TW201427950A - 經取代苯化合物 - Google Patents

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Abstract

本發明關於經取代苯化合物。本發明亦關於含有該等化合物之醫藥組成物及藉由將該等化合物和醫藥組成物投予需要其之對象來治療癌症之方法。本發明亦關於該等化合物在研究上或其他非醫療為目的之用途。

Description

經取代苯化合物
本申請案主張在2012年10月15日申請之美國臨時申請案號61/714,140、在2012年10月15日申請之美國臨時申請案號61/714,145、在2013年3月13日申請的美國臨時申請案號61/780,703和在2013年3月14日申請的美國臨時申請案號61/786,277之優先權。將該等臨時申請案之各者的整個內容以其全文併入本文中以供參考。
對作為EZH2突變體的抑制劑之新劑有持續的需求，該抑制劑可用於治療經EZH2-調介之蛋白甲基化扮演一角色的病症(例如，癌症)。
經EZH2-調介之病症為至少部分以EZH2活性調介之疾病、病症或病況。在一個具體實例中，經EZH2-調介之病症與增加之EZH2活性有關。在一個具體實例中，經EZH2-調介之病症為癌症。經EZH2-調介之癌症可 為淋巴瘤、白血病或黑色素瘤，例如瀰漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金氏(non-Hodgkin’s)淋巴瘤(NHL)、濾泡性淋巴瘤或瀰漫性大B-細胞淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性髓狀白血病、急性淋巴球白血病或混合系白血病、或骨髓造血不良症候群(MDS)。在一個具體實例中，經EZH2-調介之癌症可為惡性類橫紋肌腫瘤或INI1-缺乏性腫瘤。惡性類橫紋肌腫瘤之組織學診斷係取決於特徵性類橫紋肌細胞(具有偏心定位之細胞核及豐富的嗜酸性細胞質之大細胞)的辨識及以抗體對波形蛋白、角蛋白和上皮細胞膜抗原的免疫組織化學而定。在大部分的惡性類橫紋肌腫瘤中，定位在染色體帶22q11.2之SMARCB1/INI1基因係由於缺失及/或突變而失活。在一個具體實例中，惡性類橫紋肌腫瘤可為INI1-缺乏性腫瘤。
在EZH2的單一胺基酸殘基(例如，Y641、A677和A687)上之EZH2基因的點突變體經報導與淋巴瘤相連結。EZH2突變體的更多實例及偵測突變體之方法和治療與突變體相關聯的病症之方法說明於例如美國專利申請公告案號US 20130040906中，將其整個內容以其全文併入本文中以供參考。
熟諳所屬技術領域者可參考本文所討論的已知技術或同等技術之詳細說明的一般參考書。該等參考書包括Ausubel等人之Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.(2005)；Sambrook等 人之Molecular Clonin公克，A Laboratory Manual(3rd edition),Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York(2000)；Coligan等人之Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,N.Y.；Enna等人之Current Protocols in Pharmacology,John Wiley & Sons,N.Y.；Fingl等人之The Pharmacological Basis of Therapeutics(1975),Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA,18th edition(1990)。當然亦可在達成或使用本發明的觀點時參考該等參考書。
在一個觀點中，本發明的特色在於選自下列的經取代苯化合物 ，及其醫藥上可接受之鹽。
例如，化合物為 或其醫藥上可接受之鹽。
例如，化合物為
例如，化合物為 或其醫藥上可接受之鹽。
例如，化合物為
例如，化合物為 或其醫藥上可接受之鹽。
例如，化合物為
本發明亦提供包含一或多種醫藥上可接受之載劑及一或多種本文所揭示之化合物的醫藥組成物。
本發明的另一觀點為治療或預防經EZH2-調介之病症的方法。該方法包括將治療有效量的一或多種本文所揭示之化合物投予需要其之對象。經EZH2-調介之病症為至少部分以EZH2活性調介之疾病、病症或病況。在一個具體實例中，經EZH2-調介之病症與增加之EZH2活性有關。在一個具體實例中，經EZH2-調介之病症為癌症。經EZH2-調介之癌症可為淋巴瘤、白血病或黑色素瘤，例如瀰漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金氏(non-Hodgkin’s)淋巴瘤(NHL)、濾泡性淋巴瘤或瀰漫性大B-細胞淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性髓狀白血病、急性淋巴球白血病或混合系白血病、或骨髓造血不良症候群(MDS)。在一個具體實例中，經EZH2-調介之癌症可為惡性類橫紋肌腫瘤或INI1-缺乏性腫瘤。惡性類橫紋肌腫瘤之組織學診斷係取決於特徵性類橫紋肌細胞(具有偏心定位之細胞核及豐富的嗜酸性細胞質之大細胞)的辨識及以抗體對波形蛋白、角蛋白和上皮細胞膜抗原的免疫 組織化學而定。在大部分的惡性類橫紋肌腫瘤中，定位在染色體帶22q11.2之SMARCB1/INI1基因係由於缺失及/或突變而失活。在一個具體實例中，惡性類橫紋肌腫瘤可為INI1-缺乏性腫瘤。
治療方法的任何說明包括使用化合物提供如說明書中所述之此等治療或預防，以及使用化合物製備用於治療或預防此等病況之藥劑，除非另有其他陳述。治療包括人類或非人類動物(包括齧齒目動物)及其他疾病樣式的治療。
再者，本文所述之化合物或方法可用於研究上(例如，研究後生酵素)及其他非治療性的目的。
在特定的具體實例中，本文所揭示之較佳的化合物具有所欲藥理及/或藥物動力學性質，例如低的廓清率及/或在所評估之組合療法中有限的藥物-藥物反交互作用風險，例如由於細胞色素P-450酵素的時間依賴性及可逆性抑制作用。
本文所用的所有技術及科學術語具有與一般熟諳屬於本發明之技術領域者共同瞭解的相同意義，除非另有其他定義。在本說明書中，單數形式也包括複數，除非在上下文中另外清楚地規定。雖然可將與那些本文所述者類似或相等的方法及材料用於本發明的實施或檢驗中，但是適合的方法及材料於下文說明。將本文所述及之所有刊物、專利申請案、專利及其他參考文獻併入本文以供參考。不承認本文所引用之參考文獻為所主張之本發明的先 前技術。在衝突的情況下，以本說明書(包括定義)掌控。另外，材料、方法及實施例僅為例證而已，而不意欲為限制。在本文所揭示之化合物的化學結構與名稱之間衝突的情況下，以化學結構掌控。
本發明的其他特色及優點將由以下的詳細說明及申請專利範圍顯現。
圖1為顯示經口服投予之化合物1或化合物A對抗小鼠中的淋巴瘤KARPAS-422異體移植之抗腫瘤效果的圖形。數據係以平均±SD(n=10)呈示。
圖2為顯示化合物1或化合物A對小鼠體重之效果的圖形。數據係以平均±SD(n=10)呈示。
圖3為顯示化合物1在治療後第7天或第28天於腫瘤中之濃度及化合物A在治療後第7天於腫瘤中之濃度的圖形。在此圖中，〝A〞至〝G〞分別代表以62.5、83.3、125、166.7、250、333.3和500毫克/公斤之劑量的化合物1投予後7天；〝H〞及〝I〞分別代表以125和250毫克/公斤之劑量的化合物A投予後7天；及〝J〞至〝L〞分別代表以62.5、125和250毫克/公斤之劑量的化合物1投予後28天。
圖4為顯示化合物1或化合物A在治療後第7天或第28天於血漿中之濃度的圖形。上虛線表明經血漿蛋白結合(PPB)校正之化合物A的LCC及下虛線表明經 PPB校正之化合物1的LCC。
圖5為顯示在來自以化合物1或化合物A治療7天之小鼠的KARPAS-422腫瘤中之整體H3K27me3甲基化的圖形。在此圖中，〝A〞代表媒劑治療；〝B〞至〝H〞分別代表以62.5、83.3、125、166.7、250、333.3和500毫克/公斤之劑量的化合物1治療；及〝I〞及〝J〞分別代表以125和250毫克/公斤之劑量的化合物A治療。
圖6為顯示在來自以化合物1治療28天之小鼠的KARPAS-422腫瘤中之整體H3K27me3甲基化的圖形。
圖7為顯示在來自以化合物1或化合物A治療7天的帶有KARPAS-422異體移植腫瘤之小鼠的骨髓中之整體H3K27me3甲基化的圖形。在此圖中，〝A〞代表媒劑治療；〝B〞至〝H〞分別代表以62.5、83.3、125、166.7、250、333.3和500毫克/公斤之劑量的化合物1治療；及〝I〞及〝J〞分別代表以125和250毫克/公斤之劑量的化合物A治療。
圖8為顯示在來自以化合物1治療28天的帶有KARPAS-422異體移植腫瘤之小鼠的骨髓中之整體H3K27me3甲基化的圖形。在此圖中，〝A〞代表媒劑治療；〝B〞至〝E〞分別代表以62.5、125、250和500毫克/公斤之劑量的化合物1治療；及〝F〞代表以250毫克/公斤之劑量的化合物A治療。
本發明提供新穎的經取代苯化合物，製造該化合物之合成方法，含有該等之醫藥組成物及化合物的各種用途。
本發明的代表性化合物包括表1中列示之化合物。
在本發明的說明書中，化合物的結構式以方便起見在一些例子中代表特定的異構物，但是本發明可包括所有的異構物，諸如幾何異構物、建基於不對稱碳的光學異構物、立體異構物、互變異構物、鏡像異構物、旋轉異構物、非鏡像異構物、消旋物及類似者，應瞭解並非所有的異構物可具有相同程度的活性。另外，以化學式代表的化合物可以晶體多晶型物存在。應注意的是任何晶形、晶形混合物或其無水物或水合物包括在本發明的範圍內。
〝異構性〞意指具有相同的分子式但其原子之鍵結順序不同或其原子在空間中之排列不同的化合物。 其原子在空間中之排列不同的異構物稱為〝立體異構物〞。彼此不為鏡像之立體異構物稱為〝非鏡像異構物〞，及彼此為不重疊的鏡像之立體異構物稱為〝鏡像異構物〞或有時稱為光學異構物。含有等量之相反掌性的個別鏡像異構物形式之混合物稱為〝消旋性混合物〞。
〝幾何異構物〞意指彼之存在歸因於雙鍵或環烷基鍵聯(例如，1,3-環丁基)附近的旋轉受阻之非鏡像異構物。該等構形係以前綴詞順式和反式，或Z和E之其名稱予以區別，該前綴詞係根據Cahn-Ingold-Prelog規則指出基團在分子內之雙鍵的相同側或相反側。
應瞭解可將本發明化合物描述為立體異構物。亦應瞭解當化合物具有立體異構物形式時，則意欲使所有的立體異構物包括在本發明的範圍內，應瞭解並非所 有的立體異構物可具有相同程度的活性。
此外，在本發明所討論的結構及其他化合物包括其所有的阻轉異構物，應瞭解並非所有的阻轉異構物可具有相同程度的活性。〝阻轉異構物〞為其中兩種異構物的原子在空間中以不同方式排列的立體異構物類型。阻轉異構物的存在歸因於中心鍵附近的大基團旋轉受阻所造成的旋轉限制。此等阻轉異構物典型地以混合物存在，然而由於層析技術的最新進展已有可能在選擇的情況下分離兩種阻轉異構物之混合物。
〝互變異構物〞為二或多種平衡存在且可輕易地從一種異構物形式轉換成另一種異構物形式的結構異構物中之一。此轉換導致由相鄰之共軛雙鍵的交換所伴隨之氫原子在形式上的遷移。互變異構物係以互變異構物組之混合物存在於溶液中。在互變異構化可能的溶液中，將達到互變異構物的化學平衡。互變異構物的實際比例係取決於許多因子而定，包括溫度、溶劑和pH。經由互變異構化可互相轉換的互變異構物之觀念稱為互變異構性。
在各種可能的互變異構性類型之中，常觀察到兩種。在酮基-烯醇互變異構性中，電子及氫原子同時發生位移。環-鏈互變異構性係由於糖鏈分子中的醛基團(-CHO)與相同分子中的羥基(-OH)中之一反應而產生，使糖鏈分子得到如以葡萄糖所展現之環(成環形狀)形式。
如本文所使用之任何出現的應理解為
常見的互變異構物對為：酮-烯醇、醯胺-腈、內醯胺-內醯亞胺、在雜環上的醯胺-亞胺酸互變異構性(例如，在核鹼基上，諸如鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶)、亞胺-烯胺和烯胺-烯胺。酮基-烯醇平衡的實例為介於吡啶-2(1H)-酮與相應的吡啶-2-醇之間，如下文所示。
應瞭解可將本發明化合物描述為不同的互變異構物。亦應瞭解當化合物具有互變異構物形式時，則意欲使所有的互變異構物形式包括在本發明的範圍內，且化合物的命名不排除任何互變異構物形式。應理解的是特定的互變異構物可具有比其他者更高程度的活性。
術語〝晶體多晶型物〞、〝多晶型物〞或〝晶形〞意指晶體結構，其中化合物(或其鹽或溶劑化物)可以不同的晶體堆積排列方式結晶，全部皆具有相同元素組成。不同的晶形通常具有不同的X-射線繞射圖、紅外線光譜、熔點、密度、硬度、晶體形狀、光學和電學性質、穩定性和溶解性。再結晶溶劑、結晶速率、貯存溫度和其他因子可造成一種晶形佔優勢。化合物的晶體多晶型 物可藉由在不同的條件下結晶而製得。
本發明化合物包括化合物本身，諸如本文所揭示之化學式中之任一者。本發明化合物亦可包括若適用的其鹽及其溶劑化物。例如，鹽可在經取代苯化合物上的陰離子與荷正電基團(例如，胺基)之間形成。適當的陰離子包括氯離子、溴離子、碘離子、硫酸根、硫酸氫根、胺磺酸根、硝酸根、磷酸根、檸檬酸根、甲烷磺酸酸根、三氟乙酸根、麩胺酸根、葡萄糖醛酸根、戊二酸根、蘋果酸根、馬來酸根、琥珀酸根、富馬酸根、酒石酸根、甲苯磺酸根、水楊酸根、乳酸根、萘磺酸根和乙酸根(例如，三氟乙酸根)。術語〝藥學上可接受之陰離子〞係指適合於形成醫藥上可接受之鹽的陰離子。同樣地，鹽可在經取代苯化合物上的陽離子與荷負電基團(例如，羧酸根)之間形成。適當的陽離子包括鈉離子、鉀離子、鎂離子、鈣離子和銨陽離子，諸如四甲基銨離子。經取代苯化合物亦包括那些含有四級氮原子之鹽。
另外，本發明化合物(例如，化合物之鹽)可以水合或非水合(無水)形式存在，或與其他溶劑分子的溶劑化物存在。水合物的非限制性實例包括單水合物、二水合物等等。溶劑化物的非限制性實例包括乙醇溶劑化物、丙酮溶劑化物等等。
〝溶劑化物〞意指含有化學計量或非化學計量之溶劑量的溶劑加成形式。一些化合物具有以結晶固態捕陷固定的莫耳比之溶劑分子的傾向，因此形成溶劑化 物。若溶劑為水，則所形成的溶劑化物為水合物；及若溶劑為醇，則所形成的溶劑化物為醇化物。水合物係藉由組合一或多個分子的水與一個分子的物質而形成，其中水保留其分子狀態，如H2O。
如本文所使用的術語〝類似物〞係指在結構上類似於另一者，但組成略微不同的化學化合物(如一種原子以不同元素的原子置換或在特別的官能基存在下，或一種官能基以另一官能基置換)。因此，類似物為在功能及外觀上與參考化合物類似或可相比，但在結構或來源上與參考化合物不類似或不可相比的化合物。
如本文所定義的術語〝衍生物〞係指具有共同的核心結構且如文中所述經各種基團取代之化合物。例如，在表1中的所有化合物為經取代苯化合物且具有共同的核心。
術語〝生物類性體〞係指從原子或原子群組與另一在廣義上類似的原子或原子群組交換所得之化合物。生物類性體置換的目標係產生具有與母體化合物類似的生物性質之新化合物。生物類性體置換可建基於物理化學性或拓樸性。羧酸生物類性體的實例包括但不限於醯基磺醯亞胺、四唑、磺酸鹽和膦酸鹽。參見，例如Patani and LaVoie,Chem.Rev.96,3147-3176,1996。
本發明意欲包括出現於本發明化合物中之原子的所有同位素。同位素包括那些具有相同的原子序，但不同的質量數之原子。以通用實例而非限制方式說明，氫 的同位素包括氚和氘，及碳的同位素包括C-13和C-14。
本發明提供用於合成本文所揭示之化合物的方法。本發明亦提供根據實施例中所示之流程用於合成本發明所揭示之各種化合物的詳細方法。
在整個說明書中，其中組成物經說明為具有、包括或包含特定的組份，預期該組成物基本上亦由或係由列舉之組份所組成。同樣地，其中方法(method或process)經說明為具有、包括或包含特定的處理步驟，該方法基本上亦由或係由列舉之處理步驟所組成。再者，應瞭解步驟順序或進行特定作用的順序並不重要，只要本發明仍可操作。而且，可同時進行二或多個步驟或作用。
本發明的合成方法可以耐受各種廣泛的官能基，因此可使用各種經取代起始材料。方法通常在整個方法結束時或快結束時提供所欲最終化合物，雖然在特定的事例中可能希望進一步將化合物轉化成其醫藥上可接受之鹽。
本發明化合物可以各種方式製得，其係使用市場上可取得的起始材料、文獻中已知的化合物或從可輕易製得的中間物，藉由使用那些熟諳所屬技術領域者已知或為熟諳技術領域者按照本文的教導而明白的標準合成方法及程序。用於製備有機分子及官能基轉變和操作的標準合成方法及程序可自該領域中相關的科學文獻或標準的參考書獲得。雖然不受限於任何一或數個來源，但是經典的教科書(諸如併入本文以供參考的Smith,M.B.,March,J., March’s Advanced Organic Chemistry：Reactions,Mechanisms,and Structure,5th edition,John Wiley & Sons：New York,2001；Greene,T.W.,Wuts,P.G.M.,Protective Groups in Organic Synthesis,3rd edition,John Wiley & Sons：New York,1999；R.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers(1989)；L.Fieser and M.Fieser,Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1994)；及L.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1995)為那些本技術領域者已知的有用且經認可之有機合成參考書。以下說明的合成方法係經設計以例證而非限制用於製備本發明化合物的通用程序。
一般熟諳所屬技術領域者將認知特定的基團可能需要經由使用保護基而受到免於反應條件的保護。保護基亦可用於區別分子內類似的官能基。保護基名單與如何引入及移除該等基團可見於Greene,T.W.,Wuts,P.G.M.,Protective Groups in Organic Synthesis,3rd edition,John Wiley & Sons：New York,1999中。
較佳的保護基包括但不限於：用於羥基部分：TBS、苯甲基、THP、Ac
用於羧酸類：苯甲酯、甲酯、乙酯、烯丙酯
用於胺類：Cbz、BOC、DMB
用於二醇類：Ac(x2)TBS(x2)，或當一起為亞異丙基縮醛(acetonide)
用於硫醇類：Ac
用於苯並咪唑類：SEM、苯甲基、PMB、DMB
用於醛類：二-烷基縮醛，諸如二甲氧基縮醛或二乙基乙醯基。
在本文所述之反應流程中，可產生多種立體異構物。當未指明特定的立體異構物時，則應瞭解其意指能從反應產生的所有可能的立體異構物。一般熟諳所屬技術領域者將認知可使反應最優化而優先得到一種異構物，或可設想出新的流程以產生單一異構物。若產生混合物，則可使用技術分離出異構物，諸如製備型薄層層析術、製備型HPLC、製備型掌性HPLC或製備型SFC。
以下的縮寫應用於整個說明書中且定義如下：
本發明化合物可以那些熟諳所屬技術領域者熟悉的各種方法製得。具有本文所揭示之任何化學式的本發明化合物可根據以下的實施例中所例證之程序從市場上可取得起始材料或可使用文獻程序所製得的起始材料製得。
一般熟諳所屬技術領域者應注意可在本文所述之反應程序及合成流程期間改變特定步驟的順序，諸如保護基的引入及移除。
本發明化合物抑制EZH2或其突變體的組織蛋白甲基轉移酶活性，且據此在本發明的一個觀點中，本文所揭示之特定化合物為治療或預防其中EZH2扮演一角色的特定病況及疾病之候選者。本發明提供用於治療病況及疾病之方法，其過程可藉由調節組織蛋白或其他蛋白質的甲基化狀態而受到影響，其中該甲基化狀態至少部份係藉由EZH2的活性而調節。組織蛋白的甲基化狀態之調節進而可影響由甲基化所活化之標的基因及/或由甲基化所抑制之標的基因的表現程度。該方法包括將治療有效量的本發明化合物，或其藥學上可接受之鹽、多晶型物、溶劑化物或立體異構物投予需要此治療之對象。
治療方法的任何說明包括使用化合物提供如本說明書中所述之此等治療或預防，以及使用化合物製備用於治療或預防此等病況之藥劑，除非另有其他陳述。治療包括人類或非人類動物(包括齧齒目動物)及其他疾病樣式的治療。
在又另一觀點中，本發明關於調節在需要其之對象中的EZH2活性之方法，EZH2為催化組織蛋白H3(H3-K27)上的離胺酸27之單-至三-甲基化之PRC2複合物的催化性次單元。例如，該方法包含將治療有效量的本文所述之化合物投予患有表現突變體EZH2(例如，EZH2之Y641突變體)的癌症之對象的步驟，其中化合物抑制EZH2之組織蛋白甲基轉移酶活性，從而治療癌症。
例如，經EZH2-調介之癌症係選自由濾泡性 淋巴瘤和類胚胎中心B細胞(GCB)亞型的瀰漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)所組成之群組。例如，癌症為淋巴瘤、白血病或黑色素瘤。淋巴瘤較佳為非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、濾泡性淋巴瘤或瀰漫性大B-細胞淋巴瘤。另一選擇地，白血病為慢性骨髓性白血病(CML)、急性髓狀白血病、急性淋巴球白血病或混合系白血病。
例如，經EZH2-調介之癌前病況為骨髓造血不良症候群(MDS，之前稱為白血病前期)。
例如，經EZH2-調介之癌症為血液學癌症。
本發明化合物抑制EZH2或其突變體的組織蛋白甲基轉移酶活性，且據此本發明亦提供用於治療病況及疾病之方法，其過程可藉由調節組織蛋白或其他蛋白質的甲基化狀態而受到影響，其中該甲基化狀態至少部份係藉由EZH2的活性而調節。在本發明的一個觀點中，本文所揭示之特定化合物為治療或預防特定病況及疾病之候選者。調節組織蛋白的甲基化狀態進而可影響由甲基化所活化之標的基因及/或由甲基化所抑制之標的基因的表現程度。該方法包括將治療有效量的本發明化合物投予需要此治療之對象。
如本文所使用的〝對象〞與〝需要其之對象〞可互相交換，二者係指患有其中經EZH2-調介之蛋白甲基化扮演一角色的病症之對象或相對於一般大眾而具有發展此等病症的風險增加之對象。〝對象〞包括哺乳動物。哺乳動物可為例如人類或適當的非人類哺乳動物，諸 如靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、母牛、馬、山羊、駱駝、羊或豬。對象亦可為鳥或禽。在一個具體實例中，哺乳動物為人類。需要其之對象可為已事先診斷或確認為患有癌症或癌前病況之對象。需要其之對象亦可為患有(例如，正遭受)癌症或癌前病況之對象。另一選擇地，需要其之對象可為相對於一般大眾而具有發展此等病症的風險增加之對象(亦即相對於一般大眾而傾向發展此等病症之對象)。需要其之對象可患有癌前病況。需要其之對象可患有難治性或抵抗性癌症(亦即對治療沒有回應或尚無回應的癌症)。對象可在開始治療時具有抵抗性或可在治療期間變成抵抗性。在一些具體實例中，需要其之對象在以最近的療法緩解之後具有復發的癌症。在一些具體實例中，需要其之對象接受所有已知對癌症治療有效的療法且皆失敗。在一些具體實例中，需要其之對象接受至少一種既往的療法。在較佳的具體實例中，對象患有癌症或癌前病況。例如，癌症為淋巴瘤、白血病、黑色素瘤或橫紋肌肉瘤。淋巴瘤較佳為非霍奇金氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤或瀰漫性大B-細胞淋巴瘤。另一選擇地，白血病為慢性骨髓性白血病(CML)。癌前病況為骨髓造血不良症候群(MDS，之前稱為白血病前期)。
如本文所使用的〝治療(treating或treat)〞說明以對抗疾病、病況或病症為目的的病患管理及照護，且包括投予本發明化合物或其藥學上可接受之鹽、多晶型物或溶劑化物，以減輕疾病、病況或病症的徵候或併發症， 或消除疾病、病況或病症。術語〝治療〞亦可包括試管內或動物模式的細胞治療。
本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽、多晶型物或溶劑化物可用於或亦可能用於預防相關疾病、病況或病症，或用於確認適合於此等目的候選者。如本文所使用的〝預防(preventing或prevent)〞說明減低或消除此等疾病、病況或病症的徵候或併發症之攻擊。
在EZH2的單一胺基酸殘基(例如，Y641、A677和A687)上之EZH2基因的點突變體經報導與淋巴瘤相連結。EZH2突變體的更多實例及偵測突變體之方法和治療與突變體相關聯的病症之方法說明於例如美國專利申請公告案號US 20130040906中，將其整個內容以其全文併入本文中以供參考。
熟諳所屬技術領域者可參考本文所討論的已知技術或同等技術之詳細說明的一般參考書。該等參考書包括Ausubel等人之Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.(2005)；Sambrook等人之Molecular Cloning,A Laboratory Manual(3rd edition),Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York(2000)；Coligan等人之Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,N.Y.；Enna等人之Current Protocols in Pharmacology,John Wiley & Sons,N.Y.；Fingl等人之The Pharmacological Basis of Therapeutics(1975),Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.,Easton,PA,18th edition(1990)。當然亦可在達成或使用本發明的觀點時參考該等參考書。
如本文所使用的〝組合療法〞或〝共同療法〞包括投予本發明化合物或其藥學上可接受之鹽、多晶型物或溶劑化物與作為特定的治療制度之一部份的至少第二種試劑，意欲從該等治療劑的共同作用提供有利的效果。組合的有利效果包括但不限於源自於治療劑組合的藥物動力學或藥效動力學共同作用。
本發明亦提供包含本文所揭示之化合物與至少一種醫藥上可接受之賦形劑或載劑組合的醫藥組成物。
〝醫藥組成物〞為含有呈適合投予對象之形式的本發明化合物之調配物。在一個具體實例中，醫藥組成物呈散裝或呈單位劑型。單位劑型為各種形式中之任一者，包括例如膠囊、IV袋、錠劑、噴霧劑吸入器上的單一泵或小瓶。在單位劑量組成物中的活性成分(例如，所揭示之化合物或其鹽、水合物、溶劑化物或異構物的調配物)之數量為有效量且根據所涉及之特別治療而改變。熟諳所屬技術領域者將認知有時必須取決於病患的年齡和狀況而對劑量進行常規變化。劑量亦取決於投予途徑。涵蓋各種途徑，包括經口、肺、直腸、非經腸、穿透皮膚、皮下、靜脈內、肌肉內、腹膜內、吸入、頰內、舌下、胸膜內、脊髓內、鼻內及類似者。本發明化合物的局部或穿透皮膚投予之劑型包括粉劑、噴霧劑、軟膏、糊狀物、乳霜、洗劑、凝膠、溶液、貼片和吸入劑。在一個具體實例 中，將活性化合物在無菌條件下與醫藥上可接受之載劑及與必要的任何保存劑、緩衝劑或推進劑混合。
如本文所使用的語詞〝醫藥上可接受〞係指在合理的醫學判斷範圍內適合與人類和動物組織接觸而沒有過量毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症且具有相稱合理的利益/風險比例的那些化合物、陰離子、陽離子、材料、組成物、載劑及/或劑型。
〝醫藥上可接受之賦形劑〞意指有用於製備通常安全、無毒性且既不是生物學上，亦不是其他方面非所欲的醫藥組成物之賦形劑，且包括獸醫用途以及人類醫藥用途可接受之賦形劑。如說明書及申請專利範圍中所使用的〝醫藥上可接受之賦形劑〞同時包括一種及一種以上的此等賦形劑。
本發明的醫藥組成物係經調配而與其意欲之投予途徑可相容。投予途徑的實例包括非經腸(例如，靜脈內)、皮內、皮下、經口(例如，吸入)、穿透皮膚(局部)和穿透黏膜投予。用於非經腸、皮內或皮下施予之溶液或懸浮液可以包括下列組份：無菌稀釋劑(諸如注射用水、食鹽水溶液、非揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑)；抗細菌劑(諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯)；抗氧化劑(諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸)；緩衝劑(諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽)；及用於調整張力之劑(諸如氯化鈉或葡萄糖)。pH可以酸或鹼(例如，氫氯酸或氫氧化鈉)調整。非經腸製劑可 包封在安瓿、可棄式注射器或由玻璃或塑膠所製成的多劑量小瓶中。
本發明化合物或醫藥組成物可以目前用於化學治療的許多熟知方法投予對象。例如，用於治療癌症的本發明化合物可直接注射至腫瘤中、注射至血流或體腔中，或經口服投予，或以貼片透過皮膚施予。所選擇之劑量應足以構成有效治療，但未高至造成不可接受的副作用。病況的狀態(例如，癌症、癌前及類似者)及病患的健康較佳地應在治療期間或治療之後合理的時期內受到嚴密的監測。
如本文所使用的術語〝治療有效量〞係指治療、改善或預防經確認之疾病或病況，或展現可偵測之治療或抑制效果的醫藥劑之量。效果可以本技術中已知的任何檢定方法偵測。用於對象的精確有效量將取決於對象的體重、體型和健康；病況的本性和程度；及經選擇投予之療法或組合療法。對給定之情況的治療有效量可藉由在臨床醫師的專業和判斷範圍內的常規實驗來測定。在較佳的觀點中，欲治療之疾病或病況為癌症。在另一觀點中，欲治療的疾病或病況為細胞增生性病症。
任何化合物的治療有效量可在例如腫瘤細胞的細胞培養檢定法中，或在動物模式中(通常為大鼠、小鼠、兔子、狗或豬)初步評估。動物模式亦可用於測定適當的濃度範圍和投予途徑。此等資訊接著可用於測定有用於投予人類的劑量和途徑。治療/預防效力和毒性可藉由 在細胞培養物或實驗動物中的標準醫藥程序來測定，例如ED50(使50%之總數達到治療有效的劑量)和LD50(使50%之總數達到致死的劑量)。介於毒性與療效之間的劑量比為治療指數，且其可以比值LD50/ED50表示。以展現大的治療指數之醫藥組成物較佳。劑量可取決於所使用的劑型、病患的敏感性和投予途徑而在此範圍內改變。
劑量及投予係經調整以提供足夠量的活性劑或維持所欲效果。可納入考慮的因子包括疾病狀態的嚴重性、對象的一般健康、對象的年齡、體重和性別、飲食、投予的時間和頻率、藥物組合、反應敏感性及對療法的耐受性/回應。長效醫藥組成物可取決於特別的調配物之半生期和廓清率而以每3至4天、每週或每兩週投予一次。
含有本發明的活性化合物之醫藥組成物可以通常已知的方式製造，例如利用習知的混合、溶解、粒化、糖衣化、磨細、乳化、包膠、包覆或凍乾方法。醫藥組成物可使用一或多種包含賦形劑及/或輔助劑之醫藥上可接受之載劑的習知方式調配，該賦形劑和/或輔助劑有助於使活性化合物加工成可於醫藥上使用的製劑。當然，適當的調配物係取決於所選擇之投予途徑。
適合於可注射使用的醫藥組成物包括無菌水溶液(其中可溶於水)或分散液，及用於隨即製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。用於靜脈內投予之適合的載劑包括生理食鹽水、制菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)。在所有的例 子中，組成物必須為無菌且應為以易注射性程度存在之流體。其在製造和儲存條件下必須為穩定的，且必須經保存以對抗微生物(諸如細菌和真菌)的污染作用。載劑可為溶劑或含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇及類似者)及其適合的混合物之分散液介質。適當的流動性可以例如藉由使用包膜(諸如卵磷脂)、在分散液的例子中藉由維持必要的粒徑及藉由使用界面活性劑來維持。防止微生物的作用可藉由各種抗細菌劑和抗真菌劑達成，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、乙汞硫柳酸鈉及類似者。在許多例子中，較佳的是組成物包括等滲壓劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇和山梨醇)和氯化鈉。延長可注射組成物的吸收可藉由包括在組成物中的延緩吸收之劑(例如，單硬脂酸鋁和明膠)而造成。
無菌可注射溶液可藉由將活性化合物以必要的量在適當的溶劑中與上文列舉的成分中之一或組合合併，在必要時接著過濾殺菌而製得。分散液通常係藉由將活性化合物併入無菌媒劑中而製得，該無菌媒劑含有基底分散介質及來自那些上文列舉之必要的其他成分。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的例子中，製備方法為真空乾燥和冷凍乾燥，得到活性成分加上來自其先前無菌-過濾溶液之任何額外的所欲成分之粉末。
經口組成物通常包括惰性稀釋劑或可食用之醫藥上可接受之載劑。可將其包封在明膠膠囊中或壓縮成 錠劑。以經口治療的投予為目的，可將活性化合物與賦形劑合併且以錠劑、喉錠或膠囊形式使用。經口組成物亦可使用作為漱口藥使用的流體載劑而製得，其中在流體載劑中的化合物係經口施予且咕嚕咕嚕地漱洗口腔，並吐出或吞下。可包括醫藥上可相容之結合劑及/或佐劑材料作為組成物的一部份。錠劑、藥丸、膠囊、喉錠及類似者可含有下列成分或類似性質之化合物中之任一者：結合劑，諸如微晶纖維素、黃著膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖：崩散劑，諸如海藻酸、Primogel或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或Sterotes；助滑劑，諸如膠體二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如薄荷、水楊酸甲酯或柳橙調味。
以吸入投予之化合物係從含有適合的推進劑(例如，氣體，諸如二氧化碳)之加壓容器或分配器，或噴霧器以氣溶膠噴霧形式輸送。
全身性投予亦可以穿透黏膜或穿透皮膚的方式。將適合於欲滲透之障壁的穿透劑用於穿透黏膜或穿透皮膚投予的調配物中。此等穿透劑通常為本技術中所知且包括例如用於穿透黏膜投予的清潔劑、膽鹽和梭鏈孢酸衍生物。穿透黏膜投予可經由使用鼻噴霧劑或栓劑而完成。可將用於穿透皮膚投予的活性化合物調配成軟膏、油膏、凝膠或乳霜，其通常為本技術中所知。
活性化合物可以使化合物免於從身體快速消除的醫藥上可接受之載劑製得，諸如控制型釋放調配物， 包括植入物和微包膠化輸送系統。可使用生物可降解、生物可相容之聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酯和聚乳酸。製備此等調配物之方法為那些熟諳所屬技術領域者所明白。材料亦可於市場上自Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc取得。脂質體懸浮液(包括以具有針對病毒抗原之單株抗體的受感染細胞為標靶之脂質體)亦可用作為醫藥上可接受之載劑。此等可根據那些熟諳所屬技術領域者已知的方法製得，例如在美國專利案號4,522,811中所述。
特別有利的是調配呈容易投予及劑量一致性的單位劑型之口服或非經腸組成物。如本文所使用的單位劑型係指適合作為治療對象之單一劑量的物理分立單位，各單位含有經計算與必要的醫藥載劑締結以產生所欲療效的預定量之活性化合物。本發明的單位劑型之說明書受到由且直接取決於活性化合物的獨特特徵及欲達成之特別療效的規定。
在治療應用中，在影響所選擇之劑量的其他因子之中，依照本發明所使用的醫藥組成物之劑量係取決於藥劑，受領病患的年齡、體重和臨床狀況，及實行治療之臨床醫師或開業醫師的經驗和判斷而改變。劑量通常應足以導致腫瘤的生長變慢，而較佳地使其消退，且亦較佳地造成癌症完全消退。劑量範圍可從約0.01毫克/公斤/天至約5000毫克/公斤/天。在較佳的觀點中，劑量範圍可從約1毫克/公斤/天至約1000毫克/公斤/天。在一觀點中， 以單一、分次或連續給藥的劑量係在約0.1毫克/天至約50公克/天；約0.1毫克/天至約25公克/天；約0.1毫克/天至約10公克/天；約0.1毫克至約3公克/天；或約0.1毫克至約1公克/天之範圍內(該劑量可以公斤計之病患體重、以平方公尺計之體表面積和歲數計之年齡進行調整)。醫藥劑的有效量為提供由臨床醫師或其他合格的觀察者記下之可客觀確認出改善的量。例如，病患腫瘤的消退可參考腫瘤的直徑來測量。腫瘤直徑的縮減表明消退。消退亦藉由停止治療之後腫瘤不再出現來表明。如本文所使用的術語〝劑量有效方式〞係指活性化合物在對象或細胞中產生所欲生物效應的量。
醫藥組成物可與投予指示一起包括在容器、包裝或分配器中。
本發明化合物能夠進一步形成鹽。所有的該等形式亦涵蓋在所主張之本發明的範圍內。
如本文所使用的〝醫藥上可接受之鹽〞係指本發明化合物的衍生物，其中母體化合物係藉由製成其酸或鹼鹽而修改。醫藥上可接受之鹽的實例包括但不限於：鹼性殘基(諸如胺)的無機或有機酸鹽、酸性殘基(諸如羧酸)的鹼性或有機鹽、及類似者。醫藥上可接受之鹽包括所形成之母體化合物習知的無毒性鹽或四級銨鹽，例如來自無毒性無機或有機酸。例如，此等習知的毒性鹽包括但不限於那些衍生自選自下列者的無機酸和有機酸之鹽：2-乙醯氧基苯甲酸、2-羥基乙烷磺酸、乙酸、抗壞血酸、苯 磺酸、苯甲酸、酸式碳酸、碳酸、檸檬酸、乙二胺四乙酸、乙烷二磺酸、1,2-乙烷磺酸、富馬酸、葡萄庚酸、葡萄糖酸、麩胺酸、乙醇酸、乙醇醯基對胺苯胂酸、己基間苯二酸、哈巴酸(hydrabamic)、氫溴酸、氫氯酸、氫碘酸、羥基馬來酸、羥基萘甲酸、2-羥乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂基磺酸、馬來酸、蘋果酸、杏仁酸、甲烷磺酸、萘息酸(napsylic acid)、硝酸、草酸、雙羥萘酸、泛酸、苯基乙酸、磷酸、聚半乳糖醛酸、丙酸、水楊酸、硬脂酸、次乙酸、琥珀酸、胺磺酸、對胺苯磺酸、硫酸、單寧酸、酒石酸、甲苯磺酸和常見的胺基酸，例如甘胺酸、丙胺酸、苯基丙胺酸、精胺酸等等。
醫藥上可接受之鹽的其他實例包括己酸、環戊烷丙酸、丙酮酸、丙二酸、3-(4-羥基苯甲醯基)苯甲酸、肉桂酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、4-甲基雙環-[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、第三丁基乙酸、黏康酸及類似者。當存在於母體化合物中的酸性質子經金屬離子(例如，鹼金屬離子、鹼土金屬離子或銨離子)置換時；或與有機鹼(諸如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、胺基丁三醇、N-甲基還原葡糖胺及類似者)配位時，則本發明亦包含所形成之鹽。在鹽形式中，應瞭解化合物對鹽之陽離子或陰離子之比值可為1：1，或除了1：1以外的任何比值，例如3：1，2：1，1：2或1：3。
應瞭解所有述及之醫藥上可接受之鹽包括相 同的鹽之如本文所定義之溶劑加成形式(溶劑化物)或晶形(多晶型物)。
化合物或其醫藥上可接受之鹽係經口、鼻、穿透皮膚、肺、吸入、頰內、舌下、腹膜內、皮下、肌肉內、靜脈內、直腸、胸膜內、脊髓內和非經腸投予。在一個具體實例中，化合物係經口投予。熟諳所屬技術領域者將認知特定的投予途徑之優點。
利用化合物的劑量制度係依照各種因子來選擇，包括病患的類型、種類、年齡、體重、性別和醫學狀況；欲治療之病況的嚴重性；投予途徑；病患的腎和肝功能；及所使用的特別化合物或其鹽。一般熟諳的醫師或獸醫師可以輕易地決定及開處方用於預防、反抗或遏止病況進展所必要的藥物有效量。
調配及投予本發明所揭示之化合物的技術可見於Remington：the Science and Practice of Pharmacy,19th edition,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1995)中。在具體實例中，本文所述之化合物及其醫藥上可接受之鹽可與醫藥上可接受之載劑或稀釋劑組合而用於醫藥製劑中。適合的醫藥上可接受之載劑包括惰性固體填充劑或稀釋劑和無菌水溶液或有機溶液。化合物係以足以提供在本文所述之範圍內的所欲劑量之量存在於此等醫藥組成物中。
本文所使用的所有百分比和比值皆以重量計，除非另有其他表示。本發明的其他特色及優點係從不 同的實施例顯現。所提供之實施例例證有用於實施本發明的不同組份及方法。實施例不限制所主張之本發明。熟諳技術領域者可建基於本發明的揭示內容而確認且利用有用於實施本發明的其他組份及方法。
在本文所述之合成流程及化學結構中，化合物可以簡化起見而一種特別的構形描繪(例如，以或不以所表明之特別的立體異構物)。有或沒有此等特別的構形並不被解釋成限制本發明為一種或另一種異構物、互變異構物、區域異構物或立體異構物，亦不排除異構物、互變異構物、區域異構物或立體異構物之混合物；然而，應瞭解給定之異構物、互變異構物、區域異構物或立體異構物可具有比另一異構物、互變異構物、區域異構物或立體異構物更高程度的活性。
以上述方法所設計、選擇及/或最優化之化合物在一經製得時可使用那些熟諳所屬技術領域者已知的各種檢定法特徵化，以測定化合物是否具有生物活性。例如，分子可以習知的檢定法特徵化，包括但不限於那些下文所述之檢定法，以測定其是否具有預期的活性、結合活性和/或結合特異性。
此外，可使用高速篩選(high-throughput screening)以加速使用此等檢定法的分析。結果有可能使用本技術中已知的技術快速篩選本文所述分子的活性。進行高速篩選的通用方法說明於例如Devlin(1998)High Throughput Screening,Marcel Dekker；及美國專利案號 5,763,263中。高速檢定法可以使用一或多種不同的檢定技術，包括但不限於那些下文所述者。
將本文所引用之所有刊物及專利文件併入本文以供參考，如同每一該等刊物及文件係經具體且單獨指出而併入本文以供參考。刊物及專利文件的引用並不意欲承認任何有關的先前技術，亦不構成任何對其內容或日期的承認。現以書面說明方式說明本發明，那些熟諳所屬技術領域者將認知本發明可以各種具體實例實施，且前述的說明及以下的實施例係以例證為目的，並非限制隨後的申請專利範圍。
實施例 實施例1：本發明化合物的合成法 通用實驗 NMR
1H-NMR光譜係使用CDCl3得到，除非另有其他陳述，且使用Varian或Oxford instruments magnet(500MHz)儀器在400或500MHz記錄。所標示之多重性為s=單峰，d=雙重峰，t=三重峰，q=四重峰，quint=五重峰，sxt=六重峰，m=多重峰，dd=二個雙重峰，dt=二個三重峰；br標示寬的信號。
LCMS及HPLC
質量：Waters Acquity Ultra Performance LC。HPLC：產物係以具有150×4.5毫米YMC ODS-M80管柱或150×4.6毫米YMC-Pack Pro C18管柱之Shimadzu SPD-20A以1.0毫升/分鐘進行分析。移動相為MeCN：H2O=3：2(含有0.3%之SDS和0.05%之H3PO4)。產物係以使用具有3100 Mass Detector之Waters AutoPurification System的HPLC/MS(含有0.1%之氫氧化銨的MeOH-H2O)純化。
3-(胺基甲基)-4,6-二甲基-1,2-二氫吡啶-2-酮HCl鹽
將K2CO3(4.00公克，28.9毫莫耳)添加至H2O(200毫升)中的2-氰基乙醯胺(8.40公克，100毫莫耳)及乙醯基丙酮(10.0公克，100毫莫耳)之溶液中。將混合物在室溫下攪拌22小時。接著將沉澱之固體以Buchner漏斗過濾，以冰冷的H2O清洗且在真空壓力下乾燥，得到4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-甲腈(13.5公克，91%之產率)。
將10%之Pd(OH)2(19公克)在N2氣下添加至MeOH(1.50公升)及濃縮HCl(30毫升)中的4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-甲腈(10.0公克，67.5毫莫耳)之溶液中。將N2氣以H2氣置換且將混合物在室溫及氫氣下攪拌26小時。將H2氣以N2氣置換。將混合物經由矽藻土 過濾，以MeOH清洗且濃縮。將殘餘物以EtOH濕磨，以Buchner漏斗收集且在真空壓力下乾燥，得到成為白色固體的標題化合物(11.5公克，90%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ ppm 11.86(brs,1H),5.98(s,1H),3.78(m,2H),2.20(s,3H),2.16(s,3H)。
5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸
將1,3-二溴-5,5-二甲基尿囊素(4.34公克，15.20毫莫耳)在0℃下添加至H2SO4(20毫升)中的2-甲基-3-硝基苯甲酸(5.00公克，27.6毫莫耳)之攪拌溶液中。將反應混合物在0℃下攪拌5小時。將反應混合物倒在冰冷的水上，收集所得沉澱固體，以水清洗且在真空中乾燥，得到成為白色固體的標題化合物(7.28公克，定量產率)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ ppm；8.31(s,1H),8.17(s,1H),2.43(s,3H)。
5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯
將碳酸鈉(11.9公克，112毫莫耳)及甲基碘(15.9公克，112毫莫耳)添加至DMF(100毫升)中的5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸(7.28公克，28.0毫莫耳)之攪拌溶液中。將反應混合物在60℃下攪拌8小時。在反應完成之後，將反應混合物過濾且以乙酸乙酯清洗。將合併的濾液以水清洗且將水相以乙酸乙酯再萃取。將合併的有機層經無水硫酸鈉乾燥，過濾且在減壓下濃縮，以供給成為固體的標題化合物(7.74公克，定量產率)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)；8.17(s,1H),7.91(s,1H),3.96(s,3H),2.59(s,3H)。
3-胺基-5-溴-2-甲基苯甲酸甲酯
將氯化銨(4.45公克，83.1毫莫耳)及鐵(4.64公克，83.1毫莫耳)添加至水性EtOH(100毫升EtOH及20毫升H2O)中的5-溴-2-甲基-3-硝基苯甲酸甲酯(7.60公克，27.7毫莫耳)之攪拌溶液中。將反應混合物在80℃下攪拌5小時。接著將混合物經由矽藻土過濾且將矽藻土床以乙酸乙酯清洗。將合併的濾液在真空中濃縮。將所得殘餘物溶解在乙酸乙酯及水中。將水層以乙酸乙酯萃取(兩 次)。將合併的有機層經無水硫酸鈉乾燥，過濾且在減壓下濃縮，以供給成為棕色油的標題化合物(6.67公克，99%)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ ppm；7.37(s,1H),6.92(s,1H),3.94(s,3H),3.80(brs,2H),2.31(s,3H)。
化合物1：
步驟1：5-(((反式)-4-((第三丁氧基羰基)胺基)環己基)(乙基)胺基)-4'-羥基-4-甲基-[1,1'-聯苯基]-3-羧酸甲酯之合成法
將Na2CO3(8.01公克，75.5毫莫耳)添加至二噁烷(225毫升)與水(75毫升)之混合物中的5-溴-3-(((反式)-4-((第三丁氧基羰基)胺基)環己基)(乙基)胺基)-2-甲基苯甲酸甲酯(10公克，21.3毫莫耳，參見例如WO2012142504(Attorney Docket No.41478-507001WO))及 (4-羥苯基)硼酸(3.5公克，25.3毫莫耳)之攪拌溶液中且將溶液以氬氣洗淨30分鐘。接著添加Pd(PPh3)4(2.4公克，2.07毫莫耳)且以氬氣再洗淨15分鐘。將反應團在100℃下加熱4小時。在完成時，將反應混合物以水稀釋且以乙酸乙酯萃取。將合併的有機層經硫酸鈉乾燥。在減壓下移除溶劑，接著以管柱層析術純化，以供給標題化合物(8.9公克，87%之產率)。
步驟2：5-(((反式)-4-((第三丁氧基羰基)胺基)環己基)(乙基)胺基)-4'-(2-甲氧基乙氧基)-4-甲基-[1,1'-聯苯基]-3-羧酸甲酯之合成法
將Cs2CO3(0.485公克，1.49毫莫耳)添加至乙腈(6毫升)中的5-(((反式)-4-((第三丁氧基羰基)胺基)環己基)(乙基)胺基)-4'-羥基-4-甲基-[1,1'-聯苯基]-3-羧酸甲酯(0.6公克，1.24毫莫耳)及1-溴-2-甲氧基乙烷(0.519公克，3.73毫莫耳)之攪拌溶液中且將反應在80℃下攪拌12小時。在完成時，將水添加至其中且以乙酸乙酯萃取。將合併的有機層經無水硫酸鈉乾燥且在減壓下濃縮。將粗製化合物以管柱層析術純化，以供給標題化合物(0.6公克，76.5%之產率)。
步驟3：((反式)-4-((5-(((4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)胺甲醯基)-4'-(2-甲氧基乙氧基)-4-甲基-[1,1'-聯苯]-3-基(乙基)-胺基)-環己基)胺甲酸第三丁酯之合 成法
將水性NaOH(0.066公克，1.66毫莫耳，在5毫升H2O中)添加至EtOH(10毫升)中的5-(((反式)-4-((第三丁氧基羰基)胺基)環己基)(乙基)胺基)-4'-(2-甲氧基乙氧基)-4-甲基-[1,1'-聯苯基]-3-羧酸甲酯(0.6公克，1.11毫莫耳)之溶液中且在60℃下攪拌1小時。在反應完成之後，在減壓下移除乙醇且將殘餘物使用檸檬酸酸化，使用檸檬酸調整至pH 4。使用在DCM中的10%之甲醇進行萃取。將合併的有機層乾燥，濃縮，得到相應的酸(0.5公克，85.6%之產率)。
接著將上述之酸(0.5公克，0.95毫莫耳)溶解在DMSO(5毫升)中且將3-(胺基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(0.288公克，1.90毫莫耳)及三乙胺(0.096公克，0.950毫莫耳)添加至其中。將反應混合物在室溫下攪拌15分鐘，然後將PyBop(0.741公克，1.42毫莫耳)添加至其中且在室溫下繼續攪拌隔夜。在反應完成之後，將反應團倒入冰中且使用10%之MeOH/DCM進行萃取。將合併的有機層經硫酸鈉乾燥且在減壓下濃縮，獲得粗製材料，接著將其以管柱層析術純化，以供給標題化合物(0.45公克，71.8%之產率)。
步驟4：N-((4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-5-(((反式)-4-(二甲基胺基)-環己基)(乙基)-胺基)-4'-(2-甲氧基乙氧基)-4-甲基-[1,1'-聯苯基]-3-甲醯胺之合成法
將TFA(1毫升)添加至0℃下在DCM(5毫升)中的((反式)-4-((5-(((4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)胺甲醯基)-4'-(2-甲氧基乙氧基)-4-甲基-[1,1'-聯苯]-3-基)(乙基)胺基)環己基)胺甲酸第三丁酯(0.45公克，0.681毫莫耳)之攪拌溶液中且將反應在室溫下攪拌2小時。在完成之後，將反應濃縮至乾燥。接著將殘餘物以Na2CO3(水性)鹼化至pH 8且將水層以DCM中的20%之甲醇萃取。將合併的有機層經Na2SO4乾燥且在減壓下移除溶劑，得到Boc-去保護之化合物(0.3公克，78.7%之產率)。
將甲醛溶液(35-41%之水溶液)(0.056公克，1.87毫莫耳)在0℃下添加至二氯甲烷(3毫升)中的Boc-去保護之化合物(0.3公克，0.535毫莫耳)之攪拌溶液中且攪拌20分鐘。接著添加NaBH(OAc)3(0.28公克，1.33毫莫耳)且在0℃下攪拌2小時。在反應完成時，添加水且以DCM中的20%之甲醇萃取。將合併的有機層經Na2SO4乾燥且在減壓下移除溶劑。將粗製化合物以製備型HPLC純化，以供給標題化合物(0.1公克，31.7%之產率)。
LCMS：589.75(M+1)+；TFA-鹽：1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ 11.47(brs,1H),9.48(brs,1H),8.21(brs,1H),7.57(d,2H,J=8.0Hz),7.40(s,1H),7.23(s,1H),7.03(d,2H,J=8.8Hz),5.87(s,1H),4.29(d,2H,J=4.4Hz),4.14-4.12(m,2H),3.69-3.66(m,2H),3.32(s,3H),3.13(m,4H),2.69-2.68(m,6H),2.24(s,3H),2.21(s,3H),2.11(s, 3H),1.96(m,4H),1.44(m,4H),0.85(t,3H,J=6.8Hz)。
化合物2：
步驟1：5-溴-3-(((反式)-4-((第三丁氧基羰基)-(甲基)-胺基)環己基)(乙基)胺基)-2-甲基苯甲酸甲酯之合成法
將NaH(0.184公克，7.69毫莫耳)在0℃下添加至THF(30毫升)中的5-溴-3-(((反式)-4-((第三丁氧基羰基)胺基)環己基)(乙基)胺基)-2-甲基苯甲酸酯(3公克，6.41毫莫耳，參見例如WO2012142504)之攪拌溶液中且將其在相同的溫度下攪拌20分鐘。接著在0℃下添加甲基 碘(9.10公克，64.10毫莫耳)且將反應在室溫下攪拌隔夜。在完成時，將反應以冰水中止且以二氯甲烷萃取。將合併的有機層以水清洗，乾燥，在減壓下濃縮。將粗製化合物以管柱層析術純化，以供給粗製標題化合物，其以未進一步純化而使用(3公克，97.4%之產率)。
步驟2：3-(((反式)-4-((第三丁氧基羰基)-(甲基)胺基)環己基)(乙基)胺基)-5-(3-羥基丙-1-炔-1-基)-2-甲基苯甲酸甲酯之合成法
將CuI(0.015公克，0.079毫莫耳)、PPh3(0.043公克，0.165毫莫耳)、PdCl2(PPh3)2(0.058公克，0.082毫莫耳)、N,N-二異丙胺(1.08公克，10.78毫莫耳)添加至無水甲苯中的5-溴-3-(((反式)-4-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)環己基)(乙基)胺基)-2-甲基苯甲酸酯(2公克，4.14毫莫耳)之攪拌溶液中且將反應以氬氣洗淨15分鐘。將丙-2-炔-1-醇(0.46公克，8.29毫莫耳)添加至其中，將反應在密封的條件下以80℃加熱5小時。在完成時，將其以水中止且以乙酸乙酯萃取。經有機層經Na2SO4乾燥。將粗製化合物以管柱層析術純化，以供給標題化合物(1.2公克，63.2%之產率)。
步驟3：5-(3-溴丙-1-炔-1-基)-3-(((反式)-4-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)環己基)(乙基)胺基)-2-甲基苯甲酸甲酯之合成法：
將PPh3(1.37公克，5.22毫莫耳)及CBr4(1.7公克，5.10毫莫耳)在0℃下添加至DCM(15毫升)中的3-(((反式)-4-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)環己基)(乙基)胺基)-5-(3-羥基丙-1-炔-1-基)-2-甲基苯甲酸酯(1.2公克，2.62毫莫耳)之攪拌溶液中且將反應在室溫下攪拌4小時。在完成時，將反應以冰水中止且以二氯甲烷萃取。將合併的有機層以水清洗，乾燥，在減壓下濃縮。將粗製材料以管柱層析術純化，以供給標題化合物(0.5公克，38.5%之產率)。
步驟4：3-(((反式)-4-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)環己基)(乙基)胺基)-2-甲基-5-(3-嗎啉基丙-1-炔-1-基)苯甲酸甲酯之合成法
將嗎啉(5當量)添加至DMF中的5-(3-溴丙-1-炔-1-基)-3-(((反式)-4-((第三丁氧基羰基)-(甲基)胺基)環己基)(乙基)胺基)-2-甲基苯甲酸酯(1當量)之攪拌溶液中且將反應在室溫下攪拌12小時。在完成時，將反應以冰水中止且以二氯甲烷萃取。將合併的有機層以水清洗，乾燥，在減壓下濃縮，以供給所欲粗製標題化合物，其以未進一步純化而用於下一步驟中(98.7%之產率)。
步驟5：((反式)-4-((3-(((4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)胺甲醯基)-2-甲基-5-(3-嗎啉基丙-1-炔-1-基)苯基)(乙基)胺基)環己基)(甲基)胺甲酸第三丁酯之合成法
將NaOH(1.5當量)添加至EtOH：H2O(9：1)中的3-(((反式)-4-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)環己基)(乙基)胺基)-2-甲基-5-(3-嗎啉基丙-1-炔-1-基)苯甲酸甲酯(1當量)之溶液中且在60℃下攪拌1小時。在反應完成之後，在減壓下移除乙醇，使用稀釋的HCl酸化到至多pH 6且使用檸檬酸調整至pH 4。使用在DCM中的10%之甲醇進行萃取。將合併的有機層乾燥，濃縮，得到相應的酸。
接著將上述之酸(1當量)溶解在DMSO中且將3-(胺基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(2當量)及三乙胺(1當量)添加至其中。將反應混合物在室溫下攪拌15分鐘，然後將PyBop(1.5當量)添加至其中且在室溫下繼續攪拌隔夜。在反應完成之後，將反應團倒入冰中且使用10%之MeOH/DCM進行萃取。將合併的有機層經Na2SO4乾燥且在減壓下濃縮，獲得粗製材料，接著將其先以水清洗及接著以乙腈清洗而純化，以供給所欲標題化合物(69.4%之產率)。
步驟6：N-((4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-3-(乙基((反式)-4-(甲基胺基)環己基)胺基)-2-甲基-5-(3-嗎啉基丙-1-炔-1-基)苯甲醯胺之合成法
將TFA(3當量)添加至0℃下在DCM中的((反式)-4-((3-(((4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)胺甲醯基)-2-甲基-5-(3-嗎啉基丙-1-炔-1-基)苯基)(乙 基)胺基)環己基)(甲基)胺甲酸第三丁酯(1當量)之攪拌溶液中且將反應在室溫下攪拌2小時。在完成之後，將反應濃縮至乾燥。接著將殘餘物以Na2CO3(水性)鹼化至pH 8且將水層以DCM中的20%之甲醇萃取。將合併的有機層經Na2SO4乾燥且在減壓下移除溶劑，以供給標題化合物(99%之產率)，其以未進一步純化而用於下一反應中。
步驟7：N-((4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-3-(乙基((反式)-4-((2-甲氧基乙基)(甲基)胺基)環己基)胺基)-2-甲基-5-(3-嗎啉基丙-1-炔-1-基)苯甲醯胺之合成法
將2-甲氧基乙醛(10當量)及乙酸(6當量)在0℃下添加至二氯乙烷中的N-((4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-3-(乙基((反式)-4-(甲基胺基)環己基)胺基)-2-甲基-5-(3-嗎啉基丙-1-炔-1-基)苯甲醯胺(1當量)之攪拌溶液中且攪拌20分鐘。接著添加NaBH(OAc)3(3當量)且在0℃下攪拌2小時。在反應完成時，添加水且以DCM中的20%之甲醇萃取。將合併的有機層經Na2SO4乾燥且在減壓下移除溶劑。將粗製化合物以製備型HPLC純化，以供給標的分子(0.1公克，33.6%之產率)。
LCMS：606.65(M+1)+；TFA鹽：1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ 11.50(brs,1H),9.22(brs,1H),8.18(t,1H),7.24(s,1H),7.09(s,1H),5.86(s,1H),4.26-4.25(m,4H),3.66-3.59(m,4H),3.48-3.36(m,3H),3.29-3.17(m,7H),3.04-3.01(m,3H),2.69-2.68(m,4H),2.20(s,3H), 2.19(s,3H),2.11(s,3H),2.00-1.92(m,2H),1.82-1.73(m,3H),1.46(m,4H),0.78(t,3H,J=6.4Hz)。
化合物2之替代的合成流程：
步驟A：4-(丙-2-炔-1-基)嗎啉之合成法：
將Cs2CO3(136.5公克，420毫莫耳)在0℃下添加至丙酮(300毫升)中的炔丙基溴(50公克，420毫莫耳)之攪拌溶液中。接著逐滴添加在丙酮(200毫升)中的嗎啉(36.60公克，420毫莫耳)且將反應在室溫下攪拌16小時。在完成時，將反應團過濾且將濾液在減壓下濃縮，以供給標題化合物(50公克，粗製)。將分離之化合物以未進一步純化而直接用於後續的偶合步驟中。
步驟1：5-溴-3-(乙基((反式)-4-(甲基胺基)環己基)胺基)-2-甲基苯甲酸甲酯之合成法：
將甲醇系HCl(500毫升)添加至0℃下在甲醇(100毫升)中的5-溴-3-(((反式)-4-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)環己基)(乙基)胺基)-2-甲基苯甲酸酯(30公克，62.24毫莫耳)之攪拌溶液中且將反應在室溫下攪拌2小時。在完成之後，將反應濃縮至乾燥。將殘餘物以Na2CO3(水性)鹼化至pH 8且將水層以DCM中的10%之甲醇(200毫升x3)萃取。將合併的有機層經Na2SO4乾燥且在減壓下移除溶劑，以供給成為無色油的標題化合物(25公克，粗製)。將分離之化合物以未進一步純化而用於下一步驟中。
步驟2：5-溴-3-(乙基((反式)-4-((2-甲氧基乙基)(甲基)胺基)環己基)胺基)-2-甲基苯甲酸甲酯之合成法：
將K2CO3(18.06公克，130.8毫莫耳)及KI(6.51公克，39.21毫莫耳)添加至乙腈(250毫升)中的粗製5-溴-3-(乙基((反式)-4-(甲基胺基)環己基)胺基)-2-甲基苯甲酸酯(25公克，65.44毫莫耳)、1-溴-2-甲氧基乙烷(18.19公克，130.8毫莫耳)之攪拌溶液中。將所得反應團在65℃下攪拌16小時。在完成時，將反應混合物以水(300毫升)稀釋且以DCM(500毫升x3)萃取。將合併的有機層以水清洗，經Na2SO4乾燥且在減壓下濃縮。將粗製 化合物以矽膠管柱層析術純化，以供給標題化合物(20公克，69.3%之產率)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ 7.55(s,1H),7.45(s,1H),3.82(s,3H),3.32(m,4H),3.20(s,3H),3.05(q,2H),2.61(m,1H),2.32(s,3H),2.30(m,1H),2.15(s,3H),1.77-1.67(m,4H),1.37-1.31(m,2H),1.24-1.18(m,2H),0.78(t,3H,J=6.8Hz)。
步驟3：3-(乙基((反式)-4-((2-甲氧基乙基)(甲基)胺基)環己基)胺基)-2-甲基-5-(3-嗎啉基丙-1-炔-1-基)苯甲酸甲酯之合成法：
將氬氣起泡通過在DMF(300毫升)中的5-溴-3-(乙基((反式)-4-((2-甲氧基乙基)(甲基)胺基)環己基)胺基)-2-甲基苯甲酸酯(30公克，68.02毫莫耳)、4-(丙-2-炔-1-基)嗎啉(25.51公克，204毫莫耳)及三乙胺(20.61公克，204毫莫耳)之溶液20分鐘。接著添加CuI(3.87公克，20.36毫莫耳)及Pd(PPh3)4(7.85公克，6.79毫莫耳)且使氬氣起泡再通過20分鐘。將反應混合物在105℃下加熱4小時且接著冷卻至室溫。將反應以水(100毫升)中止且將水相以10%之MeOH/DCM(400毫升x3)萃取。將合併的有機萃取物經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。將殘餘物以矽膠管柱層析術純化，以供給標題化合物(21公克，63.7%之產率)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ 7.46(s,1H), 7.32(s,1H),3.82(s,3H),3.62-3.57(m,6H),3.50(s,2H),3.35-3.32(m,2H),3.21(s,3H),3.17(m,1H),3.05(q,2H),2.61-2.58(m,2H),2.38(s,3H),2.33(m,1H),2.18(m,2H),1.77-1.70(m,4H),1.36-1.20(m,4H),0.77(t,3H,J=6.8Hz),3H併入溶劑波峰中。
步驟4：N-((4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-3-(乙基((反式)-4-((2-甲氧基乙基)(甲基)胺基)環己基)胺基)-2-甲基-5-(3-嗎啉基丙-1-炔-1-基)苯甲醯胺之合成法：
將水性NaOH(2.59公克，64.91毫莫耳，在10毫升H2O中)添加至EtOH(100毫升)中的3-(乙基((反式)-4-((2-甲氧基乙基)(甲基)胺基)環己基)胺基)-2-甲基-5-(3-嗎啉基丙-1-炔-1-基)苯甲酸甲酯(21公克，43.29毫莫耳)之溶液中且在60℃下攪拌1小時。在反應完成之後，在減壓下移除乙醇且將殘餘物使用稀釋的HCl酸化，使用檸檬酸酸化達pH 4。使用10%之MeOH/DCM(200毫升x3)進行萃取。將合併的有機層乾燥濃縮，得到相應的酸(15.5公克，76%之產率)。
將3-(胺基甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(10公克，65.80毫莫耳)及三乙胺(23毫升，164.5毫莫耳)添加至DMSO(50毫升)中的上述之酸(15.5公克，32.90毫莫耳)的溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌15分鐘，然後將PyBop(25.66公克，49.34毫莫耳)在0℃下添加至其中 且在室溫下再攪拌隔夜。在完成之後，將反應團倒入冰水(100毫升)中且使用10%之MeOH/DCM(200毫升x3)進行萃取。將合併的有機層經Na2SO4乾燥且在減壓下濃縮。將粗製化合物在以MeOH：DCM溶析之鹼性氧化鋁上以管柱層析術純化，以供給標題化合物(11公克，55.3%之產率)。
LCMS：606.50(M+1)+；1H NMR(MeOD,400MHz)δ 7.23(s,1H),7.09(s,1H),6.11(s,1H),4.46(s,2H),3.74-3.72(m,4H),3.51(s,2H),3.47(t,2H,J=5.6Hz,),3.32(s,3H),3.07(q,2H,J=7.2Hz),2.64-2.63(m,7H),2.38(m,1H),2.37(s,3H),2.27(s,3H),2.26(s,3H),2.25(s,3H),1.89-1.86(m,4H),1.50-1.30(m,4H),0.83(t,3H,J=7.2Hz)。
化合物105： 5-溴-2-甲基-3-[(氧(oxan)-4-基)胺基]苯甲酸甲酯
將二氫-2H-哌喃-4-酮(17.3公克，173毫莫耳)及三乙醯氧基硼氫化鈉(73.6公克，330毫莫耳)添加至CH2Cl2(500毫升)及AcOH(60毫升)中的3-胺基-5-溴-2-甲 基苯甲酸酯(40.2公克，165毫莫耳)之攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌20小時。接著添加飽和水性NaHCO3且將混合物分離。將水層以CH2Cl2萃取且將合併的有機層在真空中濃縮。將殘餘物以乙醚濕磨且收集所得沉澱物，以供給成為白色固體的標題化合物(39.1公克，72%)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ ppm；7.01(s,1H),6.98(s,1H),5.00(d,J=7.6Hz,1H),3.84-3.87(m,2H),3.79(s,3H),3.54-3.56(m,1H),3.43(m,2H),2.14(s,3H),1.81-1.84(m,2H),1.47-1.55(m,2H)。
5-溴-3-[乙基(氧-4-基)胺基]-2-甲基苯甲酸甲酯
將乙醛(24.7公克，476毫莫耳)及三乙醯氧基硼氫化鈉(79.6公克，357毫莫耳)添加至CH2Cl2(400毫升)及AcOH(40毫升)中的5-溴-2-甲基-3-[(氧-4-基)胺基]苯甲酸甲酯(39.1公克，119毫莫耳)之攪拌溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌24小時。接著添加飽和水性NaHCO3且將混合物分離。將水層以CH2Cl2萃取且將合併的有機層在真空中濃縮。將殘餘物以矽膠管柱層析術純化(SiO2，庚烷/EtOAc=3/1)，得到成為黏油的標題化合物 (44.1公克，定量產率)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ ppm；7.62(s,1H),7.52(s,1H),3.80(m,5H),3.31(m,2H),2.97-3.05(m,2H),2.87-2.96(m,1H),2.38(s,3H),1.52-1.61(m,2H),1.37-1.50(m,2H),0.87(t,J=6.8Hz,3H)。
4-((3-(乙基(四氫-2H-哌喃-4-基)胺基)-5-(甲氧基羰基)-4-甲苯基)乙炔基)哌啶-1-羧酸第三丁酯
將三乙胺(2.82毫升，20.2毫莫耳)及碘化銅(I)(0.096公克，0.505毫莫耳)添加至DMF(40毫升)中的5-溴-3-(乙基(四氫-2H-哌喃-4-基)胺基)-2-甲基苯甲酸甲酯(1.80公克，5.05毫莫耳)及4-乙炔基哌啶-1-羧酸第三丁酯(1.80公克，8.59毫莫耳)之溶液中。將反應混合物以起泡氮經15分鐘脫氣。接著引入肆(三苯膦)鈀(0)(0.292公克，0.253毫莫耳)且以起泡氮再經10分鐘脫氣。將反應混合物在80℃下加熱6小時。將反應以飽和NaHCO3中止，以TBME(3×40毫升)萃取，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。將殘餘物以層析術純化(0%至40%之AcOEt/庚烷)，得到標題化合物(2.40公克，98%之產率)。1H-NMR(500MHz)δ ppm；7.65(s,1H),7.28(s,1H),3.97(brd,J=11.3Hz,2H),3.90(s,3H),3.76(m,2H),3.34(dt,J=2.0, 11.7Hz,2H),3.24(ddd,J=3.4,8.8,12.2Hz,2H),3.08(brs,2H),2.98(brs,1H),2.80(dddd,J=3.9,3.9,3.9,3.9Hz,1H),2.52(s,3H),1.87(m,2H),1.60-1.74(m,6H),1.48(s,9H),0.89(t,J=6.8Hz,3H))；MS(ESI)[M+H]+485.4。
5-((1-(第三丁氧基羰基)哌啶-4-基)乙炔基)-3-(乙基(四氫-2H-哌喃-4-基)胺基)-2-甲基苯甲酸
將水(3.0毫升)中的氫氧化鈉(0.565公克，14.1毫莫耳)之溶液在室溫下添加至乙醇(20.0毫升)中的4-((3-(乙基(四氫-2H-哌喃-4-基)胺基)-5-(甲氧基羰基)-4-甲基苯基)乙炔基)哌啶-1-羧酸第三丁酯(2.4公克，4.95毫莫耳)之溶液中。將反應混合物在60℃下加熱6小時。將反應以1M HCl(5毫升)中止且接著將pH以過量檸檬酸溶液調整至5。將混合物濃縮以移除EtOH且將剩餘水相以AcOEt(2×40毫升)萃取。將有機層合併，經Na2SO4乾燥，過濾且濃縮。將殘餘物以層析術純化(10%-100%之AcOEt/庚烷)，得到標題化合物(2.30公克，99%之產率)。1H-NMR(500MHz)δ ppm；7.82(s,1H),7.35(s,1H),3.98(brd,J=11.3Hz,2H),3.77(m,2H),3.35(dt,J=1.5,11.3Hz,2H),3.25(ddd,J=3.4,8.3,12.2Hz,2H),3.11(hrs, 2H),3.00(brs,1H),2.81(dddd,J=3.9,3.9,3.9,3.9Hz,1H),2.60(s,3H),1.88(m,2H),1.60-1.78(m,6H),1.48(s,9H),0.90(t,J=6.8Hz,3H)；MS(ESI)[M+H]+471.4。
4-((3-(((4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)胺甲醯基)-5-(乙基(四氫-2H-哌喃-4-基)胺基)-4-甲基苯基)乙炔基)哌啶-1-羧酸第三丁酯
將三乙胺(0.90毫升，6.44毫莫耳)及氯化(4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲銨(methanaminium)(0.405公克，2.15毫莫耳)添加至室溫下在DMSO(5.8毫升)中的5-((1-(第三丁氧基羰基)哌啶-4-基)乙炔基)-3-(乙基(四氫-2H-哌喃-4-基)胺基)-2-甲基苯甲酸(1.06公克，2.25毫莫耳)之溶液中。澄清溶液變得不均勻。接著添加HOBT(0.493公克，3.22毫莫耳)及EDC(0.617公克，3.22毫莫耳)且將所得反應混合物在室溫下攪拌隔夜。將反應以水(80毫升)中止且將漿液在室溫下攪拌1小時。將漿液過濾且將濾餅以水(2×20毫升)清洗。將收集之固體在真空下乾燥，得到標題化合物(1.27公克，98%之產率)。1H-NMR(500MHz,CD3OD)δ ppm； 7.22(s,1H),7.08(d,J=1.0Hz 1H),6.11(s,1H),4.45(s,2H),3.92(brd,J=10.8Hz,2H),3.78(dd,J=4.4,5.4Hz,1H),3.75(dd,J=4.4,5.4Hz,1H),3.36(t,J=11.7Hz,2H),3.21(brt,J=8.3Hz,2H),3.07(q,J=7.3Hz,2H),3.01(dddd,J=3.9,3.9,11.3,11.3Hz,1H),2.84(dddd,J=3.4,3.4.3.9,3.9Hz,1H),2.38(s,3H),2.28(s,3H),2.25(s,3H),1.88(m,2H),1.70((brd,J=12.2Hz,2H),1.60(m,4H),1.47(s,9H),0.87(t,J=7.3Hz,3H)；MS(ESI)[M+H]+605.6。
N-((4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-3-(乙基(四氫-2H-哌喃-4-基)胺基)-2-甲基-5-(哌啶-4-基乙炔基)苯甲醯胺
將1,4-二噁烷中的4M HCl(3毫升，12.0毫莫耳)在20℃下添加至DCM(3毫升)中的4-((3-(((4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)胺甲醯基)-5-(乙基(四氫-2H-哌喃-4-基)胺基)-4-甲基苯基)乙炔基)哌啶-1-羧酸第三丁酯(250毫克，0.413毫莫耳)之溶液中。將混合物在20℃下攪拌1小時。LCMS顯示反應完成。將反應混合物直接濃縮，將殘餘物溶解在DCM中且接著以飽和 NaHCO3/食鹽水中和。將有機層乾燥(Na2SO4)且過濾。並且將濾液濃縮。以未進一步純化的殘餘物用於烷基化反應(209毫克，100%)。1H-NMR(500MHz,CD3OD)δ ppm 7.21(brs,1H),7.07(brs,1H),6.11(s,1H),4.46(s,2H),3.95-3.89(m,2H),3.39-3.34(m,2H),3.08(q,J=7.0Hz,2H),3.06-2.98(m,3H),2.79-2.72(m,1H),2.72-2.65(m,2H),2.38(s,3H),2.28(s,3H),2.25(s,3H),1.94-1.88(m,2H),1.73-1.68(m,2H),1.68-1.56(m,4H),0.85(t,J=7.0Hz,3H)；MS(ESI)[M+H]+505.5。
N-((4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-3-(乙基(四氫-2H-哌喃-4-基)胺基)-2-甲基-5-((1-甲基哌啶-4-基)乙炔基)苯甲醯胺
將H2O中的35%之甲醛(0.155毫升，1.98毫莫耳)在0℃下添加至甲醇(5毫升)中的N-((4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-3-(乙基(四氫-2H-哌喃-4-基)胺基)-2-甲基-5-(哌啶-4-基乙炔基)苯甲醯胺(100毫克，0.198毫莫耳)之溶液中。在0℃下攪拌10分鐘之後，添加氰基硼氫化鈉(24.9毫克，0.396毫莫耳)。將所得混 合物在0℃下攪拌1小時。LCMS顯示反應完成。將反應以飽和NaHCO3/食鹽水中止且以EtAOc/庚烷萃取。將有機層乾燥(Na2SO4)，過濾且濃縮。將殘餘物以層析術純化(10公克管柱，MeOH/DCM=1：9，及接著MeOH/在MeOH中的7M NH3/DCM=1：1：8)，以供給標題化合物(96.0毫克，93%)。1H-NMR(500MHz,CD3OD)δ ppm 7.22(brs,1H),7.08(brs,1H),6.10(s,1H),4.46(s,2H),3.94-3.87(m,2H),3.35-3.30(m,2H),3.07(q,J=7.0Hz,2H),3.04-2.97(m,1H),2.79-2.71(m,2H),2.67-2.58(m,1H),2.38(s,3H),2.28(s,3H),2.28(s,3H),2.25(s,3H),2.28-2.21(m,2H),1.97-1.91(m,2H),1.78-1.67(m,4H),1.64-1.54(m,2H),0.85(t,J=7.0Hz,3H)；MS(ESI)[M+H]+519.4。
實施例2：生物檢定規程及通用方法 野生型及突變體PRC2酵素檢定模式
一般材料。S-腺苷甲硫胺酸(SAM)、S-腺苷高半胱胺酸(SAH)、二羥乙甘胺酸、KCl、Tween20、二甲亞碸(DMSO)及牛皮膚明膠(BSG)係以可能的最高純度等級購自Sigma-Aldrich。二硫蘇糖醇(DTT)係購自EMD。具有80 Ci/毫莫耳之特異活性的3H-SAM係購自American Radiolabeled Chemicals。384-槽孔之鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)Flashplate係購自PerkinElmer。
受質。含有未經改質之離胺酸27(H3K27me0) 或二甲基化之離胺酸27(H3K27me2)的人類組織蛋白H3殘基21-44之肽代表物係由21st Century Biochemicals以C端G(K-生物素)連結子-親和性標誌模體(motif)及C-端醯胺罩合成。肽係經高性能液相層析術(HPLC)純化至大於95%之純度且以液相層析質譜法(LC-MS)確定。序列係如下文所列示。
H3K27me0：ATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGGK(生物素)-醯胺(SEQ ID NO：101)
H3K27me2：ATKAARK(me2)SAPATGGVKKPHRYRPGGK(生物素)-醯胺(SEQ ID NO：102)
雞紅血球寡核小體(oligonucleosome)係根據確立之程序自雞血純化。
重組體PRC2複合物。將人類PRC2複合物使用桿狀病毒表現系統純化為共同表現在秋夜盜蛾(Spodoptera frugiperda)(sf9)細胞中的4-組份酵素複合物(4-component enzyme complexes)。所表現之次單元為野生型EZH2(NM_004456)或從野生型EZH2構造EED(NM_003797)、Suz12(NM_015355)和RbAp48(NM_005610)所產生之EZH2 Y641F、N、H、S或C突變體。EED次單元含有N端FLAG標誌，其被用於純化來自sf9細胞溶解物的整個4-組份複合物。複合物純度符合或超過95%，如以SDS-PAGE及Agilent Bioanalyzer分析所測定。酵素貯液濃縮物的濃度(通常為0.3-1.0毫克/毫升)係使用Bradford檢定法以相對於牛血清白蛋白(BSA)標 準物來測定。
以肽受質進行的PRC2酵素檢定法之通用程序。檢定法係在使用當日製備之由20mM二羥乙甘胺酸(pH=7.6)、0.5mM DTT、0.005%之BSG及0.002%之Tween20所組成之緩衝液中進行。將在100%之DMSO中的化合物(1微升)使用配備有384-道吸量管頭之Platemate 2 X 3(Thermo)點在聚丙烯384-槽孔V-型底盤(Greiner)中。將DMSO(1微升)添加至第11、12、23、24行第A-H列中，作為最大信號對照組，且將SAH(已知的產物及PRC2抑制劑)(1微升)添加至第11、12、23、24行第I-P列中，作為最小信號對照組。以Multidrop Combi(Thermo)添加含有野生型PRC2酵素及H3K27me0肽或Y641突變體酵素及H3K27me2肽中之任一者的混合液(cocktail)(40微升)。容許化合物與PRC2在25℃下培育30分鐘，接著添加含有非放射性-與3H-SAM之混合物的混合液(10微升)，以引發反應(最終體積=51微升)。在所有的例子中，最終濃度係如下：野生型或突變體PRC2酵素為4nM，在最小信號對照槽孔中的SAH為1mM，及DMSO濃度為1%。其餘組份的最終濃度係如下表2中所標示。檢定係藉由添加非放射性SAM(10微升)至600μM之最終濃度而停止，該添加使3H-SAM稀釋至無法再偵測出其併入肽受質的程度。接著將384-槽孔聚丙烯盤中的50微升反應轉移至384-槽孔Flashplate，且容許生物素化之肽與鏈黴抗生素蛋白表面經至少1小時結合，然後在 Biotek ELx405洗盤機(plate washer)中以0.1%之Tween20清洗三次。接著將盤在PerkinElmer TopCount盤讀值機中進行讀取，以測量與Flashplate表面結合的經3H-標記之肽的量，以每分鐘衰變率(dpm)測量，或另一選擇地稱為每分鐘計數(cpm)。
以寡核小體受質進行的野生型PRC2酵素檢定法之通用步驟。檢定法係在使用當日製備之由20mM二羥乙甘胺酸(pH=7.6)、0.5mM DTT、0.005%之BSG、100mM KCl及0.002%之Tween20所組成之緩衝液中進行。將在100%之DMSO中的化合物(1微升)使用配備有384-道吸量管頭之Platemate 2 X 3(Thermo)點在聚丙烯384-槽孔V-型底盤(Greiner)中。將DMSO(1微升)添加至第11、12、23、24行第A-H列中，作為最大信號對照組，且將SAH(已知的產物及PRC2抑制劑)(1微升)添加至第11、12、23、24行第I-P列中，作為最小信號對照組。以Multidrop Combi(Thermo)添加含有野生型PRC2酵素及雞紅血球寡核小體的混合液(40微升)。容許化合物與PRC2 在25℃下培育30分鐘，接著添加含有非放射性-與3H-SAM之混合物的混合液(10微升)，以引發反應(最終體積=51微升)。最終濃度係如下：野生型PRC2酵素為4nM，非放射性SAM為430mM，3H-SAM為120nM，雞紅血球寡核小體為120nM，在最小信號對照槽孔中的SAH為1mM，及DMSO濃度為1%。檢定係藉由添加非放射性SAM(10微升)至600μM之最終濃度而停止，該添加使3H-SAM稀釋至無法再偵測出其併入雞紅血球寡核小體受質的程度。接著將384-槽孔聚丙烯盤中的50微升反應轉移至384-槽孔Flashplate，且將雞紅血球核小體固定至盤的表面，接著將其在Biotek ELx405洗盤機中以0.1%之Tween20清洗三次。接著將盤在PerkinElmer TopCount盤讀值機中進行讀取，以測量與Flashplate表面結合的經3H-標記之雞紅血球寡核小體的量，以每分鐘衰變率(dpm)測量，或另一選擇地稱為每分鐘計數(cpm)。
抑制%之計算
其中dpm=每分鐘衰變率，cmpd=在檢定槽孔中的信號，及min和max為各自的最小和最大信號對照組。
四-參數IC50擬合
其中top及bottom通常被容許為浮動值，但在3-參數擬合中可分別固定在100或0。Hill係數通常被容許為浮動值，但在3-參數擬合中亦可固定在1。Y係抑制%，及X為化合物濃度。
以肽受質(例如，EZH2野生型和Y641F)進行的PRC2酵素檢定之IC50值呈示於以下表3中。
WSU-DLCL2甲基化檢定法
WSU-DLCL2懸浮細胞係購自DSMZ(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,Braunschweig,Germany)。RPMI/Glutamax培養基、青黴素-鏈黴素、經加熱去活化之胎牛血清及D-PBS係購自Life Technologies,Grand Island,NY,USA。萃取緩衝液及中和緩衝液(5X)係購自Active Motif,Carlsbad,CA,USA。兔子抗組織蛋白H3抗體係購自Abcam,Cambridge,MA,USA。兔子抗H3K27me3及經HRP共軛之抗兔子IgG係購自Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA。TMB〝超敏感性(Super Sensitive)〞受質係源自於BioFX Laboratories,Owings Mills,MD,USA。無IgG之牛血清白蛋白係購自Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,USA。具有Tween之PBS(10X PBST)係購自KPL, Gaithersburg,MD,USA。硫酸係購自Ricca Chemical,Arlington,TX,USA。Immulon ELISA盤係購自Thermo,Rochester,NY,USA。V-型底細胞培養盤係購自Corning Inc.,Corning,NY,USA。V-型底聚丙烯盤係購自Greiner Bio-One,Monroe,NC,USA。
將WSU-DLCL2懸浮細胞維持在生長培養基(以10%v/v之經加熱去活化之胎牛血清及100單元/毫升之青黴素-鏈黴素補充之RPMI 1640)中且在37℃，5%之CO2下培養。在檢定條件下，將細胞在檢定培養基(以20%v/v之經加熱去活化之胎牛血清及100單元/毫升之青黴素-鏈黴素補充之RPMI 1640)中，在37℃，5%之CO2下於盤震盪器上培育。
將WSU-DLCL2細胞在檢定培養基中以每毫升50,000個細胞之濃度接種在每槽孔200微升的96-槽孔V-型底細胞培養盤中。將來自96槽孔來源盤的化合物(1微升)直接添加至V-型底細胞盤中。將盤在滴定盤(titer-plate)震盪器上在37℃，5%之CO2下培育96小時。在培育4天之後，將盤以241 x g旋轉5分鐘且將培養基從細胞盤的各槽孔小心地吸出而不擾動細胞沉澱物。將細胞沉澱物再懸浮於200微升DPBS中且將盤再以241 xg旋轉5分鐘。吸出上清液且在每槽孔添加冷的(4℃)萃取緩衝液(100微升)。將盤在4℃下於迴轉式振盪器上培育2小時。將盤以3427 x g旋轉10分鐘。將上清液(每槽孔80微升)轉移至96槽孔V-型底聚丙烯盤的其各自的槽孔中。 將中和緩衝液5X(每槽孔20微升)添加至含有上清液的V-型底聚丙烯盤中。將含有粗製組織蛋白製品(CHP)的V-型底聚丙烯盤在迴轉式振盪器上培育5分鐘。將粗製組織蛋白製品添加(每槽孔2微升)至雙份含有100微升塗佈緩衝液(1X PBS+BSA 0.05%w/v)96槽孔ELISA盤的各自槽孔中。將盤密封且在4℃下培育隔夜。在隔天，將盤以每槽孔300微升1X PBST清洗3次。將槽孔以每槽孔300微升ELISA稀釋劑((PBS(1X)BSA(2%w/v))及Tween20(0.05%v/v))隔絕2小時。將盤以1X PBST洗洗3次。將組織蛋白H3偵測盤的每槽孔添加100微升在ELISA稀釋劑中以1：10,000稀釋之抗組織蛋白-H3抗體(Abcam,ab1791)。將H3K27三甲基化偵測盤的每槽孔添加100微升在ELISA稀釋劑中以1：2000稀釋之抗H3K27me3。將盤在室溫下培育90分鐘。將盤以每槽孔300微升1X PBST清洗3次。將用於組織蛋白H3偵測的每槽孔添加100微升在ELISA稀釋劑中以1：6000稀釋之與HRP共軛之抗兔子IgG抗體。將用於H3K27me3偵測的每槽孔添加100微升在ELISA稀釋劑中以1：4000稀釋之與HRP共軛之抗兔子IgG抗體。將盤在室溫下培育90分鐘。將盤以每槽孔300微升1X PBST清洗4次。每槽孔添加100微升TMB受質。將組織蛋白H3盤在室溫下培育5分鐘。將H3K27me3盤在室溫下培育10分鐘。將反應以1N硫酸(每槽孔100微升)停止。在450奈米下讀取各盤的吸光度。
首先，各槽孔的比值係由：測 定。
各盤包括8個僅以DMSO處理之對照槽孔(最小抑制)以及8個最大抑制之對照槽孔(背景值槽孔)。
計算各對照類型的比值平均且用於測定盤中各檢驗槽孔的抑制百分比。將檢驗化合物以25μM開始在DMSO中連續稀釋3倍，總計10個檢驗濃度。每一化合物濃度使用雙份槽孔來測定抑制百分比且產生IC50曲線。將此檢定的IC50值呈示於以下表3中。
細胞增生分析
WSU-DLCL2懸浮細胞係購自DSMZ(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,Braunschweig,Germany)。RPMI/Glutamax培養基、青黴素-鏈黴素、經加熱去活化之胎牛血清係購自Life Technologies,Grand Island,NY,USA。V-型底聚丙烯384-槽孔盤係購自Greiner Bio-One,Monroe,NC,USA。細胞培養384-槽孔白色不透明盤係購自Perkin Elmer,Waltham,MA,USA。Cell-Titer Glo®係購自Promega Corporation,Madison,WI,USA。SpectraMax M5盤讀值機係購自Molecular Devices LLC,Sunnyvale,CA,USA。
將WSU-DLCL2懸浮細胞維持在生長培養基(以10%v/v之經加熱去活化之胎牛血清補充之RPMI 1640)中且在37℃，5%之CO2下培養。在檢定條件下，將細胞在檢定培養基(以20%v/v之經加熱去活化之胎牛血清及100單元/毫升之青黴素-鏈黴素補充之RPMI 1640)中，在37℃，5%之CO2下培育。
關於評定化合物對WSU-DLCL2細胞株增生之效果，將對數生長細胞以1250個細胞/毫升之密度鋪置於384-槽孔白色不透明盤中，最終體積為50微升檢定培養基。化合物來源盤係藉由以10mM開始在DMSO中進行三份9點的連續3倍稀釋而製得(在檢定中，最後的化合物最高濃度為20μM及DMSO為0.2%)。將來自化合物貯液盤的100毫微升等分液添加至細胞盤中的其各自的槽孔中。100%之抑制對照組係由經最終濃度200nM之星型孢素(staurosporine)處理之細胞所組成，及0%之抑制對照組係由經DMSO處理之細胞所組成。在添加化合物之後，將檢定盤在37℃，5%之CO2，>90%之相對濕度下培育6天。細胞存活率係藉由將35微升Cell Titer Glo®試劑添加至細胞盤中以量化在細胞培養物中存在的ATP而測得。在SpectraMax M5中讀取發光亮度。50%之抑制細胞存活率的濃度係使用標準化之劑量反應曲線的4-參數擬合來測定。將此檢定的IC50值亦呈示於以下表3中。該等化 合物的質譜數據亦列示於以下表3中。
實施例3：最低細胞毒性濃度(LCC)之導衍
經完全確立的是細胞增生係通過細胞分裂而繼續進行，相對於分裂前的細胞數，該分裂導致分裂後的細胞數倍增。在固定的環境條件組下(例如，pH、離子強度、溫度、細胞密度、培養基含有的蛋白質和生長因子及類似者)，細胞將根據以下的方程式以連續倍增(即分裂)方式增生，惟可取得足夠的營養素及其他必要因子。
其中Nt為觀察期開始之後的一時間點(t)之細胞數，N0為觀察期開始時之細胞數，t為觀察期開始之後的時間，及tD為細胞倍增所必要之時間間隔，亦稱為倍增時間。方程式A.1可利用等式0.693=ln(2)而轉換成更方便以 e為底數之指數方程式的形式。
細胞增生的速率常數(kp)與倍增時間係如下式而成相反的關係。
方程式A.2與A.3的合併得到，
因此，根據方程式A.4，預期細胞數在細胞生長的初期期間隨時間呈指數增加，稱為對數生長期。如方程式A.4之指數方程式可藉由各邊取自然對數而線性化。
ln(N t )=ln(N 0)+k p t (A.5)
因此，預期ln(Nt)以時間為函數的標繪圖得到上升直線，具有等於kp之斜率及等於ln(N0)之y-截距。
環境條件的改變可導致細胞增生速率的改變，其可隨增生速率常數kp的改變而量化。在可導致增生速率改變的條件之中，有一種是在觀察期開始時(亦即在t=0時)將抗增生性化合物引入系統中。當抗增生性化合物對細胞增生產生立即性衝擊時，則預期ln(Nt)以時間為函數的標繪圖在所有的化合物濃度下持續呈直線，kp值係隨化合物濃度增加而遞減。
取決於抗增生作用的機制基礎而定，一些化合物可能不立即造成增生速率的改變。反而在化合物衝擊之前先有一段潛伏期。在此等例子中，ln(Nt)以時間為函數的標繪圖將顯現雙相性(biphasic)，且可確認化合物開始衝擊的時間點為相之間的分界點。無關於化合物對增生的衝擊是否為立即性或在潛伏期之後開始，在各化合物濃度的增生速率常數最好以ln(Nt)相對於以化合物開始衝擊至實驗的觀察期結束之時間點所得的時間曲線之斜率來定義。
施予生長細胞的化合物可藉由兩種通用方式中之一影響所觀察之增生：藉由抑制進一步的細胞分裂(細胞停滯(cytostasis))或藉由殺死細胞(細胞毒性)。若化合物為細胞停滯性，則增加化合物濃度將降低kp值，直到沒有進一步的細胞分裂為止。在此時，細胞生長速率及因此的kp值為零。另一方面，若化合物為細胞毒性，則 kp值係由兩個速率常數所構成：在化合物的存在下細胞持續生長的速率常數(kg)及化合物殺死細胞的速率常數(kd)。濃度固定之化合物的增生總速率常數因此為該等相對速率常數的絕對值之間的差異值。
k p =|k g |-|k d | (A.6)
在細胞生長速率超過細胞殺死速率的化合物濃度下，kp值為正值(即kp>0)。在細胞生長速率小於細胞殺死速率的化合物濃度下，kp值為負值(即kp<0)，且細胞數將隨時間減少，表示穩健的細胞毒性。當kg剛好等於kd時，則總增生速率常數kp值為零。吾等因此可定義最低的細胞毒性濃度(LCC)為導致kp值等於零的化合物濃度，因為任何大於此濃度的濃度將導致明顯可觀察的細胞毒性。注意：低於LCC的濃度有可能發生殺死細胞，但速率小於剩餘細胞的增生速率。處理在此不意欲界定化合物作用的生物細部。確切地說，在此的目的僅界定客觀量化細胞殺死速率超過新細胞生長的化合物濃度之實際參數。事實上，LCC代表分界點或臨界濃度，超過此濃度則觀察到明顯的細胞毒性，而非細胞毒性濃度本身。關於此點，LCC可被視為類似於其他的物理分界點度量，諸如用於界定脂質、清潔劑或其他界面活性劑物種的濃度之臨界微胞濃度(CMC)，超過此濃度則使所有分子併入微胞結構 中。
傳統上，抗增生性化合物對細胞生長的衝擊最常以IC50值量化，將其定義為細胞增生速率減少至沒有化合物的存在下(亦即媒體或溶劑對照樣品)所觀察的細胞增生速率的一半之化合物濃度。然而，IC50不能使研究員區分出細胞停滯性及細胞毒性化合物。相反地，LCC能輕易地使化合物互相區分且進一步量化發生轉變成穩健的細胞毒性表現之濃度。
若將觀察時間窗限制在開始衝擊與實驗結束之間，當ln(Nt)以時間為函數標繪圖時，則數據通常與線性方程式完全擬合(參見上文)。由此類型的擬合可測定在各檢驗之化合物濃度的kp值。kp值以化合物濃度([I])為函數的重新標繪圖具有下降的等溫線形式，以[I]=0具有最大值kmax(以媒劑或溶劑對照樣品所界定)及以無限大的化合物濃度具有最小值kmin。
其中Imid為得到在kmax值與kmin值之間的kp值之化合物濃度(注意Imid值與IC50不同，除了完全且純粹的細胞停滯性化合物以外)。因此，重新標繪的數據與方程式A.7擬合以提供kmax、kmin及Imid的評估值。若化合物為 細胞停滯性(如本文所定義)，則kmin值不可以小於零。細胞毒性化合物的kmin小於零且kmin的絕對值與化合物殺死細胞的有效性有直接的關係。
自方程式A.7導衍之擬合值亦可用於測定LCC值。當[I]=LCC時，則按定義之kp=0。因此，在該等條件下，方程式A.7變成。
方程式A.8的代數重排得到用於LCC之方程式。
此分析係以非線性曲線擬合軟體簡單地執行且可在整個藥物發現及發展過程期間應用於化合物活性的細胞檢定期間。LCC可以此方式提供評定化合物SAR(結構-活性關係)的高價值度量。
實施例4：活體內檢定法 小鼠
雌性Fox Chase SCID®小鼠(CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl,Charles River Laboratories)或無胸腺裸鼠(Crl：NU(Ncr)-Foxnlnu,Charles River Laboratories)為8週齡且在研究第1日(D1)具有16.0-21.1公克之體重(BW)範圍。動物任意進食水(逆滲透1ppm Cl)及由18.0%之粗製蛋白、5.0%之粗製脂肪及5.0%之粗製纖維所組成的經NIH 31改質且照射之Lab Diet®。將小鼠飼養於靜置的微隔離器內經照射之Enrich-o’cobsTM墊料上，處於12小時光照周期、20-22℃(68-72℉)及40-60%之濕度中。所有程序皆符合有關監禁、畜牧、手術程序、飼料與飲水調控及獸醫照護的Guide for Care and Use of Laboratory Animals之建議。
腫瘤細胞培養物
人類淋巴瘤細胞株係從不同來源獲得(ATCC、DSMZ)，例如從DSMZ獲得的Karpas-422。將細胞株以懸浮培養物維持在含有100單元/毫升之青黴素G鈉鹽、100公克/毫升之鏈黴素、1%之HEPES及1%之L-麩醯胺酸的RPMI-1640培養基中。以20%之胎牛血清補充培養基。將細胞培養在組織培養瓶中，其係置於37℃，5%之CO2與95%之空氣的氣體中之濕化培育箱中。
活體內腫瘤植入
人類淋巴瘤細胞株(例如，Karpas-422細胞)係在對數生長中期時獲取且再懸浮在RPMI-1640基底培養基及50%之MatrigelTM(BD Biosciences)(RPMI：Matrigel=1：1)中。每隻小鼠係在右脅處經皮下領受1×107個細胞(0.2毫升細胞懸浮)。以卡規二維測量腫瘤，以監測平均體積接近所欲80-120立方毫米範圍之腫瘤生長。以立方毫米計之腫瘤大小係從下式計算：
其中w=腫瘤寬度及l=腫瘤長度(以毫米計)。腫瘤重量可以假設1毫克相當於1立方毫米之腫瘤體積來估計。在10-30天之後，將具有145-150立方毫米之腫瘤的小鼠分出為具有147立方毫米之平均腫瘤體積的治療組別。
檢驗物
將檢驗化合物貯存在室溫下且避光。在每次治療當天，新鮮的化合物調配物係藉由將粉末懸浮在去離子水中的0.5%之羧甲基纖維素鈉(NaCMC)及0.1%之Tween® 80中而製得。使用媒劑(在去離子水中的0.5%之NaCMC及0.1%之Tween® 80)以相同的時程治療對照組。調配物在投予前以避光貯存在4℃。在此實驗中所述及且檢驗的化合物具有在該段落中所提到其特定的鹽形式，除非另有其他指定。
治療計劃
將小鼠以從62.5-500毫克/公斤之化合物劑量範圍處理，以BID(每天二次，每12小時一次)時程每天經口胃管灌食不同的量。每一劑量係以0.2毫升/20公克小鼠(10毫升/公斤)之體積輸送且以個別小鼠最後記錄的體重進行調整。最長的治療期為28天。
平均腫瘤體積(MTV)及腫瘤生長抑制(TGI)分析
治療效力係在最後治療日測定。在最後一天測定各組別可評估之動物數量n的平均腫瘤體積MTV(n)。腫瘤生長抑制百分比(%TGI)可以許多方式定義。首先，將指定之對照組的MTV(n)與藥物治療組的MTV(n)之間的差異以對照組的MTV(n)之百分比表示：
另一計算%TGI之方式係將從第1天至第n天的腫瘤大小改變量納入考慮，其中n為最後治療日。
△MTV 對照組=MTV(n)對照組-MTV(1)對照組
△MTV 治療組=MTV(n)治療組-MTV(1)治療組
毒性
在第1-5天測量動物每天的體重且接著每週測量兩次，直至研究結束為止。經常以任何反作用、處理相關之副作用的明顯徵象檢驗老鼠，且予以記錄。將可接受之毒性的最大耐受劑量(MTD)定義為檢驗期間少於20%之組別平均BW損失及不超過10%之由於TR死亡的致死率。若以臨床徵象及/或驗屍而證明死亡可歸因於治療副作用，或由於給藥期間的不明原因死亡，則將死亡分類為TR。若有死亡與治療副作用無關的證明，則將死亡分類為NTR。給藥間隔期間的NTR死亡通常會分類為NTRa(由於意外或人為錯誤)或NTRm(由於驗屍確認的經入侵及/或轉移之腫瘤散播)。當組別表現不支持TR分類且無法以驗屍排除給藥錯誤時，則可將給藥期間因不明原因死亡的經口治療之動物分類為NTRu。
取樣
在研究期間的第7或28天，以預指定的方式取得小鼠檢體，以評定在腫瘤中的目標抑制作用。腫瘤係在無核糖核酸酶(RNAse)的條件下從指定之小鼠獲取且切為二等分。將來自各動物的冷凍腫瘤組織在液態N2中急速冷凍且以研缽和研杵粉碎。
統計及圖形分析
所有的統計及圖形分析皆以Prism 3.03(GraphPad)的Windows版本進行。為了檢驗在整個經過的治療時間內在對照組與治療組之間的統計顯著性，使用重複測量的ANOVA檢驗，接著以Dunnets之檢驗後多重比較(multiple comparison post test)或雙因子ANOVA檢驗(2 way ANOVA test)。在P>0.05時，Prism報告結果為不具有顯著性(ns)，在0.01<P<0.05時，則具有顯著性(以〝*〞標註)，在0.001<P<0.01時，則非常具有顯著性(〝**〞標註)，在P<0.001時，則極具有顯著性(以〝***〞標註)。
組織蛋白萃取
將60-90毫克腫瘤組織在1.5毫升細胞核萃取緩衝液(10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、25mM KCl、1%之Triton X-100、8.6%之蔗糖，加上Roche蛋白酶抑制劑錠1836145)中均質化且在冰上培育5分鐘，以進行組織蛋白的分離。細胞核係在4℃下以600g離心5分鐘而收集且在PBS中清洗一次。移除上清液，以0.4N冷硫酸萃取組織蛋白一小時，以每15分鐘渦旋。萃取物係在4℃下以10000g離心10分鐘而澄清且轉移至含有10x體積之冰冷丙酮的乾淨微量離心管。組織蛋白係在-20℃下經2小時-隔夜沉澱，以10000g離心10分鐘而沉澱，且再懸浮於水中。
ELISA
組織蛋白係在塗佈緩衝液(PBS+0.05%之BSA)中以相等濃度製備，得到0.5毫微克/微升之樣品，且將100微升樣品或標準品複製地添加至2個96-槽孔ELISA盤中(Thermo Labsystems,Immulon 4HBX #3885)。將盤密封且在4℃下培育隔夜。在隔天，將盤在Bio Tek洗盤機上以300微升/槽孔之PBST(PBS+0.05%之Tween 20；10X PBST，KPL #51-14-02)清洗3次。將盤以300微升/槽孔之稀釋劑(PBS+2%BSA+0.05%之Tween 20)隔絕，在室溫下培育2小時且以PBST清洗3次。所有的抗體皆以稀釋劑稀釋。將100微升/槽孔之抗H3K27me3(CST #9733，50%之甘油貯液，以1：1,000)或抗全H3(Abcam ab1791，50%之甘油，以1：10,000)添加至各盤中。將盤在室溫下培育90分鐘且以PBST清洗3次。將100微升/槽孔之抗Rb-IgG-HRP(Cell Signaling Technology,7074)以1：2,000添加至H3K27Me3盤中及以1：6,000添加至H3盤中，且在室溫下培育90分鐘。將盤以PBST清洗4次。添加100微升/槽孔之TMB受質(BioFx Laboratories,#TMBS)且將盤在暗處於室溫下培育5分鐘，以進行偵測。反應係以100微升/槽孔之1N H2SO4停止。在SpectaMax M5微量盤讀值機上讀取在450奈米的吸光度。
7天的PD研究
為了檢驗化合物是否可調節在活體腫瘤中的 H3K27me3組織蛋白標記物，將帶有Karpas-422異體移植腫瘤之小鼠以62.5、83.3、125、166.7、250、333.3和500毫克/公斤之化合物經BID或媒劑(BID時程)治療7天。每組有5隻動物。將動物在最後的劑量之後3小時安樂死且將腫瘤以冷凍狀態保存，如上文所述。在萃取組織蛋白之後，將樣品應用於使用直接對抗組織蛋白H3K27(H3K27me3)或總組織蛋白H3之三甲基化狀態之ELISA檢定法。建基於該等數據來計算整體甲基化對總H3K27之比值。以ELISA所測量之所有組別的平均整體甲基化比值表明與媒劑相比之目標抑制範圍。將此實驗的設計顯示於表4A中。
實施例5：在Karpas-422異體移植模式中以增加劑量的效力研究
為了檢驗化合物是否能在活體內誘發抗腫瘤效果，將帶有Karpas-422異體移植腫瘤之小鼠以例如62.5、125、250或500毫克/公斤之化合物經BID治療28天。每組有10隻小鼠用於實驗之效力臂(efficacy arm)。測量媒劑及檢驗化合物治療組經28天治療期之腫瘤生長。
組織蛋白係在第28天的效力分群研究結束時從所收集之腫瘤萃取而來(在兩個分群的最後劑量之後3小時)。以劑量依賴之方式之治療來評定H3K27me3甲基標記物之調節。
將此實驗的設計顯示於表4B中。
TV係從卡尺測量值以長橢球體之體積公式 (LxW2)/2計算而來，其中L及W為各自的正交長度及寬度測量值(毫米)。
數據係以平均±標準偏差(SD)表示。在經媒劑治療與經化合物治療之組別之間的TV差異係以重複的變異測量分析(ANOVA)，接著以Dunnett-型多重比較檢驗來分析。P值<0.05(雙邊(two sided))被認為具有統計顯著性。使用Prism5軟體套裝5.04版(GraphPad Software,Inc.,CA,USA)進行統計分析。
上述研究顯示化合物1及化合物A二者在Karpas-422異體移植模式中展現腫瘤停滯和消退且完全耐受。參見例如圖1和2。再者，將來自上述研究的化合物1或化合物A之藥物動力學和藥效動力學性質例證於圖3-8中。圖3為顯示化合物1在治療後第7天或第28天於腫瘤中之濃度或化合物A在治療後第7天於腫瘤中之濃度的圖形。在此圖中，〝A〞至〝G〞分別代表以62.5、83.3、125、166.7、250、333.3和500毫克/公斤之劑量的化合物1投予後7天；〝H〞及〝I〞分別代表以125和250毫克/公斤之劑量的化合物A投予後7天；及〝J〞至〝L〞分別代表以62.5、125和250毫克/公斤之劑量的化合物1投予後28天。注意：關於在第28天的樣品，來自以250毫克/公斤之化合物A治療之組別及以500毫克/公斤之化合物1治療之組別的腫瘤對分析而言太小；以250毫克/公斤之化合物1及125毫克/公斤之化合物1治療之組別分別以10個中僅1個及在10個中有5個大到足以分 析。圖4為顯示化合物1或化合物A在治療後第7天或第28天於血漿中之濃度的圖形。上虛線表明經血漿蛋白結合(PPB)校正之化合物A的LCC及下虛線表明經PPB校正之化合物1的LCC。圖5為顯示來自以化合物1或化合物A治療7天之小鼠的KARPAS-422腫瘤中之整體H3K27me3甲基化的圖形。在此圖中，〝A〞代表媒劑治療；〝B〞至〝H〞分別代表以62.5、83.3、125、166.7、250、333.3和500毫克/公斤之劑量的化合物1治療；及〝I〞及〝J〞分別代表以125和250毫克/公斤之劑量的化合物A治療。圖6為顯示來自以化合物1治療28天之小鼠的KARPAS-422腫瘤中之整體H3K27me3甲基化的圖形。圖7為顯示來自以化合物1或化合物A治療7天的帶有KARPAS-422異體移植腫瘤之小鼠的骨髓中之整體H3K27me3甲基化的圖形。在此圖中，〝A〞代表媒劑治療；〝B〞至〝H〞分別代表以62.5、83.3、125、166.7、250、333.3和500毫克/公斤之劑量的化合物1治療；及〝I〞及〝J〞分別代表以125和250毫克/公斤之劑量的化合物A治療。圖8為顯示來自以化合物1治療28天的帶有KARPAS-422異體移植腫瘤之小鼠的骨髓中之整體H3K27me3甲基化的圖形。在此圖中，〝A〞代表媒劑治療；〝B〞至〝E〞分別代表以62.5、125、250和500毫克/公斤之劑量的化合物1治療；及〝F〞代表以250毫克/公斤之劑量的化合物A治療。
在下文的實施例6-8中，實驗及分析係以類 似於那些下列中所述之方法及技術來進行：例如J.Lin,Pharmaceutical Research,2006,23(6)：1089-1116；L.Di等人之Comb Chem High Throughput Screen.2008,11(6)：469-76；M.Fonsi等人之Journal of Biomolecular Screening,2008,13：862；E.Sjögren等人之Drug Metab.Dispos.2012,40：2273-2279；T.D.Bjornsson，等人之Drug Metab Dispos,2003,31(7)：815-832；J.B.Houston and K.E.Kenworthy,Drug Metab Dispos,2000,28(3)：246-254；及S.W.Grimm等人之Drug Metab Dispos,2009,37(7)：1355-1370，將各者之揭示內容以其全文特此併入以供參考。
實施例6：在肝微粒體中的代謝穩定性之評定
化合物1、2和105的代謝穩定性係在來自5種物種之肝微粒體中評估，包括小鼠、大鼠、狗、猴和人類。
方法：培育係在含有由100毫莫耳/公升之磷酸鉀緩衝液(pH 7.4)、1毫克/毫升之肝微粒體、8種濃度的檢驗化合物(亦即化合物1、2或105)及2毫克/毫升之NADPH所組成之250微升總體積的96-槽孔盤中進行。用於培育之化合物濃度係從45.7nM至100μM為範圍內。利用NADPH的添加而開始反應且在37℃之震盪水浴中進行至多60分鐘培育。反應係藉由添加含有內標準物(IS)的等體積之停止溶液終止。接著將樣品在分析前於冷藏型離心機中以3000 RPM旋轉最少5分鐘。使用在培育混合物 中耗損的檢驗化合物量(如使用LC/TOFMS所測定)評估以肝微粒體之固有廓清率。LC/TOFMS系統係由Shimadzu SIL-HTC自動取樣器(Kyoto,Japan)、兩個幫浦(LC-20AD；Shimadzu Corp.)及具有飛行時間質譜儀(time-of-flight mass spectrometer)(AB SCIEX Qstar Elite,AB Sciex,Foster City,CA)的管式烘箱(CTO-20AC；Shimadzu Corp.)所組成。檢驗化合物及檢定用IS之峰波面積係以Analyst QS(2.0版，Applied Biosystems,Foster City,CA)積分。使用以氮氣的碰撞活化解離(Collision activated dissociation)(CAD)產生產物離子。最優化儀器條件係在正型離子模式下。
LC/MS/MS量化係建基於檢驗化合物對IS之波峰面積比值。化合物1、2或105及IS之波峰面積計算及積分係利用Analyst QS 2.0(AB Sciex,Foster City,CA)。計算係使用Excel(Office 2010,Microsoft Corp.,Redmond,WA)及GraphPad Prism v.5.02(GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA)來進行。數據係建基於適當的SOP來分析及報告，諸如那些在J.Lin,Pharmaceutical Research,2006,23(6)：1089-1116；及Di L等人之Comb Chem High Throughput Screen.2008 11(6)：469-76中所述。
用於Km及Vmax值之以肝微粒體耗損的檢驗化合物係藉由對時間標繪來計算，以測定耗損率。接著將耗損率使用適當的動力學模式標繪。數據係建基於以下方 程式來計算：Michaelis-Menten：Clint(微升/分鐘/毫克肝微粒體)=Vmax/Km
Hill：Clint(微升/分鐘/毫克肝微粒體)=Clmax=Vmax/Ks．(n-1)/(n(n-1)1/n)
Clint(微升/分鐘/公克肝)=Clint(微升/分鐘/毫克微粒體)．標度因子或Clint(微升/分鐘/106個細胞)．標度因子。
將結果提供於以下表5中。
所有三種檢驗之化合物(亦即化合物1、2和105)在人類肝微粒體(HLM)中展現低的代謝廓清率。亦觀察出物種在代謝廓清率中的差異。石蟹獼猴通常顯示比其他物種高的廓清率。
實施例7：CYP誘發作用之評定
在來自單一予體的冷凍保存之人類肝細胞中 評估化合物1、2和105之各者的誘發作用。
方法：肝細胞係自BD Biosciences(Woburn,MA)獲得，及適當的培養基和DAPI細胞核染色係購自Life Technologies(Durham,NC)。杜貝可氏(Dulbecco’s)改質之依格氏(Eagle’s)培養基(DMEM)、杜貝可氏磷酸鹽緩衝食鹽水(DPBS)、100x MEM非基本胺基酸、100x青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸溶液、2x錐蟲藍係購自Mediatech(Manassas,VA)。胎牛血清(FBS)係取自Tissue Culture Biologicals(Tulare,CA)。用於mRNA分析的經膠原塗佈之24-槽孔盤係取自BD Biosciences(San Jose,CA)。將預設計之探針及引子用在評定mRNA改變的兩個三複製檢定中。正對照組為用於CYP1A之β-萘並黃酮(naphthoflavone)(1和10微莫耳/公升)、用於CYP2B6之苯比巴妥(Phenobarbital)(100微莫耳/公升和1毫莫耳/公升)及用於CYP2C9和CYP3A之利福平(rifampicin)(1和10微莫耳/公升)。將DMSO用作為媒劑(負)對照組。CYP形式特異性檢定係在治療期之後進行且計數細胞以測定存活率。
將冷凍保存之肝細胞在37℃之水浴中解凍且根據供應商指示鋪置。將一個試管的肝細胞添加至含有Life Technologies的冷凍保存之肝細胞回收培養基(CHRM)的50毫升錐形管中。將細胞在具有GH 3.8馬達的Beckman離心機中以800 RPM旋轉10分鐘。將上清液移除且將細胞再懸浮在用於計數之鋪置培養基中。在計 數之後，將細胞以750,000個存活細胞/毫升再懸浮。將懸浮液(0.5毫升/槽孔)添加至經膠原塗佈之24-槽孔盤中，或在添加含有10%之FBS、青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸及MEM非基本胺基酸的60微升DMEM之後，將80微升懸浮液添加至經膠原塗佈之96-槽孔盤的各槽孔中。在渦旋及搖擺以提供更好的盤覆蓋之後，將細胞放入在5%之CO2及37℃之組織培養物保溫器中且容許經隔夜附著。接著將細胞使用CellzDirect肝細胞維護培養基處理。將細胞暴露於化合物1、2或105(1或10微莫耳/公升)或媒劑48小時。在處理期間，以每24小時補足維護培養基及檢驗化合物。
在完成培育之後，將細胞以DPBS清洗。在以DPBS清洗之後，將細胞使用在DPBS中的3.7%之對-甲醛固定1小時。移除甲醛且添加在DPBS中的0.6微莫耳/公升之DAPI。將細胞以DAPI經20分鐘染色且接著以DPBS清洗3次。將細胞使用具有5X物鏡之ArrayScan II(Cellomics,Pittsburgh,PA)計數。剩餘的肝細胞部分係使用在處理條件下所發現之細胞數除以媒劑對照組所發現之細胞數計算而來。
在處理之後，將細胞使用來自Qiagen RNeasy套組之緩衝液RLT溶解。使用製造商的規程，使用RNeasy套組以DNase處理而分離出mRNA。mRNA濃度係經由Nanodrop ND-1000(Wilmington,DE)測量。使予體內的每個樣品之mRNA濃度標準化。反轉錄係以來自Life Technologies的Superscript VILO cDNA合成套組按照製造商的指示進行。在合成cDNA之後，即時量化(quantitative real time)PCR係使用來自Life Technologies的全資附屬公司Applied Biosystems之7500 Fast Real Time PCR系統進行。用於即時PCR之反應組份係由下列者所組成：10微升Taqman Fast Advanced Master Mix(Life Technologies)、2微升cDNA、5微升無核酸酶之水(Life Technologies)、用於β-2微球蛋白之1微升受引子限定之FAM標記檢定物HS00984230_m1、用於CYP1A2或用於CYP2B6之1微升受引子限定之VIC標記檢定物HS00167927_m1或HS04183483_g1、及用於CYP2C9或用於CYP3A4之1微升受引子限定之NED標記檢定物HS04260376_m1或HS00604506_m1。與媒劑對照組相比之差異倍數的計算係以使用△△Ct方法的7500 Software 2.0.5版(Life Technologies)進行。Emax和EC50的計算係使用GraphPad Prism進行。
如以上表6中所示，化合物1未展現顯著的 誘發作用(除了可能的CYP2C9以外)；化合物2未展現誘發作用(具有稍微較低的活性)；及化合物105展現CYP2B6、CYP2C9和CYP3A之誘發作用。未觀察出顯著損失的細胞存活率。
實施例8：CYP抑制作用之評定
化合物1、2或105對人類細胞色素P450(CYP)之酵素活性的潛在抑制作用係使用匯聚之人類肝微粒體評估。
方法：化合物1、2和105之競爭性抑制潛力係藉由以多重濃度評定在接近該等各自的Km值之探針CYP反應來測定，以產生人類肝微粒體(HLM)的IC50曲線。在適當時，亦藉由評估KI和kinact值來評定CYP3A4/5之時間依賴性失活(TDI)潛力。
將含有PB、HLM、CYP-選擇性探針受質及欲檢驗之抑制劑的懸浮液添加至96-槽孔盤中。將盤在37℃之水浴中預培育約2分鐘。反應係藉由將NADPH添加至96-槽孔盤之各槽孔中而引發。PB、HLM及NADPH之最終濃度分別為100毫莫耳/公升(pH 7.4)、0.1毫克/毫升及2.3毫莫耳/公升。將用作為正對照組的CYP探針受質及CYP抑制劑與該等各自的濃度列示於下。在各培育中所使用的MeOH最終濃度不超過0.8%。
在適當的培育時間之後，將含有IS之等體積中止溶液添加至適當的槽孔中。標準物及品質對照(QC)樣 品係使用與檢驗化合物類似的組份製得。空白物係以與其他樣品類似但不包括IS之中止溶液製得。將盤在桌上型離心機中以3000rpm旋轉5分鐘。將樣品以LC/MS/MS分析。將培育條件及正對照組列示於以下表7中。
將用於評定TDI之初級培育的含有PB、HLM和引發劑貯液的懸浮液添加至96-槽孔盤中。將盤在37℃之水浴中預培育約2分鐘。反應係藉由將NADPH添加至96-槽孔盤之各槽孔中而引發且進行0、5、10、15、20和30分鐘。將PB溶液取代NADPH貯液用於沒有NADPH之對照組。PB、HLM及NADPH之最終濃度分別為100毫莫耳/公升(pH 7.4)、0.2毫克/毫升及2.3毫莫耳/公升。在各自的時間點，將12.5微升初級培育懸浮液以20倍稀釋成含有CYP-選擇性探針受質的預培育之二級培育混合 物，以便評定殘餘活性。所使用之探針受質為睪固酮(250微莫耳/公升)及正對照組為醋竹桃黴素(troleandomycin)。
所使用之HPLC系統為由SIL-HTC自動取樣器、DGU-14A脫氣機、三個LC-10ADvp幫浦及CTO-10ACvp管式烘箱所組成之Shimadzu HPLC系統(Kyoto,Japan)。樣品係在API4000QTrap(AB Sciex,Foster City,CA)三段式四極質譜儀(triple quadrupole mass spectrometer)上使用加速噴霧離子化法以正離子模式分析。
所有監測之代謝物及IS之波峰計算及積分係以Analyst 1.6(AB Sciex,Foster City,CA)處理。量化係使用以代謝物對IS之波峰比相對於校正標準物之濃度標繪所建構的校正曲線而達成，且以1/x2加權之二次回歸(quadratic regression)而產生(y=ax2+bx+c)。抑制百分比的計算係利用Excel(Office 2010,Microsoft Corp.,Redmond,WA)，且使用GraphPad Prism(5.02版，GraphPad Software,Inc.,LaJolla,CA)建基於一個結合位置的假設來標繪。檢驗化合物及正對照組的標稱濃度為以GraphPad Prism轉換之對數。使用剩餘CYP3A4/5活性相對於與檢驗化合物的預培育時間之標繪圖，以非線性回歸評估CYP活性損失率(λ)。接著藉由擬合以下的方程式來評估參數kinact和KI：
其中[I]為化合物1、2或105之初始濃度。
如以上表8中所示，化合物1和2未展現顯著的抑制作用；及化合物105展現CYP2D6及CYP3A4((咪達唑侖)之潛在顯著的抑制作用。所有的化合物1、2和105亦顯示CYP3A4(使用咪達唑侖作為探針)的時間-、濃度-及NADPH-依賴性失活。
將本文所述及之專利文件及科學論文中之各者的完整揭示內容以所有的目的併入本文以供參考。
可將本發明以不違背其精神或本質特徵而以其他特定的形式具體化。前述具體實例因此在所有方面皆被視為例證而非限制本文所述之發明。本發明的範圍因此係以所附之申請專利範圍而非以前述說明指出，且意欲使所有在等同於申請專利範圍之意義及範圍內的改變皆涵蓋於本發明中。

Claims (23)

  1. 一種選自由下列所組成群組之化合物， 及其藥學上可接受之鹽。
  2. 根據申請專利範圍第1項之化合物，其中該化合物 為或其醫藥上可接受之鹽。
  3. 根據申請專利範圍第1項之化合物，其中該化合物 為。
  4. 根據申請專利範圍第1項之化合物，其中該化合物 為或其醫藥上可接受之鹽。
  5. 根據申請專利範圍第1項之化合物，其中該化合物 為。
  6. 根據申請專利範圍第1項之化合物，其中該化合物 為或其醫藥上可接受之鹽。
  7. 根據申請專利範圍第1項之化合物，其中該化合物 為。
  8. 一種醫藥組成物，其包含申請專利範圍第1-7項中任一項之化合物及醫藥上可接受之載劑。
  9. 根據申請專利範圍第1-7項中任一項之化合物，其係用於治療經EZH2-調介之病症。
  10. 根據申請專利範圍第9項之化合物，其中該經EZH2-調介之病症為癌症。
  11. 根據申請專利範圍第10項之化合物，其中該癌症為淋巴瘤、白血病或黑色素瘤。
  12. 根據申請專利範圍第10項之化合物，其中該癌症為瀰漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金氏(non-Hodgkin’s)淋巴瘤(NHL)、濾泡性淋巴瘤或瀰漫性大B-細胞淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性髓狀白血病、急性淋巴球白血病或混合系白血病、或骨髓造血不良症候群(MDS)。
  13. 根據申請專利範圍第10項之化合物，其中該癌症為惡性類橫紋肌腫瘤或INI1-缺乏性腫瘤。
  14. 一種申請專利範圍第1-7項中任一項之化合物的用途，其用於製造供治療經EZH2-調介之病症的藥劑。
  15. 根據申請專利範圍第14項之用途，其中該經 EZH2-調介之病症為癌症。
  16. 根據申請專利範圍第15項之用途，其中該癌症為淋巴瘤、白血病或黑色素瘤。
  17. 根據申請專利範圍第15項之用途，其中該癌症為瀰漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金氏(non-Hodgkin’s)淋巴瘤(NHL)、濾泡性淋巴瘤或瀰漫性大B-細胞淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性髓狀白血病、急性淋巴球白血病或混合系白血病，或骨髓造血不良症候群(MDS)。
  18. 根據申請專利範圍第15項之用途，其中該癌症為惡性類橫紋肌腫瘤或INI1-缺乏性腫瘤。
  19. 一種用於治療經EZH2-調介之病症的醫藥組成物，其包含申請專利範圍第1-7項中任一項之化合物作為主要成分。
  20. 根據申請專利範圍第19項之醫藥組成物，其中該經EZH2-調介之病症為癌症。
  21. 根據申請專利範圍第20項之醫藥組成物，其中該癌症為淋巴瘤、白血病或黑色素瘤。
  22. 根據申請專利範圍第20項之醫藥組成物，其中該癌症為瀰漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金氏(non-Hodgkin’s)淋巴瘤(NHL)、濾泡性淋巴瘤或瀰漫性大B-細胞淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性髓狀白血病、急性淋巴球白血病或混合系白血病，或骨髓造血不良症候群(MDS)。
  23. 根據申請專利範圍第20項之醫藥組成物，其中該癌症為惡性類橫紋肌腫瘤或INI1-缺乏性腫瘤。
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