KR20140082742A - 암을 치료하는 방법 - Google Patents

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카레타 엘. 크리시
고피나쓰 간지
마이클 티. 맥케이브
킴벌리 엔. 스미서맨
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글락소스미스클라인 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어 암의 치료를 필요로 하는 인간으로부터의 샘플에서 (a) 상기 인간으로부터의 샘플 중 EZH2의 알라닌 677 (A677) 잔기에서의 돌연변이의 존재 또는 부재; 또는 (b) EZH2의 티로신 641 (Y641) 잔기에서의 돌연변이의 존재 또는 부재; 또는 (c) 대조군과의 비교시 H3K27me3의 증가된 수준의 존재 또는 부재 중 적어도 하나를 결정하는 것, 및 상기 A677 돌연변이, Y641 돌연변이, 또는 H3K27me3의 증가된 수준 중 적어도 하나가 상기 샘플에 존재하는 경우에 상기 인간에게 유효량의 EZH2 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

암을 치료하는 방법 {METHODS OF TREATING CANCER}
본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
암 치료를 위한 표적화 요법의 확대되는 발달 및 이용은 핵심 종양원성 경로, 및 이들 경로의 표적화된 교란이 임상적 반응에 어떻게 상응하는지에 대한 증가하는 이해를 반영한다. 표적화 요법에 대한 효능을 예상하는 것의 어려움은 경로 탈조절에 대한 원인 메카니즘 (예를 들어, 활성화 돌연변이, 증폭)의 제한된 전반적 지식의 결과일 가능성이 있다. 종양학적 요법에 대한 전임상 중개 연구는 어떠한 종양 유형 및 유전자형이 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 가장 높은지를 결정하는 것에 초점을 맞춘다. 선택된 환자 집단을 치료하는 것은 요법의 잠재력을 극대화하도록 도울 수 있다. 종양 모델의 전임상 세포 반응 프로파일링은 신규 암 치료제의 개발에서 초석이 되어 왔다. 시험관내 종양 모델의 코호트를 이용하여 임상 효능을 예상하기 위한 노력은 성공적이었다 (예를 들어, EGFR 억제제는 EGFR 돌연변이를 보유하는 종양에 선택적으로 유용함). 따라서, 다양한 종양 유래 세포주의 포괄적인 패널은 '모든 참가자' 효능 시험을 요약할 수 있고; 그로 인해 어떠한 조직학 및 특정 종양 유전자형이 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 가장 높은지를 확인시킨다. 현재 다수의 특정 분자 마커가 임상 세팅에서 이익을 얻을 가능성이 가장 높은 환자를 확인하는데 사용된다.
EZH2 (제스트(zeste) 인핸서 상동체 2; 인간 EZH2 유전자: 문헌 [Cardoso, C, et al.; European J of Human Genetics, Vol. 8, No 3 Pages 174-180, 2000])는 히스톤 H3의 리신 27을 트리-메틸화시킴으로써 (H3K27me3) 표적 유전자를 침묵화시키는 기능을 하는 폴리콤(Polycomb) 리프레서 복합체 2 (PRC2)의 촉매 서브유닛이다. 히스톤 H3은 진핵 세포에서 염색질의 구조에 관여하는 5종의 주요 히스톤 단백질 중 하나이다. 주요 구형 도메인 및 긴 N-말단 꼬리를 특징으로 하는 히스톤은 뉴클레오솜의 구조인 '실에 꿰인 구슬' 구조에 관여한다. 히스톤 단백질은 고도로 번역-후 변형되지만, 히스톤 H3은 5종의 히스톤 중 가장 광범위하게 변형된다. 용어 "히스톤 H3" 단독은 이것이 서열 변이체 또는 변형 상태를 구별하지 않는다는 점에서 의도적으로 모호하다. 히스톤 H3은 신흥 후성학 분야에서 중요한 단백질이며, 여기서 그의 서열 변이체 및 가변적 변형 상태는 유전자의 동적인 장기간의 조절에 있어 역할을 하는 것으로 여겨진다.
암을 치료하는데 유용한 EZH2 억제제는 PCT 출원 PCT/US2011/035336, PCT/US2011/035340 및 PCT/US2011/035344에서 보고된 바 있으며, 이들은 본원에 참조로 포함된다. 이들 화합물에 반응할 가능성이 보다 높은 유전자형을 확인하는 것이 바람직하다.
본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 인간으로부터의 샘플에서
a. 상기 인간으로부터의 샘플 중 EZH2의 알라닌 677 (A677) 잔기에서의 돌연변이의 존재 또는 부재; 또는
b. EZH2의 티로신 641 (Y641) 잔기에서의 돌연변이의 존재 또는 부재; 또는
c. 대조군과의 비교시 H3K27me3의 증가된 수준의 존재 또는 부재
중 적어도 하나를 결정하는 것, 및
상기 A677 돌연변이, Y641 돌연변이, 또는 H3K27me3의 증가된 수준 중 적어도 하나가 상기 샘플에 존재하는 경우에 상기 인간에게 유효량의 EZH2 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것
을 포함하는, 상기 인간에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
도 1. 림프종 세포주의 하위세트는 극도로 상승된 H3K27me3 수준을 나타낸다. (A) 전체적 H3K27me3 수준 (전체 H3에 대해 정규화함)을 7종의 다양한 암 유형으로부터의 111종의 암 세포주에 대해 결정하였다. Y641 돌연변이를 보유하는 림프종 세포주는 별표로 표시하였다. (B) 림프종 세포주의 패널로부터의 단백질 용해물 중 전체적 H3K27me3 및 H3K27me1의 웨스턴 블롯 분석.
도 2. Pfeiffer 림프종 세포주는 EZH2의 이형접합 A677G 돌연변이를 보유한다. (A) Pfeiffer DLBCL 세포주 및 원발성 DLBCL 환자 샘플 중 EZH2의 생거(Sanger) 서열분석으로부터의 서열 추적. C2045C/G의 이형접합 비-동의 과오 돌연변이 (별표)는 A677A/G로 번역된다 (NM_001203247에 기반한 잔기 넘버링). (B) EZH2 도메인 구조 (유니프롯(Uniprot) Q15910). Pfeiffer 세포 및 원발성 종양에서 확인되는 돌연변이를 강조하였다. (C) Y641 및 A677이 고도로 보존되어 있음을 보여주는, 인간 EZH2와 인간 EZH1, 파리 오르토로그 EZ 및 6종의 다른 관련 SET 도메인 함유 히스톤 리신 메틸트랜스퍼라제의 정렬. 백색 문자를 갖는 암회색 음영은 동일한 잔기를 나타내고, 박스표시된 아미노산은 보존된 잔기를 나타낸다. 칼럼이 음영처리되기 위해서는 정렬에서 9개 중 7개의 보존된/동일한 잔기가 존재하여야 한다.
도 3. A677G EZH2 돌연변이체는 모든 H3K27 메틸화 상태에 대해 활성을 나타낸다. 기질로서 H3K27me0 (흑색 막대), H3K27me1 (회색 막대) 또는 H3K27me2 (백색 막대)를 사용한 야생형, A677G 및 Y641N EZH2에 대한 k cat (분-1).
도 4. A677G EZH2의 외인성 발현은 H3K27의 트리메틸화를 자극한다. MCF-7 유방암 세포를 EZH2의 야생형 또는 돌연변이체 형태를 코딩하는 발현 구축물로 일시적으로 형질감염시켰다. (A.) H3K27me3, 전체 H3 및 EZH2의 웨스턴 블롯 분석. 액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. (B.) 공벡터로 형질감염된 세포의 백분율로서의, 히스톤 H3에 대해 정규화된 H3K27me3 수준.
도 5. A677G EZH2 돌연변이는 Y641에 대한 영향을 통해 리신 결합 포켓을 변경한다. 야생형 EZH2의 상동성 모델은 H3K9me2 펩티드 기질에 결합된 GLP/EHMT1의 결정 구조를 이용하여 생성하였다. (A) 야생형, (B) Y641N 및 (C) A677G EZH2의 활성 부위 영역의 모델링된 구조.
도 6. H3K27me3의 높은 수준 및 EZH2 돌연변이 스테이터스는 EZH2 억제에 대한 민감성을 예측한다. 림프종 세포주를 EZH2 억제제 화합물 A의 존재 하에 6일 동안 성장시켰다. 성장에서의 50% 억제가 일어나는 화합물 A의 농도를 성장 IC50으로 표시하였고, 선으로 나타내었다. H3K27me3 수준은 세포주 Pfeiffer를 사용하여 얻은 H3K27me3 수준의 백분율 (막대 그래프)로 나타내었다. EZH2에서 Y641 또는 A677에 돌연변이를 갖는 세포주는 흑색 막대로 표시하였고, 반면에 이들 위치에서 야생형인 것들은 회색 막대로 표시하였다.
도 7. GSK126의 생화학적 및 세포 메카니즘적 활성. (A) GSK126의 구조. (B) WT 및 돌연변이체 EZH2에 대한 GSK126의 효력. K27me0, K27me1 또는 K27me2를 갖는 히스톤 H3 펩티드 (21-44)를 기질로서 사용하였다 (n=2; 평균 값 ± s.d.를 나타냄). (C) GSK126으로 48시간 동안 처리한 림프종 세포주에서의 H3K27me3에 대한 GSK126의 효과. IC50 값은 H3K27me3 ELISA를 이용하여 결정하였다 (n≥2; 평균 값 ± s.d.를 나타냄). (D) 72시간 동안 처리한 후의 KARPAS-422에서의 H3K27me3/2/1의 평가. 전체 히스톤 H3을 로딩 대조군으로서 나타내었다.
도 8. EZH2의 상동성 모델 및 화합물 B (GSK126)의 예측 결합 모드. (A) EZH2의 상동성 모델 및 화합물 B (GSK126)의 예측 결합 모드. SAM 결합 부위에 결합된 GSK126을 SAH와 겹쳤다. H3K27me2 펩티드 기질, SET 도메인 및 SET-후 도메인, 및 GSK126의 예측 결합 모드의 10 Å 이내에 있는 EZH2와 EZH1 사이의 잔기 차이를 표시하였다. (B) GSK126의 결합 모드의 확대 뷰를 도시하였다. 특이적 수소 결합 및 아렌-H 상호작용을 파선으로 나타내었다. SET-후 도메인으로부터의 잔기에 의해 기여된 결합 부위 표면을 나타내었다. (C) EZH2의 잔기와 GSK126 사이의 특이적 상호작용을 강조하는 2D 리간드 상호작용 다이어그램. (D) EZH2 기능적 도메인 (유니프롯 Q15910)의 다이어그램 (SET 도메인 내의 A677 및 Y641 활성화 돌연변이의 위치를 강조함).
도 9. GSK126으로 처리한 세포주에서의 H3K27 메틸화의 분석. (A) EZH2 WT (Toledo 및 SU-DHL-8) 및 돌연변이체 (Pfeiffer 및 KARPAS-422) 림프종 세포주에 걸친 전체적 H3K27me3, H3K27me2 및 H3K27me1 수준의 비교. (B) KARPAS-422, Pfeiffer 및 SU-DHL-8 B-세포 림프종 세포주에서의 전체적 H3K27me3 수준의 감소에 의해 측정한 시간에 따른 GSK126의 효력. 세포를 GSK126의 3배 연속 희석물로 처리하였다. H3K27me3 수준을 50%만큼 감소시키는데 요구되는 GSK126의 농도 (H3K27me3 IC50)를 ELISA에 의해 결정하였다 (n≥2; 평균 값 ± s.d.를 나타냄). (C) 72시간 동안 처리한 후의 H3K27me3, H3K27me2 및 H3K27me1의 평가. 전체 히스톤 H3을 로딩 대조군으로서 나타내었다.
도 10. 웨스턴 블롯 분석. EZH2 돌연변이체 (a,b) 또는 WT (c,d) 림프종 세포주를 0.1% DMSO (비히클 대조군), 25nM, 150nM, 500nM, 또는 2μM GSK126으로 72시간 동안 처리한 후의 EZH2, SUZ12 및 EED의 웨스턴 블롯팅. 액틴을 로딩 대조군으로서 포함시켰다.
도 11. GSK126은 여러 EZH2 돌연변이체 림프종 세포주의 증식을 억제한다. (A) 성장의 50%를 억제하는데 요구되는 GSK126의 농도 (성장 IC50)로 나타낸, 6일 후의 46종의 림프종 세포주의 성장에 대한 GSK126의 효과. DLBCL, 미만성 거대 B-세포 림프종. BL, 버킷 림프종. BCBL, AIDS 체강-기반 림프종. FL, 여포성 림프종. HL, 호지킨 림프종. NHL, 비-호지킨 림프종. (B) 성장 IC50으로 나타낸, 시간에 따른 Pfeiffer 및 KARPAS-422의 성장에 대한 GSK126의 효력. (C,F) Pfeiffer 또는 KARPAS-422에서의 시간에 따른 세포 증식에 대한 GSK126의 용량-의존성 효과. 성장은 제0 시점 (T0)에서의 CTG의 백분율로 나타내었다. (D,G) 72시간 후의 세포 주기에 대한 GSK126의 효과를 보여주는 DNA 함량 히스토그램. (E,H) 비히클 대조군 ± s.d.에 비한 카스파제 3/7 활성의 평균 배수-변화를 나타내었다 (n=4).
도 12. 18종의 DLBCL 세포주의 성장에 대한 GSK126의 효과를 나타내는 합성 용량-반응 곡선. 세포주를 다양한 농도의 GSK126으로 6일 동안 처리한 후, 세포 성장을 셀 타이터-글로(Cell Titer-Glo) (프로메가(Promega))로 평가하였다. y-축은 비히클 대조군 (0.15% DMSO)과 비교하여 성장의 퍼센트를 나타낸다.
도 13. H3K27me3의 억제, 세포 성장 및 EZH2 수준 사이의 상관관계 분석. (A) 도 7c로부터의 GSK126에 대한 H3K27me3 IC50 값에 대해 플롯팅한 표 6으로부터의 GSK126에 대한 세포 성장 IC50 값. 피어슨 상관 값을 나타내었다. (B) 림프종 세포주의 전세포 추출물로부터의 EZH2 및 액틴의 대표적인 웨스턴 블롯. EZH2 및 액틴에 대한 웨스턴 블롯 신호 강도를 리-코르 오디세이(Li-Cor Odyssey) 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. (C) EZH2 신호 강도를 전체 액틴 수준에 대해 정규화하고, 표 6으로부터의 6일 증식 검정에서의 GSK126에 대한 세포 성장 IC50 값에 대해 플롯팅하였다.
도 14. shRNA에 의한 EZH2 녹다운의 표현형 효과. (A) EZH2에 대한 shRNA 또는 비-표적화 대조군 shRNA를 발현하는 KARPAS-422 (좌측) 및 Pfeiffer (우측)의 6일간에 걸친 세포 증식. 각각의 시점에서의 CTG 신호를 제0일 (T0)의 세포의 백분율로서 나타내었다. (B) EZH2에 대한 shRNA 또는 비-표적화 대조군 shRNA를 발현하는 KARPAS-422 (좌측) 및 Pfeiffer (우측)에서의 시간에 따른 카스파제3/7 활성. 각각의 시점에서의 카스파제3/7 활성을 제0일 (T0)의 활성의 백분율로서 나타내었다. (C) EZH2의 shRNA 녹다운 후의 EZH2, H3K27me3, H3K27me2, H3K27me1 및 전체 히스톤 H3의 웨스턴 블롯 분석. 액틴을 로딩 대조군으로서 포함시켰다.
도 15. GSK126은 민감성 세포주에서 전사 활성화를 유도한다. (A) 500 nM GSK126으로 72시간 동안 처리한 후에 유의하게 변경된 유전자 발현 (FDR <0.1 및 배수-변화 >2 또는 <-2)을 나타내는 프로브 세트의 개수 (n=2). (B) GSK126 처리 후 상향조절된 유전자, 하향조절된 유전자 또는 모든 인간 전사체의 기저 H3K27me3 ChIP-seq 농축 프로파일. (C) GSK126으로 72시간 동안 처리한 후의 TXNIP 및 TNFRSF21의 qRT-PCR 분석 (n=3; 평균 값 ± s.d.를 나타냄). (D) 2배 발현 변화 컷-오프를 이용한, 10종의 DLBCL 세포주 사이의 상향조절 및 하향조절된 프로브 세트의 오버랩. (E) 5종의 가장 민감성인 돌연변이체 DLBCL 세포주 (Pfeiffer, KARPAS-422, WSU-DLCL2, SU-DHL-10 및 SU-DHL-6) 중 적어도 4종에서 유의하게 증가된 발현을 나타내는 35개의 프로브 세트의 평균 유전자 발현 강도를 보여주는 열지도.
도 16. DLBCL 세포주의 발현 분석. (A) GSK126으로 72시간 동안 처리한 후에 차등 발현된 프로브 세트에 대한 정규화된 유전자 발현 데이터의 유전자 발현 열지도. 보다 어두운 색상은 보다 높은 발현을 표시한다. (B) 10종의 DLBCL 세포주를 2벌로 500nM GSK126으로 72시간 동안 처리한 후에 0.1% DMSO (비히클 대조군)와 비교하여 유의하게 변경된 유전자 발현 (>1.5배)을 나타내는 프로브 세트의 개수. (C) 상향조절된 프로브 세트의 개수와 전사적으로 반응성 및 비반응성인 돌연변이체 EZH2 DLBCL 세포주 (Pfeiffer, WSU-DLCL2, KARPAS-422, SU-DHL-10, DB 및 SU-DHL-4)의 기저 H3K27me3 수준 사이의 상관관계. H3K27me3 수준을 전체 히스톤 H3에 대해 정규화하고, Pfeiffer 세포주에서 관찰된 수준의 백분율로 나타내었다. 전사적으로 반응성 및 비반응성인 세포주를 원형표시하였다. (D) GSK126 처리로 발현에서 1.5 또는 2배의 증가를 나타내는, 표시된 세포주 내의 공통 프로브 세트의 개수.
도 17. GSK126에 반응하여 상향조절되는 유전자는 H3K27me3에 대해 농축된다. 500nM GSK126으로 72시간 동안 처리한 후에 Pfeiffer, WSU-DLCL2 및 KARPAS 422 세포에서 유의하게 상향조절되거나, 하향조절되거나 또는 변화하지 않은 것으로 확인된 프로브 세트를 개별 유전자, 및 H3K27me3 ChIP-seq 데이터로부터 각각의 유전자 및 ±10kb에 대해 결정된 H3K27me3 농축에 대해 맵핑하였다. 상대적 H3K27me3 농축을 백색 내지 회색 구배 (백색은 농축이 없음을 나타내고, 회색은 가장 고도의 농축을 나타냄)로서 나타내었다. 각각의 행은 고유의 유전자를 나타낸다.
도 18. 유전자 온톨로지 농축 분석. A Pfeiffer, WSU-DLCL2, KARPAS-422, SU-DHL-10 또는 SU-DHL-6에서 500nM GSK126으로 유의하게 상향조절된 프로브 세트에 대한 GO 농축 분석. B Pfeiffer, WSU-DLCL2, KARPAS-422, SU-DHL-10 또는 SU-DHL-6 세포주에서 500nM GSK126으로 유의하게 상향조절 또는 하향조절된 프로브 세트에 대한 GO 농축 분석. 초과-표시된 생물학적 과정 및 분자 기능 용어는 p-값<0.01 (파선), 용어 당 5종 이상의 유전자, 및 ≥3종의 세포주에 걸쳐 공통된 것들에 대해 필터링하였다.
도 19. GSK126을 사용한 H3K27me3의 생체내 억제 및 종양 성장 반응. (A) GSK126을 10일 동안 1일 1회 투여한 후의 종양 이종이식편에서의 H3K27me3의 반응. b KARPAS-422 종양 이종이식편에서의 EZH2 표적 유전자의 qRT-PCR 분석. 평균 값 ± s.d. (n=3)를 나타내었다 (A,B). (C) 피하 KARPAS-422 이종이식편의 성장에 대한 GSK126의 활성. 평균 종양 부피 ± s.e.m.을 나타내었다 (n=10). (D) (C)에서 처리된 마우스의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선. 비히클과 처리군 사이에서 비파라미터 로그-순위 시험을 이용하여 계산된 유의 P 값. 처리군 사이에 유의차가 전혀 관찰되지 않았다 (p 값 = 0.07-0.32) .
도 20. GSK126의 약동학적 분석. (A) Pfeiffer 이종이식편을 보유하는 암컷 베이지 SCID 마우스에 50mg/kg GSK126을 복강내 투여한 후의 혈액 및 종양 분포. 3마리의 마우스를 각각의 시점에 평가하였다. (B) a에 제시된 데이터에 대한 곡선하 면적 (AUC0- 1440), 종양/혈액 AUC 비, 달성된 최대 농도 (Cmax), 및 최대 농도의 시간 (Tmax). N/A, 이용가능하지 않음.
도 21. GSK126은 생체내에서 종양 성장을 억제한다. (A) 피하 Pfeiffer 이종이식편의 성장에 대한 GSK126의 효능. (B) 1주의 휴약기를 갖거나 갖지 않은 피하 KARPAS-422 이종이식편의 성장에 대한 GSK126의 간헐적 투여의 효능. 값은 평균 종양 부피 ± 표준 오차 (n=10)이다. P 값은 비히클과 각각의 처리군을 비교하는 비파라미터 로그-순위 검정을 이용하여 계산하였다.
도 22. 체중 및 말초 혈액에 대한 GSK126의 효과. (A-C) Pfeiffer (A) 또는 KARPAS-422 (B,C) 피하 이종이식편을 보유하는 마우스의, 비히클 또는 GSK126으로 처리하는 동안의 평균 체중 측정. 값은 투여 시작시의 평균 중량의 백분율로 나타내었다. (D) 18일에 걸쳐 주 2회 투여한 후의 CD-1 마우스의 전혈 카운트 분석. RBC, 적혈구 (x106개 세포/μl); HGB, 헤모글로빈 (g/dl); HCT, 적혈구용적률 (퍼센트); MCV, 평균 혈구 부피 (fl); MCH, 평균 혈구 헤모글로빈 (pg); MCHC, 평균 혈구 헤모글로빈 농도 (g/dl); PLT, 혈소판 (x105개 혈소판/μl); WBC, 백혈구 (x103개 세포/μl); NEUT, 호중구 (x103개 세포/μl); LYMPH, 림프구 (x103개 세포/μl); MONO, 단핵구 (x103개 세포/μl); EOS, 호산구 (x103개 세포/μl); BASO, 호염기구 (x103개 세포/μl); LEUK, 백혈구 (x103개 세포/μl).
도 23. 유전자 발현 프로파일링 데이터의 주성분 및 상관관계 분석. (A) 비히클 또는 500nM GSK126으로 72시간 동안 처리한 10종의 DLBCL 세포주의 생물학적 복제물로부터의 데이터의 PCA 플롯. (B) 견고한 전사 변화를 갖는 DLBCL 세포주의 생물학적 복제물의 상관관계. K, KARPAS-422; P, Pfeiffer; W, WSU-DLCL2; S10, SU-DHL-10; S6, SU-DHL-6.
최근 게놈-범위 서열분석 연구는 특히 EZH2, MLL2, MEF2B, CREBBP 및 TP53을 비롯하여, 비-호지킨 림프종에서 빈번하게 변경되는 여러 유전자를 밝혀낸 바 있다 (1-3). 이들 유전자 중 다수는, 직접적으로 또는 보조-인자의 모집을 통해 간접적으로, 히스톤의 아미노-말단 꼬리 상에서 관찰되는 일련의 번역-후 변형을 매개한다. 추가로, 유사한 연구는 또한 방광의 이행 세포 암종 (예를 들어, UTX, ARID1A, MLL, MLL3), 두경부 편평세포암 (예를 들어, EZH2, MLL2) 및 골수성 악성종양 (예를 들어, IDH1 /2, TET2, DNMT3A, EZH2)에서 이들 및 다른 후성적 인자를 연관시킨 바 있다 (4-6). 유전자를 변형시키는 전사 인자 및 히스톤에 영향을 미치는 유전자 변화의 유병률은 종양발생에 있어서 적절한 전사 조절을 유지하는 것의 중요성을 강조한다.
EZH2 유전자는 EED, SUZ12, RbAp48 및 AEBP2와 함께 폴리콤 억제 복합체 2 (PRC2)를 형성하는 SET 도메인-함유 리신 메틸트랜스퍼라제를 코딩한다 (7, 8). EZH2는 일반적으로 디- 또는 트리-메틸화 상태로 존재할 때 전사 억제와 연관되는 히스톤 H3 리신 27 (H3K27) 잔기의 메틸화를 담당한다 (7-9). EZH2는 pro-B 세포에서 고도로 발현되며, pre-B 세포, 미성숙 B 세포 및 재순환 B 세포로의 세포 진행에 따라 발현이 점진적으로 감소한다 (10). EZH2의 유전적 불활성화는 pro-B 세포 단계의 세포의 축적을 유발한다는 점에서, 골수에서 pro-B 세포로부터 pre-B 세포 및 미성숙 B 세포로의 진행을 위해서는 EZH2 발현이 요구된다 (10). 그러나, EZH2가 pro-B 세포 단계 후에 불활성화되는 경우에는 추가의 성숙 단계가 방해받지 않으며, 이는 EZH2가 B-세포 분화의 초기에 기능한다는 것을 시사한다 (10). 실제로, EZH2가 조혈 줄기 및 전구 세포의 유지에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 다수의 그룹이 보여준 바 있다 (11, 12). 특히, 조혈 줄기 세포 (HSC)에서의 EZH2 과다-발현은 연속 이식 모델에서 계속되는 자가-재생성 능력을 유발하며, 이는 EZH2가 재증식 잠재력에 기여하고 세포가 복제 스트레스에 저항하도록 돕는다는 것을 시사한다 (11).
EZH2는 대부분의 고형 종양 유형에서 빈번하게 증폭되고/거나 과다-발현되지만 (13); 아마도 증식하는 정상 B-세포에서의 EZH2의 높은 기저 발현 때문에 림프종에서는 그렇지 않은 것처럼 보인다. 그 대신에, EZH2는 배 중심 B-세포 (GCB) 미만성 거대 B-세포 림프종의 22% 및 여포성 림프종 (FL)의 7%에서 티로신 641 (Y641) 잔기의 반복 돌연변이를 보유하는 것으로 보고된 바 있다 (3). 처음에는 기능 상실 돌연변이인 것으로 보고되었지만 (3), 후속 생화학적 연구는 상기 Y641 돌연변이체 EZH2에 대한 신규 기능 획득 활성을 입증하였다 (14, 15). 야생형 EZH2는 비메틸화 및 모노-메틸화 H3K27 기질에 대해 강한 선호를 나타내는 반면에, 림프종에서 관찰되는 Y641 EZH2 돌연변이체 (Y641F/N/S/H)는 디-메틸화 기질에 대한 극도로 증가된 활성 및 비메틸화 및 모노-메틸화 H3K27에 대한 활성의 결핍을 나타낸다 (14, 15). 야생형 및 돌연변이체 EZH2 단백질의 통합된 활성을 통해, Y641 돌연변이체 림프종에서는 모노- 및 디-메틸화 H3K27의 감소를 동반하는 H3K27의 트리-메틸화 (H3K27me3)의 전체적 증가가 존재한다 (14).
이들 EZH2 Y641 돌연변이는, 다수의 종양에서의 EZH2 과다-발현과 함께, H3K27me3 수준의 탈조절이 인간 종양발생에서 중요하다는 것을 시사한다. 실제로, H3K27me3 수준은 신세포 암종에서의 무진행 생존 (16) 및 식도 편평 세포 암종에서의 질환 중증도 및 불량한 종양 분화 (17)와 상호연관된다. EZH2 Y641의 돌연변이 뿐만 아니라, H3K27me3의 탈조절에 대한 추가의 메카니즘은 H3K27 데메틸라제 UTX의 불활성화 돌연변이 (4, 18, 19), 및 감소된 miR-101 수준 (20, 21), 이상 E2F 활성 (22) 및 염색체 증폭 (23)을 비롯한 다수의 메카니즘으로 인한 EZH2의 과다-발현을 포함한다.
100종 초과의 세포주에서의 전체적 H3K27me3 수준의 조사를 통해, 본 발명자들은 일부 림프종 세포에서 증가된 H3K27me3에 대해 책임이 있는 A677 잔기에서의 신규 EZH2 돌연변이를 확인하였다. 이러한 돌연변이체 단백질의 특성화는, Y641 EZH2 돌연변이와 유사하게, 위치 677에서의 알라닌의 글리신으로의 교환 (A677G)이 디-메틸화 H3K27 기질과의 증가된 활성을 유발한다는 것을 밝혀내었다. 그러나, 중요한 것은, 이러한 치환은 야생형 EZH2에 존재하는 결정적 상호작용을 유지하여 비-, 모노- 및 디-메틸화를 비롯한 모든 H3K27 메틸화 상태의 효율적인 활용을 유발한다는 것이다. 상기 돌연변이는 Y641 EZH2 돌연변이체의 경우와 같이 야생형 EZH2와의 통합을 요구하지 않으면서, H3K27 메틸화를 탈조절시키기 위한 세포에 대한 유일한 접근법을 제시한다.
본 발명은 암의 치료를 필요로 하는 인간으로부터의 샘플에서
a. 상기 인간으로부터의 샘플 중 EZH2의 알라닌 677 (A677) 잔기에서의 돌연변이의 존재 또는 부재; 또는
b. EZH2의 티로신 641 (Y641) 잔기에서의 돌연변이의 존재 또는 부재; 또는
c. 대조군과의 비교시 H3K27me3의 증가된 수준의 존재 또는 부재
중 적어도 하나를 결정하는 것,
및 상기 A677 돌연변이, Y641 돌연변이, 또는 H3K27me3의 증가된 수준 중 적어도 하나가 상기 샘플에 존재하는 경우에 상기 인간에게 유효량의 EZH2 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 상기 인간에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본원의 방법의 특정 실시양태에서, a, b 및 c 중 적어도 둘, 예를 들어 임의의 순서로 a 및 b, a 및 c, 또는 b 및 c를 결정한다. 추가 실시양태에서, a, b 및 c를 각각 결정하고, A677 돌연변이, Y641 돌연변이, 또는 대조군과의 비교시 H3K27me3의 증가된 수준 중 임의의 하나가 존재하는 것으로 결정되는 경우에 EZH2 억제제, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 화합물을 투여한다.
추가 실시양태에서, Y641 돌연변이의 존재 또는 부재를 결정하며, Y641 돌연변이는 Y641F, Y641S, Y641H, Y641N 또는 Y641C이다. 다른 추가 실시양태에서, A677 돌연변이의 존재 또는 부재를 결정하며, A677 돌연변이는 A677G이다.
추가 실시양태에서, 암 세포 또는 종양 세포의 전체적 메틸화 수준의 증가를 결정한다. 다른 실시양태에서, H3K27 메틸화의 수준을 결정한다. 다른 실시양태에서, H3K27me0, H3K27me1, H3K27me2 및 H3K27me3의 수준을 결정하며, H3K27me3 수준의 증가는 EZH2 억제제로의 치료를 제안한다. 이 단락의 본 발명의 추가 실시양태에서, 메틸화의 수준을 대조군과 비교하며, 대조군에 비한 메틸화의 상대적 증가는 EZH2 억제제로의 치료를 제안한다.
EZH2의 Y641 또는 A677에서의 돌연변이를 검출하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 본원의 상세한 설명 및 실시예에 기재되어 있다. 대조군과 비교한 메틸화, 예를 들어 H3K27me3의 증가된 수준을 결정하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 실시예에 나타내었으며, 히스톤 3의 트리메틸화 리신 27에 특이적인 항체를 사용하는 것을 포함한다. 대조군은 당업자가 선택할 것, 예컨대 인간으로부터의 매치되는 세포, 인간으로부터의 매치되는 조직, 야생형 EZH2를 갖는 것으로 공지된 종양과 동일한 기원의 세포, 또는 동일한 기원의 비-암성 세포 또는 야생형 EZH2를 갖는 세포에서 보이는 것과 상호연관되는 고안된 대조군일 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 샘플은 1개 이상의 암 세포를 포함한다. 특정의 이러한 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플이다.
본원의 본 발명의 실시양태 중 임의의 하나에서, 암은 림프종이다. 본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, 림프종은 배 중심 B-세포 (GCB), 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 비장 변연부 림프종 (SMZL), 발덴스트룀 마크로글로불린혈증 림프형질세포성 림프종 (WM), 여포성 림프종 (FL), 외투 세포 림프종 (MCL), 및 점막 연관 림프 조직 (MALT)의 림프절 외 변연부 B-세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원의 본 발명의 방법의 실시양태에서, A677 돌연변이 및/또는 Y641 돌연변이는 체세포 돌연변이이다.
암을 치료하는 방법의 다른 실시양태에서, 치료는 치료되지 않은 인간과 비교하여 증가된 반응률 및/또는 개선된 무진행 생존을 포함한다.
본 발명은 하기 단계: (a) 인간으로부터의 1개 이상의 종양 세포로부터 H3K27me3의 수준을 검출하는 단계 및 (b) 상기 1개 이상의 종양 세포가 H3K27me3의 높은 수준을 갖는 경우에 상기 인간에게 유효량의 EZH2 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 인간에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 하기 단계: (a) 대상 종양으로부터의 생물학적 샘플 상에서 유전자형 결정 기술을 수행하여 상기 종양이 EZH2의 티로신 641 (Y641) 잔기에 체세포 돌연변이를 갖는지의 여부를 결정하는 단계; 및 (b) 상기 돌연변이의 검출을 EZH2 억제제 투여시 증가된 반응률 및/또는 장기간 무진행 생존의 증가된 가능성과 상호연관시키는 단계를 포함하는, 인간에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기 단계: (a) 대상 종양으로부터의 생물학적 샘플 상에서 유전자형 결정 기술을 수행하여 상기 종양이 EZH2의 티로신 641 (Y641) 잔기에 체세포 돌연변이를 갖는지의 여부를 결정하는 단계; 및 (b) 상기 종양이 EZH2의 티로신 641 잔기에 돌연변이를 갖는 경우에 인간에게 유효량의 EZH2 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 인간에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기 단계: (a) 대상 종양으로부터의 생물학적 샘플 상에서 유전자형 결정 기술을 수행하여 상기 종양이 EZH2의 티로신 641 (Y641) 잔기에 체세포 돌연변이를 갖는지의 여부를 결정하는 단계; 및 (b) 상기 종양이 EZH2의 티로신 641 잔기에 돌연변이 (여기서, 이러한 EZH2 돌연변이는 Y641N, Y641F, Y641S, Y641H 또는 Y641C임)를 갖는 경우에 인간에게 유효량의 EZH2 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 인간에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기 단계: (a) 대상 종양으로부터의 생물학적 샘플 상에서 유전자형 결정 기술을 수행하여 상기 종양이 EZH2의 A677 잔기에 체세포 돌연변이를 갖는지의 여부를 결정하는 단계; 및 (b) 상기 돌연변이의 검출을 EZH2 억제제 투여시 증가된 반응률 및/또는 장기간 무진행 생존의 증가된 가능성과 상호연관시키는 단계를 포함하는, 인간에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기 단계: (a) 대상 종양으로부터의 생물학적 샘플 상에서 유전자형 결정 기술을 수행하여 상기 종양이 EZH2의 A677 잔기에 체세포 돌연변이를 갖는지의 여부를 결정하는 단계; 및 (b) 상기 종양이 EZH2의 A677 잔기에 돌연변이를 갖는 경우에 인간에게 유효량의 EZH2 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 인간에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기 단계: (a) 대상 종양으로부터의 생물학적 샘플 상에서 유전자형 결정 기술을 수행하여 상기 종양이 EZH2의 A677 잔기에 체세포 돌연변이를 갖는지의 여부를 결정하는 단계; 및 (b) 상기 종양이 EZH2의 A677 잔기에 돌연변이 (여기서, 이러한 EZH2 돌연변이는 A677G임)를 갖는 경우에 인간에게 유효량의 EZH2 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 인간에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
정의
당업계에서 이해되는 용어 "야생형"은 유전자 변형이 없는 본래의 집단에서 발생하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 또한 당업계에서 이해되는 바와 같이, "변이체"는 각각 야생형 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에서 발견되는 상응하는 아미노산 또는 핵산과 비교하여 아미노산 또는 핵산에 대해 1개 이상의 변형을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 용어 변이체는 가장 널리 발견되는 (야생형) 핵산 가닥과 비교하여 단일 염기 쌍 차이가 핵산 가닥의 서열에 존재하는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 포함한다.
본원에 사용된 "유전자 변형" 또는 "유전자 변형된" 또는 그의 문법적 변형은 DNA 서열(들)로의 1개 이상의 염기의 임의의 억제, 치환, 증폭, 결실 및/또는 삽입을 지칭하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본원에 사용된 "유전자 변형된"은 각각 핵산 또는 아미노산의 하나 이상의 결실, 치환 또는 억제를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 또는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 유전자 변이체 및/또는 SNP는 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 야생형 또는 SNP는 DNA 증폭 및 서열분석 기술, 각각 노던 및 서던 블롯을 포함하지만 이에 제한되지 않는 DNA 및 RNA 검출 기술, 및/또는 다양한 바이오칩 및 어레이 기술에 의해 확인될 수 있다. WT 및 돌연변이체 폴리펩티드는 면역진단 기술, 예컨대 ELISA 및 웨스턴 블롯을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 검출될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 대립유전자 또는 다형성을 검출하는 과정은 혈청학적 및 유전학적 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 검출된 대립유전자 또는 다형성은 개체의 표현형에 영향을 미치는데 기능적으로 관련될 수 있거나, 또는 이것은 기능적 다형성/대립유전자와 연관 불균형 상태에 있는 대립유전자 또는 다형성일 수 있다. 다형성/대립유전자는 대상체의 게놈 DNA에서 입증되지만, 당업자에게 명백할 바와 같이, 이러한 영역으로부터 전사 또는 번역된 RNA, cDNA 또는 단백질 서열로부터 또한 검출가능할 수 있다.
유전학에서 널리 공지된 바와 같이, 동일한 유전자에 대해 상이한 공급원으로부터 얻은 뉴클레오티드 및 관련 아미노산 서열은 넘버링 스킴 및 정확한 서열 둘 다에서 상이할 수 있다. 이러한 차이는 넘버링 스킴, 유전자 내에서의 고유의 서열 다양성, 및/또는 서열분석 오차로 인한 것일 수 있다. 따라서, 번호에 의한 특정한 다형성 부위에 대한 본원에서의 언급은, 심지어 상이한 넘버링/명명법 스킴이 다형성 부위를 기재하는데 사용된 경우에도, 서열 및 유전자 내의 위치에서 상응하는 이러한 다형성 부위를 포함하는 것으로 당업자에게 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 폴리펩티드 또는 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에서 유전자(들)의 다형성 대립유전자 또는 돌연변이에 대한 대상체 (또는 DNA 또는 다른 샘플)의 "유전자형 결정"은, 돌연변이된 대립유전자 또는 다형성 형태(들)의 유전자(들) 또는 유전자 발현 산물 (예를 들어, hnRNA, mRNA 또는 단백질)이 대상체 (또는 샘플)에 존재 또는 부재하는지를 검출하는 것을 의미한다. 이러한 유전자로부터 발현된 관련 RNA 또는 단백질은 또한 돌연변이체 또는 다형성 변이를 검출하는데 사용될 수 있다. 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 개체는 특정한 대립유전자에 대해 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있다. 2종 초과의 대립유전자 형태가 존재할 수 있고, 따라서 3종 초과의 가능한 유전자형이 있을 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 대립유전자는 다른 가능한 대립유전자 변이체가 배제된 경우에 '검출'될 수 있으며; 예를 들어, 명시된 핵산 위치가 아데닌 (A), 티민 (T) 또는 시토신 (C)이 아닌 것으로 밝혀지는 경우에, 그 위치에 구아닌 (G)이 존재하는 것으로 결론지을 수 있다 (즉, 대상체에서 G가 '검출'되거나 또는 '진단'됨). 서열 다양성은 직접적으로 (예를 들어, 서열분석에 의해) 또는 간접적으로 (예를 들어, 제한 단편 길이 다형성 분석, 또는 공지된 서열의 프로브의 혼성화의 검출, 또는 참조 가닥 입체형태 다형성에 의해), 또는 다른 공지된 방법을 이용함으로써 검출될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 집단의 "유전자 하위세트"는 특정한 유전자형 또는 하나 이상의 체세포 돌연변이를 갖는 종양을 갖는 집단의 구성원으로 이루어진다. 이중대립유전자 다형성의 경우에, 집단은 잠재적으로 3개의 하위세트로 분류될 수 있다: 대립유전자 1에 대한 동형접합체 (1,1), 이형접합체 (1,2), 및 대립유전자 2에 대한 동형접합체 (2,2). 대상체의 '집단'은 다양한 기준을 이용하여 규정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 암에 대한 치료를 필요로 하는 인간은 유전자형 결정에 기반하여 특정한 표현형 반응의 "경향이 있을 수 있거나" 또는 그의 "위험이 증가할 수 있고", 표적 다형성 유전자좌 (또는 유전자좌들)에서의 유전자형이 상이한 개체보다 이러한 표현형을 나타낼 가능성이 보다 높을 것이다. 표현형 반응이 다중-대립유전자 다형성 또는 1개 초과의 유전자의 유전자형 결정에 기반하는 경우에, 상대적 위험은 가능한 다중 유전자형 사이에서 상이할 수 있다.
암에 대한 치료를 필요로 하는 인간은 다르게는 체세포 돌연변이를 갖는 종양 또는 암 세포를 가질 수 있고, 유전자형 결정 또는 돌연변이의 다른 검출이 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료에 대한 "반응" 및 그의 문법적 변형은 환자에게 의약을 투여한 후에 환자의 개선된 임상적 상태를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 반응은 또한 치료 시작 후에 악화되지 않는 환자의 상태를 의미할 수 있다. 반응은 질환 또는 장애의 특정 징후의 측정치에 의해 규정될 수 있다. 암과 관련하여, 반응은 환자에서의 종양 및/또는 종양 세포의 크기 및 또는 개수의 감소를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 반응은 또한 환자에서의 전-종양성 세포의 개수의 감소 또는 감쇄와 같은 다른 종점에 의해 규정될 수 있다.
본원에 사용된 "유전자 검사" (또한 유전자 스크리닝으로도 지칭됨)는 대상체로부터의 생물학적 샘플을 시험하여 대상체의 유전자형을 결정하는 것을 지칭하며; 대상체의 유전자형이 특정한 표현형을 유발하거나 이에 대한 감수성을 증가시키는 (또는 그 표현형을 유발하거나 또는 이에 대한 감수성을 증가시키는 대립유전자(들)와 연관 불균형 상태에 있는) 대립유전자를 포함하는지를 결정하는데 활용될 수 있다.
하나 이상의 돌연변이를 시험 또는 결정하기 위한 샘플, 예를 들어 생물학적 샘플은 단백질, 뉴클레오티드, 세포 블렙(bleb) 또는 성분, 혈청, 세포, 혈액, 혈액 성분, 소변 및 타액의 군으로부터 선택될 수 있다. 돌연변이를 위한 시험은 당업계에 공지되고/거나 본원에 기재된 여러 기술에 의해 수행될 수 있다.
유전자 또는 PCR 산물 또는 그의 단편 또는 일부를 포함하는 임의의 핵산의 서열은 당업계에 공지된 임의의 방법 (예를 들어, 화학적 서열분석 또는 효소에 의한 서열분석)에 의해 서열분석될 수 있다. DNA의 "화학적 서열분석"은 맥삼(Maxam) 및 길버트(Gilbert) (1977) (문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560])의 것과 같은 방법을 나타낼 수 있고, 여기서 DNA는 개별 염기-특이적 반응을 이용하여 무작위로 절단된다. DNA의 "효소에 의한 서열분석"은 생거 (문헌 [Sanger, et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463])의 것과 같은 방법을 나타낼 수 있다.
통상의 분자 생물학, 미생물학, 및 서열분석 기술을 비롯한 재조합 DNA 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 기술은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (본원에서 "Sambrook, et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel, et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)]을 참조한다.
펩티드 핵산 (PNA) 친화도 검정은 전통적인 혼성화 검정으로부터 유래된 것이다 (문헌 [Nielsen et al., Science 254:1497-1500 (1991); Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. 114:1895-1897 (1992); James et al., Protein Science 3:1347-1350 (1994)]). PNA는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍형성 규칙을 따르는 구조적 DNA 모방체이고, 표준 DNA 혼성화 검정에서 사용된다. PNA/DNA 미스매치가 DNA/DNA 미스매치보다 더 불안정하고, 상보적 PNA/DNA 가닥이 상보적 DNA/DNA 가닥보다 더 강한 결합을 형성하기 때문에, PNA는 혼성화 검정에서 보다 큰 특이성을 나타낸다.
DNA 마이크로어레이는 유전자 변이 및 다형성을 검출하기 위해 개발되었다 (문헌 [Taton et al., Science 289:1757-60, 2000; Lockhart et al., Nature 405:827-836 (2000); Gerhold et al., Trends in Biochemical Sciences 24:168-73 (1999); Wallace, R. W., Molecular Medicine Today 3:384-89 (1997); Blanchard and Hood, Nature Biotechnology 149:1649 (1996)]). DNA 마이크로어레이는 유리 또는 나일론 기판 상에 고속 로봇공학에 의해 제작되며, 정체성이 확인된 DNA 단편 ("프로브")을 함유한다. 마이크로어레이는 전통적인 염기-쌍형성 규칙에 기반하여 공지된 DNA 단편 및 미지의 DNA 단편 ("표적")을 매치시키는데 사용된다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 호환가능하게 사용되며, 폴리펩티드 서열의 천연 단백질, 단편, 펩티드 또는 유사체를 지칭하기 위한 일반 용어로서 본원에 사용된다. 따라서, 천연 단백질, 단편 및 유사체는 폴리펩티드 속의 종이다.
폴리펩티드 서열에서의 돌연변이와 관련하여 용어 "X#Y"는 당업계에서 인식되는 것으로, 여기서 "#"는 폴리펩티드의 아미노산 번호와 관련하여 돌연변이 위치를 나타내고, "X"는 야생형 아미노산 서열의 그 위치에서 발견되는 아미노산을 나타내며, "Y"는 그 위치에서의 돌연변이체 아미노산을 나타낸다. 예를 들어, K-ras 폴리펩티드와 관련하여 표기 "G12S"는 야생형 K-ras 서열의 아미노산 번호 12에 글리신이 존재하고, 글리신이 돌연변이체 K-ras 서열에서 세린으로 대체됨을 나타낸다.
폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 및 그의 문법적 변형에서 "돌연변이"는 하나 이상의 대립유전자 변이체, 스플라이스 변이체, 유도체 변이체, 치환 변이체, 결실 변이체 및/또는 삽입 변이체, 융합 폴리펩티드, 오르토로그, 및/또는 종간 상동체를 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 의미한다. 예로서, EZH2의 하나 이상의 돌연변이는 세포에서 생산된 EZH2 단백질 중 하나 이상에 대해 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 서열의 일부 또는 전부가 부재하거나 또는 세포에서 발현되지 않는 것인 EZH2를 포함할 것이다. 예를 들어, EZH2 단백질은 말단절단된 형태로 세포에 의해 생산될 수 있고, 말단절단된 형태의 서열은 말단절단의 서열에 걸쳐 야생형일 수 있다. 결실은 유전자 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 전부 또는 일부의 부재를 의미할 수 있다. EZH2 돌연변이는 또한 폴리뉴클레오티드 중 단일 염기에서의 돌연변이, 또는 단일 아미노산 치환을 의미한다. 추가로, 세포에서 발현되거나 세포에 의해 코딩되는 단백질 중 일부는, 예를 들어 단일 아미노산에서 돌연변이될 수 있고, 반면에 동일한 세포에서 생산된 동일한 단백질의 다른 카피는 야생형일 수 있다.
돌연변이는 당업계에 널리 공지된 다수의 방법에 의해 폴리뉴클레오티드 또는 번역된 단백질에서 검출될 수 있다. 이들 방법은 서열분석, RT-PCR 및 계내 혼성화, 예컨대 형광-기반 계내 혼성화 (FISH), 항체 검출, 단백질 분해 서열분석 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 후성적 변화, 예컨대 메틸화 상태는 또한 이것을 코딩하는 상응하는 폴리뉴클레오티드로부터의 단백질의 일부 또는 전부의 돌연변이 및/또는 발현의 결핍을 일으킬 수 있다.
본원에 사용된 "유전자 이상"은 대상체의 세포의 정상적인 천연 핵산 내용물과 관련하여 결실, 치환, 부가, 전위, 증폭 등을 의미한다. 본원에 사용된 "EZH2 단백질을 코딩하는 유전자"는 임의의 EZH2 단백질을 코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 임의의 부분을 의미한다. EZH2를 코딩하는 엑손은 상기 용어의 의미 내에 포함된다. EZH2 단백질을 코딩하는 유전자는 EZH2의 일부 또는 전부를 코딩하는 유전자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 언급된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 둘 중 어느 한 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태의, 길이가 적어도 10개의 염기인 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 상기 용어는 단일 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다.
본원에 언급된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 자연 발생 및 비-자연 발생 올리고뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 자연 발생 및 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 200개 이하의 염기의 길이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 하위세트이다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 10 내지 60개의 염기의 길이, 가장 바람직하게는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 내지 40개의 염기의 길이이다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 유전자 돌연변이체의 구축에 사용하기 위한 이중 가닥일 수도 있지만, 통상적으로 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 프로브를 위한 단일 가닥이다. 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
올리고뉴클레오티드 프로브, 또는 프로브는 전형적으로 크기가 약 8개 뉴클레오티드 내지 수백개 뉴클레오티드 길이의 범위인 핵산 분자이다. 이러한 분자는 전형적으로 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 핵산 서열에 혼성화시킴으로써 샘플에서 이러한 표적 핵산 서열을 확인하는데 사용된다. 혼성화 조건은 상기 상세하게 기재되어 있다.
PCR 프라이머가 전형적으로 폴리머라제 연쇄 반응에 사용되는 매우 짧은 길이의 올리고뉴클레오티드일지라도, PCR 프라이머도 또한 핵산 서열이다. PCR 프라이머 및 혼성화 프로브는 표적 서열로부터의 서열 정보를 이용하여 당업자에 의해 용이하게 개발 및 생산될 수 있다 (예를 들어, 상기 문헌 [Sambrook et al., 또는 Glick et al.] 참조).
본원에 사용된 "과다발현된" 및 "과다발현" 및 그의 문법적 변형은 주어진 세포가 정상 세포에 비해 증가된 수의 특정 단백질을 생산한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 몇몇 종양 세포는 정상 유방 조직으로부터의 세포와 비교하여 세포 표면 상에 Her2 또는 Erb2를 과다발현하는 것으로 알려져 있다. 유전자 전달 실험은, HER2의 과다발현이 NIH 3T3 세포를 형질전환시킬 것이고, 또한 독성 대식세포 시토카인 종양 괴사 인자에 대한 내성의 증가를 유발할 것임을 보여준 바 있다. 문헌 [Hudziak et al., "Amplified Expression of the HER2/ERBB2 Oncogene Induces Resistance to Tumor Necrosis Factor Alpha in NIH 3T3 Cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5102-5106 (1988)]. 특정한 세포에서 폴리펩티드의 발현 수준은 세포 게놈에서 다양한 조절 요소 및/또는 비-코딩 서열의 돌연변이, 결실 및/또는 치환 (이에 제한되지는 않음)에 의해 영향을 받을 수 있다.
본원에 사용된 "치료"는 장애와 연관된 하나 이상의 증상이 유익하게 변경되는 임의의 방식을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 장애의 증상 또는 부작용의 치유 또는 개선, 또는 장애의 진행 속도의 감소를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "암", "신생물" 및 "종양"은 호환가능하게 사용되며, 단수 형태이든 또는 복수 형태이든 숙주 유기체에 병적 상태를 발생시키는 악성 형질전환을 경험한 세포를 지칭한다. 원발성 암 세포 (즉, 악성 형질전환 부위 근처에서 수득되는 세포)는 널리 확립된 기술, 특히 조직학적 검사에 의해 비-암성 세포로부터 용이하게 구별될 수 있다. 암 세포의 정의는, 본원에 사용된 바와 같이, 원발성 암 세포, 뿐만 아니라 암 세포 선조로부터 유래된 임의의 세포를 포함한다. 이는 전이된 암 세포, 및 암 세포로부터 유래된 시험관내 배양물 및 세포주를 포함한다. 통상적으로 고형 종양으로 나타나는 일종의 암을 지칭하는 경우에, "임상적으로 검출가능한" 종양은, 예를 들어 CAT 스캔, MR 영상화, X선, 초음파 또는 촉진과 같은 절차에 의해 종양 덩이에 기반하여 검출가능하고/거나 환자로부터 수득가능한 샘플에서의 하나 이상의 암-특이적 항원의 발현으로 인해 검출가능한 것이다. 종양은 조혈 종양, 예를 들어 혈액 세포의 종양 등일 수 있다. 이러한 종양에 기반한 임상 상태의 구체적 예는 백혈병, 예컨대 만성 골수구성 백혈병 또는 급성 골수구성 백혈병; 골수종, 예컨대 다발성 골수종; 림프종 등을 포함한다.
암은 비정상적 개수의 모세포가 존재하거나, 또는 혈액암 또는 이형성증, 예컨대 백혈병, 골수성 악성종양 또는 골수성 이형성증, 예컨대 미분화 급성 골수 백혈병, 골수모구성 백혈병, 골수모구성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 골수단핵구성 백혈병, 단핵구성 백혈병, 적백혈병 및 거핵모구성 백혈병 (이에 제한되지는 않음)으로 진단되는 임의의 암일 수 있다. 한 측면에서, 암은 골수성 악성종양 암이다. 또 다른 측면에서, 암은 백혈병이다. 백혈병은 급성 림프구성 백혈병, 급성 비-림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수 (또는 골수성) 백혈병 (CML) 및 만성 골수단핵구성 백혈병 (CMML)일 수 있다. 한 실시양태에서, 인간은 원인불명 골수 화생 및/또는 고위험 골수이형성증 (MDS)을 앓는다. 일부 측면에서, 암은 재발성 또는 불응성이다.
조혈암은 또한 림프절, 비장, 골수, 말초 혈액 및/또는 림프절외 부위에 영향을 미칠 수 있는 림프성 악성종양을 포함한다. 림프성 암은 B-세포 악성종양을 포함하며, 이는 B-세포 비-호지킨 림프종 (B-NHL)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. B-NHL은 무통성 (또는 저등급), 중간등급 (또는 공격성) 또는 고등급 (매우 공격성)일 수 있다. 무통성 B 세포 림프종은 여포성 림프종 (FL); 소림프구성 림프종 (SLL); 변연부 림프종 (MZL), 예컨대 결절성 MZL, 림프절외 MZL, 비장 MZL, 및 융모성 림프구를 갖는 비장 MZL; 림프형질세포성 림프종 (LPL); 및 점막-연관-림프 조직 (MALT 또는 림프절외 변연부) 림프종을 포함한다. 중간등급 B-NHL은 백혈병 개입이 있거나 없는 외투 세포 림프종 (MCL), 미만성 거대 세포 림프종 (DLBCL), 여포성 대세포 (또는 등급 3 또는 등급 3B) 림프종 및 원발성 종격 림프종 (PML)을 포함한다. 고등급 B-NHL은 버킷 림프종 (BL), 버킷-유사 림프종, 소 비-분할세포 림프종 (SNCCL) 및 림프모구성 림프종을 포함한다. 다른 B-NHL은 면역모세포성 림프종 (또는 면역세포종), 원발성 삼출 림프종, HIV 연관 (또는 AIDS 관련) 림프종, 및 이식후 림프증식성 장애 (PTLD) 또는 림프종을 포함한다. B-세포 악성종양은 또한 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 전림프구성 백혈병 (PLL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (WM), 모발상 세포 백혈병 (HCL), 거대 과립 림프구 (LGL) 백혈병, 급성 림프성 (또는 림프구성 또는 림프모구성) 백혈병 및 캐슬만병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. NHL은 또한 T-세포 비-호지킨 림프종 (T-NHL)을 포함할 수 있으며, 이는 달리 명시되지 않은 (NOS) T-세포 비-호지킨 림프종, 말초 T-세포 림프종 (PTCL), 역형성 대세포 림프종 (ALCL), 혈관면역모세포성 림프성 장애 (AILD), 비강 자연 킬러 (NK) 세포 / T-세포 림프종, 감마/델타 림프종, 피부 T 세포 림프종, 균상 식육종 및 세자리 증후군을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
조혈암은 또한 호지킨 림프종 (또는 질환), 예컨대 전형적 호지킨 림프종, 결절성 경화성 호지킨 림프종, 혼합 세포형 호지킨 림프종, 림프구 우세형 (LP) 호지킨 림프종, 결절성 LP 호지킨 림프종 및 림프구 결핍형 호지킨 림프종을 포함한다. 조혈암은 또한 형질 세포 질환 또는 암, 예컨대 다발성 골수종 (MM), 예컨대 아급성 MM, 의미 미결정 (또는 미지 또는 불명)의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 형질세포종 (골, 골수외), 림프형질세포성 림프종 (LPL), 발덴스트룀 마크로글로불린혈증, 형질 세포 백혈병 및 원발성 아밀로이드증 (AL)을 포함한다. 조혈암은 또한 추가의 조혈 세포, 예컨대 다형핵 백혈구 (또는 호중구), 호염기구, 호산구, 수지상 세포, 혈소판, 적혈구 및 자연 킬러 세포의 다른 암을 포함할 수 있다. 본원에서 "조혈 세포 조직"으로 지칭되는 조혈 세포를 포함하는 조직은 골수; 말초 혈액; 흉선; 및 말초 림프 조직, 예컨대 비장, 림프절, 점막과 연관된 림프 조직 (예컨대, 장-연관 림프 조직), 편도, 파이어 패치 및 충수, 및 다른 점막, 예를 들어 기관지 내막과 연관된 림프 조직을 포함한다.
일부 실시양태에서, 샘플은 암 세포, 종양 세포, 세포, 혈액, 혈액 성분, 소변 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 화합물
암의 치료를 필요로 하는 인간에서 암을 치료하는 방법의 특정 실시양태에서, EZH2 억제제는 하기 화학식 I의 것 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 I>
Figure pct00001
상기 식에서,
W는 N 또는 CR2이고;
X 및 Z는 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, (C6-C10)비시클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 할로겐, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -NRaNRaC(O)NRaRb, -NRaNRaC(O)ORa, -ORa, -OC(O)Ra 및 -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 수소 또는 할로겐이고;
R1은 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 (C6-C10)비시클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb 또는 -CONRaNRaRb이고;
존재하는 경우에, R2는 수소, (C1-C8)알킬, 트리플루오로메틸, 알콕시 또는 할로겐이고, 여기서 상기 (C1-C8)알킬은 아미노 및 (C1-C3)알킬아미노로부터 선택된 1 내지 2개의 기로 치환될 수 있고;
R7은 수소, (C1-C3)알킬 또는 알콕시이고; R3은 수소, (C1-C8)알킬, 시아노, 트리플루오로메틸, -NRaRb 또는 할로겐이고;
R6은 수소, 할로, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, -B(OH)2, 치환 또는 비치환된 (C2-C8)알키닐, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬, (C6-C10)비시클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -NRaNRaC(O)NRaRb, -NRaNRaC(O)ORa, -ORa, -OC(O)Ra 및 -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 선택되고;
여기서, 임의의 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기는 -O(C1-C6)알킬(Rc)1 -2, -S(C1-C6)알킬(Rc)1-2, -(C1-C6)알킬(Rc)1-2, (C1-C8)알킬-헤테로시클로알킬, (C3-C8)시클로알킬-헤테로시클로알킬, 할로겐, (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra, -OC(O)NRaRb, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬 및 헤테로아릴(C1-C4)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되고;
여기서, 상기 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬 또는 헤테로아릴(C1-C4)알킬의 임의의 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티는 할로겐, (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra 및 -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되고;
각각의 Rc는 독립적으로 (C1-C4)알킬아미노, -NRaSO2Rb, -SORa, -SO2Ra, -NRaC(O)ORa, -NRaRb 또는 -CO2Ra이고;
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C6-C10)비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴이고, 여기서 상기 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기는 할로겐, 히드록실, (C1-C4)알콕시, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, -CO2H, -CO2(C1-C4)알킬, -CONH2, -CONH(C1-C4)알킬, -CON((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬), -SO2(C1-C4)알킬, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4)알킬 또는 -SO2N((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되거나;
또는 Ra 및 Rb는 이들이 부착되어 있는 질소와 함께, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는 5-8원 포화 또는 불포화 고리를 나타내고, 여기서 상기 고리는 (C1-C4)알킬, (C1-C4)할로알킬, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, 히드록실, 옥소, (C1-C4)알콕시 및 (C1-C4)알콕시(C1-C4)알킬로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되고, 여기서 상기 고리는 (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 임의로 융합되거나;
또는 Ra 및 Rb는 이들이 부착되어 있는 질소와 함께, (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 임의로 융합된 6- 내지 10-원 가교된 비시클릭 고리계를 나타낸다.
화학식 I의 화합물 및 그의 제조 방법은 WO2011/140324에 개시되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
추가 실시양태에서, EZH2 억제제는 W가 CR2인 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
추가 실시양태에서, EZH2 억제제는 하기 화학식 B를 갖는 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 B>
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화학식 B를 갖는 화합물 및 그의 제조 방법은 WO 2011/140324, 예를 들어 실시예 270에 개시되어 있다.
또 다른 실시양태에서, EZH2 억제제는 화학식 1-(1-메틸에틸)-N-[(6-메틸-2-옥소-4-프로필-1,2-디히드로-3-피리디닐)메틸]-6-[6-(4-메틸-1-피페라지닐)-3-피리디닐]-1H-인다졸-4-카르복스아미드를 갖는 화합물 A이다.
추가의 EZH2 억제제가 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, EZH2 억제제는 WO 2011/140324, WO 2011/140325 및 WO 2012/075080에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원의 임의의 실시양태에서, EZH2 억제제는 WO 2011/140324, WO 2011/140325 또는 WO 2012/075080에 개시된 화합물일 수 있다.
불확실성을 피하기 위해, 달리 나타내지 않는 한, 용어 "치환된"은 1개 이상의 정의된 기로 치환됨을 의미한다. 기가 다수의 대안적인 기로부터 선택될 수 있는 경우에, 선택된 기는 동일하거나 상이할 수 있다.
용어 "독립적으로"는 1개 초과의 치환기가 다수의 가능한 치환기로부터 선택되는 경우에 이들 치환기가 동일하거나 상이할 수 있음을 의미한다.
"유효량"은, 예를 들어 연구원 또는 임상의에 의해 추구되는 조직, 계, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출할 약물 또는 제약 작용제의 양을 의미한다. 추가로, 용어 "치료 유효량"은, 이러한 양을 투여받지 않은 상응하는 대상체와 비교하여, 질환, 장애 또는 부작용의 향상된 치료, 치유, 예방 또는 개선, 또는 질환 또는 장애의 진행 속도 감소를 일으키는 임의의 양을 의미한다. 상기 용어의 범위 내에는 또한 정상적인 생리적 기능을 증진시키는데 유효한 양이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "알킬"은 명시된 개수의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 지칭하고, 이에 예를 들어 본원에 사용된 용어 "C1C8알킬"은 각각 1개 이상 8개 이하의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 지칭한다. 본 발명에 유용한 이러한 분지쇄 또는 직쇄 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 이소부틸, n-부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸, 및 후자의 5개의 노르말 알칸의 분지형 유사체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "알콕시"는 상기 알킬의 정의에 따라 -OCH3, -OCH2CH3 및 -OC(CH3)3 등을 비롯한 -O(C1C8알킬)을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "알킬티오"는 상기 알킬의 정의에 따라 -SCH3, -SCH2CH3 등을 비롯한 -S(C1C8알킬)을 의미한다.
용어 "아실옥시"는 상기 알킬의 정의에 따라 -OC(O)C1C8알킬 등을 의미한다.
"아실아미노"는 상기 알킬의 정의에 따라 -N(H)C(O)C1C8알킬 등을 의미한다.
"아릴옥시"는 -O(아릴), -O(치환된 아릴), -O(헤테로아릴) 또는 -O(치환된 헤테로아릴)을 의미한다.
"아릴아미노"는 -NH(아릴), -NH(치환된 아릴), -NH(헤테로아릴) 또는 -NH(치환된 헤테로아릴) 등을 의미한다.
용어 "알케닐" (또는 "알케닐렌")은 명시된 개수의 탄소 원자 및 1개 이상 5개 이하의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 직쇄형 또는 분지형 탄화수소 쇄를 지칭하는데 사용된다. 예는 에테닐 (또는 에테닐렌) 및 프로페닐 (또는 프로페닐렌)을 포함한다.
용어 "알키닐" (또는 "알키닐렌")은 명시된 개수의 탄소 원자 및 1개 이상 5개 이하의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 직쇄형 또는 분지형 탄화수소 쇄를 지칭하는데 사용된다. 예는 에티닐 (또는 에티닐렌) 및 프로피닐 (또는 프로피닐렌)을 포함한다.
"할로알킬"은 1개 이상의 할로겐 치환기, 적합하게는 1 내지 6개의 치환기로 치환된 알킬 기를 지칭한다. 할로알킬은 트리플루오로메틸을 포함한다.
"시클로알킬"은 명시된 개수의 탄소 원자를 함유하는 비-방향족 포화 시클릭 탄화수소 고리를 지칭하는데 사용된다. 이에, 예를 들어 용어 "C3-C8시클로알킬"은 3 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 비-방향족 시클릭 탄화수소 고리를 지칭한다. 본 발명에 유용한 예시적인 "C3-C8시클로알킬" 기는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 및 시클로옥틸을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "C5C8시클로알케닐"은 명시된 개수의 탄소 원자 및 3개 이하의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 비-방향족 모노시클릭 카르복시시클릭 고리를 지칭한다. "시클로알케닐"은 예로서 시클로펜테닐 및 시클로헥세닐을 포함한다.
"C3C8헤테로시클로알킬"이 사용되는 경우에, 이는 포화되거나 또는 1 이상의 불포화도를 갖는 명시된 개수의 고리 원자를 함유하며, O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 1개 이상의 헤테로원자 치환을 함유하는 비-방향족 헤테로시클릭 고리를 의미한다. 이러한 고리는 임의로 하나 이상의 다른 "헤테로시클릭" 고리(들) 또는 시클로알킬 고리(들)에 융합될 수 있다. 예는 본원에 하기 제공된다.
"아릴"은 6 내지 14개의 탄소 원자를 갖고 휘켈 법칙(Hueckel's Rule)을 따르는 1개 이상의 방향족 고리를 갖는, 임의로 치환된 모노시클릭 및 폴리카르보시클릭 비융합 또는 융합 기를 지칭한다. 아릴 기의 예는 하기 추가로 예시된 바와 같이 페닐, 비페닐, 나프틸, 안트라세닐, 페난트레닐 등이다.
"헤테로아릴"은 1개 이상의 고리가 휘켈 법칙을 따르고, 명시된 개수의 고리 원자를 갖고, 그 고리가 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1개 이상의 헤테로원자를 함유하는 것인 임의로 치환된 방향족 모노시클릭 고리 또는 폴리카르보시클릭 융합 고리계를 의미한다. "헤테로아릴" 기의 예는 본원에 하기 제공된다.
용어 "임의로"는 이어서 기재되는 사건(들)이 일어나거나 일어나지 않을 수 있음을 의미하며, 일어난 사건(들) 및 일어나지 않은 사건들 둘 다를 포함한다.
본원에서 용어 "제약상 허용되는 염"은 대상 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고, 최소의 바람직하지 않은 독성 효과를 나타내는 염을 지칭한다. 이들 제약상 허용되는 염은 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 계내에서 제조될 수 있거나, 또는 별개로 그의 유리 산 또는 유리 염기 형태의 정제된 화합물을 각각 적합한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
제약 제제
본 발명의 화합물, 뿐만 아니라 그의 제약상 허용되는 염 및 용매화물을 미가공 화학물질로서 투여할 수 있는 것이 가능한 한편, 활성 성분을 제약 조성물로 제공하는 것도 또한 가능하다. 따라서, 본 발명의 실시양태는 치료 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 화합물 A 또는 화합물 B, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다. 담체(들), 희석제(들) 또는 부형제(들)는 제제의 다른 성분과 상용성이고 그의 수용자에게 유해하지 않다는 점에서 허용되는 것이어야 한다. 본 발명의 또 다른 측면에 따라, 화학식 I의 화합물, 화합물 A 또는 화합물 B를 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합하는 것을 포함하는, 제약 제제의 제조 방법이 또한 제공된다.
제약 제제는 단위 용량 당 예정량의 활성 성분을 함유하는 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. 이러한 단위는 치료할 상태, 투여 경로, 및 환자의 연령, 체중 및 상태에 따라, 예를 들어 0.5mg 내지 1g, 바람직하게는 1mg 내지 800mg의 화학식 I의 화합물을 함유할 수 있다. 바람직한 단위 투여 제제는 본원에 상기 언급된 바와 같은 1일 용량 또는 하위-용량, 또는 그의 적절한 분획의 활성 성분을 함유하는 것이다. 추가로, 이러한 제약 제제는, 예를 들어 제약 분야의 당업자에 의해 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
제약 제제는 임의의 적절한 경로, 예를 들어 경구 (협측 또는 설하 포함), 직장, 비강, 국소 (협측, 설하 또는 경피 포함), 질 또는 비경구 (피하, 근육내, 정맥내 또는 피내 포함) 경로에 의한 투여에 적합할 수 있다. 이러한 제제는 제약 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 활성 성분을 담체(들) 또는 부형제(들)와 회합시켜 제조할 수 있다.
경구 투여에 적합한 제약 제제는 이산 단위, 예컨대 캡슐 또는 정제; 분말 또는 과립; 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액; 식용 폼 또는 휩; 또는 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로서 제공될 수 있다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐 형태로 경구 투여하는 경우에, 활성 약물 성분은 경구 비-독성 제약상 허용되는 불활성 담체, 예컨대 에탄올, 글리세롤, 물 등과 조합될 수 있다. 분말은 화합물을 적합한 미세 크기로 분쇄하고, 유사하게 분쇄된 제약 담체, 예컨대 예를 들어 전분 또는 만니톨과 같은 식용 탄수화물과 혼합하여 제조한다. 향미제, 보존제, 분산제 및 착색제가 또한 존재할 수 있다.
캡슐은 상기 기재된 바와 같이 분말 혼합물을 제조하고, 형성된 젤라틴 피복을 충전시켜 제조된다. 활택제 및 윤활제, 예컨대 콜로이드성 실리카, 활석, 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘 또는 고체 폴리에틸렌 글리콜이 충전 작업 이전에 분말 혼합물에 첨가될 수 있다. 캡슐이 섭취되는 경우에 의약의 이용성을 개선하기 위해 붕해제 또는 가용화제, 예컨대 한천-한천, 탄산칼슘 또는 탄산나트륨이 또한 첨가될 수 있다.
또한, 원하거나 필요한 경우에, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 착색제가 또한 혼합물에 혼입될 수 있다. 적합한 결합제는 전분, 젤라틴, 천연 당, 예컨대 글루코스 또는 베타-락토스, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 검, 예컨대 아카시아, 트라가칸트 또는 알긴산나트륨, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 포함한다. 이들 투여 형태에 사용되는 윤활제는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨 등을 포함한다. 붕해제는 비제한적으로 전분, 메틸 셀룰로스, 한천, 벤토나이트, 크산탄 검 등을 포함한다. 정제는, 예를 들어 분말 혼합물의 제조, 과립화 또는 슬러깅, 윤활제 및 붕해제의 첨가, 및 정제로의 압축에 의해 제제화된다. 분말 혼합물은 적합하게 분쇄된 화합물을 상기 기재된 바와 같은 희석제 또는 염기, 및 임의로 결합제, 예컨대 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴 또는 폴리비닐 피롤리돈, 용해 지연제, 예컨대 파라핀, 흡수 촉진제, 예컨대 4급 염, 및/또는 흡수 작용제, 예컨대 벤토나이트, 카올린 또는 인산이칼슘과 혼합하여 제조된다. 분말 혼합물은 결합제, 예컨대 시럽, 전분 페이스트, 아카시아 점액, 또는 셀룰로스 또는 중합체 물질의 용액으로 습윤시키고, 스크린을 통해 통과시켜 과립화될 수 있다. 과립화에 대한 대안으로서, 분말 혼합물을 타정기에 통과시킬 수 있으며, 그 결과물로 과립으로 부수어지는 불완전하게 형성된 슬러그가 생성된다. 정제 형성 다이에 점착되는 것을 방지하기 위해, 스테아르산, 스테아레이트 염, 활석 또는 미네랄 오일을 첨가함으로써 과립을 윤활시킬 수 있다. 윤활된 혼합물은 이어서 정제로 압축된다. 본 발명의 화합물은 또한 자유 유동 불활성 담체와 배합되어, 과립화 또는 슬러깅 단계를 거치지 않고 직접 정제로 압축될 수 있다. 쉘락의 실링 코트, 당 또는 중합체 물질의 코팅, 및 왁스의 광택 코팅으로 이루어진 투명 또는 불투명 보호 코팅이 제공될 수 있다. 상이한 단위 투여량을 구별하기 위해 이들 코팅에 염료를 첨가할 수 있다.
경구용 유체, 예컨대 용액, 시럽 및 엘릭시르는 주어진 양이 예정량의 화합물을 함유하도록 하는 투여 단위 형태로 제조될 수 있다. 시럽은 화합물을 적합한 향미 수용액 중에 용해시킴으로써 제조될 수 있는 한편, 엘릭시르는 비-독성 알콜성 비히클을 사용하여 제조된다. 현탁액은 화합물을 비-독성 비히클 중에 분산시킴으로써 제제화될 수 있다. 가용화제 및 유화제, 예컨대 에톡실화 이소스테아릴 알콜 및 폴리옥시 에틸렌 소르비톨 에테르, 보존제, 향미 첨가제, 예컨대 페퍼민트 오일 또는 천연 감미제 또는 사카린 또는 다른 인공 감미제 등이 또한 첨가될 수 있다.
적절한 경우에, 경구 투여를 위한 투여 단위 제제는 마이크로캡슐화될 수 있다. 제제는 또한, 예를 들어 중합체, 왁스 등에 미립자 물질을 코팅 또는 포매시켜 연장 또는 지연 방출되도록 제조될 수 있다.
투여 단위 형태는 또한 당업자가 공급할 수 있는 정맥내 전달을 위한 형태로 존재할 수 있다.
예를 들어, 정맥내 전달을 위한 투여 단위 형태는 또한 리포솜 전달 시스템, 예컨대 소형 단층 소포, 대형 단층 소포 및 다층 소포의 형태로 존재할 수 있다. 리포솜은 다양한 인지질, 예컨대 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린, 또는 당업자에게 친숙한 다른 형태로부터 형성될 수 있다.
상기 구체적으로 언급된 성분 뿐만 아니라, 제제는 해당 제제의 유형에 대해 당업계에서 통상적인 다른 작용제를 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 하며, 예를 들어 경구 투여에 적합한 것은 향미제를 포함할 수 있다.
화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 치료 유효량은, 예를 들어 동물의 연령 및 체중, 치료를 요구하는 정확한 상태 및 그의 중증도, 제제의 성질 및 투여 경로를 비롯한 다수의 요인에 따라 달라질 것이며, 궁극적으로는 의사 또는 수의사의 판단에 따를 것이다. 그러나, 본원에 기재된 것과 같은 암성 상태의 치료를 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 염의 유효량은 일반적으로 1일당 0.1 내지 100 mg/kg 수용자 (포유동물) 체중의 범위, 보다 통상적으로는 1일당 1 내지 12 mg/kg 체중의 범위일 것이다. 따라서, 70kg 성체 포유동물의 경우에, 실제 1일 양은 통상적으로 70 내지 840 mg일 것이며, 이러한 양은 1일당 단일 용량으로 제공될 수 있거나, 또는 보다 통상적으로는 총 1일 용량이 동일하도록 1일당 다수 (예컨대, 2, 3, 4, 5 또는 6회)의 하위-용량으로 제공될 수 있다. 그의 염 또는 용매화물의 유효량은 화학식 I의 화합물 그 자체의 유효량의 비율에 따라 결정될 수 있다. 유사한 투여량이 상기 언급된 다른 상태의 치료에 적절할 것으로 여겨진다.
본 발명의 이들 측면에 따라 투여 또는 처방된 화합물의 양은, 예를 들어 환자의 연령 및 체중, 치료를 요구하는 정확한 상태, 상태의 중증도, 제제의 성질 및 투여 경로를 비롯한 다수의 요인에 따라 달라질 것이다. 궁극적으로는, 양은 담당 의사에 판단에 따를 것이다.
조합 및 추가의 항신생물제
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 추가의 항신생물제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
EZH2 억제제, 예컨대 화학식 I, 화합물 A 또는 화합물 B (이에 제한되지는 않음)가 암의 치료를 위해 투여되는 경우에, 본원에 사용된 용어 "공-투여" 및 그의 파생어는 본원에 기재된 바와 같은 EZH2 억제 화합물, 및 화학요법 및 방사선 치료를 비롯한 암의 치료에 유용한 것으로 공지된 추가의 활성 성분 또는 성분들의 동시 투여 또는 임의의 방식의 개별 순차적 투여를 의미한다. 본원에 사용된 추가의 활성 성분 또는 성분들이라는 용어는 암에 대한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여시 유리한 특성을 나타내는 것으로 공지되어 있거나 또는 이러한 특성을 나타내는 임의의 화합물 또는 치료제를 포함한다. 투여가 동시에 이루어지지 않는 경우에, 화합물은 서로 매우 근접한 시간 내에 투여된다. 추가로, 화합물이 반드시 동일한 투여 형태로 투여되어야 하는 것은 아니며, 예를 들어 하나의 화합물은 국소로 또는 정맥내 (i.v.) 투여될 수 있고, 또 다른 화합물은 경구로 투여될 수 있다.
전형적으로, 치료할 감수성 종양 또는 암 (예를 들어, 림프종)에 대한 활성을 갖는 임의의 항신생물제는 본 발명에서의 암의 치료에서 공-투여될 수 있다. 이러한 작용제의 예는 문헌 [Cancer Principles and Practice f Oncology by V.T. Devita and S. Hellman (editors), 6th edition (February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers]에서 찾아볼 수 있다. 당업자는 작용제의 조합이 약물 및 관련된 암의 특정한 특성에 기반하여 유용할 것인지를 인지할 수 있을 것이다. 본 발명에 유용한 전형적 항신생물제는 림프종에 대한 임의의 치료제, 예컨대: 리툭시맙, 시클로포스파미드, DNA 알킬화 가교제; 히드록시다우노루비신 (즉, 독소루비신 또는 아드리아마이신), DNA 삽입제; 온코빈 (빈크리스틴) (이는 단백질 튜불린에 결합함으로써 세포 분열을 억제함), 및 코르티코스테로이드 프레드니손 또는 프레드니솔론을 포함하는 비-호지킨 림프종에 대한 5종 성분 치료제인 R-CHOP; CHOP, R-CVP (R-CHOP와 유사하게 리툭시맙, 시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니솔론/프레드니손을 포함함), CVP; 보르테조밉; 벤다무스틴; 알렘투주맙; 및 방사선면역요법 (예를 들어, 이브리투모맙 (제발린), 토시투모맙 (벡사르))을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 유용한 다른 전형적 항신생물제는 부류 I 및 부류 II 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제 (예를 들어, 보리노스타트), DNA 메틸라제 억제제 (예를 들어, 데시타빈 또는 아자시티딘), 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT) 억제제 (예를 들어, p300 및 PCAF 억제제), 항미세관제, 예컨대 디테르페노이드 및 빈카 알칼로이드; 백금 배위 착물; 알킬화제, 예컨대 질소 머스타드, 옥사자포스포린, 알킬술포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠; 항생제, 예컨대 안트라시클린, 악티노마이신 및 블레오마이신; 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 에피포도필로톡신; 항대사물, 예컨대 퓨린 및 피리미딘 유사체 및 항폴레이트 화합물; 토포이소머라제 I 억제제, 예컨대 캄프토테신; 호르몬 및 호르몬 유사체; 신호 전달 경로 억제제; 비-수용체 티로신 키나제 혈관신생 억제제; 면역요법제; 아폽토시스 촉진제; 및 세포 주기 신호전달 억제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 EZH2 억제 화합물과 조합하여 사용하거나 공-투여하기 위한 추가의 활성 성분 또는 성분들의 예는 화학요법제이다.
항미세관제 또는 항유사분열제는 세포 주기의 M기 또는 유사분열기 동안 종양 세포의 미세관에 대해 활성인 단계 특이적 작용제이다. 항미세관제의 예는 디테르페노이드 및 빈카 알칼로이드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
천연 공급원으로부터 유래되는 디테르페노이드는 세포 주기의 G2/M기에서 작동하는 단계 특이적 항암제이다. 디테르페노이드는 미세관과 결합하여 이 단백질의 β-튜불린 서브유닛을 안정화시키는 것으로 여겨진다. 이어서, 상기 단백질의 분해가 억제되어 유사분열이 정지되고 세포 사멸이 일어나는 것으로 보인다. 디테르페노이드의 예는 파클리탁셀 및 그의 유사체 도세탁셀을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
파클리탁셀, (2R,3S)-N-벤조일-3-페닐이소세린과의 5β,20-에폭시-1,2α,4,7β,10β,13α-헥사-히드록시탁스-11-엔-9-온 4,10-디아세테이트 2-벤조에이트 13-에스테르는 태평양주목 탁수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)로부터 단리된 천연 디테르펜 생성물이고, 주사가능한 용액 탁솔(TAXOL)®로서 상업적으로 입수가능하다. 이것은 테르펜의 탁산 패밀리의 구성원이다. 이것은 1971년에 문헌 [Wani et al. J. Am. Chem, Soc., 93:2325. 1971]에 의해 최초로 단리되었으며, 화학적 방법 및 X선 결정학적 방법에 의해 그의 구조를 특성화하였다. 그의 활성에 대한 하나의 메카니즘은 튜불린에 결합함으로써 암 세포 성장을 억제하는 파클리탁셀의 능력에 관한 것이다. 문헌 [Schiff et al., Proc. Natl, Acad, Sci. USA, 77:1561-1565 (1980); Schiff et al., Nature, 277:665-667 (1979); Kumar, J. Biol, Chem, 256: 10435-10441 (1981)]. 일부 파클리탁셀 유도체의 합성 및 항암 활성의 검토에 대해서는 문헌 [D. G. I. Kingston et al., Studies in Organic Chemistry vol. 26, entitled "New trends in Natural Products Chemistry 1986", Attaur-Rahman, P.W. Le Quesne, Eds. (Elsevier, Amsterdam, 1986) pp 219-235]을 참조한다.
파클리탁셀은 미국에서 불응성 난소암 치료에서의 임상 용도 (문헌 [Markman et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 64:583, 1991; McGuire et al., Ann. lntem, Med., 111:273,1989]) 및 유방암의 치료 (문헌 [Holmes et al., J. Nat. Cancer Inst., 83:1797,1991])에 대해 승인되었다. 이는 피부에서의 신생물 (문헌 [Einzig et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 20:46]) 및 두경부 암종 (문헌 [Forastire et al., Sem. Oncol., 20:56, 1990])의 치료를 위한 잠재적인 후보이다. 이 화합물은 또한 다낭성 신장 질환 (문헌 [Woo et al., Nature, 368:750. 1994]), 폐암 및 말라리아의 치료에 대한 잠재성을 보여준다. 파클리탁셀을 사용한 환자의 치료는 역치 농도 (50nM)를 초과하는 용량의 지속시간과 관련된 골수 억제 (다중 세포 계통, 문헌 [Ignoff, R.J. et al., Cancer Chemotherapy Pocket Guide, 1998])를 유발한다 (문헌 [Kearns, C.M. et al., Seminars in Oncology, 3(6) p.16-23, 1995]).
도세탁셀, 5β-20-에폭시-1,2α,4,7β,10β,13α-헥사히드록시탁스-11-엔-9-온 4-아세테이트 2-벤조에이트와의, (2R,3S)-N-카르복시-3-페닐이소세린, N-tert-부틸 에스테르, 13-에스테르, 3수화물은 주사액 탁소테레(TAXOTERE)®로서 상업적으로 입수가능하다. 도세탁셀은 유방암 치료를 위해 처방된다. 도세탁셀은 유럽 주목의 침엽으로부터 추출된 천연 전구체인 10-데아세틸-바카틴 III를 사용하여 제조된, 파클리탁셀 q.v.의 반합성 유도체이다. 도세탁셀의 용량 제한 독성은 호중구감소증이다.
빈카 알칼로이드는 페리윙클 식물로부터 유래된 단계 특이적 항신생물제이다. 빈카 알칼로이드는 튜불린에 특이적으로 결합함으로써 세포 주기의 M기 (유사분열)에서 작용한다. 결과적으로, 결합된 튜불린 분자는 미세관으로 중합될 수 없다. 유사분열은 중기에서 정지되어 이후에 세포 사멸이 일어난다고 여겨진다. 빈카 알칼로이드의 예는 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
빈블라스틴, 빈카류코블라스틴 술페이트는 벨반(VELBAN)®이라는 주사액으로서 상업적으로 입수가능하다. 이는 다양한 고형 종양의 2차적 요법으로서의 처방이 가능하지만, 주로 고환암, 및 호지킨병; 및 림프구성 및 조직구성 림프종을 비롯한 다양한 림프종의 치료에 처방된다. 골수억제가 빈블라스틴의 용량 제한 부작용이다.
빈크리스틴, 빈카류코블라스틴, 22-옥소-, 술페이트는 온코빈(ONCOVIN)®이라는 주사액으로서 상업적으로 입수가능하다. 빈크리스틴은 급성 백혈병의 치료에 처방되며, 호지킨 및 비-호지킨 악성 림프종에 대한 치료 요법에서의 용도가 또한 발견되었다. 탈모증 및 신경학적 작용이 빈크리스틴의 가장 흔한 부작용이며, 그보다 덜한 정도로 골수억제 및 위장 점막염 작용이 발생한다.
주사액 비노렐빈 타르트레이트 (나벨빈(NAVELBINE®))로서 상업적으로 입수가능한 비노렐빈, 3',4'-디데히드로-4'-데옥시-C'-노르빈카류코블라스틴 [R-(R*,R*)-2,3-디히드록시부탄디오에이트 (1:2)(염)]은 반합성 빈카 알칼로이드이다. 비노렐빈은 다양한 고형 종양, 특히 비소세포 폐암, 진행성 유방암 및 호르몬 불응성 전립선암의 치료에 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제, 예컨대 시스플라틴과 조합되어 처방된다. 골수억제가 비노렐빈의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
백금 배위 착물은 DNA와 상호작용하는 비-단계 특이적 항암제이다. 백금 착물은 종양 세포에 유입되고 수화되어 DNA와 가닥내 및 가닥간 가교를 형성하여 종양에 대한 유해한 생물학적 작용을 유발한다. 백금 배위 착물의 예는 시스플라틴 및 카르보플라틴을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
시스플라틴, 시스-디암민디클로로백금은 플라티놀(PLATINOL)®이라는 주사액으로서 상업적으로 입수가능하다. 시스플라틴은 주로 전이성 고환암 및 난소암 및 진행성 방광암의 치료에 처방된다. 시스플라틴의 주요 용량 제한 부작용은 수화 및 이뇨에 의해 제어될 수 있는 신독성, 및 이독성이다.
카르보플라틴, 백금, 디암민 [1,1-시클로부탄-디카르복실레이트(2-)-O,O']은 파라플라틴(PARAPLATIN)®이라는 주사액으로서 상업적으로 입수가능하다. 카르보플라틴은 주로 진행성 난소 암종의 1차 및 2차 치료에 처방된다. 골수 억제가 카르보플라틴의 용량 제한 독성이다.
알킬화제는 비-단계 특이적 항암제 및 강력한 친전자체이다. 전형적으로, 알킬화제는 DNA 분자의 친핵성 모이어티, 예컨대 포스페이트, 아미노, 술프히드릴, 히드록실, 카르복실 및 이미다졸 기를 통해 DNA에 대한 공유 연결을 알킬화에 의해 형성한다. 이러한 알킬화는 핵산 기능을 파괴하여 세포 사멸을 유발한다. 알킬화제의 예는 질소 머스타드, 예컨대 시클로포스파미드, 멜팔란 및 클로람부실; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴; 및 트리아젠, 예컨대 다카르바진을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
시클로포스파미드, 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]테트라히드로-2H-1,3,2-옥사자포스포린 2-옥시드 1수화물은 시톡산(CYTOXAN)®이라는 주사액 또는 정제로서 상업적으로 입수가능하다. 시클로포스파미드는 악성 림프종, 다발성 골수종 및 백혈병의 치료에 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제와 조합되어 처방된다. 탈모증, 오심, 구토 및 백혈구감소증이 시클로포스파미드의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
멜팔란, 4-[비스(2-클로로에틸)아미노]-L-페닐알라닌은 알케란(ALKERAN)®이라는 주사액 또는 정제로서 상업적으로 입수가능하다. 멜팔란은 다발성 골수종 및 난소의 비-절제가능한 상피 암종의 완화적 치료를 위해 처방된다. 골수 억제가 멜팔란의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
클로람부실, 4-[비스(2-클로로에틸)아미노]벤젠부탄산은 류케란(LEUKERAN)® 정제로서 상업적으로 입수가능하다. 클로람부실은 만성 림프 백혈병, 및 악성 림프종, 예컨대 림프육종, 거대 여포성 림프종, 및 호지킨병의 완화적 치료를 위해 처방된다. 골수 억제가 클로람부실의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
부술판, 1,4-부탄디올 디메탄술포네이트는 밀레란(MYLERAN)® 정제로서 상업적으로 입수가능하다. 부술판은 만성 골수성 백혈병의 완화적 치료를 위해 처방된다. 골수 억제가 부술판의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
카르무스틴, 1,3-[비스(2-클로로에틸)-1-니트로소우레아는 BiCNU®라는 동결건조된 물질의 단일 바이알로서 상업적으로 입수가능하다. 카르무스틴은 뇌 종양, 다발성 골수종, 호지킨병 및 비-호지킨 림프종의 완화적 치료를 위한 단일 작용제로서 또는 다른 작용제와 조합되어 처방된다. 지연된 골수억제가 카르무스틴의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
다카르바진, 5-(3,3-디메틸-1-트리아제노)-이미다졸-4-카르복스아미드는 DTIC-Dome®이라는 물질의 단일 바이알로서 상업적으로 입수가능하다. 다카르바진은 전이성 악성 흑색종의 치료를 위해 호지킨병의 2차 치료를 위한 다른 작용제와 조합되어 처방된다. 오심, 구토 및 식욕부진이 다카르바진의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
항생제 항신생물제는 DNA와 결합하거나 그에 삽입되는 비-단계 특이적 작용제이다. 전형적으로, 이러한 작용은 안정한 DNA 복합체 또는 가닥 파괴를 일으키고, 이로 인해 핵산의 통상적인 기능이 파괴되어 세포 사멸에 이르게 된다. 항생제성 항신생물제의 예는 악티노마이신, 예컨대 닥티노마이신, 안트로시클린, 예컨대 다우노루비신 및 독소루비신; 및 블레오마이신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
닥티노마이신 (악티노마이신 D로 또한 공지되어 있음)은 코스메겐 (COSMEGEN)®이라는 주사가능한 형태로서 상업적으로 입수가능하다. 닥티노마이신은 윌름 종양 및 횡문근육종의 치료를 위해 처방된다. 오심, 구토 및 식욕부진이 닥티노마이신의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
다우노루비신, (8S-시스-)-8-아세틸-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥소피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-1-메톡시-5,12 나프타센디온 히드로클로라이드는 다우녹솜(DAUNOXOME)®이라는 리포솜 주사가능한 형태로서 또는 세루비딘(CERUBIDINE)®이라는 주사가능한 형태로서 상업적으로 입수가능하다. 다우노루비신은 급성 비림프구성 백혈병 및 진행성 HIV 연관된 카포시 육종의 치료에서 유도를 위해 처방된다. 골수억제가 다우노루비신의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
독소루비신, (8S,10S)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥소피라노실)옥시]-8-글리콜로일, 7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-1-메톡시-5,12 나프타센디온 히드로클로라이드는 루벡스(RUBEX)® 또는 아드리아마이신 RDF(ADRIAMYCIN RDF)®라는 주사가능한 형태로서 상업적으로 입수가능하다. 독소루비신은 주로 급성 림프모구성 백혈병 및 급성 골수모구성 백혈병의 치료를 위해 처방되나, 또한 몇몇 고형 종양 및 림프종의 치료에 유용한 성분이기도 하다. 골수억제가 독소루비신의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
블레오마이신 (스트렙토미세스 베르티실루스(Streptomyces verticillus)의 균주로부터 단리된 세포독성 당펩티드 항생제의 혼합물)은 블레녹산(BLENOXANE)®으로서 상업적으로 입수가능하다. 블레오마이신은 편평 세포 암종, 림프종 및 고환 암종의 완화적 치료로서 단일 작용제로서 또는 다른 작용제와 조합되어 처방된다. 폐 및 피부 독성이 블레오마이신의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
토포이소머라제 II 억제제는 에피포도필로톡신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
에피포도필로톡신은 맨드레이크 식물로부터 유래된 단계 특이적 항신생물제이다. 에피포도필로톡신은 전형적으로 토포이소머라제 II 및 DNA와 함께 3원 복합체를 형성하여 DNA 가닥을 파괴함으로써 세포 주기 중 S 및 G2기에 있는 세포에 영향을 미친다. 가닥 파괴가 축적된 후에 세포 사멸이 일어난다. 에피포도필로톡신의 예는 에토포시드 및 테니포시드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
에토포시드, 4'-데메틸-에피포도필로톡신 9[4,6-0-(R)-에틸리덴-β-D-글루코피라노시드]는 베페시드(VePESID)®라는 주사액 또는 캡슐로서 상업적으로 입수가능되고, 통상적으로 VP-16으로 공지되어 있다. 에토포시드는 고환암 및 비소세포 폐암의 치료에 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제와 조합되어 처방된다. 골수억제가 에토포시드의 가장 흔한 부작용이다. 백혈구감소증의 발생률이 혈소판감소증보다 더 심각한 경향이 있다.
테니포시드, 4'-데메틸-에피포도필로톡신 9[4,6-0-(R)-테닐리덴-β-D-글루코피라노시드]는 부몬(VUMON)®이라는 주사액으로서 상업적으로 입수가능하고, 일반적으로 VM-26으로 공지되어 있다. 테니포시드는 소아에서의 급성 백혈병 치료에 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제와 조합되어 처방된다. 골수억제가 테니포시드의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다. 테니포시드는 백혈구감소증 및 혈소판감소증 둘 다를 유발할 수 있다.
항대사물 신생물제는 DNA 합성을 억제하거나 퓨린 또는 피리미딘 염기 합성을 억제하여 DNA 합성을 제한함으로써 세포 주기의 S기 (DNA 합성)에서 작용하는 단계 특이적 항신생물제이다. 결과적으로, S기는 진행되지 않고, 이어서 세포 사멸이 일어난다. 항대사물 항신생물제의 예는 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 시타라빈, 메르캅토퓨린, 티오구아닌 및 겜시타빈을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
5-플루오로우라실, 5-플루오로-2,4-(1H,3H)피리미딘디온은 플루오로우라실로서 상업적으로 입수가능하다. 5-플루오로우라실의 투여는 티미딜레이트 합성의 억제를 유발하고, 또한 RNA 및 DNA 둘 다에 혼입된다. 그 결과는 전형적으로 세포 사멸이다. 5-플루오로우라실은 유방, 결장, 직장, 위 및 췌장의 암종 치료에 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제와 조합되어 처방된다. 골수억제 및 점막염이 5-플루오로우라실의 용량 제한 부작용이다. 다른 플루오로피리미딘 유사체는 5-플루오로 데옥시우리딘 (플록수리딘) 및 5-플루오로데옥시우리딘 모노포스페이트를 포함한다.
시타라빈, 4-아미노-1-β-D-아라비노푸라노실-2(1H)-피리미디논은 시토사르-유(CYTOSAR-U)®로서 상업적으로 입수가능하고, 일반적으로 Ara-C로 공지되어 있다. 시타라빈은, 이것이 성장하는 DNA 쇄 내로 말단 혼입되어 DNA 쇄 연장을 억제함으로써 S-기에서 세포 단계 특이성을 나타낸다고 여겨진다. 시타라빈은 급성 백혈병의 치료에 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제와 조합되어 처방된다. 다른 시티딘 유사체는 5-아자시티딘 및 2',2'-디플루오로데옥시시티딘 (겜시타빈)을 포함한다. 시타라빈은 백혈구감소증, 혈소판감소증 및 점막염을 유발한다.
메르캅토퓨린, 1,7-디히드로-6H-퓨린-6-티온 1수화물은 퓨린톨(PURINETHOL)®로서 상업적으로 입수가능하다. 메르캅토퓨린은 아직 규명되지 않은 메카니즘을 통해 DNA 합성을 억제함으로써 S-기에서 세포 단계 특이성을 나타낸다. 메르캅토퓨린은 급성 백혈병의 치료에 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제와 조합되어 처방된다. 골수억제 및 위장 점막염이 고용량에서 메르캅토퓨린의 예상되는 부작용이다. 유용한 메르캅토퓨린 유사체는 아자티오프린이다.
티오구아닌, 2-아미노-1,7-디히드로-6H-퓨린-6-티온은 타블로이드(TABLOID)®로서 상업적으로 입수가능하다. 티오구아닌은 아직 규명되지 않은 메카니즘을 통해 DNA 합성을 억제함으로써 S-기에서 세포 단계 특이성을 나타낸다. 티오구아닌은 급성 백혈병의 치료에 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제와 조합되어 처방된다. 백혈구감소증, 혈소판감소증 및 빈혈을 비롯한 골수억제가 티오구아닌 투여의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다. 그러나, 위장 부작용이 발생하며, 용량 제한적일 수 있다. 다른 퓨린 유사체는 펜토스타틴, 에리트로히드록시노닐아데닌, 플루다라빈 포스페이트 및 클라드리빈을 포함한다.
겜시타빈, 2'-데옥시-2',2'-디플루오로시티딘 모노히드로클로라이드 (β-이성질체)는 겜자르(GEMZAR)®로서 상업적으로 입수가능하다. 겜시타빈은 G1/S 경계를 통한 세포의 진행을 차단함으로써 S-기에서 세포 단계 특이성을 나타낸다. 겜시타빈은 국소 진행성 비소세포 폐암의 치료에 시스플라틴과 조합되어 처방되고, 국소 진행성 췌장암의 치료에 단독으로 처방된다. 백혈구감소증, 혈소판감소증 및 빈혈을 비롯한 골수억제가 겜시타빈 투여의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
메토트렉세이트, N-[4[[(2,4-디아미노-6-프테리디닐)메틸]메틸아미노]벤조일]-L-글루탐산은 메토트렉세이트 나트륨으로서 상업적으로 입수가능하다. 메토트렉세이트는 퓨린 뉴클레오티드 및 티미딜레이트의 합성에 필요한 디히드로폴산 리덕타제의 억제를 통해 DNA 합성, 복구 및/또는 복제를 억제함으로써 S-기에서 특이적으로 세포 단계 효과를 나타낸다. 메토트렉세이트는 융모막암종, 수막 백혈병, 비-호지킨 림프종, 및 유방, 두부, 경부, 난소 및 방광의 암종의 치료에 단일 작용제로서 또는 다른 화학요법제와 조합되어 처방된다. 골수억제 (백혈구감소증, 혈소판감소증 및 빈혈) 및 점막염은 메토트렉세이트 투여의 예상되는 부작용이다.
캄프토테신 및 캄프토테신 유도체를 비롯한 캄프토테신은 토포이소머라제 I 억제제로서 이용가능하거나 개발 중에 있다. 캄프토테신 세포독성 활성은 그의 토포이소머라제 I 억제 활성과 관련된 것으로 여겨진다. 캄프토테신의 예는 이리노테칸, 토포테칸, 및 하기 기재된 7-(4-메틸피페라지노-메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20-캄프토테신의 다양한 광학 형태를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
이리노테칸 HCl, (4S)-4,11-디에틸-4-히드록시-9-[(4-피페리디노피페리디노)카르보닐옥시]-1H-피라노[3',4',6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,14(4H,12H)-디온 히드로클로라이드는 주사액 캄프토사르(CAMPTOSAR)®로서 상업적으로 입수가능하다.
이리노테칸은 그의 활성 대사물 SN-38과 함께 토포이소머라제 I - DNA 복합체에 결합하는 캄프토테신의 유도체이다. 세포독성은 토포이소머라제 I: DNA: 이리노테칸 또는 SN-38 3원 복합체와 복제 효소의 상호작용에 의해 유발되는, 복구할 수 없는 이중 가닥 파괴의 결과로서 발생하는 것으로 여겨진다. 이리노테칸은 결장 또는 직장의 전이성 암의 치료를 위해 처방된다. 이리노테칸 HCl의 용량 제한 부작용은 호중구감소증을 비롯한 골수억제, 및 설사를 비롯한 GI 작용이다.
토포테칸 HCl, (S)-10-[(디메틸아미노)메틸]-4-에틸-4,9-디히드록시-1H-피라노[3',4',6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,14-(4H,12H)-디온 모노히드로클로라이드는 주사액 하이캄틴(HYCAMTIN)®으로서 상업적으로 입수가능하다. 토포테칸은 토포이소머라제 I - DNA 복합체에 결합하고, DNA 분자의 비틀림 변형에 대한 반응으로 토포이소머라제 I에 의해 유발되는 단일 가닥 파괴가 다시 라이게이션되는 것을 방지하는 캄프토테신의 유도체이다. 토포테칸은 난소암 및 소세포 폐암의 전이성 암종의 2차 치료를 위해 처방된다. 토포테칸 HCl의 용량 제한 부작용은 골수억제, 주로 호중구감소증이다.
또한 관심대상은 라세미 혼합물 (R,S) 형태 뿐만 아니라 R 및 S 거울상이성질체를 포함하여 현재 개발 중인 하기 화학식 F 및 하기 화학 명칭의 캄프토테신 유도체이다:
<화학식 F>
Figure pct00003
"7-(4-메틸피페라지노-메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(R,S)-캄프토테신 (라세미 혼합물) 또는 "7-(4-메틸피페라지노-메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(R)-캄프토테신 (R 거울상이성질체) 또는 "7-(4-메틸피페라지노-메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20(S)-캄프토테신 (S 거울상이성질체). 이러한 화합물 뿐만 아니라 관련 화합물은 제조 방법을 비롯하여 미국 특허 번호 6,063,923; 5,342,947; 5,559,235; 5,491,237 및 1997년 11월 24일에 출원되어 계류 중인 미국 특허 출원 번호 08/977,217에 기재되어 있다.
호르몬 및 호르몬 유사체는 호르몬(들)과 암의 성장 및/또는 성장의 결핍 사이에 관계가 있는 암을 치료하는데 유용한 화합물이다. 암 치료에 유용한 호르몬 및 호르몬 유사체의 예는 아드레노코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손 및 프레드니솔론 (이는 소아에서 악성 림프종 및 급성 백혈병 치료에 유용함); 아미노글루테티미드 및 기타 아로마타제 억제제, 예컨대 아나스트로졸, 레트라졸, 보라졸 및 엑세메스탄 (부신피질 암종, 및 에스트로겐 수용체 함유 호르몬 의존성 유방 암종의 치료에 유용함); 프로게스트린, 예컨대 메게스트롤 아세테이트 (호르몬 의존성 유방암 및 자궁내막 암종의 치료에 유용함); 에스트로겐, 안드로겐, 및 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 시프로테론 아세테이트 및 5α-리덕타제, 예컨대 피나스테리드 및 두타스테리드 (전립선 암종 및 양성 전립선 비대증의 치료에 유용함); 항에스트로겐, 예컨대 타목시펜, 토레미펜, 랄록시펜, 드롤록시펜, 아이오독시펜, 뿐만 아니라 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예컨대 미국 특허 번호 5,681,835, 5,877,219 및 6,207,716에 기재된 것들 (호르몬 의존성 유방 암종 및 기타 감수성 암의 치료에 유용함); 및 전립선 암종의 치료를 위한 황체형성 호르몬 (LH) 및/또는 여포 자극 호르몬 (FSH)의 방출을 자극하는 고나도트로핀-방출 호르몬 (GnRH) 및 그의 유사체, 예를 들어 LHRH 효능제 및 길항제, 예컨대 고세렐린 아세테이트 및 류프롤리드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
레트로졸 (상표명 페마라(Femara))은 수술 후에 호르몬-반응성 유방암의 치료를 위한 경구 비-스테로이드성 아로마타제 억제제이다. 에스트로겐은 아로마타제 효소의 활성을 통해 안드로겐의 전환에 의해 생산된다. 이어서, 에스트로겐은 에스트로겐 수용체에 결합하여, 세포 분열을 유도한다. 레트로졸은 아로마타제가 그의 시토크롬 P450 유닛의 헴에 대한 경쟁적 가역성 결합에 의해 에스트로겐을 생산하는 것을 방지한다. 작용은 특이적이고, 레트로졸은 미네랄- 또는 코르티코스테로이드의 생산을 감소시키지 않는다.
신호 전달 경로 억제제는 세포내 변화를 일으키는 화학적 과정을 차단하거나 억제하는 억제제이다. 본원에 사용된 상기 변화는 세포 증식 또는 분화이다. 본 발명에 유용한 신호 전달 억제제는 수용체 티로신 키나제, 비-수용체 티로신 키나제, SH2/SH3 도메인 차단제, 세린/트레오닌 키나제, 포스포티딜 이노시톨-3-키나제, 미오-이노시톨 신호전달 및 Ras 종양유전자의 억제제를 포함한다.
여러 단백질 티로신 키나제는 세포 성장의 조절에 관여하는 다양한 단백질 내의 특이적 티로실 잔기의 인산화를 촉매화한다. 이러한 단백질 티로신 키나제는 수용체 또는 비-수용체 키나제로서 광범위하게 분류될 수 있다.
수용체 티로신 키나제는 세포외 리간드 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 티로신 키나제 도메인을 갖는 막횡단 단백질이다. 수용체 티로신 키나제는 세포 성장의 조절에 관여하며, 일반적으로 성장 인자 수용체라 명명된다. 예를 들어 과다발현 또는 돌연변이에 의한 다수의 이들 키나제의 부적절하거나 탈제어된 활성화, 즉 비정상적인 키나제 성장 인자 수용체 활성은 탈제어된 세포 성장을 일으키는 것으로 나타났다. 따라서, 이러한 키나제의 비정상적인 활성은 악성 조직 성장과 관련이 있었다. 결과적으로, 이러한 키나제의 억제제는 암 치료 방법을 제공할 수 있다. 성장 인자 수용체는, 예를 들어 표피 성장 인자 수용체 (EGFr), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFr), erbB2, erbB4, 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFr), 이뮤노글로불린-유사 및 표피 성장 인자 상동성 도메인을 갖는 티로신 키나제 (TIE-2), 인슐린 성장 인자-I (IGFI) 수용체, 대식세포 콜로니 자극 인자 (cfms), BTK, ckit, cmet, 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 수용체, Trk 수용체 (TrkA, TrkB 및 TrkC), 에프린 (eph) 수용체 및 RET 원종양유전자를 포함한다. 여러 성장 수용체 억제제가 개발 중에 있고, 리간드 길항제, 항체, 티로신 키나제 억제제 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 성장 인자 수용체, 및 성장 인자 수용체 기능을 억제하는 작용제는, 예를 들어 문헌 [Kath, John C., Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(6):803-818; Shawver et al. DDT Vol 2, No. 2 February 1997; 및 Lofts, F. J. et al., "Growth factor receptors as targets", New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy, ed. Workman, Paul and Kerr, David, CRC press 1994, London]에 기재되어 있다.
성장 인자 수용체 키나제가 아닌 티로신 키나제는 비-수용체 티로신 키나제라고 명명된다. 항암 약물의 표적 또는 잠재적 표적인, 본 발명에 유용한 비-수용체 티로신 키나제는 cSrc, Lck, Fyn, Yes, Jak, cAbl, FAK (국소 부착 키나제), 브루톤 티로신 키나제 및 Bcr-Abl을 포함한다. 비-수용체 티로신 키나제 기능을 억제하는 이러한 비-수용체 키나제 및 작용제는 문헌 [Sinh, S. and Corey, S.J., (1999) Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research 8 (5): 465 - 80; 및 Bolen, J.B., Brugge, J.S., (1997) Annual review of Immunology. 15: 371-404]에 기재되어 있다.
SH2/SH3 도메인 차단제는, PI3-K p85 서브유닛, Src 패밀리 키나제, 어댑터 분자 (Shc, Crk, Nck, Grb2) 및 Ras-GAP를 비롯한 다양한 효소 또는 어댑터 단백질에서의 SH2 또는 SH3 도메인 결합을 파괴하는 작용제이다. 항암 약물용 표적으로서의 SH2/SH3 도메인은 문헌 [Smithgall, T.E. (1995), Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 34(3) 125-32]에 논의되어 있다.
세린/트레오닌 키나제의 억제제는 Raf 키나제 (rafk), 미토겐 또는 세포외 조절 키나제 (MEK) 및 세포외 조절 키나제 (ERK)의 차단제를 비롯한 MAP 키나제 캐스케이드 차단제; 및 PKC (알파, 베타, 감마, 엡실론, 뮤, 람다, 이오타, 제타), IkB 키나제 패밀리 (IKKa, IKKb), PKB 패밀리 키나제, AKT 키나제 패밀리 구성원 및 TGF 베타 수용체 키나제의 차단제를 비롯한 단백질 키나제 C 패밀리 구성원 차단제를 포함한다. IkB 키나제 패밀리 (IKKa, IKKb), PKB 패밀리 키나제, AKT 키나제 패밀리 구성원 및 TGF 베타 수용체 키나제. 이러한 세린/트레오닌 키나제 및 그의 억제제는 문헌 [Yamamoto, T., Taya, S., Kaibuchi, K., (1999), Journal of Biochemistry. 126 (5) 799-803; Brodt, P, Samani, A., and Navab, R. (2000), Biochemical Pharmacology, 60. 1101-1107; Massague, J., Weis-Garcia, F. (1996) Cancer Surveys. 27:41-64; Philip, P.A., and Harris, A.L. (1995), Cancer Treatment and Research. 78: 3-27, Lackey, K. et al. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, (10), 2000, 223-226]; 미국 특허 번호 6,268,391; 및 [Martinez-Iacaci, L., et al., Int. J. Cancer (2000), 88(1), 44-52]에 기재되어 있다.
PI3-키나제, ATM, DNA-PK 및 Ku의 차단제를 비롯한 포스포티딜 이노시톨-3 키나제 패밀리 구성원의 억제제가 또한 본 발명에 유용하다. 이러한 키나제는 문헌 [Abraham, R.T. (1996), Current Opinion in Immunology. 8 (3) 412-8; Canman, C.E., Lim, D.S. (1998), Oncogene 17 (25) 3301-3308; Jackson, S.P. (1997), International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 29 (7):935-8; 및 Zhong, H. et al., Cancer res, (2000) 60(6), 1541-1545]에 논의되어 있다.
또한, 미오-이노시톨 신호전달 억제제, 예컨대 포스포리파제 C 차단제 및 미오이노시톨 유사체가 본 발명에 유용하다. 이러한 신호 억제제는 문헌 [Powis, G., and Kozikowski A., (1994) New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy ed., Paul Workman and David Kerr, CRC press 1994, London]에 기재되어 있다.
신호 전달 경로 억제제의 또 다른 군은 Ras 종양유전자의 억제제이다. 이러한 억제제는 파르네실트랜스퍼라제의 억제제, 게라닐-게라닐 트랜스퍼라제의 억제제 및 CAAX 프로테아제의 억제제 뿐만 아니라 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 및 면역요법을 포함한다. 이러한 억제제는 야생형 돌연변이체 ras를 함유하는 세포에서 ras 활성화를 차단함으로써 항증식제로서 작용하는 것으로 밝혀졌다. Ras 종양유전자 억제는 문헌 [Scharovsky, O.G., Rozados, V.R., Gervasoni, S.I. Matar, P. (2000), Journal of Biomedical Science. 7(4) 292-8; Ashby, M.N. (1998), Current Opinion in Lipidology. 9 (2) 99 - 102; 및 Bennett, C.F. and Cowsert, L.M. BioChim. Biophys. Acta, (1999) 1489(1):19-30]에 논의되어 있다.
상기 언급된 바와 같이, 수용체 키나제 리간드 결합에 대한 항체 길항제도 또한 신호 전달 억제제로서 작용할 수 있다. 상기 군의 신호 전달 경로 억제제는 수용체 티로신 키나제의 세포외 리간드 결합 도메인에 대한 인간화 항체를 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 임클론(Imclone) C225 EGFR 특이적 항체 (문헌 [Green, M.C. et al., Monoclonal Antibody Therapy for Solid Tumors, Cancer Treat. Rev., (2000), 26(4), 269-286] 참조); 헤르셉틴(Herceptin)® erbB2 항체 (문헌 [Tyrosine Kinase Signalling in Breast cancer:erbB Family Receptor Tyrosine Kniases, Breast cancer Res., 2000, 2(3), 176-183] 참조); 및 2CB VEGFR2 특이적 항체 (문헌 [Brekken, R.A. et al., Selective Inhibition of VEGFR2 Activity by a monoclonal Anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice, Cancer Res. (2000) 60, 5117-5124] 참조)가 있다.
비-수용체 키나제 혈관신생 억제제가 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 혈관신생 관련 VEGFR 및 TIE2의 억제제는 신호 전달 억제제와 관련하여 상기에 논의되어 있다 (수용체는 둘 다 수용체 티로신 키나제임). erbB2 및 EGFR의 억제제는 혈관신생, 주로 VEGF 발현을 억제하는 것으로 나타났기 때문에, 혈관신생은 일반적으로 erbB2/EGFR 신호 전달과 관련이 있다. 따라서, 혈관신생의 억제제와의 erbB2/EGFR 억제제의 조합은 타당하다. 따라서, 비-수용체 티로신 키나제 억제제는 본 발명의 EGFR/erbB2 억제제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, VEGFR (수용체 티로신 키나제)을 인식하지 않지만, 리간드에는 결합하는 항-VEGF 항체; 혈관신생을 억제하는 인테그린 (알파v 베타3)의 소분자 억제제; 엔토스타틴 및 안지오스타틴 (비-RTK)은 또한 개시된 erb 패밀리 억제제와 조합되어 유용한 것으로 판명될 수 있다 (문헌 [Bruns CJ et al. (2000), Cancer Res., 60: 2926-2935; Schreiber AB, Winkler ME, and Derynck R. (1986), Science, 232: 1250-1253; Yen L et al. (2000), Oncogene 19: 3460-3469] 참조).
보트리엔트(VOTRIENT)®로서 상업적으로 입수가능한 파조파닙은 티로신 키나제 억제제 (TKI)이다. 파조파닙은 화학 명칭 5-[[4-[(2,3-디메틸-2H-인다졸-6-일)메틸아미노]-2-피리미디닐]아미노]-2-메틸벤젠술폰아미드 모노히드로클로라이드를 갖는 히드로클로라이드 염으로 제공된다. 파조포닙은 진행성 신세포 암종을 갖는 환자의 치료에 대해 승인받았다.
아바스틴(AVASTIN)®으로서 상업적으로 입수가능한 베바시주맙은 VEGF-A를 차단하는 인간화 모노클로날 항체이다. 아바스틴®는 결장직장, 폐, 유방, 신장 및 교모세포종을 비롯한 다양한 암의 치료에 대해 승인된 형태이다.
mTOR 억제제는 라파마이신 (FK506) 및 라파로그, RAD001 또는 에베롤리무스 (아피니토르(Afinitor)), CCI-779 또는 템시롤리무스, AP23573, AZD8055, WYE-354, WYE-600, WYE-687 및 Pp121을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
에베롤리무스는 노파르티스(Novartis)에 의해 아피니토르®로서 시판되고, 시롤리무스의 40-O-(2-히드록시에틸) 유도체이며, mTOR (라파마이신의 포유동물 표적) 억제제로서 시롤리무스와 유사하게 작용한다. 이는 현재 기관 이식의 거부의 예방 및 신세포 암의 치료를 위한 면역억제제로 사용된다. 많은 연구는 또한 수많은 암에 사용하기 위해 에베롤리무스 및 다른 mTOR 억제제에 대해 수행되었다. 이는 하기 화학 구조 (화학식 V) 및 화학 명칭을 갖는다:
<화학식 V>
Figure pct00004
디히드록시-12-[(2R)-1-[(1S,3R,4R)-4-(2-히드록시에톡시)-3-메톡시시클로헥실]프로판-2-일]-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-11,36-디옥사-4-아자트리시클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-2,3,10,14,20-펜톤.
벡사로텐은 탈그레틴(Targretin)®으로 시판되고, 레티노이드 X 수용체 (RXR)를 선택적으로 활성화시키는 레티노이드의 하위부류의 구성원이다. 이러한 레티노이드 수용체는 레티노산 수용체 (RAR)와 구별되는 생물학적 활성을 갖는다. 화학 명칭은 4-[1-(5,6,7,8-테트라히드로-3,5,5,8,8-펜타메틸-2-나프탈레닐)에테닐]벤조산이다. 벡사로텐은 질환이 하나 이상의 다른 의약과 성공적으로 치료될 수 없는 사람들에서 피부 T-세포 림프종 (CTCL, 일종의 피부암)을 치료하는데 사용된다.
넥사바르(Nexavar)®로 판매되는 소라페닙은 멀티키나제 억제제로 지칭되는 의약의 부류에 포함된다. 그의 화학 명칭은 4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카르바모일아미노]페녹시]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드이다. 소라페닙은 진행성 신세포 암종 (신장에서 시작되는 일종의 암)을 치료하는데 사용된다. 소라페닙은 또한 절제불가능한 간세포성 암종 (수술로 치료될 수 없는 일종의 간암)을 치료하는데 사용된다.
면역치료 요법에서 사용되는 작용제는 또한 화학식 I의 화합물과 조합되어 유용할 수 있다. erbB2 또는 EGFR에 대하여 면역 반응을 발생시키는 다수의 면역학적 전략이 존재한다. 이들 전략은 일반적으로 종양 백신접종의 영역에 속한다. 면역학적 접근법의 효능은 소분자 억제제를 사용하는 erbB2/EGFR 신호전달 경로의 조합된 억제를 통해 크게 증진될 수 있다. erbB2/EGFR에 대한 면역학적/종양 백신 접근법의 논의는 문헌 [Reilly RT et al. (2000), Cancer Res. 60: 3569-3576; 및 Chen Y, Hu D, Eling DJ, Robbins J, and Kipps TJ. (1998), Cancer Res. 58: 1965-1971]에서 찾아볼 수 있다.
erbB 억제제의 예는 라파티닙, 에를로티닙 및 게피티닙을 포함한다. 라파티닙, N-(3-클로로-4-{[(3-플루오로페닐)메틸]옥시}페닐)-6-[5-({[2-(메틸술포닐)에틸]아미노}메틸)-2-푸라닐]-4-퀴나졸린아민 (하기 예시된 바와 같이, 화학식 VI에 의해 나타내어짐)은, HER2-양성 전이성 유방암의 치료에 있어서 카페시타빈과의 조합물로 승인된, erbB-1 및 erbB-2 (EGFR 및 HER2) 티로신 키나제의 강력한 경구 소분자 이중 억제제이다.
<화학식 VI>
Figure pct00005
화학식 VI의 화합물의 유리 염기, HCl 염 및 디토실레이트 염은, WO 99/35146 (1999년 7월 15일에 공개됨); 및 WO 02/20552 (2002년 1월 10일에 공개됨)에 개시된 절차에 따라 제조될 수 있다.
에를로티닙, N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스{[2-(메틸옥시)에틸]옥시}-4-퀴나졸린아민 (상표명 타르세바(Tarceva) 하에 상업적으로 입수가능함)은 하기 예시된 바와 같이 화학식 VII에 의해 나타내어진다:
<화학식 VII>
Figure pct00006
에를로티닙의 유리 염기 및 HCl 염은, 예를 들어 U.S. 5,747,498, 실시예 20에 따라 제조될 수 있다.
게피티닙, 4-퀴나졸린아민,N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-[3-4-모르폴린)프로폭시]는 하기 예시된 바와 같이 화학식 VIII에 의해 나타내어진다:
<화학식 VIII>
Figure pct00007
게피티닙 (상표명 이레사(IRESSA)®, 아스트라-제네카(Astra-Zeneca)) 하에 상업적으로 입수가능함)은, 백금-기반 및 도세탁셀 화학요법 둘 다 실패한 후, 국소 진전된 또는 전이성 비소세포 폐암을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 단독요법으로서 처방되는 erbB-1 억제제이다. 게피티닙의 유리 염기, HCl 염 및 디HCl 염은, 국제 특허 출원 번호 PCT/GB96/00961 (1996년 4월 23일에 출원되고, 1996년 10월 31일에 WO 96/33980으로 공개됨)의 절차에 따라 제조될 수 있다.
트라스투주맙 (헤르셉틴®)은 HER2 수용체에 결합하는 인간화 모노클로날 항체이다. 그의 최초의 적응증은 HER2 양성 유방암이다.
세툭시맙 (에르비툭스(ERBITUX)®)은 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 억제하는 키메라 마우스 인간 항체이다.
페르투주맙 (또한 2C4로 지칭됨, 상표명 옴니타르그(Omnitarg))은 모노클로날 항체이다. 작용제 계열의 그의 부류 중 첫번째는 "HER 이량체화 억제제"로 지칭된다. HER2에 결합함으로써, 이는 종양 성장을 느리게 하는 것으로 가정된 다른 HER 수용체와의 HER2의 이량체화를 억제한다. 페르투주맙은 2001년 1월 4일에 공개된 WO01/00245에 기재되어 있다.
리툭시맙은 리툭산(RITUXAN)® 및 맙테라(MABTHERA)®로서 시판되는 키메라 모노클로날 항체이다. 리툭시맙은 B 세포 상의 CD20에 결합하고, 세포 아폽토시스를 유발한다. 리툭시맙은 정맥내로 투여되고, 류마티스 관절염 및 B-세포 비-호지킨 림프종의 치료에 대해 승인받았다.
오파투무맙은 아르제라(ARZERRA)®로서 시판되는 완전 인간 모노클로날 항체이다. 오파투무맙은 B 세포 상의 CD20에 결합하고, 플루다라빈 (플루다라) 및 알렘투주맙 (캄파트)을 사용한 치료에 불응성인 성인에서 만성 림프구성 백혈병 (CLL; 백혈구의 암의 일종)를 치료하는데 사용된다.
아폽토시스 촉진 요법에 사용되는 작용제 (예를 들어, bcl-2 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 또한 본 발명의 조합물에 사용될 수 있다. Bcl-2 패밀리 단백질의 구성원은 아폽토시스를 차단한다. 따라서, bcl-2의 상향조절은 내화학성과 관련이 있다. 연구는 표피 성장 인자 (EGF)가 bcl-2 패밀리의 항아폽토시스 구성원 (즉, mcl-1)을 자극하는 것으로 나타냈다. 따라서, 종양에서 bcl-2의 발현을 하향조절하도록 고안된 전략은 임상적 이익이 입증되어, 현재 II상/III상 시험 중에 있으며, 이는 즉 겐타(Genta)의 G3139 bcl-2 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. bcl-2에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 전략을 이용하는 이러한 아폽토시스 촉진 전략은 문헌 [Water JS et al. (2000), J. Clin. Oncol. 18: 1812-1823; 및 Kitada S et al. (1994), Antisense Res. Dev. 4: 71-79]에 논의되어 있다.
세포 주기 신호전달 억제제는 세포 주기의 제어에 관여하는 분자를 억제한다. 시클린 의존성 키나제 (CDK)로 지칭되는 단백질 키나제 패밀리, 및 이들과 시클린으로 지칭되는 단백질 패밀리의 상호작용은 진핵 세포 주기를 통한 진행을 제어한다. 다양한 시클린/CDK 복합체의 조화된 활성화 및 불활성화는 세포 주기를 통한 정상적인 진행에 필요하다. 세포 주기 신호전달의 여러 억제제가 개발 중에 있다. 예를 들어, CDK2, CDK4 및 CDK6을 비롯한 시클린 의존성 키나제 및 이들에 대한 억제제의 예는, 예를 들어 문헌 [Rosania et al., Exp. Opin. Ther. Patents (2000) 10(2):215-230]에 기재되어 있다.
본 발명의 임의의 암 치료 방법은, EZH2의 Y641 또는 A677에서의 돌연변이 또는 H3K27me3의 증가된 수준 중 하나가 검출된 경우에, 하나 이상의 추가의 항신생물제, 예컨대 항미세관제, 백금 배위 착물, 알킬화제, 항생제, 토포이소머라제 II 억제제, 항대사물, 토포이소머라제 I 억제제, 호르몬 및 호르몬 유사체, 신호 전달 경로 억제제, 비-수용체 티로신 키나제 혈관신생 억제제, 면역요법제, 아폽토시스 촉진제 및 세포 주기 신호전달 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로의 치료를 추가로 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1: 세포 배양 및 원발성 종양 시편. Pfeiffer DLBCL 세포주 (ATCC)는 10% 태아 소 혈청 (FBS) (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))으로 보충된 RPMI-1640 배지 (미디어테크(MediaTech)) 중에서 유지시켰다. 다른 모든 세포주는 ATCC 또는 DSMZ로부터 입수하였으며, 권고된 세포 배양 배지 중에서 유지시켰다. 41명의 림프종 환자에 대한 게놈 DNA는 오리진(OriGene; 메릴랜드주 록빌)으로부터 입수하였다. 높은 종양 함량 (>40%)을 갖는 병리상태-확인된 종양 조직의 동결된 블록으로부터 DNA를 추출하였다. 조직은 IRB 승인 및 환자 사전 동의에 따라 분자 분석을 위해 수집하였다. 종양 시편의 상세한 임상적 특성은 표 2에 나타내었다.
실시예 2: 히스톤 H3 및 H3K27me3 수준의 ELISA-기반 정량화. 세포주를 수확하고, 1X PBS로 헹구고, 원심분리하였다. 세포 펠릿을 0.2N HCl로 30분 동안 용해시켜 히스톤을 추출하였다. 산 불용성 부분을 원심분리에 의해 펠릿화시키고, 상청액을 프로테아제 억제제 (로슈(Roche))를 함유하는 중화 완충제 (1M Na2HPO4, pH 12.5; 액티브모티프(ActiveMotif))로 중화시켰다. 단백질 용해물 및 재조합 H3K27me3 (액티브모티프)을 중화된 용해 완충제 중에서 적정하고, 맥시소르프(Maxisorp) ELISA 플레이트 (눈크(Nunc))에 각각의 2개의 플레이트 상에 2벌로 첨가하였다. 차단 완충제 (1% BSA)를 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션한 후, 트윈-20(Tween-20) (KPL)을 함유하는 이미다졸 완충 염수로 4회 세척하였다. 플레이트를 H3K27me3 (셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)) 또는 전체 H3 (액티브모티프)에 대한 1차 항체와 함께 인큐베이션하고, 세척하고, 2차 항-토끼 IgG HRP-연결된 항체 (셀 시그널링 테크놀로지)와 함께 인큐베이션하였다. 루미나타 포르테(Luminata Forte) 기질 (밀리포어(Millipore))을 첨가하고, 5분 후에 엔비전(EnVision) 다중-표지 플레이트 판독기 (퍼킨엘머(PerkinElmer))를 사용하여 화학발광을 정량화하였다. 재조합 H3K27me3 신호를 표준 대조군으로 이용하여 세포주 당 H3K27me3 및 전체 H3 수준을 계산하고, H3K27me3 값을 전체 H3 값에 대해 정규화하였다.
실시예 3: H3K27 메틸화 스테이터스의 웨스턴 블롯 분석. 세포주를 PBS로 헹구고, 얼음 상에서 프로테아제 및 포스파타제 억제제 (로슈)를 함유하는 RIPA 완충제 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))로 용해시켰다. 이어서, 용해물을 브랜슨(Branson) 초음파처리기 150 (세팅 = 2)을 사용하여 15초 동안 초음파처리하고, 단백질 농도를 BCA 단백질 검정 (써모 사이언티픽)으로 결정하였다. 이어서, 단백질 용해물 (1-5μg)을 비스-트리스 SDS-폴리아크릴아미드 겔 (인비트로젠(Invitrogen)) 상에서 변성시키고 전기영동한 후, PVDF 막 (인비트로젠)으로 전달시켰다. 막을 오디세이 차단 완충제 (리-코르)로 차단하고, EZH2 (BD 트랜스덕션 랩스(BD Transduction Labs)), 히스톤 H3 (압캠(Abcam)), H3K27me1, H3K27me3 (셀 시그널링 테크놀로지) 또는 액틴 (시그마)을 인식하는 항체로 프로브처리하였다. 0.1% 트윈-20을 함유하는 PBS (PBST)로 세척한 후, 막을 형광 2차 항체 (리-코르)와 혼성화하고, PBST로 세척하고, 오디세이 적외선 영상화 시스템 (리-코르)을 사용하여 영상화하였다.
실시예 4: EZH2의 전장 생거 서열분석. 맥스웰(Maxwell) 16 세포 DNA 정제 키트 (프로메가)를 사용하여 게놈 DNA (gDNA)를 세포 펠릿으로부터 단리하였다. 변형된 RNeasy 키트 절차 (퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 전체 RNA를 준비하고, HiFi 제1 가닥 cDNA 합성 키트 프로토콜 (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics))을 이용하여 cDNA로 전환시켰다. 꼬리에 M13 범용 서열분석 프라이머 서열 (인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies))을 갖는 프라이머 (표 3) 및 핫스타택(HotstarTaq) DNA 폴리머라제 (퀴아젠)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. DNA (50ng)가 증폭되었고, PCR 생성물을 암퓨어(AmPure) (아젠쿠르 바이오사이언스(Agencourt Bioscience))를 사용하여 정제하였다. M13 프라이머를 갖는 정제된 PCR 생성물의 직접 서열분석은 v3.1 빅 다이(Big Dye)-종결자 순환 서열분석 키트 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 사용하여 3730XL 유전자 분석기 (어플라이드 바이오시스템즈)로 수행하였다. 서열분석 반응을 분석하였고, 모든 서열은 코돈 코드 정렬기 (코돈코드 코포레이션(CodonCode Corporation))를 사용하여 조립하고 분석하였다.
실시예 5: 세포에서의 야생형 및 돌연변이체 EZH2 단백질의 일시적 발현. 형질감염 전날에 MCF-7 유방암 세포 (3x105개; ATCC)를 10% FBS로 보충된 RPMI-1640 배지 중에서 6-웰 조직 배양 플레이트에 시딩하였다. 제조업체의 권고에 따라, 2 μg 플라스미드 DNA 및 6 μl 리포펙타민 2000 (인비트로젠)을 500 μl Opti-MEM (인비트로젠) 중에서 합하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 세포에 첨가하였다. 이어서, 상기 기재된 바와 같은 단백질 용해물 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 수확할 때까지 세포를 37℃에서 5% CO2와 함께 인큐베이션하였다.
실시예 6: EZH2 야생형 및 돌연변이체 5-원 PRC2의 클로닝, 발현 및 정제. 인간 EED1 (NM_003797), SUZ12 (NP_056170), RbAp48 (RBBP4; NP_005601) 및 AEBP2 (NP_694939)를 pENTR/TEV/D-TOPO (인비트로젠) 내로 클로닝하고, pDEST8 (인비트로젠) 내로 서브-클로닝하였다. 인간 EZH2 (NP_001190176)를 pENTR/TEV/D-TOPO 내로 클로닝하고, N-말단 FLAG 에피토프 태그를 함유하는 pDEST8 내로 서브-클로닝하였다. pENTR/TEV/D-TOPO 내의 인간 EZH2를 부위-지정 돌연변이유발 (퀵체인지(QuikChange) II XL, 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies))에 의해 돌연변이유발시켜 A677G, Y641N, Y641F, Y641C, Y641H 또는 Y641S의 단일 아미노산 변화를 도입시키고 (표 4), N-말단 FLAG 에피토프 태그를 함유하는 pDEST8 내로 서브-클로닝하였다. 모든 돌연변이체의 전체 코딩 영역을 이중 가닥 서열분석에 의해 확인하였다. 포유동물 발현 연구를 위해, 야생형 인간 EZH2를 pIRES2-ZsGreen1 (클론테크(Clontech)) 내로 서브-클로닝하였다. 이어서, 상기 기재된 바와 같이 부위-지정 돌연변이유발을 활용하여 A677 및 Y641 돌연변이체를 수득하였다.
EED1, SUZ12, RbAp48, AEBP2 및 FLAG-tev-EZH2의 발현을 위해 Bac-to-Bac® 시스템 (인비트로젠)을 사용하여 개별 바큘로바이러스 스톡을 생성하였다. 각각의 성분에 대해 10 L 웨이브 백 당 2x107개의 바큘로바이러스 감염된 곤충 세포를 첨가함으로써 Sf9 곤충 세포에서 모든 5종의 PRC2 성분을 공-발현시켰다. 세포를 27℃에서 인큐베이션하고, 세포 페이스트를 감염-후 66-70시간 사이에 수확하였다.
flag-태그부착된 야생형 EZH2 또는 돌연변이체 EZH2 (A677G, Y641F, Y641N, Y641S, Y641H 또는 Y641C)를 함유하는 PRC2 복합체 (EZH2, EED, SUZ12, AEBP2, RbAp48)를 1 L Sf9 세포 페이스트 용해물로부터 10 ml 항-FLAG M2 수지 (시그마)를 사용하여 4℃에서 정제하였다. 수지를 XK26 칼럼 내에 패킹하고, 완충제 A (50 mM 트리스 HCl pH7.5, 250 mM NaCl, 2 mM DTT)로 세척하였다. 이어서, PRC2 복합체를 100 μg/mL FLAG 펩티드 (캘리포니아 펩티드 리서치(California Peptide Research))를 함유하는 완충제 A로 용리하였다. 이어서, EZH2를 함유하는 분획을 모으고, 완충제 A로 평형화시킨 슈퍼덱스(Superdex) 200 칼럼 (16/60) (GE 파마시아(GE Pharmacia))에 적용시켰다. 단량체 PRC2 복합체를 수집하고, 순도를 SDS-PAGE에 의해 평가하고, 모든 성분 및 EZH2 돌연변이를 펩티드 맵핑 분석에 의해 확인하였다.
실시예 7: 메틸트랜스퍼라제 활성의 생화학적 평가. 달리 언급되지 않는 한, 모든 시약은 시그마로부터 입수하였고, 최소 시약 등급이었다. 비변형, 모노-메틸화 또는 디-메틸화된 리신 27을 갖는 히스톤 H3 펩티드 (AA21-44; ATKAAR K SAPATGGVKKPHRYRPGG[K-Ahx-비오틴]-아미드)의 주문제작 합성물은 21st 센츄리 바이오케미칼즈(21st Century Biochemicals; 매사추세츠주 말보로)로부터 구입하였다. 라이브러리 내에 함유된 펩티드는 21st 센츄리 바이오케미칼즈, 아나스펙(AnaSpec; 캘리포니아주 프리몬트) 또는 알타 바이오사이언스(Alta Bioscience; 영국 버밍엄)로부터 획득하였다. 마이크로신트20(MicroScint20), 스트렙타비딘 SPA 비드 (RPNQ0261) 및 [3H-]S-아데노실-메티오닌 (SAM)은 퍼킨엘머로부터 구입하였다.
모든 반응은 50 mM 트리스-HCl (pH8.0), 2 mM MgCl2, 4 mM DTT 및 트윈-20 (EZH2 펩티드 활성 검정의 경우에 0.001%; 뉴클레오솜 활성 검정의 경우에 0.002%)을 함유하는 검정 완충제 중에서 주위 온도에서 평가하였다.
펩티드 검정의 경우에, 다양한 농도의 H3K27 펩티드 및 [3H-]SAM을 함유하는 96-웰 반응 플레이트 (코닝(Corning))에 EZH2 (20 nM)를 첨가하였다. 반응 진행 곡선의 선형 부분 도중에 0.1 mM 비표지된 SAM을 첨가하여 반응물을 켄칭하였다. 켄칭된 반응 혼합물을 0.2 M NH4HCO3, pH 8.0 (세척 완충제 1)으로 미리 세척한 96-웰 멀티-스크린 HTS 필터 플레이트 (밀리포어 MSPHNXB50)로 옮기고, 30분 동안 인큐베이션하여 포획되도록 하였다. 이어서, 필터 플레이트를 추가의 세척 완충제 1 150 μL 분취액으로 4회 세척하고, 건조되도록 하였다. 마이크로신트20 (60μL/웰)을 첨가하고, 밀봉한 플레이트를 30분 동안 인큐베이션하고, 포획된 [3H-]Me-펩티드 또는 [3H-]Me-뉴클레오솜을 탑카운트(TopCount) 액체 섬광 계수기에서 모니터링하였다. 여과 후에 개별 플레이트 상에 위치시킨 반응 표준물에 대해 출력 DPM을 정규화하였다.
뉴클레오솜 검정의 경우에, 필터 플레이트 (밀리포어 MSDEN6B50) 및 세척 완충제 (50 mM 인산칼륨, pH 7.6, 세척 완충제 2)를 제외하고는 유사한 절차를 이용하였다. 모노- 및 디-뉴클레오솜을 이전에 기재된 바와 같이 HeLa 세포로부터 정제하였다 (35). 불균질 천연 뉴클레오솜 제조물 내의 개별 모노-뉴클레오솜 단위의 분자량은 개별 히스톤의 누적 중량 [2xH2A (2x14.0 kDa) + 2xH2B (2x13.8 kDa) + 2xH3 (2x15.2 kDa) + 2xH4 (2x11.2 kDa) + 200 염기쌍 dsDNA (200x0.66 kDa)]에 기반하여 추정하였다.
기질 공-적정으로부터 획득한 속도 데이터를 순차적 동역학 메카니즘에 따른 방정식 (1)에 적합시켰다. 방정식 (1)에 대해, V는 최대 속도이고, k cat 는 효소 농도에 대해 정규화된 V를 나타내고, A 및 B는 기질 농도를 나타내고, K ia는 A에 대한 해리 상수이며, K a 및 K b는 각각 기질 A 및 B에 대한 미카엘리스(Michaelis) 상수이다.
Figure pct00008
실시예 8: EZH2의 구조적 모델링. 야생형 EZH2의 상동성 모델을 1차 주형으로서 H3K9me2 펩티드 기질 (PDB ID = 2RFI)에 결합된 GLP/EHMT1을 이용하여 구축하고, 규명된 결정 구조를 갖는 다른 관련된 SET 도메인 함유 히스톤 리신 메틸트랜스퍼라제와 구조적으로 비교하였다. 상동성 모델은 케미칼 컴퓨팅 그룹(Chemical Computing Group; CCG)으로부터의 몰레큘라 오퍼레이팅 인바이론먼트(Molecular Operating Environment)의 2009 버전을 사용하여 구축하였다. 잔기를 MOE에서 돌연변이시키고, 회전이성질체 기하구조의 탐색으로부터 최적 배향을 선택하였다. A677G 돌연변이체의 모델 (도 5C)의 경우에는, 트리-메틸화에 대해 최적인 배향에서 디-메틸화 리신을 수동으로 회전시킨 후에 Y641의 저에너지 회전이성질체를 선택하였다.
실시예 9: 증식에 대한 효과를 평가하고 성장 IC50 (gIC50)을 계산하기 위한 검정 프로토콜. 세포를 플라스크에서 적절한 배지 중에서 80-100% 전면생장률로 배양하였다. 세포를 수확하고, 계수하고, 384-웰 조직 배양 플레이트 (그라이너(Greiner) #781090)에 개별 세포주의 성장 특성에 따라 웰당 50개 세포 내지 웰당 4000개 세포 범위의 미리 결정된 최적 시딩 밀도로 플레이팅하였다. 이어서, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 0.15% DMSO의 최종 농도로 20 지점 1:2 배수 희석 스킴을 이용하여 화합물로 처리하였다. 플레이트 당 1개의 칼럼은 단지 0.15% DMSO만으로 처리한 세포를 함유하였고, 1개의 칼럼은 백그라운드로 사용하기 위해 세포를 전혀 함유하지 않았다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 6일 동안 인큐베이션하였다. 제0 시점 (t0) 판독은 화합물 첨가 당일에 수행하였다. 플레이트를 디벨로핑하기 위해, 셀 타이터 글로 (프로메가 #G7572)를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 12분 동안 인큐베이션하였다. 발광을 테칸 사파이어2(Tecan Safire2) 상에서 측정하였다.
데이터를 어세이 클라이언트(Assay Client) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 용량 반응 곡선을 t0과 비교한 성장의 퍼센트에 기반하여 생성하였다. 성장 IC50 값을 4 파라미터 로지스틱 모델을 이용하여 계산하였다.
Figure pct00009
화합물 A는 EZH2 억제제이다.
실시예 10: Y641 야생형 림프종 세포주에서의 비정상적으로 상승된 H3K27me3 수준. EZH2의 다양한 활성화 및 불활성화 돌연변이가 GCB DLBCL, FL 및 골수이형성 증후군 (MDS)으로부터 유래된 원발성 종양에서 기재된 바 있다 (1-3, 24-26). 이들 돌연변이의 최종 결과는 H3K27의 증가된 또는 감소된 메틸화이다 (14, 15, 24, 26). 인간 암 세포주에서의 H3K27me3의 변경을 특성화하기 위해, 본 발명자들은 7종의 고유 종양 유형으로부터의 111종의 세포주에서 ELISA에 의해 전체적 H3K27me3 및 전체 히스톤 H3 수준을 정량화하였다 (도 1A). 검사된 각각의 종양 유형은 가장 높은 비-림프종 세포주보다 2-3배 더 높은 H3K27me3 수준을 갖는 여러 림프종 세포주와 함께 소정 범위의 H3K27me3 수준을 나타내었다. 이들 세포주 중 몇몇으로부터의 단백질 용해물의 추가의 분석은 H3K27의 메틸화 상태 사이의 명백한 불균형을 밝혀내었다 (도 1B). 전반적으로, H3K27me3 수준은 보다 낮은 전체적 H3K27me3 수준을 갖는 림프종 세포주에 비해 감소된 H3K27me1의 대가로 증가되었다.
실시예 11: 비정상적으로 상승된 H3K27me3을 갖는 림프종 세포주에서의 EZH2의 A677 잔기의 글리신으로의 돌연변이. EHZ2의 Y641 잔기의 페닐알라닌 (F), 아스파라긴 (N), 세린 (S) 또는 히스티딘 (H)으로의 돌연변이를 보유하는 림프종 세포에서의 H3K27에 대한 과다-트리메틸화 표현형을 입증하는 최근의 발견에 기반하여, 본 발명자들은 H3K27me3의 가장 높은 수준을 갖는 림프종 세포주가 Y641에 활성화 돌연변이를 가질 수 있다고 가정하였다. Y641 코돈에 대한 모든 세포주의 생거 서열분석은 전체적 H3K27me3 수준에 의해 순위를 매긴 최상위 7종의 림프종 중 6종에 대해 활성화 돌연변이를 밝혀내었다.
Y641에서 돌연변이되지 않은 높은 H3K27me3 수준을 갖는 1종의 세포주는 Pfeiffer였다. Pfeiffer 세포주는 DLBCL의 백혈병 기에 있는 환자의 흉막 삼출물로부터 1992년에 확립되었다 (27). 모든 EZH2 코딩 엑손에 대한 게놈 DNA의 생거 서열분석은 A677 잔기의 글리신으로의 비-동의 돌연변이 (A677G)를 유발하는 뉴클레오티드 2045에서의 이형접합성 C → G 돌연변이를 밝혀내었다 (도 2A). cDNA의 서열 분석은 야생형 및 돌연변이체 대립유전자가 둘 다 발현된다는 것을 밝혀내었다 (데이터는 제시되지 않음). 이 잔기는 EZH2의 촉매 SET 도메인에 속하며, 엑손 18의 Y641 잔기의 2 엑손 하류에 위치한다 (도 2B). 이 잔기는 다수의 종 및 다수의 히스톤 메틸트랜스퍼라제에 걸쳐 고도로 보존되어 있으며 (도 2C), 이는 이것이 EZH2의 기능에서 필수적인 역할을 할 수 있음을 나타낸다.
실시예 12: 원발성 림프종 샘플에서의 A677G EZH2 돌연변이의 발생. Pfeiffer 세포주에서 확인된 돌연변이가 원발성 인간 림프종에서 발생하는지의 여부를 입증하기 위해, 이 잔기를 41개의 림프종 시편의 패널에서 서열분석하였다. 이 패널은 30개의 DLBCL, 6개의 FL, 1개의 점막 연관 림프 조직 (MALT)의 림프절 외 변연부 B-세포 림프종, 1개의 외투 세포 림프종 (MCL), 1개의 비장 변연부 림프종 (SMZL), 및 2개의 발덴스트룀 마크로글로불린혈증 또는 림프형질세포성 림프종 (WM)으로 구성되었다 (표 2). Y641 돌연변이의 4회 발생 뿐만 아니라, 비-동의 과오 돌연변이가 P488 및 A677에 대해 관찰되었다. A677 돌연변이는 이형접합이었고, 74세 여성으로부터 획득한 단계 IIE DLBCL에서 발생하였다 (도 2A; 표 2). cDNA에서 대립유전자 둘 다가 검출되었으므로, 이 돌연변이는 발현되었다 (데이터는 제시되지 않음). 이들 데이터는 A677G 돌연변이가 원발성 인간 림프종에서 발생하며, 단순히 세포 배양의 아티팩트가 아님을 입증한다.
실시예 13: EZH2 A677G 돌연변이는 H3K27 메틸화 상태에 비의존적인 생화학적 활성을 부여한다. EZH2 Y641 돌연변이는 기질 특이성에 영향을 미쳐 비변형 및 모노-메틸화 형태에 비해 H3K27me2에 대한 선호를 유발한다 (도 2B) (3, 14). 기질 선호에 대한 A677G 돌연변이의 효과를 추가로 조사하기 위해, 본 발명자들은 H3K27me0, H3K27me1 또는 H3K27me2를 함유하는 펩티드 기질을 사용하여 야생형 및 돌연변이체 EZH2 복합체의 정상 상태 동역학을 특성화하였다. 3종의 펩티드 기질에 의한 턴오버 (k cat 또는 k cat /K m 으로서)를 비교하였을 때, 야생형 EZH2는 점진적으로 보다 많은 메틸 기가 H3K27 내로 혼입되는 경우에 활성을 상실하였다 (즉, H3K27me0 > H3K27me1 > H3K27me2) (도 3, 표 1). 대조적으로, 평가된 모든 Y641 돌연변이체 효소는 H3K27me2 펩티드가 가장 효율적으로 활용되는 정반대의 경향을 보여주었다 (즉, H3K27me2 > H3K27me1 > H3K27me0) (도 3, 표 1). 한편, A677G EZH2 복합체는 야생형 및 Y641 돌연변이체 둘 다와 상이한 프로파일을 보여주었다. A677G EZH2는 모든 3종의 기질을 거의 동일한 효율로, 그리고 야생형 효소에 의해 밝혀진 최고 턴오버와 비슷한 속도 (k cat = 각각 0.64초-1 대 0.62초-1)로 활용하였다 (도 3, 표 1). HeLa 세포로부터 정제한 뉴클레오솜을 평가하였을 때, A677G EZH2의 활성은 야생형 EZH2 및 Y641 돌연변이체보다 더 높았다 (k cat = 0.17초-1 대 0.10초-1 (야생형의 경우) 및 0.11초-1 (Y641S의 경우)). 이러한 관찰은 H3K27에서 이형접합적으로 변형되는 히스톤의 보다 큰 비율에 대해 작용하는 A677G EZH2 복합체의 능력의 결과일 가능성이 있다.
실시예 14: A677G EZH2의 발현은 H3K27의 과다-트리메틸화를 일으키기에 충분하다. 히스톤 메틸화 수준에 대한 A677G 및 Y641 EZH2 돌연변이체의 효과를 탐색하기 위해, EZH2의 야생형 및 돌연변이체 버전을 세포에서 일시적으로 발현시킨 후, H3K27me1 및 H3K27me3 수준을 평가하였다. MCF-7 세포가 H3K27me3의 상대적으로 낮은 수준 (Pfeiffer H3K27me3 수준의 26%; 도 1A)을 나타내며, 쉽게 형질감염되기 때문에, 본 분석을 위해 MCF-7 세포를 선택하였다. 실제로, A677G 또는 Y641 돌연변이체 EZH2의 외인성 발현은 H3K27me3의 2-3배 증가를 유도할 수 있었으며, 이는 이 마크의 전체적 수준을 Pfeiffer 세포에서 관찰된 것과 유사한 수준으로 만들었다 (도 4). 이들 데이터는 A677G의 발현이 H3K27 잔기의 전체적 과다-트리메틸화를 유도하기에 충분하다는 것을 입증한다.
실시예 15: A677G 돌연변이체 EZH2의 기질 선호 및 생성물 특이성에 대한 구조적 근거. EZH2 결정 구조가 존재하지 않으므로, 상동성 모델을 야생형 EZH2의 단백질 서열 및 H3K9me2를 함유하는 히스톤 H3 펩티드 기질에 결합된 GLP/EHMT1의 결정 구조에 기반하여 구축하였다 (도 5A). 이 모델은 야생형 EZH2가 주로 H3K27의 모노- 및 디-메틸화를 촉매화하지만 트리-메틸화는 그렇지 않은 것을 입증하는 생화학적 데이터와 일치한다. 다른 메틸트랜스퍼라제, 예컨대 Set7/9와 유사하게, 고도로 보존된 EZH2 Y641 잔기는 리신 ε-아민 기와의 수소 결합을 통한 최적 메틸 전달을 위해 H3K27의 비메틸화 및 모노-메틸화 형태를 배향시키는 것으로 보인다 (28, 29). 또한, Phe/Tyr 스위치 위치에서 티로신 대신에 보존된 페닐알라닌 잔기 (F724)의 존재는, 비-메틸화 리신을 추가로 배향시키는 것으로 나타난 구조적으로 보존된 물 분자 (도 5에 도시되지 않음)에 대한 수소 결합의 상실을 일으킨다 (28). 보존된 물에서 추가의 수소 결합이 결핍되기 때문에, 이것은 아마도 보다 약하게 결합하며, 따라서 모노-메틸화 리신이 제2 메틸 전달을 위한 위치로 회전할 때 그에 의해 보다 쉽게 전위될 수 있다. 따라서, 이 모델은 모노- 및 디-메틸트랜스퍼라제로서 효율적으로 기능하는 EZH2를 뒷받침한다. 그러나, 디-메틸화 리신의 경우에는 제3 메틸 기를 수용하기 위한 위치로 회전하기 위해 매우 작은 공간이 존재한다 (Y641의 히드록실 산소와 H3K27me2의 ε-아민 기 사이가 단지 3.3 Å임). 따라서, EZH2의 Y641 잔기는 비메틸화 및 모노-메틸화 리신의 배향에 참여하는 한편 동시에 트리-메틸화를 입체적으로 제한하는 이중 목적을 갖는다.
이 모델은 Y641의 보다 작은 잔기, 예컨대 아스파라긴으로의 돌연변이 (Y641N)가 결정적 수소 결합의 상실 및 보다 큰 리신 터널의 생성 둘 다를 일으킨다고 예측한다 (도 5B). 보다 큰 리신 터널 및 적절한 수소 결합의 상실은 아마도 고도로 가요성인 비변형 또는 모노-메틸화 리신의 안정화를 방해한다. 한편, Y641을 보다 작은 잔기, 예컨대 아스파라긴으로 대체하는 것은 디-메틸화 리신이 제3 메틸 전달을 위한 위치로 회전하도록 허용하는 보다 큰 터널 (H3K27me2 메틸 탄소에서 N641 측쇄까지의 거리 = 3.8 Å)을 생성한다. 아마도 H3Kme2의 2개의 메틸 기는 또한 디-메틸화 리신을 추가로 배향시키는 것을 돕는 리신 터널에서의 유리한 소수성 상호작용을 만든다. 이러한 해석은 Y641 돌연변이체가 비메틸화 리신을 효율적으로 활용하지 않으며, 디-메틸화 기질과의 견고한 활성을 획득하였음을 입증하는 본 발명자들 및 다른 이들에 의해 제시된 데이터와 일치한다.
흥미롭게도, 야생형 EZH2에 대한 구조적 모델은 고도로 보존된 A677 잔기가 SAM 또는 H3K27과 직접적으로 상호작용하지 않는다는 것을 시사하는 반면에, 이것은 Y641의 히드록실 산소에 매우 근접해 있다 (3.3 Å) (도 5A). 따라서, A677을 보다 작은 글리신 잔기로 돌연변이시키는 것은 Y641이 리신 터널 내부에 디-메틸화 기질이 메틸 전달에 적합한 배향으로 회전하도록 하는 추가의 공간을 생성하는 대안적 입체형태를 채택하도록 허용한다는 것이 예측된다 (도 5C). 이러한 대안적 Y641 입체형태는 심지어 리신 꼬리가 제3 메틸 전달을 위한 위치로 회전되는 경우에도 Y641의 히드록실 산소와 H3K27me2의 가장 가까운 메틸 탄소 사이에 충분한 공간 (3.1 Å)을 갖는다. 따라서, 이 모델은 대안적 Y641 배향과 조합된 Y641 잔기의 유지가 비변형, 모노- 및 디-메틸화 기질의 효율적 메틸화에 기여한다는 것을 시사한다.
실시예 16: 증식 검정 (검정 1)에서의 EZH2 억제제에 대한 세포주 민감성.
EZH2 돌연변이 및 H3K27me3 수준이 EZH2 억제에 대한 민감성에 미치는 효과를 평가하기 위해, 38종의 림프종 세포주를 화합물 A로 표시된 EZH2 억제제를 사용하여 6일 증식 검정 (검정 1)으로 평가하였다. 표 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, EZH2에 돌연변이를 보유하고 높은 H3K27me3 (Pfeiffer의 100% 이상)을 갖는 세포주는 EZH2 억제에 대해 민감성이다. EZH2 돌연변이가 EZH2 억제에 대해 저항성이거나 약하게 민감성인 다수의 세포주 (예를 들어, SUDL-4, DB, OC1-LY-19 및 SKM1)가 존재하기 때문에, EZH2 돌연변이 스테이터스 단독으로는 이들 조건 하에 EZH2 억제에 대한 민감성을 예측하지 않는다. 또한, EZH2 억제 검정의 추가의 최적화
실시예 17: EZH2 돌연변이, 암, 및 EZH2 억제제로의 치료에 대한 논의
EZH2의 상승된 수준은 다수의 암의 특징이며, SU-DHL-4 DLBCL 세포주에서의 EZH2의 녹다운이 G1/S 이행에서의 성장 정지를 일으키는 것과 같이 일부 림프종 세포의 증식에 요구되는 것으로 보인다 (30). 최근 연구는 H3K27 과다-트리메틸화를 일으키는 림프종에서의 EZH2의 Y641에서의 돌연변이를 확인한 바 있다 (1, 3, 14, 15). 본원에서, 본 발명자들은 인간 림프종 세포에서 전체적 H3K27me3을 증가시킬 수 있는 신규 EZH2 돌연변이의 확인 및 특성화를 보고하며, H3K27me3의 상승된 수준을 갖고 EZH2에 Y641 또는 A677 돌연변이를 보유하는 림프종 세포주가 EZH2의 억제에 대해 민감성임을 입증한다.
EZH2 Y641 돌연변이가 GCB DLBCL의 22% 및 FL의 7%에서 발생하는 반면 (3), 본 발명자들의 연구는 EZH2 A677의 글리신으로의 돌연변이가 상당히 희귀한 사건임을 나타낸다. 본 발명자들은 50종의 림프종 세포주 중 1종 및 41개의 원발성 림프종 샘플 중 1개에서 상기 돌연변이를 관찰하였다. 또한 모린(Morin) 등은 최근에 RNA-seq, 엑솜-seq 및/또는 게놈-seq에 의해 평가된 127개의 샘플 중에서 A677G 돌연변이를 갖는 DLBCL의 단일 사례 (63세 여성 단계 1AE)를 관찰하였다 (1). 따라서, 이러한 변경의 진정한 발생률을 확립하기 위해서는 A677 코돈의 집중적인 유전자형 결정에 의한 보다 광범위한 연구가 요구될 것이지만, 이들 초기 데이터는 상기 돌연변이의 빈도가 2-3% 미만일 가능성이 있음을 시사한다.
이들 두 돌연변이의 최종 결과 (즉, 증가된 H3K27me3)가 상당히 유사할 수 있다는 점을 고려하면, 이들 돌연변이가 이러한 상이한 비율로 발생하는 것은 처음에는 놀라운 일이었다. 그러나, 이러한 차이는 각 부위에서의 가능한 활성화 돌연변이의 스펙트럼에 의해 대부분 설명될 수 있었다. 현재까지, Y641의 5종의 상이한 잔기 (F, N, S, C 또는 H) 중 임의의 것으로의 돌연변이가 H3K27me2 기질과의 활성을 증가시키는 것으로 보고된 바 있다 ((1, 3, 14, 15) 및 본 연구). 이러한 증가된 활성은 보다 큰 H3K27me2 기질이 메틸 전달을 위한 위치로 회전하는 것을 허용하는 Y641의 보다 작은 잔기로의 교체로 인한 것이었다. A677G 돌연변이는 유사하게 알라닌의 보다 작은 아미노산으로의 교체를 통해 리신 터널의 규모를 증가시키는 것으로 보이지만; 알라닌이 이미 두 번째로 가장 작은 아미노산이기 때문에, 이것은 단지 글리신으로만 교체될 수 있다. 뉴클레오티드 수준에서, A677 코돈 내의 9개의 단일 뉴클레오티드 돌연변이 중 단지 1개만이 글리신 잔기를 달성할 것이고, 반면에 9개 중 5개가 Y641에서의 활성화 돌연변이를 달성한다. 따라서, EZH2 A677G 돌연변이의 명백히 낮은 발생률은 단순히 이러한 특정한 부위에 대한 가능한 변경의 극히 제한된 개수로 인한 것일 수 있다.
SET 도메인이 오르토로그 및 상동체 메틸트랜스퍼라제에 걸쳐 고도로 보존되어 있다는 사실은 한 메틸트랜스퍼라제에서 또 다른 것으로의 발견내용의 해석을 허용한다. 예를 들어, EZH2의 Y641 잔기에서의 변화의 효과는 생화학적 특성이 보다 광범위하게 연구된 바 있는 다른 SET 도메인 메틸트랜스퍼라제의 돌연변이 분석에 기반하여 예측가능하다. 그러나, 인간 SET7/9 메틸트랜스퍼라제는 정상적으로는 H3K4를 모노-메틸화하지만, SET7/9 Y245 잔기 (EZH2 Y641의 등가물)가 알라닌으로 돌연변이되는 경우에, 돌연변이체는 더이상 H3K4me0 기질을 변형시킬 수 없는 대신에 H3K4me1 펩티드 기질을 디- 및 트리-메틸화하는 능력을 획득한다 (31). H3K9 메틸트랜스퍼라제 G9a를 사용한 추가의 연구는 Y1067의 페닐알라닌으로의 돌연변이가 효소를 모노- 및 디-메틸트랜스퍼라제에서 트리-메틸트랜스퍼라제로 전환시킨다는 것을 입증하였다 (32).
실시예 18: EZH2 A677 돌연변이체, 예를 들어 EZH2 A677G는 요법에서 사용하기 위한 신규 바이오마커이다. 본 발명자들이 아는 한, 본 연구는 다수의 PKMTase에 걸쳐 보존되어 있는 EZH2의 A677 잔기의 생화학적 및 세포 활성을 검사하는 최초의 보고이다. 그러나, 흥미롭게도, 구조적으로 관련된 엔. 크라사(N. crassa)로부터의 SET 도메인 함유 DIM-5는 동등한 위치에 글리신을 가지며 (도 2C), 그의 H3K9 기질에 대해 모든 3종의 메틸화 사건을 수행하는 것으로 보고된 바 있다 (33, 34). 따라서, EZH2의 잔기 677의 알라닌 및 아마도 다른 SET 도메인 메틸트랜스퍼라제에서의 동등한 잔기는 기질과의 직접 접촉 없이 기질 특이성의 조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. EZH2에서의 Y641과 A677 사이의 이러한 상호작용은, 리신 메틸트랜스퍼라제의 기질 및 생성물 특이성을 조절하기 위해 진화하였을 가능성이 있는 다수의 중요한 메카니즘 중 하나를 강조한다.
실시예 19: 시험관내 및 생체내에서의 EZH2 돌연변이체에서의 EZH2 억제제 화합물 B 처리의 개관
진핵생물에서, 히스톤의 후성적 번역-후 변형은 염색질 구조 및 유전자 발현의 조절에 결정적이다. EZH2는 폴리콤 억제 복합체 2 (PRC2)의 촉매 서브유닛이며, 히스톤 H3의 리신 27 (H3K27) 상에서의 메틸화를 통해 유전자 발현을 억제하는 것을 담당한다. EZH2 과다-발현은 종양발생과 관련이 있으며, 다수의 종양 유형에서의 불량한 예후와 상호연관된다 (21, 36-39). 추가로, EZH2의 촉매 SET 도메인 내의 Y641 및 A677 잔기의 체성 이형접합 돌연변이가 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL) 및 여포성 림프종 (FL)에서 발생한다 (1, 3, 40-42). Y641 잔기는 GCB (배세포 B-세포) DLBCL 및 FL의 최대 22%가 이 부위에 돌연변이를 보유하는 가장 빈번하게 돌연변이되는 잔기이다. 이들 림프종은 돌연변이체 효소의 변경된 기질 선호로 인해 상승된 H3K27 트리-메틸화 (H3K27me3)를 나타낸다 (14, 15, 41, 43). 그러나, EZH2 메틸트랜스퍼라제 활성의 특이적, 직접적 억제가 EZH2 돌연변이체 림프종을 치료하는데 효과적일지의 여부는 알려져 있지 않다. 본원에서, 본 발명자들은 EZH2 메틸트랜스퍼라제 활성의 강력하고, 고도로 선택적이고, S-아데노실-메티오닌 (SAM)-경쟁적인 소분자 억제제인 GSK126이 전체적 H3K27me3 수준을 감소시키고, 침묵화된 PRC2 표적 유전자를 재활성화한다는 것을 입증한다. GSK126은 EZH2 돌연변이체 DLBCL 세포주의 증식을 효과적으로 억제하며, 마우스에서 EZH2 돌연변이체 DLBCL 이종이식편의 성장을 극적으로 억제한다. 종합하면, 이들 데이터는 EZH2 활성의 약리학적 억제가 EZH2 돌연변이체 림프종에 대한 가능성 있는 치료를 제공할 수 있다는 것을 입증한다.
화합물 B (GSK126)는 EZH2 억제제이다. 화합물 B는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00010
실시예 20: EZH2 메틸트랜스퍼라제 활성의 강력한 억제제로서의 화합물 B (GSK126)를 확인하기 위한 고처리량 스크린
EZH2 메틸트랜스퍼라제 활성의 억제제를 확인하기 위해, 5-원 PRC2 단백질 복합체를 사용한 고처리량 생화학적 스크린을 수행하였다 (44). 이 작업으로 Ki app = 700 nM을 갖는 소분자 EZH2 억제제를 확인하였다. 의약 화학을 통한 이 화합물의 광범위한 최적화는 GSK126을 생성하였다 (도 7A). GSK126은 WT 및 돌연변이체 EZH2 메틸트랜스퍼라제 활성 둘 다를, 활용되는 기질에 비의존적인 유사한 효력 (Ki app = 0.5-3 nM)으로 강력하게 억제하며, SAM과 경쟁적이고 펩티드 기질과 비-경쟁적이다 (도 7B, 데이터는 제시되지 않음). GSK126은 다른 메틸트랜스퍼라제 및 단백질 부류에 대해 고도로 선택적이다 (데이터는 제시되지 않음). 특히, GSK126은 SET 도메인 및 비-SET 도메인 함유 메틸트랜스퍼라제 둘 다를 비롯한 20종의 다른 인간 메틸트랜스퍼라제에 비해 EZH2에 대해 >1,000배 선택적이다 (45). 심지어 SET 도메인 내에서 EZH2와 96% 동일하고 전체적으로 76% 동일한 EZH1도 >150배 덜 강력하게 억제된다 (Ki app = 89 nM). EZH2 상동성 모델 (41)을 효소 작용-메카니즘 및 억제제 구조-활성 관계 데이터와 조합하여 활용함으로써, 인 실리코 도킹은 GSK126에 대한 가장 그럴듯한 도킹 부위로서 SAM 결합 포켓을 밝혀내었다. 여기서, 이것은 SAM 결합 포켓의 한쪽 면을 형성하는 SET-후 도메인과 광범위한 접촉을 생성하는 것으로 예측된다 (도 8a-d). 흥미롭게도, 예측된 GSK126 결합 부위의 10 Å 이내에서 EZH2와 EZH1 사이의 6개의 잔기 차이 중 4개가 SET-후 도메인 내에 존재하며, 이들은 EZH1에 대한 효력의 손실에 기여할 수 있다.
실시예 21: 화합물 B (GSK126)는 H3K27me3의 손실을 유도한다
EZH2 돌연변이체의 변경된 기질 선호는 세포 H3K27 메틸화 상태에서의 불균형을 유발한다 (도 9a) (14, 41). 그럼에도 불구하고, GSK126은 EZH2 WT 및 돌연변이체 DLBCL 세포주 둘 다에서, EZH2 돌연변이 스테이터스에 비의존적인 10 - 252 nM 범위의 IC50 값으로 H3K27me3의 손실을 유도하였다 (T-검정, p=0.27) (도 7c). 추가의 분석은 H3K27me3의 억제가 24시간 전에 시작되었고 효력이 2일 후에 최대였음을 입증하였다 (도 9b). GSK126은 H3K27me3을 가장 강력하게 억제하였고, H3K27me2가 그 다음이었으며, H3K27me1은 가장 높은 억제제 농도에서 단지 약하게 감소되었다 (도 7 및 도 9c). 전체 히스톤 H3 및 PRC2 성분은 GSK126에 의해 영향을 받지 않았고 (도 9c 및 10), 따라서 H3K27 메틸화의 감소는 히스톤 H3 또는 PRC2의 분해가 아니라 EZH2 메틸트랜스퍼라제 활성의 직접 억제로 인한 것이다. 이는 PRC2 복합체의 분해를 촉진하고 세포내 SAH 농도에 대한 효과를 통해 EZH2를 간접적으로 억제하는 S-아데노실-L-호모시스테인 (SAH) 히드롤라제의 억제제인 3-데아자네플라노신 A (DZNep)와 대조적이다 (46).
실시예 22: 화합물 B는 B 세포 림프종 세포의 성장을 억제한다
본 발명자들은 화합물 A에 이용된 것 (검정 1을 화합물 A 처리에 이용하였음, 상기 참조)과 비교하여 개선된 증식 검정을 이용하여, B-세포 림프종 세포주의 패널에서의 세포 증식에 대한 화합물 B (GSK126)의 효과를 평가하였다. 따라서, 실시예 22 및 표 6은 세포주, 예를 들어 림프종 세포주 상에서의 HZH2 억제제의 억제를 보다 잘 반영한다. DLBCL 세포주가 EZH2 억제에 가장 민감성이었다 (도 11a). 7종의 가장 민감성인 DLBCL 세포주 중 6종은 Y641N, Y641F 또는 A677G EZH2 돌연변이를 보유하였다 (성장 IC50 = 28-861 nM) (도 11a, 표 6 및 도 12). 예외는 EZH2에 대해 WT인 HT였다 (성장 IC50 = 516 nM). 흥미롭게도, HT는 다수의 종양 유형에서 빈번하게 불활성화되는 H3K27 데메틸라제인 UTX의 돌연변이 (R1111C)를 보유한다 (19). 11종의 나머지 DLBCL 세포주 중 단지 2종만이 돌연변이체 EZH2를 보유하였으며, 이는 대부분의 경우에 돌연변이체 EZH2를 갖는 DLBCL 세포주가 세포 성장에 대해 EZH2 활성에 의존적이지만; 일부 상황에서는 동시-발생 변경이 EZH2 활성에 대한 세포의 의존성을 무효화하여 이것이 EZH2 억제에 덜 민감성이도록 만들 수 있음을 시사한다. EZH2 돌연변이 세포주 사이에서, GSK126에 대한 민감성은 DLBCL 내에서 발견된 공통 변경인 BCL2 전위 또는 p53 돌연변이에 비의존적이다 (표 6). H3K27me3의 억제와 세포 성장 사이에 중간 정도의 상관관계가 존재하였지만 (피어슨, r=0.62), GSK126에 대한 민감성과 EZH2 단백질 수준 사이에는 상관관계가 전혀 존재하지 않았다 (도 13a-c). 흥미롭게도, 가장 민감성인 DLBCL 세포주 중 2종인 WSU-DLCL2 및 KARPAS-422는 불응성 질환을 앓는 환자로부터 유래되었으며 (47, 48), 이는 진료 표준에 저항성인 DLBCL 세포가 EZH2 억제에 민감성일 수 있음을 시사한다. 버킷 (BL) 및 호지킨 (HL) 림프종 세포주는 WT EZH2를 갖는 BL 세포주인 Jiyoye (성장 IC50 = 0.23 μM)를 제외하고는 일반적으로 EZH2 억제에 대해 덜 민감성이었다 (성장 IC50 > 1.3 μM). 림프종 하위유형 사이의 민감성의 결정요인을 완전히 규명하기 위해서는 추가의 림프종 세포주에서의 GSK126의 평가 및 광범위한 게놈 및 에피게놈 특성화가 요구될 것이다.
세포증식억제 및 세포독성 반응 둘 다가 가장 민감성인 세포주 사이에서 관찰되었고 (표 6); 따라서, 증식 및 세포 사멸에 대한 GSK126-유도된 효과의 타이밍을 가장 민감성인 세포주 중 2종에서 상세히 검사하였다. Pfeiffer에서, 세포 증식의 강력한 억제가 2일 후에 관찰되었고 (도 11b), 세포 개수의 순감소는 3일 후에 분명해졌다 (도 11c). 이러한 세포 사멸은 서브-G1 집단의 증가 (도 11d) 및 카스파제 활성의 용량-의존성 유도 (도 11e)에 의해 나타난 바와 같이 카스파제-매개 아폽토시스에 의해 유발되는 것으로 보인다. KARPAS-422에서의 반응은 최대 효력을 위해 6-7일이 요구되어 보다 느렸다 (도 11b). 추가로, 제0일 수준 초과로 남아 있는 CTG 값, 서브-G1 함량이 거의 없는 G1 정지 (각각 DMSO 및 500 GSK126에 의해 세포의 43% 및 77%가 G1에 있음), 및 <1 μM GSK126에 의한 최소 카스파제 활성에 의해 입증된 바와 같이, KARPAS-422에서는 주로 세포증식억제 효과 관찰되었다 (도 11f-h). 이들 관찰과 일치하게, EZH2의 shRNA-매개 녹다운은 Pfeiffer에서의 극심한 세포독성 및 아폽토시스 반응, 및 KARPAS-422에서의 감소된 세포 증식 및 카스파제 활성의 부재를 유발하였으며, 이는 GSK126에 의해 관찰된 표현형 효과가 EZH2의 억제로 인한 것임을 입증한다 (도 14a-c).
실시예 23: 유전자 발현에 대한 화합물 B의 효과
EZH2가 전사 억제와 연관되기 때문에, 본 발명자들은 소정 범위의 GSK126에 대한 민감성을 갖는 DLBCL 세포주에서의 유전자 발현에 대한 GSK126의 효과를 평가하였다. 견고한 전사 활성화가 가장 민감성인 세포주에서 기록되었다 (도 15a, 도 16a, 및 데이터가 제시되지 않음). H3K27me2/3의 억제 성질을 고려하면 놀랍지 않게도, 전사 변화의 대부분은 상향조절을 포함하였다. KARPAS-422 및 Pfeiffer 세포에서 GSK126 처리 및 EZH2 녹다운에 의해 관찰된 유전자 발현 변화 사이의 고도의 유사성은 이들 전사 변화가 표적-외 효과가 아닌 EZH2 활성의 손실로 인한 것임을 시사한다 (데이터는 제시되지 않음). 추가로, 3종의 가장 민감성인 세포주에 대한 ChIP-seq 데이터의 분석은 처리 전에 상향조절된 유전자가 H3K27me3의 광범위한 농축을 나타내었다는 것을 밝혀내었으며, 이는 이들 유전자가 H3K27me3에 의해 마킹된 EZH2 표적임을 시사한다 (도 15b 및 도 17a-c).
민감성 세포주에서 관찰된 반응과 대조적으로, EZH2 억제에 의해 성장이 영향을 받지 않는 WT EZH2를 갖는 세포주인 Toledo에서의 GSK126 처리에 의해서는 최소한의 전사 변화가 일어났다 (도 15a, 도 16b). 심지어 2 μM GSK126에서, 상기 용량 및 시간에서의 H3K27me3의 거의 완전한 손실에도 불구하고 Toledo에서는 매우 적은 전사 변화가 관찰되었다 (23개의 상향조절된 및 10개의 하향조절된 프로브 세트) (도 9c, 및 데이터가 제시되지 않음). 마찬가지로, 2개의 H3K27me3-농축된 유전자에 대해 수행한 qRT-PCR은 Pfeiffer 및 KARPAS-422에서 25 nM만큼 적은 GSK126에 의해 유전자 발현의 용량-반응성 증가를 밝혀내었지만, Toledo에서는 최대 1 μM GSK126에 의해서도 전사 변화가 전혀 없었다 (도 15c, 데이터가 제시되지 않음). 흥미롭게도, 심지어 가장 민감성인 WT EZH2 세포주인 HT에서도, 전사 반응은 유사한 민감성을 갖는 EZH2 돌연변이체 DLBCL 세포주와 비교시 덜 명백하였다 (도 15a). 전사 배수-변화 기준을 2.0에서 1.5로 완화시키는 것은 HT 세포에서의 추가적인 중간 정도의 전사 변화를 밝혀내었다 (도 16b). EZH2 WT 및 덜 민감성인 돌연변이 세포주에서의 이러한 약한 전사 반응은 다른 보상 메카니즘 (예컨대, H3K9, H4K20 또는 DNA 메틸화)이 이들 세포주에 존재하여 전사 반응을 약화시킬 수 있음을 시사한다.
EZH2 돌연변이 세포주 사이에서, 전체적 H3K27me3 수준은 전사-반응성 세포주에서 통계적으로 보다 높았으며 (T-검정, p = 0.019), 이는 EZH2 돌연변이 스테이터스가 전체적 H3K27me3 수준과 함께 EZH2 돌연변이 스테이터스 단독보다 우수한 예측 바이오마커일 수 있음을 시사한다 (도 16c). 5종의 가장 민감성인 EZH2 돌연변이 세포주가 상향조절된 유전자 발현 변화의 수적 우위 (69-95%)를 나타낸 반면, 상이하게 조절된 프로브 세트 사이에서는 2배 또는 1.5배 유의성 기준을 이용하여 오버랩이 거의 관찰되지 않았다 (도 15d 및 도 16d). 단지 35종의 상향조절된 프로브 세트만이 이들 5종의 돌연변이 세포주 중 적어도 4종에 대해 공통되었다 (표 7). 이들 공통적으로 상향조절된 프로브 세트의 검사는 다수가 H3K27me3에 대해 농축되어 있음 (32/35)을 밝혀내었다 (표 7, 및 데이터가 제시되지 않음). 추가로, 이들 프로브 세트 중 다수는 다른 세포주에서 약하게라도 유도되며, 이는 이들 세팅에서 완전한 유전자 활성을 위해서는 추가의 시간 또는 염색질 요인이 요구될 수 있음을 시사한다 (도 15e 및 표 7). 마지막으로, 어떠한 단일 경로 또는 과정도 공통적으로 상향조절된 유전자의 제한된 세트 사이에서 유의하게 농축되지 않은 반면, 각각의 세포주에서의 조절된 유전자 세트의 유전자 온톨로지 농축 분석은 세포 주기 조절, 세포 사멸, 및 생물학적/세포 과정의 조절을 비롯한 여러 공통 과정을 개별적으로 밝혀내었다 (도 18, 및 데이터가 제시되지 않음). 이들 데이터는 GSK126에 의한 EZH2의 억제 후의 H3K27me3의 전체적 손실이 민감성과 잘 상호연관되는 EZH2 표적 유전자의 전사 활성화와 연관되어 있다는 것, 및 돌연변이체 EZH2가 H3K27me3을 표적화보다는 오히려 전체적 방식으로 탈조절시킨다는 것을 입증한다. 민감성 세포주의 상향조절된 유전자 세트 사이의 유의한 차이는, 각각의 세포주에서의 에피게놈의 복잡성 및 고유성, 및 개별 림프종의 발달 동안 선택적 압력의 다양성을 강조할 가능성이 있는 놀라운 발견이다.
실시예 24: 화합물 B는 생체내에서 종양 성장을 억제한다.
세포 배양에서의 강력한 효과에 기반하여, 본 발명자들은 마우스에서 KARPAS-422 및 Pfeiffer의 피하 이종이식편을 사용하여 GSK126을 평가하였다. GSK126을 10일 동안 1일 1회 (QD) 투여한 후, 세포 배양으로부터의 관찰과 일치하게 용량-의존적 방식으로 전체적 H3K27me3이 감소하고 유전자 발현이 증가하였다 (도 19a,b). GSK126이 초기에 혈액으로부터 신속하게 제거되었을지라도, 혈액 및 종양으로부터의 약물 제거가 보다 느린 연장된 종결기가 존재하였다 (도 20a,b). 매일 50 mg/kg 투여함으로써, 완전한 종양 성장 억제가 KARPAS-422 및 Pfeiffer 모델 둘 다에서 관찰되었다 (도 19c 및 도 21a). 보다 높은 용량의 투여 요법을 KARPAS-422 이종이식편을 사용하여 검사하였을 때, 현저한 종양 퇴행이 관찰되었다 (도 19c). 투여의 정지시, 50 mg/kg QD 군의 종양은 종양 정체를 나타낸 반면, 150 mg/kg QD 및 300 mg/kg 2회/주 군에서는 완전한 종양 박멸이 관찰되었다. 종양 성장 억제는 또한 보다 공격성인 KARPAS-422 종양을 보유하는 마우스의 통계적으로 유의하게 증가된 생존율과 상호연관되었으며, 여기서 비히클-처리된 동물에서는 자연적 사망이 발생하였다 (도 19d). 이들 충격적인 관찰에 기반하여, 낮은 용량의 GSK126이 매주 또는 1주의 휴약기를 두고 제공되는 간헐적 투여 요법을 대형 종양을 갖는 KARPAS-422 종양 이종이식편에서 검사하였다 (도 21b). 모든 스케줄은 종양 성장 억제 (91-100%, T-검정, p 값 = 0.0008 내지 0.0024)를 입증하였다. 이들 결과는 GSK126에 대한 반응이 지속적이며 간헐적 투여 스케줄이 심지어 진행성 종양에서의 임상 세팅에서도 효과적일 수 있다는 것을 나타낸다.
GSK126은 KARPAS-422 이종이식편을 보유하는 마우스에서 체중 감소가 거의 없거나 전혀 없는 것, 정상적인 그루밍 및 행동, 및 대단히 개선된 생존율에 의해 측정된 바와 같이 검사한 용량 및 스케줄에서 잘 허용되었다 (도 22a-c 및 도 19d). 정상적인 조혈에서의 EZH2의 역할 및 골수성 악성종양에서의 EZH2 기능 상실 돌연변이의 확인을 고려하여 (49-52), 본 발명자들은 면역적격 마우스의 말초 혈액에 대한 GSK126 처리의 효과를 조사하였다. 전혈 카운트 분석은 종양 이종이식편에서 효능이 관찰된 용량 및 시간에서 어떠한 혈액 세포 유형에서도 유의한 변화가 없음을 밝혀내었다 (도 22d).
지난 10년에 걸쳐, 활성화 체성 변경을 갖는 종양단백질을 특이적으로 억제하는 표적화 작용제의 개발은 암 환자에 대해 엄청난 임상적 이익을 제공해 왔다 (53, 54). 본원의 데이터는 EZH2 메틸트랜스퍼라제 활성의 억제가 EZH2에 활성화 돌연변이를 보유하는 DLBCL 및 비-무통성 FL의 치료를 위한 실효성 있는 전략일 수 있다는 강력한 증거를 제공한다. GSK126은 또한 EZH2 활성이 EZH2 과다-발현이 불량한 예후와 연결되어 있는 종양 (36-39), 및 UTX의 기능 상실 돌연변이를 보유하는 종양 (19, 50, 55)의 생존에 요구되는지의 여부를 평가하기 위한 수단을 제공한다. 본 발명자들은 GSK126이 EZH2에 기능 상실 돌연변이를 보유하는 골수성 악성종양을 치료하는데 효과적일 것으로 기대하지 않았지만 (50-52), GSK126은 정상적 골수 발달에서의 EZH2의 역할을 평가하고 골수증식성 신생물에서의 EZH2의 종양원성 역할을 이해하기 위한 중요한 도구가 되어야 한다. 마지막으로, PRC2 복합체의 분해를 유발하지 않는 선택적 EZH2 억제제의 확인은 EZH2 메틸트랜스퍼라제 활성의 역할 대 통상의 유전자 조작 연구를 통해 규명할 수 없었던 발생, 종양발생 및 종양 진행에서의 그의 구축중인 역할을 이해하기 위한 유용한 도구를 제공한다.
실시예 25: GSK126 (화합물 B)을 개시하는 실시예에 대한 방법 요약
생화학적 검정은 WT 또는 돌연변이체 EZH2를 함유하는 5-원 PRC2 복합체 (인간 Flag-EZH2, EED, SUZ12, AEBP2, RbAp48), [3H-]SAM 및 지정된 펩티드 기질을 활용하였고; 반응물을 30분 동안 인큐베이션하였다. 전체적 히스톤 변형 수준은 전체 히스톤 H3, H3K27me1, H3K27me2 또는 H3K27me3에 특이적인 항체를 사용하여 ELISA 또는 웨스턴 블롯 방법에 의해 결정하였다. 세포 증식 및 카스파제-3/7 활성은 각각 셀타이터-글로 및 카스파제-글로 3/7 (프로메가)을 사용하여 평가하였다. 유전자 발현 프로파일링은 아피메트릭스(Affymetrix) 인간 게놈 U133 플러스 2.0 마이크로어레이를 사용하여 수행하였다. 차등-발현된 프로브 세트는, 리마(limma) 통계 패키지 (http://www. bioconductor.org)를 사용하여 데이터를 선형 모델에 적합시키고, 처리군 대 대조군의 쌍 대조를 수행함으로써 결정하였다. 유의한 프로브 세트는 검출 (8의 log2 신호 역치), 평균 배수-변화 > 2 또는 < -2, 또는 >1.5 또는 <-1.5, 나타낸 경우에는, FDR (벤자미니 호치버그(Benjamini Hochberg))에 의한 다중 시험 보정을 위해 조정된 p-값 < 0.1에 대해 필터링하였다. H3K27me3 ChIP 판독치는 보타이(Bowtie) (56)를 사용하여 정렬시켰다. H3K27me3 농축 피크는 SICER (57)를 최적화된 파라미터로 사용하여 확인하였다. 주문제작 PERL 스크립트를 활용하여 유전자 세트에 걸친 평균 기저 H3K27me3 ChIP-seq 태그 밀도를 정량화하였다. 모든 생체내 연구는 GSK 산하의 동물 실험 윤리 위원회에 의한 검토 후에, 실험 동물의 관리, 복지 및 처리에 대한 GSK 정책에 따라 수행하였다. GSK126 및 비히클은 마우스 복강내로 투여하였다. 양측 t-검정은 2개의 샘플의 등분산을 가정하여 수행하였다.
WT 및 돌연변이체 EZH2의 GSK126 억제에 대한 Ki app 값의 결정. WT 또는 돌연변이체 (A677G, Y641N, Y641C, Y641H, Y641S 또는 Y641F) EZH2를 함유하는 5원 PRC2 복합체 (Flag-EZH2, EED, SUZ12, AEBP2, RbAp48)를 이전에 기재된 바와 같이 제조하였다 (41). GSK126을 DMSO 중에 용해시키고, 2.5%의 최종 DMSO 농도로 0.6 nM 내지 300 nM의 농도에서 시험하였다. 시험관내에서 기질로서 H3K27me0을 선호하는 야생형 EZH2와 대조적으로, EZH2 Y641 돌연변이체는 H3K27me2를 선호하고, H3K27me0 또는 H3K27me1과의 활성을 거의 갖지 않는다. A677G 돌연변이체는 이것이 H3K27me0, H3K27me1 및 H3K27me2를 효율적으로 메틸화한다는 점에서 EZH2의 야생형 및 Y641 돌연변이체 둘 다와 구별되며; 따라서, K27me0 (WT, A677G EZH2), K27me1 (A677G EZH2) 또는 K27me2 (A677G, Y641N, Y641C, Y641H, Y641S 및 Y641F EZH2)를 갖는 히스톤 H3 펩티드 (잔기 21-44; 10 μM 최종)를 메틸트랜스퍼라제 기질로서 사용하였다. GSK126을 플레이트에 첨가하고, 이어서 6 nM EZH2 복합체 및 펩티드를 첨가하였다. GSK126의 효력이 [SAM] = K m에서의 검정 실행의 강한 결합 한계에 있거나 또는 그에 가까우므로, 본 발명자들은 경쟁적 기질 SAM의 K m 에 비해 고농도에서 IC50 값을 측정하는 방법을 이용하였다 (7.5 μM SAM, 여기서 SAM K m 은 0.3 μM임). 이들 조건 하에, 효소 농도로부터의 기여는 상대적으로 작아지고 (식 1 참조), Ki의 정확한 추정치를 계산할 수 있다 (58). 반응을 [3H-]SAM으로 개시하고, 30분 동안 인큐베이션하고, 500배 과량의 비표지된 SAM을 첨가하여 켄칭하고, 메틸화 생성물 펩티드를 MSPH 멀티스크린 플레이트 (EMD 밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌러리카)에 대한 공급업체 제공 프로토콜에 따라 포스포셀룰로스 필터 상에 포획시켰다. 마이크로신트-20 칵테일 20 μL를 첨가한 후, 플레이트를 탑카운트 상에서 판독하였다 (둘 다 퍼킨엘머로부터임, 미국 매사추세츠주 월섬). 겉보기 K i 값 +/- s.d.를 경쟁적 억제제 (n=2)에 대한 쳉-프루소프 관계 (59)를 이용하여 계산하였다.
식 1: IC50 = Ki * (1 + [S]/Km) + [E]/2.
EZH2의 GSK126 억제의 메카니즘. EZH2의 GSK126 억제에 대한 IC50 값을 상기 기재된 검정 조건을 이용하여 0.1 μM 내지 15 μM 범위의 여러 SAM 농도에서, 이어서 개별적으로 16 μM 내지 60 μM 범위의 여러 펩티드 농도에서 결정하였다. 생성된 IC50 값을 각각 [SAM]/K m 비 또는 [펩티드]/K m 비에 대해 플롯팅하였다.
세포 배양 및 이뮤노블롯팅. 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) 또는 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼불투렌(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellbulturen)으로부터 입수하였고, 권고된 세포 배양 배지 중에서 37℃에서 5% CO2 하에 유지시켰다. 세포를 방사성면역침전법 (RIPA) 완충제 (써모사이언티픽)로 용해시키고, 웨스턴 블롯 분석을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (41). 항체는 이전에 기재된 바와 같이 (41) 또는 셀 시그널링 테크놀로지 (SUZ12, 3737) 또는 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology) (EED, sc-28701)로부터 입수하였다.
GSK126 처리 후의 H3K27 메틸화 스테이터스 및 PRC2 성분. 세포 (2x105개/웰)를 6-웰 조직 배양 플레이트에 적절한 세포 배양 배지 중에서 처리 24시간 전에 시딩하였다. 이어서, 세포를 0.1% DMSO 또는 가변 농도의 GSK126 (범위 = 25 nM - 2 μM)에 24, 72 또는 144시간 동안 노출시켰다.
전체 히스톤 H3 및 H3K27me3 수준의 ELISA-기반 정량화. 조직을 균질화시킨 후, 종양 조직 용해물을 에피젠테크(Epigentek) 히스톤 추출 키트 (OP-0006)를 사용하여 제조하였다. 다르게는, 세포를 96-웰 플레이트에 2,000개 세포/웰로 시딩하고, GSK126의 10-지점 3배 연속 희석물 (용량 범위 = 2 nM - 38 μM)로 48시간 동안 처리하였다. 세포를 0.2N HCl로 30분 동안 용해시켜 히스톤을 추출하고, 산-불용성 부분을 원심분리에 의해 펠릿화시키고, 상청액을 프로테아제 억제제 (로슈)를 함유하는 중화 완충제 (1M Na2HPO4, pH 12.5; 액티브모티프)로 중화시켰다. 용해물을 맥시소르프 ELISA 플레이트 (눈크)에 각각의 2개의 플레이트 상에 2벌로 첨가하고, 차단 완충제 (1% BSA)를 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하고, 트윈-20 (키르케가드 & 페리 래보러토리즈(Kirkegaard & Perry Laboratories))을 함유하는 이미다졸 완충 염수로 4회 세척하고, H3K27me3 또는 전체 H3에 대한 1차 항체와 함께 인큐베이션하고, 세척하고, HRP-연결된 2차 항-토끼 IgG 항체와 함께 인큐베이션하고, 다시 세척하였다. 루미나타 포르테 기질 (밀리포어)을 첨가하고, 5분 후에 엔비전 다중-표지 플레이트 판독기 (퍼킨엘머)를 사용하여 화학발광을 정량화하였다. H3K27me3 수준을 전체 H3 값에 대해 정규화하고, IC50 값을 4-파라미터 곡선 적합을 이용하여 결정하였다.
세포 증식 검정. 최적 세포 시딩은 384-웰 포맷에서 광범위한 시딩 밀도의 성장을 검사하여 6일 동안의 증식을 허용한 조건을 확인함으로써 모든 세포주에 대해 실증적으로 결정하였다. 이어서, 세포를 최적 시딩 밀도로 플레이팅하고, 24시간 후에 GSK126 또는 0.15% DMSO의 20-지점 2배 연속 희석물로 처리하였다 (2벌). 플레이트를 5% CO2 하에 37℃에서 6일 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 셀타이터-글로 (프로메가)로 용해시키고, 화학발광 신호를 테칸 사파이어2 마이크로플레이트 판독기로 검출하였다. 또한, 비처리된 세포 플레이트를 화합물 첨가 시점 (T0)에 수확하여 세포의 출발 개수를 정량화하였다. 6일 동안 처리한 후에 얻은 CTG 값을 T0 값의 퍼센트로 나타내고, 화합물 농도에 대해 플롯팅하였다. 데이터를 4-파라미터 방정식으로 적합시켜 농도 반응 곡선을 생성하고, 성장의 50%를 억제하기 위해 요구되는 GSK126의 농도 (gIC50)를 결정하였다.
카스파제 3/7 검정. 카스파제-3/7 활성의 검출을 위해, 세포를 96-웰 플레이트에서 배양하고, GSK126의 10-지점 3배 연속 희석물 (범위 0.03 nM 내지 5 μM)로 처리하고, 카스파제-글로 3/7 (프로메가)을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 평가하였다. 값을 각각의 시점에서 셀타이터 글로 (프로메가) 수준에 대해 정규화하고, 비히클 처리된 대조군의 백분율로 나타내었다. 데이터는 n=4의 평균을 나타낸다.
세포 주기 분석. 세포 주기의 기 분포를 유동 세포측정법에 의해 검사하였다. 세포를 6-웰 배양 플레이트에 시딩하고 24시간 후, 세포를 GSK126 또는 0.1% DMSO (비히클)로 3일 동안 처리하였다. 세포를 PBS로 세척하고, BD 완충 용액 중에서 펠릿화시키고, 순간 냉동시키고, -80℃에 보관하였다. 사이클테스트(CycleTest)™ 플러스 DNA 시약 키트 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson), 340242)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 핵을 준비하고 아이오딘화프로피듐으로 염색하였다. 샘플을 팩스칼리버(FACSCalibur) 유동 세포측정기 (벡톤 디킨슨)를 사용하여 평가하고, 데이터를 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (트리 스타(Tree Star))를 사용하여 분석하였다.
유전자 발현 프로파일링. 세포 (2x105개/웰)를 처리 24시간 전에 적절한 세포 배양 배지 중에서 6-웰 조직 배양 플레이트에 시딩하였다. 이어서, 2벌의 웰을 0.1% DMSO, 500 nM 또는 2 μM GSK126에 72시간 동안 노출시켰다. 세포를 트리졸(Trizol) 시약 (인비트로젠) 중으로 수집하고, 전체 RNA를 페놀:클로로포름 추출 및 RNeasy 키트 (퀴아젠)를 통해 제조업체의 지침에 따라 단리하였다. 전체 RNA를 표지하고, 익스프레션 아날리시스(Expression Analysis; 노스캐롤라이나주 더럼)에서 아피메트릭스 인간 게놈 U133 플러스 2.0 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이에 제조업체 (아피메트릭스, 미국 캘리포니아주 산타 클라라)의 지침에 따라 혼성화시켰다. 이들 데이터는 GEO, 등록 번호 GSE40972를 통해 접근가능하다. 주성분 및 상관관계 분석을 이용하여 데이터 재현성을 확인하였다 (도 16).
아피메트릭스 유전자 칩 데이터 분석. 개별 샘플에 상응하는 CEL 파일은 신호 값을 500의 표적 강도로 스케일링하고 log2 변환시키는 마이크로 어레이 스위트(Suite) 5.0 (MAS5) 알고리즘 (http://www.affymetrix.com/support/index. affx)에 의해 프로세싱하였다. 차등 발현된 프로브 세트는 데이터를 선형 모델에 적합시키고, 처리군 대 대조군의 쌍 대조를 수행함으로써 결정하였다. 유의한 프로브 세트는 검출 (8의 log2 신호 역치), 평균 배수-변화 > 2 또는 < -2, 또는 >1.5 또는 <-1.5, 나타낸 경우에는, FDR (벤자미니 호치버그)에 의한 다중 시험 보정을 위해 조정된 p-값 < 0.1에 대해 필터링하였다. 통계적 분석은 바이오컨덕터(Bioconductor)로부터의 리마 패키지 (http://www. bioconductor.org/)를 사용하여 수행하였다. 차등 발현된 프로브 세트의 기능적 분석은 DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)를 사용하여 수행하였다. 유의하게 과다-표시된 GO 생물학적 과정 (BP) 및 분자 기능 (MF) 용어 (수준 3-5)는 EASE p-값 <0.01에 대해 필터링하였다.
qRT-PCR. 세포를 0.1% DMSO 또는 소정 농도 범위의 GSK126 (범위 = 25 nM - 1 μM)으로 72시간 동안 처리하고, 전체 RNA를 상기 기재된 바와 같이 단리하였다. RNA (2.8 μg)를 멀티스크라이브(MultiScribe) 역전사효소 (어플라이드 바이오시스템즈)로 제조업체의 권고에 따라 역전사시켰다. 생성된 cDNA를 희석하고, 택맨(TaqMan) 유전자 발현 검정 (어플라이드 바이오시스템즈; GAPDH, Hs03929097_g1; TNFRSF21, Hs00205419_m1; TXNIP, Hs00197750_m1), 택맨 유전자 발현 마스터 믹스 (어플라이드 바이오시스템즈) 및 ViiA 7 실시간 PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈)과 함께 제조업체의 권고에 따라 사용하여 유전자 발현을 정량화하였다.
ChIP-seq. 세포 (5x107개)를 고정 전에 24시간 동안 적절한 세포 배양 배지 중에서 유지시켰다. 세포를 새로이 제조한 포름알데히드 용액 (최종 농도 1% 포름알데히드, 10 mM NaCl, 0.1 mM EDTA pH 8.0, 5 mM HEPES pH 7.9)으로 실온에서 15분 동안 고정시킨 후, 글리신을 125mM까지 첨가하였다. 고정된 세포를 0.5% 이게팔(Igepal) CA-630 (시그마)을 함유하는 PBS 중에서 2회 헹구고, 세포 펠릿을 순간 냉동시켰다. ChIP 검정을 액티브모티프 인크. (캘리포니아주 샌디에고)에서 맞춤형 검정 프로토콜을 이용하여 수행하였다. H3K27me3 ChIP 및 입력 라이브러리를 일루미나(Illumina) GAIIx 서열분석기 상에서 제조업체의 지침에 따라 35개의 뉴클레오티드 단일-말단에 대해 제조하였다. 이들 데이터는 GEO, 등록 번호 GSE40970을 통해 접근가능하다. 판독치를 품질에 대해 평가하고 (기본 품질 <20은 배제함), 최대 2개의 미스매치를 허용하는 보타이27 알고리즘을 이용하여 인간 참조 서열 (hg19 빌드)에 정렬시켰다. 단지 고유하게 맵핑된 판독치만을 후속 분석에 활용하였다.
ChIP-seq 분석. 평균 기저 H3K27me3 ChIP-seq 태그 카운트를, 주문제작 PERL 스크립트를 사용하여 GSK126으로 처리한 후에 상향조절되거나, 하향조절되거나 또는 변화되지 않은 유전자에 걸쳐 정량화하였다. 유전자 바디 뿐만 아니라, 전사 개시 부위의 10 kb 상류 및 전사 종결 부위의 10 kb 하류를 포함하는 영역을 평가하였다. 모든 유전자를 가닥에 의해 배향시키고, 유전자 바디의 가변 길이를 10,000 bin으로 표준화하였다. 각각의 염기 쌍에서의 서열 태그의 개수의 평균을 낸 후, 값을 ChIP 당 맵핑된 서열 태그의 총 개수에 대해 정규화하였다. 이어서, 500개 염기 쌍 중심 이동 평균법을 적용시켜 보다 큰 경향을 강조하고, 좁은 범위의 변동을 제거하였다. 멀티익스페리먼트 뷰어(MultiExperiment Viewer) (http://www.tm4.org/mev/)를 사용하여 개별 유전자에 걸친 농축을 평가하였다. H3K27me3 농축의 피크를 피크 콜링 소프트웨어 SICER28을 하기 파라미터로 사용하여 확인하였다: 단편 크기: 250bp; 효과적 게놈 크기 분획: 0.86; 윈도우 크기: 750bp; 갭 크기: 3; 중복 역치: 1; FDR: 0.001. 상응하는 입력 샘플에 비해 ChIP 샘플에서 농축된 통계적으로 중요한 피크 (FDR <0.001)를 게놈 위치에 대해 주석을 달고, 전사 개시 부위 (TSS)로부터 +/- 10kb 이내의 유전자에 할당하여 표적 유전자를 확인하였다 : 상류 (TSS에 비해 -10 내지 2.5kb); 프로모터 (-2.5kb 내지 +2.5kb); 5'UTR; 코딩 영역; 3'UTR. 모든 유전자를 5'->3' 배향으로 고찰하였다. 베드툴즈(Bedtools)를 데이터의 조작 및 분석에 사용하였고, IGV http://www.broadinstitute.org/igv를 시각화에 사용하였다. 주석 파일은 UCSC로부터 다운로드하였다. 차등 발현된 프로브 세트의 기능적 분석은 DAVID (http://david. abcc.ncifcrf.gov)를 사용하여 수행하였다.
종양 이종이식편으로부터의 RNA 단리. 퀴아졸(Qiazol) (300 μl/mg 종양) (퀴아젠)을 종양 이종이식편 조직에 첨가하였다. 종양을 퀴아젠 조직분쇄기(TissueLyzer) 및 스테인레스 스틸 비드를 사용하여 용해 및 균질화시켰다. 클로로포름을 퀴아졸 용해물에 첨가하였다. 이어서, 퀴아졸/클로로포름 균질물을 퀴아젠 맥스트랙트(MaXtract) 고밀도 튜브 (퀴아젠)에 첨가하였다. 수성 상을 새로운 튜브로 옮기고, 동등 부피의 70% EtOH와 혼합하고, 퀴아젠 RNeasy 칼럼 (퀴아젠)에 적용시켰다. 나머지 RNA 단리는 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다.
생체내 연구. 모든 연구는 GSK 산하의 동물 실험 윤리 위원회에 의한 검토 후에, 실험 동물의 관리, 복지 및 처리에 대한 GSK 정책에 따라 수행하였다. 모든 생체내 연구의 경우에, GSK126 또는 비히클은 1 N 아세트산을 사용하여 pH 4-4.5로 조정한 20% 캅티솔 중 0.2 mL/20 g 체중의 용량 부피로 복강내로 투여하였다. 100% 매트리겔 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences)) 중 Pfeiffer 또는 KARPAS-422 세포 (1x107개)를 암컷 베이지 SCID 마우스에 피하 이식하였다. 종양을 캘리퍼로 측정하고, 종양 크기에 따라 처리군으로 블록 무작위화하였다. 효능 연구를 위해, 10마리의 마우스를 투여의 개시 전에 각각의 처리군으로 무작위화하고, 종양 부피가 Pfeiffer 및 KARPAS-422 연구 (도 10c 및 도 21a)에서는 대략 200 mm3 및 KARPAS-422 간헐적 투여 연구 (도 21b)에서는 500 mm3이 되면 GSK126 처리를 개시하였다. 마우스를 칭량하고, 종양을 매주 2회 캘리퍼로 측정하였다. 마우스 약동학 연구를 위해, 종양 및 혈액 샘플을 지정된 시간에 안락사시킨 마우스로부터 수확하였다. 혈액 및 종양 균질물을 순간 냉동시키고, 후속적으로 HPLC/MS/MS에 의해 분석하여 GSK126의 농도를 평가하였다. 약역학 연구를 위해, 각각의 종양의 일부를 H3K27me3/H3 ELISA를 위해 냉동시키거나, 또는 RNA 단리를 위해 RNAlater (암비온(Ambion))에 넣었다. 말초 혈액 분석을 위해, 제18일에 안락사시킨 면역적격 CD-1 마우스 (3마리의 마우스/군)로부터 심장 천공을 통해 혈액을 수확하였다. 혈액을 즉시 마이크로테이너(Microtainer) EDTA 튜브 (BD)에 넣고, 인버팅에 의해 약하게 혼합하였다. 전혈 카운트 분석은 멀티-스피시즈(multi-species) 소프트웨어를 사용하는 아드비아(Advia) 2120 혈액학 분석기 (지멘스 메디칼 솔루션즈(Siemens Medical Solutions))를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행하였다.
참고문헌
참고문헌 목록은 본원 전체에 걸쳐 인용된다. 각각의 참고문헌은, 예를 들어 추가의 실험 상세사항을 제공하기 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 참고문헌이 본원에 기재된 특허청구범위, 실시양태 또는 정의와 충돌하는 경우에는, 본 명세서를 따른다.
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SEQUENCE LISTING <110> Creasy, Caretha L. Ganji, Gopinath McCabe, Michael T. Smitheman, Kimberly N. <120> Methods of Treating Cancer <130> PU64764 <140> PCT/US2012/58188 <141> 2012-09-30 <150> 61/541304 <151> 2011-09-30 <160> 58 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 ggtgatcata ttcaggctgg 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 aaacttattg aacttaggag ggg 23 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ttttgtatta tttgaatgtg ggaaa 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 aagatggaca ccctgaggtc 20 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 accctaagta aaagaaaaga gagaa 25 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ggaaaagagt aatactgcac agg 23 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 aaatctggag aactgggtaa agac 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 tcatgcccta tatgcttcat aaac 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 aggctatgcc tgttttgtcc 20 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 aaaagagaaa gaagaaacta agccc 25 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 ctgactggca ttccacaga 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 aagtgtagtg gctcatccgc 20 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 catcaaaagt aacacatgga aacc 24 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 ttgtaataaa tgatagcact ctcca 25 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 tccattaatt gacttttcca gtg 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 acctccacca aagtgcaaag 20 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 ttctcttcca tcaaaatgag tttta 25 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 tcctcacaac acgaactttc ac 22 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 gagttgtcct catcttttcg c 21 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 ccaagaattt tctttgtttg gac 23 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 aagaatggtt tgcctaaata agac 24 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 ccttgcctgc agtgtctatc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 tcttggcttt aacgcattcc 20 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 caaattggtt taacatacag aaggc 25 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 tgatcgtttc catctccctg 20 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 agggagtgct cccatgttc 19 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 gagagtcagt gagatgccca g 21 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 tttgccccag ctaaatcatc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 tttgtcccca gtccattttc 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 tttccaatca aacccacaga c 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 ttctgtcagg cttgatcacc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 ctcgtttctg aacactcggc 20 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 tgaagctgct tgatttattt gc 22 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 aacctaattc cccactaatg ctc 23 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 tctcagcaca 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tgtggagaga ttatttctca agatg 55 <210> 52 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sequences used for site-directed mutagenesis of EZH2 <400> 52 catcttgaga aataatctct ccacagaatt ctgagatgaa ttcatttttc tgcac 55 <210> 53 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sequences used for site-directed mutagenesis of EZH2 <400> 53 gaaaaatgaa ttcatctcag aatcatgtgg agagattatt tctc 44 <210> 54 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sequences used for site-directed mutagenesis of EZH2 <400> 54 gagaaataat ctctccacat gattctgaga tgaattcatt tttc 44 <210> 55 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sequences used for site-directed mutagenesis of EZH2 <400> 55 gaaaaatgaa ttcatctcag aacactgtgg agagattatt tctc 44 <210> 56 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sequences used for site-directed mutagenesis of EZH2 <400> 56 gagaaataat ctctccacag tgttctgaga tgaattcatt tttc 44 <210> 57 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sequences used for site-directed mutagenesis of EZH2 <400> 57 gcagaaaaat gaattcatct cagaatgctg tggagagatt atttctcaag atg 53 <210> 58 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide sequences used for site-directed mutagenesis of EZH2 <400> 58 catcttgaga aataatctct ccacagcatt ctgagatgaa ttcatttttc tgc 53

Claims (19)

  1. 암의 치료를 필요로 하는 인간으로부터의 샘플에서
    a. 상기 인간으로부터의 샘플 중 EZH2의 알라닌 677 (A677) 잔기에서의 돌연변이의 존재 또는 부재; 또는
    b. EZH2의 티로신 641 (Y641) 잔기에서의 돌연변이의 존재 또는 부재; 또는
    c. 대조군과의 비교시 H3K27me3의 증가된 수준의 존재 또는 부재
    중 적어도 하나를 결정하는 것,
    및 상기 A677 돌연변이, Y641 돌연변이, 또는 H3K27me3의 증가된 수준 중 적어도 하나가 상기 샘플에 존재하는 경우에 상기 인간에게 유효량의 EZH2 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것
    을 포함하는, 상기 인간에서 암을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, EZH2 억제제가 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법.
    <화학식 I>
    Figure pct00025

    상기 식에서,
    W는 N 또는 CR2이고;
    X 및 Z는 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, (C6-C10)비시클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 할로겐, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -NRaNRaC(O)NRaRb, -NRaNRaC(O)ORa, -ORa, -OC(O)Ra 및 -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Y는 수소 또는 할로겐이고;
    R1은 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 (C6-C10)비시클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb 또는 -CONRaNRaRb이고;
    존재하는 경우에, R2는 수소, (C1-C8)알킬, 트리플루오로메틸, 알콕시 또는 할로겐이고, 여기서 상기 (C1-C8)알킬은 아미노 및 (C1-C3)알킬아미노로부터 선택된 1 내지 2개의 기로 치환될 수 있고;
    R7은 수소, (C1-C3)알킬 또는 알콕시이고; R3은 수소, (C1-C8)알킬, 시아노, 트리플루오로메틸, -NRaRb 또는 할로겐이고;
    R6은 수소, 할로, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, -B(OH)2, 치환 또는 비치환된 (C2-C8)알키닐, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬, 비치환 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬, (C6-C10)비시클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 아릴, 비치환 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -NRaNRaRb, -NRaNRaC(O)Rb, -NRaNRaC(O)NRaRb, -NRaNRaC(O)ORa, -ORa, -OC(O)Ra 및 -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    여기서, 임의의 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기는 -O(C1-C6)알킬(Rc)1 -2, -S(C1-C6)알킬(Rc)1-2, -(C1-C6)알킬(Rc)1-2, (C1-C8)알킬-헤테로시클로알킬, (C3-C8)시클로알킬-헤테로시클로알킬, 할로겐, (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra, -OC(O)NRaRb, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬 및 헤테로아릴(C1-C4)알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되고;
    여기서, 상기 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬 또는 헤테로아릴(C1-C4)알킬의 임의의 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티는 할로겐, (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -SRa, -SORa, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 니트로, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -NRaC(O)NRaRb, -NRaC(O)ORa, -NRaSO2Rb, -NRaSO2NRaRb, -ORa, -OC(O)Ra 및 -OC(O)NRaRb로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되고;
    각각의 Rc는 독립적으로 (C1-C4)알킬아미노, -NRaSO2Rb, -SORa, -SO2Ra, -NRaC(O)ORa, -NRaRb 또는 -CO2Ra이고;
    Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C6-C10)비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴이고, 여기서 상기 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기는 할로겐, 히드록실, (C1-C4)알콕시, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, -CO2H, -CO2(C1-C4)알킬, -CONH2, -CONH(C1-C4)알킬, -CON((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬), -SO2(C1-C4)알킬, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4)알킬 또는 -SO2N((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되거나;
    또는 Ra 및 Rb는 이들이 부착되어 있는 질소와 함께, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는 5-8원 포화 또는 불포화 고리를 나타내고, 여기서 상기 고리는 (C1-C4)알킬, (C1-C4)할로알킬, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, 히드록실, 옥소, (C1-C4)알콕시 및 (C1-C4)알콕시(C1-C4)알킬로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 기에 의해 임의로 치환되고, 여기서 상기 고리는 (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 임의로 융합되거나;
    또는 Ra 및 Rb는 이들이 부착되어 있는 질소와 함께, (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 임의로 융합된 6- 내지 10-원 가교된 비시클릭 고리계를 나타낸다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, EZH2 억제제가, W가 CR2인 화학식 I의 화합물인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, EZH2 억제제가 하기 화합물 B 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법.
    Figure pct00026
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, a, b 및 c 중 적어도 둘을 결정하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, a, b 및 c를 결정하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Y641 돌연변이의 존재 또는 부재를 결정하며, Y641 돌연변이가 Y641F, Y641S, Y641H, Y641N 또는 Y641C인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, A677 돌연변이의 존재 또는 부재를 결정하며, A677 돌연변이가 A677G인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 1개 이상의 암 세포를 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 림프종인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 림프종이 배 중심 B-세포 (GCB), 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 비장 변연부 림프종 (SMZL), 발덴스트룀 마크로글로불린혈증 림프형질세포성 림프종 (WM), 여포성 림프종 (FL), 외투 세포 림프종 (MCL), 및 점막 연관 림프 조직 (MALT)의 림프절 외 변연부 B-세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, A677 돌연변이 및/또는 Y641 돌연변이가 체세포 돌연변이인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, a) EZH2의 A766 돌연변이의 존재; b) EZH2의 Y641 돌연변이의 존재 및/또는 대조군과의 비교시 H3K27me3의 증가된 수준의 존재 중 적어도 하나를 갖는 인간이, a, b 또는 c를 갖지 않는 인간과 비교하여 EZH2 억제제로 치료시 증가된 반응률 및/또는 개선된 무진행 생존을 갖는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 항신생물제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제1항의 a, b 또는 c 중 하나 이상을 결정하기 위한 키트 및 제1항의 a, b 또는 c 중 하나 이상을 결정하기 위한 수단을 포함하는, 암의 치료를 위한 키트.
  16. 제15항에 있어서, 상기 수단이 프라이머, 프로브 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  17. 요법에서 사용하기 위한 바이오마커로서의 A677 돌연변이를 코딩하는 EZH2 핵산 또는 폴리펩티드 서열.
  18. 제17항에 있어서, A677 돌연변이가 A677G인 EZH2 서열.
  19. 암의 치료를 필요로 하는 인간으로부터의 샘플에서 제1항의 a, b 또는 c 중 하나 이상을 결정하는 것, 및 상기 샘플에서의 상기 돌연변이 중 하나 이상의 존재 및/또는 대조군과의 비교시 H3K27me3의 증가된 수준의 존재를, 상기 돌연변이를 갖지 않고 대조군과의 비교시 H3K27me3의 증가된 수준을 갖지 않는 인간과의 비교시에 암에 대한 치료를 필요로 하는 상기 인간에서의 반응률의 증가 가능성 및/또는 개선된 무진행 생존과 상호연관시키는 것을 포함하는, 상기 인간에서의 암의 치료 방법.
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