KR20150067370A - 치환된 벤젠 화합물 - Google Patents

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에피자임, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 치환된 벤젠 화합물들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 화합물을 함유하는 약제학적 조성물, 및 암의 치료가 필요한 대상체에게 이들 화합물 및 약제학적 조성물을 투여함으로써 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 연구 또는 다른 비치료적 목적을 위한 이러한 화합물의 용도에 관한 것이다.

Description

치환된 벤젠 화합물{SUBSTITUTED BENZENE COMPOUNDS}
본 출원은 2012년 10월 15일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/714,140호, 2012년 10월 15일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/714,145호, 2013년 3월 13일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/780,703호 및 2013년 3월 14일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/786,277호에 대한 우선권 및 유익을 주장한다. 이들 가출원 특허의 각각의 전문의 내용은 본 명세서에 그들의 전문이 참조로 포함된다.
EZH2-매개 장애(예를 들어, 암)를 치료하기 위해 사용될 수 있는 EZH2 활성의 저해제로서 신규한 작용제에 대한 요구가 계속되고 있다.
일 양태에서, 본 발명은
Figure pct00001
로부터 선택된 치환된 벤젠 화합물, 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 특징으로 한다.
예를 들어, 화합물은
Figure pct00002
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
예를 들어, 화합물은
Figure pct00003
이다.
예를 들어, 화합물은
Figure pct00004
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
예를 들어, 화합물은
Figure pct00005
이다.
예를 들어, 화합물은
Figure pct00006
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
예를 들어, 화합물은
Figure pct00007
이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 및 본 명세서에 기재된 임의의 화학식의 화합물로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 EZH2-매개 장애를 치료 또는 예방하는 방법이다. 상기 방법은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 화합물의 치료적 유효량을 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. EZH2-매개 장애는 EZH2의 활성에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질환, 장애 또는 병태이다. 일 실시형태에서, EZH2-매개 장애는 증가된 EZH2 활성에 관한 것이다. 일 실시형태에서, EZH2-매개 장애는 암이다. EZH2-매개 암은 림프종, 백혈병 또는 흑색종, 예를 들어, 미만성 큰 B-세포 림프종(DLBCL), 비호지킨 림프종(NHL), 여포성 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 혼합형 백혈병, 또는 골수 형성이상 증후군(MDS)이다. 일 실시형태에서 EZH2-매개 암은 악성횡문근양종양 또는 INI1-결핍 종양일 수 있다. 악성횡문근양종양의 조직학적 진단은 간상소체 세포(중심을 달리해서 위치된 핵 및 흔한, 호산성 세포질을 지니는 거대 세포)의 동정 및 비멘틴, 케라틴 및 상피막 항원에 대한 항체를 이용하는 면역조직화학에 의존한다. 대부분의 악성횡문근 종양에서, 염색체 밴드 22q11.2에 위치된 SMARCB1/INI1 유전자는 결실 및/또는 돌연변이에 의해 불활성화된다. 일 실시형태에서, 악성횡문근 종양은 INI1-결핍 종양일 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 치료 방법의 임의의 설명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 이러한 치료 또는 예방을 제공하기 위한 화합물의 사용뿐만 아니라 이러한 병태를 치료 또는 예방하기 위해 의약을 제조하기 위한 화합물의 사용을 포함한다. 치료는 인간 또는 설치류를 포함하는 비-인간 동물 및 다른 질환 모델의 치료를 포함한다.
추가로, 본 명세서에 기재된 화합물 또는 방법은 연구(예를 들어, 후성적 효소 연구) 및 기타 비치료적 목적을 위해 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바람직한 화합물은 약학적 및/또는 약동학적 특성, 예를 들어 저 클리어런스율 및/또는, 예를 들어, 사이토크롬 P-450 효소의 시간-의존적 및 가역적 저해의 감소를 통해 평가된 병용 요법에서의 해로운 약물-약물 상호작용의 제한된 위험을 가진다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 명세서에서, 단수 형태는 또한 달리 문맥에서 명확하게 지시되지 않는 한, 복수를 포함한다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 참고로 포함된다. 본 명세서에 인용된 참고문헌은 특허청구된 발명에 대한 선행 기술이 되는 것으로 용인되지 않는다. 모순되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서로 조절할 것이다. 추가로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에 기재된 화학적 구조와 명칭 간의 모순이 있는 경우에, 화학적 구조로 조절한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백하게 될 것이다.
도 1은 마우스에서 림프종 KARPAS-422 이종이식에 대한 경구로 투여된 화합물 1 또는 화합물 A의 항종양 효과를 나타내는 다이어그램을 도시한 도면. 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다(n=10).
도 2는 마우스 체중에 대한 화합물 1 또는 화합물 A의 효과를 나타내는 다이어그램을 도시한 도면. 이터는 평균 ± SD를 나타낸다(n=10).
도 3은 처리 후 제7일 또는 제28일에 종양에서 화합물 1의 농도 또는 처리 후 제7일에 종양에서 화합물 A의 농도를 나타내는 다이어그램을 도시한 도면. 이 도면에서, "A" 내지 "G"는 각각 62.5, 83.3, 125, 166.7, 250, 333.3 및 500㎎/㎏의 투약량에서 화합물 1의 투여 후 7일을 의미하며; "H" 및 "I"는 각각 125 및 250㎎/㎏의 투약량에서 화합물 A의 투여 후 7일을 의미하고; "J" 내지 "L"은 각각 62.5, 125 및 250㎎/㎏의 투약량에서 화합물 1의 투여 후 28일을 의미한다.
도 4는 처리 후 제7일 및 제28일에 혈장에서 화합물 1 또는 화합물 A의 농도를 나타내는 다이어그램을 도시한 도면. 상부 파선은 화합물 A의 혈장 단백질 결합(plasma protein binding: PPB) 보정 LCC를 나타내며, 하부 파선은 화합물 1의 PPB 보정 LCC를 나타낸다.
도 5는 7일 동안 화합물 1 또는 화합물 A로 처리한 마우스로부터의 KARPAS-422 종양에서 전체적인 H3K27me3 메틸화를 나타내는 다이어그램을 도시한 도면. 이 도면에서, "A"는 비히클 처리를 의미하고; "B" 내지 "H"는 각각 62.5, 83.3, 125, 166.7, 250, 333.3 및 500㎎/㎏의 투약량에서 화합물 1로 처리를 의미하며; "I" 및 "J"는 125 및 250㎎/㎏의 투약량에서 화합물 A로 처리를 의미한다.
도 6은 28일 동안 화합물 1로 처리한 마우스로부터의 KARPAS-422 종양에서 전체적인 H3K27me3 메틸화를 나타내는 다이어그램을 도시한 도면.
도 7은 7일 동안 화합물 1 또는 화합물 A로 처리한 KARPAS-422 이종이식 종양 보유 마우스로부터의 골수에서 전체적인 H3K27me3 메틸화를 나타내는 다이어그램을 도시한 도면. 이 도면에서, "A"는 비히클 처리를 의미하고; "B" 내지 "H"는 각각 62.5, 83.3, 125, 166.7, 250, 333.3 및 500㎎/㎏의 투약량에서 화합물 1로 처리를 의미하며; "I" 및 "J"는 각각 125 및 250㎎/㎏의 투약량에서 화합물 A로 처리를 의미한다.
도 8은 28일 동안 화합물 1로 처리한 KARPAS-422 이종이식 종양 보유 마우스로부터의 골수에서 전체적인 H3K27me3 메틸화를 나타내는 다이어그램을 도시한 도면. 이 도면에서, "A"는 비히클 처리를 의미하고; "B" 내지 "E"는 각각 62.5, 125, 250 및 500㎎/㎏의 투약량에서 화합물 1로 처리를 의미하며; "F"는 250㎎/㎏의 투약량에서 화합물 A로 처리를 의미한다.
본 발명은 신규한 치환된 벤젠 화합물, 화합물의 제조를 위한 합성 방법, 그들을 함유하는 약제학적 조성물 및 화합물의 다양한 용도를 제공한다.
본 발명의 화합물의 대표적인 화합물은 표 1에 열거된 화합물을 포함한다.
Figure pct00008
본 명세서에서, 화합물의 구조식은 일부 경우에 편의를 위해 특정 이성질체를 나타내지만, 본 발명은 모든 이성질체, 예컨대 기하학적 이성질체, 비대칭 탄소에 기반한 광학 이성질체, 입체이성질체, 호변체, 거울상체, 로타머, 부분입체이성질체, 라세미체 등을 포함할 수 있으며, 모든 이성질체는 동일한 수준의 활성을 갖는 것으로 이해된다. 추가로, 결정 다형성은 화학식에 의해 표시되는 화합물에 대해 존재할 수 있다. 임의의 결정 형태, 이의 결정 형태 혼합물 또는 무수물 또는 수화물은 본 발명의 범주 내에 포함된다는 것이 언급된다.
"이성질 현상"은 동일한 분자식을 가지지만 그들의 원자의 결합 순서가 다르거나 또는 공간 내 그들의 원자의 배열이 다른 화합물을 의미한다. 공간에서 그들의 원자의 배열이 다른 이성질체는 "입체이성질체"로 지칭된다. 서로 거울상이 아닌 입체이성질체는 "부분입체이성질체"로 칭하며, 서로 비대칭거울상(non-superimposable mirror image)인 입체이성질체는 "거울상체" 또는 때때로 광학 이성질체로 칭해진다. 반대의 키랄성의 동일한 양의 개개 거울상체 형태를 함유하는 혼합물은 "라세미 혼합물"로 칭해진다.
"기하 이성질체"는 이중 결합 또는 사이클로알킬 링커(예를 들어, 1,3-사이클로뷰틸)에 대해 입체 방해된 회전으로 그들의 존재를 가지는 부분입체이성질체를 의미한다. 이들 입체배치는 칸-잉골드-프레로그(Cahn-Ingold-Prelog) 규칙에 따라 기들이 분자 내 이중결합의 동일측 또는 반대측 상에 있는지를 나타내는, 접두사 시스 및 트랜스, 또는 Z 및 E에 의해 그들의 명칭이 구분된다.
본 발명의 화합물은 입체이성질체로서 도시될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한 화합물이 입체이성질체 형태를 가질 때, 모든 입체이성질체 형태는 본 발명의 범주에 내에 포함되는 것으로 의도되고, 모든 입체이성질체가 동일한 수준의 활성을 가지지 않을 수도 있다는 것이 이해된다.
더 나아가, 본 발명에서 논의되는 구조 및 다른 화합물은 이들의 모든 아트로프(atropic) 이성질체를 포함하며, 모든 아트로프 이성질체가 동일한 수준의 활성을 가지지 않을 수도 있다는 것이 이해된다. "아트로프 이성질체"는 두 이성질체의 원자가 공간에서 상이하게 배열되는 입체이성질체의 유형이다. 아트로프 이성질체는 중심 결합에 대해 거대한 기의 회전의 입체방해에 의해 야기되는 제한된 회전에 대해 그들의 존재를 가진다. 이러한 아트로프 이성질체는 전형적으로 혼합물로서 존재하지만, 크로마토그래피 기법에서 최근의 진보의 결과로서, 선택 경우에 2개의 아트로프 이성질체의 혼합물을 분리할 수 있었다.
"호변체"는 평형상태에서 존재하고 하나의 이성질체로부터 다른 것으로 용이하게 전환되는 2 이상의 구조적 이성질체 중 하나이다. 이 전환은 인접한 컨쥬게이트된 이중 결합의 전환을 수반하는 수소 원자의 형식적 이동을 초래한다. 호변체는 용액 중에서 호변체 세트의 혼합물로서 존재한다. 호변체화가 가능한 용액에서, 호변체의 화학적 평형상태가 도달될 것이다. 호변체의 정확한 비는 온도, 용매 및 pH를 포함하는 몇몇 인자에 의존한다. 호변이성에 의해 상호 전환되는 호변체의 개념은 호변체화로 불린다.
가능한 호변체화의 다양한 유형 중에서, 2가지가 통상적으로 관찰된다. 케토-엔올 호변체화에서, 전자 및 수소 원자의 동시 이동이 일어난다. 고리-쇄 호변체화는 동일 분자에서 하이드록시기(-OH) 중 하나와 반응하는 당 쇄 분자 내 알데하이드기(-CHO)의 결과로서 생겨서, 글루코스에 의해 나타나는 바와 같이 환식(고리형상) 형태를 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이,
Figure pct00009
의 임의의 경우는
Figure pct00010
로서 해석되어야 한다.
통상적인 호변체 쌍은: 케톤-엔올, 아마이드-나이트릴, 락탐-락팀, 헤테로환식 고리 내 아마이드-이미드산 호변체(예를 들어, 구아닌, 티민 및 사이토신과 같은 핵염기에서), 이민-엔아민 및 엔아민-엔아민이다. 케토-엔올 평형상태의 예는 이하에 나타내는 바와 같이 피리딘-2(1H)-온과 대응하는 피리딘-2-올 간이다.
Figure pct00011
본 발명의 화합물은 상이한 호변체로서 도시될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한 화합물이 호변체 형태일 때, 모든 호변체 형태는 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도되며, 화합물의 명명은 임의의 호변체 형태를 제외하지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 특정 호변체는 다른 것보다 더 높은 수준의 활성을 가질 수 있다는 것이 이해될 것이다.
용어 "결정 다형체" 또는 "다형체" 또는 "결정 형태"는 화합물이 상이한 결정 패킹 배열로 결정화할 수 있는 결정 구조를 의미하며, 이들 모두는 동일한 원소의 조성물을 가진다. 상이한 결정 형태는 보통 상이한 X-선 회절 패턴, 적외선 스펙트럼, 융점, 밀도 경도, 결정 형상, 광학적 및 전기적 특성, 안정성 및 용해도를 가진다. 재결정화 용매, 결정화 속도, 저장 온도 및 기타 인자는 하나의 결정 형태가 지배적이 되도록 야기할 수 있다. 화합물의 결정 다형체는 상이한 조건 하에서 결정화에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물은 본 명세서에 개시된 임의의 화학식과 같은 화합물 그 자체를 포함한다. 본 발명의 화합물은 또한 적용가능하다면, 그들의 염 및 그들의 용매화물을 포함할 수있다. 염은, 예를 들어, 치환된 벤젠 화합물 상에서 음이온과 양으로 하전된 기(예를 들어, 아미노) 사이에 형성될 수 있다. 적합한 음이온은 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 황산염, 중황산염, 설파민산염, 질산염, 인산염, 시트르산염, 메탄설포네이트, 트라이플루오로아세테이트, 글루탐산염, 글루쿠론산염, 글루타르산염, 말산염, 말레산염, 숙신산염, 퓨마르산염, 타르타르산염, 토실산염, 살리실산염, 락트산염, 나프탈렌설포네이트, 및 아세테이트(예를 들어, 트라이플루오로아세테이트)를 포함한다. 용매 "약제학적으로 허용가능한 음이온"은 약제학적으로 허용가능한 염을 형성하는데 적합한 음이온을 지칭한다. 마찬가지로, 염은 또한 치환된 벤젠 화합물 상에서 양이온과 음으로 하전된 기(예를 들어, 카복실레이트) 사이에 형성될 수 있다. 적합한 양이온은 나트륨 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온 및 암모늄 양이온, 예컨대 테트라메틸암모늄 이온을 포함한다. 치환된 벤젠 화합물은 또한 4차 질소 원자를 함유하는 해당 염을 포함한다.
추가적으로, 본 발명의 화합물, 예를 들어, 화합물의 염은 수화 또는 불수화(무수) 형태 중 하나로 또는 다른 용매 분자와의 용매화물로 존재할 수 있다. 수화물의 비제한적 예는 일수화물, 이수화물 등을 포함한다. 용매화물의 비제한적 예는 에탄올 용매화물, 아세톤 용매화물 등을 포함한다.
"용매화물"은 용매의 화학량론적 또는 비화학량론적 양을 함유하는 용매 추가 형태를 의미한다. 일부 화합물은 결정질 고체 상태에서 고정된 몰 비의 용매 분자를 가두는 경향을 가지며, 따라서 용매화물을 형성한다. 용매가 물이라면, 형성된 용매화물은 수화물이고; 용매가 알코올이라면, 형성된 용매화물은 알코올레이트이다. 수화물은 하나 이상의 물 분자와 물질 한 분자의 조합에 의해 형성되며, 이때 물은 H2O로서 그의 분자 상태를 유지한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "유사체"는 다른 것과 구조적으로 유사하지만 조성이 약간 다른(하나의 원자의 상이한 원소의 원자에 의한 대체에서 또는 특정 작용기의 존재에서, 또는 하나의 작용기의 다른 작용기에 의한 대체에서와 같이) 화학적 화합물을 지칭한다. 따라서, 유사체는 기능 및 외관이 유사 또는 비슷하지만, 기준 화합물에 대한 구조에 있는 또는 유래는 아닌 화합물이다.
본 명세서에 정의된 바와 같은, 용어 "유도체"는 공통 중심 구조를 갖는 화합물을 지칭하며, 본 명세서에 기재된 다양한 기로 치환된다. 예를 들어, 표 1에서의 모든 화합물은 치환된 벤젠 화합물이며, 공통 중심을 가진다.
용어 "생등배전자체(bioisostere)"는 원자의 또는 원자 그룹의 다른, 광범위하게 유사한 원자 또는 원자의 그룹으로의 교환으로부터 초래되는 화합물을 지칭한다. 생등배전자체 대체의 목적은 모 화합물에 대해 유사한 생물학적 특성을 지니는 새로운 화합물을 만드는 것이다. 생등배전자체 대체는 물리화학에 또는 위상 수학에 기반할 수 있다. 카복실산 생등배전자체의 예는 아실, 설폰이미드, 테트라졸, 설포네이트 및 포스포네이트를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Patani and LaVoie, Chem. Rev. 96, 3147-3176, 1996] 참조.
본 발명은 모 화합물에서 생기는 원자의 모든 동위원소를 포함하도록 의도된다. 동위원소는 동일한 원자수를 가지지만 상이한 질량수를 갖는 해당 원자를 포함한다. 일반적 예로서 제한 없이, 수소의 동위원소는 삼중수소 및 중수소를 포함하고, 탄소의 동위원소는 C-13 및 C-14를 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 화학식의 화합물의 합성을 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 실시예에 나타낸 바와 같은 반응식에 따르는 본 발명의 다양한 개시 화합물의 합성을 위한 상세한 방법을 제공한다.
조성물이 구체적 성분을 갖거나, 포함하거나 또는 포함하는 것으로 기재되는 경우 설명 전체적으로, 조성물은 또한 열거된 성분으로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진다는 것이 상정된다. 유사하게, 방법 또는 공정이 구체적 공정 단계를 갖거나, 포함하거나 또는 포함하는 것으로 기재된 경우, 공정은 인용된 공정 단계로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진다. 추가로, 단계의 순서 또는 특정 작용을 수행하기 위한 순서는 본 발명의 작동가능한 채로 남아있는 한 중요하지 않다는 것이 이해되어야 한다. 게다가, 2 이상의 단계 또는 작용은 동시에 수행될 수 있다.
본 발명의 합성 공정은 매우 다양한 작용기를 용인할 수 있고, 따라서 다양한 치환된 출발 물질이 사용될 수 있다. 공정은, 그것이 특정 예에서 화합물을 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 추가로 전환시키는데 바람직할 수도 있지만, 일반적으로 전반적인 공정의 마지막에서 또는 마지막 근처에서 목적으로 하는 최종 화합물을 제공한다.
본 발명의 화합물은 상업적으로 입수가능한 출발 물질, 문헌에 공지된 화합물을 이용하는 다양한 방법에서 또는 용이하게 제조된 중간체로부터, 당업자에게 공지되거나 또는 본 명세서의 교시에 비추어 당업자에게 명백할 표준 합성 방법 및 절차를 사용함으로써 제조될 수 있다. 유기 분자의 제조 및 작용기 전환 및 조작을 위한 표준 합성 방법 및 절차는 적절한 과학적 문헌으로부터 또는 해당 분야에서의 표준 교재로부터 얻을 수 있다. 비록 임의의 하나 또는 몇몇 공급원으로 제한되는 것은 아니지만, 고전적 교재, 예컨대 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Smith, M. B., March, J., March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th edition, John Wiley & Sons: New York, 2001; Greene, T.W., Wuts, P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons: New York, 1999; R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); 및 L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)]은 당업자에게 공지된 유기 합성의 유용하고 인정된 참고 교재이다. 합성 방법의 다음의 설명은 예시를 위해 설계되지만, 본 발명의 제조를 위한 일반적 절차를 제한하지 않는다.
당업자는 특정기가 보호기의 사용을 통해 반응 조건으로부터의 보호를 필요로 할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 보호기는 또한 분자 내 유사한 작용기를 구별하기 위해 사용될 수 있다. 보호기의 목록 및 이들 기의 도입 및 제거 방법은 문헌[Greene, T.W., Wuts, P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons: New York, 1999]에서 찾을 수 있다.
바람직한 보호기는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다:
하이드록실 모이어티에 대해: TBS, 벤질, THP, Ac
카복실산에 대해: 벤질 에스터, 메틸 에스터, 에틸 에스터, 알릴 에스터
아민에 대해: Cbz, BOC, DMB
다이올에 대해: Ac (x2) TBS (x2), 또는 아세토나이드와 함께 취할 때
티올에 대해: Ac
벤즈이미다졸에 대해: SEM, 벤질, PMB, DMB
알데하이드에 대해: 다이-알킬 아세탈, 예컨대 다이메톡시 아세탈 또는 다이에틸 아세틸.
본 명세서에 기재된 반응 반응식에서, 다수의 입체이성질체가 생성될 수 있다. 특정 입체이성질체를 나타낼 때, 반응으로부터 생성될 수 있는 모든 가능한 입체이성질체를 의미하는 것으로 이해된다. 당업자는 반응이 우선적으로는 하나의 이성질체를 제공하기 위해 최적화될 수 있거나, 또는 새로운 반응식이 단일 이성질체를 생성하도록 고안될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 혼합물이 생성된다면, 박막 크로마토그래피, 분취 HPLC, 분취 카이랄 HPLC, 또는 분취 SFC와 같은 기법이 이성질체를 분리하기 위해 사용될 수 있다.
다음의 약어는 본 명세서 전체적으로 사용되며 이하에 정의한다:
Ac 아세틸
AcOH 아세트산
aq. 수성
BID 또는 b.i.d. 1일 2회(하루에 두번)
BOC tert-뷰톡시 카보닐
Cbz 벤질옥시 카보닐
CDCl3 중수소화 클로로폼
CH2Cl2 다이클로로메탄
DCM 다이클로로메탄
DMB 2,4 다이메톡시 벤질
DMF N,N-다이메틸폼아마이드
DMSO 다이메틸 설폭사이드
EA 또는 EtOAc 에틸 아세테이트
EDC 또는 EDCI N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드
ESI- 전자분무 음성모드
ESI+ 전자분무 양성모드
EtOH 에탄올
h 시간
H2O 물
HOBt 1-하이드록시벤조트라이아졸
HCl 염화수소 또는 염산
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
K2CO3 탄산칼륨
LC/MS 또는 LC-MS 액체 크로마토그래피 질량 스펙트럼
M 몰농도
MeCN 아세토나이트릴
min 분
Na2CO3 탄산나트륨
Na2SO4 황산나트륨
NaHCO3 중탄산나트륨
NaHMDs 나트륨 헥사메틸다이실라자이드
NaOH 수산화나트륨
NaHCO3 중탄산나트륨
Na2SO4 황산나트륨
NMR 핵자기 공명
Pd(OH)2 팔라듐 다이하이드록사이드
PMB 파라 메톡시벤질
p.o. 입으로(경구 투여)
ppm 백만분율
분취 HPLC 분취 고성능 액체 크로마토그래피
PYBOP (벤조트라이아졸-1-일옥시)트라이피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트
Rt 또는 RT 실온
TBME tert-뷰틸 메틸 에터
TFA 트라이플루오로아세트산
THF 테트라하이드로퓨란
THP 테트라하이드로피란
본 발명의 화합물은 당업자에게 친숙한 다양한 방법에 의해 편리하게 제조될 수 있다. 본 명세서에 개시된 임의의 화학식을 지니는 본 발명의 화합물은 상업적으로 입수가능한 출발 물질 또는 문헌 절차를 사용하여 제조될 수 있는 출발 물질로부터 이하의 실시예에 도시된 절차에 따라 제조될 수 있다.
당업자는 반응 순서 및 본 명세서에 기재된 합성 반응식 동안, 보호기의 도입 및 제거와 같은 특정 단계의 순서가 변할 수 있다는 것을 주의할 것이다.
본 발명의 화합물은 EZH2 또는 이의 돌연변이체의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 저해하고, 따라서, 본 발명의 일 양태에서, 본 명세서에 개시된 특정 화합물은 특정 병태 및 질환을 치료 또는 예방하기 위한 후보이다. 본 발명은 히스톤 또는 다른 단백질의 메틸화 상태를 조절함으로써 영향받을 수 있는 과정인 병태 및 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하되, 상기 메틸화 상태는 EZH2의 활성에 의해 적어도 부분적으로 매개된다. 히스톤의 메틸화 상태의 조절은 차례로 메틸화에 의해 활성화된 표적 유전자, 및/또는 메틸화에 의해 억제되는 표적 유전자의 발현 수준에 영향을 미칠수 있다. 상기 방법은 본 발명의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체, 용매화물, 또는 입체이성질체의 치료적 유효량을 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
달리 언급되지 않는 한, 치료 방법의 임의의 설명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 이러한 치료 또는 예방을 제공하기 위한 화합물의 용도뿐만 아니라 이러한 병태를 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제조하기 위한 화합물의 용도를 포함한다. 치료는 인간 또는 설치류를 포함하는 비-인간 동물 및 다른 질환 모델의 치료를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료가 필요한 대상체에서 히스톤 H3 상의 라이신 27(H3-K27)의 모노- 내지 트라이-메틸화를 촉매하는 PRC2 복합체의 촉매적 서브유닛인 EZH2의 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 화합물의 치료적 유효량을 돌연변이체 EZH2를 발현시키는 암을 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 화합물(들)은 EZH2의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 저해함으로써, 암을 치료한다.
예를 들어, EZH2-매개 암은 배중심 B 세포-유사(GCB) 서브유닛의 여포성 림프종 및 미만성 큰 B-세포 림프종(DLBCL)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 암은 림프종, 백혈병 또는 흑색종이다. 바람직하게는, 림프종은 비호지킨 림프종(NHL), 여포성 림프종 또는 미만성 큰 B-세포 림프종이다. 대안적으로, 백혈병은 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병 또는 혼합형 백혈병이다.
예를 들어, EZH2-매개 전암상태는 골수 형성이상 증후군(MDS, 이전에 전백혈병으로서 알려짐)이다.
예를 들어, EZH2-매개 암은 혈액암이다.
본 발명의 화합물(들)은 EZH2 또는 이의 돌연변이체의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 저해하고, 따라서, 본 발명은 또한 병태 및 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이의 과정은 히스톤 또는 다른 단백질의 메틸화 상태를 조절함으로써 영향받을 수 있도, 상기 메틸화 상태는 EZH2의 활성에 의해 적어도 부분적으로 매개된다. 본 발명의 일 양태에서, 본 명세서에 개시된 특정 화합물은 특정 병태 및 질환을 치료 또는 예방하기 위한 후보이다. 히스톤의 메틸화 상태의 조절은 차례로 메틸화에 의해 활성화된 표적 유전자 및/또는 메틸화에 의해 억제된 표적 유전자의 발현 수준에 영향을 미칠 수 있다. 상기 방법은 본 발명의 화합물의 치료적 유효량을 이러한 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "대상체"는 치료가 필요한 대상체와 상호호환가능하며, 이들 둘 다 EZH2-매개 단백질 메틸화가 부분적으로 작용하는 장애를 갖는 대상체, 또는 전체적 집단에 비해 이러한 장애가 발생할 증가된 위험을 갖는 대상체를 지칭한다. "대상체"는 포유류를 포함한다. 포유류는, 예를 들어 인간 또는 적절한 비-인간 포유류, 예컨대 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 소, 말, 염소, 낙타, 양 또는 돼지일 수 있다. 대상체는 또한 조류 또는 가금류일 수 있다. 일 실시형태에서, 포유류는 인간이다. 치료가 필요한 대상체는 암 또는 전암상태를 갖는 것으로 이전에 진단되거나 또는 동정된 대상체일 수 있다. 치료가 필요한 대상체는 또한 암 또는 전암상태를 갖는 대상체(예를 들어, 암 또는 전암상태로 고통받는)일 수 있다. 대안적으로, 치료가 필요한 대상체는 전체적으로 집단에 대해 이러한 장애가 발생할 증가된 위험을 갖는 대상체(즉, 전체적으로 집단에 대해 이러한 장애가 발생할 성향이 있는 대상체)일 수 있다. 치료가 필요한 대상체는 전암상태를 가질 수 있다. 치료가 필요한 대상체는 난치성 또는 내성 암(즉, 치료에 대해 반응하지 않거나 또는 아직 반응한 적이 없는 암)을 가질 수 있다. 대상체는 치료의 시작에서 저항성일 수 있거나 또는 치료 동안 저항성이 될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료가 필요한 대상체는 가장 최근의 요법에 대한 관해(remission) 후에 암 재발을 가진다. 일부 실시형태에서, 치료가 필요한 대상체는 암 치료를 위한 모든 공지된 효과적인 요법을 받았고 실패하였다. 일부 실시형태에서, 치료가 필요한 대상체는 적어도 하나의 사전 요법을 받았다. 바람직한 실시형태에서, 대상체는 암 또는 암성 병태를 가진다. 예를 들어, 암은 림프종, 백혈병, 흑색종 또는 횡문근육종이다. 바람직하게는, 림프종은 비호지킨 림프종, 여포성 림프종 또는 미만성 큰 B-세포 림프종이다. 대안적으로, 백혈병은 만성 골수성 백혈병(CML)이다. 전암상태는 골수 형성이상 증후군(MDS, 이전에 전백혈병으로서 알려짐)이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "치료하는" 또는 "치료하다"는 질환, 병태 또는 장애와 싸우는 목적을 위한 환자의 관리 및 돌봄을 설명하며, 질환, 병태 또는 장애의 증상 또는 합병증을 완화하거나 또는 질환, 병태 또는 장애를 제거하기 위한 본 발명의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물의 투여를 포함한다. 용어 "치료하는"은 또한 시험관내 세포 또는 동물 모델의 치료를 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물은 적절한 질환, 병태 또는 장애를 예방하기 위해, 또는 이러한 목적을 위한 적합한 후보를 동정하기 위해 사용될 수 있거나 또는 사용될 수도 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "예방하는", "예방하다" 또는 "에 대해 보호하는"은 이러한 질환, 병태 또는 장애의 증상 또는 합병증의 개시를 감소 또는 제거하는 것을 기재한다.
EZH2의 단일 아미노산 잔기(예를 들어, Y641, A677 및 A687)에서 EZH2 유전자의 점 돌연변이는 림프종과 관련되는 것으로 보고되었다. EZH2 돌연변이체 및 돌연변이의 검출 방법 및 돌연변이-관련 장애의 치료 방법의 더 많은 예는, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제20130040906호에 기재되어 있으며, 이들의 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다.
당업자는 본 명세서에 논의된 공지된 기술 또는 동등한 기술의 상세한 설명을 위해 일반적 참고문헌을 참조할 수 있다. 이들 교재는 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (2005); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2000); Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, N.Y.; Enna et al., Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, N.Y.; Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics (1975), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition (1990)]을 포함한다. 이들 교재는 물론 본 발명의 양태를 제조하거나 또는 사용함에 있어 참조될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "병용요법" 또는 "공동-요법"은 본 발명의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형체 또는 용매화물, 및 이들 치료제의 공동-작용으로부터 유리한 효과를 제공하도록 의도된 구체적 치료 요법의 부분으로서 적어도 제2 작용제의 투여를 포함한다. 병용의 유리한 효과는 치료제의 병용으로부터 초래되는 약동학적 또는 약역학적 공동 작용을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체와 조합하여 본 명세서에 개시된 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
"약제학적 조성물"은 대상체에게 투여를 위한 적합한 형태로 본 발명의 화합물을 함유하는 제형이다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 벌크 또는 단위 제형이다. 단위 제형은, 예를 들어, 캡슐, IV 백, 정제, 에어로졸 흡입기 상의 단일 펌프 또는 바이알을 포함하는 임의의 다양한 형태이다. 조성물의 단위 용량에서 활성 성분(예를 들어 개시된 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 이성질체의 제형)의 양은 효과적인 양이며, 수반된 특정 치료에 따라 변한다. 당업자는 환자의 연령 및 병태에 따라서 투약량에 대한 일상적인 변형을 하는 것이 때때로 필요하다는 것을 인식할 것이다. 투약량은 또한 투여 경로에 의존할 것이다. 경구, 폐, 직장, 비경구, 경피, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 흡입, 협측, 설하, 흉막내, 척추강내, 비강내 등을 포함하는 다양한 경로가 상정된다. 본 발명의 화합물의 국소 또는 경피 투여를 위한 제형은 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 일 실시형태에서, 활성 화합물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 임의의 보존제, 완충제 또는 필요한 추진제와 멸균 조건 하에서 혼합된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 어구 "약제학적으로 허용가능한"은 타당한 의학적 판단의 범주 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉시 사용에 적합하고, 합리적인 유해/유익비에 비례하는 해당 화합물, 음이온, 양이온, 물질, 조성물, 담체 및/또는 제형을 지칭한다.
"약제학적으로 허용가능한 부형제"는 일반적으로 안전하고 비독성이며, 생물학적이지 않거나 또는 달리 바람직하지 못하지 않고, 수의학적 용도뿐만 아니라 인간 약제학적 용도에 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제조함에 있어 유용한 부형제를 의미한다. 본 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 바와 같은 "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 1종과 1종 이상의 이러한 부형제를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 그것의 의도된 투여 경로와 양립가능하게 되도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구(예를 들어, 흡입), 경피(국소), 및 경점막 투여를 포함한다. 비경구, 피내, 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음의 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 애컨대 주사용수, 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글라이콜, 글라이세린, 프로필렌 글라이콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중황산나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세트산염, 시트르산염 또는 인산염, 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장 조절제. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조절될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기 또는 다회 용량 바이알 중에 밀봉될 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 약제학적 조성물은 화학치료적 치료를 위해 현재 사용되는 잘 공지된 다수의 방법에서 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 암의 치료를 위해, 본 발명의 화합물은 종양 내로 직접 주사되거나, 혈류 또는 체강 내로 주사되거나 또는 경구로 취해지거나 또는 패치를 이용하여 피부를 통해 도포될 수 있다. 선택된 용량은 효과적인 치료를 구성하기에 충분하지만 허용가능하지 않은 부작용을 야기할만큼 높지는 않아야 한다. 질환 병태(예를 들어, 암, 전암 등)의 상태 및 환자의 건강상태는 바람직하게는 치료 후 합리적인 기간 동안 밀접하게 모니터링되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "치료적 유효량"은 동정된 질환 또는 병태를 치료, 완화 또는 예방하거나, 또는 검출가능한 치료적 또는 저해적 효과를 나타내기 위한 약제학적 작용제의 양을 지칭한다. 효과는 당업계에 공지된 임의의 분석 방법에 의해 검출될 수 있다. 대상체에 대한 정확한 유효량은 대상체의 체중, 크기 및 건강상태; 질환의 특성 및 정도; 및 투여를 위한 치료제 또는 선택된 치료제의 조합에 따를 것이다. 주어진 상황에 대한 치료적 유효량은 임상의의 기술 및 판단 내에서 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 양태에서, 치료될 질환 또는 병태는 암이다. 다른 양태에서, 치료될 질환 또는 병태는 세포 증식성 장애이다.
임의의 화합물에 대해, 치료적 유효량은 예를 들어 종양 세포의 세포 배양 분석에서, 또는 동물 모델, 보통 래트, 마우스, 토끼, 개 또는 돼지에서 처음에 추정될 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이어서, 이러한 정보는 인간에서 투여를 위한 유용한 용량 및 경로를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 치료적/예방적 효능 및 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차, 예를 들어 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량) 및 LD50(집단의 50%에 대해 치명적인 용량)에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료적 효과 간의 용량 비는 치료지수이며, 이는 비 LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 약제학적 조성물이 바람직하다. 투약량은 사용된 투약 형태, 환자의 민감도, 및 투여 경로에 따라서 이 범위 내에서 다를 수 있다.
투약량 및 투여는 충분한 수준의 활성제(들)를 제공하거나 또는 목적으로 하는 효과를 유지하도록 조절된다. 고려될 수 있는 인자는 질환 상태의 중증도, 대상체의 일반적 건강 상태, 연령, 체중 및 대상체의 성별, 식이요법, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감도 및 내약성/요법에 대한 반응을 포함한다. 장시간 작용하는 약제학적 조성물은 특정 제형의 반감기 및 클리어런스율에 따라서 3 내지 4일마다, 매주 또는 2주마다 1회 투여될 수 있다.
본 발명의 활성 화합물을 함유하는 약제학적 조성물은 일반적으로 공지된 방식으로, 예를 들어 전통적인 혼합, 용해, 과립화, 드라제-제조, 가루화, 에멀전화, 캡슐화, 엔트래핑 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 활성 화합물의 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 용이하게 하는 부형제 및/또는 보조제를 포함하는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 사용하는 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 물론, 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 의존한다.
주사용에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액(수용성) 또는 분산물 및 멸균 주사용 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리식염수, 정균수, 크레모포(Cremophor) EL(상표명)(뉴저지주 파시패니에 소재한 BASF) 또는 인산 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균이어야 하고, 용이한 주사능(syringeability)이 존재하는 정도로 유동되어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물유기체의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글라이세롤, 프로필렌 글라이콜, 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산물의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물유기체 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 다수의 경우에 조성물 중에, 등장제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨 및 솔비톨 및 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써 초래될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 상기 열거한 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매 중에서 필요한 양으로 활성 화합물을 포함시키고, 필요하다면, 그 후에 멸균여과시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산물은 염기성 분산 매질 및 상기 열거한 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 포함시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 활성 성분의 분말 + 이의 이전에 멸균 여과한 용액으로부터의 임의의 추가적인 목적으로 하는 성분을 수득하는 진공 건조 및 냉동 건조이다.
경구 조성물은 일반적으로 비활성 희석제 또는 식용의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 그들은 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압축될 수 있다. 치료적 투여의 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 포함될 수 있고, 정제, 트로키 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강세척액으로서 사용을 위한 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있되, 유체 담체 내 화합물은 경구로 적용되거나, 스위쉬(swish)되거나 뱉어내 지거나 또는 삼켜진다. 약제학적으로 양립가능한 결합제 및/또는 애주번트 물질은 조성물의 부분으로서 포함될 수 있다. 정제, 알약, 트로키 등은 임의의 다음의 성분 또는 유사한 특성의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 미정질 셀룰로스, 트래거캔스검 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테로츠(Sterotes); 활택제, 예컨대 콜로이드 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지향.
흡입에 의한 투여를 위해, 화합물은 가압 용기 또는 적합한 추진제, 예를 들어 이산화탄소와 같은 기체를 함유하는 디스펜서로부터의 에어로졸 스프레이 또는 네뷸라이저의 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 침투될 장벽에 대해 적절한 침투제가 제형에서 사용된다. 이러한 추진제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 경점막 투여를 위해, 세정제, 담즙산염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 수행될 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제형화된다.
활성 화합물은 이식물 및 마이크로캡슐화된 전달시스템을 포함하는 제어된 방출 제형과 같이 신체로부터의 빠른 제거에 대해 화합물을 보호할 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성의, 생체양립가능한 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글라이콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조를 위한 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 재료는 또한 알자사(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼스사(Nova Pharmaceuticals, Inc)로부터 상업적으로 얻을 수 있다. 리포좀 현탁액(바이러스 항원에 대해 단클론성 항체에 의해 감염된 세포에 대해 표적화된 리포좀을 포함함)이 또한 약제학적으로 허용가능한 담체로서 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투약량의 투여의 용이함 및 균일성을 위한 단위 제형에서 경구 또는 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 투약량 단위는 치료될 대상체에 대한 단일 투약량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 목적으로 하는 치료적 효과를 생성하기 위해 계산된 활성 화합물의 사전결정된 양을 함유한다. 본 발명의 단위 제형에 대한 사양은 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성될 특정 치료적 효과에 의해 좌우되고 직접적으로 의존한다.
치료적 적용에서, 본 발명에 따라 사용되는 약제학적 조성물의 투약량은 작용제, 수용 환자의 연령, 체중 및 임상적 상태, 및 임상의의 경험 및 판단 또는 요법을 투여하는 실행자, 특히 선택된 투약량에 영향을 미치는 인자에 따라 다르다. 일반적으로 용량은 종양 성장을 늦추고 바람직하게는 퇴보시키며, 또한 바람직하게는 암의 완전한 퇴보를 야기하는 것을 초래하는데 충분하여야 한다. 투약량은 약 0.01㎎/㎏/일 내지 약 5000㎎/㎏/일의 범위에 있을 수 있다. 바람직한 양태에서, 투약량은 약 1㎎/㎏/일 내지 약 1000㎎/㎏/일의 범위에 있을 수 있다. 양태에서, 용량은 단일, 분할 또는 연속 용량(용량은 환자의 체중(㎏), 체표면적(㎡) 및 연령(세)에 대해 조절될 수 있음)으로 약 0.1㎎/일 내지 약 50g/일; 약 0.1㎎/일 내지 약 25g/일; 약 0.1㎎/일 내지 약 10g/일; 약 0.1㎎ 내지 약 3 g/일; 또는 약 0.1㎎ 내지 약 1g/일의 범위에 있을 것이다. 약제학적 작용제의 유효량은 임상의 또는 기타 자격이 있는 관찰자에 의해 언급되는 바와 같은 객관적으로 동정가능한 개선을 제공하는 것이다. 예를 들어, 환자에서 종양의 퇴보는 종양의 직경을 참조로 하여 측정될 수 있다. 종양 직경의 감소는 퇴보를 나타낸다. 퇴보는 또한 치료가 중단된 후에 다시 생기는 종양의 실패에 의해 표시된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "투약 효과적 방식"은 대상체 또는 세포에서 목적으로 하는 생물학적 효과를 생성하기 위한 활성 화합물의 양을 지칭한다.
약제학적 조성물은 투여 설명서와 함께 용기, 포장 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
본 발명의 화합물은 염을 추가로 형성할 수 있다. 모든 이들 형태는 또한 특허청구된 발명의 범주 내에서 상정된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 염"은 모 화합물이 이의 산 또는 염기염을 제조함으로써 변형되는 본 발명의 화합물의 유도체를 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 염의 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 무기 또는 유기산염, 카복실산과 같은 산성잔기의 알칼리 또는 유기염 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용가능한 염은, 예를 들어 비독성 무기 또는 유기산으로부터 형성된 전통적인 비-독성 염 또는 모 화합물의 4차 암모늄 염을 포함한다. 예를 들어, 이러한 통상적인 비-독성 염은 2-아세톡시벤조산, 2-하이드록시에탄 설폰산, 아세트산, 아스코브산, 벤젠 설폰산, 벤조산, 중탄산, 탄산, 시트르산, 에데트산, 에탄 다이설폰산, 1,2-에탄 설폰산, 퓨마르산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글라이콜산, 글라이콜 아르사닐산, 헥실레조신산, 하이드라밤산, 브롬화수소산, 염산, 요오드화수소산, 하이드록시말레산, 하이드록시나프토산, 이세티온산, 락트산, 락토바이오닉산, 라우릴 황산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄 설폰산, 나프실산, 질산, 옥살산, 팜산, 판토텐산, 페닐아세트산, 인산, 폴리갈락투론산, 프로피온산, 살리실산, 스테아르산, 아아세트산, 숙신산, 설팜산, 설파닐산, 황산, 탄닌산, 타르타르산, 톨루엔 설폰산, 및 통상적으로 생기는 아민산, 예를 들어, 글라이신, 알라닌, 페닐알라닌, 알기닌 등으로부터 선택된 무기산 및 유기산으로부터 유래된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
약제학적으로 허용가능한 염의 다른 예는 헥산산, 사이클로펜탄 프로피온산, 파이루브산, 말론산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 신남산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캠퍼설폰산, 4-메틸바이사이클로-[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카복실산, 3-페닐프로피온산, 트라이메틸아세트산, 3차 뷰틸아세트산, 뮤콘산 등을 포함한다. 본 발명은 또한 산성 양성자가 금속 이온, 예를 들어 알칼리 금속 이온, 알칼리토금속 이온 또는 알루미늄 이온에 의해 대체되는 모 화합물에서 존재할 때 형성되는 염을 포함하거나; 또는 에탄올아민, 다이에탄올아민, 트라이에탄올아민, 트로메트아민, N-메틸글루카민 등과 같은 유기 염기를 배위한다. 염 형태에서, 화합물 대 염의 양이온 또는 음이온의 비가 1:1, 또는 1:1이 아닌 임의의 비, 예를 들어, 3:1, 2:1, 1:2 또는 1:3일 수 있다는 것이 이해된다.
약제학적으로 허용가능한 염에 대한 모든 언급은 동일한 염 중에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 용매 추가 형태(용매화물) 또는 결정 형태(다형체)를 포함한다는 것이 이해되어야 한다.
화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 경구로, 비강으로, 경피로, 폐로, 흡입으로, 협측으로, 설하로, 복강내로, 피하로, 근육내로, 정맥내로, 직장으로, 흉막내로, 척추강내로 및 비경구로 투여된다. 일 실시형태에서, 화합물은 경구로 투여된다. 당업자는 특정 투여 경로의 이점을 인식할 것이다.
화합물을 이용하는 투약 요법은 환자의 유형, 종, 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태; 치료될 병태의 중증도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 및 사용되는 특정 화합물 및 이의 염을 포함하는 다양한 인자에 따라 선택된다. 보통의 숙련된 의사 또는 수의사는 병태의 진행을 예방, 대응 또는 저지하기 위해 필요한 약물의 유효량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
개시된 본 발명의 화합물의 제형 및 투여를 위한 기술은 문헌[Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995)]에서 찾을 수 있다. 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 조합하여 약제학적 제제에서 사용된다. 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체는 비활성 고체 충전제 또는 희석제 및 멸균 수성 또는 유기 용액을 포함한다. 화합물은 본 명세서에 기재된 범위에서 요망되는 투약량을 제공하는데 충분한 양으로 이러한 약제학적 조성물 중에 존재할 것이다.
본 명세서에서 사용된 모든 백분율 및 비는, 달리 표시되지 않는 한, 중량이다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 상이한 실시예로부터 명백하게 된다. 제공된 실시예는 본 발명을 실시함에 있어 유용한 상이한 성분 및 방법을 예시한다. 실시예는 특허청구된 발명을 제한하지 않는다. 본 개시내용에 기반하여, 당업자는 본 발명을 실행하는데 유용한 다른 성분 및 방법을 동정하고 사용할 수 있다.
본 명세서에 기재된 합성 반응식에서, 화합물은 단순함을 위해 하나의 특정 입체 배치(예를 들어, 특정 표시된 입체이성질체가 있거나 또는 없음)로 그려질 수 있다. 이러한 특정 입체 배치 또는 이의 결여는 본 발명을 하나 또는 다른 이성질체, 호변체, 레지오이성질체 또는 입체이성질체로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 그것이 이성질체, 호변체, 레지오이성질체 또는 입체이성질체의 혼합물을 제외하는 것으로 해석되어서는 안 되지만; 주어진 이성질체, 호변체, 레지오이성질체 또는 입체이성질체는 다른 이성질체, 호변체, 레지오이성질체 또는 입체이성질체보다 더 높은 활성 수준을 가질 수 있다는 것이 이해될 것이다.
일단 생성되면 상기 기재된 방법에 의해 설계, 선택 및/또는 최적화된 화합물은 화합물이 생물학적 활성을 갖는지 여부를 결정하기 위해 당업자에게 공지된 다양한 분석을 사용하여 특성규명될 수 있다.　 예를 들어, 분자는 그들이 예측된 활성, 결합 활성 및/또는 결합 특이성을 갖는지 여부를 결정하기 위해, 이하에 기재된 해당 분석을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 통상적인 분석에 의해 특성규명될 수 있다.
더 나아가, 고속대량 스크리닝(high-throughput screening)을 사용하여 이러한 분석을 사용하는 분석의 속도를 높일 수 있다. 그 결과, 당업계에 공지된 기법을 사용하여 활성에 대해 본 명세서에 기재된 분자를 빠르게 스크리닝하는 것이 가능할 수 있다. 고속대량 스크리닝을 수행하기 위한 일반적 방법은, 예를 들어 문헌[Devlin (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker]; 및 미국 특허 제5,763,263호에 기재되어 있다.　 고속대량 분석은 이하에 기재된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 상이한 분석 기법을 사용할 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허 문헌은 각각의 이러한 간행물 또는 문헌이 본 명세서에 참조로서 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시되는 바와 같이 본 명세서에 참조로서 포함된다.　간행물 및 특허 문헌의 인용은 어떤 것도 적절한 선행 기술이라는 용인으로서 의도되는 것도 아니고, 그것이 선행기술의 내용 또는 일자에 대한 어떤 용인을 구성한다는 것으로도 의도되지 않는다. 본 발명은 이제 기재된 설명에 의해 설명되며, 당업자는 본 발명이 다양한 실시형태에서 실행될 수 있고 앞서 언급한 설명 및 이하의 실시예는 예시의 목적을 위한 것이고 하기의 특허청구범위의 제한은 아니라는 것을 인식할 것이다.
실시예
실시예 1 본 발명의 화합물의 합성
일반적 실험
NMR
달리 언급되지 않는 한, CDCl3을 사용하여 1H-NMR 스펙트럼을 취하였고, 배리언(Varian) 또는 옥스포드(Oxford) 기기 자석형(500㎒) 기기를 사용하여 400 또는 500㎒에서 기록하였다. 나타난 다중선은 다음과 같다 s=단일선, d = 2중선, t = 3중선, q = 4중선, 퀸트 = 5중선, sxt = 6중선, m = 다중선, dd = 이중선의 이중선, dt = 삼중선의 이중선; br은 넓은 신호를 나타냄.
LCMS 및 HPLC
질량: 워터스 엑퀴티 초성능 LC(Waters Acquity Ultra Performance LC). HPLC: 150 x 4.5㎜ YMC ODS-M80 칼럼을 또는 1.0㎖/분에서 150 x 4.6㎜ YMC-Pack Pro C18 칼럼을 이용하는 시마즈(Shimadzu) SPD-20A에 의해 생성물을 분석하였다. 이동상은 MeCN:H2O=3:2(0.3% SDS 및 0.05% H3PO4를 함유함)였다. 생성물을 3100 질량 검출기를 지니는 워터스 오토정제 시스템(Waters AutoPurification System)을 사용하는 HPLC/MS(0.1% 수산화암모늄을 함유하는 MeOH-H2O)에 의해 정제하였다.
3-(아미노메틸)-4,6-다이메틸-1,2-다이하이드로피리딘-2-온 HCl 염
Figure pct00012
H2O(200㎖) 중의 2-사이아노아세트아마이드(8.40g, 100m㏖) 및 아세틸아세톤(10.0g, 100m㏖)의 용액에 K2CO3(4.00g, 28.9m㏖)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 22시간 동안 교반시켰다. 이어서, 침전된 고체를 부흐너 깔때기를 이용하여 여과시키고 나서, 빙랭 H2O로 세척하고, 진공 압력 하에서 건조시켜 4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-카보나이트릴(13.5g, 91% 수율)을 제공하였다.
MeOH(1.50ℓ) 및 진한 HCl(30㎖) 중의 4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-카보나이트릴(10.0g, 67.5m㏖)의 용액에 N2 분위기 하에 10% Pd(OH)2(19g)를 첨가하였다. N2 기체를 H2 기체로 대체하고 나서, 혼합물을 26시간 동안 실온에서 수소 분위기 하에 교반시켰다. H2 기체를 N2 기체로 대신하였다. 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고 나서, MeOH로 세척하고, 농축시켰다. 잔사를 EtOH와 함께 분쇄하고 나서, 부흐너 깔때기를 이용하여 수집하고, 진공 압력 하에서 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체(11.5g, 90%)로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ ppm 11.86 (brs, 1H), 5.98 (s, 1H), 3.78 (m, 2H), 2.20 (s, 3H), 2.16 (s, 3H).
5-브로모-2-메틸-3-나이트로벤조산
Figure pct00013
H2SO4(20㎖) 중의 2-메틸-3-나이트로벤조산(5.00g, 27.6m㏖)의 교반 용액에 1,3-다이브로모-5,5-다이메틸하이단토인(4.34g, 15.20m㏖)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 5시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 빙랭 물에 붓고 나서, 얻어진 침전된 고체를 수집하고, 물로 세척하고 나서 진공에서 건조시켜 백색 고체로서 표제 화합물(7.28g, 정량적 수율)을 제공하였다. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm; 8.31 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 2.43 (s, 3H).
메틸 5-브로모-2-메틸-3-나이트로벤조에이트
Figure pct00014
DMF(100㎖) 중의 5-브로모-2-메틸-3-나이트로벤조산(7.28 g, 28.0 m㏖)의 교반 용액에 탄산나트륨(11.9 g, 112m㏖) 및 요오드화메틸(15.9 g, 112m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 8시간 동안 교반시켰다. 반응 완료 후에, 반응 혼합물을 여과시키고 나서 에틸 아세테이트로 세척하였다. 합한 여과액을 물로 세척하고 나서, 수성상을 에틸 아세테이트로 재추출하였다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 여과 후, 감압 하에 농축시켜 고체로서 표제 화합물(7.74 g, 정량적 수율)을 얻었다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ(ppm); 8.17 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 2.59 (s, 3H).
메틸 3-아미노-5-브로모-2-메틸벤조에이트
Figure pct00015
수성 EtOH(EtOH 100㎖ 및 H2O 20㎖) 중의 메틸 5-브로모-2-메틸-3-나이트로벤조에이트(7.60g, 27.7m㏖)의 교반 용액에 염화암모늄(4.45g, 83.1m㏖) 및 철(4.64g, 83.1m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 5시간 동안 교반시켰다. 이어서, 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고 나서, 셀라이트 층을 에틸 아세테이트로 세척하였다. 합한 여과액을 진공에서 농축시켰다. 얻어진 잔사를 에틸 아세테이트 및 수 중에서 용해시켰다. 수층을 에틸 아세테이트로 추출하였다(2회). 합한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 여과시키고, 감압 하에 농축시켜 갈색 오일로서 표제 화합물(6.67g, 99%)을 얻었다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm; 7.37 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.80 (brs, 2H), 2.31 (s, 3H).
화합물 1:
Figure pct00016
단계 1: 메틸 5-(((트랜스)-4-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)사이클로헥실)(에틸)아미노)-4'-하이드록시-4-메틸-[1,1'-바이페닐]-3-카복실레이트의 합성
다이옥산(225㎖)과 물(75㎖)의 혼합물 중의 메틸 5-브로모-3-(((트랜스)-4-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)사이클로헥실)(에틸)아미노)-2-메틸벤조에이트(10g, 21.3m㏖, 예를 들어, WO2012142504호(변리사 문서 번호 4 1478-507001WO) 참조) 및 (4-하이드록시페닐)보론산(3.5g, 25.3m㏖)의 용액에 Na2CO3(8.01g, 75.5m㏖)를 첨가하고 나서, 용액을 아르곤으로 30분 동안 퍼지시켰다. 이어서, Pd(PPh3)4(2.4g, 2.07m㏖)를 첨가하고 나서, 아르곤을 다시 다른 15분 동안 퍼지시켰다. 반응물을 100℃에서 4시간 동안 가열하였다. 완료 시, 반응 혼합물을 물로 희석시키고 나서, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기층을 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 하에서 용매의 제거 후에 칼럼 크로마토그래피 정제로 표제 화합물(8.9g, 87% 수율)을 제공하였다.
단계 2: 메틸 5-(((트랜스)-4-((tert-뷰톡시카보닐)아미노) 사이클로헥실) (에틸)아미노)-4'-(2-메톡시에톡시)-4-메틸-[1,1'-바이페닐]-3-카복실레이트의 합성
아세토나이트릴(6㎖) 중의 메틸 5-(((트랜스)-4-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)사이클로헥실)(에틸)아미노)-4'-하이드록시-4-메틸-[1,1'-바이페닐]-3-카복실레이트(0.6g, 1.24m㏖) 및 1-브로모-2-메톡시에탄(0.519g, 3.73m㏖)의 교반 용액에, Cs2CO3(0.485g, 1.49m㏖)를 첨가하고 나서, 반응물을 80℃에서 12시간 동안 교반시켰다. 완료 시, 물을 그것에 첨가하고 나서, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 감압 하에 농축시켰다. 조질의 화합물을 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물(0.6g, 76.5% 수율)을 얻었다.
단계 3: tert-뷰틸((트랜스)-4-((5-(((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일) 메틸) 카바모일)-4'-(2-메톡시에톡시)-4-메틸-[1,1'-바이페닐]-3-일(에틸)-아미노)-사이클로헥실) 카바메이트의 합성
수성 NaOH(0.066g, 5㎖ H2O 중의 1.66m㏖)를 EtOH(10㎖) 중의 메틸 5-(((트랜스)-4-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)사이클로헥실)(에틸)아미노)-4'-(2-메톡시에톡시)-4-메틸-[1,1'-바이페닐]-3-카복실레이트(0.6g, 1.11m㏖)의 용액에 첨가하고 나서, 60℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응의 완료 후에, 에탄올을 감압 하에 제거하고 나서, 잔사를 시트르산을 사용하여 산성화하고, 시트르산을 사용하여 pH 4까지 조절하였다. DCM 중의 10% 메탄올을 사용하여 추출을 수행하였다. 합한 유기층을 건조시키고 나서, 농축시켜 각각의 산(0.5g, 85.6% 수율)을 제공하였다.
이어서, 상기 산(0.5g, 0.95m㏖)을 DMSO(5㎖) 및 3-(아미노메틸)-4,6-다이메틸피리딘-2(1H)-온(0.288g, 1.90m㏖) 중에 용해시키고 나서, 트라이에틸 아민(0.096g, 0.950m㏖)을 그것에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반시킨 후에 PyBop(0.741g, 1.42m㏖)를 그것에 첨가하고 나서, 실온에서 밤새 교반을 계속하였다. 반응의 완료 후에, 반응물을 얼음에 붓고 나서, 10% MeOH/DCM을 사용하여 추출을 수행하였다. 합한 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 감압 하에 농축시켜 조질의 물질을 얻었고, 이어서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물(0.45g, 71.8% 수율)을 얻었다.
단계 4: N-((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)-5-(((트랜스)-4-(다이메틸아미노)-사이클로헥실)(에틸)-아미노)-4'-(2-메톡시에톡시)-4-메틸-[1,1'-바이페닐]-3-카복스아마이드의 합성
0℃에서 DCM(5㎖) 중의 tert-뷰틸((트랜스)-4-((5-(((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)카바모일)-4'-(2-메톡시에톡시)-4-메틸-[1,1'-바이페닐]-3-일)(에틸)아미노)사이클로헥실)카바메이트(0.45g, 0.681m㏖)의 교반 용액에, TFA(1㎖)를 첨가하고 나서, 반응물을 2시간 동안 실온에서 교반시켰다. 완료 후, 반응물을 농축건조시켰다. 이어서, 잔사를 Na2CO3(수성)를 이용하여 pH 8로 염기화하고, 수층을 DCM 중의 20% 메탄올로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 용매를 감압 하에 제거하여 Boc-탈보호된 화합물(0.3g, 78.7% 수율)을 제공하였다.
다이클로로메탄(3㎖) 중의 Boc-탈보호된 화합물(0.3g, 0.535m㏖)의 교반 용액에 0℃에서 폼알데하이드 용액(35-41% 수성)(0.056g, 1.87m㏖)을 첨가하고 나서, 20분 동안 교반시켰다. 이어서, NaBH(OAc)3(0.28g, 1.33m㏖)를 첨가하고 나서, 2시간 동안 0℃에서 교반시켰다. 반응의 완료 시, 물을 첨가하고 나서, DCM 중의 20% 메탄올로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 용매를 감압 하에 제거하였다. 조질의 화합물을 분취 HPLC에 의해 정제하여 표제 화합물(0.1g, 31.7% 수율)을 얻었다.
LCMS: 589.75 (M+1)+; TFA-염: 1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ11.47 (brs, 1H), 9.48 (brs, 1H), 8.21 (brs, 1H), 7.57 (d, 2H, J=8.0 Hz), 7.40 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.03 (d, 2H, J=8.8 Hz), 5.87 (s, 1H), 4.29 (d, 2H, J=4.4 Hz), 4.14-4.12 (m, 2H), 3.69-3.66 (m, 2H), 3.32 (s, 3H), 3.13 (m, 4H), 2.69-2.68 (m, 6H), 2.24 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 1.96 (m, 4H), 1.44 (m, 4H), 0.85 (t, 3H, J=6.8 Hz).
화합물 2:
Figure pct00017
Figure pct00018
단계 1: 메틸 5-브로모-3-(((트랜스)-4-((tert-뷰톡시카보닐)(메틸)-아미노)-사이클로헥실)(에틸)아미노)-2-메틸벤조에이트의 합성
THF(30㎖) 중의 메틸 5-브로모-3-(((트랜스)-4-((tert-뷰톡시카보닐)아미노)사이클로헥실)(에틸)아미노)-2-메틸벤조에이트(3g, 6.41m㏖, 예를 들어, WO2012142504 참조)의 교반 용액에, NaH(0.184g, 7.69m㏖)를 0℃에서 첨가하고 나서, 그것을 동일 온도에서 20분 동안 교반시켰다. 이어서, 요오드화메틸(9.10g, 64.10m㏖)을 첨가하고 나서, 0℃에서 반응물을 밤새 실온에서 교반시켰다. 완료 시, 반응을 얼음물로 퀀칭시키고 나서, 다이클로로메탄으로 추출하였다. 합한 유기층을 물로 세척하고 나서, 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 조질의 화합물을 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 조질의 표제 화합물을 얻었고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다(3g, 97.4% 수율).
단계 2: 메틸 3-(((트랜스)-4-((tert-뷰톡시카보닐)(메틸)-아미노)-사이클로헥실)(에틸)아미노)-5-(3-하이드록시프로프-1-인-1-일)-2-메틸벤조에이트의 합성
건조 톨루엔 중의 메틸 5-브로모-3-(((트랜스)-4-((tert-뷰톡시카보닐)(메틸)-아미노)-사이클로헥실)(에틸)아미노)-2-메틸벤조에이트(2g, 4.14m㏖)의 교반 용액에 CuI(0.015g, 0.079m㏖), PPh3(0.043g, 0.165m㏖), PdCl2(PPh3)2(0.058g, 0.082m㏖), N,N-다이아이소프로필 아민(1.08g, 10.78m㏖)을 첨가하고 나서, 반응물을 아르곤으로 15분 동안 퍼지시켰다. 프로프-2-인-1-올(0.46g, 8.29m㏖)을 그것에 첨가하고 나서, 반응물을 밀봉 조건에서 80℃에서 5시간 동안 가열하였다. 완료 시, 그것을 물로 퀀칭시키고 나서, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시켰다. 조질의 화합물 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물(1.2g, 63.2% 수율)을 정제하였다.
단계 3: 메틸 5-(3-브로모프로프-1-인-1-일)-3-(((트랜스)-4-((tert-뷰톡시 카보닐)(메틸)아미노)사이클로헥실)(에틸)아미노)-2-메틸벤조에이트의 합성:
DCM (15㎖) 중의 메틸 3-(((트랜스)-4-((tert-뷰톡시카보닐)(메틸)-아미노)-사이클로헥실)(에틸)아미노)-5-(3-하이드록시프로프-1-인-1-일)-2-메틸벤조에이트(1.2g, 2.62m㏖)의 교반 용액에, PPh3(1.37g, 5.22m㏖) 및 CBr4(1.7g, 5.10m㏖)를 0℃에서 첨가하였고, 반응물을 4시간 동안 실온에서 교반시켰다. 완료 시, 반응을 얼음물로 퀀칭시키고 나서, 다이클로로메탄으로 추출하였다. The 합한 유기층을 물로 세척하고 나서, 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 조질의 물질을 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물(0.5g, 38.5% 수율)을 얻었다.
단계 4: 메틸 3-(((트랜스)-4-((tert-뷰톡시카보닐)(메틸)아미노) 사이클로헥실)(에틸)아미노)-2-메틸-5-(3-몰폴리노프로프-1-인-1-일)벤조에이트의 합성
DMF 중의 메틸 5-(3-브로모프로프-1-인-1-일)-3-(((트랜스)-4-((tert-뷰톡시 카보닐)(메틸)아미노)사이클로헥실)(에틸)아미노)-2-메틸벤조에이트(1 당량)의 교반 용액에, 몰폴린(5 당량)을 첨가하고 나서, 반응물을 12시간 동안 실온에서 교반시켰다. 완료 시, 반응물을 얼음물로 퀀칭시키고 나서, 다이클로로메탄으로 추출하였다. 합한 유기층을 물로 세척하고 나서, 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 목적으로 하는 조질의 표제 화합물을 얻었고 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다(98.7% 수율)
단계 5: tert-뷰틸((트랜스)-4-((3-(((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로 피리딘-3-일)메틸)카바모일)-2-메틸-5-(3-몰폴리노프로프-1-인-1-일) 페닐)(에틸)아미노)사이클로헥실)(메틸)카바메이트의 합성
NaOH (1.5 eq.)을 EtOH: H2O(9:1) 중의 메틸 3-(((트랜스)-4-((tert-뷰톡시카보닐)(메틸)아미노)사이클로헥실)(에틸)아미노)-2-메틸-5-(3-몰폴리노프로프-1-인-1-일)벤조에이트(1 당량)의 용액에 첨가하고 나서, 60℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응의 완료 후에, 에탄올을 감압 하에 제거하고 나서, 묽은 HCl을 사용하여 pH 6까지 산성화하고, 시트르산을 사용하여 pH 4로 조절하였다. DCM 중의 10% 메탄올을 사용하여 추출을 수행하였다. 합한 유기층을 농축건조시켜 각각의 산을 제공하였다.
이어서, 상기 산(1 당량)을 DMSO 중에 용해시키고, 3-(아미노 메틸)-4,6-다이메틸피리딘-2(1H)-온(2 당량) 및 트라이에틸 아민(1 당량)을 그것에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반시킨 후에 PyBop(1.5 당량)를 그것에 첨가하고, 밤새 실온에서 교반을 계속하였다. 반응의 완료 후에, 반응물을 얼음에 붓고 나서, 10% MeOH/DCM을 사용하여 추출을 수행하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 감압 하에 농축시켜 조질의 물질을 얻었고, 이어서 물에 의해 정제한 다음, 아세토나이트릴로 세척하여 목적으로 하는 표제 화합물(69.4% 수율)을 얻었다.
단계 6: N-((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)-3-(에틸((트랜스)-4-(메틸아미노)사이클로헥실)아미노)-2-메틸-5-(3-몰폴리노프로프-1-인-1-일)벤즈아마이드의 합성
0℃에서 DCM 중의 tert-뷰틸((트랜스)-4-((3-(((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로 피리딘-3-일)메틸)카바모일)-2-메틸-5-(3-몰폴리노프로프-1-인-1-일) 페닐)(에틸)아미노)사이클로헥실)(메틸)카바메이트(1 당량)의 교반 용액에, TFA(3 당량)를 첨가하고 나서, 반응물을 2시간 동안 실온에서 교반시켰다. 완료 후, 반응물을 농축건조시켰다. 이어서, 잔사를 Na2CO3(수성)로 pH 8까지 염기화하고 나서, 수층을 DCM 중의 20% 메탄올로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 용매를 감압 하에 제거하여 표제 화합물(99% 수율)을 얻었고, 이를 추가 정제 없이 다음 반응에서 사용하였다.
단계 7: N-((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)-3-(에틸((트랜스)-4-((2-메톡시에틸)(메틸)아미노)사이클로헥실)아미노)-2-메틸-5-(3-몰폴리노프로프-1-인-1-일)벤즈아마이드의 합성
다이클로로에탄 중의 N-((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)-3-(에틸((트랜스)-4-(메틸아미노)사이클로헥실)아미노)-2-메틸-5-(3-몰폴리노프로프-1-인-1-일)벤즈아마이드(1 당량)의 교반 용액에, 2-메톡시아세트알데하이드(10 당량) 및 아세트산(6 당량)을 첨가하고 나서, 0℃에서 20분 동안 교반시켰다. 이어서, NaBH(OAc)3(3 당량)를 첨가하고 나서, 0℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 반응의 완료 시, 물을 첨가하고 나서 DCM 중의 20% 메탄올로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 용매를 감압 하에 제거하였다. 조질의 화합물 분취 HPLC에 의해 정제하여 표적 분자(0.1g, 33.6% 수율)를 얻었다.
LCMS: 606.65 (M+1)+; TFA 염: 1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ11.50 (brs, 1H), 9.22 (brs, 1H), 8.18 (t, 1H), 7.24 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 5.86 (s, 1H), 4.26-4.25 (m, 4H), 3.66-3.59 (m, 4H), 3.48-3.36 (m, 3H), 3.29-3.17 (m, 7H), 3.04-3.01 (m, 3H), 2.69-2.68 (m, 4H), 2.20 (s, 3H), 2.19 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.00-1.92 (m, 2H), 1.82-1.73 (m, 3H), 1.46 (m, 4H), 0.78 (t, 3H, J=6.4 Hz).
화합물 2에 대한 대안의 합성 반응식:
Figure pct00019
단계 A: 4-(프로프-2-인-1-일)몰폴린의 합성:
아세톤(300㎖) 중의 프로파길 브롬화물(50g, 420m㏖)의 교반 용액에, Cs2CO3(136.5g, 420m㏖)를 0℃에서 첨가하였다. 이어서, 아세톤(200㎖) 중의 몰폴린(36.60g, 420m㏖)을 적가하고 나서, 반응물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 완료 시, 반응물을 여과시키고 나서, 여과액을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물(50g, 조질)을 얻었다. 단리된 화합물을 추가 정제 없이 후속 결합 단계에서 직접 사용하였다.
단계 1: 메틸 5-브로모-3-(에틸((트랜스)-4-(메틸아미노) 사이클로헥실) 아미노)-2-메틸벤조에이트의 합성:
0℃에서 메탄올(100㎖) 중의 메틸 5-브로모-3-(((트랜스)-4-((tert-뷰톡시카보닐)(메틸)아미노)사이클로헥실)(에틸)아미노)-2-메틸벤조에이트(30g, 62.24m㏖)의 교반 용액에, 메탄올 HCl(500㎖)을 첨가하고 나서, 반응물을 2시간 동안 실온에서 교반시켰다. 완료 후, 반응물을 농축건조시켰다. 잔사를 Na2CO3(수성)에 의해 pH 8로 염기화하고 나서, 수성층을 DCM 중의 10% 메탄올로 추출하였다(200㎖ x 3). 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 용매를 감압 하에 제거하여 표제 화합물을 무색의 오일(25g, 조질)로서 얻었다. 단리된 화합물을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
단계 2: 메틸 5-브로모-3-(에틸((트랜스)-4-((2-메톡시에틸)(메틸)-아미노) 사이클로헥실) 아미노)-2-메틸벤조에이트의 합성:
아세토나이트릴(250㎖) 중의 조질의 메틸 5-브로모-3-(에틸((트랜스)-4-(메틸아미노) 사이클로헥실)아미노)-2-메틸벤조에이트(25g, 65.44m㏖), 1-브로모-2-메톡시에탄(18.19g, 130.8m㏖)의 교반 용액에, K2CO3(18.06g, 130.8m㏖) 및 KI(6.51g, 39.21m㏖)를 첨가하였다. 얻어진 반응물을 65℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 완료 시, 반응 혼합물 물(300㎖)로 희석시키고 나서, DCM으로 추출하였다(500㎖ x 3). 합한 유기층을 물로 세척하고 나서, Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 조질의 화합물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물(20g, 69.3% 수율)을 얻었다.
1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 7.55 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.32 (m, 4H), 3.20 (s, 3H), 3.05 (q, 2H), 2.61 (m, 1H), 2.32 (s, 3H), 2.30 (m, 1H), 2.15 (s, 3H), 1.77-1.67 (m, 4H), 1.37-1.31(m, 2H), 1.24-1.18 (m, 2H), 0.78 (t, 3H, J=6.8 Hz).
단계 3: 메틸 3-(에틸((트랜스)-4-((2-메톡시에틸)(메틸)-아미노)-사이클로헥실)-아미노)-2-메틸-5-(3-몰폴리노프로프-1-인-1-일)벤조에이트의 합성:
DMF(300㎖) 중의 메틸 5-브로모-3-(에틸((트랜스)-4-((2-메톡시에틸)(메틸)-아미노) 사이클로헥실) 아미노)-2-메틸벤조에이트(30g, 68.02m㏖), 4-(프로프-2-인-1-일) 몰폴린(25.51g, 204m㏖) 및 트라이에틸아민(20.61g, 204m㏖)의 용액을 아르곤으로 20분 동안 버블링하였다. 이어서, CuI(3.87g, 20.36m㏖) 및 Pd (PPh3)4(7.85g, 6.79m㏖)를 첨가하고 나서, 아르곤을 추가 20분 동안을 통해 버블링하였다. 반응 혼합물을 105℃에서 4시간 동안 가열하고 나서, 실온으로 냉각시켰다. 반응을 물(100㎖)로 퀀칭시키고, 수성상을 10% MeOH/DCM으로 추출하였다(400㎖ x 3). 합한 유기 추출물을 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 나서, 농축시켰다. 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물(21g, 63.7% 수율)을 얻었다.
1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 7.46 (s, 1H), 7.32 (s, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.62-3.57 (m, 6H), 3.50 (s, 2H), 3.35-3.32 (m, 2H), 3.21 (s, 3H), 3.17 (m, 1H), 3.05 (q, 2H), 2.61-2.58 (m, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.33 (m, 1H), 2.18 (m, 2H), 1.77-1.70 (m, 4H), 1.36-1.20 (m, 4H), 0.77 (t, 3H, J=6.8 Hz), 3H는 용매 피크에 합쳐졌다.
단계 4: N-((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)-3-(에틸((트랜스)-4-((2-메톡시에틸)(메틸)아미노)사이클로헥실)아미노)-2-메틸-5-(3-몰폴리노프로프-1-인-1-일)벤즈아마이드의 합성:
수성 NaOH(2.59g, 10㎖ H2O 중의 64.91m㏖)를 EtOH(100㎖) 중의 메틸 3-(에틸((트랜스)-4-((2-메톡시에틸)(메틸)-아미노)-사이클로헥실)-아미노)-2-메틸-5-(3-몰폴리노프로프-1-인-1-일)벤조에이트(21g, 43.29m㏖)의 용액에 첨가하고 나서, 60℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응의 완료 후에, 에탄올을 감압 하에 제거하고 나서, 잔사를 묽은 HCl을 사용하고 시트르산을 사용하여 pH 4로 산성화하였다. 10 % MeOH/DCM을 사용하여 추출을 수행하였다(200㎖ x 3). 합한 유기층을 농축건조시켜 각각의 산(15.5g, 76% 수율)을 제공하였다.
DMSO(50㎖) 중의 상기 산(15.5g, 32.90m㏖)의 용액에, 3-(아미노 메틸)-4,6-다이메틸피리딘-2(1H)-온(10g, 65.80m㏖) 및 트라이에틸 아민(23㎖, 164.5m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반시킨 후에 PyBop(25.66g, 49.34m㏖)를 그것에 0℃에서 첨가하고, 추가로 밤새 실온에서 교반시켰다. 완료 후, 반응물을 얼음물(100㎖)에 붓고 나서, 추출을 10% MeOH/DCM을 사용하여 수행하였다(200㎖ x 3). 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 감압 하에 농축시켰다. 조질의 화합물을 MeOH:DCM으로 용리하는 염기성 알루미나에 걸친 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물(11g, 55.3% 수율)을 얻었다.
LCMS: 606.50 (M + 1)+; 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ7.23 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.11 (s, 1H), 4.46 (s, 2H), 3.74-3.72 (m, 4H), 3.51 (s, 2H), 3.47 (t, 2H, J=5.6 Hz,), 3.32 (s, 3H), 3.07 (q, 2H, J=7.2 Hz), 2.64-2.63 (m, 7H), 2.38 (m,1H), 2.37 (s, 3H), 2.27 (s, 3H), 2.26 (s, 3H), 2.25 (s, 3H), 1.89-1.86 (m, 4H), 1.50-1.30 (m, 4H), 0.83 (t, 3H, J=7.2 Hz).
화합물 105:
메틸 5-브로모-2-메틸-3-[(옥산-4-일)아미노]벤조에이트
Figure pct00020
CH2Cl2(500㎖) 및 AcOH(60㎖) 중의 메틸 3-아미노-5-브로모-2-메틸벤조에이트(40.2g, 165m㏖)의 교반 용액에 다이하이드로-2H-피란-4-온(17.3g, 173m㏖) 및 나트륨 트라이아세톡시보로하이드라이드(73.6g, 330m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반시켰다. 이어서, 포화 수성 NaHCO3을 첨가하고 나서, 혼합물을 분리시켰다. 수층을 CH2Cl2로 추출하고 나서, 합한 유기층을 진공에서 농축시켰다. 잔사를 에틸에터와 함께 분쇄하고 나서, 얻어진 침전물을 수집하여 백색 고체로서 표제 화합물(39.1g, 72%)을 얻었다. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δppm; 7.01 (s, 1H), 6.98 (s, 1H), 5.00 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.84-3.87 (m, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.54-3.56 (m, 1H), 3.43 (m, 2H), 2.14 (s, 3H), 1.81-1.84 (m, 2H), 1.47-1.55 (m, 2H).
메틸 5-브로모-3-[에틸(옥산-4-일)아미노]-2-메틸벤조에이트
Figure pct00021
CH2Cl2(400㎖) 및 AcOH(40㎖) 중의 메틸 5-브로모-2-메틸-3-[(옥산-4-일)아미노]벤조에이트(39.1g, 119m㏖)의 교반 용액에 아세트알데하이드(24.7g, 476m㏖) 및 나트륨 트라이아세톡시보로하이드라이드(79.6g, 357m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. 이어서, 포화 수성 NaHCO3을 첨가하고 나서, 혼합물을 분리시켰다. 수층을 CH2Cl2로 추출하고 나서, 합한 유기층을 진공에서 농축시켰다. 잔사를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(SiO2 헵탄/EtOAc = 3/1)에 의해 정제하여 점성의 오일로서 표제 화합물(44.1g, 정량적 수율)을 제공하였다. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δppm; 7.62 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 3.80 (m, 5H), 3.31 (m, 2H), 2.97-3.05 (m, 2H), 2.87-2.96 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 1.52-1.61 (m, 2H), 1.37-1.50 (m, 2H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
tert -뷰틸 4-((3-(에틸(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-5-(메톡시카보닐)-4-메틸페닐)에티닐)피페리딘-1-카복실레이트
Figure pct00022
DMF(40㎖) 중의 메틸 5-브로모-3-(에틸(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-2-메틸벤조에이트(1.80g, 5.05m㏖) 및 tert-뷰틸 4-에티닐피페리딘-1-카복실레이트(1.80g, 8.59m㏖)의 용액에 트라이에틸아민(2.82 ㎖, 20.2m㏖) 및 요오드화 구리(I)(0.096g, 0.505m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 버블링에 의해 15분 동안 탈기시켰다. 이어서, 테트라키스(트라이페닐포스핀)팔라듐(0)(0.292g, 0.253m㏖)을 도입하고 나서, 추가적인 10분 동안 질소를 버블링함으로써 탈기시켰다. 반응 혼합물을 80℃에서 6시간 동안 가열하였다. 반응을 포화 NaHCO3로 퀀칭시키고 나서, TBME(3x40㎖)로 추출하였고, Na2SO4로 건조 후, 여과시키고 나서, 농축시켰다. 잔사를 크로마토그래피(0% 내지 40% AcOEt/헵탄)에 의해 정제하여 표제 화합물(2.40g, 98% 수율)을 제공하였다. 1H-NMR (500 MHz) δppm; 7.65 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 3.97 (brd, J = 11.3 Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.76 (m, 2H), 3.34 (dt, J = 2.0, 11.7 Hz, 2H), 3.24 (ddd, J = 3.4, 8.8, 12.2 Hz, 2H), 3.08 (brs, 2H), 2.98 (brs, 1H), 2.80 (dddd, J=3.9, 3.9, 3.9, 3.9 Hz, 1H), 2.52 (s, 3H), 1.87 (m, 2H), 1.60-1.74 (m, 6H), 1.48 (s, 9H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H); MS (ESI) [M+H]+ 485.4.
5-((1-( tert -뷰톡시카보닐)피페리딘-4-일)에티닐)-3-(에틸(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-2-메틸벤조산
Figure pct00023
에탄올(20.0㎖) 중의 tert-뷰틸 4-((3-(에틸(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-5-(메톡시카보닐)-4-메틸페닐)에티닐)피페리딘-1-카복실레이트(2.4g, 4.95m㏖)의 용액에 실온에서 물(3.0㎖) 중의 수산화나트륨(0.565g, 14.1m㏖) 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 6시간 동안 가열하였다. 반응을 1 M HCl(5㎖)로 퀀칭시키고 나서, 과량의 시트르산 용액으로 pH를 5로 조절하였다. 혼합물을 농축시켜 EtOH를 제거하였고, 남아있는 수성상을 AcOEt로 추출하였다(2x40㎖). 유기층을 합하고, Na2SO4로 건조시킨 후, 여과시키고 나서, 농축시켰다. 잔사를 크로마토그래피(10% 내지 100% AcOEt/헵탄)에 의해 정제하여 표제 화합물(2.30g, 99% 수율)을 제공하였다. 1H-NMR (500 MHz) δppm; 7.82 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 3.98 (brd, J = 11.3Hz, 2H), 3.77 (m, 2H), 3.35 (dt, J = 1.5, 11.3Hz, 2H), 3.25 (ddd, J = 3.4, 8.3, 12.2 Hz, 2H), 3.11 (brs, 2H), 3.00 (brs, 1H), 2.81 (dddd, J=3.9, 3.9, 3.9, 3.9 Hz, 1H), 2.60 (s, 3H), 1.88 (m, 2H), 1.60-1.78 (m, 6H), 1.48 (s, 9H), 0.90 (t, J = 6.8Hz, 3H); MS (ESI) [M+H]+ 471.4.
tert -뷰틸 4-((3-(((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)카바모일)-5-(에틸(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-4-메틸페닐)에티닐)피페리딘-1-카복실레이트
Figure pct00024
실온에서 DMSO(5.8㎖) 중의 5-((1-(tert-뷰톡시카보닐)피페리딘-4-일)에티닐)-3-(에틸(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-2-메틸벤조산(1.06g, 2.25m㏖)의 용액에 트라이에틸아민(0.90㎖, 6.44m㏖) 및 (4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메탄아미늄 클로라이드(0.405g, 2.15m㏖)를 첨가하였다. 맑은 용액은 균질하게 되었다. 이어서, HOBT(0.493g, 3.22m㏖) 및 EDC(0.617g, 3.22m㏖)을 첨가하고 나서, 얻어진 반응 혼합물 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응을 물(80㎖)로 퀀칭시키고 나서 1시간 동안 실온에서 교반시켰다. 슬러리를 여과시키고 나서, 케이크를 물로 세척하였다(2x20㎖). 수집한 고체를 진공 하에 건조시키고 나서, 표제 화합물(1.27g, 98% 수율)을 제공하였다. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δppm; 7.22 (s, 1H), 7.08 (d, J = 1.0 Hz 1H), 6.11 (s, 1H), 4.45 (s, 2H), 3.92 (brd, J = 10.8 Hz, 2H), 3.78 (dd, J =4.4, 5.4 Hz, 1H), 3.75 (dd, J =4.4, 5.4 Hz, 1H), 3.36 (t, J = 11.7 Hz, 2H), 3.21 (br t, J=8.3 Hz, 2H), 3.07 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 3.01 (dddd, J=3.9, 3.9, 11.3, 11.3 Hz, 1H), 2.84 (dddd, J=3.4, 3.4. 3.9, 3.9 Hz, 1H), 2.38 (s, 3H), 2.28 (s, 3H), 2.25 (s, 3H), 1.88 (m, 2H), 1.70 ((brd, J = 12.2 Hz, 2H), 1.60 (m, 4H), 1.47 (s, 9H), 0.87 (t, J = 7.3 Hz, 3H); MS (ESI) [M+H]+ 605.6.
N -((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)-3-(에틸(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-2-메틸-5-(피페리딘-4-일에티닐)벤즈아마이드
Figure pct00025
DCM(3㎖) 중의 tert-뷰틸 4-((3-(((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)카바모일)-5-(에틸(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-4-메틸페닐)에티닐)피페리딘-1-카복실레이트(250㎎, 0.413m㏖)의 용액에 20℃에서 1,4-다이옥산(3㎖, 12.0m㏖) 중의 4M HCl을 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반시켰다. LCMS는 반응이 완료되었다는 것을 나타내었다. 반응 혼합물을 직접 농축시키고 나서, 잔사를 DCM 중에 용해시킨 다음, 포화 NaHCO3/염수로 중화시켰다. 유기층을 건조시키고 나서, (Na2SO4) 여과시켰다. 여과액을 농축시켰다. 잔사를 추가 정제 없이 알킬화를 위해 사용하였다(209㎎, 100%). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) d ppm 7.21 (brs, 1H), 7.07 (brs, 1H), 6.11 (s, 1H), 4.46 (s, 2H), 3.95-3.89 (m, 2H), 3.39-3.34 (m, 2H), 3.08 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.06-2.98 (m, 3H), 2.79-2.72 (m, 1H), 2.72-2.65 (m, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.28 (s, 3H), 2.25 (s, 3H), 1.94-1.88 (m, 2H), 1.73-1.68 (m, 2H), 1.68-1.56 (m, 4H), 0.85 (t, J = 7.0 Hz, 3H); MS (ESI) [M+H]+ 505.5.
N -((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)-3-(에틸(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-2-메틸-5-((1-메틸피페리딘-4-일)에티닐)벤즈아마이드
Figure pct00026
메탄올(5㎖) 중의 N-((4,6-다이메틸-2-옥소-1,2-다이하이드로피리딘-3-일)메틸)-3-(에틸(테트라하이드로-2H-피란-4-일)아미노)-2-메틸-5-(피페리딘-4-일에티닐)벤즈아마이드(100㎎, 0.198m㏖)의 용액에 H2O(0.155㎖, 1.98m㏖) 중의 35% 폼알데하이드를 0℃에서 첨가하였다. 0℃에서 10분 동안 교반시킨 후에, 나트륨 사이아노보로하이드라이드(24.9㎎, 0.396m㏖)를 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반시켰다. LCMS는 반응이 완료되었다는 것을 나타내었다. 반응을 포화 NaHCO3/염수로 퀀칭시키고 나서, EtAOc/헵탄으로 추출하였다. 유기층을 건조시키고 나서(Na2SO4), 여과시키고 나서, 농축시켰다. 잔사를 크로마토그래피(10 g 칼럼, MeOH/DCM=1:9, 이어서 MeOH/DCM=1:1:8 중의 MeOH/7M NH3)에 의해 정제하여 표제 화합물(96.0㎎, 93%)을 얻었다. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) d ppm 7.22 (brs, 1H), 7.08 (brs, 1H), 6.10 (s, 1H), 4.46 (s, 2H), 3.94-3.87 (m, 2H), 3.35-3.30 (m, 2H), 3.07 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.04-2.97 (m, 1H), 2.79-2.71 (m, 2H), 2.67-2.58 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 2.28 (s, 3H), 2.28 (s, 3H), 2.25 (s, 3H), 2.28-2.21 (m, 2H), 1.97-1.91 (m, 2H), 1.78-1.67 (m, 4H), 1.64-1.54 (m, 2H), 0.85 (t, J = 7.0 Hz, 3H); MS (ESI) [M+H]+ 519.4.
실시예 2: 생분석 프로토콜 및 일반적 방법
야생형 및 돌연변이체 PRC2 효소 분석에 대한 프로토콜
일반적 물질. S-아데노실메티오닌(SAM), S-아데노실호모시스테인(SAH), 비신, KCl, 트윈(Tween) 20, 다이메틸설폭사이드(DMSO) 및 소 피부 젤라틴(BSG)을 가능한 가장 고수준의 순도에서 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich)로부터 구입하였다. 다이티오트레이톨(DTT)을 EMD사로부터 구입하였다. 3H-SAM을 80 Ci/m㏖의 특이적 활성을 지니는 아메리칸 라디오라벨드 케미컬즈사(American Radiolabeled Chemicals)로부터 구입하였다. 384-웰 스트렙타비딘 플래쉬플레이트(Flashplates)를 퍼킨엘머사(PerkinElmer)로부터 구입하였다.
기질. 미변형 라이신 27(H3K27me0) 또는 다이메틸화된 라이신 27(H3K27me2) 중 하나를 함유하는 대표적인 인간 히스톤 H3 잔기 21 내지 44의 펩타이드를 21st 센추리 바이오케미컬스사(21st Century Biochemicals)에 의해 C-말단 G(K-바이오틴) 링커-친화도 태그 모티프 및 C-말단 아마이드 캡을 이용하여 합성하였다. 펩타이드를 95% 초과의 순도로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 정제하고 나서, 액체 크로마토그래피 질량분석법(LC-MS)에 의해 확인하였다. 서열을 이하에 나타낸다.
H3K27me0: ATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGGK(바이오틴)-아마이드(서열번호 101)
H3K27me2: ATKAARK(me2)SAPATGGVKKPHRYRPGGK(바이오틴)-아마이드(서열번호 102)
닭 적혈구 올리고뉴클레오솜을 확립된 절차에 따라 닭 혈액으로부터 정제하였다.
재조합체 PRC2 복합체. 인간 PRC2 복합체를 바큘로바이러스 발현시스템을 사용하여 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda: sf9)에서 과발현시킨 4-성분 효소 복합체로서 정제하였다. 발현된 서브유닛은 야생형 EZH2 작제물, EED(NM_003797), Suz12(NM_015355) 및 RbAp48(NM_005610)로부터 생성된 야생형 EZH2(NM_004456) 또는 EZH2 Y641F, N, H, S 또는 C 돌연변이체였다. EED 서브유닛은 sf9 세포 용해물로부터의 전체 4-성분 복합체를 정제하기 위해 사용한 N-말단의 FLAG 태그를 함유하였다. 복합체의 순도는 SDS-PAGE 및 애질런트 바이오어날라이저(Agilent Bioanalyzer) 분석에 의해 결정되는 바와 같이 95%를 충족시키거나 또는 초과한다. 소 혈청 알부민(BSA) 표준에 대해 브래드포드(Bradford) 분석을 사용하여 효소 저장액 농도(일반적으로 0.3 내지 1.0㎎/㎖)를 결정하였다.
펩타이드 기질에 대한 PRC2 효소 분석을 위한 일반적 절차. 분석을 모두 20mM 비신(pH = 7.6), 0.5 mM DTT, 0.005% BSG 및 0.002% 트윈20로 이루어진 완충제 중에서 수행하고 나서, 사용일에 제조하였다. 100% DMSO(1㎕) 중의 화합물을 384-채널 피펫 헤드(써모사(Thermo))를 구비한 플레이트메이트(Platemate) 2 X 3를 사용하여 폴리프로필렌 384-웰 V-자 바닥 플레이트(그라이너사(Greiner)) 내로 스팟팅하였다. DMSO(1㎕)를 최대 신호 제어를 위해 열 11, 12, 23, 24, 행 A 내지 H에 첨가하고 나서, PRC2의 공지된 생성물 및 저해제인 SAH(1㎕)를 최소 신호 제어를 위해 열 11, 12, 23, 24, 행 I 내지 P에 첨가하였다. 야생형 PRC2 효소 및 H3K27me0 펩타이드 또는 임의의 Y641 돌연변이체 효소 및 H3K27me2 펩타이드를 함유하는 칵테일(40㎕)을 멀티드롭 콤비(Multidrop Combi)(써모(Thermo))에 의해 첨가하였다. 화합물을 25℃에서 30분 동안 PRC2와 함께 인큐베이션시킨 다음, 비-방사성 및 3H-SAM의 혼합물을 함유하는 칵테일(10㎕)을 첨가하여 반응을 개시하였다(최종 용적 = 51㎕). 모든 경우에, 최종 농도는 다음과 같았다: 야생형 또는 돌연변이체 PRC2 효소는 4nM이고, 최소 신호 제어 웰에서 SAH는 1mM이며, DMSO 농도는 1%였다. 성분의 나머지의 최종 농도를 이하의 표 2에 나타낸다. 600μM의 최종 농도로 비-방사성 SAM(10㎕)의 첨가에 의해 분석을 중단하였고, 3H-SAM을, 펩타이드 기질 내에 그것의 포함이 더 이상 검출되지 않는 수준까지 희석시켰다. 이어서, 384-웰 폴리프로필렌 플레이트 내 50㎕의 반응물을 384-웰 플래쉬플레이트에 옮기고 나서, 바이오티닐화된 펩타이드를 적어도 1시간 동안 스트렙타비딘 표면에 결합시킨 후에 바이오테크(Biotek) ELx405 플레이트 세척기에서 0.1% 트윈 20으로 3회 세척하였다. 이어서, 플레이트를 퍼킨엘머 탑카운트(TopCount) 플레이트 판독기에서 판독하여 플래쉬플래이트 표면에 결합된 3H-표지 펩타이드의 양을 측정하고, 분당 붕해(disintegrations per minute: dpm)로서 측정하며, 또는 대안적으로 분당 계수(counts per minute: cpm)로서 지칭하였다.
EZH2 정체성(야생형 또는 Y641 돌연변이체 EZH2)에 기반한 각각의 분석 변화에 대한 성분의 최종 농도
PRC2 효소
(EZH2 정체성에 의해 정의됨)		 펩타이드(nM) 비-방사성 SAM(nM) 3H-SAM (nM)
야생형 185 1800 150
Y641F 200 850 150
Y641N 200 850 150
Y641H 200 1750 250
Y641S 200 1300 200
Y641C 200 3750 250
올리고뉴클레오솜 기질에 대한 야생형 PRC2 효소 분석에 대한 일반적 절차. 분석을 20mM 비신(pH = 7.6), 0.5 mM DTT, 0.005% BSG, 100mM KCl 및 0.002% 트윈 20으로 이루어진 완충제 중에서 수행하였고, 사용일에 제조하였다. 100% DMSO(1㎕) 중의 화합물을 384-채널 피펫 헤드(써모사)를 구비한 플레이트메이트 2 X 3를 사용하여 폴리프로필렌 384-웰 V-자 바닥 플레이트(그라이너사) 내로 스팟팅하였다. DMSO(1㎕)를 최대 신호 제어를 위해 열 11, 12, 23, 24, 행 A 내지 H에 첨가하고 나서, PRC2의 공지된 생성물 및 저해제인 SAH(1㎕)를 최소 신호 제어를 위해 열 11, 12, 23, 24, 행 I 내지 P에 첨가하였다. 야생형 PRC2 효소 및 닭 적혈구 올리고뉴클레오솜을 함유하는 칵테일(40㎕)을 멀티드롭 콤비(Multidrop Combi)(써모사)에 의해 첨가하였다. 화합물을 25℃에서 30분 동안 PRC2와 함께 인큐베이션시킨 다음, 비-방사성 및 3H-SAM의 혼합물을 함유하는 칵테일(10㎕)을 첨가하여 반응을 개시하였다(최종 용적 = 51㎕). 최종 농도는 다음과 같았다: 야생형 PRC2 효소는 4nM이고, 비-방사성 SAM은 430nM이며, 3H-SAM은 120 nM이고, 닭 적혈구 올리고뉴클레오솜은 120nM이며, 최소 신호 제어 웰 내 SAH는 1mM이고, DMSO 농도는 1%였다. 600μM의 최종 농도로 비-방사성 SAM(10㎕)의 첨가에 의해 분석을 중단하였고, 3H-SAM을, 닭 적혈구 올리고뉴클레오솜 기질 내에 그것의 포함이 더 이상 검출되지 않는 수준까지 희석시켰다. 384-웰 폴리프로필렌 플레이트 중의 50㎕의 반응물을 384-웰 플래쉬플레이트에 옮기고, 닭 적혈구 뉴클레오솜을 플레이트의 표면에 고정시킨 다음, 바이오테크 ELx405 플레이트 세척기에서 0.1% 트윈20으로 3회 세척하였다. 이어서, 플레이트를 퍼킨엘머 탑카운트 플레이트 판독기에서 판독하여 플래쉬플레이트 표면에 결합된 3H-표지 닭 적혈구 올리고뉴클레오솜의 양을 측정하고, 분당 붕해(dpm)로서 측정하며, 또는 대안적으로 분당 계수(counts per minute: cpm)로서 지칭하였다.
저해% 계산
Figure pct00027
여기서, dpm = 분당 붕해, cmpd = 분석 웰에서의 신호이고, min 및 max는 각각 최소 및 최대 신호 제어이다.
4-변수 IC 50 적합도
Figure pct00028
상부 및 하부가 정상적으로 유동되는 경우이지만, 3-변수 적합도에서 각각 100 또는 0에서 고정될 수 있다. 힐 계수(Hill Coefficient)는 정상적으로 유동되지만 또한 3-변수 적합도에서 1로 고정될 수 있다. Y는 저해%이고, X는 화합물 농도이다.
펩타이드 기질(예를 들어, EZH2 야생형 및 Y641F)에 대한 PRC2 효소 분석에 대한 IC50 값을 이하의 표 3에 제시한다.
WSU-DLCL2 메틸화 분석
WSU-DLCL2 현탁 세포를 DSMZ(독일 브라운슈바이크에 소재한 독일 미생물 및 세포 배양물의 수집기관(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures))로부터 구입하였다. RPMI/글루타맥스(Glutamax) 배지, 페니실린-스트렙토마이신, 열-불활성화 태아 소 혈청 및 D-PBS를 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 라이프 테크놀로지즈사(Life Technologies)로부터 구입하였다. 추출 완충제 및 중화 완충제(5X)를 미국 캘리포니아주 칼스베드에 소재한 액티브 모티프사(Active Motif)로부터 구입하였다. 토끼 항-히스톤 H3 항체를 미국 매사추세츠주 캠브릿지에 소재한 Abcam사로부터 구입하였다. 토끼 항-H3K27me3 및 HRP-컨쥬게이트 항-토끼-IgG를 미국 매사추세츠주 댄버에 소재한 셀 시그널링 테크놀로지사(Cell Signaling Technology)로부터 구입하였다. TMB "초민감(Super Sensitive)" 기질을 미국 메릴랜드주 오잉 밀스에 소재한 바이오에프엑스 래버러토리즈사(BioFX Laboratories)로부터 구입하였다. IgG-유리 소 혈청 알부민을 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브에 소재한 잭슨 이뮤노리서치사(Jackson ImmunoResearch)로부터 구입하였다. 트윈과 함께 PBS(10X PBST)를 미국 메릴랜드주 게이더스버그에 소재한 KPL사로부터 구입하였다. 황산을 미국 텍사스주 알링턴에 소재한 리카 케미컬사(Ricca Chemical)로부터 구입하였다. 이뮬론(Immulon) ELISA 플레이트를 미국 뉴욕주 로체스터에 소재한 써모사로부터 구입하였다. V-자 바닥 세포 배양 플레이트를 미국 뉴욕주 코닝에 소재한 코닝사(Corning Inc.)로부터 구입하였다. V-자 바닥 폴리프로필렌 플레이트를 미국 노스캐롤라이나주 먼로에 소재한 그라이너 바이오-원사(Greiner Bio-One)로부터 구입하였다.
WSU-DLCL2 현탁 세포를 성장 배지(10% v/v 열 불활성화된 소 태아 혈청 및 100단위/㎖ 페니실린-스트렙토마이신으로 보충한 RPMI 1640)에서 유지하고 나서 37℃에서 5% CO2하에 배양시켰다. 분석 조건 하에서, 세포를 플레이트 진탕기 상에서 37℃에서 5% CO2 하에 분석 배지(20% v/v 열 불활성화된 소 태아 혈청 및 100 단위/㎖ 페니실린-스트렙토마이신으로 보충한 RPMI 1640)에서 배양시켰다.
WSU-DLCL2 세포를 200㎕/웰을 지니는 96-웰 V-자 바닥 세포 배양 플레이트에 대해 50,000개 세포/㎖의 농도에서 분석 배지 중에 파종하였다. 96 웰 공급물 플레이트로부터의 화합물(1㎕)을 V-자 바닥 세포 플레이트에 직접 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 96시간 동안 역가-플레이트 진탕기 상에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션의 4일 후에, 플레이트를 5분 동안 241 x g에서 교반시키고 나서, 세포 펠렛을 건드리는 일 없이 세포 플레이트의 각 웰로부터 배지를 부드럽게 흡입하였다. 펠렛을 200㎕ DPBS 중에서 재현탁시키고 나서, 플레이트를 241 x g에서 5분 동안 다시 교반시켰다. 상청액을 흡입하고 나서, 차가운(4℃) 추출 완충제(100㎕)를 웰 마다 첨가하였다. 플레이트를 2시간 동안 오비탈 진탕기 상에서 4℃에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 3427 x g x 10분에 교반시켰다. 상청액(80㎕/웰)을 96 웰 V-자 바닥 폴리프로필렌 플레이트에서 그것의 각각의 웰에 옮겼다. 중화 완충제 5X(20㎕/웰)를 상청액을 함유하는 V-자 바닥 폴리프로필렌 플레이트에 첨가하였다. 조질의 히스톤 제제(CHP)를 함유하는 V-자 바닥 폴리프로필렌 플레이트를 오비탈 진탕기 상에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 조질의 히스톤 제제를 100㎕ 코팅 완충제(1X PBS + BSA 0.05% w/v)를 함유하는 이중 96웰 ELISA 플레이트 내로 각각의 웰에 첨가하였다(2㎕/웰). 플레이트를 밀봉하고 나서, 밤새 4℃에서 인큐베이션시켰다. 다음날, 플레이트를 300㎕/웰 1X PBST로 3회 세척하였다. 웰을 300㎕/웰 ELISA 희석제((PBS (1X) BSA(2% w/v) 및 트윈20(0.05% v/v))으로 2시간 동안 차단시켰다. 플레이트를 1X PBST로 3회 세척하였다. 히스톤 H3 검출 플레이트에 대해, 100㎕/웰에 ELISA희석제 중에서 1:10,000으로 희석시킨 항-히스톤-H3 항체(Abcam, ab1791)를 첨가하였다. H3K27 트라이메틸화 검출 플레이트에 대해, 100㎕/웰에 ELISA 희석제 중에서 1:2000으로 희석시킨 항-H3K27me3을 첨가하였다. 플레이트를 90분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 300㎕ 1X PBST/웰로 3회 세척하였다. 히스톤 H3 검출을 위해, ELISA 희석제 중에서 1:6000으로 희석시킨 100㎕의 HRP-컨쥬게이트된 항-토끼 IgG 항체를 웰마다 첨가하였다. H3K27me3 검출을 위해, ELISA 희석제 중에서 1:4000으로 희석시킨 100㎕의 HRP 컨쥬게이트된 항-토끼 IgG 항체를 웰마다 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 90분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 1X PBST 300㎕/웰로 4회 세척하였다. TMB 기질 100㎕를 웰마다 첨가하였다. 히스톤 H3 플레이트를 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. H3K27me3 플레이트를 10분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 반응을 황산 1N(100㎕/웰)로 중단시켰다. 각 플레이트에 대한 흡광도를 450㎚에서 판독하였다.
우선, 각 웰에 대한 비를 다음의 식에 의해 결정하였다:
Figure pct00029
각각의 플레이트는 DMSO만 처리(최소 저해)한 8개의 대조군 웰뿐만 아니라 최대 저해(배경 웰)에 대한 8개의 대조군 웰을 포함하였다.
각각의 대조군 유형에 대한 비 값의 평균을 계산하고 플레이트 내 각각의 시험 웰에 대한 저해%를 결정하기 위해 사용하였다. 시험 화합물을 25μM에서 시작해서 총 10개의 시험 농도에 대해 DMSO 중에서 3배로 단계 희석시켰다. 저해%를 결정하고, 화합물의 농도 당 이중 웰을 사용하여 IC50 곡선을 만들었다. 이 분석에 대한 IC50 값을 이하의 표 3에 제시한다.
Figure pct00030
세포 증식 분석
WSU-DLCL2 현탁 세포를 DSMZ(독일 브라운슈바이크에 소재한 독일 미생물 및 세포 배양물의 수집기관)로부터 구입하였다. RPMI/글루타맥스 배지, 페니실린-스트렙토마이신, 열 불활성화 소태아 혈청을 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 라이프 테크놀로지즈사로부터 구입하였다. V-자 바닥 폴리프로필렌 384-웰 플레이트를 미국 노스캐롤라이나주 먼로에 소재한 그라이너 바이오-온으로부터 구입하였다. 세포 배양 384-웰 백색 불투명 플레이트를 미국 매사추세츠주 윌섬에 소재한 퍼킨엘머로부터 구입하였다. 셀-타이터 글로(Cell-Titer Glo)(등록상표)를 미국 위스콘신주에 소재한 프로메가사(Promega Corporation)로부터 구입하였다. 스펙트라맥스(SpectraMax) M5 플레이트 판독기를 미국 캘리포니아주 써니베일에 소재한 몰레큘러 디바이스 엘엘씨(Molecular Devices LLC)로부터 구입하였다.
WSU-DLCL2 현탁 세포를 성장 배지(10% v/v 열 불활성화된 소 태아 혈청으로 보충한 RPMI 1640)에서 유지하고 나서 37℃에서 5% CO2 하에 배양시켰다. 분석 조건 하에서, 세포를 분석 배지(20% v/v 열 불활성화된 소 태아 혈청로 보충한 RPMI 1640 및 100 단위/㎖ 페니실린-스트렙토마이신)에서 37℃에서 5% CO2하에 인큐베이션시켰다.
WSU-DLCL2 세포주의 증식에 대한 화합물 효과의 평가를 위해, 대수적으로 성장하는 세포를 분석 매질의 최종 용적 50㎕ 중에서 1250 세포/㎖의 밀도로 384-웰 백색 불투명 플레이트에서 플레이팅하였다. 10mM(분석에서 화합물의 최종적 최고 농도는 20μM이고 DMSO는 0.2%였음)에서 시작해서 DMSO 중에서 3회 9-지점 3배 단계 희석을 수행함으로써 화합물 공급 플레이트를 준비하였다. 화합물 저장 플레이트로부터의 100nℓ 알리쿼트를 세포 플레이트에서 그것의 각각의 웰에 첨가하였다. 100% 저해 대조군은 스타우로스포린의 200nM 최종 농도로 처리한 세포로 이루어지고, 0% 저해 대조군은 DMSO 처리 세포로 이루어진다. 화합물의 첨가 후에, 분석 플레이트를 6일 동안 37℃, 5% CO2, 상대 습도 > 90%에서 6일 동안 인큐베이션시켰다. 세포 배양물에 존재하는 ATP의 정량화에 의해 세포 생존도를 측정하였고, 35㎕의 셀 타이터 글로(등록상표)시약을 세포 플레이트에 첨가하였다. 스펙트라맥스 M5에서 발광을 판독하였다. 정규화된 용량 반응 곡선의 4-변수 적합도를 사용하여 50%만큼 세포 생존도를 저해하는 농도를 결정하였다. 이 분석에 대한 IC50 값을 또한 이하의 표 3에 제시한다. 이들 화합물에 대한 질량 스펙트럼 데이터를 이하의 표 3에서 열거한다.
화합물# ELISA H3K27me3 IC50(μM) WSU 증식 IC50(μM) WT EZH2 IC50(μM) EZH2 IC 50 펩타이드 v2(μM) MS
(유리 형태)
1 0.077 0.0230 <0.005 588.37
2 0.11043 0.38533 0.01498 605.81
105 0.058-0.150 0.325 <0.01 0.0084 518.3257
실시예 3: 가장 낮은 세포독성 농도(Lowest Cytotoxic Concentration: LCC)의 유래
세포 증식이 분할 전 세포 수에 대해 분할 후 세포 수가 배가 되는 세포 분할을 통해 진행한다는 것은 잘 확립되어 있다. 고정된 세트의 환경적 조건(예를 들어, pH, 이온 강도, 온도, 세포 밀도, 단백질의 배지 함량 및 성장 인자 등) 하에서, 세포는 다음의 식에 따라 연속적으로 배가(즉, 분할)가 됨으로써 증식할 것이며, 단, 충분한 영양소 및 기타 필요한 인자는 이용가능하다.
Figure pct00031
(A.1)
여기서 Nt는 관찰 기간의 개시 후 시점(t)에서 세포수이고, N0는 관찰 기간의 개시 시 세포수이며, t는 관찰 기간의 개시 후 시간이고, tD는 세포 배가에 필요한 시간 간격으로, 또한 배가 시간으로 지칭된다. 식 A.1은 0.693 = ln(2)을 이용하여 염기 e에서 지수 식의 더 편리한 형태로 전환될 수 있다.
Figure pct00032
(A.2)
세포 증식에 대한 속도 상수(kp)는 다음과 같이 배가 시간에 반비례한다.
Figure pct00033
(A.3)
식 A.2 및 A.3을 조합하여 하기를 얻는다,
Figure pct00034
(A.4)
따라서, 식 A.4에 따라 세포 수는 대수기 성장으로서 지칭되는 세포성장의 초기 동안 시간에 따라 기하급수적으로 증가하는 것으로 예상된다. 식 A.4와 같은 지수식은 각 측의 자연로그를 취함으로써 선형화될 수 있다.
Figure pct00035
(A.5)
따라서, 시간의 함수로서 ln(Nt)의 플롯은 kp와 동일한 기울기 및 ln(N0)와 동일한 y-절편을 지니는 상승적인 직선을 수득할 것으로 예상된다.
환경적 조건에서의 변화는 증식 속도 상수 kp의 변화로서 정량화할 수 있는 세포 증식 속도 변화를 초래할 수 있다. 증식 속도에서의 변화를 초래할 수 있는 조건 중에 관찰 기간의 개시 시(즉, t = 0에서) 항증식성 화합물의 시스템에 대한 도입이 있다. 항증식성 화합물이 세포 증식에 대해 즉시 충격을 가질 때에, 시간의 함수로서 ln(Nt)의 플롯은 모든 화합물 농도에서 계속해서 선형이 될 것이며 화합물의 농도가 증가함에 따라 kp의 값은 감소된다.
Figure pct00036
(A.6)
항증식 작용의 기계론적 기반에 따라서, 일부 화합물은 증식 속도에서의 변화를 즉시 달성하지 않을 수도 있다. 대신에, 화합물의 영향이 실현되기 전에 잠복기간이 있을 수 있다. 이러한 경우에, 시간의 함수로서 ln(Nt)의 플롯은 2상으로 나타날 것이며 화합물의 영향이 시작되는 시점은 상들 간의 중지점으로서 동정될 수 있다. 증식에 대한 화합물의 영향이 잠복 기간 직후인지 또는 이후에 시작되는지 여부와 관계없이, 각각의 화합물 농도에서 증식에 대한 속도 상수는 ln(Nt)의 기울기 대 화합물 영향이 시작되는 시점으로부터 실험의 관찰 기간의 끝까지의 시간 곡선에 의해 가장 잘 정의된다.
성장 세포에 적용되는 화합물은 2개의 일반적 방법(추가 세포 분할을 저해함으로써(세포정지(cytostasis)) 또는 세포 사멸(세포독성)에 의해) 중 하나에서 관찰 증식에 영향을 미칠 수 있다. 화합물이 세포정지라면, 세포분할이 추가로 없을 때까지, 증가된 화합물의 농도는 kp 값을 감소시킬 것이다. 이 시점에, 세포 성장 속도, 및 그에 따른 kp의 값은 0이 될 것이다. 반대로, 화합물이 세포독성이라면, kp의 값은 2개의 속도 상수로 구성될 것이다: 화합물의 존재에서 계속된 세포 성장에 대한 속도 상수(kg) 및 화합물에 의한 세포 사멸에 대한 속도 상수(kd). 고정된 농도의 화합물에서 증식에 대한 전반적인 속도 상수는 따라서 이들 반대되는 속도 상수의 절대값 간의 차이가 될 것이다.
세포 성장 속도가 세포 사멸의 속도를 초과하는 화합물 농도에서, kp의 값은 양의 값(즉, kp > 0)을 가질 것이다. 세포 성장 속도가 세포 사멸 속도 미만인 화합물 농도에서, kp의 값은 음의 값(즉, kp < 0)을 가질 것이며, 세포수는 시간에 따라 감소되어 강한 세포독성을 나타낼 것이다. kg가 kd와 정확하게 매칭될 때, 전반적인 증식 속도 상수인 kp는 0의 값을 가질 것이다. 따라서 본 발명자들은, 이것이 명확하게 관찰가능한 세포독성을 초래할 때보다 큰 임의의 농도 때문에, kp 값이 0이 되게 하는 화합물의 해당 농도로서 최저 세포독성 농도(LCC)를 정의할 수 있다. 주의: LCC 미만의 농도에서, 세포 사멸이 일어날 가능성이 있지만, 잔여 세포 증식 속도 미만인 속도에서임. 여기서 처리는 화합물 작용의 생물학인 상세한 설명을 정의하는 것으로 의도되지 않는다. 오히려, 여기서 목표는 단지 세포 사멸 속도가 새로운 세포 성장을 초과하는 화합물의 농도를 객관적으로 정량화하는 실행적 변수를 정의하는 것이다. 사실, LCC는 세포독성 농도 그 자체보다는 노골적인 세포독성이 관찰된 것 초과의 중지점 또는 임계 농도를 표시한다. 이와 관련하여, LCC는 모든 분자가 미셀 구조 내로 포함된 것 초과의 지질, 계면활성제 또는 다른 계면활성제 종의 농도를 정의하기 위해 사용되는 임계 미셀 농도(critical micelle concentration: CMC)와 같은 다른 물리적 중지점 측정기준과 유사하게 보일 수 있다.
전통적으로, 세포 성장에 대한 항증식 화합물의 영향은, 화합물의 부재시(즉, 비히클 또는 용매 대조군 샘플에 대해) 관찰된 것의 1/2로 세포 증식 속도를 감소시키는 화합물의 해당 농도로서 정의되는 IC50 값에 의해 가장 통상적으로 정량화되었다. 그러나 IC50은 세포정지와 세포독성 화합물 간을 구별하기 위한 조사자를 허용하지 않는다. 대조적으로, LCC는 용이하게 이러한 차별을 만들게 하며, 강한 세포독성 거동에 대한 전이가 일어나는 농도를 추가로 정량화하게 한다.
영향의 시작과 실험의 마지막 사이의 관찰 시간창을 제한한다면, 데이터는 일반적으로 시간의 함수로서 ln(Nt)으로서 플롯팅될 때 선형식에 잘 적합하게 될 것이다(상기 참조). 이들 유형의 적합도로부터, kp의 값을 시험 화합물의 각각의 농도에서 결정할 수 있다. 화합물 농도([I])의 함수로서 kp 값의 재플롯팅은 하강하는 등온선의 형태를 가지고, kmax(비히클 또는 용매 대조군 샘플로서 정의됨)의 [I] = 0에서 최대값 및 kmin의 무한한 화합물 농도에서 최소값을 지닐 것이다.
Figure pct00037
(A.7)
여기서, Imid는 kmax와 kmin 값 사이의 중간인 kp 값을 수득하는 화합물의 농도이다(완전하고 순수한 세포정지 화합물의 경우를 제외하고, Imid의 값은 IC50과 동일하지 않다는 것을 주의한다). 따라서, 식 A.7에 대한 재플롯 데이터를 적합화하는 것은 kmax, kmin 및 Imid의 추정을 제공한다. 화합물이 세포정지라면(본 명세서에 정의된 바와 같음), kmin-의 값은 0 미만이 아닐 수 있다. 세포독성 화합물에 대해, kmin은 0 미만일 것이고, kmin의 절대값은 사멸 세포에서 화합물의 유효성과 직접 관련될 것이다.
식 A.7로부터 유도된 적합화된 값을 또한 사용하여 LCC의 값을 결정할 수 있다. 정의에 의해, [I] = LCC일 때, kp = 0이다. 따라서, 이들 조건 하에서, 식 A.7이 된다.
Figure pct00038
(A.8)
식 A.8의 대수적 재배열(Algebraic rearrangement)로 LCC에 대한 식을 수득한다.
Figure pct00039
(A.9)
이 분석은 비선형 곡선 적합화 소프트웨어를 이용하여 실행하는 것이 간단하고, 약물 발견 및 개발 공정을 통해 화합물 활성의 세포 분석 동안 적용될 수 있다. 이 방식에서, LCC는 화합물 SAR(구조-활성 관계)의 평가를 위한 가치있는 측정 수단을 제공할 수 있다.
실시예 4: 생체내 분석
마우스
암컷 폭스 체이스(Fox Chase) SCID(등록상표) 마우스(CB17/Icr-Prkdc scid /IcrIcocrl, 찰스 리버 래버로토리즈(Charles River Laboratories)) 또는 무흉선 누드 마우스(Crl:NU(Ncr)-Foxn1 nu , 찰스 리버 래버로토리즈)는 8주령이며, 연구의 제1일에 16.0 내지 21.1 g의 체중(body-weight: BW) 범위를 가졌다. 동물에 임의로 물(역삼투 1ppm Cl) 및 18.0% 조질의 단백질, 5.0% 조질의 지방, 5.0% 조질의 섬유질로 이루어진 NIH 31 변형 및 조사된 실험 식단(Modified and Irradiated Lab Diet)(등록상표)을 공급하였다. 마우스를 20 내지 22℃(68 내지 72℃) 및 40 내지 60% 습도에서 12시간 광주기에 대해 정적 마이크로아이솔레이터(microisolators) 내의 조사된 인리치-오콥스(Enrich-o'cobs)(상표명) 잠자리 상에 수용하였다. 모든 절차는 규제, 절약, 수술적 절차, 공급 및 유체 조절 및 수의적 돌봄에 대한 실험동물의 돌봄 및 사용을 위한 지침(Guide for Care and Use of Laboratory Animals)의 권고를 준수하였다.
종양 세포 배양
인간 림프종 세포주를 상이한 공급원(ATCC, DSMZ), 예를 들어, DSMZ로부터 얻은 Karpas-422로부터 얻었다. 세포주를 100 단위/㎖ 페니실린 G 나트륨염, 100g/㎖ 스트렙토마이신, 1% HEPES 및 1% L-글루타민을 함유하는 RPMI-1640 배지 내 현탁 배양물로서 피에몬트(Piedmont)에서 유지한다. 배지를 20% 소 태아 혈청 및 2mM 글루타민으로 보충한다. 세포를 5% CO2 및 95% 공기의 분위기에서 37℃에서 습한 인큐베이터 내 조직 배양 플라스크에서 배양시킨다.
생체내 종양 이식
인간 림프종 세포주, 예를 들어, Karpas-422 세포를 중간-로그 성장 동안 채취하고 나서, RPMI-1640 기본 배지 및 50% 매트리겔(Matrigel)(상표명)(BD 바이오사이언스사(BD Biosciences))(RPMI:매트리겔=1:1) 중에서 재현탁시킨다. 각각의 마우스는 우측 옆구리에서 피하로 1 x 107개 세포(0.2㎖ 세포 현탁액)를 받았다. 종양을, 평균 용적이 목적으로 하는 80 내지 120㎣ 범위에 접근함에 따라 선장을 모니터링하기 위해 2차원으로 캘리퍼스 측정하였다. 종양 크기(㎣)를 하기로부터 계산하였다:
Figure pct00040
여기서 w = 종양의 폭, l = 종양의 길이(㎜)이다. 종양 중량은, 1㎎이 1㎣의 종양 용적과 동일하다는 추정을 이용하여 추정될 수 있었다. 10 내지 30일 후에, 145 내지 150㎣ 종양을 지니는 마우스를 평균 종양 용적 147㎣를 지니는 처리군으로 분류하였다.
시험 항목
시험 화합물을 실온에서 분류하고, 빛으로부터 보호하였다. 각 처리일에, 신선한 화합물 제형을 탈이온수 중에서 0.5% 카복시메틸셀룰로스나트륨(NaCMC) 및 0.1% 트윈(등록상표)80 중에서 분말을 현탁시킴으로써 제조한다. 탈이온수 중의 비히클, 0.5% NaCMC 및 0.1% 트윈(등록상표)80을 사용하여 동일 스케줄에서 대조군을 처리하였다. 제형을 투여 전에 4℃에서 빛으로부터 떨어져서 저장하였다. 달리 구체화되지 않는 한, 본 실험에서 지칭되고 시험되는 화합물은 본 단락에서 언급한 그들의 구체적 염 형태였다.
치료 계획
마우스를 62.5 내지 500㎎/㎏의 범위에 있는 화합물 용량에서 경구 위관영양법에 의해 여러 날 동안 BID(1일 2회, 12시간마다)에 대해 처리한다. 각각의 용량을 0.2㎖/20g 마우스(10㎖/㎏)의 용적으로 전달하고 나서, 개개 동물의 최종 기록 중량에 대해 조절하였다. 최대 처리 길이는 28일이었다.
중앙값 종양 용적(Median Tumor Volume: MTV) 및 종양 성장 저해(Tumor Growth Inhibition: TGI) 분석
처리 효능을 마지막 처리일에 결정하였다. 마지막 날에 평가 가능한 동물의 수(n)에 대한 중앙값 종양 용적 MTV(n)을 각각의 그룹에 대해 결정하였다. 종양 성장 저해%(Percent tumor growth inhibition: %TGI)는 정해진 몇 가지 방법일 수 있었다. 첫째, 지정된 대조군의 MTV(n)와 약물-처리군의 MTV(n) 간의 차이를 대조군의 MTV(n)의 백분율로서 표현한다:
Figure pct00041
TGI%를 계산하는 다른 방법은 제1일로부터 제n일까지의 종양 크기의 변화를 고려하며 n은 최종 처리일이다.
Figure pct00042
독성
동물을 제1일 내지 제5일에 매일, 이어서, 연구의 완료까지 매주 2회 체중을 쟀다. 마우스는 임의의 유해한 처리 관련 부작용의 명시적인 징후에 대해 빈번하게 시험하고, 이를 기록하였다. 최대 허용 용량(maximum tolerated dose: MTD)에 대해 허용가능한 독성은 시험 동안 20% 미만의 그룹 평균 BW 상실 및 TR 사망에 기인하는 10% 이하의 사망률로서 정의되었다. 사망은, 그것이 임상적 징후 및/또는 괴사에 의해 증명되거나 또는 투약 기간 동안 알려지지 않은 원인에 기인하는 바와 같은 처리 부작용에 기인한다면, TR로서 분류될 것이다. 사망이 처리 부작용과 관련없다는 증거가 있다면, 사망은 NTR로서 분류될 것이다. 투약 간격 동안 NTR 사망은 전형적으로 NTRa(사고 또는 인간 오류에 기인) 또는 NTRm(침입 및/또는 전이에 의한 괴사-확인 종양 전파에 기인)으로서 범주화된다. 투약 기간 동안 알려지지 않은 원인으로 사망하는 경구 처리 동물은, 그룹 수행이 투약 오류를 제외하기 위한 TR 분류 및 괴사를 뒷받침하지 않을 때, NTRu로서 분류될 수 있고, 실현가능하지 않다.
샘플링
연구 동안 제7일 또는 제28일에 마우스를 사전 구체화된 방식으로 샘플링하여 종양에서 표적 저해를 평가하였다. 종양을 RNAse 유리 조건 하에 구체화된 마우스로부터 채취하고, 2등분하였다. 각각의 동물로부터 냉동시킨 종양 조직을 액체 N2 중에서 순간 냉동시키고, 막자사발을 이용해서 분쇄시켰다.
통계학적 및 그래프적 분석
모든 통계학적 및 그래프적 분석을 윈도우용 프리즘 3.03(Prism 3.03)(그래프패드(GraphPad))를 이용하여 수행하였다. 전체 처리시간 과정에 걸쳐 대조군과 처리군 간의 통계학적 유의도를 시험하기 위해, 반복된 측정 ANOVA 시험 후에, 던넷(Dunnet) 다중 비교 사후 검정 또는 2원 ANOVA 검정을 사용하였다. 프리즘은 P > 0.05에서 유의하지 않음(ns), 0.01 < P < 0.05에서 유의함("*"으로 기호화), 0.001 < P < 0.01에서 매우 유의함("**") 및 P < 0.001에서 극도로 유의함("***")의 결과를 보고한다.
히스톤 추출
히스톤의 단리를 위해, 60 내지 90㎎ 종양 조직을 1.5㎖ 핵 추출 완충제(10mM 트리스-HCl, 10 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1% 트리톤 X-100, 8.6% 수크로스, + 로쉐(Roche) 프로테아제 저해제 정제 1836145) 중에서 균질화하고 나서, 얼음 상에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 핵을 4℃에서 5분 동안 600g에서 원심분리에 의해 수집하고 나서, PBS 중에서 1회 세척하였다. 상청액을 제거하고 나서, 히스톤을 0.4N 차가운 황산과 함께 15분마다 교반시키면서 1시간 동안 추출하였다. 추출물을 10000g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 정화시키고 나서, 10x 용적의 빙랭 아세톤을 함유하는 새로운 마이크로원심분리관에 옮겼다. 히스톤을 -20℃에서 2시간 내지 밤새 침전시키고 나서, 10000g에서 10분 동안 원심분리에 의해 펠렛화하고, 수 중에서 재현탁시켰다.
ELISA
히스톤을 0.5n/㎕ 샘플을 수득하는 코팅 완충제(PBS+0.05%BSA) 중에서 동등한 농도로 준비하고, 100㎕의 샘플 또는 표준을 2 96-웰 ELISA 플레이트(써모 랩시스템즈사(Thermo Labsystems), 이뮬론(Immulon) 4HBX #3885)에 2회 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 나서, 밤새 4℃에서 인큐베이션시켰다. 다음날, 플레이트를 바이오 테크 플레이트 세척기 상에서 300㎕/웰 PBST(PBS+0.05% 트윈 20; 10X PBST, KPL #51-14-02)로 3x 세척하였다. 플레이트를 300㎕/웰의 희석제(PBS+2%BSA+0.05% 트윈 20)로 차단시키고 나서, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시키고, PBST로 3x 세척하였다. 모든 항체를 희석제 중에서 희석시켰다. 100㎕/웰의 항-H3K27me3(CST #9733, 50% 글라이세롤 저장액 1:1,000) 또는 항-전체 H3(Abcam ab1791, 50% 글라이세롤 1:10,000)을 각각의 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 90분 동안 인큐베이션시키고 나서, PBST로 3x 세척한다. 100㎕/웰의 항-Rb-IgG-HRP(셀 시그널링 테크놀로지사(Cell Signaling Technology), 7074)를 H3K27Me3 플레이트에 대해 1:2,000으로 H3 플레이트에 대해 1:6,000으로 첨가하고 나서, 90분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PBST로 4x 세척하였다. 검출을 위해, 100㎕/웰의 TMB 기질(바이오에프엑스 래버러토리즈사(BioFx Laboratories), #TMBS)을 첨가하고 나서, 플레이트를 암실 내 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 반응을 100㎕/웰 1N H2SO4로 중단시킨다. 450㎚에서 흡광도를 스펙타맥스(SpectaMax) M5 마이크로플레이트 판독기 상에서 판독한다.
제7일 PD 연구
화합물이 생체내 종양에서 H3K27me3 히스톤 마크를 조절할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, Karpas-422 이종이식 종양 보유 마우스를 7일 동안 62.5, 83.3, 125, 166.7, 250, 333.3 또는 500 ㎎/㎏ BID 또는 비히클(BID 스케줄)에서 화합물로 처리하였다. 그룹 당 5마리 동물이 있다. 최종 용량 및 종양을 상기 기재한 바와 같은 냉동 상태에서 보존하고 3시간 후에 동물을 안락사시켰다. 히스톤 추출 후에, 샘플은 히스톤 H3K27(H3K27me3) 또는 전체 히스톤 H3의 트라이메틸화된 상태와 관련된 항체를 사용하여 ELISA 분석에 적용하였다. 이들 데이터에 기반하여, 전체적으로 메틸화된 H3K27 대 전체의 비를 계산하였다. ELISA에 의해 측정한 바와 같은 모든 그룹에 대한 평균 전체 메틸화 비는 비히클과 비교한 표적 저해 범위를 표시하였다. 이 실험에 대한 설계를 표 4A에 나타낸다.
(표 4A)
Figure pct00043
실시예 5: Karpas-422 이종이식 모델에서 용량이 증가함에 따른 효능 연구
화합물이 생체내 항종양 효과를 유발할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, Karpas-422 이종이식 종양 보유 마우스를 28일 동안, 예를 들어, 62.5, 125, 250 또는 500㎎/㎏ BID에서 화합물로 처리하였다. 실험의 효능암에 대해 그룹 당 10마리 마우스가 있었다. 비히클 및 화합물 처리군에 대해 28일의 처리 과정에 걸친 종양 성장을 측정하였다.
제28일에 연구의 마지막에(코호트 둘 다에 대해 최종 용량의 3시간 후) 종양으로부터 히스톤을 추출한다. H3K27me3 메틸 마크를 용량 의존적 방식으로 처리에 의해 조절에 대해 평가하였다.
(표 4B)
Figure pct00044
TV는 편장형 타원면의 용적에 대한 식 (LxW2)/2에 의해 캘리퍼 측정으로부터 계산하고, 여기서 L 및 W는 각각 직교 길이 및 폭 측정(㎜)이었다.
데이터를 평균±표준편차(SD)로서 표현하였다. 비히클-처리군과 화합물 처리군 간의 TV에서의 차이를 일원분산분석(ANOVA) 다음에 던넷-유형(Dunnett-type) 다중 비교 검정에 의해 분석한다. P < 0.05(양측)의 값을 통계적으로 유의한 것으로 고려하였다. 프리즘 5 소프트웨어 패키지 버전 5.04(미국 캘리포니아주에 소재한 그래프패드 소프트웨어사)를 사용하여 통계학적 분석을 수행한다.
상기 연구는 화합물 1과 화합물 A가 Karpas-422 이종이식 모델에서 종양 정체와 퇴행을 둘 다 나타내고 잘 용인된다는 것을 나타내었다. 예를 들어, 도 1 및 도 2 참조. 추가로, 상기 연구로부터의 화합물 1 또는 화합물 A의 약력학적 및 약동학적 특성을 도 3 내지 도 8에서 도시한다. 도 3은 처리 후 제7일 또는 제28일에 종양에서 화합물 1의 농도 또는 처리 후 제7일에 종양에서 화합물 A의 농도를 나타내는 다이어그램이다. 이 도면에서, "A" 내지 "G"는 각각 62.5, 83.3, 125, 166.7, 250, 333.3 및 500㎎/㎏의 투약량에서 화합물 1의 투여 후 7일을 의미하며; "H" 및 "I"는 각각 125 및 250㎎/㎏의 투약량에서 화합물 A의 투여 후 7일을 의미하고; "J" 내지 "L"은 각각 62.5, 125 및 250㎎/㎏의 투약량에서 화합물 1의 투여 후 28일을 의미한다. 주의: 제28일에 샘플에 대해, 종양은 250㎎/㎏ 화합물 A로 처리한 그룹으로부터의 분석용 및 500㎎/㎏ 화합물 1로 처리한 그룹으로부터의 분석용으로 너무 작았고; 10 중의 1 및 10 중의 5만이 각각 250㎎/㎏ 화합물 1 및 125㎎/㎏ 화합물 1로 처리한 그룹으로부터의 분석용으로 충분히 컸다. 도 4는 처리 후 제7일 또는 제28일에 혈장 내 화합물 1 또는 화합물 A의 농도를 나타내는 다이어그램이다. 상부 파선은 화합물 A의 혈장 단백질 결합(PPB) 보정 LCC를 나타내며, 하부 파선은 화합물 1의 PPB 보정 LCC를 나타낸다. 도 5는 7일 동안 화합물 1 또는 화합물 A로 처리한 마우스로부터의 KARPAS-422 종양에서 전체적인 H3K27me3 메틸화를 나타내는 다이어그램이다. 이 도면에서, "A"는 비히클 처리를 의미하고; "B" 내지 "H"는 각각 62.5, 83.3, 125, 166.7, 250, 333.3 및 500㎎/㎏의 투약량에서 화합물 1로 처리를 의미하며; "I" 및 "J"는 125 및 250㎎/㎏의 투약량에서 화합물 A로 처리를 의미한다. 도 6은 28일 동안 화합물 1로 처리한 마우스로부터의 KARPAS-422 종양에서 전체적인 H3K27me3 메틸화를 나타내는 다이어그램이다. 도 7은 7일 동안 화합물 1 또는 화합물 A로 처리한 KARPAS-422 이종이식 종양 보유 마우스로부터의 골수에서 전체적인 H3K27me3 메틸화를 나타내는 다이어그램이다. 이 도면에서, "A"는 비히클 처리를 의미하고; "B" 내지 "H"는 각각 62.5, 83.3, 125, 166.7, 250, 333.3 및 500㎎/㎏의 투약량에서 화합물 1로 처리를 의미하며; "I" 및 "J"는 각각 125 및 250㎎/㎏의 투약량에서 화합물 A로 처리를 의미한다. 도 8은 28일 동안 화합물 1로 처리한 KARPAS-422 이종이식 종양 보유 마우스로부터의 골수에서 전체적인 H3K27me3 메틸화를 나타내는 다이어그램을 도시한 도면. 이 도면에서, "A"는 비히클 처리를 의미하고; "B" 내지 "E"는 각각 62.5, 125, 250 및 500㎎/㎏의 투약량에서 화합물 1로 처리를 의미하며; "F"는 250㎎/㎏의 투약량에서 화합물 A로 처리를 의미한다.
이하의 실시예 6 내지 8에서, 실험 및 분석을, 예를 들어, 문헌[J. Lin, Pharmaceutical Research, 2006, 23(6):1089-1116; L. Di et al., Comb Chem High Throughput Screen . 2008, 11(6):469-76; M. Fonsi et al., Journal of Biomolecular Screening, 2008, 13:862; E.
Figure pct00045
et al., Drug Metab . Dispos . 2012, 40:2273-2279; T.D. Bjornsson, et al., Drug Metab Dispos, 2003, 31(7):815-832; J.B. Houston and K.E. Kenworthy, Drug Metab Dispos, 2000, 28(3):246-254; 및 S.W. Grimm et al., Drug Metab Dispos, 2009, 37(7):1355-1370]에 기재되어 있는 것과 유사한 방법 및 기술에 의해 수행하였으며, 이들 각각의 내용은 그들의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
실시예 6: 간 마이크로솜에서 전이성 안정성의 평가
화합물 1, 2 및 105의 대사 안정성을 마우스, 래트, 개, 당나귀 및 인간을 포함하는 5종의 종으로부터의 간 마이크로솜에서 평가하였다.
방법: 100m㏖/ℓ 인산칼륨 완충제(pH 7.4), 1㎎/㎖ 간 마이크로솜, 8농도에서 시험 화합물(즉, 화합물 1, 2 또는 105) 및 2㎎/㎖ NADPH로 이루어진 총 용적 250㎕를 함유하는 96-웰 플레이트에서 인큐베이션을 수행하였다. 인큐베이션을 위해 사용한 화합물의 농도는 45.7nM 내지 100μM의 범위에 있었다. NADPH의 첨가를 사용하여 반응을 시작하고 나서, 인큐베이션을 37℃에서 60분까지 동안 진탕 수욕에서 행하였다. 내부 표준(IS)을 함유하는 동일 용적의 정지 용액을 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. 이어서, 샘플을 분석 5분 전 최소 동안 3000RPM에서 냉장 원심분리로 교반시켰다. LC/TOFMS를 사용함으로써 결정한 바와 같은 시험 화합물에 대한 인큐베이션 혼합에서의 고갈량을 사용하여 간 마이크로솜에 의한 고유 클리어런스값을 추정하였다. LC/TOFMS 시스템은 비행시간형 질량분석기(AB SCIEX Qstar Elite, 캘리포니아주 포스터 시티에 소재한 AB Sciex)와 함께 시마즈(Shimadzu) SIL-HTC 오토샘플러(일본 교토에 소재), 2 폄프 LC-20AD; 시마즈 코포레이션), 및 칼럼 오븐(CTO-20AC; 시마즈 코포레이션)으로 구성되었다. 분석에 대한 시험 화합물 및 IS의 피크 면적을 애널리스트(Analyst) QS(버전 2.0, 캘리포니아주 포스터 시티에 소재한 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))에 의해 통합하였다. 질소를 이용하는 충돌 활성화 해리(Collision activated dissociation: CAD)를 사용하여 생성물 이온을 생성하였다. 최적화된 기기 상태는 양이온 모드 하에 있었다.
LC/MS/MS 정량화는 시험 화합물의 피크 면적 대 IS의 피크 면적의 비에 기반하였다. 화합물 1, 2 또는 105 및 IS의 피크 면적 계산 및 통합은 애널리스트 QS 2.0(캘리포니아주 포스터 시티에 소재한 AB Sciex)을 이용하였다. 엑셀(워싱턴주 레드먼드에 소재한 마이크로소프트 코포레이션, 오피스 2010) 및 그래프패드 프리즘 v. 5.02(캘리포니아주 라욜라에 소재한 그래프패드 소프트웨어사(GraphPad Software Inc.))를 사용하여 계산을 행하였다. 데이터를 분석하고 문헌[J. Lin, Pharmaceutical Research, 2006, 23(6):1089-1116; 및 Di L et al., Comb Chem High Throughput Screen . 2008 11(6):469-76]에 기재되어 있는 것과 같은 적절한 SOP에 기반하여 기록하였다.
간 마이크로솜과 함께 Km 및 Vmax 값에 대해 사용한 시험 화합물의 고갈을 시간에 대해 플롯팅함으로써 계산하여 고갈 속도를 결정하였다. 이어서, 적절한 역학 모델을 사용하여 고갈 속도를 플롯팅하였다. 데이터를 다음의 식에 기반하여 계산하였다:
미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten): Clint(㎕/분/㎎의 간 마이크로솜) = Vmax/Km
힐(Hill): Clint (㎕/분/㎎의 간 마이크로솜) = Clmax = Vmax / Ks·(n - 1)/(n (n - 1)1/n)
Clint (㎕/분/g 간) = Clint (㎕/분/㎎ 마이크로솜)·환산계수(Scaling Factor) 또는 Clint(㎕/분/106개 세포)·환산계수.
결과를 이하의 표 5에 제공한다.
Figure pct00046
3가지 시험 화합물 모두, 즉, 화합물 1, 2 및 105는 인간 간 마이크로솜(HLM)에서 낮은 대사적 클리어런스를 나타내었다. 대사적 클리어런스에서 종 차이를 또한 관찰하였다. 사이아노몰구스 원숭이는 일반적으로 다른 종보다 더 높은 클리어런스를 나타내었다.
실시예 7: CYP 유도의 평가
각각의 화합물 1, 2 및 105의 유도를 단일 공여체로부터의 냉동보존 인간 간세포에서 평가하였다.
방법: 간세포를 BD 바이오사이언스(BD Biosciences)(매사추세츠주 워번에 소재)로부터 얻었고, 적절한 배지 및 DAPI 핵 착색제를 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)(노스캐롤라이나주 더럼에 소재)로부터 구입하였다. 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM), 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS), 100x MEM 비필수 아미노산, 100x 페니실린/스트렙토마이신/글루타민 용액, 2x 트립판 블루를 메디아테크(Mediatech)(버지니아주 매너서스에 소재)로부터 구입하였다. 소태아 혈청(FBS)을 티슈 컬쳐 바이올로지컬스(Tissue Culture Biologicals)(캘리포니아주 툴레어에 소재)로부터 획득하였다. mRNA 분석을 위한 24-웰 콜라겐 코팅 플레이트를 BD 바이오사이언스(캘리포니아주 산호세에 소재)로부터 획득하였다. 사전설계한 프로브 및 프라이머를 mRNA에서의 변화를 평가하기 위해 2회 3중 분석에서 사용하였다. 양성 대조군은 CYP1A에 대해 β-나프토플라본(1 및 10μ㏖/ℓ), CYP2B6에 대패 페노바르비탈(100μ㏖/ℓ 및 1 m㏖/ℓ) 및 CYP2C9 및 CYP3A에 대해 리팜피신(1 및 10μ㏖/ℓ)이었다. 비히클(음성) 대조군으로서 DMSO를 사용하였다. 처리 기간 후에 CYP 형태 특이적 분석을 수행하고, 세포를 계수측정하여 생존도를 결정하였다.
냉동보존한 간세포를 37℃ 수욕에서 해동시키고, 공급업자의 설명서에 따라 플레이팅하였다. 간세포의 하나의 관을 라이프 테크놀로지즈 냉동보존 간세포 회수 배지(cryopreserved hepatocyte recovery medium: CHRM)를 함유하는 50㎖ 원뿔형 관에 첨가하였다. 세포를 800 RPM에서 10분 동안 GH 3.8 로터를 이용하는 벡맨(Beckman) 원심분리에서 교반시켰다. 상청액을 제거하고 나서, 세포를 계수측정을 위해 플레이팅 배지에서 재현탁시켰다. 계수측정 후에, 세포를 7십 5만개의 살아있는 세포/㎖에서 재현탁시켰다. 현탁액(0.5㎖/웰)을 24-웰 콜라겐 코팅 플레이트 내로 첨가하거나, 또는, 10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신/글루타민 및 MEM 비필수 아미노산, 80㎕의 현탁액을 함유하는 60㎕의 DMEM의 첨가 후에, 현탁액을 96-웰 콜라겐 코팅 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 더 양호한 플레이트 범위를 제공하기 위한 스월링(swirling) 및 로킹(rocking) 후에, 세포를 5% CO2 및 37℃에서 조직 배양 인큐베이터에 두었고, 밤새 부착시켰다. 이어서, 세포를 셀즈다이렉트(CellzDirect) 간세포 유지 배지를 사용하여 처리하였다. 세포를 화합물 1, 2 또는 105(1 또는 10μ㏖/ℓ) 또는 비히클에 48시간 동안 노출시켰다. 치료 동안, 유지 배지 및 시험 화합물을 24시간마다 보충하였다.
인큐베이션의 완료 후에, 세포를 DPBS로 세척하였다. DPBS로 세척 후에, 세포를 DPBS 중의 3.7% p-폼알데하이드를 사용하여 한 시간 동안 고정시켰다. 폼알데하이드를 제거하고 나서, DPBS 중의 0.6μ㏖/ℓ DAPI를 첨가하였다. 세포를 20분 동안 DAPI에 의해 염색한 다음, DPBS로 3회 세척하였다. 5X 대물렌즈를 지니는 어레이스캔 II(ArrayScan II)(펜실베니아주 피츠버그에 소재한 셀로믹스(Cellomics))를 사용하여 세포를 계수측정하였다. 처리 조건에서 발견한 세포의 수/비히클 대조군을 이용하여 발견한 세포의 수를 사용하여 남아있는 간세포 분획을 계산하였다.
처리 후에, 퀴아젠 RNeasy 키트로부터의 완충제 RLT를 사용하여 세포를 용해시켰다. 제조업자의 프로토콜을 사용하는 DNase 처리를 이용하는 RNeasy 키트를 사용하여 mRNA를 단리시켰다. 나노드롭(Nanodrop) ND-1000(델라웨어주 윌밍턴에 소재)를 통해 mRNA 농도를 측정하였다. mRNA 농도를 공여체 내에서 모든 샘플에 대패 정규화하였다. 제조업자의 지시에 따라 라이프 테크놀로지즈로부터의 수퍼스크립트(Superscript) VILO cDNA 합성에 의해 역전사를 수행하였다. cDNA 합성 후에, 어플라이드 바이오시스템즈사(Applied Biosystems)제의 7500 패스트 리얼 타임(Fast Real Time) PCR을 사용하여 정량적 실시간 PCR을 수행하였고, 이들 모두는 라이프 테크놀로지즈의 자회사 소유이다. 실시간 PCR에 대한 반응 성분은: 10㎕의 텍맨 패스트 어드밴스트 마스터 믹스(Taqman Fast Advanced Master Mix)(라이프 테크놀로지즈), 2㎕ cDNA, 5㎕ 무 뉴클레아제수(라이프 테크놀로지즈), β-2 마이크로글로뷸린에 대한 1㎕의 프라이머 제한 FAM 표지 분석 HS00984230_m1, CYP1A2에 대한 1㎕의 프라이머 제한 VIC 표지 분석 HS00167927_m1 또는 CYP2B6에 대한 HS04183483_g1, 및 CYP2C9에 대한 1㎕의 프라이머 제한 NED 표지 분석 HS04260376_m1 또는 CYP3A4에 대한 HS00604506_m1로 이루어졌다. 비히클 대조군과 비교한 배수 차이의 계산을 ΔΔCt 방법을 사용하는 7500 소프트웨어 버전 2.0.5(라이프 테크놀로지즈)에 의해 행하였다. Emax 및 EC50의 계산을 그래프패드 프리즘을 사용하여 행하였다.

화합물
농도
(μM)		 CYP1A CYP2B6 CYP2C9 CYP3A 대조군에 대해 남아있는 세포%
유도
배수		 양성 대조군% 유도 배수 양성 대조군% 유도 배수 양성 대조군% 유도 배수 양성 대조군%
1 1 1.04 2.8 0.98 18.0 1.04 43.5 1.04 13.9 107.44
10 1.14 3.0 1.43 26.3 1.26 52.6 0.99 13.3 99.00
2 1 0.73 NA 0.61 NA 0.57 NA 0.59 NA 124.70
10 0.83 NA 0.64 NA 0.73 NA 0.73 NA 120.90
105 1 1.14 3.0 1.39 25.5 1.20 50.4 1.35 18.1 103.19
10 1.65 4.4 2.84 52.2 1.82 76.3 2.52 33.8 97.49
상기 표 6에서 나타낸 바와 같이, 화합물 1은 상당한 유도가 없음을 나타내고(잠재적으로 CYP2C9를 제외함); 화합물 2는 유도 없음을 나타내며(약간 더 낮은 활성을 지님); 화합물 105는 CYP2B6, CYP2C9 및 CYP3A의 유도를 나타내었다. 세포 생존도의 상당한 손실은 관찰되지 않았다.
실시예 8: CYP 저해의 평가
화합물 1, 2 또는 105의 인간 사이토크롬 P450(CYP)의 효소 활성의 가능한 저해를 모은 인간 간 마이크로좀을 사용하여 평가하였다.
방법: 화합물 1, 2 및 105의 경쟁적 저해 잠재력을 그들 각각의 Km 값 근처의 프로브 CYP 반응 상에서 다수 농도를 평가함으로써 결정하여 인간 간 마이크로솜(HLM)에서 IC50 곡선을 생성하였다. 시간-의존적 불활성화(TDI) 잠재력을 또한 적절할 때에 KI 및 kinact 값을 평가함으로써 CYP3A4/5에 대패 평가하였다.
PB, HLM, CYP-선택적 프로브 기질을 함유하는 현탁액 및 시험 중인 저해제를 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 대략 2분 동안 37℃ 수욕에서 사전인큐베이션시켰다. 반응을 96-웰 플레이트의 각 웰에 NADPH의 첨가에 의해 개시하였다. PB, HLM 및 NADPH의 최종 농도는 각각 100m㏖/ℓ(pH 7.4), 0.1㎎/㎖ 및 2.3m㏖/ℓ였다. CYP 프로브 기질 및 CYP 저해제를 양성 대조군으로서 사용하고, 그들 각각의 농도를 이하에 열거하였다. 각 인큐베이션에서 사용한 최종 MeOH 농도는 0.8%를 초과하지 않았다.
적절한 인큐베이션 시간 후에, IS를 함유하는 동일 용적의 퀀칭 용액을 적절한 웰에 첨가하였다. 표준 및 품질 관리(QC) 샘플을 시험 샘플과 유사한 성분을 사용하여 준비하였다. 블랭크는 다른 샘플과 유사한 퀀칭 용액을 이용하여 준비하였지만 IS를 포함하지 않았다. 플레이트를 3000rpm에서 벤치-탑 원심분리로 5분 동안 교반시켰다. 샘플을 LC/MS/MS에 의해 분석하였다. 인큐베이션 조건 및 양성 대조군을 이하의 표 7에 열거한다.
시험한 CYP CYP
프로브 기질		 기질
농도
(μ㏖)		 CYP
저해제
(양성 대조군)		 최대 저해 농도
(μ㏖/ℓ)		 인큐베이션 시간
(분)		 내부 표준
(LC/MS/MS)
CYP1A2 페나세틴 40 푸라필린 20 10 13C2,15N-아세트아미노펜
CYP2B6 부프로피온 140 티클로피딘 5 10 2H6-하이드록시부프로피온
CYP2C8 아모디아퀸 10 몬텔루카스트 12 10 2H3-데스에틸아모디아퀸
CYP2C9 톨부타마이드 100 설파페나졸 20 10 2H9-하이드록시톨부트아마이드
CYP2C19 (S)-메페니토인 30 (S)-벤질니르바놀 8 10 2H3-4'-하이드록시메펜나이토인
CYP2D6 (±)-부프라롤 20 퀴니딘 2 5 2H9-1'-하이드록시부푸랄롤
CYP3A4/5 미다졸람 3 케토코나졸 1 5 13C3-1'-하이드록시미다졸람
테스토스테론 70 (R)-프로프라놀롤
TDI를 평가하기 위해, 1차 인큐베이션, PB, HLM 및 저해제 저장액을 함유하는 현탁액을 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 대략 2분 동안 37℃ 수욕에서 사전인큐베이션시켰다. 반응을 96-웰의 각각의 웰에 NADPH의 첨가에 의해 개시하였고, 0, 5, 10, 15, 20 및 30분 동안 수행하였다. NADPH가 없는 대조군에 대해, PB 용액을 NADPH 저장 용액으로 대체하였다. PB, HLM 및 NADPH에 대한 최종 농도는 각각 100 m㏖/ℓ(pH 7.4), 0.2㎎/㎖ 및 2.3 m㏖/ℓ였다. 각각의 시간에서, 12.5㎕의 1차 인큐베이션 현탁액을 CYP-선택적 프로브 기질을 함유하는 사전-인큐베이션한 2차 인큐베이션 혼합물 내로 20배 희석시켜 잔여 활성을 평가하였다. 사용한 프로브 기질은 테스토스테론(250μ㏖/ℓ)이었고, 양성 대조군은 트롤레안도마이신이었다.
사용한 HPLC 시스템은 SIL-HTC 오토샘플러, DGU-14A 탈기기, 3개의 LC-10ADvp 펌프 및 CTO-10ACvp 칼럼 오븐으로 이루어진 시마즈 HPLC 시스템(일본 교토에 소재)였다. 샘플을 양이온 모드 하에 터보 분사 이온화를 사용하는 API4000QTrap(캘리포니아주 포스터 시티에 소재한 AB Sciex) 삼중 극자 질량 분석기 상에서 분석하였다.
모든 모니터링한 대사산물 및 IS의 피크 면적 계산 및 통합을 애널리스트 1.6(캘리포니아주 포스터 시티에 소재한 AB Sciex)에 의해 처리하였다. 교정 표준의 농도에 대해 대사산물 대 IS의 피크 면적비를 플롯팅함으로써 구성한 교정 곡선의 사용을 이용하여 정량화를 달성하였고, 1/x2 가중치(y = a x2 + b x + c)를 이용하는 이차 회귀에 의해 생성하였다. 저해 백분율 계산은 엑셀(Excel)(오피스 2010, 워싱턴주 레드몬드에 소재한 마이크로소프트 코포레이션)을 이용하였고, 하나의 결합 부위의 추정에 기반하여 그래프패드 프리즘(버전 5.02, 캘리포니아주 라욜라에 소재한 그래프패드 소프트웨어사)을 사용하여 플롯팅하였다. 시험 화합물의 공칭 농도 및 양성 대조군을 그래프패드 프리즘에서 로그 전환하였다. 사전인큐베이션 시간에 대한 남아있는 CYP3A4/5 활성의 플롯을 사용하여, CYP 활성 손실률(λ)을 비선형 회귀에 의해 추정하였다. 변수, kinact 및 KI를 후속적으로 다음의 식에 적합화시킴으로써 추정하였다:
Figure pct00047
[I]는 화합물 1, 2 또는 105의 초기 농도이다.
가역적 저해
화합물 IC50 (μM)
CYP1A CYP2C8 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP3A4/5
미다졸람		 CYP3A4/5
테스토스테론
1 >100 >100 >100 89.57 22.94 40.46 >100
2 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100
105 >100 47.43 75.66 33.65 2.95 9.67 >100
시간-의존적 불활성화(Time-Dependent Inactivation: TDI) 평가
화합물 KI(μM) kinact(분-1) kinact/KI(μM-1·분-1)
1 6.4 (3.3**) 0.0277 0.0043
105 10.2 0.0214 0.0021
2 22.3 0.0376 0.0017
상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 화합물 1 및 2는 상당한 가역적 저해가 없음을 나타내고; 화합물 105는 CYP2D6 및 CYP3A4(미다졸람)의 잠재적으로 상당한 저해를 나타내었다. 또한, 상기 표 9에서 나타낸 바와 같이, 모든 화합물 1, 2 및 105는 CYP3A4/5의 시간-, 농도- 및 NADPH-의존적 불활성화(프로브로서 미다졸람을 사용)를 나타내었다.
본 명세서에 언급된 각각의 특허 문헌 및 과학적 논문의 전체 개시내용은 모든 목적을 위하여 참조로 포함된다.
본 발명은 이의 정신 또는 본질적 특징으로부터 벗어나는 일 없이 다른 구체적 형태로 구형될 수 있다. 따라서 앞서 언급한 실시형태는 모든 측면에서 본 명세서에 기재된 본 발명의 제한하기보다는 예시적인 것으로 고려되어야 한다. 따라서 본 발명의 범주는 앞서 언급한 설명에 의하기보다는 첨부하는 특허청구범위에 의해 표시되며, 특허청구범위의 동일한 의미 및 범위 내가 되는 모든 변화는 특허청구범위에 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims (16)

  1. Figure pct00048
    및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물은
    Figure pct00049
    또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화합물은
    Figure pct00050
    인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 화합물은
    Figure pct00051
    또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 화합물은
    Figure pct00052
    인 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 화합물은
    Figure pct00053
    또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 화합물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 화합물은
    Figure pct00054
    인 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  9. EZH2-매개 장애의 치료방법으로서, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물의 치료적 유효량을 치료가 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, EZH2-매개 장애의 치료방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 EZH2-매개 장애는 암인, EZH2-매개 장애의 치료방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 암은 림프종, 백혈병 또는 흑색종인, EZH2-매개 장애의 치료방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 암은 미만성 큰 B-세포 림프종(DLBCL), 비호지킨 림프종(NHL), 여포성 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 혼합형 백혈병 또는 골수 형성이상 증후군(MDS)인, EZH2-매개 장애의 치료방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 암은 악성횡문근양종양 또는 INI1-결핍 종양인, EZH2-매개 장애의 치료방법.
  14. EZH2-매개 장애를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물.
  15. EZH2-매개 장애의 치료에서 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
  16. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물을 주성분으로서 포함하는, EZH2-매개 장애의 치료를 위한 약제학적 조성물.
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