KR102453519B1 - 인간 ｅｚｈ2의 억제제 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 히스톤 H3 상의 리신 27(H3-K27)의 모노메틸화 내지 트리메틸화를 촉매화하는 PRC2 복합체의 촉매성 서브유닛인 인간 히스톤 메틸트랜스퍼라제 EZH2의 야생형 형태 및 특정 돌연변이체 형태의 억제에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 억제는 EZH2의 돌연변이체 형태에 대해 선택성이고, 이로써, 특정 암과 관련이 있는 H3-K27의 트리메틸화는 억제된다. 본 방법을 사용하여 여포성 림프종 및 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)을 비롯한 암을 치료할 수 있다. 또한 EZH2의 돌연변이체 형태의 소분자 선택성 억제제를 확인하는 방법, 및 피험체에서 EZH2 억제제에 대한 반응성을 결정하는 방법도 제공한다.

Description

인간 ＥＺＨ2의 억제제 및 이의 사용 방법{INHIBITORS OF HUMAN EZH2, AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원
본 출원은 2012년 3월 12일 출원된 미국 특허 출원 번호 제13/418,242호를 우선권 주장하며, 이 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 히스톤 H3 상의 리신 27(H3-K27)의 모노메틸화 내지 트리메틸화를 촉진하는 PRC2 복합체의 촉매성 서브유닛인 인간 히스톤 메틸트랜스퍼라제 EZH2의 야생형 형태 및 특정 돌연변이체 형태의 억제, 여포성 림프종 및 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL: diffuse large B-cell lymphoma)을 비롯한 암을 치료하는 방법, 및 피험체에서의 EZH2 억제제에 대한 반응성을 결정하는 방법에 관한 것이다.
진핵생물 세포에서, DNA는 히스톤과 함께 패키징되어 크로마틴을 형성한다. 대략 150개의 염기쌍의 DNA는 히스톤의 옥타머 주위에 2회 래핑되어(히스톤 2A, 2B, 3 및 4의 각 2개), 크로마틴의 기본 단위인 뉴클레오좀을 형성한다. 크로마틴의 질서있는 구조의 변화는 연관 유전자의 전사의 변경을 초래할 수 있다. 이 프로세스는, 유전자 발현 패턴의 변화가 기본적 세포내 프로세스, 예컨대, 분화, 증식 및 아폽토시스에 크게 영향을 미칠 수 있기 때문에, 고도로 제어된다. 크로마틴 구조의 변화의 제어(및 그에 따른 전사의 제어)는 가장 특히 N 말단 꼬리의, 히스톤으로의 공유적 변형에 의해 매개된다. 이 변형은 유전자 발현의 유전적 변화를 초래할 수 있으나 DNA 자체의 서열에는 영향을 미치지 않기 때문에, 종종 후생적으로 지칭된다. 아미노산의 측쇄의 공유적 변형(예컨대, 메틸화, 아세틸화, 인산화 및 유비퀴틴화)은 효소에 의해 매개된다.
히스톤 상의 특정 아미노산 부위에의 메틸기의 선택적 부가는 히스톤 메틸트랜스퍼라제(HMT: histone methyltransferase)로 알려져 있는 특유 계열의 효소의 작용에 의해 조절된다. 특별한 유전자의 발현 수준은 관련 히스톤 부위에 있는 하나 이상의 메틸기의 존재 또는 부재에 의해 영향을 받는다. 특별한 히스톤 부위에 있는 메틸기의 특정 효과는 메틸기가 히스톤 탈메틸라제에 의해 제거될 때까지, 또는 변형된 히스톤이 뉴클레오좀 반전을 통해 치환될 때까지 지속된다. 마찬가지 방식으로, 다른 효소 부류는 DNA 및 히스톤을 다른 화학종으로 수식할 수 있고, 또 다른 효소는 이러한 종을 제거함으로써 유전자 발현을 제어할 수 있다.
전사적 조절의 배후의 생화학적 시스템의 조직화된 집합은 세포 성장 및 분화가 최적으로 진행되도록 면밀히 제어되어야 한다. 이 질환 상태는, 이러한 제어가 DNA 및 히스톤 변형의 원인이 되는 효소의 이상 발현 및/또는 활성에 의해 방해될 때 초래된다. 예를 들어, 인간 암에서, 조절곤란성 후생적 효소 활성이 암과 연관된 조절 장애 세포 증식뿐만 아니라, 증진된 세포 이동 및 침습과 같은 기타 암 관련 표현형에 기여한다는 것을 제시하는 증거체가 증가하고 있다. 암 외에도, 다수의 기타 인간 질환, 예컨대, 대사 질환(예컨대, 당뇨병), 염증 질환(예컨대, 크론병), 신경퇴행성 질환(예컨대, 알츠하이머병), 및 심혈관 질환에서의 후생적 효소의 역할에 대한 증거가 증가하고 있다. 그러므로, 후생적 효소의 이상 작용을 선택적으로 조절하는 것은 다양한 범위의 질환들의 치료에 대한 전망을 밝게 한다.
히스톤 메틸트랜스퍼라제 EZH2
폴리콤 군(PcG) 및 트리토락스 군(trxG) 단백질은 세포 기억 체계의 부분인 것으로 알려져 있다(문헌[Francis et al., (2001) Nat Rev Mol Cell Biol 2:409-21]; 문헌[Simon et al., (2002) Curr Opin Genet Dev 12:210-8]). 상기 두 군 모두의 단백질 모두는 일시적으로 발현되는 분절 유전자에 의해 배아 발달 시에 조기 확립되는 호메오틱 박스(Hox) 유전자 발현의 공간 패턴의 유지에 관여한다. 일반적으로, PcG 단백질은 "분리(off) 상태"를 유지하는 전사 억제인자이고, trxG 단백질은 "부착(on) 상태"를 유지하는 전사 활성인자이다. PcG 및 trxG 단백질의 구성원은 고유의 히스톤 메틸트랜스퍼라제(HMTase) 활성을 보유하기 때문에, PcG 및 trxG 단백질은 코어 히스톤의 메틸화를 통해 세포 기억에 참여할 수 있다(문헌[Beisel et al., (2002) Nature 419:857-62]; [Cao et al., (2002) Science 298: 1039-43]; [Czermin et al., (2002) Cell 111: 185-96]; [Kuzmichev et al., (2002) Genes Dev 16:2893-905]; [Milne et al., (2002) Mol Cell 10: 1107-17]; [Muller et al., (2002) Cell 111: 197-208]; [Nakamura et al., (2002) Mol Cell 10: 1119-28]).
생화학적 및 유전학적 연구는 초파리(Drosophila) PcG 단백질이 적어도 2개의 구분된 단백질 복합체, 즉, 폴리콤 억제 복합체 1(PRC1: Polycomb repressive complex 1) 및 ESC-E(Z) 복합체(폴리콤 억제 복합체 2(PRC2: Polycomb repressive complex 2)로도 알려져 있음)에서, 이 복합체들의 조성이 역학적일 수 있으나 작용한다는 증거를 제공하였다(문헌[Otte et al., (2003) Curr Opin Genet Dev 13:448-54]). 초파리(문헌[Czermin et al., 상기 문헌 동일]; [Muller et al., 상기 문헌 동일]) 및 포유동물 세포(문헌[Cao et al., 상기 문헌 동일]; [Kuzmichev et al., 상기 문헌 동일])에서의 연구는 ESC-E(Z)/EED-EZH2(즉, PRC2) 복합체가 고유 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 가진다는 것을 입증하였다. 상이한 기들에 의해 단리된 복합체의 조성이 약간 상이하나, 일반적으로 EED, EZH2, SUZ12, 및 RbAp48 또는 그의 초파리 동족체를 포함한다. 그러나, EED, EZH2, 및 SUZ12만을 포함하는 재구성된 복합체는 히스톤 H3의 리신 27에 대한 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 보유한다(미국 특허 제7,563,589호(참조로 포함됨)).
PRC2 복합체를 구성하는 각종 단백질들 중, EZH2(Enhancer of Zeste Homolog 2)는 촉매성 서브유닛이다. 이에 EZH2의 촉매작용 부위도 트리토락스 군 및 폴리콤 군 모두의 구성원을 포함하는 수개의 크로마틴 연관 단백질에서 발견되는 매우 보존된 서열 모티프인 SET 도메인(Su(var)3-9, Zeste의 인핸서 및 트리토락스를 따라 명명) 내에 존재한다. SET 도메인은 H3-K79 메틸트랜스퍼라제 DOT1을 제외한 모든 알려진 히스톤 리신 메틸트랜스퍼라제의 특징이다.
Hox 유전자 침묵에 부가하여, PRC2-매개 히스톤 H3-K27 메틸화는 X-불활성화에 관여하는 것으로 나타났다(문헌[Plath et al., (2003) Science 300: 131-5]; [Silva et al., (2003) Dev Cell 4:481-95]). 히스톤 H3-K27에서의 PRC2 복합체의 Xi로의 동원 및 후속 트리메틸화의 도입은 X 불활성화의 초기 단계 동안에 일어나고, Xist RNA에 의존한다. 또한, EZH2 및 그의 연관 히스톤 H3-K27 메틸트랜스퍼라제 활성은 다능성 외배엽 세포 및 분화된 영양외배엽을 상이하게 표시하는 것으로 나타났다(문헌[Erhardt et al., (2003) Development 130:4235-48)]).
다능성 외배엽 세포의 후생적 변형 패턴을 유지함에 있어서의 EZH2의 역할과 일관되게, EZH2의 Cre 매개 결실은 세포 내 히스톤 H3-K27 메틸화의 상실을 초래한다(문헌[Erhardt et al., 상기 문헌 동일]). 또한, 전립선암 및 유방암 세포주 및 조직에 있어서의 연구는, EZH2 및 SUZ12의 수준과 이들 암의 침습성 사이의 강한 상관성을 보여주었고(문헌[Bracken et al., (2003) EMBO J 22:5323-35]; [Kirmizis et al., (2003) Mol Cancer Ther 2:113-21]; [Kleer et al., (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100: 11606-11]; [Varambally et al., (2002) Nature 419:624-9)]), 이는 PRC2 복합체의 기능이상이 암의 원인이 될 수 있음을 나타낸다.
최근, EZH2의 체세포 돌연변이가 여포성 림프종(FL: follicular lymphoma) 및 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)의 배중심 B 세포 유사(GCB: germinal center B cell-like) 서브타입과 관련이 있다고 보고되었다(문헌[Morin et al., (2010) Nat Genet 42: 181-5]). 모든 경우에서, 돌연변이체 EZH2 유전자의 발생은 이형접합성인 것으로 나타났고, 야생형 및 돌연변이체 대립유전자 둘 모두의 발현은 트랜스크립톰 서열분석에 의해 프로파일링된 돌연변이체 시료에서 검출되었다. 현재, DLBCL의 대부분의 사례의 치료를 위한 표준 치료법은 R-CHOP 요법이다. 그러나, 상기 요법의 결과는 전혀 만족스럽지 못하다. 따라서, 임의적으로, 피험체의 유전적 프로파일에 기초하여 신규하고 효과적인 요법을 찾는 것이 의학상 크게 요구되고 있다.
본 발명은, 특정 EZH2 돌연변이체를 발현하는 세포가 야생형 EZH2를 발현하는 세포보다 EZH2 억제제에 대하여 더욱 큰 반응성을 보인다는 발견에 기초한다.
본 발명은 서열 번호 6으로 정의된, 기질 포켓 도메인 중 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 EZH2를 발현하는 피험체에게 치료학상 유효량의 EZH2 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 암 또는 전암성 병증의 증상을 치료하거나, 또는 완화시키는 방법을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 피험체 유래의 시료를 제공하는 단계; 및 서열 번호 6으로 정의된, EZH2 기질 포켓 도메인 중 돌연변이를 검출하는 단계로서, 상기 돌연변이의 존재는 피험체가 EZH2 억제제에 대하여 반응성이라는 것을 나타내는 것인 단계를 포함하는, EZH2 억제제에 대한 암 또는 전암성 병증을 앓는 피험체의 반응성을 결정하는 방법(또는 시험관내 방법)을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 서열 번호 6으로 정의된, 기질 포켓 도메인 중 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 EZH2를 발현하는 피험체에서 암 또는 전암성 병증의 증상을 치료하거나, 또는 완화시키기 위한 약제의 제조에서 치료학상 유효량의 EZH2 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 돌연변이체 EZH2는 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드 또는 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이다. 바람직하게, 돌연변이체 EZH2는 서열 번호 1의 아미노산 위치 677, 687, 674, 685, 또는 641에 돌연변이를 포함한다. 더욱 바람직하게, 돌연변이는 서열 번호 1의 아미노산 위치 677에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 글리신(G)으로의 치환(A677G); 서열 번호 1의 아미노산 위치 687에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 발린(V)으로의 치환(A687V); 서열 번호 1의 아미노산 위치 674에서 야생형 잔기 발린(V)의 메티오닌(M)으로의 치환(V674M); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 히스티딘(H)으로의 치환(R685H); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 시스테인(C)으로의 치환(R685C); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 페닐알라닌(F)으로의 치환(Y641F); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 히스티딘(H)으로의 치환(Y641H); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 아스파라긴(N)으로의 치환(Y641N); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 세린(S)으로의 치환(Y641S); 및 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 시스테인(C)으로의 치환(Y641C)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 피험체는 암 또는 전암성 병증 진단을 받았거나, 그의 증상을 앓거나, 그가 발병될 위험이 있는 임의의 인간 피험체를 포함한다. 예를 들어, 암은 림프종, 백혈병 또는 흑색종이다. 바람직하게, 림프종은 비호지킨 림프종, 여포성 림프종 또는 미만성 거대 B 세포 림프종이다. 별법으로, 백혈병은 만성 골수성 백혈병(CML: chronic myelogenous leukemia)이다. 전암성 병증은 골수이형성 증후군(MDS: myelodysplasia syndrome, 이전에는 전백혈병으로 알려져 있었음)이다.
본 발명의 방법을 위한 바람직한 EZH2 억제제는 하기 표 1에 열거되어 있는 화합물로부터 선택된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 숙련가에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에서, 문맥상 명백히 달리 지시되지 않는 한, 단수 형태는 복수 형태도 또한 포함한다. 비록 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 발명의 수행 또는 시험에 사용될 수 있기는 하지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기술된다. 본원에 언급된 모든 공개 문헌, 특허출원 및 다른 참고 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 본원에 인용된 참고 문헌은 청구 발명에 대한 선행 기술로 인정되는 것은 아니다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서에 의해 조정될 것이다. 추가로, 상기 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 EZH2의 B 세포 림프종 연관 돌연변이체가 활성 히스톤 메틸트랜스퍼라제라는 것을 확립하는 2개의 그래프이다. EZH2의 야생형 및 각종 Y641 돌연변이체를 함유하는 PRC2 복합체의 시험관내 메틸트랜스퍼라제 활성을 (A) 펩티드(H3 21-44)를 기질로 이용하는 메틸 전달 반응, 및 (B) 조류 뉴클레오좀을 기질로 이용하는 메틸 전달 반응으로서 측정하였다. 기호: 야생형(●), Y641F(○), Y641H(□), Y641N(■), 및 Y641S(▲). CPM은 분당 계수이며, 이는 3H 방사선의 결과로서의 섬멸 계수를 의미한다.
도 2는 돌연변이체 EZH2를 함유하는 PRC2 복합체가 히스톤 H3-K27의 디메틸화 및 트리메틸화를 우선적으로 촉매한다는 것을 확립하는 4개의 그래프이다. (A) 비메틸화된 펩티드(열린 형 막대), 모노메틸화된 펩티드(해시형 막대), 및 디메틸화된 펩티드(닫힌 형 막대)에 대한 돌연변이체 및 야생형(WT) 복합체의 메틸트랜스퍼라제 활성. (B) K½에 의해 판단되는 펩티드 기질에 대한 친화성은 야생형(○), Y641F(●), Y641H(□), Y641N(■), 및 Y641S(▲) EZH2를 함유하는 PRC2 복합체에 대한 모든 펩티드 메틸화 상태 전반에 걸쳐 유사하다. 모든 기질 및 모든 효소 형태 전반에 걸친 K½ 값의 변동은 3.5배 미만이라는 것을 주목한다. 기질의 어떠한 특별한 메틸화 상태에 대해서도, K½ 값의 변동은 2배 미만이다. (C) 효소 반전 수(kcat)는 EZH2의 WT 및 Y641 돌연변이체에 대해 반대되는 방식으로 기질 메틸화 상태에 따라 변동한다. kcat은 야생형(○)에 대한 K27 메틸화 상태의 증가에 따라 감소하나, EZH2의 Y641F(●), Y641H(□), Y641N(■), 및 Y641S(▲) 돌연변이체에 대해서는 증가한다. (D) 촉매 효율(kcat/K½)은 야생형(○)에 대한 K27 메틸화 상태의 증가에 따라 감소하나, EZH2의 Y641F(●), Y641H(□), Y641N(■), 및 Y641S(▲) 돌연변이체에 대해서는 증가한다. 패널 B-D에서, 데이터 점을 연결하여 그려진 선은 어떠한 수학적 관계를 의미하고자 하는 것이 아니며; 오히려 단지 시각적 보조 수단으로서의 역할을 하고자 하는 것이다.
도 3A는 상이한 EZH2 돌연변이체를 함유하는 세포에 대한 H3-K27me3(상단 패널), H3-K27me2(중간 패널), 및 H3-K27me1(하단 패널)의 예측된 상대 수준을 나타내는 3종 그래프이다. 표 2에 나타낸 커플링된 효소 정지 상태 속도 방정식 및 정지 상태 동역학적 매개변수를 이용하여 모의를 수행하였다. 모든 값들은 동형접합성 WT EZH2 함유 세포에 대해 상대적이고, Km에 대해 상대적인 세포내 SAM의 포화 농도, 및 Km과 유사한 세포내 뉴클레오좀 농도를 가정한다.
도 3B은 WT EZH2에 대해 동형접합성이거나 표시된 EZH2 Y641 돌연변이에 대해 이형접합성인 림프종 세포주에 대한 H3-K27 메틸화 상태의 상대 패턴의 일련의 웨스턴 블롯 분석이다. 상단에서 하단까지의 패널은 하기에 대해 특이적인 항체로 프로빙한 것에 대한 결과를 나타낸다: 총 EZH2; H3-K27me3; H3-K27me2; H3-K27me1; 및 (로딩 대조군으로서의) 총 히스톤 H3.
도 4는 암에 있어 이상적으로 높은 수준의 히스톤 H3-K27에 대한 트리메틸화를 초래하는 선택된 제안된 기전을 나타낸다. 이는 a) 비메틸화 내지 모노메틸화 및 디메틸화된 히스톤 H3-K27으로부터의 기질 선호도의 변화를 초래하는 EZH2에서의 Y641의 돌연변이; b) EZH2의 과다발현; c) 효소 기능을 불활성화시켜 H3-K27me3의 탈메틸화를 감소시키는 UTX에서의 돌연변이; 및 d) 특정 유전자에의 PRC2 복합체의 동원을 증가시키고, 히스톤 H3-K27 트리메틸화를 증가시키는 PRC2 복합체 서브유닛 PHF19/PCL3의 과다발현을 포함한다. 4가지 모든 모델들에서, 상기 변경은 암에 있어 핵심 유전자의 전사 억제를 초래하는 유전자의 근위 프로모터 영역에서의 이상 히스톤 H3-K27 트리메틸화를 초래한다.
도 5는 각각의 5-성분 PRC2 복합체의 발현 수준이 돌연변이체 및 야생형 EZH2와 유사함을 보여주는 SDS-PAGE 겔을 나타낸다.
도 6은 돌연변이체 및 야생형(WT) PRC2 복합체가 H3-K27 함유 펩티드에 대한 강한 기질 선호도를 보인다는 것을 나타내는 한 쌍의 표이다. 각 효소를 H3 및 H4 모두를 커버하는 중첩 15량체 펩티드의 패널에 대해 시험하였다. 활성을 속도(분당 CPM)로서 측정하였고, 보고된 값은 각 반응에 대한 2가지 독립 측정값의 평균을 나타낸다. 모든 복합체들에 대해, 가장 선호되는 펩티드는 H3: 16-30이었다. WT 복합체는 돌연변이체 복합체 중 어느 것보다 상기 펩티드에 대해 6배 초과로 더 큰 활성을 가졌다.
도 7은 EZH2의 EZH2 WT 및 Y641 돌연변이체에 대한 S-아데노실-L-호모시스테인(SAH: S-adenosyl-L-homocysteine) 억제 효능을 나타내는 그래프이다. X 축은 SAH의 로그 농도를 나타내는 것이고; Y 축은 억제율(%)을 나타내는 것이다.
도 8은 EZH2의 EZH2 WT 및 Y641 돌연변이체에 대한 화합물 75의 억제 효능을 나타내는 그래프이다. X 축은 화합물 75의 로그 농도를 나타내는 것이고; Y 축은 억제율(%)을 나타내는 것이다.
도 9는 WT 또는 Y641 돌연변이체 EZH2를 발현하는 다중 DLBCL 세포주를 포함하는 세포주 패널에서의 H3-K27me1, me2 및 me3의 상대 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다. 히스톤을 제시된 세포주로부터 추출하여, 4 내지 20% 겔 상의 SDS-PAGE에 의해 분별하고, 니트로스 셀룰로스 막으로 전달하고, 히스톤 H3, H3-K27me1, me2, 또는 me3에 대한 항체로 프로빙하였다.
도 10은 WT 및 Y641 돌연변이체 림프종 세포주의 패널에서의 H3 및 H3-K27me3 수준의 면역세포화학 분석을 나타낸다. 명시된 세포주로부터의 세포 펠릿을 고정하고, 파라핀 중에 포매하였다. 슬라이드를 제조하고, 히스톤 H3 또는 H3-K27me3에 대한 항체를 이용하여 면역세포화학에 의해 H3 및 H3-K27me3의 수준을 평가하였다.
도 11은 WT 및 Y641 돌연변이체 림프종 세포주의 패널에서의 H3 및 H3-K27me2 수준의 면역세포화학 분석을 나타낸다. 명시된 세포주로부터의 세포 펠릿을 고정하고, 파라핀 중에 포매하였다. 슬라이드를 제조하고, 히스톤 H3, 또는 H3-K27me2에 대한 항체를 이용하여 면역세포화학에 의해 H3 및 H3-K27me2의 수준을 평가하였다.
도 12는 Y641 돌연변이체 WSU-DLCL2 세포에서의 EZH2 억제제 처리에 의한 전반적 H3-K27me3 수준의 억제를 나타내는 그래프이다. WSU-DLCL2 세포를 4일 동안 표시된 농도의 EZH2 억제제 A 또는 B로 처리하였다. 화합물 처리 후, 히스톤을 추출하고, 4 내지 20% 겔 상의 SDS-PAGE에 의해 분별하여, 니트로스 셀룰로스 막으로 전달하고, 히스톤 H3 또는 H3-K27me3에 대한 항체로 프로빙하였다.
도 13은 EZH2 억제제가 Y641 돌연변이체 WSU-DLCL2 세포의 증식을 차단할 수 있으나, 비-Y641 돌연변이체 OCI-LY19 세포에 대해서는 효과가 극미하였음을 보여주는 그래프이다. 세포를 11일 동안 농도를 점차 증가시킨 EZH2 억제제 A 또는 B의 존재 하에 인큐베이션하였다. 비히클 처리(DMSO) 세포를 대조군으로서 포함시켰다. 구아바 이지사이트 플러스(Guava EasyCyte Plus) 기기에서 구아바 바이아카운트(Guava Viacount) 검정을 이용하여 세포수 및 생존율을 측정하였다. 세포를 분할하고, 배지 및 화합물을 3 내지 4일마다 보충해 주었다.
도 14는 EZH2(Y641) 돌연변이 및/또는 높은 H3-K27me3 및 낮은 H3-K27me2 수준의 존재가 EZH2 억제제에 대한 감수성을 예측함을 보여주는 그래프이다. 세포주를 25 μM까지 점차 증가하는 농도의 한 EZH2 억제제의 존재 하에 유지시켰다. 생존 세포 계수(counts)를 사용하여, 11일간의 처리 후의 IC90 값을 유도하였다. 결과를 EZH2 돌연변이 상태에 따라 격리된 세포주(A), 또는 H3-K27me2 및 H3-K27me3 수준에 따라 격리된 세포주(B)에 대비하여 플롯팅하였다. 양 플롯 모두에서, 선은 명시된 세포주 군으로부터의 평균 IC90 값을 나타낸다.
도 15는 야생형, A677G 또는 A687V EZH2에 대해 측정된 효소 농도 대 속도를 보여주는 그래프 패널이다. 메틸이 없는(unmethyl), 모노메틸, 디메틸, 또는 트리메틸 리신27(H3K27me0 내지 H3K27me3)을 포함하는 히스톤 H3 잔기 21-44를 나타내는 비오티닐화된 펩티드를 고정된 농도로, 명시된 EZH2 효소의 일련의 희석액을 이용하여 검정하였다. 90분 동안 걸쳐 시점들을 표본 추출하고, 플래쉬플레이트(Flashplate) 에 펩티드를 포획하고, 분당 계수(CPM: counts per minute)를 판독하여 H3 펩티드의 리신 27에의 3H-SAM 혼입을 측정하였다. 시간 경과에 따른 선형 회귀를 통해, 효소 농도의 함수로서 플롯팅된 효소 속도(분당 CPM(CPM/min))를 얻었다.
크로마틴 구조는 유전자 제어 및 후생적 유전에서 중요하다. 히스톤의 번역 후 변형, 예컨대 메틸화는 고차 크로마틴 구조를 확립하고 유지하는 데 관여한다.
EZH2 돌연변이체
EZH2는 히스톤 H3 상의 리신 27(H3-K27)의 모노메틸화 내지 트리메틸화를 촉진하는 PRC2 복합체의 촉매성 서브유닛인 히스톤 메틸트랜스퍼라제이다.
EZH2의 단일 아미노산 잔기(예컨대, Tyr641, 본원에서 Y641로 지칭됨)에 있는 EZH2 유전자의 점 돌연변이는 인간 B 세포 림프종의 서브세트와 연관이 있는 것으로 보고되었다(문헌[Morin et al. (2010) Nat Genet 42(2): 181-5]). 특히, Morin 등은 EZH2의 티로신 641(Y641F, Y641H, Y641N, 및 Y641S)의 체세포 돌연변이는 여포성 림프종(FL), 및 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)의 배중심 B 세포 유사(GCB) 서브타입과 관련되어 있다고 보고하였다. 돌연변이체 대립유전자는 항상 질환 세포에서의 야생형 대립유전자와 회합되어 있고(이형접합성), 돌연변이는 비변형된 펩티드 기질을 메틸화하기 위한 PRC2 복합체의 효소 활성을 제거하는 것으로 보고되었다.
본 발명은 부분적으로는 EZH2 돌연변이체를 발현하는 세포가 야생형 EZH2를 발현하는 세포보다 본 발명의 EZH2 억제제에 대하여 더욱 큰 감수성을 보인다는 놀라운 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명의 측면은 돌연변이체 EZH2를 발현하는 피험체에게 치료학상 유효량의 EZH2 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 암 또는 전암성 병증의 증상을 치료하거나, 또는 완화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 돌연변이체 EZH2는 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드 또는 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 바람직하게 돌연변이체 EZH2는 서열 번호 6으로 정의된, 그의 기질 포켓 도메인 중 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이는 치환, 점 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 결실, 또는 삽입일 수 있다. 예시적인 치환 아미노산 돌연변이로는 서열 번호 1의 아미노산 위치 677, 687, 674, 685, 또는 641에서의 치환, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 서열 번호 1의 아미노산 위치 677에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 글리신(G)으로의 치환(A677G); 서열 번호 1의 아미노산 위치 687에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 발린(V)으로의 치환(A687V); 서열 번호 1의 아미노산 위치 674에서 야생형 잔기 발린(V)의 메티오닌(M)으로의 치환(V674M); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 히스티딘(H)으로의 치환(R685H); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 시스테인(C)으로의 치환(R685C); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 페닐알라닌(F)으로의 치환(Y641F); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 히스티딘(H)으로의 치환(Y641H); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 아스파라긴(N)으로의 치환(Y641N); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 세린(S)으로의 치환(Y641S); 또는 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 시스테인(C)으로의 치환(Y641C)을 포함한다.
본 발명의 돌연변이는 또한 서열 번호 3의 아미노산 위치 322에서 야생형 잔기 아스파라긴(N)의 세린(S)으로의 치환(N322S), 서열 번호 3의 아미노산 위치 288에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 글루타민(Q)으로의 치환(R288Q), 서열 번호 3의 아미노산 위치 573에서 야생형 잔기 트레오닌(T)의 이소류신(I)으로의 치환(T573I), 서열 번호 3의 아미노산 위치 664에서 야생형 잔기 아스파르트산(D)의 글루탐산(E)으로의 치환(D664E), 서열 번호 5의 아미노산 위치 458에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 글루타민(Q)으로의 치환(R458Q), 서열 번호 3의 아미노산 위치 249에서 야생형 잔기 글루탐산(E)의 리신(K)으로의 치환(E249K), 서열 번호 3의 아미노산 위치 684에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 시스테인(C)으로의 치환(R684C), 서열 번호 21의 아미노산 위치 628에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 히스티딘(H)으로의 치환(R628H), 서열 번호 5의 아미노산 위치 501에서 야생형 잔기 글루타민(Q)의 히스티딘(H)으로의 치환(Q501H), 서열 번호 3의 아미노산 위치 192에서 야생형 잔기 아스파르트산(D)의 아스파라긴(N)으로의 치환(D192N), 서열 번호 3의 아미노산 위치 664에서 야생형 잔기 아스파르트산(D)의 발린(V)으로의 치환(D664V), 서열 번호 3의 아미노산 위치 704에서 야생형 잔기 발린(V)의 류신(L)으로의 치환(V704L), 서열 번호 3의 아미노산 위치 132에서 야생형 잔기 프롤린(P)의 세린(S)으로의 치환(P132S), 서열 번호 21의 아미노산 위치 669 에서 야생형 잔기 글루탐산(E)의 리신(K)으로의 치환(E669K), 서열 번호 3의 아미노산 위치 255에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 트레오닌(T)으로의 치환(A255T), 서열 번호 3의 아미노산 위치 726에서 야생형 잔기 글루탐산(E)의 발린(V)으로의 치환(E726V), 서열 번호 3의 아미노산 위치 571에서 야생형 잔기 시스테인(C)의 티로신(Y)으로의 치환(C571Y), 서열 번호 3의 아미노산 위치 145에서 야생형 잔기 페닐알라닌(F)의 시스테인(C)으로의 치환(F145C), 서열 번호 3의 아미노산 위치 693에서 야생형 잔기 아스파라긴(N)의 트레오닌(T)으로의 치환(N693T), 서열 번호 3의 아미노산 위치 145에서 야생형 잔기 페닐알라닌(F)의 세린(S)으로의 치환(F145S), 서열 번호 21의 아미노산 위치 109에서 야생형 잔기 글루타민(Q)의 히스티딘(H)으로의 치환(Q109H), 서열 번호 21의 아미노산 위치 622에서 야생형 잔기 페닐알라닌(F)의 시스테인(C)으로의 치환(F622C), 서열 번호 3의 아미노산 위치 135에서 야생형 잔기 글리신(G)의 아르기닌(R)으로의 치환(G135R), 서열 번호 5의 아미노산 위치 168에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 글루타민(Q)으로의 치환(R168Q), 서열 번호 3의 아미노산 위치 159에서 야생형 잔기 글리신(G)의 아르기닌(R)으로의 치환(G159R), 서열 번호 5의 아미노산 위치 310에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 시스테인(C)으로의 치환(R310C), 서열 번호 3의 아미노산 위치 561에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 히스티딘(H)으로의 치환(R561H), 서열 번호 21의 아미노산 위치 634에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 히스티딘(H)으로의 치환(R634H), 서열 번호 3의 아미노산 위치 660에서 야생형 잔기 글리신(G)의 아르기닌(R)으로의 치환(G660R), 서열 번호 3의 아미노산 위치 181에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 시스테인(C)으로의 치환(Y181C), 서열 번호 3의 아미노산 위치 297에서 야생형 잔기 히스티딘(H)의 아르기닌(R)으로의 치환(H297R), 서열 번호 21의 아미노산 위치 612에서 야생형 잔기 시스테인(C)의 세린(S)으로의 치환(C612S), 서열 번호 3의 아미노산 위치 694에서 야생형 잔기 히스티딘(H)의 티로신(Y)으로의 치환(H694Y), 서열 번호 3의 아미노산 위치 664에서 야생형 잔기 아스파르트산(D)의 알라닌(A)으로의 치환(D664A), 서열 번호 3의 아미노산 위치 150에서 야생형 잔기 이소류신(I)의 트레오닌(T)으로의 치환(I150T), 서열 번호 3의 아미노산 위치 264에서 야생형 잔기 이소류신(I)의 아르기닌(R)으로의 치환(I264R), 서열 번호 3의 아미노산 위치 636에서 야생형 잔기 프롤린(P)의 류신(L)으로의 치환(P636L), 서열 번호 3의 아미노산 위치 713에서 야생형 잔기 이소류신(I)의 트레오닌(T)으로의 치환(I713T), 서열 번호 5의 아미노산 위치 501에서 야생형 잔기 글루타민(Q)의 프롤린(P)으로의 치환(Q501P), 서열 번호 3의 아미노산 위치 243에서 야생형 잔기 리신(K)의 글루타민(Q)으로의 치환(K243Q), 서열 번호 5의 아미노산 위치 130에서 야생형 잔기 글루탐산(E)의 아스파르트산(D)으로의 치환(E130D), 서열 번호 3의 아미노산 위치 509에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 글리신(G)으로의 치환(R509G), 서열 번호 3의 아미노산 위치 566에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 히스티딘(H)으로의 치환(R566H), 서열 번호 3의 아미노산 위치 677에서 야생형 잔기 아스파르트산(D)의 히스티딘(H)으로의 치환(D677H), 서열 번호 5의 아미노산 위치 466에서 야생형 잔기 리신(K)의 아스파라긴(N)으로의 치환(K466N), 서열 번호 3의 아미노산 위치 78에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 히스티딘(H)으로의 치환(R78H), 서열 번호 6의 아미노산 위치 1에서 야생형 잔기 리신(K)의 메티오닌(M)으로의 치환(K6M), 서열 번호 3의 아미노산 위치 538에서 야생형 잔기 세린(S)의 류신(L)으로의 치환(S538L), 서열 번호 3의 아미노산 위치 149에서 야생형 잔기 류신(L)의 글루타민(Q)으로의 치환(L149Q), 서열 번호 3의 아미노산 위치 252에서 야생형 잔기 류신(L)의 발린(V)으로의 치환(L252V), 서열 번호 3의 아미노산 위치 674에서 야생형 잔기 류신(L)의 발린(V)으로의 치환(L674V), 서열 번호 3의 아미노산 위치 656에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 발린(V)으로의 치환(A656V), 서열 번호 3의 아미노산 위치 731에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 아스파르트산(D)으로의 치환(Y731D), 서열 번호 3의 아미노산 위치 345에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 트레오닌(T)으로의 치환(A345T), 서열 번호 3의 아미노산 위치 244에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 아스파르트산(D)으로의 치환(Y244D), 서열 번호 3의 아미노산 위치 576에서 야생형 잔기 시스테인(C)의 트립토판(W)으로의 치환(C576W), 서열 번호 3의 아미노산 위치 640에서 야생형 잔기 아스파라긴(N)의 리신(K)으로의 치환(N640K), 서열 번호 3의 아미노산 위치 675에서 야생형 잔기 아스파라긴(N)의 리신(K)으로의 치환(N675K), 서열 번호 21의 아미노산 위치 579에서 야생형 잔기 아스파르트산(D)의 티로신(Y)으로의 치환(D579Y), 서열 번호 3의 아미노산 위치 693에서 야생형 잔기 아스파라긴(N)의 이소류신(I)으로의 치환(N693I), 및 서열 번호 3의 아미노산 위치 693에서 야생형 잔기 아스파라긴(N)의 리신(K)으로의 치환(N693K)을 포함한다.
본 발명의 돌연변이는 서열 번호 3, 5 또는 21의 아미노산 위치 730, 391, 461, 441, 235, 254, 564, 662, 715, 405, 685, 64, 73, 656, 718, 374, 592, 505, 730, 또는 363, 또는 서열 번호 3, 5, 또는 21을 코딩하는 핵산 서열의 상응하는 뉴클레오티드 위치에서의 프레임쉬프트일 수 있다. EZH2의 돌연변이는 또한 서열 번호 3, 5, 또는 21의 아미노산 위치 148 내지 149 사이의 글루탐산(E)의 삽입일 수 있다. EZH2 돌연변이의 또 다른 예는 서열 번호 3, 5, 또는 21의 아미노산 위치 148 및 149의 글루탐산(E) 및 류신(L)의 결실이다. 돌연변이체 EZH2는 추가로 서열 번호 3, 5, 또는 21의 아미노산 위치 733, 25, 317, 62, 553, 328, 58, 207, 123, 63, 137, 또는 60에 넌센스 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다.
예상외로, 야생형(WT) EZH2 효소는 H3-K27의 제로메틸화 내지 모노메틸화 반응에 대한 가장 큰 촉매 효능(kcat/K)과 후속(모노메틸화 내지 디메틸화 및 디메틸화 내지 트리메틸화) 반응에 대한 보다 적은 효능을 나타내고; 반면 극명히 대조적으로, 질환과 관련된 Y641 돌연변이는 1차 메틸화 반응을 수행하는 매우 제한된 능력을 나타내나, 야생형 효소에 대한 후속 반응에 대해서는 증진된 촉매 효능을 가진다는 것 또한 밝혀졌다. 이 결과는 질환의 악성 표현형은 H3-K27의 트리메틸화된 형태(H3-K27me3)로의 증강된 전환을 위한 돌연변이체 EZH2 함유의 PRC2와 함께 H3-K27 모노메틸화 효소(WT EZH2 또는 EZH1 함유의 PRC2)의 조합된 활성을 이용한다는 것을 시사한다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 EZH2의 특정 돌연변이체 형태를 비롯한, EZH2의 활성을 억제시키는 것에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 EZH2의 특정 돌연변이체 형태의 활성을 선택적으로 억제시키는 것에 관한 것이다.
어떤 한 이론으로도 한정하고자 하지 않으면서, 그의 기질 포켓 도메인 중 EZH2의 돌연변이는 효소-2기질의 삼원 중합체의 활성 부위에서의 H-결합 패턴 및/또는 입체 과밀에 영향을 줌으로써 다회에 걸친 H3-K27 메틸화를 촉진시킬 수 있고, 이는 반응하는 리신의 탈양자화를 위한 적절한 수로의 형성에 영향을 줄 수 있을 것이라고 가정하였다.
인간 EZH2 핵산 및 폴리펩티드는 앞서 기술된 바 있다. 예컨대, 문헌[Chen et al., (1996) Genomics 38:30-7][746개의 아미노산]; 스위스-Prot(Swiss-Prot) 수탁 번호 Q15910[746개의 아미노산]; 진뱅크 수탁 번호(GenBank Accession Nos.) NM_004456 및 NP_004447(이소폼 a[751개의 아미노산]); 및 진뱅크 수탁 번호 NM_152998 및 NP_694543(이소폼 b[707개의 아미노산])(이들 각각은 그 전문이 본원에서 참조로 포함됨)을 참조할 수 있다.
Figure 112021068876035-pat00001
Figure 112021068876035-pat00002
Figure 112021068876035-pat00003
Figure 112021068876035-pat00004
Figure 112021068876035-pat00005
Figure 112021068876035-pat00006
Figure 112021068876035-pat00007
Figure 112021068876035-pat00008
Figure 112021068876035-pat00009
핵 수용체 결합 SET 도메인 단백질 1(NSD1: nuclear receptor binding protein 1)의 A 쇄에 기초한 부분 EZH2 단백질의 구조 모델이 하기 제시되어 있다. 이 모델은 서열 번호 1의 EZH2 서열의 아미노산 잔기 533-732에 상응한다.
Figure 112021068876035-pat00010
상기 모델의 상응하는 아미노산 서열은 하기에 제시되어 있다. 기질 포켓 도메인의 잔기는 밑줄로 표시되어 있다. SET 도메인의 잔기는 이탤릭체로 표시되어 있다.
Figure 112021068876035-pat00011
EZH2의 촉매성 부위는 SET 도메인으로 알려진 단백질의 보존된 도메인 내에 있는 것으로 판단된다. EZH2의 SET 도메인의 아미노산 서열은 스위스-Prot 수탁 번호 Q15910(서열 번호 1)의 아미노산 잔기 613-726에 걸쳐 있는 하기 부분 서열에 의해 제공된다:
Figure 112021068876035-pat00012
서열 번호 7에 밑줄로 표시된 티로신(Y) 잔기는 스위스-Prot 수탁 번호 Q15910(서열 번호 1) 중의 Tyr641(Y641)이다.
진뱅크 수탁 번호 NP_004447(서열 번호 3)의 SET 도메인은 아미노산 잔기 618-731에 걸쳐 있고, 서열 번호 6과 동일하다. 서열 번호 7에 밑줄로 표시된 스위스-Prot 수탁 번호 Q15910 중의 Y641에 상응하는 티로신 잔기는 진뱅크 수탁 번호 NP_004447(서열 번호 3) 중의 Tyr646(Y646)이다.
진뱅크 수탁 번호 NP_694543(서열 번호 5)의 SET 도메인은 아미노산 잔기 574-687에 걸쳐 있고, 서열 번호 7과 동일하다. 서열 번호 7에 밑줄로 표시된 스위스-Prot 수탁 번호 Q15910 중의 Y641에 상응하는 티로신 잔기는 진뱅크 수탁 번호 NP_694543(서열 번호 5) 중의 Tyr602(Y602)이다.
진뱅크 수탁 번호 NP_004447의 SET 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은
Figure 112021068876035-pat00013
이다.
본 출원의 목적을 위해, 인간 EZH2의 아미노산 잔기 Y641은 스위스-Prot 수탁 번호 Q15910 중의 Y641이거나, 또는 그에 상응하는 티로신 잔기를 지칭하는 것으로 이해된다.
Figure 112021068876035-pat00014
또한, 본 출원의 목적을 위해, 인간 EZH2의 Y641 돌연변이체 및 등가적으로, EZH2의 Y641 돌연변이체는 야생형 인간 EZH2의 Y641에 상응하는 아미노산 잔기가 티로신 이외의 아미노산 잔기로 치환된 인간 EZH2를 지칭하는 것으로 이해된다.
한 실시양태에서, EZH2의 Y641 돌연변이체의 아미노산 서열은 단지 야생형 인간 EZH2의 Y641에 상응하는 단일 아미노산 잔기가 티로신 외의 아미노산 잔기로 치환되었다는 점에서만 야생형 인간 EZH2의 아미노산 서열과 상이하다.
한 실시양태에서, EZH2의 Y641 돌연변이체의 아미노산 서열은 단지 야생형 인간 EZH2의 Y641에 상응하는 단일 아미노산 잔기가 페닐알라닌(F)으로 치환되었다는 점에서만 야생형 인간 EZH2의 아미노산 서열과 상이하다. 본 실시양태에 따른 EZH2의 Y641 돌연변이체는 본원에서 Y641F 돌연변이체 또는 등가적으로 Y641F로 지칭된다.
Figure 112021068876035-pat00015
한 실시양태에서, EZH2의 Y641 돌연변이체의 아미노산 서열은 단지 야생형 인간 EZH2의 Y641에 상응하는 단일 아미노산 잔기가 히스티딘(H)으로 치환되었다는 점에서만 야생형 인간 EZH2의 아미노산 서열과 상이하다. 본 실시양태에 따른 EZH2의 Y641 돌연변이체는 본원에서 Y641H 돌연변이체 또는 등가적으로 Y641H로 지칭된다.
Figure 112021068876035-pat00016
한 실시양태에서, EZH2의 Y641 돌연변이체의 아미노산 서열은 단지 야생형 인간 EZH2의 Y641에 상응하는 단일 아미노산 잔기가 아스파라긴(N)으로 치환되었다는 점에서만 야생형 인간 EZH2의 아미노산 서열과 상이하다. 본 실시양태에 따른 EZH2의 Y641 돌연변이체는 본원에서 Y641N 돌연변이체 또는 등가적으로 Y641N으로 지칭된다.
Figure 112021068876035-pat00017
한 실시양태에서, EZH2의 Y641 돌연변이체의 아미노산 서열은 단지 야생형 인간 EZH2의 Y641에 상응하는 단일 아미노산 잔기가 세린(S)으로 치환되었다는 점에서만 야생형 인간 EZH2의 아미노산 서열과 상이하다. 본 실시양태에 따른 EZH2의 Y641 돌연변이체는 본원에서 Y641S 돌연변이체 또는 등가적으로 Y641S로 지칭된다.
Figure 112021068876035-pat00018
한 실시양태에서, EZH2의 Y641 돌연변이체의 아미노산 서열은 단지 야생형 인간 EZH2의 Y641에 상응하는 단일 아미노산 잔기가 시스테인(C)으로 치환되었다는 점에서만 야생형 인간 EZH2의 아미노산 서열과 상이하다. 본 실시양태에 따른 EZH2의 Y641 돌연변이체는 본원에서 Y641C 돌연변이체 또는 등가적으로 Y641C로 지칭된다.
Figure 112021068876035-pat00019
한 실시양태에서, EZH2의 A677 돌연변이체의 아미노산 서열은 단지 야생형 인간 EZH2의 A677에 상응하는 단일 아미노산 잔기가 알라닌이 아닌 아미노산, 바람직하게 글리신(G)으로 치환되었다는 점에서만 야생형 인간 EZH2의 아미노산 서열과 상이하다. 본 실시양태에 따른 EZH2의 A677 돌연변이체는 본원에서 A677 돌연변이체, 및 바람직하게, A677G 돌연변이체 또는 등가적으로 A677G로 지칭된다.
Figure 112021068876035-pat00020
한 실시양태에서, EZH2의 A687 돌연변이체의 아미노산 서열은 단지 야생형 인간 EZH2의 A687에 상응하는 단일 아미노산 잔기가 알라닌이 아닌 아미노산, 바람직하게 발린(V)으로 치환되었다는 점에서만 야생형 인간 EZH2의 아미노산 서열과 상이하다. 본 실시양태에 따른 EZH2의 A687 돌연변이체는 본원에서 A687 돌연변이체 및 바람직하게, A687V 돌연변이체, 또는 등가적으로, A687V로 지칭된다.
Figure 112021068876035-pat00021
한 실시양태에서, EZH2의 R685 돌연변이체의 아미노산 서열은 단지 야생형 인간 EZH2의 R685에 상응하는 단일 아미노산 잔기가 아르기닌이 아닌 아미노산, 바람직하게 히스티딘(H) 또는 시스테인(C)으로 치환되었다는 점에서만 야생형 인간 EZH2의 아미노산 서열과 상이하다. 본 실시양태에 따른 EZH2의 R685 돌연변이체는 본원에서 R685 돌연변이체 및 바람직하게, R685C 돌연변이체 또는 R685H 돌연변이체, 또는 등가적으로, R685H 또는 R685C로 지칭된다.
Figure 112021068876035-pat00022
한 실시양태에서, EZH2의 돌연변이체의 아미노산 서열은 서열 번호 6으로 정의된, 그의 기질 포켓 도메인 중 하나 이상의 아미노산 잔기에서 야생형 인간 EZH2의 아미노산 서열과 상이하다. 본 실시양태에 따른 EZH2의 돌연변이체는 본원에서 EZH2 돌연변이체로 지칭된다.
Figure 112021068876035-pat00023
인간 질환에 대한 본 결과의 의미는 하기 표 2(실시예 5 참조)에 요약되어 있는 데이터에 의해 명백해진다. EZH2에 대해 이형접합성인 세포는 WT 효소에 의한 H3-K27me1의 효율적 형성, 및 돌연변이체 효소 형태(들)에 의해 상기 전구체 종의 H3-K27me2, 특히 H3-K27me3으로의 효율적인 후속 전이에 기인하여 악성 표현형을 나타낼 것으로 예상된다.
H3-K27me1 형성은 WT-EZH2 촉매 작용에 전적으로 의존하는 것은 아니라는 것이 보고되었다. EZH2 및 또 다른 PRC2 서브유닛인 EED의 녹아웃 연구를 통해 H3-K27me1 형성이 촉매성 서브유닛으로서 EZH2 또는 관련 단백질 EZH1을 함유하는 PRC2 복합체에 의해 촉진될 수 있다는 것이 입증되었다(문헌[Shen, X. et al. (2008) Mol Cell 32:491-502]). 따라서, 돌연변이체 EZH2 종과 WT-EZH2 또는 WT-EZH1 함유의 PRC2 복합체 간의 촉매 결합은 H3-K27me2/3 형성을 증강시키는 데 충분하고, 따라서 수반 악성 표현형을 생성하게 된다. 그러므로, 상기 데이터는 EZH2의 돌연변이형의 발현과 연관된 여포성 림프종(FL) 및 배중심 B 세포(GCB) 서브타입의 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)의 악성 표현형이 H3-K27의 트리메틸화된 형태의 형성에 대한 기능의 전반적 이득의 결과임을 제시한다. 이러한 데이터 해석은 또한 EZH2 또는 PRC2 연관 단백질(예컨대, PHF19/PCL3)의 암 연관 과발현의 존재와 히스톤 H3-K27 탈메틸라제 UTX에 대한 기능 상실 유전자형을 조화시키는 것을 돕는다. UTX 활성에 대한 상실은 EZH2의 기능에 대한 이득과 효소적으로 동등하고, 그 중 임의의 상황에서도 암세포의 트리메틸화된 H3-K27의 보다 큰 정지 상태 수준을 초래한다(도 4).
히스톤 H3-K27의 모노메틸화, 디메틸화 및 트리메틸화 상태는 전사 조절에 있어 상이한 기능과 연관된다. 히스톤 H3-K27 모노메틸화는 전사에 대해 취해진 유전자의 활성 전사와 연관된다. 문헌[Cui et al., (2009) Cell Stem Cell 4:80-93]; [Barski (2007) Cell 129:823-37]. 이와 대조적으로, 히스톤 H3-K27의 트리메틸화는 전사 억제 유전자 또는 히스톤 H3-K4 트리메틸화가 시스로 있을 때 전사에 대해 취해진 유전자와 연관된다(문헌[Cui et al., 상기 문헌 동일]; [Kirmizis et al., (2007) Genes Dev 18: 1592-1605]; [Bernstein et al., (2006) Cell 125:315-26]). 종합해 보면, EZH2의 Y641 돌연변이를 비롯한, 암에서 보고된 PRC2 복합체 활성의 변경이 암에서 히스톤 H3-K27의 트리메틸화된 상태의 증가를 초래하고, 이에 따라 전사는 억제될 것으로 예측된다.
본 발명의 또 다른 발견은, 서열 번호 6으로 정의된, 기질 포켓 도메인 중 돌연변이를 포함하는 EZH2 돌연변이체를 발현하는 세포가 일반적으로 야생형(WT) EZH2를 발현하는 세포보다 소분자 EZH2 억제제에 대해 더 큰 감수성을 보인다는 점이다. 구체적으로, Y641 돌연변이체 EZH2를 발현하는 세포는 EZH2 억제제의 처리 후에 성장, 분할 또는 증식의 감소를 나타내거나, 심지어 아폽토시스 또는 괴사를 겪는다. 이와 대조적으로, WT EZH2를 발현하는 세포는 EZH2 억제제의 항증식성 효과에 대해 반응성이지 않다(도 13 및 14). 특히, 서열 번호 1의 아미노산 위치 677에 치환 돌연변이를 발현하는 세포는 다른 EZH2 돌연변이체를 발현하는 세포보다 EZH2 억제제에 대하여 더욱 큰 감수성을 보였다(실시예 19).
EZH2 및 다른 단백질 메틸트랜스퍼라제가 약물 발견을 위해 관심의 대상이 되는 표적이 되는 것으로 제안되었다(문헌[Copeland et al., (2009) Nat Rev Drug Discov 8:724-32]; [Copeland et al., (2010) Curr Opin Chem Biol 14(4):505-10]; [Pollock et al., (2010) Drug Discovery Today: Therapeutic Strategies 6(1):71-9]). 본 데이터는 또한 FL 및 GCB 림프종에 대해 특이적인 약물의 개발을 위한 실험적 방법을 제시한다. WT 및 질환 연관 돌연변이체 간의 기질 인식의 차이가 전이 상태 상호작용으로부터 비롯될 경우, WT 효소의 전이 상태보다는 돌연변이체 EZH2의 전이 상태를 선택적으로 모방하는 소분자 억제제가 돌연변이 포함 세포에서의 H3-K27 메틸화를 차단하는 데 효과적인 것으로 입증될 것이다. 표적 매개 독성이 WT 효소만을 포함하는 임의의 세포에 대해 최소가 되므로, 상기 유형의 억제제는 대형 치료 색인을 표시하는 것으로 기대될 것이다. 전이 상태 모방은 많은 질환 영역들에서 약물 설계를 위한 효과적인 방법임이 입증되었다. 예를 들어, 문헌[Copeland, R. A. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism and Data Analysis. 2nd ed, (Wiley, 2000)]를 참조할 수 있다.
본 결과는 여포성 림프종 및 미만성 거대 B 세포 림프종에서의 병인에 대한 EZH2의 특정 돌연변이형과 H3-K27 모노메틸화를 수행하는 효소들 간의 효소 결합에 대한, 과거 인식되지 못한 놀라운 의존성을 나타낸다. 어떠한 이론에도 국한시키고자 함은 아니나, 데이터는 정상(WT) 및 질환 연관 돌연변이체(예컨대, Y641) 효소 간의 촉매 활성의 상기와 같은 결합에 의존하는 인간 질환의 첫 번째 예를 구성하는 것으로 판단된다.
본 발명의 한 측면은 서열 번호 6으로 정의된, 기질 포켓 도메인 중 돌연변이를 포함하는 EZH2 돌연변이체를 발현하는 피험체에게 치료학상 유효량의 EZH2 억제제를 투여함으로써 피험체에서 암 또는 전암성 병증의 증상을 치료하거나, 또는 완화시키는 방법이다.
본 발명의 한 측면은 피험체에서의 H3-K27의 트리메틸화된 H3-K27로의 전환을 억제하는 방법이다. 상기 억제는 비메틸화된 H3-K27의 모노메틸화된 H3-K27로의 전환, 모노메틸화된 H3-K27의 디메틸화된 H3-K27로의 전환, 디메틸화된 H3-K27의 트리메틸화된 H3-K27로의 전환, 또는 그의 임의의 조합, 예를 들어, 모노메틸화된 H3-K27의 디메틸화된 H3-K27로의 전환 및 디메틸화된 H3-K27의 트리메틸화된 H3-K27로의 전환을 수반할 수 있다. 본원에 사용되는 비메틸화된 H3-K27이란, 리신 27의 아미노기에 공유결합된 메틸기가 없는 히스톤 H3을 지칭한다. 본원에 사용되는 모노메틸화된 H3-K27이란, 리신 27의 아미노기에 공유 결합된 단일 메틸기가 있는 히스톤 H3을 지칭한다. 모노메틸화된 H3-K27란 또한 본원에서 H3-K27me1로도 지칭된다. 본원에 사용되는 디메틸화된 H3-K27란 리신 27의 아미노기에 공유 결합된 2개의 메틸기가 있는 히스톤 H3을 지칭한다. 디메틸화된 H3-K27은 또한 본원에서 H3-K27me2로도 지칭된다. 본원에 사용되는 트리메틸화된 H3-K27란, 리신 27의 아미노기에 공유 결합된 3개의 메틸기가 있는 히스톤 H3을 지칭한다. 트리메틸화된 H3-K27은 또한 본원에서 H3-K27me3으로도 지칭된다.
히스톤 H3은 서열이 알려진 136개 아미노산 길이의 단백질이다. 예를 들어, 내용이 본원에 참조로 인용되는 진뱅크 수탁 번호 CAB02546을 참조한다. 본원에 또한 개시되어진 바와 같이, 전장의 히스톤 H3에 부가하여, 전장의 히스톤 H3의 K27에 상응하는 리신 잔기를 포함하는 히스톤 H3의 펩티드 단편은 H3-K27m1의 H3-K27m2로의 전환 및 H3-K27m2의 H3-K27m3로의 전환을 평가하기 위해 EZH2(및 마찬기지로 EZH2의 돌연변이체 형태)용 기질로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 그러한 펩티드 단편은 히스톤 H3의 아미노산 잔기 21-44에 상응한다. 그러한 펩티드 단편은 하기 아미노산 서열을 갖는다: LATKAARKSAPATGGVKKPHRYRP(서열 번호 19).
본 발명의 방법은 돌연변이체 EZH2를 발현하는 피험체에게 치료학상 유효량의 EZH2의 억제제를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 억제제는 피험체에서 EZH2의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 억제시킴으로써 H3-K27의 트리메틸화된 H3-K27로의 전환을 억제시키고, 이로써, 피험체에서 비정상적인 히스톤 메틸화 수준과 관련된 암 또는 장애의 증상을 치료하거나, 또는 완화시킨다.
본 발명의 돌연변이체 EZH2를 발현하는 피험체란 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드를 검출가능한 양으로 포함하고 있는 피험체를 의미한다. 바람직하게, 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드는 서열 번호 6으로 정의된, 그의 기질 포켓 도메인 중 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예시적인 돌연변이는 서열 번호 1의 아미노산 위치 677, 687, 674, 685, 또는 641에 치환을 포함하고, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 서열 번호 1의 아미노산 위치 677에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 글리신(G)으로의 치환(A677G); 서열 번호 1의 아미노산 위치 687에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 발린(V)으로의 치환(A687V); 서열 번호 1의 아미노산 위치 674에서 야생형 잔기 발린(V)의 메티오닌(M)으로의 치환(V674M); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 히스티딘(H)으로의 치환(R685H); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 시스테인(C)으로의 치환(R685C); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 페닐알라닌(F)으로의 치환(Y641F); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 히스티딘(H)으로의 치환(Y641H); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 아스파라긴(N)으로의 치환(Y641N); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 세린(S)으로의 치환(Y641S); 또는 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 시스테인(C)으로의 치환(Y641C)을 포함한다. 더욱 바람직하게, 피험체는 서열 번호 1의 아미노산 위치 677에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 글리신(G)으로의 치환(A677G); 서열 번호 1의 아미노산 위치 687에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 발린(V)으로의 치환(A687V); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 히스티딘(H)으로의 치환(R685H); 또는 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 시스테인(C)으로의 치환(R685C)을 포함하는 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드를 검출가능한 양으로 포함한다.
별법으로, 본 발명의 돌연변이체 EZH2를 발현하는 피험체는 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 검출가능한 양으로 포함하는 피험체를 의미한다. 바람직하게, 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 6으로 정의된, 그의 기질 포켓 도메인 중 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예시적인 돌연변이는 서열 번호 1의 아미노산 위치 677, 687, 674, 685, 또는 641에 치환을 포함하고, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 서열 번호 1의 아미노산 위치 677에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 글리신(G)으로의 치환(A677G); 서열 번호 1의 아미노산 위치 687에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 발린(V)으로의 치환(A687V); 서열 번호 1의 아미노산 위치 674에서 야생형 잔기 발린(V)의 메티오닌(M)으로의 치환(V674M); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 히스티딘(H)으로의 치환(R685H); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 시스테인(C)으로의 치환(R685C); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 페닐알라닌(F)으로의 치환(Y641F); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 히스티딘(H)으로의 치환(Y641H); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 아스파라긴(N)으로의 치환(Y641N); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 세린(S)으로의 치환(Y641S); 또는 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 시스테인(C)으로의 치환(Y641C)을 포함한다. 더욱 바람직하게, 피험체는 서열 번호 1의 아미노산 위치 677에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 글리신(G)으로의 치환(A677G); 서열 번호 1의 아미노산 위치 687에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 발린(V)으로의 치환(A687V); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 히스티딘(H)으로의 치환(R685H); 또는 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 시스테인(C)으로의 치환(R685C)을 포함하는 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 검출가능한 양으로 포함한다.
EZH2 돌연변이체 검출
돌연변이체 EZH2 폴리펩티드는 임의의 적합한 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드는 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드, 또는 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드의 특징이 되는 펩티드 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 검출될 수 있다. 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드의 특징이 되는 펩티드 단편은 예를 들어, 서열 번호 6으로 정의된 기질 포켓 도메인 중의 하나 이상의 잔기가 야생형 잔기 이외의 아미노산 잔기로 치환된 것을 제외한, 서열 번호 7에 제공된 바와 같은 SET 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드의 특징이 되는 펩티드 단편은 예를 들어, 서열 번호 6으로 정의된 기질 포켓 도메인 중의 하나 이상의 잔기가 야생형 잔기 이외의 아미노산 잔기로 치환된 것을 제외한, 서열 번호 7에 제공된 바와 같은 SET 도메인의 10-113개의 아미노산 단편을 포함할 수 있되, 단, 상기 단편은 EZH2의 돌연변이에 상응하는 아미노산 잔기를 포함한다. 항체는, 그것이 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드 또는 그의 펩티드 단편에는 결합하나 상응하는 야생형 EZH2 폴리펩티드 또는 그의 펩티드 단편에는 결합하지 않을 경우, 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드 또는 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드에 특징적인 펩티드 단편에 특이적으로 결합하는 것으로 간주된다. 한 실시양태에서, 그러한 항체는, 그것이 상응하는 야생형 EZH2 폴리펩티드 또는 그의 펩티드 단편에 대해서보다 약 100배 이상 더 큰 친화도로 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드 또는 그의 펩티드 단편에 결합하는 경우, 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드 또는 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드에 특징적인 펩티드 단편에 특이적으로 결합하는 것으로 간주된다. 한 실시양태에서, 그러한 항체는, 그것이 상응하는 야생형 EZH2 폴리펩티드 또는 그의 펩티드 단편에 대해서보다 약 1,000배 이상 더 큰 친화도로 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드 또는 그의 펩티드 단편에 결합하는 경우, 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드 또는 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드에 특징적인 펩티드 단편에 특이적으로 결합하는 것으로 간주된다. 항체는, 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay) 또는 웨스턴 블롯 검정에 사용될 수 있다. 항체는 모노클로날, 폴리클로날, 키메라, 또는 항체 단편일 수 있다. 반응 생성물을 검출하는 단계는 임의의 적합한 면역검정법을 이용함으로써 수행될 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 모노클론 항체이다. 모노클론 항체는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Koehler and Milstein (1975) Nature 256 (5517):495-7]을 참조할 수 있다.
또 다른 예로서, 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드는 질량 분석법(MS: mass spectrometry), 예를 들어, 비행시간 결합 전기분무 이온화(ESITOF: electrospray ionization coupled with time-of-flight) 또는 비행시간 결합 기질 지원 탈착/이온화(MALDI-TOF: matrix-assisted laser desorption/ionization coupled with time-of-flight)를 이용하여 검출될 수 있다. 그러한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상기 분석은 관심 돌연변이, 예를 들어, 야생형 EZH2 내의 돌연변이에 상응하는 아미노산에 걸친 서열을 포함하는 펩티드 12 내지 24개 아미노산 길이의 관심 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 펩티드 단편을 확인하는 것을 포함할 것이다.
돌연변이체 EZH2 폴리펩티드 또는 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드의 특징이 되는 펩티드 단편을 코딩하는 핵산 서열은 임의의 적합한 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 당업계에 주지된 방법에 따라 적당히 선택된 DNA 공급원 및 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction) 프라이머를 이용하여 전체 게놈 재서열분석 또는 표적 영역 재서열분석(후자는 또한 표적 재서열분석으로도 알려져 있음)을 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Bentley (2006) Curr Opin Genet Dev. 16:545-52], 및 [Li et al., (2009) Genome Res 19: 1124-32]를 참조할 수 있다. 상기 방법은 통상 또한 일반적으로 게놈 DNA 정제, 관심 영역을 증복시키기 위한 PCR 증폭, 사이클 서열분석, 서열분석 반응 세정, 모세관 전기영동 및 데이터 분석의 단계를 수반한다. 관심 영역을 커버하기 위한 고품질의 PCR 프라이머는 인실리코 프라이머 디자인 도구를 이용하여 디자인된다. 사이클 서열분석은 열 사이클러에서 연속 수행되는 불활성화, 어닐링 및 연장이 연장 생성물의 선형 증폭을 초래하는 간단한 방법이다. 그 생성물은 통상 G, A, T, 또는 C와 같은 말단 뉴클레오티드 염기를 확인하는 형광 태그로 말단 지정된다. 모세관 전기영동 주입을 위해 경쟁할 수 있는 염 및 도입되지 않은 염료 종결인자는 세정에 의해 제거된다. 모세관 전기영동 중에는, 사이클 서열분석 반응의 생성물이 중합체로 충전된 모세관을 통해 이동한다. 음하전 DNA 단편은 양의 전극을 향해 모세관을 통과하여 이동할 때 크기에 의해 분리된다. 전기영동 후, 데이터 수집 소프트웨어는 원 데이터의 샘플 파일을 생성시킨다. 또한, 하류 소프트웨어 애플리케이션을 이용하여, 추가 데이터 분석을 수행하여, 수집된 색상 데이터 영상을 상응하는 뉴클레오티드 염기로 전환한다. 별법으로 또는 추가로, 상기 방법은 마이크로어레이 기재의 표적 영역 게놈 DNA 캡쳐 및/또는 서열분석의 사용을 포함할 수 있다. 적절한 PCR 프라이머를 선택하여 재서열분석을 수행하기 위한 키트, 시약 및 방법은, 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 애질런트(Agilent) 및 님블젠(NimbleGen)(로슈 다이아그노스틱 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH))으로부터 상업적으로 이용가능하다. 이들과 같은 방법을 사용하여, JAK2 및 골수증식성 백혈병 유전자(MPL: myeloproliferative leukemia gene) 돌연변이를 검출하고 진성적혈구증가증, 본태성 혈소판 증가증, 및 특발성 골수 섬유증을 진단하였다. 본 발명에서의 용도를 위해, 예를 들어, 서열 번호 8(상기)의 적어도 한 관련 부분을 증폭시키기 위해 PCR 프라이머를 선택할 수 있다.
별법으로 또는 추가로, 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 당업계에 주지된 방법에 따라 써던 블롯을 이용하여 검출될 수 있다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 고도로 엄격한 조건하에 수행되는 핵산 하이브리드화를 이용하여 검출된다. 핵산 프로브는, 그 서열이 야생형 EZH2의 돌연변이에 상응하는 돌연변이체 아미노산에 대한 코돈을 포함하는 표적 핵산 서열에 상보적이도록 선택된다. 상기 돌연변이는 임의의 EZH2 돌연변이, 바람직하게, 서열 번호 6으로 정의된, 기질 포켓 도메인 중의 EZH2의 하나 이상의 돌연변이, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 서열 번호 1의 아미노산 위치 677에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 글리신(G)으로의 치환(A677G); 서열 번호 1의 아미노산 위치 687에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 발린(V)으로의 치환(A687V); 서열 번호 1의 아미노산 위치 674에서 야생형 잔기 발린(V)의 메티오닌(M)으로의 치환(V674M); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 히스티딘(H)으로의 치환(R685H); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 시스테인(C)으로의 치환(R685C); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 페닐알라닌(F)으로의 치환(Y641F); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 히스티딘(H)으로의 치환(Y641H); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 아스파라긴(N)으로의 치환(Y641N); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 세린(S)으로의 치환(Y641S); 또는 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 시스테인(C)으로의 치환(Y641C)을 포함한다.
서열 특이적 프로브는 고도로 엄격한 조건하에 시험하고자 하는 시료와 조합된다. 본원에 사용되는 바, "고도로 엄격한 조건"이라는 용어는 당업계에 자명한 매개변수를 지칭한다. 핵산 하이브리드화 매개변수는 상기 방법들이 편집되어 있는 참고 문헌, 예를 들어, 문헌[J. Sambrook, et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 또는 문헌[F. M. Ausubel, et al, eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York]에서 찾아볼 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 사용되는 고도로 엄격한 조건이란 예를 들어, 하이브리드화 완충제(3.5xSSC, 0.02% 피콜(Ficoll), 0.02% 폴리비닐 피롤리돈, 0.02% 우혈청 알부민(BSA: bovine serum albumin), 2.5 mM NaH2P04(pH 7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA) 중에서 65℃에서 하이브리드화하는 것을 지칭한다. SSC는 0.15 M 염화나트륨/0.015 M 시트르산나트륨(pH 7)이고; SDS는 황산도데실나트륨이며; EDTA는 에틸렌디아민테트라세트산이다. 하이브리드화 후, DNA가 전달되는 막은, 예를 들어, 실온에서 2xSSC로 세정한 후, 실온 내지 68℃에서 0.1 내지 0.5xSSC/0.1xSDS로 세정된다.
유사한 엄격도를 초래하는, 사용가능한 다른 조건, 시약 등이 있다. 그러한 조건은 당업자에게 자명할 것이며, 따라서 본원에 제시되지 않는다. 그러나, 특히 당업자라면 (예컨대, 보다 덜 엄격한 조건을 이용함으로써) EZH2의 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는, 본 발명의 EZH2 연관 핵산을 명료히 확인하도록 하는 방식으로 상기 조건을 조작할 수 있음이 이해될 것이다. 또한 당업자에게 상기 분자의 발현을 위한 세포 및 라이브러리를 스크리닝하는 방법으로서, 그 분자를 그 후 통상적 방식으로 단리한 후, 관련 핵산 분자를 단리하고 서열분석하는 방법이 자명할 것이다.
피험체에게 치료학상 유효량의 EZH2의 억제제를 투여한다. 본원에 사용되는 EZH2의 억제제란 일반적으로 EZH2의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 효소 활성을 간섭할 수 있는 소분자, 즉, 분자량이 약 1.5 킬로달톤(kDa) 미만인 분자를 지칭한다.
한 실시양태에서, EZH2의 억제제는 야생형 EZH2의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 억제한다. 한 실시양태에서, EZH2의 억제제는 돌연변이체 EZH2의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 억제한다. 한 실시양태에서, EZH2의 억제제는 야생형 EZH2의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성 및 돌연변이체 EZH2의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 억제한다. 한 실시양태에서, EZH2의 억제제는 돌연변이체 EZH2의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 선택적으로 억제한다.
본원에 개시된, EZH2의 특정 돌연변이체(예컨대, Y641)는 비메틸화된 H3-K27의 H3-K27me1로의 전환을 위한 촉매로서는 비교적 좋지 않으나, H3-K27me2의 H3-K27me3으로의 전환을 위한 촉매로서는 놀랍게도 효과적이다. EZH2의 특정 돌연변이체(예컨대, A687)는 모노메틸 H3-K27 기질을 선호한다. 그에 반해, EZH2의 특정 돌연변이체(예컨대, A677)는 비메틸화된, 모노메틸화된 및 디메틸화된 H3-K27 사이에 동일한 선호도를 보인다. 이와 반대로, 야생형 EZH2는 비메틸화된 H3-K27의 H3-K27me1로의 전환을 위한 촉매로서는 비교적 효과적이나, H3-K27me2의 H3-K27me3로의 전환을 위한 촉매로서는 놀랍게도 비효과적이다. 이는 H3-K27의 모노메틸화, 디메틸화 및 트리메틸화 상태가 전사 조절에 있어 다른 기능을 나타내기 때문에 중요하다. 예를 들어, H3-K27me1은 전사를 위해 취해진 유전자의 활성 전사와 연관된 반면, H3-K27me3은 전사 억제 유전자 또는 H3-K4 트리메틸화가 시스일 때 전사에 취해지는 유전자이다. 따라서, EZH2의 돌연변이체의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성의 선택적 억제는 H3-K27의 다르게 메틸화된 형태 생성에 대한 선택적 억제에 영향을 줄 수 있고, 이로써, H3-K27 메틸화 수준과 관련된 전사는 변형된다.
EZH2의 억제제는, 그것이 야생형 EZH2의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 억제하는 것보다 더 효과적으로 돌연변이체 EZH2의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 억제할 때, 돌연변이체 EZH2의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 "선택적으로 억제한다". 예를 들어, 한 실시양태에서, 선택적 억제제는 야생형 EZH2에 대한 IC50보다 40% 이상 더 낮은 돌연변이체 EZH2에 대한 IC50을 가진다. 한 실시양태에서, 선택적 억제제는 야생형 EZH2에 대한 IC50보다 50% 이상 더 낮은 돌연변이체 EZH2에 대한 IC50을 가진다. 한 실시양태에서, 선택적 억제제는 야생형 EZH2에 대한 IC50보다 60% 이상 더 낮은 돌연변이체 EZH2에 대한 IC50을 가진다. 한 실시양태에서, 선택적 억제제는 야생형 EZH2에 대한 IC50보다 70% 이상 더 낮은 돌연변이체 EZH2에 대한 IC50을 가진다. 한 실시양태에서, 선택적 억제제는 야생형 EZH2에 대한 IC50보다 80% 이상 더 낮은 돌연변이체 EZH2에 대한 IC50을 가진다. 야생형 EZH2에 대한 IC50보다 90% 이상 더 낮은 돌연변이체 EZH2에 대한 IC50을 가진다.
한 실시양태에서, 돌연변이체 EZH2의 선택적 억제제는 야생형 EZH2에 대한 억제 효과를 본질적으로 나타내지 않는다.
억제제는 H3-K27me2의 H3-K27me3으로의 전환을 억제한다. 한 실시양태에서, 억제제는 H3-K27의 트리메틸화를 억제한다고 언급된다. H3-K27me1의 H3-K27me2으로의 전환이 H3-K27me2의 H3-K27me3으로의 전환보다 선행되기 때문에, H3-K27me1의 H3-K27me2으로의 전환의 억제제는 또한 H3-K27me2의 H3-K27me3으로의 전환을 자연적으로 억제하는데, 이는 즉, H3-K27의 트리메틸화를 억제한다. 또한, H3-K27me1의 H3-K27me2으로의 전환을 억제하지 않으면서 H3-K27me2의 H3-K27me3으로의 전환을 억제하는 것도 가능하다. 이러한 유형의 억제는 또한 비록 H3-K27의 디메틸화는 억제하지 않으나, H3-K27의 트리메틸화의 억제를 초래할 것이다.
한 실시양태에서, 억제제는 H3-K27me1의 H3-K27me2으로의 전환 및 H3-K27me2의 H3-K27me3으로의 전환을 억제한다. 그러한 억제제는 H3-K27me1의 H3-K27me2으로의 전환만을 직접적으로 억제할 수 있다. 별법으로, 그러한 억제제는 H3-K27me1의 H3-K27me2으로의 전환 및 H3-K27me2의 H3-K27me3으로의 전환 모두를 직접적으로 억제할 수 있다.
상기 억제제는 히스톤 메틸라제 활성을 억제한다. 히스톤 메틸라제 활성의 억제는 임의의 적합한 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 상기 억제는 히스톤 메틸라제 활성 속도의 측면에서 또는 히스톤 메틸라제 활성의 생성물로서 측정될 수 있다. 이러한 판독값 중 임의의 것에 대해 적합한 방법이 하기 실시예에 포함되어 있다.
상기 억제는 적합한 음성 대조군과 대비하여 측정가능한 억제이다. 한 실시양태에서, 억제는 적합한 음성 대조군 대비, 10% 이상의 억제이다. 즉, 억제제를 이용한 효소 활성의 속도 또는 산물의 양은 억제제를 이용하지 않았을 때의 상응하는 속도 또는 양의 90% 이하이다. 각종 다른 실시양태에서, 억제는 적합한 음성 대조군과 대비하여 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 또는 95% 이상의 억제율 %이다. 한 실시양태에서, 억제는 적합한 음성 대조군과 대비하여 99% 이상의 억제이다. 즉, 억제제를 이용한 효소 활성의 속도 또는 산물의 양은 억제제를 이용하지 않았을 때의 상응하는 속도 또는 양의 1% 이하이다.
한 실시양태에서, 억제제는 S-아데노실-L-호모시스테인(SAH)이다. SAH는 하기 구조식:
Figure 112021068876035-pat00024
를 가지며, 이는 예를 들어, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich; 미국 미주리주 세인트루이스)를 비롯한 다수의 공급업체로부터 상업적으로 이용가능하다. SAH는 S-아데노실메티오닌 의존성 메틸트랜스퍼라제에 의한 트랜스메틸화의 억제제로서 기술되었다.
한 실시양태에서, 억제제는 하기 화합물 75, 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:
Figure 112021068876035-pat00025
.
특정 실시양태에서, 본 발명은 피험체 유래의 시료 내의 EZH2의 돌연변이체를 검출하기 위한 검정을 수행하는 단계를 포함한다. 이러한 유형의 검정은 상기 기재되어 있다. 본원에 사용되는 바, "피험체 유래의 시료"은 피험체로부터 수득된 것이거나, 그로부터 유래된 세포 또는 세포 성분을 포함하는 임의의 적합한 시료를 지칭한다. 한 실시양태에서, 시료는 돌연변이체 EZH2를 발현하는 것으로 의심되는 세포, 예를 들어, 암 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 시료는 혈액 시료이다. 한 실시양태에서, 시료는, 예를 들어, 림프 조직(예컨대, 림프절) 또는 골수로부터 수득한 생검 시료이다. 한 실시양태에서, 시료는 림프 조직(예컨대, 림프절) 또는 골수 외의 조직 또는 이들에 부가적인 조직으로부터 수득한 생검 시료이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 시료는 암, 예를 들어, 암 세포로 이루어진 종양으로부터의 생검이다. 시료 내의 세포는 시료의 다른 성분으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell)는 당업계의 숙련가에게 자명한 방법에 따라 원심분리된 혈액 시료로부터 연막(buffy coat)으로서 단리될 수 있다.
피험체 유래의 시료에 대한 검정 결과가 돌연변이체 EZH2가 시료 내에 존재하는 것을 나타낼 때, 상기 피험체는 돌연변이체 EZH2를 발현하는 것으로 언급된다. 실제로, 한 실시양태에서, 피험체 유래의 시료에 대한 검정 결과가 돌연변이체 EZH2가 시료 내에 존재하는 것을 나타낼 때, 상기 피험체는 EZH2의 억제제(여기서, 억제제는 돌연변이체 EZH2의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 선택적으로 억제한다)를 이용한 치료를 위한 후보로서 확인된다.
암으로부터의 시료에 대한 검정 결과가 돌연변이체 EZH2가 암 내에 존재하는 것을 나타낼 때, 상기 암은 돌연변이체 EZH2를 발현하는 것으로 언급된다.
유사하게, 암을 앓는 피험체 유래의 암 세포를 포함하는 시료에 대한 검정 결과가 돌연변이체 EZH2가 암 내에 존재하는 것을 나타낼 때, 상기 피험체는 돌연변이체 EZH2를 발현하는 것으로 언급된다.
디메틸화된 H3-K27 또는 트리메틸화된 H3-K27의 검출은 당업계의 임의의 적합한 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 메틸화 수준은 디메틸화된 H3-K27 또는 트리메틸화된 H3-K27에 대해 특이적인 항체를 이용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 단리된 조직은 장기 보존을 위해 포르말린으로 고정하고 파라핀 블록에 포매한다. 블록은 메틸화된 H3-K27에 대한 항체를 이용한 형광 염색 또는 면역조직화학 염색을 위한 슬라이드 제작에 사용될 수 있다. 별법으로, 전 세포 용해물 또는 히스톤 추출물은 단리된 조직 시료로부터 제조된 후, 면역조직화학 염색, 웨스턴 블롯 분석 또는 형광 염색을 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 메틸화 수준은 디메틸화된 H3-K27 또는 트리메틸화된 H3-K27에 대해 특이적인 폴리펩티드 또는 압타머를 이용하여 검출된다. 또 다른 실시양태에서, 메틸화 수준은 질량분석법(MS)을 이용하여 검출된다.
대조군 디메틸화된 H3-K27 또는 대조군 트리메틸화된 H3-K27은 대조군 시료, 예를 들어, 피험체로부터 단리된 인접 비종양 조직 또는 건강한 피험체 유래의 건강한 조직으로부터 확립될 수 있다. 별법으로, H3-K27me2 또는 H3-K27me3의 대조군 메틸화 수준은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 병리학자에 의해 확립될 수 있다.
스크리닝 방법
본 발명의 한 측면은 시험 화합물을 돌연변이체 EZH2의 억제제로서 확인하는 방법이다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 단리된 돌연변이체 EZH2를 히스톤 기질, 메틸기 도너(예컨대, S-아데노실 메티오닌(SAM)), 및 시험 화합물과 조합하는 단계(여기서, 히스톤 기질은 비메틸화된 H3-K27, 모노메틸화된 H3-K27, 디메틸화된 H3-K27, 및 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 H3-K27의 한 형태를 포함한다); 및 히스톤 기질 내 H3-K27의 메틸화를 검출하기 위한 검정을 수행함으로써, 화합물의 존재 하에서의 H3-K27의 메틸화가 시험 화합물의 부재하에서의 H3-K27의 메틸화보다 적을 때, 시험 화합물을 돌연변이체 EZH2의 억제제로서 확인하는 단계를 포함한다. H3-K27의 메틸화를 검출하는 검정은 메틸화의 속도, 메틸화의 정도, 또는 메틸화의 속도 및 정도 모두를 측정함으로써 선택될 수 있다.
돌연변이체 EZH2는 PRC2 복합체 또는 그의 기능적 등가물로서 단리된다. 본원에 사용되는 바, "단리된"이라는 용어는 실질적으로 다른 성분들로부터 분리되며 이로써 복합체가 본래 발생하는 그대로 발견될 수 있게 됨을 의미한다. 화합물은 반드시 정제될 필요없이 단리될 수 있다. 한 실시양태에서, EZH2의 돌연변이체는 돌연변이체 EZH2와 EED 및 SUZ12와의 복합체로서 단리된다. 또 다른 실시양태에서, EZH2의 돌연변이체는 돌연변이체 EZH2와 EED, SUZ12, 및 RbAp48의 복합체로서 단리된다. 적절한 조건하에서, PRC2 복합체 또는 그의 기능적 등가물은 H3-K27에 대해 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 나타낸다. 한 실시양태에서, 복합체는 재조합 발현 성분인 폴리펩티드, 예를 들어, EZH2, EED, SUZ12로 이루어지고, 이때 RbAp48은 존재하거나 부재한다.
단리된 돌연변이체 EZH2는 히스톤 기질과 조합된다. 히스톤 기질은 EZH2에 대한 기질로서 작용할 수 있는 임의의 적합한 공급원의 히스톤 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 히스톤 기질은 피험체로부터 단리된 히스톤을 포함한다. 히스톤은 임의의 적합한 방법을 이용하여 피험체의 세포로부터 단리될 수 있고; 그러한 방법은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있어 본원에 다시 명시될 필요가 없다. 예를 들어, 문헌[Fang et al., (2004) Methods Enzymol 377:213-26]을 참조한다. 이하 실시예에 따라, 한 실시양태에서, 히스톤 기질은 뉴클레오좀으로서 제공된다. 이하 실시예에 따라, 한 실시양태에서, 히스톤 기질은 조류(닭) 적혈구 뉴클레오좀으로서 제공된다.
이와 같이 제공된 히스톤 기질은 H3-K27 메틸화 상태에 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅함으로 판단할 때, H3-K27 메틸화의 각종 상태를 비롯한, 히스톤 변형의 상태의 혼합물을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 히스톤 기질은 정제된 전장의 히스톤 H3으로서 제공될 수 있다. 그러한 정제된 전장의 히스톤 H3은 H3-K27 메틸화의 상태에 대한 균질 제제로서, 또는 H3-K27 메틸화의 각종 상태의 혼합물로서 제공될 수 있다. H3-K27 메틸화의 상태에 대한 단리된 히스톤 H3의 균질 제제는 부분적으로, 적합한 H3-K27 메틸화 상태에 특이적인 항체가 적재된 면역친화성 칼럼에 통과시킴으로써, 또는 적합한 H3-K27 메틸화 상태에 대해 특이적인 항체로 코팅된 자기 비드를 이용한 면역침전에 의해 제조될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, H3-K27의 메틸화 상태는 검정을 수행하는 부분인 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 출발 물질 히스톤 기질은 50% 비메틸화된 H3-K27, 40% 모노메틸화된 H3-K27, 10% 디메틸화된 H3-K27, 및 0% 트리메틸화된 H3-K27을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
한 실시양태에서, 히스톤 기질은, 특히 H3-K27을 포함한 서열을 비롯한, 히스톤 H3과 관련된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 라이브러리 또는 적합한 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 히스톤 기질은 히스톤 H3의 아미노산 잔기 21-44에 상응하는 펩티드 단편이다. 그러한 펩티드 단편은 아미노산 서열 LATKAARKSAPATGGVKKPHRYRP(서열 번호 19)를 가진다. 펩티드 라이브러리 또는 펩티드는 당업계에 공지된 기법에 따른 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있고, H3-K27에 상응하는 리신의 메틸화를 임의의 원하는 정도로 도입하도록 임의적으로 변형될 수 있다. 이하 실시예에 기재된 바와 같이, 그러한 펩티드는 하류 검정을 수행하는 데 유용한 표지, 예컨대, 비오틴을 도입하도록 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, 표지는 펩티드(들)의 아미노(N) 말단에 부착된다. 한 실시양태에서, 표지는 펩티드(들)의 카복시(C) 말단에 부착된다.
H3-K27 메틸화 특이적 항체는, 예를 들어, 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)(미국 메사츄세츠주 덴버스) 및 액티브 모티프(Active Motif)(미국 캘리포니아주 칼스배드)를 비롯한 각종 상업적 공급업체들로부터 입수가능하다.
단리된 돌연변이체 EZH2는 시험 화합물과 조합된다. 본원에 사용되는 바, "시험 화합물"이란 약 1.5 kDa 미만의 분자량을 가지는 유기 소분자를 지칭한다. 한 실시양태에서, 시험 화합물은 공지 화합물이다. 한 실시양태에서, 시험 화합물은 신규 화합물이다. 한 실시양태에서, 시험 화합물은 그러한 화합물의 라이브러리의 일부로서 제공될 수 있고, 여기서 라이브러리는, 예를 들어, 수십개, 수백개, 수천개 또는 더 많은 화합물을 포함한다. 화합물의 라이브러리는 고처리량 검정으로, 예를 들어, 당업계에 공지된 일반 기법에 따라 시험 화합물의 어레이 및 로보트식 조작을 이용하여 유리하게 스크리닝된다.
특정 실시양태에서, 시험 화합물은 SAH의 유도체 또는 화합물 75의 유도체인 화합물이다.
H3-K27의 메틸화의 검출은 임의의 적합한 방법을 이용하여 확립될 수 있다. 한 실시양태에서, 도너 메틸기의 출처는 검출가능한 표지로 표지된 메틸기를 포함한다. 한 실시양태에서, 검출가능한 표지는 동위원소 표지, 예를 들어, 삼중수소이다. 다른 유형의 표지는, 예를 들어, 형광 표지를 포함할 수 있다.
트리메틸화된 H3-K27의 형성의 검출은 임의의 적합한 방법을 이용하여 확립될 수 있다. 예를 들어, 트리메틸화된 H3-K27의 형성의 검출은, 크기, 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis), 모세관 전기영동(CE: capillary electrophoresis), 또는 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 표지된 생성물을 분리하기 위한 크로마토그래피법 또는 다른 방법과 임의적으로 조합된, 표지된 메틸기, 예컨대, 상기 기재된 것과 같은 표지된 메틸기의 도입을 검출하기 위한 검정을 이용하여 확립될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 트리메틸화된 H3-K27의 형성의 검출은 트리메틸화된 H3-K27에 대해 특이적인 항체를 이용하여 확립될 수 있다.
모노메틸화된 H3-K27의 디메틸화된 H3-K27로의 전환의 검출은 임의의 적합한 방법을 이용하여 확립될 수 있다. 한 실시양태에서, 전환은 모노메틸화된 H3-K27 및 디메틸화된 H3-K27에 대해 특이적인 항체를 이용하여 측정된다. 예를 들어, 모노메틸화된 H3-K27 및 디메틸화된 H3-K27의 출발 양 또는 농도는 모노메틸화된 H3-K27 및 디메틸화된 H3-K27에 대해 특이적인 적절한 항체를 이용하여 측정될 수 있다. 효소, 기질, 메틸기 도너, 및 시험 화합물의 조합에 따라, 모노메틸화된 H3-K27 및 디메틸화된 H3-K27의 결과적 양 또는 농도가 이어서 모노메틸화된 H3-K27 및 디메틸화된 H3-K27에 대해 특이적인 적절한 항체를 이용하여 측정될 수 있다. 이어서, 모노메틸화된 H3-K27 및 디메틸화된 H3-K27의 초기 및 결과적 양 또는 농도를 비교할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 모노메틸화된 H3-K27 및 디메틸화된 H3-K27의 초기 및 결과적 양 또는 농도를 이어서 음성 대조군으로부터의 상응하는 양 또는 농도와 비교할 수 있다. 시험 물질이 검정에 포함되지 않은 음성 대조군 반응은 병행 조절 또는 사적(historical) 조절로 수행될 수 있다. 그러한 조절 반응의 결과는 임의적으로 상기 비교를 수행하기 전 또는 그와 함께 실험 반응의 상응하는 결과로부터 차감될 수 있다.
H3-K27의 디메틸화된 형태는 또한 동일 검정으로 메틸화될 수 있기 때문에, 모노메틸화된 H3-K27의 양 또는 농도의 감소는 디메틸화된 H3-K27의 증가에 직접적으로 상응하는 것으로 보이지 않을 수 있다. 그러나, 이 예에서, 모노메틸화된 H3-K27의 양 또는 농도의 감소는 그것만으로 모노메틸화된 H3-K27의 디메틸화된 H3-K27로의 전환을 반영하는 것으로 추정될 수 있다.
디메틸화된 H3-K27의 트리메틸화된 H3-K27로의 전환의 검출은 임의의 적합한 방법을 이용하여 확립될 수 있다. 한 실시양태에서, 디메틸화된 H3-K27 및 트리메틸화된 H3-K27에 대해 특이적인 항체를 이용하여 전환을 측정한다. 예를 들어, 디메틸화된 H3-K27 및 트리메틸화된 H3-K27의 출발 양 또는 농도는 디메틸화된 H3-K27 및 트리메틸화된 H3-K27에 특이적인 적절한 항체를 이용하여 측정될 수 있다. 효소, 기질 및 시험 화합물의 조합에 따라, 디메틸화된 H3-K27 및 트리메틸화된 H3-K27의 결과적 양 또는 농도가 이어서 디메틸화된 H3-K27 및 트리메틸화된 H3-K27에 대해 특이적인 적절한 항체를 이용하여 측정될 수 있다. 이어서, 디메틸화된 H3-K27 및 트리메틸화된 H3-K27의 초기 및 결과적 양 또는 농도를 비교할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 디메틸화된 H3-K27 및 트리메틸화된 H3-K27의 초기 및 결과적 양 또는 농도를 이어서 음성 대조군으로부터의 상응하는 양 또는 농도와 비교할 수 있다. 시험 물질이 검정에 포함되지 않은 음성 대조군 반응은 병행 조절 또는 사적 조절로 수행될 수 있다. 그러한 조절 반응의 결과는 임의적으로 상기 비교를 수행하기 전 또는 그와 함께 실험 반응의 상응하는 결과로부터 차감될 수 있다.
시험 화합물을 이용한 H3-K27의 메틸화가 시험 화합물을 이용하지 않은 H3-K27의 메틸화보다 적을 때, 시험 물질은 돌연변이체 EZH2의 억제제로 확인된다. 한 실시양태에서, 시험 화합물의 존재 하에서의 H3-K27의 트리메틸화가 시험 화합물의 부재하에서의 H3-K27의 트리메틸화보다 적을 때, 시험 물질은 돌연변이체 EZH2의 억제제로 확인된다.
본 발명의 한 측면은 돌연변이체 EZH2의 선택적 억제제를 확인하는 방법이다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 단리된 돌연변이체 EZH2를 히스톤 기질, 메틸기 도너(예컨대, SAM), 및 시험 화합물과 조합하여 시험 혼합물을 형성하는 단계로서, 여기서, 히스톤 기질은 모노메틸화된 H3-K27, 디메틸화된 H3-K27, 및 모노메틸화된 H3-K27 및 디메틸화된 H3-K27의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 H3-K27의 형태를 포함하는 것인 단계; 단리된 야생형 EZH2를 히스톤 기질, 메틸기 도너(예컨대, SAM), 및 시험 화합물과 조합합으로써(여기서, 히스톤 기질은 모노메틸화된 H3-K27, 디메틸화된 H3-K27, 및 모노메틸화된 H3-K27과 디메틸화된 H3-K27의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 H3-K27의 한 형태를 포함함), 대조군 혼합물을 형성하는 단계; 각각의 시험 혼합물 및 대조군 혼합물에서 히스톤 기질의 트리메틸화를 검출하기 위한 검정을 수행하는 단계; (a) 돌연변이체 EZH2 및 시험 화합물을 이용한(M+) 트리메틸화 대 (b) 시험 화합물 없이 돌연변이체 EZH2를 이용한(M-) 트리메틸화의 비를 계산하는 단계; (c) 야생형 EZH2 및 시험 화합물을 이용한(WT+) 트리메틸화 대 (d) 시험 화합물 없이 야생형 EZH2를 이용한(WT-) 트리메틸화의 비를 계산하는 단계; 비 (a)/(b)를 비 (c)/(d)와 비교하는 단계; 및 비 (a)/(b)가 비 (c)/(d)보다 작을 때, 시험 화합물을 돌연변이체 EZH2의 선택적 억제제로서 확인하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 또한 시험 혼합물 및 대조군 혼합물 중 어느 하나 또는 양자 모두에 대해 시험 화합물이 없는 음성 대조군을 고려하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 종전에는 인정받지 못했던, EZH2 억제제에 대한 환자의 반응성에 관한 놀라운 상관관계를 제공한다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 암 또는 전암성 병증을 앓는 피험체에서 EZH2 억제제에 대한 반응성을 결정하는 방법이다. 본 방법은 일반적으로 서열 번호 6으로 정의된, EZH2 기질 포켓 도메인 중 돌연변이를 검출하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이는 상기 기술된 치환, 점 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 결실, 또는 삽입일 수 있다. 바람직한 치환 아미노산 돌연변이는 서열 번호 1의 아미노산 위치 677, 687, 674, 685, 또는 641에 치환을 포함하고, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 서열 번호 1의 아미노산 위치 677에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 글리신(G)으로의 치환(A677G); 서열 번호 1의 아미노산 위치 687에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 발린(V)으로의 치환(A687V); 서열 번호 1의 아미노산 위치 674에서 야생형 잔기 발린(V)의 메티오닌(M)으로의 치환(V674M); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 히스티딘(H)으로의 치환(R685H); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 시스테인(C)으로의 치환(R685C); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 페닐알라닌(F)으로의 치환(Y641F); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 히스티딘(H)으로의 치환(Y641H); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 아스파라긴(N)으로의 치환(Y641N); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 세린(S)으로의 치환(Y641S); 또는 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 시스테인(C)으로의 치환(Y641C)을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 피험체는 암 또는 암성 병증을 앓는다. 예를 들어, 암은 림프종, 백혈병 또는 흑색종이다. 바람직하게, 림프종은 비호지킨 림프종, 여포성 림프종 또는 미만성 거대 B 세포 림프종이다. 별법으로, 백혈병은 만성 골수성 백혈병(CML)이다. 전암성은 골수이형성 증후군(MDS, 이전에는 전백혈병으로 알려져 있었다)이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드 또는 본 발명의 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 6으로 정의된, EZH2 기질 포켓 도메인 중 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드 또는 본 발명의 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 1의 아미노산 위치 677, 687, 674, 685, 또는 641에 치환을 포함하고, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 서열 번호 1의 아미노산 위치 677에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 글리신(G)으로의 치환(A677G); 서열 번호 1의 아미노산 위치 687에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 발린(V)으로의 치환(A687V); 서열 번호 1의 아미노산 위치 674에서 야생형 잔기 발린(V)의 메티오닌(M)으로의 치환(V674M); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 히스티딘(H)으로의 치환(R685H); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 시스테인(C)으로의 치환(R685C); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 페닐알라닌(F)으로의 치환(Y641F); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 히스티딘(H)으로의 치환(Y641H); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 아스파라긴(N)으로의 치환(Y641N); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 세린(S)으로의 치환(Y641S); 또는 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 시스테인(C)으로의 치환(Y641C)을 포함한다.
제약 조성물
하나 이상의 EZH2 길항제는 본원에 기술된 바와 같은 질환 또는 병증을 치료 또는 호전시키는 용량으로 인간 환자에게 단독 투여되거나, 적합한 담체 또는 부형제(들)와 혼합된 제약 조성물로서 투여된다. 이들 EZH2 길항제의 혼합물은 또한 단순 혼합물로서 또는 적합하게 제제화된 제약 조성물로서 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 측면은 치료학상 유효량의 EZH2 길항제 또는 그의 제약상 허용되는 염, 수화물, 거울이성질체 또는 입체이성질체; 및 제약상 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
EZH2 길항제의 제제 및 투여 기법은 당업계의 숙련가에게 공지된 참조문헌, 예컨대, 문헌[Remington's "The Science and Practice of Pharmacy," 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins 2005]에서 찾아볼 수 있다.
적합한 투여 경로는, 예를 들어, 경구, 직장 또는 장내 투여; 비경구 전달, 예컨대, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하 또는 골수내 주사, 및 척추강내, 직접적 심실내, 또는 안내 주사; 국소 전달, 예컨대, 점안제 및 경피제; 및 비내 및 다른 경점막 전달을 포함할 수 있다.
별법으로, 예를 들어, 부종 부위에 EZH2 길항제를 직접, 종종 데포 또는 지속 방출형 제제의 형태로 주사함으로써, 전신 방식이 아닌 국소 방식으로 EZH2 길항제를 투여할 수 있다.
한 실시양태에서, EZH2 길항제는 종양 또는 림프절 내로 직접적 주사에 의해 투여된다.
또한, 표적 약물 전달 시스템, 예를 들어, 암 세포 특이적 항체로 코팅된 리포좀으로 EZH2 길항제를 투여할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은, 예를 들어, 통상적 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 분쇄, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결 건조 공정에 의해 제조될 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따라 사용하기 위한 제약 조성물은 제약상 사용될 수 있는 제제 내로 활성 EZH2 길항제를 가공하는 것을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체를 이용하여 통상적 방식으로 제제화될 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여 경로에 따라 달라진다.
주사를 위해, 본 발명의 작용제는 수용액, 바람직하게는 생리학적 적합성 완충제, 예컨대, 행크스액(Hanks' solution), 링거액(Ringer's solution), 또는 생리식염수 완충제 내에 제제화될 수 있다. 경점막 투여를 위해, 투과제가 투과될 배리어에 적합한 제제로 제제화될 수 있다. 그러한 투과제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.
경구 투여를 위해, EZH2 길항제는 활성 EZH2 길항제를 당업계에 공지된 제약상 허용되는 담체와 조합함으로써 용이하게 제제화될 수 있다. 그러한 담체는 본 발명의 EZH2 길항제가 치료받는 환자에 의해 경구 섭취되도록 하기 위해, 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리, 현탁제 등으로 제제화될 수 있도록 한다. 경구용 제약 제제는 활성 EZH2 길항제를 고체 부형제와 조합하고, 임의적으로는 수득된 혼합물을 분쇄하며, 및 필요한 경우 적합한 보조제를 첨가한 후에 과립 혼합물을 처리하여 정제 또는 당의정 코어를 얻음으로써 수득할 수 있다. 적합한 부형제는 충전제, 예컨대, 당, 예를 들어, 락토스, 수크로스, 만닛톨 또는 소르비톨와 같은 충전제; 셀룰로스 제제, 예를 들어, 옥수수 전분, 밀가루, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가간트 검, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함한다. 필요에 따라, 붕해제, 예컨대, 가교 폴리비닐 피롤리돈, 아가 또는 알긴산 또는 그의 염, 예컨대, 알긴산나트륨을 첨가할 수 있다.
당의정 코어에 적합한 코팅이 제공될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 농축 아가 용액이 사용될 수 있고, 이는 임의적으로 아라비아검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄, 락커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 염료 또는 안료를 확인하기 위한 정제 또는 당의정 코팅에, 또는 활성 EZH2 길항제 투약의 상이한 조합물에 첨가할 수 있다.
경구 사용될 수 있는 제약 제제는 젤라틴으로 제조된 푸쉬 피트식(push-fit) 캡슐제, 및 젤라틴 및 가소제, 예컨대, 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질의 실링된 캡슐제를 포함한다. 푸쉬 피트식 캡슐제는 락토스와 같은 충전제, 및/또는 탈크 또는 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제, 및 임의적으로 안정화제와 혼합되는 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐제에서, 활성 EZH2 길항제를 적합한 액체, 예컨대, 지방 알콜, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 현탁시킬 수 있다. 또한, 안정화제가 첨가될 수 있다.
협측 투여를 위해, 조성물은 통상적 방식으로 제제화된 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따라 사용하기 위한 EZH2 길항제는 적합한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하면서, 가압 팩 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 스프레이 제공 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정된다. 예를 들어, 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 EZH2 길항제의 분말 믹스 및 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기재를 함유하도록 제제화될 수 있다.
EZH2 길항제는 주사, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제제화될 수 있다. 주사용 제제는 부가된 보존제와 함께, 단위 투약 형태, 예를 들어, 앰플 또는 다중 투약 용기 내에 제공될 수 있다. 상기 조성물은 유성 또는 수성 비히클 내의 현탁제, 액제 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화 물질을 함유할 수 있다.
비경구 투여용 제약 제제는 수용성 형태의 활성 EZH2 길항제의 수용액을 포함한다. 추가로, 활성 EZH2 길항제의 현탁액은 적절한 오일성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 참깨 오일과 같은 지방 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대, 올레산에틸 또는 트리글리세리드, 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의적으로, 현탁액은 또한 고농축 액제로 제조될 수 있도록 하기 위해 EZH2 길항제의 가용성을 증가시키는 작용제 또는 적합한 안정화제도 함유할 수 있다.
별법으로, 활성 성분은 적합한 비히클, 예를 들어, 무균 발열원 무함유 물과 함께 사용하기 전에 재구성을 위한 분말 형태의 것일 수 있다.
EZH2 길항제는 또한 직장용 조성물, 예컨대, 좌제 또는 정체 관장, 예를 들어, 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상적 조약 기재 내에 제제화될 수 있다.
전술된 제제에 부가하여, EZH2 길항제는 또한 데포 제제로서 제제화될 수도 있다. 그러한 장기 작용성 제제는 이식에 의해 (예컨대, 피하 또는 경피 또는 근육내 또는 근육내 주사에 의해) 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, EZH2 길항제는 적합한 중합체 또는 소수성 물질(예컨대, 허용가능한 오일내 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지, 또는 난용성 유도체(예컨대, 난용성 염으로서)와 함께 제제화될 수 있다.
별법으로, 소수성 제약 EZH2 길항제를 위한 다른 전달계가 이용될 수 있다. 리포좀 및 에멀젼은 소수성 약물용 전달 비히클 또는 담체의 예이다. 디메틸술폭시드와 같은 특정 유기 용매도 이용될 수 있다. 또한, EZH2 길항제는 또한 지속 방출계, 예컨대, 치료제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질을 이용하여 전달될 수 있다. 각종 지속 방출 물질이 확립되었고 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 지속 방출 캡슐제는, 그것의 화학 성질에 따라 수주 내지 100일 초과까지의 기간 동안 EZH2 길항제를 방출할 수 있다. 치료제의 화학 구조 및 생물학적 안정성에 따라, 단백질 안정화를 위한 추가적 방법이 이용될 수 있다.
제약 조성물은 또한 적합한 고체 또는 겔 이동 담체 또는 부형제를 포함할 수도 있다. 그러한 담체 또는 부형제의 예에는 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당류, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
치료 방법
본원에서는 히스톤 또는 다른 단백질의 메틸화 상태를 조절함으로써 병증 및 질환의 진행 과정에 영향을 줄 수 있고, 여기서, 상기 메틸화 상태는 적어도 부분적으로는 EZH2의 활성에 의해 매개되는 것인, 병증 및 질환, 예컨대, 암 및 전암성 병증의 증상을 치료, 예방 또는 완화시키는 방법을 제공한다. 히스톤의 메틸화 상태 조절은 결국 메틸화에 의해 활성화되는 표적 유전자, 및/또는 메틸화에 의해 억제되는 표적 유전자의 발현 수준에 영향을 줄 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 한 측면은 암 또는 전암성 병증의 증상을 치료하거나, 또는 완화시키는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 암 또는 전암성 병증을 앓고, 돌연변이체 EZH2를 발현하는 피험체에게 치료학상 유효량의 EZH2의 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드 또는 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 6으로 정의된, 그의 기질 포켓 도메인 중 돌연변이를 포함한다. 더욱 바람직하게, 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드 또는 돌연변이체 EZH2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호 1의 아미노산 위치 677, 687, 674, 685, 또는 641에 치환 돌연변이를 포함하고, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 서열 번호 1의 아미노산 위치 677에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 글리신(G)으로의 치환(A677G); 서열 번호 1의 아미노산 위치 687에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 발린(V)으로의 치환(A687V); 서열 번호 1의 아미노산 위치 674에서 야생형 잔기 발린(V)의 메티오닌(M)으로의 치환(V674M); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 히스티딘(H)으로의 치환(R685H); 서열 번호 1의 아미노산 위치 685에서 야생형 잔기 아르기닌(R)의 시스테인(C)으로의 치환(R685C); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 페닐알라닌(F)으로의 치환(Y641F); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 히스티딘(H)으로의 치환(Y641H); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 아스파라긴(N)으로의 치환(Y641N); 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 세린(S)으로의 치환(Y641S); 또는 서열 번호 1의 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 시스테인(C)으로의 치환(Y641C)을 포함한다.
한 실시양태에서, 억제제는 돌연변이체 EZH2의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 억제시킨다. 한 실시양태에서, 억제제는 돌연변이체 EZH2의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 선택적으로 억제시킨다. 임의적으로, 암은 림프종. 바람직하게, 암은 비호지킨 림프종, 여포성 림프종 또는 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)을 포함한다. 별법으로, 암은 백혈병(예컨대, CML) 또는 흑색종이다. 전암성으로는 골수이형성 증후군(MDS, 이전에는 전백혈병으로 알려져 있었다)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
암 및 신경성 질환과 같은 질환은 단백질(예를 들어, 히스톤) 메틸화의 조절제, 예를 들어 히스톤 메틸트랜스퍼라제 또는 히스톤 탈메틸라제 효소 활성의 조절제의 투여에 의해 치료될 수 있다. 히스톤 메틸화는 암 내 특정 유전자의 이상 발현, 및 비신경 세포 내 신경 유전자의 침묵에 연관된 것으로 보고되었다. 본원에 기재된 조절제는 그러한 질환을 치료하기 위해, 즉, 이환된 세포에서의 히스톤을 억제하기 위해 사용될 수 있다.
비정상적인 히스톤 메틸화가 특정 암 및 전암성 병증과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다는 사실에 적어도 근거하여, 피험체에서 암을 치료하는 방법은 해당 처리를 필요로 하는 피험체에게 메틸화를 억제하거나 메틸화를 상대 정상 세포에서의 대략적 그 수준으로 복원하는 정상 세포 치료학상 유효량의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 피험체에서 암 또는 전암성 병증을 치료하는 방법은 상기 치료를 필요로 하는 피험체에게 비메틸화된 H3-K27의 모노메틸화된 H3-K27(H3-K27me1)로의 전환을 억제하는 화합물을 치료학상 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 피험체에서 암 또는 전암성 병증을 치료하는 방법은 상기 치료를 필요로 하는 피험체에게 모노메틸화된 H3-K27(H3-K27me1)의 디메틸화된 H3-K27(H3-K27me2)로의 전환을 억제하는 화합물을 치료학상 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 피험체에서 암 또는 전암성 병증을 치료하는 방법은 상기 치료를 필요로 하는 피험체에게 H3-K27me2의 트리메틸화된 H3-K27(H3-K27me3)로의 전환을 억제하는 화합물을 치료학상 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 피험체에서 암 또는 전암성 병증을 치료하는 방법은 상기 치료를 필요로 하는 피험체에게 H3-K27me1의 H3-K27me2으로의 전환 및 H3-K27me2의 H3-K27me3으로의 전환, 이 둘 모두를 억제하는 화합물을 치료학상 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 질환 특이 메틸화의 증가는 히스톤 또는 단백질 메틸화의 세포내 수준의 전반적 증가의 부재하에 핵심 게놈 유전자좌에서의 크로마틴에서 일어날 수 있다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 예를 들어, 핵심 질환 관련 유전자에서의 이상 과메틸화가 전반적 히스톤 또는 단백질 저메틸화의 배경에 대해 일어날 가능성이 있다.
메틸화의 조절제는 일반적으로 세포 증식을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 과도한 증식은 메틸화를 감소시키는 작용제를 이용하여 감소될 수 있는 반면, 불충분한 증식은 메틸화를 증가시키는 작용제를 이용하여 자극될 수 있다. 따라서, 치료될 수 있는 질환은 과다증식성 질환, 예컨대, 양성 세포 성장 및 악성 세포 성장(암)이 포함된다.
치료될 수 있는 암의 예로는 비호지킨 림프종, 여포성 림프종(FL) 및 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)을 비롯한, 림프종; 흑색종; 및 CML을 비롯한, 백혈병을 포함한다. 예시적인 전암성 병증은 골수이형성 증후군(MDS: 이전에는 전백혈병으로 알려져 있었다)을 포함한다.
다른 암에는 급성 림프모구 백혈병; 급성 골수양 백혈병; 부신피질 암종; AIDS 관련 암; AIDS 관련 림프종; 항문 암; 아동 소뇌 성상세포종; 아동 대뇌 성상세포종; 기저 세포 암종, 예컨대, 피부암(비흑색종); 간외 담도암; 방광암; 골암, 골육종/악성 섬유성 조직구종; 뇌 줄기 신경교종; 뇌 종양; 소뇌 성상세포종 뇌 종양; 대뇌 성상세포종/악성 신경교종 뇌 종양; 상의세포종 뇌 종양; 수모세포종 뇌 종양; 미분화 신경 외배엽성 종양 뇌 종양; 소아 시교차 및 시상하부 신경교종 뇌 종양; 유방암; 기관지 선종/유암종; 버킷 림프종; 유암 종양; 위장관 유암 종양; 미지의 원발성 암종; 원발성 중추신경계 림프종; 소뇌 성상세포종; 자궁경부암; 아동암; 만성 림프구성 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 모(hair) 세포 만성 골수성 백혈병; 만성 골수증식성 장애; 결장암; 대장암; 피부 T 세포 림프종, 예컨대, 균상 식육종 및 세자리 증후군; 자궁내막암; 식도암; 유잉계 종양; 간외 담도암; 눈 암, 안구 흑색종; 망막모세포종 눈암; 담낭암; 위장(위)암; 위장관 유암 종양; 두개외 생식 세포 종양; 고환외 생식 세포 종양; 난소 생식 세포 종양; 임신성 융모성 종양; 신경교종; 아동 뇌 줄기 신경교종;아동 대뇌 성상세포종 신경교종; 아동 시신경로 및 시상하부 신경교종; 모 세포 백혈병; 두경부암; 성인 (원발성) 간세포(간) 암); 아동 (원발성) 간세포(간) 암); 호지킨 림프종; 임신중 호지킨 림프종; 하인두암; 시상하부 및 시신경로 신경교종; 안구 흑색종; 섬 세포 암종(내분비 췌장암); 카포시 육종; 신장(신장 세포)암; 신장암; 후두암; 백혈병; 입술 및 구강암; 성인 (원발성) 간암; 아동 (원발성) 간암; 비소세포 폐암; 소세포 폐암; 원발성 중추신경계 림프종; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 골 악성 섬유성 조직구종/골육종; 수모세포종; 흑색종; 머켈 세포 암종; 중피종; 성인 악성 중피종; 잠복 원발성 전이 경부 편평세포암; 다발성 내분비 샘종증 증후군; 다발성 골수종; 다발성 골수종/혈장 세포 신생물 균상식육종; 골수이형성 증후군; 골수이형성/골수증식성 질환; 급성 성인 골수양 백혈병; 급성 아동 골수양 백혈병; 만성 골수증식성 장애; 비강 및 부비동암; 비인두암; 신경아세포종; 비호지킨 림프종; 임신중 비호지킨 림프종; 경구암; 구강 및 입술암; 구인두암; 골육종/악성 골 섬유성 조직구종; 난소암; 난소 상피세포암; 난소 경계성 종양; 췌장암; 췌도세포 췌장암; 부비동 및 비강암; 부갑상선암; 음경암; 갈색세포종; 송과체모세포종 및 미분화 신경 외배엽성 종양; 뇌하수체 종양; 혈장 세포 신생물/다발성 골수종; 흉막 폐 모세포종; 임신 및 유방암; 전립선암; 직장암; 망막모세포종; 횡문근육종; 침샘암; 유잉계 종양 육종; 연조직 육종; 난소; 세자리 증후군; 피부암; 피부암(비흑색종); 소장암; 연조직 육종; 편평상피 암종, 예컨대, 피부암(비흑색종); 전이성 잠복 원발성 경부 편평세포암; 위(위장)암; 고환암; 흉선종; 흉선종 및 흉선 암종; 갑상선암; 신우 및 요관 이행 세포암; 임신성 융모 종양; 미지 원발성 부위의암; 아동의 비통적암; 요도암; 자궁내막 자궁암; 자궁 육종; 질암; 시신경로 및 시상하부 신경교종; 외음부암; 발덴스트롬 거대글로불린혈증; 윌름 종양; 및 여성암이 포함된다.
EZH2에 의해 매개되는 후생적 메틸화가 작용할 수 있는 임의의 다른 질환이 본원에 기재된 화합물 및 방법을 이용하여 치료되거나 예방될 수 있다.
예를 들어, 치료될 수 있는 신경 질환에는 간질, 정신분열증, 양극 장애 또는 다른 생리학적 및/또는 정신과적 장애, 신경병, 골격근 위축 및 신경퇴행성 질환, 예를 들어 신경퇴행성 질환이 포함된다. 예시적 신경퇴행성 질환에는 알츠하이머병, 근위축성 측색 경화증(ALS: Amyotrophic Lateral Sclerosis), 및 파킨슨병이 포함된다. 또 다른 부류의 신경퇴행성 질환에는 적어도 부분적으로 폴리글루타민의 응집에 의해 유발되는 질환이 포함된다. 이 부류의 질환에는 헌팅턴병, 척수성 근육 위축(SBMA: Spinalbulbar Muscular Atrophy 또는 케네디병), 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증(DRPLA: Dentatorubropallidoluysian Atrophy), 척수소뇌 운동실조증 1(SCA1: Spinocerebellar Ataxia 1), 척수소뇌 운동실조증 2(SCA2: Spinocerebellar Ataxia 2), 마카도-조셉병(MJD; Machado-Joseph Disease; SCA3), 척수소뇌 운동실조증 6(SCA6: Spinocerebellar Ataxia 6), 척수소뇌 운동실조증 7(SCA7: Spinocerebellar Ataxia 7), 및 척수소뇌 운동실조증 12(SCA12: Spinocerebellar Ataxia 12)이 포함된다.
병용 요법
본 발명의 한 측면에서, EZH2 길항제 또는 그의 제약상 허용되는 염은 또 다른 치료제와 조합되어, 암 및/또는 신경 장애와 같은 질환을 치료할 수 있다. 예를 들어, 추가의 작용제는 본 발명의 화합물에 의해 치료되는 질환 또는 상태를 치료하는 데 유용한 것으로 당업계에서 인식되고 있는 치료제일 수 있다. 상기 추가의 작용제는 또한 치료용 조성물(예컨대, 조성물의 점도에 영향을 미치는 작용제)에 유익한 속성을 부여하는 작용제일 수 있다.
본 발명에 의해 고려되는 병용 요법은, 예를 들어, 단일 제약 제제 내의 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 추가의 작용제(들)의 투여 및 분리된 제약 제제 내의 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 추가의 작용제(들)의 투여를 포함한다. 즉, 공동 투여는 양 작용제 모두의 조합의 유익한 효과를 제공하기 위해 피험체에게 2개 이상의 작용제를 투여함을 의미할 것이다. 예를 들어, 상기 작용제는 일정 시간에 걸쳐 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
이하에 기재된 작용제는 예시적 목적을 위한 것으로서 제한적이지 않도록 의도된다. 본 발명의 부분인 조합은 본 발명의 화합물 및 이하 목록에서 선택되는 하나 이상의 추가의 작용제일 수 있다. 상기 조합은 또한 그 조합이 형성된 조성물이 그것의 의도된 기능을 수행할 수 있도록 되어진 경우, 1 초과의 추가의 작용제, 예를 들어, 2개 또는 3개의 추가의 작용제를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 한 측면은 암 및/또는 신경 장애의 치료를 위한, 또 다른 제제와 조합되는 EZH2 길항제의 용도에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 부가적 제제는 히스톤 변형에 영향을 미치는 화합물인 항암제, 예컨대, HDAC 억제제이다. 특정 실시양태에서, 부가적 항암 제제는 화학요법제(예컨대, 2CdA, 5-FU, 6-머캅토퓨린, 6-TG, 아브락산(Abraxane)™, 아쿠탄(Accutane)®, 악티노마이신(Actinomycin)-D, 아드리아마이신(Adriamycin)®, 알림타(Alimta)®, 올-트랜스 레티노산, 아메토프테린, Ara-C, 아자시타딘(Azacitadine), BCNU, 블레녹산(Blenoxane)®, 캄포사르(Camptosar)®, CeeNU®, 클로파라빈(Clofarabine), 클로라르(Clolar)™, 사이톡산(Cytoxan)®, 다우노루비신 염화물, 다우녹솜(DaunoXome)®, 다코젠(Dacogen)®, DIC, 독실(Doxil)®, 엘렌스(Ellence)®, 엘록사틴(Eloxatin)®, 엠시트(Emcyt)®, 에토포시드 인산염, 플루다라(Fludara)®, FUDR®, 겜자르(Gemzar)®, 글리벡(Gleevec)®, 헥사메틸멜라민, 하디캄틴(Hycamtin)®, 하이드레아(Hydrea)®, 이다마이신(Idamycin)®, 이펙스(Ifex)®, 익사베필론(ixabepilone), 이그젬프라(Ixempra)®, L-아스파라기나제, 류게란(Leukeran)®, 리포좀형 Ara-C, L-PAM, 라이소드렌(Lysodren), 마툴란(Matulane)®, 미트라신(mithracin), 미토마이신(Mitomycin)-C, 마일레란(Myleran)®, 나벨빈(Navelbine)®, 뉴트렉신(Neutrexin)®, 닐로티닙(nilotinib), 니펜트(Nipent)®, 질소 머스타드, 노반트론(Novantrone)®, 온카스파(Oncaspar)®, 판트레틴(Panretin)®, 파라플라틴(Paraplatin)®, 플라티놀(Platinol)®, 카르무스틴 임플란트를 갖는 프롤리페프로스판(prolifeprospan) 20, 산도스타틴(Sandostatin)®, 타르그레틴(Targretin)®, 타시그나(Tasigna)®, 탁소테레(Taxotere)®, 테모다르(Temodar)®, TESPA, 트리세녹스(Trisenox)®, 발스타르(Valstar)®, 벨반(Velban)®, 비다자(Vidaza)™, 빈크리스틴(vincristine) 황산염, VM 26, 젤로다(Xeloda)® 및 자노사르(Zanosar)®); 생물학제(예컨대, 알파 인터페론(Alpha Interferon), 바실러스 칼메트-구아린(Bacillus Calmette-Guerin), 벡사르(Bexxar)®, 캄파쓰(Campath)®, 에르가미솔(Ergamisol)®, 에를로티닙(Erlotinib), 헤르셉틴(Herceptin)®, 인터류킨-2, 이레사(Iressa)®, 레날리도마이드(lenalidomide), 마일로타르그(Mylotarg)®, 온타크(Ontak)®, 페가사이스(Pegasys)®, 레블리미드(Revlimid)®, 리툭산(Rituxan)®, 타르세바(Tarceva)™, 탈로미드(Thalomid)®, 벨케이드(Velcade)® 및 제발린(Zevalin)™); 소분자(예컨대, 타이케르브(Tykerb)®); 코르티코스테로이드류(예컨대, 덱사메타손 인산나트륨, 델타손(DeltaSone)® 및 델타-코르테프(Delta-Cortef)®); 호르몬 치료제(예컨대, 아리미덱스(Arimidex)®, 아로마신(Aromasin)®, 카소덱스(Casodex)®, 사이타드렌(Cytadren)®, 델리가르드(Eligard)®, 에울렉신(Eulexin)®, 에비스타(Evista)®, 파슬로덱스(Faslodex)®, 페마라(Femara)®, 할로테스틴(Halotestin)®, 메게이스(Megace)®, 닐라드론(Nilandron)®, 놀바덱스(Nolvadex)®, 플레나식스(Plenaxis)™ 및 졸라덱스(Zoladex)®); 및 및 방사능화학제(예컨대, 요오도프(Iodotope)®, 메타스트론(Metastron)®, 포스포콜(Phosphocol)® 및 사마리움(Samarium) SM-153)으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
투여량
본원에 사용되는 바, "치료학상 유효량" 또는 "치료학상 유효 용량"은 병증의 진행을 전체적으로 또는 부분적으로 억제시키거나, 병증의 하나 이상의 증상을 적어도 부분적으로 완화시키는, EZH2 길항제 또는 2종 이상의 그러한 화합물의 조합의 양이다. 치료학상 유효량은 또한 예방적으로 효과적인 양일 수도 있다. 치료 유효한 양은 환자의 크기 및 성별, 치료하고자 하는 병증, 병증의 중증도 및 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 한 실시양태에서, 치료학상 유효 용량이란 환자에서의 증상을 호전시켜 주는 EZH2 길항제의 양을 지칭한다. 소정의 환자에 대해, 치료학상 유효량은 당업계의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
EZH2 길항제의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, 최대 내인 용량(MTD: maximum tolerated dose) 및 ED50(50% 최대 반응을 위한 유효 용량)을 측정하기 위한, 세포 배양액 또는 실험 동물 내에서의 표준 제약 방법에 의해 측정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 간의 용량 비는 치료 지수이고, 이는 MTD와 ED50 간의 비로 표현될 수 있다. 이 세포 배양액 검정 및 동물 연구로부터 수득한 데이터는 인간에 사용하기 위한 용량 범위를 설정하기 위해 사용될 수 있다. 투여량은 또한 질환 조직 또는 대리 조직에 있어 효소 억제의 약력학적 마커에 대한 EZH2 길항제의 효과(예컨대, 히스톤 메틸화 또는 표적 유전자 발현)를 모니터링함으로써 지정될 수도 있다. 세포 배양액 또는 동물 실험은 약력학적 마커의 변화에 필요한 용량 간의 관계를 결정하기 위해 사용될 수 있고, 치료 효능에 필요한 용량은 세포 배양액 또는 동물 실험 또는 조기 단계 임상 실험에서 결정될 수 있다. 그러한 EZH2 길항제의 투여량은 바람직하게 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50를 포함하는 일정 범위의 순환 농도 내에 있다. 상기 투여량은 이용되는 투약 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 변동될 수 있다. 정확한 제제에서, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개인 주치의에 의해 선택될 수 있다. 위기 처치시에, 신속한 반응을 얻기 위해, MTD에 접근하도록 급성 볼루스 또는 주입을 투여하는 것이 필요할 수 있다.
투여량 및 간격은 치료 효능을 달성하기 위해 필요 시간 동안 최소의 유효 농도(MEC: minimal effective concentration) 또는 메틸트랜스퍼라제 조절 효과를 유지하는 데 충분한 활성 부분의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조절될 수 있다. MEC는 각 EZH2 길항제에 대해 변동될 것이나, 시험관내 데이터 및 동물 실험으로부터 평가될 수 있다. MEC를 달성하는 데 필요한 투여량은 개인 특징 및 투여 경로에 의존할 것이다. 그러나, 혈장 농도를 측정하기 위해 고압 액체 크로마토그래피(HPLC: high pressure liquid chromatography) 검정 또는 생체검정을 사용할 수 있다.
투약 간격은 또한 MEC 값을 이용하여 결정될 수도 있다. 한 실시양태에서, EZH2 길항제는 시간의 10 내지 90% 동안, 바람직하게는 요망되는 증상 경감이 달성될 때까지 30 내지 90%, 가장 바람직하게는 50 내지 90% 동안 MEC를 초과하는 혈장 수준을 유지하는 요법을 이용하여 투여되어야 한다. 다른 실시양태에서, 상이한 MEC 혈장 수준은 상이한 시간의 양 동안 유지될 것이다. 국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우, 약물의 유효 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수 있다.
당업계의 숙련가는 각종 투여 요법으로부터 선택할 수 있고, EZH2 길항제의 투여량은 물론 치료받는 피험체, 피험체의 체중, 질환의 중증도, 투여 방식 및 처방 주치의 판단에 의존할 것이다.
화합물 및 제약 조성물
본 발명의 측면은 본 발명의 방법에 따라 유용한 화합물에 관한 것이다. 상기 화합물은 본원에서 "EZH2의 억제제" 및 등가적으로 "EZH2 길항제"로 지칭된다. 상기 화합물은 화합물 그 자체, 화합물의 제약상 허용되는 염, 또는 제약 조성물로서 제공될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하는 데 적합한 화합물은 하기 화학식 I의 화합물, 또는 그의 염을 포함한다:
Figure 112021068876035-pat00026
(I)
상기 식에서,
V1은 N 또는 CR7이고,
V2는 N 또는 CR2이되, 단, V1이 N일 때, V2는 N이고,
X 및 Z는 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, (C6-C10)비시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 아릴, 비치환된 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환된 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 할로, 시아노,
Figure 112021068876035-pat00027
로 이루어진 군으로부터 선택되고,
Y는 H 또는 할로이고;
R1은 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C6-C10)비시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환된 또는 치환된 아릴, 비치환된 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, 비치환된 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환된 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬 또는 -(C2-C8)알케닐, -CORa, -CO2Ra, -CONRaRb, -CONRaNRaRb이고;
R2는 수소, (C1-C8)알킬, 트리플루오로메틸, 알콕시, 또는 할로이고, 여기서, 상기 (C1-C8)알킬은 임의적으로 아미노 및 (C1-C3)알킬아미노로부터 선택되는 1 내지 2개의 기로 치환되고;
R7은 수소, (C1-C3)알킬, 또는 알콕시이고;
R3은 수소, (C1-C8)알킬, 시아노, 트리플루오로메틸, -NRaRb, 또는 할로이고;
R6은 수소, 할로, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 (C3-C8)시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐, 비치환된 또는 치환된 (C5-C8)시클로알케닐-(C1-C8)알킬, (C6-C10)비시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로시클로알킬-(C1-C8)알킬, 비치환된 또는 치환된 아릴, 비치환된 또는 치환된 아릴-(C1-C8)알킬, 비치환된 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환된 또는 치환된 헤테로아릴-(C1-C8)알킬, 시아노,
Figure 112021068876035-pat00028
으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
여기서, 임의의 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 기는 임의적으로 독립적으로 -O(C1-C6)알킬(Rc)1-2, -S(C1-C6)알킬(Rc)1-2, -(C1-C6)알킬(Rc)1-2, -(C1-C8)알킬-헤테로시클로알킬, (C3-C8)시클로알킬-헤테로시클로알킬, 할로, (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노,
Figure 112021068876035-pat00029
헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬, 및 헤테로아릴(C1-C4)알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 기에 의해 치환되고;
여기서, 상기 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬, 또는 헤테로아릴(C1-C4)알킬의 임의의 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티는 임의적으로 독립적으로 할로, (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노,
Figure 112021068876035-pat00030
로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 기에 의해 치환되고;
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C6-C10)비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이고, 여기서, 상기 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 기는 임의적으로 독립적으로 할로, 히드록실, (C1-C4)알콕시, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, -CO2H, -CO2(C1-C4)알킬, -CONH2, -CONH(C1-C4)알킬, -CON((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬), -SO2(C1-C4)알킬, -SO2NH2,-SO2NH(C1-C4)알킬, 및 SO2N((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 기에 의해 치환되거나;
Ra 및 Rb는 그들이 부착된 질소와 함께, 임의적으로 산소, 질소, 및 황으로부터 선택되는 추가의 헤테로원자를 함유하는 5-8원 포화된 또는 불포화된 고리를 나타내고, 여기서, 상기 고리는 임의적으로 독립적으로 (C1-C4)알킬, (C1-C4)할로알킬, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, 히드록실, 옥소, (C1-C4)알콕시, 및 (C1-C4)알콕시(C1-C4)알킬로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 기에 의해 치환되고, 여기서, 상기 고리는 임의적으로 (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리에 융합되거나;
Ra 및 Rb는 그들이 부착된 질소와 함께, 임의적으로 (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리에 융합된, 6 내지 10원 가교된 비시클릭 고리 시스템을 나타내고;
각각의 Rc는 독립적으로 (C1-C4)알킬아미노, -NRaSO2Rb, -SORa -SO2Ra, -NRaC(O)ORa, -NRaRb, 또는 -CO2Ra이다.
일반 구조식 I에 포함된 화합물의 서브군은 하기로 나타낼 수 있다:
화학식 I의 서브군 A
X 및 Z는 (C1-C8)알킬, (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -NRaRb, 및 -ORa로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 H 또는 F이고;
R1은 (C1-C8)알킬, (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 수소, (C1-C8)알킬, 트리플루오로메틸, 알콕시, 또는 할로이고, 여기서, 상기 (C1-C8)알킬은 임의적으로 아미노 및 (C1-C3)알킬아미노로부터 선택되는 1 내지 2개의 기로 치환되고;
R7은 수소, (C1-C3)알킬, 또는 알콕시이고;
R3은 수소, (C1-C8)알킬, 시아노, 트리플루오로메틸, -NRaRb 및 할로로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6은 수소, 할로, 시아노, 트리플루오로메틸, 아미노, (C1-C8)알킬, (C3-C8)시클로알킬;, 아릴, 헤테로아릴, 아실아미노; (C2-C8)알키닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알키닐; -SO2Ra; -SO2NRaRb 및 -NRaS02Rb로 이루어진 군으로부터 선택되고;
여기서, 임의의 (C1-C8)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C2-C8)알키닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알키닐 기는 임의적으로 독립적으로 -O(C1-C6)알킬(Rc)1-2, -S(C1-C6)알킬(Rc)1-2, -(C1-C6)알킬(Rc)1-2, -(C1-C8)알킬-헤테로시클로알킬, (C3-C8)시클로알킬-헤테로시클로알킬, 할로, (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노,
Figure 112021068876035-pat00031
헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬, 및 헤테로아릴(C1-C4)알킬로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 기에 의해 치환되고;
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C6-C10)비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이고, 여기서, 상기 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 비시클로알킬, 헤테로시클로알킬 ,아릴 또는 헤테로아릴 기는 임의적으로 독립적으로 할로, 히드록실, (C1-C4)알콕시, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, -CO2H, -CO2(C1-C4)알킬, -CONH2, -CONH(C1-C4)알킬, -CON((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬), -SO2(C1-C4)알킬, -SO2NH2, -S02NH(C1-C4)알킬, 및 -SO2N((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 기에 의해 치환되거나;
Ra 및 Rb는 그들이 부착된 질소와 함께, 임의적으로 산소, 질소, 및 황으로부터 선택되는 추가의 헤테로원자를 함유하는 5-8원 포화된 또는 불포화된 고리를 나타내고, 여기서, 상기 고리는 임의적으로 독립적으로 (C1-C4)알킬, (C1-C4)할로알킬, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, 히드록실, 옥소, (C1-C4)알콕시, 및 (C1-C4)알콕시(C1-C4)알킬로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 기에 의해 치환되고; 여기서, 상기 고리는 임의적으로 (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리에 융합되거나;
Ra 및 Rb는 그들이 부착된 질소와 함께, 임의적으로 (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리에 융합된, 6 내지 10원 가교된 비시클릭 고리 시스템을 나타낸다. 상기 특정 서브군 A에서 아릴 또는 헤테로아릴 기는 독립적으로 푸란, 티오펜, 피롤, 옥사졸, 티아졸, 이미다졸, 피라졸, 옥사디아졸, 티아디아졸, 트리아졸, 테트라졸, 벤조푸란, 벤조티오펜, 벤즈옥사졸, 벤조티아졸, 페닐, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 트리아진, 테트라진, 퀴놀린, 신놀린, 퀴나졸린, 퀴녹살린, 및 나프티리딘 또는 하기와 같은 또 다른 아릴 또는 헤테로아릴 기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure 112021068876035-pat00032
((1)에서,
A는 O, NH, 또는 S이고; B는 CH 또는 N이고, C는 수소 또는 C1-C8알킬이다); 또는
Figure 112021068876035-pat00033
((2)에서,
D는 임의적으로 수소 또는 C1-C8알킬에 의해 치환된 N 또는 C이다); 또는
Figure 112021068876035-pat00034
((3)에서,
E는 NH 또는 CH2이고; F는 O 또는 CO이고; G는 NH 또는 CH2이다); 또는
Figure 112021068876035-pat00035
((4)에서,
J는 O, S 또는 CO이다); 또는
Figure 112021068876035-pat00036
((5)에서,
Q는 CH 또는 N이고;
M은 CH 또는 N이고;
L/(5)은 수소, 할로, 아미노, 시아노, (C1-C8)알킬, (C3-C8)시클로알킬,
Figure 112021068876035-pat00037
이고,
여기서, 임의의 (C1-C8)알킬 또는 (C3-C8)시클로알킬 기는 임의적으로 독립적으로 (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노,
Figure 112021068876035-pat00038
로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 기에 의해 치환되고, 여기서, Ra 및 Rb는 상기 정의된 바와 같다); 또는
Figure 112021068876035-pat00039
((6)에서,
L/(6)은 NH 또는 CH2이다); 또는
Figure 112021068876035-pat00040
((7)에서,
M/(7)은 수소, 할로, 아미노, 시아노, (C1-C8)알킬, (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬,
Figure 112021068876035-pat00041
이고,
여기서, 임의의 (C1-C8)알킬, (C3-C8)시클로알킬, 또는 헤테로시클로알킬 기는 임의적으로 독립적으로 (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노,
Figure 112021068876035-pat00042
로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 기에 의해 치환되고, 여기서, Ra 및 Rb는 상기 정의된 바와 같다); 또는
Figure 112021068876035-pat00043
((8)에서,
P는 CH2, NH, O, 또는 S이고; Q/(8)는 CH 또는 N이고; n은 0-2이다); 또는
Figure 112021068876035-pat00044
((9)에서,
S/(9) 및 T/(9)는 C이거나, 또는 S/(9)는 C이고, T/(9)는 N이거나, 또는 S/(9)는 N이고, T/(9)는 C이고;
R은 수소, 아미노, 메틸, 트리플루오로메틸, 또는 할로이고;
U은 수소, 할로, 아미노, 시아노, 니트로, 트리플루오로메틸, (C1-C8)알킬, (C3-C8)시클로알킬,
Figure 112021068876035-pat00045
여기서, 임의의 (C1-C8)알킬 또는 (C3-C8)시클로알킬 기는 임의적으로 독립적으로 (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노,
Figure 112021068876035-pat00046
로부터 선택되는 3개의 기에 의해 치환되고, 여기서, Ra 및 Rb는 상기 정의된 바와 같다).
화학식 I의 서브군 B
X 및 Z는 (C1-C8)알킬, (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, -NRaRb, 및 -ORa로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Y는 H이고;
R1은 (C1-C8)알킬, (C3-C8)시클로알킬, 또는 헤테로아릴이고;
R2는 수소, (C1-C3)알킬, 또는 할로이고, 여기서, 상기 (C1-C3)알킬은 임의적으로 아미노 및 (C1-C3)알킬아미노로부터 선택되는 1 내지 2개의 기로 치환되고;
R7은 수소, (C1-C3)알킬, 또는 알콕시이고;
R3은 수소, (C1-C8)알킬, 또는 할로이고;
R6은 수소, 할로, 시아노, 트리플루오로메틸, 아미노, (C1-C8)알킬, (C3-C8)시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아실아미노; (C2-C8)알키닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알키닐, -SO2Ra, -SO2NRaRb, 또는 -NRaS02Rb이고;
여기서, 임의의 (C1-C8)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C2-C8)알키닐, 아릴알키닐, 또는 헤테로아릴알키닐 기는 임의적으로 독립적으로 할로, (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노,
Figure 112021068876035-pat00047
헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴(C1-C4)알킬, 및 헤테로아릴(C1-C4)알킬로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 기에 의해 치환되고; ;
Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C6-C10)비시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴이고, 여기서, 상기 (C1-C8)알킬, (C2-C8)알케닐, (C2-C8)알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 비시클로알킬, 헤테로시클로알킬 ,아릴 또는 헤테로아릴 기는 임의적으로 독립적으로 할로, 히드록실, (C1-C4)알콕시, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, -CO2H, -CO2(C1-C4)알킬, -CONH2, -CONH(C1-C4)알킬, -CON((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬), -SO2(C1-C4)알킬, -SO2NH2, -SO2NH(C1-C4)알킬, 및 -SO2N((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 기에 의해 치환되거나;
Ra 및 Rb는 그들이 부착된 질소와 함께, 임의적으로 산소, 질소, 및 황으로부터 선택되는 추가의 헤테로원자를 함유하는 5-8원 포화된 또는 불포화된 고리를 나타내고, 여기서, 상기 고리는 임의적으로 독립적으로 (C1-C4)알킬, (C1-C4)할로알킬, 아미노, (C1-C4)알킬아미노, ((C1-C4)알킬)((C1-C4)알킬)아미노, 히드록실, 옥소, (C1-C4)알콕시, 및 (C1-C4)알콕시(C1-C4)알킬로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 기에 의해 치환되고; 여기서, 상기 고리는 임의적으로 (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리에 융합되거나;
Ra 및 Rb는 그들이 부착된 질소와 함께, 임의적으로 (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리에 융합된, 6 내지 10원 가교된 비시클릭 고리 시스템을 나타낸다. 상기 특정 서브군 B에서 아릴 또는 헤테로아릴 기는 푸란, 티오펜, 피롤, 옥사졸, 티아졸, 이미다졸, 피라졸, 옥사디아졸, 티아디아졸, 트리아졸, 테트라졸, 벤조푸란, 벤조티오펜, 벤즈옥사졸, 벤조티아졸, 페닐, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 트리아진, 테트라진, 퀴놀린, 신놀린, 퀴나졸린, 퀴녹살린, 및 나프티리딘, 또는 하기와 같은 또 다른 아릴 또는 헤테로아릴 기의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure 112021068876035-pat00048
((1)에서,
A는 O, NH, 또는 S이고; B는 CH 또는 N이고, C는 수소 또는 C1-C8알킬이다); 또는
Figure 112021068876035-pat00049
((2)에서,
D는 임의적으로 수소 또는 C1-C8알킬에 의해 치환된 N 또는 C이다); 또는
Figure 112021068876035-pat00050
((3)에서,
E는 NH 또는 CH2이고; F는 O 또는 CO이고; G는 NH 또는 CH2이다); 또는
Figure 112021068876035-pat00051
((4)에서,
J는 O, S 또는 CO이다); 또는
Figure 112021068876035-pat00052
((5)에서,
Q는 CH 또는 N이고;
M은 CH 또는 N이고;
L/(5)은 수소, 할로, 아미노, 시아노, (C1-C8)알킬, (C3-C8)시클로알킬,
Figure 112021068876035-pat00053
이고,
여기서, 임의의 (C1-C8)알킬 또는 (C3-C8)시클로알킬 기는 임의적으로 독립적으로 (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노,
Figure 112021068876035-pat00054
로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 기에 의해 치환되고, 여기서, Ra 및 Rb는 상기 정의된 바와 같다); 또는
Figure 112021068876035-pat00055
((6)에서,
L/(6)은 NH 또는 CH2이다); 또는
Figure 112021068876035-pat00056
((7)에서,
M/(7)은 수소, 할로, 아미노, 시아노, (C1-C8)알킬, (C3-C8)시클로알킬, 헤테로시클로알킬,
Figure 112021068876035-pat00057
이고,
여기서, 임의의 (C1-C8)알킬, (C3-C8)시클로알킬, 또는 헤테로시클로알킬 기는 임의적으로 독립적으로 (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노,
Figure 112021068876035-pat00058
로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 기에 의해 치환되고, 여기서, Ra 및 Rb는 상기 정의된 바와 같다); 또는
Figure 112021068876035-pat00059
((8)에서,
P는 CH2, NH, O, 또는 S이고; Q/(8)는 CH 또는 N이고; n은 0-2이다); 또는
Figure 112021068876035-pat00060
((9)에서,
S/(9) 및 T/(9)는 C이거나, 또는 S/(9)는 C이고, T/(9)는 N이거나, 또는 S/(9)는 N이고, T/(9)는 C이고;
R은 수소, 아미노, 메틸, 트리플루오로메틸, 또는 할로이고;
U은 수소, 할로, 아미노, 시아노, 니트로, 트리플루오로메틸, (C1-C8)알킬, (C3-C8)시클로알킬,
Figure 112021068876035-pat00061
여기서, 임의의 (C1-C8)알킬 또는 (C3-C8)시클로알킬 기는 임의적으로 독립적으로 (C1-C6)알킬, (C3-C8)시클로알킬, (C5-C8)시클로알케닐, (C1-C6)할로알킬, 시아노,
Figure 112021068876035-pat00062
로부터 선택되는 3개의 기에 의해 치환되고, 여기서, Ra 및 Rb는 상기 정의된 바와 같다).
화학식 I의 서브군 C
X는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 , 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 페닐, 트리플루오로메틸, 테트라히드로피란, 히드록시메틸, 메톡시메틸, 또는 벤질이고;
Y는 H이고;
Z는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 트리플루오로메틸, 또는 벤질이고;
R1은 이소프로필, tert-부틸, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, (1-메틸에틸)시클로프로필, 1,1-디옥소-테트라히드로티오펜-3-일, 1-Me-피페리딘-4-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로피란-4-일, N,N-디메틸-1-프로판아미닐, 벤질, 또는 4-피리딜;
R2는 수소, (C1-C3)알킬, 또는 할로이고, 여기서, 상기 (C1-C3)알킬은 임의적으로 아미노 및 (C1-C3)알킬아미노로부터 선택되는 1 내지 2개의 기로 치환되고;
R7은 수소, (C1-C3)알킬, 또는 알콕시이고;
R3은 H, 메틸, 또는 Br이고;
R6은 메틸, 비스(1,1-디메틸에틸), 비스(l-메틸에틸), 시클로프로필, 프로필, 디메틸아미노, 에틸아미노, (2-히드록시에틸) 아미노, 2-프로펜-1-일아미노, 1-피페라지닐, 1-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 4-피페리디닐아미노, 테트라히드로-2H-피란-4-일아미노, 페닐아미노, (페닐메틸)아미노, (4-피리디닐메틸)아미노, [2-(2-피리디닐아미노)에틸]아미노, 2-(디메틸아미노)에틸] 아미노, 4-피리디닐아미노, 4-(아미노카보닐)페닐]아미노, 3-히드록시-3-메틸-1-부틴-1-일, 4-피리디닐에티닐, 페닐에티닐, 2-푸라닐, 3-티에닐; 1H-피라졸-4-일, 1H-피라졸-5-일, 1H-인다졸-6-일, 3-메틸-1H-인다졸-5-일, 1H-1,2,3-벤조트리아졸-5-일, 2-옥소-2,3-디히드로-1H-벤즈이미다졸-5-일, 2-옥소-2,3-디히드로-1H-인돌-5-일, 2-옥소-2,3-디히드로-1H-인돌-6-일, 2,1,3-벤즈옥사디아졸-5-일, 2-아미노-6-퀴나졸리닐, 2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라히드로-5-피리미디닐, 2-아미노-5-피리미디닐, 7-옥소-1,5,6,7-테트라히드로-1,8-나프티리딘-3-일, 페닐, 2-메틸페닐, 2-니트로페닐, 2-페닐에틸, 3-아미노페닐, 4-아미노페닐, 4-클로로페닐, 4-플루오로페닐, 4-(메틸옥시)페닐, 3-(아세틸아미노)페닐, 4-(아세틸아미노)페닐, 4-(아미노카보닐)페닐, 4-(1H-피라졸-4-일)페닐, 4-(아미노술포닐)페닐, 4-(메틸술포닐)페닐, 4-[(디메틸아미노)술포닐]페닐, 4-[(메틸아미노)카보닐]페닐, 4-[(메틸아미노)술포닐]페닐, 4-[(메틸술포닐)아미노]페닐, 3-피리디닐, 4-피리디닐, 2-(4-모르폴리닐)-4-피리디닐, 2-아미노-4-피리디닐, 5-(메틸옥시)-3-피리디닐, 5-(메틸술포닐)-3-피리디닐, 5-[(시클로프로필술포닐)아미노]-6-(메틸옥시)-3-피리디닐, 5-[(페닐술포닐)아미노]-3-피리디닐, 6-(4-메틸-1-피페라지닐)-3-피리디닐, 6-(4-모르폴리닐)-3-피리디닐, 6-(아세틸아미노)-3-피리디닐, 6-(디메틸아미노)-3-피리디닐, 6-(메틸옥시)-3-피리디닐, 6-[(메틸아미노)카보닐]-3-피리디닐, 6-[(메틸아미노)술포닐]-3-피리디닐, 6-메틸-3-피리디닐, 또는 4-피리디닐옥시이다 (예컨대, WO 2011/140325; WO 2011/140324; 및 WO 2012/005805(상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함됨) 참조).
본 발명의 방법에서 사용하는 데 적합한 화합물은 또한 하기 화학식 II의 화합물을 포함한다:
Figure 112021068876035-pat00063
상기 식에서,
X1은 N 또는 CR11이고;
X2는 N 또는 CR13이고;
Z1은 NR7R8, OR7, SR7, 또는 CR7R8R14이고;
각각의 R1, R5, R9, 및 R10은 독립적으로 H, 또는 임의적으로 할로, 히드록실, COOH, C(O)O-C1-C6알킬, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, C3-C8시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 및 5 또는 6원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환된 C1-C6알킬이고;
각각의 R2, R3, 및 R4는 독립적으로 -Q1-T1이고, 여기서, Q1은 결합, 또는 임의적으로 할로, 시아노, 히드록실 또는 C1-C6알콕시로 치환된 C1-C3알킬 링커이고, 및 T1은 H, 할로, 히드록실, COOH, 시아노, 또는 Rs1이고, 여기서, Rs1은 C1-C3알킬, C2-C6알케닐, C2-C6알키닐, C1-C6알콕실, C(O)O-C1-C6알킬, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 또는 5 또는 6원 헤테로아릴이고, Rs1은 임의적으로 할로, 히드록실, 옥소, COOH, C(O)O-C1-C6알킬, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, C3-C8시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 및 5 또는 6원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환되고;
R6은 C6-C10아릴 또는 5 또는 6원 헤테로아릴이고, 이들 각각은 임의적으로 하나 이상의 -Q2-T2로 치환되고, 여기서, Q2는 결합, 또는 임의적으로 할로, 시아노, 히드록실 또는 C1-C6알콕시로 치환된 C1-C3알킬 링커이고, T2는 H, 할로, 시아노, -ORa, -NRaRb, -(NRaRbRc)+A-, -C(O)Ra, -C(O)ORa, -C(O)NRaRb, -NRbC(O)Ra, -NRbC(O)ORa, -S(O)2Ra, -S(O)2NRaRb, 또는 RS2이고, 여기서, 각각의 Ra, Rb, 및 Rc는 독립적으로 H 또는 RS3이고, A-는 제약상 허용되는 음이온이고, 각각의 RS2 및 RS3은 독립적으로 C1-C6알킬, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 또는 5 또는 6원 헤테로아릴이거나, 또는 Ra 및 Rb는 그들이 부착된 N 원자와 함께 0 또는 1개의 추가의 헤테로원자를 가지는 4 내지 12원 헤테로시클로알킬 고리를 형성하고, 각각의 RS2, RS3 및 Ra 및 Rb에 형성된 4 내지 12원 헤테로시클로알킬 고리는 임의적으로 하나 이상의 -Q3-T3으로 치환되고, 여기서, Q3은 결합, 또는 임의적으로 할로, 시아노, 히드록실 또는 C1-C6알콕시로 치환된 C1-C3알킬 링커이고, T3은 할로, 시아노, C1-C6알킬, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 5 또는 6원 헤테로아릴, ORd, COORd, -S(O)2Rd, -NRdRe, 및 -C(O)NRdRe로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각의 Rd 및 Re는 독립적으로 H 또는 C1-C6알킬이거나 또는 -Q3-T3은 옥소이거나; 또는 임의의 인접한 두 -Q2-T2는 그들이 부착되는 원자와 함께, 임의적으로 N, O 및 S로부터 선택되는 1-4개의 헤테로원자를 함유하고, 임의적으로, 할로, 히드록실, COOH, C(O)O-C1-C6알킬, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, C3-C8시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 및 5 또는 6원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환된 5 또는 6원 고리를 형성하되; 단, -Q2-T2는 H가 아니고;
R7은 -Q4-T4이고, 여기서, Q4는 결합, C1-C4알킬 링커, 또는 C2-C4알케닐 링커이고, 각각의 링커는 임의적으로 할로, 시아노, 히드록실 또는 C1-C6알콕시로 치환되고, T4는 H, 할로, 시아노, NRfRg, -ORf, -C(O)Rf, -C(O)ORf, -C(O)NRfRg, -C(O)NRfORg, -NRfC(O)Rg, -S(O)2Rf, 또는 Rs4이고, 여기서, 각각의 Rf 및 Rg는 독립적으로 H 또는 Rs5이고, 각각의 Rs4 및 Rs5는 독립적으로 C1-C6알킬, C2-C6알케닐, C2-C6알키닐, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 또는 5 또는 6원 헤테로아릴이고, 각각의 Rs4 및 Rs5는 임의적으로 하나 이상의 -Q5-T5로 치환되고, 여기서, Q5는 결합, C(O), C(O)NRk, NRkC(O), S(O)2, 또는 C1-C3알킬 링커이고(Rk는 H 또는 C1-C6알킬이다), T5는 H, 할로, C1-C6알킬, 히드록실, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 5 또는 6원 헤테로아릴, 또는 S(O)qRq(여기서, q는 0, 1, 또는 2이고, Rq는 C1-C6알킬, C2-C6알케닐, C2-C6알키닐, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 또는 5 또는 6원 헤테로아릴이다)이고, T5는 임의적으로 할로, C1-C6알킬, 히드록실, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 및 5 또는 6원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환되되, 단, T5가 H, 할로, 히드록실, 또는 시아노일 때를 예외로 하거나; 또는 -Q5-T5는 옥소이되; 단, R7은 H가 아니고;
각각의 R8, R11, R12, 및 R13은 독립적으로 H, 할로, 히드록실, COOH, 시아노, Rs6, ORs6, 또는 COORs6이고, 여기서, Rs6은 C1-C6알킬, C2-C6알케닐, C2-C6알키닐, C3-C8시클로알킬, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 또는 디-C1-C6알킬아미노이고, Rs6은 임의적으로 할로, 히드록실, COOH, C(O)O-C1-C6알킬, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 및 디-C1-C6알킬아미노로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환되거나; 또는 R7 및 R8은 그들이 부착된 N 원자와 함께, 0 내지 2개의 추가의 헤테로원자를 가지는 4 내지 11원 헤테로시클로알킬 고리를 형성하거나, 또는 R7 및 R8은 그들이 부착된 C 원자와 함께, C3-C8 시클로알킬 또는 1 내지 3개의 헤테로원자를 가지는 4 내지 11원 헤테로시클로알킬 고리를 형성하고, R7 및 R8에 의해 형성된 각각의 4 내지 11원 헤테로시클로알킬 고리 또는 C3-C8시클로알킬은 임의적으로 하나 이상의 -Q6-T6으로 치환되고, 여기서, Q6은 결합, C(O), C(O)NRm, NRmC(O), S(O)2, 또는 C1-C3알킬 링커이고(Rm은 H 또는 C1-C6알킬이다), T6은 H, 할로, C1-C6알킬, 히드록실, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 5 또는 6원 헤테로아릴, 또는 S(O)pRp이고(여기서, p는 0, 1, 또는 2이고, Rp는 C1-C6알킬, C2-C6알케닐, C2-C6알키닐, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 또는 5 또는 6원 헤테로아릴이다), T6은 임의적으로 할로, C1-C6알킬, 히드록실, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 및 5 또는 6원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환되되, 단, T6이 H, 할로, 히드록실, 또는 시아노일 때를 예외로 하거나; 또는 -Q6-T6는 옥소이고;
R14는 존재하지 않거나, H, 또는 임의적으로 할로, 히드록실, COOH, C(O)O-C1-C6알킬, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 및 5 또는 6원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환된 C1-C6알킬이다.
화학식 II의 화합물의 한 서브세트는 하기 화학식 IIa의 것을 포함한다:
Figure 112021068876035-pat00064
화학식 II의 화합물의 또 다른 서브세트는 하기 화학식 IIb, IIc, 또는 IId의 것을 포함한다:
Figure 112021068876035-pat00065
Figure 112021068876035-pat00066
또는
Figure 112021068876035-pat00067
화학식 II, IIb, IIc, 및 IId의 화합물은 하기 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
예를 들어, X1은 CR11이고, X2는 CR13이다.
예를 들어, X1은 CR11이고, X2는 N이다.
예를 들어, X1은 N이고, X2는 CR13이다.
예를 들어, X1은 N이고, X2는 N이다.
예를 들어, Z1은 NR7R8이다.
예를 들어, Z1은 CR7R8R14이다.
예를 들어, Z1은 OR7이다.
예를 들어, Z1은 SR7이다.
예를 들어, R6은 하나 이상의 -Q2-T2로 치환된 페닐이다.
예를 들어, R6은 N, O, 및 S로부터 선택되는 1-3개의 추가의 헤테로원자를 함유하고, 임의적으로, 하나 이상의 -Q2-T2로 치환된 5 내지 6원 헤테로아릴이다.
예를 들어, R6은 각각은 임의적으로 하나 이상의 -Q2-T2로 치환된, 피리디닐, 피라졸릴, 피리미디닐, 퀴놀리닐, 테트라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 푸릴, 또는 티에닐이다.
예를 들어, Q2는 결합이다.
예를 들어, Q2는 비치환된 C1-C3알킬 링커이다.
예를 들어, T2는 각각은 임의적으로 하나 이상의 -Q3-T3으로 치환된, C1-C6알킬 또는 C6-C10아릴이다.
예를 들어, T2는 비치환된 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, t-부틸, n-펜틸, s-펜틸 및 n-헥실을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 치환된 직쇄 C1-C6 또는 분지형 C3-C6알킬이다.
예를 들어, T2는 페닐이다.
예를 들어, T2는 할로(예컨대, 불소, 염소, 브롬, 및 요오드)이다.
예를 들어, T2는 임의적으로 하나 이상의 -Q3-T3으로 치환된, 4 내지 7원 헤테로시클로알킬(예컨대, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로-2H-피라닐, 3,6-디히드로-2H-피라닐, 테트라히드로-2H-티오피란, 모르폴리닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐 등)이다.
예를 들어, T2는
Figure 112021068876035-pat00068
이다.
예를 들어, T2는 -NRaRb 또는 -C(O)NRaRb이고, 여기서, 각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 H 또는 C1-C6알킬이거나, 또는 Ra 및 Rb는 그들이 부착된 N 원자와 함께, 임의적으로 하나 이상의 -Q3-T3으로 치환된, 0 또는 1개의 추가의 헤테로원자를 가는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬 고리, C1-C6알킬, 및 4 내지 7원 헤테로시클로알킬 고리를 형성한다.
예를 들어, Q2는 임의적으로 할로 또는 히드록실로 치환된 C1-C3알킬 링커이다.
예를 들어, Q2는 결합 또는 메틸 링커이고, T2는 H, 할로, -ORa, -NRaRb, -(NRaRbRc)+A-, 또는 -S(O)2NRaRb이다.
예를 들어, 각각의 Ra, Rb, 및 Rc는 독립적으로 H, 또는 임의적으로 하나 이상의 -Q3-T3으로 치환된 C1-C6알킬이다.
예를 들어, Ra, Rb, 및 Rc 중 하나는 H이다.
예를 들어, Ra, 및 Rb는 그들이 부착된 N 원자와 함께, 임의적으로 하나 이상의 -Q3-T3으로 치환된, N 원자에 대하여 0 또는 1개의 추가의 헤테로원자를 가지는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬 고리(예컨대, 아제티디닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐 등)를 형성한다.
예를 들어, -Q3-T3은 옥소이다.
예를 들어, T2는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬 또는 C3-C8시클로알킬이고, 하나 이상의 -Q3-T3은 옥소이다.
예를 들어, Q3은 결합 또는 비치환된 또는 치환된 C1-C3알킬 링커이다.
예를 들어, T3은 H, 할로, 4 내지 7원 헤테로시클로알킬, C1-C3알킬, ORd, COORd,-S(O)2Rd, 또는 -NRdRe이다.
예를 들어, Rd 및 Re 중 하나는 H이다.
예를 들어, R7은 -C(O)Rf이다.
예를 들어, R7은 -C(O)Rf이고, 여기서, Rf는 C3-C8시클로알킬이다.
예를 들어, R7은 하나 이상의 -Q5-T5로 치환된 C6-C10아릴이다.
예를 들어, R7은 임의적으로 하나 이상의 -Q5-T5로 치환된 페닐이다.
예를 들어, R7은 임의적으로 하나 이상의 -Q5-T5로 치환된 C1-C6알킬이다.
예를 들어, R7은 임의적으로 하나 이상의 -Q5-T5로 치환된 C3-C8시클로알킬이다.
예를 들어, R7은 임의적으로 하나 이상의 -Q5-T5로 치환된, 4 내지 7원 헤테로시클로알킬(예컨대, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로-2H-피라닐, 3,6-디히드로-2H-피라닐, 테트라히드로-2H-티오피란, 및 모르폴리닐 등)이다.
예를 들어, R7은 임의적으로 하나 이상의 -Q5-T5로 치환된, 5 내지 6원 헤테로시클로알킬이다.
예를 들어, R7은 이소프로필이다.
예를 들어, R7은 각각은 임의적으로 하나 이상의 -Q5-T5로 치환된, 피롤리디닐, 피페리디닐, 테트라히드로피란, 테트라히드로-2H-티오피라닐, 시클로펜틸, 또는 시클로헥실, 시클로헵틸이다.
예를 들어, R7은 각각은 임의적으로 하나 이상의 -Q5-T5로 치환된, 시클로펜틸 시클로헥실 또는 테트라히드로-2H-티오피라닐이다.
예를 들어, 하나 이상의 -Q5-T5는 옥소이다.
예를 들어, R7은 1-옥시드-테트라히드로-2H-티오피라닐 또는 1,1-디옥시드-테트라히드로-2H-티오피라닐이다.
예를 들어, Q5는 결합이고, T5는 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노이다.
예를 들어, Q5는 NHC(O)이고, T5는 C1-C6알킬 또는 C1-C6알콕시이다.
예를 들어, T4는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬 또는 C3-C8시클로알킬이고, 하나 이상의 -Q5-T5는 옥소이다.
예를 들어, T5는 H, 할로, C1-C6알킬, C1-C6알콕실, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬이다.
예를 들어, Q5는 결합이고, T5는 C1-C6알킬, C3-C8시클로알킬, 또는 4 내지 7원 헤테로시클로 알킬이다.
예를 들어, Q5는 CO, S(O)2, 또는 NHC(O)이고; T5는 C1-C6알킬, C1-C6알콕실, C3-C8시클로알킬, 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬이다.
예를 들어, T5는 각각은 임의적으로 각각은 임의적으로 할로, 히드록실, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, 또는 C3-C8시클로알킬로 치환된, C1-C6알킬 또는 C1-C6알콕실이다.
예를 들어, Q5는 C1-C3알킬 링커이고, T5는 H 또는 C6-C10아릴이다.
예를 들어, Q5는 C1-C3알킬 링커이고, T5는 C3-C8시클로알킬, 4 내지 7원 헤테로시클로알킬, 또는 S(O)qRq이다.
예를 들어, R11은 H이다.
예를 들어, 각각의 R2 및 R4는 독립적으로 H, 또는 임의적으로 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, 또는 C6-C10아릴로 치환된 C1-C6알킬이다.
예를 들어, 각각의 R2 및 R4는 독립적으로 임의적으로 C1-C6알콕실로 치환된 C1-C3알킬이다.
예를 들어, 각각의 R2 및 R4는 메틸이다.
예를 들어, R1은 H이다.
예를 들어, R12는 H, 메틸, 에틸, 에테닐, 또는 할로이다.
예를 들어, R12는 메틸이다.
예를 들어, R12는 에틸이다.
예를 들어, R12는 에테닐이다.
예를 들어, R8은 H, 메틸, 에틸, 또는 에테닐이다.
예를 들어, R8은 메틸이다.
예를 들어, R8은 에틸이다.
예를 들어, R8은 4 내지 7원 헤테로시클로알킬(예컨대, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로-2H-피라닐, 3,6-디히드로-2H-피라닐, 테트라히드로-2H-티오피란, 모르폴리닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐 등)이다.
예를 들어, R8은 테트라히드로피란이다.
예를 들어, R8은 테트라히드로피란이고, R7은 -Q4-T4이고, 여기서, Q4는 결합 또는 C1-C4알킬 링커이고, T4는 H, C1-C6알킬, C3-C8시클로알킬 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬이다.
예를 들어, Z1은 NR7R8 또는 CR7R8R14이고, 여기서, R7 및 R8은 그들이 부착된 원자와 함께, 각각은 임의적으로 하나 이상의 -Q6-T6으로 치환된, 1 내지 3개의 헤테로원자를 가지는 4 내지 11원 헤테로시클로알킬 고리(예컨대, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로-2H-피라닐, 3,6-디히드로-2H-피라닐, 테트라히드로-2H-티오피란, 및 모르폴리닐 등) 또는 C3-C8시클로알킬을 형성한다.
예를 들어, R7 및 R8에 의해 형성된 고리는, 각각은 임의적으로 하나의 -Q6-T6로 치환된, 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 모르폴리닐, 피페라지닐, 및 시클로헥세닐로 이루어진 군으로부터 선택된다 .
예를 들어, -Q6-T6은 옥소이다.
예를 들어, T6은 H, 할로, C1-C6알킬, C1-C6알콕실, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬이다.
예를 들어, Q6은 결합이고, T6은 C1-C6알킬, C3-C8시클로알킬, 또는 4 내지 7원 헤테로시클로 알킬이다.
예를 들어, Q6은 CO, S(O)2, 또는 NHC(O)이고; T6은 C1-C6알킬, C1-C6알콕실, C3-C8시클로알킬, 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬이다.
예를 들어, T6은 각각은 임의적으로 할로, 히드록실, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, 또는 C3-C8시클로알킬로 치환된, C1-C6알킬 또는 C1-C6알콕실이다.
예를 들어, Q6은 C1-C3알킬 링커이고, T6은 H 또는 C6-C10아릴이다.
예를 들어, Q6은 C1-C3알킬 링커이고, T6은 C3-C8시클로알킬, 4 내지 7원 헤테로시클로알킬, 또는 S(O)pRp이다.
예를 들어, 각각의 Rp 및 Rq는 독립적으로 C1-C6알킬이다.
예를 들어, R13은 H 또는 메틸이다.
예를 들어, R13은 H이다.
예를 들어, R3은 H이다.
예를 들어, A-는 Br-이다.
예를 들어, 각각의 R5, R9, 및 R10은 H이다.
화학식 II의 화합물의 또 다른 서브세트는 하기 화학식 IIe의 것을 포함한다:
Figure 112021068876035-pat00069
화학식 IIe의 화합물은 하기 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
예를 들어, 각각의 Ra 및 Rb는 독립적으로 H, 또는 임의적으로 하나 이상의 임의적으로 하나 이상의 -Q3-T3으로 치환된 C1-C6알킬이다.
예를 들어, 각각의 Ra 및 Rb는 H이다.
예를 들어, Ra 및 Rb는 그들이 부착된 N 원자와 함께, 임의적으로 하나 이상의 -Q3-T3으로 치환된, N 원자에 대하여 0 또는 1개의 추가의 헤테로원자를 가지는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬 고리(예컨대, 아제티디닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐 등)를 형성한다.
예를 들어, Ra, 및 Rb는 그들이 부착된 N 원자와 함께, 임의적으로 하나 이상의 -Q3-T3으로 치환된, 아제티디닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 또는 모르폴리닐을 형성한다.
예를 들어, 하나 이상의 -Q3-T3은 옥소이다.
예를 들어, Q3은 결합 또는 비치환된 또는 치환된 C1-C3알킬 링커이다.
예를 들어, T3은 H, 할로, 4 내지 7원 헤테로시클로알킬, C1-C3알킬, ORd, COORd,-S(O)2Rd, 또는 -NRdRe이다.
예를 들어, Rd 및 Re 중 하나는 H이다.
예를 들어, R7은 각각은 임의적으로 하나 이상의 -Q5-T5로 치환된, C3-C8 시클로알킬 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬이다.
예를 들어, R7은 각각은 임의적으로 하나 이상의 -Q5-T5로 치환된, 피페리디닐, 테트라히드로피란, 테트라히드로-2H-티오피라닐, 시클로펜틸, 시클로헥실, 피롤리디닐, 또는 시클로헵틸이다.
예를 들어, R7은 각각은 임의적으로 하나 이상의 -Q5-T5로 치환된, 시클로펜틸, 시클로헥실 또는 테트라히드로-2H-티오피라닐이다.
예를 들어, Q5는 NHC(O)이고, T5는 C1-C6알킬 또는 C1-C6알콕시이다.
예를 들어, 하나 이상의 -Q5-T5는 옥소이다.
예를 들어, R7은 1-옥시드-테트라히드로-2H-티오피라닐 또는 1,1-디옥시드-테트라히드로-2H-티오피라닐이다.
예를 들어, Q5는 결합이고, T5는 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노이다.
예를 들어, Q5는 CO, S(O)2, 또는 NHC(O)이고; T5는 C1-C6알킬, C1-C6알콕실, C3-C8시클로알킬, 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬이다.
예를 들어, R8은 H, 메틸, 또는 에틸이다.
본 발명의 방법에서 사용하는 데 적합한 화합물은 하기 화학식 III의 화합물, 또는 제약상 허용되는 염 또는 에스테르를 포함한다:
Figure 112021068876035-pat00070
.
화학식 III에서,
X1'은 N 또는 CR11'이고;
X2'는 N 또는 CR13'이고;
X3은 N 또는 C이고, X3이 N일 때, R6'은 존재하지 않고;
Z2는 NR7'R8', OR7', S(O)a'R7', 또는 CR7'R8'R14', 여기서, a'는 0, 1, 또는 2이고;
각각의 R1', R5', R9', 및 R10'은 독립적으로 H, 또는 임의적으로 할로, 히드록실, COOH, C(O)O-C1-C6알킬, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 및 5 또는 6원 헤테로아릴이고;
각각의 R2', R3', 및 R4'는 독립적으로 -Q1'-T1'이고, 여기서, Q1'은 결합, 또는 임의적으로 할로, 시아노, 히드록실 또는 C1-C6알콕시로 치환된 C1-C3알킬 링커이고, 및 T1'은 H, 할로, 히드록실, COOH, 시아노, 아지도, 또는 Rs1'이고, 여기서, Rs1'은 C1-C3알킬, C2-C6알케닐, C2-C6알키닐, C1-C6알콕실, C(O)O-C1-C6알킬, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 또는 5 또는 6원 헤테로아릴이고, Rs1'은 임의적으로 할로, 히드록실, 옥소, COOH, C(O)O-C1-C6알킬, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, C3-C8시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 및 5 또는 6원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환되고;
R6'은 H, 할로, 시아노, 아지도, ORa', -NRa'Rb', -C(O)Ra', -C(O)ORa', -C(O)NRa'Rb', -NRb'C(O)Ra', -S(O)b'Ra', -S(O)b'NRa'Rb', 또는 RS2'이고, 여기서, RS2'는 C1-C6알킬, C2-C6알케닐, C2-C6알키닐, C3-C8시클로알킬, 또는 4 내지 12원 헤테로시클로알킬이고, b'는 0, 1, 또는 2이고, 각각의 Ra' 및 Rb'는 독립적으로 H 또는 Rs3'이고, Rs3'은 C1-C6알킬, C2-C6알케닐, C2-C6알키닐, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 또는 5 또는 6원 헤테로아릴이거나; 또는 Ra' 및 Rb'는 그들이 부착된 N 원자와 함께, 0 또는 1개의 추가의 헤테로원자를 가지는 4 내지 12원 헤테로시클로알킬 고리를 형성하고; 각각의 RS2', RS3' 및 Ra' 및 Rb'에 형성된 4 내지 12원 헤테로시클로알킬 고리는 임의적으로 하나 이상의 -Q2'-T2'로 치환되고, 여기서, Q2'는 결합, 또는 각각 임의적으로 할로, 시아노, 히드록실 또는 C1-C6알콕시로 치환된 C1-C3 알킬 링커이고, T2'는 H, 할로, 시아노, -ORc', -NRc'Rd', -C(O)NRc'Rd', -NRd'C(O)Rc', -NRd'C(O)ORc', -S(O)2Rc', -S(O)2NRc'Rd', 또는 Rs4'이고, 여기서, 각각의 Rc' 및 Rd'는 독립적으로 H 또는 Rs5'이고, 각각의 Rs4' 및 Rs5'는 독립적으로 C1-C6알킬, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 또는 5 또는 6원 헤테로아릴이거나, 또는 Rc' 및 Rd'는 그들이 부착된 N 원자와 함께, 0 또는 1개의 추가의 헤테로원자를 가지는 4 내지 12원 헤테로시클로알킬 고리를 형성하고, 각각의 Rs4', Rs5', 및 Rc' 및 Rd'에 의해 형성된 4 내지 12원 헤테로시클로알킬 고리는 임의적으로 하나 이상의 -Q3'-T3'으로 치환되고, 여기서, Q3'은 결합 또는 각각은 임의적으로 할로, 시아노, 히드록실 또는 C1-C6알콕시로 치환된 C1-C3알킬 링커이고, T3'은 할로, 시아노, C1-C6알킬, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 5 또는 6원 헤테로아릴, ORe' , COORe', -S(O)2Re' , -NRe'Rf', 및 -C(O)NRe'Rf'로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각의 Re' 및 Rf'는 독립적으로 H 또는 C1-C6알킬이거나, 또는 -Q3'-T3'은 옥소이거나; -Q2'-T2'는 옥소이되 단, -Q2'-T2'는 H가 아니고;
R7'은 -Q4'-T4'이고, 여기서, Q4'는 결합, C1-C4알킬 링커, 또는 C2-C4알케닐 링커이고, 각각의 링커는 임의적으로 할로, 시아노, 히드록실 또는 C1-C6알콕시로 치환되고, T4'는 H, 할로, 시아노, NRg'Rh', -ORg', -C(O)Rg', -C(O)ORg', -C(O)NRg'Rh', -C(O)NRg'ORh' , -NRg'C(O)Rh', -S(O)2Rg', 또는 Rs6'이고, 여기서, 각각의 Rg' 및 Rh'는 독립적으로 H 또는 Rs7'이고, 각각의 Rs6' 및 Rs7'은 독립적으로 C1-C6알킬, C2-C6알케닐, C2-C6알키닐, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 또는 5 또는 6원 헤테로아릴이고, 각각의 Rs6' 및 Rs7'은 임의적으로 하나 이상의 -Q5'-T5'로 치환되고, 여기서, Q5'는 결합, C(O), C(O)NRk' , NRk'C(O), S(O)2, 또는 C1-C3알킬 링커이고(Rk'는 H 또는 C1-C6알킬이다), T5'는 H, 할로, C1-C6알킬, 히드록실, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 5 또는 6원 헤테로아릴, 또는 S(O)q'Rq'이고, 여기서, q'는 0, 1, 또는 2이고, Rq'는 C1-C6알킬, C2-C6알케닐, C2-C6알키닐, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 또는 5 또는 6원 헤테로아릴이고, T5'는 임의적으로 할로, C1-C6알킬, 히드록실, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 및 5 또는 6원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환되되, 단, T5가 H, 할로, 히드록실, 또는 시아노일 때를 예외로 하거나; 또는 -Q5'-T5'는 옥소이되; 단, R7'은 H가 아니고;
각각의 R8', R11', R12', 및 R13'은 독립적으로 H, 할로, 히드록실, COOH, 시아노, Rs8', ORs8' 또는 COORs8'이고, 여기서, Rs8'은 C1-C6알킬, C2-C6알케닐, C2-C6알키닐, C3-C8시클로알킬, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 또는 디-C1-C6알킬아미노이고, Rs8'은 임의적으로 할로, 히드록실, COOH, C(O)O-C1-C6알킬, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 및 디-C1-C6알킬아미노로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환되거나; 또는 R7' 및 R8'은 그들이 부착된 N 원자와 함께, 0 내지 2개의 추가의 헤테로원자를 가지는 4 내지 12원 헤테로시클로알킬 고리를 형성하거나, R7' 및 R8'은 그들이 부착된 C 원자와 함께, C3-C8시클로알킬 또는 1 내지 3개의 헤테로원자를 가지는 4 내지 12원 헤테로시클로알킬 고리를 형성하고, R7' 및 R8'에 의해 형성된 각각의 4 내지 12원 헤테로시클로알킬 고리 또는 C3-C8시클로알킬은 임의적으로 하나 이상의 -Q6'-T6'으로 치환되고, 여기서, Q6' 결합, C(O), C(O)NRm' , NRm'C(O), S(O)2, 또는 C1-C3알킬 링커이고(Rm'은 H 또는 C1-C6알킬이다), T6'은 H, 할로, C1-C6알킬, 히드록실, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, C3-C8시클로알킬, C6-C10 아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 5 또는 6원 헤테로아릴, 또는 S(O)p'Rp'이고, 여기서, p'는 0, 1, 또는 2이고, Rp'는 C1-C6알킬, C2-C6알케닐, C2-C6알키닐, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 또는 5 또는 6원 헤테로아릴이고, T6'은 임의적으로 할로, C1-C6알킬, 히드록실, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 디-C1-C6 알킬아미노, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 및 5 또는 6원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환되되, T6'이 H, 할로, 히드록실, 또는 시아노일 때를 예외로 하거나; 또는 -Q6'-T6'는 옥소이고;
R14'는 존재하지 않거나, H, 또는 임의적으로 할로, 히드록실, COOH, C(O)O-C1-C6알킬, 시아노, C1-C6알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 디-C1-C6알킬아미노, C3-C8시클로알킬, C6-C10아릴, 4 내지 12원 헤테로시클로알킬, 및 5 또는 6원 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환된 C1-C6알킬이다.
화학식 III의 화합물의 한 서브세트는 하기 화학식 IIIa의 것을 포함한다:
Figure 112021068876035-pat00071
화학식 III의 화합물의 또 다른 서브세트는 하기 화학식 IIIb, IIc, 또는 IId의 것을 포함한다:
Figure 112021068876035-pat00072
Figure 112021068876035-pat00073
또는
Figure 112021068876035-pat00074
화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc, 및 IIId의 화합물은 하기 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
예를 들어, 화학식 III의 화합물은 하기 화합물은 아니다:
N-(5-(((4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸)카바모일)-2-메틸페닐)푸란-2-카복스아미드,
N,N'-(5-(((4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸)카바모일)-1,3-페닐렌)디아세트아미드,
N-((4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸)-3-피발아미도벤즈아미드,
3-(3,4-디히드로-2H-벤조[b][1,4]디옥세핀-7-술폰아미도)-N-((4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸)벤즈아미드,
N-((4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸)-3,5-디메톡시벤즈아미드,
N-((4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸)-3,4,5-트리메톡시벤즈아미드,
3-알릴-N-((4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸)-4,5-디메톡시벤즈아미드,
4-(2-아미노-2-옥소에톡시)-3-클로로-N-((4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸)-5-메톡시벤즈아미드,
3-클로로-N-((4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸)-4-히드록시-5-메톡시벤즈아미드, 또는
3-브로모-N-((4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸)-5-메톡시-4-프로폭시벤즈아미드.
예를 들어, X1'은 CR11'이고, X2'는 CR13'이다.
예를 들어, X1'은 CR11이고, X2'는 N이다.
예를 들어, X1'은 N이고, X2'는 CR13'이다.
예를 들어, X1'은 N이고, X2'는 N이다.
예를 들어, X3은 C이다.
예를 들어, X3은 N이고, R6'은 존재하지 않는다.
예를 들어, Z2는 NR7'R8'이다.
예를 들어, Z2는 CR7'R8'R14'이다.
예를 들어, Z2는 OR7'이다.
예를 들어, Z2는 S(O)a'R7'이고, 여기서, a'는 0, 1, 또는 2이다.
예를 들어, R6'은 H이다.
예를 들어, R6'은 할로(예컨대, 불소, 염소, 브롬, 및 요오드)이다.
예를 들어, R6'은 임의적으로 하나 이상의 -Q2'-T2'로 치환된 C1-C3알킬이다.
예를 들어, R6'은 CF3이다.
예를 들어, R6'은 각각은 임의적으로 하나 이상의 -Q2'-T2'로 치환된 C2-C6알케닐, C2-C6알키닐, 또는 C3-C6시클로알킬이다.
예를 들어, R6'은 에테닐이다.
예를 들어, R6'은 에티닐이다.
예를 들어, R6'은 하나 이상의 -Q2'-T2'로 치환된 에티닐이고, 여기서, Q2'는 결합 또는 C1-C3알킬 링커이고, T2'는 임의적으로 하나 이상의 -Q3'-T3'으로 치환된, C1-C6알킬, C3-C6시클로알킬, 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬(예컨대, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로-2H-피라닐, 3,6-디히드로-2H-피라닐, 테트라히드로-2H-티오피라닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 및 모르폴리닐 등)이다.
예를 들어, R6'은 시아노이다.
예를 들어, R6'은 아지도이다.
예를 들어, R6'은 C(O)H이다.
예를 들어, R6'은 ORa' 또는 -C(O)Ra'이다.
예를 들어, Ra'는 임의적으로 하나 이상의 -Q2'-T2'로 치환된, C1-C6알킬 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬(예컨대, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로-2H-피라닐, 3,6-디히드로-2H-피라닐, 테트라히드로-2H-티오피라닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 및 모르폴리닐 등)이다.
예를 들어, R6'은 임의적으로 하나 이상의 -Q2'-T2'로 치환된, 4 내지 7원 헤테로시클로알킬(예컨대, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로-2H-피라닐, 3,6-디히드로-2H-피라닐, 테트라히드로-2H-티오피라닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 및 모르폴리닐 등)이다.
예를 들어, R6'은 이들 각각은 임의적으로 하나 이상의 -Q2'-T2'로 치환된, 피페리디닐, 2,2,6,6-테트라메틸-피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 2,2,6,6-테트라메틸-1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 테트라히드로-2H-피라닐, 3,6-디히드로-2H-피라닐, 또는 피롤리디닐이다.
예를 들어, R6'은 임의적으로 하나 이상의 -Q2'-T2'로 치환된, 4 내지 7원 헤테로시클로알킬이고, -Q2'-T2'는 옥소이거나, Q2'는 결합이고, T2는 이들 각각은 Rc' 또는 Rd'가 H가 아닐 때, 임의적으로 하나 이상의 -Q3'-T3'으로 치환된, -ORc', -NRc'Rd', -C(O)Rc', -C(O)ORc', -S(O)2Rc', C1-C6알킬, 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬이다.
예를 들어, R6'은 -NRa'Rb', -C(O)Ra', -C(O)ORa', -C(O)NRa'Rb', -NRb'C(O)Ra', -SRa', -S(O)2Ra', 또는 -S(O)2NRa'Rb'이다.
예를 들어, 각각의 Ra' 및 Rb'는 독립적으로 H, 임의적으로 하나 이상의 -Q2'-T2'로 치환된, C1-C6알킬, 또는 C3-C8 시클로알킬이다.
예를 들어, Ra' 및 Rb' 중 하나는 H이다.
예를 들어, Ra' 및 Rb'는 그들이 부착된 N 원자와 함께, 임의적으로 하나 이상의 -Q2'-T2'로 치환된, N 원자에 대하여 0 또는 1개의 추가의 헤테로원자를 가지는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬 고리(예컨대, 아제티디닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 및 모르폴리닐 등)를 형성한다.
예를 들어, -Q2'-T2'는 옥소이다.
예를 들어, Q2'는 결합이다.
예를 들어, Q2'는 비치환된 C1-C3알킬 링커이다.
예를 들어, T2'는 각각은 임의적으로 하나 이상의 -Q3'-T3'으로 치환된, C1-C6알킬 또는 C6-C10 아릴이다.
예를 들어, T2'는 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, t-부틸, n-펜틸, s-펜틸 및 n-헥실을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 비치환된 치환된 직쇄 C1-C6 또는 분지형 C3-C6알킬이다.
예를 들어, T2'는 페닐이다.
예를 들어, T2'는 할로(예컨대, 불소, 염소, 브롬, 및 요오드)이다.
예를 들어, T2'는 임의적으로 하나 이상의 -Q3'-T3'으로 치환된, 4 내지 7원 헤테로시클로알킬(예컨대, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로-2H-피라닐, 3,6-디히드로-2H-피라닐, 테트라히드로-2H-티오피라닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 및 모르폴리닐 등)이다.
예를 들어, T2'는 -ORc', -NRc'Rd', -C(O)Rc', -C(O)ORc', 또는 -S(O)2Rc'이다.
예를 들어, Rc'는 임의적으로 하나 이상의 -Q3'-T3'으로 치환된, C1-C6알킬 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬(예컨대, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로-2H-피라닐, 3,6-디히드로-2H-피라닐, 테트라히드로-2H-티오피라닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 및 모르폴리닐 등)이다.
예를 들어, 각각의 Rc' 및 Rd'는 독립적으로 H, 또는 임의적으로 하나 이상의 -Q3'-T3'으로 치환된, C1-C6알킬이다.
예를 들어, Rc'는 H이다.
예를 들어, Rd'는 H이다.
예를 들어, Rc' 및 Rd'는 그들이 부착된 N 원자와 함께, 임의적으로 하나 이상의 -Q3'-T3'으로 치환된, N 원자에 대하여 0 또는 1개의 추가의 헤테로원자를 가지는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬 고리(예컨대, 아제티디닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 및 모르폴리닐 등)를 형성한다.
예를 들어, Q2'는 결합이고, T2'는 이들 각각은 Rc' 또는 Rd'가 H가 아닐 때, 임의적으로 하나 이상의 -Q3'-T3'으로 치환된, -ORc', -NRc'Rd', -C(O)Rc', -C(O)ORc', -S(O)2Rc', C1-C6알킬, 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬이다.
예를 들어, -Q3'-T3'은 옥소이다.
예를 들어, T2'는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬 또는 C3-C8시클로알킬이고, 하나 이상의 -Q3'-T3'은 옥소이다.
예를 들어, Q3'은 결합 또는 비치환된 또는 치환된 C1-C3알킬 링커이다.
예를 들어, T3'은 H, 할로, 4 내지 7원 헤테로시클로알킬, C1-C3알킬, ORe', COORe',-S(O)2Re',-NRe'Rf', 또는 -C(O)NRe'Rf'이다.
예를 들어, Re' 및 Rf' 중 하나는 H이다.
예를 들어, Q3'은 결합 또는 C1-C3알킬 링커이고, T3'은 C1-C3알킬, 할로, ORe', -S(O)2Re', -NRe'Rf', 및 -C(O)NRe'Rf'로 이루어진 군으로부터 선택된다.
예를 들어, Q3'은 결합 또는 1-C3알킬 링커이고, T3'은 C1-C3알킬, ORe', -S(O)2Re', 또는 -NRe'Rf'로 이루어진 군으로부터 선택된다.
예를 들어, Re'는 H이다.
예를 들어, Rf'는 H이다.
예를 들어, R7'은 -C(O)Rg'이다.
예를 들어, R7'은 -C(O)Rg'이고, 여기서, Rg'는 C3-C8시클로알킬, 4 내지 7원 헤테로시클로알킬, C3-C8시클로알킬이다.
예를 들어, R7'은 하나 이상의 -Q5'-T5'로 치환된, C6-C10아릴이다.
예를 들어, R7'은 임의적으로 하나 이상의 -Q5'-T5'로 치환된 페닐이다.
예를 들어, R7'은 임의적으로 하나 이상의 -Q5'-T5'로 치환된 C1-C6알킬이다.
예를 들어, R7'은 임의적으로 하나 이상의 -Q5'-T5'로 치환된, C3-C8시클로알킬이다.
예를 들어, R7'은 임의적으로 하나 이상의 -Q5'-T5'로 치환된, 4 내지 7원 헤테로시클로 알킬(예컨대, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로-2H-피라닐, 3,6-디히드로-2H-피라닐, 테트라히드로-2H-티오피라닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 및 모르폴리닐 등)이다.
예를 들어, R7'은 임의적으로 하나 이상의 -Q5'-T5'로 치환된, 5 내지 6원 헤테로시클로 알킬이다.
예를 들어, R7'은 이소프로필이다.
예를 들어, R7'은 각각은 임의적으로 하나의 -Q5'-T5'로 치환된, 피롤리디닐, 피페리디닐, 테트라히드로피란, 시클로펜틸, 또는 시클로헥실, 시클로헵틸이다.
예를 들어, R7'은 각각은 임의적으로 하나의 -Q5'-T5'로 치환된 시클로펜틸 또는 시클로헥실이다.
예를 들어, Q5'는 NHC(O)이고, T5'는 C1-C6알킬 또는 C1-C6알콕시이다.
예를 들어, -Q5'-T5'는 옥소이다.
예를 들어, T4'는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬, C3-C8시클로알킬, 또는 C6-C10 아릴이고, 하나 이상의 -Q5'-T5'는 옥소이다.
예를 들어, R7'은 1-옥시드-테트라히드로-2H-티오피라닐 또는 1,1-디옥시드-테트라히드로-2H-티오피라닐이다.
예를 들어, R7'은 시클로헥사노닐, 예컨대, 시클로헥사논-4-일이다
예를 들어, T5'는 H, 할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕실, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬이다.
예를 들어, Q5'는 결합이고, T5'는 C1-C6 알킬, C3-C8 시클로알킬, 또는 4 내지 7원 헤테로시클로 알킬이다.
예를 들어, Q5'는 결합이고, T5'는 임의적으로 할로, 히드록실, C1-C6 알콕실, 또는 C3-C8 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환된, 5 또는 6원 헤테로아릴, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 디-C1-C6 알킬아미노이다.
예를 들어, Q5'는 CO, S(O)2, 또는 NHC(O)이고; T5'는 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕실, C3-C8 시클로알킬, 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬이다.
예를 들어, T5'는 각각은 임의적으로 할로, 히드록실, 시아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 디-C1-C6 알킬아미노, 또는 C3-C8 시클로알킬로 치환된, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알콕실이다.
예를 들어, Q5'는 C1-C3알킬 링커이고, T5'는 H 또는 C6-C10 아릴이다.
예를 들어, Q5'는 C1-C3알킬 링커이고, T5'는 C3-C8 시클로알킬, 4 내지 7원 헤테로시클로알킬, 또는 S(O)q'Rq'이다.
예를 들어, R6'은 할로(예컨대, 불소, 염소, 브롬, 및 요오드)이고, Z2는 S(O)a'R7'이고, 여기서, a'는 0, 1, 또는 2이고, R7'은 C1-C6 알킬(예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, 부틸, 또는 t-부틸), C3-C8 시클로알킬(예컨대, 시클로펜틸, 시클로헥실, 또는 시클로헵틸) 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬(예컨대, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로-2H-피라닐, 3,6-디히드로-2H-피라닐, 테트라히드로-2H-티오피라닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 및 모르폴리닐 등)이고, R7'은 임의적으로 하나 이상의 -Q5'-T5'로 치환된다.
예를 들어, R6'은 할로(예컨대, 불소, 염소, 브롬, 및 요오드)이고, Z2는 OR7'이고, 여기서, R7'은 4 내지 7원 헤테로시클로알킬(예컨대, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로-2H-피라닐, 3,6-디히드로-2H-피라닐, 테트라히드로-2H-티오피라닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 및 모르폴리닐 등)이고, R7'은 임의적으로 하나 이상의 -Q5'-T5'로 치환된다.
예를 들어, R11'은 H이다.
예를 들어, 각각의 R2' 및 R4'는 독립적으로 H, 또는 임의적으로 아지도, 할로, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 디-C1-C6 알킬아미노, 또는 C6-C10 아릴로 치환된 C1-C6 알킬이다.
예를 들어, 각각의 R2' 및 R4'는 독립적으로 임의적으로 C1-C6 알콕실로 치환된, C1-C3알킬이다.
예를 들어, 각각의 R2' 및 R4'는 메틸이다.
예를 들어, R1'은 H이다.
예를 들어, R1'은 임의적으로 아지도, 할로, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 디-C1-C6 알킬아미노, 또는 C6-C10 아릴로 치환된 C1-C6 알킬이다.
예를 들어, R12'는 H, 메틸, 에틸, 에테닐, 또는 할로이다.
예를 들어, R12'는 메틸이다.
예를 들어, R12'는 에틸이다.
예를 들어, R12'는 에테닐 또는 프로페닐이다.
예를 들어, R12'는 메톡실이다.
예를 들어, R8'은 H, 메틸, 에틸, 또는 에테닐이다.
예를 들어, R8'은 메틸이다.
예를 들어, R8'은 에틸이다.
예를 들어, R8'은 프로필이다.
예를 들어, R8'은 에테닐 또는 프로페닐이다.
예를 들어, R8'은 할로(예컨대, F, CI, 또는 Br), 히드록실, 또는 C1-C6 알콕실로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환된 C1-C6 알킬이다.
예를 들어, R8'은 임의적으로 치환된 4 내지 7원 헤테로시클로알킬(예컨대, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로-2H-피라닐, 3,6-디히드로-2H-피라닐, 테트라히드로-2H-티오피라닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 및 모르폴리닐 등)이다.
예를 들어, R8'은 피페리디닐이다.
예를 들어, R8'은 임의적으로 치환된 4 내지 7원 헤테로시클로알킬이고, R7'은 -Q4'-T4'이고, 여기서, Q4'는 결합 또는 C1-C4 알킬 링커이고, T4'는 H, C1-C6 알킬, C3-C8 시클로알킬 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬이다.
예를 들어, Z2는 NR7'R8' 또는 CR7'R8'R14'이고, 여기서, R7' 및 R8'은 그들이 부착된 원자와 함께, 각각은 임의적으로 하나 이상의 -Q6'-T6'으로 치환된, 1 내지 3개의 헤테로원자를 가지는 4 내지 11원 헤테로시클로알킬 고리(예컨대, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로-2H-피라닐, 3,6-디히드로-2H-피라닐, 테트라히드로-2H-티오피라닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 모르폴리닐 등) 또는 C3-C8 시클로알킬을 형성한다.
예를 들어, R7' 및 R8'에 의해 형성된 고리는 각각은 임의적으로 하나의 -Q6'-T6'으로 치환된, 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 모르폴리닐, 피페라지닐, 및 시클로헥세닐로 이루어진 군으로부터 선택된다.
예를 들어, -Q6'-T6'은 옥소이다.
예를 들어, T6'은 H, 할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕실, C3-C8 시클로알킬, C6-C10 아릴, 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬이다.
예를 들어, Q6'은 결합이고, T6'은 C1-C6 알킬, C3-C8 시클로알킬, 또는 4 내지 7원 헤테로시클로 알킬이다.
예를 들어, Q6'은 CO, S(O)2, 또는 NHC(O)이고; T6'은 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕실, C3-C8 시클로알킬, 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬이다.
예를 들어, T6'은 각각은 임의적으로 할로, 히드록실, 시아노, C1-C6 알콕실, 아미노, 모노-C1-C6 알킬아미노, 디-C1-C6 알킬아미노, 또는 C3-C8 시클로알킬로 치환된, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알콕실이다.
예를 들어, Q6'은 C1-C3알킬 링커이고, T6'은 H 또는 C6-C10아릴이다.
예를 들어, Q6'은 C1-C3알킬 링커이고, T6'은 C3-C8 시클로알킬, 4 내지 7원 헤테로시클로알킬, 또는 S(O)p'Rp'이다.
예를 들어, 각각의 Rp' 및 Rq'는 독립적으로 C1-C6 알킬이다.
예를 들어, R6'은 -S(O)b'Ra' 또는 아지도이고, 여기서, b'는 0, 1, 또는 2이고, Ra'는 C1-C6 알킬 또는C3-C8 시클로알킬이고; Z2는 NR7'R8'이고, 여기서, R7'은 각각은 임의적으로 하나 이상의 -Q5'-T5'로 치환된, C3-C8 시클로알킬(예컨대, 시클로펜틸, 시클로헥실, 또는 시클로헵틸) 또는 4 내지 7원 헤테로시클로알킬(예컨대, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로-2H-피라닐, 3,6-디히드로-2H-피라닐, 테트라히드로-2H-티오피라닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 및 모르폴리닐 등)이고, R8'은 H 또는 C1-C6킬(예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, 부틸, 또는 t-부틸)이다.
예를 들어, R6'은 할로(예컨대, 불소, 염소, 브롬, 및 요오드)이고, Z2는 NR7'R8' 또는 CR7'R8'R14'이고, 여기서, R7' 및 R8'은 그들이 부착된 원자와 함께, 각각은 임의적으로 하나 이상의 -Q6'-T6'으로 치환된, 1 내지 3개의 헤테로원자를 가지는 4 내지 11원 헤테로시클로알킬 고리(예컨대, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 피페리디닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로-2H-피라닐, 3,6-디히드로-2H-피라닐, 테트라히드로-2H-티오피라닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 모르폴리닐 등) 또는 C3-C8 시클로알킬을 형성한다.
예를 들어, R13'은 H 또는 메틸이다.
예를 들어, R13'은 H이다.
예를 들어, R3'은 H이다.
예를 들어, 각각의 R5', R9', 및 R10'은 H이다.
본 발명의 방법에 적합한 화합물은 2012년 2월 28일 출원된 PCT/US2012/026953; 2011년 4월 13일 출원된 미국 가출원 시리얼 번호 제61/474821호; 2011년 4월 13일 출원된 제61/474825호; 2011년 6월 21일 출원된 제61/499595호; 및 2011년 7월 8일 출원된 제61/505676호(상기 가출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.
본 발명의 EZH2 억제제 화합물의 예가 하기 표 1에 제시되어 있다. 하기 표에서,
Figure 112021068876035-pat00075
은 각각
Figure 112021068876035-pat00076
인 것으로 해석되어야 한다.
Figure 112021068876035-pat00077
Figure 112021068876035-pat00078
Figure 112021068876035-pat00079
Figure 112021068876035-pat00080
Figure 112021068876035-pat00081
Figure 112021068876035-pat00082
Figure 112021068876035-pat00083
Figure 112021068876035-pat00084
Figure 112021068876035-pat00085
Figure 112021068876035-pat00086
Figure 112021068876035-pat00087
Figure 112021068876035-pat00088
Figure 112021068876035-pat00089
Figure 112021068876035-pat00090
Figure 112021068876035-pat00091
Figure 112021068876035-pat00092
Figure 112021068876035-pat00093
Figure 112021068876035-pat00094
Figure 112021068876035-pat00095
Figure 112021068876035-pat00096
Figure 112021068876035-pat00097
Figure 112021068876035-pat00098
달리 명시되지 않는 한, "치환된"이라는 용어는 하나 이상의 정의된 기에 의해 치환된 것을 의미한다. 기가 다수의 대체 기로부터 선택될 수 있는 경우 선택된 기는 동일하거나, 상이할 수 있다.
"독립적으로"라는 용어는 1 초과의 치환기가 다수의 가능한 치환기로부터 선택되는 경우, 이들 치환기 동일하거나, 상이할 수 있다.
"유효량"이란 예를 들어, 연구원 또는 임상의가 추구하고자 하는 조직, 계통, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 약물 또는 제약 제제의 양을 의미한다. 추가로, "치료학상 유효량"이라는 용어는 상기 양을 받지 않은 상응한 피험체와 비교하여 질환, 장애 또는 부작용의 치료, 치유, 예방 또는 호전을 개선시키거나, 질환 또는 장애의 진행 속도를 저속화시키는 임의의 양을 의미한다. 상기 용어는 또한 그의 범주 안에 정상적인 생리학적 기능을 증진시키는 데 효과적인 양을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "알킬," "C1, C2, C3, C4, C5 또는 C6 알킬" 또는 "C1-C6 알킬"은 C1, C2, C3, C4, C5 또는 C6 직쇄(선형) 포화 지방족 탄화수소 기 및 C3, C4, C5 또는 C6 분지형 포화 지방족 탄화수소 기를 포함하는 것으로 한다. 예를 들어, C1-C6 알킬은 C1, C2, C3, C4, C5 및 C6 알킬 기를 포함하는 것으로 한다. 아릴의 예로는 1 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 모이어티, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, t-부틸, n-펜틸, s-펜틸 또는 n-헥실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 직쇄 또는 분지형 알킬은 6개 이하의 탄소 원자를 가지고(예컨대, 직쇄의 경우, C1-C6, 분지쇄의 경우, C3-C6), 또 다른 실시양태에서, 직쇄 또는 분지형 알킬은 4개 이하의 탄소 원자를 가진다.
본원에서 사용되는 바, "시클로알킬"이라는 용어는 3 내지 30개의 탄소 원자(예컨대, C3-C10)를 가지는 포화 또는 불포화 비방향족 탄화수소 단일 고리 또는 다중 고리(예컨대, 융합된, 가교된, 또는 스피로 고리) 시스템을 의미한다. 시클로알킬의 예로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 시클로펜테닐, 시클로헥세닐, 시클로헵테닐, 및 아다만틸을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.달리 언급되지 않는 한, "헤테로시클로알킬"이라는 용어는 하나 이상의 헤테로원자(예컨대, O, N, S, 또는 Se)를 가지는 포화 또는 불포화 비방향족 3-8원 모노시클릭, 7-12원 비시클릭(융합된, 가교된, 또는 스피로 고리), 또는 11-14원 트리시클릭 고리 시스템(융합된, 가교된, 또는 스피로 고리)을 의미한다. 헤테로시클로알킬 기의 예로는 피페리디닐, 피페라지닐, 피롤리디닐, 디옥사닐, 테트라히드로푸라닐, 이소인돌리닐, 인돌리닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라히드로푸라닐, 옥시라닐, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 테트라히드로피라닐, 디히드로피라닐, 피라닐, 모르폴리닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비시클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비시클로[2.2.1]헵타닐 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"임의적으로 치환된 알킬"이라는 용어는 비치환된 알킬, 또는 탄화수소 골격의 하나 이상의 탄소 상의 하나 이상의 수소 원자를 치환하는 지정된 치환기를 가지는 알킬을 의미한다. 상기 치환기로는 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 히드록실, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카복실레이트, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알콕시카보닐, 아미노카보닐, 알킬아미노카보닐, 디알킬아미노카보닐, 알킬티오카보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 아미노(알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노(알킬카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 카바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술프히드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다.
"아릴알킬" 또는 "아르알킬" 모이어티는 아릴로 치환된 알킬이다(예컨대, 페닐메틸(벤질)). "알킬아릴" 모이어티는 알킬로 치환된 아릴이다(예컨대, 메틸페닐).
본원에서 사용되는 바, "알킬 링커"는 C1, C2, C3, C4, C5 또는 C6 직쇄(선형) 포화 2가 지방족 탄화수소 기 및 C3, C4, C5 또는 C6 분지형 포화 지방족 탄화수소 기를 포함하는 것으로 한다. 예를 들어, C1-C6 알킬 링커는 C1, C2, C3, C4, C5 및 C6 알킬 링커기를 포함하는 것으로 한다. 알킬 링커의 예로는 1 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 모이어티, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 메틸(-CH2-), 에틸(-CH2CH2-), n-프로필(-CH2CH2CH2-), i-프로필(-CHCH3CH2-), n-부틸(-CH2CH2CH2CH2-), s-부틸(-CHCH3CH2CH2-), i-부틸 (-C(CH3)2CH2-), n-펜틸(-CH2CH2CH2CH2CH2-), s-펜틸(-CHCH3CH2CH2CH2-) 또는 n-헥실(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)을 포함한다.
"알케닐"은 상기 기술된 알킬과 길이 및 가능한 치환에 있어서는 유사하지만, 1개 이상의 이중 결합을 포함하는, 불포화 지방족 기를 포함한다. 예를 들어, "알케닐"이라는 용어는 직쇄 알케닐 기(예컨대, 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 헵테닐, 옥테닐, 노네닐, 데세닐), 및 분지형 알케닐 기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 직쇄 또는 분지형 알케닐 기는 그의 골격 중에 6개 이하의 탄소 원자를 가진다(예컨대, 직쇄인 경우, C2-C6, 분지쇄인 경우, C3-C6). "C2-C6"이라는 용어는 2 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 알케닐 기를 포함한다. "C3-C6"이라는 용어는 3 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 알케닐 기를 포함한다.
"임의적으로 치환된 알케닐"이라는 용어는 비치환된 알케닐, 또는 하나 이상의 탄화수소 골격의 탄소 원자 상의 하나 이상의 수소 원자를 치환하는 지정된 치환기를 가지는 알케닐을 의미한다. 상기 치환기로는 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 히드록실, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카복실레이트, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알콕시카보닐, 아미노카보닐, 알킬아미노카보닐, 디알킬아미노카보닐, 알킬티오카보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 아미노(알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노(알킬카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 카바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술프히드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 헤테로시클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다.
"알키닐"은 상기 기술된 알킬과 길이 및 가능한 치환에 있어서는 유사하지만, 1개 이상의 삼중 결합을 포함하는, 불포화 지방족 기를 포함한다. 예를 들어, "알키닐"은 직쇄 알키닐 기(예컨대, 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, hexynyl, 헵티닐, 옥티닐, 노니닐, 데시닐), 및 분지형 알키닐 기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 직쇄 또는 분지형 알키닐 기는 그의 골격 중에 6개 이하의 탄소 원자를 가진다(예컨대, 직쇄인 경우, C2-C6, 분지쇄인 경우, C3-C6). "C2-C6"이라는 용어는 2 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 알키닐 기를 포함한다. "C3-C6"이라는 용어는 3 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 알키닐 기를 포함한다.
"임의적으로 치환된 알키닐"이라는 용어는 비치환된 알키닐, 또는 하나 이상의 탄화수소 골격의 탄소 원자 상의 하나 이상의 수소 원자를 치환하는 지정된 치환기를 가지는 알키닐을 의미한다. 상기 치환기로는 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 히드록실, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카복실레이트, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알콕시카보닐, 아미노카보닐, 알킬아미노카보닐, 디알킬아미노카보닐, 알킬티오카보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 아미노(알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노(알킬카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 카바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술프히드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함하 수 있다.
다른 임의적으로 치환된 모이어티(예컨대, 임의적으로 치환된 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴)는 비치환된 모이어티 및 지정된 치환기 중 하나 이상을 가지는 모이어티, 둘 모우를 포함한다. 예를 들어, 치환된 헤테로시클로알킬은 하나 이상의 알킬 기로 치환된 것, 예컨대, 2,2,6,6-테트라메틸-피페리디닐 및 2,2,6,6-테트라메틸-1,2,3,6-테트라히드로피리디닐을 포함한다.
"아릴"은 "컨쥬게이트된" 것을 비롯한, 방향성을 가지거나, 1개 이상의 방향족 고리를 가지는 멀티시클릭 시스템을 포함하고, 고리 구조에는 어떤 헤테로원자도 포함하지 않는다. 그 예로는 페닐, 벤질, 1,2,3,4-테트라히드로나프탈레닐 등을 포함한다.
"헤테로아릴" 기는 상기 정의된 바와 같지만, 예외적으로, 고리 구조에 1 내지 4개의 헤테로원자를 가지는 아릴 기이며, 이는 또한 "아릴 헤테로시클" 또는 "헤테로방향족"으로도 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "헤테로아릴"이라는 용어는 탄소 원자, 및 독립적으로 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자, 예컨대, 1 또는 1-2 또는 1-3 또는 1-4 또는 1-5, 또는 1-6개의 헤테로원자, 또는 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 헤테로원자로 구성된 안정한 5, 6, 또는 7원 모노시클릭 또는 7, 8, 9, 10, 11 또는 12원 비시클릭 방향족 헤테로시클릭 고리를 포함하는 것으로 한다. 질소 원자는 치환될 수 있거나, 또는 치환되지 않을 수 있다(즉, N 또는 NR(여기서, R은 H 또는 정의된 바와 같으 다른 치환기이다)). 질소 및 황 헤테로원자는 임의적으로 산화될 수 있다(즉, N→O 및 S(O)p(여기서, p = 1 또는 2)). 방향족 헤테로시클 중 S 및 O 원자의 총 개수는 1을 초과하지 않는다는 점에 주의한다.
헤테로아릴 기의 예로는 피롤, 푸란, 티오펜, 티아졸, 이소티아졸, 이미다졸, 트리아졸, 테트라졸, 피라졸, 옥사졸, 이속사졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 피리미딘 등을 포함한다.
추가로, "아릴" 및 "헤테로아릴"로는 멀티시클릭 아릴 및 헤테로아릴 기, 예컨대, 트리시클릭, 비시클릭, 예컨대, 나프탈렌, 벤즈옥사졸, 벤조디옥사졸, 벤조티아졸, 벤조이미다졸, 벤조티오펜, 메틸렌디옥시페닐, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 나프티리딘, 인돌, 벤조푸란, 퓨린, 벤조푸란, 데아자퓨린, 인돌리진을 포함한다.
멀티시클릭 방향족 고리인 경우, 고리 모두가 방향족일 수도 있지만(예컨대, 퀴놀린), 고리 중 단 1개만은 반드시 방향족이어야 한다(예컨대, 2,3-디히드로인돌). 제2 고리 또한 융합 또는 가교될 수 있다.
시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리는 하나 이상의 고리 위치(예컨대, 고리 형성 탄소 또는 헤테로원자, 예컨대, N)에서 상기 정의된 바와 같은 치환기, 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 히드록실, 알콕시, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카복실레이트, 알킬카보닐, 알킬아미노카보닐, 아르알킬아미노카보닐, 알케닐아미노카보닐, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 아르알킬카보닐, 알케닐카보닐, 알콕시카보닐, 아미노카보닐, 알킬티오카보닐, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 아미노(알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노(알킬카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 카바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술프히드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티로 치환될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴 기는 또한 멀티시클릭 시스템(예컨대, 테트랄린, 메틸렌디옥시페닐)을 형성하기 위해, 방향족이 아닌 알리시클릭(alicyclic) 또는 헤테로시클릭 고리와 융합되거나, 가교될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "카보시클" 또는 "카보시클릭 고리"는 포화, 불포화, 또는 방향족일 수 있는, 탄소를 명시된 개수 가지는 임의의 안정한 모노시클릭, 비시클릭 또는 트리시클릭 고리를 포함하는 것으로 한다. 카보시클은 시클로알킬 및 아릴을 포함한다. 예를 들어, C3-C4 카보시클은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 탄소 원자를 가지는, 모노시클릭, 비시클릭 또는 트리시클릭 고리를 포함하는 것으로 한다. 카보시클의 예로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로부테닐, 시클로펜틸, 시클로펜테닐, 시클로헥실, 시클로헵테닐, 시클로헵틸, 시클로헵테닐, 아다만틸, 시클로옥틸, 시클로옥테닐, 시클로옥타디에닐, 플루오레닐, 페닐, 나프틸, 인다닐, 아다만틸 및 테트라히드로나프틸을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, [3.3.0]비시클로옥탄, [4.3.0]비시클로노난, [4.4.0]비시클로데칸 및 [2.2.2]비시클로옥탄을 비롯한 가교된 고리 또한 카보시클 정의에 포함된다. 하나 이상의 탄소 원자가 비인접한 2개의 탄소 원자를 연결할 때, 가교된 고리가 생성된다. 한 실시양태에서, 가교 고리는 1 또는 2개의 탄소 원자이다. 가교는 항상 모노시클릭 고리를 트리시클릭 고리로 전환시킨다는 것에 주의한다. 고리가 가교된 고리일 경우, 고리에 대해 언급되는 치환기는 또한 가교 상에 존재할 수 있다. 융합된(예컨대, 나프틸, 테트라히드로나프틸) 및 스피로 고리 또한 포함된다.
본원에서 사용되는 바, "헤테로시클" 또는 "헤테로시클릭 기"는 1개 이상의 고리 헤테로원자(예컨대, N, O 또는 S)를 포함하는 임의의 고리 구조(포화, 불포화, 또는 방향족)를 포함한다. 헤테로시클은 헤테로시클로알킬 및 헤테로아릴을 포함한다. 헤테로시클의 예로는 모르폴린, 피롤리딘, 테트라히드로티오펜, 피페리딘, 피페라진, 옥세탄, 피란, 테트라히드로피란, 아제티딘, 및 테트라히드로푸란을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
헤테로시클릭 기의 예로는 아크리디닐, 아조시닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 벤조티오푸라닐, 벤조티오페닐, 벤즈옥사졸릴, 벤즈옥사졸리닐, 벤즈티아졸릴, 벤즈트리아졸릴, 벤즈테트라졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤즈이소티아졸릴, 벤즈이미다졸리닐, 카바졸릴, 4aH-카바졸릴, 카볼리닐, 크로마닐, 크로메닐, 신놀리닐, 데카히드로퀴놀리닐, 2H,6H-1,5,2-디티아지닐, 디히드로푸로[2,3-b]테트라히드로푸란, 푸라닐, 푸라자닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸릴, 1H-인다졸릴, 인돌레닐, 인돌리닐, 인돌리지닐, 인돌릴, 3H-인돌릴, 이사티노일, 이소벤조푸라닐, 이소크로마닐, 이소인다졸릴, 이소인돌리닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀리닐, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 메틸렌디옥시페닐, 모르폴리닐, 나프티리디닐, 옥타히드로이소퀴놀리닐, 옥사디아졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,2,5-옥사디아졸릴, 1,3,4-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸5(4H)-온, 옥사졸리디닐, 옥사졸릴, 옥신돌릴, 피리미디닐, 페난트리디닐, 페난트롤리닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사티닐, 페녹사지닐, 프탈라지닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 피페리도닐, 4-피페리도닐, 피페로닐, 프테리디닐, 푸리닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리도옥사졸, 피리도이미다졸, 피리도티아졸, 피리디닐, 피리딜, 피리미디닐, 피롤리디닐, 피롤리닐, 2H-피롤릴, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀리닐, 4H-퀴놀리지닐, 퀴녹살리닐, 퀴누클리디닐, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 테트라히드로퀴놀리닐, 테트라졸릴, 6H-1,2,5-티아디아지닐, 1,2,3-티아디아졸릴, 1,2,4-티아디아졸릴, 1,2,5-티아디아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 티안트레닐, 티아졸릴, 티에닐, 티에노티아졸릴, 티에노옥사졸릴, 티에노이미다졸릴, 티오페닐, 트리아지닐, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 1,2,5-트리아졸릴, 1,3,4-트리아졸릴 및 크산테닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "치환된"이라는 용어는 지정된 원자 상의 임의의 하나 이상의 수소 원자가 명시된 기로부터 선택된 기로 대체되되, 단, 지정된 원자의 정규 원자가를 초과하지 않으며, 치환을 통해 안정한 화합물이 생성된다는 것을 의미한다. 치환기가 옥소 또는 케토일 때(즉, =0), 원자 상의 두 수소 원자가 치환된다. 케토 치환기는 방향족 모이어티에는 존재하지 않는다. 본원에서 사용되는 바,고리 이중 결합은 인접한 두 고리 원자 사이에 형성된 이중 결합이다(예컨대, C=C, C=N 또는 N=N). "안정한 화합물" 및 "안정한 구조"란 반응 혼합물로부터 유용할 정도의 순도로 단리시키는 단리 과정, 및 유효한 치료제로 제제화하는 과정을 견뎌낼 수 있을 정도로 충분히 강력한 화합물을 나타낸다는 것을 의미한다.
치환기에의 결합이 고리 중의 두 원자를 연결하는 결합과 교차하는 것으로 나타난 경우, 이때 상기 치환기는 고리 중 임의 원자에 결합될 수 있다. 치환기가 한 원자를 통해 주어진 화학식의 화합물의 나머지 부분에 결합되어 있는 경우, 그 원자를 명시하지 않고 치환기가 열거되어 있다면, 이때 상기 치환기는 상기 화학식 중 임의 원자를 통해 결합될 수 있다. 치환기 및/또는 변수의 조합이 허용되지만, 단, 상기 조합을 통해 안정한 화합물이 생성되는 경우에만 그러하다.
임의의 변수(예컨대, R1)이 화합물에 대한 임의의 구성 요소 또는 화학식에서 1회 초과로 존재하는 경우, 각각의 그의 정의는 모든 다른 경우에서의 그의 정의와는 독립적이다. 따라서, 기가 0-2개의 R1 모이어티로 치환된 것으로 제시되어 있다면, 이때, 상기 기는 임의적으로 최대 2개의 R1 모이어티로 치환될 수 있고, 각각의 R1은 R1의 정의로부터 독립적으로 선택된다. 또한, 치환기 및/또는 변수의 조합이 허용되지만, 단, 상기 조합을 통해 안정한 화합물이 생성되는 경우에만 그러하다.
"히드록시" 또는 "히드록실"이라는 용어는 -OH 또는 -O-를 가지는 기를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "할로" 또는 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 의미한다. "퍼할로겐화된"이라는 용어는, 모든 수소 원자가 할로겐 원자로 치환된 것인 모이어티를 의미한다. "할로알킬" 또는 "할로알콕실"이라는 용어는 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 알킬 또는 알콕실을 의미한다.
"카보닐"이라는 용어는 산소 원자에 이중 결합으로 연결된 탄소를 포함하는 화합물 및 모이어티를 포함한다. 카보닐을 포함하는 모이어티의 예로는 알데히드, 케톤, 카복실산, 아미드, 에스테르, 안히드라이드 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"카복실"이라는 용어는 -COOH 또는 그의 C1-C6 알킬 에스테르를 의미한다.
"아실"은 아실 라디칼(R-C(O)-) 또는 카보닐 기를 포함하는 모이어티를 포함한다. "치환된 아실"은 수소 원자 중 하나 이상의 것이 예를 들어, 알킬 기, 알키닐 기, 할로겐, 히드록실, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카복실레이트, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알콕시카보닐, 아미노카보닐, 알킬아미노카보닐, 디알킬아미노카보닐, 알킬티오카보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 아미노(알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노(알킬카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 카바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술프히드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티로 치환된, 아실 기를 포함한다.
"아로일"은 카보닐 기에 결합된 아릴 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함하는 모이어티를 포함한다. 아로일 기의 예로는 페닐카복시, 나프틸 카복시 등을 포함한다.
"알콕시알킬," "알킬아미노알킬," 및 "티오알콕시알킬"은, 산소, 질소 또는 황이 하나 이상의 탄화수소 골격의 탄소 원자를 치환하는, 상기 기술된 바와 같은 알킬 기를 포함한다.
"알콕시" 또는 "알콕실"이라는 용어는 산소 원자에 공유적으로 결합된 치환된 및 비치환된 알킬, 알케닐 및 알키닐 기를 포함한다. 알콕시 기 또는 알콕실 라디칼의 예로는 메톡시, 에톡시, 이소프로필옥시, 프로폭시, 부톡시 및 펜톡시 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 치환된 알콕시 기의 예로는 할로겐화된 알콕시 기를 포함한다. 알콕시 기는 기, 예컨대, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 히드록실, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카복실레이트, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알콕시카보닐, 아미노카보닐, 알킬아미노카보닐, 디알킬아미노카보닐, 알킬티오카보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 아미노(알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노, 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노(알킬카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 카바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술프히드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티로 치환될 수 있다. 할로겐 치환된 알콕시 기의 예로는 플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 트리플루오로메톡시, 클로로메톡시, 디클로로메톡시 및 트리클로로메톡시를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"에테르" 또는 "알콕시"라는 용어는 2개의 탄소 원자 또는 헤테로원자에 결합된 산소를 포함하는 화합물 또는 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 본 용어는 알킬 기에 공유적으로 결합된 산소 원자에 공유적으로 결합된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 기를 의미하는 "알콕시알킬"을 포함한다.
"에스테르"라는 용어는 카보닐 기의 탄소에 결합된 산소 원자에 결합된 탄소 또는 헤테로원자를 포함하는 화합물 또는 모이어티를 포함한다. "에스테르"라는 용어는 알콕시카복시 기, 예컨대, 메톡시카보닐, 에톡시카보닐, 프로폭시카보닐, 부톡시카보닐, 펜톡시카보닐 등을 포함한다.
"티오알킬"이라는 용어는 황 원자에 연결된 알킬 기를 포함하는 화합물 또는 모이어티를 포함한다. 티오알킬 기는 기, 예컨대, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 히드록실, 알킬카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 알콕시카보닐옥시, 아릴옥시카보닐옥시, 카복실레이트, 카복시산, 알킬카보닐, 아릴카보닐, 알콕시카보닐, 아미노카보닐, 알킬아미노카보닐, 디알킬아미노카보닐, 알킬티오카보닐, 알콕실, 아미노(알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노(알킬카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 카바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술프히드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티로 치환될 수 있다.
"티오카보닐" 또는 "티오카복시"라는 용어는 황 원자에 이중 결합으로 연결된 탄소를 포함하는 화합물 및 모이어티를 포함한다.
"티오에테르"라는 용어는 2개의 탄소 원자 또는 헤테로원자에 결합된 황 원자를 포함하는 모이어티를 포함한다. 티오에테르의 예로는 알크티오알킬, 알크티오알케닐, 및 알크티오알키닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "알크티오알킬"이라는 용어는 알킬 기에 결합된 황 원자에 결합된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 기를 포함하는 모이어티를 포함한다. 유사하게, "알크티오알케닐"이라는 용어는 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기가 알케닐 기에 공유적으로 결합된 황 원자에 결합되어 있는 것인 모이어티를 의미하고; "알크티오알키닐"이라는 용어는 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기가 알키닐 기에 공유적으로 결합된 황 원자에 결합되어 있는 것인 모이어티를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "아민" 또는 "아미노"란 비치환된 또는 치환된 -NH2를 의미한다. "알킬아미노"는 -NH2의 질소가 1개 이상의 알킬 기에 결합되어 있는 것인, 화합물의 기를 포함한다. 알킬아미노 기의 예로는 벤질아미노, 메틸아미노, 에틸아미노, 페네틸아미노 등을 포함한다. "디알킬아미노"는 -NH2의 질소가 2개 이상의 추가의 알킬 기에 결합되어 있는 것인, 기를 포함한다. 디알킬아미노 기의 예로는 디메틸아미노 및 디에틸아미노를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "아릴아미노" 및 "디아릴아미노"는 질소가 각각 1 또는 2개 이상의 아릴 기에 결합되어 있는 것인, 기를 포함한다. "아미노아릴" 및 "아미노아릴옥시"는 아미노로 치환된 아릴 및 아릴옥시를 의미한다. "알킬아릴아미노," "알킬아미노아릴" 또는 "아릴아미노알킬"은 1개 이상의 알킬 기 및 1개 이상의 아릴 기에 결합된 아미노 기를 의미한다. "알크아미노알킬"은 알킬 기에도 결합된 질소 원자에 결합된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 기를 의미한다. "아실아미노"는 질소가 아실 기에 결합되어 있는 기를 포함한다. 아실아미노의 예로는 알킬카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 카바모일 및 우레이도 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"아미드" 또는 "아미노카복시"라는 용어는 카보닐 또는 티오카보닐 기의 탄소에 결합된 질소 원자를 포함하는 화합물 또는 모이어티를 포함한다. 본 용어는 카보닐 또는 티오카보닐 기의 탄소에 결합된 아미노 기에 결합된 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기를 포함하는 "알크아미노카복시" 기를 포함한다. 이는 또한 카보닐 또는 티오카보닐 기의 탄소에 결합된 아미노 기에 결합된 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함하는 "아릴아미노카복시" 기 또한 포함한다. "알킬아미노카복시," "알케닐아미노카복시," "알키닐아미노카복시" 및 "아릴아미노카복시"라는 용어는 알킬, 알케닐, 알키닐 및 아릴 모이어티가 각각 질소 원자에 결합되고, 이는 결국 카보닐 기의 탄소에 결합되어 있는 것인, 모이어티를 포함한다. 아미드는 치환기, 예컨대, 직쇄 알킬, 분지형 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로시클로 치환될 수 있다. 아미드 기 상의 치환기는 추가로 치환될 수 있다.
"임의적으로" 라는 용어는 순차적으로 기술되는 이벤트(들)가 발생할 수 있거나, 또는 발생하지 않을 수 있고, 발생하는 이벤트(들), 및 발생하지 않는 이벤트, 이 둘 모두를 포함한다는 것을 의미한다.
본원에서, "제약상 허용되는 염"이라는 용어는 대상 화합물의 원하는 생물학적 활성을 유지하면서, 바람직하지 못한 독물학상의 효과는 최소로 나타내는 염을 의미한다. 이러한 제약상 허용되는 염은 화합물의 최종의 단리 및 정제 동안 계내에서, 또는 그의 유리산 산 또는 유리 염기 형태의 정제된 화합물을 각각 적합한 염기 또는 산과 따로따로 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "공동 투여하는"이라는 용어 및 그의 파생어는 암이든, 암 또는 암 요법의 부작용이든, 또는 일부 다른 질환이든 간에 그를 치료하기 위해 하나 이상의 추가의 제약상 활성인 화합물을 동시 투여하는 것, 또는 별개로 순차적으로 투여하는 임의 방식을 의미한다. 바람직하게, 투여가 동시 투여가 아닌 경우, 화합물은 시간상 서로 가까운 시점에 투여된다. 추가로, 호합물이 같은 투여 형태로 투여되는지 여부는 중요하지 않고, 예컨대, 한 화합물은 국부적으로 투여될 수 있고, 또 다른 화합물은 경구적으로 투여될 수 있다.
화학식 I-III의 화합물은 화합물 그 자체 뿐만 아니라, 적용가능할 경우, 그의 염, 그의 수화물, 그의 N-옥시드, 및 그의 프로드럭을 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학식 I-III에 따른 화합물은 염을 형성할 수 있을 정도로 충분한 산성을 띠는, 산성 작용기를 포함할 수 있다. 대표적인 염으로는 제약상 허용되는 금속 염, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄 및 아연; 제약상 허용되는 유기 1차, 2차 및 3차 아민, 예를 들어, 지방족 아민, 방향족 아민, 지방족 디아민, 및 히드록시 알킬아민, 예컨대, 메틸아민, 에틸아민, 2-히드록시에틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 및 시클로헥실아민을 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학식 I-III에 따른 화합물은 염기성 작용기를 포함할 수 있고, 따라서, 적합한 산 처리에 의해 제약상 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 적합한 산으로는 제약상 허용되는 무기산 및 제약상 허용되는 유기산을 포함한다. 대표적인 제약상 허용되는 산 부가염으로는 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 니트레이트, 메틸니트레이트, 술페이트, 비술페이트, 술파메이트, 포스페이트, 아세테이트, 히드록시아세테이트, 페닐아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 이소부티레이트, 발레레이트, 말레에이트, 히드록시말레에이트, 아크릴레이트, 푸마레이트, 말레이트, 타르트레이트, 시트레이트, 살리실레이트, p-아미노살리실레이트, 글리콜레이트, 락테이트, 헵타노에이트, 프탈레이트, 옥살레이트, 숙시네이트, 벤조에이트, o-아세톡시벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 만델레이트, 태네이트, 포르메이트, 스테아레이트, 아스코르베이트, 팔미테이트, 올레에이트, 피루베이트, 파모에이트, 말로네이트, 라우레이트, 글루타레이트, 글루타메이트, 에스톨레이트, 메탄술포네이트(메실레이트), 에탄술포네이트(에실레이트), 2-히드록시에탄술포네이트, 벤젠술포네이트(베실레이트), p-아미노벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 및 나프탈렌-2-술포네이트를 포함한다.
질소를 포함하는 본 발명의 화합물은 산화제(예컨대, 3-클로로퍼옥시벤조산(mCPBA) 및/또는 수소 퍼옥시드) 처리로 N-옥시드로 전환될 수 있고, 이로써, 본 발명의 다른 화합물이 수득된다. 따라서, 제시되고, 청구되는 질소 함유 화합물은 모두 원자가 및 구조상 허용된다면, 제시된 화합물 및 그의 N-옥시드 유도체(이는 N→0 또는 N+→0-로 표시될 수 있다), 둘 모두를 포함하는 것으로 간주된다. 추가로, 다른 경우에서, 본 발명의 화합물 중의 질소는 N-히드록시 또는 N-알콕시 화합물로 전환될 수 있다. 예를 들어, N-히드록시 화합물은 산화제, 예컨대, m-CPBA에 의해 모체 아민을 산화시킴으로써 제조될 수 있다. 모든 제시되고, 청구되는 질소 함유 화합물 또한 원자가 및 구조상 허용된다면, 제시된 화합물 및 그의 N-히드록시(즉, N-OH) 및 N-알콕시(즉, N-OR, 여기서, R은 치환된 또는 비치환된 C1-C6 알킬, C1-C6 알케닐, C1-C6 알키닐, 3-14원 카보시클 또는 3-14원 헤테로시클이다) 유도체, 둘 모두를 포함하는 것으로 간주된다.
본 명세서에서, 화합물의 구조식은 일부 경우에는 편의상 특정 이성체를 나타내지만, 본 발명은 모든 이성체, 예컨대, 기하 이성체, 비대칭 탄소에 기초한 광학 이성체, 입체이성체, 호변이성체 등을 포함한다. 추가로, 화학식으로 제시된 화합물에 대하여 결정 다형성이 존재할 수 있다. 임의의 결정 형태, 결정 형태 혼합물, 또는 그의 무수물 또는 수화물도 본 발명의 범주내에 포함된다는 것에 주의한다. 추가로, 생체내에서 본 화합물의 분해에 의해 생산되는 이른바 대사산물이라는 것도 본 발명의 범주내 포함된다.
"이성질현상"은 화합물이 동일한 분자식을 가지지만, 그의 원자 결합 순서에 있어서, 또는 공간내 그의 원자의 배열에 있어서 차이가 나는 것을 의미한다. 공간내 그의 원자의 배열에 있어서 차이가 나는 이성체는 "입체이성체"로 명명된다. 서로 거울상이 아닌 입체이성체는 "부분입체이성체"로 명명되고, 서로 중첩불가능한 거울상인 입체이성체는 "거울상이성체" 또는 때때로 광학 이성체로 명명된다. 반대 키랄성의 개별 거울상이성체 형태를 동량으로 함유하는 혼합물은 "라세믹 혼합물"로 명명된다.
동일하지 않는 4개의 치환기에 결합된 탄소 원자는 "키랄 중심"으로 명명된다.
"키랄 이성체"란 1개 이상의 키랄 중심을 가지는 화합물을 의미한다. 1개 초과의 키랄 중심을 가지는 화합물은 개별 부분입체이성체로서, 또는 "부분입체이성체 혼합물"로 명명되는 부분입체이성체의 혼합물로서 존재할 수 있다. 하나의 키랄 중심이 존재할 때, 입체이성체는 키랄 중심의 절대 배열(R 또는 S)을 특징으로 할 수 있다. 절대 배열이란 키랄 중심에 부착된 치환기의 공간상의 배열을 의미한다. 고려되는 키랄 중심에 부착된 치환기는 [Sequence Rule of Cahn, Ingold and Prelog](문헌 [Cahn et al., Angew. Chem. Inter. Edit. 1966, 5, 385; errata 511]; [Cahn et al., Angew. Chem. 1966, 78, 413]; [Cahn and Ingold, J. Chem. Soc. 1951 (London), 612]; [Cahn et al., Experientia 1956, 12, 81]; [Cahn, J. Chem. Educ. 1964, 41, 116])에 따라 정렬된다.
"기하 이성체"란 이중 결합 또는 시클로알킬 링커(예컨대, 1,3-시클로부틸) 주변의 회전 장애로 인해 존재하게 되는 부분입체이성체를 의미한다. 상기 배열은 기가 칸-인골드-프렐로그(Cahn-Ingold-Prelog)에 따라 이중 결합의 같은편 또는 반대편에 존재하는 것을 나타내는, 접두사 시스 및 트랜스, 또는 Z 및 E에 의해 그의 명칭은 차별화된다.
본 발명의 화합물은 상이한 키랄 이성체 또는 기하 이성체로 도시될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 화합물이 키랄 이성체 또는 기하 이성체 형태를 가질 때, 모든 이성체 형태는 본 발명의 범주내에 포함되는 것으로 하며, 화합물 명명이 이성체 형태를 배제시키는 것은 아니라는 것도 이해하여야 한다.
추가로, 본 발명에서 논의된 구조 및 다른 화합물은 그의 모든 어트로픽(Atropic) 이성체를 포함한다. "어트로픽 이성체"는 두 이성체의 원자가 공간상에서 다르게 배열되어 있는 것인 입체이성체 유형이다. 어트로픽 이성체는 중심 결합 주변의 큰 기의 회전 장애에 의해 유발되는 회전 제약으로 인해 존재하게 되는 것이다. 상기 어트로픽 이성체는 전형적으로는 혼합물로서 존재하지만, 최근 크로마토그래피 기법상의 진보로서 선택된 경우 두 어트로픽 이성체의 혼합물을 분리할 수 있다.
"호변이성체"는 평형 상태로 존재하고, 한 이성체에서 또 다른 것으로 쉽게 전환되는 2개 이상의 구조상의 이성체이다. 이러한 전환을 통해 인접한 컨쥬게이트된 이중 결합의 스위치를 동반하는 수소 원자의 형식적 이동이 이루어진다. 호변이성체는 용액 중에 호변이성체 세트의 혼합물로서 존재한다. 호변이성화가 가능한 용액 중에서, 호변이성체는 화학적 평형에 도달하게 될 것이다. 호변이성체의 정확한 비는 온도, 용매 및 pH를 비롯한, 수개의 인자에 따라 달라진다. 호변이성화에 의해 상호전환가능한 호변이성체 개념은 호변이성으로 명명된다.
가능한 다양한 유형의 호변이성 중, 일반적으로 2가지가 관찰된다. 케토-에놀 호변이성에서, 전자 및 수소 원자의 동시 이동이 이루어진다. 고리-쇄 호변이성은 당 쇄 분자 중의 알데히드 기(-CHO)가 동일 분자의 히드록시 기(-OH)와 반응하여 글루코스로 제시되는 바와 같은 시클릭(고리 형상)을 제공하는 것의 결과로서 발생된다.
일반적인 호변이성체 쌍은 케톤-에놀, 아미드-이트릴, 락탄-락팀, 헤테로시클릭 고리에서 아미드-이미드산 호변이성(예컨대, 뉴클레오염기, 예컨대, 구아닌, 티민 및 시토신에서의 것), 이민-에나민, 및 에나민-에나민이다. 케톤-에놀 평형의 예는 하기 예시되는 바와 같이, 피리딘-2(1H)-온과 상응하는 피리딘-2-올 사이에 존재한다.
Figure 112021068876035-pat00099
본 발명의 화합물은 상이한 호변이성체로 도시될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 화합물이 호변이성체 형태를 가질 때, 그의 혼합물을 비롯한, 모든 호변이성체 형태는 본 발명의 범주내에 포함되는 것으로 하며, 화합물 명명이 호변이성체 형태를 배제시키는 것은 아니라는 것도 이해하여야 한다.
화학식 I-III의 화합물은 결정질 또는 비결정질 형태로 제조될 수 있고, 결정질 형태일 경우, 이는 임의적으로, 예컨대, 수화물로서 수화될 수 있다. 본 발명은 그의 범주내에 화학량론적 용매화물(예컨대, 수화물) 뿐만 아니라, 다양한 양의 용매(예컨대, 물)를 함유하는 화합물을 포함한다.
본원에 기술된 특정 화합물은 하나 이상의 키랄 원자를 함유할 수 있거나, 또는 다르게는 2가지 거울상이성체로서 존재할 수 있다. 하기 청구되는 화합물은 거울상이성체의 혼합물 뿐만 아니라, 정제된 거울상이성체 또는 거울상이성체적으로 강화된 혼합물을 포함한다. 화학식 I-III으로 제시되거나, 또는 하기 청구되는 화합물의 개별 이성체 뿐만 아니라, 그의 임의의 전체적으로 또는 부분적으로 평형화된 혼합물도 또한 본 발명의 범주내에 포함된다. 본 발명은 또한 청구된 화합물의 개별 이성체를 하나 이상의 키랄 중심이 역전된, 그의 이성체와의 혼합물로서 포함한다.
상이한 이성체 형태가 존재할 경우, 이는 종래 방법에 의해 한 이성체를 다른 것으로부터 분리하거나, 분할 수 있거나, 임의의 주어진 이성체는 종래 합성 방법에 의해 또는 입체특이성 또는 비대칭 합성법에 의해 수득할 수 있다.
요법용으로서 화학식 I-III의 화합물 뿐만 아니라, 염, 용매화물, N-옥시드 등은 순수 제제로서 투여될 수 있지만, 즉, 어떤 추가의 담체 없이도 투여가 가능하지만, 더욱 일반적으로는 실행되는 것은 담체 또는 희석제와 함께 조제된 활성 성분을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 추가로 화학식 I-III의 화합물 및 염, 용매화물 등, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 화학식 I-III의 화합물 및 염, 용매화물, N-옥시드 등은 상기 기술된 바와 같다. 담체(들), 희석제, 또는 부형제(들)는 제제 중의 다른 성분과 화합성이고, 그를 받은 수혜자에게 유해하지 않아야 한다는 점에서 허용되어야 하는 것이다. 본 발명의 또 다른 측면에 따라, 화학식 I-III의 화합물, 또는 염, 용매화물, N-옥시드 등을 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 혼합하는 단계를 포함하는, 제약 제제를 제조하는 방법 또한 제공한다.
최종의 탈보호화 단계 이전에 제조될 수 있는, 화학식 I-III의 화합물의 특정의 보호된 유도체는 그 자체로서는 약리학적 활성을 가지지지 않을 수도 있지만, 특정 경우에서, 이는 경구적으로 또는 비경구적으로 투여될 수 있고, 이후, 체내에서 대사되어 약리학상 활성을 띠는 본 발명의 화합물로 형성될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 상기 유도체는 "프로드럭"으로 기술될 수 있다. 추가로, 본 발명의 특정 화합물은 본 발명의 다른 화합물의 프로드럭으로서 작용할 수 있다. 본 발명의 화합물의 모든 보호된 유도체 및 프로드럭은 본 발명의 범주내 포함된다. 관능기가 본 발명의 화합물 내에 존재할 경우, 당업자에게 "프로모이어티"로 공지되어 있는 특정의 모이어티는 적절한 관능기 상에 배치될 수 있다는 것을 당업자는 추가로 이해할 것이다. 본 발명의 화합물에 대하여 바람직한 프로드럭으로는 에스테르, 카보네이트 에스테르, 헤미에스테르, 포스페이트 에스테르, 니트로 에스테르, 술페이트 에스테르, 술폭시드, 아미드, 카바에이트, 아조 화합물, 포스파미드, 글리코시드, 에테르, 아세탈, 및 케탈을 포함한다.
추가로, 본 발명의 화합물, 예를 들어, 화합물의 염은 수화된 또는 비수화된(무수) 형태로, 또는 다른 용매 분자와의 용매화물로서 존재할 수 있다. 수화물의 비제한적인 예로는 일수화물, 이수화물 등을 포함한다. 용매화물의 비제한적인 예로는 에탄올 용매화물, 아세톤 용매화물 등을 포함한다.
"용매화물"이란 용매를 화학량론적 또는 비화학량론적 양으로 함유하는 용매 부가 형태를 의미한다. 일부 화합물은 결정질 고체 상태에서 용매 분자를 고정 몰비롤 포획하는 경향을 가지며, 이로써 용매화물이 형성된다. 용매가 물일 경우, 형성된 용매화물은 수화물이고; 용매가 알콜일 경우, 형성된 용매화물은 알콜레이트이다. 하나 이상의 물 분자를 한 물질 분자와 조합함으로써 수화물이 형성되며, 여기서, 물은 H2O로서 그의 분자 상태를 유지한다.
본원에서 사용되는 바, "유사체"라는 용어는 또 다른 것과 구조상으로는 유사하지만, (한 원자가 다른 원소의 원자로 치환된 경우, 또는 특정 작용기가 존재하에 있는 경우, 또는 한 작용기가 또 다른 작용기로 치환된 경우에서와 같이) 그 조성에 있어서는 약간 상이한 화학 화합물을 의미한다. 따라서, 본 발명의 유사체는 참조 화합물과 구조 또는 기원이 아닌, 기능 및 외관상으로 유사하거나, 비슷하다.
본원에서 정의된 바와 같이, "유도체"라는 용어는 공통된 코어 구조를 가지고, 본원에 기술된 것과 같은 다양한 기로 치환된 화합물을 의미한다. 예를 들어, 화학식 I로 제시된 화합물은 모두 아릴 또는 헤테로아릴 치환된 벤젠 화합물이고, 공통 코어로서 화학식 I을 가진다.
"생물학적 동배체"라는 용어는 원자를, 또는 원자의 기를 광범위하게 유사한 또 다른 원자 또는 원자의 기와 교환함으로써 생성되는 화합물을 의미한다. 생물학적 동배체 치환의 목적은 모체 화합물과 유사한 생물학적 특성을 가지는 신규한 화합물을 제조하고자 하는 것이다. 생물학적 동배성 치환은 물리화학적 또는 위상적 방식에 기반할 수 있다. 카복실산 생물학적 동배체의 예로는 아실 술폰이미드, 테트라졸s, 술포네이트 및 포스포네이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 문헌 [Patani and LaVoie, Chem. Rev. 96, 3147-3176, 1996]을 참조할 수 있다.
본 발명은 본 화합물에 존재하는 원자의 동위원소 모두를 포함하는 것으로 한다. 동위원소는 원자 번호는 같지만, 질량수는 다른 원자를 포함한다. 제한하는 것은 아니지만, 일반적인 예로서, 수소의 동위원소로는 삼중 수소 및 중수소를 포함하고, 탄소의 동위원소로는 C-13 및 C-14를 포함한다.
상기 화합물은 또한 하기 화합물 75, 및 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다:
Figure 112021068876035-pat00100
.
본 발명은 추가로 하기 화합물 75, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물을 포함한다:
Figure 112021068876035-pat00101
.
EZH2 길항제 및 임의적으로 다른 치료제는 그 자체로(순수) 또는 제약상 허용되는 염의 형태로 투여될 수 있다. 의약으로 사용될 때, 염은 제약상 허용가능하여야 하나, 제약상 허용가능하지 않은 염은 그의 제약상 허용되는 염을 제조하는 데 편리하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 유용한 화합물은 제약상 화합성인 카운터이온을 가지는 염(즉, 제약상 허용되는 염)으로서 제공될 수 있다. "제약상 허용되는 염"은 수령인에게 투여시에 화합물 또는 본 발명에 따라 유용한 화합물의 프로드럭을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 임의의 비독성 염을 의미한다. "제약상 허용되는 카운터이온"은 피험체에게 투여시, 염으로부터 유리될 때 비독성인 염의 이온 부분이다. 제약상 화합성인 염은 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산 및 숙신산을 포함하나, 이에 한정되지 않는 많은 산들로 형성될 수 있다. 염은 물 또는 다른 양성자성 용매 중에서 그 염의 상응하는 유리 염기 형태보다 가용성인 더 큰 경향이 있다. 본 발명은 상기 염의 용도를 포함한다.
제약상 허용되는 산 부가 염에는 염산 및 브롬화수소산과 같은 무기 산으로 형성된 염, 및 말산과 같은 유기산으로 형성된 염이 포함된다. 예를 들어, 제약상 허용되는 염을 형성하는 데 통상 이용되는 산에는 이황화수소, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산 및 인산과 같은 무기산, 및 파라-톨루엔술폰산, 살리실산, 타르타르산, 비타르타르산, 아스코르브산, 말레산, 베실산, 푸마르산, 글루콘산, 글루코론산, 포름산, 글루탐산, 메탄술폰산, 에탈술폰산, 벤젠술폰산, 락트산, 옥살산, 파라-브로모페닐술폰산, 카르본산, 숙신산, 시트르산, 벤조산 및 아세트산과 같은 유기산, 및 관련 무기산 및 유기산이 포함된다. 이에 따라 그러한 제약상 허용되는 염으로는 술페이트, 피로술페이트, 비술페이트, 술파이트, 비술파이트, 포스페이트, 모노히드로겐포스페이트, 디히드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피오네이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레에이트, 부틴-1,4-디올레이트, 헥신-1,6-디올레이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 술포네이트, 크실렌술포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-히드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레에이트, 타르트레이트, 메탄술포네이트, 프로판술포네이트, 나프탈렌-1-술포네이트, 나프탈렌-2-술포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.
산성 작용기와 제약상 허용되는 염을 형성하는 데 유용한 적합한 염기로는 나트륨, 칼륨 및 리튬과 같은 알칼리 금속의 수산화물; 칼슘 및 마그네슘과 같은 알칼리 토금속의 수산화물; 알루미늄 및 아연과 같은 다른 금속의 수산화물; 암모니아 및 유기 아민, 예컨대, 비치환 또는 하이드록시 치환 모노, 디, 또는 트리알킬아민; 디시클로헥실아민; 트리부틸 아민; 피리딘; N-메틸, N-에틸아민; 디에틸아민; 트리에틸아민; 모노, 비스, 또는 트리스(2-하이드록시-저급 알킬 아민), 예컨대, 모노, 비스, 또는 트리스(2-하이드록시에틸)아민, 2-하이드록시-tert-부틸아민, 또는 트리스-(하이드록시메틸)메틸아민, N,N-디알킬-N-(하이드록시 알킬)-아민, 예컨대, N,N-디메틸-N-(2-하이드록시에틸)아민, 또는 트리-(2-하이드록시에틸)아민; N-메틸-D-글루카민; 및 아르기닌, 리신 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라 유용한 특정 화합물 및 그의 염은 1 초과의 결정질 형태(즉, 다형성)으로 존재할 수 있고; 본 발명은 각각의 결정질 형태 및 그의 혼합물의 용도를 포함한다.
본 발명에 따라 유용한 특정 화합물은 하나 이상의 키랄 중심을 포함할 수 있고, 상이한 광학 활성 형태로 존재할 수 있다. 본 발명에 따라 유용한 화합물이 하나의 키랄 중심을 포함할 때, 그 화합물은 2개의 거울이성체 형태로 존재하고, 본 발명은 거울이성체 및 거울이성체들의 혼합물, 예컨대, 라세믹 혼합물 모두의 용도를 포함한다. 거울이성체는 당업계의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 분할될 수 있고; 예를 들어, 거울이성체는 예를 들어, 결정화에 의해 분리될 수 있는 부분입체이성체의 형성; 예를 들어, 결정화, 기체-액체 또는 액체 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있는 부분입체이성체 유도체 또는 복합체의 형성; 예를 들어, 효소 에스테르화를 통한, 한 거울이성체의 거울이성체 특이적 시약과의 선택적 반응; 또는 키랄 환경에서, 예를 들어, 키랄 지지체(예를 들어, 결합된 키랄 리간드를 가지는 실리카) 상 또는 키랄 용매의 존재 하에서의 기체-액체 또는 액체 크로마토그래피에 의해 분석될 수 있다. 요망되는 거울이성체가 상술된 분리 절차들 중 하나에 의해 또 다른 화학 실체로 전환되는 경우, 요망되는 정제된 거울이성체를 유리하기 위해 다른 한 단계가 사용될 수 있다. 별법으로, 특정 거울이성체는 광학 활성 시약, 기질, 촉매 또는 용매를 이용한 비대칭 합성에 의해, 또는 비대칭 변형에 의해 한 거울이성체를 다른 한 거울이성체로 전환시킴으로써 합성될 수 있다.
본 발명에 따라 유용한 화합물이 1 초과의 키랄 중심을 포함할 때, 이는 부분입체이성체 형태로 존재할 수 있다. 부분입체이성체 화합물은 당업계의 숙련가에 공지된 방법(예를 들어, 크로마토그래피 또는 결정화)에 의해 분리될 수 있고, 개별 거울이성체는 상술된 바와 같이 분리될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명에 따라 유용한 화합물의 각종 부분입체이성체 및 그의 혼합물의 용도를 포함한다. 본 발명에 따라 유용한 화합물은 상이한 호변이성체 형태로 또는 상이한 기하 이성체로 존재할 수 있고, 본 발명은 본 발명에 따라 유용한 화합물의 각 호변이성체 및 그의 혼합물의 사용을 포함한다. 본 발명에 따라 유용한 화합물은 쯔비터이온 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 본 발명에 따라 유용한 화합물의 각 쯔비터이온 형태 및 그의 혼합물의 용도를 포함한다.
키트
EZH2 길항제는 원하는 경우, EZH2 길항제를 함유하는 하나 이상의 단위 투약 형태를 포함할 수 있는 키트(예를 들어, 팩 또는 디스펜서 장치) 내에 제공될 수 있다. 상기 팩은 예를 들어, 블리스터 팩과 같이, 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여에 대한 설명서를 동반할 수 있다. 화합성 제약 담체 내에 제제화된 본 발명의 EZH2 길항제를 포함하는 조성물이 또한 제조되어, 적절한 용기에 배치되며, 표시된 상태의 치료에 대해 표지될 수 있다. 사용에 대한 설명서가 또한 제공될 수도 있다.
또한, 메틸화된 H3-K27을 검출하는 복수 개의 메틸화 검출 시약을 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 예를 들어, 상기 키트는 모노메틸화된 H3-K27, 디메틸화된 H3-K27 및 트리메틸화된 H3-K27 검출 시약을 포함한다. 검출 시약은 예를 들어, 항체 또는 그의 단편, 폴리펩티드 또는 압타머이다.
키트는 또한 EZH2 돌연변이체 검출 시약, 예컨대, EZH2 핵산 서열의 일부에 상보적인, 상동성 핵산 서열, 예컨대, 올리고뉴클레오티드 서열을 가짐으로써 돌연변이체 EZH2 핵산 서열을 특이적으로 확인할 수 있는 핵산, 또는 키트의 형태로 함께 패키징된 돌연변이체 EZH2 핵산에 의해 코딩된 단백질에 대한 항체를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 EZH2 유전자의 단편일 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 길이는 200, 150, 100, 50, 25, 10개 이하의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 키트는 별도의 용기에 압타머 또는 항체, 대조군 제제(양성 및/또는 음성), 및/또는 검출가능한 표지, 예컨대, 플루오레신, 녹생 형광 단백질, 로다민, 시아닌 염료, 알렉사 염료, 루시퍼라제, 방사성표지를 포함할 수 있다. 검정 수행을 위한 설명서(예를 들어, 서면 작성된 것, 테이프, VCR, CD-ROM 등)이 키트에 포함될 수 있다. 검정은 예를 들어, 당업계에 공지된 바와 같은 웨스턴 블롯 분석, 면역조직화학법(IHC: Immunohistochemistry), 면역형광법(IF: immunofluorescence) 및 질량분석법(MS) 형태의 것일 수 있다.
정의
편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 특허청구범위에 이용된 구체적 용어들이 여기에 집결되어 있다. 본원에 정의되고 사용되어진 모든 정의들은 사전적 정의, 참조로 인용된 문헌 내의 정의, 및/또는 정의된 용어의 일반 의미를 대체한다.
"하나"("a" 및 "an")라는 관사는 관사의 문법상의 목적어 하나 또는 1 초과(즉, 1개 이상)를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 1 초과의 요소를 의미한다.
명세서 및 청구범위에 있어 본원에 사용되는 "및/또는"이란 어구는 이와 같이 연결된 요소들 중 "어느 하나 또는 양자 모두," 즉, 일부의 경우에는 결합되어 존재하거나 다른 경우에는 해체되어 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해하여야 한다. "및/또는"으로 연결된 다중 요소도 동일한 방식으로 간주되어야 하며, 즉, 요소들 중 "하나 이상"이 그와 같이 결합된 것이다. 다른 요소는 구체적으로 규명된 요소들과의 관련 여부와 상관없이 "및/또는"에 의해 구체적으로 규명된 요소 외에 임의적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및/또는 B"란 "포함하는"과 같은 한도가 없는 문구와 함께 사용될 때, 예를 들어, 한 실시양태에서는 A만(B 외의 요소를 임의적으로 포함함); 또 다른 실시양태에서는 B만(A 외의 요소를 임의적으로 포함한다); 또 다른 실시양태에서는 A 및 B 모두(임의적으로 기타 요소를 포함한다); 등을 나타낸다.
명세서 및 청구범위에 있어 본원에 사용되는 "또는"이란 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"와 동일한 의미를 가지는 것으로 이해하도록 한다. 예를 들어, 목록에서 항목들을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포함적인 것으로 해석되어야 것이고, 즉, 다수 또는 목록의 요소들 및 임의적으로는 열거되지 항목들 중 하나 이상, 또한 1 초과를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 그와 명백히 반대되는 단지라는 용어들, 예컨대, "중 단지 하나" 또는 "중 정확히 하나", 또는 청구범위에 사용될 때, "로 구성되는"은 다수 또는 목록의 요소들 중 정확히 하나의 요소만을 포함함을 의미한다. 일반적으로, 본원에 사용되는 "또는"이란 용어는, 배타적 용어, 예컨대, "어느 하나," "중 하나," "중 단지 하나" 또는 "중 정확히 하나"가 선행될 때 단지 배타적 택일(즉, "하나 또는 다른 하나, 단 양자 모두는 아니다")을 나타내는 것으로 해석되어야 한다. "로 본질적으로 이루어진"은 청구범위에 사용될 때, 특허법 분야에 사용되는 통상의 의미를 가져야 한다.
명세서 및 청구범위에 있어 본원에 사용되는, 하나 이상의 요소들의 목록과 관련한 "하나 이상"이란 어구는 요소들의 목록 내 요소들 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 하나 이상의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 하나, 반드시 요소들의 목록 내에 구체적으로 열거된 각 모든 요소들 중 하나 이상을 반드시 포함하는 것은 아니며, 다만 요소들의 목록 내 요소들의 어떠한 조합도 배제하지 않는다. 이 정의는 또한 "하나 이상"이라는 어구가 구체적으로 명시된 상기 요소들과의 관련 여부와 상관없이 지칭하는 요소들의 목록 내에 구체적으로 명시된 요소들 외의 요소도 임의적으로 존재할 수 있게 한다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및 B 중 하나 이상" (또는 이와 균등하게, "A 또는 B 중 하나 이상" 또는 이와 균등하게 "A 및/또는 B 중 하나 이상")은, 한 실시양태에서, 임의적으로는 1 초과를 포함하는 하나 이상의 A를 포함하나 B는 존재하지 않음(또한 임의적으로 B 외의 요소를 포함함); 또 다른 실시양태는 임의적으로는 1 초과를 포함하는 하나 이상의 B를 포함하나 A는 존재하지 않음(또한 임의적으로 A 외의 요소를 포함함); 또 다른 실시양태에서, 임의적으로는 1 초과를 포함하는 하나 이상의 A를 포함하고 임의적으로는 1 초과를 포함하는 하나 이상의 B를 포함함(또한 임의적으로 기타 요소를 포함한다); 등을 지칭할 수 있다.
또한, 반대로 명백히 표시되지 않는 한, 1 초과의 단계 또는 행동을 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서는, 그 방법의 단계 또는 행동의 순서가 그 방법의 단계 또는 행동이 인용되어진 순서에 반드시 제한되는 것은 아님을 이해하여야 한다.
상기 청구범위 및 명세서에서, "포함하는," "내포하는," "지니는," "가지는," "함유하는," "수반하는," "보유하는," "구성된" 등과 같은 모든 이행 어구는 한계가 개방된 것으로, 즉, 포함하되 그 요소들로 국한되지 않는 것으로 이해하도록 한다. 다만 "구성된" 및 "본질적으로 ~로 구성된"은 미국 특허청 특허심사절차 매뉴얼 섹션 2111.03에 나와 있는 바와 같이, 각기 한계가 닫혀 있거나 반정도 닫혀 있는 것으로 이해하도록 한다.
"공동 투여" 및 "공동 투여하는"이란 어구는 치료제가 동시에 어느 정도로 환자 내에 존재하는 한, 동시 투여(2종 또는 그 이상의 치료제를 동시에 투여함) 및 시간 변동 투여(하나 이상의 치료제를 부가적 치료제(들)의 투여 시간과 상이한 시간에 투여함) 모두를 지칭한다.
"전암성 병증" 또는 "전암 병증"은 치료하지 않은 채로 방치할 경우, 암으로 진행될 수 있는, 질환, 증상, 또는 소견을 의미한다. 이는 암의 위험이 유의적으로 증가되어 있는 것과 관련이 있는 전신 병증이다.
본원에 사용되는 바, "치료하는 것"이라는 용어는 질환, 장애 또는 병증의 하나 이상의 증상을 경감시키는 것을 지칭한다. 상기 용어는 상태의 관리 또는 치유를 목적으로, 피험체에게 본원에 기재된 하나 이상의 화합물을 투여 및/또는 적용하는 것을 포괄한다. 본 개시내용의 목적을 위한 "치료"는 반드시는 아니나, 치유를 제공할 수 있고; "치료"는 상태의 관리의 형태의 것일 수 있다. 본원에 기재된 화합물을 사용하여 암을 포함하는 원치 않는 증식 세포를 치료하는 데 사용될 때, "치료"는 정상 세포에 대해서는 최소 파괴 효과를 가지면서 원치 않는 증식 세포의 부분 또는 전체 파괴를 포함한다. 세포내 수준에서의 암 세포를 포함한, 원치 않는 급속 증식 세포의 요망되는 치료 기작은 아포프토시스이다.
본원에 사용되는 바, "예방하는"이라는 용어는 임상적으로 명백환 질환 진행의 개시를 함께 예방하거나 저속화하는 것, 또는 위험에 있는 개체의 질환의 임상전 명백한 단계의 개시를 예방 또는 저속화하는 것을 포함한다. 이는 질환이 발달할 위험에 있는 피험체에 대한 예방적 치료도 포함한다.
치료 목적으로 본원에 사용되는 바, "피험체"라는 용어는 암 또는 전암성 병증 진단을 받았거나, 그의 증상을 가지고 있거나, 그가 발병될 위험에 있는 임의의 인간 피험체를 포함한다. 피험체의 예방 방법에 있어, 피험체는 임의의 인간 피험체이다. 예방의 목적으로 예시하자면, 피험체는 암과 같은, 원치 않는 신속한 세포 증식을 특징으로 하는 장애에 걸릴 위험에 있거나, 그러한 장애에 걸릴 유전적 소인이 있는 인간 피험체일 수 있다. 상기 피험체는 원치 않는 신속한 세포 증식 등을 특징으로 하는 장애에 걸릴 유전적 소인으로 인해 발암성 물질에의 노출에 기인하여 위험에 있을 수 있다.
달리 명시되는 경우를 제외하고는, 재조합 및 합성 폴리펩티드, 융합 단백질, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 핵산 서열의 조작, 형질전환 세포의 생성 등을 위해 표준 방법이 사용될 수 있다. 그러한 기법은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)]; [F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York)]을 참조할 수 있다.
"EZH2 폴리펩티드"라는 용어는 기능적 단편 및 기능적 등가물이 천연 폴리펩티드의 기능적 성질들 중 하나 이상을 보유할 경우, 실질적으로 유사하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열(적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 98% 또는 그 이상의 아미노산 서열 유사성 또는 동일성)을 가지는 상기 것들의 전장의 폴리펩티드의 기능적 단편 및 그의 기능적 등가물을 포괄한다.
"기능적"이란, 폴리펩티드(또는 핵산)가 천연 폴리펩티드 (또는 핵산)의 생물학적 성질들 중 하나 이상에 대해 동일하거나 실질적으로 유사한 활성(예컨대, 천연 폴리펩티드(또는 핵산)의 활성의 적어도 약 50%, 75%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 또는 그 이상)을 가진다는 것을 의미한다.
"조절하다"(및 그의 문법상 등가물)라는 용어는 활성을 증가시키거나 감소시키는 것을 지칭한다. 특정 실시양태에서, "증가시키다" 또는 "증진시키다" (및 그의 문법적 균등어)이라는 용어는 적어도 약 25%, 50%, 75%, 2배, 3배, 5배, 10배, 15배, 20배 또는 그 이상이 상승함을 의미한다. 특정 실시양태에서, "감소" 또는 "감축"(및 그의 문법상 등가물)이라는 용어는 적어도 약 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 그 이상의 감쇠를 의미한다. 일부 실시양태에서, 표시된 활성, 물질 또는 다른 파라미터는 검출가능하지 않다. 구체적으로 EZH2의 길항제가 제공된다.
"약력학적 마커"라는 용어는 약물을 수령한 환자에서 측정될 수 있는 약물 반응의 분자 마커를 지칭한다. 상기 마커는 약물 표적의 조절의 직접적 척도이어야 하고, 용량에 대한 반응의 정량적 변화를 보여줄 수 있어야 한다. EZH2 길항제에 대한 잠재적 약력학적 마커는 질환 또는 대용 조직에서의 히스톤 H3-K27 메틸화의 수준일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "반응성"이라는 용어는 "반응성인," "감수성인", 및 "감수성"이라는 용어들과 상호교환될 수 있으며, 이는 EZH 억제제를 투여받았을 때, 치료학적 반응을 보이는 피험체, 예컨대, 피험체의 종양 세포 또는 종양 조직이 아포프토시스 및/또는 괴사되고/거나, 성장, 분열 또는 증식 감소를 보인다는 것을 의미한다.
"대조군" 또는 "참조"라는 용어는 피험체 유래의 단리된 인접한 비종양 조직에서 검출되거나, 건강한 피험체 유래의 건강한 조직에서 검출되거나, 또는 당업계의 표준 방법을 이용하여 병리학자에 의해 확립된 메틸화 수준(예컨대, 모노메틸화 수준, 디메틸화 수준 또는 트리메틸화 수준)을 의미한다.
"시료"란 피험체로부터 유래된 임의의 생물학적 시료를 의미하며, 이는 세포, 조직, 시료 및 체액(점액, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 타액 및 정액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서 전역에 걸쳐, 조성물이 구체적인 성분을 가지거나, 내포하거나, 또는 포함하는 것으로 기술된 경우, 조성물은 또한 언급된 성분으로 본질적으로 구성되거나, 또는 그로 구성된 것으로 고려된다. 유사하게, 방법 또는 공정이 구체적인 공정 단계를 가지거나, 내포하거나, 또는 포함하는 것으로 기술된 경우, 공정은 또한 언급된 공정 단계로 본질적으로 구성되거나, 또는 그로 구성된 것으로 고려된다. 추가로, 단계 순서 또는 특정 조치를 수행하는 순서는 본 발명이 여전히 그대로 작동가능한 한, 중요하지 않다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 2가지 이상의 단계 또는 조치는 동시에 수행될 수 있다.
본 발명의 합성 공정은 매우 다양한 작용기를 허용할 수 있으며; 따라서, 다양하게 치환된 출발 물질이 사용될 수 있다. 비록 특정 경우에서는 화합물을 그의 제약상 허용되는 염, 에스테르 또는 프로드럭으로 추가로 전환시키는 것이 바람직할 수도 있지만, 일반적으로는 공정을 통해서 전체 공정 종료시 또는 거의 종료되었을 때 원하는 최종 화합물을 수득하게 된다.
본 발명의 화합물은 상업적으로 이용가능한 출발 물질, 문헌에 공지되어 있는 화합물을 사용하여, 또는 쉽게 제조되는 중간체로부터, 당업자에게 공지되어 있거나, 또는 본원의 교시에 비추어 당업자에게 자명해질 표준 합성 방법 및 절차를 사용함으로써 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 유기 분자의 제조 및 작용기 변화 및 조작에 관한 표준 합성 방법 및 절차는 관련 과학 문헌으로부터 또는 해당 분야의 표준 서적으로부터 수득할 수 있다. 임의의 한 또는 수개의 출처로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 고전 서적, 예컨대, 문헌 [Smith, M. B., March, J., March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th edition, John Wiley & Sons: New York, 2001]; 및 [Greene, T.W., Wuts, P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons: New York, 1999](본원에서 참조로 포함된다)이 유용하고, 당업자에게 공지된 유기 합성법에 관한 참고 서적으로 인정받고 있다. 합성 방법에 관한 하기의 설명은 제한하는 것은 아니지만, 본 발명의 화합물을 제조하는 일반 방법을 예시하도록 디자인된 것이다.
본 발명의 화합물은 당업자에게 익숙한 다양한 방법으로 편리하게 제조될 수 있다. 본원에서 각각 화학식으로 기술되어 있는 본 발명의 화합물은 상업적으로 이용가능한 출발 물질로부터, 또는 문헌상의 방법을 사용하여 제조될 수 있는 출발 물질로부터 하기 방법에 따라 제조될 수 있다. 이러한 방법은 본 발명의 대표적인 화합물의 제조 방법을 보여준다.
상기 기술된 방법에 의해 디자인되고/거나, 선별되고/거나, 최적화된 화합물은 일단 제조되고 나면, 화합물이 생물학적 활성을 가지는지 여부를 측정할 수 있는, 당업자에게 공지된 다양한 검정법을 사용하여 특징이 규명될 수 있다. 예를 들어, 분자는 분자가 예측된 활성, 결합 활성 및/또는 결합 특이성을 가지는지 여부를 측정하는, 하기 기술되는 검정법을 포함하나, 이에 한정되지 않는 종래 검정법에 의해 특징이 규명될 수 있다.
추가로, 상기 검정법을 사용하는 분석법의 속도를 가속화시키기 위해 고처리량 스크리닝이 사용될 수 있다. 그 결과, 당업계에 공지된 기법을 사용하여 본원에 기술된 분자를 그 활성에 대해 신속하게 스크리닝할 수 있다. 고처리량 스크리닝을 수행하는 일반 방법은 예를 들어, 문헌 [Devlin (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker]; 및 미국 특허 번호 제5,763,263호에 기술되어 있다. 고처리량 검정법은 하기 기술되는 기법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 상이한 검정 기법을 사용할 수 있다.
본원에서 인용된 모든 공개 문헌 및 특허 문서는 마치 각각의 상기 공개 문헌 또는 문서가 구체적으로 및 개별적으로 본원에 참조로 포함되어 있다고 명시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 공개 문헌 및 특허 문서를 인용하는 것은 임의의 것이 선행 기술과 관련이 있음을 인정하는 것으로 의도되지 않아야 하고, 상기의 내용 또는 날짜에 관해서는 어느 것도 인정하지 않는 것으로 간주된다. 이제 본 발명은 작성된 명세서로 설명되지만, 당업자는 본 발명이 상기 다양한 실시양태로 수행될 수 있고, 상기 설명 및 하기의 실시예는 설명 목적의 것이며, 하기 특허청구범위를 제한하고자 하는 것이 아님을 이해할 것이다.
[실시예]
이제 본 발명을 일반적으로 기술하지만, 본 발명은 단지 본 발명의 특정 측면 및 실시양태를 예시하기 위한 목적으로 포함되고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는 하기 실시예를 참조로 하여 더욱 명백히 이해될 것이다.
실시예 1-재조합 5-성분 PRC2 복합체
야생형 EZH2(진뱅크 수탁 번호 NM_004456호) 또는 Tyr641 돌연변이체를 바큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf9) 세포에서 야생형 AEBP2(진뱅크 수탁 번호 NM_153207호), EED(진뱅크 수탁 번호 NM_003797), SUZ12(진뱅크 수탁 번호 NM_015355) 및 RbAp48(진뱅크 수탁 번호 NM_005610)과 함께 공동 발현시켰다. EED 상의 N 말단 FLAG 태그를 사용하여, 세포 용해물(BPS 바이오사이언스(BPS Bioscience), 카탈로그 번호 51004)로부터 활성 PRC2 복합체를 정제하였다. 쿠마시(Coomassie) 블루 염색을 이용한 SDS-PAGE에 의해 최종 PRC2 제제의 순도를 평가하였다.
실시예 2 - H3, H4 펩티드 패널
21st 센츄리 바이오케미칼즈(21st Century Biochemicals: 미국 메사츄세츠주 말보로)에 의해 각기 15개 아미노산의 44개 펩티드로 구성된 라이브러리를 합성하였다. 이 펩티드 패널은 구성 펩티드 서열들 간에 5개 잔기 중첩을 가지는 인간 히스톤 H3 및 H4의 아미노산 모두를 포괄하였다. 각 펩티드의 N 말단에 비오틴을 첨부하고, C 말단을 아미드로 나타내었다. 순도(>95%) 및 실체를 액체 크로마토그래피/질량 분광 분석에 의해 확인하였다.
효소 활성의 H3-K27 메틸화 상태 의존성의 연구를 위해, 비변형, 모노메틸화, 디메틸화 또는 트리메틸화된 측쇄 아민으로서 나타낸 리신 27을 가지는 잔기 21-44(H3:21-44)로부터의 인간 H3의 아미노산 서열을 나타내는 펩티드를 합성하였다. 각 펩티드의 C 말단에 비오틴이 첨부되어 있는 것인 상기 펩티드들을 뉴 잉글랜드 펩티드(New England Peptide: 미국 메사츄세츠주 가드너)로부터 구입하였다.
실시예 3 - 세포에서의 H3-K27 메틸화 상태 평가
세포주 OCI-LY19(ACC 528), 카르파스(KARPAS)-422(ACC 32), 및 WSU-DLCL2(ACC 575)를 DSMZ로부터 입수하였다. 세포주 DB(CRL-2289) 및 SU-DHL6(CRL-2959)를 ATCC로부터 입수하였다. OCI-LY19, WSU-DLCL2, 및 DB 세포주를 10% FBS를 가지는 RPMI-1640 중에서 성장시켰고, 카르파스-422 및 SU-DHL6 세포주를 20% FBS로 보충된 RPMI-1640 중에서 성장시켰다. 세포를 1.5-2x106개의 세포/mL의 밀도까지 성장시켰고, 264xg에서의 원심분리에 의해 1x107개의 세포를 회수하였으며, 빙냉 PBS로 세정하고, 0.1% SDS 및 프로테아제 억제제 정제(로슈(Roche) 번호 1836153)로 보충되고 50 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 0.25% DOC, 1% NP-40, 및 1 mM EDTA(밀리포어(Millipore) 번호 20-188)를 함유하는 10x 펠릿 부피의 RIPA 세포용해 완충제 중에 재현탁시킴으로써 세포용해시켰다. 용해물을 미소닉스(Misonix) XL-2000을 이용한 셋팅 3에서 2회의 101-초 버스트에 의해 초음파처리함으로써 효율적 히스톤 추출을 확실히 하였고, 10분 동안 14,000 rpm에서의 벤치 탑 원심분리를 이용하여 4℃에서 원심분리함으로써 소거하였다. BCA 검정(피어스(Pierce))에 의해 단백질 농도를 구하였다. 4 ㎍의 각 용해물을 4 내지 20% 트리스-글리신 겔(인비트로젠(Invitrogen)) 상에서 분별하고, PVDF로 보내어, 오디세이(Odyssey) 차단용 완충제 중에서 하기 항체로 프로빙하였다: 마우스 항-EZH2(CST 3147; 1:2,000 희석), 토끼 항-H3-K27me3(CST 9733; 1:10,000 희석), 토끼 항-H3-K27me2(CST 9755; 1:5,000 희석), 토끼 항-H3-K27me1(활성 모티프 39377; 1:5,000 희석), 및 마우스 항-총 H3(CST 3638; 1:20,000 희석). 1차 항체의 인큐베이션 후에, 막을 IRDye 800CW 당나귀-항-마우스 IgG(리코르(LiCOR) 번호 926-32212) 또는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 680 염소-항-토끼 IgG(인비트로젠 번호 A-21076) 2차 항체로 프로빙하고, 리코르 오딧세이 시스템을 이용하여 영상화하였다.
실시예 4 - 효소학적 성질
상기 언급된 바와 같이, 앞서 Tyr641에서의 질환 관련 변화로 인해 EZH2 촉매화된 H3-K27 메틸화와 관련하여 기능 상실이 일어났다는 결론을 얻었다. 그러나, 효소 이형접합성으로 인한 H3-K27 메틸화 속도의 추정상의 감소는, 특히 H3-K27 트리메틸화의 증가와 연관된, EZH2의 과발현, 상응하는 H3-K27 데메틸라제 UTX에서의 기능 상실 돌연변이, 또는 PRC2의 성분, 예컨대, PHF19/PCL3의 과발현이 모두 특정 인간 암에서의 악성 표현형을 초래함을 나타내는 이전 데이터에 비추어 볼 때, 악성 표현형에 대한 기초로서 합리화하는 것이 어려웠다(문헌 [Morin et al., (2010) Nat Genet 42: 181-5]; [Martinez-Garcia et al., (2010) Nat Genet 42:100-1]; [Bracken et al., (2003) EMBO J 22:5323-35]; [Kleer et al., (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100: 11606-11]; [Varambally et al., (2002) Nature 419:624-9]; [Simon et al., (2008) Mutat Res 647:21-9]; [van Haaften et al., (2009) Nat Genet 41:521-3]; [Wang et al., (2004) Gene 343:69-78]; [Cao et al., (2008) Mol Cell Biol 28: 1862-72]; 및 [Sarma et al., (2008) Mol Cell Biol 28:2718-31]). 그러므로, 이들 돌연변이의 효소학적 성질은 더욱 상세하게 연구되었다.
인간 EZH2의 WT 및 Tyr641 돌연변이체 버전을 이용하여 재조합 PRC2 복합체를 제조하였다(상기 실시예 1; 문헌 [Cao et al., (2004) Mol Cell 15:57-67] 참조). 동일한 농도(단백질 측정에 기초하여 명목상 8 nM)의 각 복합체를 먼저 표지화된 S-아데노실 메티오닌(SAM)에서 H3-K27(H3:21-44)를 둘러싸는 아미노산 서열을 나타내는 비변형 펩티드 또는 네이티브 조류 적혈구 올리고뉴클레오좀으로의 3H-메틸 전달을 촉매화하는 능력에 대해 테스트하였다. 앞서 보고된 바와 같이(문헌 [Morin et al., (2010) Nat Genet 42: 181-5]), WT 효소는 이 비메틸화된 펩티드성 기질로의 메틸 전달을 위한 강한 활성을 나타냈으나, 돌연변이체 효소들 중 어느 것도 유의적 메틸트랜스퍼라제 활성을 나타냈지 않았음(도 1A)이 밝혀졌다. 앞서 보고된 데이터 및 도 1A에서의 데이터와 대조적으로, 모든 돌연변이체 EZH2 구축물이 조류 뉴클레오좀 기질에 대한 활성 메틸트랜스퍼라제임이 밝혀졌다(도 1B). 조류 천연 출처로부터 단리된 뉴클레오좀은, H3-K27 메틸화 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 판단 시에 H3-K27 메틸화의 각종 상태를 포함한, 히스톤 변형 상태들의 혼합을 나타낸다.
펩티드 및 뉴클레오좀 기질에 대한 돌연변이체 PRC2 복합체의 부조화 활성에 대한 수가지 가능한 설명들이 있다. 한 가능성은, 효소 활성 부위(즉, 엑소사이트)에 대해 원위에 있는 기질 인식 부위가 기질 결합 및 반전에 대한 중요한 결정자이고; 이 부위는 소형 펩티드성 기질에 대해 이용가능하지 않은 뉴클레오좀에 상보적 인식 요소를 결부시키게 된다는 것이다. 그러나, E. 콜라이(E. coli)-발현 재조합 인간 히스톤 H3을 WT 및 돌연변이체 PRC2 복합체에 대한 기질로서 테스트하였을 때, 얻어진 활성 패턴이 펩티드 기질에 대해 보여지는 것과 동일하였고; 즉, WT 효소가 H3 기질에 대한 강한 메틸트랜스퍼라제 활성을 나타냈고, Y641F 돌연변이체는 WT 복합체의 활성에 대해 7%를 나타냈고, 모든 다른 돌연변이체는 WT 복합체의 활성의 ≤1%를 나타내었다. 이에 따라, 엑소사이트 결부는 현 결과에 대한 가능성이 별로 없는 설명인 것으로 보인다. 뉴클레오좀은 소형 펩티드성 기질 내에 존재하지 않을 메틸화의 잠재적 부위로서 H3-K27 외의 많은 리신 잔기들을 제시한다. 따라서, 또 다른 가능성은 Y641의 돌연변이가 H3-K27 외의 리신 잔기의 메틸화를 초래하도록 하는 EZH2의 기질 특이성을 변경시킨다는 것이다. 이 가능성은 소형 펩티드 및 재조합 H3 단백질 기질에 대한 돌연변이체 활성 간의 우수한 일치성이 있을 경우에는 가능성이 별로 없다.
본 결과와 앞서 보고된 결과 간의 명백한 부조화는, WT 및 돌연변이체 PRC2 복합체의 효소 활성을 히스톤 H3 및 히스톤 H4의 모든 가능한 리신(K) 잔기들을 나타내는 펩티드성 기질의 패널에 대해 테스트하였을 때 해결되었다(상기 실시예 2 참조). 모든 효소 형태들은 잔기 H3-K27의 등가물을 함유하는 펩티드에 대해서만 유의적인 활성을 나타내었다. 그러나, 돌연변이체의 특이적 활성은 WT>>Y641F>Y641S∼Y641H>Y641N의 순으로 WT에 대해 크게 감소하였고, 이 역시 앞서 보고된 결과와 일관된다.
실시예 5 - 효소학적 성질
이들 돌연변이체의 효소 활성을 추가로 이해하고, 펩티드성 및 뉴클레오좀 기질에 대한 활성들간의 명백한 불일치를 해소하기 위해, H3:21-44 펩티드와 관련한 각종 H3-K27 메틸화 상태 또한 촉매화하는 효소 형태의 능력을 연구하였다. 상기 언급된 바와 같이, 모든 돌연변이체 효소들이 WT 효소 대비, 비변형 H3-K27 펩티드 메틸화에 대하여 결함이 있는 촉매임이 밝혀졌다. 그러나, 놀랍게도, 모든 돌연변이체 효소들은 모노메틸화된 H3-K27 펩티드, 및 특히 디메틸화된 H3-K27 펩티드의 메틸화를 추가로 촉매함에 있어 WT 효소보다 우수한 것으로 나타났다(도 2). 따라서, 데이터는 비메틸화 반응 내지 모노메틸화 반응을 촉매화함에 있어 가장 효율적이라는 것을 제시한다. 돌연변이체 효소는 이 초기 단계를 촉매화하는 데에는 결함이 있으나, 모노메틸 내지 디메틸 및 트리메틸 H3-K27에서 이어지는 후속 단계를 촉매화함에 있어서는 WT 효소보다 더 효율적이다.
정상 상태 효소 동역학을 통해 WT 및 돌연변이체 EZH2의 차등적 기질 특이성의 기원을 연구하였다. 하기 표 2에 요약되어 있는 바와 같이, 돌연변이는 뉴클레오좀에 대한 Km 및 펩티드 기질에 대한 K½의 유사 값들에 의해 입증되는 바와 같이, 기저 상태의 기질 인식에 대해 최소의 영향을 미쳤다. 모든 경우들에서, 펩티드성 기질은 S자형 결합 양상을 보였고; 따라서, 최대 속도의 ½ 속도에 도달하게 하는 펩티드의 농도를 본원에서는 좀더 일반적인 미카엘리스(Michaelis) 상수 Km 대신에 K½로 기록하였다(문헌 [Copeland (2005) Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide to Medicinal Chemists and Pharmacologists, Wiley]). 마찬가지로 SAM Km는 208 ± 50 내지 304 ± 64 Nm의 범위에서 효소 형태들 간의 최소 변동을 나타내었다. 그 대신, 기질 이용에 있어서의 차이는 각종 기질에 대한 효소들 간의 kcat 값의 차이에 의해 입증되는 바와 같이, 전이 상태 인식에 그 기원을 가지는 것으로 보였다(표 2). 결과적으로, 비 kcat/K(여기서, K는 기질 아이덴티티에 따라, Km이거나, 또는 K½이다(상기 참조))으로 정량화되는 촉매 효율은 상이한 H3-K27 메틸화 상태로 인해 WT 효소와 돌연변이체 효소 간에 달라졌다(표 2).
Figure 112021068876035-pat00102
실시예 6 - 효소학적 성질
표 2에 열거된 정상 상태 동역학 파라미터로 인해, WT 효소에 대한 동종성인 세포 대비, 각종 돌연변이체 EZH2 형태에 대해 이형접합성인 세포에 대해 상이한 H3-K27 메틸화 상태의 예상 수준을 계산할 수 있게 되었다. 이 모의를 수행하기 위해, 다수의 단순화 가정이 수립되었다: (1) 정상 상태 효소 동역학적 성질은 세포과 관련하여 PRC2-촉매 H3-K27 메틸화와 관련되어 있고, 모든 측정들은 세포 성장에 있어 동일 시점에서 행해지며; (2) 돌연변이체 및 WT 효소는 이형접합성 세포에서 동등한 수준으로 발현되고, 총 EZH2 수준이 모든 세포들에서 동일하며; (3) SAM의 세포내 농도는 그것의 Km 대비, 포화이고, 세포들 간에 변화하지 않으며; (4) 뉴클레오좀의 세포내 농도는 그것의 Km과 유사하며, 마찬가지로 세포들 간에 변화하지 않고; (5) H3-K27의 EZH1 촉매작용 메틸화는 유의적이지 않고, 세포들 간에 일정하며; (6) 임의의 H3-K27 데메틸라제 활성도 또한 세포들 간에 일정하였다.
이들 가정 하에, 도 3A에 도시된 예측들이 H3-K27me3(상단 패널), H3-K27me2(중간 패널) 및 H3-K27me1(하단 패널)의 상대 수준에 대해 얻어졌다. 이 모의들에서 한 명료한 패턴이 나온다. H3-K27me3의 수준은 모든 돌연변이체 잠복 세포들에 대해 WT 세포 대비 증가하고, 그 범위는 Y641H 돌연변이체에 대해 30% 증가 내지 Y641N 돌연변이체에 대해 >400%이다. 이와 동시에, H3-K27me2의 수준은 모든 돌연변이체들에 대해 WT의 <50%로 감소되고, H3-K27me1의 수준은 WT 대비, 모든 돌연변이체들에 대해 대략 절반 감소된다.
이어서, WT EZH2(OCI-LY19)에 대해서는 동종성이고 EZH2 Y641N(DB, 카르파스 422, 및 SU-DHL-6) 또는 EZH2 Y641F(WSU-DLCL2)에 대해서는 이종성인 것으로 알려진 B 세포 림프종 세포주 내 H3-K27 메틸화 상태의 상대 수준을 웨스턴 블로팅에 의해 측정하였다(도 3B). 도 3b에 나와 있는 상대 H3-K27 메틸화 상태의 패턴은 모의에 사용된 가정 및 기질로서의 비생리학적 펩티드 대리의 사용에도 불구하고 시험관내 정상 상태 동역학 파라미터에 기초한 모의의 결과와 우수하게 일치한다.
따라서, WT 대비, 모든 Y641 돌연변이체 잠복 세포에 대해서는 증가된 H3-K27me3이 관찰되었고, WT 대비, 모든 Y641 돌연변이체 잠복 세포에 대해서는 감소된 H3-K27me2가 관찰되었으며, 4개의 돌연변이체 세포주들 중 2개 이상에 대해 감소된 H3-K27me1이 관찰되었다. WT 및 카르파스 422 및 SU-DHL-6 세포 내 H3-K27me1의 거의 필적할만한 수준은 WT 및 EZH2 돌연변이체의 상이한 발현 수준, EZH1의 상이한 기여, 또는 모의에서 설명되지 않는 기타 요인들을 반영할 수 있다. 그럼에도 불구하고, H3-K27 메틸화 상태의 예측된 패턴과 실험 패턴 상의 일치성이 주목할만하고, WT와 돌연변이체 EZH2 간의 효소 결합이 H3-K27me3 증가를 초래한다는 견해를 지지하며, 이는 따라서 상기 돌연변이체에 대해 이형접합성인 악성 표현형의 세포를 초래한다.
실시예 7 - PRC2 메틸트랜스퍼라제 활성의 시험관내 검정
펩티드 기질을 이용한 플래쉬플레이트 검정. WT 및 EZH2의 Y641 돌연변이체의 초기 비교를 위해, 800 nM의 농도로 비메틸화된 K27(뉴 잉글랜드 펩티드), 모노메틸화된 K27(밀리포어) 또는 디메틸화된 K27(밀리포어)를 함유하는 비오티닐화된 히스톤 H3:21-44 펩티드를 1,700 nM의 S-아데노실메티오닌-Cl(SAM) 및 300 nM 삼중 수소화 SAM(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))의 혼합물과 조합하였다. 이어서, 이 기질 조합물을 검정 완충제(20 mM BICINE, 1 mM DTT, 0.002% 트윈(Tween) 20, 0.005% 우피 젤라틴(BSG: bovine skin gelatin), pH 7.6) 중의 PRC2에 첨가하였다. 명시된 시간 간격 동안 반응을 진행시킨 후, 과량의 냉 SAM(600 μM 최종 농도)을 첨가하여 ??칭시켰다. ??칭된 반응 혼합물을 스트렙트아비딘으로 코팅된 플래쉬플레이트(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 SMP410)로 옮긴 후, 1시간 동안 결합시킨 후, 탑카운트(TopCount) NXT HTS 섬광 및 발광 계수기(퍼킨 엘머)에서 판독하였다. 각 시점은 6개의 개별 반응들의 평균을 나타내었다. 다른 기질의 포화 조건 하에서, 펩티드 또는 SAM의 농도를 변동시킨 것을 제외하고는 동일한 반응 조건 하에서 정상 상태 동역학 파라미터를 구하였다. 속도를 변동되는 기질 농도의 함수로서 플로팅하였고, 데이터를 비변형 버전의 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 방정식 또는 비변형 버전의 S자형 동역학 방정식에 피팅하여, K 및 kcat의 값을 구하였다. 피팅된 파라미터의 표준오차를 표 2에 열거하고 이를 도 2 패널 B 및 C에 도시된 오차 막대를 제작하는 데 사용하였다. kcat/K(표 2)와 연관된 오차를 오차 전파를 위한 표준 방법에 따라 계산하였고; kcat/K의 분수 오차를 하기와 같이 구하였다:
Figure 112021068876035-pat00103
(1)
(여기서, μkcat는 kcat의 표준 오차이고, μK는 K의 표준 오차이다).
올리고뉴클레오좀을 이용한 필터플레이트 검정. 전술된 바와 같이 닭 적혈구 올리고뉴클레오좀을 정제하였다(문헌 [Fang et al., (2004) Methods Enzymol 377:213-26]). 뉴클레오좀을 SAM 및 삼중 수소화 SAM의 혼합물과 조합하여, 검정 완충제(20 mM BICINE, 100 mM KCl, 1 mM DTT, 0.002% 트윈 20, 0.005% BSG, pH 7.6) 내의 PRC2에 첨가하였다. 상기와 같이 반응을 수행하고 ??칭시켰다. ??칭된 반응 혼합물을 유리 섬유 필터플레이트(밀리포어, 카탈로그 번호 MSFBN6B)로 옮겨, 10% 삼염화아세트산으로 3회 세정하고, 건조시켰다. 마이크로신트 제로(Microscint Zero)(30 ㎕)를 첨가하고, 탑카운트 섬광 및 발광 계수기에서 삼중 수소 도입을 검출하였다. 다른 기질의 포화 조건 하에서, 뉴클레오좀 또는 SAM의 농도를 변동시킨 것을 제외하고는 동일한 반응 조건 하에서 정상 상태 파라미터를 구하였다. 속도를 변동되는 기질 농도의 함수로서 플로팅하였고, 데이터를 비변형 버전의 미카엘리스-멘텐 방정식에 피팅하여, 상술된 바와 같이 Km 및 kcat의 값을 유도하였다.
실시예 8 - 화합물 제조
A. 화합물 63의 제조
Figure 112021068876035-pat00104
DCE(250 mL) 중의 9-((3aR,4R,6R,6aR)-6-(아미노메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로플루오로[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)-9H-푸린-6-아민(문헌 [Townsend, A. P. et al., (2009) Org. Let. 11:2976-2979])(3.05 g, 9.96 mmol)의 용액에 (9H-플루오렌-9-일)메틸(2-옥소에틸)카바메이트(2.8 g, 9.96 mmol) 및 NaB(OAc)3H(2.96 g, 13.95 mmol)를 첨가하였고, 그 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. pH 8 내지 9가 되도록 K2CO3 용액을 첨가하였다. DCM을 첨가하였고, 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 농축시키며, SGC(DCM: MeOH = 30:1)에 의해 정제하여, 63(2.9 g, 수율: 50.9%)을 수득하였다.
B. 화합물 65의 제조
Figure 112021068876035-pat00105
Figure 112021068876035-pat00106
DCE(250 mL) 중의 63(2.9 g, 5.08 mmol)의 용액에 (S)-벤질 2-((tert-부톡시카보닐)아미노)-4-옥소부타노에이트(1.56 g, 5.08 mmol) 및 NaB(OAc)3H(1.51 g, 7.11 mmol)를 첨가하였고, 그 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. pH가 8 내지 9가 되도록 K2CO3 용액을 첨가하였다. DCM을 첨가하였고, 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 농축시키며, SGC(DCM:MeOH = 100:1)에 의해 정제하여, 65(2.8 g, 수율: 63.9%)를 수득하였다.
C. 화합물 75의 제조
Figure 112021068876035-pat00107
Figure 112021068876035-pat00108
단계 1. DCM(10 mL) 중의 65B(2.2 g, 2.55 mmol)의 용액에 Et2NH(1.1 g, 15.3 mmol)을 첨가하였고, 그 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축하여, 조 72(2.2 g)을 수득하였다.
단계 2. MeOH(4 mL) 중의 72(167 mg, 0.26 mmol)의 교반 용액에 2-(4-클로로페닐)아세트알데히드(40 mg, 0.26 mmol)를 첨가하여, 20분 동안 실온에서 교반하였다. 이어서, Na(OAc)3BH(83 mg, 0.39 mmol) 및 HOAc(0.4 mL)를 첨가하고, 밤새도록 교반하였다. 이어서, NaHCO3(수성)를 첨가하여, DCM(25 mLx3)로 추출하며, 염수로 세정하고, Na2SO4로 건조시켜, 농축하였다. 조 생성물을 분취 TLC(DCM/MeOH = 10:1)에 의해 정제하여, 73(30 mg, 수율: 14%)을 백색 분말로서 수득하였다. LC/MS(m/z): 779.7 [M+1]+.
단계 3. MeOH(2 mL) 중의 73(30 mg, 0.038 mmol) 및 10% Pd/C(15 mg)의 혼합물을 밤새도록 H2 하에서 실온에서 교반하였다. 그 혼합물을 여과하였고, 여과액을 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 분취 TLC(DCM/MeOH = 8:1)에 의해 정제하여, 74(20 mg, 수율: 69%)를 백색 분말로서 제공하였다. LC/MS(m/z): 689.7 [M+1]+.
단계 4. 90% TFA(1 mL) 중의 74(20 mg, 0.028 mmol)의 용액을 1시간 동안 실온에서 교반하였고, 고체로서 농축시켜 TFA를 제거함으로써, 화합물 75(TFA 염)를 정제하지 않고 무색 오일로서 수득하였다. LC/MS(m/z): 549.7 [M+1]+.
실시예 9 - SAH에 의한 EZH2 야생형 및 Y641 돌연변이체의 억제
S-아데노실-L-호모시스테인(SAH)을 10 지점에 대해 DMSO 중에 3배로 일련으로 희석하고, 1 ㎕를 384 웰 마이크로티터 플레이트에 플레이팅하였다. 양성 대조군(100% 억제 표준)은 100 μM 최종 농도의 SAH였고, 음성 대조군(0% 억제 표준)은 1 ㎕의 DMSO를 포함하였다. 이어서, 40 ㎕/웰의 검정 완충제(pH 7.6)(20 mM BICINE, 100 mM KCl, 1 mM DTT, 0.002% 트윈(Tween) 20, 0.005% BSG) 중 8 nM의 EZH2 야생형 및 돌연변이체와 함께 SAH를 30분 동안 인큐베이션하였다. pH 7.6의 검정 완충제 중에 150 nM의 S-아데노실메티오닌-Cl(SAM), 100 nM의 삼중 수소화 SAM, 및 150 nM의 비오티닐화된 올리고뉴클레오좀을 함유하는, 10 ㎕/웰의 기질 믹스를 첨가하였다. ??칭된 효소 반응을 스트렙트아비딘으로 코팅된 플래쉬플레이트(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 SMP410)로 옮기고, 1시간 동안 결합시키며, 탑카운트 NXT HTS(퍼킨 엘머)에서 검출하였다.
결과가 도 7에 나와 있다. IC50 값이 표 3에 제시되어 있다.
Figure 112021068876035-pat00109
실시예 10 - 화합물 75에 의한 EZH2 야생형 및 Y641 돌연변이체의 억제
화합물 75을 10 지점에 대해 DMSO 중에 3배로 일련으로 희석하고, 1 ㎕를 384 웰 마이크로티터 플레이트에 플레이팅하였다. 양성 대조군(100% 억제 표준)은 최종 농도 100 μM의 SAH였고, 음성 대조군(0% 억제 표준)은 1 ㎕의 DMSO를 포함하였다. 이어서, 40 ㎕/웰의, 검정 완충제(pH 7.6)(20 mM BICINE, 100 mM KCl, 1 Mm DTT, 0.002% 트윈 20, 0.005% BSG) 중 8 nM의 EZH2 야생형 및 돌연변이체와 함께 화합물 75를 30분 동안 인큐베이션하였다. pH 7.6의 검정 완충제 중에 150 nM의 S-아데노실메티오닌-Cl(SAM), 100 nM의 삼중 수소화 SAM, 및 150 nM의 비오티닐화된 올리고뉴클레오좀을 함유하는, 10 ㎕/웰의 기질 믹스를 첨가하였다. ??칭된 효소 반응을 스트렙트아비딘으로 코팅된 플래쉬플레이트(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 SMP410)로 옮기고, 1시간 동안 결합시키고, 탑카운트 NXT HTS(퍼킨 엘머)에서 검출하였다.
결과가 도 8에 나와 있다. IC50 값이 표 4에 나와 있다.
Figure 112021068876035-pat00110
실시예 11-H3-K27me2/me3 비를 통해 EZH2 억제제에 대한 감수성을 예측할 수 있다
EZH2(Y641) 돌연변이에 대해 이형접합성인 종양 세포주는 H3-K27me3의 증가된 수준을 나타내어, H3-K27의 메틸화 상태는 종양발생에 있어 중요한 것으로 사료된다. EZH2에 대해 WT이거나 EZH2(Y641) 돌연변이에 대해 이형접합성인, 세포주의 패널 내 모노메틸화(H3-K27me1), 디메틸화(H3-K27me2), 또는 트리메틸화된(H3-K27me3) 형태의 H3-K27의 수준을 평가하였다. 사용된 세포주들은 표 4에 열거되어 있다. 다수의 세포주는 B 세포 림프종 세포주이나, 2개의 흑색종 세포주도 또한 포함되었다. IGR1은 EZH2 내에 Y641N 돌연변이를 포함하는 것으로 최근 밝혀진 흑색종 세포주이고, A375 세포는 WT EZH2 흑색종 대조군 세포주로서 포함되었다. 도 9A 및 B는 H3-K27me1, H3-K27me2, 또는 H3-K27me3을 인식하는 항체로 프로빙된 상기 세포주 패널로부터 단리된 히스톤의 웨스턴 블롯 분석의 결과를 보여준다. 일반적으로, 전반적 H3-K27me3 수준은 WT EZH2만을 발현하는 세포주에서보다 Y641 돌연변이체 함유 세포주에서 더 높다. 2가지 예외는 파라지(Farage) 및 파이퍼(Pfeiffer) 세포이고, 이 세포 내 H3-K27me3 수준은 WT 세포주에서의 그 수준과 유사하였다. 더욱 놀랍게도, 야생형 세포주 대비, EZH2 Y641 돌연변이체 세포주 내 H3-K27me2의 수준이 현저하게 더 낮다. Y641 돌연변이체 세포주로부터 추출된 히스톤의 웨스턴 블롯에서 H3-K27me2 신호가 거의 관찰되지 않았거나 전혀 관찰되지 않은 반면, WT 세포주에서 동일한 항체로 관찰된 신호는 H3-K27me3에 대해 특이적인 항체에서 관찰된 것보다 더욱 강하였다. 전반적으로, WT 세포주에서, HK27me2 항체에서의 웨스턴 블롯 신호는 H3-K27me3 항체로 관찰된 신호보다 더 높았던 반면, Y641 돌연변이체 세포주에 대해서는 그 반대가 성립된다. 따라서, Y641 세포주에서의 H3-K27me3/me2 신호의 비는 WT 세포주에서 관찰된 비보다 더 높다.
H3-K27 메틸화 상태는 또한 항체 시약에 의존하지 않는 비의존적 방법인 질량분석법(MS)에 의해서도 조사될 수 있다. MS 분석은, H3-K27me3 수준이 다른 WT 세포주들에서보다 Y641 돌연변이체 및 파이퍼 세포주(A677G)에서 더 높은 반면, H3-K27me2 수준에 대해서는 그 반대가 성립함을 입증하였다. Y641 돌연변이체 및 파이퍼 세포주(A677G)에서, H3-K27me3 수준은 H3-K27me2 수준보다 더 높은 반면, 다른 WT 세포주에 대해서는 그 반대가 성립하였다. 이 결과는 도 9A 및 B에서 웨스턴 블롯 분석에 의해 관찰되는 것과 일치한다.
H3-K27 메틸화 상태의 차이는 또한 H3-K27me2 또는 H3-K27me3에 대한 항체를 이용하여 면역세포화학에 의해 검출되었다. 이 면역조직화학 검정은 포르말린에 고정하고, 파라핀에 포매한 환자 종양 조직 시료에서 Y641 돌연변이체 EZH2와 연관된 이상 H3-K27me2/3 비를 검출하기 위해 사용된다. 5개의 WT 및 5개의 Y641 돌연변이체 림프종 세포주 펠릿의 패널을 고정하여, 파라핀 블록에 포매하고, 항-H3-K27me2 또는 H3-K27me3 항체로 염색하였다. 모든 세포들이 핵 히스톤 H3을 함유하게 되므로, 히스톤 H3에 대한 항체를 양성 대조군으로 포함시켰다. 도 10은, 모든 세포주들이 H3-K27me3 및 H3 염색 모두에 대해 세포들 중 100%에 있어 양성이었다. 이들 조건 하에서, WT 및 Y641 돌연변이체 세포주 간에는 H3-K27me3 염색 강도의 명료한 차이가 관찰되지 않았다. 이는 다른 검출 방법에 비해 제한된 역학 범위의 발색 면역세포화학 염색을 반영할 수 있다. 그러나, 도 11에 나타낸 바와 같이, 세포주는 H3-K27me2에 대해 양성 또는 음성으로 염색된 것들로 명료하게 격리될 수 있었다. 파이퍼 세포를 제외한 모든 WT 세포주들은 H3-K27me2에 대해 양성으로 염색된 반면, 모든 Y641 돌연변이체 세포주 및 파이퍼 세포(A677G)는 H3-K27me2 항체에 대해 염색을 나타내지 않았다. 이 결과들은 웨스턴 분석 및 MS 분석에 의해 얻은 결과와 일치한다.
어떤 한 이론으로도 한정하고자 하지 않으면서, EZH2(Y641) 돌연변이의 기능 획득과 관련된 증가된 H3-K27me3 수준은 EZH2 돌연변이를 가지는 세포가 소분자 EZH2 억제제에 대해 더욱 민감하도록 만들 수 있다. EZH2 Y641 돌연변이의 부재하에 파이퍼 세포에서 관찰된 증가된 H3-K27me3 수준 및/또는 감소된 H3-K27me2 수준이 또한 EZH2 억제제에 대한 감수성과 상관 관계가 있는지의 여부를 평가하기 위해, IC50이 각기 85 nM 및 16 nM인 생화학적 검정에서 EZH2의 강한 억제를 나타내는 2개의 화합물을 테스트하였다. 그 중 어느 한 화합물을 이용한 WSU-DLCL2 세포의 처리는 전반적 H3-K27me3 수준의 억제를 초래하였고, 이로써 세포에 들어가서 세포내 EZH2 메틸트랜스퍼라제 활성을 억제하는 능력을 확인하였다(도 12).
각 화합물에 대한 WT 및 Y641 돌연변이체 세포주의 패널의 감수성을 증식 검정으로 평가하였다. EZH2 억제제의 항증식성 활성이 분명해지는 데에는 수일이 걸리기 때문에, 화합물을 11일 증식 검정으로 평가하였다. 도 13에는 WT(OCI-LY19), 또는 테스트 화합물로 처리한 Y641 돌연변이체(WSU-DLCL2) 세포주에 대한 대표적 성장 곡선이 제시되어 있다. 두 화합물 모두는 WSU-DLCL2 세포에 대해 항증식성 활성을 나타냈고, OCI-LY19 세포에 대해서는 거의 활성을 나타내지 않았다. 억제제 A는 억제제 B보다 WSU-DLCL2 증식의 더욱 강한 억제제였고, 이는 생화학적 검정에서 억제제 A가 더욱 강한 EZH2의 억제제인 것과 일치한다. 억제제 B를 이용하여 WT 및 Y641 돌연변이체 림프종 세포주의 패널에서 증식 검정을 수행하였고, 11일 IC90 값을 유도하였다. 도 14A는 EZH2 Y641 상태에 의해 군 분류된 림프종 세포주의 IC90 값을 도시한다. 전반적으로, RL 및 SUDHL4 세포가 다른 돌연변이체 세포주보다 유의적으로 덜 민감하나, Y641 돌연변이체 세포주는 WT 세포주에 비해 EZH2 억제제에 대한 증가된 감수성을 나타내었다. 파이퍼 세포는 WT이므로 예외이나 낮은 몰 범위 또는 서브나노몰 범위의 IC90을 가지는 양 화합물의 항증식성 효과에 대해 매우 민감하다. 파이퍼 세포는 높은 H3-K27me3 및 낮은 H3-K27me2 수준을 나타내고, 높은 H3-K27me3 수준 및 낮은 H3-K27me2에 따라 상기와 같이 군 분류된 세포주는 도 14B에서 억제제 B에 대해 도시된 바와 같이 EZH2 억제제 감수성을 보다 잘 식별하도록 한다. 따라서, 높은 H3-K27me3 수준 및 낮은 H3-K27me2 수준은 돌연변이 상태를 아는 것과 무관하게, EZH2 억제제에 대한 감수성을 예측하기 위해 사용될 수 있다. 파이퍼 세포에서 관찰되는 이상 메틸화 비는 EZH2 활성에 대한 의존성을 부여하는 분리된 기작에 의해 일어난다.
이 결과는, 환자 종양에서의 EZH2 Y641 돌연변이를 확인하고/하거나 환자에 있어 웨스턴 블롯, MS 또는 IHC와 같은 기법을 이용함으로써 H3-K27me3 대비 H3-K27me2의 낮은 수준을 검출하는 것은 어느 환자가 EZH2 억제제 처리에 대해 반응하는지 여부를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
Figure 112021068876035-pat00111
Figure 112021068876035-pat00112
실시예 12 - 재조합 4-성분 PRC2 복합체
야생형(WT) EZH2(진뱅크 수탁 번호 NM_004456) 또는 A677G 및 A687V 돌연변이체 바큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 스포도프테라 프루기페르다(Sf9) 세포에서 야생형 EED(진뱅크 수탁 번호 NM_003797), SUZ12(진뱅크 수탁 번호 NM_015355) 및 RbAp48(진뱅크 수탁 번호 NM_005610)과 함께 공동 발현시켰다. EED 상의 N 말단 FLAG 태그를 사용하여, 세포 용해물로부터 활성 PRC2 복합체를 정제하였다. 쿠마시 블루 염색을 이용한 SDS-PAGE에 의해 최종 PRC2 제제의 순도를 평가하고, 브래드포드 검정법(Bradford assay)으로 소 혈청 알부민 표준 곡선을 이용하여 단백질 농도를 측정하였다.
실시예 13 - PRC2 메틸트랜스퍼라제 활성의 시험관내 검정
펩티드 기질을 이용한 플래쉬플레이트 검정을 위한 표준 방법. 하기 서열 ATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGG[K-Ahx-Biot]-아미드(서열 번호 20)(여기서, 변형되는 H3-K27 리신은 밑줄로 표시)로 구성된, 비변형된, 모노메틸화된, 디메틸화된 또는 트리메틸화된 측쇄 아민으로 표시되는, 리신 27을 포함하는 잔기 21-44로부터의 인간 H3의 아미노산 서열(H3:21-44)을 나타내는 일련의 4가지 펩티드를 이용하여 야생형 또는 돌연변이체 EZH2 함유 PRC2 복합체의 활성을 조사하였다. 리신 측쇄 아민에 부착된 아미노헥실 링커(AHX)를 통해 C 말단 리신(K) 잔기에 비오틴(Biot)을 첨부하였다(21st 센츄리 바이오케미칼즈). WT의 돌연변이체 및 돌연변이체 EZH2 활성을 비교하기 위해, 비오티닐화된 히스톤 H3:21-44 펩티드를 검정 완충제(20 mM BICINE, 1 mM DTT, 0.002% 트윈 20, 0.005% 우피 젤라틴(BSG), pH 7.6) 중의 S-아데노실메티오닌(SAM; 시그마-알드리치) 및 삼중 수소화된 SAM(3H-SAM; 아메리칸 라디오라벨드 케미칼즈(American Radiolabeled Chemicals)) 및 재조합 4-성분 PRC2의 혼합물과 조합하였다. 명시된 시간 간격 동안 반응을 진행시킨 후, 과량의 냉 SAM(100 μM 최종 농도)을 첨가하여 ??칭시켰다. ??칭된 반응 혼합물을 스트렙트아비딘으로 코팅된 플래쉬플레이트(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 SMP410)로 옮긴 후, 1시간 동안 결합시킨 후, 바이오테크 EL-405(Biotek EL-405x) 플레이트세척기에서 플레이틀 세척하고, 탑카운트 NXT HTS 섬광 및 발광 계수기(퍼킨 엘머)에서 판독하였다.
실시예 14 - 효소학적 성질
EZH2의 야생형 및 A677G 또는 A687V 돌연변이체 버전을 이용하여 재조합 4-성분 PRC2 복합체를 제조하였다(상기 실시예 12 참조; 문헌 [Cao et al., (2004) Mol Cell 15:57-67]). 각 복합체를 먼저 표지된 S-아데노실 메티오닌(SAM)에서 각각의 4가지 H3:21-44 펩티드로의 3H-메틸 전달을 촉매화하는 능력에 대해 테스트하였다. 효소를 일련으로 희석하고, 펩티드(200 nM) 및 SAM(200 nM 3H-SAM 및 800 nM 표지화되지 않은 SAM)의 혼합물을 첨가하였다. 과량의 표지화되지 않은 SAM을 첨가함으로써 15분 간격으로 반응을 ??칭시키고, 원시 분당 계수(CPM) 대 시간에 대한 선형 회귀에 기초하여 반응 속도를 계산하였다. 도 15에 제시되어 있는 바와 같이, 돌연변이체 효소는 야생형 효소와는 다른 패턴의 활성을 보였다. A677G 및 A687V 돌연변이체는 비메틸화된, 모노메틸화된 및 디메틸화된 H3:21-44 펩티드, 모두에 대해 강력한 활성을 보인 반면, 야생형 효소는 오직 비메틸화된 및 모노메틸화된 펩티드에 대해서만 강력한 활성을 보였다. 완전하게 트리메틸화된 H3-K27을 포함하는 대조군 펩티드는 본 검정에서 메틸화되지 않았는데, 이는 H3-K27이 표적 리신이였다는 것을 시사하는 것이다.
실시예 15 - 효소학적 성질
상기 돌연변이체의 효소 활성을 추가로 이해하기 위해, 정상 상태 효소 동역학을 통해 야생형 및 돌연변이체 EZH2의 차등적 기질 특이성의 기원을 연구하였다. H3-K27 펩티드를 고정 효소(4 nM) 및 SAM(200 nM 3H-SAM 및 800 nM 표지화되지 않은 SAM)로 적정하는 것을 포함하는 반응을 수행하였다. 모든 경우에서, 펩티드성 기질은 S자형 결합 양상을 보였고; 따라서, 최대 속도의 ½ 속도에 도달하게 하는 펩티드의 농도는 본원에서 좀더 일반적인 미카엘리스-멘텐 상수 Km 대신에 K½로 기록하였다(문헌 [Copeland (2005) Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide to Medicinal Chemists and Pharmacologists, Wiley]). 하기 표 6에 요약되어 있는 바와 같이, 돌연변이는 비메틸화된 펩티드 기질에 대해서는 K½이 더 낮고, 디메틸화된 펩티드 기질에 대해서는 K½이 더 높은 것으로 입증되는 바와 같이, 뉴클레오좀에 대한 Km 및 펩티드 기질에 대한 K½의 유사 값들에 의해 입증되는 바와 같이, 기저 상태의 기질 인식에 대해 영향을 미쳤다. 추가로, 효소의 최대 속도는 돌연변이에 의해 영향을 받았다. A677G 돌연변이를 통해서는 모노, 및 디메틸 H3-K27 펩티드 기질과 관련하여 kcat가 2.9, 3.7 및 22배 증가한 반면, A687V 돌연변이를 통해서는 비메틸 H3-K27 펩티드에 있어 kcat가 3배 감소하였지만, 모노 및 디메틸 H3-K27 펩티드에 있어서는 kcat가 각각 3.5 및 2.5배 증가하였다. H3-K27 잔기에 바람직한 메틸화 상태를 포함하는 기질에 대해 SAM Km은 효소 형태들 간에 403 ± 64 nM 내지 899 ± 89 nM로 최소의 변동을 보였다.
Figure 112021068876035-pat00113
실시예 16 - EZH2 억제제에 의한 야생형 EZH2 및 EZH2 돌연변이체의 억제
테스트 화합물을 10 지점에 대해 DMSO 중에 3배로 일련으로 희석하고, 384 채널 헤드(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))가 장착된 플레이트매이트 플러스(Platemate Plus)를 이용하여 1 ㎕를 384 웰 마이크로플레이트에 이중으로 스폿팅하였다. 본 검정에서 테스트 화합물의 최종의 최고 농도는 10 μM이었다. 양성 대조군(100% 억제 표준)은 최종 농도 1 mM의 SAH였고, 음성 대조군(0% 억제 표준)은 1 ㎕의 DMSO를 포함하였다. 이어서, 40 ㎕/웰의 1x 검정 완충제(20 mM BICINE(pH = 7.6), 1 mM DTT, 0.002% 트윈 20, 0.005% BSG)) 중 야생형 EZH2(최종 농도는 4 nM이었다), Y641F EZH2(최종 농도는 0.1 nM이었다), 및 A677G 및 A687V EZH2(각각의 최종 농도는 2 nM이었다) 및 펩티드와 함께 테스트 화합물을 30분 동안 인큐베이션하였다. 야생형 EZH2 및 A677G EZH2 검정의 경우, 비메틸화된 K27을 포함하는 비오티닐화된 펩티드 H3:21-44는 200 nM의 최종 농도로 존재하였고, A687V EZH2 검정에서 모노메틸화된 K27을 포함하는 비오티닐화된 펩티드 H3:21-44는 200 nM의 최종 농도로 존재하였고, Y641F EZH2 검정에서 디메틸화된 K27을 포함하는 비오티닐화된 펩티드 H3:21-44는 200 nM의 최종 농도로 존재하였다. 야생형 EZH2 효소를 포함하는 반응을 개시시키기 위해, 1x 검정 완충제 중 표지화되지 않은 SAM(최종 농도는 1,800 nM이었다) 및 3H-SAM(최종 농도는 200 nM이었다)을 함유하는 10 ㎕/웰의 기질 믹스를 첨가하였다. Y641F EZH2 효소를 포함하는 반응을 개시시키기 위해, 1x 검정 완충제 중 표지화되지 않은 SAM(최종 농도는 700 nM이었다), 및 3H-SAM(최종 농도는 300 nM이었다)을 함유하는 10 ㎕/웰의 기질 믹스를 첨가하였다. A677G 또는 A687V EZH2를 포함하는 반응을 개시시키기 위해, 표지화되지 않은 SAM(최종 농도는 400 nM이었다), 및 3H-SAM(최종 농도는 100 nM이었다)을 함유하는 10 ㎕/웰의 기질 믹스를 첨가하였다. 90 min 동안 반응을 진행시킨 후, 과량의 표지화되지 않은 SAM(167 μM)으로 ??칭시킨 후, 스트렙트아비딘으로 코팅된 플래쉬플레이트(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 SMP410)로 옮기고, 1시간 동안 결합시키고, 탑카운트 NXT HTS(퍼킨 엘머)에서 검출하였다. 효소 활성의 억제율(%)에 대한 4-파라미터 피트로부터 IC50 값을 수득하고, 이를 하기 표 7에 표로 작성해 두었다. IC50 값을 도출하는 데 사용된 식은 하기에 제시되어 있다.
Figure 112021068876035-pat00114
여기서, dpm = 분당 붕괴수, cmpd = 검정 웰의 신호, 및 최소 및 최대는 신호 대조군의 최소치 및 최대치.
4-파라미터 IC50 피트
Figure 112021068876035-pat00115
여기서, 최고치 및 최저치는 보통은 변동가능한 수치이지만, 3-파라미터 피트에서는 각각 100 또는 0으로 고정될 수 있다. 힐 계수(Hill Coefficient) 역시 보통은 변동가능한 수치이지만, 3-파라미터 피트에서는 1로 고정될 수 있다. Y는 억제율(%)이고, X는 화합물 농도이다.
Figure 112021068876035-pat00116
Figure 112021068876035-pat00117
Figure 112021068876035-pat00118
실시예 17 - A677 돌연변이체가 EZH2 억제제에 대하여 가장 높은 감수성을 보였다.
파이퍼 세포를 ATCC(CRL-2632)로부터 입수하였다. WSU-DLCL2(ACC 575) 및 OCI-Lyl9(ACC 528) 세포를 DSMZ로부터 입수하였다. 모든 세포를 RPMI + 10% FBS 중에서 유지시켰다. 세포 증식 분석을 위해, 지수 성장하는 파이퍼, WSU-DLC2, 또는 OCI-Lyl9 세포를 각각 최종 부피 150 uL 중 1x105개의 세포/mL, 5x104개의 세포/mL, 또는 2.5x105개의 세포/mL의 밀도로 96 웰 플레이트에 삼중으로 플레이팅하였다. 11일 동안에 걸쳐 IC50 측정을 위해 세포를 0.011 내지 25 uM 범위의 최종 농도의 화합물 번호 7과 함께 인큐베이션시켰다. 11일 동안에 걸쳐 IC50 측정을 위해 세포를 0.00004 내지 10 uM 범위의 최종 농도의 화합물 번호 13과 함께 인큐베이션시켰다. 3 내지 4일마다 구아바 이지사이트 플러스 기기에서 구아바 바이아카운트 검정(밀리포어 #4000-0040)을 이용하여 생존가능한 세포수를 측정하였다. 세포를 계수한 후, 성장 배지 및 EPZ2 억제제(화합물 번호 7 또는 화합물 번호 13)를 교체하고, 세포를 다시 원래의 플레이팅 밀도로 역으로 분할하였다. 시간 경로 중 11일째로부터의 최종 분할 조정된 생존가능한 세포수/mL를 사용하여 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용함으로써 증식 IC50 값을 계산하였다.
이형접합성 EZH2 돌연변이 A677G를 함유하는 파이퍼 세포주가 소분자 억제제 화합물 번호 7에 의한 EZH2 억제에 대해 감수성인 것으로 나타났다. 증식 억제는 억제제 처리 후 96 hr째 정도로 조기에 관찰되었다. Y641F 이형접합성 돌연변이를 함유하는 WSU-DLCL2 세포의 경우, IC50이 270 nM, 또는 EZH2에 대해 야생형인 OCT-Ly19 세포의 경우, IC50이 3,000 nM인 것과 비교하여, 화합물 번호 7로 처리된 파이퍼 세포에 대한 11일 경과 후의 증식 IC50은 5.2 nM이었다. 상기 결과를 통해, 세포와 관련하여 증식에 의해 측정된 바, 소분자 억제제에 의한 억제에 대한 WT 및 돌연변이체 EZH2의 감수성은 A677G>>>Y641F>>WT인 것으로 나타났다.
이형접합성 EZH2 돌연변이 A677G를 함유하는 파이퍼 세포주가 소분자 억제제 화합물 번호 13에 의한 EZH2 억제에 대해 감수성인 것으로 나타났다. 증식 억제는 억제제 처리 후 96 hr째 정도로 조기에 관찰되었다. Y641F 이형접합성 돌연변이를 함유하는 WSU-DLCL2 세포의 경우, IC50이 4.9 nM, 또는 EZH2에 대해 야생형인 OCT-Ly19 세포의 경우, IC50이 430 nM인 것과 비교하여, 화합물 번호 13으로 처리된 파이퍼 세포에 대한 11일 경과 후의 증식 IC50은 0.4 nM이었다. 상기 결과를 통해, 세포와 관련하여 증식에 의해 측정된 바, 소분자 억제제에 의한 억제에 대한 WT 및 돌연변이체 EZH2의 감수성은 A677G>>>Y641F>>WT인 것으로 나타났다.
균등론
본 발명의 실시양태가 본원에 기술되고, 예시되었지만, 당업계의 숙련가들은 기능을 수행하고/거나, 본원에 기술된 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 구상할 것이며, 그러한 각각의 변형 및/또는 수정은 각기 본 발명의 범주내에 포함되는 것으로 간주된다. 더욱 일반적으로, 당업자는 본원에 기술된 모든 파라미터, 크기, 물질 및 구성은 예시적인 것을 의미하고, 실제 파라미터, 크기, 물질 및/또는 구성은 본 발명의 교시가 이용되는 구체적인 적용 또는 적용들에 따라 달라질 것이라는 것을 이해할 것이다. 당업자는 단지 통상적인 실험만을 사용한 경우에도 본원에 기술된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 많은 등가물을 이해하거나, 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 실시양태들은 단지 예로서 제시된 것이며, 첨부된 특허청구범위 및 그에 대한 등가물의 범주내에서 본 발명이 구체적으로 기재되고 청구된 것과는 다른 방식으로 수행될 수도 있다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명은 본원에 기술된 각각의 개별적 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 추가로, 2종 이상의 상기 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법의 임의의 조합은, 상기 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법이 상충되지 않는다면, 본 발명의 범주내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Epizyme, Inc. Kuntz, Kevin Knutson, Sarah Wigle, Timothy <120> Inhibitors of Human EZH2, and Methods of Use Thereof <130> EPIZ-006/002WO <140> PCT/US13/30565 <141> 2013-03-12 <150> US 13/418,242 <151> 2012-03-12 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 746 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Gln Thr Gly Lys Lys Ser Glu Lys Gly Pro Val Cys Trp Arg 1 5 10 15 Lys Arg Val Lys Ser Glu Tyr Met Arg Leu Arg Gln Leu Lys Arg Phe 20 25 30 Arg Arg Ala Asp Glu Val Lys Ser Met Phe Ser Ser Asn Arg Gln Lys 35 40 45 Ile Leu Glu Arg Thr Glu Ile Leu Asn Gln Glu Trp Lys Gln Arg Arg 50 55 60 Ile Gln Pro Val His Ile Leu Thr Ser Val Ser Ser Leu Arg Gly Thr 65 70 75 80 Arg Glu Cys Ser Val Thr Ser Asp Leu Asp Phe Pro Thr Gln Val Ile 85 90 95 Pro Leu Lys Thr Leu Asn Ala Val Ala Ser Val Pro Ile Met Tyr Ser 100 105 110 Trp Ser Pro Leu Gln Gln Asn Phe Met Val Glu Asp Glu Thr Val Leu 115 120 125 His Asn Ile Pro Tyr Met Gly Asp Glu Val Leu Asp Gln Asp Gly Thr 130 135 140 Phe Ile Glu Glu Leu Ile Lys Asn Tyr Asp 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actcaccgaa cagcagctcc caggcgcact 960 tcctcctgaa tgtaccccca acatagatgg accaaatgct aaatctgttc agagagagca 1020 aagcttacac tcctttcata cgcttttctg taggcgatgt tttaaatatg actgcttcct 1080 acatcgtaag tgcaattatt cttttcatgc aacacccaac acttataagc ggaagaacac 1140 agaaacagct ctagacaaca aaccttgtgg accacagtgt taccagcatt tggagggagc 1200 aaaggagttt gctgctgctc tcaccgctga gcggataaag accccaccaa aacgtccagg 1260 aggccgcaga agaggacggc ttcccaataa cagtagcagg cccagcaccc ccaccattaa 1320 tgtgctggaa tcaaaggata cagacagtga tagggaagca gggactgaaa cggggggaga 1380 gaacaatgat aaagaagaag aagagaagaa agatgaaact tcgagctcct ctgaagcaaa 1440 ttctcggtgt caaacaccaa taaagatgaa gccaaatatt gaacctcctg agaatgtgga 1500 gtggagtggt gctgaagcct caatgtttag agtcctcatt ggcacttact atgacaattt 1560 ctgtgccatt gctaggttaa ttgggaccaa aacatgtaga caggtgtatg agtttagagt 1620 caaagaatct agcatcatag ctccagctcc cgctgaggat gtggatactc ctccaaggaa 1680 aaagaagagg aaacaccggt tgtgggctgc acactgcaga aagatacagc tgaaaaagga 1740 cggctcctct aaccatgttt acaactatca accctgtgat catccacggc agccttgtga 1800 cagttcgtgc ccttgtgtga tagcacaaaa tttttgtgaa aagttttgtc aatgtagttc 1860 agagtgtcaa aaccgctttc cgggatgccg ctgcaaagca cagtgcaaca ccaagcagtg 1920 cccgtgctac ctggctgtcc gagagtgtga ccctgacctc tgtcttactt gtggagccgc 1980 tgaccattgg gacagtaaaa atgtgtcctg caagaactgc agtattcagc ggggctccaa 2040 aaagcatcta ttgctggcac catctgacgt ggcaggctgg gggattttta tcaaagatcc 2100 tgtgcagaaa aatgaattca tctcagaata ctgtggagag attatttctc aagatgaagc 2160 tgacagaaga gggaaagtgt atgataaata catgtgcagc tttctgttca acttgaacaa 2220 tgattttgtg gtggatgcaa cccgcaaggg taacaaaatt cgttttgcaa atcattcggt 2280 aaatccaaac tgctatgcaa aagttatgat ggttaacggt gatcacagga taggtatttt 2340 tgccaagaga gccatccaga ctggcgaaga gctgtttttt gattacagat acagccaggc 2400 tgatgccctg aagtatgtcg gcatcgaaag agaaatggaa atcccttgac atctgctacc 2460 tcctcccccc tcctctgaaa cagctgcctt agcttcagga acctcgagta ctgtgggcaa 2520 tttagaaaaa gaacatgcag tttgaaattc tgaatttgca aagtactgta agaataattt 2580 atagtaatga gtttaaaaat caacttttta ttgccttctc accagctgca aagtgttttg 2640 taccagtgaa tttttgcaat aatgcagtat ggtacatttt tcaactttga ataaagaata 2700 cttgaacttg tccttgttga atc 2723 <210> 3 <211> 751 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gly Gln Thr Gly Lys Lys Ser Glu Lys Gly Pro Val Cys Trp Arg 1 5 10 15 Lys Arg Val Lys Ser Glu Tyr Met Arg Leu Arg Gln Leu Lys Arg Phe 20 25 30 Arg Arg Ala Asp Glu Val Lys Ser Met Phe Ser Ser Asn Arg Gln Lys 35 40 45 Ile Leu Glu Arg Thr Glu Ile Leu Asn Gln Glu Trp Lys Gln Arg Arg 50 55 60 Ile Gln Pro Val His Ile Leu Thr Ser Val Ser Ser Leu Arg Gly Thr 65 70 75 80 Arg Glu Cys Ser Val Thr Ser Asp Leu Asp Phe Pro Thr Gln Val Ile 85 90 95 Pro Leu Lys Thr Leu Asn Ala Val Ala Ser Val Pro Ile Met Tyr Ser 100 105 110 Trp Ser Pro Leu Gln Gln Asn Phe Met Val Glu Asp Glu Thr Val Leu 115 120 125 His Asn Ile Pro Tyr Met Gly Asp Glu Val Leu Asp Gln Asp Gly Thr 130 135 140 Phe Ile Glu Glu Leu Ile Lys Asn Tyr Asp Gly Lys Val His Gly Asp 145 150 155 160 Arg Glu Cys Gly Phe Ile Asn Asp Glu Ile Phe Val Glu Leu 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cgggggcgac gcgcgggaac aacgcgagtc ggcgcgcggg 180 acgaagaata atcatgggcc agactgggaa gaaatctgag aagggaccag tttgttggcg 240 gaagcgtgta aaatcagagt acatgcgact gagacagctc aagaggttca gacgagctga 300 tgaagtaaag agtatgttta gttccaatcg tcagaaaatt ttggaaagaa cggaaatctt 360 aaaccaagaa tggaaacagc gaaggataca gcctgtgcac atcctgactt ctgtgagctc 420 attgcgcggg actagggagg tggaagatga aactgtttta cataacattc cttatatggg 480 agatgaagtt ttagatcagg atggtacttt cattgaagaa ctaataaaaa attatgatgg 540 gaaagtacac ggggatagag aatgtgggtt tataaatgat gaaatttttg tggagttggt 600 gaatgccctt ggtcaatata atgatgatga cgatgatgat gatggagacg atcctgaaga 660 aagagaagaa aagcagaaag atctggagga tcaccgagat gataaagaaa gccgcccacc 720 tcggaaattt ccttctgata aaatttttga agccatttcc tcaatgtttc cagataaggg 780 cacagcagaa gaactaaagg aaaaatataa agaactcacc gaacagcagc tcccaggcgc 840 acttcctcct gaatgtaccc ccaacataga tggaccaaat gctaaatctg ttcagagaga 900 gcaaagctta cactcctttc atacgctttt ctgtaggcga tgttttaaat atgactgctt 960 cctacatcct tttcatgcaa cacccaacac ttataagcgg aagaacacag aaacagctct 1020 agacaacaaa ccttgtggac cacagtgtta ccagcatttg gagggagcaa aggagtttgc 1080 tgctgctctc accgctgagc ggataaagac cccaccaaaa cgtccaggag gccgcagaag 1140 aggacggctt cccaataaca gtagcaggcc cagcaccccc accattaatg tgctggaatc 1200 aaaggataca gacagtgata gggaagcagg gactgaaacg gggggagaga acaatgataa 1260 agaagaagaa gagaagaaag atgaaacttc gagctcctct gaagcaaatt ctcggtgtca 1320 aacaccaata aagatgaagc caaatattga acctcctgag aatgtggagt ggagtggtgc 1380 tgaagcctca atgtttagag tcctcattgg cacttactat gacaatttct gtgccattgc 1440 taggttaatt gggaccaaaa catgtagaca ggtgtatgag tttagagtca aagaatctag 1500 catcatagct ccagctcccg ctgaggatgt ggatactcct ccaaggaaaa agaagaggaa 1560 acaccggttg tgggctgcac actgcagaaa gatacagctg aaaaaggacg gctcctctaa 1620 ccatgtttac aactatcaac cctgtgatca tccacggcag ccttgtgaca gttcgtgccc 1680 ttgtgtgata gcacaaaatt tttgtgaaaa gttttgtcaa tgtagttcag agtgtcaaaa 1740 ccgctttccg ggatgccgct gcaaagcaca gtgcaacacc aagcagtgcc cgtgctacct 1800 ggctgtccga gagtgtgacc ctgacctctg 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tgacgtggca ggctggggga tttttatcaa agatcctgtg 60 cagaaaaatg aattcatctc agaatactgt ggagagatta tttctcaaga tgaagctgac 120 agaagaggga aagtgtatga taaatacatg tgcagctttc tgttcaactt gaacaatgat 180 tttgtggtgg atgcaacccg caagggtaac aaaattcgtt ttgcaaatca ttcggtaaat 240 ccaaactgct atgcaaaagt tatgatggtt aacggtgatc acaggatagg tatttttgcc 300 aagagagcca tccagactgg cgaagagctg ttttttgatt ac 342 <210> 9 <211> 746 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Y641 mutant of Homo sapiens EZH2, wherein x can be any amino acid residue other than tyrosine (Y) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (641)..(641) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid other than tyrosine (Y) <400> 9 Met Gly Gln Thr Gly Lys Lys Ser Glu Lys Gly Pro Val Cys Trp Arg 1 5 10 15 Lys Arg Val Lys Ser Glu Tyr Met Arg Leu Arg Gln Leu Lys Arg Phe 20 25 30 Arg Arg Ala Asp Glu Val Lys Ser Met Phe Ser Ser Asn Arg Gln Lys 35 40 45 Ile Leu Glu Arg Thr Glu Ile Leu Asn Gln Glu Trp Lys Gln Arg Arg 50 55 60 Ile Gln Pro Val His Ile Leu Thr Ser Val Ser Ser Leu Arg Gly Thr 65 70 75 80 Arg Glu Cys Ser Val Thr Ser Asp Leu Asp Phe Pro Thr Gln Val Ile 85 90 95 Pro Leu Lys Thr Leu Asn Ala Val Ala Ser Val Pro Ile Met Tyr Ser 100 105 110 Trp Ser Pro Leu Gln Gln Asn Phe Met Val Glu Asp Glu Thr Val Leu 115 120 125 His Asn Ile Pro Tyr Met Gly Asp Glu Val Leu Asp Gln Asp Gly Thr 130 135 140 Phe Ile Glu Glu Leu Ile Lys Asn Tyr Asp Gly Lys Val His Gly Asp 145 150 155 160 Arg Glu Cys Gly Phe Ile Asn Asp Glu Ile Phe Val Glu Leu Val Asn 165 170 175 Ala Leu Gly Gln Tyr Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Glu Glu Arg Glu Glu Lys Gln Lys Asp Leu Glu Asp His Arg Asp 195 200 205 Asp Lys Glu Ser Arg Pro Pro Arg Lys Phe Pro Ser Asp Lys Ile Phe 210 215 220 Glu Ala Ile Ser Ser Met Phe Pro Asp Lys Gly Thr Ala Glu Glu Leu 225 230 235 240 Lys Glu Lys Tyr Lys Glu Leu Thr Glu Gln Gln Leu Pro Gly Ala Leu 245 250 255 Pro Pro Glu Cys Thr Pro Asn Ile Asp Gly Pro Asn Ala Lys Ser Val 260 265 270 Gln Arg Glu Gln Ser Leu His Ser Phe His Thr 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EZH2 <400> 11 Met Gly Gln Thr Gly Lys Lys Ser Glu Lys Gly Pro Val Cys Trp Arg 1 5 10 15 Lys Arg Val Lys Ser Glu Tyr Met Arg Leu Arg Gln Leu Lys Arg Phe 20 25 30 Arg Arg Ala Asp Glu Val Lys Ser Met Phe Ser Ser Asn Arg Gln Lys 35 40 45 Ile Leu Glu Arg Thr Glu Ile Leu Asn Gln Glu Trp Lys Gln Arg Arg 50 55 60 Ile Gln Pro Val His Ile Leu Thr Ser Val Ser Ser Leu Arg Gly Thr 65 70 75 80 Arg Glu Cys Ser Val Thr Ser Asp Leu Asp Phe Pro Thr Gln Val Ile 85 90 95 Pro Leu Lys Thr Leu Asn Ala Val Ala Ser Val Pro Ile Met Tyr Ser 100 105 110 Trp Ser Pro Leu Gln Gln Asn Phe Met Val Glu Asp Glu Thr Val Leu 115 120 125 His Asn Ile Pro Tyr Met Gly Asp Glu Val Leu Asp Gln Asp Gly Thr 130 135 140 Phe Ile Glu Glu Leu Ile Lys Asn Tyr Asp Gly Lys Val His Gly Asp 145 150 155 160 Arg Glu Cys Gly Phe Ile Asn Asp Glu Ile Phe Val Glu Leu Val Asn 165 170 175 Ala Leu Gly Gln Tyr Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Glu Glu Arg Glu Glu Lys Gln Lys Asp Leu Glu Asp His Arg Asp 195 200 205 Asp Lys 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of Homo sapiens EZH2 <400> 14 Met Gly Gln Thr Gly Lys Lys Ser Glu Lys Gly Pro Val Cys Trp Arg 1 5 10 15 Lys Arg Val Lys Ser Glu Tyr Met Arg Leu Arg Gln Leu Lys Arg Phe 20 25 30 Arg Arg Ala Asp Glu Val Lys Ser Met Phe Ser Ser Asn Arg Gln Lys 35 40 45 Ile Leu Glu Arg Thr Glu Ile Leu Asn Gln Glu Trp Lys Gln Arg Arg 50 55 60 Ile Gln Pro Val His Ile Leu Thr Ser Val Ser Ser Leu Arg Gly Thr 65 70 75 80 Arg Glu Cys Ser Val Thr Ser Asp Leu Asp Phe Pro Thr Gln Val Ile 85 90 95 Pro Leu Lys Thr Leu Asn Ala Val Ala Ser Val Pro Ile Met Tyr Ser 100 105 110 Trp Ser Pro Leu Gln Gln Asn Phe Met Val Glu Asp Glu Thr Val Leu 115 120 125 His Asn Ile Pro Tyr Met Gly Asp Glu Val Leu Asp Gln Asp Gly Thr 130 135 140 Phe Ile Glu Glu Leu Ile Lys Asn Tyr Asp Gly Lys Val His Gly Asp 145 150 155 160 Arg Glu Cys Gly Phe Ile Asn Asp Glu Ile Phe Val Glu Leu Val Asn 165 170 175 Ala Leu Gly Gln Tyr Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Glu Glu Arg Glu Glu Lys Gln Lys Asp Leu Glu Asp His Arg Asp 195 200 205 Asp Lys Glu Ser Arg Pro Pro Arg Lys Phe Pro Ser Asp Lys Ile Phe 210 215 220 Glu Ala Ile Ser Ser Met Phe Pro Asp Lys Gly Thr Ala Glu Glu Leu 225 230 235 240 Lys Glu Lys Tyr Lys Glu Leu Thr Glu Gln Gln Leu Pro Gly Ala Leu 245 250 255 Pro Pro Glu Cys Thr Pro Asn Ile Asp Gly Pro Asn Ala Lys Ser Val 260 265 270 Gln Arg Glu Gln Ser Leu His Ser Phe His Thr Leu Phe Cys Arg Arg 275 280 285 Cys Phe Lys Tyr Asp Cys Phe Leu His Pro Phe His Ala Thr Pro Asn 290 295 300 Thr Tyr Lys Arg Lys Asn Thr Glu Thr Ala Leu Asp Asn Lys Pro Cys 305 310 315 320 Gly Pro Gln Cys Tyr Gln His Leu Glu Gly Ala Lys Glu Phe Ala Ala 325 330 335 Ala Leu Thr Ala Glu Arg Ile Lys Thr Pro Pro Lys Arg Pro Gly Gly 340 345 350 Arg Arg Arg Gly Arg Leu Pro Asn Asn Ser Ser Arg Pro Ser Thr Pro 355 360 365 Thr Ile Asn Val Leu Glu Ser Lys Asp Thr Asp Ser Asp Arg Glu Ala 370 375 380 Gly Thr Glu Thr Gly Gly Glu Asn Asn Asp Lys Glu Glu Glu Glu Lys 385 390 395 400 Lys Asp Glu Thr Ser Ser Ser Ser Glu Ala Asn Ser Arg Cys Gln Thr 405 410 415 Pro Ile Lys Met Lys Pro Asn Ile Glu Pro Pro Glu Asn Val Glu Trp 420 425 430 Ser Gly Ala Glu Ala Ser Met Phe Arg Val Leu Ile Gly Thr Tyr Tyr 435 440 445 Asp Asn Phe Cys Ala Ile Ala Arg Leu Ile Gly Thr Lys Thr Cys Arg 450 455 460 Gln Val Tyr Glu Phe Arg Val Lys Glu Ser Ser Ile Ile Ala Pro Ala 465 470 475 480 Pro Ala Glu Asp Val Asp Thr Pro Pro Arg Lys Lys Lys Arg Lys His 485 490 495 Arg Leu Trp Ala Ala His Cys Arg Lys Ile Gln Leu Lys Lys Asp Gly 500 505 510 Ser Ser Asn His Val Tyr Asn Tyr Gln Pro Cys Asp His Pro Arg Gln 515 520 525 Pro Cys Asp Ser Ser Cys Pro Cys Val Ile Ala Gln Asn Phe Cys Glu 530 535 540 Lys Phe Cys Gln Cys Ser Ser Glu Cys Gln Asn Arg Phe Pro Gly Cys 545 550 555 560 Arg Cys Lys Ala Gln Cys Asn Thr Lys Gln Cys Pro Cys Tyr Leu Ala 565 570 575 Val Arg Glu Cys Asp Pro Asp Leu Cys Leu Thr Cys Gly Ala Ala Asp 580 585 590 His Trp Asp Ser Lys Asn Val Ser Cys Lys Asn Cys Ser Ile Gln Arg 595 600 605 Gly Ser Lys Lys His Leu Leu Leu Ala Pro Ser Asp Val Ala Gly Trp 610 615 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20 25 30 Arg Arg Ala Asp Glu Val Lys Ser Met Phe Ser Ser Asn Arg Gln Lys 35 40 45 Ile Leu Glu Arg Thr Glu Ile Leu Asn Gln Glu Trp Lys Gln Arg Arg 50 55 60 Ile Gln Pro Val His Ile Leu Thr Ser Val Ser Ser Leu Arg Gly Thr 65 70 75 80 Arg Glu Cys Ser Val Thr Ser Asp Leu Asp Phe Pro Thr Gln Val Ile 85 90 95 Pro Leu Lys Thr Leu Asn Ala Val Ala Ser Val Pro Ile Met Tyr Ser 100 105 110 Trp Ser Pro Leu Gln Gln Asn Phe Met Val Glu Asp Glu Thr Val Leu 115 120 125 His Asn Ile Pro Tyr Met Gly Asp Glu Val Leu Asp Gln Asp Gly Thr 130 135 140 Phe Ile Glu Glu Leu Ile Lys Asn Tyr Asp Gly Lys Val His Gly Asp 145 150 155 160 Arg Glu Cys Gly Phe Ile Asn Asp Glu Ile Phe Val Glu Leu Val Asn 165 170 175 Ala Leu Gly Gln Tyr Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Glu Glu Arg Glu Glu Lys Gln Lys Asp Leu Glu Asp His Arg Asp 195 200 205 Asp Lys Glu Ser Arg Pro Pro Arg Lys Phe Pro Ser Asp Lys Ile Phe 210 215 220 Glu Ala Ile Ser Ser Met Phe Pro Asp Lys Gly Thr Ala Glu Glu Leu 225 230 235 240 Lys Glu Lys Tyr Lys Glu Leu Thr Glu Gln Gln Leu Pro Gly Ala Leu 245 250 255 Pro Pro Glu Cys Thr Pro Asn Ile Asp Gly Pro Asn Ala Lys Ser Val 260 265 270 Gln Arg Glu Gln Ser Leu His Ser Phe His Thr Leu Phe Cys Arg Arg 275 280 285 Cys Phe Lys Tyr Asp Cys Phe Leu His Pro Phe His Ala Thr Pro Asn 290 295 300 Thr Tyr Lys Arg Lys Asn Thr Glu Thr Ala Leu Asp Asn Lys Pro Cys 305 310 315 320 Gly Pro Gln Cys Tyr Gln His Leu Glu Gly Ala Lys Glu Phe Ala Ala 325 330 335 Ala Leu Thr Ala Glu Arg Ile Lys Thr Pro Pro Lys Arg Pro Gly Gly 340 345 350 Arg Arg Arg Gly Arg Leu Pro Asn Asn Ser Ser Arg Pro Ser Thr Pro 355 360 365 Thr Ile Asn Val Leu Glu Ser Lys Asp Thr Asp Ser Asp Arg Glu Ala 370 375 380 Gly Thr Glu Thr Gly Gly Glu Asn Asn Asp Lys Glu Glu Glu Glu Lys 385 390 395 400 Lys Asp Glu Thr Ser Ser Ser Ser Glu Ala Asn Ser Arg Cys Gln Thr 405 410 415 Pro Ile Lys Met Lys Pro Asn Ile Glu Pro Pro Glu Asn Val Glu Trp 420 425 430 Ser Gly Ala Glu Ala Ser Met Phe Arg Val Leu Ile Gly Thr Tyr Tyr 435 440 445 Asp Asn Phe Cys Ala Ile Ala Arg Leu Ile Gly Thr Lys Thr Cys Arg 450 455 460 Gln Val Tyr Glu Phe Arg Val Lys Glu Ser Ser Ile Ile Ala Pro Ala 465 470 475 480 Pro Ala Glu Asp Val Asp Thr Pro Pro Arg Lys Lys Lys Arg Lys His 485 490 495 Arg Leu Trp Ala Ala His Cys Arg Lys Ile Gln Leu Lys Lys Asp Gly 500 505 510 Ser Ser Asn His Val Tyr Asn Tyr Gln Pro Cys Asp His Pro Arg Gln 515 520 525 Pro Cys Asp Ser Ser Cys Pro Cys Val Ile Ala Gln Asn Phe Cys Glu 530 535 540 Lys Phe Cys Gln Cys Ser Ser Glu Cys Gln Asn Arg Phe Pro Gly Cys 545 550 555 560 Arg Cys Lys Ala Gln Cys Asn Thr Lys Gln Cys Pro Cys Tyr Leu Ala 565 570 575 Val Arg Glu Cys Asp Pro Asp Leu Cys Leu Thr Cys Gly Ala Ala Asp 580 585 590 His Trp Asp Ser Lys Asn Val Ser Cys Lys Asn Cys Ser Ile Gln Arg 595 600 605 Gly Ser Lys Lys His Leu Leu Leu Ala Pro Ser Asp Val Ala Gly Trp 610 615 620 Gly Ile Phe Ile Lys Asp Pro Val Gln Lys Asn Glu Phe Ile Ser Glu 625 630 635 640 Tyr Cys Gly Glu Ile Ile Ser Gln Asp Glu Ala Asp Arg Arg Gly Lys 645 650 655 Val Tyr Asp Lys Tyr Met Cys Ser Phe Leu Phe Asn Leu Asn Asn Asp 660 665 670 Phe Val Val Asp Xaa Thr Arg Lys Gly Asn Lys Ile Arg Phe Ala Asn 675 680 685 His Ser Val Asn Pro Asn Cys Tyr Ala Lys Val Met Met Val Asn Gly 690 695 700 Asp His Arg Ile Gly Ile Phe Ala Lys Arg Ala Ile Gln Thr Gly Glu 705 710 715 720 Glu Leu Phe Phe Asp Tyr Arg Tyr Ser Gln Ala Asp Ala Leu Lys Tyr 725 730 735 Val Gly Ile Glu Arg Glu Met Glu Ile Pro 740 745 <210> 16 <211> 746 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A687 mutant of Homo sapiens EZH2, wherein X is preferably a valine (V) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (687)..(687) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably a valine (V) <400> 16 Met Gly Gln Thr Gly Lys Lys Ser Glu Lys Gly Pro Val Cys Trp Arg 1 5 10 15 Lys Arg Val Lys Ser Glu Tyr Met Arg Leu Arg Gln Leu Lys Arg Phe 20 25 30 Arg Arg Ala Asp Glu Val Lys Ser Met Phe Ser Ser Asn Arg Gln Lys 35 40 45 Ile Leu Glu Arg Thr Glu Ile Leu Asn Gln Glu Trp Lys Gln Arg Arg 50 55 60 Ile Gln Pro Val His Ile Leu Thr Ser Val Ser Ser Leu Arg Gly Thr 65 70 75 80 Arg Glu Cys Ser Val Thr Ser Asp Leu Asp Phe Pro Thr Gln Val Ile 85 90 95 Pro Leu Lys Thr Leu Asn Ala Val Ala Ser Val Pro Ile Met Tyr Ser 100 105 110 Trp Ser Pro Leu Gln Gln Asn Phe Met Val Glu Asp Glu Thr Val Leu 115 120 125 His Asn Ile Pro Tyr Met Gly Asp Glu Val Leu Asp Gln Asp Gly Thr 130 135 140 Phe Ile Glu Glu Leu Ile Lys Asn Tyr Asp Gly Lys Val His Gly Asp 145 150 155 160 Arg Glu Cys Gly Phe Ile Asn Asp Glu Ile Phe Val Glu Leu Val Asn 165 170 175 Ala Leu Gly Gln Tyr Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Glu Glu Arg Glu Glu Lys Gln Lys Asp Leu Glu Asp His Arg Asp 195 200 205 Asp Lys Glu Ser Arg Pro Pro Arg Lys Phe Pro Ser Asp Lys Ile Phe 210 215 220 Glu Ala Ile Ser Ser Met Phe Pro Asp Lys Gly Thr Ala Glu Glu Leu 225 230 235 240 Lys Glu Lys Tyr Lys Glu Leu Thr Glu Gln Gln Leu Pro Gly Ala Leu 245 250 255 Pro Pro Glu Cys Thr Pro Asn Ile Asp Gly Pro Asn Ala Lys Ser Val 260 265 270 Gln Arg Glu Gln Ser Leu His Ser Phe His Thr Leu Phe Cys Arg Arg 275 280 285 Cys Phe Lys Tyr Asp Cys Phe Leu His Pro Phe His Ala Thr Pro Asn 290 295 300 Thr Tyr Lys Arg Lys Asn Thr Glu Thr Ala Leu Asp Asn Lys Pro Cys 305 310 315 320 Gly Pro Gln Cys Tyr Gln His Leu Glu Gly Ala Lys Glu Phe Ala Ala 325 330 335 Ala Leu Thr Ala Glu Arg Ile Lys Thr Pro Pro Lys Arg Pro Gly Gly 340 345 350 Arg Arg Arg Gly Arg Leu Pro Asn Asn Ser Ser Arg Pro Ser Thr Pro 355 360 365 Thr Ile Asn Val Leu Glu Ser Lys Asp Thr Asp Ser Asp Arg Glu Ala 370 375 380 Gly Thr Glu Thr Gly Gly Glu Asn Asn Asp Lys Glu Glu Glu Glu Lys 385 390 395 400 Lys Asp Glu Thr Ser Ser Ser Ser Glu Ala Asn Ser Arg Cys Gln Thr 405 410 415 Pro Ile Lys Met Lys Pro Asn Ile Glu Pro Pro Glu Asn Val Glu Trp 420 425 430 Ser Gly Ala Glu Ala Ser Met Phe Arg Val Leu Ile Gly Thr Tyr Tyr 435 440 445 Asp Asn Phe Cys Ala Ile Ala Arg Leu Ile Gly Thr Lys Thr Cys Arg 450 455 460 Gln Val Tyr Glu Phe Arg Val Lys Glu Ser Ser Ile Ile Ala Pro Ala 465 470 475 480 Pro Ala Glu Asp Val Asp Thr Pro Pro Arg Lys Lys Lys Arg Lys His 485 490 495 Arg Leu Trp Ala Ala His Cys Arg Lys Ile Gln Leu Lys Lys Asp Gly 500 505 510 Ser Ser Asn His Val Tyr Asn Tyr Gln Pro Cys Asp His Pro Arg Gln 515 520 525 Pro Cys Asp Ser Ser Cys Pro Cys Val Ile Ala Gln Asn Phe Cys Glu 530 535 540 Lys Phe Cys Gln Cys Ser Ser Glu Cys Gln Asn Arg Phe Pro Gly Cys 545 550 555 560 Arg Cys Lys Ala Gln Cys Asn Thr Lys Gln Cys Pro Cys Tyr Leu Ala 565 570 575 Val Arg Glu Cys Asp Pro Asp Leu Cys Leu Thr Cys Gly Ala Ala Asp 580 585 590 His Trp Asp Ser Lys Asn Val Ser Cys Lys Asn Cys Ser Ile Gln Arg 595 600 605 Gly Ser Lys Lys His Leu Leu Leu Ala Pro Ser Asp Val Ala Gly Trp 610 615 620 Gly Ile Phe Ile Lys Asp Pro Val Gln Lys Asn Glu Phe Ile Ser Glu 625 630 635 640 Tyr Cys Gly Glu Ile Ile Ser Gln Asp Glu Ala Asp Arg Arg Gly Lys 645 650 655 Val Tyr Asp Lys Tyr Met Cys Ser Phe Leu Phe Asn Leu Asn Asn Asp 660 665 670 Phe Val Val Asp Ala Thr Arg Lys Gly Asn Lys Ile Arg Phe Xaa Asn 675 680 685 His Ser Val Asn Pro Asn Cys Tyr Ala Lys Val Met Met Val Asn Gly 690 695 700 Asp His Arg Ile Gly Ile Phe Ala Lys Arg Ala Ile Gln Thr Gly Glu 705 710 715 720 Glu Leu Phe Phe Asp Tyr Arg Tyr Ser Gln Ala Asp Ala Leu Lys Tyr 725 730 735 Val Gly Ile Glu Arg Glu Met Glu Ile Pro 740 745 <210> 17 <211> 746 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens EZH2 with a mutation at residue 685, wherein X is preferably a cysteine (C) or a histidine (H) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (685)..(685) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, preferably a cysteine (C) or a histidine (H) <400> 17 Met Gly Gln Thr Gly Lys Lys Ser Glu Lys Gly Pro Val Cys Trp Arg 1 5 10 15 Lys Arg Val Lys Ser Glu Tyr Met Arg Leu Arg Gln Leu Lys Arg Phe 20 25 30 Arg Arg Ala Asp Glu Val Lys Ser Met Phe Ser Ser Asn Arg Gln Lys 35 40 45 Ile Leu Glu Arg Thr Glu Ile Leu Asn Gln Glu Trp Lys Gln Arg Arg 50 55 60 Ile Gln Pro Val His Ile Leu Thr Ser Val Ser Ser Leu Arg Gly Thr 65 70 75 80 Arg Glu Cys Ser Val Thr Ser Asp Leu Asp Phe Pro Thr Gln Val Ile 85 90 95 Pro Leu Lys Thr Leu Asn Ala Val Ala Ser Val Pro Ile Met Tyr Ser 100 105 110 Trp Ser Pro Leu Gln Gln Asn Phe Met Val Glu Asp Glu Thr Val Leu 115 120 125 His Asn Ile Pro Tyr Met Gly Asp Glu Val Leu Asp Gln Asp Gly Thr 130 135 140 Phe Ile Glu Glu Leu Ile Lys Asn Tyr Asp Gly Lys Val His Gly Asp 145 150 155 160 Arg Glu Cys Gly Phe Ile Asn Asp Glu Ile Phe Val Glu Leu Val Asn 165 170 175 Ala Leu Gly Gln Tyr Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Glu Glu Arg Glu Glu Lys Gln Lys Asp Leu Glu Asp His Arg Asp 195 200 205 Asp Lys Glu Ser Arg Pro Pro Arg Lys Phe Pro Ser Asp Lys Ile Phe 210 215 220 Glu Ala Ile Ser Ser Met Phe Pro Asp Lys Gly Thr Ala Glu Glu Leu 225 230 235 240 Lys Glu Lys Tyr Lys Glu Leu Thr Glu Gln Gln Leu Pro Gly Ala Leu 245 250 255 Pro Pro Glu Cys Thr Pro Asn Ile Asp Gly Pro Asn Ala Lys Ser Val 260 265 270 Gln Arg Glu Gln Ser Leu His Ser Phe His Thr Leu Phe Cys Arg Arg 275 280 285 Cys Phe Lys Tyr Asp Cys Phe Leu His Pro Phe His Ala Thr Pro Asn 290 295 300 Thr Tyr Lys Arg Lys Asn Thr Glu Thr Ala Leu Asp Asn Lys Pro Cys 305 310 315 320 Gly Pro Gln Cys Tyr Gln His Leu Glu Gly Ala Lys Glu Phe Ala Ala 325 330 335 Ala Leu Thr Ala Glu Arg Ile Lys Thr Pro Pro Lys Arg Pro Gly Gly 340 345 350 Arg Arg Arg Gly Arg Leu Pro Asn Asn Ser Ser Arg Pro Ser Thr Pro 355 360 365 Thr Ile Asn Val Leu Glu Ser Lys Asp Thr Asp Ser Asp Arg Glu Ala 370 375 380 Gly Thr Glu Thr Gly Gly Glu Asn Asn Asp Lys Glu Glu Glu Glu Lys 385 390 395 400 Lys Asp Glu Thr Ser Ser Ser Ser Glu Ala Asn Ser Arg Cys Gln Thr 405 410 415 Pro Ile Lys Met Lys Pro Asn Ile Glu Pro Pro Glu Asn Val Glu Trp 420 425 430 Ser Gly Ala Glu Ala Ser Met Phe Arg Val Leu Ile Gly Thr Tyr Tyr 435 440 445 Asp Asn Phe Cys Ala Ile Ala Arg Leu Ile Gly Thr Lys Thr Cys Arg 450 455 460 Gln Val Tyr Glu Phe Arg Val Lys Glu Ser Ser Ile Ile Ala Pro Ala 465 470 475 480 Pro Ala Glu Asp Val Asp Thr Pro Pro Arg Lys Lys Lys Arg Lys His 485 490 495 Arg Leu Trp Ala Ala His Cys Arg Lys Ile Gln Leu Lys Lys Asp Gly 500 505 510 Ser Ser Asn His Val Tyr Asn Tyr Gln Pro Cys Asp His Pro Arg Gln 515 520 525 Pro Cys Asp Ser Ser Cys Pro Cys Val Ile Ala Gln Asn Phe Cys Glu 530 535 540 Lys Phe Cys Gln Cys Ser Ser Glu Cys Gln Asn Arg Phe Pro Gly Cys 545 550 555 560 Arg Cys Lys Ala Gln Cys Asn Thr Lys Gln Cys Pro Cys Tyr Leu Ala 565 570 575 Val Arg Glu Cys Asp Pro Asp Leu Cys Leu Thr Cys Gly Ala Ala Asp 580 585 590 His Trp Asp Ser Lys Asn Val Ser Cys Lys Asn Cys Ser Ile Gln Arg 595 600 605 Gly Ser Lys Lys His Leu Leu Leu Ala Pro Ser Asp Val Ala Gly Trp 610 615 620 Gly Ile Phe Ile Lys Asp Pro Val Gln Lys Asn Glu Phe Ile Ser Glu 625 630 635 640 Tyr Cys Gly Glu Ile Ile Ser Gln Asp Glu Ala Asp Arg Arg Gly Lys 645 650 655 Val Tyr Asp Lys Tyr Met Cys Ser Phe Leu Phe Asn Leu Asn Asn Asp 660 665 670 Phe Val Val Asp Ala Thr Arg Lys Gly Asn Lys Ile Xaa Phe Ala Asn 675 680 685 His Ser Val Asn Pro Asn Cys Tyr Ala Lys Val Met Met Val Asn Gly 690 695 700 Asp His Arg Ile Gly Ile Phe Ala Lys Arg Ala Ile Gln Thr Gly Glu 705 710 715 720 Glu Leu Phe Phe Asp Tyr Arg Tyr Ser Gln Ala Asp Ala Leu Lys Tyr 725 730 735 Val Gly Ile Glu Arg Glu Met Glu Ile Pro 740 745 <210> 18 <211> 745 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Homo sapiens EZH2 comprising one or more mutations in the substrate pocket domain, wherein X can be any amino acid except the corresponding wild type residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (641)..(641) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, except the corresponding wild type residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (663)..(665) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, except the corresponding wild type residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (667)..(667) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, except the corresponding wild type residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (674)..(675) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, except the corresponding wild type residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (677)..(677) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, except the corresponding wild type residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (684)..(687) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, except the corresponding wild type residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (707)..(707) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, except the corresponding wild type residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (723)..(723) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, except the corresponding wild type residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (725)..(725) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, except the corresponding wild type residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (729)..(729) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, except the corresponding wild type residue <400> 18 Met Gly Gln Thr Gly Lys Lys Ser Glu Lys Gly Pro Val Cys Trp Arg 1 5 10 15 Lys Arg Val Lys Ser Glu Tyr Met Arg Leu Arg Gln Leu Lys Arg Phe 20 25 30 Arg Arg Ala Asp Glu Val Lys Ser Met Phe Ser Ser Asn Arg Gln Lys 35 40 45 Ile Leu Glu Arg Thr Glu Ile Leu Asn Gln Glu Trp Lys Gln Arg Arg 50 55 60 Ile Gln Pro Val His Ile Leu Thr Ser Val Ser Ser Leu Arg Gly Thr 65 70 75 80 Arg Glu Cys Ser Val Thr Ser Asp Leu Asp Phe Pro Thr Gln Val Ile 85 90 95 Pro Leu Lys Thr Leu Asn Ala Val Ala Ser Val Pro Ile Met Tyr Ser 100 105 110 Trp Ser Pro Leu Gln Gln Asn Phe Met Val Glu Asp Glu Thr Val Leu 115 120 125 His Asn Ile Pro Tyr Met Gly Asp Glu Val Leu Asp Gln Asp Gly Thr 130 135 140 Phe Ile Glu Glu Leu Ile Lys Asn Tyr Asp Gly Lys Val His Gly Asp 145 150 155 160 Arg Glu Cys Gly Phe Ile Asn Asp Glu Ile Phe Val Glu Leu Val Asn 165 170 175 Ala Leu Gly Gln Tyr Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Glu Glu Arg Glu Glu Lys Gln Lys Asp Leu Glu Asp His Arg Asp 195 200 205 Asp Lys Glu Ser Arg Pro Pro Arg Lys Phe Pro Ser Asp Lys Ile Phe 210 215 220 Glu Ala Ile Ser Ser Met Phe Pro Asp Lys Gly Thr Ala Glu Glu Leu 225 230 235 240 Lys Glu Lys Tyr Lys Glu Leu Thr Glu Gln Gln Leu Pro Gly Ala Leu 245 250 255 Pro Pro Glu Cys Thr Pro Asn Ile Asp Gly Pro Asn Ala Lys Ser Val 260 265 270 Gln Arg Glu Gln Ser Leu His Ser Phe His Thr Leu Phe Cys Arg Arg 275 280 285 Cys Phe Lys Tyr Asp Cys Phe Leu His Pro Phe His Ala Thr Pro Asn 290 295 300 Thr Tyr Lys Arg Lys Asn Thr Glu Thr Ala Leu Asp Asn Lys Pro Cys 305 310 315 320 Gly Pro Gln Cys Tyr Gln His Leu Glu Gly Ala Lys Glu Phe Ala Ala 325 330 335 Ala Leu Thr Ala Glu Arg Ile Lys Thr Pro Pro Lys Arg Pro Gly Gly 340 345 350 Arg Arg Arg Gly Arg Leu Pro Asn Asn Ser Ser Arg Pro Ser Thr Pro 355 360 365 Thr Ile Asn Val Leu Glu Ser Lys Asp Thr Asp Ser Asp Arg Glu Ala 370 375 380 Gly Thr Glu Thr Gly Gly Glu Asn Asn Asp Lys Glu Glu Glu Glu Lys 385 390 395 400 Lys Asp Glu Thr Ser Ser Ser Ser Glu Ala Asn Ser Arg Cys Gln Thr 405 410 415 Pro Ile Lys Met Lys Pro Asn Ile Glu Pro Pro Glu Asn Val Glu Trp 420 425 430 Ser Gly Ala Glu Ala Ser Met Phe Arg Val Leu Ile Gly Thr Tyr Tyr 435 440 445 Asp Asn Phe Cys Ala Ile Ala Arg Leu Ile Gly Thr Lys Thr Cys Arg 450 455 460 Gln Val Tyr Glu Phe Arg Val Lys Glu Ser Ser Ile Ile Ala Pro Ala 465 470 475 480 Pro Ala Glu Asp Val Asp Thr Pro Pro Arg Lys Lys Lys Arg Lys His 485 490 495 Arg Leu Trp Ala Ala His Cys Arg Lys Ile Gln Leu Lys Lys Asp Gly 500 505 510 Ser Ser Asn His Val Tyr Asn Tyr Gln Pro Cys Asp His Pro Arg Gln 515 520 525 Pro Cys Asp Ser Ser Cys Pro Cys Val Ile Ala Gln Asn Phe Cys Glu 530 535 540 Lys Phe Cys Gln Cys Ser Ser Glu Cys Gln Asn Arg Phe Pro Gly Cys 545 550 555 560 Arg Cys Lys Ala Gln Cys Asn Thr Lys Gln Cys Pro Cys Tyr Leu Ala 565 570 575 Val Arg Glu Cys Asp Pro Asp Leu Cys Leu Thr Cys Gly Ala Ala Asp 580 585 590 His Trp Asp Ser Lys Asn Val Ser Cys Lys Asn Cys Ser Ile Gln Arg 595 600 605 Gly Ser Lys Lys His Leu Leu Leu Ala Pro Ser Asp Val Ala Gly Trp 610 615 620 Gly Ile Phe Ile Lys Asp Pro Val Gln Lys Asn Glu Phe Ile Ser Glu 625 630 635 640 Xaa Cys Gly Glu Ile Ile Ser Gln Asp Glu Ala Asp Arg Arg Gly Lys 645 650 655 Val Tyr Asp Lys Tyr Met Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Asn Leu Asn Asn Asp 660 665 670 Phe Xaa Xaa Asp Xaa Thr Arg Lys Gly Asn Lys Xaa Xaa Xaa Xaa His 675 680 685 Ser Val Asn Pro Asn Cys Tyr Ala Lys Val Met Met Val Asn Gly Asp 690 695 700 His Arg Xaa Gly Ile Phe Ala Lys Arg Ala Ile Gln Thr Gly Glu Glu 705 710 715 720 Leu Phe Xaa Asp Xaa Arg Tyr Ser Xaa Ala Asp Ala Leu Lys Tyr Val 725 730 735 Gly Ile Glu Arg Glu Met Glu Ile Pro 740 745 <210> 19 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment from Homo sapiens histone H3 <400> 19 Leu Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr Gly Gly Val 1 5 10 15 Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro 20 <210> 20 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Biotin is attached through an aminohexyl linker (AHX) <400> 20 Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr Gly Gly Val Lys 1 5 10 15 Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Gly Lys 20 25 <210> 21 <211> 695 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Gly Gln Thr Gly Lys Lys Ser Glu Lys Gly Pro Val Cys Trp Arg 1 5 10 15 Lys Arg Val Lys Ser Glu Tyr Met Arg Leu Arg Gln Leu Lys Arg Phe 20 25 30 Arg Arg Ala Asp Glu Val Lys Ser Met Phe Ser Ser Asn Arg Gln Lys 35 40 45 Ile Leu Glu Arg Thr Glu Ile Leu Asn Gln Glu Trp Lys Gln Arg Arg 50 55 60 Ile Gln Pro Val His Ile Leu Thr Ser Cys Ser Val Thr Ser Asp Leu 65 70 75 80 Asp Phe Pro Thr Gln Val Ile Pro Leu Lys Thr Leu Asn Ala Val Ala 85 90 95 Ser Val Pro Ile Met Tyr Ser Trp Ser Pro Leu Gln Gln Asn Phe Met 100 105 110 Val Glu Asp Glu Thr Val Leu His Asn Ile Pro Tyr Met Gly Asp Glu 115 120 125 Val Leu Asp Gln Asp Gly Thr Phe Ile Glu Glu Leu Ile Lys Asn Tyr 130 135 140 Asp Gly Lys Val His Gly Asp Arg Glu Cys Gly Phe Ile Asn Asp Glu 145 150 155 160 Ile Phe Val Glu Leu Val Asn Ala Leu Gly Gln Tyr Asn Asp Asp Asp 165 170 175 Asp Asp Asp Asp Gly Asp Asp Pro Glu Glu Arg Glu Glu Lys Gln Lys 180 185 190 Asp Leu Glu Asp His Arg Asp Asp Lys Glu Ser Arg Pro Pro Arg Lys 195 200 205 Phe Pro Ser Asp Lys Ile Phe Glu Ala Ile Ser Ser Met Phe Pro Asp 210 215 220 Lys Gly Thr Ala Glu Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Lys Glu Leu Thr Glu 225 230 235 240 Gln Gln Leu Pro Gly Ala Leu Pro Pro Glu Cys Thr Pro Asn Ile Asp 245 250 255 Gly Pro Asn Ala Lys Ser Val Gln Arg Glu Gln Ser Leu His Ser Phe 260 265 270 His Thr Leu Phe Cys Arg Arg Cys Phe Lys Tyr Asp Cys Phe Leu His 275 280 285 Pro Phe His Ala Thr Pro Asn Thr Tyr Lys Arg Lys Asn Thr Glu Thr 290 295 300 Ala Leu Asp Asn Lys Pro Cys Gly Pro Gln Cys Tyr Gln His Leu Glu 305 310 315 320 Gly Ala Lys Glu Phe Ala Ala Ala Leu Thr Ala Glu Arg Ile Lys Thr 325 330 335 Pro Pro Lys Arg Pro Gly Gly Arg Arg Arg Gly Arg Leu Pro Asn Asn 340 345 350 Ser Ser Arg Pro Ser Thr Pro Thr Ile Asn Val Leu Glu Ser Lys Asp 355 360 365 Thr Asp Ser Asp Arg Glu Ala Gly Thr Glu Thr Gly Gly Glu Asn Asn 370 375 380 Asp Lys Glu Glu Glu Glu Lys Lys Asp Glu Thr Ser Ser Ser Ser Glu 385 390 395 400 Ala Asn Ser Arg Cys Gln Thr Pro Ile Lys Met Lys Pro Asn Ile Glu 405 410 415 Pro Pro Glu Asn Val Glu Trp Ser Gly Ala Glu Ala Ser Met Phe Arg 420 425 430 Val Leu Ile Gly Thr Tyr Tyr Asp Asn Phe Cys Ala Ile Ala Arg Leu 435 440 445 Ile Gly Thr Lys Thr Cys Arg Gln Val Tyr Glu Phe Arg Val Lys Glu 450 455 460 Ser Ser Ile Ile Ala Pro Ala Pro Ala Glu Asp Val Asp Thr Pro Pro 465 470 475 480 Arg Lys Lys Lys Arg Lys His Arg Leu Trp Ala Ala His Cys Arg Lys 485 490 495 Ile Gln Leu Lys Lys Gly Gln Asn Arg Phe Pro Gly Cys Arg Cys Lys 500 505 510 Ala Gln Cys Asn Thr Lys Gln Cys Pro Cys Tyr Leu Ala Val Arg Glu 515 520 525 Cys Asp Pro Asp Leu Cys Leu Thr Cys Gly Ala Ala Asp His Trp Asp 530 535 540 Ser Lys Asn Val Ser Cys Lys Asn Cys Ser Ile Gln Arg Gly Ser Lys 545 550 555 560 Lys His Leu Leu Leu Ala Pro Ser Asp Val Ala Gly Trp Gly Ile Phe 565 570 575 Ile Lys Asp Pro Val Gln Lys Asn Glu Phe Ile Ser Glu Tyr Cys Gly 580 585 590 Glu Ile Ile Ser Gln Asp Glu Ala Asp Arg Arg Gly Lys Val Tyr Asp 595 600 605 Lys Tyr Met Cys Ser Phe Leu Phe Asn Leu Asn Asn Asp Phe Val Val 610 615 620 Asp Ala Thr Arg Lys Gly Asn Lys Ile Arg Phe Ala Asn His Ser Val 625 630 635 640 Asn Pro Asn Cys Tyr Ala Lys Val Met Met Val Asn Gly Asp His Arg 645 650 655 Ile Gly Ile Phe Ala Lys Arg Ala Ile Gln Thr Gly Glu Glu Leu Phe 660 665 670 Phe Asp Tyr Arg Tyr Ser Gln Ala Asp Ala Leu Lys Tyr Val Gly Ile 675 680 685 Glu Arg Glu Met Glu Ile Pro 690 695 <210> 22 <211> 2682 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gacgacgttc gcggcgggga actcggagta gcttcgcctc tgacgtttcc ccacgacgca 60 ccccgaaatc cccctgagct ccggcggtcg cgggctgccc tcgccgcctg gtctggcttt 120 atgctaagtt tgagggaaga gtcgagctgc tctgctctct attgattgtg tttctggagg 180 gcgtcctgtt gaattcccac ttcattgtgt acatcccctt ccgttccccc caaaaatctg 240 tgccacaggg ttactttttg aaagcgggag gaatcgagaa gcacgatctt ttggaaaact 300 tggtgaacgc ctaaataatc atgggccaga ctgggaagaa atctgagaag ggaccagttt 360 gttggcggaa gcgtgtaaaa tcagagtaca tgcgactgag acagctcaag aggttcagac 420 gagctgatga agtaaagagt atgtttagtt ccaatcgtca gaaaattttg gaaagaacgg 480 aaatcttaaa ccaagaatgg aaacagcgaa ggatacagcc tgtgcacatc ctgacttctt 540 gttcggtgac cagtgacttg gattttccaa cacaagtcat cccattaaag actctgaatg 600 cagttgcttc agtacccata atgtattctt ggtctcccct acagcagaat tttatggtgg 660 aagatgaaac tgttttacat aacattcctt atatgggaga tgaagtttta gatcaggatg 720 gtactttcat tgaagaacta ataaaaaatt atgatgggaa agtacacggg gatagagaat 780 gtgggtttat aaatgatgaa atttttgtgg agttggtgaa tgcccttggt caatataatg 840 atgatgacga tgatgatgat ggagacgatc ctgaagaaag agaagaaaag cagaaagatc 900 tggaggatca ccgagatgat aaagaaagcc gcccacctcg gaaatttcct tctgataaaa 960 tttttgaagc catttcctca atgtttccag ataagggcac agcagaagaa ctaaaggaaa 1020 aatataaaga actcaccgaa cagcagctcc caggcgcact tcctcctgaa tgtaccccca 1080 acatagatgg accaaatgct aaatctgttc agagagagca aagcttacac tcctttcata 1140 cgcttttctg taggcgatgt tttaaatatg actgcttcct acatcctttt catgcaacac 1200 ccaacactta taagcggaag aacacagaaa cagctctaga caacaaacct tgtggaccac 1260 agtgttacca gcatttggag ggagcaaagg agtttgctgc tgctctcacc gctgagcgga 1320 taaagacccc accaaaacgt ccaggaggcc gcagaagagg acggcttccc aataacagta 1380 gcaggcccag cacccccacc attaatgtgc tggaatcaaa ggatacagac agtgataggg 1440 aagcagggac tgaaacgggg ggagagaaca atgataaaga agaagaagag aagaaagatg 1500 aaacttcgag ctcctctgaa gcaaattctc ggtgtcaaac accaataaag atgaagccaa 1560 atattgaacc tcctgagaat gtggagtgga gtggtgctga agcctcaatg tttagagtcc 1620 tcattggcac ttactatgac aatttctgtg ccattgctag gttaattggg accaaaacat 1680 gtagacaggt gtatgagttt agagtcaaag aatctagcat catagctcca gctcccgctg 1740 aggatgtgga tactcctcca aggaaaaaga agaggaaaca ccggttgtgg gctgcacact 1800 gcagaaagat acagctgaaa aagggtcaaa accgctttcc gggatgccgc tgcaaagcac 1860 agtgcaacac caagcagtgc ccgtgctacc tggctgtccg agagtgtgac cctgacctct 1920 gtcttacttg tggagccgct gaccattggg acagtaaaaa tgtgtcctgc aagaactgca 1980 gtattcagcg gggctccaaa aagcatctat tgctggcacc atctgacgtg gcaggctggg 2040 ggatttttat caaagatcct gtgcagaaaa atgaattcat ctcagaatac tgtggagaga 2100 ttatttctca agatgaagct gacagaagag ggaaagtgta tgataaatac atgtgcagct 2160 ttctgttcaa cttgaacaat gattttgtgg tggatgcaac ccgcaagggt aacaaaattc 2220 gttttgcaaa tcattcggta aatccaaact gctatgcaaa agttatgatg gttaacggtg 2280 atcacaggat aggtattttt gccaagagag ccatccagac tggcgaagag ctgttttttg 2340 attacagata cagccaggct gatgccctga agtatgtcgg catcgaaaga gaaatggaaa 2400 tcccttgaca tctgctacct cctcccccct cctctgaaac agctgcctta gcttcaggaa 2460 cctcgagtac tgtgggcaat ttagaaaaag aacatgcagt ttgaaattct gaatttgcaa 2520 agtactgtaa gaataattta tagtaatgag tttaaaaatc aactttttat tgccttctca 2580 ccagctgcaa agtgttttgt accagtgaat ttttgcaata atgcagtatg gtacattttt 2640 caactttgaa taaagaatac ttgaacttgt ccttgttgaa tc 2682

Claims (34)

  1. 서열 번호 1의 제스트 상동체 2의 인핸서(EZH2) 폴리펩티드 내 아미노산 위치 687 또는 677에서, 또는 이소폼 a(서열 번호 3)의 제스트 상동체 2의 인핸서(EZH2) 폴리펩티드 내 아미노산 위치 692 또는 682에서, 또는 이소폼 b(서열 번호 5)의 제스트 상동체 2의 인핸서(EZH2) 폴리펩티드 내 아미노산 위치 648 또는 638에서, 돌연변이의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 방법으로서, 상기 EZH2 폴리펩티드는 암을 앓고 있는 피험체로부터 수득된 생물학적 시료 내에 존재하는 것인 방법.
  2. 제스트 상동체 2의 인핸서(EZH2) 내 돌연변이의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 방법으로서, 돌연변이가 서열 번호 1의 제스트 상동체 2의 인핸서(EZH2) 폴리펩티드 내 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 시스테인(C)으로의 치환(Y641C), 또는 이소폼 a(서열 번호 3)의 제스트 상동체 2의 인핸서(EZH2) 폴리펩티드 내 아미노산 위치 646에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 시스테인(C)으로의 치환(Y646C), 또는 이소폼 b(서열 번호 5)의 제스트 상동체 2의 인핸서(EZH2) 폴리펩티드 내 아미노산 위치 602에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 시스테인(C)으로의 치환(Y602C)을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 돌연변이가 서열 번호 1의 아미노산 위치 677에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 글리신(G)으로의 치환(A677G), 또는 이소폼 a(서열 번호 3)의 아미노산 위치 682에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 글리신(G)으로의 치환(A682G), 또는 이소폼 b(서열 번호 5)의 아미노산 위치 638에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 글리신(G)으로의 치환(A638G)을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 돌연변이가 서열 번호 1의 아미노산 위치 687에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 발린(V)으로의 치환(A687V), 또는 이소폼 a(서열 번호 3)의 아미노산 위치 692에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 발린(V)으로의 치환(A692V), 또는 이소폼 b(서열 번호 5)의 아미노산 위치 648에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 발린(V)으로의 치환(A648V)을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 야생형 EZH2 대립유전자를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 야생형 EZH2 대립유전자를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 돌연변이가 히스톤 H3의 리신27(H3-K27)의 EZH2 트리메틸화를 증가시키는 것인 방법.
  8. 제2항에 있어서, 돌연변이가 히스톤 H3의 리신27(H3-K27)의 EZH2 트리메틸화를 증가시키는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 돌연변이가 치환 돌연변이이고, 상기 치환 돌연변이가 서열 번호 6의 EZH2 기질 포켓 도메인 내에 존재하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, EZH2 기질 포켓 도메인이 서열 번호 7에 제시된 SET 도메인을 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 서열 번호 7은 서열 번호 1, 서열 번호 3 및 서열 번호 5에 포함되는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이의 존재는 피험체가 EZH2 억제제에 대하여 반응성인 것을 나타내고, 상기 EZH2 억제제가 하기 표 1의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염인 방법:
    [표 1]
    Figure 112022031444240-pat00136

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    Figure 112022031444240-pat00150

    Figure 112022031444240-pat00151

    Figure 112022031444240-pat00152

    Figure 112022031444240-pat00153

    Figure 112022031444240-pat00154

    Figure 112022031444240-pat00155

    Figure 112022031444240-pat00156

    Figure 112022031444240-pat00157
    .
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이의 존재는 피험체가 EZH2 억제제에 대하여 반응성인 것을 나타내고, 상기 EZH2 억제제는
    Figure 112022031444240-pat00134
    또는 이의 제약상 허용되는 염인 방법.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 검출은
    a. 생물학적 시료를 돌연변이를 포함하는 EZH2 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체와 접촉시키는 단계로서, 상기 하나 이상의 항체는 상기 돌연변이를 포함하는 EZH2 폴리펩티드와 복합체를 형성하는 것인 단계; 및
    b. 상기 복합체의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 돌연변이의 존재가 생물학적 시료 내에서 검출되는 경우, 상기 피험체를 EZH2 억제제를 이용한 치료를 위한 후보로서 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 림프종, 백혈병 또는 흑색종인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 림프종은 비호지킨 림프종, 여포성 림프종 및 미만성 거대 B 세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 백혈병은 만성 골수성 백혈병(CML)인 방법.
  19. 제스트 상동체 2의 인핸서(EZH2) 폴리펩티드의 돌연변이체를 발현하는 세포 내 H3-K27의 트리메틸화된 H3-K27로의 전환을 억제하기 위한 방법으로서, 상기 세포를 EZH2 억제제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 돌연변이체는 서열번호 1의 제스트 상동체 2의 인핸서(EZH2) 폴리펩티드 내 아미노산 위치 687 또는 677에서, 또는 이소폼 a(서열 번호 3)의 제스트 상동체 2의 인핸서(EZH2) 폴리펩티드 내 아미노산 위치 692 또는 682에서, 또는 이소폼 b(서열 번호 5)의 제스트 상동체 2의 인핸서(EZH2) 폴리펩티드 내 아미노산 위치 648 또는 638에서 돌연변이를 포함하고, 상기 EZH2 폴리펩티드는 암을 앓고 있는 피험체로부터 수득된 생물학적 시료 내에 존재하는 것인 방법.
  20. 제스트 상동체 2의 인핸서(EZH2)의 돌연변이체를 발현하는 세포 내 H3-K27의 트리메틸화된 H3-K27로의 전환을 억제하기 위한 방법으로서, 상기 세포를 EZH2 억제제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 돌연변이가 서열 번호 1의 제스트 상동체 2의 인핸서(EZH2) 폴리펩티드 내 아미노산 위치 641에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 시스테인(C)으로의 치환(Y641C), 또는 이소폼 a(서열 번호 3)의 제스트 상동체 2의 인핸서(EZH2) 폴리펩티드 내 아미노산 위치 646에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 시스테인(C)으로의 치환(Y646C), 또는 이소폼 b(서열 번호 5)의 제스트 상동체 2의 인핸서(EZH2) 폴리펩티드 내 아미노산 위치 602에서 야생형 잔기 티로신(Y)의 시스테인(C)으로의 치환(Y602C)을 포함하는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 돌연변이가 서열 번호 1의 아미노산 위치 677에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 글리신(G)으로의 치환(A677G), 또는 이소폼 a(서열 번호 3)의 아미노산 위치 682에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 글리신(G)으로의 치환(A682G), 또는 이소폼 b(서열 번호 5)의 아미노산 위치 638에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 글리신(G)으로의 치환(A638G)을 포함하는 것인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 돌연변이가 서열 번호 1의 아미노산 위치 687에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 발린(V)으로의 치환(A687V), 또는 이소폼 a(서열 번호 3)의 아미노산 위치 692에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 발린(V)으로의 치환(A692V), 또는 이소폼 b(서열 번호 5)의 아미노산 위치 648에서 야생형 잔기 알라닌(A)의 발린(V)으로의 치환(A648V)을 포함하는 것인 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, EZH2 억제제가 하기 표 1의 화합물 또는 이의 제약상 허용되는 염인 방법:
    [표 1]
    Figure 112022031444240-pat00158

    Figure 112022031444240-pat00159

    Figure 112022031444240-pat00160

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    Figure 112022031444240-pat00167

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    Figure 112022031444240-pat00172

    Figure 112022031444240-pat00173

    Figure 112022031444240-pat00174

    Figure 112022031444240-pat00175

    Figure 112022031444240-pat00176

    Figure 112022031444240-pat00177

    Figure 112022031444240-pat00178

    Figure 112022031444240-pat00179
    .
  24. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, EZH2 억제제는
    Figure 112022031444240-pat00135
    또는 이의 제약상 허용되는 염인 방법.
  25. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, EZH2의 돌연변이체를 발현하는 세포가 피험체로부터 수득된 세포인 방법.
  26. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 피험체로부터 EZH2의 돌연변이체를 발현하는 세포를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, EZH2의 돌연변이체를 발현하는 세포가 암을 앓고 있는 피험체의 세포인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 피험체가 인간 피험체인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 암은 림프종, 백혈병 또는 흑색종인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 림프종은 비호지킨 림프종, 여포성 림프종 또는 미만성 거대 B 세포 림프종인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 백혈병은 만성 골수성 백혈병(CML)인 방법.
  32. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 피험체 내에 존재하고, 접촉이 피험체에게 EZH2 억제제를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  33. 삭제
  34. 삭제
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