BR112015008487B1 - Compostos de benzeno substituído, composição farmacêutica compreendendo os ditos compostos e uso terapêutico dos mesmos para tratar um distúrbio mediado por ezh2 - Google Patents
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Abstract
COMPOSTOS DE BENZENO SUBSTITUÍDO. A presente invenção se refere a compostos de benzeno substituído. A presente invenção se refere também a composições farmacêuticas contendo estes compostos e métodos para tratar câncer administrando estes compostos e composições farmacêuticas a sujeitos em necessidade dos mesmos. A presente invenção se refere também ao uso desses compostos para pesquisa ou outras finalidades não terapêuticas.
Description
[001]Este pedido reivindica prioridade a, e o benefício de, pedidos provisórios US 61/714.140, depositado em 15 de outubro, 2012, 61/714.145, depositado em 15 de outubro, 2012, 61/780.703, depositado em 13 de março, 2013, e 61/786.277, depositado em 14 de março, 2013. Os conteúdos de cada um destes pedidos provisórios são incorporados aqui por referência em suas totalidades.
[002]Há uma necessidade em andamento para novos agentes como inibidores da atividade de EZH2, que pode ser usado para tratar distúrbio mediado por EZH2 (por exemplo, câncer).
[003]Em um aspecto, a presente invenção fornece um composto de benzeno substituído selecionado de
, e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[004]Por exemplo, o composto é
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo
[005]Por exemplo, o composto é
[006]Por exemplo, o composto é
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[007]Por exemplo, o composto é
[008]Por exemplo, o composto
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[009]Por exemplo, o composto é
[010]A presente invenção ainda fornece [007]Por exemplo, o composto é ou um sal [009]Por exemplo, o composto é composições farmacêuticas [010]A presente invenção ainda fornece composições farmacêuticas compreendendo um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis e um ou mais compostos revelados aqui.
[011]Outro aspecto da presente invenção é um método de tratamento ou prevenção de um distúrbio mediado pela EZH2. O método inclui a administração a um sujeito em necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais compostos aqui revelados. O distúrbio mediado por EZH2 é uma doença, distúrbio ou condição que é mediada, pelo menos em parte, pela atividade de EZH2. Em uma modalidade, o distúrbio mediado por EZH2 está relacionado com um aumento da atividade de EZH2. Em uma modalidade, o distúrbio mediado pela EZH2 é um câncer. O câncer mediado por EZH2 pode ser linfoma, leucemia ou melanoma, por exemplo, linfoma de células B grandes difuso (DLBCL), linfoma não Hodgkin (NHL), linfoma folicular, leucemia mieloide crônica (CML), leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia de linhagem mista, ou síndrome mielodisplásica (MDS). Em uma modalidade o câncer mediado por EZH2 pode ser um tumor maligno ou tumor rabdoide deficiente em INI1. O diagnóstico histológico de tumor maligno rabdoide depende de identificação de células rabdoides características (células grandes com núcleos localizados excentricamente e abundantes, citoplasma eosinofílico) e imunohistoquímica com anticorpos contra vimentina, queratina e o antígeno da membrana epitelial. Na maior parte dos tumores malignos rabdoides, o gene SMARCB1/INI1, localizado na banda de cromossoma 22q11.2, é inativada por deleções e/ou mutações. Em uma modalidade, os tumores malignos podem ser tumores rabdoides deficientes em INI1.
[012]A menos que indicado de outra forma, qualquer descrição de um método de tratamento inclui os usos dos compostos para proporcionar tal profilaxia ou tratamento como é descrito na especificação, assim como as utilizações de compostos para preparar um medicamento para tratar ou prevenir essa condição. O tratamento inclui o tratamento de humanos ou animais não humanos, incluindo roedores e outros modelos de doenças.
[013]Além disso, os compostos ou métodos aqui descritos podem ser usados para a investigação (por exemplo, estudar enzimas epigenéticas) e outros fins não terapêuticos.
[014]Em certas modalidades, os compostos preferidos aqui descritos possuem propriedades farmacológicas e/ou farmacocinéticas desejáveis, por exemplo, baixas taxas de depuração e/ou risco limitado de interações medicamentosas adversas avaliadas em terapia de combinação, por exemplo, através de inibição dependente do tempo e reversível de enzimas do citocromo P-450.
[015]A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um especialista na técnica à qual esta invenção pertence. Na especificação, as formas singulares incluem o plural a menos que o contexto dite claramente o contrário. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência. As referências aqui citadas não são admitidas sendo a técnica anterior da invenção reivindicada. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitativos. No caso de conflito entre as estruturas químicas e os nomes dos compostos aqui descritos, as estruturas químicas prevalecerão.
[016]Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e reivindicações.
[017] A Figura 1 é um diagrama que mostra os efeitos antitumorais de administração oral de Composto 1 ou Composto A contra um linfoma xenoenxerto de KARPAS-422 em camundongos. Os dados representam a média ± DP (n = 10).
[018]A Figura 2 é um diagrama que mostra o efeito do Composto 1 ou Composto A no peso corporal do camundongo. Os dados representam a média ± DP (n = 10).
[019]A Figura 3 é um diagrama que mostra a concentração do Composto 1 no tumor no dia 7 ou no dia 28 após o tratamento ou a concentração do Composto A no tumor no dia 7 após tratamento. Nesta figura, “A” que “G” indicam que 7 dias após a administração do composto 1 em dosagens de 62,5, 83,3, 125, 166,7, 250, 333,3, e 500 mg/kg, respectivamente; “H” e “I” denotam 7 dias após a administração do Composto A em doses de 125 e 250 mg/kg, respectivamente; e “J” a “L” denotam 28 dias após a administração do composto 1 em dosagens de 62,5, 125 e 250 mg/kg, respectivamente.
[020]A Figura 4 é um diagrama que mostra a concentração do Composto 1 ou Composto A no plasma no dia 7 ou no dia 28 após tratamento. O topo de linha pontilhada indica a LCC corrigida de ligação às proteínas plasmáticas (PPB) do Composto A e parte inferior da linha pontilhada indica LCC corrigida de PPB de Composto 1.
[021]A Figura 5 é um diagrama, mostrando metilação global do H3K27me3 em tumores KARPAS-422 de camundongos tratados com o Composto 1 ou Composto A durante 7 dias. Nesta figura, “A” indica a tratamento com veículo; “B” até “H” denotam o tratamento com o Composto 1 em doses de 62,5, 83,3, 125, 166,7, 250, 333,3, e 500 mg/kg, respectivamente; e “I” e “J” denotam o tratamento com o Composto A em doses de 125 e 250 mg/kg, respectivamente.
[022]A Figura 6 é um diagrama mostrando metilação global do H3K27me3 em tumores KARPAS-422 de camundongos tratados com Composto 1 durante 28 dias.
[023]A Figura 7 é um diagrama mostrando metilação global do H3K27me3 na medula óssea a partir de camundongos tendo tumor de xenoenxerto KARPAS-422 tratados com o Composto 1 ou Composto A durante 7 dias. Nesta figura, “A” indica a tratamento com veículo; “B” até “H” denotam o tratamento com o Composto 1 em doses de 62,5, 83,3, 125, 166,7, 250, 333,3, e 500 mg/kg, respectivamente; e “I” e “J” denotam o tratamento com o Composto A em doses de 125 e 250 mg/kg, respectivamente.
[024]A Figura 8 é um diagrama mostrando metilação global do H3K27me3 na medula óssea a partir de camundongos tendo tumor xenoenxerto KARPAS-422 tratados com Composto 1 durante 28 dias. Nesta figura, “A” indica a tratamento com veículo; “B” até “E” denota o tratamento com o Composto 1 em doses de 62,5, 125, 250, e 500 mg/kg, respectivamente; e “F” indica o tratamento com o Composto A, em uma dose de 250 mg/kg. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[025]A presente invenção proporciona novos compostos de benzeno substituídos, os métodos sintéticos para a preparação dos compostos, composições farmacêuticas contendo os mesmos contêm e vários usos dos compostos.
[026]Os compostos representativos da presente invenção incluem os compostos listados na Tabela 1.
[027]No presente relatório descritivo, a fórmula estrutural do composto representa um determinado isômero para a conveniência em alguns casos, mas a presente invenção pode incluir todos os isômeros, como isômeros geométricos, isômeros ópticos baseados em um carbono assimétrico, estereoisômeros, tautômeros, enantiômeros, diastereoisômeros, rotâmeros, racematos e semelhantes, entendendo-se que nem todos os isômeros podem ter o mesmo nível de atividade. Além disso, um polimorfismo de cristal pode estar presente para os compostos representados pela fórmula. Note-se que qualquer forma de cristal, mistura de forma cristalina, ou o anidrido ou hidrato do mesmo, está incluído no escopo da presente invenção.
[028] “Isomerismo” significa compostos que têm fórmulas moleculares idênticas mas que diferem na sequência da ligação dos seus átomos ou no arranjo dos seus átomos no espaço. Os isômeros que diferem no arranjo dos seus átomos no espaço são denominados “estereoisômeros”. Os estereoisômeros que não são imagens especulares um do outro são denominados “diastereoisômeros” e estereoisômeros que são imagens especulares não sobreponíveis um do outro são denominados “enantiômeros” ou por vezes isômeros ópticos. Uma mistura que contém quantidades iguais de formas enantioméricas individuais de quiralidade oposta é denominada uma “mistura racêmica”.
[029]“Isômero geométrico” significa os diastereoisômeros que devem sua existência à rotação impedida sobre ligações duplas ou um ligante cicloalquil (por exemplo, 1,3-ciclobutil). Estas configurações são diferenciadas nos seus nomes pelos prefixos cis e trans ou Z e E, que indicam que os grupos se encontram no mesmo lado ou oposto da ligação dupla na molécula de acordo com as regras de Cahn-Ingold- Prelog.
[030]Deve ser compreendido que os compostos da presente invenção podem ser representados na forma de estereoisômeros. Também deve ser entendido que quando os compostos têm as formas estereoisoméricas, todas as formas estereoisoméricas são destinadas a ser incluídas no escopo da presente invenção, subentendendo-se que nem todos os estereoisômeros podem ter o mesmo nível de atividade.
[031]Além disso, as estruturas e outros compostos discutidos na presente invenção incluem todos os isômeros atrópicos da mesma, entendendo-se que nem todos os isômeros atrópicos podem ter o mesmo nível de atividade. “Isômeros” atrópicos são um tipo de estereoisômero em que os átomos de dois isômeros são dispostos de forma diferente no espaço. Isômeros atrópicos devem sua existência a uma rotação restrita causada por impedimento de rotação de grandes grupos sobre uma ligação central. Tais isômeros atrópicos tipicamente existem como uma mistura, no entanto, como resultado de avanços recentes em técnicas de cromatografia, foi possível separar as misturas de dois isômeros atrópicos em casos selecionados.
[032] “Tautômero” é um de dois ou mais isômeros estruturais que existem em equilíbrio e é facilmente convertido de uma forma isomérica para outra. Esta conversão resulta na migração formal de um átomo de hidrogénio acompanhado por um interruptor de ligações duplas conjugadas adjacentes. Os tautômeros existem como uma mistura tautomérica de um conjunto em solução. Em soluções onde tautomerização é possível, um equilíbrio químico dos tautômeros será alcançado. A proporção exata dos tautômeros depende de vários fatores, incluindo temperatura, solvente e pH. O conceito de tautômeros que são interconversíveis por tautomerização é chamado tautomerismo.
[033]Dos vários tipos de tautomerismo que são possíveis, dois são frequentemente observados. No tautomerismo ceto-enol uma mudança simultânea de elétrons e um átomo de hidrogênio ocorre. Tautomerismo de cadeia de anel surge como resultado do grupo aldeído (CHO) em uma molécula de cadeia de açúcar reagindo com um dos grupos hidroxil (-OH) da mesma molécula para dar-lhe uma forma cíclica (em forma de anel) que são exibidas pela glicose.
[034]Como aqui utilizado, qualquer ocorrência
deve ser interpretada o como
[035]Pares tautoméricos comuns são: tautomerismo cetona-enol, amida- nitrila, lactama-lactima, amida-ácido imídico em anéis heterocíclicos (por exemplo, em nucleobases, como guanina, timina e citosina), imina-enamina e enamina-enamina. Um exemplo de equilíbrio ceto-enol é entre piridin-2(1H)-onas e os correspondentes piridin-2-óis, como mostrado abaixo.
[036] Deve ser compreendido que os compostos da presente invenção podem ser representados como diferentes tautômeros. Também deve ser entendido que quando os compostos têm formas tautoméricas, todas as formas tautoméricas são consideradas como estando incluídas no escopo da presente invenção, e a nomenclatura dos compostos não exclui nenhuma forma de tautômero. Será entendido que certos tautômeros podem ter um nível mais elevado de atividade do que outros.
[037]O termo “polimorfos de cristal”, “polimorfos” ou “formas de cristal” significa estruturas cristalinas em que um composto (ou um sal ou solvato do mesmo) pode cristalizar em arranjos de empacotamento em cristal diferentes, todos os quais têm a mesma composição elementar. Diferentes formas de cristal geralmente têm diferentes padrões de difração de raios X, espectro de infravermelho, pontos de fusão, dureza de densidade, forma de cristal, propriedades elétricas, estabilidade e solubilidade. Solvente de recristalização, taxa de cristalização, temperatura de armazenamento, e outros fatores podem gerar qualquer forma cristalina para dominar. Polimorfos de cristal dos compostos podem ser preparados por cristalização sob diferentes condições.
[038]Os compostos desta invenção incluem os próprios compostos, como qualquer uma das fórmulas reveladas aqui. Os compostos desta invenção podem ainda incluir seus sais, e seus solvatos, se aplicável. Um sal, por exemplo, pode ser formado entre um ânion e um grupo carregado positivamente (por exemplo, amino) em um composto benzeno substituído. Ânions apropriados incluem cloreto, brometo, iodeto, sulfato, bissulfato, sulfamato, nitrato, fosfato, citrato, metanossulfonato, trifluoracetato, glutamato, glucuronato, glutarato, malato, maleato, succinato, fumarato, tartrato, tosilato, salicilato, lactato, naftalenossulfonato, e acetato (por exemplo, trifluoracetato). O termo “ânion farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ânion apropriado para formar um sal farmaceuticamente aceitável. Da mesma forma, um sal pode ainda ser formado entre um cátion e um grupo carregado negativamente (por exemplo, carboxilato) em um composto benzeno substituído. Cátions apropriados incluem íon de sódio, íon de potássio, íon de magnésio, íon de cálcio, e um cátion de amônio como íon de tetrametilamônio. Os compostos benzeno substituídos ainda incluem aqueles sais contendo átomos de nitrogênio quaternário.
[039]Além disso, os compostos da presente invenção, por exemplo, os sais dos compostos, podem existir em forma hidratada ou não hidratada (anidra) ou como solvatos com outras moléculas solventes. Exemplos não limitantes de hidratos incluem monohidratos, dihidratos, etc. Exemplos não limitantes de solvatos incluem etanol solvatos, acetona solvatos, etc.
[040]“Solvato” significa formas de adição de solvente que contêm quantidades estequiométricas ou não estequiométricas de solvente. Alguns compostos têm uma tendência a aprisionar uma proporção molar fixa de moléculas de solvente no estado sólido cristalino, assim, formando um solvato. Se o solvente é água o solvato formado é um hidrato; e se o solvente é álcool, o solvato formado é um alcoolato. Hidratos são formados pela combinação de uma ou mais moléculas de água com uma molécula da substância em que a água retém seu estado molecular como H2O.
[041]Como aqui utilizado, o termo “análogo” refere-se a um composto químico que é estruturalmente semelhante a outro, mas difere ligeiramente na sua composição (como na substituição de um átomo por um átomo de um elemento diferente ou na presença de um determinado grupo funcional, ou a substituição de um grupo funcional por outro grupo funcional). Assim, um análogo é um composto que é semelhante ou comparável em função e aparência, mas não na estrutura ou origem ao composto de referência.
[042]Como aqui definido, o termo “derivado” refere-se a compostos que têm uma estrutura nuclear comum, e são substituídos com vários grupos, como aqui descrito. Por exemplo, todos os compostos da Tabela 1 são compostos de benzeno substituído, e têm um núcleo comum.
[043]O termo “bioisóstero” refere-se a um composto resultante da troca de um átomo ou de um grupo de átomos com outro, de um modo semelhante, átomo ou grupo de átomos. O objetivo de uma substituição bioisostérica é criar um novo composto com propriedades biológicas semelhantes às do composto parente. A substituição pode ser bioisostérica física ou topologicamente baseada. Exemplos de bioisósteres de ácido carboxílico incluem, entre outros, sulfonimidas acil, tetrazois, sulfonatos e fosfonatos. Ver, por exemplo, Patani e LaVoie, Chem. Rev. 96, 31473176, 1996.
[044]A presente invenção destina-se a incluir todos os isótopos de átomos que ocorrem nos presentes compostos. Os isótopos incluem os átomos que têm o mesmo número atômico, mas números de massa diferentes. A título de exemplo geral e sem limitação, os isótopos de hidrogênio incluem o trítio e deutério, e isótopos de carbono incluem C-13 e C-14.
[045]A presente invenção proporciona métodos para a síntese dos compostos de qualquer fórmula aqui divulgada. A presente invenção também fornece métodos detalhados para a síntese de vários compostos revelados da presente invenção de acordo com os esquemas seguintes, como mostrado nos Exemplos.
[046]Ao longo da descrição, quando as composições são descritas como possuindo, incluindo, ou compreendendo componentes específicos, é contemplado que as composições também consistem essencialmente em, ou consistem nos componentes referidos. Da mesma forma, em que os métodos ou processos são descritos como tendo, inclusive, ou compreendendo etapas específicas do processo, os processos também consistem essencialmente em, ou consistem nas etapas de processamento referidas. Além disso, deve ser entendido que a ordem das etapas ou ordem para realizar certas ações é imaterial, desde que a invenção continue a ser operável. Além disso, duas ou mais etapas ou ações podem ser realizadas simultaneamente.
[047]Os processos de síntese da presente invenção podem tolerar uma ampla variedade de grupos funcionais, por conseguinte, vários materiais de partida substituídos podem ser usados. Os processos geralmente fornecem o composto final desejado em ou perto do final do processo global, embora possa ser desejável, em certos casos, converter adicionalmente o composto em sal farmaceuticamente aceitável, éster ou pró-droga farmaceuticamente aceitável.
[048]Os compostos da presente invenção podem ser preparados em uma variedade de maneiras, utilizando materiais de partida disponíveis comercialmente, os compostos conhecidos na literatura, ou a partir de intermediários facilmente preparados, através do emprego de métodos e procedimentos conhecidos dos especialistas na técnica de síntese padrão, ou que serão evidentes para o especialista na técnica à luz dos ensinamentos aqui contidos. Métodos de síntese convencionais e procedimentos para a preparação de moléculas orgânicas e transformações de grupos funcionais e manipulação podem ser obtidos a partir da literatura científica relevante ou a partir de livros de texto correntes no campo. Embora não se limitando a qualquer um ou várias fontes, textos clássicos, como Smith, M.B., March, J., March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5a edição, John Wiley & Sons: Nova Iorque, 2001; Greene, T.W., Wuts, P. G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3a edição, John Wiley & Sons: Nova Iorque, 1999; R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); L. Fieser e M. Fieser, Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); e L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), aqui incorporados por referência, são manuais de síntese orgânica conhecidos dos especialistas na técnica de referência úteis e reconhecidas. As seguintes descrições de métodos sintéticos são concebidas para ilustrar, mas não limitar, os procedimentos gerais para a preparação de compostos da presente invenção.
[049]Um especialista na técnica reconhecerá que certos grupos podem necessitar de proteção contra as condições de reação através da utilização de grupos protetores. Os grupos protetores também podem ser usados para diferenciar os grupos funcionais nas moléculas semelhantes. Uma lista de grupos protetores e a forma de introduzir e remover esses grupos pode ser encontrada em Greene, T.W., Wuts, P.G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3a edição, John Wiley & Sons: Nova Iorque, 1999.
[050]Os grupos protetores preferidos incluem, entre outros:
[051]Para uma fração hidroxil: TBS, benzil, THP, Ac
[052]Para os ácidos carboxílicos: éster benzílico, éster metílico, éster etílico, éster alil
[053]Para aminas: Cbz, BOC, DMB
[054]Para diois: Ac (x2) TBS (x2), ou quando tomados em conjunto acetonidas
[055]Para tióis: Ac
[056]Para benzimidazois: SEM, benzil, PMB, DMB
[057]Para aldeídos: di-alquil acetais, como dimetoxi acetal ou acetil dietil.
[058]Nos esquemas de reação aqui descritos, vários estereoisômeros podem ser produzidos. Quando nenhum estereoisômero em particular é indicado, entende- se todos os estereoisômeros possíveis que poderiam ser produzidos a partir da reação. Um especialista na técnica reconhecerá que as reações podem ser otimizadas para gerar um isômero de preferência, ou os novos sistemas podem ser concebidos para produzir um único isômero. Se as misturas são produzidas, técnicas como cromatografia em camada fina preparativa, HPLC preparativa, HPLC preparativa quiral, ou SFC preparativa podem ser utilizadas para separar os isômeros.
[059]As seguintes abreviaturas são usadas ao longo da especificação e são definidas abaixo:
[060]AcAcetil
[061]AcOHácido acético
[062]aq.aquoso
[063]BID ou b.i.d.bis in die (duas vezes ao dia)
[064]BOCtert-butoxi carbonil
[065]Cbzbenziloxi carbonil
[066]CDCl3Clorofórmio deuterado
[067]CH2Cl2Diclorometano
[068]DCM Diclorometano
[069]DMB2,4 dimetoxi benzil
[070]DMFN,N-dimetilformamida
[071]DMSODimetilsulfóxido
[072]EA ou EtOAcacetato de etil
[073]EDC ou EDCIN-(3-Dimetilaminopropil)-N‘-etilcarbodiimida
[074]ESI-Eletrospray modo negativo
[075]ESI+Eletrospray modo positivo
[076]EtOHetanol
[077]hHoras
[078]H2OÁgua
[079]HOBt1-Hidroxibenzotriazol
[080]HClhidrogênio cloreto ou ácido clorídrico
[081]HPLCCromatografia líquida de alto desempenho
[082]K2CO3carbonato de potássio
[083]LC/MS ou LC-MSCromatografia líquida com espectrometria de massa
[084]MMolar
[085]MeCNAcetonitrila
[086]minMinutos
[087]Na2CO3carbonato de sódio
[088]Na2SO4sulfato de sódio
[089]NaHCO3carbonato de sódio
[090]NaHMDSHexametildisilazida de sódio
[091]NaOHhidróxido de sódio
[092]NaHCO3 carbonato de sódio
[093]Na2SO4 sulfato de sódio
[094]NMRressonância magnética nuclear
[095]Pd(OH)2 Paládio dihidróxido
[096]PMBpara metoxibenzil
[097]p.o.per os (administração oral)
[098]PpmPartes por milhão
[099]prep HPLCcromatografia líquida de alta eficiência preparativa
[0100]PyBop(Benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfônio hexafluorfosfato
[0101]rt ou RTTemperatura ambiente
[0102]TBMEtert-Butil metil éter
[0103]TFAÁcido trifluoracético
[0104]THFtetrahidrofurano
[0105]THPtetrahidropirano
[0106]Compostos da presente invenção podem ser convenientemente preparados por uma variedade de métodos familiares aos especialistas na técnica. Os compostos desta invenção com qualquer Fórmula revelada aqui podem ser preparados de acordo com os procedimentos ilustrados nos Exemplos abaixo, a partir de materiais de partida comercialmente disponíveis ou materiais de partida que podem ser preparados usando procedimentos de literatura.
[0107]Um especialista na técnica notará que, durante as sequências de reação e esquemas sintéticos descritos aqui, a ordem de certas etapas pode ser alterada como a introdução e remoção de grupos de proteção.
[0108]Os compostos da presente invenção inibem a atividade da histona metiltransferase de EZH2 ou um mutante da mesma e, por conseguinte, em um aspecto da invenção, certos compostos aqui divulgados, são candidatos para o tratamento ou prevenção de certas condições e doenças em que EZH2 desempenha um papel. A presente invenção proporciona métodos para o tratamento de condições e doenças no decurso das quais podem ser influenciados através da modulação do estado de metilação das histonas e outras proteínas, em que o referido estado de metilação é mediada, pelo menos em parte, pela atividade de EZH2. A modulação do estado de metilação das histonas pode por sua vez influenciar o nível de expressão de genes alvo ativados por metilação, e/ou genes alvo suprimidos por metilação. O método inclui a administração a um sujeito em necessidade de tal tratamento, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, polimorfo, solvato, ou estereoisômero do mesmo.
[0109]Salvo indicação em contrário, qualquer descrição de um método de tratamento inclui os usos dos compostos para proporcionar tal profilaxia ou tratamento como é descrito na especificação, assim como as utilizações de compostos para preparar um medicamento para tratar ou prevenir essa condição. O tratamento inclui o tratamento de humanos ou animais não humanos, incluindo roedores e outros modelos de doenças.
[0110]Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de modulação da atividade da EZH2, a subunidade catalítica do complexo PRC2 que catalisa a mono- até trimetilação de lisina 27 em histona H3 (H3-K27) em um sujeito com essa necessidade. Por exemplo, o método compreende a etapa de administrar a um sujeito que tem um câncer que expressa um mutante EZH2 uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto aqui descrito, em que os compostos inibem a atividade de histona metiltransferase de EZH2, assim, o tratamento de câncer.
[0111]Por exemplo, o câncer mediado por EZH2 é selecionado a partir do grupo que consiste em linfoma folicular e linfoma de células B grandes difuso (DLBCL) de subtipo tipo célula B central germinativa (GCB). Por exemplo, o câncer é o linfoma, leucemia ou melanoma. De preferência, o linfoma é linfoma não Hodgkin (NHL), linfoma folicular ou linfoma de células B grandes difuso. Alternativamente, a leucemia é leucemia mielogênica crônica (CML), leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica aguda ou leucemia de linhagem mista.
[0112]Por exemplo, a condição pré-cancerígena mediada por EZH2 é síndrome mielodisplásica (SMD, anteriormente conhecido como pré-leucemia).
[0113]Por exemplo, o câncer mediado EZH2 é um câncer hematológico.
[0114]Os compostos da presente invenção inibem a atividade da histona metiltransferase de EZH2 ou um mutante da mesma e, em conformidade, a presente invenção também fornece métodos para o tratamento de condições e doenças no decurso das quais podem ser influenciados através da modulação de estado de metilação de histonas ou outras proteínas, em que o referido estado de metilação é mediado, pelo menos em parte, pela atividade de EZH2. Em um aspecto da invenção, certos compostos aqui divulgados, são candidatos para o tratamento ou prevenção de certas condições e doenças. A modulação do estado de metilação das histonas pode por sua vez influenciar o nível de expressão de genes alvo ativados por metilação, e/ou genes alvo suprimidos por metilação. O método inclui a administração a um sujeito em necessidade de tal tratamento, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção.
[0115]Como aqui utilizado, um “sujeito” é intercambiável com “sujeito com essa necessidade, ambas as quais se referem a um sujeito com um distúrbio em que a metilação mediada pela proteína EZH2 desempenha um papel, ou em um sujeito com um risco aumentado de desenvolvimento de tal distúrbio em relação à população em geral. Um “sujeito” inclui um mamífero. O mamífero pode ser, por exemplo, um humano ou mamífero não humano adequado, como primata, camundongo, rato, cão, gato, vaca, cavalo, cabra, camelo, ovelha ou porco. O objeto pode também ser uma ave ou um pássaro. Em uma modalidade, o mamífero é um ser humano. Um sujeito com necessidade do mesmo pode ser um que tenha sido previamente diagnosticado ou identificado como tendo câncer ou uma condição pré-cancerígena. Um sujeito com essa necessidade, também pode ser um que tem (por exemplo, está sofrendo de) câncer ou de uma condição pré-cancerígena. Alternativamente, um sujeito em necessidade do mesmo pode ser um que tem um risco aumentado de desenvolvimento de tal distúrbio em relação à população em geral (isto é, um indivíduo que esteja predisposto para desenvolver um dito distúrbio em relação à população em geral). Um sujeito com necessidade do mesmo pode ter uma condição pré- cancerígena. Um sujeito com necessidade dos mesmos pode ter câncer refratário ou resistente (ou seja, câncer que não responde ou ainda não respondeu ao tratamento). O sujeito pode ser resistente no início do tratamento ou pode tornar-se resistente durante o tratamento. Em algumas modalidades, o sujeito em necessidade do mesmo tem reincidência após a remissão do câncer em terapia mais recente. Em algumas modalidades, o sujeito em necessidade do mesmo recebeu e não falhou em todas as terapias eficazes conhecidas para o tratamento do câncer. Em algumas modalidades, o sujeito em necessidade do mesmo recebeu, pelo menos, uma terapia anterior. Em uma modalidade preferida, o sujeito tem câncer ou uma condição cancerígena. Por exemplo, o câncer é o linfoma, leucemia, melanoma, ou rabdomiossarcoma. De preferência, o linfoma é linfoma não Hodgkin, linfoma folicular ou linfoma de células B grandes difuso. Alternativamente, a leucemia é leucemia mielogênica crônica (CML). A condição pré-cancerígena é síndrome mielodisplasica (MDS, anteriormente conhecida como pré-leucemia).
[0116]Como aqui utilizado, “tratamento” ou “tratar”, descreve a gestão e o cuidado de um paciente para o propósito de combater uma doença, condição, ou distúrbio e inclui a administração de um composto da presente invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável sal, polimorfo ou solvato, para aliviar os sintomas ou complicações da doença, condição ou distúrbio, ou para eliminar a doença, condição ou distúrbio. O termo “tratamento” também pode incluir o tratamento de uma célula in vitro ou em um modelo animal.
[0117]Um composto da presente invenção, ou um sal, polimorfo ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ou podem também ser utilizados para prevenir uma doença, condição ou distúrbios em causa, ou utilizadas para identificar candidatos adequados para tais fins. Como aqui utilizado, “prevenir”, “prevenir”, ou “proteção contra” descreve reduzir ou eliminar o aparecimento dos sintomas ou complicações de tal doença, condição ou distúrbios.
[0118]As mutações pontuais do gene EZH2 a um único resíduo de aminoácido (por exemplo, Y641, A677, e A687) de EZH2 têm sido relatadas para ser ligadas a um linfoma. Mais exemplos de mutantes EZH2 e aos métodos de detecção de mutação e métodos de tratamento de distúrbios associados à mutação são descritos em, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente US No. US 20130040906, todo o conteúdo da qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[0119]Um especialista na técnica pode referir-se aos textos de referência gerais para as descrições detalhadas de técnicas conhecidas ou técnicas equivalentes aqui discutidas. Estes textos incluem Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (2005); Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (2000); Coligan et al, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nova Iorque; Enna et al, Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, Nova Iorque; Fingl et al, The Pharmacological Basis of Therapeutics (1975), Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th Edition (1990). Estes textos podem, é claro, também ser referidos em produzir ou utilizar um aspecto da invenção.
[0120]Como aqui utilizado, “terapia de combinação” ou “co-terapia” inclui a administração de um composto da presente invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, polimorfo ou solvato, e pelo menos um segundo agente como parte de um regime específico de tratamento destina-se a proporcionar o efeito benéfico da coação destes agentes terapêuticos. O efeito benéfico da combinação inclui, entre outros, coação farmacocinética ou farmacodinâmica resultante da combinação de agentes terapêuticos.
[0121]A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas que compreendem um composto aqui descrito, em combinação com pelo menos um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
[0122]Uma “composição farmacêutica” é uma formulação que contém os compostos da presente invenção em uma forma adequada para administração a um sujeito. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é a granel ou em forma de dosagem unitária. A forma de dosagem unitária é qualquer uma de uma variedade de formas, incluindo, por exemplo, uma cápsula, uma bolsa IV, um comprimido, uma única bomba de um inalador de aerossol ou um frasco. A quantidade de ingrediente ativo (por exemplo, uma formulação do composto revelado ou sal, hidrato, solvato ou isômero do mesmo) em uma dose unitária de composição é uma quantidade eficaz e varia de acordo com o tratamento particular envolvido. Um especialista na técnica irá apreciar que por vezes é necessário fazer variações de rotina para a dosagem dependendo da idade e condição do paciente. A dosagem também dependerá da via de administração. Uma variedade de vias é contemplada, incluindo a via oral, pulmonar, retal, parenteral, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, por inalação, bucal, sublingual, intrapleural, intratecal, intranasal, e semelhantes. As formas de dosagem para administração tópica ou transdérmica de um composto desta invenção incluem pós, sprays, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, soluções, emplastros e inalantes. Em uma modalidade, o composto ativo é misturado sob condições estéreis com um carreador farmaceuticamente aceitável, e com quaisquer conservantes, tampões, ou propulsores que sejam requeridos.
[0123]Como aqui utilizada, a frase “farmaceuticamente aceitável” refere-se aos compostos, as formas de ânions, cátions, materiais, composições, carreadores, e/ou de dosagem que são, dentro do escopo do juízo médico, adequadas para utilização em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, comensurável com uma relação benefício/risco razoável.
[0124] “Excipiente farmaceuticamente aceitável” significa um excipiente que é útil na preparação de uma composição farmacêutica que é geralmente segura, não tóxica e nem biologicamente nem de outro modo indesejável, e inclui excipiente que é aceitável para uso veterinário bem como para utilização farmacêutica humana. Um “excipiente farmaceuticamente aceitável” como usado na especificação e reivindicações inclui tanto um como mais do que um desses excipientes.
[0125]Uma composição farmacêutica da invenção é formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração parenteral incluem, por exemplo, intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral (por exemplo, por inalação), transdérmica (tópica), e administração transmucosa. As soluções ou suspensões utilizadas para aplicação parenteral, intradérmica, subcutânea ou aplicação podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos como álcool benzílico ou metilparabeno; antioxidantes como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes como o ácido etilenodiaminotetracético; tampões como acetatos, citratos ou fosfatos, e agentes para o ajustamento da tonicidade como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parenteral pode ser encerrada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas feitos de vidro ou plástico.
[0126]Um composto ou composição farmacêutica da invenção pode ser administrado a um sujeito em muitos dos métodos bem conhecidos atualmente utilizados para o tratamento quimioterápico. Por exemplo, para o tratamento de cânceres, um composto da invenção pode ser injetado diretamente em tumores, injetados na corrente sanguínea ou cavidades do corpo ou tomado por via oral ou aplicado através da pele com adesivos. A dose escolhida deve ser suficiente para constituir um tratamento eficaz, mas não tão alta que cause efeitos colaterais inaceitáveis. O estado da condição de doença (por exemplo, câncer, pré-câncer, e semelhantes) e a saúde do paciente deve preferencialmente ser cuidadosamente monitorada durante e por um período de tempo razoável após o tratamento.
[0127]O termo “quantidade terapeuticamente eficaz”, como aqui utilizado, refere-se a uma quantidade de um agente farmacêutico para tratar, melhorar, ou prevenir uma doença ou condição identificada, ou para exibir um efeito terapêutico ou inibidor detectável. O efeito pode ser detectado por qualquer método de ensaio conhecido na técnica. A quantidade eficaz precisa para um sujeito dependerá do peso corporal do sujeito, tamanho e saúde; a natureza e extensão da condição; e o agente terapêutico ou combinação de agentes terapêuticos selecionados para administração. As quantidades terapeuticamente eficazes para uma dada situação podem ser determinadas por experimentação de rotina que está dentro da perícia e julgamento do médico. Em um aspecto preferido, a doença ou condição a ser tratada é o câncer. Em outro aspecto, a doença ou condição a ser tratada é um distúrbio proliferativo celular.
[0128]Para qualquer composto, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios de cultura de células, por exemplo, células neoplásicas, ou em modelos animais, geralmente camundongos, ratos, coelhos, cães, ou porcos. O modelo animal também pode ser utilizado para determinar o intervalo de concentração apropriada e a via de administração. Tal informação pode então ser utilizada para determinar as doses úteis e vias de administração em seres humanos. Eficácia terapêutica/profilática e toxicidade podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) e LD50 (a dose letal para 50% da população). A razão de doses entre os efeitos tóxico e terapêutico é o índice terapêutico, e ele pode ser expresso como a razão LD50/ED50. As composições farmacêuticas que exibem índices terapêuticos grandes são preferidas. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregue, da sensibilidade do paciente, e da via de administração.
[0129]A dosagem e a administração são ajustadas para proporcionar níveis suficientes dos agentes ativos ou para manter o efeito desejado. Os fatores que podem ser tidos em conta incluem a severidade do estado da doença, a saúde geral do sujeito, idade, peso e sexo do sujeito, dieta, tempo e frequência de administração, combinações de drogas, sensibilidades de reação, e a tolerância/resposta à terapia. As composições farmacêuticas de longa atuação podem ser administradas a cada 3 a 4 dias, todas as semanas, ou uma vez a cada duas semanas, dependendo da meia- vida e da taxa de depuração da formulação particular.
[0130]As composições farmacêuticas contendo os compostos ativos da presente invenção podem ser fabricadas de uma forma que é do conhecimento geral, por exemplo, por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, fabricação de drágeas, levigação, emulsificação, encapsulação, aprisionamento ou processos liofilização. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de uma maneira convencional usando um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis que compreendem excipientes e/ou auxiliares que facilitam o processamento dos compostos ativos em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. Claro que, a formulação apropriada é dependente da via de administração escolhida.
[0131]As composições farmacêuticas adequadas para utilização injetável incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Para a administração intravenosa, carreadores adequados incluem soro fisiológico, água bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) ou salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que existe seringabilidade fácil. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de micro-organismos como bactérias e fungos. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido, e semelhantes), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pela utilização de surfactantes. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser conseguida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, e outros semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poli-álcoois como manitol e sorbitol, e cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que atrasa a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[0132]As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido de esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação são a secagem por vácuo e liofilização que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução filtrada anteriormente estéril da mesma.
[0133]As composições orais geralmente incluem um diluente inerte ou um veículo comestível farmaceuticamente aceitável. Eles podem ser encerrados em cápsulas de gelatina ou comprimidas em comprimidos. Para a finalidade de administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes e utilizado na forma de comprimidos, troches ou cápsulas. As composições orais podem também ser preparadas usando um carreador fluido para usar como elixir, em que o composto no transportador fluido é aplicado oralmente e bochechado e expectorado ou engolido. Os agentes de ligação farmaceuticamente compatíveis, e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, troches e semelhantes podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes, ou compostos de uma natureza semelhante: um ligante como celulose microcristalina, goma de tragacanto ou gelatina; um excipiente como amido ou lactose, um agente desintegrante como ácido algínico, Primogel, ou amido de milho; um lubrificante como estearato de magnésio ou Sterotes; um deslizante como dióxido de silício coloidal; um agente edulcorante como sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante como hortelã-pimenta, salicilato de metila, ou aroma de laranja.
[0134]Para administração por inalação, os compostos são administrados na forma de um pulverizador de aerossol a partir do recipiente ou dispensador pressurizado, que contém um propulsor adequado, por exemplo, um gás como dióxido de carbono, ou um nebulizador.
[0135]A administração sistêmica também pode ser transmucosa ou por meios transdérmicos. Para a administração transdérmica ou transmucosa, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, para administração transmucosa, detergentes, sais biliares, e derivados do ácido fusídico. A administração transmucosa pode ser conseguida através do uso de sprays nasais ou supositórios. Para administração transdérmica, os compostos ativos são formulados em unguentos, pomadas, géis, ou cremes como geralmente conhecido na técnica.
[0136]Os compostos ativos podem ser preparados com carreadores farmaceuticamente aceitáveis, que irão proteger o composto contra a eliminação rápida do organismo, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de liberação microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser utilizados, como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Os métodos para a preparação de tais formulações serão evidentes para os especialistas na técnica. Os materiais podem também ser obtidos comercialmente a partir de Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. As suspensões de lipossomas (incluindo lipossomas direcionados para células infectadas com anticorpos monoclonais para antígenos virais) podem também ser utilizadas como carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos dos especialistas na técnica, por exemplo, como descrito na Patente US 4.522.811.
[0137]É especialmente vantajoso formular composições orais ou parenterais em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem, como aqui utilizado, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para o sujeito a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dosagem unitárias da invenção é ditada por e diretamente dependente das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser alcançado.
[0138]Em aplicações terapêuticas, as dosagens das composições farmacêuticas utilizadas de acordo com a presente invenção variam dependendo do agente, da idade, peso e condição clínica do doente receptor, e a experiência e do julgamento do clínico ou o médico que administra a terapia, entre outros fatores que afetam a dosagem selecionada. Geralmente, a dose deve ser suficiente para resultar na desaceleração, e de preferência a regressão, o crescimento dos tumores e também gerando de preferência a regressão completa do câncer. As dosagens podem variar desde cerca de 0,01 mg/kg por dia a cerca de 5000 mg/kg por dia. Em aspectos preferidos, as dosagens podem variar entre cerca de 1 mg/kg por dia a cerca de 1000 mg/kg por dia. Em um aspecto, a dose estará na faixa de cerca de 0,1 mg/dia a cerca de 50 g/dia; cerca de 0,1 mg/dia a cerca de 25 g/dia; cerca de 0,1 mg/dia a cerca de 10 g/dia; cerca de 0,1 mg a cerca de 3 g/dia; ou cerca de 0,1 mg a cerca de 1 g/dia, em doses únicas, divididas, ou contínuas (cuja dose pode ser ajustada para o peso do paciente, em kg, área de superfície corporal em m2, e a idade em anos). Uma quantidade eficaz de um agente farmacêutico é a que proporciona uma melhoria objetivamente identificável como observado pelo médico ou outro observador qualificado. Por exemplo, a regressão de um tumor em um paciente pode ser medida com referência ao diâmetro de um tumor. Diminuição do diâmetro de um tumor indica regressão. Regressão também é indicada pela falha de tumores em reaparecer após o tratamento ter sido interrompido. Como aqui utilizado, o termo “forma de dosagem eficaz” refere-se à quantidade de um composto ativo para produzir o efeito biológico desejado em um indivíduo ou célula.
[0139]As composições farmacêuticas podem ser incluídas em um recipiente, pacote, ou dispensador juntamente com instruções para administração.
[0140]Os compostos da presente invenção são capazes de formar adicionalmente sais. Todas estas formas são também contempladas dentro do escopo da invenção reivindicado.
[0141]Como aqui utilizado, “sais farmaceuticamente aceitáveis” referem-se a derivados dos compostos da presente invenção em que o composto parente é modificado, gerando os sais de ácido dos mesmos ou base dos mesmos. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, sais de ácido orgânico ou mineral de resíduos básicos, como aminas, sais alcalinos ou orgânicos de resíduos ácidos como ácidos carboxílicos, e semelhantes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais não tóxicos convencionais ou os sais de amônio quaternários do composto parente formados, por exemplo, a partir de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. Por exemplo, tais sais convencionais não tóxicos incluem, entre outros, aqueles derivados a partir de ácidos inorgânicos e orgânicos selecionados a partir de 2-acetoxibenzoico, 2-hidroxietano sulfônico, acético, ascórbico, benzenossulfônico, benzoico, bicarbônico, carbônico, cítrico, edético, etano dissulfônico, 1,2-etano sulfônico, fumárico, glucoheptônico, glucônico, glutâmico, glicólico, glicoliarsanílico, hexilresorcínico, hidrabâmico, bromídrico, clorídrico, iodídrico, hidroximaleico, hidroxinaftoico, isetiônico, láctico, lactobiônico, lauril sulfônico, maleico, málico, mandélico, metanossulfônico, napsílico, nítrico, oxálico, pamoico, pantotênico, fenilacético, fosfórico, poligalacturônico, propiônico, salicílico, esteárico, subacético, succínico, sulfâmico, sulfanílico, sulfúrico, tânico, tartárico, toluenossulfônico, e os ácidos de amina de ocorrência comum, por exemplo, glicina, alanina, fenilalanina, arginina, etc.
[0142]Outros exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem o ácido hexanoico, ácido propiônico ciclopentano, ácido pirúvico, ácido malônico, ácido 3- (4- hidroxibenzoil) benzoico, ácido cinâmico, ácido 4-clorobenzenossulfônico, ácido 2- naftalenossulfônico, ácido 4-toluenossulfônico, ácido canforsulfônico, ácido 4- metilbiciclo-[2.2.2]-oct-2-eno-1-carboxílico, ácido 3-fenilpropiônico, ácido trimetilacético, ácido butilacético terciário, ácido mucônico, e similares. A presente invenção também engloba os sais formados quando um próton ácido presente no composto parente é substituído por um íon metálico, por exemplo, um íon de metal alcalino, um íon alcalino-terroso, ou um íon alumínio; ou coordena com uma base orgânica como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N- metilglucamina, e semelhantes. Na forma de sal, entende-se que a proporção do composto de cátion ou ânion do sal pode ser 1:1, ou qualquer proporção diferente de 1:1, por exemplo, 3:1, 2:1, 1:2, ou 1:3.
[0143]Deve ser entendido que todas as referências a sais farmaceuticamente aceitáveis incluem formas de adição do solvente (solvatos) ou formas cristalinas (polimorfos) como definido aqui, do mesmo sal.
[0144]Os compostos, ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, são administrados por via oral, por via nasal, por via transdérmica, pulmonar, por inalação, bucal, sublingual, intraperintoneal, por via subcutânea, por via intramuscular, por via intravenosa, por via retal, intrapleural, intratecal e parenteral. Em uma modalidade, o composto é administrado por via oral. Um especialista na técnica irá reconhecer as vantagens de certas vias de administração.
[0145]O regime de dosagem utilizando os compostos é selecionado de acordo com uma variedade de fatores incluindo tipo, espécie, idade, peso, sexo e condição médica do paciente; a gravidade da condição a ser tratada; a via de administração; a função renal e hepática do paciente; e o composto particular ou seu sal empregado. Um médico ou um veterinário ordinariamente especialista pode facilmente determinar e prescrever a quantidade eficaz da droga requerida para prevenir, contrariar ou parar o progresso da condição.
[0146]As técnicas para formulação e administração dos compostos descritos da invenção podem ser encontradas em Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995). Em uma modalidade, os compostos aqui descritos, e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, são utilizadas em preparações farmacêuticas, em combinação com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Os veículos adequados farmaceuticamente aceitáveis incluem agentes de enchimento ou diluentes sólidos inertes e soluções aquosas ou orgânicas estéreis. Os compostos estarão presentes em tais composições farmacêuticas em quantidades suficientes para proporcionar a quantidade de dosagem desejada na faixa aqui descrita.
[0147]Todas as percentagens e razões aqui utilizadas, a menos que indicado de outra forma, são em peso. Outras características e vantagens da presente invenção são evidentes a partir dos diferentes exemplos. Os exemplos apresentados ilustram diferentes componentes e metodologia útil na prática da presente invenção. Os exemplos não limitam a invenção reivindicada. Com base na presente descrição o especialista na técnica pode identificar e utilizar outros componentes e metodologia úteis para a prática da presente invenção.
[0148]Nos esquemas de síntese aqui descritos, os compostos podem ser desenhados com uma configuração específica (por exemplo, sem ou com um estereoisômero indicado em particular) para simplicidade. Tais configurações particulares ou ausência das mesmas não devem ser interpretadas como limitando a invenção a um ou outro isômero, tautômero, regioisômero ou estereoisômero, nem exclui misturas de isômeros, tautômeros, regioisômeros ou estereoisômeros; No entanto, será compreendido que um determinado isômero, tautômero, regioisômero ou estereoisômero pode ter um nível mais elevado de atividade do que o outro isômero, tautômero, regioisômero ou estereoisômero.
[0149]Os compostos concebidos, selecionados e/ou otimizados por meio de métodos descritos acima, uma vez produzidos, podem ser caracterizados utilizando uma variedade de ensaios conhecidos dos especialistas na técnica, para determinar se os compostos têm atividade biológica. Por exemplo, as moléculas podem ser caracterizadas por ensaios convencionais, incluindo, entre outros, ensaios descritos a seguir, para determinar se eles têm uma atividade prevista, a atividade de ligação e/ou especificidade de ligação.
[0150] Além disso, a triagem de alto rendimento pode ser utilizada para acelerar a análise utilizando tais ensaios. Como resultado, pode ser possível triar rapidamente as moléculas aqui descritas para a atividade, utilizando técnicas conhecidas na técnica. Metodologias gerais para realizar a triagem de alto rendimento são descritas, por exemplo, em Devlin (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker; e Patente US 5.763.263. Os ensaios de alto rendimento podem utilizar uma ou mais técnicas de ensaio diferentes, incluindo, entre outras, aquelas descritas abaixo.
[0151]Todas as publicações e documentos de patente aqui citados são aqui incorporados por referência como se cada publicação ou documento fosse especificamente e individualmente indicado para ser aqui incorporado por referência. Citação de publicações e de documentos de patentes não pretendem ser uma admissão de que é qualquer técnica anterior pertinente, nem constitui qualquer admissão quanto ao conteúdo ou à data do mesmo. A invenção foi agora descrita a título de descrição escrita, os especialistas na técnica reconhecerão que a invenção pode ser praticada em uma variedade de modalidades e que a descrição anterior e os exemplos abaixo são para fins de ilustração e não como limitação das reivindicações que se seguem. Exemplos Exemplo 1. Síntese dos compostos da invenção Experimental Geral NMR
[0152]Espectros 1H-RMN foram feitos usando CDCl3 salvo indicação em contrário e foram registrados a 400 ou 500 MHz utilizando um instrumento ímã Varian ou Oxford (500 MHz). As multiplicidades indicadas são s = singleto, d = dubleto, t = tripleto, q = quarteto, quint = quinteto, sxt = sexteto, m = multipleto, dd = duplo de dubletos, dt = duplo de tripletos; br indica um sinal amplo. LCMS e HPLC
[0153]Massa: Waters Acquity LC Ultra Performance. HPLC: Os produtos foram analisados por Shimadzu SPD-20A com coluna 150 x 4,5 mm YMC ODS-M80 ou coluna YMC-Pack Pro C18 150 x 4,6 mm a 1,0 ml/min. A fase móvel era de MeCN:H2O = 3: 2 (contendo 0,3% de SDS e 0,05% de H3PO4). Os produtos foram purificados por HPLC/MS (MeOH-H2O, contendo hidróxido de amônio a 0,1%) utilizando um sistema Waters Autopurification 3100 com detector de massa. 3-(aminometil)-4,6-dimetil-1,2-di-hidropiridin-2-ona sal de HCl
[0154]A uma solução de 2-cianoacetamida (8,40 g, 100 mmol) e acetilacetona (10,0 g, 100 mmol) em H2O (200 mL) foi adicionado K2CO3(4,00 g, 28,9 mmol). A mistura foi agitada em TA durante 22 horas. Em seguida, o sólido precipitado foi separado por filtração com funil de Buchner, lavado com H2O gelada, e seco sob a pressão do vácuo para gerar 4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridina-3-carbonitrila (13,5 g, 91% Rendimento).
[0155]A uma solução de 4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridina-3-carbonitrila (10,0 g, 67,5 mmol) em MeOH (1,50 L) e do HCl concentrado (30 mL) foi adicionado 10% Pd(OH)2 (19 g) sob atmosfera de N2. O gás N2 foi deslocado pelo gás H2 e a mistura foi agitada durante 26 horas em temperatura ambiente sob atmosfera de hidrogênio. O gás H2 foi deslocado pelo gás N2. A mistura foi filtrada através de Celite, lavada com MeOH e concentrada. O resíduo foi triturado com EtOH, coletado com funil de Buchner e seco sob a pressão de vácuo para gerar o composto título como um sólido branco (11,5 g, 90%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ ppm 11,86 (brs, 1H), 5,98 (s, 1H), 3,78 (m, 2H), 2,20 (s, 3H), 2,16 (s, 3H). Ácido 5-Bromo-2-metil-3-nitrobenzoico
[0156]A uma solução agitada de ácido 2-metil-3-nitrobenzoico (5,00 g, 27,6 mmol) em H2SO4 (20 mL) foi adicionado l,3-dibromo-5,5-dimetilhidantoína (4,34 g, 15,20 mmol) a 0°C. A mistura de reação foi agitada a 0°C durante 5 horas. A mistura de reação foi vertida sobre água gelada, o precipitado sólido resultante foi coletado, lavado com água e seco em vácuo para gerar o composto título como um sólido branco (7,28 g, rendimento quantitativo). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm; 8,31 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 2,43 (s, 3H). Metil 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoato
[0157]A uma solução agitada de ácido 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoico (7,28 g, 28,0 mmol) em DMF(100 mL) foi adicionado carbonato de sódio (11,9 g, 112 mmol) e iodeto de metila (15,9 g, 112 mmol). A mistura de reação foi agitada a 60°C durante 8 horas. Depois de completada a reação, a mistura de reação foi filtrada e lavada com acetato de etila. O filtrado combinado foi lavado com água e a fase aquosa foi re- extraída com acetato de etila. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio anidro, filtradas e concentradas sob pressão reduzida para gerar o composto título como um sólido. (7,74 g, rendimento quantitativo). 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ (ppm); 8,17 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 3,96 (s, 3H), 2,59 (s, 3H). Metil 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato
[0158]A uma solução agitada de metil 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoato (7,60 g, 27,7 mmol) em EtOH aq. (100 mL de EtOH e 20 mL de H2O), foi adicionado cloreto de amônio (4,45 g, 83,1 mmol) e ferro (4,64 g, 83,1 mmol). A mistura de reação foi agitada a 80°C durante 5 horas. Em seguida, a mistura foi filtrada através de Celite e o leito de Celite foi lavado com acetato de etila. O filtrado combinado foi concentrado em vácuo. O resíduo resultante foi dissolvido em acetato de etila e água. A camada aquosa foi extraída com acetato de etila (duas vezes). A camada orgânica combinada seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para gerar o composto título como um óleo marrom (6,67 g, 99%). 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ ppm; 7,37 (s, 1H), 6,92 (s, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,80 (brs, 2H), 2,31 (s, 3H). Composto 1:
[0159]Etapa 1: Síntese de metil 5-(((trans)-4-((tert- butoxicarbonil)amino)ciclohexil)(etil)amino)-4'-hidroxi-4-metil-[1,1'-bifenil]-3- carboxilato
[0160]A uma solução agitada de metil 5-bromo-3-(((trans)-4-((tert- butoxicarbonil)amino)ciclohexil)(etil)amino)-2-metilbenzoato (10g, 21,3 mmol, ver, por exemplo, WO2012142504 (Attorney Docket No. 41478-507001WO)) e ácido (4- hidroxifenil)borônico (3,5g, 25,3 mmol) em uma mistura de dioxano (225 mL) e água (75 mL), Na2CO3 (8,01 g, 75,5 mmol) foi adicionada e a solução foi purgada com argônio por 30 min. Então Pd(PPh3)4 (2,4 g, 2,07 mmol) foi adicionado e argônio foi purgado novamente por mais 15 min. A massa de reação foi aquecida a 100oC por 4 h. Na conclusão, mistura de reação foi diluída com água e extraída com acetato de etila. Camada orgânica combinada foi seca em sulfato de sódio. Remoção do solvente sob pressão reduzida seguido por purificação em cromatografia de coluna gerou o composto título (8,9 g, 87% de rendimento).
[0161]Etapa 2: Síntese de metil 5-(((trans)-4-((tert-butoxicarbonil)amino) ciclohexil) (etil)amino)-4'-(2-metoxietoxi)-4-metil-[1,1'-bifenil]-3-carboxilato
[0162]A uma solução agitada de metil 5-(((trans)-4-((tert- butoxicarbonil)amino)ciclohexil)(etil)amino)-4'-hidroxi-4-metil-[1,1'-bifenil]-3- carboxilato (0,6 g, 1,24 mmol) e 1-bromo-2-metoxietano (0,519 g, 3,73 mmol) em acetonitrila (6 mL), Cs2CO3 (0,485 g, 1,49 mmol) foi adicionado e reação foi agitada em 80 oC por 12 h. Na conclusão, água foi adicionada a esta e extraída com acetato de etila. As camadas orgânicas combinadas foram secas em sulfato de sódio anidro e concentradas sob pressão reduzida. O composto bruto foi purificado por cromatografia em coluna para gerar o composto título (0,6 g, 76,5% de rendimento).
[0163]Etapa 3: Síntese de tert-butil ((trans)-4-((5-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2- dihidropiridin-3-il) metil) carbamoil)-4'-(2-metoxietoxi)-4-metil-[1,1'-bifenil]-3-il(etil)- amino)-ciclohexil) carbamato
[0164]NaOH aquoso (0,066 g, 1,66 mmol em 5 mL H2O) foi adicionado à uma solução de metil 5-(((trans)-4-((tert-butoxicarbonil)amino)ciclohexil)(etil)amino)-4'-(2- metoxietoxi)-4-metil-[1,1'-bifenil]-3-carboxilato (0,6 g, 1,11 mmol) em EtOH (10 mL) e agitado a 60oC por 1 h. Após conclusão da reação, etanol foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi acidificado usando ácido cítrico para pH 4 que foi justado usando ácido cítrico. Extração foi realizada usando 10% metanol em DCM. Camadas orgânicas combinadas foram secas, concentradas gerando respectivo ácido (0,5 g, 85,6% de rendimento).
[0165]O ácido acima (0,5 g, 0,95 mmol) foi então dissolvido em DMSO (5 mL) e 3-(aminometil)-4,6-dimetilpiridin-2(1H)-ona (0,288 g, 1,90 mmol) e trietil amina (0,096g, 0,950 mmol) foi adicionado a este. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 15 min antes de PyBop (0,741g, 1,42 mmol) ser adicionado a esta e agitação foi continuada durante a noite em temperatura ambiente. Após conclusão da reação, massa da reação foi vertida em gelo e extração foi realizada usando 10 % MeOH/DCM. Camadas orgânicas combinadas foram secas em sulfato de sódio e concentradas sob pressão reduzida para obter material bruto que foi então purificado por cromatografia em coluna para gerar o composto título (0,45 g, 71,8% de rendimento).
[0166]Etapa 4: Síntese de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5- (((trans)-4-(dimetilamino)-ciclohexil)-(etil)-amino)-4'-(2-metoxietoxi)-4-metil-[1,1'- bifenil] -3-carboxamida
[0167]A uma solução agitada de tert-butil((trans)-4-((5-(((4,6-dimetil-2-oxo- 1,2-dihidropiridin-3-il)metil)carbamoil)-4'-(2-metoxietoxi)-4-metil-[1,1'-bifenil]-3- il)(etil)amino)ciclohexil)carbamato (0,45 g, 0,681 mmol) em DCM (5 mL) a 0oC, TFA (1 mL) foi adicionado e reação foi agitada por 2 h em temperatura ambiente. Após conclusão, reação foi concentrada até secagem. O resíduo foi então basificado com Na2CO3 (aq.) para pH 8 e a camada aquosa extraída com 20% metanol em DCM. As camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SO4 e o solvente removido sob pressão reduzida para gerar composto Boc-desprotegido (0,3 g, 78,7% de rendimento).
[0168]A uma solução agitada de composto Boc-desprotegido (0,3 g, 0,535 mmol) em diclorometano (3 mL) foi adicionada solução de formaldeído (35-41% aq.) (0,056 g, 1,87 mmol) a 0oC e agitada por 20 min. Então, NaBH(OAc)3 (0,28 g, 1,33 mmol) foi adicionado e agitado por 2 h a 0oC. Na conclusão da reação, água foi adicionada e extraída com 20% metanol em DCM. As camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SO4 e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O composto bruto foi purificado por HPLC prep. para gerar o composto título (0,1 g, 31,7% de rendimento).
[0169]LCMS: 589,75 (M+1)+; TFA-sal: 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 11,47 (brs, 1H), 9,48 (brs, 1H), 8,21 (brs, 1H), 7,57 (d, 2H, J=8,0 Hz), 7,40 (s, 1H), 7,23 (s, 1H), 7,03 (d, 2H, J=8,8 Hz), 5,87 (s, 1H), 4,29 (d, 2H, J=4,4 Hz), 4,14-4,12 (m, 2H), 3,69-3,66 (m, 2H), 3,32 (s, 3H), 3,13 (m, 4H), 2,69-2,68 (m, 6H), 2,24 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 1,96 (m, 4H), 1,44 (m, 4H), 0,85 (t, 3H, J=6,8 Hz). Composto 2:
[0170]Etapa 1: Síntese de metil 5-bromo-3-(((trans)-4-((tert-butoxicarbonil)- (metil)-amino)-ciclohexil)(etil)amino)-2-metilbenzoato
[0171]A uma solução agitada de metil 5-bromo-3-(((trans)-4-((tert- butoxicarbonil)amino)ciclohexil)(etil)amino)-2-metilbenzoato (3 g, 6,41 mmol, ver, por exemplo, WO2012142504) em THF (30 mL), NaH (0,184 g, 7,69 mmol) foi adicionado a 0 °C e agitada na mesma temperatura por 20 min. Então metil iodeto (9,10 g, 64,10 mmol) foi adicionado a 0 oC e reação foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. Na conclusão, reação foi extinta com água gelada e extraída com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água, secas, concentradas sob pressão reduzida. O composto bruto foi purificado por cromatografia em coluna para gerar o composto título bruto que foi usado sem outra purificação (3 g, 97,4% de rendimento).
[0172]Etapa 2: Síntese de metil 3-(((trans)-4-((tert-butoxicarbonil)-(metil)- amino)-ciclohexil)-(etil)amino)-5-(3-hidroxiprop-1-in-1-il)-2-metilbenzoato
[0173]A uma solução agitada de metil 5-bromo-3-(((trans)-4-((tert- butoxicarbonil)-(metil)-amino)-ciclohexil)(etil)amino)-2-metilbenzoato (2 g, 4,14 mmol) em tolueno seco foi adicionado CuI (0,015 g, 0,079 mmol), PPh3 (0,043 g, 0,165 mmol), PdCl2(PPh3)2 (0,058 g, 0,082 mmol), N,N-diisopropil amina (1,08 g, 10,78 mmol) e reação foi purgada com argônio por 15 min. prop-2-in-1-ol (0,46 g, 8,29 mmol) foi adicionado a esta reação foi aquecida a 80 oC em condição vedada por 5 h. Na conclusão, esta foi extinta com água e extraída com acetato de etila. Camada orgânica foi seca em Na2SO4. O composto bruto foi purificado por cromatografia em coluna para gerar o composto título (1,2 g, 63,2% de rendimento).
[0174]Etapa 3: Síntese de metil 5-(3-bromoprop-1-in-1-il)-3-(((trans)-4-((tert- butoxicarbonil)-(metil)amino)ciclohexil)(etil)amino)-2-metilbenzoato:
[0175]A uma solução agitada de metil 3-(((trans)-4-((tert-butoxicarbonil)- (metil)-amino)-ciclohexil)-(etil)amino)-5-(3-hidroxiprop-1-in-1-il)-2-metilbenzoato (1,2 g, 2,62 mmol) em DCM (15 mL), PPh3 (1,37 g, 5,22 mmol) e CBr4 (1,7 g, 5,10 mmol) foram adicionados a 0 oC e reação foi agitada por 4 h em temperatura ambiente. Na conclusão, reação foi extinta com água gelada e extraída com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água, secas, concentradas sob pressão reduzida. O material bruto foi purificado por cromatografia em coluna para gerar o composto título (0,5 g, 38,5% de rendimento).
[0176]Etapa 4: Síntese de metil 3-(((trans)-4-((tert- butoxicarbonil)(metil)amino) ciclohexil)(etil)amino)-2-metil-5-(3-morfolinoprop-1-in-1- il)benzoato
[0177]A uma solução agitada de metil 5-(3-bromoprop-1-in-1-il)-3-(((trans)-4- ((tert-butoxicarbonil)-(metil)amino)ciclohexil)(etil)amino)-2-metilbenzoato (1 equiv.) em DMF, morfolina (5 equiv.) foi adicionado e reação foi agitada por 12 h em temperatura ambiente. Na conclusão, a reação foi extinta com água gelada e extraída com diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água, secas, concentradas sob pressão reduzida para gerar composto título bruto desejado que foi usado na etapa seguinte sem outra purificação (98,7% de rendimento)
[0178]Etapa 5: Síntese de tert-butil ((trans)-4-((3-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2- dihidro piridin-3-il)metil)carbamoil)-2-metil-5-(3-morfolinoprop-1-in-1-il) fenil)(etil)amino)ciclohexil)(metil)carbamato
[0179]NaOH (1,5 eq.) foi adicionado à uma solução de metil 3-(((trans)-4- ((tert-butoxicarbonil)(metil)amino)ciclohexil)(etil)amino)-2-metil-5-(3-morfolinoprop-1- in-1-il)benzoato (1 equiv.) em EtOH: H2O (9:1) e agitada a 60oC por 1 h. Após conclusão da reação, etanol foi removido sob pressão reduzida e acidificado usando HCl diluído até pH 6 e pH 4 foi ajustado usando ácido cítrico. Extração foi realizada usando 10% metanol em DCM. Camadas orgânicas combinadas foram secas e concentradas gerando ácido respectivo.
[0180]O ácido acima (1 equiv.) foi então dissolvido em DMSO e 3- (aminometil)-4, 6-dimetilpiridin-2(1H)-ona (2 equiv.) e trietil amina (1 equiv.) foi adicionado a esta. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 15 min antes de PyBop (1,5 equiv.) ser adicionado a esta e agitação foi continuada durante a noite em temperatura ambiente. Após conclusão da reação, a massa da reação foi vertida em gelo e extração foi realizada usando 10% MeOH/DCM. As camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SO4 e concentradas sob pressão reduzida para obter material bruto que então purificou primeiro em água seguido por acetonitrila lavando para gerar composto título desejado (69,4% de rendimento).
[0181]Etapa 6: Síntese de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-3- (etil((trans)-4-(metilamino)ciclohexil)amino)-2-metil-5-(3-morfolinoprop-1-in-1- il)benzamida
[0182]A uma solução agitada de tert-butil((trans)-4-((3-(((4,6-dimetil-2-oxo- 1,2-dihidro piridin-3-il)metil)carbamoil)-2-metil-5-(3-morfolinoprop-1-in-1-il) fenil)(etil)amino)ciclohexil)(metil)carbamato (1 equiv.) em DCM a 0 oC, TFA (3 equiv.) foi adicionado e reação foi agitada por 2 h em temperatura ambiente. Após conclusão, reação foi concentrada até secagem. O resíduo foi então basificado com Na2CO3 (aq.) a pH 8 e a camada aquosa foi extraída com 20% metanol em DCM. As camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SO4 e solvente foi removido sob pressão reduzida para gerar o composto título (99% de rendimento) que foi usado na reação seguinte sem outra purificação.
[0183]Etapa 7: Síntese de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-3- (etil((trans)-4-((2-metoxietil)(metil)amino)ciclohexil)amino)-2-metil-5-(3-morfolinoprop- 1-in-1-il)benzamida
[0184]A uma solução agitada de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3- il)metil)-3-(etil((trans)-4-(metilamino)ciclohexil)amino)-2-metil-5-(3-morfolinoprop-1-in- 1-il)benzamida (1 equiv.) em dicloroetano, 2-metoxiacetaldeído (10 equiv.) e ácido acético (6 equiv.) foi adicionado a 0 oC e agitada por 20 min. Então NaBH(OAc)3 (3 equiv.) foi adicionado e agitada por 2h a 0 oC. Na conclusão da reação, água foi adicionada e extraída com 20% metanol em DCM. Camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SO4 e solvente removido sob pressão reduzida. O composto bruto foi purificado por prep. HPLC para gerar molécula alvo (0,1 g, 33,6% de rendimento).
[0185]LCMS: 606,65 (M+1)+; TFA sal: 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 11,50 (brs, 1H), 9,22 (brs, 1H), 8,18 (t, 1H), 7,24 (s, 1H), 7,09 (s, 1H), 5,86 (s, 1H), 4,26-4,25 (m, 4H), 3,66-3,59 (m, 4H), 3,48-3,36 (m, 3H), 3,29-3,17 (m, 7H), 3,04-3,01 (m, 3H), 2,69-2,68 (m, 4H), 2,20 (s, 3H), 2,19 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 2,00-1,92 (m, 2H), 1,82-1,73 (m, 3H), 1,46 (m, 4H), 0,78 (t, 3H, J=6,4 Hz). Esquema sintético Alternativo para composto 2:
[0186]Etapa A: Síntese de 4-(prop-2-in-1-il)morfolina:
[0187]A uma solução agitada de propargil brometo (50 g, 420 mmol) em acetona (300 mL), Cs2CO3 (136,5 g, 420 mmol) foi adicionado a 0 oC. Então morfolina (36,60 g, 420 mmol) em acetona (200 mL) foi adicionado sob gotejamento e reação foi agitada em temperatura ambiente por 16 h. Na conclusão, a massa da reação foi filtrada e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para gerar o composto título (50 g, bruto). O composto isolado foi usado diretamente na etapa de acoplamento subsequente sem outra purificação.
[0188]Etapa 1: Síntese de metil 5-bromo-3-(etil((trans)-4-(metilamino) ciclohexil) amino)-2-metilbenzoato:
[0189]A uma solução agitada de metil 5-bromo-3-(((trans)-4-((tert- butoxicarbonil)(metil)amino)ciclohexil)(etil)amino)-2-metilbenzoato (30 g, 62,24 mmol) em metanol (100 mL) a 0 oC, HCl metanólico (500 mL) foi adicionado e reação foi agitada por 2 h em temperatura ambiente. Após conclusão, reação foi concentrada até secagem. O resíduo foi basificado com Na2CO3 (aq.) a pH 8 e camada aquosa foi extraída com 10% metanol em DCM (200 mL x 3). Camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SO4 e solvente removido sob pressão reduzida para gerar o composto título como óleo incolor (25 g, bruto). O composto resíduo foi usado na etapa seguinte sem outra purificação.
[0190]Etapa 2: Síntese de metil 5-bromo-3-(etil((trans)-4-((2-metoxietil)- (metil)-amino) ciclohexil) amino)-2-metilbenzoato:
[0191]A uma solução agitada de bruto de metil 5-bromo-3-(etil((trans)-4- (metilamino) ciclohexil)amino)-2-metilbenzoato (25 g, 65,44 mmol), 1-bromo-2- metoxietano (18,19 g, 130,8 mmol) em acetonitrila (250 mL), K2CO3 (18,06 g, 130,8 mmol) e KI (6,51 g, 39,21 mmol) foram adicionados. A massa da reação resultante foi agitada em 65 oC por 16 h. Na conclusão, mistura de reação foi diluída com água (300 mL) e extraída com DCM (500 mL x 3). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água, secas em Na2SO4 e concentradas sob pressão reduzida. O composto bruto foi purificado por cromatografia de sílica gel em coluna para gerar o composto título (20 g, 69,3% de rendimento).
[0192]1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7,55 (s, 1H), 7,45 (s, 1H), 3,82 (s, 3H), 3,32 (m, 4H), 3,20 (s, 3H), 3,05 (q, 2H), 2,61 (m, 1H), 2,32 (s, 3H), 2,30 (m, 1H), 2,15 (s, 3H), 1,77-1,67 (m, 4H), 1,37-1,31(m, 2H), 1,24-1,18 (m, 2H), 0,78 (t, 3H, J=6,8 Hz).
[0193]Etapa 3: Síntese de metil 3-(etil((trans)-4-((2-metoxietil)-(metil)-amino)- ciclohexil)-amino)-2-metil-5-(3-morfolinoprop-1-in-1-il)benzoato:
[0194]A solução de metil 5-bromo-3-(etil((trans)-4-((2-metoxietil)-(metil)- amino) ciclohexil) amino)-2-metilbenzoato (30 g, 68,02 mmol), 4-(prop-2-in-1-il) morfolina (25,51 g, 204 mmol) e trietilamina (20,61 g, 204 mmol) em DMF (300 mL) foi borbulhada por Argônio por 20 min. Então CuI (3,87 g, 20,36 mmol) e Pd (PPh3)4 (7,85 g, 6,79 mmol) foram adicionados e Argônio foi borbulhada por mais 20 min. A mistura de reação foi aquecida a 105 oC por 4 h e então resfriada até temperatura ambiente. A reação foi extinta com água (100 mL) e a fase aquosa foi extraída com 10 % MeOH/DCM (400 mL x 3). Os extratos orgânicos combinados foram secos em Na2SO4, filtrados e concentrados. O resíduo foi purificado por cromatografia de sílica gel em coluna para gerar o composto título (21 g, 63,7% de rendimento).
[0195]1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7,46 (s, 1H), 7,32 (s, 1H), 3,82 (s, 3H), 3,62-3,57 (m, 6H), 3,50 (s, 2H), 3,35-3,32 (m, 2H), 3,21 (s, 3H), 3,17 (m, 1H), 3,05 (q, 2H), 2,61-2,58 (m, 2H), 2,38 (s, 3H), 2,33 (m, 1H), 2,18 (m, 2H), 1,77-1,70 (m, 4H), 1,36-1,20 (m, 4H), 0,77 (t, 3H, J=6,8 Hz), 3H emergiu em pico de solvente.
[0196]Etapa 4: Síntese de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-3- (etil((trans)-4-((2-metoxietil)(metil)amino)ciclohexil)amino)-2-metil-5-(3-morfolinoprop- 1-in-1-il)benzamida:
[0197]NaOH aquoso (2,59 g, 64,91 mmol em 10 mL H2O) foi adicionado à uma solução de metil 3-(etil((trans)-4-((2-metoxietil)-(metil)-amino)-ciclohexil)-amino)-2- metil-5-(3-morfolinoprop-1-in-1-il)benzoato (21 g, 43,29 mmol) em EtOH (100 mL) e agitada a 60 oC por 1 h. Após conclusão da reação, etanol foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi acidificado usando HCl diluído até pH 4 usando ácido cítrico. Extração foi realizada usando 10 % MeOH/DCM (200 mL x 3). Camadas orgânicas combinadas foram secas concentradas gerando ácido respectivo (15,5 g, 76% de rendimento).
[0198]À solução de ácido acima (15,5 g, 32,90 mmol) em DMSO (50 mL), 3- (amino metil)-4,6-dimetilpiridin-2(1H)-ona (10 g, 65,80 mmol) e trietil amina (23 mL, 164,5 mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 15 min antes de PyBop (25,66 g, 49,34 mmol) ser adicionado a esta a 0 oC e novamente agitada durante a noite em temperatura ambiente. Após conclusão, a massa da reação foi vertida em água gelada (100 mL) e extração foi realizada usando 10 % MeOH/DCM (200 mL x 3). Camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SO4 e concentradas sob pressão reduzida. O composto bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre alumina básica eluindo com MeOH:DCM para gerar o composto título (11 g, 55,3% de rendimento).
[0199]LCMS: 606,50 (M + 1)+; 1H NMR (MeOD, 400 MHz) δ 7,23 (s, 1H), 7,09 (s, 1H), 6,11 (s, 1H), 4,46 (s, 2H), 3,74-3,72 (m, 4H), 3,51 (s, 2H), 3,47 (t, 2H, J=5,6 Hz,), 3,32 (s, 3H), 3,07 (q, 2H, J=7,2 Hz), 2,64-2,63 (m, 7H), 2,38 (m,1H), 2,37 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 2,26 (s, 3H), 2,25 (s, 3H), 1,89-1,86 (m, 4H), 1,50-1,30 (m, 4H), 0,83 (t, 3H, J=7,2 Hz). Composto 105: Metil-5-bromo-2-metil-3-[oxan-4-il)amino]benzoato
[0200]A uma solução agitada de metil 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato (40,2 g, 165 mmol) em CH2Cl2 (500 mL) e AcOH (60 ml) foi adicionado di-hidro-2H-piran-4- ona (17,3 g, 173 mmol) e triacetoxiborohidreto de sódio (73,6 g, 330 mmol). A mistura de reação foi agitada em TA durante 20 horas. Em seguida, NaHCO3 saturado aq. foi adicionado e a mistura foi separada. A camada aquosa foi extraída com CH2Cl2 e a camada orgânica combinada foi concentrada em vácuo. O resíduo foi triturado com éter etílico, e o precipitado resultante foi coletado para produzir o composto título como um sólido branco (39,1 g, 72%). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm; 7,01 (s, 1H), 6,98 (s, 1H), 5,00 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 3,84-3,87 (m, 2H), 3,79 (s, 3H), 3,54-3,56 (m, 1H) , 3,43 (m, 2H), 2,14 (s, 3H), 1,81-1,84 (m, 2H), 1,47-1,55 (m, 2H). Metil 5-bromo-3-[etil(oxan-4-il)amino]-2-metilbenzoato
[0201]A uma solução agitada de metil 5-bromo-2-metil-3-[(oxan-4- il)amino]benzoato (39,1 g, 119 mmol) em CH2Cl2 (400 mL) e AcOH (40 mL) foi adicionado acetaldeído (24,7 g, 476 mmol) e triacetoxiborohidreto de sódio (79,6 g, 357 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT durante 24 h. Então NaHCO3 aq. saturado foi adicionado e a mistura foi separada. A camada aquosa foi extraída com CH2Cl2 e a camada orgânica combinada foi concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel (SiO2 Heptano/EtOAc = 3/1) para gerar o composto título como um óleo viscoso (44,1 g, rendimento quantitativo). 1H- NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm; 7,62 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 3,80 (m, 5H), 3,31 (m, 2H), 2,97-3,05 (m, 2H), 2,87-2,96 (m, 1H), 2,38 (s, 3H), 1,52-1,61 (m, 2H), 1,37-1,50 (m, 2H), 0,87 (t, J = 6,8 Hz, 3H). tert-Butil 4-((3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-5-(metoxicarbonil)-4- metilfenil)etinil)piperidin-1-carboxilato
[0202]A uma solução de metil 5-bromo-3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)- 2-metilbenzoato (1,80 g, 5,05 mmol) e tert-butil 4-etinilpiperidin-1-carboxilato (1,80 g, 8,59 mmol) em DMF (40 ml) foi adicionado trietilamina (2,82 ml, 20,2 mmol) e iodeto de cobre (I) (0,096 g, 0,505 mmol). A mistura de reação foi desgaseificada por borbulhamento de nitrogênio por 15 min. Então tetrakis(trifenilfosfino)paládio(0) (0,292 g, 0,253 mmol) foi introduzido e desgaseificado por borbulhamento de nitrogênio. A mistura de reação foi aquecida a 80°C por 6 h. A reação foi extinta com NaHCO3 sat., extraída com TBME (3x40 mL), seca em Na2SO4, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia (0% a 40% AcOEt/Heptano) para gerar o composto título (2,40 g, 98% rendimento). 1H-NMR (500 MHz) δ ppm; 7,65 (s, 1H), 7,28 (s, 1H), 3.97 (brd, J = 11.3 Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 3,76 (m, 2H), 3.34 (dt, J = 2,0, 11,7 Hz, 2H), 3,24 (ddd, J = 3,4, 8,8, 12,2 Hz, 2H), 3,08 (brs, 2H), 2.98 (brs, 1H), 2,80 (dddd, J=3.9, 3.9, 3.9, 3.9 Hz, 1H), 2,52 (s, 3H), 1,87 (m, 2H), 1,60-1,74 (m, 6H), 1,48 (s, 9H), 0,89 (t, J = 6,8 Hz, 3H) ); MS (ESI) [M+H]+ 485,4. Ácido 5-((1-(tert-Butoxicarbonil)piperidin-4-il)etinil)-3-(etil(tetrahidro-2H-piran-
[0203] A uma solução de tert-butil 4-((3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-5- (metoxicarbonil)-4-metilfenil)etinil)piperidin-1-carboxilato (2,4 g, 4,95 mmol) em etanol (20,0 mL) foi adicionada uma solução de hidróxido de sódio (0,565 g, 14,1 mmol) em água (3,0 ml) em rt. A mistura de reação foi aquecida a 60°C por 6 h. A reação foi extinta com 1 M HCl (5 mL) e então excesso de solução de ácido cítrico para ajustar o pH para 5. A mistura foi concentrada para remover EtOH e o restante da fase aquosa foi extraída com AcOEt (2x40 mL). As camadas orgânicas foram combinadas, secas em Na2SO4, filtradas e concentradas. O resíduo foi purificado por cromatografia (10% a 100% AcOEt/Heptano) para gerar o composto título (2,30 g, 99% rendimento). 1H- NMR (500 MHz) δ ppm; 7,82 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 3,98 (brd, J = 11.3Hz, 2H), 3,77 (m, 2H), 3.35 (dt, J = 1,5, 11.3Hz, 2H), 3,25 (ddd, J = 3,4, 8.3, 12,2 Hz, 2H), 3,11 (brs, 2H), 3,00 (brs, 1H), 2,81 (dddd, J=3,9, 3,9, 3,9, 3,9 Hz, 1H), 2,60 (s, 3H), 1,88 (m, 2H), 1,60-1,78 (m, 6H), 1,48 (s, 9H), 0,90 (t, J = 6,8Hz, 3H); MS (ESI) [M+H]+ 471,4. tert-Butil 4-((3-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)carbamoil)-5- (etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metilfenil)etinil)piperidin-1-carboxilato
[0204]A uma solução de ácido 5-((1-(tert-butoxicarbonil)piperidin-4-il)etinil)-3- (etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzoico (1,06 g, 2,25 mmol) em DMSO (5,8 mL) em rt foi adicionado trietilamina (0,90 mL, 6,44 mmol) e (4,6-dimetil-2-oxo- 1,2-dihidropyridin-3-il)metanamínio cloreto (0,405 g, 2,15 mmol). A solução clara se tornou heterogênea. Então HOBT (0,493 g, 3,22 mmol) e EDC (0,617 g, 3,22 mmol) foram adicionados e a mistura de reação resultante foi agitada em rt durante a noite. A reação foi extinta com água (80 mL) e a pasta foi agitada por 1 h em rt. A pasta foi filtrada e a torta foi lavada com água (2x20 mL). O sólido coletado foi seco sob vácuo para gerar o composto título (1,27 g, 98% rendimento). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm; 7,22 (s, 1H), 7,08 (d, J = 1,0 Hz 1H), 6,11 (s, 1H), 4,45 (s, 2H), 3,92 (brd, J = 10,8 Hz, 2H), 3,78 (dd, J =4,4, 5,4 Hz, 1H), 3,75 (dd, J =4,4, 5,4 Hz, 1H), 3.36 (t, J = 11,7 Hz, 2H), 3,21 (br t, J=8.3 Hz, 2H), 3,07 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 3,01 (dddd, J=3,9, 3,9, 11.3, 11.3 Hz, 1H), 2,84 (dddd, J=3,4, 3,4. 3,9, 3,9 Hz, 1H), 2.38 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,25 (s, 3H), 1,88 (m, 2H), 1,70 ((brd, J = 12,2 Hz, 2H), 1,60 (m, 4H), 1,47 (s, 9H), 0,87 (t, J = 7.3 Hz, 3H); MS (ESI) [M+H]+ 605,6. N-((4,6-Dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-3-(etil(tetrahidro-2H-piran- 4-il)amino)-2-metil-5-(piperidin-4-iletinil)benzamida
[0205]A uma solução de tert-butil 4-((3-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin- 3-il)metil)carbamoil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metilfenil)etinil)piperidin- 1-carboxilato (250 mg, 0,413 mmol) em DCM (3 mL) foi adicionado 4M HCl em 1,4- dioxano (3 mL, 12,0 mmol) a 20 °C. A mistura foi agitada a 20 °C por 1 h. LCMS indicou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi diretamente concentrada e o resíduo foi dissolvido em DCM e então neutralizada com NaHCO3 sat./salmoura. A camada orgânica foi seca (Na2SO4) e filtrada. E o filtrado foi concentrado. O resíduo foi usado para alquilação sem outra purificação (209 mg, 100%). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm 7,21 (brs, 1H), 7,07 (brs, 1H), 6,11 (s, 1H), 4,46 (s, 2H), 3,95-3,89 (m, 2H), 3.39-3.34 (m, 2H), 3,08 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 3,06-2,98 (m, 3H), 2,79-2,72 (m, 1H), 2,72-2,65 (m, 2H), 2.38 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,25 (s, 3H), 1,94-1,88 (m, 2H), 1,73-1,68 (m, 2H), 1,68-1,56 (m, 4H), 0,85 (t, J = 7,0 Hz, 3H); MS (ESI) [M+H]+ 505,5. N-((4,6-Dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-3-(etil(tetrahidro-2H-piran- 4-il)amino)-2-metil-5-((1-metilpiperidin-4-il)etinil)benzamida
[0206]A uma solução de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-3- (etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metil-5-(piperidin-4-iletinil)benzamida (100 mg, 0,198 mmol) em metanol (5 mL) foi adicionado 35% formaldeído em H2O (0,155 mL, 1,98 mmol) a 0 °C. Após agitação a 0 °C por 10 min, cianoborohidreto de sódio (24,9 mg, 0,396 mmol) foi adicionado. A mistura resultante foi agitada a 0 °C por 1 h. LCMS indicou que a reação foi concluída. A mistura de reação foi extinta com NaHCO3 sat./salmoura e extraída com EtAOc/Heptano. A camada orgânica foi seca (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia (coluna 10 g, MeOH/DCM=1:9, e então MeOH/7 M NH3 em MeOH/DCM=1:1:8) para gerar o composto título (96,0 mg, 93%). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm 7,22 (brs, 1H), 7,08 (brs, 1H), 6,10 (s, 1H), 4,46 (s, 2H), 3,94-3,87 (m, 2H), 3.35-3.30 (m, 2H), 3,07 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 3,04-2,97 (m, 1H), 2,79-2,71 (m, 2H), 2,67-2,58 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,25 (s, 3H), 2,28-2,21 (m, 2H), 1,97-1,91 (m, 2H), 1,781,67 (m, 4H), 1,64-1,54 (m, 2H), 0,85 (t, J = 7,0 Hz, 3H); MS (ESI) [M+H]+ 519,4. Exemplo 2: protocolo de bioensaio e Métodos Gerais Protocolo para ensaios de enzima PRC2 tipo selvagem e mutante
[0207]Materiais Gerais. S-adenosilmetionina (SAM), S-adenosilhomociteína (HAS), bicina, KCl, Tween20, dimetilsulfóxido (DMSO) e gelatina de pele bovina (BSG) foram adquiridos da Sigma-Aldrich, ao mais alto nível de pureza possível. Ditiotreitol (DTT) foi comprado de EMD. 3H-SAM foi adquirido a partir de American Radiolabeled Chemicals com uma atividade de 80 Ci/mmol específico. Flashplates de 384 poços com estreptavidina foram adquiridos da Perkin Elmer.
[0208]Substratos. Peptídeos representativos histona humana H3 resíduos 21- 44 contendo uma lisina não modificada 27 (H3K27me0) ou lisina dimetilada 27 (H3K27me2) foram sintetizados com um motivo tag de afinidade ao ligante C-terminal G(K-biotina) e uma tampa de amida C-terminal da 21st Century Biochemicals. Os peptídeos foram purificados em cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) até mais de 95% de pureza e confirmados por Cromatografia líquida com espectrometria de massa (LC-MS). As sequências são listadas abaixo. H3K27me0: ATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGGK (biotina)-amida (SEQ ID NO: 101) H3K27me2: ATKAARK(me2)SAPATGGVKKPHRYRPGGK (biotina)-amida (SEQ ID NO: 102)
[0209]Oligonucleossomas eritrocitárias de galinha foram purificadas a partir de sangue de galinha de acordo com procedimentos estabelecidos.
[0210]Complexos PRC2 recombinantes. Complexos PRC2 humanos foram purificados na forma de complexos de enzima de 4 componente co-expressos em células de Spodoptera frugiperda (sf9) usando um sistema de expressão de baculovírus. As subunidades expressas foram EZH2 tipo selvagem (NM_004456) ou EZH2 Y641F, N, H, S ou C mutantes gerados a partir do construto EZH2 tipo selvagem, EED (NM_003797), Suz12 (NM_015355) e RbAp48 (NM_005610). A subunidade EED continha um tag FLAG N-terminal que foi usado para purificar todo o complexo de 4 componente de lisados de células sf9. A pureza dos complexos met ou excedeu 95%, como determinado por análise de SDS-PAGE e Agilent Bioanalyzer. As concentrações de concentrações de enzima estoque (geralmente 0,3 - 1,0 mg/mL) foram determinadas usando um ensaio de Bradford contra um padrão de albumina de soro bovino (BSA).
[0211]Processo Geral para ensaios enzimáticos de PRC2 sobre Substratos de peptídeo. Os ensaios foram todos realizados em um tampão que consiste em 20 mM de bicina (pH = 7,6), DTT 0,5 mM, 0,005% BSG e 0,002% Tween 20, preparado no dia de utilização. Compostos em 100% DMSO (1 μL) foram colocados em placas de polipropileno de 384 poços com fundo em V (Greiner) usando um Platemate 2 X 3 equipado com uma cabeça de pipeta de 384 canais (Thermo). DMSO (1 μL) foi adicionado às colunas 11, 12, 23, 24, linhas A - H para o máximo controle de sinal, e SAH, um produto conhecido e inibidor de PRC2 (1 μL) foi adicionado às colunas 11,12, 23, 24, linhas I - P para o controle de sinal mínimo. Um coquetel (40 μL) contendo a enzima PRC2 tipo selvagem e peptídeo H3K27me0 ou qualquer uma de enzimas mutante Y641 e peptídeo H3K27me2 foi adicionado por Multidrop Combi (Thermo). Compostos foram deixados incubar com PRC2 POR 30 min a 25°C, então um coquetel (10 μL) contendo uma mistura não radioativa e 3H-SAM foi adicionada para dar início a uma reação (volume final = 51 μL). Em todos os casos, as concentrações finais foram as seguintes: enzima tipo selvagem ou mutante PRC2 foi 4 nM, SAH nos poços mínimos de controle de sinal foi 1 mM e a concentração de DMSO foi de 1%. As concentrações finais do resto dos componentes são indicadas na Tabela 2, abaixo. Os ensaios foram interrompidos por adição de SAM não radioativo (10 μL) a uma concentração final de 600 μM, que dilui 3H-SAM para um nível onde a sua incorporação no substrato de peptídeo não é mais detectável. 50 μL da reação na placa de polipropileno de 384 poços foram então transferidos para uma Flashplate de 384 poços e os peptídeos biotinilados foram deixadas ligar à superfície de estreptavidina para pelo menos 1h antes de ser lavado três vezes com 0,1% de Tween 20 em uma lavadora de placas Biotek ELx405. As placas foram lidas então em um leitor de placas Perkin Elmer TopCount para medir a quantidade de peptídeo marcado com 3H ligado a uma superfície Flashplate, medida como desintegrações por minuto (dpm) ou alternativamente, referido como contagens por minuto (cpm). Tabela 2: Concentrações finais de componentes para cada variação de ensaio com base na identidade . EZH2 (EZH2de tipo selvagem ou mutante Y641)
[0212]Procedimento Geral para ensaio de enzima de PRC2 tipo selvagem em Substrato Oligonucleossoma. Os ensaios foram realizados em um tampão que consiste em 20 mM de bicina (pH = 7,6), DTT 0,5 mM, 0,005% BSG, 100 mM de KCl e 0,002% de Tween 20, preparado no dia de utilização. Compostos em 100% DMSO (1 μL) foram colocados em placas de polipropileno de 384 poços de fundo em V (Greiner) usando um Platemate 2 X 3 equipado com uma cabeça de pipeta de 384 canais (Thermo). DMSO (1 μL) foi adicionado às colunas 11, 12, 23, 24, as linhas A - H para o controle máximo de sinal, e SAH, um produto conhecido e inibidor de PRC2 (1 μL) foi adicionado às colunas 11,12, 23, 24, linhas I - P para o controle de sinal mínimo. Um coquetel (40 μL) contendo a enzima PRC2 tipo selvagem e oligonucleossoma de eritrócitos de galinha foi adicionado por Multidrop Combi (Thermo). Compostos foram deixadas incubar com PRC2 por 30 min a 25°C, então um coquetel (10 μL) contendo uma mistura de não radioativo e 3H-SAM foi adicionado para dar início a uma reação (volume final = 51 μL). As concentrações finais foram as seguintes: enzima PRC2 tipo selvagem foi 4 nM, SAM não radioativo foi 430 nm, 3H- SAM foi 120 nM, olignonucleossoma de eritrócitos de galinha foi 120 nM, SAH nos poços de controle de sinal mínimos foi 1 mM e a concentração de DMSO foi de 1%. O ensaio foi parado por adição de SAM não radioativo (10 μL) a uma concentração final de 600 μM, que dilui 3H-SAM para um nível onde a sua incorporação no substrato olignonucleossoma de eritrócitos de galinha é não detectável. 50 μL de uma reação na placa de 384 poços de polipropileno então foi transferida para uma Flashplate de 384 poços e os nucleossomas de eritrócitos de galinha foram imobilizados à superfície de placa, que foi lavado então três vezes com 0,1% de Tween 20 em uma lavadora de placas Biotek ELx405. As placas foram então lidas em um leitor de placas Perkin Elmer TopCount para medir a quantidade de oligonucleossoma de eritrócitos de galinha marcado com 3H ligado a uma superfície Flashplate, medido como desintegrações por minutos (dpm) ou alternativamente, referido como contagens por minuto (cpm).
[0213]Cálculo de %Inibição
[0214]Onde dpm = desintegrações por minuto, cmpd = sinal em poço de ensaio, e min e max são os respectivos controles mínimo e máximo de sinal.
[0215]Ajuste de IC50 de quatro parâmetros
[0216]Onde top e bottom são normalmente deixados flutuar, mas podem ser fixados em 100 ou 0 respectivamente em um ajuste de 3 parâmetros. The coeficiente Hill normalmente deixado flutuar, mas também pode ser fixado em 1 em um ajuste de 3 parâmetros. Y é o % de inibição e X é a concentração do composto.
[0217]Os valores de IC50 para os ensaios da enzima PRC2 sobre substratos peptídicos (por exemplo, EZH2 tipo selvagem e Y641F) são apresentados nas Tabelas 3A e 3B abaixo.
[0218]Ensaio de metilação de WSU-DLCL2
[0219]As células em suspensão WSU-DLCL2 foram adquiridas de DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Alemanha). Meio RPMI/Glutamax, Penicilina-Estreptomicina, Soro Fetal Bovino inativado pelo calor, e D-PBS foram adquiridos da Life Technologies, Grand Island, NY, EUA. Tampão de extração e Tampão de Neutralização (5X) foram adquiridos a partir do motivo Active, Carlsbad, CA, EUA. Anticorpo anti-histona H3 de coelho foi adquirido de Abcam, Cambridge, MA, EUA. Anti-H3K27me3 de coelho e IgG anti-coelho conjugado a HRP foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA. O substrato TMB “Super Sensitive” foi proveniente de BioFX Laboratories, Owings Mills, MD, EUA. Albumina de Soro Bovino livre de IgG adquirida de Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EUA. PBS com Tween (PBST 10x) foi adquirido de KPL, Gaithersburg, MD, EUA. Ácido Sulfúrico foi comprado de Ricca química, Arlington, TX, EUA. Placas de ELISA Immulon foram adquiridas de Thermo, Rochester, NY, EUA. As placas de cultura celular de fundo em V foram adquiridas da Corning Inc., Corning, NY, placas de polipropileno de fundo em V foram adquiridas a partir de Greiner Bio-One, Monroe, NC, EUA.
[0220]As células em suspensão WSU-DLCL2 foram mantidas em meio de crescimento (meio RPMI 1640 suplementado com 10% v/v de soro bovino fetal inativado por calor e 100 unidades/mL de penicilina-estreptomicina) e cultivadas a 37°C, 5% de CO2. Nas condições de ensaio, as células foram incubadas em Meio de Ensaio (RPMI 1640 suplementado com 20% v/v de soro bovino fetal inativado por calor e 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina) a 37°C sob 5% de CO2 em um agitador de placas.
[0221]As células WSU-DLCL2 foram semeadas meio de ensaio em uma concentração de 50.000 células por ml para uma placa de cultura de célula de 96 cavidades de fundo em V com 200 μl por poço. Composto (1 μl) a partir das placas de origem de 96 poços foi adicionado diretamente à placa de células com fundo em V. As placas foram incubadas em um agitador de placas-título a 37°C, 5% de CO2 durante 96 horas. Depois de quatro dias de incubação, as placas foram centrifugadas a 241 x g durante cinco minutes e o meio foi aspirado suavemente de cada poço da placa de células, sem perturbar o pellet celular. Pellet foi ressuspenso em 200 μl DPBS e as placas foram centrifugadas novamente a 241 x g durante cinco minutes. O sobrenadante foi aspirado e tampão de extração frio (4°C) (100 μl) foi adicionado por poço. As placas foram incubadas a 4°C em um agitador orbital durante duas horas. As placas foram centrifugadas a 3427 x g x 10 Minutos. O sobrenadante (80 μL por poço) foi transferido para o seu respectivo poço em placa de 96 poços de polipropileno de fundo em V. Tampão de Neutralização 5X (20 μL por poço) foi adicionado à placa de polipropileno de fundo em V contendo sobrenadante. Placas de polipropileno de fundo em V contendo preparação bruta de histona (CHP) foram incubadas em agitador orbital x cinco minutes. Preparações de Histona bruta foram adicionadas (2 μl por poço) para cada um dos respectivos poços em duplicada de placas de 96 poços de ELISA contendo 100 μL de Tampão de revestimento (1X PBS + BSA a 0,05% p/v). As placas foram seladas e incubadas durante uma noite a 4°C. No dia seguinte, as placas foram lavas três vezes com 300 μL por poço 1X PBST. Os poços foram bloqueados durante duas horas com 300 μL por poço de Diluente de ELISA ((PBS (1X) BSA (2% p/v) e Tween 20 (0,05% v/v)). As placas foram lavadas três vezes COM 1X PBST. Para a placa de detecção de Histona H3, foram adicionados 100 μL por poço de anticorpo anti-Histona H3 (Abcam, ab1791) diluição 1: 10.000 em diluente de ELISA. Para placa de detecção de trimetilação de H3K27, foram adicionados 100 μL por poço de anti-H3K27me3 diluição 1:2000 em diluente de ELISA. As placas foram incubadas durante 90 minutos em temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com 300 μL por poço de 1X PBST. Para a detecção de Histona H3, 100μl de anticorpo anti-IgG de coelho conjugado a HRP diluição 1:6000 em diluente de ELISA foi adicionado por poço. Para a detecção de H3K27me3, 100 μL de anticorpo anti-IgG de coelho conjugado HRP diluição 1:4000 em diluente ELISA foi adicionado por poço. As placas foram incubadas em temperatura ambiente por 90 minutos. As placas foram lavadas quatro vezes com 1X com PBST a 300 μL por poço. 100 μL de substrato TMB foram adicionados por poço. As placas de histona H3 foram incubadas durante cinco minutos em temperatura ambiente. As placas de H3K27me3 foram incubadas por 10 minutos em temperatura ambiente. A reação foi parada com ácido sulfúrico 1 N (100 μL por poço). A absorbância para cada placa foi lida a 450 nm.
[0222]Primeiro, a proporção de cada poço foi determinada por:
[0223]Cada placa incluiu oito poços de controle de tratamento apenas com DMSO (inibição mínima), bem como oito poços de controle para a inibição máxima (poços de fundo).
[0224]A média dos valores da proporção para cada tipo de controle foi utilizada para determinar a percentagem de inibição para cada poço de teste na placa. Composto de teste foi diluído em série três vezes em DMSO para um total de dez concentrações de teste, começando a 25 μM. Percentagem de inibição foi determinada e curvas de IC50 foram geradas usando poços duplicados para cada concentração de composto. Os valores de IC50 para este ensaio são apresentados nas Tabelas 3A e 3B abaixo.
[0225]Percentagemdeinibição = 100
[0226]Análise de proliferação celular
[0227]As células em suspensão WSU-DLCL2 foram adquiridas de DSMZ (German collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Alemanha). Meio RPMI/Glutamax, Penicilina-Estreptomicina, Soro Fetal Bovino inativado pelo calor foram adquiridos da Life Technologies, Grand Island, NY, EUA. Placas de polipropileno de fundo em V de 384 poços foram adquiridas de Greiner Bio-One, Monroe, NC, EUA. As placas brancas opacas de cultura de células de 384 poços foram adquiridas da Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA. Cell-Titer Glo® foi adquirido de Promega Corporation, Madison, WI, EUA. Leitor de placas SpectraMax M5 foi adquirido da Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, EUA.
[0228]As células em suspensão WSU-DLCL2 foram mantidas em meio de crescimento (meio RPMI 1640 suplementado com 10% v/v Soro Fetal Bovino inativado pelo calor e cultivadas a 37°C, sob 5% de CO2). Nas condições do ensaio, as células foram incubadas em Meio de Ensaio (meio RPMI 1640 suplementado com 20% v/v de soro bovino fetal inativado por calor e 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina) a 37°C sob 5% de CO2.
[0229]Para a avaliação de efeito de compostos sobre a proliferação da linhagem de células WSU-DLCL2, as células em crescimento exponencial foram semeadas em placas brancas opacas de 384 poços com uma densidade de 1250 células/ml em um volume final de 50 μl de meio de ensaio. Uma placa fonte de composto foi preparada realizando diluições seriais de 3 vezes de novo pontos em triplicata em DMSO, começando em 10 mM (concentração final superior de composto em ensaio foi de 20 μM e o DMSO foi de 0,2%). Uma alíquota de 100 nL da placa de composto estoque foi ao seu respectivo poço em placa de células. O controle de inibição de 100% consistiu em células tratadas com 200 nM de concentração final de estaurosporina o controle de inibição de 0% consistiu em células tratadas com DMSO. Após a adição de compostos, as placas de ensaio foram incubadas por 6 dias a 37°C, 5% de CO2, umidade relativa >90% por 6 dias. A viabilidade celular foi medida pela quantificação de ATP presente em culturas de células, adição de 35 μl de reagente Cell Titer Glo® para as placas da célula. Luminescência foi lida em SpectraMax M5. A concentração que inibe a viabilidade celular em 50% foi determinada usando um ajuste de 4 parâmetros das curvas de resposta para doses normalizadas. Os valores de IC50 para este ensaio são também apresentados na Tabela 3 abaixo. Os dados de espectrometria de massa para estes compostos são também listados na Tabela 3 abaixo. Tabela 3
Exemplo 3: Derivação da menor concentração citotóxica (LCC)
[0230]É bem estabelecido que proliferação celular ocorre através da divisão celular que resulta em uma dobra do número de células após divisão, relativamente ao número de células antes da divisão. Sob um conjunto fixo de condições ambientais (por exemplo, pH, força iônica, temperatura e densidade das células, conteúdo de proteínas no meio e fatores de crescimento, e semelhantes), as células irão se proliferar pela duplicação consecutiva (ou seja, divisão) de acordo com a seguinte equação, contanto que nutrientes suficientes outros fatores exigidos estejam disponíveis.
[0231]
onde Nt é o número de células em um ponto de tempo (t) após o início do período de observação, N0 é o número de células no início do período de observação, t é o tempo após o início do período de observação e tD é o intervalo de tempo necessário para duplicação celular, também referido como o tempo de duplicação. Equação A.1 pode ser convertida para a forma mais conveniente de uma equação exponencial em base e, aproveitando-se de a igualdade, 0693 = ln(2). 0.693/
[0232]
[0233]A taxa constante para a proliferação celular (kp) é inversamente relacionada com o tempo de duplicação do seguinte modo.
[0234]
[0235]Combinando equação A.2 e A.3, gera,
[0236]
[0237]Assim, de acordo com a equação A.4 o número de células é esperado aumentar exponencialmente com tempo durante o período inicial de crescimento celular referido como um crescimento de fase log. As equações exponenciais como equação A.4 podem ser linearizadas, tomando o logaritmo natural de cada lado.
[0238]
[0239]Assim um gráfico de ln(Nt) como uma função de tempo espera-se gerar uma linha reta ascendente com inclinação igual ao kp e intercepção y igual a ln(N0).
[0240]Alterações nas condições ambientais pode resultar em uma mudança na taxa de proliferação celular que é quantificável conforme mudanças na constante de taxa de proliferação kp. Entre as condições que podem resultar em uma mudança da taxa de proliferação está a introdução ao sistema de um composto antiproliferativo no início do período de observação (ou seja, em t = 0). Quando um composto antiproliferativo tem um impacto imediato sobre a proliferação celular, espera-se que gráficos de ln(Nt) como uma função de tempo continuarão sendo lineares em todas as concentrações do composto, com valores decrescentes de kp em concentrações crescentes de compostos.
[0241]Dependendo da base mecanicista de ação antiproliferativa, alguns compostos podem não imediatamente realizar uma mudança na taxa de proliferação. Em vez disso, pode haver um período de latência, antes do impacto do composto ser realizado. Em tais casos, um gráfico de ln(Nt) como uma função de tempo aparece bifásico, e um ponto de tempo em que o composto começa a ser identificado como o ponto de quebra entre as fases. Independentemente de se o impacto de um composto na proliferação é imediato ou começa após um período de latência, a constante de velocidade para a proliferação em cada concentração do composto é mais definida pela inclinação de ln(Nt) versus curva a partir do ponto de tempo no tempo em que o impacto do composto começa ao fim do período de observação do experimento.
[0242]Um composto aplicado às células em crescimento pode afetar a proliferação observada em um de dois modos gerais: ao inibir a divisão da célula (citostase) ou por morte celular (citotoxicidade). Se um composto é citostático, o aumento da concentração do composto irá reduzir o valor de kp até que não haja mais divisão celular. Neste ponto, a taxa de crescimento celular, e, por conseguinte, o valor de kp, será zero. Se, por outro lado, o composto é citotóxico, em seguida, o valor de kp será composto por duas constantes de velocidade: uma constante de velocidade para o crescimento de células continuado na presença do composto (kg) e uma constante de velocidade para a morte celular pelo composto (kd). A constante de velocidade global para a proliferação a uma concentração fixa do composto será, portanto, a diferença entre os valores absolutos destas constantes de velocidade opostas.
[0243]
[0244]Em concentrações do composto para as quais a taxa de crescimento celular é superior ao da morte celular, o valor de kp terá um valor positivo (isto é, kp> 0). Em concentrações do composto para as quais a taxa de crescimento celular é menor do que para a morte celular, o valor de kp terá um valor negativo (isto é, kp <0) e o número de células irá diminuir com o tempo, indicativo de citotoxicidade robusta. Quando kg, corresponde exatamente a kd então a constante de velocidade de proliferação global, kp, terá um valor de zero. Podemos assim definir a menor concentração citotóxica (LCC) como a concentração de composto que resulta em um valor de kp igual a zero, uma vez que qualquer concentração superior a esta irá resultar em citotoxicidade claramente observável. Nota bene: em concentrações inferiores a LCC não é provável que seja de morte celular que ocorre, mas a uma taxa que é menor que a da proliferação de células residuais. O tratamento aqui não se destina a definir os detalhes biológicos de ação do composto. Em vez disso, o objetivo aqui é o de definir meramente um parâmetro prático com o qual a quantificar objetivamente a concentração de composto na qual a taxa de morte celular excede o crescimento de novas células. Com efeito, a LCC representa um ponto de quebra ou concentração crítica, acima da qual se observa franca citotoxicidade, em vez de uma concentração citotóxica, por si só. A este respeito, a LCC pode ser vista semelhante a outras métricas de pontos de quebras físicas, tais como a concentração micelar crítica (CMC) utilizada para definir a concentração de lipídeo, detergente ou de outras espécies de surfactantes acima da qual todas as moléculas se incorporam nas estruturas micelares.
[0245]Tradicionalmente, o impacto dos compostos antiproliferativos sobre o crescimento celular foi mais comumente quantificado pelo valor de IC50, que é definido como a concentração do composto que reduz a taxa de proliferação de células à metade da observada na ausência de composto (ou seja , para o veículo ou amostra de controle solvente). A IC50, no entanto, não permite que o investigador diferencie entre os compostos citostáticos e citotóxicos. A LCC, em contraste, permite facilmente que se faça uma dita diferenciação e ainda a quantificação da concentração na qual a transição para o comportamento citotóxico robusto ocorre.
[0246]Se limita-se o tempo de observação entre o início de impacto e o fim do experimento, em seguida, os dados serão geralmente se ajusta bem a uma equação linear quando plotados como ln(Nt) como uma função de tempo (vide supra). A partir dos ajustes deste tipo, o valor de kp pode ser determinado para cada concentração do composto testado. Um novo gráfico do valor de kp, como uma função da concentração do composto ([I]) terá a forma de uma isotérmica descendente, com um valor máximo de [I] = 0 de kmax (definido pelo veículo ou amostra de controle com solvente) e a um valor mínimo na concentração do composto de kmin infinito.
[0247]
onde Imid é a concentração de composto dando origem a um valor de kp, que está a meio caminho entre os valores de kmax e kmin (note-se que o valor de Imid não é o mesmo que a IC50, exceto no caso de um composto completo e puramente citostático). Assim, ajustando os dados do novo gráfico a equação A.7 fornece estimativas de kmax, kmin e Imid. Se um composto é citostático (como definido aqui), o valor de kmin não pode ser inferior a zero. Para compostos citotóxicos, kmin será menor do que zero e o valor absoluto do kmin se relacionam diretamente com a eficácia do composto em matar células.
[0248]Os valores ajustados derivados a partir da equação A.7 também podem ser utilizados para determinar o valor da LCC. Por definição, quando [I] = LCC, kp = 0. Assim, sob essas condições a equação A.7 se torna
[0249]
[0250]Rearranjo algébrico da equação A.8 gera uma equação para a LCC.
[0251]
[0252]Esta análise é simples de implementar com software de ajustamento da curva não linear e pode ser aplicada durante ensaios celulares de atividade do composto de todo o processo de descoberta de medicamentos e para o desenvolvimento. Deste modo, a LCC pode fornecer uma métrica importante para a avaliação do composto de SAR (relação entre estrutura e atividade). Exemplo 4: Ensaios In Vivo Camundongos
[0253]Camundongos fêmeas Fox Chase SCID® (CB17/ICR-Prkdcscid/IcrIcoCrl, Charles River Laboratories) ou camundongos nus atímicos (Crl:NU(NCR)-Foxnlnu, Charles River Laboratories) com 8 semanas de idade e uma faixa de peso corporal (BW) de 16,0-21,1 g em D1 do estudo. Os animais são alimentados com água ad libitum (osmose reversa 1 ppm C1) e NIH 31 Modified e and Lab Diet® consistindo em 18,0% de proteína bruta, 5,0% de gordura bruta e 5,0% fibra bruta. Os camundongos são alojados em leitos irradiados Enrich-o'cobsTM em microisoladores estáticos em um ciclo de luz de 12 horas a 20-22°C (68-72°F) e 40-60% de umidade. Todos os procedimentos em conformidade com Guide for Care and Use of Laboratory Animals no que diz respeito à contenção, criação, procedimentos cirúrgicos, alimentação e regulação de fluidos, e cuidados veterinários. Cultura tumor celular
[0254]As linhagens de células de linfoma humano são obtidas a partir de diferentes fontes (ATCC, DSMZ), por exemplo, WSU-DLCL2 obtida a partir de DSMZ. As linhas celulares são mantidas em Piedmont como culturas em suspensão em meio RPMI-1640, contendo 100 unidades/ml de sal de sódio da penicilina G, 100 g/mL de estreptomicina, e 25 g/ml de gentamicina. O meio é suplementado com 10% de soro fetal bovino e 2 mM de glutamina. As células são cultivadas em frascos de cultura de tecidos em uma incubadora umidificada a 37°C, em uma atmosfera de 5% de CO2 e 95% de ar. Implantação do Tumor In Vivo
[0255]As linhagens de células de linfoma humano, por exemplo, células de WSU-DLCL2, são colhidas durante a fase de crescimento semi-log, e ressuspensas em PBS com 50% MatrigelTM (BD Biosciences). Cada camundongo recebe 1 x 107 células (0,2 ml de células em suspensão) por via subcutânea no flanco direito. Os tumores são medidos em duas dimensões para acompanhar o crescimento como o volume médio aproximado da faixa de 80-120 mm3 desejada. O tamanho do tumor, em mm3, é calculado a partir de:
onde w = largura e l = comprimento em mm do tumor. O peso do tumor pode ser calculado com a suposição de que 1 mg é equivalente a 1 mm3 de volume de tumor. Após 10-30 dias, os camundongos com tumores de 108-126 mm3 são classificados em grupos de tratamento com volumes de tumor médios de 117-119 mm3. Artigos de teste
[0256]Os compostos de teste são armazenados em temperatura ambiente e protegidos da luz. Em cada dia de tratamento, formulações de compostos frescos são preparadas suspendendo o pó em 0,5% de carboximetilcelulose de sódio (NaCMC) e 0,1% de Tween 80 em água deionizada. Composto 141 (base livre) é dissolvido em solução salina estéril e o pH é ajustado a 4,5 com HCl fresco todos os dias. Os veículos, 0,5% de NaCMC e 0,1% de Tween 80 em água deionizada ou solução salina estéril de pH 4,5, são usados para tratar os grupos de controle nos mesmos horários. As formulações são armazenadas ao abrigo da luz a 4°C antes da administração. Salvo disposição em contrário, os compostos referidos para e testados neste experimento estão em suas formas de sal específicos mencionados neste parágrafo. Plano de Tratamento
[0257]Os camundongos são tratados com doses de composto que variam 12,5-600 mg/kg e em cronogramas TID (três vezes por dia a cada 8 h), BID (duas vezes por dia a cada 12 h) ou QD (uma vez por dia) para diferentes quantidades de dia por gavagem oral ou injeções por via intraperitoneal. Cada dose é fornecida em um volume de 0,2 mL/20 g de camundongo (10 ml/kg), e ajustada para o último peso registrado dos animais individuais. A duração máxima do tratamento é de 28 dias. Análise de Volume do tumor médio (MTV) e inibição no Crescimento do Tumor (TGI)
[0258]A eficácia do tratamento é determinada no último dia de tratamento. MTV(n), o volume de tumor médio para o número de animais, n, avaliáveis no último dia, é determinado para cada grupo. A percentagem de inibição do crescimento do tumor (%TGI) pode ser definida de várias maneiras. Em primeiro lugar, a diferença entre o MTV(n) do grupo de controle designado e MTV(n) do grupo tratado com droga é expressa como uma percentagem do MTV(n) do grupo de controle:
[0259]Outra forma de calcular %TGI é se a mudança do tamanho do tumor a partir do dia 1 até ao dia em conta n com n sendo o último dia de tratamento.
Toxicidade
[0260]Os animais são pesados diariamente nos dias 1-5, e, em seguida, duas vezes por semana até a conclusão do estudo. Os camundongos são examinados com frequência para sinais evidentes de quaisquer efeitos adversos secundários relacionados com o tratamento, que estão documentados. Toxicidade aceitável para a dose máxima tolerada (DMT) é definida como uma perda de BW média de grupo de menos de 20% durante o teste, e a mortalidade não mais de 10% de mortes devido a TR. A morte deve ser classificada como TR se esta é atribuível aos efeitos secundários do tratamento como evidenciado por meio de sinais e/ou necropsia clínicos, ou devido a causas desconhecidas durante o período de dosagem. A morte deve ser classificada como NTR se existe evidência de que a morte não está relacionada com os efeitos colaterais do tratamento. Mortes NTR durante o intervalo de dosagem normalmente seriam categorizadas como NTRa (devido a um acidente ou erro humano) ou NTRm (devido à disseminação do tumor confirmado por necropsia por invasão e/ou metástase). Animais tratados por via oral que morrem de causas desconhecidas durante o período de dosagem podem ser classificadas como NTRu quando o desempenho do grupo não suporta uma classificação TR e necropsia, para descartar um erro de dosagem, não é viável. Amostragem
[0261]Nos dias 7 ou 28 durante os estudos camundongos são amostrados de uma maneira predefinida para avaliar a inibição alvo em tumores. Os tumores são coletados a partir de camundongos especificados sob condições livres de RNAse e divididos em dois. Tecido tumoral congelado de cada animal foi congelado em N2 líquido e pulverizado com um almofariz e pilão. Análises estatísticas e gráficas
[0262]Todas as análises estatísticas e gráficas são realizadas com Prism 3.03 (GraphPad) para Windows. Para testar a significância estatística entre os grupos controle e tratados ao longo de todo o curso do tempo de tratamento um teste ANOVA de medidas repetidas seguido de teste post Dunnets de comparação múltipla ou um teste ANOVA de 2 vias são empregados. Relatórios Prism resultam como não significativas (ns) em P > 0,05, significativa (simbolizada por “*”) em 0,01 <P <0,05, muito significativa (“**”) a 0,001 <P <0,01 e extremamente significativa (“***”) com P <0,001. Extração de Histona
[0263]Para o isolamento de histonas, 60-90 mg de tecido de tumor é homogeneizado em 1,5 ml de tampão de extração nuclear (10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1% Triton X-100, 8,6% de sacarose, além de um comprimido de inibidor de protease Roche 1836145) e incubado em gelo durante 5 minutos. Os núcleos são coletados por centrifugação a 600 g durante 5 minutos a 4°C e lavados uma vez em PBS. O sobrenadante é removido e as histonas extraídas durante uma hora, com vórtex a cada 15 minutos, com 0,4 N de ácido sulfúrico frio. Os extratos são clarificados por centrifugação a 10.000 g durante 10 minutos a 4°C e transferidos para um tubo de microcentrífuga fresco contendo 10 x o volume de acetona gelada. As histonas são precipitados a -20°C durante 2 horas durante a noite, sedimentadas por centrifugação a 10.000 g durante 10 minutos, e ressuspensas em água. ELISA
[0264]As histonas são preparadas em concentrações equivalentes em tampão de revestimento (PBS + 0,05% BSA) obtendo-se 0,5 ng/ul de amostra e 100 ul de amostra ou padrão é adicionado em duplicado para duas placas de 96 poços de ELISA (Thermo Labsystems, Immulon 4HBX # 3885). As placas foram seladas e incubadas durante a noite a 4°C. No dia seguinte, as placas são lavadas 3x com 300 ul/poço de PBST (PBS + 0,05% Tween 20; 10X PBST, kPL # 51-14-02) em um lavador de placas Bio Tek. As placas são bloqueadas com 300 ul/poço de diluente (PBS + 2% BSA + 0,05% Tween 20), incubadas em TA durante 2 horas, e lavadas 3x com PBST. Todos os anticorpos são diluídos em diluente. 100 ul/poço de anti-H3K27me3 (CST#9733, 50% glicerol estoque 1:1000) ou anti-H3 total (Abcam ab1791, 50% de glicerol 1:10.000) é adicionado a cada placa. As placas são incubadas durante 90 min em temperatura ambiente e lavadas 3x com PBST. 100 ul/poço de anti-Rb-IgG-HRP (Cell Signaling Technology, 7074) é adicionado 1:2000 para a placa H3K27me3 e 1:6000 para a placa de H3 e incubadas durante 90 min em RT. As placas são lavadas 4X com PBST. Para a detecção, 100 ul/poço de substrato de TMB (BioFX Laboratories, #TMBS) é adicionado e as placas incubadas no escuro em RT durante 5 min. A reação é parada com 100 ul/poço de H2SO4 1N. A absorbância a 450 nm é lida no leitor de Microplacas SpectaMax M5. Estudo PD de 7 dias
[0265]A fim de testar se um composto pode modular a marca histona H3K27me3 em tumores in vivo, camundongos com tumores de xenoenxerto de WSU- DLCL2 são tratados com o composto em cada 200 mg/kg BID ou 400 mg/kg QD ou veículo (cronograma BID) durante 7 dias. Existem quatro animais por grupo. Os animais são sacrificados 3 horas após a última dose e o tumor é preservado em um estado congelado, tal como descrito acima. Após a extração de histona as amostras são aplicadas a ensaios ELISA utilizando anticorpos dirigidos contra o estado trimetilado de histona H3K27 (H3K27me3) ou histona H3 total. Com base nestes dados, a proporção de globalmente metilada para H3K27 total é calculada. As proporções de metilação média global para todos os grupos medidos pelo ELISA indicam faixa de inibição alvo em comparação ao veículo. O desenho para este experimento é mostrado na Tabela 4A. Tabela 4A Regime de Dosagem
* Composto A é N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-5- (etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,l'-bifenil]-3- carboxamida. Exemplo 5: estudo de eficácia com o aumento das doses em modelo de xenotransplante Karpas-422
[0266]A fim de testar se um composto poderia induzir um efeito antitumoral in vivo, camundongos tendo tumor xenoenxerto Karpas-422 foram tratados com um composto em, por exemplo, 62,5, 125, 250, ou 500 mg/kg BID para 28 dias. Havia 10 camundongos por grupo para o braço de eficácia do experimento. O crescimento do tumor durante o curso de tratamento de 28 dias para os grupos tratados com composto de teste e veículo foi medido.
[0267]As histonas foram extraídos a partir de tumores coletados no final do estudo no dia 28 para a coorte de eficácia (3h após a última dose para ambos os grupos). A marca H3K27me3 metil foi avaliada por modulação com o tratamento em questão dependente da dose.
[0268]O desenho para esta experiência é mostrado na Tabela 4B. Esquema de Dosagem
* Composto A é N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetra- hidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometi])-[l,l'-bifenil]-3-carboxamida.
[0269]TV é calculada a partir de medições de calibre pela fórmula para o volume de um elipsoide prolato (LxW2)/2 onde L e W são as respectivas medições ortogonais de largura comprimento (mm).
[0270] Os dados são expressos como a média ± desvio padrão (SD). As diferenças em TV entre os grupos tratados com veículo e tratados com composto são analisadas por uma análise de medidas repetidas de variância (ANOVA) seguido por teste de comparação múltiplo de tipo Dunnett. Um valor de P <0,05 (dois lados) é considerado estatisticamente significativo. Análises estatísticas são realizadas usando o pacote de software Prism 5 versão 5.04 (GraphPad Software, Inc., CA, EUA).
[0271]Os estudos anteriores mostraram que ambos o Composto 1 e Composto A exibiram estase e regressão tumoral no modelo de xenoenxerto de Karpas-422 e foram bem toleradas. Ver, por exemplo, as Figuras 1 e 2. Além disso, as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas do Composto 1 ou Composto A a partir dos estudos acima referidos estão ilustradas nas Figuras 3-8. A Figura 3 é um diagrama que mostra a concentração do Composto 1 no tumor no dia 7 ou no dia 28 após o tratamento ou a concentração do Composto A no tumor ao dia 7 após tratamento. Nesta figura, “A” até “L” indicam que 7 dias após a administração do composto 1 em dosagens de 62,5, 83,3, 125, 166,7, 250, 333,3, e 500 mg/kg, respectivamente; “H” e “I” denotam 7 dias após a administração do Composto A em doses de 125 e 250 mg/kg, respectivamente; e “J” até “G” denotam 28 dias após a administração do composto 1 em dosagens de 62,5, 125 e 250 mg/kg, respectivamente. Nota: para amostras no dia 28, os tumores eram demasiado pequenos para análise no grupo tratado com 250 mg/kg de Composto A e o grupo tratado com 500 mg/kg de Composto 1; apenas 1 em cada 10 e 5 dos 10 eram grandes o suficiente para a análise dos grupos tratados com 250 mg/kg Composto 1 e 125 mg/kg Composto 1, respectivamente. A Figura 4 é um diagrama que mostra a concentração do Composto 1 ou Composto A no plasma no dia 7 ou no dia 28 após tratamento. A linha superior tracejada indica LCC corrigida de ligação às proteínas plasmáticas (PPB) do Composto A e a linha tracejada indica LCC corrigida de PPB do Composto 1. A Figura 5 é um diagrama que mostra a metilação H3K27me3 global em camundongos tendo tumores KARPAS-422 tratados com o Composto 1 ou Composto A durante 7 dias. Nesta figura, “A” indica a tratamento com veículo; “B” até “H” denotam o tratamento com o Composto 1 em doses de 62,5, 83,3, 125, 166,7, 250, 333,3, e 500 mg/kg, respectivamente; e “I” e “J” denotam o tratamento com o Composto A em doses de 125 e 250 mg/kg, respectivamente. A Figura 6 é um diagrama, mostrando metilação global do H3K27me3 Karpas-422 em tumores de camundongos tratados com Composto 1 durante 28 dias. A Figura 7 é um diagrama, mostrando metilação global do H3K27me3 na medula óssea a partir de camundongos tendo tumor de xenoenxerto Karpas-422 tratados com o Composto 1 ou Composto A durante 7 dias. Nesta figura, “A” indica a tratamento com veículo; “B” até “H” denotam o tratamento com o Composto 1 em doses de 62,5, 83,3, 125, 166,7, 250, 333,3, e 500 mg/kg, respectivamente; e “I” e “J” denotam o tratamento com o Composto A em doses de 125 e 250 mg/kg, respectivamente. A Figura 8 é um diagrama, mostrando metilação global do H3K27me3 na medula óssea a partir de camundongos tendo tumor de xenoenxerto Karpas-422 tratados com Composto 1 durante 28 dias. Nesta figura, “A” indica a tratamento com veículo; “B” até “E” denota o tratamento com o Composto 1 em doses de 62,5, 125, 250, e 500 mg/kg, respectivamente; e “F” indica o tratamento com o Composto A, numa dose de 250 mg/kg.
[0272]Nos Exemplos 6-8 abaixo, os experimentos e análises foram conduzidas com métodos e técnicas semelhantes às descritas em, por exemplo, J. Lin, Pharmaceutical Research, 2006, 23 (6): 1089-1116; L. Di et al., Chem Comb High Throughput Screen, 2008, 11 (6): 469-76; Fonsi M. et al, Journal of Biomolecular Screening, 2008,13: 862, E. Sjogren et al., Drug Metab. Dispos. 2012, 40: 2273-2279; T.D. Bjornsson, et al., Drug Metab Dispos, 2003, 31 (7): 815-832; J.B. Houston e K.E. Kenworthy, Drug Metab Dispos, 2000, 28 (3): 246-254; e S.W. Grimm et al., Drug Metab Dispos, 2009, 37 (7): 1355-1370, os conteúdos de cada um dos quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Exemplo 6: Avaliação da Estabilidade Metabólica em microssomas hepáticas
[0273]A estabilidade metabólica dos Compostos 1, 2, e 105, foi avaliada em microssomas hepáticas a partir de cinco espécies, incluindo camundongos, ratos, cães, macacos e seres humanos.
[0274]Métodos: As incubações foram realizadas em placas de 96 poços contendo 250 μl de volume total consistindo de 100 mmol/L de tampão fosfato de potássio (pH 7,4), 1 mg/mL de microssomas hepáticas, composto de teste (isto é, os Compostos 1, 2, ou 105) em 8 concentrações, e 2 mg/mL NADPH. As concentrações dos compostos utilizados para a incubação variaram de 45,7 nM a 100 μM. A adição de NADPH foi utilizada para iniciar a reação, e as incubações foram realizadas em um banho de água com agitação a 37°C durante até 60 minutos. As reações foram terminadas pela adição de um volume igual de solução de parada contendo padrão interno (IS). As amostras foram então centrifugadas em uma centrífuga refrigerada a 3000 RPM durante um mínimo de 5 minutos antes da análise. A quantidade de depleção nas misturas de incubação para o composto de teste, tal como determinado através da utilização de LC/TOFMS, foi utilizada para estimar os valores de depuração intrínsecos com microssomas hepáticas. Os sistemas de LC/TOFMS foram compostos de um amostrador automático Shimadzu SIL-HTC (Kyoto, Japão), duas bombas LC-20AD; Shimadzu Corp., e um forno de coluna (CTO-20AC; Shimadzu Corp.) com um espectrômetro de massa de tempo de voo (AB SCIEX Qstar Elite, AB Sciex, Foster City, CA). As áreas de pico do composto de teste e IS para o ensaio foram integradas pela Analyst QS (versão 2.0, Applied Biosystems, Foster City, CA). Dissociação ativada por colisão (CAD), com nitrogênio, foi usada para gerar íons dos produtos. As condições instrumentais otimizadas foram sob o modo de ionização positivo.
[0275]A quantificação LC/MS/MS baseou-se nas proporções de áreas de pico do composto de teste para a IS. Cálculo da área do pico e a integração dos Compostos 1, 2, ou 105 e IS utilizou Analyst QS 2.0 (AB Sciex, Foster City, CA). Os cálculos foram feitos usando Excel (Office 2010, Microsoft Corp., Redmond, WA) e GraphPad Prism v. 5.02 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Os dados foram analisados e apresentados com base em SOPs apropriados, tais como os descritos em J. Lin, Pharmaceutical Research, 2006, 23 (6): 1089-1116; e Di L et al., Comb Chem High Throughput Screen. 2008 11 (6): 469-76.
[0276]A depleção do composto de teste utilizado para os valores de Km e Vmax em microssomas hepáticas foi calculada representando graficamente contra o tempo para determinar a taxa de depleção. As taxas de depleção foram então plotadas, usando um modelo cinético apropriado. Os dados foram calculados com base nas seguintes equações:
[0277]Michaelis-Menten: Clint (μL/min/mg de microssomas hepáticas) = Vmax/Km
[0278]Hill: Clint (μL/min/mg de microssomas hepáticas) = Clmax = Vmax/Ks^n - 1)/(n (n - 1)1/n)
[0279]Clint (μL/min/g fígado) = Clint (μL/min/mg microssomas) • Fator de escala ou Clint (μL/min/106 células) • Fator de escala.
[0280]Os resultados são fornecidos na Tabela 5 abaixo. Tabela 5
[0281]Todos os três compostos testados, isto é, os Compostos 1, 2, e 105 exibiram baixa depuração metabólica em microssomas hepáticas humanas (HLM). Também foi observada diferença em espécies na depuração metabólica. Macacos Cynomolgus geralmente apresentaram um clearance mais elevado do que outras espécies.
[0282]A indução de cada um dos compostos 1, 2, e 105 foi avaliada em hepatócitos humanos criopreservados de um único doador.
[0283]Métodos: Os hepatócitos foram obtidos de BD Biosciences (Woburn, MA), e o meio adequado e corante nuclear DAPI foram adquiridos da Life Technologies (Durham, NC). Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina (DPBS), 100x MEM aminoácidos não essenciais, 100 x solução penicilina/estreptomicina/glutamina, 2x azul de tripano foram adquiridos da Mediatech (Manassas, VA). Soro bovino fetal (FBS) foi adquirido a partir de Tissue Culture Biologicals (Tulare, CA). As placas de 24 poços revestidas com colágeno para a análise do mRNA foram adquiridas da BD Biosciences (San Jose, CA). As sondas e iniciadores pré-desenhados foram utilizados em dois ensaios para avaliar a mudança triplex em mRNA. Os controlos positivos foram β-naftoflavona para CYP1A (1 e 10 μmol/L), fenobarbital para CYP2B6 (100 μmol/L e 1 mmol/L), e rifampicina para CYP2C9 e CYP3A (1 e 10 μmol/L). DMSO foi usado como veículo de controle (negativo). Os ensaios específicos da forma CYP foram realizados após o período de tratamento, e as células foram contadas para determinar a viabilidade.
[0284]Os hepatócitos criopreservados foram descongelados em um banho de água a 37°C e plaqueados de acordo com as instruções do fornecedor. Um tubo de hepatócitos foi adicionado a um tubo de 50 mL cônico contendo meio de recuperação de hepatócitos criopreservados Life Technologies (CHRM). As células foram centrifugadas numa centrífuga Beckman com um rotor GH 3.8 a 800 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi removido e as células foram ressuspensas em meio de plaqueamento para a contagem. Após a contagem, as células foram ressuspensas em 0,75 milhões de células viáveis/ml. A suspensão (0,5 ml/poço) foi adicionada a uma placa de 24 poços revestidos de colágeno, ou, após a adição de 60 μL de DMEM contendo 10% de FBS, penicilina/estreptomicina/glutamina e MEM aminoácidos não essenciais, 80 μL da suspensão foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços revestida de colágeno. Depois de girar e balançar e de proporcionar uma melhor cobertura de placa, as células foram colocadas numa incubadora de cultura de tecidos em 5% de CO2 e 37°C e deixadas ligar durante a noite. As células foram então tratadas utilizando meio de manutenção de hepatócitos CellzDirect. As células foram expostas ao Composto 1, 2, ou 105 (1 ou 10 μmol/L) ou veículo durante 48 horas. Durante o tratamento, os meios de manutenção e os compostos de teste foram reabastecidos cada 24 horas.
[0285]Depois de completada a incubação, as células foram lavadas com DPBS. Após lavagem com DPBS, as células foram fixadas com 3,7% de p-formaldeído em DPBS durante uma hora. O formaldeído foi removido e 0,6 μmol/L DAPI em DPBS foi adicionada. As células foram coradas por DAPI, durante 20 minutos e depois lavadas três vezes com DPBS. As células foram contadas utilizando um ArrayScan II (Cellomics, Pittsburgh, PA) com uma lente objetiva 5X. Fração de hepatócitos restantes foi calculada usando o número de células encontradas no tratamento de uma condição dividido por células encontradas com o controle de veículo.
[0286]Após o tratamento, as células foram lisadas usando tampão RLT do kit Qiagen RNeasy. O mRNA foi isolado utilizando o kit RNeasy com tratamento de DNAse utilizando os protocolos do fabricante. A concentração do mRNA foi medida por meio de um Nanodrop ND-1000 (Wilmington, DE). A concentração do mRNA foi normalizada para cada amostra dentro de um doador. A transcrição reversa foi realizada com um kit de síntese de Superscript VILO dDNA da Life Technologies, seguindo as instruções do fabricante. Após a síntese de cDNA, PCR quantitativo em tempo real foi realizado utilizando um sistema 7500 Fast Real Time PCR da Applied Biosystems, uma subsidiária integral da Life Technologies. Os componentes da reação de PCR em tempo real consistiram em: 10 μl de Taqman Fast Advanced Master Mix (Life Technologies), 2 μL de cDNA, 5 μL de água livre de nuclease (Life Technologies), 1 μl de iniciador marcado com FAM limitado de ensaio HS00984230_m1 para β-2 microglobulina, 1 μL de iniciador marcado VIC limitado de ensaio HS00167927_m1 para CYP1A2 ou HS04183483_g1 para CYP2B6, e 1 μL de iniciador NED marcado limitado de ensaio HS04260376_m1 para CYP2C9 ou HS00604506_m1 para CYP3A4. Cálculos de diferença de dobragem, em comparação com controle de veículo foram feitos por 7500 Software versão 2.0.5 (Life Technologies) utilizando o método ΔΔCt. Cálculos de Emax e EC50 foram feitos utilizando GraphPad Prism. Tabela 6
[0287]Como mostrado na Tabela 6 acima, o Composto 1 não exibiu qualquer indução significativa (exceto potencialmente CYP2C9); composto 2 não exibiu nenhuma indução (com atividade um pouco menor); Composto 105 e exibiu indução de CYP2B6, CYP2C9, e CYP3A. Não foi observada nenhuma perda significativa de viabilidade celular.
[0288]A inibição potencial da atividade de enzimas de citocromos P450 humanos (CYP) de Composto 1, 2, ou 105 foi avaliada por meio de microssomas hepáticas humanas.
[0289]Métodos: O potencial de inibição competitiva de compostos 1, 2 e 105 foi determinado pela avaliação em várias concentrações sobre reações CYP de sonda perto de seus respectivos valores de Km para criar curvas de IC50 em microssomas hepáticas humanas (HLM). A inativação potencial dependente do tempo (TDI) também foi avaliada por CYP3A4/5, avaliando os valores de KI e Kinact quando apropriado.
[0290]Uma suspensão contendo PB, HLM, substrato de sonda seletiva para CYP, e o inibidor a ser testado foi adicionado a uma placa de 96 poços. As placas foram pré-incubadas num banho de água a 37°C durante aproximadamente 2 minutos. A reação foi iniciada pela adição de NADPH para cada poço da placa de 96 poços. As concentrações finais de PB, HLM, e NADPH foram de 100 mmol/L (pH 7,4), 0,1 mg/mL, e 2,3 mmol/L, respectivamente. Os substratos de sonda CYP e inibidores do CYP utilizados como controles positivos e as suas respectivas concentrações estão listados abaixo. A concentração final de MeOH utilizada em cada incubação não deve exceder 0,8%.
[0291]Após o tempo de incubação apropriado, um volume igual da solução de parada contendo IS foi adicionado aos poços apropriados. Amostras de controle padrão e qualidade (QC) foram preparadas com componentes semelhantes como as amostras de teste. O branco foi preparado com uma solução de extinção semelhante como as outras amostras, mas não inclui IS. As placas foram centrifugadas durante 5 minutos numa centrífuga de bancada a 3000 rpm. As amostras foram analisadas por LC/MS/MS. A condição de incubação e os controles positivos são listados na Tabela 7 abaixo. Tabela 7
[0292]Para a avaliação do TDI, a primeira incubação, uma suspensão contendo PB, HLM, e os estoques de inibidor foram adicionados a uma placa de 96 poços. As placas foram pré-incubadas num banho de água a 37°C durante aproximadamente 2 minutos. A reação foi iniciada pela adição de NADPH para cada poço da placa de 96 poços e realizada durante 0, 5, 10, 15, 20, e 30 minutos. Para os controles sem NADPH, solução PB foi substituída por solução estoque de NADPH. As concentrações finais para PB, HLM, e NADPH foram de 100 mmol/L (pH 7,4), 0,2 mg/mL, e 2,3 mmol/L, respectivamente. Nos respectivos tempos, 12,5 μL de suspensão de incubação primária foi diluída 20 vezes em mistura de incubação secundária pré-incubada contendo substratos de sonda seletiva para CYP, a fim de avaliar a atividade residual. Os substratos de sonda utilizados foram de testosterona (250 μmol/L) e o controle positivo foi a troleandomicina.
[0293]O sistema de HPLC utilizado foi um sistema de Shimadzu HPLC (Kyoto, Japão) consistindo de um amostrador automático SIL-HTC, um desgaseificador DGU- 14A, três bombas LC-10ADvp, e um forno de coluna CTO-10ACvp. As amostras foram analisadas num API4000QTrap (AB Sciex, Foster City, CA) triplo espectrômetro de massa de quadrupolo usando turbo de ionização de pulverização no modo de íon positivo.
[0294]O cálculo da área de pico e integração de todos os metabolitos monitorados e IS foram processados pelo Analyst 1.6 (AB Sciex, Foster City, CA). A quantificação foi conseguida com o uso de curvas de calibração construídas através da representação gráfica da relação entre a área de pico de metabolito para IS contra concentrações de padrão de calibração, e foi gerado por regressão quadrática com ponderação 1/x2 (y = a + a x2 + b + c). Cálculos da percentagem de inibição utilizaram o Excel (Office 2010, Microsoft Corp., Redmond, WA), e foram representados graficamente utilizando o GraphPad Prism (versão 5.02, GraphPad Software, Inc., LaJolla, CA) com base na assunção de um local de ligação. As concentrações nominais dos compostos de teste e os controlos positivos foram transformados em log em GraphPad Prism. Usando os gráficos da atividade CYP3A4/5 restante em função do tempo de pré-incubação, a taxa de perda de atividade CYP (À) foi estimada por meio de regressão não linear. Os parâmetros, Kinact e Kl, foram subsequentemente estimados por ajuste com a seguinte equação:
em que [I] representa a concentração inicial do composto 1, 2, ou105. Tabela 8. Inibição reversível 
Tabela 9. Avaliação de inativação dependente de tempo (TDI) 
[0295]Como mostrado na Tabela 8 acima, os compostos 1 e 2 não exibiram inibição reversível significativa; e Composto 105 exibiu inibição potencialmente significativa de CYP2D6 e CYP3A4 (midazolam). Além disso, como se mostra na Tabela 9 acima, todos os compostos 1, 2, e 105 mostraram inativação dependente de tempo, concentração, e de NADPH do CYP3A4/5 (usando midazolam como sonda).
[0296]A descrição completa de cada um dos documentos de patentes e artigos científicos aqui referidos é incorporada por referência para todos os fins.
[0297]A invenção pode ser realizada em outras formas específicas sem se afastar do espírito ou características essenciais da mesma. As modalidades anteriores, portanto, devem ser consideradas em todos os aspectos ilustrativos e não limitativos da invenção aqui descrita. O escopo da invenção é, portanto, indicado pelas reivindicações anexas e não pela descrição anterior, e todas as alterações que estejam dentro do significado e gama de equivalência das reivindicações destinam-se a ser aqui abrangidas.
Claims (14)
1. Composto CARACTERIZADO pelo fato de que é selecionado do grupo consistindo em
e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato
4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
5. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é
6. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
7. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é
8. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compre-ende um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
9. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio mediado por EZH2.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o distúrbio mediado por EZH2 é câncer.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é linfoma, leucemia ou melanoma.
12. Uso, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é linfoma de célula B grande difuso (DLBCL), linfoma não Hodgkin (NHL), linfoma folicular, leucemia mielógena crônica (CML), leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia de linhagem mista ou síndromes mielodisplásicas (MDS).
13. Uso, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é um tumor rabdoide maligno ou tumor deficiente de INI1.
14. Composição farmacêutica para tratar um distúrbio mediado por EZH2, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, como um ingrediente principal.
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Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 6.6.1 NA RPI NO 2462 DE 13/03/2018 POR TER SIDO INDEVIDA. |
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| B07G | Grant request does not fulfill article 229-c lpi (prior consent of anvisa) [chapter 7.7 patent gazette] |
Free format text: NOTIFICACAO DE DEVOLUCAO DO PEDIDO EM FUNCAO DA REVOGACAO DO ART. 229-C DA LEI NO 9.279, DE 1996, POR FORCA DA LEI NO 14.195, DE 2021 |
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 15/10/2013, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS |