は、ＡＣ１４７６ ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのアミノ酸配列である。
図３７は、ＡＣ１４８９ ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのアミノ酸配列である。
図３８は、実施例１３に記載される、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、および非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの抗腫瘍効果を決定する実験のＨＣＴ−１１６腫瘍体積の結果を描写する。
図３９は、実施例１３に記載される、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、および非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの抗ＨＣＴ−１１６腫瘍効果を決定する実験の体重の結果を描写する。
図４０は、実施例１４に記載される、ヒト精製ＣＤ３陽性Ｔ細胞の存在下での、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのＳＫ−ＯＶ−３におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を決定する実験の結果を描写する。
図４１は、実施例１４に記載される、ヒト精製ＣＤ３陽性Ｔ細胞の存在下での、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのＯＶＣＡＲ−３におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を決定する実験の結果を描写する。
図４２は、実施例８に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる、ＰＢＭＣおよびＳＫ−ＯＶ−３細胞の同時培養におけるＣＤ８およびＣＤ４細胞におけるＣＤ６９の活性化を測定する実験の結果を描写する。図４２Ａは、ＣＤ８細胞におけるＣＤ６９の活性化を描写し、図４２Ｂは、ＣＤ４細胞におけるＣＤ６９の活性化を描写する。
図４３は、実施例８に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる、ＰＢＭＣおよびＳＫ−ＯＶ−３細胞の同時培養におけるＣＤ８およびＣＤ４細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５両方の活性化を測定する実験の結果を描写する。図４３Ａは、ＣＤ８細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５両方の活性化を描写し、図４３Ｂは、ＣＤ４細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５両方の活性化を描写する。
図４４は、実施例８に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる、精製ＣＤ３＋細胞およびＳＫ−ＯＶ−３細胞の同時培養におけるＣＤ８およびＣＤ４細胞におけるＣＤ６９の活性化を測定する実験の結果を描写する。図４４Ａは、ＣＤ８細胞におけるＣＤ６９の活性化を描写し、図４４Ｂは、ＣＤ４細胞におけるＣＤ６９の活性化を描写する。
図４５は、実施例８に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる、精製ＣＤ３＋細胞およびＳＫ−ＯＶ−３細胞の同時培養におけるＣＤ８およびＣＤ４細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５両方の活性化を測定する実験の結果を描写する。図４５Ａは、ＣＤ８細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５両方の活性化を描写し、図４５Ｂは、ＣＤ４細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５両方の活性化を描写する。
図４６は、実施例８に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる、精製ＣＤ３＋細胞およびＯＶＣＡＲ３細胞の同時培養におけるＣＤ８およびＣＤ４細胞におけるＣＤ６９の活性化を測定する実験の結果を描写する。図４６Ａは、ＣＤ８細胞におけるＣＤ６９の活性化を描写し、図４６Ｂは、ＣＤ４細胞におけるＣＤ６９の活性化を描写する。
図４７は、実施例８に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる、精製ＣＤ３＋細胞およびＯＶＣＡＲ３細胞の同時培養におけるＣＤ８およびＣＤ４細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５両方の活性化を測定する実験の結果を描写する。図４７Ａは、ＣＤ８細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５両方の活性化を描写し、図４７Ｂは、ＣＤ４細胞におけるＣＤ６９およびＣＤ２５両方の活性化を描写する。
図４８は、実施例８に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる、ＰＢＭＣおよびＯＶＣＡＲ３細胞の同時培養におけるＣＤ８およびＣＤ４細胞におけるＣＤ６９の活性化を測定する実験の結果を描写する。図４８Ａは、ＣＤ８細胞におけるＣＤ６９の活性化を描写し、図４８Ｂは、ＣＤ４細胞におけるＣＤ６９の活性化を描写する。
図４９は、実施例８に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる、ＰＢＭＣおよびＯＶＣＡＲ３細胞の同時培養におけるＣＤ８およびＣＤ４細胞におけるＣＤ６９およびグランザイムＢ両方の活性化を測定する実験の結果を描写する。図４９Ａは、ＣＤ８細胞におけるＣＤ６９およびグランザイムＢ両方の活性化を描写し、図４９Ｂは、ＣＤ４細胞におけるＣＤ６９およびグランザイムＢ両方の活性化を描写する。
図５０は、実施例１５に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる、精製ＣＤ３＋細胞およびＳＫ−ＯＶ−３細胞の同時培養におけるサイトカインＩＬ−２およびＩＬ−４の放出を測定する実験の結果を描写する。図５０Ａは、放出されたＩＬ−２の濃度を描写し、図５０Ｂは、放出されたＩＬ−４の濃度を描写する。
図５１は、実施例１５に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる、精製ＣＤ３＋細胞およびＳＫ−ＯＶ−３細胞の同時培養におけるサイトカインＩＬ−６およびＩＬ−１０の放出を測定する実験の結果を描写する。図５１Ａは、放出されたＩＬ−６の濃度を描写し、図５１Ｂは、放出されたＩＬ−１０の濃度を描写する。
図５２は、実施例１５に記載される、プロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる、精製ＣＤ３＋細胞およびＳＫ−ＯＶ−３細胞の同時培養におけるサイトカインＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマの放出を測定する実験の結果を描写する。図５２Ａは、放出されたＴＮＦ−アルファの濃度を描写し、図５２Ｂは、放出されたＩＦＮ−ガンマの濃度を描写する。
図５３は、実施例１６に記載される、ＣＤ３εδリガンドに対するプロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、および非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの結合曲線を示す。
図５４は、実施例１７に記載される、ｒｈＥｐＣＡＭリガンドに対するプロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの結合特異性を示す。
図５５は、実施例１８に記載される、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、および非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの抗腫瘍効果を決定する実験のＳＷ４８０腫瘍体積の結果を描写する。
図５６は、実施例１８に記載される、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、および非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの抗ＳＷ４８０腫瘍効果を決定する実験の体重の結果を描写する。
図５７は、実施例２３に記載される、ヒトＰＢＭＣの存在下でのＳＫＯＶ３におけるプロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を決定する実験の結果を描写する。
図５８は、実施例２３に記載される、ヒトＰＢＭＣの存在下でのＯＶＣＡＲ３におけるプロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を決定する実験の結果を描写する。
図５９は、実施例２３に記載される、ヒトＰＢＭＣの存在下でのＨＣＴ１１６におけるプロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を決定する実験の結果を描写する。
図６０は、実施例２３に記載される、ヒトＰＢＭＣの存在下でのＳＷ４８０におけるプロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、およびプロテアーゼ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を決定する実験の結果を描写する。
本発明の実施形態を説明する前に、そのような実施形態は単に例示の目的で提供されており、本明細書で説明されている本発明の実施形態に対する様々な代替を本発明の実施で用い得ることを理解されたい。本発明から逸脱することなく、これより当業者は多くの変更、変形および置換を想到するだろう。
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書で説明されているものと類似のまたは等価の方法および物質を本発明の実施または試験で使用することができるが、適切な方法および物質を以下で説明する。矛盾する場合は、定義を含む本特許明細書が支配する。加えて、物質、方法および例は単なる例示であり、限定することを意図するものではない。本発明から逸脱することなく、これより当業者は多くの変更、変形および置換えを想到するだろう。
定義
本出願の文脈では、別途明記しない限り、以下の用語はこれらの用語に帰する意味を有する。
本明細書および本特許請求の範囲の全体を通して使用される場合、用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」を、後に上限が具体的に述べられている場合を除いて、これらの用語が「少なくとも１つ」、「少なくとも第１」、「１または複数」または「複数」の参照される構成要素またはステップを意味しているという意味で使用される。したがって、「切断配列」は、本明細書で使用される場合、「少なくとも第１の切断配列」を意味するが複数の切断配列を含む。組合せの作動可能な限界およびパラメーターは、任意の単剤の量と同様に、本開示を踏まえて当業者に公知であるだろう。
本明細書では、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用される。このポリマーは直鎖であってもよいし分枝していてもよく、改変アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により中断されていてもよい。これらの用語はまた、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作（例えば標識成分とのコンジュゲーション）により改変されているアミノ酸ポリマーも包含する。
用語「単量体」は、ポリペプチドに適用される場合、このポリペプチドの状態が、同一または異なる配列の１つもしくは複数の追加のポリペプチドを実質的に伴わない単一の連続したアミノ酸配列であることを指す。このポリペプチドの単量体状態を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、分子量が同一である単一のタンパク質性実体として確認することができる。
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、Ｄ型光学異性体もしくはＬ型光学異性体の両方を含むがこれらに限定されない、天然のおよび／または非天然のもしくは合成のアミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体のいずれかを指す。アミノ酸を、標準的な１文字コードまたは３文字コードを使用して指定することができる。
用語「天然Ｌ−アミノ酸」または「Ｌ−アミノ酸」は以下のＬ型光学異性体形態を意味する：グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）。
用語「天然には存在しない」は、配列に適用される場合および本明細書で使用される場合、哺乳動物で見出される野生型のまたは天然に存在する配列に対するカウンターパートを有しない、この配列に対して相補的ではないまたはこの配列との高度の相同性を有しないポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、天然には存在しないポリペプチドまたは断片は、適切にアラインさせた場合に天然配列と比較して９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％以下またはさらに低いアミノ酸配列同一性を共有し得る。
用語「親水性」および「疎水性」は、物質が有する水に対する親和性の程度を指す。親水性物質は水に対して強い親和性を有し、水に溶解する傾向、水と混合する傾向または水に濡れる傾向があり、疎水性物質は、水に対する親和性を実質的に欠いており、水をはじいて吸収しない傾向がありかつ水に溶解しない傾向または水と混合しない傾向または水に濡れない傾向がある。アミノ酸を、その疎水性に基づいて特徴付けることができる。いくつかの尺度が開発されている。一例は、Levitt, Mら、J Mol Biol （１９７６年）１０４巻：５９頁により開発された尺度であり、この尺度は、Hopp, TPら、Proc Natl Acad Sci U S A （１９８１年）７８巻：３８２４頁で列挙されている。「親水性アミノ酸」の例は、アルギニン、リシン、トレオニン、アラニン、アスパラギンおよびグルタミンである。特に興味深いのは、親水性アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸およびセリンおよびグリシンである。「疎水性アミノ酸」の例は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシンおよびバリンである。
「断片」とは、生物学的に活性なタンパク質（抗体ではない）に適用される場合、治療上活性なおよび／または生物活性の少なくとも一部を保持する生物学的に活性なタンパク質のトランケート型のことである。「バリアント」とは、生物学的に活性なタンパク質に適用される場合、生物学的に活性なタンパク質の治療活性および／または生物活性の少なくとも一部を保持する生物学的に活性な天然タンパク質に対する配列相同性を有するタンパク質のことである。例えば、バリアントタンパク質は、生物学的に活性な参照タンパク質と比較して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を共有することができる。本明細書で使用される場合、用語「生物学的に活性なタンパク質バリアント」は、例えば部位特異的変異誘発、コード遺伝子の合成、挿入により故意に改変され、または変異により偶然に改変され、活性を保持するタンパク質を含む。
用語「配列バリアント」は、１つもしくは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換により天然のまたは元々の配列と比較して改変されているポリペプチドを意味する。挿入は、タンパク質のどちらかのまたは両方の末端に位置していてもよく、アミノ酸配列の内部領域内に位置してもよい。非限定的な例は、異なるアミノ酸によるＸＴＥＮ中でのアミノ酸の置換である。欠失バリアントでは、本明細書で説明されているポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸残基が除去されている。したがって、欠失バリアントは、説明されているポリペプチド配列の全ての断片を含む。置換バリアントでは、ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基が除去されて代替残基で置換されている。一態様では、この置換は本質的に保存的であり、この種の保存的置換は当技術分野で周知である。
用語「部分」は、より大きな構成物の一成分を意味するか、またはより大きな構成物に組み込まれることが意図されていること、例えば、より大きなポリペプチドに連続的なまたは非連続的な配列として接合されるタンパク質性部分を意味する。より大きな構成物の部分は所望の機能を付与することができる。例えば、バルキング部分は、このバルキング部分が会合している、結果として得られるより大きな構成物の分子量および／または半減期を増加させる機能を付与することができる。
用語「放出セグメント」または「ＲＳ」は、１つまたは複数のプロテアーゼにより認識されて切断され得る構成物中の切断配列であって、この構成物から１つまたは複数の位置または部分を放出させる切断配列を指す。本明細書で使用される場合、「哺乳動物プロテアーゼ」は、体液、細胞、組織中に通常存在しかつ哺乳動物のある特定の標的組織または細胞中、例えば疾患組織（例えば、腫瘍）中において高レベルで見出され得るプロテアーゼを意味する。ＲＳ配列は、対象における標的組織中に存在するかもしくはこの標的組織に近位である、またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて導入される様々な哺乳動物プロテアーゼまたは多数の哺乳動物プロテアーゼにより切断されるように操作され得る。規定された切断部位を認識することが可能である他の等価のプロテアーゼ（内因性または外因性）を利用することができる。ＲＳ配列は、利用されるプロテアーゼに対して調節されかつ調整され得、リンカーアミノ酸を組み込んで隣接ポリペプチドに接合され得ることが具体的に企図される。
用語「内」は、第２のポリペプチドに連結されている第１のポリペプチドに言及する場合、第１または第２のポリペプチドのＮ末端をそれぞれ第２または第１のポリペプチドのＣ末端に接続する追加の成分の連結または融合、ならびに第２のポリペプチドの配列中への第１のポリペプチドの挿入を包含する。例えば、ＲＳ成分がキメラポリペプチドアセンブリー「内」で連結されている場合、このＲＳは、ＸＴＥＮポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端に連結され得るか、またはこのＸＴＥＮポリペプチドの任意の２つのアミノ酸間に挿入され得る。
「活性」は、本明細書で提供される組成物の形態に適用される場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイにより測定されるか臨床効果により測定されるかにかかわらず、この組成物のエフェクター成分に関する、受容体結合、アンタゴニスト活性、アゴニスト活性、細胞性のもしくは生理的な応答、細胞溶解、細胞死、または当技術分野で一般に公知の効果を含むがこれらに限定されない、作用または効果を指す。
「エフェクター細胞」は、本明細書で使用される場合、標的細胞に影響を及ぼし得る任意の真核細胞を含む。例えば、エフェクター細胞は、標的細胞の膜の完全性、核濃縮、核崩壊、アポトーシス、溶解および／または死滅の喪失を誘導することができる。別の例では、エフェクター細胞は、標的細胞の分裂、増殖、分化を誘導することができ、またはその他の方法で標的細胞のシグナル伝達を変化させることができる。エフェクター細胞の非限定的な例として、形質細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４細胞、ＣＤ８細胞、Ｂ細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ細胞）、マスト細胞、樹状細胞、調節性Ｔ細胞（ＲｅｇＴ細胞）、ヘルパーＴ細胞、骨髄性細胞、マクロファージおよびＮＫ細胞が含まれる。
「エフェクター細胞抗原」は、エフェクター細胞により発現される分子を指し、タンパク質、糖タンパク質またはリポタンパク質等の細胞表面分子が含まれるがこれに限定されない。例示的なエフェクター細胞抗原として、ＣＤ３複合体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ６９、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、ＣＤ９５、ＣＤ１０７およびＣＤ１５４のタンパク質と、エフェクター分子、例えば、エフェクター細胞に関連するサイトカイン、エフェクター細胞に結合するサイトカイン、エフェクター細胞内で発現されるサイトカイン、またはエフェクター細胞により発現されて放出されるサイトカインとが含まれる。エフェクター細胞抗原は、対象キメラポリペプチド会合体の結合ドメインの結合カウンターパートとして機能することができる。対象組成物が結合し得るエフェクター細胞抗原の非限定的な例として、細胞表面上の抗原、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ６９、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、ＣＤ９５、ＣＤ１０７およびＣＤ１５４と、ＩＬ２、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＦＮγおよびＴＮＦαから選択されるＴｈ１サイトカインが含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「ＥＬＩＳＡ」は、本明細書で説明されているまたは当技術分野で公知の酵素結合免疫吸着アッセイを指す。
「宿主細胞」は、外因性核酸が導入されている、本明細書で説明されているもの等の対象ベクターのレシピエントであり得るまたはレシピエントである個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は単一宿主細胞の子孫を含む。この子孫は、天然の、偶発的なまたは意図的な変異に起因して、元の親細胞に対して（形態においてまたは全ＤＮＡ相補体のゲノムにおいて）必ずしも完全に同一である必要はないかもしれない。宿主細胞として、本発明のベクターによりｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞が含まれる。
「単離された」は、本明細書で開示されている様々なポリペプチドを説明するために使用される場合、（例えばタンパク質精製中に）その天然環境の成分またはより複雑な混合物から同定されて分離されているおよび／または回収されているポリペプチドを意味する。その天然環境の夾雑成分は、概してポリペプチドの診断的なまたは治療的な使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性のまたは非タンパク質性の溶質を含み得る。当業者には明らかであるように、天然には存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片は、その天然に存在するカウンターパートから区別するための「単離」を必要としない。加えて、「濃縮された」、「分離された」または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片は、体積当たりの分子の濃度または数が概してその天然に存在するカウンターパートの場合と比べて大きいという点で、その天然に存在するカウンターパートと区別可能である。一般に、組換え手段により作製されて宿主細胞中で発現されたポリペプチドは、「単離されている」と見なされる。
「単離された核酸」とは、同定されかつこのポリペプチドコード核酸の天然源中において通常関連する少なくとも１種の夾雑核酸分子から分離されている核酸分子のことである。例えば、単離されたポリペプチドコード核酸分子は、それが天然で見出される形態または状況以外で存在する。したがって、単離されたポリペプチドコード核酸分子は、それが天然細胞中に存在する場合には特定のポリペプチドコード核酸分子と区別される。しかしながら、単離されたポリペプチドコード核酸分子は、通常はポリペプチドを発現する細胞に含まれるポリペプチドコード核酸分子を含み、例えば、この核酸分子は、天然細胞の場合とは異なる染色体または染色体外の位置に存在する。
「キメラ」タンパク質またはポリペプチドは、天然に存在する場合とは配列中の位置が異なる少なくとも１つの領域を含む少なくとも１つの融合ポリペプチドを含む。これらの領域は、通常は別個のタンパク質に存在し得、かつ融合ポリペプチド中で一緒になるか、または通常は同一のタンパク質中に存在し得るが融合ポリペプチド中では新たな配置に置かれる。例えば、化学合成により、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドの作成および翻訳により、キメラタンパク質を作成することができる。
「融合した」および「融合」は本明細書において互換的に使用され、２つまたはそれよりも多くのペプチドまたはポリペプチド配列を組換え手段により一緒に接合することを指す。「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」は、自然界では天然に連結されない第２のアミノ酸配列に連結された第１のアミノ酸配列を含む。
「ＸＴＥＮ化」は、組換え手段によるか化学的架橋手段によるかにかかわらず、１つまたは複数のＸＴＥＮポリペプチド（以下に記載する）のペプチドまたはポリペプチドへの連結または融合により改変されているペプチドまたはポリペプチドを示すために使用される。
「作動可能に連結された」は、連結されるＤＮＡ配列が連続しておりかつ読取り相中に存在するかまたはインフレームであることを意味する。「インフレーム融合」は、元のＯＲＦの正しいリーディングフレームを維持する方法で、連続するより長いＯＲＦを形成するための２つまたはそれよりも多くのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の接合を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがポリペプチド配列の転写に影響を及ぼす場合、このプロモーターまたはエンハンサーはポリペプチドのコード配列に作動可能に連結されている。そのため、結果として得られる組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによりコードされるポリペプチドに対応する２つまたはそれよりも多くのセグメント（これらのセグメントは通常、自然界ではそのように接合されていない）を含む単一タンパク質である。
「架橋する」、「コンジュゲートする」、「連結」、「連結する」および「接合される」は本明細書では互換的に使用され、化学反応による２つの異なる分子の共有結合的な接合を指す。架橋は、当技術分野で公知であるように、１つまたは複数の化学反応で起こり得る。
用語「コンジュゲーションパートナー」は、本明細書で使用される場合、コンジュゲーション反応で連結され得るまたは連結されている個々の成分を指す。
用語「コンジュゲート」（名詞として使用される）は、コンジュゲーションパートナー同士を共有結合的に連結する結果として形成された異種分子を指すように意図されており、例えば、放出セグメントに共有結合的に連結された結合ドメインを指すように意図されている。
「架橋剤（cross-linker）」および「架橋剤（cross-linking agent）」は、使用される化学的実体が２つまたはそれよりも多くの実体に共有結合的に接合されることを意味するために、互換的にかつその最も広い文脈で使用される。例えば、架橋剤は、２つ、３つ、４つもしくはそれよりも多くのペプチドをＸＴＥＮに接合させるか、または１つのペプチドをＸＴＥＮに接合させる。架橋剤が、反応物の架橋後に残存する共有結合した反応生成物を指すことができることを当業者は理解するだろう。架橋剤はまた、まだ反応していないが別の実体を反応することができる１つまたは複数の反応物を含むこともできる。
ポリペプチドの文脈では、「直鎖配列」または「配列」とは、この配列中で互いに隣接する残基がポリペプチドの一次構造で連続しているカルボキシル末端（Ｎ末端からＣ末端への）方向へのアミノでのポリペプチド中のアミノ酸の順序のことである。「部分配列」とは、ポリペプチドにおいて一方または両方の方向で追加の残基を含むことが公知である部分の直鎖配列のことである。
「異種」は、比較される実体の残りとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、天然コード配列から除去されかつこの天然配列以外のコード配列に作動可能に連結されたグリシンリッチ配列は、異種グリシンリッチ配列である。用語「異種」は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される場合、このポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、比較される実体の残りのものとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は互換的に使用される。これらは任意の長さのヌクレオチドを指し、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかの単一の核酸および複数の核酸を包含する。ポリヌクレオチドは任意の３次元構造を有することができ、かつ公知または未知の任意の機能を実行することができる。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義された遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体等のポリヌクレオチドは改変ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への改変をポリマーの組立ての前後に付与することができる。ヌクレオチドの配列が非ヌクレオチド成分で中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより、重合後にさらに改変されてもよい。
用語「ポリヌクレオチドの相補体」は、完全な忠実度で参照配列とハイブリダイズすることができるように、参照配列と比較して相補的な塩基配列および逆配向を有するポリヌクレオチド分子を示す。
「組換え」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、このポリヌクレオチドが、クローニング、制限および／またはライゲーションステップを含み得る組換えステップと宿主細胞中で組換えタンパク質の発現をもたらす他の手順との様々な組合せの産物であることを意味する。
用語「遺伝子」および「遺伝子断片」は本明細書では互換的に使用される。これらは、転写および翻訳の後に特定のタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子または遺伝子断片は、ポリヌクレオチドが少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む限りにおいてゲノムまたはｃＤＮＡであり得、このオープンリーディングフレームはコード領域全体またはそのセグメントを包含し得る。「融合遺伝子」とは、一緒に連結されている少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドで構成されている遺伝子のことである。
本明細書で使用される場合、「コード領域」または「コード配列」とは、ポリヌクレオチドにおいてアミノ酸へと翻訳可能なコドンからなる部分のことである。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は概してアミノ酸へと翻訳されないけれどもコード領域の一部であると考えられ得るが、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン等はコード領域の一部ではない。コード領域の境界は概して、５’末端での開始コドンであって、結果として得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする開始コドンと、３’末端での翻訳終止コドンであって、結果として得られるポリペプチドのカルボキシ末端をコードする翻訳終止コドンとにより決定される。本発明の２つまたはそれよりも多くのコード領域は、単一のポリヌクレオチド構築物中、例えば単一ベクター上にまたは別個のポリヌクレオチド構築物中、例えば別個の（異なる）ベクター上に存在することができる。したがって、単一ベクターは単一のコード領域のみを含むことができ、または２つもしくはそれよりも多くのコード領域を含むことができ、例えば、単一ベクターは、以下で説明する結合ドメインＡと結合ドメインＢとを別個にコードすることができる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明の結合ドメインをコードする核酸に融合しているまたは融合していない異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域は、分泌シグナルペプチドもしくは異種機能ドメイン等の特殊なエレメントまたはモチーフが含むがこれらに限定されない。
用語「下流」は、参照ヌクレオチド配列に対して３’に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、下流ヌクレオチド配列は、転写の開始点に後続する配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写の開始部位の下流に位置する。
用語「上流」は、参照ヌクレオチド配列に対して５’に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、上流ヌクレオチド配列は、コード領域または転写の開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは転写の開始部位の上流に位置する。
「相同性」または「相同の」は、２つもしくはそれよりも多くのポリヌクレオチド配列の間のまたは２つもしくはそれよりも多くのポリペプチド配列の間の配列の類似性または互換性を指す。ＢｅｓｔＦｉｔ等のプログラムを使用して２つの異なるアミノ酸配列の間の配列の同一性、類似性または相同性を決定する場合、デフォルトの設定を使用してもよいし、適切なスコアリングマトリックス、例えばｂｌｏｓｕｍ４５もしくはｂｌｏｓｕｍ８０を選択して同一性、類似性または相同性のスコアを最適化してもよい。好ましくは、相同であるポリヌクレオチドは、本明細書で定義されているストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、この配列と比較して少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％の、より好ましくは少なくとも９０％の、より好ましくは９５％の、より好ましくは９７％の、より好ましくは９８％の、さらにより好ましくは９９％の配列同一性を有する。相同であるポリペプチドは、比較可能な長さの配列全体にわたり最適にアラインさせた場合に、少なくとも７０％であり、好ましくは少なくとも８０％であり、さらにより好ましくは少なくとも９０％であり、さらにより好ましくは少なくとも９５〜９９％同一である配列同一性を好ましくは有する。
「ライゲーション」は、ポリ核酸に適用される場合、２つの核酸断片または遺伝子の間にホスホジエステル結合を形成し、それらを一緒に連結するプロセスを指す。ＤＮＡ断片または遺伝子を一緒にライゲートするために、ＤＮＡの末端は互いに適合しなければならない。場合によっては、これらの末端は、エンドヌクレアーゼ消化後に直接適合する。しかしながら、一般にエンドヌクレアーゼ消化後に生じる突出末端を平滑末端へと最初に変換して、これらの末端をライゲーションに適合させることが必要であり得る。
用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ポリヌクレオチドが、他の配列と比べて検出可能に大きな程度（例えばバックグラウンドの少なくとも２倍）にその標的配列にハイブリダイズする条件への言及を含む。一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、洗浄ステップが実行される温度および塩濃度を参照して部分的に表現される。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオンであり、概してｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）であり、かつ温度が、短いポリヌクレオチド（例えば１０〜５０個のヌクレオチド）の場合には少なくとも約３０℃であり、長いポリヌクレオチド（例えば５０個よりも多いヌクレオチド）の場合には少なくとも約６０℃である条件であり、例えば、「ストリンジェントな条件」は、３７℃にての５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションと、６０℃〜６５℃にての０．１×ＳＳＣ／１％ＳＤＳでのそれぞれ１５分にわたる３回の洗浄とを含むことができる。あるいは、約６５℃、６０℃、５５℃または４２℃の温度を使用してもよい。ＳＳＣ濃度は約０．１〜２×ＳＳＣで変動してもよく、ＳＤＳは約０．１％で存在する。そのような洗浄温度は概して、定義されたイオン強度およびｐＨで特定の配列に対する熱融点と比べて約５℃〜２０℃低いように選択される。Ｔｍとは、標的配列の５０％が完全に一致したプローブにハイブリダイズする（定義されたイオン強度およびｐＨでの）温度のことである。核酸ハイブリダイゼーションのＴｍおよび条件を算出するための方程式は周知であり、Sambrook, J.ら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、２００１年で見出すことができる。典型的には、ブロッキング試薬を使用して非特異的ハイブリダイゼーションをブロックする。そのようなブロッキング試薬は、例えば、剪断されたおよび変性したサケ精子ＤＮＡを約１００〜２００μｇ／ｍｌ含む。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション等の特定の状況下では、約３５〜５０体積／体積％の濃度でのホルムアミド等の有機溶媒を使用してもよい。これらの洗浄条件についての有用な変形は当業者に容易に明らかであるだろう。
用語「パーセント同一性」、「配列同一性の百分率」および「％同一性」は、ポリヌクレオチド配列に適用される場合、標準化されたアルゴリズムを使用してアラインした少なくとも２つのポリヌクレオチド配列の間での一致する残基の百分率を指す。そのようなアルゴリズムは、標準化されかつ再現可能な方法で、比較される配列にギャップを挿入して２つの配列間のアラインメントを最適化することができ、したがって、これら２つの配列のより有意義な比較を達成する。パーセント同一性を、定義されたポリヌクレオチド配列全体の長さにわたり測定してもよいし、またはより短い長さにわたり測定してもよく、例えば、より大きな定義されたポリヌクレオチド配列から取り出した断片、例えば、少なくとも４５個の、少なくとも６０個の、少なくとも９０個の、少なくとも１２０個の、少なくとも１５０個の、少なくとも２１０個のまたは少なくとも４５０個の連続した残基の断片の長さにわたり測定してもよい。そのような長さは単なる例示であり、本明細書では表、図面または配列表に示される配列により支持される任意の断片長を使用して、百分率同一性が測定され得る長さを説明し得ることが理解される。配列同一性の百分率を、比較ウィンドウ上の２つの最適にアラインした配列を比較すること、一致した位置（同一残基が両方のポリペプチド配列中に生じる）の数を決定すること、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数（すなわちウィンドウサイズ）で除算すること、およびこの結果に１００を乗算して配列同一性の百分率を得ることにより算出する。異なる長さの配列を比較する場合、最短の配列が比較ウィンドウの長さを定義する。配列同一性を算出する場合には保存的置換は考慮されない。
本明細書で同定されているポリペプチド配列に関する「パーセント（％）配列同一性」を、配列をアラインさせ、最大パーセント配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入し、配列同一性の一部としてあらゆる保存的置換を考慮せず、それにより最適なアラインメントを得た後に、比較可能な長さまたはその一部の第２の参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一であるクエリー配列中のアミノ酸残基の百分率として定義する。パーセントアミノ酸配列同一性を決定することを目的とするアラインメントを、当技術分野の技術内である様々な方法で達成することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができ、このパラメーターは、比較される配列の全長にわたり最適なアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む。パーセント同一性を、定義されたポリペプチド配列全体の長さにわたり測定してもよいし、あるいはより短い長さにわたり測定してもよく、例えば、より大きな定義されたポリペプチド配列から取り出した断片、例えば、少なくとも１５個の、少なくとも２０個の、少なくとも３０個の、少なくとも４０個の、少なくとも５０個の、少なくとも７０個または少なくとも１５０個の連続した残基の断片の長さにわたり測定してもよい。そのような長さは単なる例示であり、本明細書では表、図面または配列表に示される配列により支持される任意の断片長を使用して、百分率同一性が測定され得る長さを説明し得ることが理解される。
ポリヌクレオチド配列の文脈で使用される「反復性」は、例えば所与の長さの同一ヌクレオチド配列の頻度等の配列における内部相同性の程度を指す。反復性を、例えば同一配列の頻度を分析することにより測定することができる。
用語「発現」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えばＲＮＡまたはポリペプチドを産生するプロセスを指す。発現として、ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物への転写、およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれるがこれらに限定されない。発現により「遺伝子産物」が産生される。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写により産生されるメッセンジャーＲＮＡまたは転写物から翻訳されるポリペプチドのどちらかであることができる。本明細書で説明されている遺伝子産物として、転写後修飾、例えばポリアデニル化もしくはスプライシングを有する核酸、または翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合もしくはタンパク分解性切断を有するポリペプチドがさらに含まれる。
「ベクター」または「発現ベクター」は互換的に使用され、好ましくは適切な宿主中で自己複製する核酸分子を指し、挿入されている核酸分子を宿主細胞中へとおよび／または宿主細胞間で移動させる。この用語には、ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞中への挿入のために主に機能するベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製のために主に機能するベクターの複製、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターが含まれる。また、上記機能のうちの複数を提供するベクターも含まれる。「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞中に導入された場合に、転写されてポリペプチドへと翻訳され得るポリヌクレオチドのことである。「発現系」は通常、所望の発現産物を生じるように機能し得る発現ベクターで構成される適切な宿主細胞を含意する。
「血清分解耐性（Serum degradation resistance)」は、ポリペプチドに適用される場合、このポリペプチドの血液中でのまたはその成分中での分解に耐える能力を指し、この血液またはその成分は概して、血清中のまたは血漿中のプロテアーゼを含む。概して約３７℃で概して数日間（例えば０．２５日、０．５日、１日、２日、４日、８日、１６日）にわたりタンパク質とヒト（または必要に応じてマウス、ラット、イヌ、サル）の血清または血漿とを組み合わせることにより、血清分解耐性を測定することができる。これらの時点での試料をウェスタンブロットアッセイで泳動させることができ、タンパク質を抗体で検出する。この抗体は、このタンパク質中のタグを目的とすることができる。このタンパク質のサイズが注入したタンパク質のサイズと同一であり、このタンパク質がウェスタン上で単一のバンドを示す場合、分解は生じていない。この例示的な方法では、ウェスタンブロットまたは等価の技術により判断される、タンパク質の５０％が分解される時点が、このタンパク質の血清分解半減期または「血清半減期」である。
用語「ｔ１／２」、「半減期」「終末半減期」、「排出半減期」および「循環半減期」は本明細書において互換的に使用され、本明細書で使用される場合、ｌｎ（２）／Ｋｅｌとして算出される終末半減期を意味する。Ｋｅｌは、時間曲線に対するログ濃度の終末相線形部分の線形回帰により算出された終末相排出速度定数である。半減期は概して、生体中に蓄積された投与物質の量の半分が、正常な生物学的プロセスにより代謝されるのにまたは排出されるのに必要な時間を指す。所与のポリペプチドのクリアランス曲線が時間の関数として構築される場合、この曲線は通常、迅速なα相とより長いβ相とを有する二相性である。ヒトにおけるヒト抗体の典型的なβ相半減期は２１日である。半減期は、体液由来の時間が計測された試料を使用して測定され得るが、最も典型的には血漿試料中で測定される。
用語「分子量」は一般に、分子中の構成原子の原子量の合計を指す。分子中の構成原子の原子質量を加算することにより、分子量を理論的に決定することができる。ポリペプチドの文脈で適用される場合、アミノ酸組成物に基づいて、この組成物中の各タイプのアミノ酸の分子量を加算することにより、またはＳＤＳ電気泳動ゲル中の分子量標準との比較からの推定により、分子量を算出する。分子の算出された分子量は分子の「見かけの分子量」と異なり得、このことは一般に、１つまたは複数の分析技術により決定される分子の分子量を指す。「見かけの分子量係数」および「見かけの分子量」は関連する用語であり、ポリペプチドの文脈で使用される場合、これらの用語は、特定のアミノ酸配列またはポリペプチド配列により示される見かけの分子量の相対的な増加または減少の測度を指す。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、または「見かけのｋＤ」単位で測定した場合に球状タンパク質標準と比較することによる類似の方法を使用して、見かけの分子量を決定することができる。見かけの分子量係数とは見かけの分子量と「分子量」との間の比のことであり、後者は、上記で説明されているアミノ酸組成物に基づいて足し算することにより、またはＳＤＳ電気泳動ゲル中の分子量標準との比較からの推定により、算出される。見かけの分子量および見かけの分子量係数の決定は米国特許第８，６７３，８６０号で説明されている。
用語「流体力学的半径」または「ストークス半径」とは、溶液を通って動く本体でありかつ溶液の粘度により抵抗を受けると仮定することにより測定される、溶液中の分子の有効半径（Ｒｈ、ｎｍ）のことである。本発明の実施形態では、ＸＴＥＮポリペプチドの流体力学的半径の測定値は、より直感的な測度である「見かけの分子量係数」と相関する。タンパク質の「流体力学的半径」は、水溶液中でのこのタンパク質の拡散速度と、このタンパク質の巨大分子のゲル中で移動する能力とに影響を及ぼす。タンパク質の流体力学的半径は、このタンパク質の分子量ならびに、形状およびコンパクトさを含む、このタンパク質の構造により決定される。流体力学的半径を決定する方法は当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第６，４０６，６３２号および同第７，２９４，５１３号で説明されているようにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用による。ほとんどのタンパク質は、タンパク質が最小の流体力学的半径を有し得る最もコンパクトな３次元構造である球状構造を有する。一部のタンパク質は、ランダムかつオープンな非構造化構造または「直鎖」構造を採用し、結果として、類似の分子量の典型的な球状タンパク質と比較してはるかに大きい流体力学的半径を有する。
「拡散係数」は、面外の単位濃度勾配当たりの表面を通るモル流束（molar flux）の大きさを意味する。希薄種輸送（dilute species transport）では、拡散に起因する流束は、溶質の溶媒との相互作用の単一の性質（拡散係数）にのみ依存するＦｉｃｋの第１の法則により与えられる。
「生理的条件」は、生きている宿主中の一連の条件、ならびに生きている対象のそれらの条件を模倣する、温度、塩濃度、ｐＨを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件を指す。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで使用するための宿主の生理的に関連する条件が確立されている。一般に、生理的緩衝液は生理的濃度の塩を含み、約６．５〜約７．８、好ましくは約７．０〜約７．５の範囲の中性ｐＨに調整される。様々な生理的緩衝液がSambrookら（２００１年）で列挙されている。生理的に関連する温度は約２５℃〜約３８℃、好ましくは約３５℃〜約３７℃の範囲である。
用語「結合ドメイン」は、本明細書で使用される場合、標的抗原またはリガンドに対する特異的結合親和性を有する抗体または抗体断片のカテゴリーを含むことが具体的には意図されており、この標的抗原またはリガンドとして、細胞表面の受容体もしくは抗原もしくは糖タンパク質、オリゴヌクレオチド、酵素基質、抗原決定基、または標的組織もしくは標的細胞の表面中にもしくは表面上に存在し得る結合部位が挙げられる。
用語「抗体」は、本明細書では最も広い意味で使用され、かつ様々な抗体構造を包含し、この抗体構造として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば二特異的抗体）、および所望の抗原結合活性を示す限り抗体断片が含まれるがこれらに限定されない。完全長抗体は、例えばモノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体であることができる。
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、この集団を含む個々の抗体は同一であり、および／または同じエピトープに結合し、ただし、例えば天然に存在する変異を含むまたはモノクローナル抗体調製物の製造中に生じる想定されるバリアント抗体は除外され、そのようなバリアントは一般に小量で存在する。異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を概して含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。そのため、修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に同種の集団から得られる抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体を様々な技術により作製することができ、この技術として、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法が含まれるがこれらに限定されず、そのような方法およびモノクローナル抗体を作製する他の例示的な方法は当技術分野で公知であり、または本明細書で説明されている。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を含み、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二特異性抗体、直鎖抗体（linear antibody）、単一ドメイン抗体、単一ドメインラクダ抗体（single domain camelid antibody）、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、および抗体断片から形成される多特異的抗体が含まれるがこれらに限定されない。
「ｓｃＦｖ」または「一本鎖断片可変」は、短い柔軟なペプチドリンカーにより一緒に接合されている、重鎖（「ＶＨ」）および軽鎖（「ＶＬ」）の可変領域またはＶＨ鎖もしくはＶＬ鎖の２つのコピーを含む抗体断片のフォーマットを指すために本明細書において互換的に使用される。ｓｃＦｖは実際には抗体の断片ではないが免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質であり、Ｅ．ｃｏｌｉ中において機能する形態で容易に発現され得る。
用語「抗原」、「標的抗原」および「免疫原」は、抗体、抗体断片または抗体断片をベースとする分子が結合するか特異性を有する構造または結合決定基を指すために本明細書において互換的に使用される。
用語「エピトープ」は、抗体、抗体断片または結合ドメインが結合する抗原分子上の特定の部位を指す。エピトープとは、抗体または抗体断片のリガンドのことである。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３」または「分化のクラスター３」はＴ細胞表面抗原ＣＤ３複合体を意味しており、個々の形態でまたは独立して組み合わされた形態で、全ての公知のＣＤ３サブユニット、例えばＣＤ３イプシロン、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３アルファおよびＣＤ３ベータを含む。ＣＤ３イプシロン、ガンマおよびデルタの細胞外ドメインは免疫グロブリン様ドメインを含み、したがって免疫グロブリンスーパーファミリの一部と見なされる。
用語「特異的結合」または「特異的に結合する」または「結合特異性」は、本明細書では、結合ドメインのその対応する標的に対する高度の結合親和性を指すために互換的に使用される。典型的には、本明細書で開示されているアッセイのうちの１つまたは複数により測定される特異的結合は、約１０−６Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有するであろう。
「親和性」は、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合的な相互作用の総和の強さを指す。別途示さない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば抗体および抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。一般に、ある分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性を解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。本明細書で使用される場合、「より大きい結合親和性」は、より低いＫｄ値を意味しており、例えば、１×１０−９Ｍは１×１０−８Ｍとより結合親和性が大きい。
「阻害定数」または「Ｋｉ」は互換的に使用され、酵素−阻害剤複合体の解離定数または酵素に対する阻害剤の結合親和性の逆数を意味する。
「解離定数」または「Ｋｄ」は互換的に使用され、リガンド「Ｌ」とタンパク質「Ｐ」との間の親和性、すなわち、特定のタンパク質にリガンドがどのくらい堅く結合するかを意味する。式Ｋｄ＝［Ｌ」「Ｐ」／「ＬＰ」を使用して算出することができ、この式中、「Ｐ」、「Ｌ」および「ＬＰ」はそれぞれ、タンパク質、リガンドおよび複合体のモル濃度を表す。用語「ｋｏｎ」は、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知である抗体／抗原複合体を形成する抗原に対する抗体の会合速度定数ｏｎを指すように意図されている。用語「ｋｏｆｆ」は、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知である抗体／抗原複合体からの抗体の解離速度定数ｏｆｆを指すように意図されている。
用語「アンタゴニスト」は、本明細書で使用される場合、本明細書で開示されている天然ポリペプチドの生物活性を部分的にまたは完全にブロックするか、阻害するか、または中和するあらゆる分子を含む。ポリペプチドのアンタゴニストを特定する方法は、天然ポリペプチドと候補アンタゴニスト分子とを接触させること、およびこの天然ポリペプチドと通常関連する１つまたは複数の生物活性の検出可能な変化を測定することを含むことができる。本発明の文脈では、アンタゴニストとして、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、または生物学的に活性なタンパク質の効果を減少させる任意の他の分子を含むことができる。
「標的細胞マーカー」は標的細胞により発現される分子を指し、細胞表面の受容体、抗原、糖タンパク質、オリゴヌクレオチド、酵素基質、抗原決定基、または抗体のリガンドとして機能し得る、標的組織または標的細胞の表面中にもしくは表面上に存在し得る結合部位が含まれるがこれらに限定されない。
「標的組織」は、これらに限定されないが、がんまたは炎症状態等の疾患状態の原因またはこの疾患状態の一部である組織を指す。罹患した標的組織の起源として、身体器官、腫瘍、がん細胞、もしくはマトリックスを形成するがん細胞の集団が含まれる、またはこの起源は、疾患状態の一因となるサイトカインもしくは因子を産生するがん細胞、骨、皮膚、細胞の集団と関連して見出される。
「合成培地」は、この培地の成分が公知であるように、培養物中での細胞の生存および／または増殖に必要な栄養要件およびホルモン要件を含む培地を指す。従来、合成培地は、増殖および／または生存に必要な栄養および増殖因子の付加により製剤化されている。典型的には、合成培地は、以下のカテゴリーのうちの１つまたは複数からの少なくとも１つの成分を提供する：ａ）全ての必須アミノ酸、および通常は２０種のアミノ酸プラスシステインの基本セット；ｂ）エネルギー源、通常はグルコース等の炭水化物の形態；ｃ）ビタミンおよび／または低濃度で必要とされる他の有機化合物；ｄ）遊離脂肪酸；ならびにｅ）微量元素、この場合微量元素は、非常に低濃度、通常はマイクロモル範囲で概して必要とされる無機化合物または天然に存在する元素として定義される）。合成培地は、以下のカテゴリーのうちのいずれかからの１つまたは複数の成分が任意選択で補充されてもよい：ａ）１つまたは複数の分裂促進剤；ｂ）塩および緩衝剤、例えばカルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩；ｃ）ヌクレオシドおよび塩基、例えばアデノシンおよびチミジン、ヒポキサンチン：ならびにｄ）タンパク質および組織加水分解物。
用語「アゴニスト」は最も広い意味で使用され、本明細書で開示されている天然ポリペプチドの生物活性を模倣するあらゆる分子を含む。適切なアゴニスト分子として、アゴニスト抗体または抗体断片、天然ポリペプチド、ペプチド、有機小分子等の断片またはアミノ酸配列バリアントが具合的に含まれる。天然ポリペプチドのアゴニストを同定する方法は、天然ポリペプチドと候補アゴニスト分子とを接触させること、およびこの天然ポリペプチドと通常関連する１つまたは複数の生物活性の検出可能な変化を測定することを含むことができる。
本明細書で使用される場合、「処置」または「処置する」または「緩和する」または「寛解させる」は本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、治療上の利益および／または予防上の利益を含むがこれらに限定されない有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療上の利益は、処置される基礎障害の根絶または寛解を意味する。また、治療上の利益は、生理的症状のうちの１つもしくは複数の根絶もしくは寛解または基礎障害に関連する１つもしくは複数の臨床パラメーターの改善により達成され、その結果、対象が依然として基礎障害に罹患しているかもしれないのにもかかわらず対象において改善が観測される。予防上の利益のために、本組成物を、特定の疾患を発症するリスクがある対象に投与してもよいし、または疾患の診断がなされていない場合であっても、この疾患の生理的症状のうちの１つもしくは複数を報告する対象に投与してもよい。
「治療効果」または「治療上の利益」は、本明細書で使用される場合には生理的効果を指し、生物学的に活性なタンパク質により有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の、本発明のポリペプチドの投与により生じるヒトまたは他の動物における疾患の緩和、寛解もしくは予防または基礎障害に関連する１つもしくは複数の臨床パラメーターの改善、または別の方法でヒトもしくは動物の身体的なもしくは精神的な健康を強化することが含まれるがこれらに限定されない。予防上の利益のために、本組成物を、特定の疾患、その疾患の再発、この疾患の状態もしくは症状を発症するリスクがある対象に投与してもよいし、または疾患の診断がなされていない場合であっても、この疾患の生理的症状のうちの１つもしくは複数を報告する対象に投与してもよい。
用語「治療有効量」および「治療有効用量」は、本明細書で使用される場合、１回の投与または反復投与で対象に投与される場合に、病態または状態の任意の症状、態様、測定されたパラメーターまたは特徴に対して任意の検出可能な有益な効果を有し得る、単独またはポリペプチド組成物の一部としてのいずれかでの、薬物または生物学的に活性なタンパク質の量を指す。そのような効果は必ずしも有益である必要はない。治療有効量の決定は、本明細書に記載されている詳細な開示に特に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
用語「治療上有効なかつ非毒性の用量」は、本明細書で使用される場合、対象において深刻な毒性効果を伴うことなくまたは本質的に伴うことなく、腫瘍またはがん細胞の枯渇、腫瘍消失、腫瘍縮小または疾患の安定化を引き起こすのに十分に高い、本明細書で定義される組成物の忍容される用量を指す。そのような治療上有効なかつ非毒性の用量は、当技術分野で説明されている用量漸増研究により決定され得、かつ深刻で有害な副作用を誘発する用量未満でなければならない。
用語「用量レジメン」は、本明細書で使用される場合、組成物の連続的に投与される複数回（すなわち、少なくとも２回またはそれよりも多い）の用量のスケジュールを指し、この用量は、病態または状態の任意の症状、態様、測定されたパラメーター、評価項目または特徴への持続した有益な効果をもたらすために治療有効量で投与される。
用語「がん」および「がん性」は、制御されていない細胞の成長／増殖により概して特徴付けられる、哺乳動物における生理的状態を指す、またはこの生理的状態を説明する。がんの例として、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（gastric cancer）、食道がん、胃がん（stomach cancer）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病を含む原発性血液悪性腫瘍、骨髄増殖性新生物障害、または骨髄異形成障害、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群が含まれるがこれらに限定されない。
「腫瘍特異的マーカー」は、本明細書で使用される場合、正常な細胞または組織と比較してがん細胞中でまたはがん細胞上でより高い数で見出され得るが必ずしもそうではない、がん細胞上でまたはがん細胞中で見出される抗原を指す。
「標的細胞」は、対象組成物の抗体または抗体断片のリガンドを有し、かつがん細胞、腫瘍細胞および炎症細胞を含む疾患もしくは病的状態と関連しているまたはこれらの疾患もしくは病的状態を引き起こす細胞を指す。標的細胞のリガンドは、本明細書では「標的細胞マーカー」または「標的細胞抗原」と称され、細胞表面の受容体または抗原、サイトカイン、ＭＨＣタンパク質、および外因的に呈示されるサイトゾルタンパク質またはペプチドが含まれるがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、「標的細胞」はエフェクター細胞を含まない。
Ｉ）．一般技術
本発明の実践は、特に示していない限り、当業者の範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム学、および組換えＤＮＡに関する従来の技術を使用する。全体が参照により本明細書に組み込まれている、Sambrook, J.ら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, ２００１年；「Current protocols in molecular biology」、F. M. Ausubelら編、１９８７年; the series 「Methods in Enzymology」、Academic Press, San Diego, CA.；「PCR 2: a practical approach」、M.J. MacPherson、B.D. HamesおよびG.R. Taylor編、Oxford University Press, １９９５年；「Antibodies, a laboratory manual」、Harlow, E.およびLane, D.編、Cold Spring Harbor Laboratory、１９８８年；「Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics」、第１１版、McGraw-Hill、２００５年；およびFreshney, R.I.、「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique」、第４版、John Wiley & Sons、Somerset、NJ、２０００年を参照されたい。
宿主細胞は、多様な培地において培養することができる。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小基本培地（ＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、真核細胞を培養するために適している。加えて、動物細胞は、血清を欠如するが、特定の細胞タイプの生存および／または増殖にとって必要なホルモン、増殖因子、または他の任意の因子を補給した合成培地で増殖させることができる。細胞の生存を支持する合成培地は、生存率、形態、代謝能、およびおそらく細胞分化能を維持するが、細胞の増殖を促進する合成培地は、細胞増殖または複製にとって必要な全ての化学物質を提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの哺乳動物細胞の生存および増殖を支配する一般的なパラメーターは、当技術分野で十分に確立されている。異なる細胞培養系において制御されうる物理化学パラメーターは、例えば、ｐＨ、ｐＯ２、温度、および浸透圧である。細胞の栄養必要条件は、通常、最適な環境を提供するように開発された標準的な培地処方で提供される。栄養は、いくつかのカテゴリーに分類することができる：アミノ酸およびその誘導体、炭水化物、糖、脂肪酸、複合脂質、核酸誘導体、およびビタミン。細胞の代謝を維持するための栄養を除き、ほとんどの細胞は、以下の群の少なくとも１つからの１つまたは複数のホルモンも必要とする：無血清培地中で増殖させるための、ステロイド、プロスタグランジン、増殖因子、下垂体ホルモン、およびペプチドホルモン（Sato, G. H.ら、「Growth of Cells in Hormonally Defined Media」、Cold Spring Harbor Press、N.Y.、１９８２年）。ホルモンに加えて、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生存および増殖のために、トランスフェリン（血漿鉄輸送タンパク質）、セルロプラスミン（銅輸送タンパク質）、および高密度リポタンパク質（脂質担体）などの輸送タンパク質を必要としうる。最適なホルモンまたは輸送タンパク質の組は、それぞれの細胞タイプに関して異なる。これらのホルモンまたは輸送タンパク質のほとんどは、外から添加されているか、またはまれな場合では、特定の因子を必要としない変異体細胞株が見出されている。当業者は、過度の実験を行うことなく、細胞培養を維持するために必要な他の要因を承知しているであろう。
原核宿主細胞を増殖させるための増殖培地には、栄養ブロス（液体栄養培地）またはＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）が含まれる。適した培地は、合成培地および非合成培地を含む。一般的に、培地は、細菌の増殖に必要なグルコースなどの炭素源、水、および塩を含む。培地はまた、アミノ酸源および窒素源、例えばビーフエキスもしくは酵母エキス（非合成培地）、または既知量のアミノ酸（合成培地）を含みうる。一部の実施形態では、増殖培地は、ＬＢブロス、例えばＬＢ ＭｉｌｌｅｒブロスまたはＬＢ Ｌｅｎｎｏｘブロスである。ＬＢブロスは、ペプトン（カゼインの酵素消化産物）、酵母エキスおよび塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、抗生物質を含む選択培地を使用する。この培地では、抗生物質に対して耐性を有する所望の細胞のみが増殖する。
ＩＩ）．キメラポリペプチドアセンブリー組成物
本発明は、部分的には、限定されるものではないが、がん、自己免疫、または炎症障害を含む疾患の処置、寛解、または防止において有用なキメラポリペプチドアセンブリー組成物（「ＰｒｏＴＩＡ」とも呼ばれる）に関する。
第１の態様では、本開示は、典型的には、第１の部分、第２の部分、および第３の部分を含むキメラポリペプチドアセンブリーであって、前記第１の部分が、（ｉ）標的細胞マーカーに対する結合特異性を有する第１の結合ドメイン；および（ｉｉ）エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第２の結合ドメインを含み；前記第２の部分が、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼにより切断され得るペプチジル放出セグメント（ＲＳ）を含み；ならびに前記第３の部分が、バルキング部分を含み；前記バルキング部分が、前記第２の部分に対する前記哺乳動物プロテアーゼの作用によって前記第１の部分から放出され得る、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。理論によって束縛されるものではないが、本開示の例示的なポリペプチドアセンブリーは、１つまたは複数の以下の特色：１）アセンブリーがエフェクター細胞と標的細胞とに同時に結合する能力を有する少なくとも２つの結合ドメインを含むこと；２）アセンブリーがｉ）組成物が例えば、立体障害によって無傷である場合に結合ドメインを遮蔽し、標的抗原に対する結合親和性を低下させる、ｉｉ）対象に投与された場合に組成物の半減期の増強を提供する、および／またはｉｉｉ）疾患組織（例えば、腫瘍）と比較して正常な組織および臓器における血管系からの組成物の溢出を減少させ、臨床試験において同時に使用または評価される二特異的細胞傷害性抗体治療薬と比較して安全性プロファイルの増大をもたらすバルキング部分を含むこと；ならびに３）アセンブリーが、腫瘍または炎症組織などの疾患組織の近くにある場合、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼによって切断され得ることによって、第１の部分の結合ドメインを放出して、結合ドメインがアセンブリーから切断されていない場合の状態と比較して高い親和性で、結合ドメインが標的細胞マーカーおよびエフェクター細胞抗原に結合することができること、を示す。対象のアセンブリーは、治療部分（例えば、標的細胞とエフェクター細胞を一緒に持って行くことができる第１の部分）が、プロテアーゼが正常組織と比較して優先的に発現される疾患組織の部位で放出される点で、「プロドラッグ」として有利に作用することができる。対象のアセンブリーは、ＢｉＴＥ（登録商標）を含む現行の二特異的抗体のいくつかの大きな欠点に対処する。対象のアセンブリーは、典型的には、従来の二特異的抗体に固有の副作用を緩和しながら、ＢｉＴＥ（登録商標）などの二特異的抗体によって行われる腫瘍縮小の公知の治療利益を保持する。ある実施形態では、本発明は、第１の部分が単鎖形式の２つの結合ドメインを含み、組成物が二特異性であるように、第１の結合ドメインが腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する結合特異性を有し、第２の結合ドメインが、エフェクター細胞上の受容体またはその中のリガンドなどのエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。
一部の実施形態では、対象組成物の設計は、プロテアーゼの作用が対象組成物の放出セグメント（ＲＳ）を切断し、組成物から結合ドメインおよびバルキング部分を放出するようなものである。組成物からの放出の際に、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する結合特異性を有する第１の結合ドメインおよびエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第２の結合ドメインは、インタクトな組成物よりも高い結合親和性で同時に結合し、エフェクター細胞を標的細胞と一緒に連結して、免疫学的シナプスを形成することができ、その結果、非常に低いエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、標的細胞が、細胞間の免疫学的シナプス中にエフェクター細胞によって放出されるエフェクター分子によって作用し、限定されるものではないが、標的細胞のパーフォリン媒介性溶解、グランザイムＢ誘導性細胞死および／またはアポトーシスを含む損傷をもたらす。一部の実施形態では、対象の組成物の放出された第１の部分は、それが対象中のエフェクター細胞である細胞傷害性Ｔリンパ球と、腫瘍細胞上の予め選択された表面抗原とに同時に結合する能力を有するような結合特異性と共に設計され、それによって、標的腫瘍に対する放出されたサイトカインおよびエフェクター分子の免疫学的シナプスならびに選択的、指向的、および局在的効果をもたらし、その結果、腫瘍細胞は損傷されるか、または破壊され、対象に対する抗腫瘍活性および治療利益をもたらす。他の実施形態では、放出された第１の部分により結合されるエフェクター細胞は、形質細胞、Ｂ細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ細胞）、マスト細胞、樹状細胞、調節性Ｔ細胞（ＲｅｇＴ細胞）、ヘルパーＴ細胞、骨髄性細胞、およびＮＫ細胞からなる群から選択される細胞である。
別の態様では、本発明は、第１の部分、第２の部分、第３の部分、第４の部分、および第５の部分を含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物であって、第１の部分が、第１および第２の結合ドメイン（以下により完全に記載される）を含み、第２の部分が、放出セグメント（ＲＳ）を含み、第３の部分が、バルキング部分（以下により完全に記載される）を含み、第４の部分が、第２の部分のＲＳと同じであっても、異なっていてもよい放出セグメント（ＲＳ）を含み、第５の部分が、第３のバルキング部分と同じであっても、異なっていてもよいバルキング部分を含み、アセンブリープロテアーゼによって作用されるまで本質的にはプロドラッグ形態にある組成物を提供する。
組成物は、対象組成物が当技術分野で公知の二特異的抗体組成物と比較して改善された治療指数を有するように、一度、標的組織または疾患により不健康になった組織と関連して見出されるプロテアーゼによって切断されたら、より高い選択性、より長い半減期を有し、低毒性および少ない副作用をもたらす二特異的治療薬を提供する長く放置されてきた必要性に対処する。そのような組成物は、限定されるものではないが、がんを含むある特定の疾患の処置において有用である。
１．結合ドメイン
本発明の目的は、標的細胞マーカー（例えば、腫瘍特異的マーカー）に対する結合特異性を有する少なくとも第１の結合ドメインと、エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第２の結合ドメインとを含む第１の部分を含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供することである。一部の実施形態では、結合ドメインは、標的細胞マーカーと、エフェクター細胞抗原とに対する二特異的結合特異性を示す単鎖として連結される。
別の態様では、本発明の目的は、第１の部分の結合ドメインが切断配列を含む短いペプチド放出セグメントによってバルキング部分に連結されている構成で設計された切断性キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供することである。この例示的な構成では、結合ドメインは、組成物の意図される標的ではない非疾患組織または細胞との非特異的相互作用および結合を減少させるか、または排除するために近位のバルキング部分構成成分によって遮蔽され、それによって、望ましくない毒性または副作用を軽減する。さらに、遮蔽しているバルキング部分は、疾患組織で優先的に発現されるプロテアーゼ（以下により完全に記載される）によって放出セグメントが切断されると標的部位（例えば、疾患組織）で放出される。次いで、放出された第１の部分は、標的細胞マーカーおよびエフェクター細胞マーカーを含む、それぞれのリガンドにより自由に、またはより熱心に結合するその能力を取り戻す。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、対象のキメラポリペプチドアセンブリーは、第１の部分の二特異的結合ドメインのみを有する組成物のｍｍｏｌ／ｋｇの同等用量の投与の際またはその後の副作用と比較して、投与頻度の減少、治療効果の持続期間の増大、および対象における診断的に関連する副作用の重症度の低下に関して治療薬として多様な利点を付与する。対象組成物の使用によって回避または軽減される副作用の非限定的な例としては、ＩＬ−２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、肝酵素の血漿レベル、ならびに／または敗血症、発熱性好中球減少症、神経毒性、痙攣、脳症、サイトカイン放出症候群、言語障害、平衡障害、発熱、頭痛、混乱、低血圧、好中球減少症、悪心、意識障害、および見当識障害の発生率の望ましくない増加が挙げられる。
本発明は、限定されるものではないが、エフェクター細胞およびがん、腫瘍、または他の悪性組織である疾患組織または細胞の抗原と関連するリガンドまたは受容体に結合することができるＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、線状抗体、単一ドメイン抗体、単一ドメインラクダ抗体、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、およびダイアボディなどの、対象組成物における使用のための単鎖結合ドメインの使用を企図する。他の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第１の部分の第１および第２の結合ドメインは、アンチカリン、アドネクチン、フィノマー、アフィリン、アフィボディ、センチリン、ＤＡＲＰｉｎなどの非抗体足場であってもよい。他の実施形態では、腫瘍細胞標的のための結合ドメインは、腫瘍細胞によって過剰発現されるタンパク質のペプチド断片を搭載したＭＨＣに結合するように操作されたＴ細胞受容体の可変ドメインである。本発明の組成物は、広い治療濃度域を提供するために、標的組織プロテアーゼの位置ならびに標的化されることが意図されていない健康な組織中での同プロテアーゼの存在、ならびに健康な組織中での標的リガンドの存在であるが、不健康な標的組織中でのリガンドのより多い存在を考慮して設計される。「治療濃度域」とは、所与の治療組成物に関する最小有効用量と最大許容用量との最も大きい差異を指す。広い治療濃度域を達成するのを助けるために、組成物の第１の部分の結合ドメインは、バルキング部分（例えば、ＸＴＥＮ）の近くで遮蔽され、一方または両方のリガンドに対するインタクトな組成物の結合親和性が、哺乳動物プロテアーゼによって切断された組成物と比較して低下し、それによって、バルキング部分の遮蔽効果から第１の部分を放出する。
単鎖結合ドメインに関して、十分確立されたように、Ｆｖは完全な抗原認識および結合部位を含有し、非共有的会合にある１つの重鎖（ＶＨ）と１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とのダイマーからなる最小抗体断片である。各ＶＨおよびＶＬ鎖内には、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面上の抗原結合部位を規定するように相互作用する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）がある；結合ドメインの６つのＣＤＲは、抗体または単鎖結合ドメインに対する抗原結合特異性を付与する。一部の場合、それぞれが、各結合ドメイン内に３、４または５つのＣＨＲを有するｓｃＦｖが作出される。ＣＤＲに隣接するフレームワーク配列は、種間で天然の免疫グロブリンにおいて本質的に保存されている三次構造を有し、フレームワーク残基（ＦＲ）は、その適切な方向にＣＤＲを保持するように働く。定常ドメインは結合機能にとって必要ではないが、ＶＨ−ＶＬ相互作用を安定化するのを助けることができる。本発明のポリペプチドの結合部位のドメインは、同じか、または異なる免疫グロブリンのいずれかのＶＨ−ＶＬ、ＶＨ−ＶＨまたはＶＬ−ＶＬドメインの対であってもよいが、一般的には、親抗体に由来するそれぞれのＶＨおよびＶＬ鎖を使用して単鎖結合ドメインを作製することが好ましい。ポリペプチド鎖内のＶＨおよびＶＬドメインの順序は、本発明にとって限定的ではない；所与のドメインの順序を、通常は機能を喪失することなく逆転させることができるが、ＶＨおよびＶＬドメインは、抗原結合部位が適切に折り畳むことができるように配置されることが理解される。かくして、対象組成物の二特異的ｓｃＦｖ実施形態の単鎖結合ドメインは、順序（ＶＬ−ＶＨ）１−（ＶＬ−ＶＨ）２（ここで、「１」および「２」は、それぞれ、第１および第２の結合ドメインを表す）、または（ＶＬ−ＶＨ）１−（ＶＨ−ＶＬ）２、もしくは（ＶＨ−ＶＬ）１−（ＶＬ−ＶＨ）２、もしくは（ＶＨ−ＶＬ）１−（ＶＨ−ＶＬ）２にあってもよく、ここで、対になった結合ドメインは本明細書の以下に記載されるポリペプチドリンカーによって連結される。
したがって、本明細書に開示される例示的な二特異的単鎖抗体中での結合ドメインの配置は、第１の結合ドメインが第２の結合ドメインに対してＣ末端に位置するものであってもよい。Ｖ鎖の配置は、ＶＨ（標的細胞表面抗原）−ＶＬ（標的細胞表面抗原）−ＶＬ（エフェクター細胞抗原）−ＶＨ（エフェクター細胞抗原）、ＶＨ（標的細胞表面抗原）−ＶＬ（標的細胞表面抗原）−ＶＨ（エフェクター細胞抗原）−ＶＬ（エフェクター細胞抗原）、ＶＬ（標的細胞表面抗原）−ＶＨ（標的細胞表面抗原）−ＶＬ（エフェクター細胞抗原）−ＶＨ（エフェクター細胞抗原）またはＶＬ（標的細胞表面抗原）−ＶＨ（標的細胞表面抗原）−ＶＨ（エフェクター細胞抗原）−ＶＬ（エフェクター細胞抗原）であってもよい。第２の結合ドメインが第１の結合ドメインに対してＮ末端に位置する配置については、以下の順序が可能である：ＶＨ（エフェクター細胞抗原）−ＶＬ（エフェクター細胞抗原）−ＶＬ（標的細胞表面抗原）−ＶＨ（標的細胞表面抗原）、ＶＨ（エフェクター細胞抗原）−ＶＬ（エフェクター細胞抗原）−ＶＨ（標的細胞表面抗原）−ＶＬ（標的細胞表面抗原）、ＶＬ（エフェクター細胞抗原）−ＶＨ（エフェクター細胞抗原）−ＶＬ（標的細胞表面抗原）−ＶＨ（標的細胞表面抗原）またはＶＬ（エフェクター細胞抗原）−ＶＨ（エフェクター細胞抗原）−ＶＨ（標的細胞表面抗原）−ＶＬ（標的細胞表面抗原）。本明細書で使用される場合、「Ｎ末端に」または「Ｃ末端に」およびその文法的変形は、二特異的単鎖抗体の絶対的なＮまたはＣ末端での配置ではなく、一次アミノ酸配列内の相対的位置を指す。したがって、非限定的な例として、「第２の結合ドメインに対してＣ末端に位置する」第１の結合ドメインは、第１の結合が二特異的単鎖抗体内の第２の結合ドメインのカルボキシル側に位置することを示し、さらなる配列、例えば、Ｈｉｓ−タグ、または放射性同位体などの別の化合物が二特異的単鎖抗体のＣ末端に位置する可能性を排除しない。
一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含み、前記結合ドメインのそれぞれがｓｃＦｖであり、各ｓｃＦｖが１つのＶＬおよび１つのＶＨを含む、第１の部分を含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含み、前記結合ドメインがダイアボディの構成にあり、各ドメインが１つのＶＬドメインと１つのＶＨとを含む、第１の部分を含む。前述の実施形態では、第１のドメインは、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する結合特異性を有し、第２の結合ドメインは、エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する。前述の一実施形態では、エフェクター細胞抗原は、エフェクター細胞上で、またはその中で発現される。一実施形態では、エフェクター細胞抗原は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのＴ細胞上で発現される。別の実施形態では、エフェクター細胞抗原は、Ｂ細胞、マスト細胞、樹状細胞、または骨髄性細胞上で発現される。一実施形態では、エフェクター細胞抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞の分化３抗原のクラスターであるＣＤ３である。前述の一部の実施形態では、第１の結合ドメインは、腫瘍細胞と関連した腫瘍特異的マーカーに対する結合特異性を示す。一実施形態では、結合ドメインは、腫瘍細胞が限定されるものではないが、間質細胞腫瘍、線維芽細胞腫瘍、筋線維芽細胞腫瘍、グリア細胞腫瘍、上皮細胞腫瘍、脂肪細胞腫瘍、免疫細胞腫瘍、血管細胞腫瘍、および平滑筋細胞腫瘍由来の細胞を含んでもよい、腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する。一実施形態では、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原は、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２ ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６ βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ１３３、ガングリオシドＧＤ３；９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原１、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、胎児アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、ＣＤ２５、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ミュラー管抑制物質受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、シアル化Ｔｎ抗原（ｓ ＴＮ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＡＧ７２、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原）、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｇ２５０、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＤＬＫ１、ＳＰ１７、ＲＯＲ１、およびＥｐｈＡ２からなる群から選択される。一実施形態では、ＣＤ７０に対する結合親和性を示す第１の結合ドメインは、抗体断片ではなく、その天然リガンドであるＣＤ２７である。別の実施形態では、Ｂ７−Ｈ６に対する結合親和性を示す第１の結合ドメインは、抗体断片ではなく、その天然リガンドであるＮｋｐ３０である。
本発明の対象組成物のｓｃＦｖ実施形態は、ＶＬおよびＶＨドメインが、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原、およびエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体に由来する、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含むことが想定される。他の場合、第１および第２の結合ドメインは、それぞれ、腫瘍特異的マーカーおよびエフェクター細胞抗原などの標的細胞マーカーに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体に由来する６つのＣＤＲをそれぞれ含む。他の実施形態では、対象組成物の第１の部分の第１および第２の結合ドメインは、各結合ドメイン内に３、４または５ではなくのＣＨＲを有してもよい。他の実施形態では、本発明の実施形態は、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、ＣＤＲ−Ｈ３領域、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域をそれぞれ含み、前記領域のそれぞれが、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原と、エフェクター細胞抗原とに結合することができるモノクローナル抗体に由来する、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含む。一実施形態では、本発明は、第２の結合ドメインが、ヒトＣＤ３に結合することができるモノクローナル抗体に由来するＶＨおよびＶＬ領域を含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、ｓｃＦｖの第２の結合ドメインが、ＶＨおよびＶＬ領域を含み、各ＶＨおよびＶＬ領域が、表１から選択される抗ＣＤ３抗体の対になったＶＬおよびＶＨ配列に対して少なくとも約９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を示すか、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の態様では、本発明の第２のドメインの実施形態は、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、ＣＤＲ−Ｈ３領域、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含み、前記領域のそれぞれは、表１に記載される抗体群から選択されるモノクローナル抗体に由来する。前述の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメインを、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、または単一ドメインラクダ抗体として構成させることができる。
他の実施形態では、対象組成物の第２のドメインは、表１に記載される抗体群から選択される抗ＣＤ３抗体に由来する。前述の一実施形態では、対象組成物の第２のドメインは、表１に記載される抗体群から選択される抗ＣＤ３抗体の対になったＶＬおよびＶＨ領域配列を含む。別の実施形態では、本発明は、第２の結合ドメインがＶＨおよびＶＬ領域を含み、各ＶＨおよびＶＬ領域が、表１のｈｕＵＣＨＴ１抗ＣＤ３抗体の対になったＶＬおよびＶＨ配列に対して少なくとも約９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を示す、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。前述の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメインを、ｓｃＦｖ、ダイアボディの一部、単一ドメイン抗体、または単一ドメインラクダ抗体として構成させることができる。
他の実施形態では、組成物の第１のドメインのｓｃＦｖは、表２に記載される抗体群から選択される抗腫瘍細胞抗体に由来する。別の実施形態では、本発明は、第１の結合ドメインがＶＨおよびＶＬ領域を含み、各ＶＨおよびＶＬ領域が、表２から選択される抗腫瘍細胞抗体の対になったＶＬおよびＶＨ配列に対して少なくとも約９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を示す、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。前述の一実施形態では、列挙される組成物の第１のドメインは、本明細書に開示される抗腫瘍細胞抗体の対になったＶＬおよびＶＨ領域配列を含む。前述の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメインを、ｓｃＦｖ、ダイアボディの一部、単一ドメイン抗体、または単一ドメインラクダ抗体として構成させることができる。
別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第１の部分は、表１３の配列からなる群から選択される配列に対する少なくとも約９０％、または９１％、または９２％、または９３％、または９４％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％の同一性を有する配列を有する。
別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含む第１の部分を含み、前記結合ドメインは、ダイアボディの構成にあり、前記結合ドメインのそれぞれは、１つのＶＬドメインと１つのＶＨドメインとを含む。一実施形態では、本発明のダイアボディ実施形態は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含み、ＶＬおよびＶＨドメインは、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原、およびエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体に由来する。別の実施形態では、本発明のダイアボディ実施形態は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含み、それぞれ、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、ＣＤＲ−Ｈ３領域、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含み、前記領域のそれぞれは、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞抗原、およびエフェクター細胞抗原に結合することができるモノクローナル抗体に由来する。本発明のダイアボディ実施形態は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含み、ＶＬおよびＶＨドメインは、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞抗原、およびエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体に由来することが想定される。別の態様では、本発明のダイアボディ実施形態は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含み、それぞれ、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、ＣＤＲ−Ｈ３領域、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含み、前記領域のそれぞれは、それぞれ、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞抗原、およびエフェクター細胞抗原に結合することができるモノクローナル抗体に由来する。一実施形態では、本発明は、ダイアボディの第２の結合ドメインが、ヒトＣＤ３に結合することができるモノクローナル抗体に由来する対になったＶＨおよびＶＬ領域を含む、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、ダイアボディの第２の結合ドメインがＶＨおよびＶＬ領域を含み、各ＶＨおよびＶＬ領域が、表１から選択される抗ＣＤ３抗体の対になったＶＬおよびＶＨ配列に対して少なくとも約９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を示す、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、ダイアボディの第２の結合ドメインがＶＨおよびＶＬ領域を含み、各ＶＨおよびＶＬ領域が、表１から選択されるｈｕＵＣＨＴ１抗体のＶＬおよびＶＨ配列に対して少なくとも約９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を示す、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。他の実施形態では、組成物のダイアボディの第２のドメインは、本明細書に記載の抗ＣＤ３抗体に由来する。別の実施形態では、本発明は、ダイアボディの第１の結合ドメインがＶＨおよびＶＬ領域を含み、各ＶＨおよびＶＬ領域が、表２から選択される抗腫瘍細胞抗体のＶＬおよびＶＨ配列に対して少なくとも約９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を示す、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。他の実施形態では、組成物のダイアボディの第１のドメインは、本明細書に記載の抗腫瘍細胞抗体に由来する。
ＶＬおよびＶＨおよびＣＤＲドメインを対象組成物のために誘導することができる治療モノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。そのような治療抗体としては、限定されるものではないが、リツキシマブ、ＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ（例えば、米国特許第５，７３６，１３７号を参照されたい）、多くのリンパ腫、白血病、および一部の自己免疫障害の処置において使用されるキメラ抗ＣＤ２０抗体；慢性リンパ球性白血病のための使用について認可され、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅにより開発されている、濾胞性非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、関節リウマチおよび再発寛解型多発性硬化症について開発中である抗ＣＤ２０抗体であるオファツムマブ；非ホジキンまたはホジキンリンパ腫についてＮｏｖａｒｔｉｓにより開発された抗ＣＤ４０抗体であるルカツムマブ（ＨＣＤ１２２）（例えば、米国特許第６，８９９，８７９号を参照されたい）、非ホジキンリンパ腫を処置するためのＣＤ２０を発現する細胞に結合する、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎにより開発された抗体であるＡＭＥ−１３３、免疫性血小板減少性紫斑病を処置するためのＣＤ２０を発現する細胞に結合する、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．により開発された抗体であるベルツズマブ（ｈＡ２０）、低悪性度Ｂ細胞リンパ腫の処置のためのＩｎｔｒａｃｅｌにより開発されたＨｕｍａＬＹＭ、および関節リウマチの処置のための抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発されたオクレリズマブ（例えば、米国特許出願第２００９０１５５２５７号を参照されたい）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された、乳がんを処置するために認可されたヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体であるトラスツズマブ（例えば、米国特許第５，６７７，１７１号を参照されたい）；前立腺がん、乳がん、および卵巣がんの処置における、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された抗ＨＥＲ２ダイマー化阻害剤抗体であるペルツズマブ（例えば、米国特許第４，７５３，８９４号を参照されたい）；ＩｍｃｌｏｎｅおよびＢＭＳにより開発された、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現するＫＲＡＳ野生型転移性結腸直腸がんおよび頭頸部がんを処置するために使用される抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブ（米国特許第４，９４３，５３３号；ＰＣＴ ＷＯ９６／４０２１０を参照されたい）；転移性結腸直腸がんの処置のためにＡｍｇｅｎにより現在上市されている、ＥＧＦ受容体、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１およびＨＥＲ１としても公知である上皮増殖因子受容体に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体であるパニツムマブ（米国特許第６，２３５，８８３号を参照されたい）；頭頸部の扁平上皮癌の処置のために上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対するものである、Ｇｅｎｍａｂにより開発された完全ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体であるザルツムマブ（例えば、米国特許第７，２４７，３０１号を参照されたい）；頭頸部の扁平上皮癌、鼻咽腔がんおよびグリオーマの処置における、Ｂｉｏｃｏｎ，ＹＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣｕｂａおよびＯｎｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｕｒｏｐｅにより開発されたＥＧＦＲに対するキメラ抗体であるニモツズマブ（例えば、米国特許第５，８９１，９９６号；米国特許第６，５０６，８８３号を参照されたい）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）およびＴ細胞リンパ腫の処置のためにＢａｙｅｒ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｈａｒｍａにより上市されたＣＤ５２に対するヒト化モノクローナル抗体であるアレムツズマブ；臓器移植患者における急性拒絶を軽減するために投与される免疫抑制生物製剤として使用される、Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎにより開発された抗ＣＤ３抗体であるムロモナブ−ＣＤ３；一部の形態のＢ細胞非ホジキンリンパ腫のための処置としてＩＤＥＣ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧにより開発された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるイブリツモマブチウキセタン；急性骨髄性白血病を処置するために使用される、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｗｙｅｔｈにより開発された、放射性同位体が付着した細胞傷害性キレーターであるチウキセタンに連結された抗ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）抗体であるゲムツズマブオゾガマイシン；Ａｂｇｅｎｉｘにより開発された抗ＣＤ１４７抗体であるＡＢＸ−ＣＢＬ；Ａｂｇｅｎｉｘにより開発された抗ＩＬ８抗体であるＡＢＸ−ＩＬ８、Ａｂｇｅｎｉｘにより開発された抗ＭＵＣ１８抗体であるＡＢＸ−ＭＡ１、Ａｎｔｉｓｏｍａにより開発中である抗ＭＵＣ１であるペンツモマブ（Ｒ１５４９、９０Ｙ−ｍｕＨＭＦＧ１）、Ａｎｔｉｓｏｍａにより開発された抗ＭＵＣ１抗体であるＴｈｅｒｅｘ（Ｒ１５５０）、Ａｎｔｉｓｏｍａにより開発されたＡｎｇｉｏＭａｂ（ＡＳ１４０５）、Ａｎｔｉｓｏｍａにより開発されたＨｕＢＣ−１、Ａｎｔｉｓｏｍａにより開発されたＴｈｉｏｐｌａｔｉｎ（ＡＳ１４０７）、Ｂｉｏｇｅｎにより開発された抗アルファ−４−ベータ−１（ＶＬＡ４）およびアルファ−４−ベータ−７抗体であるＡＮＴＥＧＲＥＮ（ナタリズマブ）、Ｂｉｏｇｅｎにより開発された抗ＶＬＡ−１インテグリン抗体であるＶＬＡ−１ ｍＡｂ、Ｂｉｏｇｅｎにより開発された抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）抗体であるＬＴＢＲ ｍＡｂ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより開発された抗ＴＧＦ−β２抗体であるＣＡＴ−１５２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＡｂｂｏｔｔにより開発された抗ＩＬ−１２抗体であるＪ６９５、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＧｅｎｚｙｍｅにより開発された抗ＴＧＦβ１抗体であるＣＡＴ−１９２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより開発された抗エオタキシン１抗体であるＣＡＴ−２１３、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．により開発された抗Ｂｌｙｓ抗体であるＬＹＭＰＨＯＳＴＡＴ−Ｂ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．により開発された抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体であるＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｍＡｂ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された抗ＨＥＲ受容体ファミリー抗体であるＨＥＲＣＥＰＴＩＮ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された抗組織因子抗体である抗組織因子（ＡＴＦ）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより開発された抗ＩｇＥ抗体であるＸＯＬＡＩＲ（オマリズマブ）、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発されたＭＬＮ−０２抗体（以前はＬＤＰ−０２）；Ｇｅｎｍａｂにより開発された抗ＣＤ４抗体であるＨＵＭＡＸ ＣＤ４（登録商標）；Ｃｈｕｇａｉにより開発されたトシリズマ、および抗ＩＬ６Ｒ抗体；ＧｅｎｍａｂおよびＡｍｇｅｎにより開発された抗ＩＬ１５抗体であるＨＵＭＡＸ−ＩＬ１５、ＧｅｎｍａｂおよびＭｅｄａｒｅｘにより開発されたＨＵＭＡＸ−Ｉｎｆｌａｍ；ＧｅｎｍａｂおよびＭｅｄａｒｅｘおよびＯｘｆｏｒｄ ＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅｓにより開発された抗ヘパラナーゼＩ抗体であるＨＵＭＡＸ−Ｃａｎｃｅｒ；ＧｅｎｍａｂおよびＡｍｇｅｎにより開発されたＨＵＭＡＸ−Ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｇｅｎｍａｂにより開発されたＨＵＭＡＸ−ＴＡＣ；ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発された抗ＣＤ４０Ｌ抗体であるＩＤＥＣ−１３１；ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発された抗ＣＤ４抗体であるＩＤＥＣ−１５１（クレノリキシマブ）；ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発された抗ＣＤ８０抗体であるＩＤＥＣ−１１４；ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより開発された抗ＣＤ２３であるＩＤＥＣ−１５２；Ｉｍｃｌｏｎｅにより開発された抗ＫＤＲ抗体、Ｉｍｃｌｏｎｅにより開発された抗ｆｌｋ−１抗体であるＤＣ１０１；Ｉｍｃｌｏｎｅにより開発された抗ＶＥカドヘリン抗体；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発された抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体であるＣＥＡ−ＣＩＤＥ（ラベツズマブ）；メラノーマの処置におけるＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂにより開発された抗ＣＴＬＡ４抗体であるＹｅｒｖｏｙ（イピリムマブ）；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発された抗ＣＤ２２抗体であるＬｕｍｐｈｏｃｉｄｅ（登録商標）（エプラツズマブ）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発されたＡＦＰ−Ｃｉｄｅ；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発されたＭｙｅｌｏｍａＣｉｄｅ；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発されたＬｋｏＣｉｄｅ；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより開発されたＰｒｏｓｔａＣｉｄｅ；Ｍｅｄａｒｅｘにより開発された抗ＣＴＬＡ４抗体であるＭＤＸ−０１０；Ｍｅｄａｒｅｘにより開発された抗ＣＤ３０抗体であるＭＤＸ−０６０；Ｍｅｄａｒｅｘにより開発されたＭＤＸ−０７０；Ｍｅｄａｒｅｘにより開発されたＭＤＸ−０１８；ＭｅｄａｒｅｘおよびＩｍｍｕｎｏ−Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓにより開発された抗ＨＥＲ２抗体であるＯＳＩＤＥＭ（ＩＤＭ−１）；ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂにより開発された抗ＣＤ４抗体であるＨＵＭＡＸ（登録商標）−ＣＤ４；ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂにより開発された抗ＩＬ１５抗体であるＨｕＭａｘ−ＩＬ１５；ＭｏｒｐｈｏＳｙｓにより開発された抗細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）（ＣＤ５４）抗体ＭＯＲ２０１；Ｐｆｉｚｅｒにより開発された抗ＣＴＬＡ−４抗体であるトレメリムマブ；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓにより開発された抗ＣＤ３抗体であるビシリズマブ；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓにより開発された抗α５β１インテグリン；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓにより開発された抗ＩＬ−１２；Ｘｏｍａにより開発された抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体であるＩＮＧ−１；ならびにＸｏｍａにより開発された抗ベータ２インテグリン抗体であるＭＬＮ０１が挙げられる；本段落における上記の抗体の参照は全て、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。上記抗体の配列を、公共的に利用可能なデータベース、特許、または参考文献から得ることができる。さらに、抗ＣＤ３抗体に由来するモノクローナル抗体ならびにＶＨおよびＶＬ配列の非限定的な例は表１に提示され、がん、腫瘍、または標的細胞マーカーに対するモノクローナル抗体ならびにＶＨおよびＶＬ配列の非限定的な例は表２に提示される。
本発明の対象組成物の結合親和性および／または他の生物活性を測定する方法は、本明細書に開示されるもの、または当技術分野で一般に公知の方法であってもよい。例えば、Ｋｄとして示される、結合対（例えば、抗体と抗原）の結合親和性を、限定されるものではないが、放射性結合アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Ｂｉａｃｏｒｅ）などの非放射性結合アッセイ、ならびに酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、動的除外アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））を含む様々な好適なアッセイを使用して、または実施例に記載のように決定することができる。例えば、バルキング部分が付着したキメラポリペプチドアセンブリーと比較した、バルキング部分を除去するように切断されたキメラポリペプチドアセンブリーの結合親和性の増加または減少を、バルキング部分を含む、および含まないその標的結合パートナーに対するキメラポリペプチドアセンブリーの結合親和性を測定することによって決定することができる。
対象キメラアセンブリーの半減期の測定を、様々な好適な方法によって実施することができる。例えば、物質を対象に投与し、生物試料（例えば、血液または血漿または腹水などの生物学的流体）を定期的にサンプリングして、試料中のその物質の濃度および／または量を経時的に決定することによって、物質の半減期を決定することができる。生物試料中の物質の濃度を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、イムノブロット、ならびに高圧液体クロマトグラフィーおよび高速タンパク質液体クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー技術を含む様々な好適な方法を使用して決定することができる。一部の場合、物質を、放射性タグまたは蛍光タグなどの検出可能なタグで標識することができ、これを使用して、試料（例えば、血液試料または血漿試料）中の物質の濃度を決定することができる。次いで、結果から様々な薬物動態パラメーターを決定し、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアなどのソフトウェアパッケージを使用して、または当技術分野で公知の手動での計算によって、これを行うことができる。
さらに、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の物理化学的特性を測定して、溶解度、構造および安定性の保持を確認することができる。結合解離定数（Ｋｄ、ＫｏｎおよびＫｏｆｆ）、リガンド−受容体複合体の解離の半減期、ならびに遊離リガンドと比較した隔離されたリガンドの生物活性を阻害する結合ドメインの活性（ＩＣ５０値）を含む、リガンドに対する結合ドメインの結合特性の決定を可能にする対象組成物のアッセイを行う。用語「ＩＣ５０」とは、リガンドアゴニストの最大生物応答の半分を阻害するのに必要とされる濃度を指し、一般的には、競合結合アッセイによって決定される。用語「ＥＣ５０」とは、活性物質の最大生物応答の半分を達成するのに必要とされる濃度を指し、一般的には、本明細書に記載される実施例の方法を含む、ＥＬＩＳＡまたは細胞ベースアッセイによって決定される。
（ｉ）抗ＣＤ３結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、第２の部分の結合ドメインは、ＣＤ３の抗原に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。別の実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ３イプシロンおよびＣＤ３デルタに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＤ３ ｎｅｕに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。ＣＤ３に対するモノクローナル抗体のＶＬおよびＶＨ配列の例示的な非限定的な例は、表１に提示される。一実施形態では、本発明は、表１に記載された抗ＣＤ３ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、ＣＤ３に対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、表１に記載された抗ＣＤ３イプシロンＶＬおよびＶＨ配列を含む、ＣＤ３イプシロンに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、第１の部分のｓｃＦｖの第２の結合ドメインがＶＨおよびＶＬ領域を含み、各ＶＨおよびＶＬ領域が、表１のｈｕＵＣＨＴ１抗ＣＤ３抗体の対になったＶＬおよびＶＨ配列に対して少なくとも約９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を示す、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含み、それぞれが表１に記載されたそれぞれの抗ＣＤ３ ＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤ３に対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含み、ＣＤＲ配列がＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ、ＹＴＳＲＬＥＳ、ＱＱＧＮＴＬＰＷＴ、ＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮ、ＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴ、およびＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶである、ＣＤ３に対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。
ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）と会合し、ＴＣＲの細胞表面発現およびペプチド：ＭＨＣリガンドがＴＣＲに結合する時に始まるシグナル伝達カスケードにおいて機能する細胞表面分子の群である。典型的には、抗原がＴ細胞受容体に結合する時、ＣＤ３は細胞膜を介してＴ細胞の内部の細胞質にシグナルを送信する。これはＴ細胞の活性化を引き起こし、急速に分裂して、ＴＣＲが曝露された特定の抗原を攻撃するように感作された新しいＴ細胞を産生する。ＣＤ３複合体は、４つの他の膜に結合したポリペプチド（ＣＤ３−ガンマ、−デルタ、−ゼータ、および−ベータ）と共に、ＣＤ３イプシロン分子で構成される。ヒトにおいては、ＣＤ３−イプシロンは、第１１染色体上のＣＤ３Ｅ遺伝子によってコードされる。ＣＤ３鎖のそれぞれの細胞内ドメインは、Ｔ細胞受容体に会合すると細胞内シグナル伝達機構のための核形成点として働く免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。
いくつかの治療戦略は、ＴＣＲシグナリング、特に、免疫抑制レジームにおいて臨床的に広く使用されている抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を標的化することによって、Ｔ細胞免疫を調節する。ＣＤ３特異的マウスｍＡｂ ＯＫＴ３は、ヒトにおける使用について初めてライセンス付与されたｍＡｂ（Sgro, C. Side-effects of a monoclonal antibody, muromonab CD3/orthoclone OKT3: bibliographic review、Toxicology １０５巻：２３〜２９頁、１９９５年）であり、移植（Chatenoud、Clin. Transplant ７巻：４２２〜４３０頁（１９９３年）；Chatenoud、Nat. Rev. Immunol. ３巻：１２３〜１３２頁（２００３年）；Kumar、Transplant. Proc. ３０巻：１３５１〜１３５２頁（１９９８年））、１型糖尿病、および乾癬における免疫抑制剤として臨床的に広く使用されている。重要なことに、抗ＣＤ３ ｍＡｂは、部分的なＴ細胞シグナリングおよびクローンアネルギーを誘導することができる（Smith, JA、Nonmitogenic Anti-CD3 Monoclonal Antibodies Deliver a Partial T Cell Receptor Signal and Induce Clonal Anergy J. Exp. Med. １８５巻：１４１３〜１４２２頁（１９９７年））。ＯＫＴ３は、Ｔ細胞分裂促進因子ならびに強力なＴ細胞キラーとして文献に記載されている（Wong, JT. The mechanism of anti-CD3 monoclonal antibodies. Mediation of cytolysis by inter-T cell bridging. Transplantation ５０巻：６８３〜６８９頁（１９９０年））。特に、Ｗｏｎｇの研究は、ＣＤ３ Ｔ細胞と標的細胞とを架橋することにより、標的の殺傷を達成することができること、およびＦｃＲ媒介性ＡＤＣＣも補体固定化も、二価抗ＣＤ３ ＭＡＢが標的細胞を溶解するのに必要でないことを証明した。
ＯＫＴ３は、時間依存的様式で分裂促進活性とＴ細胞殺傷活性との両方を示す；サイトカイン放出をもたらすＴ細胞の初期の活性化の後、さらなる投与時に、ＯＫＴ３は後に全ての公知のＴ細胞機能を遮断する。ＯＫＴ３が、同種移植組織拒絶の軽減またはさらには廃止のための治療レジメンにおける免疫抑制薬としてそのような広い用途がわかったことは、Ｔ細胞機能のこの後の遮断に起因するものである。ＣＤ３分子に特異的な他の抗体は、Tunnacliffe、Int. Immunol. １巻（１９８９年）、５４６〜５０頁に開示されており、ＷＯ２００５／１１８６３５およびＷＯ２００７／０３３２３０は、抗ヒトモノクローナルＣＤ３イプシロン抗体を記載し、米国特許第５，８２１，３３７号は、マウス抗ＣＤ３モノクローナルＡｂ ＵＣＨＴ１（ｍｕｘＣＤ３、Shalabyら、J. Exp. Med. １７５巻、２１７〜２２５頁（１９９２年））およびこの抗体のヒト化バリアント（ｈｕ ＵＣＨＴ１）のＶＬおよびＶＨ配列を記載し、米国特許出願第２０１２００３４２２８号は、ヒトおよび非チンパンジー霊長類のＣＤ３イプシロン鎖のエピトープに結合することができる結合ドメインを開示する。
（ｉｉ）抗ＥｐＣＡＭ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＥｐＣＡＭに対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体ならびにそのＶＬおよびＶＨ配列の例示的な非限定的な例は、表２に提示される。一実施形態では、本発明は、表２に記載された抗ＥｐＣＡＭ ＶＬおよびＶＨ配列を含む腫瘍特異的マーカーＥｐＣＡＭに対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、第１の部分の第１の結合ドメインがＶＨおよびＶＬ領域を含み、各ＶＨおよびＶＬ領域が、表２の４Ｄ５ＭＵＣＢ抗ＥｐＣＡＭ抗体の対になったＶＬおよびＶＨ配列に対して少なくとも約９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を示す、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含み、それぞれが表２に記載されたそれぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。
上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ、１７−１Ａ抗原としても公知）は、ある特定の上皮中で、および多くのヒト癌腫上で発現される３１４アミノ酸から構成される４０ｋＤａの膜統合型糖タンパク質である（Balzar、The biology of the 17-1A antigen (Ep-CAM)、J. Mol. Med. １９９９年、７７巻：６９９〜７１２頁を参照されたい）。ＥｐＣＡＭは、結腸癌細胞を有するマウスの免疫化によって生成されたマウスモノクローナル抗体１７−１Ａ／エドレコロマブの使用によって最初に発見された（Goettlinger、Int J Cancer. １９８６年；３８巻、４７〜５３頁およびSimon、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. １９９０年；８７頁、２７５５〜２７５９頁）。その上皮細胞起源のため、原発性、転移性、および播種性非小細胞肺癌細胞（Passlick, B.ら、The 17-1A antigen is expressed on primary, metastatic and disseminated non-small cell lung carcinoma cells. Int. J. Cancer ８７巻（４号）：５４８〜５５２頁、２０００年）、胃（gastric）および胃食道接合部腺癌（Martin, I.G.、Expression of the 17-1A antigen in gastric and gastro-oesophageal junction adenocarcinomas: a potential immunotherapeutic target? J Clin Pathol １９９９年；５２巻：７０１〜７０４頁）、ならびに乳がんおよび結腸直腸がん（Packeisen Jら、Detection of surface antigen 17-1A in breast and colorectal cancer. Hybridoma. １９９９年、１８巻（１号）：３７〜４０頁）の大部分を含む、多くの癌腫に由来する腫瘍細胞は、その表面上にＥｐＣＡＭを発現し（正常で健康な細胞よりももっと）、したがって、免疫療法アプローチのための魅力的な標的である。実際、ＥｐＣＡＭの発現の増加は、上皮増殖の増加と相関する；乳がんにおいては、腫瘍細胞上でのＥｐＣＡＭの過剰発現は、生存の予測因子である（Gastl、Lancet. ２０００年、３５６巻、１９８１〜１９８２頁）。その上皮細胞起源のため、多くの癌腫に由来する腫瘍細胞は、その表面上にＥｐＣＡＭを依然として発現し、腫瘍細胞上のＥｐＣＡＭを標的とし、ＣＤ３結合領域も含有する二特異的ソリトマブ単鎖抗体組成物は、原発性子宮および卵巣ＣＳ細胞系に対する使用について提唱されている（Ferrari Fら、Solitomab, an EpCAM/CD3 bispecific antibody construct (BiTE（登録商標）), is highly active against primary uterine and ovarian carcinosarcoma cell lines in vitro. J Exp Clin Cancer Res. ２０１５年、３４巻：１２３頁）。
ＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。ＥｐＣＡＭモノクローナルＩＮＧ−１、３６２２Ｗ９４、アデカツムマブおよびエドレコロマブが、ヒト患者において試験されていると記載されている（Munz, M. Side-by-side analysis of five clinically tested anti-EpCAM monoclonal antibodies Cancer Cell International、１０巻：４４〜５６頁、２０１０年）。ＥｐＣＡＭに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、２つのハイブリドーマＯＫＴ３および９．３のいずれかと融合することにより、２つの異なる二特異的抗体の構築物を含む、ＥｐＣＡＭに対する、およびＣＤ３に対する二特異的抗体も記載されている（Moller, SA、Reisfeld, RA、Bispecific-monoclonal-antibody-directed lysis of ovarian carcinoma cells by activated human T lymphocytes. Cancer Immunol. Immunother. ３３巻：２１０〜２１６頁、１９９１年）。ＥｐＣＡＭに対する二特異的抗体の他の例としては、ＢｉＵＩＩ、（抗ＣＤ３（ラット）ｘ抗ＥｐＣＡＭ（マウス））（Zeidler、J. Immunol.、１９９９年、１６３巻：１２４７〜１２５２頁）、ｓｃＦｖ ＣＤ３／１７−１Ａ二特異的（Mack, M. A small bispecific antibody composition expressed as a functional single-chain molecule with high tumor cell cytotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci.、１９９５年、９２巻：７０２１〜７０２５頁）、ならびに抗ＣＤ３および抗ＥｐＣＡＭ特異性を有する部分ヒト化二特異的ダイアボディ（Helfrich, W. Construction and characterization of a bispecific diabody for retargeting T cells to human carcinomas. Int. J. Cancer、１９９８年、７６巻：２３２〜２３９頁）が挙げられる。
一実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的な結合ドメインと、ＣＤ３に特異的な結合ドメインとを有する第１の部分を含む二特異的キメラポリペプチドアセンブリー組成物が本明細書で提供される。解決しようとする技術的課題は、腫瘍疾患の有効な処置およびまたは寛解のための良好に許容され、より好都合の医薬（低頻度の投薬）の特性を示す改善された組成物の生成のための手段および方法を提供することであった。前記技術的課題の解決は、本明細書に開示される実施形態によって達成され、特許請求の範囲に特徴付けられる。
したがって、一部の実施形態では、本発明は、少なくとも２つの結合ドメインを含み、前記ドメインのうちの一方がＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合し、第２のドメインがＥｐＣＡＭ抗原に結合し、前記結合ドメインがＥｐＣＡＭに特異的なＶＬおよびＶＨならびにヒトＣＤ３抗原に特異的なＶＬおよびＶＨを含む、二特異的単鎖抗体組成物を含む第１の部分を含む、キメラポリペプチドアセンブリー組成物に関する。好ましくは、実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的な前記結合ドメインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。前述の一実施形態では、結合ドメインは、ｓｃＦｖ形式にある。前述の別の実施形態では、結合ドメインは、単鎖ダイアボディ形式にある。
（ｉｉｉ）抗ＣＣＲ５結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＣＣＲ５に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＣＲ５に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＣＲ５に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＣＣＲ５ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣＣＲ５に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｉｖ）抗ＣＤ１９結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＣＤ１９に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ１９に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＤ１９に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。ＶＬおよびＶＨ配列の例示的な、非限定的な例は、表２に提示される。一実施形態では、本発明は、表２に記載される抗ＣＤ１９ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣＤ１９に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、ｓｃＦｖの第２の結合ドメインがＶＨおよびＶＬ領域を含み、各ＶＨおよびＶＬ領域が、表２のＭＴ１０３抗ＣＤ１９抗体のＶＬおよびＶＨ配列対に対して少なくとも約９０％、もしくは９１％、もしくは９２％、もしくは９３％、もしくは９４％、もしくは９５％、もしくは９６％、もしくは９７％、もしくは９８％、もしくは９９％の同一性を示すか、またはそれと同一である、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表２に記載されるそれぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｖ）抗ＨＥＲ−２結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＨＥＲ−２に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＨＥＲ−２に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＨＥＲ−２に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。ＶＬおよびＶＨ配列の例示的な、非限定な例は、表２に提示される。一実施形態では、本発明は、表２に記載される抗ＨＥＲ−２ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＨＥＲ−２に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表２に記載されるそれぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｖｉ）抗ＨＥＲ−３結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＨＥＲ−３に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＨＥＲ−３に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＨＥＲ−３に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。ＶＬおよびＶＨ配列の例示的な、非限定な例は、表２に提示される。一実施形態では、本発明は、表２に記載される抗ＨＥＲ−３ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＨＥＲ−３に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表２に記載されるそれぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｖｉｉ）抗ＨＥＲ−４結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＨＥＲ−４に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＨＥＲ−４に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＨＥＲ−４に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＨＥＲ−４ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＨＥＲ−４に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｖｉｉｉ）抗ＥＧＦＲ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＥＧＦＲに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。ＶＬおよびＶＨ配列の例示的な、非限定な例は、表２に提示される。一実施形態では、本発明は、表２に記載される抗ＥＧＦＲ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＥＧＦＲに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表２に記載されるそれぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｉｘ）抗ＰＳＭＡ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＰＳＭＡに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＰＳＭＡに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＰＳＭＡに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。ＶＬおよびＶＨ配列の例示的な、非限定な例は、表２に提示される。一実施形態では、本発明は、表２に記載される抗ＰＳＭＡ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＰＳＭＡに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表２に記載されるそれぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表２に記載されるそれぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘ）抗ＣＥＡ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＣＥＡに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＥＡに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＥＡに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。ＶＬおよびＶＨ配列の例示的な、非限定な例は、表２に提示される。一実施形態では、本発明は、表２に記載される抗ＣＥＡ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣＥＡに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表２に記載されるそれぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｉ）抗ＭＵＣ１結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＭＵＣ１に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＭＵＣ１に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＭＵＣ１に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。ＶＬおよびＶＨ配列の例示的な、非限定な例は、表２に提示される。一実施形態では、本発明は、表２に記載される抗ＭＵＣ１ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＭＵＣ１に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表２に記載されるそれぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｉｉ）抗ＭＵＣ２結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＭＵＣ２に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＭＵＣ２に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＭＵＣ２に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ２ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＭＵＣ２に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｉｉｉ）抗ＭＵＣ３結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＭＵＣ３に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＭＵＣ３に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＭＵＣ３に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ３ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＭＵＣ３に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｉｖ）抗ＭＵＣ４結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＭＵＣ４に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＭＵＣ４に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＭＵＣ４に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ４ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＭＵＣ４に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｖ）抗ＭＵＣ５ＡＣ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＭＵＣ５ＡＣに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＭＵＣ５ＡＣに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＭＵＣ５ＡＣに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ５ＡＣ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＭＵＣ５ＡＣに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｖｉ）抗ＭＵＣ５Ｂ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＭＵＣ５Ｂに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＭＵＣ５Ｂに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＭＵＣ５Ｂに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ５Ｂ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＭＵＣ５Ｂに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｖｉｉ）抗ＭＵＣ７結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＭＵＣ７に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＭＵＣ７に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＭＵＣ７に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ７ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＭＵＣ７に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｖｉｉｉ）抗βｈＣＧ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーβｈＣＧに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、βｈＣＧに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。βｈＣＧに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗βｈＣＧ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーβｈＣＧに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｉｘ）抗Ｌｅｗｉｓ−Ｙ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＬｅｗｉｓ−Ｙに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、Ｌｅｗｉｓ−Ｙに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。Ｌｅｗｉｓ−Ｙに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、表２に記載される抗Ｌｅｗｉｓ−Ｙ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＬｅｗｉｓ−Ｙに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘ）抗ＣＤ２０結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＣＤ２０に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。ＶＬおよびＶＨ配列の例示的な、非限定な例は、表２に提示される。一実施形態では、本発明は、表２に記載される抗ＣＤ２０ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣＤ２０に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表２に記載されるそれぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｉ）抗ＣＤ３３結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＣＤ３３に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ３３に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＤ３３に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。ＶＬおよびＶＨ配列の例示的な、非限定な例は、表２に提示される。一実施形態では、本発明は、表２に記載される抗ＣＤ３３ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣＤ３３に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表２に記載されるそれぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｉｉ）抗ＣＤ３０結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＣＤ３０に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ３０に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＤ３０に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。ＶＬおよびＶＨ配列の例示的な、非限定な例は、表２に提示される。一実施形態では、本発明は、表２に記載される抗ＣＤ３０ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣＤ３０に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表２に記載されるそれぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｉｉｉ）抗ガングリオシドＧＤ３結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーガングリオシドＧＤ３に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ガングリオシドＧＤ３に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ガングリオシドＧＤ３に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ガングリオシドＧＤ３ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーガングリオシドＧＤ３に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｉｖ）抗９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカー９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｖ）抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＧｌｏｂｏ Ｈに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、Ｇｌｏｂｏ Ｈに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。Ｇｌｏｂｏ Ｈに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗Ｇｌｏｂｏ Ｈ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＧｌｏｂｏ Ｈに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｖｉ）抗フコシルＧＭ１結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーフコシルＧＭ１に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、フコシルＧＭ１に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。フコシルＧＭ１に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗フコシルＧＭ１ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーフコシルＧＭ１に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｖｉｉ）抗ＧＤ２結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＧＤ２に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＧＤ２に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＧＤ２に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＧＤ２ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＧＤ２に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｖｉｉｉ）抗炭酸脱水酵素ＩＸ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー炭酸脱水酵素ＩＸに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、炭酸脱水酵素ＩＸに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。炭酸脱水酵素ＩＸに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗炭酸脱水酵素ＩＸ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカー炭酸脱水酵素ＩＸに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｉｘ）抗ＣＤ４４ｖ６結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＣＤ４４ｖ６に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ４４ｖ６に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＤ４４ｖ６に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＣＤ４４ｖ６ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣＤ４４ｖ６に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｘ）抗Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＳｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＳｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｘｉ）抗Ｗｕｅ−１結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＷｕｅ−１に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、Ｗｕｅ−１に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。Ｗｕｅ−１に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗Ｗｕｅ−１ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＷｕｅ−１に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｘｉｉ）抗形質細胞抗原１結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー形質細胞抗原１に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、形質細胞抗原１に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。形質細胞抗原１に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗形質細胞抗原１ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカー形質細胞抗原１に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｘｉｉｉ）抗メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーメラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカンＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーメラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｘｉｖ）抗ＣＣＲ８結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＣＣＲ８に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＣＲ８に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＣＲ８に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＣＣＲ８ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣＣＲ８に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｘｖ）抗ＳＴＥＡＰ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＳＴＥＡＰに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＳＴＥＡＰに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＳＴＥＡＰ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＳＴＥＡＰに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｘｖｉ）抗メソテリン結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーメソテリンに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、メソテリンに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。メソテリンに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗メソテリンＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーメソテリンに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｘｖｉｉ）抗Ａ３３抗原結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＡ３３抗原に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、Ａ３３抗原に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。Ａ３３抗原に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗Ａ３３抗原ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＡ３３抗原に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｘｖｉｉｉ）抗ＰＳＣＡ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＰＳＣＡに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＰＳＣＡに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＰＳＣＡ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＰＳＣＡに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｘｘｉｘ）抗Ｌｙ−６結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＬｙ−６に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＬＹ−６に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＬＹ−６に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＬＹ−６ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＬＹ−６に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｌ）抗ＳＡＳ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＳＡＳに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＳＡＳに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＳＡＳに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＳＡＳ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＳＡＳに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｌｉ）抗デスモグレイン４結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーデスモグレイン４に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、デスモグレイン４に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。デスモグレイン４に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗デスモグレイン４ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーデスモグレイン４に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｌｉｉ）抗胎児アセチルコリン受容体結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー胎児アセチルコリン受容体に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、胎児アセチルコリン受容体に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。胎児アセチルコリン受容体に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗胎児アセチルコリン受容体ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカー胎児アセチルコリン受容体に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｌｉｉｉ）抗ＣＤ２５結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーＣＤ２５に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ２５に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＤ２５に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知であり、例えば、ダクリズマブがある。一実施形態では、本発明は、抗ＣＤ２５ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣＤ２５に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｌｉｖ）抗がん抗原１９−９結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーがん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＡ１９−９に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＡ１９−９に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗がん抗原１９−９ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣＡ１９−９に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｌｖ）抗ＣＡ−１２５結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーがん抗原１２５（ＣＡ−１２５）に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＡ−１２５に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＡ−１２５に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＣＡ−１２５ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣＡ−１２５に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｌｖｉ）抗ＭＩＳＩＩＲ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーミュラー管抑制物質ＩＩ型受容体（ＭＩＳＩＩＲ）に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＭＩＳに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＭＩＳＩＩＲに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＭＩＳＩＩＲ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＭＩＳＩＩＲに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｌｖｉｉ）抗シアル化Ｔｎ抗原結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーシアル化Ｔｎ抗原に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、シアル化Ｔｎ抗原に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。シアル化Ｔｎ抗原に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗シアル化Ｔｎ抗原ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーシアル化Ｔｎ抗原に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｌｖｉｉｉ）抗ＦＡＰ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＦＡＰに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＦＡＰに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＦＡＰ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＦＡＰに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｘｌｉｘ）抗ＣＤ２４８結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカーエンドシアリン（ＣＤ２４８）に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ２４８に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＤ２４８に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＣＤ２４８ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣＤ２４８に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｌ）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＥＧＦＲｖＩＩＩに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。ＶＬおよびＶＨ配列の例示的な、非限定な例は、表２に提示される。一実施形態では、本発明は、表２に記載される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＥＧＦＲｖＩＩＩに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表２に記載されるそれぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｌｉ）抗ＴＡＬ６結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＴＡＬ６に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＴＡＬ６に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＴＡＬ６ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＴＡＬ６に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｌｉｉ）抗ＳＡＳ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原ＳＡＳに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＳＡＳに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＳＡＳに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＳＡＳ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＳＡＳに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｌｉｉｉ）抗ＣＤ６３結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原ＣＤ６３に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ６３に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＤ６３に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＣＤ６３ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣＤ６３に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｌｉｖ）抗ＴＡＧ７２結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原ＴＡＧ７２に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＴＡＧ７２に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＴＡＧ７２に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。ＶＬおよびＶＨ配列の例示的な、非限定な例は、表２に提示される。一実施形態では、本発明は、表２に記載される抗ＴＡＧ７２ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＴＡＧ７２に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、表２に記載されるそれぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｌｖ）抗ＴＦ抗原結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原）に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＴＦ抗原に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＴＦ抗原に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＴＦ抗原ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＴＦ抗原に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｌｖｉ）抗ＩＧＦ−ＩＲ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＩＧＦ−ＩＲに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＩＧＦ−ＩＲに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＩＧＦ−ＩＲ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＩＧＦ−ＩＲに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｌｖｉｉ）抗Ｃｏｒａ抗原結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原Ｃｏｒａ抗原に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、Ｃｏｒａ抗原に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。Ｃｏｒａ抗原に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗Ｃｏｒａ抗原ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣｏｒａ抗原に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｌｖｉｉｉ）抗ＣＤ７結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原ＣＤ７に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ７に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＤ７に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＣＤ７ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣＤ７に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｌｉｘ）抗ＣＤ２２結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原ＣＤ２２に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ２２に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＤ２２に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＣＤ２２ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣＤ２２に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｌｘ）抗ＣＤ７９ａ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原ＣＤ７９ａに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ７９ａに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＤ７９ａに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＣＤ７９ａ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣＤ７９ａに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｌｘｉ）抗ＣＤ７９ｂ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原ＣＤ７９ｂに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＣＤ７９ｂに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＣＤ７９ｂに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＣＤ７９ｂ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＣＤ７９ｂに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｌｘｉｉ）抗Ｇ２５０結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原Ｇ２５０に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、Ｇ２５０に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。Ｇ２５０に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗Ｇ２５０ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＧ２５０に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｌｘｉｉｉ）抗ＭＴ−ＭＭＰ結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原ＭＴ−ＭＭＰに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＭＴ−ＭＭＰに対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＭＴ−ＭＭＰに対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＭＴ−ＭＭＰ ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＭＴ−ＭＭＰに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｌｘｉｖ）抗Ｆ１９抗原結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原Ｆ１９抗原に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、Ｆ１９抗原に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。Ｆ１９抗原に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗Ｆ１９抗原ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＦ１９抗原に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
（ｌｘｖ）抗ＥｐｈＡ２受容体結合ドメイン
一部の実施形態では、本発明は、腫瘍特異的マーカー腫瘍関連抗原ＥｐｈＡ２受容体に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインと、ＣＤ３抗原などのエフェクター細胞抗原に結合する第２の結合ドメインとを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、結合ドメインは、ＥｐｈＡ２受容体に対するモノクローナル抗体に由来するＶＬおよびＶＨを含む。ＥｐｈＡ２受容体に対するモノクローナル抗体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、本発明は、抗ＥｐｈＡ２受容体ＶＬおよびＶＨ配列を含む、腫瘍特異的マーカーＥｐｈＡ２受容体に対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、それぞれが、それぞれのＶＬおよびＶＨ配列に由来する、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、ＣＤＲ−Ｌ３領域、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む腫瘍特異的マーカーに対する結合親和性を有する第１の部分の結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましくは、実施形態では、前記結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍより高いＫｄ値を有する。
キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、バリアントが記載される抗原に対する結合特異性を示す限り、前述の結合ドメインのいずれか１つまたはそれらの配列バリアントを含んでもよいことが具体的に企図される。一実施形態では、配列バリアントを、ＶＬまたはＶＨ配列中のアミノ酸の、異なるアミノ酸との置換によって作出することができる。欠失バリアントでは、本明細書に記載のＶＬまたはＶＨ配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基が除去される。したがって、欠失バリアントは、結合ドメインポリペプチド配列の全ての断片を含む。置換バリアントでは、ＶＬまたはＶＨ（またはＣＤＲ）ポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基が除去され、代替残基で置き換えられる。一態様では、置換は天然では保存的であり、この型の保存的置換は、当技術分野で周知である。さらに、本明細書に開示される第１および第２の結合ドメインを含む組成物を、本明細書に開示される方法のいずれかにおいて用いることができることが具体的に企図される。
２．放出セグメント
別の態様では、本発明は、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼにより切断され得る放出セグメント（ＲＳ）ペプチド配列を組み込むキメラポリペプチドアセンブリー組成物に関し、プロテアーゼ（または複数のプロテアーゼ）へのＲＳの曝露の際に、ＲＳが切断され、二特異的結合ドメインが組成物から放出される。対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物の二特異的結合ドメインおよび遮蔽バルキング部分の放出の際に、バルキング部分の遮蔽効果の喪失のため、エフェクターＴ細胞およびがん、腫瘍または標的細胞に同時に結合するその完全な能力は、がん、腫瘍または標的細胞の損傷または細胞溶解をもたらす。
ある特定の実施形態では、本発明は、二官能性結合ドメイン部分、ＸＴＥＮなどの結合部分、および標的組織と関連する１つまたは複数のプロテアーゼのための基質である組み込まれたペプチドＲＳを含む単一の融合タンパク質を含み、ＲＳがバルキング部分の末端に組換えによって連結され、ＲＳが第１および第２の結合ドメインを含む第１の部分に組換えによって連結されており、かくして、ＲＳが第１の部分と、ＸＴＥＮまたは他のバルキング部分との間に位置する、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。
実施形態では、本発明は、対象における疾患標的組織と関連するプロテアーゼのための基質である１つまたは複数のＲＳを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する；その非限定的な例は、がん、腫瘍、または増殖性障害もしくは炎症疾患に関与する組織もしくは臓器である。ＲＳを含む組成物が標的化された組織関連プロテアーゼの近くにある場合に、結合ドメインが組成物から放出されるように、二特異的結合ドメインを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物における使用のために特に構成されたＲＳを提供することが、本発明の目的である。キメラポリペプチドアセンブリー組成物の設計は、結合ドメインを含む得られる放出構成成分が、得られる断片の分子質量の減少によるにしろ、または切断除去される隣接するバルキング部分（例えば、ＸＴＥＮ）による立体障害の低下によるにしろ、標的組織に溢出し、付着し、または浸透する増強された能力を有するようなものである。
ヒト癌腫における間質は、細胞外マトリックスと、白血球、内皮細胞、線維芽細胞、および筋線維芽細胞などの様々な型の非癌腫細胞とからなる。腫瘍と関連する間質は、新血管形成、ならびに並置された癌腫細胞の増殖および侵襲を刺激することにより、腫瘍増殖を活発に支援する。がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）と呼ばれることが多い間質線維芽細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の組成を動的に改変し、それによって、腫瘍細胞侵襲およびその後の転移性定着を容易にするその能力のため、腫瘍進行において特に重要な役割を有する。特に、プロテアーゼは、腫瘍血管形成、侵襲、細胞外マトリックスリモデリング、および転移を含む悪性進行に寄与する重要な構成成分であり、タンパク質分解的相互作用の広範囲の多方向的ネットワークの一部として機能することが当技術分野で公知である。悪性腫瘍の要件は、周囲の正常組織に浸透し、遠隔部位に播種するための血管系を獲得するその能力であるため、腫瘍は、複数の酵素クラスに由来する細胞外エンドプロテアーゼ、例えば、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ならびにセリン、トレオニン、システインおよびアスパラギン酸プロテアーゼの発現の増加に大きく依拠する。プロテアーゼの役割は、組織侵襲および血管形成に限定されないが、これらの酵素は、増殖因子活性化、細胞接着、細胞生存および免疫監視においても主要な役割を有している。例えば、ＭＭＰは、増殖因子、細胞表面受容体、細胞接着分子、またはケモカインを切断するその能力の結果として、腫瘍細胞挙動に影響することができる。集合的に、腫瘍関連プロテアーゼの作用は、がんの表現型進化における重要な力を表す。
正常組織と腫瘍組織との間での多くのそのようなタンパク質分解酵素の示差的発現を証明するかなりの証拠が存在するため、この示差的発現を、腫瘍の近くにある対象組成物を活性化するための手段として利用することができることが具体的に企図される。これに関して、特に、セリンおよびメタロプロテアーゼは、細胞外腫瘍環境におけるその活性の上昇と、ＲＳの短いペプチド配列を選択的かつ特異的に切断して、腫瘍での高レベルの活性な対象組成物の第１の部分および正常で健康な組織における低レベルのインタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物をもたらすその能力との両方のため、対象組成物の標的化された示差的薬物送達のための候補である。キメラポリペプチドアセンブリー組成物の選択的送達の結果として、これらの薬剤の必要とされる活性または用量の同時的低下と、肝臓、心臓および骨髄を含む正常組織に対する毒性の低下との両方が存在し、それによって、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の治療指数を大きく改善する。開示される組成物は、他の特性の中でも、切断されていない状態で、それらがそのそれぞれのリガンドに対する結合親和性の低下を示し、それらが正常で健康な組織での溢出の減少を示すが、切断時に良好に溢出し、腫瘍に浸透し、そのそれぞれのリガンドに対するより高い結合親和性を有することができる点で、このプロドラッグ概念の有益な特性を有することが具体的に企図される；これらは全て、治療指数の増強および対象組成物の副作用の軽減に寄与する。
一部の実施形態では、本発明は、組成物が標的化された組織関連プロテアーゼによって切断された場合、第１の部分の結合ドメインを含む断片を放出し、断片が、切断されない組成物と比較して、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍高い濃度で、腫瘍などの前記標的化された組織内に浸透することができる、ＲＳを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む。他の実施形態では、本発明は、組成物が標的化された組織関連プロテアーゼによって切断された場合、第１の部分の結合ドメインを含む断片を放出し、第１の部分の結合ドメインを含む断片が、ＲＳを含まない組成物と比較して、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍速い速度で、前記組織内に浸透することができる、ＲＳを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む。一実施形態では、本発明は、組成物が標的化された組織関連プロテアーゼによって切断された場合、第１の部分の結合ドメインを含む断片を放出し、切断された第１の部分の断片が、プロテアーゼによって切断されないインタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物よりも少なくとも２０％小さい、または少なくとも３０％小さい、または少なくとも４０％小さい、または少なくとも５０％小さい、または少なくとも６０％小さい、または少なくとも７０％小さい、または少なくとも８０％小さい得られる分子量を有する、ＲＳを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む。別の実施形態では、本発明は、組成物が標的化された組織関連プロテアーゼによって切断された場合、第１の部分の結合ドメインを含む断片を放出し、切断された第１の部分の断片が、プロテアーゼによって切断されないインタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物よりも少なくとも２０％小さい、または少なくとも３０％小さい、または少なくとも４０％小さい、または少なくとも５０％小さい、または少なくとも６０％小さい、または少なくとも７０％小さい、または少なくとも８０％小さい得られる流体力学半径を有する、ＲＳを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む。対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物実施形態において、組織関連プロテアーゼによる切断は、インタクトな組成物と比較して断片のサイズの減少のため、腫瘍などの組織により効果的に浸透し、標的細胞の膜に対する損傷、アポトーシスの誘導、細胞溶解または死を含んでもよい、前記組織または細胞内の結合ドメインの組合せについて当技術分野で公知の薬理学的効果をもたらすことができる第１の部分の結合ドメインを含む断片をもたらすことが具体的に企図される。また、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のＲＳは、標的組織または細胞により産生されることが公知の特異的プロテアーゼを用いて特定の組織を標的化することが意図される組成物中での使用のために設計されることも具体的に企図される。一実施形態では、ＲＳは、がんである組織と関連するプロテアーゼのための基質であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＲＳは、がん性腫瘍と関連するプロテアーゼのための基質であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＲＳは、白血病などのがんと関連するプロテアーゼのための基質であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＲＳは、増殖性障害と関連するプロテアーゼのための基質であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のＲＳは、炎症疾患と関連するプロテアーゼのための基質であるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＲＳは、メタロプロテイナーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、およびセリンプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質である。別の実施形態では、ＲＳは、メプリン、ネプリリシン（ＣＤ１０）、ＰＳＭＡ、ＢＭＰ−１、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭｓ）、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７（ＴＡＣＥ）、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２８（ＭＤＣ−Ｌ）、トロンボスポンジンモチーフを有するＡＤＡＭ（ＡＤＡＭＴＳ）、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ１）、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−３（ストロメリシン１）、ＭＭＰ−７（マトリリシン１）、ＭＭＰ−８(コラゲナーゼ２)、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）、ＭＭＰ−１０（ストロメリシン２）、ＭＭＰ−１１（ストロメリシン３）、ＭＭＰ−１２（マクロファージエラスターゼ）、ＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ３）、ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−１５（ＭＴ２−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−１９、ＭＭＰ−２３（ＣＡ−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−２４（ＭＴ５−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−２６（マトリリシン２）、ＭＭＰ−２７（ＣＭＭＰ）、レグマイン、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＸ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、セクレターゼ、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）、プラスミン、トロンビン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ、ＫＬＫ３）、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、エラスターゼ、トリプターゼ、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）、ＤＥＳＣ１、ヘプシン（ＨＰＮ）、マトリプターゼ、マトリプターゼ−２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４（ＣＡＰ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、カリクレイン関連ペプチダーゼ（ＫＬＫファミリー）、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、およびＫＬＫ１４からなる群から選択される１つまたは複数のプロテアーゼのための基質である。一部の実施形態では、ＲＳは、ＡＤＡＭ１７のための基質である。一部の実施形態では、ＲＳは、ＢＭＰ−１のための基質である。一部の実施形態では、ＲＳは、カテプシンのための基質である。一部の実施形態では、ＲＳは、システインプロテアーゼのための基質である。一部の実施形態では、ＲＳは、ＨｔｒＡ１のための基質である。一部の実施形態では、ＲＳは、レグマインのための基質である。一部の実施形態では、ＲＳは、ＭＴ−ＳＰ１のための基質である。一部の実施形態では、ＲＳは、メタロプロテイナーゼのための基質である。一部の実施形態では、ＲＳは、好中球エラスターゼのための基質である。一部の実施形態では、ＲＳは、トロンビンのための基質である。一部の実施形態では、ＲＳは、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）のための基質である。一部の実施形態では、ＲＳは、ＴＭＰＲＳＳ３のための基質である。一部の実施形態では、ＲＳは、ＴＭＰＲＳＳ４のための基質である。一部の実施形態では、ＲＳは、ｕＰＡのための基質である。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のＲＳは、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ｕＰＡ、およびマトリプターゼからなる群から選択される少なくとも２つのプロテアーゼのための基質である。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のＲＳは、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ｕＰＡ、およびマトリプターゼプロテアーゼのための基質である。
一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のＲＳは、限定されるものではないが、表３のプロテアーゼを含む標的組織により分泌される細胞外プロテアーゼのための基質であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のＲＳは、限定されるものではないが、表３のプロテアーゼを含む、細胞内に位置する細胞プロテアーゼのための基質であるアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、本発明は、表４に記載される配列群から選択される少なくとも第１の切断配列を含む対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物における使用を意図されるＲＳ組成物を提供する。一部の実施形態では、対象組成物のＲＳ配列は、ＬＳＧＲＳＤＮＨＳＰＬＧＬＡＧＳ、ＳＰＬＧＬＡＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ、ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＮＨ、ＬＡＧＲＳＤＮＨＳＰＬＧＬＡＧＳ、ＬＳＧＲＳＤＮＨＶＰＬＳＬＫＭＧ、ＳＰＬＧＬＡＧＳ、ＧＰＬＡＬＡＲＧ、ＬＳＧＲＳＤＮＨ、ＶＰＬＳＬＴＭＧ、ＶＰＬＳＬＫＭＧ、ＶＰＬＳＬＳＭＧ、ＥＰＬＥＬＶＡＧ、ＥＰＬＥＬＲＡＧ、ＥＰＡＡＬＭＡＧ、ＥＰＡＳＬＭＡＧ、ＲＩＧＳＬＲＴＡ、ＲＩＱＦＬＲＴＡ、ＥＰＦＨＬＭＡＧ、ＶＰＬＳＬＦＭＧ、ＥＰＬＥＬＰＡＧ、およびＥＰＬＥＬＡＡＧからなる配列群から選択される。必要に応じて、対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物のＲＳ配列は、ＬＳＧＲＳＤＮＨＳＰＬＧＬＡＧＳである。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のＲＳは、表４のＢＳＲＳ１の配列を含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のＲＳは、表４のＢＳＲＳ１の配列からなる。
別の実施形態では、切断コンジュゲート組成物のＲＳは、第１の切断配列と、前記第１の切断配列とは異なる第２の切断配列とを含み、各配列は、表４に記載される配列群から選択され、第１および第２の切断配列は、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンから選択される１〜６個のアミノ酸によって互いに連結されている。別の実施形態では、切断コンジュゲート組成物のＲＳは、第１の切断配列、前記第１の切断配列とは異なる第２の切断配列、および第３の切断配列を含み、各配列は、表４に記載される配列群から選択され、第１および第２および第３の切断配列は、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンから選択される１〜６個のアミノ酸によって互いに連結されている。他の実施形態では、本発明は、１、２または３個のＲＳを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。キメラポリペプチドアセンブリー組成物の複数のＲＳを繋いで、複数のプロテアーゼによって切断され得るユニバーサル配列を形成させることができることが具体的に意図される。そのような組成物は、複数のプロテアーゼを発現する疾患標的組織によってより容易に切断され、その結果、結合ドメインを担持する得られる断片は標的組織により容易に浸透し、結合ドメインの薬理学的効果を発揮することが企図される。
３．バルキング部分
別の態様では、本発明は、少なくとも第１のバルキング部分を含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物に関する。一部の実施形態では、本発明は、バルキング部分を含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。バルキング部分の非限定的な例としては、延長組換えポリペプチド（本明細書の以下に記載されるＸＴＥＮ）；アルブミン結合ドメイン；アルブミン；ＩｇＧ結合ドメイン；プロリン、セリン、およびアラニンからなる少なくとも３５０個のアミノ酸残基のポリペプチド；脂肪酸；エラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）（ＥＬＰの個々のサブユニットまたは構成要素は、ＷＯ２０１６０８１８８４に記載されるような、ＥＬＰバイオポリマーを形成するように複数回繰り返されるヒトタンパク質エラスチンに見出される５個のアミノ酸モチーフに由来する）、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＧＡ、およびヒドロキシルエチルデンプンが挙げられる。別の実施形態では、バルキング部分は、ＸＴＥＮ；アルブミン結合ドメイン；アルブミン；ＩｇＧ結合ドメイン；プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド；脂肪酸；Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＧＡ、およびヒドロキシルエチルデンプンからなる群から選択される２つの異なるバルキング部分を含み、２つのバルキング部分は互いに、次いで、組成物の放出セグメントに連結されている。好ましい実施形態では、対象組成物のバルキング部分は、１つまたは複数の分子のＸＴＥＮである。別の好ましい実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、表５に記載される配列群から選択される同等の長さのＸＴＥＮ配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するバルキング部分配列を含む。実施形態では、ＸＴＥＮポリペプチドは、組成物の第２の部分の放出セグメント（ＲＳ）に組換えによって連結される。
理論によって束縛されるものではないが、バルキング部分の組込みは、ある特定の重要な特性を付与するために対象組成物の設計に組み込まれた；ｉ）組成物が無傷である場合に、結合ドメインを遮蔽し、標的抗原およびエフェクター細胞抗原に対する結合親和性を低下させるバルキング部分を有するキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する、ｉｉ）対象に投与された場合に半減期の増強を提供するバルキング部分を有するキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する、ｉｉｉ）正常な組織および臓器での溢出を減少させるが、血管系中でより大きい孔径を有する疾患組織（例えば、腫瘍）での溢出度を許容し、ある特定の哺乳動物プロテアーゼの作用によって組成物から放出され得ることによって、組成物の結合ドメインが、疾患組織により容易に浸透し、エフェクター細胞および腫瘍細胞上の標的抗原に同時に結合することができるバルキング部分を有するキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。これらの必要性を満たすために、本発明は、バルキング部分が得られる組成物に対して質量および流体力学半径の増大を提供するキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。好ましい実施形態では、バルキング部分は、それが質量および流体力学半径の増大を提供するだけでなく、その可撓性の非構造的特徴が組成物の第１の部分の結合ドメインを超える遮蔽効果を提供することによって、標的抗原および／またはエフェクター細胞抗原を発現しない、または低下したレベルのそれを発現する正常組織または正常組織の血管系中の抗原に結合する可能性を減少させ、ｓｃＦｖの溶解性および適切なフォールディングを増強する対象組成物の設計におけるある特定の利点を提供する、ＸＴＥＮポリペプチドである。
（ｉ）ＸＴＥＮ
ある特定の実施形態では、本発明は、組成物に組換えによって連結された１つまたは複数の分子のＸＴＥＮを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。
本明細書で使用される「ＸＴＥＮ」は、生理的条件下で低い程度の二次もしくは三次構造、を有する、または二次もしくは三次構造を有さない、ならびに以下の段落に記載されるさらなる特性を有する、天然には存在しない、実質的に非反復性の配列を有するポリペプチドである。ＸＴＥＮは、典型的には、少なくとも約１００個〜少なくとも約１０００個またはそれよりも多くのアミノ酸、より好ましくは、少なくとも約２００個〜少なくとも約９００個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも約４００個〜約８６６個のアミノ酸を有し、その大部分または全部が小さい親水性のアミノ酸である。本明細書で使用される場合、ＸＴＥＮは、具体的には、全抗体または抗体断片（例えば、単鎖抗体およびＦｃ断片）を含まない。ＸＴＥＮポリペプチドは、それらが様々な役割を果たし、例えば、本明細書に記載の対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物の第１の部分の二特異的結合ドメインを含む組成物に連結された場合、ある特定の望ましい特性を付与する点で、融合パートナーとしての有用性を有する。得られる組成物は、ＸＴＥＮに連結されていない対応する結合ドメインと比較して、薬物動態特性、物理化学特性、薬理学特性の増強、ならびに毒性学的特性および薬学的特性の改善などの、増強された特性を有し、当技術分野で公知である結合ドメインが使用されるある特定の状態の処置においてそれらを有用なものにする。
ＸＴＥＮの非構造的特徴および物理化学特性は、部分的には、４〜６つの型の親水性アミノ酸に偏って限定される全体的なアミノ酸組成、定量可能な、実質的に非反復的設計でのアミノ酸の連結から、ならびにＸＴＥＮポリペプチドの得られる長さおよび／または構成から生じる。ＸＴＥＮに共通であるが、天然ポリペプチドには共通でない有利な特色では、本明細書に開示されるＸＴＥＮの特性は、変化する長さの範囲内で、類似する特性を有し、それらが連結される組成物に対して増強された特性を付与し、その多くが実施例で実証される、表５の例示的な配列の多様性によって証明されるように、絶対的な一次アミノ酸配列に拘束されない。実際、本発明の組成物は、表５に具体的に列挙されるＸＴＥＮに限定されないが、むしろ、実施形態は、それらが以下に記載されるＸＴＥＮの特性を示すため、表５の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含むことが具体的に企図される。そのようなＸＴＥＮは、タンパク質よりも非タンパク質性の、親水性ポリマー（ポリエチレングリコール、または「ＰＥＧ」など）のような特性を有することが確立されている。本発明のＸＴＥＮは、１つまたは複数の以下の有利な特性：規定の均一な長さ（所与の配列について）、立体構造的可撓性、二次構造の減少または欠如、高度のランダムコイル形成、高度の水溶解性、高度のプロテアーゼ抵抗性、低い免疫原性、哺乳動物受容体への低い結合、規定の程度の電荷、および流体力学（またはＳｔｏｋｅｓ）半径の増大；それらを融合パートナーとして特に有用にするある特定の親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）と類似する特性を示す。
対象融合タンパク質のＸＴＥＮ構成成分は、ポリマーの伸長した長さにも拘わらず、生理学的条件下で変性したペプチド配列のように振る舞うように設計される。「変性した」は、ペプチド骨格の大きなコンフォメーション自由によって特徴付けられる溶液中のペプチドの状態を記載する。多くのペプチドおよびタンパク質は、高濃度の変性剤の存在下または高温では変性したコンフォメーションを採る。変性したコンフォメーションにあるペプチドは、例えば、特徴的な円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを有し、ＮＭＲにより決定された場合、長距離相互作用の欠如によって特徴付けられる。「変性したコンフォメーション」および「非構造的コンフォメーション」は、本明細書では同義的に使用される。一部の実施形態では、本発明は、生理的条件下で二次構造を実質的に欠く変性した配列と、生理的条件下で類似するＸＴＥＮ配列を含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。本文脈で使用される「実質的に欠く」とは、ＸＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基の少なくとも約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９７％、または少なくとも約９９％が、アルゴリズムまたは分光測光アッセイを含む本明細書に記載の方法によって測定または決定された場合、二次構造に寄与しないことを意味する。
対象ＸＴＥＮの物理化学特性を決定および確認するための様々な十分に確立された方法およびアッセイが当技術分野で公知である。そのような特性としては、限定されるものではないが、二次または三次構造、溶解性、タンパク質凝集、安定性、絶対および見かけの分子量、純度および均一性、融解特性、夾雑物および水の含量が挙げられる。そのような特性を測定する方法としては、分析的遠心分離、ＥＰＲ、ＨＰＬＣ−イオン交換、ＨＰＬＣ−サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＨＰＬＣ−逆相、光散乱、キャピラリー電気泳動、円偏光二色性、示差走査熱量測定、蛍光、ＨＰＬＣ−イオン交換、ＨＰＬＣ−サイズ排除、ＩＲ、ＮＭＲ、Ｒａｍａｎ分光法、屈折率測定、およびＵＶ／可視光分光法が挙げられる。特に、二次構造を、分光測光的に、例えば、「遠ＵＶ」スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）での円偏光二色性分光法によって測定することができる。アルファ−ヘリックスおよびベータ−シートなどの二次構造エレメントは、それぞれ、ＣＤスペクトルの特徴的な形状および規模を生じさせ、これらの構造エレメントの欠如も同様である。米国特許出願公開第２００３０２２８３０９Ａ１号に記載されたような、周知のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム（Chou, P. Y.ら（１９７４年）Biochemistry、１３巻：２２２〜４５頁）およびＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎアルゴリズム（「Ｇｏｒアルゴリズム）（Garnier J、Gibrat JF、Robson B.（１９９６年）、GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence. Methods Enzymol ２６６巻：５４０〜５５３頁）などの、ある特定のコンピュータープログラムまたはアルゴリズムにより、ポリペプチド配列に関する二次構造を予測することもできる。所与の配列について、アルゴリズムは、例えば、アルファ−ヘリックスもしくはベータ−シートを形成する配列の残基の合計および／もしくは百分率、またはランダムコイル形成（二次構造を欠く）をもたらすと予測される配列の残基の百分率として表される、いくつかの二次構造が存在するか、または二次構造が全く存在しないかを予測することができる。例えば、fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1のワールドワイドウェブ上のサイトを使用するＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムおよびnpsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.htmlのＧｏｒアルゴリズム（両方とも２０１２年９月５日にアクセスした）を使用して、ポリペプチド配列を分析することができる。コンフォメーション依存的に鎖長を用いてスケーリングする固有粘度測定（Tanford, C.、Kawahara, K.およびLapanje, S.（１９６６年）、J. Biol. Chem. ２４１巻、１９２１〜１９２３頁）を使用することによる、ならびにサイズ排除クロマトグラフィー（Squire, P. G.、Calculation of hydrodynamic parameters of random coil polymers from size exclusion chromatography and comparison with parameters by conventional methods. Journal of Chromatography、１９８１年、５巻、４３３〜４４２頁）によるなど、様々な方法により、ランダムコイルを決定することができる。さらなる方法は、Arnauら、Prot Expr and Purif（２００６年）、４８巻、１〜１３頁に開示されている。
一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定された場合、０％〜約５％未満の範囲のアルファ−ヘリックスの百分率および０％〜約５％未満の範囲のベータ−シートの百分率を、ＧＯＲアルゴリズムによって決定された場合、少なくとも約９０％のランダムコイル形成を有する。別の実施形態では、開示される組成物のＸＴＥＮ配列は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによって決定された場合、約２％未満のアルファ−ヘリックスの百分率および約２％未満のベータ−シートの百分率を、ＧＯＲアルゴリズムにより決定された場合、少なくとも約９０％のランダムコイル形成を有する。別の実施形態では、組成物のＸＴＥＮ配列は、円偏光二色性により測定された場合、二次構造を実質的に欠いている。
絶対一次配列ではなく、ＸＴＥＮにおいて優位である特定の型のアミノ酸と共に、本発明の対象組成物において用いられるＸＴＥＮの非反復的特徴は、ＸＴＥＮおよび得られるキメラポリペプチドアセンブリー組成物の１つまたは複数の増強された物理化学的および生物学的特性を付与することが確立されている。したがって、表５の配列は例示的であるが、表５の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列はＸＴＥＮの増強された特性を示すため、それらは限定的であると意図されない。これらの増強された特性としては、ＸＴＥＮに連結されていない結合ドメインと比較して、宿主細胞中でのキメラポリペプチドアセンブリー組成物融合タンパク質の高度の発現、対象組成物のＸＴＥＮ部分をコードする遺伝子のより高い遺伝的安定性、凝集する傾向が低い得られるキメラポリペプチドアセンブリー組成物上でのより高い溶解性を付与するＸＴＥＮ、および得られるキメラポリペプチドアセンブリー組成物の増強された薬物動態が挙げられる。これらの増強された特性は、より効率的な製造、最終産物のより高い均一性、より低い製品コストを可能にする、および／または極端に高いタンパク質濃度の、一部の場合、１００ｍｇ／ｍｌを超える、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を含有する医薬調製物の製剤化、ならびに得られる組成物の、以下により完全に記載される、改善された安全性プロファイルおよび減少した投薬間隔を容易にする。
一部の実施形態では、本発明のキメラポリペプチドアセンブリー組成物中で使用されるＸＴＥＮ配列は、ＡＥ１４４、ＡＥ１４４＿１Ａ、ＡＥ１４４＿２Ａ、ＡＥ１４４＿２Ｂ、ＡＥ１４４＿３Ａ、ＡＥ１４４＿３Ｂ、ＡＥ１４４＿４Ａ、ＡＥ１４４＿４Ｂ、ＡＥ１４４＿５Ａ、ＡＥ１４４＿６Ｂ、ＡＥ２８８＿１、ＡＥ２８８＿２、ＡＥ１４４Ａ、ＡＥ１４４Ｂ、ＡＥ１８０Ａ、ＡＥ２１６Ａ、ＡＥ２５２Ａ、ＡＥ２８８Ａ、ＡＥ３２４Ａ、ＡＥ３６０Ａ、ＡＥ３９６Ａ、ＡＥ４３２Ａ、ＡＥ４６８Ａ、ＡＥ５０４Ａ、ＡＥ５４０Ａ、ＡＥ５７６Ａ、ＡＥ６１２Ａ、ＡＥ６４８Ａ、ＡＥ６８４Ａ、ＡＥ７２０Ａ、ＡＥ７５６Ａ、ＡＥ７９２Ａ、ＡＥ８２８Ａ、ＡＥ８６９、ＡＥ１４４＿Ｒ１、ＡＥ２８８＿Ｒ１、ＡＥ４３２＿Ｒ１、ＡＥ５７６＿Ｒ１、ＡＥ８６４＿Ｒ１、ＡＥ７１２、ＡＥ８６４＿Ｒ２、ＡＥ９１２、ＡＭ９２３、ＡＥ９４８、ＡＥ１０４４、ＡＥ１１４０、ＡＥ１２３６、ＡＥ１３３２、ＡＥ１４２８、ＡＥ１５２４、ＡＥ１６２０、ＡＥ１７１６、ＡＥ１８１２、ＡＥ１９０８、ＡＥ２００４Ａ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。ＵＳ２０１０−０２３９５５４Ａ１を参照されたい。特定の一実施形態では、ＸＴＥＮは、ＡＥ１４４、ＡＥ２８８、ＡＥ５７６、ＡＥ８６４、ＡＥ８６５、もしくはＡＥ８６６、またはそれらの任意の組合せから選択される配列を含む。
一部の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物中のＸＴＥＮのアミノ酸の１００％未満がグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される場合、または配列の１００％未満が表５のＸＴＥＮ配列からなる場合、ＸＴＥＮの残りのアミノ酸残基は、他の１４種のＬ−アミノ酸のいずれかから選択されるが、ＸＴＥＮ配列が少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％の親水性アミノ酸を含有するような親水性アミノ酸から優先的に選択される。キメラポリペプチドアセンブリー組成物中で利用されるＸＴＥＮ中の疎水性アミノ酸の含量は、５％未満、または２％未満、または１％未満の疎水性アミノ酸含量であってもよい。ＸＴＥＮの構築においてあまり好ましくない疎水性残基としては、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、およびメチオニンが挙げられる。さらに、ＸＴＥＮ配列は、５％未満もしくは４％未満もしくは３％未満もしくは２％未満もしくは１％未満の下記アミノ酸を含有するか、または下記アミノ酸を全く含有しなくてもよい：メチオニン（例えば、酸化を回避するため）、またはアスパラギンおよびグルタミン（脱アミド化（desamidation）を回避するため）。
本発明のキメラポリペプチドアセンブリー実施形態において利用されるある特定のＸＴＥＮ配列に関するアミノ酸配列を、表５に示す。
本発明は、表５のものに対して中間の長さのＸＴＥＮ、ならびに１２アミノ酸のモチーフがキメラポリペプチドアセンブリー中に組み込まれた表５のＸＴＥＮのＮまたはＣ末端に付加されたより長い長さのＸＴＥＮを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を企図する。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、表６に記載されるモチーフ群から選択される１つまたは複数のモチーフの１つまたは複数のコピーが付加された表５のＸＴＥＮを含む。
本発明に従って使用することができるＸＴＥＮ配列のさらなる例は、米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５４Ａ１号、第２０１０／０３２３９５６Ａ１号、第２０１１／００４６０６０Ａ１号、第２０１１／００４６０６１Ａ１号、第２０１１／００７７１９９Ａ１号、もしくは第２０１１／０１７２１４６Ａ１号、または国際特許出願公開第ＷＯ２０１００９１１２２Ａ１号、第ＷＯ２０１０１４４５０２Ａ２号、第ＷＯ２０１０１４４５０８Ａ１号、第ＷＯ２０１１０２８２２８Ａ１号、第ＷＯ２０１１０２８２２９Ａ１号、第ＷＯ２０１１０２８３４４Ａ２号、第ＷＯ２０１４／０１１８１９Ａ２号、もしくは第ＷＯ２０１５／０２３８９１号に開示されている。
４．Ｔ細胞結合組成物
別の態様では、本発明は、第１の部分、第２の部分、および第３の部分を含み、前記第１の部分が可撓性リンカーによって接合された抗ＣＤ３結合ドメインのＶＬおよびＶＨ配列を含み、前記第２の部分が哺乳動物プロテアーゼによって切断され得る第１の放出セグメント（ＲＳ）を含み、第３の部分がＸＴＥＮ配列を含む第１のバルキング部分を含み、前記バルキング部分および第１の部分が前記第２の部分上の前記哺乳動物プロテアーゼの作用によって組成物から放出され得る、モノマー融合タンパク質を提供する。前述の一部の実施形態では、対象組成物の第１の部分のＶＬおよびＶＨ配列は、表１に記載される配列群から選択されるモノクローナル抗体ＶＬおよびＶＨに由来する。必要に応じて、対象組成物のＶＬおよびＶＨは、表１のｈｕＵＣＨＴ１モノクローナル抗体に由来する。図２９に図示されるように、Ｎ末端からＣ末端の順序に関して、組成物を異なる順序で構成させることができることが具体的に企図される。一実施形態では、組成物は、結合ドメイン−ＲＳ−ＸＴＥＮのＮ末端からＣ末端に向かう方向で構成され、別の実施形態では、部分は、ＸＴＥＮ−ＲＳ−結合ドメインの順序で構成される。
Ｔ細胞結合組成物の一部の実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、表１のＶＨおよびＶＬ配列を含み、第２の部分のＲＳは、表４に記載される配列からなる群から選択され、第３の部分のＸＴＥＮは、表５に記載される配列からなる群から選択される。
他の実施形態では、本発明は、最適にアラインさせた場合、表７に記載されるアミノ酸配列からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性、もしくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、またはそれと１００％同一であるＴ細胞結合組成物融合タンパク質を提供する。一実施形態では、Ｔ細胞結合組成物は、表７のＴＣＢ−１のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ｔ細胞結合組成物は、表７のＴＣＢ−２のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ｔ細胞結合組成物は、表７のＴＣＢ−３のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ｔ細胞結合組成物は、表７のＴＣＢ−４のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ｔ細胞結合組成物は、表７のＴＣＢ−５のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ｔ細胞結合組成物は、表７のＴＣＢ−６のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ｔ細胞結合組成物は、表７のＴＣＢ７のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ｔ細胞結合組成物は、表７のＴＣＢ−８のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ｔ細胞結合組成物は、表７のＴＣＢ−９のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ｔ細胞結合組成物は、表７のＴＣＢ−１０のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ｔ細胞結合組成物は、表７のＴＣＢ１１のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ｔ細胞結合組成物は、表７のＴＣＢ−１２のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ｔ細胞結合組成物は、表７のＴＣＢ−１３のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ｔ細胞結合組成物は、表７のＴＣＢ−１４のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ｔ細胞結合組成物は、表７のＴＣＢ−１５のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ｔ細胞結合組成物は、表７のＴＣＢ−１６のアミノ酸配列を有する。さらに他の実施形態では、本発明は、表７に記載される配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性、もしくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、またはそれと１００％同一であるＴ細胞結合組成物融合タンパク質と、任意選択で、担体、安定剤および／または賦形剤の好適な製剤とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、表７のＴ細胞結合組成物融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。一実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチド配列が、最適にアラインさせた場合、表７に記載されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択される配列またはその相補体に対して少なくとも約９０％の配列同一性、もしくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、またはそれと１００％同一である、Ｔ細胞結合融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
関連する態様では、本発明は、Ｔ細胞結合コントラクト組成物をコードするポリヌクレオチドを利用してキメラポリペプチドアセンブリー組成物を作製し、標的細胞抗原に対する親和性を有する結合ドメインをコードするポリヌクレオチド配列をライゲートする方法に関する。一実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を作製する方法であって、Ｔ細胞結合コントラクト組成物をコードする表７のポリヌクレオチドを利用した後、第２の結合ドメインをコードする遺伝子とリンカーとを組換えによって付加することを含み、第２の結合ドメインが腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する結合特異性を有し、得られる遺伝子を、プロモーターおよびリンカーの制御下で好適な発現ベクター中に導入し、次いで、得られる発現ベクターを使用して、好適なＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を形質転換し、次いで、キメラポリペプチドアセンブリー融合タンパク質の発現にとって好適な条件下で成長させ、次いで、本明細書に記載の、または当技術分野で公知の精製方法によって単離する、方法を提供する。以下の実施例１および２は、前述の方法の実施のための例示的な方法を提供する。前述の一部の実施形態では、第２の結合ドメインは、第２の結合ドメインのＶＨおよびＶＬが表２に記載される対になったモノクローナル抗体ＶＨおよびＶＬ配列の群から選択される、ｓｃＦｖである。前述実施形態は、抗ＣＤ３可変配列のコード配列および第２の結合ドメインのコード配列を、Ｔ細胞結合組成物のコード配列に組換えによって融合し、キメラポリペプチドアセンブリーの所望の融合タンパク質産物を発現させるために利用することができる複数の個々の遺伝子を作出する能力をもたらすことによって、本明細書に記載の様々な第２の結合ドメインをコードするポリヌクレオチドと共に容易に利用することができるＴ細胞結合組成物をコードする遺伝子のモジュラー性質を利用するものである。キメラポリペプチドアセンブリー組成物を調製するためのＴ細胞結合組成物をコードする遺伝子の使用は、本明細書に記載のキメラポリペプチドアセンブリー組成物をコードするポリヌクレオチドに限定されないが、得られる発現融合タンパク質の細胞傷害効果を受けやすい目的の任意の標的組織または細胞に対する親和性を有する結合ドメインをコードする遺伝子と併せて利用することができることが具体的に企図される。
別の態様では、表７のＴ細胞結合組成物は、抗ＣＤ３抗体調製物が、限定されるものではないが、臓器移植拒絶および急性移植片拒絶、クローン病、潰瘍性大腸炎ならびに１型糖尿病などの、臨床利益をもたらすことが証明されている対象におけるある特定の疾患または状態の処置における治療的免疫抑制剤として、ならびに免疫寛容を誘導するのに有用である。
５．可撓性リンカー
別の態様では、本発明は、対象組成物のそれぞれの結合ドメインを接合するための可撓性リンカーを提供する。一部の実施形態では、本発明は、各ｓｃＦｖのＶＬおよびＶＨが表８に記載される配列から選択される親水性アミノ酸の長いリンカーによって一緒に連結され、ｓｃＦｖが表９に記載される配列群から選択される親水性アミノ酸の短いリンカーによって一緒に連結されている、第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖを含むキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。一実施形態では、ＶＬとＶＨを連結するための使用される長いリンカーは、表８のＬ７であり、２つのｓｃＦｖを連結する分子間リンカーは、表９のＳ−１である。別の実施形態では、本発明は、フォールディング後に、第１のドメイン（ＶＬまたはＶＨ）が最後のドメイン（ＶＨまたはＶＬ）と対形成して、１つのｓｃＦｖを形成し、中央の２つのドメインが対形成して、第１および第２のドメイン、ならびに第３および最後のドメインが、表９に記載される配列から選択される親水性アミノ酸の短いリンカーによって一緒に連結され、第２および第３の可変ドメインが表８から選択される長いリンカーによって連結される他のｓｃＦｖを形成する単鎖ダイアボディを含む、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。当業者であれば理解できるように、短いリンカーと長いリンカーの選択は、隣接する可変ドメインの不正確な対形成を防止することによって、ダイアボディ構成の形成を容易にすることである。
６．キメラポリペプチドアセンブリー構成
本発明の目的は、ある特定の構造的、活性、薬学的および薬理学的特性を付与するためにプロドラッグ形態で設計および作出されるキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供することである。対象組成物の設計は、少なくとも３つの重要な特性；１）エフェクター細胞を標的細胞に同時に結合させる能力を有する二特異的結合ドメインを有する組成物を提供し、免疫学的シナプスの形成を得ること；２）ｉ）結合ドメインを遮蔽し、組成物がインタクトなプロドラッグ形態にある場合に標的抗原に対する結合親和性を低下させる、ｉｉ）対象に投与した場合の半減期の増強を提供する、ｉｉｉ）疾患組織（例えば、腫瘍）と比較して、正常な組織および臓器における溢出を減少させる、ならびにｉｖ）従来の二特異的細胞傷害抗体治療薬と比較して増大した安全性プロファイルを有するバルキング部分を含む組成物を提供すること；ならびに３）疾患組織の近くにある場合、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼによって切断された時に活性化され、それによって、二特異的結合ドメインを放出し、それが標的抗原に対するその完全な結合親和性能力を取り戻すことができること、によって駆動された。対象組成物の設計は、ＸＴＥＮおよびペプチド放出セグメント（ＲＳ）構成成分の特性を利用し、第１の部分の二特異的結合ドメインに対するその配置が前述の特性を達成する。
特定の理論に束縛されるものではないが、上記の二特異的結合ドメイン形式を使用して、放出された結合ドメインは、予備および／または同時刺激を必要とすることなく、細胞傷害性エフェクター細胞の動員によって標的細胞を殺傷することができると考えられる。さらに、エフェクター細胞の予備および／または同時刺激からの独立は、放出された結合ドメインによって媒介される例外的に高い細胞傷害性に実質的に寄与し得る。一部の実施形態では、放出された第２の結合ドメインは、それが、細胞傷害性エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ細胞））を、対象中の腫瘍細胞上の予め選択された表面抗原に標的化する能力を有するような結合特異性を有するように設計されるが、第１の結合ドメインは、腫瘍細胞と関連する腫瘍マーカー抗原に対する結合特異性を有するように設計され、それによって、免疫学的シナプスならびに標的腫瘍に対する放出されたサイトカインおよびエフェクター分子の選択的、指向的、および局在的効果をもたらし、その結果、腫瘍細胞は損傷または破壊され、対象に対する抗腫瘍活性および治療利益をもたらす。一実施形態では、放出された第２の結合ドメインは、エフェクター細胞の１つまたは複数の機能を調節することができるエフェクター細胞抗原に結合し、標的腫瘍細胞に対する細胞溶解効果をもたらすか、またはそれに寄与する。エフェクター細胞抗原を、エフェクター細胞または他の細胞によって発現させることができる。一部の実施形態では、エフェクター細胞抗原は、エフェクター細胞の細胞表面上に発現される。非限定的な例は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ６９、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、ＣＤ９５、ＣＤ１０７、およびＣＤ１５４である。他の実施形態では、エフェクター細胞抗原は、ＩＬ２、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαから選択されるＴｈ１サイトカインである。かくして、当業者であれば、対象組成物の構成は、組成物が投与される対象中の健康な組織または健康な細胞と比較して、標的腫瘍組織またはがん細胞に活性形態の組成物を選択的に、または偏って送達すると共に、治療利益が得られることが意図されることを理解できる。前述から明らかなように、本発明は、所望の特性をもたらすための設計された構成における大きいファミリーのポリペプチドを提供する。
バルキング部分としてのＸＴＥＮの場合、いくつかのユニークで有益な物理化学的および薬理学的特性が、ＸＴＥＮ化された対象組成物に対して付与される。対象組成物の増強された特性の非限定的な例としては、全体の溶解性および代謝安定性の増大、循環中のタンパク質分解に対する感受性の低下、免疫原性の低下、皮下または筋肉内投与された場合の吸収速度の低下、腎臓によるクリアランスの低下、毒性の低下、ＲＳの切断によって放出されるまでの第１の部分の結合部分に対するＸＴＥＮの遮蔽効果、および薬物動態特性の増強が挙げられる。特に、対象組成物は、それらがプロドラッグ形態の第１の部分の結合ドメインにわたる、遮蔽効果と、結合親和性に対するＸＴＥＮの立体障害との組合せによって達成される、治療指数の増強および毒性または副作用の低下を有するが、ＲＳが基質であるプロテアーゼを産生する標的組織（例えば、腫瘍）の近くに、またはその中に二特異的結合ドメインを放出することができる（ＲＳ組成物中へのペプチジル切断配列の含有によって達成される）ように設計されることが具体的に企図される。
一態様では、ＸＴＥＮは、組成物中の担体として使用され、本発明は、非反復的、非構造的ポリペプチドの長さの増大がＸＴＥＮの非構造的性質を増強し、それに応じて、ＸＴＥＮ担体を含む組成物の物理化学的および薬物動態的特性を増強するという発見を利用するものである。一般に、組成物中に組み込まれる累積長さが約４００残基より長いＸＴＥＮは、より短い、例えば、約２９０残基より短い累積長さと比較して長い半減期をもたらす。特定の理論によって束縛されないが、ＸＴＥＮは、ＸＴＥＮ中の組み込まれた荷電残基の個々の電荷間の静電反発力のため、ならびに二次構造を付与する能力を欠く配列中の特定の親水性アミノ酸によって与えられる固有の可撓性のため、開いたコンフォメーションを採ることができる。その結果、対象のＸＴＥＮは、部分的には、それらが得られる組成物に対して、ＸＴＥＮを含まない組成物と比較して、ＸＴＥＮ化された組成物に対して対応する増加した見かけの分子量を付与する特性である、高い流体力学半径を付与するため、有用である。ＸＴＥＮ化は、ＸＴＥＮに連結されていないタンパク質と比較して、増大した流体力学半径、増大した見かけの分子量、および増大した見かけの分子量係数を有する組成物をもたらす。例えば、ＸＴＥＮは、約３〜５ｎｍの糸球体孔径（約７０ｋＤａの見かけの分子量に対応する）を超えて組成物の流体力学半径を効果的に拡大し（Caliceti. ２００３年. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates. Adv Drug Deliv Rev ５５巻：１２６１〜１２７７頁）、終末半減期の対応する増加と共に、循環タンパク質の腎クリアランスの減少をもたらすことができる。ＸＴＥＮにより与えられる流体力学半径の増大はまた、５〜１２ｎｍの平均孔径を有する正常で健康な組織のエリア中の循環系からのインタクトなプロドラッグ形態のキメラポリペプチドアセンブリー組成物の溢出を減少させるが、血管中のインタクトな組成物分子の退出を許容し、上皮細胞接合部がより多孔性である腫瘍に組成物分子が浸透する。正常血管よりも高い血管透過性などの、腫瘍血管系の様々な機能が損傷されることが長らく公知であった（Duran-Reynals, F. Studies on the localization of dyes and foreign proteins in normal and malignant tissue. Am J Cancer ３５巻：９８〜１０７頁（１９３９年）；Babson AL、Winnick T. Protein transfer in tumor-bearing rats. Cancer Res １４巻：６０６〜６１１頁（１９５４年））。これらの損傷した機能は、正常組織中よりも腫瘍組織中で検出される高濃度の血漿タンパク質に寄与していた；現象は、それを、腫瘍血管の透過性の増大と、腫瘍中の機能的リンパ管のクリアランス速度の低下との組合せの結果生じ、その正味の結果として、大分子が腫瘍中に蓄積する、透過性および保持効果の増強として記載した、Maedaおよび共同研究者（Matsumura Y、Maeda H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res ４６巻：６３８７〜６３９２頁（１９８６年）；Maeda H、Matsumura Y. Tumoritropic and lymphotropic principles of macromolecular drugs. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst ６巻：１９３〜２１０頁（１９８９年））によって解明された。非内因性大分子の通過に対する多くの非洞様毛細血管の毛細血管壁における孔径の生理学的上限は、５〜１２ｎｍの間の範囲であることが一般に公知である（Hemant Sarin. Physiologic upper limits of pore size of different blood capillary types and another perspective on the dual pore theory of microvascular permeability. J Angiogenes Res. ２０１０年；２巻：１４頁）が、脳腫瘍と末梢腫瘍の両方の血液−腫瘍関門における内皮細胞間のギャップは、直径４０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の間またはそれより大きいと報告されている（Sarin, H.ら、Physiologic upper limit of pore size in the blood-tumor barrier of malignant solid tumors. J. Translational Medicine ２００９年、７巻：５１頁）。本発明の目的において、対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、正常組織におけるインタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの溢出は減少するが、腫瘍血管系または他の炎症エリアの漏れやすい環境では、インタクトなアセンブリーが溢出し、腫瘍環境中のプロテアーゼによって活性化され、結合ドメインを含む第１の部分を、エフェクターおよび標的細胞に放出することができるような、バルキング部分、例えば、ＸＴＥＮの付加によってこの孔径差を利用するように設計された。キメラポリペプチドアセンブリーのＲＳの場合、設計は、キメラポリペプチドアセンブリーが１つまたは複数のプロテアーゼを産生する疾患組織、例えば、腫瘍の近くにある場合、腫瘍によって発現される１つまたは複数のプロテアーゼに対する感受性が高いＲＳ配列が、プロテアーゼ（上記により完全に記載されている）によって切断され得る状況を利用する。プロテアーゼの作用は、組成物の放出セグメント（ＲＳ）を切断し、組成物から第１の部分の結合ドメインを放出し、放出された第１の部分の二特異的結合ドメインの分子量および流体力学半径を減少させる。理解されるように、組成物の分子量および流体力学半径の減少はまた、放出された第１の部分の二特異的結合ドメインが溶液中でより自由に移動し、組織および腫瘍中でより小さい孔空間を通って移動し、より大きい孔の腫瘍血管系から腫瘍中により容易に溢出し、エフェクター細胞および腫瘍細胞の付着および連結をもたらすことができる特性も付与する。そのような特性を、様々なアッセイによって測定することができる。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーのＲＳは、切断され、前記組成物から第１の部分の二特異的結合ドメインおよび第３の部分が放出されると、哺乳動物プロテアーゼによって切断され、前記第１の部分は、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍大きい、リン酸緩衝生理食塩水中での拡散係数を有する。別の実施形態では、インタクトな組成物の見かけの分子量は、見かけの分子量がサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定される場合、哺乳動物プロテアーゼによるＲＳの切断によって放出された第１の部分よりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍大きい。別の実施形態では、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物の流体力学半径は、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定される場合、哺乳動物プロテアーゼによるＲＳの切断によって放出された第１の部分よりも少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍大きい。別の実施形態では、本発明は、第２の部分が切断されて、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第１の部分および前記第３の部分が放出されると、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって評価される場合、放出された第１の部分の流体力学半径が、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの流体力学半径の約３０％未満、または約４０％未満、または約５０％未満である、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、第２の部分が切断されて、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第１の部分および前記第３の部分が放出されると、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される場合、放出された第１の部分の流体力学半径が、約５ｎｍ未満、または約４ｎｍ未満、または約３ｎｍ未満である、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される場合、約５ｎｍ未満、または約４ｎｍ未満、または約３ｎｍ未満の流体力学半径を有する放出された第１の部分が、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーと比較して、腫瘍組織に浸透するより高い能力を有する、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される場合、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの流体力学半径が、約８ｎｍより大きい、または約９ｎｍより大きい、または約１０ｎｍより大きく、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーが、腫瘍組織の血管系と比較して対象の正常組織の血管系から溢出する能力がより低い、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。
対象組成物は、その設計およびＸＴＥＮへの連結により、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第１の部分の結合ドメインと比較して、対象に投与した場合に増強された薬物動態特性を有することが企図される。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、組成物に連結されていない対応する第１の部分と比較して、対象への投与の際、またはその後に、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または１００倍増加した対象中での終末半減期を示す。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、組成物に連結されていない対応する第１の部分と比較して、対象への投与の際、またはその後に、少なくとも２５％、５０％、１００％、２００％、または少なくとも３００％またはそれより多い、増加した曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、組成物に連結されていない対応する第１の部分と比較して、対象への投与の際、またはその後に、少なくとも２５％低い、または５０％、または１００％、または２００％、または少なくとも３００％低い分布容量を示す。一実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、対象への投与後、少なくとも約２０時間、または少なくとも約３０時間、または少なくとも約３２時間、または少なくとも約４８時間、または少なくとも約７２時間、または少なくとも約９６時間、または少なくとも約１２０時間、または少なくとも約１４４時間、または少なくとも約７日間、または少なくとも約１０日間、または少なくとも約１４日間の終末半減期を示す。別の態様では、限定されるものではないが、腫瘍などの疾患組織と関連するプロテアーゼによって優先的に活性化される対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物の設計のため、対象の循環中での放出された第１の部分の濃度は低く、それによって、保護的なバルキング部分および放出セグメントを有さない二特異的組成物と比較して改善された安全性プロファイルおよびより低い副作用の発生率に寄与することが具体的に企図される。一実施形態では、本発明は、対象へのキメラポリペプチド組成物の単回投与の際またはその後に放出された第１の部分の血漿Ｃｍａｘ濃度が約０．０１ｎｇ／ｍｌ、または約０．０３ｎｇ／ｍｌ、または約０．１ｎｇ／ｍｌ、または約０．３ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ、または約１０ｎｇ／ｍｌ、または約１００ｎｇ／ｍｌを超えない、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。別の実施形態では、本発明は、対象へのキメラポリペプチド組成物の単回投与の際またはその後に、放出された第１の部分の血漿Ｃｍａｘ濃度が、同じ対象中でのインタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの血漿レベルの１／３以下、または１／１０以下、または１／３０以下、または１／１００以下である、キメラポリペプチドアセンブリーを提供する。段落の前述の実施形態では、対象は、マウス、またはラット、またはイヌ、またはサル、またはヒトである。
別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリー組成物は、Ｃｍａｘが少なくとも２５％、５０％、１００％、２００％、または少なくとも３００％低く、次いで、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の有害効果の軽減をもたらし、集合的に、対象に投与されたコンジュゲーション組成物が長期間にわたって治療活性を提供するか、または保持するように、組成物に連結されていない対応する第１の部分と比較して、対象における皮下または筋肉内注射の後により遅い吸収を示す。
別の態様では、対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物のＸＴＥＮは、組成物の第１の部分の結合ドメインに関する立体障害と遮蔽効果の両方を提供し、その結果、インタクトなプロドラッグ形態のエフェクター細胞結合構成成分と標的細胞結合構成成分の両方が、そのそれぞれのリガンドと相互作用する能力が低下するが、プロテアーゼによってＲＳが切断され、ＸＴＥＮが放出され、プロドラッグ形態のアセンブリーが活性化形態に変換されると、放出された二特異的結合構成成分の最適な結合能力が回復することが具体的に企図される。かくして、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物のＸＴＥＮは、プロテアーゼによるＲＳの切断によって放出された結合ドメインと比較して、腫瘍特異的マーカーもしくは標的細胞抗原の抗原（例えば、ＥｐＣＡＭまたはＨＥＲ２）および／またはエフェクター細胞抗原（例えば、ＣＤ３ Ｔ細胞抗原）への結合ドメインの結合を阻害する。逆に、プロテアーゼの作用によって組成物から放出された第１の部分の結合ドメインは、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物の結合ドメインと比較してそのそれぞれのリガンドに対する高い結合親和性を有する。本発明の目的は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物から放出された第１の部分の各結合ドメインの結合親和性は、本明細書に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいてアッセイされた場合など、インタクトな組成物の結合ドメインと比較してそれぞれの標的リガンドについてより高いということである。一実施形態では、プロテアーゼによるＲＳの切断によって組成物から放出されたエフェクター細胞結合ドメインの結合親和性は、前記細胞の細胞表面上に前記エフェクター細胞抗原を有するエフェクター細胞を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイまたはエフェクター細胞抗原が結合したＥＬＩＳＡにおいて測定された場合、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物のエフェクター細胞結合ドメインと比較して、エフェクター細胞抗原について少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも７倍、または少なくとも８倍、または少なくとも９倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍高い。一実施形態では、エフェクター細胞抗原は、ＣＤ３である。他の実施形態では、プロテアーゼによるＲＳの切断によって組成物から放出された腫瘍細胞結合ドメインの結合親和性は、前記細胞の細胞表面上に前記抗原を有する腫瘍細胞を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイまたはエフェクター細胞抗原が結合したＥＬＩＳＡにおいて測定された場合、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物の腫瘍細胞結合ドメインと比較して、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞抗原について少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも７倍、または少なくとも８倍、または少なくとも９倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍高い。前述の一実施形態では、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原は、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２ ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６ βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ１３３、ガングリオシドＧＤ３；９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原１、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、胎児アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、ＣＤ２５、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ミュラー管抑制物質受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、シアル化Ｔｎ抗原（ｓ ＴＮ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＡＧ７２、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原）、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｇ２５０、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＤＬＫ１、ＳＰ１７、ＲＯＲ１、およびＥｐｈＡ２からなる群から選択される。ＸＴＥＮの遮蔽効果は、インタクトなプロドラッグ形態のキメラポリペプチドアセンブリーの前述の実施形態の両結合ドメインに適用され、ＲＳの切断によってキメラポリペプチドアセンブリー組成物からＸＴＥＮが放出されると、それぞれの結合ドメインの完全な結合能力が回復することが、段落の実施形態において具体的に企図される。
本発明の目的は、組成物へのバルキング部分の付加が、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物における遮蔽効果をもたらし、Ｔ細胞と標的組織への結合の同時的減少が、対象に投与された場合、全身曝露中のＴｈ１ Ｔ細胞関連サイトカインまたは他の前炎症性メディエーターの産生の減少をもたらし、その結果、ＸＴＥＮなどの結合部分に連結されていない二特異的結合組成物と比較して、全体の副作用および安全性プロファイルが改善されるということである。細胞性免疫の重要な構成成分として、ＩＬ−２、ＴＮＦ−アルファ、およびＩＦＮ−ガンマの産生は、Ｔｈ１応答（Romagnani S. T-cell subsets (Th1 versus Th2). Ann Allergy Asthma Immunol. ２０００年、８５巻（１号）：９〜１８頁）、特に、抗ＣＤ３によって刺激されるＴ細胞（Yoon, S.H.、Selective addition of CXCR3+CCR4-CD4+ Th1 cells enhances generation of cytotoxic T cells by dendritic cells in vitro. Exp Mol Med. ２００９年、４１巻（３号）：１６１〜１７０頁）での特質であり、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０も、二特異的抗体組成物のための細胞傷害応答において重要な前炎症性サイトカインである（Zimmerman, Z.ら、Unleashing the clinical power of T cells: CD19/CD3 bi-specific T cell engager (BiTE（登録商標）) antibody composition blinatumomab as a potential therapy. Int. Immunol.（２０１５年）、２７巻（１号）：３１〜３７頁）。一部の実施形態では、インタクトな切断されていないキメラポリペプチドアセンブリー組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベース刺激サイトカインアッセイにおけるプロテアーゼ処理されたキメラポリペプチドアセンブリー組成物の対応する放出された第１の部分の結合ドメインにより刺激されたサイトカインレベルと比較して、前記アセンブリーがｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベースサイトカイン刺激アッセイ（以下の実施例に記載されるものなど）においてエフェクター細胞および標的細胞と接触する場合、Ｔｈ１および／または前炎症性サイトカインの産生をもたらす、１／２以下、または１／３以下、または１／４以下、または１／５以下、または１／６以下、または１／７以下、または１／８以下、または１／９以下、または１／１０以下、または１／２０以下、または１／３０以下、または１／５０以下、または１／１００以下、または１／１０００以下に減少した能力を示し、ここで、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマからなる群から選択される。前述の一実施形態では、Ｔｈ１サイトカインの産生は、ＰＢＭＣまたはＣＤ３＋Ｔ細胞などのエフェクター細胞と、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２ ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６ βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ１３３、ガングリオシドＧＤ３；９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原１、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、胎児アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、ＣＤ２５、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ミュラー管抑制物質受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、シアル化Ｔｎ抗原（ｓ ＴＮ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＡＧ７２、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原）、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｇ２５０、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＤＬＫ１、ＳＰ１７、ＲＯＲ１、およびＥｐｈＡ２からなる群から選択される腫瘍特異的マーカー抗原を有する標的細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてアッセイされる。前述の別の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−２である。前述の別の実施形態では、サイトカインは、ＴＮＦアルファである。前述の別の実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮ−ガンマである。別の実施形態では、アセンブリーの放出された第１の部分の結合ドメインによって結合させることができる抗原と共に腫瘍を有する対象に投与されるインタクトな切断されていないキメラポリペプチドアセンブリー組成物は、腫瘍を有する同等の対象におけるプロテアーゼ処理されたキメラポリペプチドアセンブリー組成物の対応する放出された結合ドメインによって産生されるサイトカインレベルと比較して、対象におけるＴｈ１および／または前炎症性サイトカインの産生をもたらす、１／２以下、または１／３以下、または１／４以下、または１／５以下、または１／６以下、または１／７以下、または１／８以下、または１／９以下、または１／１０以下、または１／２０以下、または１／３０以下、または１／５０以下、または１／１００以下、または１／１０００以下に減少した能力を示す。前述の実施形態では、サイトカインを、対象から取り出された血液、流体、または組織試料から評価することができる。前述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サル、およびヒトであってもよい。しかしながら、対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物の利点において、組成物の細胞溶解特性がサイトカインによる予備刺激を必要としないこと；第１の部分の結合ドメインにより標的細胞に結合したエフェクター細胞の免疫学的シナプスの形成が標的細胞中での細胞溶解またはアポトーシスを行うのに十分であることが発見された。それにも拘わらず、前炎症性サイトカインの産生は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによるものであっても、腫瘍を有する対象の処置のモニタリングにおいても、対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物の効力または効果を評価するための有用なマーカーである。
上記の結合ドメイン実施形態によれば、腫瘍細胞マーカー抗原を認識する結合部位が、高い効率で破壊される標的細胞を捕捉するために高い結合親和性を有する場合、それは有利である。本発明のキメラポリペプチドアセンブリー組成物は、好ましい実施形態では、標的細胞結合ドメインがｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−７〜１０−１０Ｍの範囲のＫｄ値を有する親和性を有するため、腫瘍細胞を殺傷するためにそれらを数回使用することができるという利点を有する。標的腫瘍抗原に結合するための二特異的結合ドメインの親和性が高すぎる場合、組成物は、発現する腫瘍細胞に結合し、その表面上に残り、それを放出し、別の細胞に結合することができないようにする。一実施形態では、対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物のエフェクター細胞結合ドメインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−５〜１０−７Ｍの間の結合定数を有し、その詳細な例は、以下の実施例に記載される。別の実施形態では、対象キメラポリペプチドアセンブリー組成物のエフェクター細胞結合ドメインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて決定された場合、１０−５〜１０−１０Ｍの間の結合定数を有する。
一態様では、キメラポリペプチドアセンブリーのＲＳが標的細胞の環境中で哺乳動物プロテアーゼによって切断され、切断され前記組成物から第１の部分の二特異的結合ドメインおよび第３の部分が切断されると、プロドラッグ形態から活性化形態に変換される場合、前記第１の部分が、エフェクター細胞抗原、例えば、ＣＤ３を担持するＴ細胞と、エフェクター細胞が活性化される際に、第１の結合ドメインによって標的化される腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原を担持する腫瘍細胞とに同時に結合することが設計された組成物の特色である。一部の実施形態では、アセンブリーがＲＳの切断によって活性化される場合、次いで、エフェクター細胞と標的細胞とに同時に結合することにより、エフェクター細胞の少なくとも３倍、または１０倍、または３０倍、または１００倍、または３００倍、または１０００倍、活性化され、活性化は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベースアッセイにおいて評価される、サイトカイン、細胞溶解タンパク質の産生、または標的細胞の溶解によって評価される。別の実施形態では、放出された第１の部分の結合ドメインによる、ヒトＣＤ３抗原を担持するＴ細胞と、腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原を担持する腫瘍細胞とに同時に結合することにより免疫学的シナプスが形成され、その結合により、腫瘍細胞を溶解することができるＴ細胞由来エフェクター分子が放出される。エフェクター細胞活性化および／または細胞溶解を測定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例としては、細胞膜完全性アッセイ、混合細胞培養アッセイ、ＦＡＣＳベースヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルー流入アッセイ、測光酵素放出アッセイ、ＥＬＩＳＡ、放射測定５１Ｃｒ放出アッセイ、蛍光ユーロピウム放出アッセイ、ＣａｌｃｅｉｎＡＭ放出アッセイ、測光ＭＴＴアッセイ、ＸＴＴアッセイ、ＷＳＴ−１アッセイ、アラマーブルーアッセイ、放射測定３Ｈ−Ｔｈｄ取込みアッセイ、細胞分裂活性を測定するクローン形成アッセイ、ミトコンドリア膜貫通勾配を測定する蛍光ローダミン１２３アッセイ、ＦＡＣＳベースホスファチジルセリン曝露によりモニタリングされるアポトーシスアッセイ、ＥＬＩＳＡベースＴＵＮＥＬ試験アッセイ、カスパーゼ活性アッセイ、および細胞形態学アッセイ、またはサイトカイン、細胞溶解タンパク質、もしくは細胞の溶解のアッセイのための当技術分野で公知の他のアッセイ、または以下の実施例の方法が挙げられる。
当業者であれば、対象組成物を使用する対象の処置の文脈において、キメラポリペプチドアセンブリーがプロドラッグ形態で存在し、細胞環境と共局在化されるプロテアーゼの作用によってある特定の細胞環境に進入する場合により活性な形態に変換されることを理解する。標的組織中でのプロテアーゼの作用による組成物からの放出の際に、エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第２の結合ドメインおよび腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する結合特異性を有する第１の結合ドメインは、エフェクター細胞を標的細胞に同時に結合し、一緒に連結するその完全な能力を取り戻し、免疫学的シナプスを形成する。免疫学的シナプスの形成により、エフェクター細胞は活性化されるようになり、様々なシグナル経路が新しい遺伝子転写を開き、エキソサイトーシスにより、その小胞のエフェクター分子内容物を放出する。エフェクター細胞の型に応じて、様々なサイトカインおよびリンホカインが放出される；例えば、１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−βのようなサイトカインを放出するが、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）は、Ｂ細胞を刺激するＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３のようなサイトカインを放出し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、標的を殺傷するパーフォリンおよびグランザイムのような細胞傷害分子（集合的に、「エフェクター分子」）を放出する。非常に低いエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、キメラポリペプチドアセンブリーの第１の部分の放出された二特異的結合ドメインが、エフェクター細胞と標的腫瘍細胞とに同時に結合し連結すると、腫瘍細胞は、エフェクター細胞によって細胞間の免疫学的シナプス中に放出されたエフェクター分子によって作用し、腫瘍細胞の損傷、パーフォリン媒介性溶解、グランザイムＢ誘導性細胞死および／またはアポトーシスをもたらすことが具体的に企図される。かくして、別の態様では、キメラポリペプチドアセンブリーが腫瘍を有する対象に投与された場合、プロドラッグ形態が正常組織における循環系には残存するが、プロドラッグ形態のアセンブリーが腫瘍と共局在化するプロテアーゼによって活性化され、放出された第１の部分の第２の結合ドメインが、エフェクター細胞が活性化され、腫瘍細胞の溶解が行われる際に、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞のＣＤ３抗原）と、組成物の第１の結合ドメインによって標的化される腫瘍特異的マーカーを発現する腫瘍細胞とに同時に結合するように、腫瘍のより透過性が高い血管系に溢出することができることが、設計された組成物の特色である。前述の一実施形態では、腫瘍細胞とエフェクター細胞とに同時に結合した対象の腫瘍中の放出された第１の部分は、対応するインタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物と比較して、少なくとも１０倍、または少なくとも３０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも２００倍、または少なくとも３００倍、または少なくとも４００倍、または少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍のエフェクター細胞を活性化する増大した能力を示す。前述の別の実施形態では、腫瘍細胞とエフェクター細胞とに同時に結合した対象の腫瘍中の放出された第１の部分は、対応するインタクトなキメラポリペプチドアセンブリー組成物と比較して、少なくとも１０倍、または少なくとも３０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも２００倍、または少なくとも３００倍、または少なくとも４００倍、または少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍の腫瘍細胞を溶解する増大した能力を示す。前述実施形態では、エフェクター細胞活性化および／または細胞傷害性は、活性化されたエフェクター細胞のサイトメトリー測定、サイトカインのアッセイ、腫瘍サイズの測定などの、当技術分野で公知の従来の方法によって、または組織病理学によってアッセイされる。前述実施形態では、対象は、マウス、ラット、イヌ、サル、およびヒトであってもよい。
前述から明らかであるように、本発明は、特定の式が本明細書に提供される、所望の特性を実行するための設計された構成のポリペプチドの大きいファミリーを提供する。一実施形態では、本発明は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとを含む第１の部分、放出セグメントを含む第２の部分、およびバルキング部分を含む第３の部分を有するキメラポリペプチドアセンブリー組成物を提供する。実施形態では、本発明は、式Ｉの構成を有する組成物（Ｎ末端からＣ末端に向かって記載される）：
（第１の部分）−（第２の部分）−（第３の部分） Ｉ
（式中、第１の部分は、第１の結合ドメインが腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する特異的結合親和性を有し、第２の結合ドメインがエフェクター細胞に対する特異的結合親和性を有する２つのｓｃＦｖを含む二特異的であり；第２の部分は、哺乳動物プロテアーゼによって切断され得る放出セグメント（ＲＳ）を含み；および第３の部分は、バルキング部分である）
を提供する。前述の実施形態では、第１の部分の結合ドメインは、順序（ＶＬ−ＶＨ）１−（ＶＬ−ＶＨ）２（ここで、「１」および「２」は、それぞれ、第１および第２の結合ドメインを表す）、または（ＶＬ−ＶＨ）１−（ＶＨ−ＶＬ）２、または（ＶＨ−ＶＬ）１−（ＶＬ−ＶＨ）２、または（ＶＨ−ＶＬ）１−（ＶＨ−ＶＬ）２であってもよく、対になった結合ドメインは、本明細書の以下に記載されるポリペプチドリンカーによって連結される。一実施形態では、第１の部分のＶＬおよびＶＨは、表１および２から選択される；ＲＳは表４に記載される配列群から選択される；ならびにバルキング部分は、ＸＴＥＮ；アルブミン結合ドメイン；アルブミン；ＩｇＧ結合ドメイン；プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド；脂肪酸；Ｆｃドメイン；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＧＡ；ならびにヒドロキシルエチルデンプンからなる群から選択される。必要に応じて、バルキング部分は、表５に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＸＴＥＮである。前述の実施形態では、組成物は、組換え融合タンパク質である。別の実施形態では、部分は、化学的コンジュゲーションによって連結される。式Ｉの組成物構成の略図を、図６に提示する。
別の実施形態では、本発明は、式ＩＩの構成を有する組成物（Ｎ末端からＣ末端に向かって記載）：
（第３の部分）−（第２の部分）−（第１の部分） ＩＩ
（式中、第１の部分は、第１の結合ドメインが腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する特異的結合親和性を有し、第２の結合ドメインがエフェクター細胞に対する特異的結合親和性を有する２つのｓｃＦｖを含む二特異的であり；第２の部分は、哺乳動物プロテアーゼによって切断され得る放出セグメント（ＲＳ）を含み；および第３の部分は、バルキング部分である）
を提供する。前述の実施形態では、第１の部分の結合ドメインは、順序（ＶＬ−ＶＨ）１−（ＶＬ−ＶＨ）２（ここで、「１」および「２」は、それぞれ、第１および第２の結合ドメインを表す）、または（ＶＬ−ＶＨ）１−（ＶＨ−ＶＬ）２、または（ＶＨ−ＶＬ）１−（ＶＬ−ＶＨ）２、または（ＶＨ−ＶＬ）１−（ＶＨ−ＶＬ）２であってもよく、対になった結合ドメインは、本明細書の以下に記載されるポリペプチドリンカーによって連結される。一実施形態では、第１の部分のＶＬおよびＶＨは、表１および２から選択される；ＲＳは表４に記載される配列群から選択される；ならびにバルキング部分は、ＸＴＥＮ；アルブミン結合ドメイン；アルブミン；ＩｇＧ結合ドメイン；プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド；脂肪酸；ならびにＦｃドメインからなる群から選択される。必要に応じて、バルキング部分は、表５に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＸＴＥＮである。前述の実施形態では、組成物は、組換え融合タンパク質である。別の実施形態では、部分は、化学的コンジュゲーションによって連結される。式Ｉの組成物構成の略図を、図６に提示する。
別の実施形態では、本発明は、式ＩＩＩの構成を有する組成物（Ｎ末端からＣ末端に向かって記載）：
（第５の部分）−（第４の部分）−（第１の部分）−（第２の部分）−（第３の部分） ＩＩＩ
（式中、第１の部分は、第１の結合ドメインが腫瘍特異的マーカーまたは標的細胞の抗原に対する特異的結合親和性を有し、第２の結合ドメインがエフェクター細胞に対する特異的結合親和性を有する２つのｓｃＦｖを含む二特異的であり；第２の部分は、哺乳動物プロテアーゼによって切断され得る放出セグメント（ＲＳ）を含み；第３の部分は、バルキング部分であり；第４の部分は、第２の部分と同一であるか、または異なっていてもよい哺乳動物プロテアーゼによって切断され得る放出セグメント（ＲＳ）を含み；および第５の部分は、第３の部分と同一であるか、または異なっていてもよいバルキング部分である）
を提供する。前述の実施形態では、第１の部分の結合ドメインは、順序（ＶＬ−ＶＨ）１−（ＶＬ−ＶＨ）２（ここで、「１」および「２」は、それぞれ、第１および第２の結合ドメインを表す）、または（ＶＬ−ＶＨ）１−（ＶＨ−ＶＬ）２、または（ＶＨ−ＶＬ）１−（ＶＬ−ＶＨ）２、または（ＶＨ−ＶＬ）１−（ＶＨ−ＶＬ）２であってもよく、対になった結合ドメインは、本明細書の以下に記載されるポリペプチドリンカーによって連結される。前述の実施形態では、ＲＳは表４に記載される配列群から選択される。前述の実施形態では、バルキング部分は、ＸＴＥＮ；アルブミン結合ドメイン；アルブミン；ＩｇＧ結合ドメイン；プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド；脂肪酸；ならびにＦｃドメインからなる群から選択される。必要に応じて、バルキング部分は、表５に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＸＴＥＮである。前述の実施形態では、組成物は、組換え融合タンパク質である。別の実施形態では、部分は、化学的コンジュゲーションによって連結される。
対象組成物は、その設計および特定の構成成分に基づいて、対象組成物が当技術分野で公知の二特異的抗体組成物と比較して改善された治療指数を有するように、一度、それらが標的組織または疾患によって不健康にされた組織と関連して見出されるプロテアーゼによって切断されたら、より高い選択性、より長い半減期を有し、より低い毒性およびより少ない副作用をもたらす二特異的治療薬を提供する長く放置されてきた必要性に対処する。そのような組成物は、限定されるものではないが、がんを含むある特定の疾患の処置において有用である。当業者であれば、本発明の組成物が、結合ドメインを嵩高いＸＴＥＮ分子に配置することによる立体障害、組成物に係留されることにより、長い可撓性ＸＴＥＮポリペプチドの可撓性の非構造的特徴が結合ドメインを振動させ、その周囲を移動し、組成物と組織または細胞との間の遮断を提供することができる立体障害、ならびに個々の結合ドメインのサイズと比較して、大きい分子量（ＸＴＥＮの実際の分子量と、非構造的ＸＴＥＮの大きい流体力学半径のためとの両方によって寄与される）に起因する細胞または組織に浸透するインタクトな組成物の能力の低下を含む、機構の組合せによって非特異的相互作用のこの減少を達成することを理解する。しかしながら、組成物は、ＲＳを切断することができるプロテアーゼを担持もしくは分泌する標的組織もしくは細胞の近くにある場合、または結合ドメインがリガンドに結合した時に標的細胞もしくは組織に内在化された場合、二特異的結合ドメインがプロテアーゼの作用によってＸＴＥＮの塊から遊離し、立体障害の障壁を除去し、その薬理学的効果をより自由に発揮するように設計される。対象組成物は、細胞、組織または臓器への治療的二特異的抗体組成物の選択的送達が望ましい様々な状態の処置において使用を見出す。一実施形態では、標的組織は、がんであり、それは白血病、リンパ腫、または臓器もしくは系の腫瘍であってもよい。
ＩＩＩ）．医薬組成物
本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、キメラポリペプチドアセンブリーと１つまたは複数の薬学的に許容される担体とを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか１つのキメラポリペプチドアセンブリーと、任意選択で、担体、安定剤、および／または賦形剤の適した製剤とを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか１つのＴ細胞結合組成物と、任意選択で、担体、安定剤、および／または賦形剤の適した製剤とを含む。適した賦形剤および許容可能な担体には、緩衝剤、例えばクエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム、またはリン酸ナトリウム；保存剤；共溶媒；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ポリマー、例えばポリエステル、ポリオキシエチレン−ステアリン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えばポリオキシエチレンモノラウリルエーテル、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、およびポリエチレン（polethylene）グリコール；塩形成対イオン、例えばナトリウム、多価糖アルコール；アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、アスパラギン、２−フェニルアラニン、およびトレオニン；糖または糖アルコール、例えばトレハロース、スクロース、オクタスルフェート、ソルビトールまたはキシリトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ミオイノシトール（myoinisitol）、ポリソルベート、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）；硫黄含有還元剤、例えばグルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［アルファ］−モノチオグリセロール、およびチオ硫酸ナトリウム；低分子量タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン；ならびに親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンが含まれる。
本発明の医薬組成物は、それによってポリペプチドが薬学的に許容される担体ビヒクル、例えば水溶液もしくは緩衝液、薬学的に許容される懸濁液、および乳液と共に混合して組み合わされる、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化することができる。非水性溶媒の例には、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール、および植物油が含まれる。医薬組成物の治療製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１６版、Osol, A.編（１９８０年）に記載されるように、所望の程度の純度を有する活性成分を、任意選択の生理的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合して、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で保存するために調製される。さらに、医薬組成物はまた、他の薬学的に活性な化合物または複数の本発明の組成物も含みうる。
本発明の組成物は、多様な賦形剤を使用して製剤化されうる。適した賦形剤には、微結晶セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ１０１）、ポリメタクリル酸エステル、ポリ（アクリル酸エチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸トリメチルアンモニオエチルクロリド）（Ｅｕｄｒａｇｉｔ ＲＳ−３０Ｄなど）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｋ１００Ｍ、Ｐｒｅｍｉｕｍ ＣＲ Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｋ１００Ｍ、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ Ｅ５、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標））、ステアリン酸マグネシウム、タルク、クエン酸トリエチル、エチルセルロース水性分散剤（Ｓｕｒｅｌｅａｓｅ（登録商標））、および硫酸プロタミンが含まれる。徐放剤はまた、担体を含んでもよく、担体は、例えば溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤を含みうる。薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩などの無機酸塩、ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩などの有機酸の塩もまた、これらの徐放剤に使用することができる。組成物はまた、水、食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体、ならびに湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤などの物質を含みうる。リポソームもまた、担体として使用してもよい。
医薬組成物は、非経口（皮下、注入ポンプによる皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、および皮内を含む）、硝子体内、髄腔内、腹腔内、腹部内、および肺を含む任意の適した経路によって、治療のために投与されうる。同様に、好ましい経路は、レシピエントの状態および年齢、ならびに処置される疾患によって異なると認識される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物は、疾患を処置する方法において使用され、方法は、治療有効用量を使用する１つまたは複数の連続用量を含む処置レジメンに従って疾患を有する対象に医薬組成物を投与することを含む。処置レジメンは、特定の処置サイクルの一部である。一実施形態では、特定の処置サイクルは、それぞれの処置サイクルあたり、週に２回、毎週、１０日毎、２週間毎、３週間毎、または１カ月毎の、医薬組成物の投与を含む。別の実施形態では、処置レジメンによって、対象における疾患に関連する臨床パラメーターまたは評価項目の改善が得られ、臨床パラメーターまたは評価項目は、完全、部分、または不完全奏効としての腫瘍縮小；無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答；無増悪生存期間；無病生存期間；再発までの期間；転移までの期間；全生存期間；生活の質の改善；および症状の改善からなる群のうちの１つまたは任意の組合せから選択される。他の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物は、対象における疾患を処置するための医薬として調製される。この段落の前述の実施形態では、疾患は、癌腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、ＥＲ／ＰＲ＋乳がん、Ｈｅｒ２＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、悪性腹水を伴う結腸がん、粘液腫瘍、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（gastric cancer）、胃がん（stomach cancer）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、男化腫瘍、腺癌、肉腫、およびＢ細胞由来慢性リンパ性白血病でありうる。一実施形態では、医薬は、非経口経路によって（動脈内または静脈内経路によって）対象に投与するために調製される。別の実施形態では、医薬は、皮下経路によって対象に投与するために調製される。別の実施形態では、医薬は、皮内経路によって対象に投与するために対象における疾患の処置のために調製される。望ましければ、本明細書に記載の実施形態のキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物は、腫瘍および／または腹腔中の腹水の処置のために腹部内または腹腔内経路によって投与される、対象における疾患の処置のための医薬として調製される。
別の態様では、本発明は、医薬組成物の製剤に関する。一実施形態では、医薬組成物は、投与前に復元される凍結乾燥粉末として供給されうる。一実施形態では、医薬組成物は、投与のために、生理食塩水、Ｄ５水、乳酸加リンゲル液等を使用して復元される凍結乾燥粉末として供給されうる。別の実施形態では、組成物はまた、患者に直接投与することができる液体形態で供給されうる。一実施形態では、医薬組成物は、単回注射のためのプレフィルドシリンジ中の液体として供給される。一実施形態では、医薬組成物は、バイアル中の液体として供給される。別の実施形態では、医薬組成物は、バイアル中の凍結乾燥粉末として供給される。医薬組成物の実施形態の液体製剤の場合、所望の特性は、製剤が静脈内、筋肉内、関節内、または皮下投与のための針の中を通過することができる形態で供給されることである。一実施形態では、医薬組成物は液体形態である。別の実施形態では、医薬組成物は、単回注射として使用するためのプレフィルドシリンジ中に存在する。一実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１μＭ、または少なくとも１０μＭ、または少なくとも１００μＭ、または少なくとも１ｍＭ、または少なくとも２ｍＭ、または少なくとも３ｍＭ、または少なくとも４ｍＭ、または少なくとも５ｍＭ、または少なくとも６ｍＭ、または少なくとも７ｍＭ、または少なくとも８ｍＭ、または少なくとも９ｍＭ、または少なくとも１０ｍＭの濃度で、食塩水緩衝液溶液中で製剤化され、そのような溶液は、本発明の皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、髄腔内、または筋肉内投与のための２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２ゲージ針の中を通過することができる。注射筒ポンプもまた、本発明の医薬組成物を送達するために使用することができる。そのような装置は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第４，９７６，６９６号；第４，９３３，１８５号；第５，０１７，３７８号；第６，３０９，３７０号；第６，２５４，５７３号；第４，４３５，１７３号；第４，３９８，９０８号；第６，５７２，５８５号；第５，２９８，０２２号；第５，１７６，５０２号；第５，４９２，５３４号；第５，３１８，５４０号；および第４，９８８，３３７号に記載されている。当業者は、本発明の開示およびこれらの他の特許の開示の両方を考慮することによって、本発明の組成物の持続的放出のための注射筒ポンプを産生することができる。
ＩＶ）．キメラポリペプチドアセンブリー組成物の方法および使用
本発明は、切断可能なキメラポリペプチドアセンブリー組成物またはＰｒｏＴＩＡ（プロテアーゼ誘発免疫活性化因子）、および医学的状況、例えば本発明において、ある特定のがん、腫瘍、または炎症疾患の予防、処置、および／または改善において特に有用であるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物を提供する。
免疫抑制レジメンにおいて臨床的に広く使用されている抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体のＶＬおよびＶＨ部分を特に使用して、ＴｃＲシグナリングを標的化することによるＴ細胞応答のモジュレーションを含む、がん性疾患を有する対象を処置する方法に使用するためのキメラポリペプチドアセンブリー組成物を設計するために、多数の治療戦略が使用されている。ＣＤ３特異的モノクローナルＯＫＴ３は、ヒトにおいて使用が承認されたそのような最初のモノクローナル（Sgro、Toxicology、１０５巻（１９９５年）、２３〜２９頁）であり、移植における免疫抑制剤として臨床で広く使用されている（Chatenoud L: Immunologic monitoring during OKT3 therapy. Clin Transplant、７巻：４２２〜４３０頁、１９９３年）。その上、抗ＣＤ３モノクローナルは、部分的なＴ細胞シグナリングおよびクローンアネルギーを誘導することができる（Smith、J. Exp. Med. １８５巻（１９９７年）、１４１３〜１４２２頁）。ＯＫＴ３は、急性拒絶において主要な役割を果たす全てのＴ細胞の機能をおそらく遮断することによって、同種異系組織拒絶を逆転させる。ＯＫＴ３は、シグナル伝達にとって必須であるＴ細胞の抗原認識構造（ＴＣＲ）に会合する、Ｔ細胞の膜のＣＤ３複合体と反応してその機能を遮断する。これらおよび他のそのようなＣＤ３特異的抗体は、サイトカイン産生（Von Wussow、「Human gamma interferon production by leukocytes induced with monoclonal antibodies recognizing T cells」、J. Immunol.、１２７巻：１１９７〜１２００頁（１９８１年））、増殖、およびサプレッサーＴ細胞誘導を含む様々なＴ細胞応答を誘導することができる。状態に応じて、ＣＤ３特異的モノクローナル抗体は、細胞傷害性を阻害または誘導することができる（Kimball JA,ら、「The OKT3 Antibody Response Study: a multicentre study of human anti-mouse antibody (HAMA) production following OKT3 use in solid organ transplantation」、Transplant Immunol. ３号：２１２〜２２１頁（１９９５年））。がんにおいて、がん細胞を溶解するために細胞傷害性Ｔ細胞を利用する試みがなされている。標的細胞溶解をもたらすために、細胞傷害性Ｔ細胞は、直接の細胞間接触を必要とし、細胞傷害性Ｔ細胞におけるＴＣＲは、標的細胞における適切な抗原を認識して係合しなければならない。これによって免疫シナプスが作製され、次に、細胞傷害性Ｔ細胞内のシグナリングカスケードを開始させ、Ｔ細胞活性化ならびに多様な細胞傷害性サイトカインおよびエフェクター分子の産生を引き起こす。パーフォリンおよびグランザイムは、活性化細胞傷害性Ｔ細胞に常在する予め形成された顆粒内に保存される毒性の強い分子である。標的細胞の認識後、係合した細胞傷害性Ｔ細胞の細胞質顆粒は、細胞傷害性Ｔ細胞の膜に向かって遊走し、最終的に膜に融合し、その内容物を免疫シナプスの方向に放出して、標的細胞の膜内で孔を形成し、腫瘍細胞の細胞膜を破壊する。作製された孔は、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するセリンプロテアーゼファミリーであるグランザイムの流入点として作用する。これらおよび他のエフェクター分子は、上記でより十分に説明されている。本発明は、標的細胞の溶解を開始して、上記の機序によって有益な治療転帰をもたらすために、エフェクター細胞に加えて、腫瘍などの広範な悪性細胞を標的とするように遺伝子操作されている二特異的組成物の使用方法を企図する。組成物は、１つの結合ドメインがＣＤ３に結合して係合し、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するように設計されるが、第２の結合ドメインは、特定の悪性疾患の特徴である多様な異なる標的細胞抗原を標的として、それらを共に架橋して免疫シナプスを作製するように設計することができる。設計の特定の利点として、細胞傷害性エフェクター細胞とがん細胞の物理的結合により、抗原のプロセシング、ＭＨＣＩ／β２−ミクログロブリン、ならびに共刺激分子の必要がなくなる。重要な腫瘍細胞マーカーの例には、多数の固形腫瘍において発現される細胞表面糖タンパク質である、上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）が含まれる。別の例はＨＥＲ２／ｎｅｕであり、これも乳がんなどのいくつかの固形腫瘍において発現される。本発明のキメラポリペプチドアセンブリー組成物の結合ドメインを作製するために利用することができる他のがん細胞マーカーおよび代表的なＶＬおよびＶＨ配列を表２に記載するか、または本明細書において説明する。対象の組成物抗体の様々な実施形態に遺伝子操作することができる腫瘍特異的マーカー（上記でより広範に説明した）の範囲が広いことから、得られた組成物は、固形腫瘍および血液腫瘍を含む多様ながんに対して有用性を有すると認識される。一実施形態では、本発明は、腫瘍を有する対象を処置する方法を提供する。処置される腫瘍は、間質細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、グリア細胞、上皮細胞、脂肪細胞、リンパ球細胞、血管細胞、平滑筋細胞、間葉細胞、乳房組織細胞、前立腺細胞、腎細胞、脳細胞、結腸細胞、卵巣細胞、子宮細胞、膀胱細胞、皮膚細胞、胃細胞、尿生殖器官細胞、子宮頸部細胞、子宮細胞、小腸細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、胆嚢細胞、胆管細胞、食道細胞、唾液腺細胞、肺細胞、および甲状腺細胞からなる群より選択される細胞から生じる腫瘍細胞を含みうる。組成物のさらなる利点において、細胞傷害性エフェクター細胞は、１つの標的細胞の溶解を引き起こした後、架橋された標的がん細胞の損傷／破壊の際に消費されないことから、活性化エフェクター細胞は局所組織の中に放出されて他の標的がん細胞に向かって移動し、標的抗原に結合し、さらなる細胞溶解を開始することができる。さらに、固形腫瘍のような局所環境で、パーフォリンおよびグランザイムなどのエフェクター細胞分子の放出によって、二特異的結合ドメインの所定の分子に隣接するが結合しない腫瘍細胞に対して損傷を引き起こし、それによって腫瘍の増殖の停滞または縮小が起こると企図される。
したがって、本発明の有用性は、本明細書に記載のキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の治療有効用量を、標的細胞マーカーを有するがんまたは腫瘍を有する対象に投与後、がんまたは腫瘍細胞に会合したプロテアーゼによって組成物を作用させることができ、標的細胞とエフェクター細胞とを連結させることによって免疫シナプスを作製することができるように二特異的の第１の部分結合ドメインを放出し、その結果、標的細胞を溶解することができるエフェクター細胞由来エフェクター分子が、シナプスに放出されて、標的のがんまたは腫瘍細胞のアポトーシス、細胞溶解、または死が起こることであると理解される。さらに、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の使用により、放出された結合ドメインがエフェクター細胞および標的がん細胞に結合することによってひとたび免疫シナプスが形成されると、「１回死滅させる」より持続的でより一般的な有益な治療効果が得られうることは、当業者によって認識されるであろう。
一態様では、本発明は、がんまたは炎症障害などの対象における疾患を処置する方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、対象における疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載のキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。医薬組成物の治療有効量は、個体の疾患の状態、年齢、性別、および体重、ならびに抗体または抗体部分が個体において所望の応答を誘発する能力などの要因に従って変化しうる。治療有効量はまた、対象組成物のいかなる毒性または有害な効果も治療上有益な効果が上回る量である。予防有効量は、所望の予防効果を達成するために必要な期間、必要とされる医薬組成物の量を指す。
対象における疾患を処置する方法の一実施形態では、処置される疾患は、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（gastric cancer）、食道がん、胃がん（stomach cancer）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病を含む原発性血液悪性腫瘍、骨髄増殖性新生物障害、または骨髄異形成障害、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群でありうる。治療有効量は、がんまたは腫瘍を処置する（例えば、治癒するまたは重症度を低減する）または予防する（例えば、再発の可能性を低減させる）のを助けるために有益な効果を生じることができる。対象における疾患を処置する方法の別の実施形態では、医薬組成物は、対象に週２回、週１回、２週毎、３週毎、または毎月投与される１つまたは複数の治療有効用量として投与される。方法の別の実施形態では、医薬組成物は、対象に少なくとも２週、または少なくとも１カ月、または少なくとも２カ月、または少なくとも３カ月、または少なくとも４カ月、または少なくとも５カ月、または少なくとも６カ月の期間にわたって１つまたは複数の用量として投与される。方法の別の実施形態では、最初の低プライミング用量を対象に投与した後、１つまたは複数のより高用量の維持用量を少なくとも２週間、または少なくとも１カ月、または少なくとも２カ月、または少なくとも３カ月、または少なくとも４カ月、または少なくとも５カ月、または少なくとも６カ月の投薬スケジュールにわたって対象に投薬する。投与される初回プライミング用量は、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇからなる群から選択され、投与される１つまたは複数のその後の維持用量は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４．ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される。方法の別の実施形態では、医薬組成物は、対象に皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、髄腔内、または筋肉内に投与される。方法の別の実施形態では、医薬組成物は、最大の安全性および効能に関して忍容される、１つもしくは複数の治療上有効なボーラス用量または５分〜９６時間の注入によって対象に投与される。方法の別の実施形態では、医薬組成物は、１つもしくは複数の治療上有効なボーラス用量または５分〜９６時間の注入によって対象に投与され、用量は、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４．ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される。方法の別の実施形態では、医薬組成物は、１つもしくは複数の治療上有効なボーラス用量または５分〜９６時間にわたる注入によって対象に投与され、対象への投与によって、対象において少なくとも約３日、少なくとも約７日、少なくとも約１０日、少なくとも約１４日、または少なくとも約２１日維持される、少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬ〜少なくとも約２μｇ／ｍＬまたはそれを超えるキメラポリペプチドアセンブリーの血漿中濃度が得られる。方法の前述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、サル、およびヒトでありうる。
特に、キメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物は、上皮がん、好ましくは腺癌、または微小残存病変、より好ましくは初期固形腫瘍、進行固形腫瘍、または転移固形腫瘍を処置するために使用することができる。さらに、本発明において提供されるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物は、肉腫の処置において有用である。さらに、本発明において提供されるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物は、急性または慢性リンパ球性白血病、急性または慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性新生物障害、または骨髄異形成障害、Ｂ細胞障害、例えばＢ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽種、Ｂ細胞由来慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）などを含む、原発性血液悪性疾患を含む、リンパ腫および白血病、ならびに／また重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群などのＢ細胞関連自己免疫疾患の処置において有用である。さらに、本発明において提供されるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物は、尿生殖器官がん、卵巣がん、悪性腹水を有する卵巣がん、癌性腹膜炎、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮がん、腹膜中皮腫、膵臓がん、結腸がん、悪性腹水を有する結腸がん、および胃がんを含む、腹水が起こるがんの処置において有用である。
一態様では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む医薬組成物の投与によって媒介される、がんまたは腫瘍における有益な効果を達成するための方法を提供する。方法の一実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の１つの結合ドメインがエフェクター細胞ＣＤ３抗原に結合する親抗体に由来し、第２の結合ドメインが、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２ ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６ βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ１３３、ガングリオシドＧＤ３；９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原１、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、胎児アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、ＣＤ２５、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ミュラー管抑制物質受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、シアル化Ｔｎ抗原（ｓ ＴＮ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＡＧ７２、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原）、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｇ２５０、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＤＬＫ１、ＳＰ１７、ＲＯＲ１、およびＥｐｈＡ２からなる群から選択されるエフェクター細胞標的抗原に結合する親抗体に由来する治療有効量の医薬組成物を投与することによって、それを必要とする対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法におけるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の使用を提供する。方法の一実施形態では、治療有効量の医薬組成物の投与によって、基礎となるがんまたは腫瘍障害の根治または改善が起こり、対象はなおも基礎障害に罹患しうるにもかかわらず、対象において改善が観察される。
別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の１つの結合ドメインが表１の抗体からなる群から選択されるエフェクター細胞に対する親抗体に由来し、第２の結合ドメインが、表２の抗体からなる群から選択される標的細胞標的抗原に結合する親抗体に由来する、治療有効量の医薬組成物を投与することによって、対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法におけるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の１つの結合ドメインが、表１に記載の配列の群から選択されるエフェクター細胞に対する親抗体に由来するＶＬおよびＶＨ配列を含み、第２の結合ドメインが、表２の抗体からなる群から選択される標的細胞抗原に対する親抗体に由来するＶＬおよびＶＨ配列の対を含む、治療有効量の医薬組成物を投与することによって、対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法におけるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の１つの結合ドメインが、エフェクター細胞に対する親抗体に由来するＶＬおよびＶＨ配列を含み、第２の結合ドメインが、標的細胞抗原に対する親抗体に由来するＶＬおよびＶＨ配列の対を含み、連結された結合ドメインが、表１３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、治療有効量の医薬組成物を投与することによって、対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法におけるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、表１０または表１２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドアセンブリーを含む治療有効量の医薬組成物を投与することによって、対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法におけるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の使用を提供する。一実施形態では、方法の医薬組成物の用量は、ボーラス用量として投与される。別の実施形態では、方法の医薬組成物の用量はそれぞれ、静脈内注入によって投与される。別の実施形態では、方法の医薬組成物の用量はそれぞれ、腹部内注入によって投与される。別の実施形態では、方法の医薬組成物の用量はそれぞれ、動脈内注入によって投与される。別の実施形態では、方法の医薬組成物の用量はそれぞれ、皮下注射によって投与される。別の実施形態では、方法の医薬組成物の用量はそれぞれ、筋肉内注射によって投与される。別の実施形態では、方法の医薬組成物の用量はそれぞれ、腹部内注入によって投与される。この段落の前述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、イヌ、サル、およびヒトからなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、処置レジメンに従って対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法に関する。一実施形態では、本発明は、対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法であって、本明細書において開示されるキメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む医薬組成物の治療有効量の１つまたは複数の連続用量を含む処置レジメンに従って疾患を有する対象に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、本発明は、対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法であって、キメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の治療有効量の１つまたは複数の連続用量を含む処置レジメンに従って疾患を有する対象に投与することを含み、医薬組成物の治療有効量の対象への投与によって有益な治療効果が得られる方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、対象におけるがんまたは腫瘍を処置する方法であって、キメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の治療有効量の１つまたは複数の連続用量を含む処置レジメンに従って疾患を有する対象に投与することを含み、処置レジメンによって、対象における疾患に関連する臨床パラメーターまたは評価項目の改善が起こる、方法を提供する。前述において、臨床パラメーターまたは評価項目は、完全、部分、または不完全奏効としての腫瘍縮小；無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答；無増悪生存期間；無病生存期間；再発までの期間；転移までの期間；全生存期間；生活の質の改善；および症状の改善からなる群の１つまたは任意の組合せから選択される。
別の態様では、本発明は、処置レジメンが特定の処置サイクルの一部である使用方法に関する。方法の一実施形態では、処置レジメンの特定の処置サイクルは、それぞれの処置サイクルに関して、週に２回、毎週、１０日毎、２週間毎、３週間毎、または１カ月毎にキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の投与を含む。方法の別の実施形態では、処置レジメンは、疾患の処置に使用され、疾患は、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（gastric cancer）、食道がん、胃がん（stomach cancer）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病を含む原発性血液悪性腫瘍、骨髄増殖性新生物障害、または骨髄異形成障害、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群からなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を利用して、がん細胞などの標的細胞の死を誘導する改善された方法であって、標的細胞または組織に死をもたらすまたはアポトーシスを誘導するが、毒性および副作用が低減された方法に関する。本発明の方法の特定の利点において、組織および細胞に標的化送達されること、および薬物動態特性が増強されたことの両方により、優れた治療指数、すなわち毒性が低減され、効能の改善が得られることから、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の特性の増強により、用量の低減、投薬間隔の短縮、および優れた投薬レジメンを使用する、低用量医薬製剤または処置方法が可能となる。その結果、対象組成物は、ＲＳが切断され、二特異的第１の部分結合ドメインが放出されるとがんまたは腫瘍組織への浸透および結合の増強を可能にしながら、付着したバルキング部分が健康な組織に対する非特異的結合を低減させる能力および健康な組織の循環系からの溢出を防止する能力を有することから、組成物の切断時にプロドラッグ型と放出された第１の部分との異なる区画化が起こり、ＲＳおよびバルキング部分に連結していない対応する第１の部分結合ドメインと比較して優れた効能および安全性を有しうる。一実施形態では、本発明は、標的細胞およびエフェクター細胞を、本明細書に記載のキメラポリペプチドアセンブリーと接触させることを含む、標的細胞の死を誘導する方法であって、接触によって、膜の完全性の喪失、核濃縮、核崩壊、アポトーシスの内在性経路の誘導、アポトーシスの外因性経路の誘導、アポトーシス、細胞溶解、および細胞死からなる群から選択される標的細胞中での効果をもたらす、方法を提供する。効果は、標的細胞とエフェクター細胞の混合集団と、標的細胞およびエフェクター細胞の抗原に対して結合親和性を有する有効量のキメラポリペプチドアセンブリーとを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベースのアッセイにおいて決定することができる。標的細胞抗原の非限定的な例には、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２ ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６ βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ１３３、ガングリオシドＧＤ３；９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原１、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、胎児アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、ＣＤ２５、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ミュラー管抑制物質受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、シアル化Ｔｎ抗原（ｓ ＴＮ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＡＧ７２、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原）、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｇ２５０、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＤＬＫ１、ＳＰ１７、ＲＯＲ１、およびＥｐｈＡ２からなる群から選択される腫瘍特異的マーカー抗原が含まれるがこれらに限定されるわけではなく、エフェクター細胞はＴ細胞であり、エフェクター細胞抗原はＣＤ３である。
他の実施形態では、本発明は、標的細胞集団を含むがんを有する対象において標的細胞の死を誘導する方法を提供する。方法の一実施形態では、方法は、キメラポリペプチドアセンブリーを含む治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。方法の別の実施形態では、方法は、医薬組成物の１つまたは複数の連続的に投与される治療有効用量としてキメラポリペプチドアセンブリーを投与することを含む。方法の別の実施形態では、方法は、がんを有する対象において治療効果を達成するのに必要とされるキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の量を決定すること、および１つまたは複数の連続用量としての量を対象に投与することを含む。前述の方法において、がんは、癌腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、ＥＲ／ＰＲ＋乳がん、Ｈｅｒ２＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、悪性腹水を伴う結腸がん、粘液腫瘍、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（gastric cancer）、胃がん（stomach cancer）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、男化腫瘍、腺癌、肉腫、およびＢ細胞由来慢性リンパ性白血病からなる群から選択される。方法の別の実施形態では、方法は、キメラポリペプチドアセンブリーを含む治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含み、方法によって、臨床パラメーターまたは評価項目の改善が起こる。例示的な臨床パラメーターまたは評価項目は、全生存期間、症状評価項目、無病生存期間、客観的奏効率、完全奏効、奏効期間、無増悪生存期間、無増悪期間、治療成功期間、腫瘍測定、腫瘍サイズ、腫瘍奏効率、転移までの期間、およびバイオマーカー濃度でありうる。方法の別の実施形態では、方法は、キメラポリペプチドアセンブリーを含む治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含み、方法によって、キメラポリペプチドアセンブリーの第１の部分を含むが第２の部分および第３の部分を含まない組成物の同等のｍｍｏｌｅ／ｋｇでの用量を同等の対象に投与する場合と比較して、対象において診断的に関連する副作用の頻度、期間、または重症度の低減が起こり、副作用は、ＩＬ−２の血漿レベルの増大、ＴＮＦ−アルファの血漿レベルの増大、ＩＦＮ−ガンマの血漿レベルの増大、敗血症、発熱性好中球減少症、神経毒性、痙攣、脳症、サイトカイン放出症候群、言語障害、平衡障害、発熱、頭痛、混乱、低血圧、好中球減少症、悪心、意識障害、見当識障害、および肝酵素上昇からなる群から選択される。
一実施形態では、方法は、キメラポリペプチドアセンブリーを含む治療有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、それによって、二特異的第１の部分結合ドメインによって媒介される、少なくとも１つのパラメーター、評価項目、生理状態、または臨床転帰の改善が起こる。方法は、皮内、皮下、筋肉内、腹部内、または静脈内を含む、処置される疾患、障害、または状態に関して適切な任意の経路による医薬組成物の投与を企図する。
本発明の方法は、所望のパラメーターまたは臨床効果を達成および／または維持するために十分な期間、医薬組成物の治療有効量の連続用量を投与することを含んでもよく、治療有効量のそのような連続用量は、医薬組成物に関する治療有効用量レジメン、すなわち、連続的に投与される用量のスケジュールを確立し、用量は、本明細書に記載のがんおよび腫瘍を含むがこれらに限定されるわけではない、がんの疾患状態または病態の任意の臨床兆候、または症状、態様、測定されたパラメーターまたは特徴に対して持続的な有益な効果が起こる治療有効量で与えられる。
本発明の方法に関して、患者の利便性を改善するために、投薬間隔を延長させるために、および持続的な効果を得るために必要な薬物の量を低減させるために、長時間作用するキメラポリペプチドアセンブリー組成物またはキメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む医薬組成物が好ましい。一実施形態では、処置方法は、それを必要とする対象にキメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の治療有効用量を投与することを含み、それによって融合タンパク質に連結されていない、同等用量で対象に投与される対応する標的化成分と比較して、医薬組成物の標的化成分に関して確立された治療濃度域内に留まる時間の増加が起こる。一部の場合において、治療濃度域内に留まる時間の増加は、融合タンパク質に連結されていない、対象に同等用量で投与される対応する標的化成分と比較して、少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍大きい。方法はさらに、それを必要とする対象に治療有効用量レジメンを使用して投与される医薬組成物の複数の連続用量の投与によって、融合タンパク質に連結されていない対応する標的化成分と比較して、組成物の血中レベルに関して連続するＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎ谷の間の時間の増加が起こりうることを提供する。前述の実施形態では、連続するＣｍａｘピークおよび／またはＣｍｉｎ谷の間に留まる時間の増加は、融合タンパク質に連結されていない、標的化成分に関して確立された同等用量レジメンを使用して投与される対応する標的化成分と比較して、少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍大きい。本明細書においてこの段落で先に記載した実施形態では、融合タンパク質または医薬組成物の投与によって、融合タンパク質に連結されていない、同等の単位用量または用量レジメンで対象に投与される対応する標的化成分と比較して、融合タンパク質のモルでのより低い単位用量を使用して、対象のがんまたは腫瘍を評価するために有用であることが公知である少なくとも１つのパラメーターの改善が起こりうる。
一実施形態では、対象のキメラポリペプチドアセンブリー組成物を含む医薬組成物の投与によって、同じアッセイを使用して決定された、または測定された臨床パラメーターもしくは評価項目に基づいて、組成物の第２および第３の部分に連結されていない第１の部分の投与によって達成されるより大きい臨床、生化学または生理的パラメーターのうちの１つの改善が起こりうる。別の実施形態では、医薬組成物の投与によって、それぞれが、異なる標的化部分のうちの１つによって媒介される２つまたはそれより多くの臨床または代謝関連パラメーターまたは評価項目の改善が起こり、それによって同じアッセイを使用してまたは測定された臨床パラメーターに基づいて決定した場合に、ＸＴＥＮに連結していない標的化部分成分と比較して全体として増強された効果が起こりうる。一実施形態では、医薬組成物の対象への投与によって、完全、部分、または不完全奏効としての腫瘍縮小；無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答；無増悪生存期間；無病生存期間；再発までの期間；全生存期間；生活の質の改善；症状の改善；および転移までの期間からなる群の１つまたは任意の組合せから選択される臨床パラメーターまたは評価項目の改善が起こる。別の実施形態では、医薬組成物の投与によって、組成物の第２および第３の部分に連結していない第１の部分の活性より少なくとも２０％長く持続する、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％長く持続する、前述の臨床パラメーターのうちの１つまたは複数の改善が起こりうる。
別の態様では、本発明は、治療剤を腫瘍細胞に送達する方法に関する。一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのキメラポリペプチドアセンブリーを標的細胞に投与することを含む、腫瘍特異的マーカーを含む腫瘍細胞に治療剤を送達する方法であって、治療剤が、腫瘍特異的マーカーに特異的に結合する第１の部分の第１の結合ドメインを介して標的細胞に送達される、方法を提供する。方法の一実施形態では、腫瘍細胞特異的マーカーは、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２ ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６ βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ１３３、ガングリオシドＧＤ３；９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原１、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、胎児アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、ＣＤ２５、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ミュラー管抑制物質受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、シアル化Ｔｎ抗原（ｓ ＴＮ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＡＧ７２、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原）、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｇ２５０、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＤＬＫ１、ＳＰ１７、ＲＯＲ１、およびＥｐｈＡ２からなる群から選択される。キメラポリペプチドアセンブリーを標的細胞に投与することを含む、腫瘍細胞に治療剤を送達する方法の別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーは、表１２の配列からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。キメラポリペプチドアセンブリーを標的細胞に投与することを含む、腫瘍細胞に治療剤を送達する方法の別の実施形態では、キメラポリペプチドアセンブリーは、図３６または図３７に記載のポリペプチド配列と少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。治療剤を腫瘍細胞に送達する方法の別の実施形態では、腫瘍細胞は、対象の腫瘍内に常駐し、対象は、マウス、ラット、サル、イヌ、およびヒトからなる群から選択される。
Ｖ）．本発明の核酸配列
別の態様では、本発明は、ポリペプチドキメラポリペプチドアセンブリー組成物をコードする単離ポリヌクレオチド配列、およびポリペプチドキメラポリペプチドアセンブリー組成物をコードするポリヌクレオチド分子と相補的な配列に関する。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のキメラポリペプチドアセンブリー組成物の実施形態をコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチド配列の相補体を提供する。他の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの第１の部分、または第２の部分、または第３の部分をコードする単離ポリヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチド配列の相補体を提供する。一実施形態では、本発明は、表１０もしくは表１２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるキメラポリペプチドアセンブリー融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチド配列の相補体を提供する。一実施形態では、本発明は、表１０または表１４に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、キメラポリペプチドアセンブリー組成物をコードする単離ポリヌクレオチド配列を提供する。
別の実施形態では、本発明は、表７に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列からなるＴ細胞結合組成物をコードする単離ポリヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチド配列の相補体を提供する。
別の態様では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物の実施形態をコードするポリヌクレオチド配列、またはその相同な変種を含むポリヌクレオチド配列と相補的な配列を産生する方法、ならびにポリヌクレオチド配列によって発現される融合タンパク質を発現させる方法に関する。一般的に、方法は、タンパク質様キメラポリペプチドアセンブリー組成物成分をコードするポリヌクレオチド配列を産生すること、得られた遺伝子産物を発現させること、成分をコードするヌクレオチドをアセンブルすること、成分をインフレームでライゲーションすること、コード遺伝子を宿主細胞にとって適切な発現ベクターに組み込むことを含む。コードされるキメラポリペプチドアセンブリーの融合タンパク質を産生する場合、方法は、適切な宿主細胞を発現ベクターによって形質転換すること、得られた融合タンパク質を形質転換宿主細胞において発現させるまたは発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養して、それによって融合タンパク質ポリペプチドを産生し、これを本明細書に記載の方法または当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製方法によって回収することを含む。分子生物学における標準的な組換え技術を使用して、本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを作製する。
本発明に従って、キメラポリペプチドアセンブリー組成物（またはその相補体）をコードする核酸配列を使用して、適切な宿主細胞において発現を指示する組換えＤＮＡ分子を作製する。いくつかのクローニング戦略が本発明の実施にとって適しており、その多くは、本発明の組成物をコードする遺伝子またはその相補体を含む構築物を作製するために使用される。一実施形態では、クローニング戦略を使用して、組成物を発現させるための宿主細胞を形質転換するために使用されるキメラポリペプチドアセンブリーをコードするヌクレオチドを含むキメラポリペプチドアセンブリー構築物をコードする遺伝子を作製する。本明細書においてこの段落で先に記載した前述の実施形態では、遺伝子は、本明細書において開示される構成の結合部分、放出断片、およびバルキング部分をコードするヌクレオチドを含みうる。
１つのアプローチにおいて、キメラポリペプチドアセンブリー構築物に対応するＤＮＡ配列を含む構築物を最初に調製する。そのような構築物を調製するための例示的な方法を実施例に記載する。次に、構築物を使用して、キメラポリペプチドアセンブリー構築物の発現および回収のための原核宿主細胞などの宿主細胞を形質転換するために適した発現ベクターを作製する。望ましければ、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。発現ベクターの作製、宿主細胞の形質転換、ならびにＸＴＥＮの発現および回収のための例示的な方法を実施例に記載する。
キメラポリペプチドアセンブリー構築物をコードする遺伝子は、全合成により、または実施例により十分に説明する方法を含む、制限酵素媒介クローニング、ＰＣＲ、およびオーバーラップ伸長などの、酵素的プロセスと組み合わせた合成のいずれかによって、１つまたは複数のステップで作製することができる。本明細書において開示される方法は、例えば、所望の長さおよび配列の様々な成分（例えば、結合ドメイン、リンカー、放出断片、およびＸＴＥＮ）遺伝子をコードするポリヌクレオチドの配列をライゲーションするために使用することができる。キメラポリペプチドアセンブリー組成物をコードする遺伝子は、標準的な遺伝子合成技術を使用してオリゴヌクレオチドからアセンブルされる。遺伝子の設計は、キメラポリペプチドアセンブリーの産生に利用されるＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞にとって適切なコドン使用およびアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを使用して実施することができる。本発明の１つの方法において、構築物の成分をコードするポリヌクレオチドのライブラリを作製した後、上記のようにアセンブルする。次いで得られた遺伝子をアセンブルし、得られた遺伝子を使用して、宿主細胞を形質転換し、本明細書に記載のその特性の評価のために、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を産生および回収する。
次に、キメラポリペプチドアセンブリー配列をコードする得られたポリヌクレオチドを、発現ベクターに個々にクローニングすることができる．多様な技法によって、核酸配列をベクターに挿入する。一般的に、ＤＮＡを、当技術分野で公知の技術を使用して、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ベクター成分は一般的に、シグナル配列のうちの１つまたは複数、複製開始点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終止配列の１つまたは複数を含むがこれらに限定されるわけではない。これらの成分のうちの１つまたは複数を含む、適したベクターの構築は、当業者に公知である標準的なライゲーション技術を使用する。そのような技術は当技術分野で周知であり、科学文献および特許文献に十分に記載されている。様々なベクターが公的に利用可能である。ベクターは、例えば、組換えＤＮＡ技法に簡便に供することができるプラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態でありうるが、ベクターの選択はしばしば、ベクターが導入される宿主細胞に依存する。このため、ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、染色体外の実体として存在し、その複製が染色体の複製とは無関係であるベクター、例えばプラスミドでありうる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と共に複製されるベクターでありうる。
本発明は、宿主細胞と適合性で、宿主細胞によって認識され、ポリペプチドの制御発現のためにポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結されている、複製および制御配列を含むプラスミド発現ベクターの使用を提供する。ベクターは通常、複製部位、ならびに形質転換細胞において表現型の選択を提供することができるタンパク質をコードする配列を有する。そのようなベクター配列は、多様な細菌、酵母、およびウイルスに関して周知である。使用することができる有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体、および合成ＤＮＡ配列の断片を含む。「発現ベクター」は、適した宿主においてポリペプチドをコードするＤＮＡの発現をもたらすことができる、適した制御配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を指す。必要条件は、ベクターが、選択された宿主細胞において複製可能で生存可能であることである。望ましければ、低いまたは高いコピー数のベクターを使用してもよい。
適したベクターには、ＳＶ４０の誘導体およびｐｃＤＮＡ、ならびに、ｃｏｌ ＥＩ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、Smithら、Gene ５７巻：３１〜４０頁（１９８８年）に記載されるｐＧＥＸ、ｐＭＢ９およびその誘導体、ＲＰ４等のプラスミド、ＮＭ９８９などのファージＩの多数の誘導体などのファージＤＮＡ、ならびにＭ１３および糸状一本鎖ファージＤＮＡなどの他のファージＤＮＡなどの公知の細菌プラスミド；２ミクロンプラスミドまたは２ｍプラスミドの誘導体ならびにセントロメアおよび組込み型酵母シャトルベクターなどの酵母プラスミド；昆虫または哺乳動物細胞において有用なベクターなどの真核細胞において有用なベクター；プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せに由来するベクター、例えばファージＤＮＡまたは発現制御配列を使用するように改変されているプラスミドなどが含まれるがこれらに限定されるわけではない。本発明において同様に使用することができる酵母発現系には、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、融合体ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳベクター等が含まれるがこれらに限定されるわけではない。ベクターの制御配列は、転写をもたらすためのプロモーター、そのような転写を制御するための任意選択のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終止を制御する配列を含む。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示し、宿主細胞に対して同種または異種のいずれかであるタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる任意のＤＮＡ配列でありうる。原核細胞宿主の場合に発現ベクターにおいて使用するために適したプロモーターには、その全てがＣＦＸＴＥＮポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム［Changら、Nature、２７５巻：６１５頁（１９７８年）；Goeddelら、Nature、２８１巻：５４４頁（１９７９年）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム［Goeddel、Nucleic Acids Res.、８巻：４０５７頁（１９８０年）；欧州特許第３６，７７６号］、ならびにｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーター［deBoerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８０巻：２１〜２５頁（１９８３年）］が含まれる。細菌システムにおいて使用するためのプロモーターはまた、キメラポリペプチドアセンブリーポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された、シャイン−ダルガルノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含みうる。
ＶＩ）．本発明の組成物を作製する方法
別の態様では、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を使用して機能的タンパク質の高い発酵発現レベルでキメラポリペプチドアセンブリー組成物を作製する方法、ならびに高い発現レベルで細胞傷害性の活性なポリペプチド構築物組成物を産生する方法において有用な構築物をコードする発現ベクターを提供する方法に関する。
一実施形態では、方法は、１）本明細書において開示される実施形態のうちのいずれかのキメラポリペプチドアセンブリー融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製するステップと、２）生物系における高レベルタンパク質発現のために適切な転写および翻訳配列の制御下のプラスミドまたは他のベクターでありうる発現ベクターに、ポリヌクレオチドをクローニングするステップと、３）発現ベクターによって適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を形質転換するステップと、４）キメラポリペプチドアセンブリー組成物の発現にとって適した条件下で通常の栄養培地中で宿主細胞を培養するステップとを含む。望ましければ、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、ＢＬ２１ Ｇｏｌｄである。方法によって、キメラポリペプチドアセンブリー融合タンパク質の発現は、宿主細胞の粗発現産物の成分として発現された融合タンパク質の少なくとも０．１ｇ／Ｌ、または少なくとも０．２ｇ／Ｌ、または少なくとも０．３ｇ／Ｌ、または少なくとも０．５ｇ／Ｌ、または少なくとも０．６ｇ／Ｌ、または少なくとも０．７ｇ／Ｌ、または少なくとも０．８ｇ／Ｌ、または少なくとも０．９ｇ／Ｌ、または少なくとも１ｇ／Ｌの発酵力価をもたらし、発現された融合タンパク質の第１および第２の結合ドメインの少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９９％が正確にフォールディングされる。本明細書において使用される用語「正確にフォールディングされる」は、結合ドメインタンパク質がその標的リガンドに対して特異的結合能を有することを意味する。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を産生する方法であって、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を発酵反応において、発酵反応が波長６００ｎｍで少なくとも１３０の光学密度に達した場合に、前記ポリペプチドの約１０ミリグラム超／グラム乾燥重量宿主細胞（ｍｇ／ｇ）、または少なくとも約２５０ｍｇ／ｇ、または約３００ｍｇ／ｇ、または約３５０ｍｇ／ｇ、または約４００ｍｇ／ｇ、または約４５０ｍｇ／ｇ、または約５００ｍｇ／ｇの濃度でポリペプチド産物を発現するために有効な条件で培養するステップを含み、発現された融合タンパク質の第１および第２の結合ドメインが正確にフォールディングされる、方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を産生する方法であって、キメラポリペプチドアセンブリー組成物を含むポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を発酵反応において、発酵反応が波長６００ｎｍで少なくとも１３０の光学密度に達した場合に、前記ポリペプチドの約１０ミリグラム超／グラム乾燥重量宿主細胞（ｍｇ／ｇ）、または少なくとも約２５０ｍｇ／ｇ、または約３００ｍｇ／ｇ、または約３５０ｍｇ／ｇ、または約４００ｍｇ／ｇ、または約４５０ｍｇ／ｇ、または約５００ｍｇ／ｇの濃度でポリペプチド産物を発現するために有効な条件で培養するステップを含み、発現されたポリペプチド産物が可溶性である、方法を提供する。
以下は、本発明の組成物、方法、および処置レジメンの例である。上記の一般的説明を考慮して、他の様々な実施形態を実施してもよいと理解される。
（実施例１）放出断片およびＸＴＥＮを有する抗ＥｐＣＡＭ抗ＣＤ３−ＸＴＥＮを有するＰｒｏＴＩＡ構築物の構築
抗ＥｐＣＡＭ／抗ＣＤ３タンデムｓｃＦｖの後に多特異的放出断片配列（ＢＳＲＳ−１、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＨＳＰＬＧＬＡＧＳ）の１つが続く配列をコードする遺伝子を、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔで合成し、ｐＢＲ３２２−ＸＴＥＮ８６４デスティネーションベクターにおけるＮｄｅＩおよびＢｓａＩ制限部位と適合性であるＮｄｅＩおよびＢｓａＩ部位を導入した。抗ＥｐＣＡＭ／抗ＣＤ３タンデムｓｃＦｖおよびＢＳＲＳ−１を含む制限消化遺伝子断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してｐＢＲ３２２−ＸＴＥＮ８６４ベクターにライゲーションして、ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換した。形質転換体を、ＤＮＡミニプレップによってスクリーニングして、所望の構築物をＤＮＡシークエンシングによって確認した。最終ベクターは、以下の成分（Ｎ末端からＣ末端の順）：抗ＥｐＣＡＭ−抗ＣＤ３二特異的タンデムｓｃＦｖに放出断片としてのＢＳＲＳ−１が続き、これにＰｈｏＡプロモーターの制御下でＸＴＥＮ＿８６４遺伝子が融合し、およびＳＴＩＩ分泌リーダー、を有するＰｒｏＴＩＡ分子をコードする。得られた構築物はＡＣ１２７８であり、ＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列を表１０に提供する。
ＡＣ１４７６と呼ぶ、放出断片を有し、ＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列を表１０に同様に提供する別の抗ＥｐＣＡＭ抗ＣＤ３−ＸＴＥＮを、類似の方法で骨格ベクターｐＹＳ００４４−ＸＴＥＮ８６４−Ｈ６骨格ベクターに構築した。
下線で示す配列はシグナルペプチドを表し、これは分泌の際に切断され、最終の成熟タンパク質には存在しない。
（実施例２）Ｅ．ｃｏｌｉ発酵培養物からの非切断型および切断型Ｈｉｓ８−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４の産生
１）Ｅ．ｃｏｌｉ発酵培養物からのＨｉｓ（８）−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の発現および精製
融合タンパク質ＡＣ１２７８（ＭＫＫＮＩＡＦＬＬＡＳＭＦＶＦＳＩＡＴＮＡＹＡ−Ｈｉｓ（８）−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４）を、Ａｍｕｎｉｘ所有のＥ．ｃｏｌｉＡｍＥ０９８株において発現させた。１０Ｌ発酵培養物を３７℃で増殖させて、塩の供給を枯渇させた後、温度を２６℃にシフトさせた。採取の間、発酵ブロス全体を遠心分離して細胞を沈降させた。上清を収集して、次に酸凝集沈殿を使用して、エンドトキシンおよび宿主細胞タンパク質夾雑物を低減させた。１Ｍ酢酸を使用して、上清のｐＨを徐々にｐＨ４．５に低下させ、室温で３０分間インキュベートした。次に、２Ｍ ＮａＯＨを使用してｐＨをｐＨ７．５に上昇させ戻し、４℃で一晩保った。翌日、３Ｍ ＬｉｆｅＡｓｓｕｒｅフィルターカプセルを使用して、上清を０．２０μｍで濾過した。
ＨｉｓアフィニティタグのＮ末端の完全性を確保するために、固定化金属アフィニティクロマトグラフィーを最初の捕捉ステップとして使用した。５個の１０−ｍＬ ＲｅｄｉｓｅｐＲｆ ２５Ｇカラムハウジング（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ）に、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ−ＡＦ−キレート６５０Ｍ樹脂（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１０ｍＬを充填した。カラムを０．５Ｍ ＮａＯＨで消毒し、蒸留水で十分にすすいだ後、０．１Ｍ Ｎｉ２ＳＯ４を充填し、平衡緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５）の５カラム容量（ＣＶ）で平衡にした。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４の曇点が２３°Ｃであることから、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、ｐＨ ７．５）および洗浄２緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５）を予め調製して４°Ｃで保存し、使用時は氷上で維持した。カラムを平衡にした後、上清をカラムにロードした。追跡としての平衡緩衝液３ＣＶの後、カラムを冷Ｔｒｉｔｏｎ洗浄緩衝液の１０ＣＶで洗浄して、エンドトキシンを低下させ、その後、冷洗浄２緩衝液の１０ＣＶによってＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４を除去した。タンパク質を、溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ ７．５）の３ＣＶによってカラムから溶出させて、１ＣＶの画分（１０ ｍＬ）を収集した。タンパク質の酸化を低減させるために、５ｍＭ ＥＤＴＡを、各溶出液に添加した。ロード、フロースルー、および溶出液を非還元４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色によって分析した。ゲルに基づき、溶出液ＣＶ１およびＣＶ２をさらなる処理のために残しておいた（図１４Ａ）。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）をその後の研磨ステップとして選択した。２個の２０−ｍＬ ＲｅｄｉｓｅｐＲｆ ２５Ｇカラムハウジング（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ）に、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ−フェニル−６５０Ｍ樹脂（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）２０ｍＬを充填した。カラムを０．５Ｍ ＮａＯＨで消毒し、蒸留水で十分にすすぎ、緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ ７．５）の５ＣＶで平衡にした。７５％緩衝液Ａ、５０％緩衝液Ａ、および２５％緩衝液Ａの溶出緩衝液を、緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５）の適当量を混合することによって予め調製した。ＩＭＡＣ溶出液ＣＶ１および２を、先のカラムステップから共にプールし、硫酸アンモニウムを最終濃度１Ｍで添加した後、予め平衡にしたフェニルカラムにロードした。ローディングおよび緩衝液Ａの３ＣＶによる追跡後、カラムを７５％緩衝液Ａ、５０％緩衝液Ａ、２５％緩衝液Ａ、および０％緩衝液Ａのそれぞれ３ＣＶによって溶出した。ロード、フロースルー、および溶出液を、非還元４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色によって分析した。ゲルに基づき、洗浄液および７５０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４（枠内）での溶出液ＣＶ１〜２をさらなる処理のためにプールした（図１４Ｂ）。
ＸＴＥＮのＣ末端の完全性を確保するため、およびエンドトキシンをさらに低下させるために、アニオン交換クロマトグラフィーを最終研磨ステップとして選択した。ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ上のＸＫ１６カラムハウジングに、Ｃａｐｔｏ Ｑ Ｉｍｐｒｅｓｓ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）５ｍＬを充填して、０．５Ｍ ＮａＯＨで消毒し、蒸留水で十分にすすぎ、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５）の２ＣＶでストリッピングを行い、緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５）の５ＣＶで平衡にした。ＨＩＣ溶出液プールを４倍希釈した後、カラムにロードした。次に、カラムを３０％緩衝液Ｂの３ＣＶで洗浄し、３０％〜７０％緩衝液Ｂの勾配の１５ＣＶによって溶出した。溶出液を、１／２ＣＶ（２．５ｍＬ）画分に収集した。次にロード、フロースルー、および溶出液を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色によって分析し、製剤に関してプールする画分を決定した（図１４Ｃ）。
２）製剤および特徴付け
所望の溶出画分（図１４Ｃの枠内）を濃縮して、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５に緩衝液交換した。製剤化した産物を０．２μｍで濾過滅菌した。産物の品質を決定するためのロット放出は、サイズ排除クロマトグラフィー分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を伴った。ＳＥＣ分析の場合、製剤化産物１０μｇを、分析的ＳＥＣカラムに注入して、９５％超の単量体産物を確認した（図１５Ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、製剤化産物５μｇを４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルにロードして、クマシーブルーで染色することによって実施した。産物の純度は９０％超（図１５Ｂ）であった。
３）酵素の活性化および保存
組換えマウスＭＭＰ−９は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから酵素前駆体として供給され、酢酸４−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）による活性化を必要とした。ＡＰＭＡを最初に０．１Ｍ ＮａＯＨに最終濃度１０ｍＭとなるように溶解した後、０．１Ｎ ＨＣｌを使用してｐＨを中性へと再調節した。ＡＰＭＡ保存液の２．５ｍＭへのさらなる希釈は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５中で行った。プロＭＭＰを活性化するために、１ｍＭ ＡＰＭＡおよび１００ｕｇ／ｍＬプロＭＭＰ−９を３７℃で３時間インキュベートした。最終濃度５０％のグリセロールに添加した活性化酵素は、その後、−２０℃で数週間保存することができた。
４）Ｈｉｓ（８）−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４のＭＭＰ−９消化
切断型ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ−Ａを産生するために、製剤化したＨｉｓ（８）−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４（ＰｒｏＴＩＡ−Ｘ）９．１２ｍｇを、１０ｍＭ ＣａＣｌ２および酵素の基質に対するモル比１：２２３７の活性組換えマウスＭＭＰ−９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む反応混合物中、３７℃で２時間インキュベートした。ＢＳＲＳ１での特異的消化を確認するため、非消化およびＭＭＰ−９消化産物５μｇを４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動させた後、クマシーブルーによって染色した。クマシーブルー染色を使用することにより、ＭＭＰ−９消化前の完全長のＨｉｓ８−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４（ＰｒｏＴＩＡ−Ｘ）、およびＭＭＰ−９消化後のＨｉｓ８−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３切断断片（ＰｒｏＴＩＡ−Ａ）が可視化された（図１６Ａ）。
５）ＭＭＰ−９消化後の切断型Ｈｉｓ（８）−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ−Ａの精製
ＢＳＲＳ１でのＭＭＰ−９消化の確認後、固定化金属アフィニティクロマトグラフィーを使用して、ＭＭＰ−９を除去した。５−ｍＬポリプロピレンカラムハウジング（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ−ＡＦ−キレート６５０Ｍ樹脂（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）２ｍＬを充填した。カラムを、平衡緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５）の５ＣＶによって平衡にした。次に、消化混合物をカラムにロードした。ローディングおよび平衡緩衝液の１ＣＶによる追跡後、カラムを平衡緩衝液の３ＣＶで洗浄した。タンパク質を溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ ７．５）の３ＣＶによってカラムから溶出し、１ＣＶの画分（２ｍＬ）を収集した。ロード、フロースルー、および溶出液を非還元４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色によって分析し、ＰｒｏＴＩＡ−Ａを含む溶出液を決定した（図１６Ｂ）。
６）切断型Ｈｉｓ（８）−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３の製剤および特徴付け
所望の溶出液（図１６Ｂの枠内）を濃縮して、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５に緩衝液交換した。産物の品質を決定するためのロット放出は、サイズ排除クロマトグラフィー分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を伴った。ＳＥＣ分析に関して、産物１０μｇを分析的ＳＥＣカラムに注入して、９５％超の単量体産物を確認した（図１７Ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に関して、産物５μｇを、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで泳動させ、９０％超の産物純度を確認した（図１７Ｂ）。
（実施例３）：Ｅ．ｃｏｌｉ発酵培養物からの非切断型および切断型ＡＣ１４７６ ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−Ｈｉｓ（６）の産生
１） Ｅ．ｃｏｌｉ発酵培養物からのＡＣ１４７６ ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−Ｈｉｓ（６）の発現および精製
融合タンパク質ＡＣ１４７６（ＭＫＫＮＩＡＦＬＬＡＳＭＦＶＦＳＩＡＴＮＡＹＡ−ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−Ｈｉｓ（６））を、Ａｍｕｎｉｘ所有のＥ．ｃｏｌｉ ＡｍＥ０９７株において発現させた。発酵培養物１０Ｌを３７℃で増殖させて、塩の供給の枯渇後、温度を２８°Ｃにシフトさせた。採取の間、全発酵ブロスを遠心分離して細胞を沈降させた。上清を、３Ｍ ＬｉｆｅＡｓｓｕｒｅフィルターカプセルを使用して０．２０μｍで濾過した。ＸＫ５０ハウジングカラムにＴｏｙｏｐｅａｒｌ−ＡＦ−キレート−６５０Ｍ樹脂（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００ｍＬを充填して、４℃で蠕動ポンプに接続した。カラムを０．５Ｍ ＮａＯＨで消毒して、蒸留水で十分にすすぎ、０．１Ｍ ＮｉＳＯ４を充填し、平衡緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５）５ＣＶによって平衡にした。カラムの平衡後、上清をカラムにロードして、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄液、洗浄液２が続き、実施例２−１において上記のプロセスと類似の溶出を行った。溶出液を、１／４ＣＶ（２５ｍＬ）画分で収集して、ＥＤＴＡを最終濃度５ｍＭとなるように添加して、遊離のニッケルをキレート化した。ロード、フロースルー、および溶出液を、非還元４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色によって分析した。ゲルに基づき、溶出液２−５（枠内）をさらなる処理のために残した（図１８Ａ）。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）をその後の研磨ステップとして選択した。ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ上のＸＫ２４ハウジングカラムに、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ−フェニル−６５０Ｍ樹脂（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０ｍＬを充填した。カラムを０．５Ｍ ＮａＯＨで消毒し、蒸留水で十分にすすぎ、緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ ７．５）の５ＣＶで平衡にした。所望のＩＭＡＣ溶出液を前のカラムステップの溶出液と共にプールして、硫酸アンモニウムを最終濃度１Ｍとなるように添加した後、カラムにローディングした。溶出液を、１００％〜５０％緩衝液Ａの勾配の１０ＣＶによって１／２ＣＶ（２５ｍＬ）画分に収集した。ロード、フロースルー、および溶出液を、非還元４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色によって分析した。ゲルに基づき、枠内の溶出液をさらなる処理のためにプールした（図１８Ｂ）。
アニオン交換クロマトグラフィーを最終研磨ステップとして選択した。ＸＫ２４ハウジングカラムに、Ｃａｐｔｏ Ｑ Ｉｍｐｒｅｓｓ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）３０ｍＬを充填し、０．５Ｍ ＮａＯＨで消毒し、蒸留水で十分にすすぎ、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５）の２ＣＶでストリッピングを行い、緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５）の５ＣＶで平衡にした。溶出液のプールを、透過液の伝導率が８ｍｓ／ｃｍとなるまで、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ限外濾過モジュールＢｉｏｍａｘ １０ ｋＤａを通して２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５に緩衝液交換した。透過液を、Ｃａｐｔｏ Ｑ Ｉｍｐｒｅｓｓカラムにロードして、次にカラムを１０％および２０％緩衝液Ｂの３ＣＶで洗浄した。溶出液を、２０％〜７０％緩衝液Ｂの勾配の１０ＣＶによって、１／４ＣＶ（７．５ ｍＬ）画分に収集した。ロード、フロースルー、および溶出液を、非還元４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色によって分析した。ゲルに基づき、選択した溶出液（枠内）を製剤に関してプールした（図１８Ｃ）。
２）ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４−Ｈｉｓ（６）の製剤および特徴付け
所望の溶出液を濃縮して、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５に緩衝液交換した。産物の品質を決定するためのロット放出を、ＳＥＣ分析（図１９Ａ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１９Ｂ）に関して実施例２で確立したプロトコールに従って実施した。さらに、２μｇを、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードして、その後銀染色を行った（図１９Ｃ）。ＳＥＣの結果もまた使用して、ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４−Ｈｉｓ（６）の見かけの分子量および見かけの分子量係数（実際の分子量と比較して）ならびに流体力学的半径を決定した。決定された見かけの分子量は、１．７ＭＤａであり、これによって見かけの分子量係数は１２．３であり、計算された流体力学的半径は１０．８ｎｍであった。
分子の同一性をさらに証明するために、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）を実施し、実験的質量は、１３８，６５２Ｄａであると決定され、理論的分子量１３８，６５１Ｄａと比較するとΔＭａｓｓは＋１Ｄａであった（図２０Ａ）。分析的カチオン交換クロマトグラフィーに関して、試料１０μｇをＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏ ＳＣＸ ＮＰ３にロードし、移動相Ａは２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５であり、移動相Ｂは２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ４．５であった。０〜１００％Ｂの線形勾配を２０分間にわたって適用し、１つのみの単一の主ピークを検出した（図２０Ｂ）。
４）ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４−Ｈｉｓ（６）のＭＭＰ−９消化
実施例２に記載したＭＭＰ−９活性化および消化プロトコールの後、酵素の基質に対するモル比わずか１：６０００モル濃度で活性組換えマウスＭＭＰ−９を使用したが、ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４−Ｈｉｓ（６）（ＰｒｏＴＩＡ−Ｘ）２０ｍｇを消化した。非消化および消化産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２１Ａ）によって分析した。
５）ＭＭＰ−９消化後の切断型ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ８６４−Ｈｉｓ（６）の精製
ＢＳＲＳ１でのＭＭＰ−９消化の確認後、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して、切断型の遊離のＸＴＥＮおよび非切断型ＰｒｏＴＩＡ−Ｘを除去した。２個の５−ｍｌポリプロピレンカラムハウジング（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、ＭａｃｒｏＣａｐ Ｑ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）各３ｍＬを充填し、ＣＩＰ（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ）で消毒し、蒸留水で十分にすすいで、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ＰＨ ７．５）の２ＣＶによるストリッピングを行い、緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．５）の５ＣＶによって平衡にした。消化混合物をカラムにロードした。ローディングおよび緩衝液Ａの１ＣＶによる追跡後、カラムを、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、および５００ｍＭ ＮａＣｌの各２ＣＶによって溶出した。ロード、フロースルー、および溶出液を、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色によって分析し、ＰｒｏＴＩＡ−Ａを含む画分を決定した（図２１Ｂ）。
６）切断型ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３の製剤および特徴付け。所望のＰｒｏＴＩＡ−Ａ画分を濃縮して、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５に緩衝液交換した。産物の品質を決定するためのロット放出を、ＳＥＣ分析（図２２Ａ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２２Ｂ）に関して実施例２で確立したプロトコールに従って実施した。さらに、２μｇを、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、その後銀染色した（図２２Ｃ）。ＳＥＣの結果を同様に使用して、ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３の見かけの分子量および見かけの分子量係数（実際の分子量と比較して）ならびに計算された流体力学的半径を決定した。決定された見かけの分子量は、３９．８ｋＤａであり（後者は、上記のインタクトな構築物のそれより約２３倍小さい）、これは見かけの分子量係数０．７（後者は、上記のインタクトな構築物のそれより約１７倍小さい）および流体力学的半径２．３ｎｍ（後者は、上記のインタクトな構築物のそれより約５倍小さい）を与えた。
分子の同一性をさらに証明するために、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を実施し、実験的質量は、５８，０７１Ｄａであると判定され、理論的分子量５８，０６７Ｄａと比較すると、ΔＭａｓｓは＋４Ｄａであった（図２３Ａ）。２）に既に記載したプロトコールを使用する分析的カチオン交換クロマトグラフィー（図２３Ｂ）も同様に、試料の均一性を確認した。
（実施例４）：抗−ＥｐＣＡＭ×抗−ＣＤ３プロテアーゼ誘発免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のＥｐｃａｍ結合アッセイ
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ組成物の結合能を、ＥｐＣＡＭ／ペルオキシダーゼコンジュゲートプロテイン−ＬサンドイッチＥＬＩＳＡによって確認した。ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、組換えヒトＥｐＣＡＭ（ｒｈＥｐＣＡＭ）（Ｓｉｎｏ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１０６９４−Ｈ０８Ｈ９６０−ＥＰ−５０）を、９６ウェル平底プレートに０．１μｇ／１００μＬの濃度でコーティングした。４℃で一晩インキュベーションした後、アッセイプレートを洗浄して、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によって室温で１時間ブロックした。プレートを再度洗浄した後、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（すなわち、放出断片切断配列を有しないＰｒｏＴＩＡおよび、ＡＣ１４８４、ＰｒｏＴＩＡキメラポリペプチドアセンブリー組成物）ならびにプロテアーゼ処置およびプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４７６）の用量範囲を導入した。非切断性ならびにプロテアーゼ処置および非処置ＰｒｏＴＩＡに利用した用量範囲は、０．０００６〜５ｎＭであり、開始濃度５ｎＭから１：６倍連続希釈スキームによって得た。プレートを室温で１時間振盪させながらインキュベートして、非切断性、プロテアーゼ切断型、および非切断型ＰｒｏＴＩＡを、プレート上にコーティングされたｒｈＥｐＣＡＭに結合させた。非結合成分を洗浄ステップで除去し、ペルオキシダーゼコンジュゲートプロテインＬ（ＰｉｅｒｃｅＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３２４２０）を添加した。プロテインＬをｓｃＦｖのカッパ軽鎖に結合させる適切なインキュベーション期間の後、任意の非結合試薬を洗浄ステップによって除去した後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を各ウェルに添加した。ＴＭＢは、ペルオキシダーゼの色素形成基質である。所望の色強度に達成した後、０．２Ｎ硫酸を添加して反応を停止させ、分光光度計を使用して４５０ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定した。色の強度は、ｒｈＥｐＣＡＭ／プロテインＬサンドイッチＥＬＩＳＡによって捕捉された非切断性、プロテアーゼ処置、および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの濃度に比例する。産生された色（測定されたＯＤ）の強度をタンパク質濃度に対してプロットして、半最大応答（ＥＣ５０）を生じる非切断性、プロテアーゼ切断型および非切断型抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して４パラメーターロジスティック回帰式によって誘導した。
図２４に示されるように、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３二特異的ＰｒｏＴＩＡ分子と類似の結合活性を有し、それぞれ、３２０ｎＭｐＭおよび２８０ｎＭｐＭのＥＣ５０を有する。プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡは、インタクトなプロテアーゼ非処置二特異的分子または非切断性ＰｒｏＴＩＡ分子と比較して、ｒｈＥｐＣＡＭリガンドに関してＥＣ５０が１２０ｎＭｐＭで、最も強い結合活性を有する。データは、ＸＴＥＮ８６４の存在により、そのリガンドに関する抗ＥｐＣＡＭ部分の結合が少なくとも２．３倍妨害されたことを示唆している。
（実施例５）フローサイトメトリーによって評価した細胞結合
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ組成物の二特異的結合をまた、ＣＤ３陽性ヒトＪｕｒｋａｔ細胞、ならびにＳＷ４８０、ＨＣＴ−１１６、Ｋａｔｏ ＩＩＩ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＣＦ−７、ＭＴ３、ＳＫ−Ｂｒ−３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＯＶＣＡＲ−３、およびＰＣ３から選択されるＥｐＣＡＭ陽性ヒト細胞を利用して、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）ベースのアッセイによって評価する。ＣＤ３＋およびＥｐＣＡＭ＋細胞を、非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、ならびに抗ＣＤ３ ｓｃＦｖおよび抗ＥｐＣＡＭ ｓｃＦｖ陽性対照の用量範囲と共に、１％ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムを有するＰＢＳを含むＦＡＣＳ緩衝液において４℃で３０分間インキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液中で数回洗浄して、非結合試験材料を除去した後、細胞をＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｈｉｓタグ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ １２０６）と共に４℃で３０分間インキュベートした。非結合ＦＩＴＣコンジュゲート抗体をＦＡＣＳ緩衝液によって数回洗浄することによって除去し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ）または同等の機器で獲得する。フローサイトメトリーデータは全て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）または同等のもので分析する。
抗ＥｐＣＡＭ ｓｃＦｖは、Ｊｕｒｋａｔ細胞に結合しないと予想されることから、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ、非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは全て、ＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｈｉｓタグ抗体単独と共にインキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、蛍光強度の増加によって示されるように、Ｊｕｒｋａｔ細胞に結合すると予想される。同様に、抗ＥｐＣＡＭ ｓｃＦｖ、プロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは全て、ＥｐＣＡＭ陽性細胞に結合すると予想されるが、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、ＥｐＣＡＭ陽性細胞に結合しないと予想される。これらのデータは、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ組成物が、ＪｕｒｋａｔおよびＥｐＣＡＭ発現ヒト細胞株のパネルにおいてそれぞれ発現されるＣＤ３およびＥｐＣＡＭ抗原の両方を認識する二特異的結合能を反映すると予想される。さらに、表面結合に何らかの妨害をもたらすＸＴＥＮポリマーにより、非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、ＣＤ３およびＥｐＣＡＭ抗原の両方に対してプロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡより低い親和性で結合すると予想される。
（実施例６）抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼ誘発免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の細胞傷害性アッセイ
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ組成物の細胞傷害性のリダイレクトを、エフェクターとしてのヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）および標的としてのＳＷ４８０結腸細胞等のＥｐＣＡＭ陽性ヒト癌細胞（またはＨＣＴ−１１６、Ｋａｔｏ ＩＩＩ、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＭＫＮ４５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＣＦ−７、ＭＴ３、ＳＫ−Ｂｒ−３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＯＶＣＡＲ３、およびＰＣ３から選択される）を使用することによって評価した。ＰＢＭＣを、スクリーニングした健康なドナーからＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって、全血または現地の血液バンクもしくはＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＩＶＴから得たリンパ球に富むバフィーコート調製物から単離した。ＰＢＭＣを、以下に考察するように、ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣＳ／２５ｍｍｏｌ／ｍＬ ＨＥＰＥＳ中に適切な細胞密度で再懸濁して、３７℃、５％ＣＯ２湿潤インキュベータ内で使用するまで培養した。非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３組成物（例えば、ＡＣ１４８４）、プロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３切断性ＰｒｏＴＩＡ組成物（例えば、ＡＣ１２７８＆ＡＣ１４７６）の細胞溶解活性を決定するために３つの異なるタイプの細胞傷害性アッセイ、すなわち乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイ、カスパーゼ３／７アッセイ、およびＦＡＣＳベースの分析を使用する。
５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイの非放射活性代替として、ＬＤＨ放出アッセイは、５１Ｃｒが放射活性アッセイにおいて放出されるのと全く同じように細胞溶解時に放出される安定な細胞質酵素ＬＤＨを定量的に測定する。テトラゾリウム塩を赤色のホルマザン産物に変換し、形成された色の量が溶解細胞数に比例する酵素アッセイによって、培養上清に放出されたＬＤＨを測定する。
ＳＷ４８０におけるプロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ組成物の細胞傷害性能を以下のように分析した：ＳＷ４８０およびＰＢＭＣの細胞密度を最初に、フェノールレッド不含ＲＰＭＩおよび５％ＦＣＳ（フェノールレッド不含培地および５％ＦＣＳは、Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射活性細胞傷害性アッセイキット（カタログ番号Ｇ１７８０）を使用する際にバックグラウンド吸光を最小限にするために使用した）で構成されるアッセイ培地中でそれぞれ、２．５×１０５細胞／ｍＬおよび１×１０６細胞／ｍＬに調節した。エフェクターの標的に対する比５：１を達成するために、ＰＢＭＣの１００μＬアリコートを、９６ウェル丸底プレートのアッセイウェルあたりＳＷ４８０細胞の８０μＬアリコートと同時培養した。プロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３組成物試料を、アッセイ培地で所望の用量濃度となるように希釈して２０μＬをそれぞれの実験ウェルに添加し、アッセイ全量を２００μＬとした。プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡを、４４０ｎＭで開始する１２ポイントの５倍連続希釈用量濃度として、０．０００００５〜４４ｎＭの最終用量範囲を得て評価した。非処置非切断型ＰｒｏＴＩＡ組成物を、１８４ｎＭで開始する１２ポイントの５倍連続希釈用量濃度として、０．０００００２〜１８．４ｎＭの最終用量範囲を得て分析した。エフェクターおよび標的細胞が放出する自然発生ＬＤＨ；標的細胞が放出する最大ＬＤＨ；溶解溶液の添加による容量補正対照、および培養培地バックグラウンドを含むアッセイ対照も同様にこの時点で設定した。標的が放出する自然発生ＬＤＨの場合、ＳＷ４８０細胞を、任意のプロテアーゼ処置または非処置組成物の非存在下、アッセイ培地２００μＬ中でインキュベートした。エフェクターが放出する自然発生ＬＤＨの場合、ＰＢＭＣを、任意のプロテアーゼ処置または非処置組成物の非存在下、アッセイ培地２００μＬ中でインキュベートした。標的細胞が放出する最大ＬＤＨは、１０倍溶解溶液２０μＬをＳＷ４８０（全量２２０μＬ）に添加して、溶解溶液の存在下で標的細胞を４５分間インキュベートし、その後ＬＤＨ測定のために上清を採取することによって決定した。容量補正対照は、１０倍溶解溶液２０μＬをアッセイ培地２００μＬに添加することによって得て、一方培養培地バックグラウンドはアッセイ培地２００μＬをインキュベートすることによって得た。プロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ組成物の実験ウェルならびに全てのそれぞれのアッセイ対照を含むプレートを、全て２回の反復で試験し、次に３７℃、５％ＣＯ２湿潤インキュベータ内で一晩インキュベートした。
細胞溶解の結果として上清に放出されたＬＤＨの量を、Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｙｔｏＴｏｘアッセイキットを使用して、製造元の説明書に従って測定した。簡単に説明すると、アッセイプレートの各ウェルの上清５０μＬを平底酵素用プレートの対応するウェルに移した。酵素用プレートの各ウェルに、復元された基質５０μＬを添加した。次にプレートに蓋をして遮光し、室温で３０分間インキュベートした。所望のインキュベーション期間の後、停止溶液５０μＬを各ウェルに添加して、４９０ｎｍでの吸光度を記録した。
次にデータ解析を以下のように実施した：
１．実験、Ｅ：Ｔ比５：１（平均）−培養培地バックグラウンド（平均）
ＳＷ４８０標的の自然放出（平均）−培養培地バックグラウンド（平均）
ＰＢＭＣエフェクターの自然放出（平均）−培養培地バックグラウンド（平均）
２．ＳＷ４８０標的の最大放出（平均）−容量補正対照（平均）
３．％特異的溶解＝［（実験−ＳＷ４８０標的の自然放出−ＰＢＭＣエフェクターの自然放出）／（ＳＷ４８０標的の最大放出−ＳＷ４８０標的の自然放出）］×１００
４．次にプロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの用量濃度を％特異的溶解に対してプロットし、半最大応答を生じるタンパク質濃度（ＥＣ５０）を、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、４パラメーターロジスティック回帰式から誘導した。
図２５に示すように、ＰＢＭＣの存在下で、プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡおよび非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ組成物にＳＷ４８０細胞を曝露すると、濃度依存的細胞傷害性用量曲線が得られ、プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡはインタクトな非処置ＰｒｏＴＩＡより活性が４８倍高かった（ＥＣ５０はそれぞれ、２．５ｐＭ対１２０ｐＭ）。
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの特異性を、ＬＤＨアッセイにおいてプロテアーゼ処置およびプロテアーゼ非処置ＰｒｏＴＩＡの細胞傷害活性を非コンジュゲート単一特異的抗ＥｐＣＡＭ ｓｃＦｖおよび単一特異的抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの細胞傷害活性と比較することによってさらに評価した。簡単に説明すると、ＰＢＭＣおよびＳＷ４８０細胞を、上記の９６ウェル丸底プレートにおいてアッセイ培地中、エフェクター対標的比５：１で同時培養した。プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、プロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、および非コンジュゲート単一特異的抗ＥｐＣＡＭ ｓｃＦｖプラス単一特異的抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ試料を全て、最終用量範囲０．００００５〜４５ｎＭの１２ポイントの５倍連続希釈液として、アッセイ全量２００μＬで評価した。実験ウェルと共に、上記の全ての関連するアッセイ対照も同様にアッセイプレートに含めて、プレートを３７℃、５％ＣＯ２湿潤インキュベータ内で一晩インキュベートした。
細胞溶解の結果として上清に放出されたＬＤＨの量を、Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｙｔｏＴｏｘアッセイキットを使用して測定し、結果を上記のように分析した。
予想されるように、ＳＷ４８０細胞をＰＢＭＣの存在下でプロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡに曝露すると、非処置ＰｒｏＴＩＡと比較して細胞傷害性の増強を示す。重要なことに、ＳＷ４８０標的細胞およびＰＢＭＣの存在下で単一特異的抗ＥｐＣＡＭ ｓｃＦｖと単一特異的抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを組み合わせても、いかなる細胞傷害活性も起こらなかった（図２６）。データは、標的化ａＥｐＣＡＭ部分を二特異的分子の形態でａＣＤ３エフェクター部分に連結させることが、細胞傷害性の誘導のために標的細胞の近位にＣＤ３陽性細胞を積極的に動員するために必要であることを示している。
本発明者らはまた、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡに存在する放出断片切断配列がそれ自身、腫瘍細胞によってまたは活性化ＣＤ３陽性Ｔ細胞によって放出されるプロテアーゼ（例えば、グランザイム）による切断に対して感受性がありうるという仮説を立てた。この仮説に取り組むために、放出断片を有しない非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１３５７）を構築し、プロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１２７８）と共に評価した。３つ全てのＰｒｏＴＩＡを、ＰＢＭＣのＳＷ４８０に対する比５：１を使用して、５倍連続希釈スキームで得られた０．００００５〜４５ｎＭの１２ポイント用量濃度範囲で試験するＬＤＨアッセイにおいて分析した。
図２７に示すように、非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡより活性が３２倍低い（ＥＣ５０は、２８８ｐＭ対８．９ｐＭ）。興味深いことに、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（すなわち、放出断片切断配列を有しないＰｒｏＴＩＡ）は、プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡより活性が３７１倍低い（ＥＣ５０は、３３００ｐＭ対８．９ｐＭ）。結果は、切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ分子内に含まれる放出断片が、腫瘍細胞および／または活性化ＣＤ３陽性Ｔ細胞によっておそらく放出されるプロテアーゼによる何らかの切断に対して感受性があることを示唆している。
放出断片を有しない非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４８４）ならびにプロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４７６）を、卵巣起源のヒト細胞株においても評価した。この実験において、ＰＢＭＣをＳＫ−ＯＶ−３卵巣細胞と共に５：１の比で混合し、３つ全てのＰｒｏＴＩＡ分子を上記のようにＬＤＨアッセイにおいて１２ポイントの５倍連続希釈用量曲線で試験した。予想されるように、ＳＫ−ＯＶ−３卵巣細胞株においてプロファイルを調べた３つのＰｒｏＴＩＡ分子の活性の傾向は、ＳＷ４８０結腸直腸細胞株において観察された傾向と類似であることが見出された。ＳＫ−ＯＶ−３細胞において、非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡより活性が４５倍低く（ＥＣ５０は、１３６ｐＭ対３ｐＭ）、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡより活性が６００倍低かった（ＥＣ５０は、１７９３ｐＭ対３ｐＭ）（図３０）。
（実施例７）フローサイトメトリーによって評価した細胞溶解
フローサイトメーターによる２４時間後の細胞溶解の分析に関して、ＥｐＣＡＭ陽性ＳＫ−ＯＶ−３標的細胞（またはＨＣＴ−１１６、Ｋａｔｏ ＩＩＩ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＣＦ−７、ＭＫＮ４５、ＭＴ３、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＳＫ−Ｂｒ−３、ＳＷ４８０、ＯＶＣＡＲ３、およびＰＣ３細胞株から選択される標的細胞）を、蛍光膜色素ＣｅｌｌＶｕｅ Ｍａｒｏｏｎ色素（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号８８−０８７０−１６）によって、製造元の説明書に従って標識する。あるいは、ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＭＩＮＩ２６およびＰＫＨ２６ＧＬ）も同様に使用することができる。簡単に説明すると、ＳＫ−ＯＶ−３細胞をＰＢＳで２回洗浄後、ＣｅｌｌＶｕｅ Ｍａｒｏｏｎ標識キットに提供された希釈剤Ｃの０．１ｍＬ中で２×１０６個の細胞に再懸濁する。別個の試験管で、ＣｅｌｌＶｕｅ Ｍａｒｏｏｎ色素２アイクロＬを希釈液Ｃ ０．５ｍＬと混合した後、０．１ｍＬをＳＫ−ＯＶ−３細胞懸濁液に添加する。細胞懸濁液およびＣｅｌｌＶｕｅ Ｍａｒｏｏｎ色素を混合して、室温で２分間インキュベートした。次にＦＣＳ ０．２ｍＬを添加して標識反応を停止させる。標識細胞を完全細胞培養培地（１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）で２回洗浄し、生存細胞の総数をトリパンブルー排除によって決定する。ウェルあたり全量２００μＬでエフェクター対標的比５：１の場合、９６ウェル丸底プレートにおいてウェルあたり１×１０５個のＰＢＭＣを２×１０４個のＣｅｌｌＶｕｅ Ｍａｒｏｏｎ標識ＳＫ−ＯＶ−３細胞と共に、プロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ試料の表記の用量範囲濃度の非存在下または存在下で同時培養する。２４時間後、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＡＴ１０４）によって採取して、２％ＦＣＳ／ＰＢＳで洗浄した。Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で細胞を獲得する前に、生細胞（７−ＡＡＤ陰性）と死細胞（７−ＡＡＤ陽性）とを識別するために、細胞を、２．５μｇ／ｍＬ ７−ＡＡＤ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−６９９３−５０）を添加した２％ＦＣＳ／ＰＢＳ １００μＬ中に再懸濁する。ＦＡＣＳデータを、ｇｕａｖａＳｏｆｔソフトウェア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって分析し、７−ＡＡＤ陽性／ＣｅｌｌＶｕｅ Ｍａｒｏｏｎ陽性細胞数をＣｅｌｌＶｕｅ Ｍａｒｏｏｎ陽性細胞の総数で除算することによって、死滅した標的細胞の百分率を計算する。
ＰｒｏＴＩＡ濃度に対する細胞傷害性百分率の用量応答死滅曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して４パラメーターロジスティック回帰式によって分析し、半最大細胞傷害性百分率を誘導するＰｒｏＴＩＡの濃度をこのように決定する。
フローサイトメトリーを利用する細胞傷害性の結果は、ＬＤＨアッセイで得られた結果と一致すると予想される。ＳＫ−ＯＶ−３細胞を、ＰＢＭＣの非存在下でプロテアーゼ切断型および非切断型抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ組成物に曝露しても、効果を有しないと予想される。同様に、ＰＢＭＣは、標的細胞がなければＰｒｏＴＩＡの存在下で活性化されないと予想される。これらの結果は、細胞傷害活性に関してＰＢＭＣを刺激するためには、ＰｒｏＴＩＡ組成物が標的細胞の表面上に集合する必要があることを示すと予想される。ＰＢＭＣおよび標的細胞の存在下では、プロテアーゼによって前処置したまたは非処置のＰｒｏＴＩＡによる濃度依存的細胞傷害効果が存在するであろう。さらに、ＰＢＭＣの存在下で非処置ＰｒｏＴＩＡ（プロテアーゼなし）にＳＫ−ＯＶ−３細胞を曝露すると、プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡ組成物と比較して細胞傷害性の低減を示すことを、結果が示すと予想される。
細胞傷害性実験の上記の組を、抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ組成物および抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ組成物などの他の二特異的ＰｒｏＴＩＡ組成物について実施する。これらの例では、ＣＤ１９およびＨＥＲ２陽性標的細胞を、ＥｐＣＡＭ陽性細胞の代わりに使用する。ＣＤ１９発現細胞の例としての細胞株には、ＮＡＭＬ−６、Ｂｌｉｎ−１、ＳＫＷ６．４、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、およびＢＪＡＢが含まれるがこれらに限定されるわけではない。抗ＨＥＲ２標的化の場合、ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ４７４、ＨＣＣ−１９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＪＩＭＴ−１、ＨＣＴ−１１６などのＨＥＲ２陽性細胞株を使用する。
（実施例８）抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼ誘発免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のＴ細胞活性化マーカーアッセイ
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ誘導活性化マーカー（ＣＤ６９およびＣＤ２５）を測定するために、アッセイウェルあたり、１×１０５個のＰＢＭＣまたは精製ＣＤ３＋細胞を、２×１０４個のＳＫ−ＯＶ−３またはＯＶＣＡＲ３細胞（すなわち、エフェクター対標的比５：１）と共に、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの存在下、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０中で９６ウェル丸底プレートにおいて最終全量２００μＬで同時培養した。３７℃、５％ＣＯ２湿潤インキュベータ内で２０時間インキュベーション後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）中のＰＥＣｙ５−コンジュゲート抗ＣＤ４、ＡＰＣ−コンジュゲート抗ＣＤ８、ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ２５、およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ６９（抗体は全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄから得た）によって４℃で染色し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で獲得した。
予想されるように、ＳＫ−ＯＶ−３卵巣細胞株においてプロファイルを調べた３つのＰｒｏＴＩＡ分子のＴ細胞活性化マーカーの発現傾向は、ＬＤＨ細胞傷害性アッセイによって観察されたものと類似であることが見出された。ＳＫ−ＯＶ−３細胞を使用して、非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによるＰＢＭＣのＣＤ８およびＣＤ４集団におけるＣＤ６９の活性化は、プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡより活性が約７０倍低く（ＥＣ５０は、ＣＤ８＋に関して５４０ｐＭ対６．７ｐＭ、ＥＣ５０は、ＣＤ４＋に関して４３０ｐＭ対６．３ｐＭ）、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡより活性が約１０００倍低かった（ＥＣ５０は、ＣＤ８＋に関して８７００ｐＭ対６．７ｐＭ、ＥＣ５０は、ＣＤ４＋に関して６０００ｐＭ対６．３ｐＭ）（図４２）。
同様に、非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによるＰＢＭＣ細胞のＣＤ８およびＣＤ４集団におけるＣＤ６９およびＣＤ２５両方の活性化は、プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡより活性が約６０倍低く、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡより活性が約１３００倍低かった（図４３）。
作用機序がＣＤ３＋細胞を介することを確認するために、ＳＫ−ＯＶ−３細胞を標的細胞として使用して、非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる精製ＣＤ３＋細胞のＣＤ８およびＣＤ４集団におけるＣＤ６９の活性化は、プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡより活性が約１００倍低く（ＥＣ５０は、ＣＤ８＋に関して２６０ｐＭ対２．４ｐＭ、ＥＣ５０は、ＣＤ４＋に関して２４０ｐＭ対２．２ｐＭ）、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡより活性が約２０００倍低かった（ＥＣ５０は、ＣＤ８＋に関して５０００ｐＭ対２．４ｐＭ、ＥＣ５０は、ＣＤ４＋に関して５０００ｐＭ対２．２ｐＭ）（図４４）。非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる精製ＣＤ３＋細胞のＣＤ８およびＣＤ４集団におけるＣＤ６９およびＣＤ２５両方の活性化は、プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡより活性が約１００倍低く、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡより活性が約２０００倍低かった（図４５）。
ＯＶＣＡＲ３細胞を使用して、非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる精製ＣＤ３＋細胞のＣＤ８およびＣＤ４集団におけるＣＤ６９の活性化は、プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡより活性が約１０倍低く（ＥＣ５０は、ＣＤ８＋に関して１４ｐＭ対１．８ｐＭ、ＥＣ５０は、ＣＤ４＋に関して１６ｐＭ対１．９ｐＭ）、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡより活性が約１０００倍低かった（ＥＣ５０は、ＣＤ８＋に関して２０００ｐＭ対１．８ｐＭ、ＥＣ５０は、ＣＤ４＋に関して１５００ｐＭ対１．９ｐＭ）（図４６）。非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる精製ＣＤ３＋細胞のＣＤ８およびＣＤ４集団におけるＣＤ６９およびＣＤ２５両方の活性化もまた、プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡより活性が約１０倍低く、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡもまた、プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡより活性が約１０００倍低かった。これらの結果は、非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡが、アッセイの際に、ＳＫ−ＯＶ−３細胞と比較してＯＶＣＡＲ３細胞の存在下ではより大きい程度に切断されたことを示唆している（図４７）。
標的細胞の存在下で抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによるＴ細胞の活性化のさらなる証拠として、ＣＤ６９およびグランザイムＢの誘導を測定した。ＰＢＭＣ（１×１０５個）を、アッセイウェルあたり２×１０４個のＯＶＣＡＲ３細胞と共に（すなわち、エフェクター対標的比５：１）、９６ウェル丸底プレートにおいて最終全量２００μＬ中、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの存在下で同時培養した。３７℃、５％ＣＯ２湿潤インキュベータ内で２０時間インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）中で、ＰＥＣｙ５コンジュゲート抗ＣＤ４、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ８、およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ６９（抗体は全てＢｉｏＬｅｇｅｎｄから得た）によって４℃で染色した。細胞を固定して０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／ＰＢＳによって透過性にした後、ＦＡＣＳ緩衝液中でＰＥコンジュゲート抗グランザイムＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＭＨＧＢ０４）によって染色した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液によって洗浄した後、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターで獲得した。
予想されるように、ＣＤ６９およびグランザイムＢの両方が、ＯＶＣＡＲ３細胞の存在下でＰｒｏＴＩＡ活性化Ｔ細胞において発現される。さらに、ＣＤ４＋細胞と比較してより大きい画分のＣＤ８＋細胞が、グランザイムＢを発現する（図４８および４９）。
（実施例９）抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼ誘発免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の薬物動態特性
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの薬物動態特性をＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて分析した。群１のマウス３匹に４ｍｇ／ｋｇのプロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１２７８）を静脈内に注射し、群２のマウス３匹に非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１２７８）を静脈内注射した。適切な時点で、血液をヘパリンリチウム処理試験管に収集して、血漿へと処理した。プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ動物に関して、血漿の収集時点は、投薬前、２分、１５分、３０分、２時間、４時間、８時間、および２４時間であった。非処置ＰｒｏＴＩＡマウスに関して、血漿の収集時点は、投薬前、４時間、８時間、２４時間、２日、４日、６日、および７日であった。プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡの血漿中濃度を、プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡを標準物質としてｒｈＥｐＣＡＭ／ビオチン化抗ＨｉｓタグサンドイッチＥＬＩＳＡによって定量し、非処置ＰｒｏＴＩＡの血漿中濃度は、非切断型ＰｒｏＴＩＡを標準物質としてｒｈＥｐＣＡＭ／ビオチン化抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡによって定量した。
簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、カタログ番号４４２４０４）を、０．１μｇ／１００μＬ／ウェルのｒｈＥｐＣＡＭ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＥＨＨ１０４１１１）によってコーティングした。４℃で一晩インキュベーション後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄して、３％ＢＳＡによって室温で１時間ブロックした。プレートを再度洗浄後、プロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ標準物質の用量範囲、適切な品質対照、および血漿試験試料を適切に添加した。プレートを室温で１時間振盪させながらインキュベートして、ＰｒｏＴＩＡ標準物質、品質対照、および試験試料を、プレート上にコーティングされたｒｈＥｐＣＡＭに結合させた。非結合成分を数回の洗浄によって除去した。プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡの検出に関して、ビオチン化抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＡＭ０５０）を、０．２μｇ／１００μＬで添加して、プレートを室温で１時間インキュベートした。プロテアーゼ非処置ＰｒｏＴＩＡを検出するために、ビオチン化抗ＸＴＥＮ抗体（Ａｍｕｎｉｘ所有の抗体）を、０．１μｇ／１００μＬで添加して、プレートを室温で１時間インキュベートした。非結合のビオチン化試薬を洗浄して除去した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２１１３０）を、１：３０，０００希釈で添加して、プレートを室温で１時間インキュベートした。数回洗浄後、ＴＭＢ基質をそれぞれのウェルに添加した。望ましい色の強度に達した後、０．２Ｎ硫酸を添加して反応を停止させ、分光光度計を使用して４５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ）を測定した。色の強度は、それぞれのｒｈＥｐＣＡＭ／ビオチン化抗ＨｉｓタグおよびｒｈＥｐＣＡＭ／ビオチン化抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡによって捕捉されたプロテアーゼ処置および非処置ＰｒｏＴＩＡの濃度に比例する。血漿試料に存在するＰｒｏＴＩＡの濃度は、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用して、適切なプロテアーゼ処置または非処置ＰｒｏＴＩＡ標準曲線に対して決定した。プロテアーゼ切断型および非切断型抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの終末半減期（Ｔ１／２）の薬物動態計算は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって実施した。
予想と一致して、プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、約３．５時間の短い消失半減期（Ｔ１／２）を有するが、プロテアーゼ非処置ＰｒｏＴＩＡ（ＸＴＥＮ付着）は、３２時間のより長いＴ１／２（図２８）を有し、インタクトなＰｒｏＴＩＡ分子が、切断型分子より有意に長い半減期（少なくとも９倍長い）を有することを確認する。
（実施例１０）早期処置ＳＷ４０モデルにおける抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼ誘発免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の抗腫瘍特性
ＴおよびＢ細胞の欠損、ならびにナチュラルキラー細胞の障害によって特徴付けられる免疫欠損ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏ効能実験を実施した。マウスを無菌的な標準的な環境条件で維持し、ＵＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣＡｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ））ガイドラインに従って実験を実施した。プロテアーゼ処置およびプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１２７８）の効能を、ヒトＳＷ４８０癌異種移植モデルを使用して評価した。簡単に説明すると、０日目に、１群５匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの６個のコホートに、１×１０７個のヒトＰＢＭＣを１×１０７個のＳＷ４８０細胞と混合して右脇腹に皮下注射した。ＳＷ４８０／ＰＢＭＣの接種の１時間後、コホート１にビヒクル（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０）、コホート２および３にそれぞれ、０．０４ｍｇ／ｋｇおよび０．４ｍｇ／ｋｇプロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、コホート４および５に、０．１ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、ならびにコホート６に１ｍｇ／ｋｇプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡを注射した。コホート１〜５に１日目から４日目まで毎日、さらなる４用量を投与したが、コホート６には行わなかった。
腫瘍を、予定される３５日の間、キャリパーを使用して２つの垂直方向の径によって週に２回測定し、腫瘍の体積を（幅２×長さ）／２の式に当てはめて計算した。体重、全身の外観、ならびに急発作、震え、無気力、過敏反応、立毛、努力呼吸／頻呼吸、体色変化、および腫瘍の潰瘍化、ならびに死亡などの臨床観察も同様に、処置関連毒性の測定として厳密にモニターした。試験の評価項目は、腫瘍体積１２００２０００ｍｍ３または３５３６日生存のどちらか早いほうとして定義された。腫瘍増殖阻害指数の百分率（％ＴＧＩ）を、式（（ＰＢＳビヒクル対照の平均腫瘍体積−ＰｒｏＴＩＡ処置の平均腫瘍体積）／ＰＢＳビヒクル対照の平均腫瘍体積）×１００に当てはめて処置群のそれぞれに関して計算した。％ＴＧＩが６０％以上の処置群は、治療的に活性であると考えられる。
２６日目に、ヒトエフェクター細胞の存在下でＰＢＳビヒクルによって処置したコホート１のマウスは、腫瘍進行を阻害せず、ヒトエフェクター細胞単独がそれ自体、抗腫瘍効果を誘発できないことを証明した。ヒトエフェクター細胞の存在下でのプロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの０．０４ｍｇ／ｋｇおよび０．４ｍｇ／ｋｇによる処置（それぞれ、コホート２および３）は、腫瘍増殖の抑制に関して明白な用量依存的応答を示し、０．４ｍｇ／ｋｇ用量群（％ＴＧＩ＝８５８４％）は、０．０４ｍｇ／ｋｇ用量群（％ＴＧＩ＝６４７８％）より大きい保護を提供した。重要なことに、ヒトエフェクター細胞の存在下での抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの１ｍｇ／ｋｇ（コホート５）による処置もまた、モル等量の０．４ｍｇ／ｋｇプロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡ（コホート３）とほぼ同程度に腫瘍の増殖を阻害した（％ＴＧＩ＝７８８３％）。データは、１ｍｇ／ｋｇで、十分な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡが、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍環境でプロテアーゼによって、より活性な非ＸＴＥＮ化抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３部分へと有効に切断され、観察された効能を生じたことを示唆している。０．１ｍｇ／ｋｇプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのコホート４において腫瘍退縮がなかったこと（％ＴＧＩ＝５８％）は、この用量では、顕著な腫瘍退縮を誘導するには不十分な非ＸＴＥＮ化抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３部分が放出されたことを示唆した。抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの１回の１ｍｇ／ｋｇ用量を供されたコホート６は、対照群と比較して抑制された腫瘍増殖を示したにもかかわらず、治療活性の閾値（％ＴＧＩ＝４６５２％）に達しなかった（図３１）。結果は、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡが、ＳＷ４８０の腫瘍環境で有効に切断されて腫瘍の進行を阻害できること、および薬物濃度プラス曝露されることが薬物の効能を決定するための重要な要因であることを示唆している。
特に、全てのＰｒｏＴＩＡ処置群およびビヒクル対照において有意な体重減少が観察されず、このことは全ての処置が良好に忍容されることを示した（図３２）。
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの抗腫瘍活性の特異性を、上記の試験と非常に類似しているが、処置群あたりのマウスを８匹にしてＳＷ４８０／ＰＢＭＣを接種したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて実施する。この試験において、ＰＢＳビヒクル対照、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１３５７またはＡＣ１４８４）、二特異的陰性対照ＰｒｏＴＩＡ（ＣＤ３に対して結合活性を有するがＥｐＣＡＭに対しては有しない）、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、またはプロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる早期処置を、ＳＷ４８０／ＰＢＭＣ接種後１時間で開始する。上記の試験で決定したプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの１ｍｇ／ｋｇ用量濃度をこの試験で使用して、二特異的陰性対照ＰｒｏＴＩＡ、非切断性およびプロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ試験物質を全て、等モル濃度で静脈内投与する。腫瘍の体積、体重、および臨床観察を３５日間、週に２回モニターする。
ヒトエフェクター細胞の存在下でのＰＢＳビヒクルおよび二特異的対照ＰｒｏＴＩＡによる処置は、抗腫瘍効果を誘導しないと予想され、ヒトエフェクター細胞単独または非ＥｐＣＡＭ標的化部分のいずれも抗腫瘍効果を誘発できないことを証明する。これら両方の処置群のマウスは、試験評価項目（３５日または腫瘍体積２０００ｍｍ３）を満たすと予想される。ヒトエフェクターの存在下でのプロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの毎日５回投薬は、腫瘍増殖の抑制を誘導すると予想される。非切断性ＰｒｏＴＩＡの等モル濃度による処置は、腫瘍の増殖を遅らせると予想されるが、それがプロテアーゼ切断の基質を含まないことから、その程度は、放出断片を担持する非処置ＰｒｏＴＩＡによって示されるより非常に小さいと予想される。
（実施例１１）確立された結腸直腸腫瘍モデルにおける抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼ誘発免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の抗腫瘍特性
確立された結腸直腸腫瘍モデルにおいて、ＳＷ４８０およびＨＣＴ−１１６腫瘍細胞を、０日目にＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ）またはＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ．ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスに個別に移植する。（ＮＯＧまたはＮＳＧマウスは、ＩＬ−２Ｒγ変異を担持するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスであり、それによってマウスにＴ、Ｂ、およびＮＫ細胞の欠如、マクロファージの機能障害、樹状細胞の機能障害、および補体活性の低減がもたらされる）。次に、ヒトＰＢＭＣを、３〜１０日の間のいずれかに静脈内または腹腔内に導入する。ＳＷ４８０およびＨＣＴ−１１６腫瘍の体積が１５０ｍｍ３に達すると、プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、インタクトなプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、および非切断性型抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる処置を毎日５回用量または１回用量として開始する。プロテアーゼ切断型およびプロテアーゼ非処置ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４７６）の両方によって、確立されたＳＷ４８０およびＨＣＴ−１１６腫瘍の低減または根治が起こり、プロテアーゼ非処置ＰｒｏＴＩＡは経時的に良好な治療的曝露を与え、その結果プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡより有効な抗腫瘍効果およびより良好な安全性プロファイルが得られると予想される。
非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４８４）は、腫瘍の増殖を遅らせると予想されるが、それが腫瘍環境内でプロテアーゼ切断のための基質配列を含まないことから、その程度は、放出断片を担持するプロテアーゼ非処置ＰｒｏＴＩＡによって示されるより非常に小さいと予想される。
（実施例１２）刺激された正常で健康なヒトＰＢＭＣならびにインタクトなおよびプロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡを使用する、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインの細胞測定ビーズアレイ分析
細胞ベースのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＴ細胞関連サイトカインの放出を刺激する能力を、インタクトな抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ対切断型抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの能力の安全性評価として、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮガンマを含むサイトカインパネルを、プロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ試料によって刺激した培養ヒトＰＢＭＣの上清に関して、細胞測定ビーズアレイ（ＣＢＡ）を使用して分析した。抗ヒトＣＤ３抗体、ＯＫＴ３を陽性対照として使用し、非処置ウェルを陰性対照とした。
簡単に説明すると、ＯＫＴ３（０、１０ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭ）、ならびにプロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１２７８、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭ、および２０００ｎＭ）を、９６ウェル平底プレート上で、ウェルをバイオセーフティフード内で一晩蒸発させることによって、ドライコーティングした。次に、ウェルをＰＢＳで１回軽く洗浄し、１×１０６個のＰＢＭＣ ２００μＬを各ウェルに添加した。次にプレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、組織培養上清を各ウェルから収集して、バリデートされた市販のＣＢＡキット（ＢＤ ＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキット、カタログ番号５５１８０９）を使用して、フローサイトメトリーによって製造元の説明書に従って、放出されたサイトカインに関して分析した。
結果
検出されたサイトカインレベルの未加工データを表１１に提示し、図３３〜３にグラフで描写する。
予想されたように、ＯＫＴ３は、評価した全てのサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ）の強い分泌を誘導したが、非処置ウェルは誘導せず、これによりＣＢＡサイトカインアッセイの成績を確認した。プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによる刺激は、特に試験したサイトカインの全てに関して１００ｎＭより高い濃度で有意なサイトカイン発現を誘発した。これに対し、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファ、およびＩＦＮ−ガンマのベースラインレベルは、インタクトな非切断型抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ分子が１０〜２０００ｎＭの濃度範囲で刺激剤であったときに検出された。プロテアーゼ非処置ＰｒｏＴＩＡによって誘導すると、適切なレベルのＩＬ−４が検出されたが、ＩＬ−４レベルは、プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡについて観察されたレベルほど高くなかった（図３３〜３５）。これらのデータは、ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３部分が組成物から放出されているプロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡと比較して、インタクトなＰｒｏＴＩＡ組成物のＸＴＥＮポリマーが、かなりの遮蔽効果をもたらし、ＰＢＭＣ刺激サイトカイン応答を妨害することを示唆している。
（実施例１３）早期処置ＨＣＴ−１１６モデルにおける抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼ誘発免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の抗腫瘍特性
Ｉｎ ｖｉｖｏ効能実験を、ＴおよびＢ細胞の欠損、ならびにナチュラルキラー細胞の障害を特徴付けられる、免疫欠損ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて実施した。マウスを、無菌的な標準的な環境条件で維持し、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）ガイドラインに従って実験を実施した。プロテアーゼ処置およびプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４７６）の効能を、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（すなわち、放出断片切断配列を有しないＰｒｏＴＩＡ、その例はＡＣ１４８４である）と共に、ヒトＨＣＴ−１１６結腸直腸癌異種移植モデルを使用して評価した。簡単に説明すると、０日目に、１群５匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの４つのコホートに、５×１０６個のヒトＰＢＭＣを、５×１０６個のＨＣＴ−１１６細胞と混合して右脇腹に皮下注射した。ＨＣＴ−１１６／ＰＢＭＣ接種の１時間後、等モル投薬に基づいて、コホート１に、ビヒクル（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０）、コホート２に０．２１ｍｇ／ｋｇプロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、コホート３に、０．５ｍｇ／ｋｇプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、およびコホート４に０．４９ｍｇ／ｋｇ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡを注射した。コホート１〜４に全て、１〜４日まで毎日投与される４つのさらなる用量を供した。
腫瘍を、予定される３５日の間、キャリパーを使用して２つの垂直方向の径によって週に２回測定し、腫瘍の体積を（幅２×長さ）／２の式に当てはめて計算した。体重、全身の外観、ならびに急発作、震え、無気力、過敏反応、立毛、努力呼吸／頻呼吸、体色変化、および腫瘍の潰瘍化、ならびに死亡などの臨床観察も同様に、処置関連毒性の測定として厳密にモニターした。試験の評価項目は、腫瘍体積１２００２０００ｍｍ３または３５日での生存のどちらか早いほうとして定義された。腫瘍増殖阻害指数の百分率（％ＴＧＩ）を、式（（ＰＢＳ対照の平均腫瘍体積−ＰｒｏＴＩＡ処置の平均腫瘍体積）／ＰＢＳ対照の平均腫瘍体積）×１００に当てはめて処置群のそれぞれに関して計算した。％ＴＧＩが６０％以上の処置群は、治療的に活性であると考えられた。
１８３５日目に、ヒトエフェクター細胞の存在下でビヒクルによって処置したコホート１のマウスは、腫瘍進行を阻害せず、試験終了時の群の平均腫瘍体積は１８２３ｍｍ３であり、ヒトエフェクター細胞単独がそれ自体、抗腫瘍効果を誘発できないことを証明した。ヒトエフェクター細胞の存在下でのプロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの０．２１ｍｇ／ｋｇ（コホート２）による処置は、腫瘍増殖の強い抑制を示し、５匹中２匹のマウスが、１８日目で測定可能な腫瘍体積を示さず、完全な腫瘍退縮を示した。しかし、このコホートでは腫瘍の再増殖および進行が２５日目以降に観察され、試験終了時に５匹のマウス全てが腫瘍の負荷を担持し、平均腫瘍体積は２９６ｍｍ３であった。重要なことに、ヒトエフェクター細胞の存在下でインタクトな抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの０．５ｍｇ／ｋｇ（コホート３）による処置もまた、強い腫瘍増殖の阻害を与えた。実際にコホート３のマウス５匹中４匹が１８日目に完全な腫瘍退縮を示した。一方でマウス２匹は３５日目になおも完全な縮小を保持し、試験終了時のコホートの平均腫瘍体積は４８ｍｍ３であった。重要なことに、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの０．４９ｍｇ／ｋｇ用量を供したコホート４は、コホート２および３ほど有効に腫瘍進行のいかなる持続的な阻害も誘導せず、このコホートではマウス５匹中５匹が有意な腫瘍負荷を残した。コホート４は、１８．３５日で試験を終了し、群の平均腫瘍体積は７４８ｍｍ３であった。プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの０．２１ｍｇ／ｋｇ（コホート２）およびインタクトな抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの０．５ｍｇ／ｋｇ（コホート３）の両方がそれぞれ、８４％および９７％のＴＧＩを有し、治療的に活性であると考えられる。非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、ＴＧＩ ５９％であり、治療的に不活性であると考えられる。予想されるように、インタクトな抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの群の平均腫瘍体積は、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡコホートの体積とは有意に異なることが見出されている（ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、ｐ＝０．００１６）。明らかに、インタクトな抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡコホートの群の平均腫瘍体積はまた、プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡコホートとも有意に異なることが見出されている（ｐ＝０．００２）。結果は、０．５ｍｇ／ｋｇでは、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの有意な量が、ｉｎ ｖｉｖｏのＨＣＴ−１１６腫瘍環境に存在するプロテアーゼによって有効に切断されて非常に活性な非ＸＴＥＮ化抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３部分となり、顕著な腫瘍退縮が観察されたことを示唆している。この仮説は、放出断片基質を欠如する非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ分子では持続的な腫瘍退縮特性がなかったことにより、大いに裏付けされる（図３８）。重要なことに、データはまた、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによって、プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡより良好な治療的曝露が得られ、したがってより持続的な腫瘍退縮効果が報告されたことを示唆する。
注目すべきは、全てのＰｒｏＴＩＡ処置群およびビヒクル対照に、有意な体重減少が観察されず、全ての処置が全体的に良好に忍容されたことを示した（図３９）。
（実施例１４）精製ＣＤ３陽性Ｔ細胞の存在下での抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼ誘発免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の細胞傷害性アッセイ
ＰｒｏＴＩＡ分子の細胞傷害活性がＣＤ３陽性Ｔ細胞によって媒介されることを証明するために、放出断片を有しない非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４８４）、ならびにプロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４７６）を、精製ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞の存在下でＳＫ−ＯＶ−３およびＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣細胞株においてさらに評価した。精製ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞は、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴから購入し、ＭａｇＣｅｌｌｅｃｔヒトＣＤ３＋Ｔ細胞単離キットを使用して健康なドナーの全血から陰性選択により単離した。この実験において、精製ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞を、ＳＫ−ＯＶ−３またはＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞と５：１の比で混合して、３つ全てのＰｒｏＴＩＡ分子を、上記のＬＤＨアッセイにおいて、１２ポイントの５倍連続希釈用量曲線で試験した。予想されるように、ＳＫ−ＯＶ−３でプロファイルを調べた３つのＰｒｏＴＩＡ分子の活性の傾向は、ＰＢＭＣの存在下でのＳＫ−ＯＶ−３の分析で観察されたものと類似であることが見出された（図３０）。ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞によるＳＫ−ＯＶ−３卵巣細胞の細胞傷害性死滅において、非処置ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡより活性が５６倍低く（ＥＣ５０は、１３４ｐＭ対２．４ｐＭ）、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡより活性が１０００倍超低い（ＥＣ５０は、２６６０ｐＭ対２．４ｐＭ）（図４０）。ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞によるＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞の細胞傷害性死滅において、非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡより活性がわずか２倍低く（ＥＣ５０は、０．７ｐＭ対０．３ｐＭ）、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡより活性が２８７倍低い（ＥＣ５０は、８６ｐＭ対０．３ｐＭ）（図４１）。結果は、ＰｒｏＴＩＡ分子の細胞傷害活性が実際に、ＣＤ３陽性Ｔ細胞によって媒介されること、およびアッセイ混合物における腫瘍細胞および／または活性化ＣＤ３陽性Ｔ細胞から放出されると仮定されるプロテアーゼに対する、切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ分子内に含まれる放出断片の感受性が、細胞株の間で異なる可能性があることを証明した。
（実施例１５）抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼ誘発免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のＴ細胞活性化マーカーおよびサイトカイン放出アッセイ
サイトカインの抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ誘導発現を測定するために、アッセイウェルあたり１×１０５個の精製ＣＤ３＋細胞を、２×１０４個のＳＫ−ＯＶ−３細胞（すなわち、エフェクター対標的比５：１）と共に、９６ウェル丸底プレートにおいて最終全量２００μＬで抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの存在下で同時培養した。３７℃、５％ＣＯ２湿潤インキュベータ内で２０時間インキュベーション後、細胞上清をサイトカイン測定のために採取した。このアッセイはまた、ＨＣＴ−１１６、Ｋａｔｏ ＩＩＩ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＣＦ−７、ＭＫＮ４５、ＭＴ３、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＳＫ−Ｂｒ−３、ＳＷ４８０、ＯＶＣＡＲ３、およびＰＣ３細胞株から選択される他の標的細胞ならびに精製ＣＤ３＋細胞の代わりにＰＢＭＣについても実施することができる。
細胞培養上清に分泌されたインターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−アルファおよびインターフェロン（ＩＦＮ）−ガンマのサイトカイン分析を、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン細胞測定ビーズアレイ（ＣＢＡ）キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５０７４９）を使用して、製造元の説明書に従って定量した。ＰｒｏＴＩＡの非存在下では、精製ＣＤ３＋細胞からバックグラウンドを超えるサイトカイン分泌は予想されない。ＥｐＣＡＭ陽性標的細胞および精製ＣＤ３＋細胞の存在下でのＰｒｏＴＩＡは、Ｔ細胞を活性化して、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−アルファなどのＴｈ１サイトカインの比率が高いＴ細胞サイトカインパターンを分泌すると予想される。
予想されるように、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、評価した全てのサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ）の強い分泌を誘導した（図５０〜５２を参照されたい）。ＳＫ−ＯＶ−３細胞およびプロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡによって精製ＣＤ３＋細胞を刺激すると、特に試験したサイトカインの全てに関して２０ｐＭより高い濃度で有意なサイトカイン発現を誘発した。これに対し、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマのベースラインレベルは、インタクトな非切断型抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ分子を８〜２００ｐＭ（ＥＣ５０は４．３ｎＭ）の濃度範囲で使用した場合に検出された。さらに、試験した全てのサイトカインのベースラインレベルは、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ分子を４０ｐＭ〜１ｎＭの濃度範囲で使用した場合に検出された。これらのデータは、インタクトなＰｒｏＴＩＡ組成物のＸＴＥＮポリマーが、かなりの遮蔽効果をもたらし、ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３部分が組成物から放出されるプロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡと比較してＣＤ３＋Ｔ細胞刺激サイトカイン応答を妨害することを示唆する。
（実施例１６）抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼ誘発免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のＣＤ３結合特異性
ＰｒｏＴＩＡは二特異的標的化組成物であることから、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ組成物の結合能をヒトＣＤ３に対する結合親和性に関しても評価した。これは、ＣＤ３εδ／ペルオキシダーゼコンジュゲートプロテインＬサンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した。このＥＬＩＳＡにおいて、組換えヒトＣＤ３（ｒｈＣＤ３εδ）（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭａｒｔ、カタログ番号ＣＤ３Ｅ＆ＣＤ３Ｄ−２１９Ｈ）を９６ウェル平底プレートに０．０２５μｇ／１００μＬの濃度でコーティングした。４℃で一晩インキュベーション後、アッセイプレートを洗浄して、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によって室温で１時間ブロックした。プレートを再度洗浄後、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４８４）、プロテアーゼ処置およびプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４７６）の用量範囲を導入した。３つ全てのバージョンのＰｒｏＴＩＡに関して利用した用量範囲は、開始濃度１００ｎＭから１：６倍連続希釈スキームによって達成される０．００２〜１００ｎＭであった。プレートを室温で１時間振盪させながらインキュベートして、非切断性、プロテアーゼ切断型、およびプロテアーゼ非処置ＰｒｏＴＩＡを、プレート上にコーティングしたｒｈＣＤ３εδに結合させた。非結合成分を洗浄ステップで除去して、ペルオキシダーゼコンジュゲートプロテインＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３２４２０）の０．０５μｇ／１００μＬを添加した。適切なインキュベーション期間の後、任意の非結合試薬を洗浄ステップによって除去した後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を各ウェルに添加した。所望の色強度に達した後、０．２Ｎ硫酸を添加して反応を停止させ、分光光度計を使用して４５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ）を測定した。色の強度は、ｒｈＣＤ３εδ／プロテインＬサンドイッチＥＬＩＳＡによって捕捉された非切断性、プロテアーゼ処置、および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの濃度に比例する。産生された色の強度（測定されたＯＤ）をタンパク質濃度に対してプロットし、半最大応答を生じる非切断性、プロテアーゼ切断型、および非切断型抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの濃度（ＥＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して４パラメーターロジスティック回帰式から誘導した。
結果：図５３に示すように、プロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３二特異的ＰｒｏＴＩＡ分子と類似の結合活性を有し、それぞれ、１８００ｐＭおよび２２００ｐＭのＥＣ５０を担持した。プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡは、インタクトなプロテアーゼ非処置二特異的分子または非切断性ＰｒｏＴＩＡ分子と比較してｒｈＣＤ３εδリガンドに関して３１０ｐＭのＥＣ５０で最も強い結合活性を有した。ＸＴＥＮ８６４ブロッキング部分が抗ＣＤ３ｓｃＦｖ部分の直後に位置することから、ＸＴＥＮ８６４は、そのリガンドに対する非切断型抗ＣＤ３実体の結合に、ＰｒｏＴＩＡの切断型および放出された抗ＣＤ３ｓｃＦｖ部分のＣＤ３リガンドへの結合と比較して約５．８倍の妨害をもたらす。
（実施例１７）抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼ誘発免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の結合特異性
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４７６）の結合特異性を、標的抗原／ビオチンコンジュゲートプロテインＬサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、対照ＰｒｏＴＩＡ組成物抗ＣＥＡ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４３２）および抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４０８）と共に評価した。抗ＣＥＡ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４３２）および抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４０８）は両方とも、標的化成分が異なるにもかかわらず、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４７６）と同じ抗ＣＤ３ｓｃＦｖ成分を担持する。ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、組換えヒトＥｐＣＡＭ（ｒｈＥｐＣＡＭ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９６０−ＥＰ−５０）、組換えヒトＣＥＡ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ７４２）、および組換えヒトＨＥＲ２（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＨＥ２−Ｈ５２５）を０．１μｇ／１００μＬの濃度で９６ウェル平底プレートにコーティングした。４℃で一晩インキュベーション後、アッセイプレートを洗浄して、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によって室温で１時間ブロックした。プレートを再度洗浄後、プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４７６）の用量範囲（０．０００７〜０．５ｎＭ、０．５ｎＭの開始濃度から１：３倍連続希釈スキームによって達成される）を、ＥｐＣＡＭコーティングウェル、ＣＥＡコーティングウェル、およびＨＥＲ２コーティングウェルに導入した。対照として、プロテアーゼ処置抗ＣＥＡ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４３２）をＣＥＡコーティングウェルに類似の用量範囲で導入し、プロテアーゼ処置抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（ＡＣ１４０８）も同様に、ＨＥＲ２コーティングウェルに類似の用量範囲で導入した。プレートを室温で１時間振盪させながらインキュベートし、様々なプロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡを、プレート上にコーティングしたそれぞれの抗原に結合させた。非結合成分を洗浄ステップで除去して、ビオチンコンジュゲートプロテインＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２９９９７）を０．０５μｇ／１００μＬで添加した。適切なインキュベーション期間の後、任意の非結合試薬を洗浄ステップで除去した後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を各ウェルに添加した。所望の色強度に達した後、０．２Ｎ硫酸を添加して反応を停止させ、分光光度計を使用して４５０ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定した。色の強度は、プレート上にコーティングした適切な抗原によって捕捉されたそれぞれのプロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡの濃度に比例する。産生された（測定されたＯＤ）色の強度をＰｒｏＴＩＡ濃度に対してプロットして、それぞれの用量曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して４パラメーターロジスティック回帰式によって誘導した。
結果：図５４（および図２４の結果と同等）に示すように、プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プレート上にコーティングしたｒｈＥｐＣＡＭに用量依存的に結合して、１１０ｐＭのＥＣ５０を生じる。同様に、プロテアーゼ処置抗ＣＥＡ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プレート上にコーティングしたＣＥＡ抗原に用量依存的に結合し、７０ｐＭのＥＣ５０を生じ、プロテアーゼ処置抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プレート上にコーティングしたＨＥＲ２抗原に用量依存的に結合し、４７ｐＭのＥＣ５０を生じる。重要なことに、プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡに関して、プレート上にコーティングしたＣＥＡおよびＨＥＲ２抗原の両方への結合対する用量依存的結合は観察されず、プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡがＥｐＣＡＭに特異的に結合するがＣＥＡまたはＨＥＲ２抗原には結合しないことを示している。このように、組成物は、その標的リガンドに対する特異的結合親和性を示し、非特異的結合を示さなかった。
（実施例１８）早期処置ＳＷ４８０モデルにおいてインタクトな抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ対非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの抗腫瘍特性
腫瘍環境における抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ分子（例えば、ＡＣ１４７６）に遺伝子操作された放出断片（ＲＳ）のプロテアーゼ感受性をまた、ＳＷ４８０／ＰＢＭＣ接種ＮＯＤ／ＳＣＩＤ異種移植片モデルにおいて、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４８４）、プロテアーゼ処置およびプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４７６）と共にｉｎ ｖｉｖｏで評価した。実施例１０および１３に記載される試験と同様に、ＳＷ４８０／ＰＢＭＣ接種（０日目とする）の１時間後に、コホート１のマウスにビヒクル（ＰＢＳ＿０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０）、コホート２に０．２１ｍｇ／ｋｇプロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、コホート３に０．５ｍｇ／ｋｇインタクトな抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、およびコホート４に０．４９ｍｇ／ｋｇ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡを注射した。全てのコホート（すなわち、１〜４）を、１日目〜４日目まで１日に投与される追加の４用量によってさらに処置した。腫瘍の体積、体重、および臨床観察を目標の３５日間に週に２回モニターする。
図５５に示すように、プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの０．２１ｍｇ／ｋｇ（コホート２）、インタクトな抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの０．５ｍｇ／ｋｇ（コホート３）、および非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの０．４９ｍｇ／ｋｇ（コホート４）は全て治療的に活性であると決定され、腫瘍増殖阻害指数（％ＴＧＩ）はそれぞれ、９３％、９５％、および８０％である。このように、等モル濃度で投薬すると、インタクトな抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、腫瘍濃縮プロテアーゼによって、高度に活性な放出された抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３（ＸＴＥＮ部分に連結していない）へと有効に切断され、プロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡと同等の腫瘍退縮効能を示す。予想されるように、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、腫瘍進行の阻害において有効であるが、インタクトな抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡほど有効ではなく、放出断片の存在が、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３結合ドメインの放出を可能にすることによって、組成物の治療効能を改善することを示している。
図５６に示すように、ＳＷ４８０異種移植片モデルにおいて何らかの体重減少がコホート２および３において観察され、何らかの起こりうる毒性を示唆した。最少有効用量、投薬回数の低減、および確立された腫瘍モデルにおける評価を評価するさらなる実験は、この最初の知見をさらに解明するであろう。
（実施例１９）ＯＶＣＡＲ−３卵巣モデルにおける抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼ誘発免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の抗腫瘍特性
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのｉｎ ｖｉｖｏ効能をまた、重度免疫欠損のＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ．ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）またはＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ）マウスに腹腔内に移植したヒト卵巣ＯＶＣＡＲ−３細胞株を使用して評価する。ＮＯＧおよびＮＳＧマウスは、Ｔ、Ｂ、ＮＫ細胞の欠損ならびにマクロファージ、樹状細胞、および補体系の機能障害を特徴付けられる。簡単に説明すると、０日目に、１群あたりＮＯＧまたはＮＳＧマウス５匹の７つのコホートに、５〜１０×１０６個のＯＶＣＡＲ−３細胞を腹腔内に移植した後、５〜１０×１０６個のＰＢＭＣを１４日目に静脈内に導入した。１６日目に処置を開始し、コホート１にビヒクル（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０）を毎日５用量（ｑｄｘ５）、コホート２に０．２１ｍｇ／ｋｇプロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡをｑｄｘ５、コホート３に１．０５ｍｇ／ｋｇプロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡを週に１回（ｑｗ）、コホート４に０．５ｍｇ／ｋｇプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡをｑｄｘ５、コホート５に２．５ｍｇ／ｋｇプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡをｑｗ、コホート６に０．４９ｍｇ／ｋｇ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡをｑｄｘ５、およびコホート７に２．４５ｍｇ／ｋｇ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡをｑｗで注射する。全てのコホートを、翌週に別の処置サイクルに供する。マウスを行動および生存に関して毎日モニターし、体重および腹部膨満に関して週に２回モニターする。腫瘍発達の兆候としてＣＡ１２５を決定するために血液を、３０日、４０日、５０日、および６０日目に収集した。動物の体重が０日目から３０％増加すると、動物は、試験評価項目を満たすと定義され、屠殺して剖検する。
ＯＶＣＡＲ−３腫瘍の増殖は、体重の増加、腹部直径の増加、および循環中のＣＡ１２５レベルの増加によってモニターする腹腔内の腹水の発生によって証明する。プロテアーゼ切断型およびプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４７６）の両方によって、生存が改善し、腹水形成の非存在または遅延が起こると予想される。同様に、プロテアーゼ非処置ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡより良好な治療的曝露を有し、それによってより有効な抗腫瘍効果およびより良好な安全性プロファイルが得られると予想される。非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡはまた、腫瘍の増殖を遅らせるが、その程度は、放出断片を担持するプロテアーゼ非処置およびプロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡによって証明されるより非常に小さいと予想される。
（実施例２０）ＯＶＣＡＲ−３卵巣モデルにおける抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼ誘発免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のＰＫ特性
プロテアーゼ切断型、プロテアーゼ非処置および非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのＰＫおよび生体分布プロファイルを、ＯＶＣＡＲ−３腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて独立して金属標識した分子の混合物として評価する。それぞれの放射線照射ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに対して、１０００万個のＯＶＣＡＲ−３細胞を０日目に腹腔に注射する。腹部膨満が肉眼で観察されると、および／または動物の体重が０日目から１０〜１５％増加すると、処置を開始する。ＯＶＣＡＲ−３腫瘍を担持する２０匹のマウスのうち、１８匹を選択して、個々の体重に従って、１群あたり動物９匹の２群に無作為化する。１群のマウス９匹に金属１標識プロテアーゼ切断型抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、金属２標識プロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ、および金属３標識非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの等モル濃度を含む混合物１．５ｍｇ／ｋｇを静脈内注射する。他の群の動物９匹に同じＰｒｏＴＩＡ混合物１．５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与する。
同じ群（すなわち、静脈内および腹腔内投与群）の動物間で交替して採取することにより、血液を頸静脈／上顎静脈穿刺によってヘパリンリチウム試験管に、試験物質の投与後０．５時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、３日、５日、および７日目に収集する。血液を１３００ｇ、４℃で１０分間遠心分離することによって血漿に処理し、分析するまで−８０℃で保存する。
腹水を静脈内および腹腔内投与群の両方から、同じ群の動物で交替して採取することにより、試験物質の投与後４時間、８時間、２４時間、４８時間、３日、５日、および７日目に収集する。腹水試料を直ちに３００ｇ、４℃で１０分間遠心分離して、液体成分を分析するまで−８０℃で凍結する。
各群３匹のマウスは、３、５、および７日目に終了する。臓器（脳、心臓、肝臓、肺、脾臓、および膵臓）および腹腔中の腫瘍の結節を採取して、重量を測定し、瞬間凍結して、分析を実施するまで−８０℃で保存する。
全ての試料（血液、腹水、正常な臓器および腫瘍組織）を、ＩＣＰ−ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析法）によって分析する。静脈内アームでは、３つ全てのＰｒｏＴＩＡの少量が腹水に検出されると予想される。血漿成分において、金属２標識プロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡおよび金属３標識非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、金属１標識プロテアーゼ切断型抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡより長い全身半減期を証明すると予想される。腹腔内アームでは、３つ全てのＰｒｏＴＩＡバージョンが腹水中に検出可能であると予想され、金属２標識プロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡおよび金属３標識非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、金属１標識プロテアーゼ切断型抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡと比較して腹腔中でより長い保持時間を有すると予想される。同様に、金属２標識プロテーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、腫瘍が負荷された腹腔内環境に見出されるプロテアーゼによる切断により、金属３標識非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡより短い腹腔内半減期を有すると予想される。金属２標識プロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡおよび金属３標識非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、初期の時点では血漿中にほとんど検出されず、腹腔内投与された分子の全身循環への漏出がほとんどないことを示している。３つ全てのＰｒｏＴＩＡバージョンは、腹腔から摘出された腫瘍結節に存在するが正常な臓器には存在しないと予想される。
（実施例２１）ＳＫ−ＯＶ−３卵巣モデルにおける抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼ誘発免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の抗腫瘍特性
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡのｉｎ ｖｉｖｏ効能をまた、重度免疫欠損ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ．ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）またはＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ）マウスの腹腔内に移植したヒト卵巣ＳＫ−ＯＶ−３細胞株を使用して評価する。ＮＯＧおよびＮＳＧマウスは、Ｔ、Ｂ、およびＮＫ細胞の欠損、ならびにマクロファージ、樹状細胞、および補体系の機能障害によって特徴付けられる。簡単に説明すると、０日目に、１群あたり５匹のＮＯＧまたはＮＳＧマウスの７つのコホートに、５〜１０×１０６個のＳＫ−ＯＶ−３細胞を腹腔内に移植した後、５〜１０×１０６個のＰＢＭＣを５日目に腹腔内に導入する。７日目に処置を開始し、コホート１にビヒクル（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０）を毎日５用量（ｑｄｘ５）、コホート２に０．２１ｍｇ／ｋｇプロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡをｑｄｘ５、コホート３に１．０５ｍｇ／ｋｇプロテアーゼ処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡを週に１回（ｑｗ）、コホート４に０．５ｍｇ／ｋｇプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡをｑｄｘ５、コホート５に２．５ｍｇ／ｋｇプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡをｑｗ、コホート６に０．４９ｍｇ／ｋｇ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡをｑｄｘ５、およびコホート７に２．４５ｍｇ／ｋｇ非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡをｑｗで注射した。マウスを行動および生存に関して毎日、体重および腹部膨満に関して週に２回モニターする。動物の体重が０日目から３０％増加すると、動物は、試験評価項目を満たすと定義され、屠殺して剖検する。
ＳＫ−ＯＶ−３の増殖は、体重の増加および腹部直径の増加によってモニターする腹腔内の腹水の発生によって証明する。プロテアーゼ切断型およびプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ（例えば、ＡＣ１４７６）の両方によって、生存が改善し、腹水が存在しないかまたは腹水形成が遅れると予想される。同様に、プロテアーゼ非処置ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡより良好な治療的曝露、より有効な抗腫瘍効果およびより良好な安全性プロファイルを与えると予想される。非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡもまた、腫瘍の増殖を遅らせるが、その程度は、放出断片を担持するプロテアーゼ非処置ＰｒｏＴＩＡおよびプロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡによって示されるより非常に小さいと予想される。
（実施例２２）ヒト悪性腹水試料中の抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼ誘発免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物の成績
ヒト悪性腹水を、進行、再発、または難治性の卵巣（腺癌および膠様）、結腸直腸、胃、胆管／胆管細胞癌、ファーター膨大部、膵臓癌および非明細胞腎臓癌患者を含むがこれらに限定されるわけではない、原発性腹腔内ＥｐＣＡＭ陽性上皮悪性疾患を有する患者から収集する。試料収集前３０日以内に化学療法、免疫療法、生物および／またはコルチコステロイド療法を受けている患者は除外する。悪性腹水を３００〜４００ｇ、室温で１０分間遠心分離して、液体および沈降成分を採取した。液体成分中のＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２、マトリプターゼおよびｕＰＡを含むがこれらに限定されるわけではないヒトプロテアーゼの濃度を、市販のＥＬＩＳＡキット（ヒトＭＭＰ−９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＫＨＣ３０６１または同等物；ヒトＭＭＰ−２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＫＨＣ３０８１または同等物；ヒトマトリプターゼ、Ｅｎｚｏ、カタログ番号ＡＤＩ−９００−２２１；およびヒトｕＰＡ、Ａｂｃａｍ、カタログ番号１１９６１１）を使用して、製造元の説明書に従って定量する。腹水液に見出されるプロテアーゼによるインタクトな抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３（例えば、ＡＣ１４７６）の切断速度を、既知濃度のＰｒｏＴＩＡを腹水液成分に添加して、３７℃で混合物をインキュベートし、表記の時点、０．５時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、３日、４日、５日、および７日にアリコートを採取することによって決定する。それぞれの時点に存在するインタクトな抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの量を、標準物質としてインタクトな抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３によるｒｈＥｐＣＡＭ／ビオチン化抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析する。
簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、カタログ番号４４２４０４）を、ウェルあたり０．１μｇ／１００μＬのｒｈＥｐＣＡＭ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＥＨＨ１０４１１１）でコーティングする。４℃で一晩インキュベーション後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄して、３％ＢＳＡによって室温で１時間ブロックする。プレートを再度洗浄後、インタクトなプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ標準物質の用量範囲、適切な品質対照、およびＰｒｏＴＩＡ添加腹水試験試料を適切に添加する。プレートを室温で１時間振盪させながらインキュベートして、ＰｒｏＴＩＡ標準物質、品質対照、および試験試料を、プレート上にコーティングしたｒｈＥｐＣＡＭに結合させる。非結合成分を数回の洗浄によって除去する。ビオチン化抗ＸＴＥＮ抗体（Ａｍｕｎｉｘ所有の抗体）を、０．１μｇ／１００μＬで添加して、プレートを室温で１時間インキュベートした。非結合のビオチン化試薬を洗浄して除去した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２１１３０）を１：３０，０００希釈で添加し、プレートを室温で１時間インキュベートする。数回洗浄後、ＴＭＢ基質を各ウェルに添加する。所望の色強度に達した後、０．２Ｎ硫酸を添加して反応を停止させ、分光光度計を使用して４５０ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定する。色の強度は、ｒｈＥｐＣＡＭ／ビオチン化抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡによって捕捉されたインタクトなＰｒｏＴＩＡの濃度に比例する。腹水試験試料中に存在するインタクトなＰｒｏＴＩＡの濃度を、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用してインタクトなＰｒｏＴＩＡ標準曲線に対して決定する。ｒｈＥｐＣＡＭ／ビオチン化抗ＸＴＥＮサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて検出されたインタクトなＰｒｏＴＩＡの減少速度（すなわち、半減期）を、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍを使用して決定する。
腹水の沈降物を、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＡ１２５、およびＣＤ５６発現に関して表現型を決定する。ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３に関して試験陽性である悪性腹水試料を、プロテアーゼ処置およびプロテアーゼ非処置ＰｒｏＴＩＡの細胞傷害性の分析に使用する。簡単に説明すると、１×１０５個の腹水細胞を、適当量の腹水液で復元して、２４ウェルプレートにおいて３回の反復で２４時間接着させる。細胞を、プロテアーゼ処置およびインタクトな抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの用量濃度で４８時間処置した後、製造元の指示通りに（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７、カタログ番号Ｇ８０９１）発光性カスパーゼ３／７基質を使用してカスパーゼ３／７の定量を行う。発光シグナルはカスパーゼ３／７活性に比例することから、プロテアーゼ処置および非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの用量濃度を、次に発光シグナルに対してプロットして、半最大応答を生じるタンパク質濃度（ＥＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して４パラメーターロジスティック回帰式によって誘導する。進行、再発、および難治性ＥｐＣＡＭ陽性がん患者に由来するヒト悪性腹水は、インタクトな抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの、強い細胞傷害活性を発揮する非ＸＴＥＮ化抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３部分への切断およびその後の活性化にとって全ての必要な成分を含むことが予想される。腫瘍除去の兆候としてのＥｐＣＡＭ陽性細胞の数の減少およびＴ細胞活性化を反映するＣＤ６９およびグランザイムなどのＴ細胞活性化マーカーの増加も同様に予想される。
（実施例２３）抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３プロテアーゼ誘発免疫活性化因子（ＰｒｏＴＩＡ）組成物のカスパーゼ３／７アッセイ
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡ組成物のリダイレクト細胞傷害性も同様に、アポトーシス細胞のカスパーゼ３／７活性によって評価した。上記のＬＤＨ細胞傷害性アッセイと同様に、ＰＢＭＣまたは精製ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、ＳＷ４８０、ＳＫ−ＯＶ−３、およびＯＶＡＲ−３細胞などのＥｐＣＡＭ陽性腫瘍標的細胞とエフェクター５対標的１、ＨＣＴ−１１６と１０：１の比で混合し、３つ全てのＰｒｏＴＩＡバージョンを、上記のようにＬＤＨアッセイにおいて１２ポイントの５倍連続希釈の用量濃度で試験した。
細胞の溶解時、培養上清に放出されたカスパーゼ３／７を、「グロータイプ」の発光シグナルを生成するカスパーゼ３／７による発光性のカスパーゼ３／７基質切断量によって測定した（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７、カタログ番号Ｇ８０９１）。発光の量はカスパーゼ活性の量に比例する。
予想されるように、ＳＫ−ＯＶ−３、ＯＶＣＡＲ−３、ＨＣＴ−１１６、およびＳＷ４８０腫瘍細胞株においてプロファイルを調べたプロテアーゼ処置、プロテアーゼ非処置、および非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡの活性の傾向は、ＬＤＨアッセイ分析で観察された活性と一致することが見出された。ヒトＰＢＭＣによるＳＫ−ＯＶ−３卵巣細胞の細胞傷害性死滅において、非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡより活性が１２倍低く（ＥＣ５０は、１４０ｐＭ対１２ｐＭ）、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡより活性が３９０倍低い（ＥＣ５０は、４７００ｐＭ対１２ｐＭ）（図５７）。ＰＢＭＣによるＯＶＣＡＲ−３卵巣細胞の細胞傷害性死滅において、プロテアーゼ非切断型抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ処置ＰｒｏＴＩＡより活性が４倍低く（ＥＣ５０は、９．８ｐＭ対２．５ｐＭ）、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡより活性が４２０倍低い（ＥＣ５０は、１０４３ｐＭ対２．５ｐＭ）（図５８）。ＰＢＭＣによるＨＣＴ−１１６結腸直腸細胞の細胞傷害性死滅において、プロテアーゼ処置およびインタクトなプロテアーゼ非処置抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、ほぼ類似の活性を有し（ＥＣ５０は、１．８ｐＭ対３．６ｐＭ）、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡより活性が１３０倍低い（ＥＣ５０は、２４０ｐＭ対１．８ｐＭ）（図５９）。ＰＢＭＣによるＳＷ４８０結腸直腸細胞の細胞傷害性死滅において、プロテアーゼ処置およびプロテアーゼ非切断型抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡもまた、類似の活性を証明し（ＥＣ５０は、２ｐＭ対１ｐＭ）、非切断性抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３ ＰｒｏＴＩＡは、プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡより活性が７０倍低い（ＥＣ５０は、１４８ｐＭ対２ｐＭ）（図６０）。結果は、非切断性ＰｒｏＴＩＡが、非ＸＴＥＮ化抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３部分より一貫して活性が低いことを証明した。使用した細胞株に応じて、インタクトなプロテアーゼ非処置ＰｒｏＴＩＡの活性は、プロテアーゼ切断型ＰｒｏＴＩＡと比較して類似から１２倍低い活性までの範囲で変化し、アッセイ混合物において腫瘍細胞および／または活性化ＣＤ３陽性Ｔ細胞から放出されると仮定されるプロテアーゼに対する放出断片の感受性の程度の差を示唆している。
（実施例２４）様々なプロテアーゼを使用した、ＡＣ１４７６ ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−Ｈｉｓ（６）のタンパク質溶解切断
実験は、実施例３に既に記載したａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−Ｈｉｓ（６） ＡＣ１４７６が、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、および好中球エラスターゼを含む多数の腫瘍関連プロテアーゼによってｉｎ ｖｉｔｒｏで切断されうることを証明するために実施した。
１．酵素の活性化
使用した酵素は全て、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから得た。組換え好中球エラスターゼおよび組換えヒトマトリプターゼは、活性化酵素として提供され、使用するまで−８０℃で保存した。組換えマウスＭＭＰ−２および組換えマウスＭＭＰ−９は、酵素前駆体として供給され、酢酸４−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）による活性化を必要とした。ＡＰＭＡを最初に、０．１Ｍ ＮａＯＨに、最終濃度１０ｍＭとなるように溶解後、ｐＨを０．１Ｎ ＨＣｌを使用して中性に再調節した。ＡＰＭＡ保存液の２．５ｍＭへのさらなる希釈は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ ７．５中で行った。プロＭＭＰを活性化するために、１ｍＭ ＡＰＭＡおよび１００μｇ／ｍＬプロＭＭＰを３７℃で１時間（ＭＭＰ−２）または３時間（ＭＭＰ−９）インキュベートした。グリセロールを、最終濃度５０％となるように活性化酵素に添加して、その後それぞれを−２０℃で保存した。
２．酵素の消化
酵素のパネルを使用して、ＡＣ１４７６ ａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３−ＢＳＲＳ１−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−Ｈｉｓ（６） ＰｒｏＴＩＡ組成物を消化した。１０μＭの基質組成物を、それぞれの酵素と共に以下の酵素対基質モル比：ＭＭＰ−２（１：２００）、ＭＭＰ−９（１：２０００）、マトリプターゼ（１：１２．５）および好中球エラスターゼ（１：１０００）で個々にインキュベートした。反応を３７℃で２時間インキュベートした後、ゲルローディング色素および８０℃での加熱によって消化を停止させた。
３．切断の分析
非消化および消化材料５μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードして、クマシーブルーで染色することにより試料の分析を実施した。ＢＳＲＳ−１放出断片でそれぞれのプロテアーゼによって処置すると、基質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて検出可能な２つの断片を生じ、小さい断片はａＥｐＣＡＭ−ａＣＤ３（結合ドメインを有する活性化第１の部分の形態）を含み、他方は放出されたＸＴＥＮバルキング部分を含み、インタクト型よりＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でわずかに低い見かけの分子量で移動する。放出されたＸＴＥＮを同様に消化する好中球エラスターゼに関して、活性化型ならびに他のより小さい断片がゲルにおいて観察されたが、後者は配列に沿った様々な位置でのＸＴＥＮの切断が原因であった。結果は、試験した全てのプロテアーゼが、意図されるように構築物を切断し、結合ドメインを放出させたことを確認する。

Claims (138)

  1. 第１の部分、第２の部分、および第３の部分を含むキメラポリペプチドアセンブリーであって、
    ａ．前記第１の部分が、
    ｉ．標的細胞マーカーに対する結合特異性を有する第１の結合ドメイン；および
    ｉｉ．エフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する第２の結合ドメインを含み；
    ｂ．前記第２の部分が、１つまたは複数の哺乳動物プロテアーゼにより切断され得るペプチジル放出セグメント（ＲＳ）を含み；
    ｃ．前記第３の部分が、バルキング部分を含み；
    前記バルキング部分が、前記第２の部分に対する前記哺乳動物プロテアーゼの作用によって前記第１の部分から放出され得る、キメラポリペプチドアセンブリー。
  2. Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記第１の部分が前記第２の部分に連結され、次いで、前記第２の部分が前記第３の部分に連結されている、請求項１に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  3. Ｎ末端からＣ末端に向かって、前記第３の部分が前記第２の部分に連結され、次いで、前記第２の部分が前記第１の部分に連結されている、請求項１に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  4. 前記標的細胞マーカーが腫瘍特異的マーカーである、請求項１から３のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  5. 前記標的細胞マーカーが炎症マーカーである、請求項１から３のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  6. 前記哺乳動物プロテアーゼが、腫瘍組織中で優先的に発現される、請求項１から４のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  7. 前記哺乳動物プロテアーゼが、炎症組織中で優先的に発現される、請求項１から３および５のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  8. モノマー融合タンパク質である、請求項１から７のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  9. （ｉ）前記第２の部分および前記第３の部分がモノマー融合タンパク質であり、前記第１の部分が前記第２の部分に化学的にコンジュゲートされている；または（ｉｉ）前記第１の部分および前記第２の部分がモノマー融合タンパク質であり、前記第３の部分が前記第２の部分に化学的にコンジュゲートされている、請求項１から７のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  10. 前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインがそれぞれｓｃＦｖである、先行する請求項のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  11. 前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインが単鎖ダイアボディであるか、またはそれぞれ単一ドメイン抗体であるか、またはそれぞれ単一ドメインラクダ抗体であるか、またはそれぞれ非抗体足場である、請求項１から９のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  12. 第２の結合ドメインが、形質細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ細胞）、マスト細胞、樹状細胞、調節性Ｔ細胞（ＲｅｇＴ細胞）、ヘルパーＴ細胞、骨髄性細胞、およびＮＫ細胞からなる群から選択されるエフェクター細胞上で発現されるエフェクター細胞抗原に対する結合特異性を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  13. 前記エフェクター細胞がＴ細胞である、請求項１２に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  14. 前記エフェクター細胞抗原がＣＤ３である、請求項１２または１３に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  15. 前記エフェクター細胞抗原がＣＤ３εである、請求項１２または１３に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  16. 前記第２の結合ドメインが、ヒトＣＤ３に結合することができるモノクローナル抗体に由来するＶＨおよびＶＬ領域を含む、請求項１４に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  17. 前記第２の結合ドメインＶＨおよびＶＬが、表１に記載される配列群から選択されるＶＨおよびＶＬに由来する、請求項１４に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  18. 前記第２の結合ドメインが、ヒトＣＤ３εに結合することができるモノクローナル抗体に由来するＶＨおよびＶＬ領域を含む、請求項１５に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  19. 前記第２の結合ドメインｓｃＦｖが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順序に配置されるＶＨおよびＶＬ領域を含む、請求項１６または１７のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  20. 前記第２の結合ドメインが、それぞれ、表１のモノクローナル抗体に由来する、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、ＣＤＲ−Ｈ３領域、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含む、請求項１４または請求項１５に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  21. 前記第１の結合ドメインが、前記腫瘍特異的マーカーに結合することができるモノクローナル抗体に由来するＶＨおよびＶＬ領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  22. 前記第１の結合ドメインＶＨおよびＶＬ領域が、表２に記載される配列群から選択されるモノクローナル抗体ＶＨおよびＶＬに由来する、請求項２１に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  23. 前記腫瘍特異的マーカーが腫瘍細胞によって発現される、先行する請求項のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  24. 前記腫瘍細胞が、間質細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、グリア細胞、上皮細胞、脂肪細胞、リンパ球細胞、血管細胞、平滑筋細胞、間葉細胞、乳房組織細胞、前立腺細胞、腎臓細胞、脳細胞、結腸細胞、卵巣細胞、子宮細胞、膀胱細胞、皮膚細胞、胃細胞、尿生殖路細胞、頸部細胞、子宮細胞、小腸細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、胆嚢細胞、胆管細胞、食道細胞、唾液腺細胞、肺細胞、および甲状腺細胞からなる群から選択される細胞から生じる、請求項２１に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  25. 前記腫瘍特異的マーカーが、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２ ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６、βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ１３３、ガングリオシドＧＤ３；９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原１、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、胎児アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、ＣＤ２５、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ミュラー管抑制物質受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、シアル化Ｔｎ抗原（ｓ ＴＮ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＡＧ７２、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原）、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｇ２５０、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＤＬＫ１、ＳＰ１７、ＲＯＲ１、およびＥｐｈＡ２からなる群から選択される、請求項２１または請求項２２に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  26. 前記第１の結合ドメインが、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの形態でＮ末端からＣ末端に向かって配置されるＶＨおよびＶＬ領域を含むｓｃＦｖである、請求項２１から２５のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  27. 前記第１の結合ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１領域、ＣＤＲ−Ｈ２領域、ＣＤＲ−Ｈ３領域、ＣＤＲ−Ｌ１領域、ＣＤＲ−Ｌ２領域、およびＣＤＲ−Ｈ３領域を含み、前記領域のそれぞれが、表２に記載される配列群から選択されるモノクローナル抗体配列に由来する、請求項１から２０のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  28. 前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインが、表８および表９に記載される配列群から選択される可撓性ポリペプチドリンカーによって連結されている、先行する請求項のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  29. 前記ＲＳが表４に記載される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  30. 前記ＲＳが、配列ＬＳＧＲＳＤＮＨＳＰＬＧＬＡＧＳ、ＳＰＬＧＬＡＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ、ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＮＨ、ＬＡＧＲＳＤＮＨＳＰＬＧＬＡＧＳ、ＬＳＧＲＳＤＮＨＶＰＬＳＬＫＭＧ、ＳＰＬＧＬＡＧＳ、ＧＰＬＡＬＡＲＧ、ＬＳＧＲＳＤＮＨ、ＶＰＬＳＬＴＭＧ、ＶＰＬＳＬＫＭＧ、ＶＰＬＳＬＳＭＧ、ＥＰＬＥＬＶＡＧ、ＥＰＬＥＬＲＡＧ、ＥＰＡＡＬＭＡＧ、ＥＰＡＳＬＭＡＧ、ＲＩＧＳＬＲＴＡ、ＲＩＱＦＬＲＴＡ、ＥＰＦＨＬＭＡＧ、ＶＰＬＳＬＦＭＧ、ＥＰＬＥＬＰＡＧ、およびＥＰＬＥＬＡＡＧからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  31. 前記ＲＳが、表３に記載されるプロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼによって切断され得るアミノ酸配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  32. 前記バルキング部分が、延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）；アルブミン結合ドメイン；アルブミン、ＩｇＧ結合ドメイン；プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド；脂肪酸；ＥＬＰバイオポリマー；Ｆｃドメイン；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＧＡ；ならびにヒドロキシエチルデンプンからなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  33. 前記バルキング部分がＸＴＥＮである、請求項３２に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  34. 前記ＸＴＥＮが、表５に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  35. 前記キメラポリペプチドアセンブリーの前記第１の部分が、表１３に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  36. 前記哺乳動物プロテアーゼによって前記第２の部分が切断され、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第１の部分が放出されると、前記第１の部分が、ヒトＣＤ３抗原を担持するＴ細胞と前記腫瘍特異的マーカーを担持する腫瘍細胞との両方を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、前記Ｔ細胞と前記腫瘍細胞とに同時に結合することができる、請求項１３から３５のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  37. 前記第２の部分が切断されて、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第１の部分および前記第３の部分が放出されると、前記放出された第１の部分が、前記第３の部分の１／２、１／３、１／４、または１／５以下である分子量を有する、請求項３６に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  38. 前記第２の部分が切断されると、前記キメラポリペプチドアセンブリーから放出された前記第１の部分が、前記第２の部分が切断されていないキメラ結合アセンブリーと比較して、前記ＣＤ３抗原を担持する前記Ｔ細胞または前記腫瘍細胞マーカーに対する増大した結合親和性を有する、請求項３６に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  39. 前記ヒトＣＤ３抗原を担持する前記Ｔ細胞または前記腫瘍細胞マーカーに対する前記放出された第１の部分の結合親和性が、前記ＲＳが切断されていない、前記ヒトＣＤ３抗原を担持する前記Ｔ細胞または前記腫瘍細胞マーカーに対する前記キメラポリペプチドアセンブリーの結合親和性と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高い、請求項３６に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  40. 前記第１の部分が前記Ｔ細胞と前記腫瘍細胞とに同時に結合することにより、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて前記腫瘍細胞に対する細胞傷害活性が生じる、請求項３６に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  41. 前記キメラポリペプチドアセンブリーの前記放出された第１の部分が、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてインタクトなキメラ結合アセンブリーと比較して前記腫瘍細胞のより多い量の細胞溶解を行うことができる、請求項３６に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  42. 前記キメラポリペプチドアセンブリーの前記放出された第１の部分によって行われる細胞溶解の量が、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける前記インタクトなキメラ結合アセンブリーと比較して少なくとも１０倍多い、または少なくとも３０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも３００倍、または少なくとも１０００倍多い、請求項３６に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  43. 前記腫瘍細胞の前記細胞傷害活性および／または細胞溶解が、前記Ｔ細胞の標的特異的活性化によって媒介される、請求項４０から４２のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  44. 前記キメラポリペプチドアセンブリーの前記放出された第１の部分によって行われる前記Ｔ細胞の活性化の量が、前記インタクトなキメラ結合アセンブリーと比較して少なくとも１０倍多い、または少なくとも３０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも３００倍、または少なくとも１０００倍多い、請求項４３に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  45. ａ）（ｉ）前記エフェクター細胞抗原を担持する前記エフェクター細胞と、前記標的細胞マーカーを担持する腫瘍細胞との両方を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける前記腫瘍細胞に対する前記放出された第１の部分の細胞傷害性と、（ｉｉ）１〜約１０個のアミノ酸の非切断性ペプチドによって連結されている、前記キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第１の部分と、前記キメラポリペプチドアセンブリーの対応する第３の部分とを含む組成物の細胞傷害性との比として測定される相対的細胞傷害性；および
    ｂ）前記エフェクター細胞抗原に対するａ（ｉ）の前記放出された第１の部分の前記第２の結合ドメインの結合親和性と、前記エフェクター細胞抗原に対するａ（ｉｉ）の前記組成物の結合親和性との比として測定される、相対的結合親和性
    の比較において、前記相対的細胞傷害性と前記相対的結合親和性との比が、少なくとも１０：１より大きい、または少なくとも３０：１より大きい、または少なくとも５０：１より大きい、または少なくとも１００：１より大きい、または少なくとも３００：１より大きい、または少なくとも５００：１より大きい、または少なくとも１０００：１より大きい、請求項４０から４４のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  46. 前記非切断性ペプチドが配列グリシン−セリンを有し、前記エフェクター細胞抗原がＣＤ３である、請求項４５に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  47. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが、細胞膜完全性アッセイ、混合細胞培養アッセイ、ＦＡＣＳベースヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルー流入アッセイ、測光酵素放出アッセイ、放射測定５１Ｃｒ放出アッセイ、蛍光ユーロピウム放出アッセイ、ＣａｌｃｅｉｎＡＭ放出アッセイ、測光ＭＴＴアッセイ、ＸＴＴアッセイ、ＷＳＴ−１アッセイ、アラマーブルーアッセイ、放射測定３Ｈ−Ｔｈｄ取込みアッセイ、細胞分裂活性を測定するクローン形成アッセイ、ミトコンドリア膜貫通勾配を測定する蛍光ローダミン１２３アッセイ、ＦＡＣＳベースホスファチジルセリン曝露によりモニタリングされるアポトーシスアッセイ、ＥＬＩＳＡベースＴＵＮＥＬ試験アッセイ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、カスパーゼ活性アッセイ、細胞ベースＬＤＨ放出アッセイ、および細胞形態学アッセイ、またはその任意の組合せからなるアッセイ群から選択される、請求項３６から４６のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  48. 前記腫瘍特異的マーカーに対する前記放出された第１の部分の前記第１の結合ドメインの結合親和性が、前記ＣＤ３抗原に対する前記放出された第１の部分の前記第２の結合ドメインの結合親和性と比較して高い、請求項３６に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  49. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＫｄ定数によって測定された場合、前記標的細胞に対する前記第１の結合ドメインの結合親和性が、前記ＣＤ３抗原に対する前記第２の結合ドメインのより高い結合親和性と比較して、少なくとも一桁低い、請求項３６に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  50. 前記キメラポリペプチドアセンブリーの前記第１の結合ドメインの前記Ｋｄ定数が、１０−５〜１０−９Ｍであり、前記第２の結合ドメインのＫｄが１０−５〜１０−９Ｍである、請求項３６に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  51. 前記キメラポリペプチドアセンブリーを含む組成物を対象に投与した後、前記キメラポリペプチドアセンブリーの前記第２の部分が、前記キメラポリペプチドアセンブリーが対象に投与された場合、前記ＲＳを切断することができるプロテアーゼを発現する腫瘍の近くで切断される、請求項１から３５のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  52. 前記哺乳動物プロテアーゼによって前記第２の部分が切断され、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第１の部分が放出されると、前記第１の部分が、前記ヒトＣＤ３抗原を担持するＴ細胞と、前記腫瘍特異的マーカーを担持する腫瘍細胞とに同時に結合することができる、請求項５１に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  53. 前記第１の部分が、前記ＣＤ３抗原を担持するＴ細胞と、前記腫瘍細胞マーカーを担持する前記腫瘍細胞とに同時に結合することにより、Ｔ細胞由来エフェクター分子が放出される、請求項５２に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  54. 前記エフェクター分子が、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、インターロイキン２、パーフォリン、およびグランザイムからなる群の１つまたは複数のエフェクター分子から選択される、請求項５３に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  55. 前記第１の部分が、前記ヒトＣＤ３抗原を担持するＴ細胞と、前記腫瘍特異的マーカーを担持する腫瘍細胞とに同時に結合すると、前記腫瘍細胞の溶解が前記Ｔ細胞によって行われる、請求項５２に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  56. 同等用量で対象に投与された後の前記第２および第３の部分に連結されていない前記第１の部分の半減期と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍長い、対象に投与された後の半減期を示す、請求項５１から５５のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  57. 前記キメラポリペプチドアセンブリーを対象に投与し、前記第２の部分が切断され、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第１の部分および前記第３の部分が放出された後に、前記第１の部分が、前記対象における前記インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーと比較して１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、または１／１０以下である半減期を有する、請求項５１から５６のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  58. 前記キメラポリペプチドアセンブリーを含む組成物を前記対象に単回投与した後の前記放出された第１の部分の血漿Ｃｍａｘ濃度が、約０．０１ｎｇ／ｍｌ、または約０．１ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ、または約１０ｎｇ／ｍｌ、または約１００ｎｇ／ｍｌを超えない、請求項５１から５７のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  59. 前記キメラポリペプチドアセンブリーを含む組成物を前記対象に単回投与した後の前記放出された第１の部分の血漿Ｃｍａｘ濃度が、同じ対象における前記インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの１／３以下、または１／１０以下、または１／３０以下、または１／１００以下である、請求項５１から５７のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  60. 前記インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーが、前記ＲＳが切断され、前記第１の部分および前記第３の部分を放出する前記キメラポリペプチドアセンブリーと比較して、対象における血液循環系からの溢出の減少を示す、請求項５１から５９のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  61. 前記対象が、マウス、ラット、サル、イヌ、およびヒトからなる群から選択される、請求項５１から６０のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  62. 先行する請求項のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリーと、１つまたは複数の薬学的に好適な賦形剤とを含む医薬組成物。
  63. 皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、髄腔内、または筋肉内投与のために製剤化されている、請求項６２に記載の医薬組成物。
  64. 液体形態である、請求項６２に記載の医薬組成物。
  65. 単回注射のためのプレフィルドシリンジ中にある、請求項６４に記載の医薬組成物。
  66. 投与前に復元される凍結乾燥粉末として製剤化されている、請求項６２に記載の医薬組成物。
  67. 対象における疾患の処置のための医薬の調製における請求項１から６１のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリーの使用。
  68. 前記疾患が、癌腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、ＥＲ／ＰＲ＋乳がん、Ｈｅｒ２＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、悪性腹水を伴う結腸がん、粘液腫瘍、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（gastric cancer）、胃がん（stomach cancer）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、男化腫瘍、腺癌、肉腫、およびＢ細胞由来慢性リンパ性白血病からなる群から選択される、請求項６７に記載の使用。
  69. 対象における疾患を処置する方法であって、それを必要とする前記対象に、請求項１から６８のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリーまたは前記キメラポリペプチドアセンブリーを含む医薬組成物の治療有効用量を投与することを含む方法。
  70. 前記疾患が、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（gastric cancer）、食道がん、胃がん（stomach cancer）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病を含む原発性血液悪性腫瘍、骨髄増殖性新生物障害、または骨髄異形成障害、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、またはグッドパスチャー症候群からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記医薬組成物が、前記対象に週２回、週１回、２週毎、３週毎、または毎月投与される１つまたは複数の治療有効用量として投与される、請求項６９または７０に記載の方法。
  72. 前記医薬組成物が、前記対象に少なくとも２週、または少なくとも１カ月、または少なくとも２カ月、または少なくとも３カ月、または少なくとも４カ月、または少なくとも５カ月、または少なくとも６カ月の期間にわたって１つまたは複数の用量として投与される、請求項６９から７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記用量が、皮内、皮下、静脈内、動脈内、腹部内、腹腔内、髄腔内、または筋肉内に投与される、請求項６９から７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記用量が、最大の安全性および効能のために忍容されるように、ボーラス用量として、または５分〜９６時間の注入によって投与される、請求項６９から７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記用量が、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される、請求項６９から７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 初期用量が、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇからなる群から選択され、その後の用量が、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される、請求項６９から７４のいずれか一項または組合せに記載の方法。
  77. 前記対象への前記投与が、少なくとも約３日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、または少なくとも約２１日間、前記対象において少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬ〜少なくとも約２ｎｇ／ｍＬまたはそれよりも多くの前記キメラポリペプチドアセンブリーの血漿濃度をもたらす、請求項６９から７４のいずれか一項または組合せに記載の方法。
  78. 前記対象が、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群から選択される、請求項６９から７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 任意選択で、治療有効用量を使用する１つまたは複数の連続用量を含む処置レジメンに従って、前記疾患を有する対象に前記医薬組成物または前記キメラポリペプチドアセンブリーを投与することを含む、前記疾患の処置のための方法における使用のための、請求項６２から６５のいずれか一項に記載の医薬組成物または請求項１から６１のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  80. 前記疾患が、癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、結腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、任意の形態の皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、悪性腹水を伴う上皮腹腔内悪性腫瘍、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（gastric cancer）、食道がん、胃がん（stomach cancer）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、腺癌、任意の起源の肉腫、急性もしくは慢性リンパ球性白血病、急性もしくは慢性骨髄性白血病を含む原発性血液悪性腫瘍、骨髄増殖性新生物障害、または骨髄異形成障害、重症筋無力症、バセドウ病、橋本甲状腺炎、およびグッドパスチャー症候群からなる群から選択される、請求項７９に記載の使用のための医薬組成物またはキメラポリペプチドアセンブリー。
  81. 前記処置レジメンが特定の処置サイクルの一部である、請求項７９または請求項８０に記載の使用のための医薬組成物またはキメラポリペプチドアセンブリー。
  82. 前記特定の処置サイクルが、各処置サイクルあたり、週２回、毎週、１０日毎、２週毎、３週毎、または毎月の前記医薬組成物の投与を含む、請求項８２に記載の使用のための医薬組成物またはキメラポリペプチドアセンブリー。
  83. 前記処置レジメンが、前記対象における前記疾患と関連する臨床パラメーターまたは評価項目の改善をもたらす、請求項７９から８１のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物またはキメラポリペプチドアセンブリー。
  84. 前記臨床パラメーターまたは評価項目が、完全、部分または不完全奏効としての腫瘍縮小；無増悪期間、治療成功期間、バイオマーカー応答；無増悪生存期間；無病生存期間；再発までの期間；転移までの期間；全生存期間；生活の質の改善；および症状の改善からなる群の１つまたは任意の組合せから選択される、請求項８３に記載の使用のための医薬組成物またはキメラポリペプチドアセンブリー。
  85. 請求項６２から６５のいずれか一項に記載の医薬組成物、容器、および前記容器上の、またはそれに付随するラベルまたは添付文書を含むキット。
  86. ペプチジルＲＳを含む第４の部分と、バルキング部分を含む第５の部分とをさらに含む、請求項３２から３５のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  87. 前記第４の部分のＲＳが、表４に記載される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８６に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  88. 前記第４の部分のＲＳが、配列ＬＳＧＲＳＤＮＨＳＰＬＧＬＡＧＳ、ＳＰＬＧＬＡＧＳＬＳＧＲＳＤＮＨ、ＳＰＬＧＬＳＧＲＳＤＮＨ、ＬＡＧＲＳＤＮＨＳＰＬＧＬＡＧＳ、ＬＳＧＲＳＤＮＨＶＰＬＳＬＫＭＧ、ＳＰＬＧＬＡＧＳ、ＧＰＬＡＬＡＲＧ、ＬＳＧＲＳＤＮＨ、ＶＰＬＳＬＴＭＧ、ＶＰＬＳＬＫＭＧ、ＶＰＬＳＬＳＭＧ、ＥＰＬＥＬＶＡＧ、ＥＰＬＥＬＲＡＧ、ＥＰＡＡＬＭＡＧ、ＥＰＡＳＬＭＡＧ、ＲＩＧＳＬＲＴＡ、ＲＩＱＦＬＲＴＡ、ＥＰＦＨＬＭＡＧ、ＶＰＬＳＬＦＭＧ、ＥＰＬＥＬＰＡＧ、およびＥＰＬＥＬＡＡＧからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  89. 前記ＲＳが、表３に記載されるプロテアーゼからなる群から選択されるプロテアーゼによって切断され得るアミノ酸配列を含む、請求項８６に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  90. 前記バルキング部分が、ＸＴＥＮ；アルブミン結合ドメイン；アルブミン；ＩｇＧ結合ドメイン；プロリン、セリン、およびアラニンからなるポリペプチド；脂肪酸；Ｆｃドメイン；ならびにエラスチン様タンパク質からなる群から選択される、請求項８６に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  91. 前記バルキング部分がＸＴＥＮである、請求項９０に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  92. 前記ＸＴＥＮが、表５に記載される配列群から選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  93. 表１０または表１２に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドアセンブリー。
  94. インタクトな前記アセンブリーが、前記アセンブリーに連結されていないアセンブリーの対応する第１の部分と比較して、エフェクター細胞からのＴｈ１サイトカインの産生を行う能力が１／１０以下、または１／２０以下、または１／３０以下、または１／４０以下、または１／５０以下、または１／６０以下、または１／７０以下、または１／８０以下、または１／９０以下、または１／１００以下、または１／１０００以下であり、前記アセンブリーが、前記エフェクター細胞および標的細胞と接触している、請求項１から３５および９３のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  95. 前記Ｔｈ１サイトカインの産生が、ＰＢＭＣまたはＣＤ３＋Ｔ細胞ならびにアルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２ ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６ βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ１３３、ガングリオシドＧＤ３；９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原１、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、胎児アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、ＣＤ２５、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ミュラー管抑制物質受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、シアル化Ｔｎ抗原（ｓ ＴＮ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＡＧ７２、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原）、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｇ２５０、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＤＬＫ１、ＳＰ１７、ＲＯＲ１、およびＥｐｈＡ２からなる群から選択される腫瘍特異的マーカー抗原を有する標的細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてアッセイされる、請求項９４に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  96. 前記Ｔｈ１サイトカインが、ＩＬ−２、ＴＮＦ−アルファ、およびＩＦＮ−ガンマからなる群から選択される、請求項９４に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  97. 前記Ｔｈ１サイトカインの産生が、前記アセンブリーに連結されていない対応する第１の部分を投与された対象と比較して、前記アセンブリーを投与された対象に由来する血液または流体試料を使用してアッセイされる、請求項９４または請求項９６に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  98. 前記対象が、マウス、ラット、サル、およびヒトからなる群から選択される、請求項９７に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  99. インタクトな前記キメラポリペプチドアセンブリーが、同等用量で対象に投与された場合の前記アセンブリーに連結されていない前記第１の部分と比較して、対象に投与された場合の循環から溢出する能力が１／３以下、または１／１０以下、または１／２０以下、または１／３０以下、または１／４０以下、または１／５０以下、または１／６０以下、または１／７０以下、または１／８０以下、または１／９０以下、または１／１００以下である、請求項１から３５および９３のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  100. （ａ）請求項１から６１および８６から９９のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリーをコードするポリヌクレオチド、または（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補体から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
  101. 表１０または表１３に記載されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
  102. 請求項９４または請求項１０１に記載のポリヌクレオチド配列と、前記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結した組換え調節配列とを含む発現ベクター。
  103. 請求項１０２に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
  104. Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１０３に記載の単離された宿主細胞。
  105. 表７に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むモノマー融合タンパク質。
  106. （ａ）請求項１０５に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）表７に記載されるポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列；または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドの相補体から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
  107. 請求項１から６１および８６から９９のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリーまたはその相補体をコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法における、請求項１０６に記載の核酸の使用。
  108. 請求項１０６に記載のポリヌクレオチド配列と、前記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結した組換え調節配列とを含む発現ベクター。
  109. 請求項１０８に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
  110. Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１０９に記載の単離された宿主細胞。
  111. 請求項１から６１および８６から９９のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリーを産生する方法であって、宿主細胞を請求項１０２または請求項１０８に記載の発現ベクターで形質転換すること、形質転換された前記宿主細胞中での前記キメラポリペプチドアセンブリーの発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養すること、および前記キメラポリペプチドアセンブリーを可溶性ポリペプチドとして単離することを含む方法。
  112. 標的細胞の死を誘導する方法であって、前記標的細胞を、請求項１から６１および８５から９８のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリーならびにエフェクター細胞と接触させることを含み、前記接触が、膜完全性の喪失、核濃縮、核崩壊、アポトーシスの内因性経路の誘導、アポトーシスの外因性経路の誘導、アポトーシス、細胞溶解、および細胞死からなる群から選択される前記標的細胞中での効果をもたらす、方法。
  113. 前記標的細胞と前記エフェクター細胞との混合集団、ならびに前記標的細胞および前記エフェクター細胞の抗原に対する結合親和性を有する有効量の前記キメラポリペプチドアセンブリーを含むｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞ベースアッセイにおいて用いられる、請求項１１２に記載の方法。
  114. 前記標的細胞が、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２ ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６ βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ１３３、ガングリオシドＧＤ３；９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原１、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、胎児アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、ＣＤ２５、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ミュラー管抑制物質受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、シアル化Ｔｎ抗原（ｓ ＴＮ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＡＧ７２、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原）、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｇ２５０、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＤＬＫ１、ＳＰ１７、ＲＯＲ１、およびＥｐｈＡ２からなる群から選択される腫瘍特異的マーカー抗原を有し、前記エフェクター細胞がＴ細胞であり、前記エフェクター細胞抗原がＣＤ３である、請求項１１２に記載の方法。
  115. 前記標的細胞の集団を含むがんを有する対象において用いられ、前記対象に治療有効量の前記キメラポリペプチドアセンブリーを投与することを含む、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記キメラポリペプチドアセンブリーと、１つまたは複数の賦形剤とを含む医薬組成物の１つまたは複数の連続的に投与される治療有効用量として、前記キメラポリペプチドアセンブリーを投与することを含む、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記がんを有する前記対象において治療効果を達成するのに必要とされる医薬組成物の量を決定し、１つまたは複数の連続用量としての前記量を前記対象に投与するレジメンを含む、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記がんが、癌腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、芽細胞腫、乳がん、ＥＲ／ＰＲ＋乳がん、Ｈｅｒ２＋乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、悪性腹水を伴う結腸がん、粘液腫瘍、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん、メラノーマ、尿生殖路がん、卵巣がん、悪性腹水を伴う卵巣がん、腹膜癌症、子宮漿液性癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮がん、腹腔の中皮腫、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん（gastric cancer）、胃がん（stomach cancer）、小腸がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝芽腫、脂肪肉腫、膵がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、唾液腺癌、甲状腺がん、上皮がん、男化腫瘍、腺癌、肉腫、およびＢ細胞由来慢性リンパ性白血病からなる群から選択される、請求項１１５から１１７のいずれか一項に記載の方法。
  119. 全生存期間、症状評価項目、無病生存期間、客観的奏功率、完全奏効、奏効期間、無増悪生存期間、無増悪期間、治療成功期間、腫瘍測定、腫瘍サイズ、腫瘍奏効率、転移までの期間、およびバイオマーカー濃度からなる群から選択される臨床パラメーターまたは評価項目の改善をもたらす、請求項１１５から１１８のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記方法が、前記キメラポリペプチドアセンブリーの前記第１の部分を含み、前記第２の部分および第３の部分を含まない組成物の、同等の対象へのｍｍｏｌ／ｋｇの同等用量の投与と比較して、前記対象における診断的に関連する副作用の頻度、持続期間、または重症度の減少をもたらし、前記副作用が、ＩＬ−２の血漿レベルの増大、ＴＮＦ−アルファの血漿レベルの増大、ＩＦＮ−ガンマの血漿レベルの増大、敗血症、発熱性好中球減少症、神経毒性、痙攣、脳症、サイトカイン放出症候群、言語障害、平衡障害、発熱、頭痛、混乱、低血圧、好中球減少症、悪心、意識障害、見当識障害、および肝酵素の増加からなる群から選択される、請求項１１５から１１９のいずれか一項に記載の方法。
  121. 腫瘍特異的マーカーを含む腫瘍細胞に治療剤を送達する方法であって、標的細胞に、請求項１から６１および８６から９９のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリーを投与することを含み、前記治療剤が、前記腫瘍特異的マーカーに特異的に結合する前記第１の部分の前記第１の結合ドメインを介して前記標的細胞に送達される、方法。
  122. 前記腫瘍特異的マーカーが、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２ ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６ βｈＣＧ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ１３３、ガングリオシドＧＤ３；９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、ＧＭ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）、Ｗｕｅ−１、形質細胞抗原１、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＣＣＲ８、前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、メソテリン、Ａ３３抗原、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、Ｌｙ−６、デスモグレイン４、胎児アセチルコリン受容体（ｆｎＡＣｈＲ）、ＣＤ２５、がん抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、がん抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ミュラー管抑制物質受容体ＩＩ型（ＭＩＳＩＩＲ）、シアル化Ｔｎ抗原（ｓ ＴＮ）、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、エンドシアリン（ＣＤ２４８）、上皮増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、腫瘍関連抗原Ｌ６（ＴＡＬ６）、ＳＡＳ、ＣＤ６３、ＴＡＧ７２、Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原）、インスリン様増殖因子Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ２２、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｇ２５０、ＭＴ−ＭＭＰ、Ｆ１９抗原、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、アルファ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＤＬＫ１、ＳＰ１７、ＲＯＲ１、およびＥｐｈＡ２からなる群から選択される、請求項１２１に記載の方法。
  123. 前記腫瘍特異的マーカーが、アルファ４インテグリン、Ａｎｇ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ｃＭＥＴ、ＣＴＬＡ４、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＦＯＬＲ１、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）／ＨＥＲ３、ＨＥＲ２／３、メソテリン、ＭＵＣ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２からなる群から選択される、請求項１２１に記載の方法。
  124. キメラポリペプチドアセンブリーが、表１２の配列からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２３に記載の方法。
  125. キメラポリペプチドアセンブリーが、図３６または図３７に記載される配列からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２３に記載の方法。
  126. 前記腫瘍細胞が、対象における腫瘍中に存在する、請求項１２１から１２５のいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記対象が、マウス、ラット、サル、イヌ、およびヒトからなる群から選択される、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記第２の部分も前記第３の部分も前記第１の部分に対する特異的結合親和性を有さない、請求項１から６１のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  129. 前記第１の部分が、前記キメラポリペプチドアセンブリーの分子量の５０％未満を占める、請求項１から６１のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  130. 見かけの分子量係数がサイズ排除クロマトグラフィーによって評価される場合、前記第１の部分が、前記キメラポリペプチドアセンブリーの見かけの分子量係数の３０％未満、または４０％未満、または５０％未満を占める、請求項１から６１のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  131. 前記第２の部分が切断され、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第１の部分および前記第３の部分が放出されると、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって評価される場合、前記放出された第１の部分の流体力学半径が、前記インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの流体力学半径の約３０％未満、または約４０％未満、または約５０％未満である、請求項３６に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  132. 前記第２の部分が切断され、前記キメラポリペプチドアセンブリーから前記第１の部分および前記第３の部分が放出されると、流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される場合、前記放出された第１の部分の流体力学半径が、約５ｎｍ未満、または約４ｎｍ未満、または約３ｎｍ未満である、請求項３６に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  133. 前記放出された第１の部分が、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーと比較して、腫瘍組織に浸透する高い能力を有する、請求項１３２に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  134. 流体力学半径がサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される場合、インタクトなキメラポリペプチドアセンブリーの流体力学半径が、約８ｎｍより大きい、または約９ｎｍより大きい、または約１０ｎｍより大きい、請求項１から３５のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  135. 腫瘍を有する対象に投与されたインタクトなキメラポリペプチドアセンブリーが、前記腫瘍の血管系から溢出する能力と比較して、前記対象の正常組織の血管系から溢出する能力がより低い、請求項１から３５のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドアセンブリー。
  136. 表１０または表１２に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるキメラポリペプチドアセンブリー。
  137. 図３６または図３７に記載される配列からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドアセンブリー。
  138. 図３６または図３７に記載される配列からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるキメラポリペプチドアセンブリー。
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