CN105102431B - 经取代的苯化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经取代的苯化合物。本发明还涉及含有这些化合物的医药组合物以及通过向有需要的受试者投与这些化合物和医药组合物来治疗癌症的方法。本发明还涉及所述化合物用于研究或其它非治疗性目的的用途。

Description

经取代的苯化合物
相关申请
本申请要求以下各者的优先权和权益：2012年10月15日提交的美国临时申请第61/714,140号、2012年10月15日提交的美国临时申请第61/714,145号、2013年3月13日提交的美国临时申请第61/780,703号以及2013年3月14日提交的美国临时申请第61/786,277号。这些临时申请中的每一个的完整内容以其全文引用的方式并入本文中。
背景技术
存在对作为EZH2活性抑制剂的可以用于治疗EZH2介导的病症(例如，癌症)的新药剂的持续需求。
发明内容
一方面，本发明提供一种经取代的苯化合物，其选自
以及其医药学上可接受的盐。
举例来说，所述化合物是或其医药学上可接受的盐。
举例来说，所述化合物是
举例来说，所述化合物是或其医药学上可接受的盐。
举例来说，所述化合物是
举例来说，所述化合物是或其医药学上可接受的盐。
举例来说，所述化合物是
本发明还提供了医药组合物，其包含一或多种医药学上可接受的载剂和一或多种本文中所公开的化合物。
本发明的另一方面是一种治疗或预防EZH2介导的病症的方法。所述方法包括向有需要的受试者投与治疗有效量的一或多种本文中所公开的化合物。EZH2介导的病症是至少部分通过EZH2的活性介导的疾病、病症或病况。在一个实施例中，EZH2介导的病症与增加的EZH2活性有关。在一个实施例中，EZH2介导的病症是癌症。EZH2介导的癌症可以是淋巴瘤、白血病或黑素瘤，例如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma；NHL)、滤泡性淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、混合系白血病或骨髓发育不良综合症(MDS)。在一个实施例中，EZH2介导的癌症可以是恶性横纹肌样肿瘤或缺乏INI1的肿瘤。恶性横纹肌样肿瘤的组织学诊断取决于特征性横纹肌样细胞(具有偏离中心定位的细胞核和丰富的嗜曙红细胞质的大细胞)的鉴别和抗体对波形蛋白、角蛋白和上皮膜抗原的免疫组织化学。在大多数恶性横纹肌样肿瘤中，位于染色体带22q11.2中的SMARCB1/INI1基因通过缺失和/或突变而失活。在一个实施例中，恶性横纹肌样肿瘤可以是缺乏INI1的肿瘤。
除非另外说明，否则治疗方法的任何描述包括使用所述化合物来提供如在说明书中所描述的这类治疗或预防，以及使用所述化合物制备用于治疗或预防这些病况的药剂。所述治疗包括人类或非人类动物的治疗，所述非人类动物包括啮齿动物和其它疾病模型。
此外，本文中所述的化合物或方法可以用于研究(例如，研究表观遗传酶)和其它非治疗性目的。
在某些实施例中，本文中所公开的优选化合物在所评估的组合疗法中具有合意的药理学和/或药物动力学特性，例如低清除率和/或不利的药物-药物相互作用的有限风险，例如通过细胞色素P-450酶的时间依赖性并且可逆的抑制。
除非另外规定，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。在本说明书中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式也包括复数。虽然可以在本发明的实践或测试中使用类似于或等效于本文中所述的那些方法和材料的方法和材料，但合适的方法和材料描述如下。本文中提到的所有公开、专利申请、专利以及其它参考文献全以引用的方式并入本文中。不承认本文中所引用的参考文献是所要求的发明的现有技术。在有冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。另外，所述材料、方法和实例仅仅是说明性的并且并不打算是限制性的。在本文中所公开的化合物的化学结构与名称有冲突的情况下，将以化学结构为准。
本发明的其它特征和优点从以下详细说明和权利要求书将是清楚的。
附图说明
图1是示出了经口投与的化合物1或化合物A在小鼠中抗淋巴瘤KARPAS-422异种移植的抗肿瘤效应的图。数据表示平均值±SD(n＝10)。
图2是示出了化合物1或化合物A对小鼠体重的影响的图。数据表示平均值±SD(n＝10)。
图3是示出了在处理之后第7天或第28天肿瘤中的化合物1的浓度或在处理之后第7天肿瘤中的化合物A的浓度的图。在这个图中，“A”到“G”表示在对应地以62.5、83.3、125、166.7、250、333.3和500mg/kg的剂量投与化合物1之后的7天；“H”和“I”表示在对应地以125和250mg/kg的剂量投与化合物A之后的7天；以及“J”到“L”表示在对应地以62.5、125和250mg/kg的剂量投与化合物1之后的28天。
图4是示出了在处理之后第7天或第28天在血浆中的化合物1或化合物A的浓度的图。上方虚线表示化合物A的血浆蛋白结合(PPB)校正的LCC并且下方虚线表示化合物1的PPB校正的LCC。
图5是示出了来自用化合物1或化合物A处理了7天的小鼠的KARPAS-422肿瘤中的全基因组H3K27me3甲基化的图。在这个图中，“A”表示媒剂处理；“B”到“H”表示对应地以62.5、83.3、125、166.7、250、333.3和500mg/kg的剂量用化合物1处理；以及“I”和“J”表示对应地以125和250mg/kg的剂量用化合物A处理。
图6是示出了来自用化合物1处理了28天的小鼠的KARPAS-422肿瘤中的全基因组H3K27me3甲基化的图。
图7是示出了来自用化合物1或化合物A处理了7天的携有KARPAS-422异种移植肿瘤的小鼠的骨髓中的全基因组H3K27me3甲基化的图。在这个图中，“A”表示媒剂处理；“B”到“H”表示对应地以62.5、83.3、125、166.7、250、333.3和500mg/kg的剂量用化合物1处理；以及“I”和“J”表示对应地以125和250mg/kg的剂量用化合物A处理。
图8是示出了来自用化合物1处理了28天的携有KARPAS-422异种移植肿瘤的小鼠的骨髓中的全基因组H3K27me3甲基化的图。在这个图中，“A”表示媒剂处理；“B”到“E”表示对应地以62.5、125、250和500mg/kg的剂量用化合物1处理；以及“F”表示以250mg/kg的剂量用化合物A处理。
具体实施方式
本发明提供新颖的经取代的苯化合物、用于制造所述化合物的合成方法、含有其的医药组合物以及所述化合物的各种用途。
本发明的代表性化合物包括表1中所列的化合物。
表1
在本说明书中，化合物的结构式在一些情况下为了方便起见表示某种异构体，但是本发明可以包括所有异构体，例如几何异构体、基于不对称碳的光学异构体、立体异构体、互变异构体、对映异构体、旋转异构体、非对映异构体、外消旋体等，应了解不是所有的异构体都可以具有相同的活性水平。另外，由所述式表示的化合物可能存在晶体的多晶型现象。应注意，在本发明的范围中包括任何晶体形式、晶体形式混合物或其酸酐或水合物。
“异构现象”意指化合物具有相同的分子式，但是其原子的键结顺序或其原子在空间的排列不同。其原子在空间的排列不同的异构体称为“立体异构体”。彼此不成镜像的立体异构体称为“非对映异构体”，并且彼此是非可重叠镜像的立体异构体称为“对映异构体”或有时称为光学异构体。含有等量单独的具有相反手性的对映异构形式的混合物称为“外消旋混合物”。
“几何异构物”意指其存在归因于围绕双键或环烷基连接基团(例如，1,3-环丁基)的旋转受阻的非对映异构体。这些构型通过前缀顺式和反式或Z和E在其名称中加以区分，所述前缀表示根据卡恩-英格尔-普雷洛格规则(Cahn-Ingold-Prelog rule)，在分子中，基团是在双键的同一侧或相对侧上。
应了解，本发明化合物可以描绘为立体异构体。还应了解，当化合物具有立体异构形式时，打算在本发明的范围中包括所有立体异构形式，应了解不是所有的立体异构体都可以具有相同的活性水平。
此外，本发明中所讨论的结构和其它化合物包括其所有阻转异构体，应了解不是所有的阻转异构体都可以具有相同的活性水平。“阻转异构体”是其中两个异构体的原子在空间中以不同方式排列的一类立体异构体。阻转异构体将其存在归因于由大基团围绕中心键的旋转位阻引起的旋转限制。这些阻转异构体通常以混合物形式存在，然而作为色谱技术方面的最新进展的结果，已经有可能在精选的情况下分离两种阻转异构体的混合物。
“互变异构体”是平衡地存在并且容易从一种异构形式转化成另一种的两个或更多个结构异构体中的一个。这种转化引起氢原子的缩甲醛式迁移，伴随着相邻共轭双键的转换。互变异构体以一组互变异构体的混合物形式存在于溶液中。在其中可能互变异构化的溶液中，将达到互变异构体的化学平衡。互变异构体的精确比率取决于若干种因素，包括温度、溶剂和pH。可通过互变异构化互相转化的互变异构体的概念称作互变异构现象。
在不同类型的可能的互变异构现象中，一般观察到两个。在酮基-烯醇互变异构现象中，发生电子和氢原子的同时转移。环-链互变异构现象出现的原因是糖链分子中的醛基(-CHO)与同一分子中的一个羟基(-OH)反应，从而赋予它如通过葡萄糖所展现的环状(环形)形式。
如本文中所用，的任何出现应该理解为
常见的互变异构对是：酮-烯醇、酰胺-腈、内酰胺-内酰亚胺、杂环(例如，在核碱基中，例如鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶)中的酰胺-亚胺酸互变异构现象、亚胺-烯胺以及烯胺-烯胺。酮基-烯醇平衡的实例是在吡啶-2(1H)-酮与对应的吡啶-2-醇之间，如下所示。
应了解，本发明化合物可以描绘为不同的互变异构体。还应了解，当化合物具有互变异构形式时，打算在本发明的范围中包括所有互变异构形式，并且化合物的命名不排除任何互变异构体形式。应了解，某些互变异构体的活性水平可以高于其它的。
术语“晶体多晶型物”、“多晶型物”或“晶体形式”意指其中化合物(或其盐或溶剂合物)可以按不同的晶体堆积排列结晶的晶体结构，所有这些晶体堆积排列都具有相同的元素组成。不同的晶体形式通常具有不同的X射线衍射图、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶体形状、光学和电学特性、稳定性以及溶解性。再结晶溶剂、结晶速率、储存温度和其它因素可以使一种晶体形式占主导地位。化合物的结晶多晶型物可以通过在不同条件下结晶来制备。
本发明化合物包括所述化合物本身，例如本文中所公开的式中的任一个。适当时，本发明化合物还可以包括其盐和其溶剂合物。举例来说，可以在阴离子与经取代的苯化合物上的带正电的基团(例如，氨基)之间形成盐。合适的阴离子包括氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、硫酸氢根、氨基磺酸根、硝酸根、磷酸根、柠檬酸根、甲烷磺酸根、三氟乙酸根、谷氨酸根、葡糖醛酸根、戊二酸根、苹果酸根、顺丁烯二酸根、丁二酸根、反丁烯二酸根、酒石酸根、甲苯磺酸根、水杨酸根、乳酸根、萘磺酸根以及乙酸根(例如，三氟乙酸根)。术语“医药学上可接受的阴离子”是指适用于形成医药学上可接受的盐的阴离子。类似地，还可以在阳离子与经取代的苯化合物上的带负电的基团(例如，羧酸根)之间形成盐。合适的阳离子包括钠离子、钾离子、镁离子、钙离子以及铵阳离子，例如四甲铵离子。经取代的苯化合物还包括含有季氮原子的那些盐。
另外，本发明化合物(例如，所述化合物的盐)能够以水合或未水合(无水)形式或以与其它溶剂分子的溶剂合物形式存在。水合物的非限制性实例包括一水合物、二水合物等。溶剂合物的非限制性实例包括乙醇溶剂合物、丙酮溶剂合物等。
“溶剂合物”意指含有化学计算量或非化学计算量的溶剂的溶剂加成形式。一些化合物具有截留固定摩尔比的呈结晶固体状态的溶剂分子，由此形成溶剂合物的倾向。如果溶剂是水，那么所形成的溶剂合物是水合物；并且如果溶剂是醇，那么所形成的溶剂合物是醇化物。水合物通过一或多个水分子与一个物质分子的组合形成，其中水保持其分子状态为H2O。
如本文中所用，术语“类似物”是指在结构上类似于另一种化合物但组成略有不同(如一个原子被不同元素的原子置换或存在特定官能团，或一个官能团被另一个官能团置换)的化合物。因此，类似物是在功能和外观上与参比化合物类似或相当，但是在结构或来源上不类似或相当的化合物。
如本文中所定义，术语“衍生物”是指具有共同核心结构，并且经如本文中所述的各种基团取代的化合物。举例来说，表1中的所有化合物都是经取代的苯化合物，并且具有共同核心。
术语“生物电子等排体”是指由一个原子或一组原子与另一个或另一组大致类似的原子交换产生的化合物。生物电子等排取代的目的是产生与母体化合物具有类似生物特性的新化合物。生物电子等排取代可以基于物理化学或拓扑学。羧酸生物电子等排体的实例包括(但不限于)酰基磺酰亚胺、四唑、磺酸盐以及膦酸盐。参看例如帕塔尼(Patani)和拉沃伊(LaVoie),《化学评论》(Chem.Rev.)96,3147-3176,1996。
本发明打算包括本发明化合物中出现的原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子数但不同质量数的那些原子。通过一般实例来举例说明并且不限于这些实例，氢的同位素包括氚和氘，并且碳的同位素包括C-13和C-14。
本发明提供用于合成本文中所公开的化合物的方法。本发明还提供了用于根据如实例中所示的方案合成本发明的各种公开化合物的详细方法。
在整个说明中，当将组合物描述为具有、包括或包含特定组分时，预期组合物还主要由所述组分组成或由所述组分组成。类似地，当将方法或工艺描述为具有、包括或包含特定工艺步骤时，所述工艺还主要由所述工艺步骤组成或由所述工艺步骤组成。此外应了解，步骤顺序或用于执行某些动作的顺序是不重要的，只要本发明保持可操作即可。此外，可以同时执行两个或更多个步骤或动作。
本发明的合成工艺可以耐受各种官能团，因此可以使用各种经取代的起始物质。所述工艺一般在整个工艺结束时或接近结束时提供所希望的最终化合物，但是在某些情况下可能需要将所述化合物进一步转化成其医药学上可接受的盐。
本发明化合物可以通过采用本领域的技术人员已知或根据本文中的教示熟练的业内人士将清楚的标准合成方法和程序，使用可商购的起始物质、文献中已知的化合物，或从容易制备的中间物以多种方式制备。用于制备有机分子和官能团转换与操控的标准合成方法和程序可以从相关科学文献或从本领域中的标准教科书获得。虽然不限于任何一个或若干个来源，但是经典文本是本领域的普通技术人员已知的有机合成的有用并且公认的参考教科书，所述经典文本例如史密斯M.B.(Smith,M.B.),马彻J.(March,J.),《马彻的高等有机化学：反应、机制和结构》(March's Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure),第5版,约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons)：纽约,2001；格林T.W.(Greene,T.W.),伍兹P.G.M.(Wuts,P.G.M.),《有机合成中的保护基》(Protective Groups in Organic Synthesis),第3版,约翰·威利父子公司：纽约,1999；R.拉罗克(R.Larock),《综合有机转化》(Comprehensive Organic Transformations),VCH出版社(1989)；L.费舍尔(L.Fieser)和M.费舍尔(M.Fieser),《费舍尔和费舍尔的有机合成试剂》(Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis),约翰·威利父子公司(1994)；以及L.帕克特(L.Paquette)编,《有机合成试剂丛书》(Encyclopedia of Reagentsfor Organic Synthesis),约翰·威利父子公司(1995)，以引用的方式并入本文中。合成方法的以下描述被设计成用于说明(但不限制)用于制备本发明化合物的通用程序。
本领域的普通技术人员将认识到，某些基团可能需要通过使用保护基来保护不受反应条件影响。也可以使用保护基来区分在分子中的类似官能团。保护基清单以及如何引入和去除这些基团可见于格林T.W.,伍兹P.G.M.,《有机合成中的保护基》,第3版,约翰·威利父子公司：纽约,1999中。
优选的保护基包括(但不限于)：
针对羟基部分：TBS、苯甲基、THP、Ac
针对羧酸：苯甲酯、甲酯、乙酯、烯丙酯
针对胺：Cbz、BOC、DMB
针对二醇：Ac(x2)TBS(x2)或当连在一起时，丙酮化合物
针对硫醇：Ac
针对苯并咪唑：SEM、苯甲基、PMB、DMB
针对醛：二-烷基缩醛，例如二甲氧基缩醛或二乙基乙酰基。
在本文中所述的反应方案中，会产生多种立体异构体。当没有指明具体立体异构体时，应了解意指可能从所述反应产生的所有可能的立体异构体。本领域的普通技术人员将认识到，可以优化反应以优先得到一种异构体，或可以设计新方案来产生单一异构体。如果产生混合物，那么可以使用例如制备型薄层色谱、制备型HPLC、制备型手性HPLC或制备型SFC的技术来分离异构体。
以下缩写用于整篇说明书中并且定义如下：
Ac 乙酰基
AcOH 乙酸
aq. 水溶液
BID或b.i.d. 一日两次(一天两次)
BOC 叔丁氧羰基
Cbz 苯甲氧羰基
CDCl3 氘化氯仿
CH2Cl2 二氯甲烷
DCM 二氯甲烷
DMB 2,4-二甲氧基苯甲基
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
EA或EtOAc 乙酸乙酯
EDC或EDCI N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳化二亚胺
ESI- 电喷雾负离子模式
ESI+ 电喷雾正离子模式
EtOH 乙醇
h 小时
H2O 水
HOBt 1-羟基苯并三唑
HCl 氯化氢或盐酸
HPLC 高效液相色谱
K2CO3 碳酸钾
LC/MS或LC-MS 液相色谱-质谱
M 摩尔
MeCN 乙腈
min 分钟
Na2CO3 碳酸钠
Na2SO4 硫酸钠
NaHCO3 碳酸氢钠
NaHMD 六甲基二硅基氨基钠
NaOH 氢氧化钠
NaHCO3 碳酸氢钠
Na2SO4 硫酸钠
NMR 核磁共振
Pd(OH)2 二氢氧化钯
PMB 对甲氧基苯甲基
p.o. 口服(经口投药)
ppm 百万分之一
制备型HPLC 制备型高效液相色谱
PYBOP (苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
Rt或RT 室温
TBME 叔丁基甲基醚
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
THP 四氢吡喃
本发明化合物可以便利地通过本领域的技术人员熟悉的各种方法制备。具有本文中所公开的任何式的本发明化合物可以根据以下实例中所展示的程序，从可商购的起始物质或可以使用文献程序制备的起始物质来制备。
本领域的普通技术人员应注意，在本文中所述的反应顺序和合成方案期间，某些步骤顺序可以改变，例如保护基的引入和去除。
本发明化合物抑制EZH2或其突变体的组蛋白甲基转移酶活性，并且因此在本发明的一个方面中，本文中所公开的某些化合物是用于治疗或预防其中EZH2起作用的某些病况和疾病的候选物。本发明提供用于治疗可以通过调节组蛋白或其它蛋白质的甲基化状态来影响其过程的病况和疾病的方法，其中所述甲基化状态至少部分通过EZH2的活性介导。组蛋白的甲基化状态的调节又可以影响通过甲基化活化的目标基因和/或通过甲基化遏制的目标基因的表达水平。所述方法包括向需要这类治疗的受试者投与治疗有效量的本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物、溶剂合物或立体异构体。
除非另外说明，否则治疗方法的任何描述包括使用所述化合物来提供如在说明书中所描述的这类治疗或预防，以及使用所述化合物制备用于治疗或预防这些病况的药剂。所述治疗包括人类或非人类动物的治疗，所述非人类动物包括啮齿动物和其它疾病模型。
在再一方面中，本发明涉及在有需要的受试者中调节EZH2的活性的方法，所述EZH2是催化组蛋白H3上的赖氨酸27(H3-K27)的单甲基化到三甲基化的PRC2复合物的催化亚基。举例来说，所述方法包含以下步骤：向患有表达突变体EZH2的癌症的受试者投与治疗有效量的本文中所述的化合物，其中所述化合物抑制EZH2的组蛋白甲基转移酶活性，由此治疗癌症。
举例来说，EZH2介导的癌症选自由生发中心B细胞样(GCB)亚型的滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)组成的群组。举例来说，所述癌症是淋巴瘤、白血病或黑素瘤。优选地，所述淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)、滤泡性淋巴瘤或弥漫性大B细胞淋巴瘤。或者，所述白血病是慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病或混合系白血病。
举例来说，EZH2介导的癌前病况是骨髓发育不良综合症(MDS，曾称为白血病前期)。
举例来说，EZH2介导的癌症是血液癌症。
本发明化合物抑制EZH2或其突变体的组蛋白甲基转移酶活性并且因此，本发明还提供用于治疗可以通过调节组蛋白或其它蛋白质的甲基化状态影响其过程的病况和疾病的方法，其中所述甲基化状态至少部分通过EZH2的活性介导。在本发明的一个方面中，本文中所公开的某些化合物是用于治疗或预防某些病况和疾病的候选物。组蛋白的甲基化状态的调节又可以影响通过甲基化活化的目标基因和/或通过甲基化遏制的目标基因的表达水平。所述方法包括向需要这类治疗的受试者投与治疗有效量的本发明化合物。
如本文中所用，“受试者”与“有需要的受试者”是可互换的，两者均是指患有其中EZH2介导的蛋白质甲基化起作用的病症的受试者，或相对于群体中的大多数，患这类病症的风险增加的受试者。“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物可以是例如人类或恰当的非人类哺乳动物，例如灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、山羊、骆驼、绵羊或猪。受试者还可以是鸟或家禽。在一个实施例中，所述哺乳动物是人类。有需要的受试者可以是先前已被诊断或鉴定为患有癌症或癌前病况的受试者。有需要的受试者还可以是患有(例如，正在遭受)癌症或癌前病况的受试者。或者，有需要的受试者可以是相对于群体中的大多数，患这类病症的风险增加的受试者(即，相对于群体中的大多数，倾向于患这类病症的受试者)。有需要的受试者可以具有癌前病况。有需要的受试者可以患有难治愈的或耐药性癌症(即，对治疗无反应或尚未对治疗做出反应的癌症)。受试者可能在治疗开始时具有耐药性或可能在治疗期间变得具有耐药性。在一些实施例中，有需要的受试者在基于最新疗法缓解之后有癌症复发。在一些实施例中，有需要的受试者接受了所有已知可用于癌症治疗的有效疗法并且失败了。在一些实施例中，有需要的受试者接受了至少一种先前疗法。在优选实施例中，受试者患有癌症或癌性病况。举例来说，所述癌症是淋巴瘤、白血病、黑素瘤或横纹肌肉瘤。优选地，所述淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤或弥漫性大B细胞淋巴瘤。或者，所述白血病是慢性骨髓性白血病(CML)。所述癌前病况是骨髓发育不良综合症(MDS，曾称为白血病前期)。
如本文中所用，“治疗(treating)”或“治疗(treat)”描述为了对抗疾病、病况或病症而对患者采取的管理和护理，并且包括投与本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物，以减轻疾病、病况或病症的症状或并发症，或消除所述疾病、病况或病症。术语“治疗”还可以包括体外细胞或动物模型的治疗。
本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物可以或还可以用于预防相关疾病、病况或病症，或用于鉴别用于这类目的的合适候选物。如本文中所用，“预防(preventing)”、“预防(prevent)”或“保护对抗(protecting against)”描述减少或消除这类疾病、病况或病症的症状或并发症的发作。
在EZH2的单一氨基酸残基(例如，Y641、A677和A687)处EZH2基因的点突变已被报告为与淋巴瘤有关。EZH2突变体和突变检测方法以及治疗突变相关病症的方法的更多实例描述在例如美国专利申请公开第US 20130040906号中，所述公开的完整内容以其全文引用的方式并入本文中。
关于本文中所讨论的已知技术或等效技术的详细说明，本领域技术人员可以参考通用参考文本。这些文本包括奥斯贝(Ausubel)等人,《分子生物学实验室指南》(CurrentProtocols in Molecular Biology),约翰·威利父子公司(2005)；萨姆布鲁克(Sambrook)等人,《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)(第3版),冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press),冷泉港,纽约(2000)；科利根(Coligan)等人,《免疫学实验室指南》(Current Protocols in Immunology),约翰·威利父子公司,纽约；恩纳(Enna)等人,《药理学实验室指南》(Current Protocols in Pharmacology),约翰·威利父子公司,纽约；芬格尔(Fingl)等人,《治疗学的药理学基础》(The Pharmacological Basisof Therapeutics)(1975),《雷明顿的药物科学》(Remington's PharmaceuticalSciences),马克出版公司(Mack Publishing Co.),伊斯顿(Easton),宾夕法尼亚州(PA),第18版(1990)。当然还可以在制造或使用本发明的一个方面的过程中提到这些文本。
如本文中所用，“组合疗法”或“辅助疗法”包括投与本发明化合物或其医药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物以及至少一种第二药剂作为特定治疗方案的一部分，所述治疗方案打算从这些治疗剂的共同作用提供有益作用。所述组合的有益作用包括(但不限于)由所述治疗剂组合产生的药物动力学或药效学共同作用。
本发明还提供了医药组合物，其包含本文中所公开的化合物以及至少一种医药学上可接受的赋形剂或载剂。
“医药组合物”是含有本发明化合物的呈适用于向受试者投与的形式的调配物。在一个实施例中，医药组合物呈散装形式或单位剂型。单位剂型是各种形式中的任一种，包括例如胶囊、IV袋、片剂、气雾剂吸入器上的单个泵或小瓶。单位剂量组合物中的活性成分(例如，所公开的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或异构体的调配物)的数量是有效量并且根据所涉及的具体治疗而改变。本领域技术人员应了解，有时需要取决于患者的年龄和病况对剂量做出例行改变。剂量还将取决于投药途径。涵盖了各种途径，包括经口、经肺、经直肠、肠胃外、经皮、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、吸入、经颊、舌下、胸膜内、鞘内、鼻内等等。用于局部或经皮投与本发明化合物的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴片以及吸入剂。在一个实施例中，在无菌条件下混合活性化合物与医药学上可接受的载剂和所需要的任何防腐剂、缓冲液或推进剂。
如本文中所用，短语“医药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相匹配的那些化合物、阴离子、阳离子、材料、组合物、载剂和/或剂型。
“医药学上可接受的赋形剂”意指适用于制备通常安全无毒并且在生物学上和其它方面均合乎需要的医药组合物的赋形剂，并且包括对于兽用以及对于人类药物使用可接受的赋形剂。如说明书和权利要求书中所使用的“医药学上可接受的赋形剂”包括一种和超过一种此类赋形剂。
本发明医药组合物可以被调配为与其预期投与途径相容。投与途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如，吸入)、经皮(局部)以及经粘膜投与。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、生理盐水溶液、非挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调整张力的药剂，例如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱调整，例如盐酸或氢氧化钠。可以将肠胃外制剂密封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
本发明的化合物或医药组合物可以按目前用于化学疗法治疗的许多众所周知的方法向受试者投与。举例来说，对于癌症的治疗，本发明化合物可以直接注射到肿瘤中、注射到血流或体腔中或口服或用贴片经由皮肤施用。所选择的剂量应足以构成有效治疗但尚未高到产生不可接受的副作用。应该优选地在治疗期间和在治疗之后的合理时间段密切监控疾病病况(例如，癌症、初癌等)的状态和患者的健康。
如本文中所用的术语“治疗有效量”是指用于治疗、改善或预防所鉴别的疾病或病况或用于展现可检测的治疗性或抑制性作用的药剂的量。所述作用可以通过本领域中已知的任何分析方法检测。受试者的精确有效量将取决于受试者的体重、身材和健康；病况的性质和程度；以及所选择用于投与的疗法或疗法组合。针对指定情况的治疗有效量可以通过在临床医师的技能和判断内的常规实验来测定。在一个优选方面，有待治疗的疾病或病况是癌症。在另一方面，有待治疗的疾病或病况是细胞增殖病症。
对于任何化合物，治疗有效量都可以最初在例如赘生性细胞的细胞培养分析中或在动物模型(通常是大鼠、小鼠、兔、狗或猪)中估算。动物模型还可以用于测定投药的适当浓度范围和途径。这类信息随后可以用于确定在人体中投与的有用剂量和途径。治疗性/预防性功效和毒性可以通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中测定，例如ED50(可在50％的群体中治疗有效的剂量)和LD50(使50％的群体致死的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比是治疗指数，并且它可以表示为比率LD50/ED50。展现大治疗指数的医药组合物是优选的。所述剂量可以取决于所采用的剂型、患者的敏感性以及投药途径而在此范围内变化。
调整剂量和投与以提供充足量的活性剂或维持所要效果。可以考虑的因素包括疾病病况的严重程度、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、投药时间和频率、药物组合、反应灵敏度以及对疗法的耐受性/反应。取决于具体调配物的半衰期和清除率，长效医药组合物可以每3到4天、每周或每两周一次投与。
含有本发明活性化合物的医药组合物可以按一般已知的例如借助于常规的混合、溶解、粒化、制糖衣药丸、水磨、乳化、封装、包覆或冻干工艺的方式来制造。医药组合物可以按常规方式使用一或多种医药学上可接受的载剂(包含赋形剂和/或助剂)来调配，所述载剂促使将活性化合物加工成可以在医药学上使用的制剂。当然，恰当调配物取决于所选择的投药途径。
适用于可注射使用的医药组合物包括用于无菌可注射溶液或分散液的临时制备的无菌水溶液(其中水可溶)或分散液和无菌粉末。关于静脉内投药，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、克列莫佛(Cremophor)ELTM(新泽西州派西派尼的巴斯夫(BASF,Parsippany,N.J.))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应该是达到存在容易可注射性的程度的流体。它在制造和储存条件下必须稳定并且必须抗微生物(例如细菌和真菌)的污染活动地加以保存。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇以及液体聚乙二醇等)以及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用涂层(例如卵磷脂)、在分散液情况下通过维持所需粒度和/或通过使用表面活性剂来维持适当流动性。微生物活动的预防可以通过各种抗细菌和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露糖醇和山梨糖醇)以及氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)实现。
无菌可注射溶液可以通过如下制备：视需要将所需量的活性化合物与上文所列举的成分中的一种或组合并入适当溶剂中，接着过滤灭菌。通常，通过将活性化合物并入含有碱性分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这产生了活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何其它所希望的成分的粉末。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用的医药学上可接受的载剂。它们可以被密封在明胶胶囊中或被压缩成片剂。为了经口治疗性投药，活性化合物可以与赋形剂一起并入并且以片剂、糖衣片或胶囊形式使用。口服组合物还可以使用适用作漱口水的流体载剂制备，其中在流体载剂中的化合物经口施用并且漱口并吐掉或吞咽。可以包括医药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、糖衣片等可以含有以下成分或具有类似性质的化合物中的任一种：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、普利莫吉尔(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或斯特罗特斯(Sterotes)；助流剂，例如胶状二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
关于通过吸入投药，所述化合物以气雾剂喷雾形式从含有合适的推进剂(例如气体，例如二氧化碳)或喷雾器的加压容器或分配器传递。
还可以通过经粘膜或经皮手段全身性投药。关于经粘膜或经皮投药，在调配物中使用适于渗透屏障的渗透剂。这类渗透剂一般是本领域中已知的，并且例如对于经粘膜投药，包括清洁剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜投药可以通过使用经鼻喷雾剂或栓剂实现。如一般在本领域中已知的，对于经皮投药，活性化合物被调配成软膏、油膏、凝胶或乳膏。
活性化合物可以与医药学上可接受的载剂一起制备，所述载剂将保护化合物免于从体内快速消除，例如控制释放调配物，包括植入剂和微封装的传递系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯以及聚乳酸。用于制备这类调配物的方法将为本领域的技术人员所清楚。所述物质还可以从阿尔扎公司(Alza Corporation)和诺瓦药物公司(Nova Pharmaceuticals,Inc.)商购获得。还可以使用脂质体悬浮液(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)作为医药学上可接受的载剂。这些物质可以根据本领域的技术人员已知的方法制备，例如如美国专利第4,522,811号中所描述。
尤其有利的是以便于投药和剂量均匀性的单位剂型调配经口或肠胃外组合物。如本文中所用的单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗受试者的物理离散单位；每个单位含有与所需药物载剂结合，经计算以产生所希望的治疗效果的预定数量的活性化合物。关于本发明单位剂型的规格由活性化合物的独特特征和要获得的具体治疗效果指定并且直接取决于这些。
在治疗性应用中，根据本发明使用的医药组合物的剂量取决于药剂、接受者患者的年龄、体重和临床病况以及投与疗法的临床医师或从业者的经验和判断以及影响要选择的剂量的其它因素而变化。一般来讲，所述剂量应该足以减缓并且优选地消退肿瘤生长，并且还优选地促成癌症的完全消退。剂量可以在约0.01mg/kg/天到约5000mg/kg/天的范围内变化。在优选方面，剂量可以在约1mg/kg/天到约1000mg/kg/天的范围内变化。在一个方面中，所述剂量将在以下范围内：约0.1mg/天到约50g/天；约0.1mg/天到约25g/天；约0.1mg/天到约10g/天；约0.1mg到约3g/天；或约0.1mg到约1g/天，呈单一、分次或连续剂量形式(所述剂量可以针对患者的体重(以kg计)、体表面积(以m2计)以及年龄(以年计)加以调整)。药剂的有效量是提供如由临床医师或其它具备资格的观察者所指出的客观地可鉴别的改善的量。举例来说，患者中肿瘤的消退可以参照肿瘤的直径来测量。肿瘤直径减小表示消退。在治疗已经停止之后，肿瘤复发失败也表示消退。如本文中所用，术语“剂量有效方式”是指用于在受试者或细胞中产生所希望的生物作用的活性化合物的量。
医药组合物可以连同投药说明书一起包括在容器、包装或分配器中。
本发明化合物能够进一步形成盐。所有这些形式也都被涵盖在所要求的发明的范围内。
如本文中所用，“医药学上可接受的盐”是指本发明化合物的衍生物，其中母体化合物通过制造其酸或碱盐加以改性。医药学上可接受的盐的实例包括(但不限于)碱性残基(例如胺)的无机或有机酸盐；酸性残基(例如羧酸)的碱金属或有机盐等等。医药学上可接受的盐包括从例如无毒的无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒的盐或季铵盐。举例来说，这类常规无毒盐包括(但不限于)从无机和有机酸衍生的那些，所述酸选自2-乙酰氧基苯甲酸、2-羟基乙烷磺酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、重碳酸、碳酸、柠檬酸、依地酸(edetic acid)、乙烷二磺酸、1,2-乙烷磺酸、反丁烯二酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、谷氨酸、乙醇酸、对氨苯基胂酸、己基间苯二酚酸、海巴胺酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟基顺丁烯二酸、羟基萘甲酸、羟乙基磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂基磺酸、顺丁烯二酸、苹果酸、杏仁酸、甲烷磺酸、萘磺酸、硝酸、草酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、聚半乳糖醛酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、亚乙酸、丁二酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、鞣酸、酒石酸、甲苯磺酸以及常见氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等。
医药学上可接受的盐的其它实例包括己酸、环戊烷丙酸、丙酮酸、丙二酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、黏康酸等。本发明还涵盖当母体化合物中所存在的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)置换；或与有机碱(例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、缓血酸胺、N-甲基葡糖胺等)配位时所形成的盐。在盐形式中，应了解盐的所述化合物比阳离子或阴离子的比率可以是1:1，或除1:1以外的任何比率，例如3:1、2:1、1:2或1:3。
应了解，所有提到的医药学上可接受的盐包括同一种盐的如本文中所定义的溶剂加成形式(溶剂合物)或晶体形式(多晶型物)。
经口、经鼻、经皮、经肺、吸入、经颊、舌下、腹膜内、皮下、肌肉内、静脉内、经直肠、胸膜内、鞘内以及肠胃外投与所述化合物或其医药学上可接受的盐。在一个实施例中，经口投与所述化合物。本领域技术人员将认识到某些投药途径的优势。
根据各种因素选择利用所述化合物的给药方案，所述因素包括患者的类型、种属、年龄、体重、性别和医学病况；有待治疗的病况的严重程度；投药途径；患者的肾脏和肝脏功能；以及所采用的具体化合物或其盐。一般熟练的医师或兽医可以容易地确定并规定用于预防、对抗或阻止病况进展所需的药物的有效量。
所公开的本发明化合物的调配和投与技术可见于《雷明顿：药物科学和实践》(Remington:the Science and Practice of Pharmacy),第19版,马克出版公司,伊斯顿,宾夕法尼亚州(1995)中。在一个实施例中，本文中所述的化合物和其医药学上可接受的盐以与医药学上可接受的载剂或稀释剂组合的药物制剂形式使用。合适的医药学上可接受的载剂包括惰性固体填充剂或稀释剂以及无菌水溶液或有机溶液。所述化合物将以足以提供在本文中所述的范围内的所希望的剂量的量存在于这类医药组合物中。
除非另外指明，否则本文中所用的所有百分比和比率都按重量计。本发明的其它特征和优点从不同实例是显而易见的。所提供的实例说明了适用于实践本发明的不同组分和方法。所述实例不限制所要求的发明。基于本发明，熟练的业内人士可以鉴别并且采用适用于实践本发明的其它组分和方法。
在本文中所述的合成方案和化学结构中，为简单起见，化合物可用一种特定构型(例如，存在或不存在所标出的特定立体异构体)绘制。这类特定构型或其缺乏不应理解为将本发明限制在一种或另一种异构体、互变异构体、区位异构体或立体异构体，它也不排除异构体、互变异构体、区位异构体或立体异构体的混合物；然而应了解，指定异构体、互变异构体、区位异构体或立体异构体的活性水平可以高于另一种异构体、互变异构体、区位异构体或立体异构体。
通过上文所述的方法设计、选择和/或优化的化合物一旦产生，就可以使用本领域的技术人员已知用于测定化合物是否具有生物活性的各种分析来表征。举例来说，可以通过常规分析来表征分子，所述分析包括(但不限于)如下所述用于测定它们是否具有所预测的活性、结合活性和/或结合特异性的那些分析。
此外，可以使用高通量筛选来加速使用这类分析进行的分析。因此，可能可以使用本领域中已知的技术针对活性快速地筛选本文中所述的分子。用于执行高通量筛选的通用方法描述在例如德弗林(Devlin)(1998)《高通量筛选》(High Throughput Screening),马塞尔·德克(Marcel Dekker)；和美国专利第5,763,263号中。高通量分析可以使用一或多种不同的分析技术，包括(但不限于)如下所述的那些。
本文中引用的所有出版物和专利文件全以引用的方式并入本文中，如同每个所述出版物或文件特定地并且单独地指出以引用的方式并入本文中。出版物和专利文件的引用不打算承认任一个是相关现有技术，它也不构成对相关现有技术的内容或日期的任何承认。现在正借助于书面说明描述本发明，本领域的技术人员将认识到，本发明可以按各种实施例实践并且以上描述和以下实例是出于说明的目的并且不是以下权利要求书的限制。
实例
实例1本发明化合物的合成
一般实验
NMR
除非另外说明，否则使用CDCl3获得1H-NMR光谱并且使用瓦里安(Varian)或牛津(Oxford)仪器磁体(500MHz)仪器在400或500MHz下记录所述光谱。所指出的多峰性是s＝单峰，d＝二重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，quint＝五重峰，sxt＝六重峰，m＝多重峰，dd＝双二重峰，dt＝双三重峰，br表示宽峰信号。
LCMS和HPLC
质谱:沃特斯阿奎蒂超高效LC(Waters Acquity Ultra Performance LC).HPLC：通过岛津(Shimadzu)SPD-20A用150×4.5mm YMC ODS-M80柱或150×4.6mm YMC-Pack ProC18柱以1.0ml/min分析产物。流动相是MeCN:H2O＝3:2(含有0.3％SDS和0.05％H3PO4)。通过HPLC/MS(MeOH-H2O，含有0.1％氢氧化铵)，使用含3100质量检测器的沃特斯自动纯化系统纯化产物。
3-(氨甲基)-4,6-二甲基-1,2-二氢吡啶-2-酮盐酸盐
向2-氰基乙酰胺(8.40g，100mmol)和乙酰丙酮(10.0g，100mmol)于H2O(200mL)中的溶液中添加K2CO3(4.00g，28.9mmol)。在室温下搅拌混合物22小时。然后用布氏漏斗过滤所沉淀的固体，用冰冷的H2O洗涤，并且在真空压力下干燥，从而得到4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲腈(13.5g，91％产率)。
在N2氛围下，向4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲腈(10.0g，67.5mmol)于MeOH(1.50L)和浓HCl(30mL)中的溶液中添加10％Pd(OH)2(19g)。用H2气体取代N2气体并且在室温下在氢气氛围下搅拌混合物26小时。用N2气体取代H2气体。混合物通过硅藻土过滤，用MeOH洗涤并且浓缩。残余物用EtOH湿磨，用布氏漏斗收集，并且在真空压力下干燥，从而得到呈白色固体状的标题化合物(11.5g，90％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 11.86(brs,1H),5.98(s,1H),3.78(m,2H),2.20(s,3H),2.16(s,3H)。
5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸
在0℃下，向2-甲基-3-硝基苯甲酸(5.00g，27.6mmol)于H2SO4(20mL)中的搅拌溶液中添加1,3-二溴-5,5-二甲基乙内酰脲(4.34g，15.20mmol)。在0℃下搅拌反应混合物5小时。将反应混合物倒到冰冷水上，收集所得沉淀固体，用水洗涤并且在真空中干燥，从而得到呈白色固体状的标题化合物(7.28g，定量产率)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm；8.31(s,1H),8.17(s,1H),2.43(s,3H)。
5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯
向5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸(7.28g，28.0mmol)于DMF(100mL)中的搅拌溶液中添加碳酸钠(11.9g，112mmol)和碘甲烷(15.9g，112mmol)。在60℃下搅拌反应混合物8小时。在反应完成之后，过滤反应混合物并且用乙酸乙酯洗涤。用水洗涤经合并的滤液并且用乙酸乙酯反萃取水相。经合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩，从而获得呈固体状的标题化合物。(7.74g，定量产率)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)；8.17(s,1H),7.91(s,1H),3.96(s,3H),2.59(s,3H)。
3-氨基-5-溴-2-甲基苯甲酸甲酯
向5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯(7.60g，27.7mmol)于EtOH水溶液(100mL EtOH和20mL H2O)中的搅拌溶液中添加氯化铵(4.45g，83.1mmol)和铁(4.64g，83.1mmol))。在80℃下搅拌反应混合物5小时。然后通过硅藻土过滤混合物并且用乙酸乙酯洗涤硅藻土床。在真空中浓缩经合并的滤液。将所得残余物溶解于乙酸乙酯和水中。用乙酸乙酯萃取水层(两次)。经合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并且在减压下浓缩，从而获得呈棕色油状物的标题化合物(6.67g，99％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm；7.37(s,1H),6.92(s,1H),3.94(s,3H),3.80(brs,2H),2.31(s,3H)。
化合物1：
步骤1：合成5-(((反)-4-((叔丁氧羰基)氨基)环己基)(乙基)氨基)-4'-羟基-4-甲基-[1,1'-联苯]-3-甲酸甲酯
向5-溴-3-(((反)-4-((叔丁氧羰基)氨基)环己基)(乙基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯(10g，21.3mmol，参看例如WO2012142504(代理人档案编号41478-507001WO))和(4-羟基苯基)硼酸(3.5g，25.3mmol)于二噁烷(225mL)和水(75mL)的混合物中的搅拌溶液中添加Na2CO3(8.01g，75.5mmol)，并且用氩气净化溶液30分钟。然后添加Pd(PPh3)4(2.4g，2.07mmol)并且再次用氩气再净化15分钟。在100℃下加热反应物质4小时。完成时，反应混合物用水稀释并且用乙酸乙酯萃取。用硫酸钠干燥经合并的有机层。在减压下去除溶剂，接着柱色谱纯化，获得标题化合物(8.9g，87％产率)。
步骤2：合成5-(((反)-4-((叔丁氧羰基)氨基)环己基)(乙基)氨基)-4'-(2-甲氧基乙氧基)-4-甲基-[1,1'-联苯]-3-甲酸甲酯
向5-(((反)-4-((叔丁氧羰基)氨基)环己基)(乙基)氨基)-4'-羟基-4-甲基-[1,1'-联苯]-3-甲酸甲酯(0.6g，1.24mmol)和1-溴-2-甲氧基乙烷(0.519g，3.73mmol)于乙腈(6mL)中的搅拌溶液中添加Cs2CO3(0.485g，1.49mmol)，并且在80℃下搅拌反应物12小时。完成时，向其中添加水，并且用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩。通过柱色谱纯化粗化合物，从而获得标题化合物(0.6g，76.5％产率)。
步骤3：合成((反)-4-((5-(((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-4'-(2-甲氧基乙氧基)-4-甲基-[1,1'-联苯]-3-基(乙基)-氨基)-环己基)氨基甲酸叔丁酯
向5-(((反)-4-((叔丁氧羰基)氨基)环己基)(乙基)氨基)-4'-(2-甲氧基乙氧基)-4-甲基-[1,1'-联苯]-3-甲酸甲酯(0.6g，1.11mmol)于EtOH(10mL)中的溶液中添加NaOH水溶液(0.066g，1.66mmol，在5mL H2O中)并且在60℃下搅拌1小时。在反应完成之后，在减压下去除乙醇并且使用柠檬酸将残余物酸化到pH 4，使用柠檬酸调整。使用10％甲醇/DCM执行萃取。干燥、浓缩经合并的有机层，得到对应的酸(0.5g，85.6％产率)。
然后将以上的酸(0.5g，0.95mmol)溶解于DMSO(5mL)和3-(氨甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(0.288g，1.90mmol)中，并且向其中添加三乙胺(0.096g，0.950mmol)。在室温下搅拌反应混合物15分钟，然后向其中添加PyBop(0.741g，1.42mmol)并且在室温下继续搅拌过夜。在反应完成之后，将反应物质倒入冰中并且使用10％MeOH/DCM执行萃取。经合并的有机层用硫酸钠干燥并且在减压下浓缩，获得粗物质，然后通过柱色谱纯化所述粗物质，从而获得标题化合物(0.45g，71.8％产率)。
步骤4：合成N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(((反)-4-(二甲基氨基)-环己基)(乙基)-氨基)-4'-(2-甲氧基乙氧基)-4-甲基-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺
在0℃下，向((反)-4-((5-(((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-4'-(2-甲氧基乙氧基)-4-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)(乙基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(0.45g，0.681mmol)于DCM(5mL)中的搅拌溶液中添加TFA(1mL)，并且在室温下搅拌反应物2小时。完成后，将反应物浓缩至干燥。然后将残余物用Na2CO3(水溶液)碱化到pH8并且用20％甲醇/DCM萃取水层。用Na2SO4干燥经合并的有机层并且在减压下去除溶剂，从而得到去除Boc保护基的化合物(0.3g，78.7％产率)。
在0℃下，向去除Boc保护基的化合物(0.3g，0.535mmol)于二氯甲烷(3mL)中的搅拌溶液中添加甲醛溶液(35-41％水溶液)(0.056g，1.87mmol)并且搅拌20分钟。然后添加NaBH(OAc)3(0.28g，1.33mmol)并且在0℃下搅拌2小时。反应完成时，添加水并且用20％甲醇/DCM萃取。用Na2SO4干燥经合并的有机层并且在减压下去除溶剂。通过制备型HPLC纯化粗化合物，从而获得标题化合物(0.1g，31.7％产率)。
LCMS：589.75(M+1)+；三氟乙酸盐：1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ11.47(brs,1H),9.48(brs,1H),8.21(brs,1H),7.57(d,2H,J＝8.0Hz),7.40(s,1H),7.23(s,1H),7.03(d,2H,J＝8.8Hz),5.87(s,1H),4.29(d,2H,J＝4.4Hz),4.14-4.12(m,2H),3.69-3.66(m,2H),3.32(s,3H),3.13(m,4H),2.69-2.68(m,6H),2.24(s,3H),2.21(s,3H),2.11(s,3H),1.96(m,4H),1.44(m,4H),0.85(t,3H,J＝6.8Hz)。
化合物2：
步骤1：合成5-溴-3-(((反)-4-((叔丁氧羰基)-(甲基)-氨基)环己基)(乙基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯
在0℃下，向5-溴-3-(((反)-4-((叔丁氧羰基)氨基)环己基)(乙基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯(3g，6.41mmol，参看例如WO2012142504)于THF(30mL)中的搅拌溶液中添加NaH(0.184g，7.69mmol)，并且在相同温度下将它搅拌20分钟。然后在0℃下添加碘甲烷(9.10g，64.10mmol)并且在室温下搅拌反应物过夜。完成时，反应物用冰水淬灭并且用二氯甲烷萃取。经合并的有机层用水洗涤，干燥，在减压下浓缩。通过柱色谱纯化粗化合物，从而获得不经进一步纯化即使用的粗标题化合物(3g，97.4％产率)。
步骤2：合成3-(((反)-4-((叔丁氧羰基)-(甲基)氨基)环己基)(乙基)氨基)-5-(3-羟基丙-1-炔-1-基)-2-甲基苯甲酸甲酯
向5-溴-3-(((反)-4-((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)环己基)(乙基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯(2g，4.14mmol)于无水甲苯中的搅拌溶液中添加CuI(0.015g，0.079mmol)、PPh3(0.043g，0.165mmol)、PdCl2(PPh3)2(0.058g，0.082mmol)、N,N-二异丙胺(1.08g，10.78mmol)，并且用氩气净化反应物15分钟。向其中添加丙-2-炔-1-醇(0.46g，8.29mmol)，在80℃下在密封条件下加热反应物5小时。完成时，反应物用水淬灭并且用乙酸乙酯萃取。用Na2SO4干燥有机层。通过柱色谱纯化粗化合物，从而获得标题化合物(1.2g，63.2％产率)。
步骤3：合成5-(3-溴丙-1-炔-1-基)-3-(((反)-4-((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)环己基)(乙基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯：
在0℃下，向3-(((反)-4-((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)环己基)(乙基)氨基)-5-(3-羟基丙-1-炔-1-基)-2-甲基苯甲酸甲酯(1.2g，2.62mmol)于DCM(15mL)中的搅拌溶液中添加PPh3(1.37g，5.22mmol)和CBr4(1.7g，5.10mmol)，并且在室温下搅拌反应物4小时。完成时，反应物用冰水淬灭并且用二氯甲烷萃取。经合并的有机层用水洗涤，干燥，在减压下浓缩。通过柱色谱纯化粗物质，从而获得标题化合物(0.5g，38.5％产率)。
步骤4：合成3-(((反)-4-((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)环己基)(乙基)氨基)-2-甲基-5-(3-吗啉代丙-1-炔-1-基)苯甲酸甲酯
向5-(3-溴丙-1-炔-1-基)-3-(((反)-4-((叔丁氧羰基)-(甲基)氨基)环己基)(乙基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯(1当量)于DMF中的搅拌溶液中添加吗啉(5当量)，并且在室温下搅拌反应物12小时。完成时，反应物用冰水淬灭并且用二氯甲烷萃取。经合并的有机层用水洗涤，干燥，在减压下浓缩，从而获得不经进一步纯化即用于下一步骤中的所希望的粗标题化合物(98.7％产率)。
步骤5：合成((反)-4-((3-(((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-2-甲基-5-(3-吗啉代丙-1-炔-1-基)苯基)(乙基)氨基)环己基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯
向3-(((反)-4-((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)环己基)(乙基)氨基)-2-甲基-5-(3-吗啉代丙-1-炔-1-基)苯甲酸甲酯(1当量)于EtOH:H2O(9:1)中的溶液中添加NaOH(1.5当量)，并且在60℃下搅拌1小时。在反应完成之后，在减压下去除乙醇并且使用稀HCl酸化到pH 6并且使用柠檬酸调整到pH 4。使用10％甲醇/DCM执行萃取。干燥、浓缩经合并的有机层，得到对应的酸。
然后将以上的酸(1当量)溶解于DMSO中并且向其中添加3-(氨甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(2当量)和三乙胺(1当量)。在室温下搅拌反应混合物15分钟，然后向其中添加PyBop(1.5当量)并且在室温下继续搅拌过夜。在反应完成之后，将反应物质倒入冰中并且使用10％MeOH/DCM执行萃取。经合并的有机层用Na2SO4干燥并且在减压下浓缩，获得粗物质，然后首先通过水、接着乙腈洗涤来纯化所述粗物质，从而获得所希望的标题化合物(69.4％产率)。
步骤6：合成N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-(乙基((反)-4-(甲氨基)环己基)氨基)-2-甲基-5-(3-吗啉代丙-1-炔-1-基)苯甲酰胺
在0℃下，向((反)-4-((3-(((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-2-甲基-5-(3-吗啉代丙-1-炔-1-基)苯基)(乙基)氨基)环己基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(1当量)于DCM中的搅拌溶液中添加TFA(3当量)，并且在室温下搅拌反应物2小时。完成后，将反应物浓缩至干燥。然后将残余物用Na2CO3(水溶液)碱化到pH 8并且用20％甲醇/DCM萃取水层。用Na2SO4干燥经合并的有机层并且在减压下去除溶剂，从而获得不经进一步纯化即用于下一反应中的标题化合物(99％产率)。
步骤7：合成N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-(乙基((反)-4-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)环己基)氨基)-2-甲基-5-(3-吗啉代丙-1-炔-1-基)苯甲酰胺
在0℃下，向N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-(乙基((反)-4-(甲氨基)环己基)氨基)-2-甲基-5-(3-吗啉代丙-1-炔-1-基)苯甲酰胺(1当量)于二氯乙烷中的搅拌溶液中添加2-甲氧基乙醛(10当量)和乙酸(6当量)，并且搅拌20分钟。然后添加NaBH(OAc)3(3当量)并且在0℃下搅拌2小时。反应完成时，添加水并且用20％甲醇/DCM萃取。用Na2SO4干燥经合并的有机层并且在减压下去除溶剂。通过制备型HPLC纯化粗化合物，从而获得目标分子(0.1g，33.6％产率)。
LCMS：606.65(M+1)+；三氟乙酸盐：1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ11.50(brs,1H),9.22(brs,1H),8.18(t,1H),7.24(s,1H),7.09(s,1H),5.86(s,1H),4.26-4.25(m,4H),3.66-3.59(m,4H),3.48-3.36(m,3H),3.29-3.17(m,7H),3.04-3.01(m,3H),2.69-2.68(m,4H),2.20(s,3H),2.19(s,3H),2.11(s,3H),2.00-1.92(m,2H),1.82-1.73(m,3H),1.46(m,4H),0.78(t,3H,J＝6.4Hz)。
化合物2的替代性合成方案：
步骤A：合成4-(丙-2-炔-1-基)吗啉：
在0℃下，向炔丙基溴(50g，420mmol)于丙酮(300mL)中的搅拌溶液中添加Cs2CO3(136.5g，420mmol)。然后逐滴添加吗啉(36.60g，420mmol)/丙酮(200mL)并且在室温下搅拌反应物16小时。完成时，过滤反应物质并且在减压下浓缩滤液，从而获得标题化合物(50g，粗物质)。经分离化合物不进一步纯化即直接用于后一偶合步骤中。
步骤1：合成5-溴-3-(乙基((反)-4-(甲氨基)环己基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯：
在0℃下，向5-溴-3-(((反)-4-((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)环己基)(乙基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯(30g，62.24mmol)于甲醇(100mL)中的搅拌溶液中添加甲醇HCl(500mL)，并且在室温下搅拌反应物2小时。完成后，将反应物浓缩至干燥。将残余物用Na2CO3(水溶液)碱化到pH 8并且用10％甲醇/DCM(200mL×3)萃取水层。用Na2SO4干燥经合并的有机层并且在减压下去除溶剂，从而获得呈无色油状物的标题化合物(25g，粗物质)。经分离化合物不经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤2：合成5-溴-3-(乙基((反)-4-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)环己基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯：
向粗物质5-溴-3-(乙基((反)-4-(甲氨基)环己基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯(25g，65.44mmol)、1-溴-2-甲氧基乙烷(18.19g，130.8mmol)于乙腈(250mL)中的搅拌溶液中添加K2CO3(18.06g，130.8mmol)和KI(6.51g，39.21mmol)。在65℃下搅拌所得反应物质16小时。完成时，反应混合物用水(300mL)稀释并且用DCM(500mL×3)萃取。经合并的有机层用水洗涤，用Na2SO4干燥，并且在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱纯化粗化合物，从而获得标题化合物(20g，69.3％产率)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ7.55(s,1H),7.45(s,1H),3.82(s,3H),3.32(m,4H),3.20(s,3H),3.05(q,2H),2.61(m,1H),2.32(s,3H),2.30(m,1H),2.15(s,3H),1.77-1.67(m,4H),1.37-1.31(m,2H),1.24-1.18(m,2H),0.78(t,3H,J＝6.8Hz)。
步骤3：合成3-(乙基((反)-4-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)环己基)氨基)-2-甲基-5-(3-吗啉代丙-1-炔-1-基)苯甲酸甲酯：
向5-溴-3-(乙基((反)-4-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)环己基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯(30g，68.02mmol)、4-(丙-2-炔-1-基)吗啉(25.51g，204mmol)和三乙胺(20.61g，204mmol)于DMF(300mL)中的溶液中鼓入氩气20分钟。然后添加CuI(3.87g，20.36mmol)和Pd(PPh3)4(7.85g，6.79mmol)并且使氩气再鼓泡20分钟。将反应混合物在105℃下加热4小时并且然后冷却到室温。用水(100mL)淬灭反应物并且用10％MeOH/DCM(400mL×3)萃取水相。经合并的有机萃取物用Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱纯化残余物，从而获得标题化合物(21g，63.7％产率)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ7.46(s,1H),7.32(s,1H),3.82(s,3H),3.62-3.57(m,6H),3.50(s,2H),3.35-3.32(m,2H),3.21(s,3H),3.17(m,1H),3.05(q,2H),2.61-2.58(m,2H),2.38(s,3H),2.33(m,1H),2.18(m,2H),1.77-1.70(m,4H),1.36-1.20(m,4H),0.77(t,3H,J＝6.8Hz),3H并入在溶剂峰中。
步骤4：合成N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-(乙基((反)-4-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)环己基)氨基)-2-甲基-5-(3-吗啉代丙-1-炔-1-基)苯甲酰胺：
向3-(乙基((反)-4-((2-甲氧基乙基)(甲基)氨基)环己基)氨基)-2-甲基-5-(3-吗啉代丙-1-炔-1-基)苯甲酸甲酯(21g，43.29mmol)于EtOH(100mL)中的溶液中添加NaOH水溶液(2.59g，64.91mmol，在10mL H2O中)并且在60℃下搅拌1小时。在反应完成之后，在减压下去除乙醇并且使用稀HCl，使用柠檬酸，将残余物酸化到pH 4。使用10％MeOH/DCM(200mL×3)执行萃取。干燥、浓缩经合并的有机层，得到对应的酸(15.5g，76％产率)。
向以上的酸(15.5g，32.90mmol)于DMSO(50mL)中的溶液中添加3-(氨甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(10g，65.80mmol)和三乙胺(23mL，164.5mmol)。在室温下搅拌反应混合物15分钟，然后在0℃下向其中添加PyBop(25.66g，49.34mmol)并且在室温下进一步搅拌过夜。完成后，将反应物质倒入冰水(100mL)中并且使用10％MeOH/DCM(200mL×3)执行萃取。经合并的有机层用Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。用MeOH:DCM洗脱，通过碱性氧化铝柱色谱纯化粗化合物，从而获得标题化合物(11g，55.3％产率)。
LCMS：606.50(M+1)+；1H NMR(MeOD,400MHz)δ7.23(s,1H),7.09(s,1H),6.11(s,1H),4.46(s,2H),3.74-3.72(m,4H),3.51(s,2H),3.47(t,2H,J＝5.6Hz,),3.32(s,3H),3.07(q,2H,J＝7.2Hz),2.64-2.63(m,7H),2.38(m,1H),2.37(s,3H),2.27(s,3H),2.26(s,3H),2.25(s,3H),1.89-1.86(m,4H),1.50-1.30(m,4H),0.83(t,3H,J＝7.2Hz)。
化合物105：
5-溴-2-甲基-3-[(噁烷-4-基)氨基]苯甲酸甲酯
向3-氨基-5-溴-2-甲基苯甲酸甲酯(40.2g，165mmol)于CH2Cl2(500mL)和AcOH(60mL)中的搅拌溶液中添加二氢-2H-吡喃-4-酮(17.3g，173mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(73.6g，330mmol)。在室温下搅拌反应混合物20小时。然后添加饱和NaHCO3水溶液并且分离混合物。用CH2Cl2萃取水层并且在真空中浓缩经合并的有机层。用乙基醚湿磨残余物，并且收集所得沉淀，从而获得呈白色固体状的标题化合物(39.1g，72％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm；7.01(s,1H),6.98(s,1H),5.00(d,J＝7.6Hz,1H),3.84-3.87(m,2H),3.79(s,3H),3.54-3.56(m,1H),3.43(m,2H),2.14(s,3H),1.81-1.84(m,2H),1.47-1.55(m,2H)。
5-溴-3-[乙基(噁烷-4-基)氨基]-2-甲基苯甲酸甲酯
向5-溴-2-甲基-3-[(噁烷-4-基)氨基]苯甲酸甲酯(39.1g，119mmol)于CH2Cl2(400mL)和AcOH(40mL)中的搅拌溶液中添加乙醛(24.7g，476mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(79.6g，357mmol)。在室温下搅拌反应混合物24小时。然后添加饱和NaHCO3水溶液并且分离混合物。用CH2Cl2萃取水层并且在真空中浓缩经合并的有机层。通过硅胶柱色谱(SiO2庚烷/EtOAc＝3/1)纯化残余物，从而得到呈粘性油状物的标题化合物(44.1g，定量产率)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm；7.62(s,1H),7.52(s,1H),3.80(m,5H),3.31(m,2H),2.97-3.05(m,2H),2.87-2.96(m,1H),2.38(s,3H),1.52-1.61(m,2H),1.37-1.50(m,2H),0.87(t,J＝6.8Hz,3H)。
4-((3-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-5-(甲氧羰基)-4-甲基苯基)乙炔基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
向5-溴-3-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-2-甲基苯甲酸甲酯(1.80g，5.05mmol)和4-乙炔基哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.80g，8.59mmol)于DMF(40ml)中的溶液中添加三乙胺(2.82ml，20.2mmol)和碘化铜(I)(0.096g，0.505mmol)。通过使氮气起泡使反应混合物脱气15分钟。然后引入四(三苯基膦)钯(0)(0.292g，0.253mmol)并且通过使氮气起泡再脱气10分钟。在80℃下加热反应混合物6小时。反应物用饱和NaHCO3淬灭，用TBME(3×40mL)萃取，用Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。通过色谱(0％到40％AcOEt/庚烷)纯化残余物，从而得到标题化合物(2.40g，98％产率)。1H-NMR(500MHz)δppm；7.65(s,1H),7.28(s,1H),3.97(brd,J＝11.3Hz,2H),3.90(s,3H),3.76(m,2H),3.34(dt,J＝2.0,11.7Hz,2H),3.24(ddd,J＝3.4,8.8,12.2Hz,2H),3.08(brs,2H),2.98(brs,1H),2.80(dddd,J＝3.9,3.9,3.9,3.9Hz,1H),2.52(s,3H),1.87(m,2H),1.60-1.74(m,6H),1.48(s,9H),0.89(t,J＝6.8Hz,3H))；MS(ESI)[M+H]+485.4。
5-((1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基)乙炔基)-3-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-2-甲基苯甲酸
在室温下，向4-((3-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-5-(甲氧羰基)-4-甲基苯基)乙炔基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(2.4g，4.95mmol)于乙醇(20.0mL)中的溶液中添加氢氧化钠(0.565g，14.1mmol)于水(3.0ml)中的溶液。在60℃下加热反应混合物6小时。用1M HCl(5mL)淬灭反应物并且然后用过量柠檬酸溶液将pH调整到5。浓缩混合物以去除EtOH并且用AcOEt(2×40mL)萃取剩余的水相。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。通过色谱(10％-100％AcOEt/庚烷)纯化残余物，从而得到标题化合物(2.30g，99％产率)。1H-NMR(500MHz)δppm；7.82(s,1H),7.35(s,1H),3.98(brd,J＝11.3Hz,2H),3.77(m,2H),3.35(dt,J＝1.5,11.3Hz,2H),3.25(ddd,J＝3.4,8.3,12.2Hz,2H),3.11(brs,2H),3.00(brs,1H),2.81(dddd,J＝3.9,3.9,3.9,3.9Hz,1H),2.60(s,3H),1.88(m,2H),1.60-1.78(m,6H),1.48(s,9H),0.90(t,J＝6.8Hz,3H)；MS(ESI)[M+H]+471.4。
4-((3-(((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基苯基)乙炔基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在室温下，向5-((1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基)乙炔基)-3-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-2-甲基苯甲酸(1.06g，2.25mmol)于DMSO(5.8mL)中的溶液中添加三乙胺(0.90mL，6.44mmol)和(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲铵氯化物(0.405g，2.15mmol)。澄清溶液变成非均质。然后添加HOBT(0.493g，3.22mmol)和EDC(0.617g，3.22mmol)并且在室温下搅拌所得反应混合物过夜。用水(80mL)淬灭反应物并且在室温下搅拌浆料1小时。过滤浆料并且用水(2×20mL)洗涤滤饼。在真空中干燥所收集的固体，从而得到标题化合物(1.27g，98％产率)。1H-NMR(500MHz,CD3OD)δppm；7.22(s,1H),7.08(d,J＝1.0Hz 1H),6.11(s,1H),4.45(s,2H),3.92(brd,J＝10.8Hz,2H),3.78(dd,J＝4.4,5.4Hz,1H),3.75(dd,J＝4.4,5.4Hz,1H),3.36(t,J＝11.7Hz,2H),3.21(br t,J＝8.3Hz,2H),3.07(q,J＝7.3Hz,2H),3.01(dddd,J＝3.9,3.9,11.3,11.3Hz,1H),2.84(dddd,J＝3.4,3.4.3.9,3.9Hz,1H),2.38(s,3H),2.28(s,3H),2.25(s,3H),1.88(m,2H),1.70((brd,J＝12.2Hz,2H),1.60(m,4H),1.47(s,9H),0.87(t,J＝7.3Hz,3H)；MS(ESI)[M+H]+605.6。
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-2-甲基-5-(哌啶-4-基乙炔基)苯甲酰胺
在20℃下，向4-((3-(((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)氨基甲酰基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基苯基)乙炔基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(250mg，0.413mmol)于DCM(3mL)中的溶液中添加4M HCl/1,4-二噁烷(3mL，12.0mmol)。在20℃下搅拌混合物1小时。LCMS表明反应完全。直接浓缩反应混合物并且将残余物溶解于DCM中并且然后用饱和NaHCO3/盐水中和。干燥(Na2SO4)并且过滤有机层。并且浓缩滤液。残余物(209mg，100％)不经进一步纯化即用于烷基化。1H-NMR(500MHz,CD3OD)δppm 7.21(brs,1H),7.07(brs,1H),6.11(s,1H),4.46(s,2H),3.95-3.89(m,2H),3.39-3.34(m,2H),3.08(q,J＝7.0Hz,2H),3.06-2.98(m,3H),2.79-2.72(m,1H),2.72-2.65(m,2H),2.38(s,3H),2.28(s,3H),2.25(s,3H),1.94-1.88(m,2H),1.73-1.68(m,2H),1.68-1.56(m,4H),0.85(t,J＝7.0Hz,3H)；MS(ESI)[M+H]+505.5。
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-2-甲基-5-((1-甲基哌啶-4-基)乙炔基)苯甲酰胺
在0℃下，向N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-3-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-2-甲基-5-(哌啶-4-基乙炔基)苯甲酰胺(100mg，0.198mmol)于甲醇(5mL)中的溶液中添加35％甲醛/H2O(0.155mL，1.98mmol)。在0℃下搅拌10分钟之后，添加氰基硼氢化钠(24.9mg，0.396mmol)。在0℃下搅拌所得混合物1小时。LCMS表明反应完全。反应物用饱和NaHCO3/盐水淬灭并且用EtAOc/庚烷萃取。干燥(Na2SO4)有机层，过滤并且浓缩。通过色谱(10g柱，MeOH/DCM＝1:9，并且然后是MeOH/含7M NH3的MeOH/DCM＝1:1:8)纯化残余物，从而获得标题化合物(96.0mg，93％)。1H-NMR(500MHz,CD3OD)δppm 7.22(brs,1H),7.08(brs,1H),6.10(s,1H),4.46(s,2H),3.94-3.87(m,2H),3.35-3.30(m,2H),3.07(q,J＝7.0Hz,2H),3.04-2.97(m,1H),2.79-2.71(m,2H),2.67-2.58(m,1H),2.38(s,3H),2.28(s,3H),2.28(s,3H),2.25(s,3H),2.28-2.21(m,2H),1.97-1.91(m,2H),1.78-1.67(m,4H),1.64-1.54(m,2H),0.85(t,J＝7.0Hz,3H)；MS(ESI)[M+H]+519.4。
实例2：生物分析方案和通用方法
野生型和突变型PRC2酶分析的方案
通用材料.S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、S-腺苷高半胱氨酸(SAH)、二甘氨酸、KCl、Tween20、二甲亚砜(DMSO)和牛皮明胶(BSG)以可能的最高纯度水平购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。二硫苏糖醇(DTT)购自EMD。3H-SAM以80Ci/mmol的比活性购自美国放射性标记化学品(American Radiolabeled Chemicals)。384孔链霉亲和素闪光培养板(streptavidin Flashplate)购自珀金埃尔默(PerkinElmer)。
底物.代表含有未经修饰的赖氨酸27(H3K27me0)或二甲基化赖氨酸27(H3K27me2)的人类组蛋白H3残基21-44的肽由21世纪生物化学品(21st Century Biochemicals)用C端G(K-生物素)连接子-亲和性标记基元和C端酰胺帽合成。所述肽经高效液相色谱(HPLC)纯化到大于95％纯度并且通过液相色谱-质谱(LC-MS)证实。下文列出序列。
H3K27me0：ATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGGK(生物素)-酰胺(SEQ ID NO:101)
H3K27me2：ATKAARK(me2)SAPATGGVKKPHRYRPGGK(生物素)-酰胺(SEQ ID NO:102)
根据已确立的程序从鸡血中纯化鸡红细胞寡核小体。
重组PRC2复合物.人类PRC2复合物使用杆状病毒表达系统以在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，sf9)细胞中共表达的4组分酶复合物的形式纯化。所表达的亚基是野生型EZH2(NM_004456)或由野生型EZH2构筑体产生的EZH2Y641F、N、H、S或C突变体、EED(NM_003797)、Suz12(NM_015355)和RbAp48(NM_005610)。EED亚基含有N端FLAG标记，其用于从sf9细胞溶解物中纯化全部4组分复合物。复合物的纯度满足或超出95％，如通过SDS-PAGE和安捷伦生物分析仪(Agilent Bioanalyzer)分析所测定。酶储备浓缩物的浓度(通常是0.3-1.0mg/mL)使用布莱德福分析(Bradford assay)对照牛血清白蛋白(BSA)标准物测定。
对肽底物的PRC2酶分析的通用程序.分析均在使用当天制备的由20mM二甘氨酸(pH＝7.6)、0.5mM DTT、0.005％BSG和0.002％Tween20组成的缓冲液中进行。使用配备有384通道移液管头的Platemate 2×3(赛默(Thermo))将含化合物的100％DMSO(1μL)点样到聚丙烯384孔V形底培养板(葛莱娜(Greiner))中。将DMSO(1μL)添加到第11、12、23、24列、第A-H行以用于最大信号对照，并且将PRC2的已知产物和抑制剂SAH(1μL)添加到第11、12、23、24列、第I-P行以用于最小信号对照。通过Multidrop Combi(赛默)添加含有野生型PRC2酶和H3K27me0肽或Y641突变型酶与H3K27me2肽中的任一者的混合液(40μL)。允许化合物与PRC2一起在25℃下孵育30分钟，接着添加含有非放射性和3H-SAM的混合物的混合液(10μL)以引发反应(最终体积＝51μL)。在所有情况下，最终浓度如下：野生型或突变型PRC2酶是4nM，最小信号对照孔中的SAH是1mM，并且DMSO浓度是1％。其余组分的最终浓度指示在以下表2中。通过添加非放射性SAM(10μL)到600μM的最终浓度停止分析，其将3H-SAM稀释到其在肽底物中的并入不再可检测的程度。接着，将384孔聚丙烯培养板中的50μL反应物转移到384孔闪光培养板中，并且允许生物素化肽结合于链霉亲和素表面至少1小时，随后用0.1％Tween20在伯腾(Biotek)ELx405培养板洗涤器中洗涤三次。接着，在珀金埃尔默TopCount读板仪中读取培养板，以测量结合于闪光培养板表面的3H标记的肽的数量，按每分钟衰变数(dpm)或可替代地称为每分钟计数(cpm)测量。
表2：基于EZH2特性(野生型或Y641突变型EZH2)的每一分析变化形式的组分的最终浓度
对寡核小体底物的野生型PRC2酶分析的通用程序.分析在使用当天制备的由20mM二甘氨酸(pH＝7.6)、0.5mM DTT、0.005％BSG、100mM KCl和0.002％Tween20组成的缓冲液中进行。使用配备有384通道移液管头的Platemate 2×3(赛默)将含化合物的100％DMSO(1μL)点样到聚丙烯384孔V形底培养板(葛莱娜)中。将DMSO(1μL)添加到第11、12、23、24列、第A-H行以用于最大信号对照，并且将PRC2的已知产物和抑制剂SAH(1μL)添加到第11、12、23、24列、第I-P行以用于最小信号对照。通过Multidrop Combi(赛默)添加含有野生型PRC2酶和鸡红细胞寡核小体的混合液(40μL)。允许化合物与PRC2一起在25℃下孵育30分钟，接着添加含有非放射性和3H-SAM的混合物的混合液(10μL)以引发反应(最终体积＝51μL)。最终浓度如下：野生型PRC2酶是4nM，非放射性SAM是430nM，3H-SAM是120nM，鸡红细胞寡核小体是120nM，最小信号对照孔中的SAH是1mM，并且DMSO浓度是1％。分析通过添加非放射性SAM(10μL)到600μM的最终浓度来停止，其将3H-SAM稀释到其在鸡红细胞寡核小体底物中的并入不再可检测的程度。接着，将384孔聚丙烯培养板中的50μL反应物转移到384孔闪光培养板中，并且使鸡红细胞核小体固定于培养板表面，接着用0.1％Tween20在伯腾ELx405培养板洗涤器中洗涤所述培养板三次。接着，在珀金埃尔默TopCount读板仪中读取培养板，以测量结合于闪光培养板表面的3H标记的鸡红细胞寡核小体的数量，按每分钟衰变数(dpm)或可替代地称为每分钟计数(cpm)测量。
抑制％计算
其中dpm＝每分钟衰变数，cmpd＝分析孔中的信号，并且min和max是对应的最小和最大信号对照。
四参数IC50拟合
其中顶部和底部通常允许浮动，但在3参数拟合中可分别固定在100或0处。希尔系数(Hill Coefficient)通常允许浮动，但在3参数拟合中也可固定在1处。Y是抑制％，并且X所述化合物浓度。
对肽底物的PRC2酶分析(例如EZH2野生型和Y641F)的IC50值呈现在以下表3中。
WSU-DLCL2甲基化分析
WSU-DLCL2悬浮细胞购自DSMZ(德国不伦瑞克的德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,Braunschweig,Germany))。RPMI/Glutamax培养基、青霉素-链霉素、热灭活胎牛血清和D-PBS购自美国纽约州格兰德岛的生命技术公司(Life Technologies,Grand Island,NY,USA)。提取缓冲液和中和缓冲液(5×)购自美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的活性基元公司(Active Motif,Carlsbad,CA,USA)。兔抗组蛋白H3抗体购自美国马萨诸塞州剑桥的艾碧康公司(Abcam,Cambridge,MA,USA)。兔抗H3K27me3和HRP结合的抗兔IgG购自美国马萨诸塞州丹佛斯的细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA)。TMB“超灵敏(SuperSensitive)”底物来源于美国马里兰州奥因斯米尔斯的BioFX实验室(BioFXLaboratories,Owings Mills,MD,USA)。无IgG牛血清白蛋白购自美国宾夕法尼亚州西格罗夫的杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,USA)。具有Tween的PBS(10×PBST)购自美国马里兰州盖瑟斯堡的KPL公司(KPL,Gaithersburg,MD,USA)。硫酸购自美国德克萨斯州阿林顿的瑞卡化学公司(Ricca Chemical,Arlington,TX,USA)。Immulon ELISA培养板购自美国纽约州罗契斯特的赛默公司(Thermo,Rochester,NY,USA)。V型底细胞培养板购自美国纽约州康宁的康宁公司(Corning Inc.,Corning,NY,USA)。V型底聚丙烯培养板购自美国北卡罗来纳州门罗的葛莱娜第一生化公司(Greiner Bio-One,Monroe,NC,USA)。
将WSU-DLCL2悬浮细胞维持在生长培养基(补充有10％v/v热灭活胎牛血清和100单位/毫升青霉素-链霉素的RPMI 1640)中并且在37℃下在5％CO2下培养。在分析条件下，在37℃下在5％CO2下在培养板振荡器上在分析培养基(补充有20％v/v热灭活胎牛血清和100单位/毫升青霉素-链霉素的RPMI 1640)中孵育细胞。
将WSU-DLCL2细胞以50,000个细胞/毫升的浓度接种于分析培养基中，以每孔200μL接种于96孔V型底细胞培养板中。将来自96孔来源培养板的化合物(1μL)直接添加到V型底细胞培养板中。将培养板在滴定培养板振荡器上在37℃、5％CO2下孵育96小时。孵育四天后，培养板以241×g旋转五分钟，并且在不扰乱细胞球粒的情况下从细胞培养板的每一孔中轻轻地抽吸培养基。将球粒再悬浮于200μL DPBS中，并且培养板以241×g再旋转五分钟。抽吸上清液，并且每孔添加冷(4℃)提取缓冲液(100μL)。将培养板在4℃下在定轨振荡器上孵育两小时。培养板以3427×g旋转10分钟。将上清液(80μL/孔)转移到96孔V型底聚丙烯培养板中的其对应孔中。将中和缓冲液5×(20μL/孔)添加含有上清液的V型底聚丙烯培养板中。在定轨振荡器上孵育含有粗组蛋白制备物(CHP)的V型底聚丙烯培养板五分钟。将粗组蛋白制备物(2μL/孔)添加到含有100μL涂布缓冲液(1×PBS+BSA 0.05％w/v)的一式两份96孔ELISA培养板中的每一对应孔中。将培养板密封并且在4℃下孵育过夜。第二天，用每孔300μL 1×PBST洗涤培养板三次。各孔用每孔300μL ELISA稀释剂((PBS(1×)BSA(2％w/v)和Tween20(0.05％v/v))封闭两小时。培养板用1×PBST洗涤三次。对于组蛋白H3检测培养板，每孔添加100μL在ELISA稀释剂中1:10,000稀释的抗组蛋白H3抗体(艾碧康，ab1791)。对于H3K27三甲基化检测培养板，每孔添加100μL在ELISA稀释剂中1:2000稀释的抗H3K27me3。培养板在室温下孵育90分钟。用每孔300μL 1×PBST洗涤培养板三次。对于组蛋白H3检测，每孔添加100μL在ELISA稀释剂中1:6000稀释的HRP结合的抗兔IgG抗体。对于H3K27me3检测，每孔添加100μL在ELISA稀释剂中1:4000稀释的HRP结合的抗兔IgG抗体。培养板在室温下孵育90分钟。用每孔300μL 1×PBST洗涤培养板四次。每孔添加100μL TMB底物。组蛋白H3培养板在室温下孵育五分钟。H3K27me3培养板在室温下孵育10分钟。反应用硫酸1N(每孔100μL)停止。每一培养板的吸光度在450nm下读取。
首先，通过下式测定每一孔的比率：
每一培养板包括八个仅DMSO处理的对照孔(最小抑制)以及八个用于最大抑制的对照孔(背景孔)。
计算每一对照类型的比率值的平均值，并且将其用于测定培养板中每一测试孔的抑制百分比。测试化合物在DMSO中连续稀释三倍，总共十个测试浓度，以25μM开始。测定抑制百分比，并且根据化合物浓度使用一式两份孔产生IC50曲线。以下表3中呈现此分析的IC50值。
细胞增殖分析
WSU-DLCL2悬浮细胞购自DSMZ(德国不伦瑞克的德国微生物和细胞培养物保藏中心)。RPMI/Glutamax培养基、青霉素-链霉素、热灭活胎牛血清购自美国纽约州格兰德岛的生命技术公司。V型底聚丙烯384孔培养板购自美国北卡罗来纳州门罗的葛莱娜第一生化公司。细胞培养384孔白色不透明培养板购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默公司(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)。Cell-Titer购自美国威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega Corporation,Madison,WI,USA)。SpectraMax M5读板仪购自美国加利福尼亚州森尼韦尔的分子装置有限责任公司(Molecular Devices LLC,Sunnyvale,CA,USA)。
将WSU-DLCL2悬浮细胞维持在生长培养基(补充有10％v/v热灭活胎牛血清的RPMI1640)中并且在37℃下在5％CO2下培养。在分析条件下，在37℃下在5％CO2下在分析培养基(补充有20％v/v热灭活胎牛血清和100单位/毫升青霉素-链霉素的RPMI 1640)中孵育细胞。
为了评定化合物对WSU-DLCL2细胞系的增殖的作用，将呈指数生长的细胞以1250个细胞/毫升的密度在最终体积50μl的分析培养基中接种于384孔白色不透明培养板中。化合物来源培养板通过在DMSO中执行一式三份九点3倍连续稀释来制备，以10mM开始(分析中化合物的最终最高浓度是20μM，并且DMSO是0.2％)。将来自化合物储备液培养板的100nL等分试样添加到细胞培养板中的其对应孔中。100％抑制对照由用200nM最终浓度的星形孢菌素处理的细胞组成，并且0％抑制对照由DMSO处理的细胞组成。添加化合物后，在37℃、5％CO2、相对湿度>90％下孵育分析培养板6天。通过量化细胞培养物中存在的ATP，将35μl CellTiter试剂添加到细胞培养板中来测量细胞存活率。在SpectraMax M5中读取发光。抑制细胞存活率50％的浓度使用归一化剂量反应曲线的4参数拟合来测定。以下表3中也呈现此分析的IC50值。这些化合物的质谱数据也在以下表3中列出。
表3
实例3：最低细胞毒性浓度(LCC)的推导
已明确细胞增殖经由细胞分裂进行，这引起细胞在分裂之后的数量相对于细胞在分裂之前的数量倍增。在一组固定的环境条件(例如pH、离子强度、温度、细胞密度、蛋白质与生长因子的培养基含量等)下，细胞将通过连续倍增(即，分裂)根据以下方程式增殖，其限制条件是可获得足够的营养物和其它所需因子。
其中Nt是在观察阶段开始之后在时间点(t)下的细胞数量，N0是在观察阶段开始时的细胞数量，t是在观察阶段开始之后的时间，并且tD是细胞倍增所需的时间间隔，也称为倍增时间。方程式A.1可转换为更便利的以e为底数利用等式0.693＝ln(2)的指数方程式形式。
细胞增殖的速率常数(kp)与倍增时间如下成反比相关。
合并方程式A.2和A.3，得到，
因此，根据方程式A.4，预期细胞数量在称为对数生长期的早期细胞生长阶段期间随时间推移呈指数增加。如方程式A.4的指数方程式可通过采用每一侧的自然对数进行线性化。
ln(Nt)＝ln(N0)+kpt (A.5)
因此，预期ln(Nt)随时间而变的曲线图得到斜率等于kp并且y-截距等于ln(N0)的上升直线。
环境条件的变化可引起细胞增殖速率的变化，其可作为增殖速率常数kp的变化定量。可引起增殖速率变化的条件有在观察阶段开始时(即，在t＝0时)将抗增殖化合物引入系统。当抗增殖化合物对细胞增殖即刻有影响时，预期ln(Nt)随时间而变的曲线图将在所有化合物浓度下持续为线形的，并且在化合物浓度递增时kp值递减。
取决于抗增殖作用的机制基础，一些化合物可能不会立即实现增殖速率的变化。取而代之，在实现化合物的影响之前可能存在潜伏期。在此类情况下，ln(Nt)随时间而变的曲线图将呈现双相，并且化合物影响开始的时间点可被标识为各相之间的断点。与化合物对增殖的影响是即刻的还是在潜伏期之后开始无关，在每一化合物浓度下的增殖速率常数最佳由从化合物影响开始的时间点到实验观察阶段结束的ln(Nt)对时间曲线的斜率定义。
施加到生长细胞的化合物可能以两种通用方式中的一者影响观察到的增殖：通过抑制进一步细胞分裂(细胞生长抑制性)或通过细胞杀伤(细胞毒性)。如果化合物是细胞生长抑制性的，那么化合物浓度递增将使kp值减小，直到不存在进一步细胞分裂。此时，细胞生长速率并且因此kp值将为零。另一方面，如果化合物是细胞毒性的，那么kp值将由两个速率常数组成：在化合物存在下继续细胞生长的速率常数(kg)和细胞被化合物杀伤的速率常数(kd)。因此，在固定化合物浓度下增殖的总速率常数将为这些相对的速率常数的绝对值之间的差值。
kp＝|kg|-|kd| (A.6)
在细胞生长速率超过细胞杀伤速率的化合物浓度下，kp值将具有正值(即，kp>0)。在细胞生长速率小于细胞杀伤速率的化合物浓度下，kp值将具有负值(即，kp<0)，并且细胞数量将随时间的推移减少，指示稳定的细胞毒性。当kg恰好与kd相符时，那么总增殖速率常数kp的值将为零。我们可由此将最低细胞毒性浓度(LCC)定义为使得kp值等于零的化合物浓度，因为大于此浓度的任何浓度都将引起可清楚观察到的细胞毒性。注意：在低于LCC的浓度下，很可能出现细胞杀伤，但在小于剩余细胞增殖速率的速率下。这里的处理并不打算定义化合物作用的生物学详情。确切地说，这里的目的仅仅是定义使用其来客观定量细胞杀伤速率超过新细胞生长的化合物浓度的实际参数。实际上，LCC表示高于其就会观察到明白的细胞毒性的断点或临界浓度，而非细胞毒性浓度本身。在这点上，LCC可与其它物理断点度量值类似地查看，如用于定义高于其所有分子就均并入到胶束结构中的脂质、去垢剂或其它表面活性剂物质的浓度的临界胶束浓度(CMC)。
传统上，抗增殖化合物对细胞生长的影响已最常利用IC50值定量，所述值被定义为将细胞增殖速率降低到在不存在化合物的情况下(即，对于媒剂或溶剂对照样品)所观察到的浓度的一半的化合物浓度。然而，IC50并不允许研究者区分细胞生长抑制性与细胞毒性化合物。相比之下，LCC易于允许进行此类区分，并且进一步定量过渡到发生稳定细胞毒性行为时的浓度。
如果将观察时间窗口限制在影响开始与实验结束之间，那么数据将在按ln(Nt)随时间而变绘制(参见上文)时通常充分拟合线形方程式。从此类拟合，可在所测试的每一化合物浓度下测定kp值。kp值随化合物浓度([I])而变的重制曲线将具有递减等温线形式，具有在[I]＝0下的最大值kmax(由媒剂或溶剂对照样品定义)和在无穷大化合物浓度下的最小值kmin。
其中Imid是得到在kmax与kmin值之间中间位置的kp值的化合物浓度(应注意，Imid值与IC50不同，除了在完全和纯粹细胞生长抑制性化合物的情况下)。因此，将重制曲线数据拟合方程式A.7得到kmax、kmin和Imid的估算值。如果化合物是细胞生长抑制性的(如本文中所定义)，那么kmin值不可小于零。对于细胞毒性化合物，kmin将小于零，并且kmin的绝对值将与化合物杀伤细胞的有效性直接相关。
从方程式A.7推导的拟合值也可用于测定LCC值。通过定义，在[I]＝LCC时，kp＝0。因此，在这些条件下，方程式A.7变为
方程式A.8的代数重排得到LCC的方程式。
此分析仅仅用非线性曲线拟合软件实施，并且可在整个药物发现和发展过程中在化合物活性的细胞分析期间应用。以此方式，LCC可为化合物SAR(结构-活性关系)的评定提供有价值的量度。
实例4：体内分析
小鼠
雌性逐狐(Fox Chase)小鼠(CB 17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl，查尔斯河实验室(Charles River Laboratories))或无胸腺裸小鼠(Crl:NU(Ncr)-Foxn1nu，查尔斯河实验室)在研究的第1天是8周大的并且体重(BW)在16.0-21.1g范围内。动物被任意喂水(反渗透1ppm Cl)和由18.0％粗蛋白、5.0％粗脂肪和5.0％粗纤维组成的NIH 31改变并且照射过的Lab小鼠在照射过的Enrich o'cobsTM垫料上在静态微型隔离笼中在20-22℃(68-72℉)和40-60％湿度下按12小时光周期圈养。关于限制、饲养、手术程序、喂食与流体调节和兽医学照护的所有程序均符合《实验动物照护与使用指南》(Guide for Care andUse of Laboratory Animals)的建议。
肿瘤细胞培养
人类淋巴瘤细胞系获自不同来源(ATCC、DSMZ)，例如，Karpas-422获自DSMZ。细胞系以悬浮培养物形式维持在含有100单位/毫升青霉素G钠盐、100g/mL链霉素、1％HEPES和1％L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中。培养基补充有20％胎牛血清。在含湿气孵育箱中在37℃下在5％CO2和95％空气的大气中在组织培养烧瓶中培养细胞。
体内肿瘤植入
在对数生长中期期间收集人类淋巴瘤细胞系(例如，Karpas-422细胞)，并且将其再悬浮于RPMI-1640基础培养基和50％MatrigelTM(碧迪生物科学公司(BD Biosciences))(RPMI:Matrigel＝1:1)中。每一小鼠在右侧腹皮下接受1×107个细胞(0.2mL细胞悬浮液)。随着平均体积接近所需80-120mm3范围，在两个尺寸上对肿瘤测径以监测生长。肿瘤大小(mm3)由下式计算：
其中w＝肿瘤的宽度并且l＝肿瘤的长度(mm)。肿瘤重量可用1mg相当于1mm3肿瘤体积的假设估算。在10-30天之后，将具有145-150mm3肿瘤的小鼠分选到处理组中，并且平均肿瘤体积为147mm3。
测试物品
测试化合物储存在室温下并且避光。在每一处理日，通过将粉末悬浮在含0.5％羧甲基纤维素钠(NaCMC)和0.1％80的去离子水中来制备新鲜化合物调配物。媒剂(含0.5％NaCMC和0.1％80的去离子水)用于在相同的时程下处理对照组。调配物在投与之前在4℃下避光储存。除非另外规定，否则在此实验中提及并且测试的化合物是呈在此段落中提及的其特定盐形式。
处理计划
小鼠通过口服管饲以在62.5-500mg/kg范围内的化合物剂量以BID(一天2次，每12小时)时程处理不同的天数。每一剂量以0.2mL/20g小鼠(10mL/kg)的体积递送，并且针对个别动物最后一次记录的体重调节。最大处理时长是28天。
中位肿瘤体积(MTV)和肿瘤生长抑制(TGI)分析
在最后一个处理日测定处理功效。测定每一组的可在最后一天评估的针对动物数量n的中位肿瘤体积MTV(n)。肿瘤生长抑制百分比(TGI％)可以数种方式定义。首先，指定对照组的MTV(n)与药物处理组的MTV(n)之间的差值表示为对照组的MTV(n)的百分比：
计算TGI％的另一方式是考虑肿瘤大小从第1天到第n天的变化，并且n为最后一个处理日。
ΔMTV对照＝MTV(n)对照-MTV(1)对照
ΔMTV经处理＝MTV(n)经处理-MTV(1)经处理
毒性
在第1-5天每天称重动物，并且接着每周两次直到完成研究。时常检查小鼠的任何有记载的不良的、处理相关的副作用的明显征象。最大耐受剂量(MTD)的可接受毒性被定义为在测试期间组平均BW损失小于20％，并且因TR死亡所致的死亡率不超过10％。死亡在其可归因于如由临床征象和/或尸检证明的处理副作用或归因于在给药阶段期间的未知原因时被归类为TR。死亡在有迹象表明死亡与处理副作用不相关时被归类为NTR。在给药间隔期间的NTR死亡将通常归类为NTRa(归因于事故或人为差错)或NTRm(归因于尸检证实的肿瘤通过侵袭和/或癌转移引起的扩散)。在给药阶段期间死于未知原因的经口处理的动物在组表现并不支持TR分类并且尸检(为了排除给药错误)不可行时可归类为NTRu。
采样
在第7天或第28天，在研究期间，以预先规定的方式对小鼠进行取样以评定肿瘤的目标抑制。在无RNA酶条件下从指定的小鼠收集肿瘤，并且将其平分。来自每一动物的冷冻肿瘤组织在液N2中快速冷冻，并且用研钵和研杵粉碎。
统计和图形分析
所有统计和图形分析均用视窗(Windows)的Prism 3.03(格拉夫帕德(GraphPad))进行。为了测试经整个处理时程在对照与处理组之间的统计显著性，相继通过重复测量ANOVA检验、邓尼特多重比较事后检验(Dunnets multiple comparison post test)或2因子ANOVA检验。Prism将结果报导为：在P>0.05时不显著(ns)，在0.01<P<0.05时显著(利用“*”表现)，在0.001<P<0.01时非常显著(“**”)，以及在P<0.001时极其显著(“***”)。
组蛋白提取
为了分离组蛋白，将60-90mg肿瘤组织在1.5ml核提取缓冲液(10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、25mM KCl、1％Triton X-100、8.6％蔗糖加上罗氏(Roche)蛋白酶抑制剂片剂1836145)中均质化，并且在冰上孵育5分钟。细胞核通过在4℃下在600g下离心5分钟来收集，并且在PBS中洗涤一次。移出上清液，并且在每15分钟涡旋的情况下用0.4N冷硫酸抽提组蛋白一小时。提取物通过在4℃下在10000g下离心10分钟来澄清，并且转移到含有10×体积冰冷丙酮的新鲜微量离心机管中。组蛋白在-20℃下沉淀2小时到过夜，通过在10000g下离心10分钟来粒化，并且再悬浮于水中。
ELISA
组蛋白在涂布缓冲液(PBS+0.05％BSA)中以当量浓度制备，得到0.5ng/μL样品，并且将100μL样品或标准物一式两份地添加2个96孔ELISA培养板(赛默雷勃(ThermoLabsystems)，Immulon 4HBX#3885)中。将培养板密封并且在4℃下孵育过夜。第二天，培养板用300微升/孔PBST(PBS+0.05％Tween 20；10×PBST，KPL#51-14-02)在伯腾培养板洗涤器上洗涤3次。培养板用300微升/孔稀释剂(PBS+2％BSA+0.05％Tween 20)封闭，在室温下孵育2小时，并且用PBST洗涤3次。所有抗体均在稀释剂中稀释。将100微升/孔抗H3K27me3(CST#9733，50％甘油储备液1:1,000)或抗总H3(艾碧康ab1791，50％甘油1:10,000)添加到每一培养板中。在室温下孵育培养板90分钟，并且用PBST洗涤3次。将100微升/孔的抗-Rb-IgG-HRP(细胞信号传导技术公司，7074)1:2,000添加到H3K27Me3培养板中，并且1:6,000添加到H3培养板中，并且在室温下孵育90分钟。培养板用PBST洗涤4次。为了检测，添加100微升/孔TMB底物(BioFx实验室(BioFx Laboratories)，#TMBS)，并且在室温下在暗处孵育培养板5分钟。反应用100微升/孔1N H2SO4停止。在SpectraMax M5微量板读取器上在450nm下读取吸光度。
7天PD研究
为了测试化合物是否可在体内调节肿瘤中的H3K27me3组蛋白标志，携有Karpas-422异种移植肿瘤的小鼠用化合物以62.5、83.3、125、166.7、250、333.3或500mg/kg BID或媒剂(BID时程)处理7天。每组5只动物。动物在最后一次剂量后3小时安乐死，并且肿瘤如上文所述以冷冻状态保藏。在组蛋白提取之后，将样品施加到使用针对三甲基化态的组蛋白H3K27(H3K27me3)或总组蛋白H3的抗体的ELISA分析中。基于这些数据，计算总体甲基化与总H3K27的比率。如通过ELISA测量的所有组的平均总体甲基化比率指示与媒剂相比的目标抑制范围。此实验的设计示出在表4A中。
表4A给药时程
组次 数量 处理 剂量(mg/kg) 给药体积 给药途径 时程
1 5 媒剂 -- 10μl/g. 口服 BID×7
2 5 化合物1 62.5 10μl/g 口服 BID×7
3 5 化合物1 83.3 10μl/g 口服 BID×7
4 5 化合物1 125 10μl/g 口服 BID×7
5 5 化合物1 166.7 10μl/g 口服 BID×7
6 5 化合物1 250 10μl/g 口服 BID×7
7 5 化合物1 333.3 10μl/g 口服 BID×7
8 5 化合物1 500 10μl/g 口服 BID×7
9 5 化合物A* 125 10μl/g. 口服 BID×7
10 5 化合物A 250 10μl/g. 口服 BID×7
*化合物A是N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4'-(吗啉代甲基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺。
实例5：在Karpas-422异种移植模型中在递增剂量下的功效研究
为了测试化合物是否可以在体内诱导抗肿瘤作用，携有Karpas-422异种移植肿瘤的小鼠用化合物以例如62.5、125、250或500mg/kg BID处理28天。关于实验的功效组，每组10只小鼠。测量媒剂和测试化合物处理组经28天处理疗程的肿瘤生长。
关于功效组(两组均在最后一次给药之后3小时)，从在第28天研究结束时收集的肿瘤提取组蛋白。针对以剂量依赖性方式的处理调节，评定H3K27me3甲基标志。
此实验的设计示出在表4B中。
表4B给药方案
组次 数量 处理 剂量(mg/kg) 给药体积 给药途径 时程
1 10 媒剂 -- 10μl/g. 口服 BID×28
2 10 化合物1 62.5 10μl/g 口服 BID×28
3 10 化合物1 125 10μl/g. 口服 BID×28
4 10 化合物1 250 10μl/g. 口服 BID×28
5 10 化合物1 500 10μl/g. 口服 BID×28
6 10 化合物A* 250 10μl/g. 口服 BID×28
*化合物A是N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4'-(吗啉代甲基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺。
通过针对长椭球体积的公式(L×W2)/2由测径规测量法计算TV，其中L和W是对应的正交长度和宽度测量值(mm)。
数据表示为平均值±标准偏差(SD)。媒剂处理组与化合物处理组之间的TV差异相继通过重复测量方差分析(ANOVA)、邓尼特型多重比较检验来分析。P<0.05的值(双侧)视为统计学上显著的。使用Prism 5软件包5.04版(美国加利福尼亚州格拉夫帕德软件公司(GraphPad Software,Inc.,CA,USA))执行统计分析。
以上研究显示，化合物1和化合物A均在Karpas-422异种移植模型中展现出肿瘤停滞和消退并且是良好耐受的。参看例如图1和2。此外，来自以上研究的化合物1或化合物A的药物动力学和药效学特性展示在图3-8中。图3是示出了在处理之后第7天或第28天肿瘤中的化合物1的浓度或在处理之后第7天肿瘤中的化合物A的浓度的图。在这个图中，“A”到“G”表示在对应地以62.5、83.3、125、166.7、250、333.3和500mg/kg的剂量投与化合物1之后的7天；“H”和“I”表示在对应地以125和250mg/kg的剂量投与化合物A之后的7天；以及“J”到“L”表示在对应地以62.5、125和250mg/kg的剂量投与化合物1之后的28天。注意：关于在第28天的样品，来自用250mg/kg化合物A处理的组和用500mg/kg化合物1处理的组的肿瘤对于分析来说过小；用250mg/kg化合物1和125mg/kg化合物1处理的组中对应地仅1/10和5/10大到足够进行分析。图4是示出了在处理之后第7天或第28天在血浆中的化合物1或化合物A的浓度的图。上方虚线表示化合物A的血浆蛋白结合(PPB)校正的LCC并且下方虚线表示化合物1的PPB校正的LCC。图5是示出了来自用化合物1或化合物A处理了7天的小鼠的KARPAS-422肿瘤中的全基因组H3K27me3甲基化的图。在这个图中，“A”表示媒剂处理；“B”到“H”表示对应地以62.5、83.3、125、166.7、250、333.3和500mg/kg的剂量用化合物1处理；以及“I”和“J”表示对应地以125和250mg/kg的剂量用化合物A处理。图6是示出了来自用化合物1处理了28天的小鼠的KARPAS-422肿瘤中的全基因组H3K27me3甲基化的图。图7是示出了来自用化合物1或化合物A处理了7天的携有KARPAS-422异种移植肿瘤的小鼠的骨髓中的全基因组H3K27me3甲基化的图。在这个图中，“A”表示媒剂处理；“B”到“H”表示对应地以62.5、83.3、125、166.7、250、333.3和500mg/kg的剂量用化合物1处理；以及“I”和“J”表示对应地以125和250mg/kg的剂量用化合物A处理。图8是示出了来自用化合物1处理了28天的携有KARPAS-422异种移植肿瘤的小鼠的骨髓中的全基因组H3K27me3甲基化的图。在这个图中，“A”表示媒剂处理；“B”到“E”表示对应地以62.5、125、250和500mg/kg的剂量用化合物1处理；以及“F”表示以250mg/kg的剂量用化合物A处理。
在以下实例6-8中，用类似于在以下各者中所描述的那些方法和技术的方法和技术执行实验和分析：例如J.林(J.Lin),《药物研究》(Pharmaceutical Research),2006,23(6):1089-1116；L.迪(L.Di)等人,《组合化学与高通量筛选》(Comb Chem High ThroughputScreen).2008,11(6):469-76；M.丰西(M.Fonsi)等人,《生物分子筛选杂志》(Journal ofBiomolecular Screening),2008,13:862；E.休格连等人,《药物代谢与处置》(Drug Metab.Dispos).2012,40:2273-2279；T.D.比约恩松(T.D.Bjornsson)等人,《药物代谢与处置》,2003,31(7):815-832；J.B.休斯顿(J.B.Houston)和K.E.肯沃西(K.E.Kenworthy),《药物代谢与处置》,2000,28(3):246-254；以及S.W.格林姆(S.W.Grimm)等人,《药物代谢与处置》,2009,37(7):1355-1370，其中每一个的内容特此以其全文引用的方式并入本文中。
实例6：肝微粒体中的代谢稳定性的评定
评估化合物1、2和105在来自五个物种的肝微粒体中的代谢稳定性，所述物种包括小鼠、大鼠、狗、猴和人类。
方法：在含有250μL总体积的96孔板中执行孵育，所述总体积由以下各者组成：100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.4)、1mg/mL肝微粒体、浓度为8的测试化合物(即，化合物1、2或105)以及2mg/mL NADPH。用于孵育的化合物的浓度在45.7nM到100μM的范围内。使用NADPH的添加来开始反应，并且在37℃下的振动型水浴中进行孵育，持续长达60分钟。通过添加相等体积的含有内标(IS)的停止溶液来终止反应。然后使样品在分析之前在冷冻离心机中在3000RPM下旋转最少5分钟。使用如通过使用LC/TOFMS测定的孵育混合物中测试化合物的损耗量来估算肝微粒体的内在清除率值。LC/TOFMS系统由以下各者构成：岛津SIL-HTC自动进样器(日本京都)、两个泵LC-20AD(岛津公司)以及柱温箱(CTO-20AC；岛津公司)与飞行时间质谱仪(加利福尼亚州福斯特市爱博才思(AB Sciex,Foster City,CA)的AB SCIEXQstar Elite)。通过Analyst QS(2.0版，加利福尼亚州福斯特市的应用生物系统公司)对用于分析的测试化合物和IS的峰面积进行积分。使用氮气碰撞活化解离(CAD)产生产物离子。优化的仪器条件是在正电离模式下。
LC/MS/MS定量是基于测试化合物的峰面积比IS的峰面积的比率。化合物1、2或105和IS的峰面积计算和积分采用Analyst QS 2.0(加利福尼亚州福斯特市的爱博才思)。使用Excel(华盛顿州雷德蒙德的微软公司(Microsoft Corp.,Redmond,WA)的Office2010)和格拉夫帕德Prism 5.02版(加利福尼亚州拉荷亚的格拉夫帕德软件公司)进行计算。基于恰当的SOP分析和报告数据，所述SOP例如在J.林,《药物研究》,2006,23(6):1089-1116；和迪L(Di L)等人,《组合化学与高通量筛选》.2008,11(6):469-76中所描述的那些。
通过绘制与时间的曲线，计算用于肝微粒体的Km和Vmax值的测试化合物的损耗量，从而测定损耗速率。然后使用恰当的动力学模型绘制损耗速率。基于方程式计算数据：
米氏方程(Michaelis-Menten)：Clint(μL/min/mg肝微粒体)＝Vmax/Km
希尔方程：Clint(μL/min/mg肝微粒体)＝Clmax＝Vmax/Ks·(n-1)/(n(n-1)1/n)
Clint(μL/min/mg肝脏)＝Clint(μL/min/mg微粒体)·比例因子或Clint(μL/分钟/106个细胞)·比例因子。
结果提供在以下表5中。
表5
所有这三种被测试的化合物(即，化合物1、2和105)都在人类肝微粒体(HLM)中展现出低代谢清除率。还观察到了代谢清除率的物种差异。食蟹猴通常显示出高于其它物种的清除率。
实例7：CYP诱导的评定
评估化合物1、2和105中的每一种在来自单个捐献者的冷冻保存的人类肝细胞中的诱导情况。
方法：肝细胞获自碧迪生物科学公司(马萨诸塞州沃本(Woburn,MA))，并且恰当的培养基和DAPI核染色剂购自生命技术公司(北卡罗来纳州德罕(Durham,NC))。杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's Medium；DMEM)、杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)、100×MEM非必需氨基酸、100×青霉素/链霉素/谷氨酰胺溶液、2×锥虫蓝购自美的泰克公司(Mediatech)(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,VA))。胎牛血清(FBS)从组织培养生物制剂公司(Tissue Culture Biologicals)(加利福尼亚州图莱里(Tulare,CA))获得。用于mRNA分析的涂有胶原蛋白的24孔板从碧迪生物科学公司(加利福尼亚州圣何塞(San Jose,CA))获得。在两个三重分析中使用预先设计好的探针和引物来评定mRNA变化。阳性对照是β-萘黄酮用于CYP1A(1和10μmol/L)，苯巴比妥用于CYP2B6(100μmol/L和1mmol/L)以及利福平用于CYP2C9和CYP3A(1和10μmol/L)。DMSO用作媒剂(阴性)对照。在处理期之后执行CYP形式特异性分析，并且对细胞进行计数以测定活力。
在37℃水浴中解冻冷冻保存的肝细胞并且根据供应商说明书接种。向含有生命技术公司的冷冻保存的肝细胞恢复培养基(CHRM)的50mL锥形管中添加一管肝细胞。使细胞在具有GH 3.8转子的贝克曼(Beckman)离心机中在800RPM下旋转10分钟。移出上清液并且将细胞再悬浮于用于计数的平板培养基中。在计数之后，使细胞以75万个活细胞/毫升再悬浮。将所述悬浮液(0.5毫升/孔)添加到涂有胶原蛋白的24孔板中，或在添加60μL含有10％FBS、青霉素/链霉素/谷氨酰胺和MEM非必需氨基酸的DMEM之后，向涂有胶原蛋白的96孔板的每个孔中添加80μL悬浮液。在涡流并且摇荡以得到更好的板覆盖率之后，将细胞放置于在5％CO2和37℃下的组织培养孵育箱中并允许贴附过夜。然后使用CellzDirect肝细胞维持培养基处理细胞。使细胞暴露于化合物1、2或105(1或10μmol/L)或媒剂中持续48小时。在处理期间，每24小时补充维持培养基和测试化合物。
在孵育完成之后，用DPBS洗涤细胞。在用DPBS洗涤之后，使用含3.7％多聚甲醛的DPBS固定细胞一小时。去除甲醛并且添加含0.6μmol/L DAPI的DPBS。用DAPI给细胞染色20分钟并且然后用DPBS洗涤三次。使用含5×物镜的ArrayScan II(宾夕法尼亚州匹兹堡的赛尔米克公司(Cellomics,Pittsburgh,PA))对细胞进行计数。使用在处理条件下发现的细胞数量除以随媒剂对照发现的细胞来计算剩余的肝细胞的分数。
在处理之后，使用来自凯杰(Qiagen)RNeasy试剂盒的缓冲液RLT溶解细胞。使用RNeasy试剂盒使用制造商的方案用DNA酶处理来分离mRNA。通过Nanodrop ND-1000(特拉华州威明顿(Wilmington,DE))测量mRNA浓度。针对捐献者内的每一个样品，将mRNA浓度归一化。用来自生命技术公司的Superscript VILO cDNA合成试剂盒根据制造商的说明执行逆转录。在cDNA合成之后，使用来自应用生物系统公司(生命技术公司的全资子公司)的7500快速实时PCR系统执行定量实时PCR。实时PCR的反应组分由以下组成：10μL塔克曼(Taqman)快速高级主混合物(生命技术公司)、2μL cDNA、5μL无核酸酶水(生命技术公司)、用于β-2微球蛋白的1μL引物限制的FAM标记分析HS00984230_m1、用于CYP1A2的1μL引物限制的VIC标记分析HS00167927_m1或用于CYP2B6的HS04183483_g1以及用于CYP2C9的1μL引物限制的NED标记分析HS04260376_m1或用于CYP3A4的HS00604506_m1。通过7500软件2.0.5版(生命技术公司)使用ΔΔCt方法，计算相比于媒剂对照的倍数差异。使用格拉夫帕德Prism计算Emax和EC50。
表6
如上表6中所示，化合物1未展现显著诱导(除了CYP2C9有可能)；化合物2未展现诱导(活性略有降低)；以及化合物105展现CYP2B6、CYP2C9和CYP3A的诱导。观察到细胞活力无显著损失。
实例8：CYP抑制的评定
使用合并的人类肝微粒体评估化合物1、2或105对人类细胞色素P450(CYP)的酶活性的可能性抑制。
方法：通过在探针CYP反应上在接近其对应的Km值的多种浓度下评定，产生人类肝微粒体(HLM)的IC50曲线，从而测定化合物1、2和105的竞争性抑制可能性。在适当时，还通过评估KI和k失活值来评定CYP3A4/5的时间依赖性失活(TDI)可能性。
向96孔板中添加含有PB、HLM、CYP选择性探针底物以及要测试的抑制剂的悬浮液。在37℃水浴中预孵育板约2分钟。通过向96孔板的每个孔中添加NADPH引发反应。PB、HLM和NADPH的最终浓度对应地是100mmol/L(pH 7.4)、0.1mg/mL和2.3mmol/L。CYP探针底物和用作阳性对照的CYP抑制剂以及其对应的浓度列在下文中。每个孵育中所用的最终MeOH浓度不超过0.8％。
在恰当孵育时间之后，向恰当孔中添加相等体积的含有IS的淬灭溶液。使用与测试样品类似的组分制备标准样品和质量控制(QC)样品。用与另一个样品类似但不包括IS的淬灭溶液制备空白。使板在台式离心机中在3000rpm下旋转5分钟。通过LC/MS/MS分析样品。孵育条件和阳性对照列出在下表7中。
表7
为了评定TDI，向96孔板中添加含有PB、HLM和抑制剂储备液的初次孵育悬浮液。在37℃水浴中预孵育板约2分钟。通过向96孔板的每个孔中添加NADPH引发反应并且执行0、5、10、15、20和30分钟。关于无NADPH对照，用PB溶液取代NADPH储备溶液。PB、HLM和NADPH的最终浓度对应地是100mmol/L(pH 7.4)、0.2mg/mL和2.3mmol/L。在对应的时间，将12.5μL初次孵育悬浮液稀释20倍到含有CYP选择性探针底物的预孵育的二次孵育混合物中以便评定残留活性。所用探针底物是睾酮(250μmol/L)并且阳性对照是醋竹桃霉素。
所用HPLC系统是岛津HPLC系统(日本京都)，它由SIL-HTC自动进样器、DGU-14A脱气装置、三个LC-10ADvp泵以及CTO-10ACvp柱温箱组成。在API4000QTrap(加利福尼亚州福斯特市的爱博才思)三重四极杆质谱仪上使用涡轮喷雾电离在正离子模式下分析样品。
通过Analyst 1.6(加利福尼亚州福斯特市的爱博才思)处理所有被监控的代谢物和IS的峰面积计算和积分。借由使用通过绘制代谢物比IS的峰面积比对比校准标准的浓度的曲线构造的校准曲线来实现定量，并且所述定量由以1/x2加权的二次回归(y＝a x2+b x+c)产生。抑制百分比计算采用Excel(华盛顿州雷德蒙德的微软公司的Office2010)，并且使用格拉夫帕德Prism(5.02版，加利福尼亚州拉荷亚的格拉夫帕德软件公司)基于一个结合位点的假设来绘制。测试化合物和阳性对照的标称浓度是用格拉夫帕德Prism转换的对数。使用剩余的CYP3A4/5活性对比预孵育时间的图，通过非线性回归估算CYP活性损失速率(λ)。接着通过拟合以下方程式来估算参数k失活和KI：
其中[I]是化合物1、2或105的初始浓度。
表8可逆抑制
表9时间依赖性失活(TDI)评定
化合物 KI(μM) k失活(min-1) K失活/KI(μM-1·min-1)
1 6.4(3.3**) 0.0277 0.0043
105 10.2 0.0214 0.0021
2 22.3 0.0376 0.0017
如上表8中所示，化合物1和2未展现显著可逆抑制；并且化合物105展现CYP2D6和CYP3A4(咪达唑仑)的可能显著抑制。此外，如上表9中所示，化合物1、2和105全部显示出CYP3A4/5(使用咪达唑仑作为探针)的时间、浓度和NADPH依赖性失活。
本文中提及的每一专利文件和科学文章的全部公开内容以引用的方式并入用于所有目的。
可在不脱离本发明的精神或本质特征的情况下，以其它特定形式实施本发明。因此，前述实施例被视为在所有方面都是说明性的，而不是对本文所述的本发明进行限制。因此，本发明的范围是由所附的权利要求书而不是通过上述的说明来指明的，并且在所述权利要求书的等效性的含义和范围之内的所有变化均旨在涵盖于其中。

Claims (13)

1.一种化合物，其选自由以下组成的群组：
以及其医药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是
3.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是或其医药学上可接受的盐。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是
5.一种医药组合物，包含根据权利要求1到4中任一项所述的化合物和医药学上可接受的载体。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的化合物在制备治疗EZH2介导的病症的药剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述治疗包含向有需要的受试者投与治疗有效量的根据权利要求1到4中任一项所述的化合物。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其中所述EZH2介导的病症是癌症。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述癌症是淋巴瘤、白血病或黑素瘤。
10.根据权利要求9所述的应用，其中所述癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病或混合系白血病。
11.根据权利要求8所述的应用，其中所述癌症是恶性横纹肌样肿瘤或缺乏INI1的肿瘤。
12.根据权利要求6或7所述的应用，其中所述EZH2介导的病症是骨髓增生异常综合症。
13.一种医药组合物，其用于治疗EZH2介导的病症，所述医药组合物包含根据权利要求1到4中任一项所述的化合物作为主要成分。
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