JP6461802B2 - 置換ベンゼン化合物 - Google Patents

Description

関連出願
本願は、２０１２年１０月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／７１４，１４０号、２０１２年１０月１５日に出願された同第６１／７１４，１４５号、２０１３年３月１３日に出願された同第６１／７８０，７０３日、および２０１３年３月１４日に出願された同第６１／７８６，２７７号の優先権および利益を請求する。これらの仮出願のそれぞれの全内容は、参照により全体として本明細書中に組み込まれる。

ＥＺＨ２介在性障害（たとえばガン）を治療するために使用できる、ＥＺＨ２活性の阻害剤としての新規薬剤が継続的に必要とされる。

１つの態様において、本発明は、

から選択される置換ベンゼン化合物およびその薬剤的に許容される塩を特徴とする。

例えば、化合物は

またはその薬剤的に許容される塩である。

例えば、化合物は

である。

例えば、化合物は

またはその薬剤的に許容される塩である。

例えば、化合物は

である。

例えば、化合物は

またはその薬剤的に許容される塩である。

例えば、化合物は

である。

本発明はまた、１以上の薬剤的に許容される担体と本明細書中で開示される１以上の化合物とを含む医薬組成物も提供する。

本発明の別の態様は、ＥＺＨ２介在性障害を治療または予防する方法である。方法は、それを必要とする対象に治療有効量の本明細書中で開示される１以上の化合物を投与することを含む。ＥＺＨ２介在性障害は、少なくとも一つにはＥＺＨ２の活性が関与する疾患、障害、または状態である。１つの実施形態において、ＥＺＨ２介在性障害は、増加したＥＺＨ２活性と関連する。１つの実施形態において、ＥＺＨ２介在性障害はガンである。ＥＺＨ２介在ガンは、リンパ腫、白血病または黒色腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、濾胞性リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、混合系統白血病、または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）であり得る。１つの実施形態において、ＥＺＨ２介在ガンは、悪性ラブドイド腫瘍またはＩＮＩ１欠損腫瘍である。悪性ラブドイド腫瘍の組織学的診断は、特有のラブドイド細胞（偏在する核と豊富な好酸性細胞質とを有する大細胞）の同定およびビメンチン、ケラチンおよび上皮膜抗原に対する抗体に関する免疫組織化学に左右される。ほとんどの悪性ラブドイド腫瘍において、染色体バンド２２ｑ１１．２に位置するＳＭＡＲＣＢ１／ＩＮＩ１遺伝子は、欠失および／または突然変異によって不活性化される。１つの実施形態において、悪性ラブドイド腫瘍はＩＮＩ１欠損腫瘍であり得る。

特に指定のない限り、治療方法の任意の記載は、本明細書中で記載されるような治療または予防を提供するための化合物の使用、ならびにそのような状態を治療または予防するための薬剤を調製するための化合物の使用を包含する。治療は、ヒトまたはヒト以外の動物、例えばげっ歯類および他の疾患モデルの治療を包含する。

さらに、本明細書中で記載する化合物または方法を研究（例えばエピジェネティック酵素の研究）および他の非治療目的のために使用することができる。

ある実施形態において、本明細書中で開示される好ましい化合物は、望ましい薬理学的
および／または薬物速度論的特性、例えば、低クリアランス率および／または例えばシト
クロムＰ−４５０酵素の時間に依存し、かつ可逆的な阻害によって評価される併用療法に
おける有害な薬物相互作用の限定的なリスクを有する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）



およびその医薬として許容される塩から選択される化合物。
（項目２）

またはその医薬として許容される塩である、項目１記載の化合物。
（項目３）

である、項目１記載の化合物。
（項目４）

またはその医薬として許容される塩である、項目１記載の化合物。
（項目５）

である、項目１記載の化合物。
（項目６）

またはその医薬として許容される塩である、項目１記載の化合物。
（項目７）

である、項目１記載の化合物。
（項目８）
項目１〜７のいずれかに記載の化合物および医薬として許容される担体を含む医薬組
成物。
（項目９）
治療を必要とする対象に治療有効量の項目１〜７のいずれかに記載の化合物を投与す
ることを含む、ＥＺＨ２介在性障害を治療する方法。
（項目１０）
前記ＥＺＨ２介在性障害がガンである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ガンがリンパ腫、白血病または黒色腫である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ガンが、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、非ホジキンリンパ腫（
ＮＨＬ）、濾胞性リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病、急性リン
パ性白血病、混合系統白血病、または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である、項目１０に
記載の方法。
（項目１３）
前記ガンが悪性ラブドイド腫瘍またはＩＮＩ１欠損腫瘍である、項目１０に記載の方
法。
（項目１４）
ＥＺＨ２介在性障害を治療するための方法で使用するための項目１〜７のいずれかに
記載の化合物。
（項目１５）
ＥＺＨ２介在性障害の前記治療における薬剤の製造のための項目１〜７のいずれかに
記載の化合物の使用。
（項目１６）
ＥＺＨ２介在性障害を治療するための医薬組成物であって、項目１〜７のいずれかに
記載の化合物を主成分として含む、医薬組成物。

別段の定めがない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。明細書中で、単数形は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り．複数形も包含する。本明細書中で記載するものと類似または等しい方法および材料を本発明の実施または試験で使用できるが、好適な方法および材料を後述する。本明細書中で引用される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照により組み込まれる。本明細書中で引用される参考文献は、請求される発明の先行技術であると認められるものではない。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は単に例示的であり、限定を意図するものではない。本明細書中で開示される化合物の化学構造と名称との間に矛盾がある場合は、化学構造が優先する。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

図１は、マウスにおけるリンパ腫ＫＡＲＰＡＳ−４２２異種移植片に対する経口投与された化合物１または化合物Ａの抗腫瘍効果を示す図である。データは平均±ＳＤを表す（ｎ＝１０）。 図２は、マウス体重に対する化合物１または化合物Ａの効果を示す図である。データは平均±ＳＤを表す（ｎ＝１０）。 図３は、治療後７日もしくは２８日での腫瘍における化合物１の濃度または治療後７日での腫瘍における化合物Ａの濃度を示す図である。この図中、「Ａ」〜「Ｇ」は、それぞれ６２．５、８３．３、１２５、１６６．７、２５０、３３３．３、および５００ｍｇ／ｋｇの投与量の化合物１の投与後７日を示す；「Ｈ」および「Ｉ」は、それぞれ１２５および２５０ｍｇ／ｋｇの投薬量の化合物Ａの投与後７日を示す；そして「Ｊ」〜「Ｌ」は、それぞれ６２．５、１２５および２５０ｍｇ／ｋｇの投薬量の化合物１の投与後２８日を示す。 図４は、治療後７日または２８日の結晶中の化合物１または化合物Ａの濃度を示す図である。上の破線は化合物Ａの血漿タンパク質結合（ＰＰＢ）補正ＬＣＣを示し、下の破線は化合物１のＰＰＢ補正ＬＣＣを示す。 図５は、化合物１または化合物Ａで７日間治療されたマウス由来のＫＡＲＰＡＳ−４２２腫瘍における全体的Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３メチル化を示す図である。この図中、「Ａ」はビヒクル治療を示す；「Ｂ」〜「Ｈ」は、それぞれ６２．５、８３．３、１２５、１６６．７、２５０、３３３．３、および５００ｍｇ／ｋｇの投薬量の化合物１での治療を示す；そして「Ｉ」および「Ｊ」は、それぞれ１２５および２５０ｍｇ／ｋｇの投薬量の化合物Ａでの治療を示す。 図６は、化合物１で２８日間治療したマウス由来のＫＡＲＰＡＳ−４２２腫瘍における全体的なＨ３Ｋ２７ｍｅ３メチル化を示す図である。 図７は、化合物１または化合物Ａで７日間治療した異種移植腫瘍を有するマウス由来の骨髄における全体的Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３メチル化を示す図である。この図中、「Ａ」はビヒクル治療を示す；「Ｂ」〜「Ｈ」は、それぞれ６２．５、８３．３、１２５、１６６．７、２５０、３３３．３、および５００ｍｇ／ｋｇの投薬量の化合物１での治療を示す；そして「Ｉ」および「Ｊ」は、それぞれ１２５および２５０ｍｇ／ｋｇの投薬量の化合物Ａでの治療を示す。 図８は、化合物１で２８日間治療した異種移植腫瘍を有するマウス由来の骨髄における全体的Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３メチル化を示す図である。この図中、「Ａ」はビヒクル治療を示す；「Ｂ」〜「Ｅ」は、それぞれ６２．５、１２５、２５０、および５００ｍｇ／ｋｇの投薬量の化合物１での治療を示す；そして「Ｆ」は２５０ｍｇ／ｋｇの投薬量の化合物Ａでの治療を示す。

本発明は、新規置換ベンゼン化合物、この化合物を作製するための合成方法、それらを含む医薬組成物、およびこの化合物の様々な使用を提供する。

本発明の代表的な化合物は、表１で列挙した化合物を包含する。

本明細書において、化合物の構造式は、場合によっては簡便のためにある１つの異性体を表すが、本発明は、幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体、エナンチオマー、回転異性体、ジアステレオマー、ラセミ化合物などのあらゆる異性体を包含し得、すべての異性体が同じレベルの活性を有し得るとは限らないと理解される。加えて、結晶多形が式によって表される化合物について存在し得る。任意の結晶形態、結晶形態混合物、またはその無水物もしくは水和物が本発明の範囲内に含まれることに留意する。

「異性」とは、同じ分子式を有するが、それらの原子の結合の配列または空間におけるそれらの原子の配置が異なる化合物を意味する。空間におけるそれらの原子の配置が異なる異性体を「立体異性体」と称する。互いに鏡像でない立体異性体を「ジアステレオマー」と称し、たがに重ねあわすことができない鏡像である立体異性体を「エナンチオマー」または場合によっては光学異性体と称する。反対のキラリティーを有する個々のエナンチオマー形態の等量の混合物を「ラセミ混合物」と称する。

「幾何異性体」は、それらの存在が二重結合またはシクロアルキルリンカー（例えば、１，３−シクロブチル）の周りの束縛回転に負うジアステレオマーを意味する。これらの立体配置は、カーン・インゴルド・プレローグ順位則にしたがって、その基が分子中の二重結合の同じ側または反対側にあることを示す、接頭語シスおよびトランス、またはＺおよびＥによってその名前で区別される。

本発明の化合物は立体異性体として示すことができると理解すべきである。化合物が立体異性体を有する場合、全ての立体異性体が本発明の範囲内に含まれるわけではないということも理解されるべきであり、全ての立体異性体が同じレベルの活性を有し得るとは限らないと理解すべきである。

さらに、本明細書中で検討する構造および他の化合物はそのすべてのアトロピック（atropic）異性体を包含し、全てのアトロピック異性体が同じレベルの活性を有し得るとは限らないと理解される。「アトロピック異性体」は、２つの異性体の原子が空間において異なって配置されている立体異性体の一種である。アトロピック異性体は、中心の結合の周りの大きな基の回転の妨害に起因する束縛回転にそれらの存在を負う。そのようなアトロピック異性体は特徴的には混合物として存在するが、クロマトグラフィー技術の近年の進歩の結果、限定された場合で２つのアトロピック異性体の混合物を分離することが可能になった。

「互変異性体」は、平衡状態で存在し、１つの異性体から別の異性体へ容易に変換される２以上の構造異性体の１つである。この変換の結果、隣接する共役二重結合のスイッチに付随する水素原子のホルマール移動が起こる。互変異性体は、溶液中互変異性体のセットの混合物として存在する。互変異性化が可能な溶液中で、互変異性体の化学平衡が達成される。互変異性体の正確な比は、温度、溶媒およびｐＨをはじめとするいくつかの要因に左右される。互変異性化によって相互転換可能である互変異性体の概念は互変異性と呼ばれる。

可能な互変異性の様々な種類のうち、２つが通常観察される。ケト−エノール互変異性では、電子と水素原子の同時シフトが起こる。環−鎖互変異性は、糖鎖分子中のアルデヒド基（−ＣＨＯ）が同じ分子中のヒドロキシ基（−ＯＨ）の１つと反応する結果として起こり、それをグルコースによって示されるような環状（環の形状）形態にする。

本明細書中で用いられる場合、

のいずれの場合も

と解釈されるべきである。

一般的な互変異性体対は：ケトン−エノール、アミド−ニトリル、ラクタム−ラクチム、ヘテロ環中のアミド−イミド酸互変異性（例えば、グアニン、チミンおよびシトシンなどの核酸塩基中）、イミン−エナミンおよびエナミン−エナミンである。ケト−エノール平衡の一例は、以下で示すようなピリジン−２（１Ｈ）−オンと対応するピリジン−２−オール間である。

本発明の化合物は異なる互変異性体として示すことができると理解されるべきである。化合物が互変異性体を有する場合、全ての互変異性体は本発明の範囲内に含まれることが意図されることも理解すべきであり、化合物の命名は互変異性体を排除しない。ある互変異性体は他よりも高いレベルの活性を有し得ると理解される。

「結晶多形」、「多形体」または「結晶形態」という語は、化合物（またはその塩もしくは溶媒和物）が異なる結晶充填配置（packing arrangement）で結晶化することができ、そのすべてが同じ元素組成を有する結晶構造を意味する。異なる結晶形態は、通常、異なるＸ線回折パターン、赤外スペクトル、融点、密度硬度（density hardness）、結晶形、光学および電気特性、安定性および溶解性を有する。再結晶溶媒、晶析速度、貯蔵温度および他の因子は、１つの結晶形態が優勢になる原因となり得る。化合物の結晶多形は、異なる条件下での結晶化によって調製できる。

本発明の化合物は、例えば本明細書中で開示される式のいずれかなどの化合物自体を包含する。本発明の化合物は、妥当な場合、それらの塩、およびそれらの溶媒和物も包含する。塩は、例えば、アニオンと置換ベンゼン化合物上の正電荷を持つ基（例えばアミノ）との間に形成され得る。好適なアニオンとしては、クロリド、ブロミド、ヨージド、スルフェート、ビスルフェート、スルファメート、ニトレート、ホスフェート、シトレート、メタンスルホネート、トリフルオロアセテート、グルタメート、グルクロネート、グルタレート、マレート、マレエート、スクシネート、フマレート、タータレート（tartrate）、トシレート、サリチレート、ラクテート、ナフタレンスルホネート、およびアセテート（たとえば、トリフルオロアセテート）が挙げられる。「薬剤的に許容されるアニオン」という語は、薬剤的に許容される塩を形成するために好適なアニオンを指す。同様に、塩は、カチオンと置換ベンゼン化合物上の負電荷を有する基（例えば、カルボキシレート）との間にも形成され得る。好適なカチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、およびアンモニウムカチオン、例えばテトラメチルアンモニウムイオンが挙げられる。置換ベンゼン化合物はまた、第４窒素原子を含む塩も包含する。

さらに、本発明の化合物、たとえば化合物の塩は、水和もしくは非水和（無水）形態で、または他の溶媒分子との溶媒和物として存在し得る。水和物の非限定的例としては、一水和物、二水和物などが挙げられる。溶媒和物の非限定的例としては、エタノール溶媒和物、アセトン溶媒和物などが挙げられる。

「溶媒和物」とは、化学量論量または非化学量論量のいずれかの溶媒を含む溶媒付加形態を意味する。一部の化合物は結晶性固体状態で一定のモル比の溶媒分子をトラップする傾向があり、かくして溶媒和物を形成する。溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は水和物であり；溶媒がアルコールである場合、形成される溶媒和物はアルコラートである。水和物は、１以上の水分子と、水がＨ_２Ｏとしてその分子状態を保持する物質１分子との組み合わせによって形成される。

本明細書中で用いられる場合、「アナログ」という語は、構造的に互いに類似しているが、組成が若干異なる（１つの原子が異なる元素の原子によってもしくは特定の官能基の存在下で置換されているか、または１つの官能基が別の官能基によって置換されているような）化合物を指す。しがたって、アナログは、参考化合物に対して、機能および外観が類似または匹敵しているが、構造または起源が異なる化合物である。

本明細書中で定義されるように、「誘導体」という語は、共通のコア構造を有し、本明細書中で記載される様々な基で置換されている化合物を指す。たとえば、表１中の化合物はすべて置換ベンゼン化合物であり、共通のコアを有する。

「生物学的等価体（bioisostere）」という語は、ある原子または原子団と、別の大まかに類似している原子または原子団との交換から得られる化合物を指す。生物学的等価体置換の目的は、親化合物に類似した特性を有する新規化合物を作製することである。生物学的等価体置換は、物理化学的またはトポロジー的ベースであり得る。カルボン酸生物学的等価体の例としては、限定されるものではないが、アシルスルホンイミド、テトラゾール、スルホネートおよびホスホネートが挙げられる。例えば、Patani and LaVoie, Chem. Rev. 96, 3147-3176, 1996を参照のこと。

本発明は、本発明の化合物中に存在する原子のすべての同位体を包含することが意図される。同位体は、同じ原子番号を有するが、異なる質量数を有する原子を包含する。一般的な例として、限定されるものではないが、水素の同位体は、三重水素および重水素を包含し、炭素の同位体はＣ−１３およびＣ−１４を包含する。

本発明は、本明細書中で開示する化合物を合成するための方法を提供する。本発明はまた、実施例で示すようなスキームにしたがって本発明の様々な開示された化合物を合成するための詳細な説明も提供する。

記載全体にわたって、組成物が特定の成分を有する、包含する、または含むと記載されている場合、組成物はまた、記載された成分から本質的になる、または記載された成分からなることが想定される。同様に、方法またはプロセスが特定のプロセスステップを有する、包含する、または含むと記載されている場合、そのプロセスはまた、記載された加工ステップから本質的になるか、または記載された加工ステップからなる。さらに、本発明が操作可能なままである限り、ステップの順序またはある動作を実施する順序は重要ではない。さらに、２以上のステップまたは動作を同時に実施することができる。

本発明の合成法は、様々な官能基を許容でき、したがって、様々な置換された出発物質を使用できる。プロセスは、概してプロセス全体の最後または最後付近で望ましい最終化合物を提供するが、場合によっては、化合物をその薬剤的に許容される塩にさらに変換することが望ましい可能性がある。

本発明の化合物は、市販の出発物質、文献で公知の化合物を使用して、または容易に調製される中間体から、当業者に公知であるか、または本明細書中の教示を照らして当業者には明らかである標準的合成法および手順を使用することにより、様々な方法で調製することができる。有機分子および官能基変換および操作のための標準的合成法および手順は、関連する科学文献または当該技術分野の標準的な教科書から得ることができる。いずれか１つまたはいくつかの出典に限定されないが、古典的教科書、例えば、Smith, M. B., March, J., March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5^th edition, John Wiley & Sons: New York, 2001; Greene, T.W., Wuts, P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd edition, John Wiley & Sons: New York, 1999; R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); and L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)（参照により本明細書中に組み込まれる）は、当業者に公知の有機合成の有用で認識された参考教科書である。合成法の以下の説明は、説明のために設計され、本発明の化合物の調製のための一般的手順を限定するものではない。

当業者は、ある基が保護基の使用により反応条件からの保護を必要とする場合があることを認めるであろう。保護基は、分子中の類似した官能基を区別するために使用することもできる。保護基のリストおよびこれらの基を導入し、除去する方法は、Greene, T.W., Wuts, P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons: New York, 1999で見いだすことができる。

好ましい保護基としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる：

ヒドロキシル部分については：ＴＢＳ、ベンジル、ＴＨＰ、Ａｃ

カルボン酸については：ベンジルエステル、メチルエステル、エチルエステル、アリルエステル

アミンについては：Ｃｂｚ、ＢＯＣ、ＤＭＢ

ジオールについては：Ａｃ（×２）ＴＢＳ（×２）、または一緒になった場合アセトニド

チオールについては：Ａｃ

ベンゾイミダゾールについては：ＳＥＭ、ベンジル、ＰＭＢ、ＤＭＢ

アルデヒドについては：ジメトキシアセタールまたはジエチルアセチルなどのジ−アルキルアセタール

明細書中で記載する反応スキームで、複数の立体異性体が生じる可能性がある。特定の立体異性体が表示されていない場合、反応から生じ得るすべての可能な立体異性体を意味すると理解される。当業者は、１つの異性体が優先的に得られるように最適化することができる、または単一の異性体を製造するための新規スキームを考案できることを当業者は認めるであろう。混合物が生じる場合、分取薄層クロマトグラフィー、分取ＨＰＬＣ、分取キラルＨＰＬＣ、または分取ＳＦＣなどの技術を使用して異性体を分離することができる。

以下の略語を明細書全体にわたって使用し、以下のように定義される：

Ａｃ アセチル

ＡｃＯＨ 酢酸

ａｑ． 水性

ＢＩＤまたはｂ．ｉ．ｄ． ｂｉｓ ｉｎ ｄｉｅ（１日２回）

ＢＯＣ ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル

Ｃｂｚ ベンジルオキシカルボニル

ＣＤＣｌ_３ 重クロロホルム

ＣＨ_２Ｃｌ_２ ジクロロメタン

ＤＣＭ ジクロロメタン

ＤＭＢ ２，４ ジメトキシベンジル

ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド

ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド

ＥＡまたはＥｔＯＡｃ 酢酸エチル

ＥＤＣまたはＥＤＣＩ Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド

ＥＳＩ− エレクトロスプレー 陰イオンモード

ＥＳＩ＋ エレクトロスプレー 陽イオンモード

ＥｔＯＨ エタノール

ｈ 時間

Ｈ_２Ｏ 水

ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール

ＨＣｌ 塩化水素または塩酸

ＨＰＬＣ 高性能液体クロマトグラフィー

Ｋ_２ＣＯ_３ 炭酸カリウム

ＬＣ／ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ 液体クロマトグラフィー質量スペクトル

Ｍ モル濃度

ＭｅＣＮ アセトニトリル

ｍｉｎ 分

Ｎａ_２ＣＯ_３ 炭酸ナトリウム

Ｎａ_２ＳＯ_４ 硫酸ナトリウム

ＮａＨＣＯ_３ 重炭酸ナトリウム

ＮａＨＭＤｓ ナトリウムヘキサメチルジシラジド

ＮａＯＨ 水酸化ナトリウム

ＮａＨＣＯ_３ 重炭酸ナトリウム

Ｎａ_２ＳＯ_４ 硫酸ナトリウム

ＮＭＲ 核磁気共鳴

Ｐｄ（ＯＨ）_２ 二水酸化パラジウム

ＰＭＢ パラメトキシベンジル

ｐ．ｏ． ｐｅｒ ｏｓ （経口投与）

ｐｐｍ １００万分の１部

ｐｒｅｐ ＨＰＬＣ 分取高性能液体クロマトグラフィー

ＰＹＢＯＰ （ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート

ＲｔまたはＲＴ 室温

ＴＢＭＥ ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル

ＴＦＡ トリフルオロ酢酸

ＴＨＦ テトラヒドロフラン

ＴＨＰ テトラヒドロピラン

本発明の化合物は、当業者に周知の様々な方法によって都合よく調製することができる。本明細書中で開示される任意の式を有する本発明の化合物は、市販の出発物質または文献の手順を用いて調製できる出発物質から、下記実施例に示した手順にしたがって調製できる。

本明細書中で記載される反応シーケンスおよび合成スキームの間、あるステップの順序、例えば保護基の導入および除去は変更できることに当業者は気づくであろう。

本発明の化合物は、ＥＺＨ２またはその突然変異体のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を阻害し、したがって、本発明の１つの態様では、本明細書中で開示されるある化合物は、ＥＺＨ２が関与するある状態および疾患を治療または予防する候補である。本発明は、その過程がヒストンまたは他のタンパク質のメチル化状態を調節することによって影響を受ける可能性がある状態および疾患を治療するための方法を提供する。ヒストンのメチル化状態の調節は、今度はメチル化によって活性化される標的遺伝子、および／またはメチル化によって抑制される標的遺伝子の発現レベルに影響を及ぼす可能性がある。そのような治療を必要とする対象に、治療有効量の本発明の化合物、またはその薬剤的に許容される塩、多形体、溶媒和物、もしくは立体異性体を投与することを含む。

特に指定のない限り、治療方法の任意の記載は、本明細書中で記載されるような治療または予防を提供するための化合物の使用、ならびにそのような状態を治療または予防するための薬剤を調製するための化合物の使用を包含する。治療は、ヒトまたはヒト以外の動物、例えばげっ歯類および他の疾患モデルの治療を包含する。

さらに別の態様では、本発明は、それを必要とする対象において、ヒストンＨ３上のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）のモノメチル化〜トリメチル化を触媒するＰＲＣ２複合体の触媒サブユニットであるＥＺＨ２の活性を調節する方法に関する。例えば、方法は、変異ＥＺＨ２を発現するガンと有する対象に治療有効量の本明細書中で記載される化合物を投与するステップを含み、ここで、化合物（複数可）は、ＥＺＨ２のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を阻害し、それによってガンを治療する。

例えば、ＥＺＨ２介在性ガンは、濾胞性リンパ腫および胚芽中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）サブタイプのびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）からなる群から選択される。例えば、ガンはリンパ腫、白血病または黒色腫である。好ましくは、リンパ種は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、濾胞性リンパ腫またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。あるいは、白血病は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病または混合系統白血病である。

例えば、ＥＺＨ２介在性前ガン状態は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、以前は前白血病と呼ばれていた）である。

例えば、ＥＺＨ２介在性ガンは血液がんである。

本発明の化合物は、ＥＺＨ２またはその突然変異体のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を阻害し、したがって、本発明はまた、その過程がヒストンまたは他のタンパク質のメチル化状態を調節することによって影響を受ける可能性がある状態および疾患を治療するための方法も提供し、ここで、前記メチル化状態は少なくとも１つにはＥＺＨ２の活性が介在する。本発明の１つの態様では、本明細書中で開示されるある化合物は、ある状態および疾患を治療、または予防するための候補である。ヒストンのメチル化状態の調節は、今度はメチル化によって活性化される標的遺伝子、および／またはメチル化によって抑制される標的遺伝子の発現レベルに影響を及ぼす可能性がある。方法は、そのような治療を必要とする対象に、治療有効量の本発明の化合物を投与することを含む。

本明細書中で用いられる場合、「対象」は「それを必要とする対象」と交換可能であり、どちらもＥＺＨ２が介在するタンパク質メチル化が関与する障害にかかっている対象、または集団全体に対してそのような障害を発症するリスクが増大している対象を指す。「対象」は哺乳類を包含する。哺乳類は、例えばヒトまたは適切なヒト以外の哺乳類、例えば霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジまたはブタであり得る。対象は、鳥または家禽でもあり得る。１つの実施形態において、哺乳類はヒトである。それを必要とする対象は、ガンまたは前ガン状態を有すると依然に診断または特定された対象であり得る。それを必要とする対象はまた、ガンまたは前ガン状態を有する（例えばかかっている）対象でもあり得る。別法として、それを必要とする対象は、集団全体に対してそのような障害を発症するリスクが増大した対象（すなわち、集団全体に対してそのような障害を発症する経口がある対象）であり得る。それを必要とする対象は前ガン状態を有し得る。それを必要とする対象は、難治性または耐性ガン（すなわち、治療に反応しない、またはまだ治療に反応していないガン）を有し得る。対象は、治療開始時に耐性であり得るか、または治療中に耐性になり得る。いくつかの実施形態では、それを必要とする対象は、ほとんどの最近の治療で寛解後にガンを再発している。いくつかの実施形態では、それを必要とする対象は、がん治療のあらゆる公知の有効な治療を受け、失敗した。いくつかの実施形態では、それを必要とする対象は少なくとも１つの前治療を受けた。好ましい実施形態では、対象はガンまたはガン性状態を有する。例えば、ガンは、リンパ腫、白血病、黒色腫、または横紋筋肉腫である。好ましくは、リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。あるいは、白血病は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。前ガン状態は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ、以前は前白血病と呼ばれていた）である。

本明細書中で用いられる場合、「治療する（treatingまたはtreat）」は、疾患、状態、または障害と闘うための患者の管理および看護を表し、本発明の化合物、またはその薬剤的に許容される塩、多形体もしくは溶媒和物を投与して、疾患、状態または障害の症状または合併症を軽減する、あるいは疾患、状態または障害を除去することを含む。「治療する」という語はまた、インビトロの細胞または動物モデルの処置も包含し得る。

本発明の化合物、またはその薬剤的に許容される塩、多形体もしくは溶媒和物は、関連する疾患、状態または障害を予防するため、あるいはそのような目的のための好適な候補を特定するために使用することもできる。本明細書中で用いられる場合、「予防する（preventing、prevent）」または「〜から保護する」は、そのような疾患、状態または障害の症状または合併症の開始を減少または除去することを記載する。

ＥＺＨ２の単一アミノ酸残基（たとえば、Ｙ６４１、Ａ６７７、およびＡ６８７）でのＥＺＨ２遺伝子の点突然変異はリンパ腫と関連づけられることが報告されている。ＥＺＨ２突然変異体および突然変異の検出方法および突然変異関連障害の治療方法のさらなる例は、例えば、その全体が参照により全体として本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２０１３００４０９０６号で記載されている。

当業者は、本明細書中で開示される公知技術または同等の技術の詳細な説明に関して一般的な参考書を参照できる。これらの教科書には、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (2005); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3^rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2000); Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, N.Y.; Enna et al., Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, N.Y.; Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics (1975), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18^th edition (1990)が含まれる。これらの文書も、もちろん本発明の態様の作製または使用において参照することができる。

本明細書中で用いられる場合、「併用療法」または「同地治療」は、本発明の化合物、またはその薬剤的に許容される塩、多形体もしくは溶媒和物、ならびにこれらの治療薬の相互作用から有益な効果を提供することを意図される特定の治療計画の一部として少なくとも第２の薬剤の投与を含む。組み合わせの有益な効果としては、限定されるものではないが、治療薬の組み合わせに起因する薬物動態または薬力学的相互作用があげられる。

本発明はまた、少なくとも１つの薬剤的に許容される賦形剤または担体と組み合わされた本明細書中で開示される化合物を含む医薬組成物も提供する。
「医薬組成物」は、対象への投与に適した形態の本発明の化合物を含む配合物である。１つの実施形態において、医薬組成物はバルクで、または単位投与形態である。単位投与形態は、例えば、カプセル、ＩＶバッグ、錠剤、エアゾル吸入具上の単一ポンプ（single pump）またはバイアルをはじめとする様々な形態のいずれかである。単位用量の組成物中の活性成分（たとえば、開示された化合物またはその塩、水和物、溶媒和物もしくは異性体の処方）の量は有効量であり、関連する特定の治療によって変わる。患者の年齢および状態に応じて投薬量に所定の変動を加える必要がある場合があることを当業者は理解するであろう。投薬量はまた、投与経路にも依存する。経口、肺、直腸、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、吸入、口腔、舌下、胸膜内、くも膜下腔内、鼻腔内などをはじめとする様々な経路が想定される。本発明の化合物の局所または経皮投与用の投与形態としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、貼付剤および吸入剤が挙げられる。１つの実施形態では、活性化合物を無菌条件下で薬剤的に許容される担体、必要とされる任意の防腐剤、緩衝液、またはプロペラントと混合する。

本明細書中で用いられる場合、「薬剤的に許容される」という表現は、健全な医学的判断の範囲内であり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症がなくヒトよび動物の組織と接触した使用に好適であり、妥当な損益比で釣り合う化合物、アニオン、カチオン、材料、組成物、担体、および／または投与形態を指す。

「薬剤的に許容される賦形剤」とは、一般的に安全、非毒性で、生物学的にも、またその他でも望ましくないものではない賦形剤を意味し、獣医学的用途ならびにヒト製薬学的用途について許容される賦形剤を包含する。明細書および特許請求のっ範囲で使用される「薬剤的に許容される賦形剤」は、１以上のそのような賦形剤を包含する。

本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように処方される。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、および経粘膜投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸；緩衝液、例えばアセテート、市トレートまたはホスフェート、ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性調節剤。ｐＨは酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調節することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回投与用バイアル中に封入することができる。

本発明の化合物または医薬組成物を、化学療法のために現在使用される周知の方法の多くで対象に投与することができる。例えば、ガンの治療に関しては、本発明の化合物を腫瘍に直接注入、血流もしくは体腔中に注入または経口接種または貼付剤で皮膚を通して適用することができる。選択される用量は、有効な治療をもたらすために充分でなければならないが、許容されない副作用を引き起こすほど高くてはならない。疾患状態（例えば、ガン、前ガン状態、およびその他）ならびに患者の健康は、治療中または治療後妥当な期間、注意深くモニタリングしなければならない。

「治療有効量」という語は、本明細書中で用いられる場合、特定された疾患もしくは状態を治療、改善、または予防する、あるいは検出可能な治療効果または阻害効果を示す医薬品の量を指す。効果は、当該技術分野で公知の任意のアッセイ法によって検出できる。対象に関する正確な有効量は、対象の体重、サイズ、および健康；状態の性質および程度；ならびに投与のために選択された治療または治療の組み合わせに左右される。所与の状況に関する治療有効量は、臨床医の技術および判断の範囲内である日常的な実験によって決定することができる。好ましい態様において、治療される疾患または状態はガンである。別の態様では、治療される疾患または状態は細胞増殖性障害である。

任意の化合物について、治療有効量は、例えば新生細胞の細胞培養において、または動物モデル、通常はラット、ウサギ、イヌ、もしくはブタにおいてのいずれかでまず推定することができる。動物モデルは、適切な濃度範囲および投与経路を決定するためにも使用できる。そのような情報は次いでヒトにおける投与のために有用な用量および経路を決定するために使用できる。治療／予防効果および毒性、例えばＥＤ_５０（集団の５０％で治療上有効な用量）およびＬＤ_５０（集団の５０％に対して致死的な用量）は、細胞培養または実験動物における標準的な調剤手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比は治療指数であり、これは比ＬＤ_５０／ＥＤ_５０として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。投薬量は、用いられる投与形態、患者の感受性、および投与経路に応じて個の範囲内で変動し得る。

充分なレベルの活性剤（複数可）を提供するため、または所望の効果を維持するために、投薬量および投与を調節する。考慮され得る因子としては、疾患状態の重篤度、対照の全体的健康状態、対照の年齢、体重、および性別、食事、投与時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、ならびに治療に対する寛容性／応答が挙げられる。長時間作用型医薬組成物は、特定の処方の半減期およびクリアランス率に応じて、３〜４日ごと、毎週、または２週間ごとに１回投与することができる。

本発明の活性化合物を含む医薬組成物は、一般的に公知の方法で、例えば通常の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、ゲル化（levigating）、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥法によって製造することができる。医薬組成物は、活性化合物を薬剤敵意使用できる製剤に加工するのを促進する賦形剤および／または補助薬を含む１以上の薬剤的に許容される担体を使用する通常の方法で処方することができる。もちろん、適切な処方は、選択された投与経路に左右される。

注射用途に好適な医薬組成物は、無菌注射溶液もしくは分散液の即時調製のための無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および無菌粉末を含む。静脈内投与に関して、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州パーシッパニー）またはリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射針に通過する程度まで流動性でなければならない。それは、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにそれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は必要とされる粒子サイズの維持、そして界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の予防は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌剤および抗真菌剤によって達成できる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖、マンニトールおよびソルビトールなどのポリアルコール、ならびに塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物中に、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。

無菌注射溶液は、活性化合物を必要とされる柳雄で適切な溶媒中、上述の成分の１つまたはっ組み合わせとともに組み入れ、続いて濾過滅菌することによって調製できる。概して、分散液は、塩基性分散媒および上述のものからの必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクル中に活性化合物を組み入れることによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これによって活性成分の粉末と、あらかじめ滅菌濾過されたその溶液からの任意のさらなる所望の成分が得られる。

経口組成物は概して不活性希釈剤または可食性の薬剤的に許容される担体を含む。それらはゼラチンカプセル中に封入することができるか、または圧縮して錠剤にすることができる。経口治療投与のために、活性化合物を賦形剤とともに組み入れることができ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用することができる。経口組成物は、洗口剤として使用される流体担体を使用して調製することもでき、この場合、流体担体中の化合物を経口適用し、くちゅくちゅし、吐き出すかまたは飲み込む。薬剤的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分のいずれか、または類似の性質の化合物を含み得る：バインダー、例えば微結晶セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはコーンスターチ；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化珪素；甘味剤、例えばスクロースもしくはサッカリン；または香味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジフレーバー。

吸入による投与のために、化合物は、好適なプロペラント、例えば二酸化炭素などのガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアゾルスプレーの形態で送達される。

全身投与は、経粘膜または経皮手段によるものでもあり得る。経粘膜または経皮投与に関しては、透過されるバリヤに適切な浸透剤を処方で使用する。そのような浸透剤は、概して当該技術分野で公知であり、例えば経粘膜投与については、洗剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用により達成することができる。経皮投与のために、活性化合物は、当該技術分野で一般的に公知の軟膏、軟膏（salve）、ゲル、またはクリームに処方される。

活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムをはじめとする制御放出処方などの、身体からの迅速排除から化合物を保護する薬剤的に許容される担体を用いて、活性化合物を調製できる。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用できる。そのような処方の調製のための方法は、当業者には明らかである。材料は、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染した細胞を標的とするリポソームを含む）は、薬剤的に許容される担体として使用することもできる。これらは、当業者に公知の方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号で記載されているようにして調製することがでいる。

投与の容易性および投薬量の均一性のために、単位投与形態の経口または非経口組成物に処方することが特に有利である。本明細書中で用いられる場合、単位投与形態は、治療される対象に単位投薬量として適した物理的に独立した単位を指す；各単位は、必要とされｒ鵜医薬担体と組み合わせて所望の治療効果をもたらすように計算されたあらかじめ決められた量の活性化合物を含む。本発明の単位投与形態についての明細は、活性化合物の独自の特性および達成される特定の治療効果によるか、または直接依存して決定される。

治療への応用で、本発明にしたがって使用される医薬組成物の投薬量は、選択された投薬量に影響を及ぼす他の因子の中でも、薬剤、受容患者の年齢、体重、および臨床症状、ならびに治療を施す臨床医または開業医の経験および判断によって変わる。概して、用量は、腫瘍成長の遅延、およびこのましくは退行をもたらし、そしてまた好ましくはガンの完全縮小を引き起こすのに充分でなければならない。投薬量は、１日あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇから１日あたり約５０００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。好ましい態様において、投薬量は１日当たり約１ｍｇ／ｋｇから１日あたり約１０００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。１つの態様では、用量は、単回、分割、または持続投与量で、約０．１ｍｇ／日〜約５０ｇ／日；約０．１ｍｇ／日〜約２５ｇ／日；約０．１ｍｇ／日〜約１０ｇ／日；約０．１ｍｇ〜約３ｇ／日；または約０．１ｍｇ〜約１ｇ／日の範囲内である（この用量は、患者の体重（ｋｇ）、体表面積（ｍ^２）、および年齢（歳）について調節することができる）。医薬品の有効量は、臨床医または他の資格のある観察者によって指摘される客観的に確認可能な改善を提供するものである。例えば、患者における腫瘍の退縮は、腫瘍の直径に関連して測定することができる。腫瘍の直径の減少は退縮を意味する。退縮は、治療をやめた後に腫瘍が再発しないことによっても示される。本明細書中で用いられる場合、「効果的な投薬量（dosage effective manner）」とは、対象または細胞において所望の生物学的効果をもたらす活性化合物の量を指す。

医薬組成物を容器、パック、またはディスペンサー中に投与のための使用説明書とともに含めることができる。

本発明の化合物はさらに塩を形成する可能性がある。これらの形態のいずれも請求される発明の範囲内に含まれることが想定される。

本明細書中で用いられる場合、「薬剤的に許容される塩」は、親化合物がその酸または塩基塩を作製することによって修飾される本発明の化合物の誘導体を指す。薬剤的に許容される塩の例としては、限定されるものではないが、アミン、アルカリなどの塩基性残基の鉱酸もしくは有機酸塩またはカルボン酸などの酸性残基の有機塩などが挙げられる。薬剤的に許容される塩としては、例えば非毒性無機または有機酸から形成される親化合物の通常の非毒性塩または第４アンモニウム塩が挙げられる。例えば、そのような通常の非毒性塩としては、限定されるものではないが、２−アセトキシ安息香酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、酢酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、重炭酸、炭酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、１，２−エタンスルホン酸、フマル酸、グルコへプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリコール酸、グリコリルアルサニル酸（glycollyarsanilic）、ヘキシルレゾルシン酸、ヒドラバミン酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフトエ酸、イソチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ナプシル酸、硝酸、シュウ酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、ポリガラクツロン酸、プロピオン酸、サリチル（salicyclic）酸、ステアリン酸、スバセチン酸、コハク酸、スルファミン酸、スルファニリン酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、および一般的に存在するアミン酸、例えばグリシン、アラニン、フェニルアラニン、アルギニンなどから選択される無機および有機酸由来のものが挙げられる。

薬剤的に許容される他の例としては、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、ピルビン酸、マロン酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ−［２．２．２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第３ブチル酢酸、ムコ酸などが挙げられる。本発明はまた、親化合物中に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属、またはアルミニウムイオンによって置換されている場合に形成される塩；またはエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどの有機塩基との配位体を包含する。塩形態において、化合物と塩のカチオンまたはアニオンとの比は、１：１、または１：１以外の任意の他の比、例えば３：１、２：１、１：２、または１：３であり得ると理解される。

薬剤的に許容される塩に関するすべての言及は、同じ塩の本明細書中で定義されるような溶媒付加形態（溶媒和物）または結晶形態（多形体）を包含すると理解されるべきである。

化合物、またはその薬的に許容される塩は、経口、経鼻、経皮、肺、吸入、口腔、舌下、腹腔内（intraperintoneally）、皮下、筋肉内、静脈内、直腸、胸膜内、くも膜下腔内および非経口投与される。１つの実施形態では、化合物を経口投与する。当業者はある投与経路の利点を認めるであろう。

化合物を利用する投薬計画は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的状態；治療される状態の重篤度；投与経路；患者の腎機能および肝機能；および用いられる特定の化合物またはその塩をはじめとする様々な因子にしたがって選択される。通常の技術を有する医師または獣医師は状態を予防、対抗または進行を阻止するために必要な薬物の有効量を容易に決定し、処方することができる。

開示された本発明の化合物の処方および投与のための技術は、Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995)で見出すことができる。１つの実施形態において、本明細書中で記載される化合物、およびその薬剤的に許容される塩を、薬剤的に許容される担体または希釈剤と組み合わせた製剤で使用する。好適な薬剤的に許容される担体には、不活性固体フィラーまたは希釈剤および水溶液または有機溶液が含まれる。化合物は、そのような組成物中、本明細書中で記載される範囲内の所望の投与量を提供するために充分な量で存在する。

本明細書中で用いられるすべてのパーセンテージおよび比は、別段の指示がない限り、重量基準である。本発明の他の特徴および利点は、様々な実施例から明らかである。提供した実施例は、本発明の実施に有用な様々な成分および方法を示す。実施例は請求される発明を限定しない。本開示に基づいて、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を特定でき、利用できる。

本明細書中で記載される合成スキームおよび化学構造において、化合物は、簡単にするために１つの特定の立体配置（例えば１つの特定の立体異性体を表示または非表示）で描くことができる。そのような特定の立体配置は、本発明を１つまたは別の異性体、互変異性体、位置異性体または立体異性体に限定すると解釈されるべきではなく、また異性体、互変異性体、位置異性体または立体異性体を排除するものでもない；しかしながら、所与の異性体、互変異性体、位置異性体または立体異性体は、別の異性体、互変異性体、位置異性体、または立体異性体よりも高い活性レベルを有し得ると理解される。

上述の方法によって設計、選択および／または最適化された化合物は、一旦製造されると、化合物が生物学的活性を有するかどうかを判定する当業者に公知の様々なアッセイを使用して特徴づけることができる。例えば、分子は、限定されるものではないが、それらが予想される活性、結合活性、および／または結合特異性を有するかどうかを判定するための後述するアッセイをはじめとする通常のアッセイによって特徴づけることができる。

さらに、ハイスループットスクリーニングを使用して、そのようなアッセイを用いる分析を迅速化することができる。 その結果、本明細書中に記載される分子を活性について、当該技術分野で公知の技術を用いて迅速にスクリーニングすることが可能であり得る。 ハイスループットスクリーニングを実施するための一般的方法は、例えば、Devlin (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker; and U.S. Patent No. 5,763,263；および米国特許第５，７６３，２６３号で記載されている。 ハイスループットアッセイは、限定されるものではないが、後述するものをはじめとする１以上の異なるアッセイ技術を使用できる。

本明細書中で言及されるすべての刊行物および特許文書は、そのような刊行物または文書のそれぞれが、参照により本明細書中に組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、参照により本明細書中に組み込まれる。 刊行物および特許文書の言及は、いずれも関連のある先行技術であることを認めることを意図せず、またその内容または日付に関する承認を構成するものでもない。 本発明を明細書によって説明してきたが、当業者は、本発明を様々な実施形態で実施することができ、前述の記載事項および後述の実施例は説明のためであり、以下の特許請求の範囲を限定するものではないことを理解するであろう。
実施例
実施例１ 本発明の化合物の合成
一般的実験
ＮＭＲ

特に指定のない限り、ＣＤＣｌ_３を使用して^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを取得し、そしてＶａｒｉａｎまたはＯｘｆｏｒｄ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ｍａｇｎｅｔ（５００ＭＨｚ）装置を使用して４００ＭＨｚまたは５００ＭＨｚで記録した。表示された多重度は、ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｑｕｉｎｔ＝五重項、ｓｘｔ＝六重項、ｍ＝多重項、ｄｄ＝二重項の二重項、ｄｔ＝三重項の二重項である；ｂｒはブロードなシグナルを示す。

ＬＣＭＳおよびＨＰＬＣ
質量： Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬＣ。ＨＰＬＣ：生成物を、１５０×４．５ｍｍのＹＭＣ ＯＤＳ−Ｍ８０カラムまたは１５０×４．６ｍｍのＹＭＣ−パック Ｐｒｏ Ｃ１８カラムを有するＳｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ−２０Ａで１．０ｍｌ／分にて分析した。移動相は、ＭｅＣＮ：Ｈ_２Ｏ＝３：２（０．３％のＳＤＳおよび０．０５％のＨ_３ＰＯ_４を含む）。生成物を、３１００ Ｍａｓｓ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを有するＷａｔｅｒｓ Ａｕｔｏ精製 Ｓｙｓｔｅｍを使用するＨＰＬＣ／ＭＳ（０．１％水酸化アンモニウムを含むＭｅＯＨ−Ｈ_２Ｏ）によって精製した。

３−（アミノメチル）−４，６−ジメチル−１，２−ジヒドロピリジン−２−オンＨＣｌ塩

２−シアノアセトアミド（８．４０ｇ、１００ミリモル）およびアセチルアセトン（１０．０ｇ、１００ミリモル）のＨ_２Ｏ（２００ｍＬ）中溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（４．００ｇ、２８．９ミリモル）を添加した。混合物を室温で２２時間撹拌した。次いで沈殿した固体をブフナー漏斗でろ過し、氷冷Ｈ_２Ｏで洗浄し、そして真空下で乾燥して、４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボニトリル（１３．５ｇ、９１％収率）を得た。

４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−カルボニトリル（１０．０ｇ、６７．５ミリモル）のＭｅＯＨ（１．５０Ｌ）および濃ＨＣｌ（３０ｍＬ）中溶液１０％Ｐｄ（ＯＨ）_２（１９ｇ）をＮ_２雰囲気下で添加した。Ｎ_２ガスをＨ_２ガスで置換し、混合物を２６時間室温にて水素雰囲気下で撹拌した。Ｈ_２ガスをＮ_２ガスで置換した。混合部宇と、セライトを通して濾過し、ＭｅＯＨで洗浄し、濃縮した。残留物をＥｔＯＨで摩砕し、ブフナー漏斗で集め、そして真空下で乾燥して、表題化合物を白色固体として得た（１１．５ｇ、９０％）。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ ppm 11.86 (brs, 1H), 5.98 (s, 1H), 3.78 (m, 2H), 2.20 (s, 3H), 2.16 (s, 3H).

５−ブロモ−２−メチル−３−ニトロ安息香酸

２−メチル−３−ニトロ安息香酸（５．００ｇ、２７．６ミリモル）のＨ_２ＳＯ_４（２０ｍＬ）中撹拌溶液に、１，３−ジブロモ−５，５−ジメチルヒダントイン（４．３４ｇ、１５．２０ミリモル）を０℃で添加した。反応混合物を０℃で５時間撹拌した。反応混合物を氷冷水上に注ぎ、結果としての析出した固体を集め、水で洗浄し、真空中で乾燥させて、表題化合物を白色固体として得た（７．２８ｇ、定量的収率）。¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm; 8.31 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 2.43 (s, 3H).

５−ブロモ−２−メチル−３−ニトロ安息香酸メチル

５−ブロモ−２−メチル−３−ニトロ安息香酸（７．２８ｇ、２８．０ミリモル）のＤＭＦ（１００ｍＬ）中撹拌溶液に、炭酸ナトリウム（１１．９ｇ、１１２ミリモル）およびヨウ化メチル（１５．９ｇ、１１２ミリモル）を添加した。反応混合物を６０℃で８時間撹拌した。反応完了後、反応混合物をろ過し、酢酸エチルで洗浄した。合した濾液を水で洗浄し、水相を酢酸エチルで再抽出した。合した有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物を固体として得た。（７．７４ｇ、定量的収率）。¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm); 8.17 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 2.59 (s, 3H).

３−アミノ−５−ブロモ−２−メチル安息香酸メチル

５−ブロモ−２−メチル−３−ニトロ安息香酸メチル（７．６０ｇ、２７．７ミリモル）のＥｔＯＨ水溶液（１００ｍＬのＥｔＯＨおよび２０ｍＬのＨ_２Ｏ）中撹拌溶液に、塩化アンモニウム（４．４５ｇ、８３．１ミリモル）および鉄（４．６４ｇ、８３．１ミリモル）を添加した。反応混合物を８０℃で５時間撹拌した。次いでセライトを通して混合物をろ過し、セライト床を酢酸エチルで洗浄した。合した濾液を真空中で濃縮した。結果としての残留物を酢酸エチルおよび水中に溶解させた。水層を酢酸エチルで抽出した（２回）。合した有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮して、表題化合物を褐色油として得た（６．６７ｇ、９９％）。¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm; 7.37 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.80 (brs, 2H), 2.31 (s, 3H).

化合物１：

ステップ１：５−（（（トランス）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）シクロヘキシル）（エチル）アミノ）−４’−ヒドロキシ−４−メチル−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボン酸メチルの合成

５−ブロモ−３−（（（トランス）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）シクロヘキシル）（エチル）アミノ）−２−メチル安息香酸メチル（１０ｇ、２１．３ミリモル、例えば、ＷＯ２０１２１４２５０４（代理人整理番号４１４７８−５０７００１ＷＯ）を参照のこと）および（４−ヒドロキシフェニル）ボロン酸（３．５ｇ、２５．３ミリモル）のジオキサン（２２５ｍＬ）および水（７５ｍＬ）の混合物中撹拌溶液に、Ｎａ_２ＣＯ_３（８．０１ｇ、７５．５ミリモル）を添加し、そして溶液にアルゴンを３０分間パージした。次いでＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（２．４ｇ、２．０７ミリモル）を添加し、そしてアルゴンを再度さらに１５分間パージした。反応生成物を１００℃で４時間加熱した。完了したら、反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。合した有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、続いてカラムクロマトグラフィー精製をおこなって、表題化合物を得た（８．９ｇ、８７％収率）。

ステップ２：５−（（（トランス）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）シクロヘキシル）（エチル）アミノ）−４’−（２−メトキシエトキシ）−４−メチル−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボン酸メチルの合成

５−（（（トランス）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）シクロヘキシル）（エチル）アミノ）−４’−ヒドロキシ−４−メチル−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボン酸メチル（０．６ｇ、１．２４ミリモル）および１−ブロモ−２−メトキシエタン（０．５１９ｇ、３．７３ミリモル）のアセトニトリル（６ｍＬ）中撹拌溶液に、Ｃｓ_２ＣＯ_３（０．４８５ｇ、１．４９ミリモル）を添加し、そして反応を８０℃で１２時間撹拌した。完了したら、水をそれに添加し、酢酸エチルで抽出した。合した有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗化合物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を得た（０．６ｇ、７６．５％収率）。

ステップ３：（（トランス）−４−（（５−（（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）−４’−（２−メトキシエトキシ）−４−メチル−［１，１’−ビフェニル］−３−イル（エチル）−アミノ）−シクロヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成

ＮａＯＨ水溶液（０．０６６ｇ、５ｍＬのＨ２Ｏ中１．６６ミリモル）を５−（（（トランス）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）シクロヘキシル）（エチル）アミノ）−４’−（２−メトキシエトキシ）−４−メチル−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボン酸メチル（０．６ｇ、１．１１ミリモル）のＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中溶液に添加し、そして６０℃で１時間撹拌した。反応完了後、エタノールを減圧下で除去し、クエン酸を用いて残留物をｐＨ４に酸性化した。１０％ＤＣＭ中メタノールを使用して抽出を実施した。合した有機層を乾燥させ、濃縮して、各酸を得た（０．５ｇ、８５．６％収率）。

上記酸（０．５ｇ、０．９５ミリモル）を次いでＤＭＳＯ（５ｍＬ）中に溶解させ、３−（アミノメチル）−４，６−ジメチルピリジン−２（１Ｈ）−オン（０．２８８ｇ、１．９０ミリモル）およびトリエチルアミン（０．０９６ｇ、０．９５０ミリモル）をそれに添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した後、ＰｙＢｏｐ（０．７４１ｇ、１．４２ミリモル）をそれに添加し、撹拌を一晩室温で続けた。反応完了後、反応生成物を氷中に注ぎ、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭを使用して抽出を実施した。合した有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗物質を得、これを次いでカラムクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を得た（０．４５ｇ、７１．８％収率）。

ステップ４：Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−５−（（（トランス）−４−（ジメチルアミノ）−シクロヘキシル）（エチル）−アミノ）−４’−（２−メトキシエトキシ）−４−メチル−［１，１’−ビフェニル］−３−カルボキサミドの合成

０℃で（（トランス）−４−（（５−（（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）−４’−（２−メトキシエトキシ）−４−メチル−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（エチル）アミノ）シクロヘキシル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（０．４５ｇ、０．６８１ミリモル）のＤＣＭ（５ｍＬ）中撹拌溶液に、ＴＦＡ（１ｍＬ）を添加し、反応を２時間室温で撹拌した。完了後、反応を濃縮乾固した。残留物を次いでＮａ_２ＣＯ_３（水溶液）でｐＨ８に塩基性化し、水層をＤＣＭ中２０％メタノールで抽出した。合した有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、溶媒を減圧下で除去して、Ｂｏｃ脱保護された化合物を得た（０．３ｇ、７８．７％収率）。

Ｂｏｃ脱保護された化合物（０．３ｇ、０．５３５ミリモル）のジクロロメタン（３ｍＬ）中撹拌溶液に、ホルムアルデヒド溶液（３５〜４１％水溶液）（０．０５６ｇ、１．８７ミリモル）を０℃で添加し、２０分間撹拌した。次いで、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３（０．２８ｇ、１．３３ミリモル）を添加し、そして２時間０℃で撹拌した。反応が完了したら、水を添加し、ＤＣＭ中２０％メタノールで抽出した。合した有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。粗化合物を分収ＨＰＬＣによって精製して、表題化合物を得た（０．１ｇ、３１．７％収率）。

LCMS: 589.75(M+1)⁺;TFA-塩:¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 11.47 (brs, 1H), 9.48 (brs, 1H), 8.21 (brs, 1H), 7.57 (d, 2H, J=8.0 Hz), 7.40 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.03 (d, 2H, J=8.8 Hz), 5.87 (s, 1H), 4.29 (d, 2H, J=4.4 Hz), 4.14-4.12 (m, 2H), 3.69-3.66 (m, 2H), 3.32 (s, 3H), 3.13 (m, 4H), 2.69-2.68 (m, 6H), 2.24 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 1.96 (m, 4H), 1.44 (m, 4H), 0.85 (t, 3H, J=6.8 Hz).

化合物２：

ステップ１：５−ブロモ−３−（（（トランス）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−（メチル）−アミノ）シクロヘキシル）（エチル）アミノ）−２−メチル安息香酸メチルの合成

５−ブロモ−３−（（（トランス）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）シクロヘキシル）（エチル）アミノ）−２−メチル安息香酸メチル（３ｇ、６．４１ミリモル、例えば、ＷＯ２０１２１４２５０４を参照のこと）のＴＨＦ（３０ｍＬ）中撹拌溶液に、ＮａＨ（０．１８４ｇ、７．６９ミリモル）を０℃で添加し、それを同じ温度で２０分間撹拌した。次いで、ヨウ化メチル（９．１０ｇ、６４．１０ミリモル）を０℃で添加し、反応を一晩室温で撹拌した。完了したら、反応を氷水でクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。合した有機層を水で洗浄し、乾燥し、減圧下で濃縮した。粗化合物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、粗表題化合物を得、これをさらに精製することなく使用した（３ｇ、９７．４％収率）。

ステップ２：３−（（（トランス）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−（メチル）アミノ）シクロヘキシル）（エチル）アミノ）−５−（３−ヒドロキシプロプ−１−イン−１−イル）−２−メチル安息香酸メチルの合成

５−ブロモ−３−（（（トランス）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）シクロヘキシル）（エチル）アミノ）−２−メチル安息香酸メチル（２ｇ、４．１４ミリモル）の乾燥トルエン中撹拌溶液に、ＣｕＩ（０．０１５ｇ、０．０７９ミリモル）、ＰＰｈ_３（０．０４３ｇ、０．１６５ミリモル）、ＰｄＣｌ_２（ＰＰｈ_３）_２（０．０５８ｇ、０．０８２ミリモル）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（１．０８ｇ、１０．７８ミリモル）を添加し、反応をアルゴンで１５分間パージした。プロプ−２−イン−１−オール（０．４６ｇ、８．２９ミリモル）をそれに添加し、反応を８０℃にて密封状態で５時間加熱した。完了したら、それを水でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥した。粗化合物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を得た（１．２ｇ、６３．２％収率）。

ステップ３：５−（３−ブロモプロプ−１−イン−１−イル）−３−（（（トランス）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）シクロヘキシル）（エチル）アミノ）−２−メチル安息香酸メチルの合成：

３−（（（トランス）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）シクロヘキシル）（エチル）アミノ）−５−（３−ヒドロキシプロプ−１−イン−１−イル）−２−メチル安息香酸メチル（１．２ｇ、２．６２ミリモル）のＤＣＭ（１５ｍＬ）中撹拌溶液に、ＰＰｈ_３（１．３７ｇ、５．２２ミリモル）およびＣＢｒ_４（１．７ｇ、５．１０ミリモル）を０℃で添加し、反応を４時間室温で撹拌した。完了したら、反応を氷水でクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。合した有機層を水で洗浄し、乾燥し、減圧下で濃縮した。粗物質をカラムクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を得た（０．５ｇ、３８．５％収率）。

ステップ４：３−（（（トランス）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）シクロヘキシル）（エチル）アミノ）−２−メチル−５−（３−モルホリノプロプ−１−イン−１−イル）安息香酸メチルの合成

５−（３−ブロモプロプ−１−イン−１−イル）−３−（（（トランス）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−（メチル）アミノ）シクロヘキシル）（エチル）アミノ）−２−メチル安息香酸メチル（１当量）のＤＭＦ中撹拌溶液に、モルホリン（５当量）を添加し、そして反応を１２時間室温で撹拌した。完了したら、反応を氷水でクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。合した有機層を水で洗浄し、乾燥し、減圧下で濃縮して、粗表題化合物を得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した（９８．７％収率）。

ステップ５：（（トランス）−４−（（３−（（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）−２−メチル−５−（３−モルホリノプロプ−１−イン−１−イル）フェニル）（エチル）アミノ）シクロヘキシル）（メチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルの合成

ＮａＯＨ（１．５当量）を３−（（（トランス）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）シクロヘキシル）（エチル）アミノ）−２−メチル−５−（３−モルホリノプロプ−１−イン−１−イル）安息香酸メチル（１当量）のＥｔＯＨ：Ｈ_２Ｏ（９：１）中溶液に添加し、そして６０℃で１時間撹拌した。反応完了後、エタノールを減圧下で除去し、希ＨＣｌを使用してｐＨ６まで酸性化し、そしてクエン酸を使用してｐＨ４を調節した。１０％ＤＣＭ中メタノールを使用して抽出を実施した。合した有機層を乾燥し、濃縮して、各酸を得た。

上記酸（１当量）を次いでＤＭＳＯ中に溶解させ、３−（アミノメチル）−４，６−ジメチルピリジン−２（１Ｈ）−オン（２当量）およびトリエチルアミン（１当量）をそれに添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した後、ＰｙＢｏｐ（１．５当量）をそれに添加し、撹拌を一晩室温で続けた。反応完了後、反応生成物を氷中に注ぎ、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭを使用して抽出を実施した。合した有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、溶媒を減圧下で除去し、減圧下で濃縮して、粗物質を得、これを次いでまず水で、続いてアセトニトリル洗浄で精製して、所望の表題化合物を得た（６９．４％収率）。

ステップ６：Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−３−（エチル（（トランス）−４−（メチルアミノ）シクロヘキシル）アミノ）−２−メチル−５−（３−モルホリノプロプ−１−イン−１−イル）ベンズアミドの合成

０℃で（（トランス）−４−（（３−（（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）−２−メチル−５−（３−モルホリノプロプ−１−イン−１−イル）フェニル）（エチル）アミノ）シクロヘキシル）（メチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１当量）のＤＣＭ中撹拌溶液に、ＴＦＡ（３当量）を添加し、反応を室温で２時間撹拌した。完了後、反応を濃縮乾固した。残留物を次いでＮａ_２ＣＯ_３（水溶液）でｐＨ８に塩基性化し、水層を２０％ＤＣＭ中メタノールで抽出した。合した有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物を得（９９％収率）、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。

ステップ７：Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−３−（エチル（（トランス）−４−（（２−メトキシエチル）（メチル）アミノ）シクロヘキシル）アミノ）−２−メチル−５−（３−モルホリノプロプ−１−イン−１−イル）ベンズアミドの合成

Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−３−（エチル（（トランス）−４−（メチルアミノ）シクロヘキシル）アミノ）−２−メチル−５−（３−モルホリノプロプ−１−イン−１−イル）ベンズアミド（１当量）のジクロロエタン中撹拌溶液に、２−メトキシアセトアルデヒド（１０当量）および酢酸（６当量）を０℃で添加し、２０分間撹拌した。次いでＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３（３当量）を添加し、そして２時間０℃で撹拌した。反応が完了したら、水を添加し、ＤＣＭ中２０％メタノールで抽出した。合した有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、そして溶媒を減圧下で除去した。粗化合物を分収ＨＰＬＣによって精製して、標的分子を得た（０．１ｇ、３３．６％収率）。

LCMS: 606.65(M+1)⁺;TFA塩:¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 11.50 (brs, 1H), 9.22 (brs, 1H), 8.18 (t, 1H), 7.24 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 5.86 (s, 1H), 4.26-4.25 (m, 4H), 3.66-3.59 (m, 4H), 3.48-3.36 (m, 3H), 3.29-3.17 (m, 7H), 3.04-3.01 (m, 3H), 2.69-2.68 (m, 4H), 2.20 (s, 3H), 2.19 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.00-1.92 (m, 2H), 1.82-1.73 (m, 3H), 1.46 (m, 4H), 0.78 (t, 3H, J=6.4 Hz).

化合物２の別の合成スキーム：

ステップＡ：４−（プロプ−２−イン−１−イル）モルホリンの合成：

プロパルギルブロミド（５０ｇ、４２０ミリモル）のアセトン（３００ｍＬ）中撹拌溶液に、Ｃｓ_２ＣＯ_３（１３６．５ｇ、４２０ミリモル）を０℃で添加した。次いで、アセトン（２００ｍＬ）中モルホリン（３６．６０ｇ、４２０ミリモル）を滴加し、反応を室温で１６時間撹拌した。完了したら、反応生成物を濾過し、ろ液を減圧下で濃縮して、表題化合物を得た（５０ｇ、粗）。単離された化合物をさらに精製することなくその後のカップリングで直接使用した。

ステップ１：５−ブロモ−３−（エチル（（トランス）−４−（メチルアミノ）シクロヘキシル）アミノ）−２−メチル安息香酸メチルの合成：

０℃で５−ブロモ−３−（（（トランス）−４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）シクロヘキシル）（エチル）アミノ）−２−メチル安息香酸メチル（３０ｇ、６２．２４ミリモル）のメタノール（１００ｍＬ）中撹拌溶液に、メタノール性ＨＣｌ（５００ｍＬ）を添加し、反応を室温で２時間撹拌した。完了後、反応を濃縮乾固した。残留物をＮａ_２ＣＯ_３（水溶液）でｐＨ８に塩基性化し、水層をＤＣＭ中１０％メタノール（２００ｍＬ×３）で抽出した。合した有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物を無色油として得た（２５ｇ、粗）。単離された化合物をさらに精製することなく次のステップで使用した。

ステップ２：５−ブロモ−３−（エチル（（トランス）−４−（（２−メトキシエチル）（メチル）アミノ）シクロヘキシル）アミノ）−２−メチル安息香酸メチルの合成：

粗５−ブロモ−３−（エチル（（トランス）−４−（メチルアミノ）シクロヘキシル）アミノ）−２−メチル安息香酸メチル（２５ｇ、６５．４４ミリモル）、１−ブロモ−２−メトキシエタン（１８．１９ｇ、１３０．８ミリモル）のアセトニトリル（２５０ｍＬ）中撹拌溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（１８．０６ｇ、１３０．８ミリモル）およびＫＩ（６．５１ｇ、３９．２１ミリモル）を添加した。結果として得られた反応生成物を６５℃で１６時間撹拌した。完了したら、反応混合物を水（３００ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（５００ｍＬ×３）で抽出した。合した有機層を水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を得た（２０ｇ、６９．３％収率）。

¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 7.55 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.32 (m, 4H), 3.20 (s, 3H), 3.05 (q, 2H), 2.61 (m, 1H), 2.32 (s, 3H), 2.30 (m, 1H), 2.15 (s, 3H), 1.77-1.67 (m, 4H), 1.37-1.31(m, 2H), 1.24-1.18 (m, 2H), 0.78 (t, 3H, J=6.8 Hz).

ステップ３：３−（エチル（（トランス）−４−（（２−メトキシエチル）（メチル）アミノ）シクロヘキシル）アミノ）−２−メチル−５−（３−モルホリノプロプ−１−イン−１−イル）安息香酸メチルの合成：

５−ブロモ−３−（エチル（（トランス）−４−（（２−メトキシエチル）（メチル）アミノ）シクロヘキシル）アミノ）−２−メチル安息香酸メチル（３０ｇ、６８．０２ミリモル）、４−（プロプ−２−イン−１−イル）モルホリン（２５．５１ｇ、２０４ミリモル）およびトリエチルアミン（２０．６１ｇ、２０４ミリモル）のＤＭＦ（３００ｍＬ）中溶液に、アルゴンを２０分間吹き込んだ。Ｔｈｅｎ ＣｕＩ（３．８７ｇ、２０．３６ミリモル）およびＰｄ（ＰＰｈ_３）_４（７．８５ｇ、６．７９ミリモル）を添加し、アルゴンをさらに２０分間吹き込んだ。反応混合物を１０５℃で４時間加熱し、次いで室温まで冷却した。反応を水（１００ｍＬ）でクエンチし、水相を１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（４００ｍＬ×３）で抽出した。合した有機抽出物をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。ろ過し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を得た（２１ｇ、６３．７％収率）。

¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 7.46 (s, 1H), 7.32 (s, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.62-3.57 (m, 6H), 3.50 (s, 2H), 3.35-3.32 (m, 2H), 3.21 (s, 3H), 3.17 (m, 1H), 3.05 (q, 2H), 2.61-2.58 (m, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.33 (m, 1H), 2.18 (m, 2H), 1.77-1.70 (m, 4H), 1.36-1.20 (m, 4H), 0.77 (t, 3H, J=6.8 Hz), ３Ｈは溶媒ピークに統合した。

ステップ４：Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−３−（エチル（（トランス）−４−（（２−メトキシエチル）（メチル）アミノ）シクロヘキシル）アミノ）−２−メチル−５−（３−モルホリノプロプ−１−イン−１−イル）ベンズアミドの合成：

ＮａＯＨ水溶液（２．５９ｇ、６４．９１ミリモル、１０ｍＬのＨ_２Ｏ中）を３−（エチル（（トランス）−４−（（２−メトキシエチル）（メチル）アミノ）シクロヘキシル）アミノ）−２−メチル−５−（３−モルホリノプロプ−１−イン−１−イル）安息香酸メチル（２１ｇ、４３．２９ミリモル）のＥｔＯＨ（１００ｍＬ）中溶液に添加し、そして６０℃で１時間撹拌した。反応完了後、エタノールを減圧下で除去し、希ＨＣｌを使用して残留物を酸性化し、クエン酸を使用してｐＨまでにした。１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（２００ｍＬ×３）を使用して抽出を実施した。合した有機層を乾燥し、濃縮して、各酸を得た（１５．５ｇ、７６％収率）。

上記酸（１５．５ｇ、３２．９０ミリモル）のＤＭＳＯ（５０ｍＬ）中溶液に、３−（アミノメチル）−４，６−ジメチルピリジン−２（１Ｈ）−オン（１０ｇ、６５．８０ミリモル）およびトリエチルアミン（２３ｍＬ、１６４．５ミリモル）を添加した。反応混合物を室温で１５分間撹拌した後、ＰｙＢｏｐ（２５．６６ｇ、４９．３４ミリモル）をそれに０℃で添加し、一晩室温でさらに撹拌した。完了後、反応生成物を氷水（１００ｍＬ）中に注ぎ、１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（２００ｍＬ×３）を使用して抽出を実施した。合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗化合物を塩基性アルミナ上カラムクロマトグラフィーにより精製し、ＭｅＯＨ：ＤＣＭで溶出させて、表題化合物（１１ｇ、５５．３％収率）を得た。

LCMS: 606.50(M+1)⁺; ¹H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 7.23 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.11 (s, 1H), 4.46 (s, 2H), 3.74-3.72 (m, 4H), 3.51 (s, 2H), 3.47 (t, 2H, J=5.6 Hz,), 3.32 (s, 3H), 3.07 (q, 2H, J=7.2 Hz), 2.64-2.63 (m, 7H), 2.38 (m,1H), 2.37 (s, 3H), 2.27(s, 3H), 2.26 (s, 3H), 2.25 (s, 3H), 1.89-1.86 (m, 4H), 1.50-1.30 (m, 4H), 0.83 (t, 3H, J=7.2 Hz).

化合物１０５：
５−ブロモ−２−メチル−３−［（オキサン−４−イル）アミノ］安息香酸メチル

３−アミノ−５−ブロモ−２−メチル安息香酸メチル（４０．２ｇ、１６５ミリモル）のＣＨ_２Ｃｌ_２（５００ｍＬ）およびＡｃＯＨ（６０ｍＬ）中撹拌溶液に、ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−オン（１７．３ｇ、１７３ミリモル）およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（７３．６ｇ、３３０ミリモル）を添加した。反応混合物をＲＴで２０時間撹拌した。次いで飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を添加し、混合物を分離した。水層をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出し、合した有機層を真空中で濃縮した。残留物をエチルエーテルで摩砕し、結果としての析出物を集めて表題化合物を白色固体として得た（３９．１ｇ、７２％）。¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm; 7.01 (s, 1H), 6.98 (s, 1H), 5.00 (d, J=7.6 Hz, 1H), 3.84-3.87 (m, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.54-3.56 (m, 1H), 3.43 (m, 2H), 2.14 (s, 3H), 1.81-1.84 (m, 2H), 1.47-1.55 (m, 2H).

５−ブロモ−３−［エチル（オキサン−４−イル）アミノ］−２−メチル安息香酸メチル

５−ブロモ−２−メチル−３−［（オキサン−４−イル）アミノ］安息香酸メチル（３９．１ｇ、１１９ミリモル）のＣＨ_２Ｃｌ_２（４００ｍＬ）およびＡｃＯＨ（４０ｍＬ）中撹拌溶液に、アセトアルデヒド（２４．７ｇ、４７６ミリモル）およびナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（７９．６ｇ、３５７ミリモル）を添加した。反応混合物をＲＴで２４時間撹拌した。次いで飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を添加し、混合物を分離した。水層をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出し、合した有機層を真空中で濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２ヘプタン／ＥｔＯＡｃ＝３／１）により精製して、表題化合物を粘稠性油として得た（４４．１ｇ、定量的収率）。¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm; 7.62 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 3.80 (m, 5H), 3.31 (m, 2H), 2.97-3.05 (m, 2H), 2.87-2.96 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 1.52-1.61 (m, 2H), 1.37-1.50 (m, 2H), 0.87 (t, J=6.8 Hz, 3H).

４−（（３−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−５−（メトキシカルボニル）−４−メチルフェニル）エチニル）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル

５−ブロモ−３−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−２−メチル安息香酸メチル（１．８０ｇ、５．０５ミリモル）および４−エチニルピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．８０ｇ、８．５９ミリモル）のＤＭＦ（４０ｍＬ）中撹拌溶液に、トリエチルアミン（２．８２ｍＬ、２０．２ミリモル）およびヨウ化銅（Ｉ）（０．０９６ｇ、０．５０５ミリモル）を添加した。窒素を１５分間吹き込むことによって反応混合物を脱気した。次いで、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．２９２ｇ、０．２５３ミリモル）を導入し、窒素を吹き込むことによってさらに１０分間脱気した。反応混合物を８０℃で６時間加熱した。反応を飽和ＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＴＢＭＥ（３×４０ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残留物をクロマトグラフィー（０％から４０％ＡｃＯＥｔ／ヘプタン）によって精製して、表題化合物を得た（２．４０ｇ、９８％収率）。¹H-NMR (500 MHz) δ ppm; 7.65 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 3.97 (brd, J=11.3 Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.76 (m, 2H), 3.34 (dt, J=2.0, 11.7 Hz, 2H), 3.24 (ddd, J=3.4, 8.8, 12.2 Hz, 2H), 3.08 (brs, 2H), 2.98 (brs, 1H), 2.80 (dddd, J=3.9, 3.9, 3.9, 3.9 Hz, 1H), 2.52 (s, 3H), 1.87 (m, 2H), 1.60-1.74 (m, 6H), 1.48 (s, 9H), 0.89 (t, J=6.8 Hz, 3H) ); MS (ESI) [M+H]⁺ 485.4.

５−（（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペリジン−４−イル）エチニル）−３−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−２−メチル安息香酸

４−（（３−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−５−（メトキシカルボニル）−４−メチルフェニル）エチニル）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２．４ｇ、４．９５ミリモル）のエタノール（２０．０ｍＬ）中溶液に、水酸化ナトリウム（０．５６５ｇ、１４．１ミリモル）の水（３．０ｍＬ）中溶液を室温で添加した。反応混合物を６０℃で６時間加熱した。反応を１Ｍ ＨＣｌ（５ｍＬ）、次いで過剰のクエン酸溶液でクエンチして、ｐＨを５に調節した。混合物を濃縮してＥｔＯＨを除去し、残存する水相をＡｃＯＥｔ（２×４０ｍＬ）で抽出した。有機層を合し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残留物をクロマトグラフィー（１０％〜１００％のＡｃＯＥｔ／ヘプタン）によって精製して、表題化合物を得た（２．３０ｇ、９９％収率）。¹H-NMR (500 MHz) δ ppm; 7.82 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 3.98 (brd, J=11.3Hz, 2H), 3.77 (m, 2H), 3.35 (dt, J=1.5, 11.3Hz, 2H), 3.25 (ddd, J=3.4, 8.3, 12.2 Hz, 2H), 3.11 (brs, 2H), 3.00 (brs, 1H), 2.81 (dddd, J=3.9, 3.9, 3.9, 3.9 Hz, 1H), 2.60 (s, 3H), 1.88 (m, 2H), 1.60-1.78 (m, 6H), 1.48 (s, 9H), 0.90 (t, J=6.8Hz, 3H); MS (ESI) [M+H]⁺ 471.4.

４−（（３−（（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチルフェニル）エチニル）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル

室温で５−（（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペリジン−４−イル）エチニル）−３−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−２−メチル安息香酸（１．０６ｇ、２．２５ミリモル）のＤＭＳＯ（５．８ｍＬ）中溶液に、トリエチルアミン（０．９０ｍＬ、６．４４ミリモル）および（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メタンアミニウムクロリド（０．４０５ｇ、２．１５ミリモル）を添加した。透明溶液は不均一になる。ＨＯＢＴ（０．４９３ｇ、３．２２ミリモル）およびＥＤＣ（０．６１７ｇ、３．２２ミリモル）を添加し、結果として得られた反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応を水（８０ｍＬ）でクエンチし、スラリーを１時間室温で撹拌した。スラリーを濾過し、ケーキを水で洗浄した（２×２０ｍＬ）。集めた固体を真空下で乾燥して、表題化合物を得た（１．２７ｇ、９８％収率）。¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD) δ ppm; 7.22 (s, 1H), 7.08 (d, J=1.0 Hz 1H), 6.11 (s, 1H), 4.45 (s, 2H), 3.92 (brd, J=10.8 Hz, 2H), 3.78 (dd, J =4.4, 5.4 Hz, 1H), 3.75 (dd, J =4.4, 5.4 Hz, 1H), 3.36 (t, J=11.7 Hz, 2H), 3.21 (br t, J=8.3 Hz, 2H), 3.07 (q, J=7.3 Hz, 2H), 3.01 (dddd, J=3.9, 3.9, 11.3, 11.3 Hz, 1H), 2.84 (dddd, J=3.4, 3.4. 3.9, 3.9 Hz, 1H), 2.38 (s, 3H), 2.28 (s, 3H), 2.25 (s, 3H), 1.88 (m, 2H), 1.70 ((brd, J=12.2 Hz, 2H), 1.60 (m, 4H), 1.47 (s, 9H), 0.87 (t, J=7.3 Hz, 3H); MS (ESI) [M+H]⁺ 605.6.

Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−３−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−２−メチル−５−（ピペリジン−４−イルエチニル）ベンズアミド

４−（（３−（（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）カルバモイル）−５−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−４−メチルフェニル）エチニル）ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２５０ｍｇ、０．４１３ミリモル）のＤＣＭ（３ｍＬ）中溶液に、２０℃で１，４−ジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（３ｍＬ、１２．０ミリモル）を添加した。混合物を２０℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応が完了したことを示した。反応混合物を直接濃縮し、残留物をＤＣＭ中に溶解させ、次いで飽和ＮａＨＣＯ_３／塩水で中和した。有機層を乾燥（Ｎａ_２ＳＯ_４）し、濾過した。そしてろ液を濃縮した。残留物をさらに精製することなくアルキル化のために使用した（２０９ｍｇ、１００％）。¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD) δ ppm 7.21 (brs, 1H), 7.07 (brs, 1H), 6.11 (s, 1H), 4.46 (s, 2H), 3.95-3.89 (m, 2H), 3.39-3.34 (m, 2H), 3.08 (q, J=7.0 Hz, 2H), 3.06-2.98 (m, 3H), 2.79-2.72 (m, 1H), 2.72-2.65 (m, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.28 (s, 3H), 2.25 (s, 3H), 1.94-1.88 (m, 2H), 1.73-1.68 (m, 2H), 1.68-1.56 (m, 4H), 0.85 (t, J=7.0 Hz, 3H); MS (ESI) [M+H]⁺ 505.5.

Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−３−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−２−メチル−５−（（１−メチルピペリジン−４−イル）エチニル）ベンズアミド

Ｎ−（（４，６−ジメチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）メチル）−３−（エチル（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）−２−メチル−５−（ピペリジン−４−イルエチニル）ベンズアミド（１００ｍｇ、０．１９８ミリモル）のメタノール（５ｍＬ）中溶液に、Ｈ_２Ｏ中３５％ホルムアルデヒド（０．１５５ｍＬ、１．９８ミリモル）を０℃で添加した。０℃で１０分間撹拌した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（２４．９ｍｇ、０．３９６ミリモル）を添加した。結果として得られた混合物を０℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは反応が完了したことを示した。反応を飽和ＮａＨＣＯ_３／塩水でクエンチし、ＥｔＡＯｃ／ヘプタンで抽出した。有機層を乾燥し（Ｎａ_２ＳＯ_４）、ろ過し、濃縮した。残留物をクロマトグラフィー（１０ｇカラム、ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１：９、次いでＭｅＯＨ／ＭｅＯＨ中７Ｍ ＮＨ_３／ＤＣＭ＝１：１：８）によって精製して、表題化合物を得た（９６．０ｍｇ、９３％）。¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD) δ ppm 7.22 (brs, 1H), 7.08 (brs, 1H), 6.10 (s, 1H), 4.46 (s, 2H), 3.94-3.87 (m, 2H), 3.35-3.30 (m, 2H), 3.07 (q, J=7.0 Hz, 2H), 3.04-2.97 (m, 1H), 2.79-2.71 (m, 2H), 2.67-2.58 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 2.28 (s, 3H), 2.28 (s, 3H), 2.25 (s, 3H), 2.28-2.21 (m, 2H), 1.97-1.91 (m, 2H), 1.78-1.67 (m, 4H), 1.64-1.54 (m, 2H), 0.85 (t, J=7.0 Hz, 3H); MS (ESI) [M+H]⁺ 519.4.

実施例２：バイオアッセイプロトコルおよび一般的方法
野生型および突然変異体ＰＲＣ２酵素アッセイのためのプロトコル
一般的材料。Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）、ビシン、ＫＣｌ、Ｔｗｅｅｎ２０、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および牛皮ゼラチン（ＢＳＧ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから可能な最高レベルの純度で購入した。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）をＥＭＤから購入した。^３Ｈ−ＳＡＭを８０Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活性でＡｍｅｒｉｃａｎ 放射性標識ｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。３８４ウェルストレプトアビジンＦｌａｓｈプレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから購入した。

基質。非修飾リジン２７（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ０）またはジメチル化リジン２７（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２）のいずれかを含むヒトヒストンＨ３残基２１〜４４に代表的なペプチドを２１^ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ製のＣ末端Ｇ（Ｋ−ビオチン）リンカー−親和性標識モチーフおよびＣ末端アミドキャップで合成した。ペプチドを高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製して９５％を超える純度にし、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって確認した。配列を以下に記載する。
Ｈ３Ｋ２７ｍｅ０：ＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧＧＫ（ビオチン）−アミド（配列番号１）
Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２：ＡＴＫＡＡＲＫ（ｍｅ２）ＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧＧＫ（ビオチン）−アミド（配列番号２）

ニワトリ赤血球オリゴヌクレオソームをニワトリ血液から確立された手順にしたがって精製した。

組換えＰＲＣ２複合体。ヒトＰＲＣ２複合体を、バキュロウイルス発現系を使用してＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ｓｆ９）細胞において同時発現された４−成分酵素複合体として精製した。発現されたサブユニットは、野生型ＥＺＨ２構築物、ＥＥＤ（ＮＭ＿００３７９７）、Ｓｕｚ１２（ＮＭ＿０１５３５５）およびＲｂＡｐ４８（ＮＭ＿００５６１０）から生成された野生型ＥＺＨ２（ＮＭ＿００４４５６）またはＥＺＨ２ Ｙ６４１Ｆ、Ｎ、Ｈ、ＳまたはＣ突然変異体であった。ＥＥＤサブユニットはＮ末端ＦＬＡＧタグを含み、これを使用して全４−成分複合体をｓｆ９細胞溶解物から精製した。複合体の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ分析によって測定して９５％を満たすかまたは超過した。酵素ストック濃度の濃度（概して０．３〜１．０ｍｇ／ｍＬ）を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準に対して使用して測定した。

ペプチド基質に関するＰＲＣ２酵素アッセイの一般的手順。アッセイはすべて、２０ｍＭビシン（ｐＨ＝７．６）、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．００５％ＢＳＧおよび０．００２％のＴｗｅｅｎ２０からなり、使用当日に調製された緩衝液中で実施した。１００％ＤＭＳＯ（１μＬ）中化合物をポリプロピレン製３８４ウェルＶ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中に、３８４チャンネルピペットヘッド（Ｔｈｅｒｍｏ）を装備したプレートｍａｔｅ２Ｘ３を使用してスポットした。ＤＭＳＯ（１μＬ）を最大シグナル制御について、１１、１２、２３、２４行、Ａ〜Ｈ列に添加し、公知製品であり、ＰＣＲ２の阻害剤であるＳＡＨ（１μＬ）を最小シグナル制御について、１１、１２、２３、２４列、Ｉ〜Ｐ行に添加した。野生型ＰＲＣ２酵素およびＨ３Ｋ２７ｍｅ０ペプチドまたはＹ６４１突然変異体酵素およびＨ３Ｋ２７ｍｅ２ペプチドのいずれかを含むカクテル（４０μＬ）を、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉ（Ｔｈｅｒｍｏ）によって添加した。化合物をＰＲＣ２と３０分間２５℃でインキュベートし、次いで非放射性および^３Ｈ−ＳＡＭの混合物を含むカクテル（１０μＬ）を添加して、反応を開始した（最終体積＝５１μＬ）。全ての場合において、最終濃度は次のとおりであった：野生型または突然変異体ＰＲＣ２酵素は４ｎＭであり、最小シグナル制御ウェル中のＳＡＨは１ｍＭであり、ＤＭＳＯ濃度は１％であった。残りの成分の最終濃度は以下の表２に示す。非放射性ＳＡＭ（１０μＬ）を６００μＭの最終濃度まで添加し、それにより^３Ｈ−ＳＡＭを、ペプチド基質中へのその取り込みがもはや検出可能でなくなるレベルまで希釈することによって、アッセイを停止した。３８４ウェルポリプロピレンプレート中の５０μＬの反応を次いで３８４ウェルＦｌａｓｈプレートに移し、ビオチニル化ペプチドをストレプトアビジン表面に少なくとも１時間結合させた後、Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬｘ４０５プレートウォッシャー中０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。プレートを次いでＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＴｏｐＣｏｕｎｔプレートリーダーで読み取って、１分あたりの崩壊（ｄｐｍ）で測定されるか、あるいは１分あたりのカウント（ｃｐｍ）と称される、Ｆｌａｓｈプレート表面に結合した^３Ｈ標識ペプチドの量を測定した。

オリゴヌクレオソーム基質に対する野生型ＰＲＣ２酵素アッセイの一般的手順。２０ｍＭのビシン（ｐＨ＝７．６）、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．００５％ＢＳＧ、１００ｍＭのＫＣｌおよび０．００２％のＴｗｅｅｎ２０からなり、使用当日に調製された緩衝液中でアッセイを実施した。１００％ＤＭＳＯ（１μＬ）中化合物をポリプロピレン製３８４ウェルＶ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中に、３８４チャンネルピペットヘッド（Ｔｈｅｒｍｏ）を装備したプレートｍａｔｅ２Ｘ３を使用してスポットした。ＤＭＳＯ（１μＬ）を最大シグナル制御について、１１、１２、２３、２４行、Ａ〜Ｈ列に添加し、公知製品であり、ＰＣＲ２の阻害剤であるＳＡＨ（１μＬ）を最小シグナル制御について、１１、１２、２３、２４列、Ｉ〜Ｐ行に添加した。野生型ＰＲＣ２酵素およびニワトリ赤血球オリゴヌクレオソームを含むカクテル（４０μＬ）をＭｕｌｔｉｄｒｏｐ Ｃｏｍｂｉ（Ｔｈｅｒｍｏ）で添加した。化合物をＰＲＣ２と３０分間２５℃でインキュベートし、次いで非放射性および^３Ｈ−ＳＡＭの混合物を含むカクテル（１０μＬ）を添加して、反応を開始した（最終体積＝５１μＬ）。最終濃度は次のとおりであった：野生型ＰＲＣ２酵素は４ｎＭであり、非放射性ＳＡＭは４３０ｎＭであり、^３Ｈ−ＳＡＭは１２０ｎＭであり、ニワトリ赤血球オリグノヌクレオソーム（ｏｌｉｇｎｏｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ）は１２０ｎＭであり、最小シグナル制御ウェル中のＳＡＨは１ｍＭであり、そしてＤＭＳＯ濃度は１％であった。非放射性ＳＡＭ（１０μＬ）を６００μＭの最終濃度まで添加し、これによって^３Ｈ−ＳＡＭを、ニワトリ赤血球オリグノヌクレオソーム（olignonucleosome）基質中へのその取り込みがもはや検出可能でないレベルまで希釈することによって、アッセイを停止した。３８４ウェルポリプロピレンプレート中の５０μＬの反応を３８４ウェルＦｌａｓｈプレートに移し、ニワトリ赤血球ヌクレオソームをプレートの表面に固定し、これをＢｉｏｔｅｋ ＥＬｘ４０５プレートウォッシャー中０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。プレートを次いでＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＴｏｐＣｏｕｎｔプレートリーダーで読み取って、Ｆｌａｓｈプレート表面に結合した^３Ｈ標識ニワトリ赤血球オリゴヌクレオソームの量を測定し、１分あたりの崩壊（ｄｐｍ）として測定するか、または１分あたりのカウントと称する。

％阻害計算

式中、ｄｐｍ＝１分あたりの崩壊、ｃｍｐｄ＝アッセイウェル中のシグナル、ｍｉｎおよびｍａｘはそれぞれ最小および最大シグナル制御である。

４パラメータＩＣ_５０適合

式中、ｔｏｐおよびｂｏｔｔｏｍは通常変動してもよいが、３パラメータ適合ではそれぞれ１００または０に固定される可能性がある。ヒル係数は通常変動してもよいが、これもまた３パラメータ適合では１に適合され得る。Ｙは％阻害であり、Ｘは化合物濃度である。

ペプチド基質（たとえば、ＥＺＨ２野生型およびＹ６４１Ｆ）に関するＰＲＣ２酵素アッセイのＩＣ_５０値を以下の表３に提示する。

ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２メチル化アッセイ
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２懸濁細胞をＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（独国ブランシュヴァイク））から購入した。ＲＰＭＩ／Ｇｌｕｔａｍａｘ培地、ペニシリン−ストレプトマイシン、熱不活性化ウシ胎仔血清、およびＤ−ＰＢＳはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国ニューヨーク州グランドアイランド）から購入した。抽出緩衝液および中和緩衝液（５Ｘ）はＡｃｔｉｖｅモチーフ（米国カリフォルニア州カールスバッド）から購入した。ウサギ抗ヒストンＨ３抗体はＡｂｃａｍ（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）から購入した。ウサギ抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３およびＨＲＰ結合型抗ウサギＩｇＧは、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国マサチューセッツ州ダンバース）から購入した。ＴＭＢ「超感受性の」基質はＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国メリーランド州オウイングズミルズ）から調達した。ＩｇＧを含まないウシ血清アルブミンはＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ研究（米国ペンシルベニア州ウェストグローブ）から購入した。Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ（１０ＸＰＢＳＴ）はＫＰＬ（米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）から購入した。硫酸をＲｉｃｃａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（米国テキサス州アーリントン）から購入した。Ｉｍｍｕｌｏｎ ＥＬＩＳＡプレートはＴｈｅｒｍｏ（米国ニューヨーク州ロチェスター）から購入した。Ｖ底細胞培養プレートは、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．（米国ニューヨーク州コーニング）から購入した。Ｖ底ポリプロピレンプレートは、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−オン（米国ノースカロライナ州モンロー）から購入した。

ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２懸濁細胞を成長培地（１０％ｖ／ｖ熱不活性化ウシ胎仔血清および１００単位／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０）中で維持し、そして３７℃にて５％ＣＯ_２下で培養した。アッセイ条件下で、細胞をアッセイ培地（２０％熱不活性化ウシ胎仔血清および１００単位／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０）中、３７℃にて５％ＣＯ_２下、プレートシェーカー上でインキュベートした。

ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞を、１ウェルあたり２００μＬの９６ウェルＶ底細胞培養プレートに５０，０００細胞／ｍＬの濃度でアッセイ培地中に蒔いた。９６ウェルソースプレートからの化合物（１μＬ）をＶ底細胞プレートに直接添加した。プレートをタイタープレートシェーカーで３７℃、５％ＣＯ２にて９６時間インキュベートした。４日のインキュベーション後、プレートを２４１×ｇで５分間スピンさせ、細胞ペレットを乱すことなく細胞プレートの各ウェルから培地を穏やかに吸引した。ペレットを２００μＬのＤＰＢＳ中に再懸濁させ、プレートを２４１×ｇで５分間再度スピンさせた。上清を吸引し、冷（４℃）抽出緩衝液（１００μＬ）をウェルごとに添加した。プレートを４℃にてオービタルシェーカーで２時間インキュベートした。プレートを３４２７×ｇ×１０分間でスピンさせた。上清（８０μＬ／ウェル）を９６ウェルＶ底ポリプロピレンプレート中のそれぞれのウェルに移した。中和緩衝液５Ｘ（２０μＬ／ウェル）を、上清を含むＶ底ポリプロピレンプレートに添加した。粗ヒストン調製物（ＣＨＰ）を含むＶ底ポリプロピレンプレートをオービタルシェーカーで５分間インキュベートした。粗ビストン調製物を、１００μＬのＣｏａｔｉｎｇ緩衝液（１ＸＰＢＳ＋ＢＳＡ０．０５％ｗ／ｖ）を含む２連の９６ウェルＥＬＩＳＡプレート中の各ウェルに添加した（２μＬ／ウェル）。ウェルを密封し、一晩４℃でインキュベートした。翌日、プレートを３００μＬ／ウェルの１Ｘ ＰＢＳＴで３回洗浄した。ウェルを２時間、３００μＬ／ウェルのＥＬＩＳＡ希釈剤（（ＰＢＳ（１Ｘ）ＢＳＡ（２％ｗ／ｖ）およびＴｗｅｅｎ２０（０．０５％ｖ／ｖ））でブロックした。プレートを１Ｘ ＰＢＳＴで３回洗浄した。ヒストンＨ３検出プレートについて、ＥＬＩＳＡ希釈剤中で１：１０，０００に希釈した抗ヒストン−Ｈ３抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１７９１）を１ウェルあたり１００μＬ添加した。Ｈ３Ｋ２７トリメチル化検出プレートについて、ＥＬＩＳＡ希釈剤中で１：２０００に希釈した抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３を１ウェルあたり１００μＬ添加した。プレートを室温で９０分間インキュベートした。プレートを１ウェルあたり３００μＬの１ＸＰＢＳＴで３回洗浄した。ヒストンＨ３検出に関して、ヒストンＨ３検出に関して、ＥＬＩＳＡ希釈剤中１：６０００に希釈したＨＲＰ結合型抗ウサギＩｇＧ抗体を１ウェルあたり１００μＬ添加した。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３検出に関して、ＥＬＩＳＡ希釈剤中で１：４０００に希釈されたＨＲＰ結合型抗ウサギＩｇＧ抗体を１ウェルあたり１００μＬ添加した。プレートを室温で９０分間インキュベートした。プレートを１ウェルあたり１ＸＰＢＳＴ３００μＬで４回洗浄した。１ウェルあたりＴＭＢ基質１００μＬを添加した。ヒストンＨ３プレートを５分間室温でインキュベートした。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３プレートを室温で１０分間インキュベートした。硫酸１Ｎ（１００μＬ／ウェル）で反応を停止させた。各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで読み取った。

まず、各ウェルの比を：

によって決定した。

各プレートは、ＤＭＳＯのみの治療（最小阻害）の８つの対照ウェルならびに最大阻害（バックグラウンドウェル）の８つの対照ウェルを含んでいた。

各対照タイプの比の値の平均を算出し、使用して、プレート中の各試験ウェルについての阻害パーセントを決定した。試験化合物を、２５μＭから始めて、合計１０の試験濃度についてＤＭＳＯ中で連続して３倍希釈した。化合物の濃度ごとに２連のウェルを使用して、パーセント阻害を決定し、ＩＣ_５０曲線を作製した。このアッセイのＩＣ_５０値を以下の表３に提示する。

細胞増殖分析

ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２懸濁細胞をＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（独国ブランシュヴァイク））から購入した。ＲＰＭＩ／Ｇｌｕｔａｍａｘ培地、ペニシリン−ストレプトマイシン、熱不活化ウシ胎仔血清はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国ニューヨーク州グランドアイランド）から購入した。Ｖ底ポリプロピレン３８４ウェルプレートはＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−オン（米国ノースカロライナ州モンロー）から購入した。細胞培養３８４ウェル乳白色プレートは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（米国マサチューセッツ州ウォルサム）から購入した。Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国ウィスコンシン州マディソン）から購入した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＬＬＣ（米国カリフォルニア州サニーベール）から購入した。

ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２懸濁細胞を成長培地（１０％ｖ／ｖ熱不活性化ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０中で維持し、そして３７℃にて５％ＣＯ_２下で培養した。アッセイ条件下で、細胞をアッセイ培地（２０％熱不活性化ウシ胎仔血清および１００単位／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０）中、３７℃にて５％ＣＯ_２下でインキュベートした。

ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞系の増殖に関する化合物の効果の評価のために、対数増殖期細胞を５０μｌのアッセイ培地の最終体積中１２５０細胞／ｍｌの密度で３８４ウェル乳白色プレート中に蒔いた。１０ｍＭから開始して、ＤＭＳＯ中で３連の９点３倍連続希釈を実施することによって化合物ソースプレートを調製した（アッセイ中の化合物の最終最高濃度は２０μＭであり、ＤＭＳＯは０．２％であった）。細胞プレート中の各ウェルに化合物ストックプレートからの１００ｎＬアリコートを添加した。１００％阻害対照は、２００ｎＭの最終濃度のスタウロスポリンで処理された細胞から構成され、０％阻害対照はＤＭＳＯ処理された細胞から構成されていた。化合物の添加後、アッセイプレートを６日間３７℃、５％ＣＯ_２、相対湿度９０％未満でインキュベートした。細胞培養中に存在するＡＴＰの定量化、３５μｌのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）試薬を細胞プレートに添加することによって、細胞の生存を測定した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５で発光を読み取った。正規化用量応答曲線の４パラメータ適合を用いて細胞の生存を５０％阻害する濃度を決定した。このアッセイのＩＣ_５０値も以下の表３に提示する。これらの化合物の質量スペクトルデータも以下の表３に提示する。

実施例３：最低中毒濃度（ＬＣＣ）の誘導
細胞増殖は、細胞分裂によって進行し、この結果、分裂前の細胞数に対して、分裂後の細胞数が倍増することは充分に確立されている。一定の環境条件（例えば、ｐＨ、イオン強度、温度、細胞密度、タンパク質の培地含有量および成長因子など）下で、細胞は、次式にしたがった連続的倍加（すなわち分裂）によって増殖するが、ただし、充分な栄養および他の必要とされる因子が入手可能であるものとする。

式中、Ｎ_ｔは、観察期間開始後のある時点（ｔ）での細胞数であり、Ｎ_０は、観察期間開始時の細胞数であり、ｔは観察期間開始後の時間であり、そしてｔ_Ｄは、細胞倍増に必要な期間であり、倍増期間とも称される式Ａ．１は、式０．６９３＝ｌｎ（２）を利用して、底ｅの指数式のより看板な形態に変換することができる。

細胞増殖（ｋ_ｐ）の速度定数は、次のように倍増時間に反比例する。

式Ａ．２とＡ．３とを組み合わせると、

となる。

したがって、式Ａ．４によると、細胞数は対数期成長と称される細胞成長の初期の間で時間とともに指数関数的に増加することが予想される。式Ａ．４のような指数方程式は、両側の自然対数をとることによって線形化することができる。

したがって、時間の関数としてのｌｎ（Ｎ_ｔ）のプロットによって、ｋ_ｐに等しい勾配と（Ｎ_０）に等しいｙ切片とを有する上昇する直線が得られることが予想される。

環境条件の変化は、増殖速度定数ｋ_ｐにおける変化として定量化可能な細胞増殖率の変化をもたらし得る。増殖率の変化をもたらし得る条件には、観察期間の最初（すなわちｔ＝０）での抗増殖性化合物の系への導入が含まれる。抗増殖性化合物が細胞増殖に対して直接的影響を及ぼす場合、時間の関数としてのｌｎ（Ｎ_ｔ）のプロットは、全ての化合物濃度で引き続き線形であり、化合物の濃度の増加でｋ_ｐの値が減少することが予想される。

抗増殖性作用の基本メカニズムに応じて、一部の化合物は増殖速度の変化に即効性がない可能性がある。その代わり、化合物の影響が認識される前に潜伏期間があり得る。そのような場合、時間の関数としてのｌｎ（Ｎ_ｔ）のプロットは二相のようであり、化合物の影響が始まる時点が相間の分断点として特定され得る。増殖に対する化合物の影響が即効性であるか、または潜伏期後に始まるかに関わらず、各化合物濃度での増殖の速度定数は、化合物の影響が始まる時点から実験の観察期間の最後までのｌｎ（Ｎ_ｔ）対時間曲線の勾配によって最もよく定義される。

増殖細胞に適用された化合物は２つの一般的な方法にうちの１つ、すなわち、さらなる細胞分裂の阻害（細胞分裂停止）によるか、または細胞死滅（細胞毒性）によって、観察される増殖に対して影響を及ぼす可能性がある。化合物が細胞分裂停止性である場合、化合物の濃度を増加させることによって、さらなる細胞分裂がなくなるまでｋ_ｐの値が減少する。この時点で、細胞成長速度、したがってｋ_ｐの値は０になる。一方、化合物が細胞毒性である場合、ｋ_ｐの値は、２つの速度定数、すなわち化合物（ｋ_ｇ）の存在下での継続した細胞成長の速度定数および化合物（ｋ_ｄ）による細胞死滅の速度定数から構成される。化合物の一定濃度での増殖の全体的な速度定数は、したがってこれらの相対する速度定数の絶対値の差になる。

細胞成長速度が細胞死滅速度を上回る化合物濃度で、ｋ_ｐの値は正値を有する（すなわち、ｋ_ｐ＞０）。細胞成長速度が細胞死滅速度よりも低い化合物濃度で、ｋ_ｐの値は負の値を有し（すなわち、ｋ_ｐ＜０）、細胞数は時間とともに減少し、このことは強力な細胞毒性を示す。ｋ_ｇがｋ_ｄとちょうど一致する場合、全体的な増殖速度定数ｋ_ｐは０の値を有するであろう。したがって、これよりも高い濃度は明らかに観察できる細胞毒性をもたらすので、最低中毒濃度（ＬＣＣ）は、ｋ_ｐの値が０に等しくなるような化合物の濃度と定義できる。注：ＬＣＣより低い濃度で細胞死滅が起こる可能性があるが、残存細胞増殖よりも低い速度である。ここでの治療は、化合物の作用の生物学的詳細を規定することを意図しない。むしろ、ここでの目標は、細胞死滅速度が新しい細胞成長を上回る化合物の濃度を客観的に定量する実際的なパラメータを単に規定することである。実際、ＬＣＣは、細胞毒性濃度自体ではなく、それを上回ると真の細胞毒性が観察される分断または臨界濃度を表す。これに関して、ＬＣＣは、それよりも高いとすべての分子がミセル構造に組み入れられる、脂質、洗剤または他の界面活性剤種の濃度を規定するために使用される臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）などの他の物理的分断点法（physical breakpoint metrics）と同様にみなすことができる。

伝統的には、細胞成長に対する抗増殖性化合物の影響は、細胞増殖速度が化合物の非存在下（すなわち、ビヒクルまたは溶媒対照サンプルについて）で観察される速度の半分に減少する化合物の濃度と定義される、ＩＣ_５０値によって最も一般的に定量される。しかしながら、ＩＣ_５０は細胞分裂停止性と細胞毒性化合物とを調査員に区別させない。対照的に、ＬＣＣはそのような区別すること、および強力な細胞毒性挙動への遷移が起こる濃度をさらに定量することを容易に可能にする。

観察期間を影響の開始から実験の終わりに限定する場合、データは時間の関数としてのｌｎ（Ｎ_ｔ）としてプロットすると線形式に概して充分適合する（上記参照）。この種類の適合から、ｋ_ｐの値を試験した化合物の各濃度で決定することができる。化合物濃度（［Ｉ］）の関数としてのｋ_ｐの値の再プロットは、下降する等温線の形態を有し、［Ｉ］＝０でｋ_ｍａｘの最大値（ビヒクルまたは溶媒対照サンプルによって定義される）および無限化合物濃度でｋ_ｍｉｎの最小値を有する。

式中、Ｉ_ｍｉｄはｋ_ｍａｘおよびｋ_ｍｉｎの値の中間であるｋ_ｐ値をもたらす化合物濃度である（完全かつ純粋に細胞分裂停止性化合物の場合を除いて、Ｉ_ｍｉｄの値はＩＣ_５０と同じではないことに注意する）。しがたって、再プロットデータを式Ａ．７に適合させることによって、ｋ_ｍａｘ、ｋ_ｍｉｎおよびＩ_ｍｉｄの推定値が得られる。化合物が細胞分裂停止性（本明細書中で定義のとおり）である場合、ｋ_ｍｉｎの値は０未満であり得ない。細胞毒性化合物について、ｋ_ｍｉｎは０未満であり、ｋ_ｍｉｎの絶対値は死滅細胞における化合物の有効性に直接関係がある。

式Ａ．７から誘導される近似値は、ＬＣＣの値を決定するためにも使用できる。定義により、［Ｉ］＝ＬＣＣである場合、ｋ_ｐ＝０である。しがたって、これらの条件下で、式Ａ．７は

になる。

式Ａ．８を代数的に並べ替えてＬＣＣについての式を得る。

この分析は、非線形曲線適合ソフトウェアで実施するのが簡単であり、薬物発見および開発過程全体にわたる化合物活性の細胞アッセイの間に適用することができる。このようにして、ＬＣＣは化合物ＳＡＲ（構造活性相関）の評価のための有益な方法を提供し得る。

実施例４：インビボアッセイ
マウス
Ｆｅｍａｌｅ Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤ（登録商標）マウス（ＣＢ１７／Ｉｃｒ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＩｃｒＩｃｏＣｒｌ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または無胸腺ヌードマウス（Ｃｒｌ：ＮＵ（Ｎｃｒ）−Ｆｏｘｎ１ｎｕ， Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は８週令であり、実験の第１日で１６．０〜２１．１ｇの範囲の体重（ＢＷ）を有していた。動物に水を自由に与え（逆浸透１ｐｐｍ Ｃｌ）、ＮＩＨ３１Ｍｏｄｉｆｉｅｄ およびＩｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｌａｂ Ｄｉｅｔ（登録商標）は、１８．０％の粗タンパク質、５．０％の粗脂肪、および５．０％の粗繊維から構成されていた。マウスを、２０〜２２℃（６８〜７２°Ｆ）および湿度４０〜６０％で１２時間光サイクルで静的マイクロアイソレーター中、照射されたＥｎｒｉｃｈ−ｏ’ｃｏｂｓ（商標）寝床上で飼育した。すべての手順は、拘束、畜産、外科手術、餌および水分規制、および獣医医療に関するthe Guide for Care and Use of Laboratory Animals の勧告にしたがった。

腫瘍細胞培養
ヒトリンパ腫細胞系を異なる供給源（ＡＴＣＣ、ＤＳＭＺ）から入手し、例えば、Ｋａｒｐａｓ−４２２はＤＳＭＺから入手した。細胞系を、１００単位／ｍＬのペニシリンＧナトリウム塩、１００ｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１％のＨＥＰＥＳ、および１％のＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中懸濁培養として維持した。培地に２０％ウシ胎仔血清を添加した。細胞を、５％ＣＯ２および９５％空気の雰囲気中、３７℃の加湿インキュベーター中の組織フラスコ中で培養した。

インビボ腫瘍移植
ヒトリンパ腫細胞系、例えば、Ｋａｒｐａｓ−４２２細胞を対数中期（mid-log phase）成長中に収集し、そしてＲＰＭＩ−１６４０基礎培地（base media）および５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ＲＰＭＩ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ＝１：１）中に再懸濁させた。各マウスに１×１０^７細胞（０．２ｍＬ細胞懸濁液）を右脇腹で皮下投与した。腫瘍を二次元でカリパスにて測定して、所望の８０〜１２０ｍｍ^３の範囲に到達した平均体積として成長をモニタリングした。腫瘍サイズ（ｍｍ^３）を：

（式中、ｗ＝腫瘍の幅（ｍｍ）およびｌ＝腫瘍の長さ（ｍｍ））から算出した。腫瘍重量は、１ｍｇが１ｍｍ^３の腫瘍体積に等しいと仮定して推定することができる。１〜３０日後、１４５〜１５０ｍｍ^３の腫瘍を有するマウスを、１４７ｍｍ^３の平均腫瘍体積を有する治療群に分類した。

被験物質
試験化合物を室温で保存し、光から保護した。各治療日に、０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＮａＣＭＣ）中に懸濁させ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を脱イオン水中に懸濁させることによって、新鮮な化合物配合物を調製した。脱イオン水中ビヒクル、０．５％ＮａＣＭＣおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を使用して、対照群を同じスケジュールで処理した。配合物を投与まで光から遠ざけて４℃にて保存した。特別の定めのない限り、この実験で参照され、試験される化合物は、この段落でふれた、それらの特定の塩形態であった。

治療プラン
６２．５〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲の化合物用量にてＢＩＤ（１日２回、１２時間ごと）スケジュールで様々な日数、経口栄養投与（oral gavage）によりマウスを治療した。各用量を０．２ｍＬ／２０ｇマウス（１０ｍＬ／ｋｇ）の体積で送達し、個々の動物の最後に記録された重量について調節した。最長治療期間は２８日であった。

中央腫瘍体積（ＭＴＶ）および腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）分析
治療効果を最終治療日に測定した。最終日に評価可能な、動物ｎ匹についての中央腫瘍体積ＭＴＶ（ｎ）を各群について測定した。パーセント腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）はいくつかの方法で定義することができる。まず、指定の対照群のＭＴＶ（ｎ）と薬物治療群のＭＴＶ（ｎ）との差を、対照群のＭＴＶ（ｎ）のパーセンテージとして表す：

％ＴＧＩを算出する別の方法は、第１日から第ｎ日までの腫瘍サイズの変化を考慮し、ｎは最終治療日である。

毒性
動物を第１日〜第５日で毎日計量し、その後、実験完了まで１週間に２回計量した。マウスを、文書化された、治療に関連する有害な副作用の明白な徴候について頻繁に調査した。最大耐量（ＭＴＤ）についての許容される毒性は、試験中の２０％未満の群平均ＢＷ損失、および１０％以下のＴＲ死による死亡率と定義された。死は、臨床的兆候および／もしくは解剖によって証明される治療副作用に起因するか、または投薬期間中原因不明の場合、ＴＲとして分類される。死が治療の副作用と無関係であるという証拠がある場合、死はＮＴＲと分類される。投薬期間中のＮＴＲ死は、典型的にはＮＴＲａ（事故または人的ミスによる）またはＮＴＲｍ（解剖で確認される浸潤および／または転移による腫瘍伝播）として分類される。投薬期間中に原因不明で死ぬ経口治療された動物は、グループ性能がＴＲ分類を支持せず、投薬過誤を排除するためにＴＲ分類が実行可能でない場合はＮＴＲｕと分類することができる。

サンプリング
実験中の第７日または第２８日に、マウスをあらかじめ特定された方法でサンプリングして、腫瘍における標的阻害を評価する。腫瘍を特定のマウスからＲＮＡｓｅのない条件下で収集し、２等分する。各動物からの凍結腫瘍組織を液体Ｎ_２中で急速冷凍し、乳鉢および乳棒で微粉化する。

統計およびグラフ分析
全ての統計およびグラフ分析をＷｉｎｄｏｗｓ用Ｐｒｉｓｍ ３．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ）で実施する。治療期間全体にわたって対照と治療群との統計的有意性を試験するために、反復測定ＡＮＯＶＡ試験とそれに続く試験後のＤｕｎｎｅｔｓ多重比較後試験または２ウェイＡＮＯＶＡ試験を用いた。Ｐｒｉｓｍは結果を、Ｐ＞０．０５で非有意（ｎｓ）、０．０１＜Ｐ＜０．０５で有意（「＊」で記号化）、０．００１＜Ｐ＜０．０１で非常に有意（「＊＊」）、およびＰ＜０．００１で極度に有意（「＊＊＊」）として報告する。

ヒストン抽出
ヒストンの単離のために、６０〜９０ｍｇの腫瘍組織を１．５ｍｌの核抽出緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２５ｍＭのＫＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、８．６％のスクロース、＋Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤錠剤１８３６１４５）中で均質化し、５分間氷上でインキュベートする。核を、６００ｇで５分間４℃にて遠心分離することによって集め、ＰＢＳ中で１回洗浄した。上清を除去し、１５分ごとにボルテックスしながら、０，４Ｎの冷硫酸で１時間抽出した。抽出物を１０，０００ｒｐｍで１０分間４℃にて遠心分離することによって清澄化し、１０×体積の氷冷アセトンを含む新しいミクロ遠心管に移す。ヒストンを−２０℃で２時間〜一晩析出させ、１０，０００ｇで１０分間遠心分離によってペレット化し、そして水中に再懸濁させた。

ＥＬＩＳＡ
ヒストンをコーティング緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ＢＳＡ）中糖濃度で調製して、０．５ｎｇ／ｕＬのサンプルを得、そして１００ｕＬのサンプルまたは標準を２連で２ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ＨＢＸ ＃３８８５）に添加した。プレートを密封し、一晩４℃でインキュベートした。翌日、プレートをＢｉｏ Ｔｅｋプレートウォッシャーにより３００ｕＬ／ウェルのＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０； １０ＸＰＢＳＴ、ＫＰＬ ＃５１−１４−０２）で３回洗浄した。プレートを３００ｕＬ／ウェルの希釈剤（ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）でブロックし、室温で２時間インキュベートし、そしてＰＢＳＴで３回洗浄した。すべての抗体を希釈剤中で希釈した。１００ｕＬ／ウェルの抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（ＣＳＴ ＃９７３３、５０％グリセロールストック１：１，０００）または抗全Ｈ３（Ａｂｃａｍ ａｂ１７９１、５０％グリセロール１：１０，０００）を各プレートに添加した。プレートを９０分間室温にてインキュベートし、そしてＰＢＳＴで３回洗浄した。１００ｕＬ／ウェルの抗Ｒｂ−ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ７０７４）を１：２，０００でＨ３Ｋ２７Ｍｅ３プレートに添加し、１：６，０００でＨ３プレートに添加し、そして９０分間室温でインキュベートした。プレートを４回ＰＢＳＴで洗浄した。検出のために、１００ｕＬ／ウェルのＴＭＢ基質（ＢｉｏＦｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＃ＴＭＢＳ）を添加し、そしてプレートを暗所で室温にて５分間インキュベートした。反応を１００ｕＬ／ウェルの１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４で停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ Ｍｉｃｒｏプレートリーダーで読み取った。

７日ＰＤ研究
化合物がインビボで腫瘍におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３ヒストンマークを調節できるかどうかを試験するために、異種移植腫瘍を有するマウスを６２．５、８３．３、１２５、１６６．７、２５０、３３３．３、または５００ｍｇ／ｋｇＢＩＤまたはビヒクル（ＢＩＤスケジュール）の化合物で７日間治療した。１群あたり５匹の動物であった。動物を最終投与の３時間後に安楽死させ、腫瘍を上述のように凍結状態で保存した。ヒストン抽出後、ヒストンＨ３Ｋ２７（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）または全ヒストンＨ３のトリメチル化状態に対する抗体を使用したＥＬＩＳＡアッセイにサンプルを適用した。これらのデータに基づいて、全Ｈ３Ｋ２７に対する全体的メチル化の比を算出した。ＥＬＩＳＡによって測定される全群についての平均全体的メチル化比は、ビヒクルと比較した標的阻害範囲を示す。この実験のデザインを表４Ａに示す。

実施例５：Ｋａｒｐａｓ−４２２異種移植片モデルにおいて用量を増加させる有効性研究
化合物がインビボで抗腫瘍効果を誘導できるかどうかを試験するために、異種移植腫瘍を有するマウスを、例えば、６２．５、１２５、２５０、または５００ｍｇ／ｋｇＢＩＤの化合物で２８日間治療した。実験の有効性群については１群あたり１０匹のマウスであった。ビヒクルおよび試験化合物治療群について２８日の治療期間にわたる腫瘍成長を測定した。

有効性コホートについては第２８日の実験の最後で集めた腫瘍からヒストンを抽出した（両コホートについて最終投薬の３時間後）。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３メチルマークを用量に依存した方法で治療での調節について評価した。

この実験のデザインを表４Ｂに示す。

ＴＶを、楕円体の体積についての式（ＬｘＷ^２）／２（式中、ＬおよびＷはそれぞれ直交するながらおよび幅の測定値（ｍｍ）である）によりキャリパー測定から算出した。

データを平均±標準偏差（ＳＤ）として表した。ビヒクル処置群と化合物治療群とのＴＶにおける差を反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くダネット型多重比較検定によって分析した。０．０５未満のＰ値（両側）は統計的に有意と見なされる。Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアパッケージバージョン５．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて統計分析を実施した。

上記研究は、化合物１および化合物ＡがどちらもＫａｒｐａｓ−４２２異種移植片モデルにおいて腫瘍停止および退縮を示し、充分に耐容性であることを示した。例えば、図１および２を参照のこと。さらに、上記研究からの化合物１または化合物Ａの薬物動態学的および薬力学的特性を図３〜８に示す。図３は、治療後７日もしくは２８日での腫瘍における化合物１の濃度または治療後７日での腫瘍における化合物Ａの濃度を示す図である。この図中、「Ａ」〜「Ｇ」は、それぞれ６２．５、８３．３、１２５、１６６．７、２５０、３３３．３、および５００ｍｇ／ｋｇの投与量で化合物１投与後７日を示す「Ｈ」および「Ｉ」は、それぞれ１２５および２５０ｍｇ／ｋｇの投薬量の化合物Ａの投与後７日を示す；そして「Ｊ」〜「Ｌ」は、それぞれ６２．５、１２５および２５０ｍｇ／ｋｇの投薬量の化合物１の投与後２８日を示す。注：第２８日のサンプルについて、２５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａおよび５００ｍｇ／ｋｇの化合物１で治療した群からの腫瘍は、分析には小さすぎた；それぞれ２５０ｍｇ／ｋｇの化合物１および１２５ｍｇ／ｋｇ化合物１で治療された群から１０のうち１つだけ、１０のうちの５だけが分析に充分な大きさであった。図４は、治療後７日または２８日の結晶中の化合物１または化合物Ａの濃度を示す図である。上の破線は化合物Ａの血漿タンパク質結合（ＰＰＢ）補正ＬＣＣを示し、下の破線は化合物１のＰＰＢ補正ＬＣＣを示す。図５は、化合物１または化合物Ａで７日間治療されたマウス由来のＫＡＲＰＡＳ−４２２腫瘍における全体的Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３メチル化を示す図である。この図中、「Ａ」はビヒクル治療を示す；「Ｂ」〜「Ｈ」は、それぞれ６２．５、８３．３、１２５、１６６．７、２５０、３３３．３、および５００ｍｇ／ｋｇの投薬量の化合物１での治療を示す；そして「Ｉ」および「Ｊ」は、それぞれ１２５および２５０ｍｇ／ｋｇの投薬量の化合物Ａでの治療を示す。図６は、化合物１で２８日間治療したマウス由来のＫＡＲＰＡＳ−４２２腫瘍における全体的なＨ３Ｋ２７ｍｅ３メチル化を示す図である。図７は、化合物１または化合物Ａで７日間治療した異種移植腫瘍を有するマウス由来の骨髄における全体的Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３メチル化を示す図である。この図中、「Ａ」はビヒクル治療を示す；「Ｂ」〜「Ｈ」は、それぞれ６２．５、８３．３、１２５、１６６．７、２５０、３３３．３、および５００ｍｇ／ｋｇの投薬量の化合物１での治療を示す；そして「Ｉ」および「Ｊ」は、それぞれ１２５および２５０ｍｇ／ｋｇの投薬量の化合物Ａでの治療を示す。図８は、化合物１で２８日間治療した異種移植腫瘍を有するマウス由来の骨髄における全体的Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３メチル化を示す図である。この図中、「Ａ」はビヒクル治療を示す；「Ｂ」〜「Ｅ」は、それぞれ６２．５、１２５、２５０、および５００ｍｇ／ｋｇの投薬量の化合物１での治療を示す；そして「Ｆ」は２５０ｍｇ／ｋｇの投薬量の化合物Ａでの治療を示す。

以下の実施例６〜８では、実験および分析は、例えば、J. Lin, Pharmaceutical Research, 2006, 23(6):1089-1116; L. Di et al., Comb Chem High Throughput Screen. 2008, 11(6):469-76; M. Fonsi et al., Journal of Biomolecular Screening, 2008, 13:862; E. Sjogren et al., Drug Metab. Dispos. 2012, 40:2273-2279; T.D. Bjornsson, et al., Drug Metab Dispos, 2003, 31(7):815-832; J.B. Houston and K.E. Kenworthy, Drug Metab Dispos, 2000, 28(3):246-254; and S.W. Grimm et al., Drug Metab Dispos, 2009, 37(7):1355-1370（それぞれの内容は全体として参照により本明細書中に組み込まれる）で記載されているものと類似の方法および技術で実施した。

実施例６：肝臓ミクロソームにおける代謝的安定性の評価

化合物１、２、および１０５の代謝的安定性を、マウス、ラット、イヌ、サル、およびヒトを含む５種からの肝臓ミクロソームにおいて評価した。

方法：インキュベーションを、１００ミリモル／Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍｇ／ｍＬの肝臓ミクロソーム、８濃度の試験化合物（すなわち、化合物１、２、または１０５）、および２ｍｇ／ｍＬのＮＡＤＰＨから構成される合計２５０μＬを含む９６ウェルプレートで実施した。インキュベーションに使用した化合物の濃度は、４５．７ｎＭ〜１００μＭの範囲であった。ＮＡＤＰＨの添加を使用して反応を開始し、インキュベーションを３７℃で振盪水浴中で最高６０分間実施した。内部標準（ＩＳ）を含む等体積の停止溶液を添加することによって、反応を停止させた。サンプルを次いで分析前に３０００ＲＰＭにて最低５分間冷蔵遠心分離機でスピンさせた。ＬＣ／ＴＯＦＭＳを使用することによって測定される、試験化合物のインキュベーションミックス中の喪失量を使用して、肝臓ミクロソームでの固有クリアランス値を推定した。ＬＣ／ＴＯＦＭＳシステムは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＩＬ−ＨＴＣオートサンプラー（日本国京都府）、２つのポンプＬＣ−２０ＡＤ； Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐ．）、および飛行時間型質量分析計（ＡＢ ＳＣＩＥＸ Ｑｓｔａｒ Ｅｌｉｔｅ， ＡＢ Ｓｃｉｅｘ（カリフォルニア州フォスター・シティー））を有するカラムオーブン（ＣＴＯ−２０ＡＣ； Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐ．）から構成されていた。試験化合物およびアッセイ用のＩＳのピーク面積をＡｎａｌｙｓｔ ＱＳ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスター・シティー））によって積分した。窒素での衝突活性化解離（ＣＡＤ）を使用して生成物イオンを発生させた。最適化された計器状態は、陽イオン化モード下であった。

ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ定量化は、試験化合物のピーク面積とＩＳのピーク面積との比に基づいた。化合物１、２、または１０５およびＩＳのピーク面積計算および積分はＡｎａｌｙｓｔ ＱＳ ２．０（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ（カリフォルニア州フォスター・シティー））を使用した。計算は、Ｅｘｃｅｌ（Ｏｆｆｉｃｅ ２０１０， Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐ．， Ｒｅｄｍｏｎｄ， ＷＡ）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ． ５．０２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を使用して実施した。データを分析し、Ｊ． Ｌｉｎ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ 研究， ２００６， ２３（６）：１０８９−１１１６； ａｎｄ Ｄｉ Ｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ． ２００８ １１（６）：４６９−７６で記載されているものなどな適切なＳＯＰに基づいて分析し、報告した。

Ｋ_ｍおよびＶ_ｍａｘ値について使用した試験化合物の肝臓ミクロソームで枯渇は、時間に対してプロットすることによって算出して、枯渇速度を決定した。枯渇速度を次いで、適切な動力学モデルを使用してプロットした。データを次式に基づいて算出した：

ミカエリス・メンテン：Ｃｌ_ｉｎｔ（μＬ／ｍｉｎ／ｍｇ肝臓ミクロソーム）＝Ｖ_ｍａｘ／Ｋ_ｍ

ヒル：Ｃｌ_ｉｎｔ（μＬ／ｍｉｎ／ｍｇ肝臓ミクロソームｓ）＝Ｃｌ_ｍａｘ＝Ｖ_ｍａｘ／Ｋ_ｓ・（ｎ−１）／（ｎ（ｎ−１）^１／ｎ）

Ｃｌ_ｉｎｔ（μＬ／ｍｉｎ／ｇ肝臓）＝Ｃｌ_ｉｎｔ（μＬ／ｍｉｎ／ｍｇミクロソーム）・倍率またはＣｌ_ｉｎｔ（μＬ／ｍｉｎ／１０^６細胞）・倍率

結果を以下の表５で提示する

３つの試験した化合物、すなわち化合物１、２、および１０５はすべてヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）において低い代謝的クリアランスを示した。代謝的クリアランスにおける種差も観察された。カニクイザルは概して他の種よりも高いクリアランスを示した。

実施例７：ＣＹＰ誘導の評価

化合物１、２、および１０５のそれぞれの誘導を単一ドナー由来の凍結保存ヒト肝細胞で評価した。

方法：肝細胞をＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）から入手し、適切な培地およびＤＡＰＩ核染色をＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄｕｒｈａｍ， ＮＣ）から購入した。ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ダルベッコリン酸塩緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）、１００ｘＭＥＭ非必須アミノ酸、１００ｘペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン溶液、２ｘトリパンブルーをＭｅｄｉａｔｅｃｈ（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から購入した。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を組織培養生物学的ｓ（Ｔｕｌａｒｅ， ＣＡ）から取得した。ｍＲＮＡ分析用の２４ウェルコラーゲンでコーティングしたプレートをＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）から取得した。あらかじめ指定されたプローブおよびプライマーを２つのｔｒｉｐｌｅｘ アッセイで使用して、ｍＲＮＡにおける変化を評価した。正の対照は、ＣＹＰ１Ａについてはβ−ナフトフラボン（１および１０μｍｏｌ／Ｌ）、ＣＹＰ２Ｂ６についてはフェノバルビタール（１００μｍｏｌ／Ｌおよび１ミリモル／Ｌ）、そしてＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ３Ａについてはリファンピシン（１および１０μｍｏｌ／Ｌ）であった。ＤＭＳＯをビヒクル（負）対照として使用した。ＣＹＰ形態特異的アッセイを治療期間後に実施し、そして細胞を計数して、生存率を測定した。

凍結保存肝細胞を３７℃水浴中で解凍し、メーカーの使用説明書にしたがって播種した。チューブ１本分の肝細胞を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ凍結保存肝細胞回復培地（ＣＨＲＭ）を含む５０ｍＬの円錐管に添加した。細胞を、ＧＨ ３．８ローターを有するＢｅｃｋｍａｎ遠心機中８００ＲＰＭにて１０分間スピンさせた。上清を除去し、計数のために細胞を平板培地中に再懸濁させた。計数後、細胞を７５００００生存細胞／ｍＬで再懸濁させた。懸濁液（０．５ｍＬ／ウェル）を２４ウェルコラーゲンでコーティングされたプレート中に添加するか、または１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、およびＭＥＭ非必須アミノ酸を含む６０μＬのＤＭＥＭの添加後、８０μＬの懸濁液を９６ウェルのコラーゲンでコーティングされたプレートの各ウェルに添加した。より良好なプレート被覆を提供するために旋回および揺動した後、細胞を５％ＣＯ_２および３７℃の組織培養インキュベーター中に入れ、一晩付着させた。細胞を次いで、ＣｅｌｌｚＤｉｒｅｃｔ肝細胞維持培地を用いて処理した。細胞を化合物１、２、または１０５（１もしくは１０μｍｏｌ／Ｌ）あるいはビヒクルに４８時間暴露した。処理中、維持培地および試験化合物を２４時間ごとに補充した。

インキュベーション完了後、細胞をＤＰＢＳで洗浄した。ＤＰＢＳで洗浄した後、ＤＰＢＳ中３．７％ｐ−ホルムアルデヒドを使用して細胞を１時間固定した。ホルムアルデヒドを除去し、ＤＰＢＳ中０．６μｍｏｌ／ＬのＤＡＰＩを添加した。細胞をＤＡＰＩで２０分間染色し、次いでＤＰＢＳで３回洗浄した。５Ｘ対物レンズを有するＡｒｒａｙＳｃａｎ ＩＩ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ）を用いて細胞を計数した。処理条件で見られる細胞の数をビヒクル対照で見いだされた細胞でわったものを用いて残存する肝細胞の分率を算出した。

処理後、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットからの緩衝液ＲＬＴを使用して細胞を溶解させた。製造業者のプロトコルを使用し、ＤＮａｓｅ処理を含むＲＮｅａｓｙキットを用いてｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ−１０００（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）によって測定した。ｍＲＮＡ濃度をドナー内のすべてのサンプルについて正規化した。製造業者の指示に従って、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キットで逆転写を実施した。ＣＤＮＡ合成後、定量的リアルタイムＰＣＲを、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの株式移転完全子会社からの７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲを使用して実施した。リアルタイムＰＣＲの反応成分は次のものから構成されていた：１０μＬのＴａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２μＬのｃＤＮＡ、５μＬの無ヌクレアーゼ水（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、β−２ミクログロブリンについて１μＬのプライマー限定ＦＡＭ標識アッセイＨＳ００９８４２３０＿ｍ１、ＣＹＰ１Ａ２について１μＬのプライマー限定ＶＩＣ標識アッセイＨＳ００１６７９２７＿ｍ１またはＣＹＰ２Ｂ６についてＨＳ０４１８３４８３＿ｇ１、およびＣＹＰ２Ｃ９について１μＬのプライマー限定ＮＥＤ標識アッセイＨＳ０４２６０３７６＿ｍ１またはＣＹＰ３Ａ４についてＨＳ００６０４５０６＿ｍ１。ビヒクル対照と比較した倍数の差の計算を、ΔΔＣ_ｔ法を用いた７５００ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって実施した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してＥ_ｍａｘおよびＥＣ_５０の計算をおこなった。

上記表６で示されるように、化合物１は顕著な誘導を示さない（潜在的にＣＹＰ２Ｃ９を除く）；化合物２は誘導を示さない（活性は若干低い）；そして化合物１０５はＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、およびＣＹＰ３Ａの誘導を示した。細胞生存性の顕著な喪失は観察されなかった。

実施例８：ＣＹＰ阻害の評価
プールしたヒト肝臓ミクロソームを使用して、化合物１、２、または１０５のヒトシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）の酵素活性の潜在的阻害を評価した。

方法：複数の濃度でそれぞれのＫ_ｍ値付近でのプローブＣＹＰ反応に対して評価することによって化合物１、２、および１０５の競合的阻害能を測定して、ヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）においてＩＣ_５０曲線を作製した。適切な場合、Ｋ_Ｉおよびｋ_{ｉｎａｃｔ}値を評価することによって、時間依存性不活性化（ＴＤＩ）可能性もＣＹＰ３Ａ４／５について評価した。

ＰＢ、ＨＬＭ、ＣＹＰ選択的プローブ基質、および試験される阻害剤を含む懸濁液を９６ウェルプレートに添加した。プレート３を３７℃の水浴中で約２分間プレインキュベートした。ＮＡＤＰＨを９６ウェルプレートの各ウェルに添加することによって反応を開始した。ＰＢ、ＨＬＭ、およびＮＡＤＰＨの最終濃度はそれぞれ１００ミリモル／Ｌ（ｐＨ７．４）、０．１ｍｇ／ｍＬ、および２．３ミリモル／Ｌであった。使用したＣＹＰプローブ基質およびＣＹＰ阻害剤ならびにそれぞれの濃度を以下に記載する。各インキュベーションで使用した最終ＭｅＯＨ濃度は０．８％を越えなかった。

適切なインキュベーション時間後、ＩＳを含有する等体積のクエンチ溶液を適切なウェルに添加した。試験サンプルと同様の成分を用いて標準サンプルおよび品質管理（ＱＳ）サンプルを調製した。ＩＳを含まないこと以外は他のサンプルと同様のクエンチ溶液でブランクを調製した。プレートを５分間卓上遠心分離機で３０００ｒｐｍにてスピンさせた。サンプルをＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。インキュベーション条件および正の対照を以下の表７に記載する。

ＴＤＩを評価するために、第１インキュベーション、ＰＢ、ＨＬＭ、および阻害剤ストックを含む懸濁液を９６ウェルプレートに添加した。プレート３を３７℃の水浴中で約２分間プレインキュベートした。ＮＡＤＰＨを９６ウェルプレートの各ウェルに添加することによって反応を開始し、０、５、１０、１５、２０、および３０分間実施した。ＮＡＤＰＨなしの対照について、ＰＢ溶液をＮＡＤＰＨストック溶液と置換した。ＰＢ、ＨＬＭ、およびＮＡＤＰＨの最終濃度は、それぞれ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．４）、０．２ｍｇ／ｍＬ、および２．３ｍｍｏｌ／Ｌであった。各時点で、１２．５μＬの第１インキュベーション懸濁液を、残存活性を評価するために、あらかじめインキュベートしたＣＹＰ選択的プローブ基質を含む第２インキュベーション混合物中で２０倍に希釈した。使用したプローブ基質はテストステロン（２５０μｍｏｌ／Ｌ）であり、正の対照はトロレアンドマイシンであった。

使用したＨＰＬＣシステムは、ＳＩＬ−ＨＴＣオートサンプラー、ＤＧＵ−１４Ａ脱気装置、３つのＬＣ−１０ＡＤｖｐポンプ、およびＣＴＯ−１０ＡＣｖｐカラムオーブンからなるＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣシステム（日本国京都）であった。サンプルを、ＡＰＩ４０００ＱＴｒａｐ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ（カリフォルニア州フォスター・シティー））三連四重極質量分析計で陽イオンモードでターボスプレーイオン化を使用して分析した。

全てのモニタリングされた代謝産物およびＩＳのピーク面積計算および積分を、Ａｎａｌｙｓｔ １．６（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ（カリフォルニア州フォスター・シティー））によって処理した。定量化は、較正標準の濃度に対して代謝産物対ＩＳのピーク面積比をプロットすることによって作成された較正曲線を使用して達成され、１／ｘ^２重みづけでの二次回帰によって得た（ｙ＝ａｘ^２＋ｂｘ＋ｃ）パーセント阻害計算はＥｘｃｅｌ（Ｏｆｆｉｃｅ ２０１０， Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐ．， Ｒｅｄｍｏｎｄ， ＷＡ）を利用し、１つの結合部位の仮定に基づきＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０２， ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ラホヤ））を使用してプロットした。試験化合物および正の対照の名目濃度ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでｌｏｇ変換した。残存ＣＹＰ３Ａ４／５活性対プレインキュベーション時間のプロットを使用して、ＣＹＰ活性損失率（λ）を非線形回帰によって推定した。パラメータｋ_{ｉｎａｃｔ}およびＫ_Ｉを次に、次式：

（式中、［Ｉ］は化合物１、２、または１０５の初期濃度である）に適合させることによって推定した。

上記表８で示されるように、化合物１および２は顕著な可逆阻害を示さず、そして化合物１０５はＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ３Ａ４（ミダゾラム）の潜在的に顕著な阻害を示した。また、上記表９で示されるように、化合物１、２、および１０５のすべてはＣＹＰ３Ａ４／５の時間、濃度、およびＮＡＤＰＨに依存した不活性化を示した（プローブとしてミダゾラムを使用）。

本明細書中で言及される特許文書および科学論文のそれぞれの全開示はあらゆる目的のために参照により本明細書中に組み込まれる。

本発明は、その主旨または本質的な特性から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化することができる。前記実施形態は、したがって、本明細書中で記載する本発明に関して限定的であるよりもむしろあらゆる点で例示的であると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前記事項によってではなく、むしろ添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価物の意味および範囲内にあるすべての変更はその中に含まれることが意図される。

Claims (15)

1. 
   
   
   
   
   およびその医薬として許容される塩からなる群より選択される化合物。
2. 
   
   またはその医薬として許容される塩である、請求項１記載の化合物。
3. 
   
   である、請求項１記載の化合物。
4. 
   
   またはその医薬として許容される塩である、請求項１記載の化合物。
5. 
   
   である、請求項１記載の化合物。
6. 
   
   またはその医薬として許容される塩である、請求項１記載の化合物。
7. 
   
   である、請求項１記載の化合物。
8. 請求項１〜７のいずれかに記載の化合物および医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
9. 治療有効量の請求項１〜７のいずれかに記載の化合物を含む、ガンであるＥＺＨ２介在性障害を治療するための組成物。
10. 前記ガンが黒色腫である、請求項９に記載の組成物。
11. 前記ガンが、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、濾胞性リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、混合系統白血病、または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である、請求項９に記載の組成物。
12. 前記ガンがＩＮＩ１欠損腫瘍である、請求項９に記載の組成物。
13. ガンであるＥＺＨ２介在性障害を治療するための方法で使用するための請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
14. ガンであるＥＺＨ２介在性障害の治療における薬剤の製造のための請求項１〜７のいずれかに記載の化合物の使用。
15. ガンであるＥＺＨ２介在性障害を治療するための医薬組成物であって、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物を主成分として含む、医薬組成物。