JP5078901B2 - ＪｍｊＣドメインを含むタンパク質デメチラーゼ - Google Patents

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Description

［連邦による支援に関する陳述］
本発明は、一部には、国立衛生研究所から助成金番号ＧＭ６３０６７およびＧＭ０６８８０４を付して連邦政府の支援を受けて行われた。米国連邦政府は、本発明において所定の権利を有する。
［関連出願に関する情報］
本出願は、それらの開示が参照して全体として本明細書に組み込まれる２００５年１０月２８日に提出された米国特許仮出願第６０／７３１，０５３号および２００６年４月５日に提出された米国特許仮出願第６０／７８９，４３７号の恩典を主張する。
［発明の分野］
本発明は、新規に同定されたデメチラーゼファミリーならびに新規なデメチラーゼアッセイに関する。さらに、デメチラーゼの活性を調節する化合物を同定する方法、がんもしくは脱毛を治療するための候補化合物を同定するための方法、タンパク質を脱メチル化するための本発明のデメチラーゼの使用、デメチラーゼ活性を調節する方法、がんを治療する方法、脱毛を治療する方法、多分化能もしくは分化マーカーの発現を調節する方法、およびステロイドホルモン調節遺伝子を含む遺伝子発現を調節する方法にも関する。
タンパク質は、翻訳後にリジンのアミノ基上およびアルギニンのグアニジノ基上でＮ−メチル化される、またはアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩もしくはタンパク質Ｃ末端上でカルボキシメチル化されることがある。近年の研究は、ＲＮＡプロセッシング、受容体媒介性シグナリング、および細胞分化などの様々な細胞プロセスにおいてメチル化が果たす役割を示唆する間接的証拠を提供してきた（Ａｌｅｔｔａ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３：８９）。しかし大部分の、特異的メチルトランスフェラーゼ、タンパク質基質、およびこれらの現象においてメチル化が果たす特定の役割については確認されていない。タンパク質のメチル化は、ヒストンにおいて極めて広範に試験されてきた。Ｓ−ａｄｅｎｙｏｓｙｌメチオニン（ＳＡＭ）からヒストンへのメチル基の転移は、ヒストンメチルトランスフェラーゼとして知られる酵素によって触媒される。
共有結合ヒストン修飾は、クロマチンの動態および機能を調節することに重要な役割を果たす（Ｓｔｒａｈｌ ａｎｄ Ａｌｌｉｓ，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０３：４１−４５）。そのような修飾の１つであるメチル化は、リジンおよびアルギニンの両残基上で発生し、ヘテロクロマチン形成、Ｘ染色体不活性化、および転写調節を含む様々な生物学的プロセスに関与する（Ｌａｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１６：２１１７−２１２４；Ｍａｒｇｕｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１５：１６３−１７６）。一般に転写活性化と相関するアセチル化とは相違して、ヒストンリジンメチル化は、メチル化される特定のリジン残基に依存して活性化または抑制いずれかをシグナリングすることができる（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｒｅｉｎｂｅｒｇ，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：２３４３−２３６０）。同一リジン残基内でさえ、メチル化の生物学的影響は、それがモノメチル化、ジメチル化、もしくはトリメチル化であるのかに依存して相違することがある（Ｓａｎｔｏｓ−Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ ４１９：４０７−４１１；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１２：４７５−４８７）。
共有結合ヒストン修飾の定常状態レベルは、所与の修飾の添加および除去を触媒する酵素間の平衡によって制御される。この見解はアセチル化、リン酸化、およびユビキチン化については概して真実ではあるが、メチル−リジン残基からメチル基を除去できる酵素については最近まで定義できないままであった（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｃｅｌｌ １１９：９４１−９５３）。候補アプローチを用いて、Ｓｈｉおよび同僚らは、数種のヒストンデアセチラーゼ複合体中で以前に見いだされた核アミンオキシダーゼホモログであるＬＳＤ１／ＢＨＣ１１０（Ｈａｋｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：７４２０−７４２５）；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ ４２２：７３５−７３８；Ｙｏｕ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１４５４−１４５８）が、ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）依存性酸化反応においてモノ−およびジ−メチルＨ３Ｋ４を特異的に脱メチル化できることを証明した。分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）内には潜在的ＬＳＤ１ホモログが存在するが、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内には明白なＬＳＤ１ホモログが存在しないが、それでもこの有機体内でＨ３上の少なくとも３つの明確なリジン残基をメチル化することはできる。
タンパク質のメチル化およびカルボキシメチル化は、翻訳後共有結合修飾を通してタンパク質機能を調節するための機序である。ヒストンのメチル化は、クロマチンの動態および転写を調節する際に重要な役割を果たす。大多数の共有結合ヒストン修飾は可逆性であるが、最近まで、メチル基をヒストンから能動的に除去できるかどうかは知られていなかった。本発明は、一部には、本発明者らがＪＨＤＭ１Ａ、ＪＨＤＭ２およびＪＨＤＭ３Ａ（JmjC containing histone demethylase; ＪｍｊＣ含有ヒストンデメチラーゼ１Ａ、２Ａおよび３Ａ）と命名したＪｍｊＣドメイン含有タンパク質、ならびにリジン３６（Ｈ３−Ｋ３６）、Ｈ３−Ｋ９もしくはＨ３−Ｋ４でヒストンＨ３を特異的に脱メチル化する網膜芽細胞腫結合タンパク質２（Retinoblastoma Binding Protein-2；ＲＢＰ２／ＪＡＲＩＤ１Ａ）およびＪＡＲＩＤ１Ｂ（ＰＬＵ１）の発見に基づいている。ヒストン脱メチル化におけるＪｍｊＣドメインの機能は保存されている。例えば、ＪＨＤＭ１の出芽酵母(S. cerevisiae)のホモログもまた、Ｈ３−Ｋ３６デメチラーゼ活性を有している。さらに、分裂酵母(S. pombe)のＪＨＤＭ１ホモログ内の機能消失変異体を模倣する突然変異は、デメチラーゼ活性を損傷させた。さらに、ＲＢＰ２およびショウジョウバエ（Drosophila）オルソログのＬｉｄ（Little imaginal Discs）はどちらもＨ３−Ｋ４デメチラーゼである。そこで、本発明者らは、新規なタンパク質脱メチル化機序を見いだし、ＪｍｊＣドメインが、酵母からヒトに至る生物体内で見いだされるデメチラーゼのための代表的な(signature)モチーフであると同定した。
したがって、第１態様として、本発明は、組成物中のデメチラーゼ活性を検出する方法であって、
（ａ）メチル化タンパク質基質の脱メチル化のために十分な条件下で、前記組成物を、（ｉ）メチル化タンパク質基質、（ｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）および（ｉｉｉ）α−ケトグルタレートに接触させるステップと、
（ｂ）前記脱メチル化反応からのホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸の遊離を検出するステップであって、前記ホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸の遊離がデメチラーゼ活性の指標であるステップと
を含む方法を提供する。
また別の態様として、本発明は、デメチラーゼ活性を検出する方法であって、
（ａ）前記メチル化タンパク質基質の脱メチル化のために十分な条件下で、タンパク質を（ｉ）メチル化タンパク質基質、（ｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）および（ｉｉｉ）α−ケトグルタレートに接触させるステップと、
（ｂ）前記脱メチル化反応からのホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸の遊離を検出するステップであって、前記ホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸の遊離がデメチラーゼ活性の指標であるステップと
を含む方法を含む。
また別の態様として、本発明は、ＪｍｊＣドメインを含むデメチラーゼのデメチラーゼ活性を調節する化合物を同定する方法であって、
（ａ）試験化合物の存在下で、前記デメチラーゼをメチル化タンパク質基質と接触させるステップと、
（ｂ）脱メチル化のために十分な条件下で、前記タンパク質基質の脱メチル化のレベルを検出するステップであって、前記試験化合物の非存在下における脱メチル化のレベルと比較した前記タンパク質基質の脱メチル化における変化は、前記試験化合物が前記デメチラーゼのデメチラーゼ活性のモジュレーターであることを示唆するステップと
を含む方法を提供する。
さらにまた別の態様として、本発明は、がんを治療するための候補化合物を同定する方法であって、
（ａ）試験化合物の存在下で、ＪｍｊＣドメインを含むデメチラーゼ（例、ヒストンデメチラーゼ）をメチル化タンパク質基質（例、メチル化ヒストン基質）と接触させるステップと、
（ｂ）脱メチル化のために十分な条件下で、前記タンパク質基質の脱メチル化のレベルを検出するステップであって、前記試験化合物の非存在下における脱メチル化のレベルと比較した前記タンパク質基質の脱メチル化における変化は、前記試験化合物ががんを治療するための候補化合物であることを示唆するステップと
を含む方法を提供する。
さらにまた別の態様として、本発明は、脱毛を治療するための候補化合物を同定する方法であって、
（ａ）試験化合物の存在下で、Ｈａｉｒｌｅｓｓタンパク質をメチル化タンパク質基質と接触させるステップと、
（ｂ）脱メチル化のために十分な条件下で、前記タンパク質基質の脱メチル化のレベルを検出するステップであって、前記試験化合物の非存在下における脱メチル化のレベルと比較した前記タンパク質基質の脱メチル化における変化は、前記試験化合物が脱毛を治療するための候補化合物であることを示唆するステップと
を含む方法を提供する。
さらに本発明には、メチル化タンパク質を脱メチル化する方法であって、脱メチル化のために十分な条件下で、前記メチル化タンパク質を、ＪｍｊＣドメインを含むデメチラーゼに接触させるステップを含む方法、ならびにデメチラーゼとしてのＪｍｊＣドメイン含有タンパク質の使用もまた含まれる。
上記の方法の特定の実施形態では、前記デメチラーゼはヒストンデメチラーゼであり、前記メチル化タンパク質基質はメチル化ヒストン基質である。
本方法は、さらに、
（ａ）ＪｍｊＣドメインを含むデメチラーゼと、
（ｂ）脱メチル化反応を実施するためのＪｍｊＣドメイン含有タンパク質の使用方法についての説明書、および任意選択により、脱メチル化反応を実施するためにＪｍｊＣドメイン含有タンパク質を使用するための追加の試薬又は装置と
を含むキットも含む。
以下では、本発明の説明において本発明のこれらおよびその他の態様についてより詳細に記載する。
本発明は、一部には、新規なタンパク質デメチラーゼモチーフの発見および脱メチル化活性を評価するためのアッセイに基づいている。このアッセイを用いて、本発明者らは、ＨｅＬａ細胞からヒストンデメチラーゼ活性を同定した。さらに、ＪＨＤＭ１と命名されているＪｍｊＣドメインを含むタンパク質（Ｃｌｉｓｓｏｌｄ ａｎｄ Ｐｏｎｔｉｎｇ，（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：７−９）がデメチラーゼ活性に対して大きく関与していることは証明されている。補因子であるＦｅ（ＩＩ）およびα−ケトグルタレートの存在下では、ＪＨＤＭ１はヒストンＨ３リジン３６（Ｈ３−Ｋ３６）を脱メチル化し、ホルムアルデヒドおよびコハク酸塩を生成する。ＪＨＤＭ１中に存在するＪｍｊＣドメインは、このドメインにおける突然変異がその酵素活性を完全に無効にするので、酵素活性に対して大いに関与している。ヒストン脱メチル化におけるＪｍｊＣドメインの機能は、出芽酵母(S. cerevisiae)のホモログもＨ３−Ｋ３６を脱メチル化することができるので、保存されている。重要なことに、分裂酵母（S. pombe)のＪＨＤＭ１ホモログにおける機能消失突然変異を模倣する突然変異は、デメチラーゼ活性を無効にした。そこで、本発明者らは、新規なヒストン脱メチル化機序を見いだし、ＪｍｊＣドメインが、酵母からヒトに至る生物体内で見いだされるデメチラーゼのためのシグネチャーモチーフであることを同定した。
Ｇ９ａ−メチル化ヒストン基質を用いる並行試験では、本発明者らは、Ｈ３−Ｋ９を脱メチル化する、ＪＨＤＭ２Ａと命名された第２のＪｍｊＣドメイン含有ヒストンデメチラーゼを精製して特性解析した。ＪＨＤＭ２Ａの酵素活性は無傷ＪｍｊＣドメインに依存し、補因子であるＦｅ（ＩＩ）およびα−ケトグルタレートを必要とする。
さらに、追加のヒストンデメチラーゼを同定するために、本発明者らは、提案されたＦｅ（ＩＩ）およびα−ＫＧ結合部位内の類似性に焦点を当てて、他のＪｍｊＣファミリーメンバーのＪｍｊＣドメインをＪＨＤＭ１Ａ／ＢおよびＪＨＤＭ２Ａと比較した。関連タンパク質ヒドロキラーゼであるＦＩＨ（低酸素誘導性因子を阻害する因子）は、Ｆｅ（ＩＩ）およびα−ＫＧと複合体形成したＦＩＨの構造を利用でき、そして基準点として機能できるので、アラインメント内に含めた。タンパク質ＪＭＪＤ２Ａは、トリメチルＨ３−Ｋ９およびトリメチルＨ３−Ｋ３６を各々ジメチルＨ３−Ｋ９およびＨ３−Ｋ３６へ脱メチル化するトリメチル化Ｈ３−Ｋ９およびＨ３−Ｋ３６デメチラーゼであると同定された。このタンパク質は、その酵素機能を反映して本発明者らの現行命名法に従うために、ＪＨＤＭ３Ａと改名した。
その後の試験は、ＪＡＲＩＤ１ ＪｍｊＣファミリーのメンバーである網膜芽細胞腫結合タンパク質２（ＲＢＰ２／ＪＡＲＩＤ１Ａ）、ならびにショウジョウバエ(Drosophila)のオルソログＬｉｄ（Little Imaginal Discs）がＨ３−Ｋ４デメチラーゼであり、モノメチル化、ジメチル化もしくはトリメチル化基質を非メチル化形へ処理できることを証明している。ＪＡＲＩＤ１Ｂ（ＰＬＵ１）もまた、ＲＢＰ２に対する類似の基質特異性を備えるＨ３−Ｋ４デメチラーゼである。
本発明の実行を適用できる被験者には、鳥類および哺乳動物が含まれるがそれらに限定されず、哺乳動物が好ましい。本明細書で使用する用語「鳥類」には、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンショウおよびキジが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、被験者はヒト被験者である。ヒト被験者には、男女両性および任意の発達段階（すなわち、新生児、乳児、少年、青年、成人）にある被験者が含まれる。本発明の一部の実施形態は主としてヒト被験者に関する実施に関連するが、本発明は、動物被験者、特別には例えば非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット、マウスなどの哺乳動物被験者において実施することもできる。本発明は、獣医学目的、薬物スクリーニングおよび／または医薬品開発目的で動物に対して実施することができる。
ここで、本発明の実施形態が図示されている添付の図面を参照して、本発明をより詳細に記載する。しかし本発明は、様々な形態で具体化することができ、本明細書に記載した実施形態に限定されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が完全かつ完成しているように、そして当業者に本発明の範囲を十分に伝えるように提供する。
他に特に規定されない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されている意味と同一の意味を有する。本発明の説明において使用する用語は、特定の実施形態を記載することだけを目的とし、決して本発明を限定することは意図されていない。本明細書に言及したすべての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、全体として参照して組み込まれる。
他に示唆されている以外は、遺伝子をクローニングする、タンパク質を発現させる、核酸を増幅させるおよび検出するなどのために、当業者に知られている標準的な方法を使用できる。そのような技術は、当業者には知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ “Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
定義
本発明の説明および添付の特許請求項において使用する単数形である「１つの」および「その」は、その状況が明らかに他のことを示唆していない限り、複数形を同様に含むことが意図されている。
本明細書で使用する「および／または」は、１つまたは複数の関連する列挙した項目の任意およびすべての可能性のある組み合わせ、ならびに代替用語（「または」）において解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、それらを包含する。
さらに、本発明は、本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載した任意の特徴もしくは特徴の組み合わせを排除もしくは削除できることもまた意図している。
本明細書で使用する用語のタンパク質もしくはヒストン「基質」は、酵素反応において反応生成物を生成するために作用する出発試薬を指す。本発明によると、タンパク質もしくはヒストン基質は、デメチラーゼによって直接的に（代表的には活性部位に結合して、酵素によって触媒される化学反応を受けることによって）作用される、または酵素によって作用される前に最初に修飾されることが可能である。
本明細書で使用する用語「ＪＨＤＭタンパク質」および「ＪｍｊＣドメインを含むデメチラーゼ」（および類似用語）は、任意のＪｍｊＣドメイン含有デメチラーゼ（ヒストンデメチラーゼを含む）を包含し、これは限定されることなく、ＪＨＤＭ１ファミリー、ＪＨＤＭ２ファミリー、ＪＨＤＭ３［ＪＭＪＤ２］ファミリー、ＰＨＦ２／ＰＨＦ８ファミリー、ＪＡＲＩＤファミリー（例、制限なくＲＢＰ２［ＪＡＲＩＤ１Ａ］、ＪＡＲＩＤ１Ｂ［ＰＬＵ１］、ＪＡＲＩＤ１Ｃ［ＳＭＣＸ］およびＪＡＲＩＤ１Ｄ［ＳＭＣＹ］を含むＪＡＲＩＤ１サブファミリーならびにＪＡＲＩＤ２サブファミリー）、ＵＴＸ／ＵＴＹファミリー、ならびにＪｍｊＣドメイン単独ファミリー（ＭＩＮＡ５３／ＮＯ６６サブファミリー、ＪＭＪＤ５サブファミリー、ＰＬＡ２Ｇ４Ｂサブファミリー、ＦＩＨサブファミリー、ＨＳＰＢＡＰ１サブファミリー、ＬＯＣ３３９１２３サブファミリー、ＰＴＤＳＲサブファミリーおよびＪＭＪＤ４サブファミリーを含む）（例えば、Ｋｌｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：７１５−７２７を参照されたい）内のタンパク質を含み、そして実質的デメチラーゼ活性（例、天然タンパク質と比較して少なくとも約６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上のデメチラーゼ活性）を維持している上記のいずれかの変異体および機能的フラグメントをさらに含む。
本発明のデメチラーゼタンパク質は、哺乳動物（例、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌなど）、昆虫（例、ショウジョウバエ(Dorosophila）、鳥類、真菌、植物、酵母（例、S. pombeもしくはS. cerevisiae）、線虫(C. elegans)、ゼブラフィッシュ（D.rerio）など、ならびに対立遺伝子変異、アイソフォーム、スプライス変異体などを制限なく含む、任意の対象の種に由来してもよい。デメチラーゼ配列は、さらに全体的もしくは部分的に合成であってよい。
特定の実施形態では、ＪＭＨＤタンパク質の機能的フラグメントもしくは変異体は、ＪｍｊＣドメインを含み、そして任意選択により、ＪｍｊＮドメイン、Ｔｕｄｏｒドメイン、ジンクフィンガードメイン（例、Ｚｆ−ＣＸＸＣモチーフおよび／またはＺｆ−Ｃ２ＨＣ４モチーフ）、ジンクフィンガー様ドメイン、ＰＨＤドメイン、ＦＢＯＸドメイン、テトラトリコペプチドリピート（ＴＰＲ）、ＡＴ−リッチインタラクティブドメイン（Ａｒｉｄ／Ｂｒｉｇｈｔ）、多重コイルモチーフおよび／またはロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメインをさらに含む。ＪｍｊＣドメインは、Ｆｅ（ＩＩ）および／またはα−ケトグルタレートと配位化するアミノ酸残基を含んでいてよく、それらのアミノ酸はＪｍｊＣドメイン内で自然発生することがある、またはそれらの変異体であってよい（例えば、実施例の項およびＫｌｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：７１５−７２７を参照されたい）。
例えば、ＪＨＤＭ１タンパク質の機能的フラグメントもしくは変異体は、ＪｍｊＣドメインおよび追加して、ＬＲＲ、ＦＢＯＸドメイン、ＰＨＤドメインおよび／またはジンクフィンガードメインを含んでもよい。
代表的な実施形態では、ＰＨＦ２／ＰＨＦ８ファミリータンパク質の機能的フラグメントもしくは変異体は、ＪｍｊＣドメインおよびＰＨＤドメインを含む。
他の代表的な実施形態では、ＪＡＲＩＤファミリータンパク質の機能的フラグメントもしくは変異体は、ＪｍｊＣドメインおよび追加してＰＨＤドメイン、ＪｍｊＮドメイン、ＡＴ−リッチインタラクティブドメイン、および／またはジンクフィンガードメインを含む。
代表的な実施形態では、ＪＨＤＭ３ファミリータンパク質の機能的フラグメントもしくは変異体は、ＪｍｊＣドメインおよび追加してＪｍｊＮドメイン、ＰＨＤドメイン、および／またはジンクフィンガードメインを含む。任意選択により、機能的フラグメントもしくは変異体は、Ｔｕｄｏｒドメインをさらに含む。
代表的な実施形態では、ＵＴＸ／ＵＴＹファミリータンパク質の機能的フラグメントもしくは変異体は、ＪｍｊＣドメインおよびＴＰＲドメインを含む。
代表的な実施形態では、ＪＨＤＭ２ファミリータンパク質の機能的フラグメントもしくは変異体は、ＪｍｊＣドメインおよびジンクフィンガー様ドメインを含む。
本明細書で使用する「ＪＨＤＭ１タンパク質」には、ヒトＪＨＤＭ１ＡおよびＪＨＤＭ１Ｂタンパク質（例えば、実施例の項およびＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１２３０８、ＢＣ０４７３７１、ＢＣ０６４３６０、ＡＹ４０９１９１、ＮＰ＿０３６４４０、ＡＡＨ４７４８６、ＡＡＨ４７３７１、ＡＡＨ６４３６０、ＮＰ＿１１５９７９、ＮＰ＿００１００５３６６、ＮＭ＿０３２５９０、ＮＭ＿００１００５３６６、およびＢＣ００８７３５で見いだされるＪＨＤＭ１ＡおよびＪＨＤＭ１Ｂのタンパク質および核酸配列を参照されたい）、ならびに哺乳動物（例、ラット、マウス）、ツメガエル（Xenopus）、ゼブラフィッシュ(D. rerio)、線虫(C.elegans)、分裂酵母(S. pombe)および出芽酵母(S. cerevisiae)からのホモログ（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＨ８２６３６、ＮＰ＿６４９８６４、ＡＡＮ６５２９１、ＣＡＡ２１８７２、ＮＰ＿０１０９７１、ＮＭ＿００１００１９８４、ＮＭ＿００１０１１１７６、ＸＭ＿３４１９８３、ＢＣ０７６５７６、ＡＹ４０９１９３、ＮＰ＿００１００１９８４、ＡＡＨ５７０５１、ＮＰ＿００１００５８６６、ＮＰ＿００１００３９５３、ＮＰ＿９９８３３２、ＮＰ＿０３８９３８、ＡＡＨ５７６２２、ＡＡＨ８２０４０、ＡＡＨ６５０９０、ＮＭ＿０１３９１０、ＮＭ＿００１００５８６６、ＮＭ＿００１００３９５３、ＮＭ＿２１３１６７、ＸＭ＿２２２１７７、ＢＣ０５７６２２、ＢＣ０８２０４０、およびＢＣ０６５０９０を参照されたい）由来のホモログを含むがそれらに限定されないホモログ、さらに実質的デメチラーゼ活性（例、天然タンパク質と比較して少なくとも約６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上のデメチラーゼ活性）を保持している上記の変異体および機能的フラグメントを含むそれらのホモログが含まれる。ＪＨＤＭ１タンパク質についてのこれ以上の説明およびリストについては、Ｋｌｏｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：７１５−７２７を参照されたい。
本明細書で使用する「ＪＨＤＭ２タンパク質」には、ヒトＪＨＤＭ２Ａ、ＪＨＤＭ２ＢおよびＪＨＤＭ２Ｃタンパク質（例えば、実施例の項およびＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０６０９０３、ＮＰ＿０５７６８８、ＮＰ−００４２３２、ＮＭ＿０１８４３３、ＮＭ＿０１６６０４およびＮＭ＿００４２４１で見いだされるＪＨＤＭ２Ａ、ＪＨＤＭ２ＢおよびＪＨＤＭ２Ｃのタンパク質および核酸配列を参照されたい）、ならびに哺乳動物（例、ラット、マウス）、ツメガエル(Xenopus)、およびキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿７８６９４０、ＡＡＨ５９２６４、ＡＡＨ７０５５８、ＮＰ＿７８８６１１、ＢＣ０７０５５８、ＮＭ＿１７５７６４、ＢＣ０５９２６４およびＮＭ＿１７６４３４を参照されたい）由来のホモログを含むがそれらに限定されないホモログ、さらに実質的デメチラーゼ活性（例、天然タンパク質と比較して少なくとも約６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上のデメチラーゼ活性）を保持している上記の変異体および機能的フラグメントをさらに含むそれらのホモログが含まれる。ＪＨＤＭ２タンパク質についてのこれ以上の説明およびリストについては、Ｋｌｏｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：７１５−７２７を参照されたい。
本明細書で使用する「ＪＨＤＭ３タンパク質」には、ヒトＪＨＤＭ３Ａ、ＪＨＤＭ３Ｂ、ＪＨＤＭ３ＣおよびＪＨＤＭ３Ｄタンパク質（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０５５４７８、ＮＭ＿０１４６６３、ＮＰ＿０５５８３０、ＮＭ＿０１５０１５、ＡＡＩ０４８６２、ＢＣ１０４８６１、ＮＰ＿０６０５０９およびＮＭ＿０１８０３９で見いだされるヒトＪＨＤＭ３Ａ／ＪＭＪＤ２Ａ、ＪＨＤＭ３Ｂ／ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＨＤＭ３Ｃ／ＪＭＪＤ２ＣおよびＪＨＤＭ３Ｄ／ＪＭＪＤ２Ｄのタンパク質および核酸配列を参照されたい）、ならびに哺乳動物、線虫(C. elegans)および出芽酵母(S. cerevisiae)由来のホモログを含むがそれらに限定されないホモログ、さらに実質的デメチラーゼ活性（例えば、天然タンパク質と比較して少なくとも約６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上のデメチラーゼ活性）を保持している上記の変異体および機能的フラグメントをさらに含むそれらのホモログが含まれる。他の生物体内のホモログは、ルーチン技術によって、例えばＮＣＢＩデータベース内のｂｌａｓｔサーチによって同定することができる。ＪＨＤＭ３タンパク質についてのこれ以上の説明およびリストについては、Ｋｌｏｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：７１５−７２７を参照されたい。
本明細書で使用する「ＪＡＲＩＤタンパク質」には、ＪＡＲＩＤ１サブファミリー（例、ＲＢＰ２［ＪＡＲＩＤ１Ａ］、ＪＡＲＩＤ１Ｂ［ＰＬＵ１］、ＪＡＲＩＤ１Ｃ［ＳＭＣＸ］およびＪＡＲＩＤ１Ｄ［ＳＭＣＹ］タンパク質）およびＪＡＲＩＤ２サブファミリー（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１０４２６０３、ＮＭ＿００５０５６、ＮＭ＿００６６１８、ＢＣ０５４４９９、ＮＭ＿００４６５３およびＢＣ０４６２４６で見いだされるヒトＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ、ＪＡＲＩＤ１Ｃ、ＪＡＲＩＤ１ＤおよびＪＡＲＩＤ２タンパク質のタンパク質および核酸配列を参照されたい）内のタンパク質、ならびに哺乳動物（例、イヌ、マウス）、キイロショウジョウバエ(D. melanogaster)（例えば、Ｌｉｄ）、分裂酵母(S. pombe)、出芽酵母(S. cerevisiae)、線虫(C. elegans)（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０７８７６２、ＮＭ１６４６７１、ＮＭ＿００１０３１０２９、ＮＭ＿００１０４８０３２、ＮＭ＿０１３６６８、およびＮＭ＿０１１４１９を参照されたい）由来のホモログを含むがそれらに限定されないホモログ、さらに実質的デメチラーゼ活性（例えば、天然タンパク質と比較して少なくとも約６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上のデメチラーゼ活性）を維持している上記の変異体および機能的フラグメントを含むそれらのホモログが含まれる。他の有機体内のホモログは、ルーチン技術によって、例えばＮＣＢＩデータベース内のｂｌａｓｔサーチによって同定することができる。ＪＡＲＩＤタンパク質についてのこれ以上の説明およびリストについては、Ｋｌｏｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：７１５−７２７を参照されたい。
本明細書で使用する「Ｈａｉｒｌｅｓｓタンパク質」には、ヒトタンパク質（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＣＡＢ８６６０２、ＣＡＢ８７５７７、ＮＰ＿０６０８８１、およびＡＡＨ６７１２８を参照されたい）ならびに哺乳動物（例、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ）およびショウジョウバエ（Drosophila)（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０７７３４０、ＡＡＮ０５７５３、ＡＡＰ３３３８９、ＣＡＢ３８２２１およびＣＡＡ４７６６４を参照されたい）由来のホモログを含むがそれらに限定されないホモログ、さらに実質的活性（例、天然タンパク質と比較して少なくとも約６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上のデメチラーゼ活性）を保持している上記の変異体および機能的フラグメントをさらに含むそれらのホモログが含まれる。
ＪｍｊＣタンパク質についてのこれ以上の説明については、Ｋｌｏｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：７１５−７２７を参照されたい。
本発明の実践において使用するための「デメチラーゼ」もしくは「タンパク質デメチラーゼ」は、ＪｍｊＣドメインを含み、メチル−リジンもしくはメチル−アルギニンデメチラーゼであってよい。特定の実施形態では、デメチラーゼは、ヒストンデメチラーゼ、例えばヒストンＨ３もしくはＨ４デメチラーゼである。例えば、Ｈ３デメチラーゼは、Ｈ３−Ｋ４、Ｈ３−Ｋ９、Ｈ３−Ｋ２７、Ｈ３−Ｋ３６および／またはＨ３−Ｋ７９を脱メチル化することができる。また別の代替案として、デメチラーゼは、ヒストンＨ４−Ｋ２０を脱メチル化することができる。デメチラーゼは、モノメチル化、ジメチル化、および／またはトリメチル化基質を脱メチル化することができる。さらに、ヒストンデメチラーゼは、メチル化コアヒストン基質、モノヌクレオソーム基質、ジヌクレオソーム基質および／またはオリゴヌクレオソーム基質、ペプチド基質および／またはクロマチンに（例えば、細胞系アッセイにおいて）作用することができる。
本明細書で使用する用語「調節する」もしくは「調節」またはそれらの文法的変形は、特定活性における増強（例、増加）または阻害（例、減少）を指す。
用語「増強」、「増強する」もしくは「増強するステップ」またはそれらの文法的変形は、特定活性における増加（例、少なくとも約１．１倍、１．２５倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、１２倍、もしくは１５倍以上さえの増加）を指す。
本明細書で使用する用語「阻害」、「阻害する」もしくは「減少」、「減少する」またはそれらの文法的変形は、少なくとも約１０％、２５％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％以上の特定活性における減少もしくは縮小を指す。特定の実施形態では、阻害もしくは減少は、検出可能な活性を全くまたは基本的に（すなわち、例えば約１０％もしくは５％未満さえのわずかな量しか）生じさせない。
用語「治療する」、「治療するステップ」もしくは「〜の治療」（または文法的に等価の用語）は、被験者の状態の重症度が減少する、もしくは少なくとも部分的に改善もしくは緩和されること、および／または少なくとも１つの臨床症状における一部の軽減、緩和もしくは減少が達成される、および／または状態の進行における遅延および／または疾患もしくは疾病の発生の予防もしくは遅延が生じることを意味している。そこで、用語「治療する」、「治療するステップ」もしくは「〜の治療」（または文法的に等価の用語）は、予防的および治療的レジメンの両方を指す。
タンパク質脱メチル化アッセイ
本発明者らは、新規な脱メチル化機序を発見し、反応生成物（例えば、ホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸塩）の検出に基づいて新規なデメチラーゼアッセイを開発した。特定の実施形態では、本発明は、組成物中のデメチラーゼ活性を検出する方法であって、（ａ）メチル化タンパク質基質の脱メチル化のために十分な条件下で、前記組成物を（ｉ）メチル化タンパク質基質、（ｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）および（ｉｉｉ）α−ケトグルタレートに接触させるステップと、（ｂ）前記脱メチル化反応からのホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸の遊離を検出するステップであって、前記ホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸の遊離がデメチラーゼ活性の指標であるステップとを含む方法を提供する。本方法は、限定されることなく、デメチラーゼを含有することが知られている組成物のデメチラーゼ活性についてのアッセイとして、または組成物がデメチラーゼを含有するかどうかを決定するための、任意の目的のために実践できる。
デメチラーゼを含有する、または含有することが疑われる任意の適切なサンプルを評価することができる。例えば、サンプルは、タンパク質画分、細胞抽出物、および／または細胞抽出物に由来するタンパク質画分であってよい。細胞抽出物は、さらに、核抽出物、リソソーム抽出物、葉緑体抽出物、エンドソーム抽出物および／または細胞質ゾル抽出物を含むがそれらに限定されない特定の細胞内コンパートメントに由来してよい。
本発明は、さらにまた組成物中のデメチラーゼを同定および／または単離するために実践することができ、本方法は、（ａ）メチル化タンパク質基質の脱メチル化のために十分な条件下で、前記組成物を（ｉ）メチル化タンパク質基質、（ｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）および（ｉｉｉ）α−ケトグルタレートに接触させるステップと、（ｂ）前記脱メチル化反応からのホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸の遊離を検出するステップであって、前記ホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸の遊離がデメチラーゼ活性の指標であるステップと、任意選択的に（ｃ）前記精製プロセス中のデメチラーゼ活性を追跡するために上記のステップ（ａ）および（ｂ）の１回または複数回の繰返しが付随してよい、１つまたは複数のタンパク質精製ステップとを含む。さらに、精製されたタンパク質は、任意選択的に部分的もしくは完全にシーケンシングすることができる。
また別の態様として、本発明は、デメチラーゼ活性を検出する方法であって、（ａ）前記メチル化タンパク質基質の脱メチル化のために十分な条件下で、タンパク質を（ｉ）メチル化タンパク質基質、（ｉｉ）Ｆｅ（ＩＩ）、および（ｉｉｉ）α−ケトグルタレートに接触させるステップと、（ｂ）前記脱メチル化反応からのホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸の遊離を検出するステップであって、前記ホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸の遊離がデメチラーゼ活性の指標であるステップとを含む方法を提供する。本方法は、限定されることなく、公知のタンパク質デメチラーゼのデメチラーゼ活性についてのアッセイとして、またはタンパク質がデメチラーゼであるかどうかを決定するための、任意の目的のために実践できる。
上記に記載した方法の特定の実施形態では、反応混合物はさらにアスコルビン酸塩を含む。
本方法は、細胞系アッセイもしくは無細胞系アッセイとして実践できる。さらに、本発明は、任意のデメチラーゼを、その存在を決定するため、同定するため、および／または単離するために実施することができる。特定の実施形態では、デメチラーゼは、メチル−リジンデメチラーゼおよび／またはメチル−アルギニンデメチラーゼである。本発明の特定の態様によると、デメチラーゼはヒストンデメチラーゼであり、そしてさらにヒストンＨ３デメチラーゼ（例、Ｈ３−Ｋ４、Ｈ３−Ｋ９、Ｈ３−Ｋ２７、Ｈ３−Ｋ３６および／またはＨ３−Ｋ７９デメチラーゼ）および／またはヒストンＨ４デメチラーゼ（例、Ｈ４−Ｋ２０デメチラーゼ）であってよい。適切なメチル化ヒストン基質には、メチル化コアヒストン基質、モノヌクレオソーム基質、ジヌクレオソーム基質および／またはオリゴヌクレオソーム基質、ペプチド基質および／またはクロマチン（例えば、細胞系アッセイにおいて）が含まれるがそれらに限定されない。
メチル化タンパク質もしくはヒストン基質は、単一のリジンもしくはアルギニン残基において１つまたは複数のメチル基をさらに含むことができる（例、モノメチル化、ジメチル化および／またはトリメチル化基質）。
特定の実施形態では、メチル化ヒストン基質は、詳細にはモノメチル化、ジメチル化および／またはトリメチル化Ｈ３−Ｋ３６基質であってもよいメチル化Ｈ３−Ｋ３６基質を含んでもよい。
他の代表的な実施形態では、メチル化ヒストン基質は、詳細にはモノメチル化、ジメチル化および／またはトリメチル化Ｈ３−Ｋ９基質であってもよいメチル化Ｈ３−Ｋ９基質を含んでもよい。
他の代表的な実施形態では、メチル化ヒストン基質は、詳細にはモノメチル化、ジメチル化および／またはトリメチル化Ｈ３−Ｋ４基質であってよいメチル化Ｈ３−Ｋ４基質を含んでもよい。
本発明のこの態様によると、脱メチル化は、反応生成物、例えばホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸塩の遊離を直接的または間接的のいずれかで検出するステップによって評価できる。特定の実施形態では、ホルムアルデヒドの遊離を検出するステップは、ホルムアルデヒドを３，５−ジアセチル−１，４−ジヒドロルチジン（ＤＤＬ）へ変換させ、そして例えば放射標識されたＤＤＬ（例、３Ｈ−ＤＤＬ）を検出することによってＤＤＬを検出するステップを含む。例えば、出発基質は、標識された反応生成物（例、ホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸塩）が脱メチル化反応によって遊離するように標識することができる。例えば、タンパク質もしくはヒストン基質は、３Ｈ−ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）を用いてメチル化することができるが、これは脱メチル化反応において３Ｈ−ホルムアルデヒドの遊離を生じさせ、直接的に検出できる、またはその後に検出できる３Ｈ−ＤＤＬへの変換によって検出できる。
ホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸塩などの反応生成物は、当分野における他の任意の適切な方法、例えば、質量分析法、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、イムノアッセイ、電気泳動法など、または上記の任意の組み合わせによって検出することができる。例えば、ホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸塩は、質量分析法によって（例えば、ホルムアルデヒドのプロトン化形の検出によって、またはコハク酸の検出によって）検出することができる。
本発明者らは、ＪｍｊＣドメインを含むデメチラーゼのファミリーを同定した。そこで、本発明は、メチル化タンパク質を脱メチル化する方法であって、脱メチル化のために十分な条件下で、前記メチル化タンパク質を、ＪｍｊＣドメインを含むデメチラーゼに接触させるステップを含む方法を包含する。さらに、デメチラーゼとしてのＪｍｊＣドメイン含有タンパク質の使用も包含される（例、実験用試薬として）。特定の実施形態では、デメチラーゼはリジンデメチラーゼであり、タンパク質はリジン残基上でメチル化されている。デメチラーゼはヒストンデメチラーゼであってよく、メチル化タンパク質はメチル化ヒストン（例、ヒストンＨ３もしくはＨ４）であってもよい。適切なメチル化ヒストン基質には、メチル化コアヒストン基質、モノヌクレオソーム基質、ジヌクレオソーム基質および／またはオリゴヌクレオソーム基質、ペプチド基質および／またはクロマチンが含まれるが、それらに限定されない。さらに、メチル化タンパク質もしくはヒストンは、単一のリジンもしくはアルギニン残基（例、モノメチル化、ジメチル化および／またはトリメチル化タンパク質もしくはヒストン）で１つまたは複数のメチル基を含むことができる。代表的な実施形態では、メチル化タンパク質は、詳細にはモノメチル化、ジメチル化および／またはトリメチル化Ｈ３−Ｋ３６であってよいメチル化Ｈ３−Ｋ３６を含み、そしてデメチラーゼはＨ３−Ｋ３６デメチラーゼである。他の実施形態では、メチル化タンパク質は、詳細にはモノメチル化、ジメチル化および／またはトリメチル化Ｈ３−Ｋ９であってもよいメチル化Ｈ３−Ｋ９を含み、そしてデメチラーゼはＨ３−Ｋ９デメチラーゼである。他の例示的な実施形態では、メチル化タンパク質は、詳細にはモノメチル化、ジメチル化および／またはトリメチル化Ｈ３−Ｋ４であってもよいメチル化Ｈ３−Ｋ４を含み、そしてデメチラーゼはＨ３−Ｋ４デメチラーゼである。
本発明の一部の典型的な実施形態では、デメチラーゼはＪＨＤＭ１タンパク質である。本発明のこの態様によると、メチル化タンパク質基質は、メチル化Ｈ３−Ｋ３６および任意選択的にモノメチル化および／またはジメチル化Ｈ３−Ｋ３６であってもよい。
または、デメチラーゼはＪＨＤＭ２タンパク質（例、ＪＨＤＭ２Ａ）であってよい。本発明のこの態様によると、メチル化タンパク質基質は、メチル化Ｈ３−Ｋ９および任意選択的にモノメチル化および／またはジメチル化Ｈ３−Ｋ９であってもよい。
他の実施形態では、デメチラーゼはＪＨＤＭ３タンパク質（例、ＪＤＨＭ３Ａ）であってよい。本発明のこの態様によると、メチル化タンパク質基質は、メチル化Ｈ３−Ｋ９および／またはＨ３−Ｋ３６であってよく、ならびに任意選択的にモノメチル化、ジメチル化および／またはトリメチル化Ｈ３−Ｋ９および／またはＨ３−Ｋ３６である。
さらに他の代表的な実施形態では、デメチラーゼはＪＡＲＩＤタンパク質（本明細書に記載するように、例えば、ＲＢＰ２および／またはＪＡＲＩＤ１Ｂ）である。本発明のこの態様によると、メチル化タンパク質基質は、メチル化Ｈ３−Ｋ４および任意選択的にモノメチル化、ジメチル化および／またはトリメチル化Ｈ３−Ｋ４であってよい。
本発明は、さらに本発明のアッセイを実施するためのキットであって、（ａ）ＪｍｊＣドメインを含むデメチラーゼと、（ｂ）脱メチル化反応を実施するためのＪｍｊＣドメイン含有タンパク質の使用方法についての説明書と、任意選択的に、脱メチル化反応を実施するためにＪｍｊＣドメイン含有タンパク質を使用するための追加の試薬もしくは装置とを含むキットも包含する。特定の実施形態では、ＪｍｊＣドメイン含有タンパク質は、ＪＨＤＭ１タンパク質、ＪＤＨＭ２タンパク質および／またはＪＨＤＭ３タンパク質である。本キットは、任意選択的に、Ｆｅ（ＩＩ）、α−ケトグルタレートもしくはアスコルビン酸塩、または上記の任意の組み合わせを含んでもよい。本キットは、３Ｈ−ＳＡＭをさらに含んでもよい。
一部の実施形態では、本キットは、ヒストン基質をさらに含む。ヒストン基質は、ヒストンＨ３、任意選択的に、Ｈ３−Ｋ３６（例、モノメチル、ジメチルおよび／またはトリメチルＨ３−Ｋ３６）および／またはＨ３−Ｋ９（例、モノメチル、ジメチルおよび／またはトリ−メチルＨ３−Ｋ９）を含んでもよい。適切なヒストン基質には、メチル化コアヒストン基質、モノヌクレオソーム基質、ジヌクレオソーム基質、オリゴヌクレオソーム基質および／またはペプチド基質が含まれるが、それらに限定されない。
本発明者らは、ＪｍｊＣドメインを含む新規なデメチラーゼファミリーを同定し、機能的に特性解析した。したがって、また別の態様として、本発明は、タンパク質を候補デメチラーゼであると同定し、任意選択的にリジンデメチラーゼであると同定する方法であって、前記タンパク質内のＪｍｊＣドメインの存在を決定するステップ（例えば、デメチラーゼ活性に関連するタンパク質［またはコードする核酸］を同定し、次に前記タンパク質をシーケンシングするステップによって、または前記アミノ酸もしくは知られているタンパク質の核酸コーディング配列を評価するステップによって）を含む方法を提供する。特定の実施形態では、本方法は、候補ヒストンデメチラーゼを同定し、任意選択的にＨ３−Ｋ３６デメチラーゼ、Ｈ３−Ｋ９デメチラーゼおよび／またはＨ３−Ｋ４デメチラーゼを同定するために実践される。本方法は、例えば本発明による、そして本明細書に記載したようなデメチラーゼアッセイを使用することによって、候補デメチラーゼの酵素活性および／または基質特異性を確証するためのステップをさらに含むことができる。
スクリーニング法
本発明は、ＪｍｊＣドメインを含むデメチラーゼのデメチラーゼ活性を調節する化合物を同定する方法をさらに提供する。任意選択により、本方法は、ヒストンデメチラーゼ（例、ヒストンＨ３もしくはＨ４デメチラーゼ）のデメチラーゼ活性を調節する化合物を同定するために実践することができる。
デメチラーゼ活性を検出または決定するための任意の適切なアッセイは、デメチラーゼ活性を調節する化合物を同定するために使用することができる。
特定の実施形態では、本発明は、ＪｍｊＣドメインを含むデメチラーゼのデメチラーゼ活性を調節する化合物を同定する方法であって、前記デメチラーゼをメチル化タンパク質基質と試験化合物の存在下で接触させるステップと、前記タンパク質基質の脱メチル化のレベルを脱メチル化のために十分な条件下で検出するステップであって、前記試験化合物の非存在下における脱メチル化のレベルと比較した前記タンパク質基質の脱メチル化における変化は、前記試験化合物が前記デメチラーゼのデメチラーゼ活性のモジュレーターであることを示唆するステップとを含む方法を提供する。特定の実施形態では、デメチラーゼはヒストンデメチラーゼであり、脱メチル化タンパク質基質は、メチル化ヒストン基質である。メチル化ヒストン基質は、メチル化Ｈ３−Ｋ３６、Ｈ３−Ｋ９および／またはＨ３−Ｋ４を含むメチル化ヒストンＨ３であってよい。メチル化ヒストン基質は、リジンもしくはアルギニンであってよい特定残基でモノメチル化、ジメチル化もしくはトリメチル化されてよい。１つの典型的な基質は、モノメチル化、ジメチル化および／またはトリメチル化Ｈ３−Ｋ３６である。また別の例示的な基質は、モノメチル化、ジメチル化および／またはトリメチル化Ｈ３−Ｋ９である。また別の典型的な基質は、モノメチル化、ジメチル化および／またはトリメチル化Ｈ３−Ｋ４である。さらに、メチル化ヒストン基質は、メチル化コアヒストン基質、モノヌクレオソーム基質、ジヌクレオソーム基質および／またはオリゴヌクレオソーム基質、ペプチド基質および／またはクロマチン（例えば、細胞系アッセイにおいて）であってよい。
本発明は、任意のＪＨＤＭタンパク質、すなわちＪｍｊＣドメインを含むデメチラーゼ（ヒストンデメチラーゼを含む）を用いて実践することができる。特定の実施形態では、ＪＨＤＭタンパク質は、ＪＨＤＭ１タンパク質、ＪＨＤＭ２タンパク質、ＪＨＤＭ３タンパク質、ＪＡＲＩＤタンパク質（例、ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ［ＰＬＵ１］、ＪＡＲＩＤ１Ｃ［ＳＭＣＸ］、およびＪＡＲＩＤ１Ｄ［ＳＭＣＹ］などのＪＡＲＩＤ１サブファミリータンパク質またはＪＡＲＩＤ２サブファミリータンパク質）、ＵＴＸ／ＵＴＹタンパク質、ＰＨＦ２／ＰＨＦ８サブファミリータンパク質、またはＪｍｊＣドメイン単独サブファミリータンパク質である。
本発明によると、「脱メチル化のレベルを検出するステップ」は、当分野において知られている任意の方法によって実施することができる。特定の実施形態では、脱メチル化は直接的に（例えば、ホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸塩などの脱メチル化反応の反応生成物を検出するステップによって）検出することができる。または、メチル化のレベルを検出して、それから脱メチル化のレベル（例えば、標識化メチル化タンパク質（例えば、３Ｈ−ＳＡＭを用いてメチル化された）を検出することによって、メチル化タンパク質を検出することによって、またはメチル化タンパク質に対して特異的な抗体を用いることによって）決定することができる。
メチル化タンパク質（ヒストンを含む）基質は、当分野において知られている任意の方法によって調製することができる。例えば、ヒストンは、対象の特定メチル化部位に対して特異的な可能性があるヒストンメチルトランスフェラーゼを用いてメチル化することができる。典型的なヒストンメチルトランスフェラーゼには、ＥＺＨ２、ＳＥＴ７、Ｇ９ａ、ＰＲＭＴ１、Ｓｅｔ２、ｈＤＯＴ１Ｌ、Ｄｉｍ５、Ｓｕｖ３９Ｈ１およびＳｕｖ４−２０ｈ１が含まれる。一部の実施形態では、タンパク質もしくはヒストン基質はその天然形においてメチル化されている。
試験化合物の非存在下における脱メチル化のレベルと比較した脱メチル化活性の減少は、試験化合物がデメチラーゼのデメチラーゼ活性の阻害剤であることを示唆する。これとは反対に、試験化合物の非存在下における脱メチル化のレベルと比較した脱メチル化活性の増加は、試験化合物がデメチラーゼのデメチラーゼ活性の活性剤であることを示唆する。
デメチラーゼのデメチラーゼ活性の調節は、当分野において知られている任意の方法によって、例えば本明細書に記載した脱メチル化アッセイであって、前記デメチラーゼをタンパク質基質、Ｆｅ（ＩＩ）、α−ケトグルタレート、および任意選択によりアスコルビン酸塩と接触させるステップと、ならびに質量分析法もしくは当分野において知られている他の任意の方法によって標識（例、放射能）を検出することによって反応生成物（ホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸塩）の遊離を検出するステップとを含むアッセイによって決定することができる。
または、タンパク質のメチル化形に対して特異的である抗体は、例えば、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡによって脱メチル化のレベルを検出するために、またはウェスタンブロット法においてバンドを同定するために使用できる。タンパク質のメチル化状態は、モノメチル化、ジメチル化およびトリメチル化タンパク質に対して特異的な抗体を用いて決定することもできる。モノメチル化、ジメチル化およびトリメチル化Ｈ３−Ｋ３６、Ｈ３−Ｋ９およびＨ３−Ｋ４に対する抗体は、本明細書に記載されている。
さらにまた別の可能性として、標識メチル基を用いてメチル化されたタンパク質基質は、表面（例、マルチウェルプレートの底面、フィルター、マトリックスもしくはビーズ）に結合させることができる。結合したタンパク質基質は、デメチラーゼ、試験化合物、および補因子（例、Ｆｅ（ＩＩ）およびα−ケトグルタレート、ならびに任意選択によりアスコルビン酸塩）と接触させられてよい。脱メチル化は、その後に標識の遊離、または基質に結合した標識の減少によって決定することができる。
放射標識（例、３Ｈ）、蛍光標識、比色標識などを含むが、それらに限定されない任意の検出可能な標識は本発明と一緒に使用できる。または、脱メチル化は、本明細書に記載したように、ホルムアルデヒドおよび／またはコハク酸塩の遊離を検出することによって検出することができる。
本発明のスクリーニング法の特定の実施形態では、試験化合物の非存在下で検出されたデメチラーゼ活性のレベルと比較したデメチラーゼ活性の（例えば、ホルムアルデヒド遊離を検出することによって検出される）減少は、試験化合物が、例えば試験化合物の非存在下における活性のレベルと比較して、デメチラーゼのデメチラーゼ活性の阻害剤であることを示唆する。
他の実施形態では、試験化合物の非存在下で検出されたデメチラーゼ活性のレベルと比較したデメチラーゼ活性の増強は、試験化合物が、試験化合物の非存在下における活性のレベルと比較して、デメチラーゼのデメチラーゼ活性の活性剤であることを示唆する。
スクリーニングの第１ラウンドにおいて同定された阻害剤もしくは活性剤は、本明細書に記載したデメチラーゼアッセイもしくは他の任意の適切なアッセイを用いてＩＣ５０および特異性をさらに決定するために任意選択により評価することができる。相当に低いＩＣ５０を有して対象のタンパク質基質に対する特異性を示す化合物は、さらに組織培養中および／または有機体全体においてそれらがデメチラーゼ活性、細胞増殖、毛髪の成長および／または毒性に及ぼすインビボ作用を決定するために分析することができる。
本スクリーニング法は、細胞系の方法又は無細胞系の方法であってもよい。細胞系の方法は、培養細胞または有機体全体において実施することができる。代表的な実施形態では、本方法は、デメチラーゼのモジュレーターを同定するための高スループットスクリーニング能力を提供する。具体的に示すと、本明細書に開示した方法にしたがって使用するための細胞系高スループットスクリーニングアッセイには、ＤＮＡ合成および翻訳後プロセスなどの生合成プロセスが超小型の細胞系アッセイにおいて監視される、Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．６：７１−８３）によって記載されたアッセイが含まれる。
デメチラーゼ活性を調節する化合物は、デメチラーゼに結合する化合物を同定するステップによって同定することもできる。候補タンパク質結合分子についての低分子ライブラリーをスクリーニングするための高スループットの無細胞法は当分野においてよく知られ、デメチラーゼに結合する、およびデメチラーゼ活性を調節する、および／またはメチル化タンパク質基質に結合する分子を同定するために使用できる。例えば、ＨｅＬａ細胞から精製されたタンパク質基質、遊離ヒストンもしくはヌクレオソーム基質は、マルチウェルプレートもしくは他の適切な表面上に塗布して、デメチラーゼを含有する反応ミックスを前記基質に加えることができる。デメチラーゼの添加の前に、同時に、および／または後に、試験化合物は基質を含有するウェルもしくは表面（例、フィルター、ウェル、マトリックス、ビーズなど）へ加えることができる。反応混合物は、未結合もしくは弱く結合した試験化合物を除去するために任意選択により生理的条件を反映する溶液を用いて洗浄することができる。または、試験化合物を固定化し、デメチラーゼの溶液をウェル、マトリックス、フィルター、ビーズもしくはその他の表面と接触させることができる。試験化合物がデメチラーゼの基質への結合を調節する能力は、標識化（例、放射標識化もしくは化学発光）または競合的ＥＬＩＳＡアッセイを含むがそれらに限定されない任意の方法によって決定することができる。
本明細書に提供した方法にしたがってスクリーニングすることのできる試験化合物は、合成もしくは半合成化学薬品、精製天然生成物、タンパク質、抗体、ペプチド、ペプチドアプタマー、核酸、オリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質、またはその他の有機もしくは無機の低分子もしくは高分子を含むがそれらに限定されない多数の化学クラスを包含する。低分子は、そのような分子が経口投与後により容易に吸収され、潜在的抗原決定基をほとんど有していないために望ましい。非ペプチド物質もしくは低分子ライブラリーは、一般に合成アプローチによって調製されるが、しかし酵素を使用する生合成方法における近年の進歩は、さもなければ化学的に合成するのが困難である化学ライブラリーを調製することを可能にできる。
低分子ライブラリーは、様々な商業事業体、例えばＳＰＥＣＳ社およびＢｉｏＳＰＥＣ Ｂ．Ｖ．社（オランダ国ライスワイク）、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（カリフォルニア州サンディエゴ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ ＵＳＡ社（ニュージャージー州プリンストン）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（英国コーンウォール）、およびＡｓｉｎｅｘ社（ロシア国モスクワ）から入手できる。１つの代表的実施例は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（９２１２７カリフォルニア州サンディエゴ、１６９８１ Ｖｉａ Ｔａｚｏｎ，Ｓｕｉｔｅ Ｇ）から入手できるＤＩＶＥＲＳｅｔ（商標）として知られている。ＤＩＶＥＲＳｅｔ（商標）は、手作業により合成された１０，０００〜５０，０００個の薬物様低分子を含有している。これらの化合物は、最小数の化合物との最大のファーマコフォア多様性をカバーし、高スループットもしくは低スループットいずれかのスクリーニングのために適切である「汎用」ライブラリーを形成するために事前に選択される。追加のライブラリーについての説明については、例えば、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ａｍ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１２０：８５６５−８５６６；およびＦｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｒｏｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３６：９１−１６８を参照されたい。他の市販で入手できるライブラリーは、例えば、ＡｎａｌｙｔｉＣｏｎ ＵＳＡ社（私書箱５９２６号、７７３２５テキサス州キングウッド）；３−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（１９３４１−１１５１ペンシルバニア州エクストン、６６５ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｓｕｉｔｅ １０４）；Ｔｒｉｐｏｓ社（６３１４４−２９１３ミズーリ州セントルイス、１６９９ Ｈａｎｌｅｙ Ｒｄ．）などから入手できる。本発明の特定の実施形態では、本方法は、当分野においてよく知られている技術を用いて、例えばマルチウェルプレート内で、サンプル調製および分注用のロボット光学を用いて、高スループットフォーマットで実施される。様々なスクリーニング法の代表的な実施例は、例えば、米国特許第５，９８５，８２９号、第５，７２６，０２５号、第５，９７２，６２１号、および第６，０１５，６９２号において見いだすことができる。当業者は、適切にこれらの方法を容易に修飾および適応させることができる。
本発明のスクリーニングアッセイにおいては、他の様々な試薬を含むことができる。これらには、最適なタンパク質−タンパク質結合および／または酵素活性を促進するため、および／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を減少させるために使用できる、塩、ＡＴＰ、天然タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤などのような試薬が含まれる。さらに、別の面でプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのアッセイの有効性を向上させる試薬もまた使用できる。結合および／または酵素活性を許容する構成成分の混合物は、任意の順序で加えることができる。
ヒストンメチルトランスフェラーゼは、がんに関連付けられてきたが、これはヒストンデメチラーゼの酵素活性ががん治療のための医薬品開発についての良好な標的でもあることを示唆している。したがって、本発明は、がんを治療するための候補化合物を同定する方法であって、ＪｍｊＣドメインを含むヒストンデメチラーゼをメチル化ヒストン基質と試験化合物の存在下で接触させるステップと、前記ヒストン基質の脱メチル化のレベルを脱メチル化のために十分な条件下で検出するステップであって、前記試験化合物の非存在下における脱メチル化のレベルと比較した前記タンパク質基質の脱メチル化における変化は、前記試験化合物ががんを治療するための候補化合物であることを示唆するステップとを含む方法もまた提供する。
典型的ながんには、乳がん；骨肉腫；血管肉腫；線維肉腫および他の肉腫；白血病；リンパ腫；洞腫瘍；卵巣がん、子宮頸がん、子宮がん、尿管がん、膀胱がん、前立腺がんおよびその他の尿生殖器がん；結腸、食道および胃がんならびにその他の消化器がん；肺がん；骨髄腫；膵臓がん；肝臓がん；腎臓がん；内分泌がん；皮膚がんなどの悪性障害；ならびに神経膠腫および神経芽細胞腫を含む、悪性もしくは良性の脳もしくは中枢神経および末梢神経系（ＣＮＳ）腫瘍が含まれる。
特定の実施形態では、乳がん細胞の増殖を減少させるため、および／または乳がんを治療するための化合物を同定するためのＪＡＲＩＤ１Ｂ［ＰＬＵ１］標的に関する。
ヒストン基質は、デメチラーゼ活性のモジュレーターを同定する方法に関して上述したとおりである。同様に、脱メチル化のレベルは、上述したように当業者に知られている任意の方法によって決定できる。
毛髪の成長を制御するＨａｉｒｌｅｓｓタンパク質は、ＪｍｊＣドメイン含有タンパク質である。このタンパク質は、全身性脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌｉｓ）に罹患した個人においては突然変異している。そこで、Ｈａｉｒｌｅｓｓが同様にデメチラーゼである場合は、Ｈａｉｒｌｅｓｓのデメチラーゼ活性を調節する化合物は脱毛を治療するために同定することができる。したがって、本発明は、脱毛を治療するための候補化合物を同定する方法であって、Ｈａｉｒｌｅｓｓタンパク質をメチル化タンパク質基質と試験化合物の存在下で接触させるステップと、前記タンパク質基質の脱メチル化のレベルを脱メチル化のために十分な条件下で検出するステップであって、前記試験化合物の非存在下における脱メチル化のレベルと比較した前記タンパク質基質の脱メチル化における変化は、前記試験化合物が脱毛を治療するための候補化合物であることを示唆するステップとを含む方法もまた提供する。特定の実施形態では、本発明は、Ｈａｉｒｌｅｓｓのデメチラーゼ活性を活性化して脱メチル化を増加させる化合物を同定するために実践される。
タンパク質基質は、上記のスクリーニング法に関して上述したとおりである。さらに、脱メチル化のレベルを決定する方法は、上述したような当業者に知られている任意の方法によって実施できる。
脱メチル化を調節する方法
本発明は、本発明のスクリーニング法によって同定される化合物をさらに提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のスクリーニング法によって同定された化合物および医薬上許容される担体を含む医薬製剤を提供する。本発明は、医薬品（例えば、がんもしくは脱毛を治療するための）を調製するための本発明のスクリーニング法によって同定された化合物の使用をさらに提供する。
さらに本発明には、一般に、もしくは１つまたは複数の特異的標的遺伝子に関して細胞内もしくは被験者内における脱メチル化を調節する方法もまた包含される。脱メチル化は、特に限定されることなく、分化；増殖；アポトーシス；腫瘍形成性、白血病誘発もしくはその他の発がん性形質転換事象；脱毛；または性分化を含む様々な細胞機能を制御するために調節することができる。例えば、特定の実施形態では、本発明は、がんを有する、もしくはがんに対するリスク状態にあると考察される被験者において、ＪｍｊＣドメインを含むデメチラーゼ（例、ＪＨＤＭタンパク質などのヒストンデメチラーゼ）の活性を調節するステップによってがんを治療する方法を提供する。具体的に示すと、がん遺伝子の発現は、がん遺伝子のＨ３−Ｋ９、Ｈ３−Ｋ３６および／またはＨ３−Ｋ４の脱メチル化を調節することによって抑制できる、および／または腫瘍抑制因子の発現は腫瘍抑制因子遺伝子のＨ３−Ｋ９、Ｈ３−Ｋ３６および／またはＨ３−Ｋ４脱メチル化を調節することによって増加させることができる。本発明によって治療できる典型的ながんは、スクリーニング法に関して上述したとおりである。
また別の態様として、本発明は、ＪｍｊＣドメインを含むデメチラーゼ（例、ＪＨＤＭタンパク質などのヒストンデメチラーゼ）の活性を調節することによってステロイドホルモン依存性標的遺伝子（すなわち、ステロイドホルモン受容体の標的である遺伝子）の発現を調節する方法を提供する。ステロイドホルモン依存性標的遺伝子には、アンドロゲン依存性遺伝子、エストロゲン依存性遺伝子、プロゲステロン依存性遺伝子、甲状腺ホルモン依存性遺伝子、ビタミンＤ依存性遺伝子、および／またはコルチコステロイド依存性標的遺伝子が含まれるが、それらに限定されない。本発明のこの実施形態は、性ステロイドが標的細胞に及ぼす作用を調節するため（例えば、性的成熟および／または二次性徴を調節するため）または、例えばアンドロゲン感受性（例、前立がん）およびエストロゲン感受性（例、乳がん）がんなどのホルモン感受性がんを治療するために実践できる。
本発明者らは、さらにまた多数の多分化能および分化マーカーがＪＨＤＭ２ノックダウンによってダウンレギュレートされることも発見した。代表的な実施形態では、本発明は、例えば細胞系統決定を調節するために多分化能および分化マーカーの発現を調節する方法を提供する。細胞系統マーカーには、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｌａｍｂ１、Ｈｏｘｂ１および／またはＳｔｒａ６が含まれるが、それらに限定されない。そこで、本発明者らは、ＪｍｊＣドメインを含むデメチラーゼ（例、ＪＨＤＭタンパク質などのヒストンデメチラーゼ）の活性を調節することによって、多分化能および分化マーカーの発現を調節する方法を提供する。
本発明は、Ｈａｉｒｌｅｓｓタンパク質の活性を調節することによって脱毛を有する、もしくは脱毛のリスク状態にあると考察される被験者における脱毛を治療する方法もまた提供する。特定の実施形態では、本発明は、Ｈａｉｒｌｅｓｓの活性を増強し、それにより標的遺伝子の脱メチル化を増加させるために実践される。
デメチラーゼの活性は、当分野において知られている方法を用いて調節できる。例えば、デメチラーゼの活性は、被験者におけるデメチラーゼの産生を増加させるために前記デメチラーゼをコードする外因性核酸を導入することによって増強させることができる。任意選択により、異種核酸は、天然形と比較して強化された活性を有するデメチラーゼをコードする。さらに、低分子は、デメチラーゼ（内因性および／または外因性コーディング配列由来）の発現および／またはデメチラーゼタンパク質の活性を増強するために投与することができる。
デメチラーゼの活性は、当分野において知られている方法を用いて減少させることができる。例えば、リボザイム、阻害性ＲＮＡ（例、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、または阻害性抗体を投与することができる。または、デメチラーゼの発現および／またはデメチラーゼの活性を減少させるために低分子を投与することができる。
本発明を記載してきたが、以下では、同一のことを、例示するためにのみ本明細書に含まれ、本発明を限定することは意図されていない以下の実施例においてより詳細に説明する。
［ＪＨＤＭ１タンパク質を特性解析するための方法］
［Ｈ３−Ｋ３６デメチラーゼ活性およびＦｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１Ａの精製］ＨｅＬａ Ｓ３核タンパク質から核抽出物および核ペレットへの分離ならびにその後の核ペレットタンパク質の可溶化、ＤＥＡＥ５２およびＰ１１カラム上の分画は、標準方法にしたがって実施した（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：８５３−８５７）。ＢＣ３００［４０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、および１０％グリセロール、３００ｍＭのＫＣｌ］を用いて溶出したＰ１１画分は、２０ｍＭ硫酸アンモニウム（ＢＤ２０）を含有するバッファーＤ［４０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、および１０％グリセロール］を用いて透析し、４５ｍＬのＤＥ５ＰＷカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ社、ペンシルベニア州モンゴメリービル）にロードした。結合タンパク質は、ＢＤ５０からＢＤ５００への１２−カラム容積（ｃｖ）線形勾配を用いて溶出させた。１４０〜１８５ｍＭの硫酸アンモニウムを用いて溶出させた、デメチラーゼ活性を含有する画分を結合し、７００ｍＭ硫酸アンモニウムへ調整し、その後に２２ｍＬのフェニルセファロース（登録商標）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、スウェーデン国ウプサラ）へロードした。結合タンパク質は、ＢＤ７００からＢＤ５０への８−ｃｖ線形勾配を用いて溶出させた。４５０〜３６０ｍＭ硫酸アンモニウムから溶出させた活性画分をプールし、０．５ｍＬへ濃縮してその後に２４ｍＬのＳｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）にロードした。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６カラムは、ＢＣ４００（４００ｍＭのＫＣｌを含むバッファーＣ）を用いて溶出させた。次に２４０〜３２０ｋＤａを用いて溶出させた活性画分を結合し、ＢＣ５０を用いて２００ｍＭのＫＣｌへ調整し、その後０．１ｍＬのＭｏｎｏＱ（登録商標）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）にロードした。結合タンパク質は、ＢＣ２００からＢＣ５００への２０−ｃｖ線形勾配を用いて溶出させた。カラムからは３１５〜３４５ｍＭのＫＣｌの活性画分が溶出した。活性画分内のタンパク質を結合し、８〜１５％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ内に溶解させた。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（商標）染色後、タンパク質同定のために候補ポリペプチドを切除した。Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１Ａを発現するバキュロウイルスの生成およびＳＦ９細胞から感染させたＦｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１Ａの精製は、確立された方法にしたがって実施した（Ｃａｏ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１５：５７−６７）。
［タンパク質の同定および質量分析法による分析］タンパク質の同定のため、候補ポリペプチドをトリプシンにより消化し、タンパク質はよく知られている方法を用いて同定した（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３１：８７３−８７８）。ペプチド基質分析のために、反応混合液のアリコート（１μＬ）は０．１％蟻酸を用いて１００倍に希釈し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）ゲル装填チップ内に充填した２μＬの床容積のＰｏｒｏｓ ５０Ｒ２（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、マサチューセッツ州フレーミングハム）逆相ビーズにロードした。ペプチドは、５μＬの３０％アセトニトリル／０．１％蟻酸を用いて溶出させた。このペプチドプールの画分（０．５ｍＬ）は、（Ｅｒｄｊｕｍｅｎｔ−Ｂｒｏｍａｇｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ ８２６：１６７−１８１）によって記載されたようにＢＲＵＫＥＲ（登録商標）ＵｌｔｒａＦｌｅｘ（商標）ＴＯＦ／ＴＯＦ機器（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ（登録商標）；ドイツ国ブレーメン）を用いるマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間（ＴＯＦ）質量分析法（ＭＳ）によって分析した。ホルムアルデヒドおよびコハク酸塩を検出するために、反応混合液は０．１％トリフルオロ酢酸を用いて１：１０に希釈し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）（カリフォルニア州フォスターシティ）ＱＳＴＡＲ（商標）四重極飛行時間機器を用いるナノ−エレクトロスプレー質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）およびタンデム質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）によって直接的に分析した。以前に記載された条件（Ｋａｓｔ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１７：１８２５−１８３４）下で、５分間の獲得時間およびＰｒｏｘｅｏｎ（デンマーク国オーデンセ）ナノスプレーニードルを使用した。最適感受性のために、プロトン化ホルムアルデヒドおよびコハク酸塩の質量だけを四重極によって選択し、飛行時間分析器によって分析した（選択されたイオン監視）。ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによるコハク酸のフラグメンテーション分析は、確立された方法（Ｋａｓｔ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１７：１８２５−１８３４）を用いて実施した。
［インビトロヒストンデメチラーゼアッセイ］３Ｈ標識メチル−ヒストンオクタマーもしくは−オリゴヌクレオソーム基質の調製のために、ヒストンメチルトランスフェラーゼをＥ．ｃｏｌｉ（Ｈ３−Ｋ４のためにはＧＳＴ−ＳＥＴ７、Ｈ３−Ｋ９のためにはＧＳＴ−Ｇ９ａ、Ｈ３−Ｋ３６のためにはＣＢＰ−Ｓｅｔ２−Ｆｌａｇ（登録商標）、Ｈ３−Ｋ７９のためにはＧＳＴ−ｈＤＯＴ１Ｌ、Ｈ４−Ｒ３のためにはＧＳＴ−ＰＲＭＴ１、およびＨ４−Ｋ２０のためにはＧＳＴ−Ｓｕｖ４−２０ｈ１）、またはＳｆ９細胞（Ｈ３−Ｋ２７のためにはＥＺＨ２複合体）中において発現させた。ＨＭＴａｓｅｓは、［３Ｈ］−ＳＡＭの存在下で、ヒストンオクタマー（ＳＥＴ７、Ｇ９ａ、ＰＲＭＴ１のために）、ＨｅＬａ細胞から精製したオリゴヌクレオソーム（Ｓｅｔ２、ｈＤＯＴ１Ｌ、Ｓｕｖ４−２０ｈ１のために）、またはニワトリ血（ＥＺＨ２複合体のため）から精製したオリゴヌクレオソームと一緒にインキュベートした。ＨＭＴａｓｅ反応後、反応混合液はヒストン保存バッファー［１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、および１０％グリセロール］中に透析し、ヒストンデメチラーゼアッセイのための基質として使用した。
デメチラーゼアッセイのためには、ヒストンオクタマー、オリゴヌクレオソーム（３Ｈ標識もしくは非標識）またはＨ３−Ｋ３６メチル化ペプチド基質をタンパク質画分またはヒストン脱メチル化反応バッファー［５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、７〜７００μＭのＦｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２、１ｍＭのα−ケトグルタレート、２ｍＭのアスコルビン酸塩］中の精製Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１Ａと一緒に３７℃で１〜３時間インキュベートした。反応混合液は、ＮＡＳＨ法、ウェスタンブロット法、および質量分析法によって分析した。３Ｈ標識ホルムアルデヒドを検出するためには、修正ＮＡＳＨ法（Ｋｌｅｅｂｅｒｇ ａｎｄ Ｋｌｉｎｇｅｒ（１９８２）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８：１９−３１）を使用した。ＴＣＡ沈降法後、等量のＮＡＳＨ試薬（３．８９Ｍ酢酸アンモニウム、０．１Ｍ酢酸、０．２％の２，４−ペンタンジオン）を上清中に加え、この混合液を３７℃で５０分間にわたりインキュベートした。次に等量の１−ペンタノールをこの反応混合液を用いて抽出した。１−ペンタノール相の放射能はシンチレーション計数によって測定した。ペプチド基質を用いて脱メチル化を検出するために、反応混合液中のペプチドをＲＰマイクロチップ上で脱塩し、上述したようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析した。ウェスタンブロット分析を用いて検出もしくはヒストン脱メチル化するために、脱メチル化反応液はメチル特異的抗体を用いてウェスタンブロット法を受けさせた。
［構築物および抗体］ＧＳＴ−ＳＥＴ７、ＧＳＴ−ｈＤＯＴ１Ｌ（１−４１６）、ＧＳＴ−ＰＲＭＴ１およびＥＺＨ２複合体の構成成分をコードするプラスミドは、以前に記載されている（Ｃａｏ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１５：５７−６７；Ｍｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１７：１８２３−１８２８；Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．８：１２０７−１２１７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：８５３−８５７）。ＧＳＴ−Ｇ９ａ（６２１−１０００）、ＣＢＰ−Ｓｅｔ２−Ｆｌａｇ（登録商標）(S. pombe)、およびＧＳＴ−Ｓｕｖ４−２０ｈ１をコードするプラスミドは、親切にもＳｈｉｎｋａｉ博士、Ｓｔｒａｈｌ博士、およびＪｅｎｕｗｅｉｎ博士から各々提供された。Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１Ａ（ヒト）をコードするプラスミドは、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．ｃＤＮＡクローン（５５３４３８４）からのＰＣＲ増幅によって構築した。全長コーディング配列は、Ｎ末端Ｆｌａｇ（登録商標）−タグ付きｐｃＤＮＡ３ベクターおよびＮ末端Ｆｌａｇ（登録商標）−タグ付きｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）ベクターのＮｏｔｌおよびＸｂａｌ部位内へ挿入した。ｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１Ａ（Ｈ２１２Ａ）、ＪｍｊＣ（１４８〜３１６ａａ）ドメイン内の欠失構築物、ｚｆ−ＣＸＸＣ（５６３〜６０９ａａ）モチーフ、ＰＨＤ（６１９〜６７６ａａ）ドメイン、ＦＢＯＸ（８９３〜９３３ａａ）ドメイン、およびＬＲＲｓ（１０００〜１１１８ａａ）は、二段階ＰＣＲによって生成した。ＧＳＴ−ｓｃＪＨＤＭ１（S. cerevisiae）をコードするプラスミドは、S. cerevisiaeゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって構築した。ＧＳＴ−ｓｃＪＨＤＭ１（Ｈ３０５Ａ）およびＧＳＴ−ｓｃＪＨＤＭ１（Ｙ３１５Ａ）突然変異体は、二段階ＰＣＲによって生成した。ＰＣＲを通して生成された全構築物は、ＤＮＡ配列分析によって検証した。
Ｈ３モノメチル−Ｋ３６およびトリメチル−Ｋ３６に対する抗体は、Ａｂｃａｍ（登録商標）（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から購入した。Ｈ３ジメチル−Ｋ３６に対する抗体は、Ｋ３６（下線を引いた）が脱メチル化された合成ペプチド（ＳＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹ−Ｃ；配列番号１）の注射によってウサギにおいて生成した。Ｈ３ジメチル−Ｋ４に対する抗体は、以前に記載されている（Ｆｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：１０５２−１０５８）。Ｆｌａｇ（登録商標）に対する抗体および免疫蛍光法のための二次抗体は、Ｓｉｇｍａ（商標）（ミズーリ州セントルイス）およびＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ペンシルベニア州ウェストグローブ）から各々購入した。Ｈ３に対する抗体は、親切にもＶｅｒｒｅａｕｌｔ博士によって提供された。
［哺乳動物細胞中におけるタンパク質発現および免疫精製法］ＧＳＴおよびＣＢＰ融合タンパク質の全部をＥ．ｃｏｌｉ内で発現させ、グルタチオン固定化アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ（商標））、またはカルモジュリン親和性樹脂（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）上で精製した。ＥＺＨ２複合体の発現および精製は、知られている方法にしたがって実施した（Ｃａｏ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１５：５７−６７）。野生型および変異型Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１Ａタンパク質の免疫沈降法のために、ＣＯＳ−７細胞は、製造業者のプロトコールにしたがってＦｕＧＥＮＥ（商標）６によってプラスミドを用いて一過性でトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞をリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で洗浄し、その後にプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、ニュージャージー州ナトリー）および１ｍＭのフッ化スルホン酸フェニルメチルを含有する溶解バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１０ｍＭのＮａＦ、２０ｍＭのβ−グリセロホスフェート、１ｍＭのＥＧＴＡ、および０．５％のＮＰ−４０）を用いて溶解させた。溶解液を遠心分離で排出させ、免疫沈降法のための溶解物の量はタンパク質発現レベルに基づいて調整した。調整した量の細胞溶解液は、４℃で３時間にわたりＭ２ α−Ｆｌａｇ（登録商標）アガロース（Ｓｉｇｍａ（商標））と一緒にインキュベートした。遠心分離した後、ビーズは溶解バッファーを用いて１回、ＥＤＴＡを含まないＢＣ５０を用いて２回洗浄した。免疫沈降したタンパク質は、デメチラーゼアッセイおよびウェスタンブロット分析のために使用した。
免疫染色。２９３Ｔ細胞を１２ウェルプレート内のガラス製カバースリップ上にプレートし、１日間培養した。ＰＢＳを用いて洗浄した後、細胞は１０分間にわたり４％パラホルムアルデヒド中で固定した。次に細胞は、０．２％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含有する低温ＰＢＳを用いて５分間透過化した低温ＰＢＳを用いて１回洗浄した。透過化した細胞は次にブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン）を用いて３回洗浄し、３０分間にわたりブロックし、その後加湿チャンバー内で一次抗体と一緒に１時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳを用いた３回連続の５分間の洗浄後に、細胞は二次抗体と一緒に１時間にわたりインキュベートした。細胞は次にＰＢＳを用いて洗浄し、ＰＢＳ中の４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）を用いて染色した。細胞は再びＰＢＳを用いて２回洗浄し、次に蛍光計数培地（Ｄａｋｏ社、デンマーク国グロストラップ）に載せ、蛍光顕微鏡下で視認した。
［１ファミリーのＪｍｊＣドメイン含有タンパク質によるヒストン脱メチル化］
［ＨｅＬａ抽出物中のヒストンデメチラーゼ活性の同定］ＤＮＡ中の１−メチルアデニン（１−ｍｅＡ）および３−メチルシトシン（３−ｍｅＣ）のメチル基は、酸化的脱メチル化を通してＡｌｋＢファミリーのタンパク質によって除去することができる（スキーム１）（Ｆａｌｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ ４１９：１７８−１８２；Ｔｒｅｗｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．（２００２）ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．６：３１５−３２０）。
Figure 0005078901
これは、類似の機序を使用すると、メチル化ヒストンからメチル基を除去できることを示唆した（スキーム２）。
Figure 0005078901
これを証明するために、予測された遊離生成物の１つであるホルムアルデヒドの検出に基づいて１つのインビトロアッセイを開発した。検出感受性を最大化するために、ヌクレオソームヒストン基質は、ヒストンＨ３リジン３６（Ｈ３−Ｋ３６）特異的メチルトランスフェラーゼＳｅｔ２および［３Ｈ］−ＳＡＭを用いたインキュベーションによって放射標識した。スキーム３に略述したように、組み込まれていない［３Ｈ］−ＳＡＭは透析により除去し、次に標識された基質には補因子であるＦｅ（ＩＩ）およびα−ケトグルタレート（α−ＫＧ）の存在下で脱メチル化反応を受けさせた。遊離した［３Ｈ］−ホルムアルデヒドを検出するために、本発明者らは、ＴＣＡ沈降法によって汚染している標識されたヒストンおよびタンパク質を最初に除去した。次に化学反応を通して、本発明者らは予測された反応生成物であるホルムアルデヒドを３，５−ジアセチル−１，４−ジヒドロルチジン（ＤＤＬ）へ変換させ、これを有機溶媒中で抽出した後にシンチレーション計数によって検出した（スキーム３）。
Figure 0005078901
上述したアッセイ法を使用して、本発明者らは、ＨｅＬａ核抽出物（ＮＥ）および核ペレット（ＮＰ）に由来するタンパク質画分を分析した（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：８５３−８５７）。図１Ａに示した結果は、デメチラーゼ活性が核ペレット由来の０．３Ｍ Ｐ１１画分中において富んでいることを示唆している。検出されたこの活性が真のデメチラーゼ活性の結果であるかどうかを確証するために、本発明者らは、予測された補因子および反応条件へのそれの依存性について試験した。図１Ｂに示した結果は、ホルムアルデヒドの遊離がタンパク質画分の存在（レーン１）だけではなく、補因子であるＦｅ（ＩＩ）およびα−ＫＧ（レーン３および４）もまた必要とすることを証明している。さらに、アスコルビン酸塩もまた、おそらくはＦｅ（ＩＩＩ）からＦｅ（ＩＩ）を再生させる能力のために、最適活性を得るために必要とされる。これらの結果は、０．３Ｍ Ｐ１１画分中に存在する酵素がヒストン脱メチル化のために示唆された機序を使用できることを証明している。
［ヒストンデメチラーゼとしての新規なＪｍｊＣドメイン含有タンパク質の同定］デメチラーゼ活性に対して大いに関係しているタンパク質を同定するために、本発明者らは、６本のクロマトグラフィーカラムを通して酵素活性を監視したが（スキーム４）、数値は、ヒストンデメチラーゼ活性がそのカラムから溶出する時点の塩濃度（ｍＭ）を表している。
Figure 0005078901
ＤＥＡＥ５ＰＷおよびフェニルセファロース（登録商標）カラムを通して０．３Ｍ Ｐ１１画分を精製した後、本発明者らは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６ゲル濾過カラム上の酵素活性の相対質量を決定し、その天然サイズが約３００ｋＤａであることを見いだした（図２Ａ）。さらにＭｏｎｏＱ（登録商標）カラム上での精製により、本発明者らは、＊によって表示した２つのタンパク質バンド（図２Ｂ、上方パネル）を酵素活性（図２Ｂ、第２パネル）と相関させることができた。２種のタンパク質を同定するために、本発明者らは画分２７〜３０の間のＭｏｎｏＱ（登録商標）サンプルをプールした。濃縮させた後、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで溶解させ、２つの候補タンパク質バンドを同定のために回収した。質量分析法による分析で、２種のタンパク質のうちの大きい方がＦ−ｂｏｘおよびロイシンリッチリピートタンパク質１１（ＦＢＸＬ１１）であると同定した（図２Ｃ）。
ＦＢＸＬ１１は、最初はＦ−ｂｏｘ含有タンパク質についてのヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースを検索することによって同定されたが（Ｃｅｎｃｉａｒｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９：１１７７−１１７９；Ｗｉｎｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９：１１８０−１１８２）、ＦＢＸＬ１１の機能は特性解析されていなかった。Ｆ−ｂｏｘに加えて、ＦＢＸＬ１１は、ＪｍｊＣドメイン、ＣｘｘＣ（配列番号２）ジンクフィンガー、ＰＨＤドメイン、および３つのロイシンリッチリピートを含むいくつかの興味深いドメインを含有している（図３Ａ）。以前に、ＪｍｊＣドメイン含有タンパク質は、クロマチン機能を調節する金属酵素であると予測されていた（Ｃｌｉｓｓｏｌｄ ａｎｄ Ｐｏｎｔｉｎｇ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：７−９）。この予測は、デメチラーゼ活性が補因子としてのＦｅ（ＩＩ）を必要とするという事実と組み合わせると、ＦＢＸＬ１１がおそらくは図２における精製ヒストンデメチラーゼ活性に対して大いに関与していることを示唆する。これを証明するために、本発明者らは、Ｆｌａｇ（登録商標）−タグ付きＦＢＸＬ１１哺乳動物発現ベクターを用いてＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトした。抗Ｆｌａｇ（登録商標）を被覆したビーズを用いた免疫沈降法の後、免疫沈降物の半分をウェスタンブロット分析に、そして半分を酵素活性アッセイのために使用した。図３Ｂ（レーン１および２を比較されたい）に示した結果は、Ｆｌａｇ（登録商標）−ＦＢＸＬ１１免疫沈降物中の強固なヒストンデメチラーゼ活性を明らかにした。
ＦＢＸＬ１１の様々なドメインがその酵素活性に及ぼす重要性を評価するために、ＪｍｊＣドメイン、ＣｘｘＣ（配列番号２）ジンクフィンガー、ＰＨＤドメイン、Ｆ−ｂｏｘ、もしくはロイシンリッチリピート各々の欠失を備える一連の発現構築物を生成した（図３Ａ）。トランスフェクションおよび免疫沈降法の後、これらの変異体タンパク質にウェスタンブロット分析およびデメチラーゼ活性アッセイを受けさせた。タンパク質発現レベルについて標準化した後、様々な欠失変異体の活性を決定した（図３Ｂ）。結果は、絶対的に必要とされるのはＪｍｊＣドメインだけであるが、ＣｘｘＣ（配列番号２）ジンクフィンガー、ＰＨＤドメイン、およびロイシンリッチリピートもまた部分的に酵素活性を付与することを証明している（レーン４〜８を２と比較されたい；図３Ｂ）。酵素活性にとってのＪｍｊＣドメインの重要性をより詳細に証明するために、単一アミノ酸変異体Ｈ２１２Ａを生成した。本発明者らがＨ２１２を突然変異させることを選択したのは、このヒスチジンがＦＢＸＬ１１オルソログのＪｍｊＣドメイン内で高度に保存されているためである（図７Ｂ）。さらに、知られているＦｅ（ＩＩ）依存性オキシゲナーゼであるＦＩＨ［ＨＩＦ（低酸素誘導性因子）を阻害する因子］は、Ｆｅ（ＩＩ）へ直接的に結合することが見いだされた（Ｅｌｋｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１８０２−１８０６）。ヒストンデメチラーゼ活性のＦｅ（ＩＩ）依存性（図１Ｂ）は、Ｈ２１２Ａ突然変異がＦｅ（ＩＩ）結合を崩壊させ、そこでＦＢＸＬ１１の酵素活性を損傷させることを示唆している。図３Ｂに示した結果は、このことを確証した（レーン２および３を比較されたい）。上記の結果に基づいて、ＦＢＸＬ１１は新規なヒストンデメチラーゼであり、ＪｍｊＣドメインはその酵素活性にとって極めて重要であると結論付けられた。ヒストンデメチラーゼ活性はＦＢＸＬ１１についての最初に証明された機能であり、そしてＦＢＸＬ１１はヒストンデメチラーゼ活性を有することが示された最初のＪｍｊＣドメイン含有タンパク質であるので、このタンパク質は、その新しく同定された機能を反映するためにＪＨＤＭ１Ａ（ＪｍｊＣドメイン含有ヒストンデメチラーゼ１Ａ）と命名した。本発明者らがＪＨＤＭ１Ｂと命名した高度に関連するタンパク質ＦＢＸＬ１０（図７Ａ）もまた、活性なＨ３−Ｋ３６デメチラーゼである（データは示していない）。
［ＪＨＤＭ１ＡはＨ３ジメチル−Ｋ３６を優先的に脱メチル化する］ＪＨＤＭ１Ａを詳細に特性解析するために、本発明者らは、Ｆｌａｇ（登録商標）−タグ付きＪＨＤＭ１Ａを発現するバキュロウイルスを生成し、感染させたＳｆ９細胞から親和性クロマトグラフィーによってこのタンパク質を精製した。Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１Ａタンパク質の純度を評価して定量した後（図４Ａ）、本発明者らは、ヒストンＨ３（Ｋ４、Ｋ９、Ｋ２７、Ｋ３６、Ｋ７９）およびＨ４（Ｋ２０）内の知られている全メチル化部位で放射標識したヒストン基質を用いてその部位特異性を分析した。メチル−アルギニンの代表として、本発明者らはさらにＨ４−Ｒ３−メチル化基質もまた生成した。７種の基質中、ＪＨＤＭ１Ａのための基質はＳｅｔ２によってメチル化されたＨ３−Ｋ３６だけであった（図４Ｂ）。そこで、ＪＨＤＭ１ＡはＨ３−Ｋ３６特異的デメチラーゼであると結論付けられた。
リジン残基は、３つのメチル化状態（モノメチル化、ジメチル化、およびトリメチル化）で存在する。ＪＨＤＭ１Ａが特定のメチル化状態を優先的に脱メチル化するかどうかを決定するために、本発明者らは、未標識のコアヒストン、モノヌクレオソーム、およびオリゴヌクレオソーム基質を調製した（Ｆａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３７７：２１３−２２６）。これらの基質に酵素を用いた、または用いない脱メチル化反応を受けさせた後、モノメチル化、ジメチル化、およびトリメチル化Ｈ３−Ｋ３６に対して特異的な抗体を用いるウェスタンブロット分析によってメチル化レベルを測定した。図４Ｃに示した結果は、ＪＨＤＭ１Ａがジメチル−Ｋ３６を優先的に脱メチル化するが（第２パネル、レーン２、４、６を１、３、５と比較されたい）、モノメチルＫ３６レベルにおける減少もまた観察された（第１パネル）ことを示唆している。これとは対照的に、トリメチル−Ｋ３６レベルにおける変化は検出されなかった。これらのアッセイ条件下では、ＪＨＤＭ１Ａは、それが遊離、モノヌクレオソーム、もしくはオリゴヌクレオソーム形にあるかどうかには関わらずＨ３−Ｋ３６を脱メチル化することができた。ＪＨＤＭ１Ａのジメチル−Ｋ３６選択性を詳細に分析するため、ヒストンＨ３のＮ末端に対応する合成ペプチドをＫ３６でジメチル化もしくはトリメチル化し、組換えＦｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１Ａを用いた、または用いない脱メチル化反応を受けさせた。ジメチル−ペプチド基質を含有する反応液の質量分析法による分析は、ＪＨＤＭ１Ａ依存性方法でペプチドのモノメチル化および非メチル化形の生成（図４Ｄ）を明らかにしたが、これはジメチル−Ｋ３６ペプチドがＪＨＤＭ１Ａのための基質として機能できることを示唆している。対照的に、本発明者らは、トリメチル−Ｋ３６ペプチドに並行反応を受けさせた場合に脱メチル化を全く検出しなかった（データは示していない）。上記の結果に基づいて、ＪＨＤＭ１Ａは、ジメチル化形に対する優先性を伴って、Ｈ３−Ｋ３６を選択的に脱メチル化すると結論付けられた。
［ＪＨＤＭ１Ａは、インビボでＨ３ジメチル−Ｋ３６を脱メチル化する］インビトロにおけるＪＨＤＭ１Ａに向けてのデメチラーゼ活性が証明されたので、本発明者らはインビボにおける活性を試験しようと考えた。安定性のＪＨＤＭ１Ａノックダウン細胞系を生成しようとする本発明者らの試みは成功しなかったので、Ｈ３Ｋ３６メチル化レベルがＪＨＤＭ１Ａの過剰発現によって影響を受けるかどうかを決定した。図５Ｂに提示したデータは、２９３Ｔ細胞中におけるＦｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１Ａの過剰発現がジメチル−Ｋ３６レベルの有意な減少を生じさせるが、モノメチル−Ｋ３６、トリメチル−Ｋ３６のレベルもジメチル−Ｋ４のレベルも変化させなかったことを示唆している（図５Ａ、５Ｄ、５Ｅ）。Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１Ａがジメチル−Ｋ３６レベルに及ぼす作用は、酵素的に欠陥のある突然変異体の過剰発現がジメチル−Ｋ３６レベルに影響を及ぼさなかったので、その酵素活性に依存する（図５Ｃ）。これらの結果から、ＪＨＤＭ１ＡはインビボでＨ３ジメチル−Ｋ３６を脱メチル化すると結論付けられた。
［ＪＨＤＭ１Ａ媒介性ヒストン脱メチル化は、ホルムアルデヒドおよびコハク酸塩を生成する］インビトロおよびインビボにおけるＪＨＤＭ１Ａの酵素活性が証明されたので、本発明者らは、次に反応機序について検証した。スキーム２に示したように、脱メチル化反応は、ホルムアルデヒドおよびコハク酸塩を生成する。２，４−ペンタンジオンからＤＤＬへの変換は、反応生成物としてのホルムアルデヒドと一致しているが（スキーム３）、これはその存在を直接的に証明するものではない。このため、本発明者らは、ホルムアルデヒドを直接的に検出するために質量分析法を使用した。このアッセイ条件下では、ホルムアルデヒドは３１．０１８４の質量対電荷（ｍ／ｚ）比を備えるプロトン化形で存在する。図６Ａに示した結果は、ホルムアルデヒドがプロトン化ホルムアルデヒドの分子量での反応混合物中のイオンの出現に基づいて反応生成物であることを証明している（ｍ／ｚ ３１．０２３９）。ホルムアルデヒドの形成は、反応液中のＪＨＤＭ１Ａの存在に依存している（上方および下方パネルを比較されたい）。類似のアプローチを使用して、本発明者らは、ＪＨＤＭ１Ａ依存性方法でプロトン化コハク酸（Ｃ４Ｏ４Ｈ７）と相関するイオン（ｍ／ｚ １１９．０７７８で）もまた検出した（図６Ｂ）。類似のｍ／ｚ １１９．１２１５（しかし低いリッチ度：約２０％）のイオンもまたＪＨＤＭ１Ａの非存在下の反応混合物中で検出されたので（図５Ｂ、下方パネル）、本発明者らは、ＪＨＤＭ１Ａの存在下で検出されたイオンが実際にコハク酸であったことを検証しようと考えた。純粋コハク酸のＭＳ／ＭＳ参照スペクトル（図６Ｃ、上方パネル）を使用して、本発明者らは、脱メチル化反応において生成した予測コハク酸のフラグメンテーションパターンを分析した。フラグメンテーションパターンがコハク酸の参照スペクトルと一致したことは、この反応がコハク酸を生成したことを示唆している（図６Ｃ、上方パネルと中央パネルとを比較されたい）。重要なことに、ＪＨＤＭ１Ａの非存在下では反応液からシグナルは全く検出されなかったが（下方パネル）、これはコントロール反応液中で検出された低いリッチ度（図６Ｂ、下方パネル）がコハク酸ではないことを示唆している。これらをまとめると、これらの質量分析法による分析は、ＪＨＤＭ１Ａ媒介性ヒストン脱メチル化はホルムアルデヒドおよびコハク酸塩を生成することを証明しているので、したがってスキーム２に略述した脱メチル化機序を確証している。
［ＪｍｊＣドメイン媒介性ヒストン脱メチル化はヒトから酵母に至るまで保存されている］ＪＨＤＭ１Ａ媒介性ヒストンＨ３−Ｋ３６脱メチル化においてＪｍｊＣドメインが果たす極めて重要な役割が確定されたので（図３）、ＪｍｊＣドメインの機能が進化的に保存されているかどうかを決定した。ＳＭＡＲＴデータベースの検索により、細菌からヒトに至る生物体内における５３８種のＪｍｊＣドメイン含有タンパク質が明らかになった。各有機体内のＪｍｊＣドメイン含有タンパク質の数は、ゲノム複雑性に相関していると思われ、ヒトにおいては１０９種、マウスにおいては８６種、Drosophilaにおいては１９種、C. elegensにおいては１５種、S. pombeにおいては７種、およびS. cerevisiaeにおいては５種であった。ヒトおよびマウスにおいて見いだされた高度に関連性のＪＨＤＭ１Ｂに加えて、上記で言及した各有機体内では潜在的ＪＨＤＭ１Ａホモログが同定されたので、それらのドメイン構造を図７Ａに提示した。これらのタンパク質間でドメイン構造は完全には保存されていないが、それらのＪｍｊＣドメインは高度に保存されている（図７Ｂ）。重要なことに、それらのＪｍｊＣドメインとＦＩＨのＪｍｊＣドメインとのアラインメントは、Ｆｅ（ＩＩ）およびα−ＫＧ結合に関係している、＊および＃によって表示されたアミノ酸の厳密な保存を明らかにした（Ｅｌｋｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１８０２−１８０６）。これは、これらのタンパク質が活性なデメチラーゼである可能性が高いことを示唆している。これを証明するために、本発明者らは、ＪＨＤＭ１Ｂをクローニングし、そのＨ３−Ｋ３６デメチラーゼ活性を示した（データは示していない）。次に、本発明者らは、S. cerevisiaeのホモログであるｓｃＪＨＤＭ１をコードするＹＥＲ０５１Ｗのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅させ、それをＥ．ｃｏｌｉ内でＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。組換えｓｃＪＨＤＭ１はメチル−Ｋ３６を特異的に脱メチル化したが、メチル−Ｋ４またはメチル−Ｋ７９ではない（図７Ｃ）。検出されたデメチラーゼ活性は、ＪｍｊＣドメイン内の点突然変異（Ｈ３０５Ａ）が酵素活性を完全に無効にしたので、ＪｍｊＣドメインに依存していた（図７Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ＪｍｊＣドメインがヒストン脱メチル化において果たす極めて重要な役割およびこの機能がヒトから酵母に至るまで保存されていることを証明している。
［Ｈ３−Ｋ３６デメチラーゼ活性とＥｐｅ１機能との間の連結］ＪｍｊＣドメインの機能的保存が証明されたので、本発明者らは、ＪＨＤＭ１ファミリータンパク質の知られている機能とそれらのデメチラーゼ活性との間の連結を確証しようと考えた。文献の検索は、図７Ａに示したＪＨＤＭ１ファミリーメンバー中、機能的に特性解析されているのはS. pombeのホモログＥｐｅ１だけであることが明らかになった（Ａｙｏｕｂ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２３：４３５６−４３７０）。Ｅｐｅ１は、ヘテロクロマチン障壁外におけるサイレンシングの広がりを促進する突然変異についての遺伝的スクリーニングにおいて同定された（Ａｙｏｕｂ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２３：４３５６−４３７０）。Ｅｐｅ１突然変異は、さらにヒストンデアセチラーゼであるｃｌｒ３、ｃｌｒ６内における突然変異を抑制し、ｍａｔ遺伝子座における抑制された後成的状態を安定化させる。Ｅｐｅ１の過剰発現は、ヘテロクロマチン構造を崩壊させ、動原体機能を損傷させる。Ｅｐｅ１が正常に機能するには、ＪｍｊＣドメイン変異体Ｙ３０７Ａが機能消失ｅｐｅ１突然変異体を補完できなかったので、無傷ＪｍｊＣドメインを必要とする。興味深いことに、Ｅｐｅ１中のＹ３０７に対応するチロシンは全部のＪＨＤＭ１ファミリータンパク質中に存在し（図７Ｂ、＄によって表示した）、これはこの残基が保存された機能に関係していることを示唆している。この残基がＨ３−Ｋ３６デメチラーゼ活性にとって重要かどうかを決定するために、本発明者らは、Ｅｐｅ１ Ｙ３０７Ａ突然変異を模倣するｓｃＪＨＤＭ１内の突然変異（Ｙ３１５Ａ）を生成した。この突然変異は、Ｈ３−Ｋ３６デメチラーゼ活性を有意に減少させた（図７Ｄ）。この結果は、ｅｐｅ１表現型が同様に損傷したＨ３−Ｋ３６脱メチル化能力の結果として生じることを示唆している。このため、Ｈ３−Ｋ３６脱メチル化の主要な機能の１つは、ヘテロクロマチン安定性を維持することである。
［ＪＨＤＭ２タンパク質を特性解析するための方法］
［ヒストンデメチラーゼアッセイ］ヒストンデメチラーゼアッセイは、実施例１に記載したとおりに実施した。
天然型および組換えＪＨＤＭ２Ａの精製。ＪＨＤＭ２Ａの従来型精製の手順は、スキーム５に略述した。
Figure 0005078901
Ｐ１１ホスホセルロースカラム上のＨｅＬａ細胞核抽出物の調製および分画は、確立された方法にしたがって実施した（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １２：４７５−４８７）。ＢＣ３００を用いて溶出させたＰ１１画分は、５０ｍＭ硫酸アンモニウム（ＢＤ５０）を含有するバッファーＤ（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、および１０％グリセロール）内へ透析し、４５ｍＬのＤＥ５ＰＷカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ社）へロードした。結合タンパク質は、ＢＤ５０からＢＤ４５０への１２−ｃｖ線形勾配を用いて溶出させた。ＨＤＭ活性を含有する流液は７００ｍＭ硫酸アンモニウムへ調整し、その後にそれを２２ｍＬのフェニルセファロース（登録商標）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）へロードした。結合タンパク質は、ＢＤ７００からＢＤ０への１０−ｃｖ線形勾配を用いて溶出させた。ＢＤ１５０〜ＢＤ５０へ溶出させた活性画分を結合し、５ｍＬへ濃縮し、その後に１２０ｍＬのＳｅｐｈａｃｙｌ（登録商標）Ｓ３００ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）へロードした。約３００ｋＤａで溶出した活性画分をプールし、ＢＣ５０を用いて平衡化させた１ｍＬのＭｏｎｏＳ（登録商標）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）へロードした。結合タンパク質は、ＢＣ５０からＢＣ４００への２０−ｃｖ線形勾配を用いて溶出させた。活性画分は、ＢＣ１００〜ＢＣ１５０へ溶出した。活性画分内のタンパク質をプールし、６．５〜１２％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて溶解させた。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）染色後、タンパク質同定のために候補ポリペプチドを切除した。
Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ２Ａを発現するバキュロウイルスの生成および感染させたＳＦ９細胞からのＦｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ２Ａの精製は、よく知られている方法にしたがって実施した（Ｃａｏ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１５：５７−６７）。ＣＯＳ−７細胞由来の野生型および欠失変異型Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ２Ａの精製については、変異型Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１Ａタンパク質について記載したとおりであった（実施例１を参照されたい）。同様に、タンパク質の同定および質量分析法は、実施例１に記載した方法にしたがって実施した。
［構築物および抗体］ＧＳＴ−ＳＥＴ７をコードするプラスミド、ＧＳＴ−ｈＤＯＴ１Ｌ（１〜４１６）、ＥＺＨ２複合体の構成成分、ＧＳＴ−Ｇ９ａ（６２１〜１０００）、およびＣＢＰ−Ｓｅｔ２−Ｆｌａｇ（登録商標）は、実施例１に記載したとおりであった。ＧＳＴ−ＳＥＴ８をコードするプラスミドについては、以前に記載されている（Ｃａｏ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１５：５７−６７）。ｈＪＨＤＭ２ＡをコードするプラスミドはヒトＫＩＡＡクローン（ＫＩＡＡ０７４２）からのＰＣＲ増幅によって構築し、Ｎ末端Ｆｌａｇ（登録商標）−タグ付きｐｃＤＮＡ３ベクターまたはＮ末端Ｆｌａｇ（登録商標）−タグ付きｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）ベクターのＸｈｏｌ部位内に挿入した。ｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ２Ａ（Ｈ１１２０Ｙ）、および欠失変異体（４８９〜１３２１ａａ）、（７６６〜１３２１ａａ）、（１〜１００９ａａ）はＰＣＲによって生成した。ＰＣＲを通して生成された全構築物は、配列分析によって検証した。ＲＮＡｉ構築物は、ｍＪｈｄｍ２ａを標的とする１９ｂｐ短鎖ヘアピンＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド（ＲＮＡｉ１：５’−ＧＴＡ ＣＡＡ ＧＡＡ ＧＣＡ ＧＴＡ ＡＴＡ Ａ−３’（配列番号３）；ＲＮＡｉ２：５’−ＡＧＧ ＴＧＴ ＣＡＣ ＴＡＧ ＣＣＴ ＴＡＡ Ｔ−３’（配列番号４）を合成することによって作製し、当分野において記載されたＨ１ ＲＮＡプロモーターの調節下でｐＭＳＣＶｎｅｏレトロウイルスベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（商標）、カリフォルニア州パロアルト）内へクローン化した（Ｏｋａｄａ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ １２１：１６７−１７８）。
使用した抗体の起源は次のとおりである。Ｈ３トリメチル−Ｋ４（Ａｂｃａｍ社）、Ｈ３モノメチル−Ｋ９（Ａｂｃａｍ社）、Ｈ３ジメチル−Ｋ９（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ニューヨーク州レイクプラシッド）、およびＨ３ジメチル−Ｋ２７（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）。Ｈ３トリメチル−Ｋ９抗体は、当分野において知られている（Ｐｌａｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００：１３１−１３５）。Ｆｌａｇ（登録商標）に対する抗体および免疫蛍光法のための二次抗体は、実施例１に記載したとおりである。ｈＪＨＤＭ２Ａに対する抗体は、抗原としてこのタンパク質の最初の４９５アミノ酸を使用してウサギにおいて生成した。
［免疫染色］ＣＯＳ−７細胞を１２ウェルプレート内のガラス製カバースリップ上にプレーティングし、１日間培養した。細胞はＦｕＧＥＮＥ（商標）６によってプラスミドを用いて一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞はＰＢＳを用いて洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間にわたり固定した。次に細胞は、低温ＰＢＳを用いて３回洗浄し、０．２％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含有する低温ＰＢＳを用いて５分間透過化した。透過化した細胞は次にブロッキングバッファー（１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）を用いて３回洗浄し、３０分間にわたりブロックし、その後加湿チャンバー内で一次抗体と一緒に１時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳを用いた連続３回の５分間の洗浄後、細胞を二次抗体と一緒に１時間にわたりインキュベートし、その後ＰＢＳを用いて洗浄し、ＰＢＳ中の４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）を用いて染色した。細胞は再びＰＢＳを用いて２回洗浄し、次に蛍光計数培地（Ｄａｋｏ社）に載せ、免疫蛍光顕微鏡下で視認した。
［安定性ＪＨＤＭ２Ａノックダウン細胞系の生成］Ｆ９細胞は、０．１％ゼラチン被覆プレート上で１０％ ＦＢＳが補給されたＤＭＥＭ培地中で培養した。ＭＳＣＶｎｅｏ−ＪＨＤＭ２Ａ ｓｉＲＮＡベクターは、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションによって２９３Ｔ細胞内へｐＧａｇ−ｐｏｌおよびｐＶＳＶＧと一緒にコトランスフェクトした。トランスフェクションの４８〜７２時間後に、上清を採取し、ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ法によるＦ９細胞の形質導入のために使用した。安定性トランスフェクタントは、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（登録商標）、メリーランド州ゲーサーズバーグ）の存在下で選択した。これらのトランスフェクタントに由来する細胞を、ウェスタンブロット、リアルタイムＰＣＲ、およびＣｈＩＰ分析のために使用した。
［リアルタイムＰＣＲおよびＣｈＩＰアッセイ］リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））およびＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標））を用いて３回ずつ実施した。定量的ＰＣＲ反応は、各プライマーについて標準化された条件下で実施した。標準プラスミドの１０倍希釈液を用いて標準曲線を作製した。様々なサンプル中の相対量の標的を比較するために、全数値を適切に定量した３６Ｂ４コントロールに対して標準化した。定量的ＰＣＲにおいて使用したプライマーは、次のとおりであった。ｍＪｈｄｍ２ａ−Ｆ、５’−ＴＧＡ ＧＴＡ ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＣＧ ＡＧＡ ＴＧ−３’（配列番号５）およびｍＪｈｄｍ２ａ−Ｒ、５’−ＧＧＴ ＣＣＣ ＡＴＡ ＴＴＴ ＣＣＧ ＡＴＣ ＣＴ−３’（配列番号６）；３６Ｂ４−Ｆ、５’−ＣＴＧ ＡＴＧ ＧＧＣ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＣＣ ＡＴ−３’（配列番号７）および３６Ｂ４−Ｒ、５’−ＧＴＧ ＡＧＧ ＴＣＣ ＴＣＣ ＴＴＧ ＧＴＧ ＡＡ−３’（配列番号８）；Ｎａｎｏｇ−Ｆ、５’−ＡＡＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＣＧＧ ＡＣＴ ＧＴ−３’（配列番号９）およびＮａｎｏｇ−Ｒおよび５’−ＡＴＣ ＴＧＣ ＴＧＧ ＡＧＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ＴＡ−３’（配列番号１０）；Ｏｃｔ４−Ｆ、５’−ＣＣＡ ＡＴＣ ＡＧＣ ＴＴＧ ＧＧＣ ＴＡＧ ＡＧ−３’（配列番号１１）およびＯｃｔ４−Ｒ、５’−ＣＣＴ ＧＧＧ ＡＡＡ ＧＧＴ ＧＴＣ ＣＴＧ ＴＡ−３’（配列番号１２）；Ｓｏｘ２−Ｆ、５’−ＧＡＡ ＣＧＣ ＣＴＴ ＣＡＴ ＧＧＴ ＡＴＧ ＧＴ−３’（配列番号１３）およびＳｏｘ２−Ｒ、５’−ＴＴＧ ＣＴＧ ＡＴＣ ＴＣＣ ＧＡＧ ＴＴＧ ＴＧ−３’（配列番号１４）；ＬａｍｉｎｉｎＢ１−Ｆ、５’−ＧＴＴ ＣＧＡ ＧＧＧ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＴＣ ＴＧ−３’（配列番号１５）およびＬａｍｉｎｉｎＢ１−Ｒ、５’−ＧＴＴ ＣＡＧ ＧＣＣ ＴＴＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＧＴ−３’（配列番号１６）；Ｈｏｘａ１−Ｆ、５’−ＧＣＣ ＣＴＧ ＧＣＣ ＡＣＧ ＴＡＴ ＡＡＴ ＡＡ−３’（配列番号１７）およびＨｏｘａ１−Ｒ、５’−ＴＣＣ ＡＡＣ ＴＴＴ ＣＣＣ ＴＧＴ ＴＴＴ ＧＧ−３’（配列番号１８）；Ｓｔｒａ６−Ｆ、５’−ＧＴＴ ＣＡＧ ＧＴＣ ＴＧＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＧＣ−３’（配列番号１９）、Ｓｔｒａ６−Ｒ、５’−ＣＡＧ ＧＡＡ ＴＣＣ ＡＡＧ ＡＣＣ ＣＡＧ ＡＡ−３’（配列番号２０）。
ＣｈＩＰアッセイのために、１５０ｍｍ培養皿中の９０％のコンフルエントのＦ９細胞は、１％ホルムアルデヒドを含有するＤＭＥＭを用いて１０分間にわたり処理した。架橋結合は、５分間にわたる０．１２５Ｍグリシンの添加によって停止させた。ＰＢＳを用いて２回洗浄した後、細胞はピペッティングによって１ｍＬの細胞溶解バッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．９］、０．５％のＮＰ−４０、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ）中に再懸濁させ、氷上で１０分間維持した。４，０００ｒｐｍで５分間にわたり遠心した後、細胞ペレットは、４℃で２０分間にわたり核タンパク質を抽出するために核溶解バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．９］、２５％グリセロール、０．５％のＮＰ−４０、０．４２ＭのＮａＣｌを１．５ｍＭ、０．２ｍＭ のＥＤＴＡ）を含有するプロテアーゼ阻害剤中に再懸濁させた。クロマチンは、平均長１ｋｂを備えるフラグメントに超音波処理した。１０分間にわたる１３，０００ｒｐｍでの遠心後、上清は、１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、２ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．９］、５０ｍＭのＮａＣｌ、およびプロテアーゼ阻害剤を含有する当量の希釈バッファー中に希釈させた。ＣｈＩＰアッセイは、次に抗ＪＨＤＭ２Ａ、抗ジメチル−Ｋ９、および抗トリメチル−Ｋ４抗体を用いて実施した。全ＣｈＩＰ実験のために、定量的ＰＣＲ分析は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００配列検出システムおよびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎマスターミックスを用いてリアルタイムで実施した。ＤＮＡの量は、２−Ｃｔの代数式（式中、Ｃｔはサイクル閾値数である）にしたがって決定した。投入ＤＮＡに比した免疫沈降ＤＮＡの相対量を計算した。プライマー対は次のとおりであった。ＬａｍｉｎｉｎＢ１−Ｆ、５’−ＣＴＴ ＴＴＣ ＴＣＣ ＣＣＧ ＣＴＡ ＣＣＴ ＣＴ−３’（配列番号２１）およびＬａｍｉｎｉｎＢ１−Ｒ、５’−ＣＴＡ ＧＧＡ ＣＡＣ ＣＡＡ ＡＧＧ ＣＧＡ ＡＣ−３’（配列番号２２）；Ｓｔｒａ６−Ｆ、５’−ＴＧＧ ＡＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＧＴＣ ＴＣＴ ＧＡ−３’（配列番号２３）およびＳｔｒａ６−Ｒ、５’−ＣＴＣ ＣＴＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＧＴ ＣＴＣ ＴＣ−３’（配列番号２４）；Ｈｏｘａ１−Ｆ、５’−ＡＣＴ ＧＣＣ ＡＡＧ ＧＡＴ ＧＧＧ ＧＴＡ ＴＴ−３’（配列番号２５）および５’−ＣＴＴ ＣＧＣ ＡＧＧ ＡＴＣ ＣＡＡ ＴＣＡ ＣＴ−３’（配列番号２６）。
ＬＮＣａＰ細胞中におけるＣｈＩＰアッセイのために、細胞はＲ１８８１（５０ｎＭ）を用いた１時間にわたる処理前に３日間にわたり活性炭処理血清培地中で培養した。ＣｈＩＰアッセイは、本質的には以前に記載したように実施した（Ｙｏｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２５：３２４−３３５）。ＰＳＡ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析のためのプライマーは、５’−ＧＣＣ ＣＡＣ ＣＣＡ ＧＧＡ ＧＣＣ ＡＧＣ ＡＣＴ−３’（配列番号２７）および５’−ＧＧＣ ＣＣＣ ＣＡＧ ＡＡＴ ＣＡＣ ＣＣＧ ＡＧＣ ＡＧ−３’（配列番号２８）であった。
ＡＲ−ＪＨＤＭ２Ａ相互作用。インビトロ翻訳した３５Ｓ−メチオニン標識ＡＲ（１０μＬ）を１００μＬの反応液中の１００ｎＭ Ｒ１８８１の存在下もしくは非存在下で結合バッファー（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦおよび１０％グリセロール）中の３μＬ（３００ｎｇ）の精製組換えＪＨＤＭ２Ａと混合した。この混合液を低温室内で２時間にわたり回転させ、プロテインＡアガロースビーズおよび抗ＪＨＤＭ２Ａ抗体（１０μＬ）を加えた。１時間のインキュベーション後、ビーズは結合バッファーを用いて広汎に洗浄し、ＡＲは１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって溶解させ、オートラジオグラフィーによって視認した。
［ＪＨＤＭ２Ａは核ホルモン受容体を通しての転写活性化を促進する］
［ヒストンデメチラーゼ活性の精製および同定］ＳＥＴ２−メチル化ヌクレオソームヒストン基質は、ヒストンデメチラーゼ活性を監視するために使用されてきた。そこで、並行試験において、本発明者らもまた、Ｈ３−Ｋ９メチルトランスフェラーゼＧ９ａを含む他のヒストンメチルトランスフェラーゼによってメチル化されたヒストン基質を使用した（Ｔａｃｈｉｂａｎａ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：１７７９−１７９１）。Ｇ９ａ−メチル化ヒストン基質にＨｅＬａ細胞核抽出物（ＮＥ）および核ペレット（ＮＰ）由来のタンパク質画分を使用する脱メチル化アッセイを受けさせると（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：８５３−８５７）、本発明者らは、核抽出物由来の０．３Ｍ Ｐ１１タンパク質画分内でＨ３−Ｋ９デメチラーゼ活性を検出した（図８Ａ）。この活性が真正デメチラーゼの結果であるのかどうかを確証するために、本発明者らは、必要とされる補因子であるＦｅ（ＩＩ）およびα−ＫＧへの依存性について試験した。図８Ｂに示した結果は、ホルムアルデヒドの遊離がタンパク質画分の存在（レーン１および５を比較されたい）だけではなく、補因子であるＦｅ（ＩＩ）およびα−ＫＧ（レーン２および３をレーン１と比較されたい）もまた必要とすることを証明している。Ｆｅ（ＩＩＩ）からＦｅ（ＩＩ）を再生させることに関与しているアスコルビン酸塩の添加は、ホルムアルデヒド産生を刺激すると思われる（レーン１および４を比較されたい）。これらの結果は、ヒストンデメチラーゼ活性が核抽出物由来の０．３Ｍ Ｐ１１画分内に存在し、候補酵素はおそらくヒストン脱メチル化のためにＪＨＤＭ１Ａによって使用される同一の酸化的脱メチル化機序を使用することを示唆している（実施例２）。
このデメチラーゼ活性に重要な役割を担うタンパク質を同定するために、本発明者らは、５本のクロマトグラフィーカラムを通して酵素活性を監視した（スキーム５）。ＤＥＡＥ５ＰＷおよびＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラムを通しての０．３Ｍ Ｐ１１画分の精製後、本発明者らは、酵素活性の天然質量が、Ｓｅｐｈａｃｙｌ（登録商標）Ｓ３００カラムによって評価した場合に約３００ｋＤａであると決定した（図９Ａ）。ＭｏｎｏＳ（登録商標）カラム上でのそれ以上の精製によって、本発明者らは、酵素活性（図９Ｂ、下方パネル）を＊によって表示された約１５０ｋＤａのタンパク質に相関させることができた（図９Ｂ、上方パネル）。画分１７と２０との間では酵素活性において劇的な相違が存在したので（図９Ｂ）、本発明者らは、これら２つの画分に集中し、それらのタンパク質組成をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって比較した（図９Ｃ）。画分２０に固有のタンパク質バンドを回収した後、それらに質量分析法による分析を受けさせると、＊によって表示されたタンパク質がＪＭＪＤ１Ａ（Ｊｕｍｏｎｊｉドメイン含有１Ａ）と命名された新規なＪｍｊＣドメイン含有タンパク質もしくはＴＳＧＡ（精巣特異的遺伝子Ａ）であることが明らかになった（Ｈｏｏｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３０：１７３−１８１）（図９Ｃ）。ＪＭＪＤ１Ａが検出されたデメチラーゼ活性に対して大いに関与している検証するために、このタンパク質に対する抗体を生成し、ＭｏｎｏＳ（登録商標）カラムの画分２１〜２９からＪＭＪＤ１Ａを免疫沈降させるために使用した。免疫沈降させたサンプルを銀染色、ウェスタンブロット、およびデメチラーゼアッセイ分析のために分割した。図９Ｄに示した結果は、デメチラーゼ活性（下方パネル）が上清（Ｓ）から完全に欠失していることを証明し、これはＪＭＪＤ１Ａの欠失（中央パネル）と相関していた。重要なことに、銀染色（上方パネル）は、ＪＭＪＤ１Ａに対応する単一タンパク質を明らかにした。これらの結果をまとめると、ＪＭＪＤ１Ａが検出されたデメチラーゼ活性に対して大きく関与していることを示唆している。サイズが約３００ｋＤａであることを前提にすると（図９Ａ）、ＪＭＪＤ１Ａはホモダイマーとして機能すると思われる。ヒストンデメチラーゼ活性はそのタンパク質に対して最初に同定された活性であり、それは本発明者らが同定した第２のＪｍｊＣドメイン含有ヒストンデメチラーゼであるので、本発明者らは、その新規に同定された機能を反映するためにタンパク質ＪＨＤＭ２Ａ（ＪｍｊＣドメイン含有ヒストンデメチラーゼ２Ａ）と改名した。そこで、本発明者らは、他の２つのＪＨＤＭ２Ａ関連性ヒトタンパク質を各々ＪＨＤＭ２ＢおよびＪＨＤＭ２Ｃと命名した（図１０Ｃ）。
ＪＨＤＭ２Ａは、精巣ｃＤＮＡライブラリー内で最初に同定された（Ｈｏｏｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３０：１７３−１８１）。インサイチューハイブリダイゼーション試験は、ＪＨＤＭ２Ａが雄性胚細胞中で主として発現し、その定常状態転写体レベルは胚細胞発達の減数期中および減数後期の段階において最高であることを示唆した（Ｈｏｏｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３０：１７３−１８１）。ＳＭＡＲＴプログラムを用いたドメイン構造分析は、ＪｍｊＣドメインおよびジンクフィンガーの存在を明らかにした（図１０Ａ）。ＪｍｊＣドメインがヒストンデメチラーゼのためのシグネチャーモチーフであることを前提にすると（実施例２）、ＪＨＤＭ２Ａ中のＪｍｊＣドメインの存在は、ＪＨＤＭ２Ａが検出されたヒストンデメチラーゼ活性に対して重要な役割があることを示唆している。ＪＨＤＭ２Ａのデメチラーゼ活性を直接的に証明するために、本発明者らは、Ｆｌａｇ（登録商標）−タグ付き哺乳動物発現ベクターを用いてＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトした。抗Ｆｌａｇ（登録商標）コンジュゲート化ビーズを用いた免疫沈降法の後、免疫沈降物の半分をウェスタンブロット分析に、そして半分を酵素活性アッセイのために使用した。図１０Ｂ（レーン１）に示した結果は、Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ２Ａタンパク質に依存する強固なヒストンデメチラーゼ活性を明らかにした。
ＪＨＤＭ２Ａの酵素活性に対するＪｍｊＣおよびジンクフィンガードメインの重要性を評価するために、本発明者らは、Ｎ末端、ジンクフィンガー、およびＪｍｊＣドメイン各々の欠失を備える３つの発現構築物を生成した（図１０Ａ）。トランスフェクションおよび免疫沈降法の後、これらの変異体タンパク質にウェスタンブロット分析およびデメチラーゼ活性アッセイを受けさせた。図１０Ｂに示した結果は、ジンクフィンガーおよびＪｍｊＣドメインの両方が酵素活性のために極めて重要であることを示唆している（レーン１をレーン３〜５と比較されたい）。酵素活性にとってのＪｍｊＣドメインの重要性をより詳細に証明するために、ＪｍｊＣドメイン内で単一アミノ酸置換Ｈ１１２０Ｙを生成した。本発明者らは、アミノ酸Ｈ１１２０を突然変異させることを選択したが、これはこのヒスチジンがＪＨＤＭ２Ａ関連タンパク質のＪｍｊＣドメイン内で高度に保存され（図１０Ｄ）、そして知られているＦｅ（ＩＩ）依存性オキシゲナーゼであるＦＩＨ［ＨＩＦ（低酸素誘導性因子）を阻害する因子］が、Ｆｅ（ＩＩ）へ直接的に結合することが見いだされたためであった（Ｅｌｋｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１８０２−１８０６）。ヒストンデメチラーゼ活性のＦｅ（ＩＩ）依存性（図８Ｂ）は、Ｈ１１２０Ｙ突然変異がＦｅ（ＩＩ）結合を崩壊させ、そこでＪＨＤＭ２Ａの酵素活性を損傷させることを示唆していた。図１０Ｂに示した結果は、このことを確証した（レーン１および２を比較されたい）。このため、ＪＨＤＭ２Ａは新規なヒストンデメチラーゼであり、ＪｍｊＣドメインが酵素活性のために極めて重要であると結論付けられた。
［ＪＨＤＭ２ＡはインビトロでＨ３モノメチルおよびジメチル−Ｋ９を脱メチル化する］ＪＨＤＭ２Ａを詳細に特性解析するために、本発明者らは、Ｆｌａｇ（登録商標）−タグ付きＪＨＤＭ２Ａを発現するバキュロウイルスを生成し、感染したＳｆ９細胞から親和性クロマトグラフィーによってこのタンパク質を精製した。Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ２Ａタンパク質の純度を評価して定量した後（図１１Ａ）、本発明者らは、その酵素活性を分析して天然ＪＨＤＭ２Ａタンパク質の酵素活性と比較した。図１１Ｂに示した結果は、組換えＦｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ２Ａおよび天然ＪＨＤＭ２Ａが、等量のタンパク質を比較した場合に類似の活性を有することを証明している（レーン１をレーン４および５と比較されたい）。ＪＨＤＭ２Ａの部位特異性を分析するために、ヒストンＨ３（Ｋ４、Ｋ９、Ｋ２７、Ｋ３６、Ｋ７９）およびＨ４（Ｋ２０）内の全部の知られているメチル−リジン部位で放射標識されたヒストン基質に精製組換えＦｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ２Ａを含有する脱メチル化アッセイを受けさせた。６種の基質中、ＪＨＤＭ２Ａのための基質はＧ９ａによってメチル化されたＨ３−Ｋ３６だけであった（図１１Ｃ）。Ｈ３−Ｋ９に加えて、以前の試験は、Ｇ９ａがインビトロでＨ３−Ｋ２７もまたメチル化できることを示唆した（Ｔａｃｈｉｂａｎａ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：１７７９−１７９１）。ＪＨＤＭ２ＡはＨ３−Ｋ９を特異的に脱メチル化するがＨ３−Ｋ２７を脱メチル化しないことを検証するために、本発明者らは、Ｇ９ａ ＨＭＴを用いてＫ９ＲもしくはＫ２７Ｒのいずれかを含有する放射標識基質ヒストンＨ３を生成した。並行して、本発明者らは、さらにまた本アッセイにおいて放射標識した野生型組換えＨ３およびＨｅＬａコアヒストンも含んだ。図１１Ｄに示した結果は、ＪＨＤＭ２ＡがＫ９を突然変異させた場合はＨ３を脱メチル化できなかったが（レーン５および６を比較されたい）、Ｋ２７突然変異はＪＨＤＭ２Ａの活性には影響を及ぼさなかった（レーン７および８を比較されたい）ことを示している。そこで、ＪＨＤＭ２ＡはＨ３−Ｋ９特異的デメチラーゼであると結論付けられた。
リジン残基は、３つのメチル化状態（モノメチル化、ジメチル化、およびトリメチル化）で存在する。ＪＨＤＭ２Ａが特定のメチル化状態を優先的に脱メチル化するかどうかを決定するために、本発明者らは、Ｈ３−Ｋ９−メチル化ペプチド基質を用いる脱メチル化アッセイを実施し、質量分析法によって脱メチル化生成物を分析した。図１１Ｅに示した結果は、ジメチル−Ｋ９ペプチドの脱メチル化がＪＨＤＭ２Ａの存在に左右され、モノメチルおよびジメチル−Ｋ９の両方が基質として機能できることを示唆する、ペプチドのモノメチルおよび非メチル化形の両方と相関する質量を備える生成物を生成したことを証明している。これとは対照的に、同一配列を有するトリメチル−Ｋ９ペプチドに並行分析を受けさせた場合には、脱メチル化は検出されなかった（図１１Ｆ）。上記の結果に基づいて、ＪＨＤＭ２ＡはＨ３−モノメチルおよびジメチル−Ｋ９を選択的に脱メチル化すると結論付けられた。
［ＪＨＤＭ２ＡはインビボでＨ３モノメチルおよびジメチル−Ｋ９を脱メチル化する］インビトロにおけるＪＨＤＭ２Ａに向けてのデメチラーゼ活性が証明されたので、本発明者らはインビボにおける活性を試験しようと考えた。このために、本発明者らは、免疫染色によってＪＨＤＭ２Ａの過剰発現がＨ３−Ｋ９メチル化に及ぼす作用について調査した。ＪＨＤＭ２Ａの過剰発現はＨ３−ジメチル−Ｋ９レベルを大きく減少させることが見いだされた（図１２Ａ）。この作用は、酵素的に欠陥のある突然変異体の過剰発現がジメチル−Ｋ９レベルに影響を及ぼさなかったので、決してＦｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ２Ａの存在に起因する修飾特異的抗体を入手できないことが原因ではなかった（図１２Ｂ）。モノメチル−Ｋ９のレベルにおける減少は、ＪＨＤＭ２Ａを過剰発現した細胞内で観察された（図１２Ｃ）。しかし、トリメチル−Ｋ９（図１２Ｄ）またはジメチル−Ｋ２７のレベルに及ぼす作用は観察されなかった。さらに、ＪＨＤＭ２Ａの過剰発現は、数種の知られているＨ３Ｋ９メチルトランスフェラーゼの発現レベルを変化させない（データは示していない）。これらの結果は、ＪＨＤＭ２ＡがインビボでＨ３モノおよびジメチル−Ｋ９を脱メチル化するが、ジメチル−Ｋ９に対する優先性が見られることを示唆している。
［ＪＨＤＭ２Ａノックダウンは増加したプロモーターＨ３−Ｋ９脱メチル化が付随する転写の減少を導く］インビトロおよびインビボにおけるＪＨＤＭ２Ａの酵素活性が証明されたので、本発明者らは、ＪＨＤＭ２Ａが転写調節に役割を果たすかどうかという問題を解決することを試みた。これまでの試験は、Ｈ３−Ｋ９メチル化を転写抑制およびヘテロクロマチン形成と結び付けている（Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ（２００５）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：８３８−８４９）。このため、Ｈ３−Ｋ９デメチラーゼは、潜在的に遺伝子サイレンシングに拮抗する。これを試験するため、本発明者らは、ベクター媒介性ＲＮＡｉアプローチを使用して安定性Ｊｈｄｍ２ａノックダウン細胞を生成した（Ｏｋａｄａ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ １２１：１６７−１７８）。本発明者らは、Ｆ９細胞内でノックダウンを実施することを選択したが、これはこの細胞系が本発明者らにより分析された３種の細胞系の中で最高のＪｈｄｍ２ａ発現を示すためであった（図１３Ａ）。定量的ＰＣＲ（図１３Ｂ、上方の２つのパネル）およびウェスタンブロット（図１３Ｂ、下方の２つのパネル）分析は、ノックダウン効率がＲＮＡレベルでは約８０％およびタンパク質レベルでは約７０％であることを確証した。親Ｆ９細胞と比較してノックダウン細胞内で明白な形態学的変化は観察されなかったが（データは示していない）、これはＪｈｄｍ２ａがＦ９細胞の未分化状態を維持することに重要な役割を果たさないこと、またはＦ９細胞内でも発現する（データは示していない）高度に関連性のＪｈｄｍ２ｂがＪｈｄｍ２ａ機能を補償する可能性があることのいずれかを示唆している。Ｊｈｄｍ２ａノックダウンに応答した明白な細胞分化は観察されなかったが、それでも本発明者らは、Ｊｈｄｍ２ａノックダウンに応答した少数の遺伝子の発現レベルにおける変化を分析した。本発明者らが分析した遺伝子は、多分化能マーク（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２）ならびに分化マーク（Ｌａｍｂ１、Ｈｏｘａ１、Ｈｏｘｂ１、およびＳｔｒａ６）を含んでいた。図１３Ｃに示した結果は、Ｊｈｄｍ２ａノックダウンに応答して、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４は約２０％ダウンレギュレートされたが、分化マークであるＬａｍｂ１、Ｈｏｘｂ１、およびＳｔｒａ６は約４０〜６０％ダウンレギュレートされたことを示唆している。これらの結果は、転写を正に調節するＨ３−Ｋ９デメチラーゼとして機能するＪｈｄｍ２ａと一致している。対照的に、Ｈｏｘａ１の発現は、おそらく間接的作用に起因してＪｈｄｍ２ａノックダウンによってアップレギュレートされた。
Ｊｈｄｍ２ａノックダウンに起因する観察された転写作用が直接作用を表すのかどうかを調査するために、本発明者らは、ＣｈＩＰアッセイによってＬａｍＢ１およびＳｔｒａ６プロモーターへのＪＨＤＭ２Ａタンパク質の結合について分析した。コントロールとして、本発明者らは、それのＨｏｘａ１遺伝子プロモーターへの結合も分析した。図１３Ｄに示した結果は、ＪＨＤＭ２ＡがＬａｍＢ１およびＳｔｒａ６プロモーターには結合するが、Ｈｏｘａ１プロモーターには結合しないことを示唆している（第１列および２列を第３列と比較されたい）。Ｊｈｄｍ２ａのノックダウンはＪＨＤＭ２Ａ結合を有意に減少させたが、これは検出されたＣｈＩＰシグナルが特異的であったことを示唆している（第１列および第２列）。ＪＨＤＭ２Ａがジメチル−Ｋ９デメチラーゼとして機能するという観察に一致して、Ｊｈｄｍ２ａのノックダウンはＬａｍＢ１およびＳｔｒａ６プロモーターではジメチル−Ｋ９レベルを増加させたが、Ｈｏｘａ１プロモーターにはほとんど作用を及ぼさなかった（第４〜６列）。Ｊｈｄｍ２ａがジメチル−Ｋ９特異的デメチラーゼであるという事実に一致して、Ｊｈｄｍ２ａのノックダウンは分析した３種のプロモーターのいずれについてもトリメチル−Ｋ４レベルにおける有意な変化を誘発しなかった（第７〜９列）。これらの結果から、ＪＨＤＭ２Ａはジメチル−Ｋ９を脱メチル化するために１サブセットの遺伝子を標的とし、これは順にそれらの遺伝子発現を正に調節すると結論付けられた。
［ＪＨＤＭ２Ａのホルモン依存性動員はＨ３−Ｋ９の脱メチル化および転写活性化と相関する］ＪＨＤＭ２Ａは、２種の密接に関連するホモログであるＪＨＤＭ２ＢおよびＪＨＤＭ２Ｃを有する（図１０Ｃ）。興味深いことに、ＪＨＤＭ２Ｃは、ＴＲＩＰ８と命名された甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）相互作用タンパク質として酵母ツーハイブリッドスクリーン内で最初に同定された（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９：２４３−２５４）。さらに、ＪＨＤＭ２Ａは、核ホルモン受容体相互作用に関係するシグネチャーモチーフである８８５ＬＸＸＬＬ８８９（配列番号２９）配列を含有している（Ｈｅｅｒｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８７：７３３−７３６）。そこで、核受容体による転写調節にＪＨＤＭ２Ａが含まれることが決定された。ＴＲとのホルモン依存性相互作用はインビトロプルダウンアッセイまたは共免疫沈降アッセイのいずれによっても検出されなかったが（データは示していない）、本発明者らは、ＪＨＤＭ２Ａがリガンド依存性方法でアンドロゲン受容体（ＡＲ）と相互作用することを見いだした（図１４Ａ）。このインビトロ相互作用のインビボ関連性を調査するために、本発明者らはＪＨＤＭ２Ａがホルモン依存性方法で知られているＡＲ標的遺伝子に動員されるかどうかを調べようと考えた。そこで、本発明者らは、ホルモンの存在下または非存在下のＬＮＣａＰ細胞中で、２種の明確に特性解析されたＡＲ標的遺伝子である前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびＮＫＸ３．１についてＣｈＩＰアッセイを実施した。図１４Ｂに示した結果は、Ｒ１８８１処理後のＡＲのＰＳＡエンハンサーへの強力な結合を証明している（第３パネル、レーン１および２を比較されたい）。同様に、ＮＫＸ３．１転写開始部位の約３ｋｂ上流に位置する機能ＡＲＥ（ＡＲエンハンサー）を含有する領域へのＡＲの強力なホルモン依存性結合もまた検出された（第３パネル、レーン３および４を比較されたい）。ホルモン誘導性転写活性化（データは示していない）に一致して、どちらの場合にもヒストンアセチル化の増加が検出された（第４パネル）。重要なことに、Ｒ１８８１処理はさらにＪＨＤＭ２ＡとＡＲ標的遺伝子との結び付きの増加ももたらし（図１４Ｂ、第５パネル）、これにはジメチル−およびトリメチル−Ｋ９のレベルにおける減少が付随した（図１７Ｂ、第６および第７パネル）。ホルモン依存性方法でＰＳＡおよびＮＫＸ３．１遺伝子へ結合するＪＨＤＭ２Ａとは対照的に、ＬＳＤ１とこれら２種の遺伝子との結び付きは、当分野における教示（Ｍｅｔｚｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３７：４３６−４３９）と一致して、ホルモン処理による影響を受けなかった（図１４Ｂ、最後のパネル）。
ＪＨＤＭ２ＡおよびＬＳＤ１がホルモン依存性転写活性化において果たす役割を直接的に試験かつ比較するために、本発明者らは、ｓｉＲＮＡを使用してＬＮＣａＰ細胞中のＪＨＤＭ２ＡおよびＬＳＤ１をノックダウンした（図１４Ｃ）。本発明者らは次に、ＪＨＤＭ２ＡもしくはＬＳＤ１のノックダウンが３種のＡＲ標的遺伝子であるＰＳＡ、ＮＫＸ３．１およびＴＭＰＲＳＳ２２のホルモン誘導性活性化に及ぼす作用を定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。図１４Ｄに示した結果は、８時間にわたるＲ１８８１を用いた処理は全３種のＡＲ標的遺伝子からの転写を確実に活性化させたが、ＪＨＤＭ２Ａのノックダウンは全３種のＡＲ標的遺伝子についてホルモン応答における有意な減少をもたらしたことを証明している。ＬＳＤ１のノックダウンもまたホルモン応答の減少をもたらしたが、この作用はＪＨＤＭ２Ａのノックダウンと比較すると有意ではなかった。このため、ＪＨＤＭ２ＡはＡＲによる最適なホルモン依存性転写活性化のために極めて重要であると結論付けられた。
ＪＨＤＭ２ＡがＡＲによるホルモン依存性活性化において果たす役割が確証されたので、本発明者らは、次にＪＨＤＭ２Ａが図１４Ｂにおいて観察されたホルモン誘導性Ｈ３Ｋ９脱メチル化にとって重要であるかどうかを試験した。このために、ＬＮＣａＰ細胞を最初にＪＨＤＭ２Ａ ｓｉＲＮＡで処理し、次にＣｈＩＰ分析の１時間前にＲ１８８１による処理を実施した。図１４Ｅに示した結果は、ＪＨＤＭ２ＡのＰＳＡエンハンサーおよびＮＫＸ３．１遺伝子へのホルモン誘導性動員が、ｓｉＪＨＤＭ２Ａ処理を受けると大きく無効にされたことを証明している（第２パネル、レーン３をレーン２および４と比較されたい；レーン７をレーン６および８と比較されたい）。重要なことに、ＪＨＤＭ２ＡのノックダウンはＰＳＡエンハンサーでのジメチル−Ｈ３Ｋ９のホルモン誘導性減少を有意に損傷させた（第４パネル、レーン２および３を比較されたい）。程度は小さくなるが、ＪＨＤＭ２ＡのノックダウンはＮＫＸ３．１におけるジメチル−Ｈ３Ｋ９のホルモン誘導性減少にも影響を及ぼした（第４パネル、レーン６および７を比較されたい）。これらの結果は、ＪＨＤＭ２ＡがＡＲ標的遺伝子での抑制性ジメチル−Ｈ３Ｋ９の効率的脱メチル化のために必要とされることを示唆している。興味深いことに、ＪＨＤＭ２Ａはトリメチル−Ｈ３Ｋ９に向けての活性を有さなかったが（図１１Ｆ、１２Ｄ、１３Ｄ）、ＪＨＤＭ２ＡのノックダウンはＰＳＡエンハンサーおよびＮＫＸ３．１の両方に対するトリメチル−Ｈ３Ｋ９のホルモン誘導性減少にも影響を及ぼした（図１４Ｅ、最後のパネル）。ＪＨＤＭ２Ａのノックダウンがホルモン誘導性Ｈ３アセチル化レベルもまた減少させると思われることは興味深かった（図１４Ｅ、第３パネル、レーン２および３、６および７を比較されたい）。この観察に対する１つの説明は、Ｈ３Ｋ９脱メチル化がＨ３Ｋ９アセチル化の前提条件であることにある。他方、ＪＨＤＭ２ＡをノックダウンしてもＡＲの両方の標的遺伝子へのホルモン誘導性結合には影響を及ぼさなかったが（図１４Ｅ、第１パネル）、これはＪＨＤＭ２Ａが標的遺伝子への結合に続発するＡＲ媒介性転写活性化に寄与することを示唆している。
［ＪＨＤＭ３タンパク質を特性解析するための方法］
［構築物および組換えタンパク質］ＪＨＤＭ３ＡはＥＳＴクローン（ＩＭＡＧＥ３１３８８７５）からＰＣＲ増幅させ、Ｎ末端Ｆｌａｇ（登録商標）−タグを含有するように遺伝子組み換えされた修飾ＦａｓｔｂａｃＨＴｂ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、カリフォルニア州カールスバッド）およびｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））のＢａｍＨＩおよびＮｏｔｌ部位内へクローニングした。Ｈ１９７Ａ置換突然変異は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を用いて特定部位突然変異誘発によって生成した。検出構築物は、確立された方法を用いて生成した（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２５：６４０４−１４）。すべての場合に、ＰＣＲ増幅したクローンの配列は、配列分析によって確証した。Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ３Ａを発現するバキュロウイルスの作製および感染したＳＦ９細胞からの組換えタンパク質の精製は、実施例３に記載したとおりに実施した。
［脱メチル化アッセイおよび質量分析法］全ヒストン基質は、実施例１に記載したとおりに放射標識した。同様に、ヒストン脱メチル化アッセイおよび質量分析法も、実施例１に記載したとおりに実施した。本アッセイで使用したペプチド基質はヒストンＨ３のアミノ酸１〜１８を包含し、リジン９上でジ−メチルもしくはトリ−メチルいずれかの修飾を含有していた。
［免疫蛍光顕微鏡検査］ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、１０％のＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で増殖させた。６ウェルプレート内のカバースリップ上で増殖させた細胞は、ＦｕＧＥＮＥ（商標）６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ社）を使用して２μｇのＦｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ３Ａ発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。ＧＦＰ−ＨＰ１βを用いる実験において、トランスフェクションには２５０ｎｇの発現ベクターを含めた。細胞は４％パラホルムアルデヒド中での２０分間にわたるトランスフェクションの２４時間後に固定し、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、次に０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００／ＰＢＳ中で２０分間にわたり透過化させた。透過化した細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、３０分間にわたり３％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中でブロッキングした。細胞は、１：１００の希釈率にあるヒストン修飾抗体［トリ−メチルＨ３Ｋ９（Ｐｌａｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００：１３１−５）、ジ−メチルＨ３Ｋ９（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、モノ−メチルＨ３Ｋ９（Ａｂｃａｍ社）、およびトリ−メチルＨ３Ｋ２７（Ｐｌａｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００：１３１−５）］ならびに１：１０００の希釈率にあるＦｌａｇ（登録商標）モノクローナルＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ（登録商標））を用いて１〜３時間にわたり加湿チャンバー内で一次抗体と一緒にインキュベートした。一次抗体とのインキュベーション後、細胞は３回洗浄し、ＦＩＴＣ−もしくはローダミンコンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と一緒にインキュベートした。細胞はＰＢＳを用いて２回洗浄し、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）を用いて染色し、蛍光封入剤（Ｄａｋｏ社）中のスライドガラス上に載せた。スライドは、蛍光顕微鏡で分析した。
［ＪＨＤＭ３Ａ ｓｉＲＮＡ、ＲＴ−ＰＣＲ分析およびＣｈＩＰ］ｓｉＲＮＡ媒介性ＪＨＤＭ３Ａのノックダウン、ＡＳＣＬ２のＲＴ−ＰＣＲ分析、およびＣｈＩＰ分析は、実施例３に記載したとおりに実施した。
［ＪＨＤＭ３はヒストンＨ３リジン９トリ−メチル化を直接的に逆転させ、トリ−メチル−リジン９−媒介性ＨＰ１動員に拮抗する］
追加のヒストンリジンデメチラーゼを同定するために、本発明者らは、提案されたＦｅ（ＩＩ）およびα−ＫＧ結合部位内の類似性に焦点を当てて、他のＪｍｊＣファミリーメンバーのＪｍｊＣドメインをＪＨＤＭ１Ａ／ＢおよびＪＨＤＭ２Ａ（各々、実施例２および４）と比較した。関連タンパク質ヒドロキラーゼであるＦＩＨ（低酸素誘導性因子を阻害する因子）は、Ｆｅ（ＩＩ）およびα−ＫＧと錯体化されたＦＩＨの構造を利用でき、そこで基準点として機能できるので、アラインメント内に含めた（Ｅｌｋｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１８０２−６）。分析したＪｍｊＣドメイン含有タンパク質の中では、Ｆｅ（ＩＩ）およびα−ＫＧ結合に関係すると予測されたアミノ酸が保存されているので（図１５Ａおよび１５Ｂ）、ＪＭＪＤ２タンパク質ファミリー（Ｋａｔｏｈ ＆ Ｋａｔｏｈ （２００４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２４：１６２３−８）がデメチラーゼ活性に対する優れた候補であった。ＪＭＪＤ２Ａは特性解析された唯一のＪＭＪＤ２ファミリーメンバーであるので（Ｇｒａｙ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：２８５０７−１８；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：６４０４−１４）、本発明者らは、このタンパク質が活性ヒストンデメチラーゼであるかどうかを定義することに努力を集中した。
ＪＭＪＤ２Ａが活性ヒストンデメチラーゼであるかどうかを決定するために、本発明者らは、バキュロウイルス発現系を用いて昆虫細胞内で組換えＦｌａｇ（登録商標）−タグ付きＪＭＪＤ２Ａを生成し、この組換えタンパク質が均質性になるまで精製した（図１５Ｃ）。ヒストンＨ３およびＨ４上の複数の特性解析されたメチル−リジン部位に対応する放射標識されたメチル基を含有する様々なヒストン基質を用いる脱メチル化分析は、精製組換えＪＭＪＤ２Ａと一緒にインキュベートした場合に標識ホルムアルデヒドを遊離させるのはＤｉｍ５−標識ヒストン基質だけであることを示唆した（図１５Ｄ）。これは、ＪＭＪＤ２Ａがメチル化ヒストンＨ３Ｋ９に向けてのデメチラーゼ活性を有することを示した。ＪＭＪＤ２Ａが補因子としてＦｅ（ＩＩ）およびα−ＫＧを用いる酸化的脱メチル化機序を利用するかどうかを検証するために、確保因子をこの脱メチル化反応から個別に削除した。完全酵素活性は、完全補因子／酵素補体が反応内に存在した場合にのみ観察された（図１５Ｅ）。まとめると、これらのデータは、組換えＪＭＪＤ２Ａが補因子としてのＦｅ（ＩＩ）およびα−ＫＧを用いる酸化的脱メチル化反応を介してＨ３Ｋ９脱メチル化を触媒することを示している。ＪＭＪＤ２Ａが活性ヒストンデメチラーゼであることが証明されたので、本発明者らは、その酵素機能を反映し、現行の命名規則を確かにするために、このタンパク質をＪｍｊＣドメイン含有ヒストンデメチラーゼ３Ａ（ＪＨＤＭ３Ａ）と改名した。
真菌Ｈ３Ｋ９メチルトランスフェラーゼＤｉｍ５はモノメチル、ジメチル、およびトリメチル化ヒストンＨ３Ｋ９基質をインビトロで生成できることを前提にして（Ｔａｍａｒｕ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３４：７５−９）、本発明者らは、ＪＨＤＭ３Ａの修飾状態特異性を決定しようと考えた。このために、Ｆｌａｇ（登録商標）−タグ付きＪＨＤＭ３ＡをＮＩＨ３Ｔ３細胞内で発現させた。ＪＨＤＭ３Ａの過剰発現がＨ３Ｋ９メチル化レベルに及ぼす作用は、間接的免疫蛍光染色によって分析した。以前の観察（Ｔａｍａｒｕ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３４：７５−９）に一致して、Ｆｌａｇ（登録商標）−タグ付きＪＨＤＭ３Ａタンパク質は、広汎性核染色を示した（図１６、左のパネル）。興味深いことに、ＪＨＤＭ３Ａを発現する細胞は核の挟動原体ヘテロクロマチンおよび全真正染色質領域でトリメチルＨ３Ｋ９のほぼ完全な消失を示した（図１６Ａ、上方パネル）。観察されたトリメチル−Ｋ９の消失は、予測されたＦｅ（ＩＩ）結合部位における突然変異（Ｈ１９７Ａ）がその作用を無効にしたので、無傷ＪｍｊＣドメインに依存していた（図１６Ａ、下方パネル）。観察された脱メチル化もまた、ジ−メチルＫ９、モノ−メチルＫ９、もしくはトリメチルＫ２７を含む他のヒストン修飾状態では作用が観察されなかったので、トリメチルＨ３Ｋ９特異的であった（図１６Ｂ）。このようにして、ＪＨＤＭ３Ａはインビボでトリメチル−Ｈ３Ｋ９を優先的に脱メチル化すると結論付けられた。
次に、本発明者らは、この基質特異性がＪＨＤＭ３Ａに固有であるかどうかを決定しようと考えた。このようにして、本発明者らは、組換えＪＨＤＭ３Ａと、Ｈ３Ｋ９位置でジ−メチルもしくはトリ−メチル修飾のいずれかを含有するペプチドとをインキュベートした。脱メチル化反応後、ペプチド基質は質量分析法によって分析した。トリメチル−Ｋ９特異的デメチラーゼとして作用するＪＨＤＭ３Ａと一致して、トリメチル−Ｋ９ペプチドはジメチル−Ｋ９ペプチドへ変換され（図１６Ｃ）、単一メチル基の消失を示唆していた。単一修飾もしくは未修飾ペプチドが検出されなかったという事実は、ＪＨＤＭ３Ａがトリメチル−Ｋ９をジ−メチル状態へ特異的に脱メチル化することを示した。同一アッセイ条件下で、関連性Ｈ３Ｋ９デメチラーゼであるＪＨＤＭ２Ａによって効率的に脱メチル化される（実施例４）ジ−メチルＨ３Ｋ９ペプチドについて脱メチル化は観察されなかった（図１６Ｄ）。このため、ＪＨＤＭ３Ａはインビトロおよびインビボの両方でトリメチルＨ３Ｋ９に対する顕著な酵素特異性を示し、１つのメチル基の除去を生じさせ、ジ−メチルＨ３Ｋ９を残す。
ＪＨＤＭ３Ａがトリメチル−Ｋ９特異的デメチラーゼであることが検証されたので、本発明者らは、インビボにおけるデメチラーゼ活性についてのドメイン要件を決定した。本発明者らは各々が単一予測機能的ドメインの欠失を抱いているＪＨＤＭ３Ａの突然変異体を作製した（図１７Ａ）。これらの突然変異体発現ベクターをＮＩＨ３Ｔ３細胞内へトランスフェクトさせた後にトリメチル−Ｋ９染色を行うと、脱メチル化活性のために必要とされるのはＪｍｊＣドメインだけであることが明らかになった（図１７Ｂ〜１７Ｇ）。これは、ＪＨＤＭ３Ａの他のドメインはおそらくターゲティングおよびタンパク質−タンパク質相互作用に関係していることを示している。
マウス細胞内では、Ｓｕｖ３９Ｈ１は、挟動原体ヘテロクロマチンにおけるＨ３Ｋ９トリメチル化に大いに関与している主要なヒストンメチルトランスフェラーゼである（Ｐｅｔｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １２：１５７７−８９；Ｒｉｃｅ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １２：１５９１−８）。ＨＰ１（ヘテロクロマチンタンパク質１）は、インビトロでトリメチル化Ｈ３Ｋ９へ優先的に結合し（Ｊａｃｏｂｓ ＆ Ｋｈｏｒａｓａｎｉｚａｄｅｈ （２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５：２０８０−３；Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１０：１２０−４；Ｌａｃｈｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１０：１１６−２０）、Ｓｕｖ３９Ｈ１依存性方法で挟動原体ヘテロクロマチンへ局在する（Ｐｅｔｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １２：１５７７−８９；Ｒｉｃｅ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １２：１５９１−８）。ＪＨＤＭ３Ａがトリメチル−Ｈ３Ｋ９を活性に脱メチル化する能力を前提として、本発明者らは、ＪＨＤＭ３ＡレベルがＨ３Ｋ９トリメチル化レベルを調節することを通してＨＰ１局在化パターンに影響を及ぼせるかどうかを決定した。これに一致して、挟動原体ＨＰ１は、ＪＨＤＭ３ＡをＨＰ１と共発現させた場合に核全体に再分布した（図１８Ａおよび１８Ｂを比較されたい）。ＪＨＤＭ３ＡがＨＰ１再分布を誘導する能力は、ＪＨＤＭ３Ａ（Ｈ１９７Ａ）変異体の共発現がＨＰ１再分布を誘導することはできなかったので、そのＨ３Ｋ９デメチラーゼ活性に依存していた（図１８Ｃ）。これらのデータは、ＪＨＤＭ３Ａの上昇したレベルおよびＨ３Ｋ９脱メチル化が挟動原体ヘテロクロマチンへのＨＰ１動員に拮抗するように機能できることを示している。
ヘテロクロマチン形成に関与していることに加えて（Ｐｅｔｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １２：１５７７−８９；Ｒｉｃｅ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １２：１５９１−８）、Ｈ３Ｋ９トリメチル化はまた真正染色質における転写調節にも結び付けられてきた（Ｖａｋｏｃ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １９：３８１−３９１；Ｓｃｈｕｌｔｚ，ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：９１９−９３２；Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １２：４７５−８７）。ＪＨＤＭ３Ａが真正染色質遺伝子おけるトリメチルＨ３Ｋ９を除去することに役割を果たすかどうかを試験するために、本発明者らは、ＪＨＤＭ３Ａレベルを操作するためにｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンを利用し、それが唯一の知られているＪＨＤＭ３Ａ標的遺伝子であるＡＳＣＬ２に及ぼす作用を分析した（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：６４０４−１４）。以前の試験は、ＪＨＤＭ３ＡがＡＳＣＬ２遺伝子を抑制するためにＮＣｏＲコリプレッサー複合体と一過性で相互作用できることを示唆している（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：６４０４−１４）。転写の負の調節因子として機能するＪＨＤＭ３Ａと一致して、ｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンはＡＳＣＬ２のアップレギュレーションを生じさせた（図１９Ｂおよび１９Ｃ）。ＣｈＩＰ分析は、ＪＨＤＭ３Ａが通常は転写開始部位の１．１ｋｂ上流にあるＡＳＣＬ２プロモーター領域へ結合することを証明した（図１９Ａおよび１９Ｄ）。ｓｉＲＮＡ処理後、ＪＨＤＭ３Ａ占有度は減少した（図１９Ｄ、第３パネル）。トリメチルＨ３Ｋ９デメチラーゼとして機能するＪＨＤＭ３Ａの役割と一致して、ＪＨＤＭ３Ａノックダウン後にＡＳＣＬ２遺伝子におけるトリメチルＨ３Ｋ９のレベルにおける有意な増加が観察された（図１９Ｄ、第４パネル）。これとは対照的に、Ｈ３Ｋ２７メチル化における有意な変化は観察されなかった（図１９Ｄ、下方の３つのパネル）。証明されたサイレンシングマークとしてＨ３Ｋ９トリメチル化が役割を果たすことを前提にすると（Ｍａｒｔｉｎ ＆ Ｚｈａｎｇ（２００５）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：８３８−８４９）、転写抑制におけるトリメチル−Ｋ９デメチラーゼの機能は、ＪＨＤＭ３Ａが転写活性化に結び付けられてきたトリメチル−Ｈ３Ｋ９に拮抗するように機能できる可能性があることを示唆している（Ｖａｋｏｃ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １９：３８１−３９１）。これらのデータは、転写抑制と一致してトリメチルＨ３Ｋ９の減少したレベルを維持するためには特異的標的遺伝子における内因性ＪＨＤＭ３Ａの占有が必要とされることを明確に示唆している。
ＪＨＭＤ３Ａの同定は、トリメチル−Ｈ３Ｋ９の動的調節のための分子基盤を提供する。ヘテロクロマチン領域内には有意な量のトリメチルＨ３Ｋ９残基が存在するが（Ｐｅｔｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １２：１５７７−８９；Ｒｉｃｅ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １２：１５９１−８）、この修飾は真正染色質領域内で見いだされるサイレンシング遺伝子においても役割を果たす（Ｓｃｈｕｌｔｚ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：９１９−９３２；Ｓａｒｒａｆ ＆ Ｓｔａｎｃｈｅｖａ （２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １５：５９５−６０５）。ＪＨＤＭ３Ａは、トリメチルＨ３Ｋ９を優先的に除去しその後にジもしくはモノメチル−Ｋ９修飾を除去することはないので、ヒストンメチルトランスフェラーゼ酵素に極めて似ているヒストンデメチラーゼ（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １２：４７５−８７；Ｍａｎｚｕｒ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：１８７−９６；Ｘｉａｏ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９：１４４４−５４）は、別個の修飾状態を調節するように特異的に仕立てることができる。これに関連して、生化学試験は、ヒストンＨ３およびＨ４内のメチル−リジン残基の認識におけるＪＨＤＭ３ＡのＴａｎｄｅｍ Ｔｕｄｏｒドメインが果たす役割を定義している。理論によって結び付けることを望まなくても、ＪＨＤＭ３ＡのＴａｎｄｅｍ ＴｕｄｏｒドメインはＪＨＤＭ３Ａのデメチラーゼ活性のクロマチン含有特異的ヒストン修飾への動員を促進すると考えられる。
［ＲＢＰ２のデメチラーゼ活性を特性解析するための方法］
［構築物および組換えタンパク質］ｐｃＤＮＡ３／ＨＡ−Ｆｌａｇ（登録商標）−ＲＢＰ２は、Ｆｌａｇ（登録商標）−タグをｐｃＤＮＡ３／ＨＡ−ＲＢＰ２のＣｌａｌ部位へ挿入することによって生成した。Ｈ４８３Ａ置換変異は、実施例５に記載したとおりに特定部位突然変異誘発によってｐＣＤＮＡ３／ＨＡ−Ｆｌａｇ（登録商標）−ＲＢＰ２内へ導入した。バキュロウイルス発現タンパク質を生成するため、ＲＢＰ２は、Ｎ末端Ｆｌａｇ（登録商標）−タグを含有するように遺伝子組み換えした修飾ＦａｓｔｂａｃＨＴｂ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））ベクターのＳａｌｌおよびＸｂａｌ部位内へクローニングした。Ｆｌａｇ（登録商標）−ＲＢＰ２を発現するバキュロウイルスの作製および感染したＳＦ９細胞からの組換えタンパク質の精製は、実施例３に記載したとおりに実施した。
［抗体］ＲＢＰ２抗体である１４１６および２４７１については以前に記載されている（Ｂｅｎｅｖｏｌｅｎｓｋａｙａ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １８：６２３−６３５）。抗ＲＢＰ２ポリクローナル抗体２４７０は、ウサギにおいてグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＲＢＰ２（１３１１−１３５８）に対して生じさせた。Ｆｌａｇ（登録商標）モノクローナルＭ２抗体およびα−チューブリン抗体（クローンＢ−５−１−２）は、Ｓｉｇｍａ（登録商標）のものを用いた。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３抗体、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１抗体、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３抗体、およびＨ３抗体は、Ａｂｃａｍ（登録商標）のものを用いた。Ｈ３Ｋ４ｍｅ２抗体、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２抗体、およびＨ４Ｒ３ｍｅ２抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のものを用いた。一部の実験では、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２抗体もまた使用した（Ｆｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：１０５２−１０５８）。
［ＨｅＬａ細胞由来のＲＢＰ２複合体の精製］ＨｅＬａ Ｓ３核抽出物は、記載されたように調製した（Ｄｉｇｎａｍ，ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：１４７５−１４８９）。ＲＢＰ２を含有するタンパク質画分は、ＲＢＰ２抗体を用いるウェスタンブロット分析によって同定した。核抽出物は、１００ｍＭのＫＣｌを含有するバッファーＤ（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＡＥＢＳＦおよび１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）と同等の伝導性にさせ、２０ｍＬのＨｉＰｒｅｐ（登録商標）１６／１０ ＳＰ ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）へロードし、結合タンパク質はバッファーＤ中で１００ｍＭ〜５００ｍＭのＫＣｌへの１０−ｃｖ線形勾配を用いて溶出させた。３５０ｍＭ〜４１０ｍＭのＫＣｌ（複合体１）および２８０ｍＭ〜３１０ｍＭのＫＣｌ（複合体２）へ溶出させたＲＢＰ２を含有する画分を個別にプールし、３００ｍＭのＮａＣｌを含有するバッファーＨ（２０ｍＭのＮａ３ＰＯ４（ｐＨ６．８）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、および１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）と同等の伝導性にし、１ｍＬのＨｉＴｒａｐ（登録商標）ヘパリンＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）へロードし、結合タンパク質はバッファーＨ中で３００ｍＭ〜１．６ＭのＮａＣｌへの１２−ｃｖ線形勾配を用いて溶出させた。ＲＢＰ２複合体１を含有する画分は５４０ｍＭ〜１ＭのＮａＣｌへ溶出させ、ＲＢＰ２複合体２を含有する画分は５４０ｍＭ〜８２０ｍＭのＮａＣｌへ溶出させた。両方の画分は、１００ｍＭのＮａＣｌを含有するバッファーＣ（４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、および１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）と同等の伝導性にさせ、０．６ｍＬのＭｏｎｏＱ（登録商標）ＨＲ５／５（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）へロードし、結合タンパク質はバッファーＣ中で１００ｍＭ〜５００ｍＭのＫＣｌへの１０−ｃｖ線形勾配を用いて溶出させた。ＲＢＰ２複合体１を含有する画分は３５０ｍＭ〜４３０ＭのＮａＣｌへ溶出させ、複合体２を含有する画分は３６０ｍＭ〜４０００ｍＭのＮａＣｌへ溶出させた。
［ウェスタンブロット分析］細胞は、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）が補給された溶解バッファーＥ（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）、４００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０）中に溶解させた。ヒストンを分析するために、細胞は完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）が補給されたＳＤＳ溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ）中に溶解させ、ゲルにロードする前に超音波処理にかけた。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって決定されたように、１レーンに付き約３０μｇの細胞抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって溶解させ、ニトロセルロース膜へ移した。４％脱脂乳を加えたトリス緩衝食塩液中でブロッキングした後、膜を示唆した抗体により試験し、４％脱脂乳を加えたトリス緩衝食塩液中に希釈した。結合した抗体は、製造業者の取扱説明書にしたがって、適切なホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧもしくはヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ社、イリノイ州ロックランド）およびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ社）またはＩｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ化学発光基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））を用いて検出した。
［ヒストンデメチラーゼアッセイ］ホルムアルデヒドの遊離を分析するヒストンデメチラーゼアッセイは、実施例１に記載したとおりに同数の標識ヒストン基質および分画した細胞抽出物を用いて実施した。修飾ヒストンペプチド基質を用いるヒストンデメチラーゼアッセイは、ヒストンＨ３のアミノ酸１〜１８に対応するペプチド（Ｕｐｓｔａｔｅ １２〜５６３（ｍｅ１）、Ｕｐｓｔａｔｅ １２〜４６０（ｍｅ２）、およびＵｐｓｔａｔｅ １２〜５６４（ｍｅ３））を用いて実施した。
［免疫蛍光法］間接的免疫蛍光法は、１０％ ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で増殖させたＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用して実施した。細胞を増殖させ、透過化し、染色し、上述したように分析した。
［網膜芽細胞腫結合タンパク質ＲＢＰ２はＨ３Ｋ４デメチラーゼである］
哺乳動物ＪｍｊＣドメイン含有タンパク質のＪＡＲＩＤ１サブファミリーの１メンバーである網膜芽細胞腫結合タンパク質２（ＲＢＰ２）は、Ｈ３Ｋ９／３６メチル化の除去を標的としてトリメチル修飾状態を除去できる、ＪＨＤＭ３デメチラーゼのＪｍｊＣドメイン（図２０Ａ）と広汎な類似性を共有するＪｍｊＣドメインを含有することが観察された。ＲＢＰ２ ＪｍｊＣドメインの予測補因子結合部位内の残基の保存およびＲＢＰ２が転写調節因子として果たす明白な役割は、ＲＢＰ２がヒストンデメチラーゼ活性を有すること、そして以前に特性解析されたＪｍｊＣファミリーメンバーによって認識されなかったヒストンメチル化マークに向けての活性を示す可能性があることを示唆した。
そこで、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、およびＭｏｎｏＱ（登録商標）クロマトグラフィーカラム上での連続的分画によってＨｅＬａ核抽出物から内因性ＲＢＰ２を濃縮した（データは示していない）。ＲＢＰ２含有画分は、ＲＢＰ２特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析による各クロマトグラフィーステップによって同定された。ＲＢＰ２は、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）クロマトグラフィー後に２つの別個の画分内で検出された（データは示していない）。どちらの画分も、Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）およびＭｏｎｏＱ（登録商標）カラムを用いて並行してさらに精製した（データは示していない）。ＲＢＰ２含有タンパク質複合体がヒストンデメチラーゼ活性を有するかどうかを決定するために、ＭｏｎｏＱ（登録商標）カラムから部分的に精製したＲＢＰ２画分を様々に標識したヒストン基質と一緒にインキュベートし、ヒストンデメチラーゼ活性を標識ホルムアルデヒドの遊離によって監視した（データは示していない）。ホルムアルデヒドの遊離は、ＲＢＰ２含有画分をＨ３Ｋ４標識基質と一緒にインキュベートした場合にのみ観察され、これはＲＢＰ２含有複合体がメチル化Ｈ３Ｋ４を特異的に脱メチル化することを示唆している。
リジン特異的デメチラーゼ１（ＬＳＤ１）はＨ３Ｋ４デメチラーゼであると特徴付けられているが、リジンアミン基上におけるプロトン化窒素に対する触媒的要件はその酵素活性をＨ３Ｋ４ｍｅ１／ｍｅ２修飾基質に限定している（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３７：４３２−４３５；Ｍｅｔｚｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３７：４３６−４３９；Ｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｅｌｌ １１９：９４１−９５３；Ｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １９：８５７−８６４）。ＬＳＤ１がＨ３Ｋ４ｍｅ３を逆転できないことは、この修飾状態が酵素的脱メチル化に対して不応性であることを示唆した。ＬＳＤ１とは対照的に、ＪｍｊＣドメイン含有ヒストンデメチラーゼは直接的ヒドロキシル化反応を利用してヒストンメチル化を除去するが、これはＲＢＰ２がＨ３Ｋ４ｍｅ３の除去を触媒できる可能性を示唆している。
ＲＢＰ２がＨ３Ｋ４デメチラーゼであることを検証するため、そしてＲＢＰ２の修飾状態特異性を試験するために、Ｆｌａｇ（登録商標）−タグ付きＲＢＰ２は、バキュロウイルス発現系を使用してＳＦ９細胞内で発現させ、均質性にするために親和性精製した。精製Ｆｌａｇ（登録商標）−ＲＢＰ２はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）ｂｌｕｅ染色後に単一バンドとして現れた（図２０Ｂ）。次に組換えＲＢＰ２は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、ｍｅ２およびｍｅ１修飾状態に対応する修飾されたヒストンＨ３ペプチド基質と一緒にインキュベートした（図２０Ｃ〜２０Ｅ）。ＲＢＰ２はＨ３Ｋ４ｍｅ３およびｍｅ２に対する強固なＨ３Ｋ４デメチラーゼ活性を示し（図２０Ｃおよび２０Ｄ）、修飾された基質の８０〜９０％の脱メチル化を生じさせたが（図２０Ｆおよび２０Ｇ）、ｍｅ１修飾状態の除去を触媒することはできなかった（図２０Ｅ）。ＲＢＰ２はインビトロにおけるＨ３Ｋ４ｍｅ１の脱メチル化を開始することはできなかったが（図２０Ｅ）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびｍｅ２修飾を進行性で未修飾状態へ脱メチル化することはできた（図２０Ｃおよび２０Ｄ）。ＲＢＰ２の酵素的特性は、全３種の修飾状態の漸進性除去も触媒するがインビトロにおけるｍｅ１修飾状態上での脱メチル化を開始することはできないＪＨＤＭ３Ａに類似している。これらをまとめると、これらの観察は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾状態が酵素的に可逆性であること、そしてヒストン脱メチル化がＲＢＰ２による転写調節に寄与する可能性があることを示唆している。
ＲＢＰ２はインビボでＨ３Ｋ４を脱メチル化する。ＲＢＰ２がインビボで活性Ｈ３Ｋ４デメチラーゼとして機能することを証明するために、Ｆｌａｇ（登録商標）−タグ付きＲＢＰ２発現プラスミドをＮＩＨ３Ｔ３細胞内へトランスフェクトし、それがＨ３Ｋ４メチル化に及ぼす作用を、Ｈ３Ｋ４メチル化特異的抗体を用いる間接的免疫蛍光法によって分析した（図２１）。ＲＢＰ２を過剰発現する細胞は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２およびＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾の一様な減少を示した（図２１Ａ〜２１Ｃ、上方パネル）。Ｈ３Ｋ４メチル化の除去は、予測されたＪｍｊＣドメイン鉄結合部位（Ｈ４８３Ａ）における点突然変異がＨ３Ｋ４脱メチル化を無効にしたので、ＲＢＰ２のデメチラーゼ活性に依存していた（図２１Ａ〜２１Ｃ、下方パネル）。予想外にもそれがインビトロでＨ３Ｋ４ｍｅ１を脱メチル化できないことを前提にすると、ＲＢＰ２はさらにインビボにおけるＨ３Ｋ４ｍｅ１の除去を効率的に触媒した。この観察は、ＲＢＰ２がＨ３Ｋ４ｍｅ１特異的脱メチル化を触媒する能力はインビボでは追加の因子によって調節される可能性があることを示唆している。まとめると、これらのデータは、ＲＢＰ２がインビボではすべてのＨ３Ｋ４メチル化状態を脱メチル化できることを示唆し、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３が容易に可逆性のヒストン修飾であることを証明している。
上記は、本発明を例示したものであり、本発明を限定するものと見なされてはならない。本発明は、本明細書に含まれる特許請求の範囲の同等物とともに、添付の特許請求の範囲によって規定される。
ヒストンデメチラーゼアッセイの確立およびＨｅＬａ細胞中のデメチラーゼ活性の同定を示している。図１Ａは、ＨｅＬａ核抽出物および核ペレット画分に由来するＰ１１カラム画分の相対ヒストンデメチラーゼ活性を示している。パネル上方の数字は、溶出バッファー中のＫＣｌのモル濃度を表している。図１Ｂは、デメチラーゼ活性がＦｅ（ＩＩ）、α−ＫＧおよび０．３Ｍ Ｐ１１核ペレット画分内に存在するタンパク質の存在に依存することを示している。 ヒストンデメチラーゼ活性の精製および同定を示している。図２Ａは、ゲル濾過Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６カラムに由来するタンパク質画分の銀染色タンパク質ゲル（上方パネル）およびヒストンデメチラーゼ活性（下方パネル）を示している。タンパク質マーカーの溶出プロファイルは、パネルの上部に表示した。図２Ｂは、ｍｉｎｉ−ＭｏｎｏＱ（登録商標）カラムに由来するタンパク質画分の銀染色タンパク質ゲル（上方パネル）およびヒストンデメチラーゼ活性（下方パネル）を示している。デメチラーゼ活性と共分画した候補タンパク質は、＊で表示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のタンパク質サイズマーカーの位置は、パネルの左側に表示した。図２Ｃは、タンパク質同定のためのサンプルを含有する銀染色タンパク質ゲルである。上方のタンパク質バンドは、ＦＢＸＬ１１（ＮＰ＿０３６４４０）であると同定された。質量分析法から同定されたペプチドを列挙する。数字は、ＦＢＸＬ１１タンパク質内のアミノ酸数に対応する。「？」は、同定されていないＦＢＸＬ１１関連タンパク質を表している。 ヒストンデメチラーゼＪＨＤＭ１Ａ／ＦＢＸＬ１１の機能的ドメインの特性解析を示している。図３Ａは、それらの相対活性（右側）を含む野生型および変異型タンパク質の略図である。「＋」の数は、相対活性を表している。同定された機能的ドメインは、ＳＭＡＲＴプログラムを用いて囲みの中に示している。図３Ｂは、ＣＯＳ−７細胞中で発現させて、分析前に免疫沈降させた野生型および変異型Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１Ａタンパク質についてのウェスタンブロット（上方パネル）およびデメチラーゼアッセイ（下方パネル）分析を示している。ウェスタンブロットの下方の数字を用いて示唆した各免疫沈降タンパク質の相対量は、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪプログラムを用いて定量し、活性を標準化するために使用した。 ＪＨＤＭ１Ａの部位特異性およびメチル化状態特異性についての特性解析を示している。図４Ａは、Ｓｆ９細胞中で発現した精製Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１タンパク質のＣｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）染色タンパク質ゲルである。図４Ｂは、様々なメチル化ヒストン基質に対するＦｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１のヒストンデメチラーゼ活性を示している。ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）およびそれらのメチル化の部位は、パネルの上方に表示する。図４Ｃは、様々なヒストン基質を用いた脱メチル化反応のウェスタンブロット分析を示している。使用した抗体は、パネルの左側に表示する。図４Ｄは、Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１によるジメチル−Ｋ３６ペプチド（ＳＴＧＧＶ２ｍＫＫＰＨＲＹ−Ｃ；配列番号１）の脱メチル化の質量分析法による分析を示している。この反応液の酵素／基質モル比は、１：４０であった。数字は、基質および生成物ペプチドの質量を表している。 ＪＨＤＭ１Ａがインビボでジメチル−Ｈ３−Ｋ３６を脱メチル化することを示している。２９３Ｔ細胞は、野生型（図５Ａ、５Ｂ、５Ｄおよび５Ｅ）または変異型（図５Ｃ）Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１Ａを用いてトランスフェクトした。細胞は、図に示したように、Ｆｌａｇ（登録商標）抗体および様々なメチル化Ｈ３−Ｋ３６抗体を用いて共染色した。ジメチル−Ｋ４抗体を用いた染色は、コントロールとして機能させるために実施した。中央の図５Ｂ内の矢印は、野生型Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１Ａを発現する細胞を示唆している。 ＪＨＤＭ１媒介性ヒストン脱メチル化がホルムアルデヒドおよびコハク酸塩を生成することを示している。ＪＨＤＭ１反応液サンプル（上方パネル）および陰性コントロール（下方パネル）中のホルムアルデヒド（図６Ａ、［Ｍ＋Ｈ］＋ 理論的＝３１．０１８４）およびコハク酸塩（図６Ｂ、［Ｍ＋Ｈ］＋ 理論的＝１１９．０３４４）各々のＥＳＩ−ＭＳ検出が証明された。図６Ｃは、コハク酸塩の標準溶液（６００ｎＭ）（上方パネル）、ＪＨＤＭ１反応液サンプル（中央パネル）および陰性コントロール（下方パネル）からのｍ／ｚ １１９でのイオンのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析を示している。コハク酸塩フラグメントイオンの提案された構造は、ＭＳ／ＭＳスペクトル上に示されている。 ＪＨＤＭ１ファミリータンパク質のＨ３−Ｋ３６デメチラーゼ活性が進化中に保存されていることを示している。図７Ａは、様々な有機体内のＪＨＤＭ１ファミリータンパク質の図表示である。ヒトおよびマウスにおいて２つの高度に関連するタンパク質が同定されたが、他の有機体の各々においては１つのホモログしか見いだされなかった。このタンパク質ファミリー内に存在する様々な機能的ドメインは、ＳＭＡＲＴプログラムを用いる分析に基づいて示す。図７Ｂは、ＰＡＰＩＡシステムを用いた、ＪＨＤＭ１ファミリーメンバーのＪｍｊＣドメインとＦＩＨ１（Ｑ９ＮＷＴ６）のＪｍｊＣドメインとのアラインメントである。ＪＨＤＭ１Ａ（「１Ａ」）タンパク質についてのＮＣＢＩアクセッション番号は、次のとおりである。ＮＰ＿０３６４４０（ヒト）、ＸＰ＿３５５１２３（マウス）、ＡＡＨ８２６３６（Xenopus））、ＮＰ＿６４９８６４(Drosophila)、ＡＡＮ６５２９１（C. elegans）、ＣＡＡ２１８７２（S. pombe）、ＮＰ＿０１０９７１（S. cerevisiae）。ＪＨＤＭ１Ｂ（「１Ｂ」）タンパク質についてのＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿１１５９７９（ヒト）およびＮＰ＿００１００３９５３（マウス）である。数字は、各タンパク質のアミノ酸数を表している。Ｆｅ（ＩＩ）およびα−ＫＧ結合に関係するＦＩＨ１中のアミノ酸は、各々、「＊」および「＃」によって表示する。Ｅｐｅ１機能のために極めて重要な保存されたチロシンは、「＄」によって表示する。７つの配列中４つの配列の保存には、下線を引く。図７Ｃは、S. cerevisiaeタンパク質のデメチラーゼ活性および部位特異性を示している。図７Ｄは、ｓｃＪＨＤＭ１タンパク質のＪｍｊＣドメインの突然変異分析を示している。デメチラーゼアッセイでは、等量の野生型および変異型ＧＳＴ−ｓｃＪＨＤＭ１を使用した。Ｆｅ（ＩＩ）結合部位（Ｈ３０５Ａ）における突然変異は、Ｈ３−Ｋ３６デメチラーゼ活性を完全に無効にしたが、機能消失Ｅｐｅ１（Ｙ３０７Ａ）突然変異を模倣する突然変異（Ｙ３１５Ａ）は、Ｈ３−Ｋ３６デメチラーゼ活性を有意に減少させた。 Ｇ９ａ−メチル化ヒストン基質を用いたＨｅＬａ細胞中のヒストンデメチラーゼ活性の同定を示している。図８Ａは、Ｇ９ａメチル化ヒストン基質に対するＨｅＬａ核抽出物および核ペレット画分に由来するＰ１１カラム画分からのヒストンデメチラーゼ活性の監視を示している。パネル上方の数字は、溶出バッファー中のＫＣｌのモル濃度を表している。図８Ｂは、０．３Ｍ Ｐ１１デメチラーゼ活性がＦｅ（ＩＩ）およびα−ＫＧの存在に依存することを示している。 ヒストンデメチラーゼ活性の精製および同定を示している。図９Ａは、Ｓｅｐｈａｃｙｌ（登録商標）Ｓ３００ゲル濾過カラムに由来するタンパク質画分のヒストンデメチラーゼ活性を示している。タンパク質マーカーの溶出プロファイルは、パネルの上部に表示する。図９Ｂは、ＭｏｎｏＳ（登録商標）カラムに由来するタンパク質画分の銀染色タンパク質ゲル（上方パネル）およびヒストンデメチラーゼ活性（下方パネル）である。デメチラーゼ活性と共分画した候補タンパク質は＊で表示する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のタンパク質サイズマーカーの位置は、パネルの左側に表示する。図９Ｃは、ヒストンデメチラーゼ陽性画分２０のタンパク質組成物を隣接ヒストンデメチラーゼ陰性画分１７と比較している銀染色タンパク質ゲルである。候補タンパク質は、質量分析法によって同定された。５３％のＪＭＪＤ１Ａタンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０６０９０３）をカバーする計６３個のペプチドが同定された。質量分析法から同定された代表的ペプチドを列挙する。数字は、ＪＭＪＤ１Ａタンパク質のアミノ酸数に対応する。図９Ｄは、ＪＭＪＤ１Ａ抗体を用いて免疫沈降させたサンプルの銀染色（上方パネル）、ウェスタンブロット（中央パネル）、およびヒストンデメチラーゼアッセイ（下方パネル）分析である。「Ｉｎ」、「Ｓ」および「Ｂ」は、投入、上清、および結合を各々表している。投入サンプルは、ＭｏｎｏＳ（登録商標）カラムの２１〜２９画分をプールすることによって引き出した。 ＪＨＤＭ２ＡのＪｍｊＣドメインおよびジンクフィンガードメインの両方がヒストンデメチラーゼ活性のために必要であることを示している。図１０Ａは、それらの活性（右側）を含む野生型および変異型ＪＨＤＭ２Ａタンパク質の略図である。「＋」は活性を表し、そして「−」は不活性を表す。図１０Ｂは、ＣＯＳ−７細胞中で発現させて分析前に免疫沈降させた、野生型および変異型Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ１Ａタンパク質のウェスタンブロット（上方パネル）およびデメチラーゼアッセイ（下方パネル）分析を示している。図１０Ｃは、様々な有機体由来のＪＨＤＭ２タンパク質ファミリーの図表示である。ヒトおよびマウスにおいて３つの関連するタンパク質が同定されたが、ショウジョウバエおよびツメガエルにおいては１つのホモログしか見いだされなかった。このタンパク質ファミリー内に存在するＪｍｊＣドメインおよびジンクフィンガードメインは、ＳＭＡＲＴプログラムを用いる分析に基づいて示す。図１０Ｄは、ＰＡＰＩＡシステムを用いた、ＪＨＤＭ２ファミリーメンバーのＪｍｊＣドメインとＦＩＨ１のＪｍｊＣドメインとのアラインメントである。アラインメント内のタンパク質各々についてのアクセッション番号を列挙する。数字は、各タンパク質のアミノ酸数を表している。Ｆｅ（ＩＩ）およびα−ＫＧ結合に関係するＦＩＨ１中のアミノ酸は、各々、「＊」および「＃」によって表示する。保存された配列には下線を引く。 ＪＨＤＭ２Ａの部位特異性およびメチル化状態特異性の特性解析を示している。図１１Ａは、ＢＳＡと比較した、Ｓｆ９細胞中で発現した精製Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ２Ａタンパク質のＣｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）染色タンパク質ゲルである。レーン３内の下方バンドは、ウェスタンブロット分析によって検証された分解生成物である。図１１Ｂは、Ｓｆ９細胞中で作製された組換えＪＨＤＭ２ＡおよびＨｅＬａ細胞から精製された天然型ＪＨＤＭ２Ａの匹敵するヒストンデメチラーゼ活性を示している。定量の天然ＪＨＤＭ２Ａを、ヒストンデメチラーゼ活性（下方パネル）について、ＪＨＤＭ２Ａ抗体（上方パネル）を用いたウェスタンブロット分析によって定量された様々な量の組換えＪＨＤＭ２Ａと比較した。図１１Ｃは、同数の様々なメチル化ヒストン基質投入に対するＦｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ２Ａのヒストンデメチラーゼ活性を示している。μｇ単位での等量の基質を使用した場合に類似の結果が入手された。ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）およびそれらのメチル化の部位は、パネルの上方に表示する。図１１Ｄは、Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ２ＡがＧ９ａ−メチル化Ｈ３−Ｋ９は脱メチル化するが、Ｈ３−Ｋ２７は脱メチル化しないことを示している。ＨｅＬａ細胞から精製した天然ヒストン、およびＥ．ｃｏｌｉから精製した野生型もしくは変異型（Ｋ９Ｒ、Ｋ２７Ｒ）組換えヒストンＨ３をＧ９ａによってメチル化し、Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ２Ａの存在下（＋）または非存在下（−）においてデメチラーゼアッセイを受けさせた。Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ２Ａによるジメチル−Ｋ９（図１１Ｅ）もしくはトリメチル−Ｋ９（図１１Ｆ）ペプチド（アセチル−ＡＲＴＫＱＴＡＲｍｅＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫ−ビオチン；配列番号：７７）の脱メチル化の質量分析法による分析を実施した。反応の酵素／基質モル比は、１：４０であった。数字は、基質および生成物ペプチドの質量を表している。 ＪＨＤＭ２Ａがインビボでモノ−、およびジメチル−Ｈ３−Ｋ９を脱メチル化することを示している。ＣＯＳ７細胞は、野生型（図１２Ａ、１２Ｃ、１２Ｄおよび１２Ｅ）または変異型（図１２Ｂ）Ｆｌａｇ（登録商標）−ＪＨＤＭ２Ａを用いてトランスフェクトした。細胞は、図に示したように使用した、Ｆｌａｇ（登録商標）抗体および様々なメチル−Ｈ３−Ｋ９またはジメチル−Ｈ３−Ｋ２７抗体を用いて共染色した。矢印は、トランスフェクトされた細胞を示唆している。 Ｆ９細胞中のＪｈｄｍ２ａのノックダウンは、増加したプロモーターＨ３−Ｋ９ジメチル化が付随する転写の減少を生じさせることを示している。ＮＩＨ３Ｔ３、Ｐ１９、およびＦ９細胞中のＪｈｄｍ２ａの相対発現レベルは、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析した（図１３Ａ）。Ｊｈｄｍ２ａノックダウンＦ９細胞系の特性解析もまた実施した（図１３Ｂ）。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（左のパネル）およびウェスタンブロット分析（右のパネル）は、Ｊｈｄｍ２ａ上でＲＮＡレベルでの約８０％のノックダウンおよびタンパク質レベルでの７０％のノックダウンが達成されたことを証明した。図１３Ｃは、Ｊｈｄｍ２ａ上ノックダウンへ応答したいくつかの多分化能および分化マーカー遺伝子のＲＮＡレベルでの変化の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。これらの変化は、ノックダウン細胞内の発現レベル対野生型コントロールの発現レベルの比率として表示する。図１３Ｄは、コントロール（白色バー）およびＪｈｄｍ２ａノックダウン（黒色バー）細胞内におけるＣｈＩＰｅｄ ＤＮＡのＱ−ＰＣＲの結果を示している。分析した遺伝子プロモーター、および使用した抗体を表示する。すべてのＱ−ＰＣＲは３回繰り返されている。平均値と標準偏差を表示する。 ＪＨＤＭ２ＡがＡＲによる転写活性化に関係することを示している。ＪＨＤＭ２Ａは、インビトロでホルモン依存方法でアンドロゲン受容体（ＡＲ）と相互作用することが見いだされた（図１４Ａ）。組換えＪＭＪＤ１Ａは、Ｒ１８８１（１００ｎＭ）の非存在下もしくは存在下でインビトロ翻訳された３５Ｓ−標識化ＡＲと混合した。抗ＪＨＤＭ２Ａ抗体を用いた免疫沈降法後に、ＡＲは、オートラジオグラフィーによって検出した。図１４Ｂは、インビボにおけるＰＳＡおよびＮＫＸ３．１エンハンサーへのＪＨＤＭ２Ａのホルモン依存性動員を示している。ＬＮＣａＰ細胞は、３日間にわたり活性炭処理血清培地中で培養し、次にＲ１８８１（５０ｎＭ）を用いずに、または用いて１時間にわたり処理し、その後のＣｈＩＰ分析のために処理した。図１４Ｃは、ｓｉＲＮＡによるＬＮＣａＰ細胞中のＪＨＤＭ２ＡおよびＬＳＤ１のノックダウンを示している。ＬＮＣａＰ細胞は、示唆したようにスクランブル（ｓｉＣＯＮ）、ｓｉＪＨＤＭ２ＡもしくはｓｉＬＳＤ１を用いてトランスフェクトした。チューブリンは、ローディングコントロールとして機能した。図１４Ｄは、３つのＡＲ標的遺伝子のＲ１８８１依存性活性化にＪＨＤＭ２ＡもしくはＬＳＤ１をノックダウンさせることが及ぼす作用を示している定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。細胞は、Ｒ１８８１処理の８時間後にＲＮＡ単離のために採取した以外は図１４Ｂと同様に処理した。図１４Ｅは、ＪＨＤＭ２Ａのノックダウンがホルモン誘導性Ｈ３Ｋ９脱メチル化を損傷させることを示している。ＬＮＣａＰ細胞は、ｓｉＪＨＤＭ２ＡもしくはｓｉＣＯＮを用いて３日間にわたり処理し、次に５０ｎＭ Ｒ１８８１を用いて１時間にわたり処理し、その後に示唆した抗体を用いてＣｈＩＰアッセイのために処理した。 ＪＭＪＤ２ＡがヒストンＨ３Ｋ９デメチラーゼであることを示している。図１５Ａに図示したように、ＪＭＪＤ２Ａは、ＪｍｊＣドメインおよびクロマチン関連タンパク質中で見いだされた他のいくつかのドメインを含有している。図１５Ｂは、ＦＩＨ、ＪＨＤＭ１Ａ、ＪＨＤＭ１Ｂ、ＪＨＤＭ２Ａ、およびＪＭＪＤ２ＡのＪｍｊＣドメインにおける類似性を示しているアラインメントである。Ｆｅ（ＩＩ）および（α−ＫＧ）結合ドメインは、各々「＊」および「＃」によって表示する。下線は、保存領域を示唆している。図１５Ｃは、バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞から精製した組換えＪＭＪＤ２Ａを含有するＣｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）染色ゲルである。図１５Ｄでは、棒グラフの下方に示唆した様々なヒストンメチルトランスフェラーゼを用いてヒストンを標識し、組換えＪＭＪＤ２Ａと一緒にインキュベートした。標識化メチル基の遊離は、酵素の存在下（＋）もしくは非存在下（−）で、ヒストンデメチラーゼ活性についてアッセイするために測定した。ＪＭＪＤ２Ａは、ヒストンメチルトランスフェラーゼＤｉｍ５によって標識したＨ３Ｋ９を特異的に脱メチル化する。ＪＭＪＤ２Ａが酸化機序を用いて脱メチル化を実施することを証明するために、補因子であるＦｅ（ＩＩ）およびα−ＫＧは、図１５Ｅに示した棒グラフの下方に（−）として示唆したように反応から削除した。ＪＭＪＤ２Ａの全酵素活性は、補因子および酵素の完全相補を必要とする。 ＪＨＤＭ３Ａがトリメチル特異的ヒストンデメチラーゼであることを示している。図１６Ａでは、ＪＨＤＭ３Ａは、Ｆｌａｇ（登録商標）融合タンパク質としてマウス３Ｔ３細胞中で発現させた。Ｆｌａｇ（登録商標）（左のパネル）またはトリメチル化Ｈ３Ｋ９（中央パネル）に対する抗体を用いた間接的免疫蛍光法を使用して、インビボにおけるＪＨＭＤ３Ａの基質特異性を分析した。ＤＡＰＩ染色（右）は、各領域内での核の局在を示唆している。ＪＨＤＭ３Ａを用いてトランスフェクトした細胞は、トリメチルＨ３Ｋ９染色の顕著な消失を示し（上方パネル）、そしてこの活性は、予測Ｆｅ（ＩＩ）結合部位内での突然変異がＪＨＭＤ３Ａ内に導入された場合は染色が影響を受けないので、無傷ＪｍｊＣドメインに依存していた（下方パネル Ｈ１９７Ａ）。図１６Ｂは、ジ−メチルＨ３Ｋ９、モノ−メチルＨ３Ｋ９、もしくはトリメチルＨ３Ｋ２７に対する抗体がＪＨＤＭ３Ａを用いてトランスフェクトされた細胞中でのこれらの修飾のレベルにおける変化を全く示さないので、ＪＨＤＭ３ＡによるトリメチルＨ３Ｋ９の脱メチル化が特異的であったことを示している。トリメチルＫ９（図１６Ｃ）もしくはジメチルＫ９（図１６Ｄ）ペプチドは、質量分析法による分析の前にＪＨＤＭ３Ａの存在下（上方）または非存在下（下方）でインキュベートした。ＪＨＤＭ３ＡとトリメチルＨ３Ｋ９ペプチドとのインキュベーションは１つのメチル基（１Ｄａ）の除去を生じさせてジメチル−Ｈ３Ｋ９ペプチドを産生したが（図１６Ｃ）、他方ＪＨＤＭ３ＡとジメチルＨ３Ｋ９とのインキュベーションはペプチド修飾状態における変化を生じさせなかった（図１６Ｃ）。 インビボにおけるトリメチルＨ３Ｋ９脱メチル化にはＪｍｊＣドメインだけが必要とされることを示している。図１７Ａは、トランスフェクションアッセイにおいて使用した欠失構築物を示している図示である。突然変異体の細胞レベル以下の局在およびデメチラーゼ活性が示されている。図１７Ｂ〜１７Ｇは、免疫蛍光法によって決定されるようなトリメチルＨ３Ｋ９レベルに欠失変異体が及ぼす作用を示している。トランスフェクトされた細胞中におけるトリメチルＨ３Ｋ９染色を分析することによって（図１７Ｂ〜１７Ｇ）、提案された鉄結合ドメイン（Ｈ１９７Ａ）の突然変異だけがトリメチルＨ３Ｋ９染色の消失を無効にすることが観察された。ＴＵＤＯＲドメインの欠失は、核および細胞質の両方においてＪＨＤＭ３Ａの可変性局在を誘発したが、それでもまだトリメチルＨ３Ｋ９の脱メチル化を生じさせた（図１７Ｆ、１７Ｇ）。 ＪＨＤＭ３Ａの発現がＨＰ１動員に拮抗することを示している。図１８Ａに示したように、ＧＦＰ−ＨＰ１はマウス細胞中で挟動原体ヘテロクロマチンを含有するトリメチルＨ３Ｋ９に対応する断続性蛍光を表示している。図１８Ｂは、ＪＨＤＭ３Ａの発現はトリメチルＨ３Ｋ９脱メチル化を誘発し、結果として核内のＧＦＰ−ＨＰ１の広汎性再分布を生じさせることを証明している。図１８Ｃは、ＧＦＰ−ＨＰ１局在にＪＨＤＭ３Ａが及ぼす作用を予測されたＦｅ（ＩＩ）結合ドメイン内の突然変異が無効にしたので、挟動原体ヘテロクロマチンへのＨＰ１動員に拮抗するためには無傷ＪｍｊＣドメインが必須であることを示している。 ＪＨＤＭ３Ａが真正染色体標的遺伝子でトリメチルＨ３Ｋ９を脱メチル化することを示している。図１９Ａは、ヒトＡＳＣＬ２遺伝子構造の図である。ＪＡＲは、ＪＨＤＭ３Ａ関連性領域を表している。図１９Ｂは、ＪＨＤＭ３Ａタンパク質レベルがＪＨＤＭ３Ａ ｓｉＲＮＡを用いた細胞の処理によって効率的に減少させられたことを示している。図１９Ｃは、ＪＨＤＭ３ＡのｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンがＡＳＣＬ２遺伝子の発現増加を生じさせることを示している。ＡＳＣＬ２遺伝子でのヒストン修飾を分析するために、未処理（−）およびＪＨＤＭ３Ａ ｓｉＲＮＡ処理（＋）細胞をＣｈＩＰアッセイにおいて使用した（図１９Ｄ）。ＪＨＤＭ３Ａの減少したレベルは、ＡＳＣＬ２遺伝子でのＪＨＤＭ３Ａの占有減少およびトリメチルＨ３Ｋ９（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）のレベル上昇を誘発した。ＡＳＣＬ２遺伝子での他のヒストン修飾は、ＪＨＤＭ３Ａの特異性を検証するｓｉＲＮＡ処理後に未変化のままであった。 ＲＢＰ２は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３を除去する能力を備えるＨ３Ｋ４デメチラーゼであることを示している。図２０Ａは、ＪＡＲＩＤ１サブファミリーのＪｍｊＣドメインが、ＪＨＤＭ３デメチラーゼ酵素のＪｍｊＣドメインに高度に類似することを示している。予測されたＦｅ（ＩＩ）（「＊」）およびα−ＫＧ結合（「＃」）残基は、ＲＢＰ２および他のＪＡＲＩＤ１メンバー内に保存されている。組換えＦｌａｇ（登録商標）−ＲＢＰ２を昆虫細胞中で発現させ、Ｆｌａｇ（登録商標）クロマトグラフィーによって親和性精製し、そしてＳＤＳ−ｐａｇｅによって分析した（図２０Ｂ）。図２０Ｃ〜２０Ｅは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（図２０Ｃ）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２（図２０Ｄ）、およびＨ３Ｋ４ｍｅ１（図２０Ｅ）ペプチドに対するＲＢＰ２活性の質量分析法による分析を示している。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（図２０Ｆ）およびＨ３Ｋ４ｍｅ２（図２０Ｇ）基質上でＲＢＰ２について観察された脱メチル化レベルの定量。 ＲＢＰ２がインビボでＨ３Ｋ４を脱メチル化することを示している。提案された鉄結合部位（Ｈ４８３Ａ）において突然変異を含有するＦｌａｇ（登録商標）−ＲＢＰ２もしくはＦｌａｇ（登録商標）−ＲＢＰ２をＮＩＨ３Ｔ３細胞中で発現させた（図２１Ａ〜２１Ｃ）。Ｈ３Ｋ４メチル化のレベルは、間接的免疫蛍光法によってＨ３Ｋ４ｍｅ１（図２１Ａ）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２（図２１Ｂ）、およびＨ３Ｋ４ｍｅ３（図２１Ｃ）に対する修飾特異的抗体を用いて分析した（中央パネル）。野生型および変異型ＲＢＰ２を示す細胞はＦｌａｇ（登録商標）免疫蛍光法によって同定し（左のパネル）、核はＤＡＰＩ染色（右のパネル）によって同定した。中央および右のパネルにおける矢印は、トランスフェクトされた細胞を示唆している。ＲＢＰ２は、インビボにおける全３つのＨ３Ｋ４メチル化状態を脱メチル化する。

Claims (16)

  1. ＪｍｊＣドメインを含むデメチラーゼのデメチラーゼ活性を調節する化合物を同定する方法であって、ここで、前記デメチラーゼのＪｍｊＣドメインは、Ｆｅ（ＩＩ）及びα−ケトグルタレートに配位するアミノ酸残基を含み、
    （ａ）試験化合物と、Ｆｅ（ＩＩ）と、α−ケトグルタレートの存在下で、メチル化されたタンパク質基質にデメチラーゼを接触させるステップと、
    （ｂ）脱メチル化のために十分な条件下で、前記タンパク質基質の脱メチル化のレベルを検出するステップであって、前記試験化合物の非存在下における脱メチル化のレベルと比較した前記タンパク質基質の脱メチル化における変化は、前記試験化合物が前記デメチラーゼのデメチラーゼ活性のモジュレーターであることを示唆するステップと
    を含み、前記デメチラーゼは、
    （ｉ）ＪＨＤＭ１タンパク質、
    （ｉｉ）ＪＨＤＭ２タンパク質、又は
    （ｉｉｉ）ＪＨＤＭ３タンパク質
    である、方法。
  2. 前記ＪＨＤＭ１タンパク質が、ＪＨＤＭ１Ａ又はＪＨＤＭ１Ｂであり、前記ＪＨＤＭ２タンパク質が、ＪＨＤＭ２Ａタンパク質、ＪＨＤＭ２Ｂタンパク質又はＪＨＤＭ２Ｃタンパク質であり、及び／又は前記ＪＨＤＭ３タンパク質が、ＪＨＤＭ３Ａタンパク質である、請求項１に記載の方法。
  3. 細胞系の方法である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 無細胞系の方法である、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 試験化合物の非存在下における脱メチル化のレベルと比較した脱メチル化活性の減少は、前記試験化合物がデメチラーゼのデメチラーゼ活性の阻害剤であることを示唆し、試験化合物の非存在下における脱メチル化のレベルと比較した脱メチル化活性の増強は、前記試験化合物がデメチラーゼのデメチラーゼ活性の活性剤であることを示唆する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. メチル化されたタンパク質基質が、メチル化されたヒストン基質である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. メチル化されたヒストン基質が、メチル化されたヒストンＨ３基質である請求項６に記載の方法。
  8. 前記メチル化されたヒストンＨ３基質が、ヒストンＨ３のリジン３６（Ｈ３−Ｋ３６）においてメチル化されているか、ヒストンＨ３のリジン９（Ｈ３−Ｋ９）においてメチル化されているか、ヒストンＨ３のリジン４（Ｈ３−Ｋ４）においてメチル化されている、請求項７に記載の方法。
  9. 前記メチル化されたヒストンＨ３基質が、モノメチル化及び／又はジメチル化されたＨ３−Ｋ３６若しくはＨ３−Ｋ９である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記メチル化されたヒストンＨ３基質が、モノメチル化、ジメチル化及び／又はトリメチル化されたＨ３−Ｋ４である、請求項８に記載の方法。
  11. 前記脱メチル化が、ヒストンＨ３のリジン３６（Ｈ３−Ｋ３６）か、ヒストンＨ３のリジン９（Ｈ３−Ｋ９）か、ヒストンＨ３のリジン４（Ｈ３−Ｋ４）において検出される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記デメチラーゼがＪＨＤＭ１タンパク質であり、モノメチル化及び／又はジメチル化されたＨ３−Ｋ３６の脱メチル化が検出される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記デメチラーゼがＪＨＤＭ２タンパク質であり、モノメチル化及び／又はジメチル化されたＨ３−Ｋ９の脱メチル化が検出される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記デメチラーゼがＪＨＤＭ３タンパク質であり、ジメチル化又はトリメチル化されたＨ３−Ｋ９の脱メチル化が検出される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  15. がんを治療するための候補化合物を同定する方法であって、
    （ａ）試験化合物と、Ｆｅ（ＩＩ）と、α−ケトグルタレートの存在下で、メチル化ヒストン基質にＪｍｊＣドメインを含むヒストンデメチラーゼを接触させるステップと、ここで、前記ＪｍｊＣドメインを含むヒストンデメチラーゼは、
    （ｉ）ＪＨＤＭ１タンパク質、
    （ｉｉ）ＪＨＤＭ２タンパク質、又は
    （ｉｉｉ）ＪＨＤＭ３タンパク質
    であり、
    （ｂ）脱メチル化のために十分な条件下で、前記ヒストン基質の脱メチル化のレベルを検出するステップと、ここで、前記試験化合物の非存在下における脱メチル化のレベルと比較した前記ヒストン基質の脱メチル化における変化は、前記試験化合物ががんを治療するための候補化合物であることを示唆する、
    を含む方法。
  16. 前記ＪＨＤＭ１タンパク質が、ＪＨＤＭ１Ａ又はＪＨＤＭ１Ｂであり、前記ＪＨＤＭ２タンパク質が、ＪＨＤＭ２Ａタンパク質、ＪＨＤＭ２Ｂタンパク質又はＪＨＤＭ２Ｃタンパク質であり、及び／又は前記ＪＨＤＭ３タンパク質が、ＪＨＤＭ３Ａタンパク質である、請求項１５に記載の方法。
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