JP6317780B2 - 特異的結合タンパク質およびこれらの使用 - Google Patents

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Description

関連出願データ
本国際ＰＣＴ特許出願は、２００９年２月１８日に出願された米国特許出願番号１２／３８８，５０４の優先権を主張するものであり、該米国特許出願の開示は、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。本国際ＰＣＴ出願は、２００２年５月１３日に出願された米国特許出願番号１０／１４５，５９８（２００９年９月１５日に公開された米国特許番号７，５８９，１８０）；２００１年５月１１日に出願された米国仮特許出願番号６０／２９０，４１０；２００１年９月２８日に出願された米国仮特許出願番号６０／３２６，０１９；２００１年１２月２１日に出願された米国仮特許出願番号６０／３４２，２５８；２００２年５月１３日に出願された国際ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／１５１８５（２００２年１１月２１日にＷＯ ０２／０９２７７１として公開された）；２００８年８月１４日に出願された国際ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００９７７１（２００９年２月１９日にＷＯ ２００９／０２３２６５として公開された）；および２００７年８月１４日に出願された米国仮特許出願番号６０／９６４，７１５のそれぞれの開示もまたこの全体を参照により組み込む。
発明の分野
本発明は、増幅された上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する特異的結合メンバー、特に抗体およびこれらの断片に関し、ならびに細胞外ドメインから２６７個のアミノ酸を欠如しているトランケートされたＥＧＦＲ受容体（ｄｅ２−７ＥＧＦＲ）を生じさせる結果となるＥＧＦＲのエキソン２から７のインフレーム欠失に関する。詳細には、前記特異的結合メンバー、特に抗体およびこれらの断片によって認識されるエピトープは、異常な翻訳後修飾に基づいて強化されるまたははっきりわかる。これらの特異的結合メンバーは、癌の診断および治療に有用である。本発明の結合メンバーは、治療の際に化学療法薬もしくは抗癌剤とおよび／または他の抗体もしくはこれらの断片と併用することもできる。
関連技術の背景
化学療法手段による増殖性疾患、特に癌、の治療は、人体および動物体内のターゲット増殖性細胞と他の正常細胞の相違の利用に依存することが多い。例えば、多くの化学薬品は、急速に複製するＤＮＡにより取り込まれてＤＮＡ複製方法および細胞分裂方法を中断させるように設計される。もう１つのアプローチは、発達したヒト組織において通常は発現されない腫瘍細胞または他の異常細胞の表面の抗原、例えば腫瘍抗原または胚抗原を同定することである。このような抗原を、この抗原を遮断または中和できる抗体などの結合タンパク質でターゲッティングすることができる。加えて、抗体およびこれらの断片をはじめとする結合タンパク質は、毒剤、または腫瘍部位でこの毒剤を直接または間接的に活性化することができる他の物質を送達することができる。
ＥＧＦＲは、多くのタイプの上皮性腫瘍において過発現されるので、腫瘍をターゲットにした抗体療法の魅力的なターゲットである（Ｖｏｌｄｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）ａｎｄ ＥＧＦＲ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．８，１１９７−２０６；ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ，Ｂ．ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，Ａ．Ｍ．Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｉｎ：Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ ａｎｄ Ｉ．Ｍ．Ｒｏｉｔｔ（ｅｄｓ．），Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．２４２４−３１．Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８））。さらに、ＥＧＦＲの発現は、胃、結腸、膀胱、乳房、前立腺、子宮内膜、腎臓および脳（例えば、神経膠腫）をはじめとする多数の腫瘍タイプにおいて不良な予後に関係づけられている。その結果として、多数のＥＧＦＲ抗体が文献に報告されており、幾つかは臨床評価を受けている（Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ａｎｔｉ−Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃ２２５ Ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１８，９０４；Ｆａｉｌｌｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）：Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａｓ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．３９，４７８−８３；Ｓｅｙｍｏｕｒ，Ｌ．（１９９９）Ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｅｘｃｉｔｉｎｇ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．２５，３０１−１２））。
頭頸部癌、扁平上皮細胞肺癌、脳神経膠腫および悪性星状細胞腫を有する患者においてＥＧＦＲ ｍＡｂを使用する研究からの結果は、期待の持てるものであった。大部分のＥＧＦＲ抗体の抗腫瘍活性は、リガンド結合を遮断するこれらの能力によって強化される（Ｓｔｕｒｇｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ５２８ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ．Ｓｕｒｇ．１１１，６３３−４３；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１，１３１１−８）。このような抗体は、細胞増殖機能および抗体依存性免疫機能（例えば、補体活性化）両方の調節によりこれらの効力を媒介することができる。しかし、これらの抗体の使用は、肝臓および皮膚などの高い内因性ＥＧＦＲレベルを有する器官での取り込みにより制限されることがある（Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｆａｉｌｌｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。
ＥＧＦＲ遺伝子の増幅（即ち、ＥＧＦＲ遺伝子の多数のコピー）を有する腫瘍の有意な割合が、ｄｅ２−７ＥＧＦＲ、ΔＥＧＦＲ、またはΔ２−７（本明細書ではこれらの用語を交換可能に用いている。）として公知の該受容体のトランケートされたバージョン（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅ ｃｌａｓｓ ＩＩＩ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．４，１４８−１５８）も共発現する（Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｖａｒｉａｎｔ ＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８２，１８６−９４）。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲにおいて見られる再配列は、エキソン２−７にわたる８０１のヌクレオチドを欠くインフレーム成熟ｍＲＮＡを生じさせる結果となる（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，２９６５−９；Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｉｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８１，７７３−９；Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ（ｃ−ｅｒｂＢ）ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８，１８１６−２０；Ｓｕｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ａｂｅｒｒａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｆｒｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，８６０２−６）。対応するＥＧＦＲタンパク質は、細胞外ドメインの残基６−２７３を含む２６７のアミノ酸の欠失および融合接合点の新規グリシン残基を有する（Ｓｕｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。グリシン残基の挿入と共に、この欠失が、この欠失界面に特有の接合点ペプチドを生じさせる（Ｓｕｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。
ｄｅ２−７ ＥＧＦＲは、神経膠腫、乳房、肺、卵巣および前立腺をはじめとする多数の腫瘍タイプにおいて報告されている（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲｖＩＩＩ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７，４１３０−４０；Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｖａｒｉａｎｔ ＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８２，１８６−９４；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｉｎ ａｒｅ ｔｕｍｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５，３１４０−８；Ｇａｒｃｉａ ｄｅ Ｐａｌａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３，３２１７−２０）。このトランケートされた受容体はリガンドに結合しないが、低い構成的活性を有し、ならびにヌードマウスにおいて腫瘍異種移植片として成長した神経膠腫細胞に有意な成長利点をもたらし（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａ ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ ｃｏｎｆｅｒｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，７７２７−３１）、ならびにＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｂａｔｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｕｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ，ｃｅｌｌ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｍｕｔａｎｔ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｇｅｎｅ．Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．６，１２５１−９）およびＭＣＦ−７細胞を形質転換することもできる。神経膠腫細胞においてｄｅ２−７ ＥＧＦＲにより用いられる細胞メカニズムは、完全には明らかにされていないが、アポトーシスの減少（Ｎａｇａｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａ ｃｏｍｍｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｎｆｅｒｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６，５０７９−８６）および増殖の小規模な増進（Ｎａｇａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６）を含むことが報告されている。
このトランケートされた受容体の発現は、腫瘍細胞に限定されるので、これは、抗体療法の高特異的ターゲットになる。従って、多数の研究室が、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲのこの特有のペプチドに対して特異的なポリクローナル（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｎｔｉ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅａｃｔｉｎｇ ａｔ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，４２０７−１１）とモノクローナル（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ａｒｅ ｔｕｍｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａｓ；Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｅｌｅｔｉｏｎ−ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．７３，１３６６−７２；Ｈｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ， ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．６３，５３７−４３）抗体両方の産生を報告している。この特有のｄｅ２−７ペプチドでの免疫後に単離された一連のマウスｍＡｂは、すべて、前記トランケートされた受容体に対して選択性および特異性を示し、ならびにヌードマウスにおいて成長したｄｅ２−７ ＥＧＦＲ陽性異種移植片をターゲットにした（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９５）；Ｒｅｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｎｔ ＩＩＩ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ａｆｔｅｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ５−ｉｏｄｏ−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７，１５１０−５；Ｒｅｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｎｔ ＩＩＩ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｙｒａｍｉｎｅ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５，４３７５−８２）。
しかし、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ抗体の１つの潜在的欠点は、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を示す腫瘍の一部のみが、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲも発現する点である（Ｅｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ ｒｅｖｅａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−ａｎｄ／ｏｒ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔａｉｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，４３０９−１３）。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを含有する腫瘍の正確な百分率は、異なる技術（即ち、ＰＣＲ対免疫組織化学）および様々な抗体の使用がこの存在の頻度についての広範な報告値を生じさせたため、完全には確立されていない。公表されているデータは、神経膠腫のおおよそ２５−３０％がｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現し、この発現が退形成性星状細胞腫において最も低くおよび多形性膠芽腫において最も高いことを示している（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅ ｃｌａｓｓ ＩＩＩ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．４，１４８−５８；Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５，５５３６−９）。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現性神経膠腫の中での陽性細胞の割合は、３７−８６％にわたると報告されている（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９７））。乳癌腫の２７％および肺癌の１７％は、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲについて陽性であることが判明した（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９７）；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９５）；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）；Ｈｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。従って、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ特異的抗体は、ＥＧＦＲ陽性腫瘍のある割合にのみ有用であると予想されるであろう。
Ｖｏｌｄｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）ａｎｄ ＥＧＦＲ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．８，１１９７−２０６ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ，Ｂ．ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，Ａ．Ｍ．Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｉｎ：Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ ａｎｄ Ｉ．Ｍ．Ｒｏｉｔｔ（ｅｄｓ．），Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．２４２４−３１．Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８） Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ａｎｔｉ−Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃ２２５ Ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１８，９０４ Ｆａｉｌｌｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）：Ａ ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａｓ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．３９，４７８−８３ Ｓｅｙｍｏｕｒ，Ｌ．（１９９９）Ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｅｘｃｉｔｉｎｇ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．２５，３０１−１２） Ｓｔｕｒｇｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ５２８ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ．Ｓｕｒｇ．１１１，６３３−４３ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１，１３１１−８ Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅ ｃｌａｓｓ ＩＩＩ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．４，１４８−１５８ Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｖａｒｉａｎｔ ＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８２，１８６−９４ Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，２９６５−９ Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｉｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８１，７７３−９ Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ（ｃ−ｅｒｂＢ）ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８，１８１６−２０ Ｓｕｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ａｂｅｒｒａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｆｒｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，８６０２−６ Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲｖＩＩＩ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７，４１３０−４０ Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｖａｒｉａｎｔ ＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８２，１８６−９４ Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｉｎ ａｒｅ ｔｕｍｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５，３１４０−８ Ｇａｒｃｉａ ｄｅ Ｐａｌａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３，３２１７−２０ Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａ ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ ｃｏｎｆｅｒｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，７７２７−３１ Ｂａｔｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｕｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ，ｃｅｌｌ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｍｕｔａｎｔ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｇｅｎｅ．Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．６，１２５１−９ Ｎａｇａｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａ ｃｏｍｍｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｎｆｅｒｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６，５０７９−８６ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｎｔｉ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅａｃｔｉｎｇ ａｔ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，４２０７−１１ Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ａｒｅ ｔｕｍｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａｓ Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｅｌｅｔｉｏｎ−ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．７３，１３６６−７２ Ｈｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ， ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．６３，５３７−４３ Ｒｅｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｎｔ ＩＩＩ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ａｆｔｅｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ５−ｉｏｄｏ−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７，１５１０−５ Ｒｅｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｎｔ ＩＩＩ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｙｒａｍｉｎｅ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５，４３７５−８２ Ｅｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ ｒｅｖｅａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−ａｎｄ／ｏｒ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔａｉｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，４３０９−１３ Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５，５５３６−９
このように、ＥＧＦＲ抗体の活性の現存の証拠は期待のもてるものであるが、上記を反映する適用可能性および効力の範囲に対する制限が依然として認められる。従って、広範な腫瘍に関して効力を明示する抗体および同様の薬剤の開発が望ましいであろうし、この目標を達成することに本発明は関する。
本明細書における参考文献の引用は、これらが本発明に対する先行技術であることの承認とみなしてはならない。
発明の要旨
本発明は、野生型ＥＧＦＲからの一切のアミノ酸配列改変または置換を明示しない、ならびに腫瘍形成性、高増殖性または異常細胞において見つけられるが正常または野生型細胞では一般に検出することができない、単離された特異的結合メンバー、特に抗体またはこれらの断片を提供する（本明細書において用いる場合の用語「野生型細胞」は、内因性ＥＧＦＲ発現するがｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現しない細胞を考えており、およびこの用語は、特にＥＧＦＲ遺伝子を過発現する細胞を除外する；用語「野生型」は、異常または腫瘍形成性細胞にではなく正常細胞に存在する遺伝子型もしくは表現型または他の特性を指す。）。さらなる態様において、本発明は、腫瘍形成性、高増殖性または異常細胞において見つけられるが正常または野生型細胞では一般に検出することができないＥＧＦＲエピトープであって、異常な翻訳後修飾または異常な発現に基づいて強化されるまたははっきりわかるものであるエピトープを認識する特異的結合メンバー、特に抗体またはこれらの断片を提供する。本明細書に提供する特定の非限定的例示において、翻訳後修飾が完全でないまたは野生型細胞におけるＥＧＦＲの正常な発現で見られるほどに十分でないＥＧＦＲエピトープは、強化されるまたははっきりわかる。１つの態様において、ＥＧＦＲエピトープは、初期のもしくは単純な炭水化物修飾または早期グリコシル化、特に高マンノース修飾に基づいて強化されるまたははっきりわかり、および複雑な炭水化物修飾が存在する場合には低減されるまたははっきりわからない。
抗体であることがあり、またはこれらの断片、例えば、これらの免疫原性断片であることがある、特異的結合メンバーは、異常発現の不在下および正常ＥＧＦＲ翻訳後修飾の存在下では、正常または野生型ＥＧＦＲエピトープを含有する正常または野生型細胞に実質的に結合せず、該細胞を認識しない。
より詳細には、本発明の特異的結合メンバーは、ＥＧＦＲを過発現する（例えば、ＥＧＦＲ遺伝子が増幅される。）またはｄｅ２−７ ＥＧＦＲを、特に、異常な翻訳後修飾の存在下で、発現する細胞中に存在するＥＧＦＲエピトープであって正常条件下、特に、正常な翻訳後修飾の存在下で、ＥＧＦＲを発現する細胞では一般に検出することができないＥＧＦＲエピトープを認識する、抗体またはこれらの断片である場合がある。
本発明者らは、異常に発現されたＥＧＦＲを特異的に認識する、本明細書においてｍＡｂ８０６、ｃｈ８０６、ｈｕ８０６、ｍＡｂｌ７５、ｍＡｂｌ２４、およびｍＡｂ１１３３と呼ぶ抗体により例示する、新規モノクローナル抗体を開示した。詳細には、本発明の抗体は、腫瘍形成性、高増殖性または異常細胞において見つけられるが正常または野生型細胞では一般に検出することができないＥＧＦＲエピトープであって異常な翻訳後修飾に基づいて強化されるまたははっきりわかるエピトープを認識する。本発明の新規抗体は、増幅された野生型ＥＧＦＲおよびｄｅ２−７ ＥＧＦＲも認識するが、このｄｅ２−７ ＥＧＦＲ突然変異の特有の接合点ペプチドとは異なるエピトープに結合する。本発明の抗体は、増幅されたＥＧＦＲおよび（本明細書においてｄｅ２−７突然変異により例示される）突然変異体ＥＧＦＲをはじめとする、異常発現ＥＧＦＲを、特に異常翻訳後修飾に基づいて、特異的に認識する。加えて、これらの抗体は、正常な量のＥＧＦＲを発現する神経膠腫細胞系の細胞表面で発現されたときのＥＧＦＲを認識しないが、ＥＬＩＳＡプレートの表面に固定されたＥＧＦＲ（ｓＥＧＦＲ）の細胞外ドメインに結合する。このことは、高次構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）の認識を示す。これらの抗体は、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有するがｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現しないＡ４３１細胞の表面に結合する。重要なこととして、これらの抗体は、殆どの他の正常組織におけるより高いレベルの内因性野生型（ｗｔ）ＥＧＦＲを発現するがＥＧＦＲを異常に発現または増幅しない、肝臓および皮膚などの正常組織には有意に結合しなかった。
本発明の抗体は、ＥＧＦＲ増幅および／またはＥＧＦＲ突然変異、特にｄｅ２−７ ＥＧＦＲをはじめとする異常ＥＧＦＲ発現が存在する腫瘍または細胞を染色するまたは別様に認識することにより、ＥＧＦＲ腫瘍または腫瘍形成性細胞の性質を特異的に類別することができる。さらに、本発明の抗体は、増幅されたＥＧＦＲを含有する腫瘍に対しておよびｄｅ２−７ ＥＧＦＲ陽性異種移植片に対して有意なインビボ抗腫瘍活性を明示する。
ｄｅ２−７ ＥＧＦＲおよび増幅されたＥＧＦＲに結合するが正常、野生型ＥＧＦＲには結合しないこれらの抗体の特有の特異性は、以前から知られているＥＧＦＲ抗体で見られることがある正常組織取り込みに関連した問題を伴わずに、多数の腫瘍タイプ、例えば、頭頸部、乳房または前立腺腫瘍および神経膠腫を同定する、特性づけするおよびターゲットにする診断および治療用途をもたらす。
従って、本発明は、接合点ペプチドとは異なるエピトープにおいてｄｅ２−７ ＥＧＦＲに結合するがＥＧＦＲ遺伝子の増幅不在下で正常細胞におけるＥＧＦＲに実質的に結合しない、抗体などの特異的結合タンパク質を提供する。増幅は、この細胞がＥＧＦＲの多数のコピーを含むことを含むものとする。
好ましくは、本発明の抗体によって認識されるエピトープは、成熟正常または野生型ＥＧＦＲ配列の残基２７３−５０１を含む領域内に位置し、および好ましくは、成熟正常または野生型ＥＧＦＲ配列の残基２８７−３０２（配列番号：１４）を含む。従って、ＥＧＦＲ配列の残基２７３−５０１および／または２８７−３０２（配列番号：１４）を含む領域内に位置するエピトープでｄｅ２−７ ＥＧＦＲに結合する、抗体などの特異的結合タンパク質も提供する。前記エピトープは、当業者に公知の任意の従来のエピトープマッピング技術によって決定することができる。または、残基２７３−５０１および／もしくは２８７−３０２（配列番号：１４）をコードするＤＮＡ配列を消化し、結果として生ずる断片を適する宿主において発現させることができるであろう。抗体結合は、上で述べたように決定することができるであろう。
好ましい態様において、前記抗体は、本発明者らが同定し、特性づけした抗体の特性、特に、増幅されたＥＧＦＲおよびｄｅ２−７ ＥＧＦＲにおいて見つけられるような異常発現ＥＧＦＲを認識する特性を有するものである。
もう１つの態様において、本発明は、本発明の抗体と競合できる抗体であって、本発明の抗体のＶＨおよびＶＬ鎖配列を有する抗体の少なくとも１０％が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてこのような抗体との競合によりｄｅ２−７ ＥＧＦＲへの結合から遮断される条件下で本発明の抗体と競合できる抗体を提供する。特に、抗イディオタイプ抗体が考えられ、本明細書において例示する。抗イディオタイプ抗体ＬＭＨ−１１、ＬＭＨ−１２およびＬＭＨ−１３を本明細書において提供する。
抗体のこのターゲット抗原への結合は、この重および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）により媒介され、ＣＤＲ３の役割が特に重要である。従って、本発明の抗体の重または軽鎖、好ましくは両方、のＣＤＲ３領域に基づく特異的結合メンバーは、インビボ療法のための有用な特異的結合メンバーであるであろう。
従って、同定された本発明の抗体のＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域に基づく抗体などの特異的結合タンパク質は、これらのｄｅ２−７ ＥＧＦＲステータスに関係なく、増幅されたＥＧＦＲを有する腫瘍のターゲッティングに有用であろう。本発明の抗体は、正常、野生型受容体に有意には結合しないので、正常細胞での有意な取り込み、現在開発されているＥＧＦＲ抗体の制限がないであろう。
もう１つの態様において、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する腫瘍（該腫瘍の細胞は、ＥＧＦＲ遺伝子の多数のコピーを含有する。）におけるおよびトランケートされたバージョンのＥＧＦＲ受容体ｄｅ２−７を発現する腫瘍におけるＥＧＦＲに結合することができる単離された抗体であって、配列番号：１３のアミノ酸配列から成るｄｅ２−７接合点ペプチドに結合しないものである；ヒト野生型ＥＧＦＲの残基２８７−３０２の配列（配列番号：１４）内のエピトープに結合するものである；ならびに配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列を含まず、および配列番号：４に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列を含まないものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が配列番号：４２に示すアミノ酸配列を有し、および該軽鎖が配列番号：４７に示すアミノ酸配列を有するものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が配列番号：１２９に示すアミノ酸配列を有し、および該軽鎖が配列番号：１３４に示すアミノ酸配列を有するものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が配列番号：２２に示すアミノ酸配列を有し、および該軽鎖が配列番号：２７に示すアミノ酸配列を有するものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が配列番号：３２に示すアミノ酸配列を有し、および該軽鎖が配列番号：３７に示すアミノ酸配列を有するものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖の可変領域が、配列番号：４４、４５および４５に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含むものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該軽鎖の可変領域が、配列番号：４９、５０および５１に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含むものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖の可変領域が、配列番号：１３０、１３１および１３２に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含むものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該軽鎖の可変領域が、配列番号：１３５、１３６および１３７に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含むものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖の可変領域が、配列番号：２３、２４および２５に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含むものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該軽鎖の可変領域が、配列番号：２８、２９および３０に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含むものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖の可変領域が、配列番号：３３、３４および３５に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含むものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該軽鎖の可変領域が、配列番号：３８、３９および４０に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含むものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、単離された抗体であって、抗体Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ断片、ダイアボディー、トリアボディーまたはテトラボディーの形態である抗体を提供する。
もう１つの態様において、検出可能または機能性標識をさらに含む単離された抗体を提供する。
もう１つの態様において、前記検出可能または機能性標識は、共有結合で付けられる薬物である。
もう１つの態様において、前記標識は、放射標識である。
もう１つの態様において、単離された抗体であって、ＰＥＧ化されている抗体を提供する。
もう１つの態様において、本明細書中で詳述する単離された抗体をコードする配列を含む単離された核酸を提供する。
もう１つの態様において、単離された抗体を調製する方法を提供し、この方法は、該抗体の発現を引き起こす条件下で、上で詳述したおよび本明細書中で詳述するとおりの核酸を発現させること、および該抗体を回収することを含む。
もう１つの態様において、ヒト患者における腫瘍の治療方法を提供し、この方法は、本明細書中で詳述する単離された抗体の有効量を該患者に投与することを含む。
もう１つの態様において、本明細書中で詳述する単離された抗体を含む、ＥＧＦＲが異常発現されるまたはＥＧＦＲがトランケートされたタンパク質形態で発現される腫瘍の診断のためのキットを提供する。
もう１つの態様において、前記キットは、試薬および／または使用のための説示をさらに含む。
もう１つの態様において、本明細書中で詳述するとおりの単離された抗体を含む医薬組成物を提供する。
もう１つの態様において、前記医薬組成物は、医薬的に許容されるビヒクル、担体または希釈剤をさらに含む。
もう１つの態様において、前記医薬組成物は、化学療法薬、抗ＥＧＦＲ抗体、放射免疫療法薬およびこれらの組み合わせから成る群より選択される抗癌剤をさらに含む。
もう１つの態様において、前記化学療法薬は、チロシンキナーゼ阻害剤、リン酸化カスケード阻害剤、翻訳後調節物質、細胞成長または分裂阻害剤（例えば、抗有糸分裂剤）、シグナル伝達阻害剤およびこれらの組み合わせから成る群より選択される。
もう１つの態様において、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、ＡＧ１４７８、ＺＤ１８３９、ＳＴＩ５７１、ＯＳＩ−７７４、ＳＵ−６６６８およびこれらの組み合わせから成る群より選択される。
もう１つの態様において、前記抗ＥＧＦＲ抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体５２８、２２５、ＳＣ−０３、ＤＲ８．３、Ｌ８Ａ４、Ｙ１０、ＩＣＲ６２、ＡＢＸ−ＥＧＦおよびこれらの組み合わせから成る群より選択される。
もう１つの態様において、哺乳動物における癌を予防および／または治療する方法を提供し、この方法は、本明細書中で詳述するとおりの医薬組成物の治療有効量を哺乳動物に投与することを含む。
もう１つの態様では、哺乳動物において異常発現ＥＧＦＲを生産する脳内在性の癌を治療するための方法を提供し、この方法は、本明細書中で詳述するとおりの医薬組成物の治療有効量を哺乳動物に投与することを含む。
もう１つの態様において、前記脳内在性の癌は、膠芽腫、髄芽腫、髄膜腫、新生物性星状細胞腫および新生物性動静脈奇形から成る群より選択される。
もう１つの態様において、本明細書中で詳述する単離された抗体をコードする組換えＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿主を提供する。
もう１つの態様において、前記単細胞宿主は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、酵母、ＣＨＯ、ＹＢ／２０、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０およびＢＭＴ１０細胞、植物細胞、昆虫細胞ならびにヒト細胞（組織培養でのもの）から成る群より選択される。
もう１つの態様において、増幅されたＥＧＦＲ、ｄｅ２−７ＥＧＦＲ、または高マンノースグリコシル化を有するＥＧＦＲの存在を検出するための方法を提供し、この方法では、（ａ）増幅されたＥＧＦＲ、ｄｅ２−７ＥＧＦＲ、または高マンノースグリコシル化を有するＥＧＦＲの存在が疑われる哺乳動物からの生体サンプルと請求項１に記載の単離された抗体とを、該ＥＧＦＲの該単離された抗体への結合を可能ならしめる条件下で接触させること；および（ｂ）前記サンプルからの前記ＥＧＦＲと前記単離された抗体との間で結合が発生したかどうかを検出することによってＥＧＦＲを測定し、結合の検出が、前記サンプル中の前記ＥＧＦＲの存在または活性を示す。
増幅されたＥＧＦＲ、ｄｅ２−７ＥＧＦＲ、または高マンノースグリコシル化を有するＥＧＦＲの存在を検出する方法のもう１つの態様において、前記ＥＧＦＲの存在の検出は、該哺乳動物における腫瘍または癌の存在を示す。
もう１つの態様において、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する腫瘍（該腫瘍の細胞は、ＥＧＦＲ遺伝子の多数のコピーを含有する。）におけるおよびトランケートされたバージョンのＥＧＦＲ受容体ｄｅ２−７を発現する腫瘍におけるＥＧＦＲに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号：４２に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有する、および前記軽鎖が配列番号：４７に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有するものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、前記抗体の重鎖は、配列番号：４２に示すアミノ酸配列を含み、およびこの場合、前記抗体の軽鎖は、配列番号：４７に示すアミノ酸配列を含む。
もう１つの態様において、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する腫瘍（該腫瘍の細胞は、ＥＧＦＲ遺伝子の多数のコピーを含有する。）におけるおよびトランケートされたバージョンのＥＧＦＲ受容体ｄｅ２−７を発現する腫瘍におけるＥＧＦＲに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖の可変領域が、配列番号：４４、４５および４６に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含み、ならびに該軽鎖の可変領域が、配列番号：４９、５０および５１に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含むものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する腫瘍（該腫瘍の細胞は、ＥＧＦＲ遺伝子の多数のコピーを含有する。）におけるおよびトランケートされたバージョンのＥＧＦＲ受容体ｄｅ２−７を発現する腫瘍におけるＥＧＦＲに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が配列番号：１２９に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有し、および該軽鎖が、配列番号：１３４に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有するものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、前記抗体の重鎖は、配列番号：１２９に示すアミノ酸配列を含み、およびこの場合、前記抗体の軽鎖は、配列番号：１３４に示すアミノ酸配列を含む。
もう１つの態様において、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する腫瘍（該腫瘍の細胞は、ＥＧＦＲ遺伝子の多数のコピーを含有する。）におけるおよびトランケートされたバージョンのＥＧＦＲ受容体ｄｅ２−７を発現する腫瘍におけるＥＧＦＲに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖の可変領域が、配列番号：１３０、１３１および１３２に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含み、ならびに該軽鎖の可変領域が、配列番号：１３５、１３６および１３７に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含むものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する腫瘍（該腫瘍の細胞は、ＥＧＦＲ遺伝子の多数のコピーを含有する。）におけるおよびトランケートされたバージョンのＥＧＦＲ受容体ｄｅ２−７を発現する腫瘍におけるＥＧＦＲに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が、配列番号：２２に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有し、および該軽鎖が、配列番号：２７に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有するものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、前記抗体の重鎖は、配列番号：２２に示すアミノ酸配列を含み、およびこの場合、前記抗体の軽鎖は、配列番号：２７に示すアミノ酸配列を含む。
もう１つの態様において、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する腫瘍（該腫瘍の細胞は、ＥＧＦＲ遺伝子の多数のコピーを含有する。）におけるおよびトランケートされたバージョンのＥＧＦＲ受容体ｄｅ２−７を発現する腫瘍におけるＥＧＦＲに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖の可変領域が、配列番号：２３、２４および２５に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含み、ならびに該軽鎖の可変領域が、配列番号：２８、２９および３０に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含むものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する腫瘍（該腫瘍の細胞は、ＥＧＦＲ遺伝子の多数のコピーを含有する。）におけるおよびトランケートされたバージョンのＥＧＦＲ受容体ｄｅ２−７を発現する腫瘍におけるＥＧＦＲに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が、配列番号：３２に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有し、および該軽鎖が、配列番号：３７に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有するものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、前記抗体の重鎖は、配列番号：３２に示すアミノ酸配列を含み、およびこの場合、前記抗体の軽鎖は、配列番号：３７に示すアミノ酸配列を含む。
もう１つの態様において、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する腫瘍（該腫瘍の細胞は、ＥＧＦＲ遺伝子の多数のコピーを含有する。）におけるおよびトランケートされたバージョンのＥＧＦＲ受容体ｄｅ２−７を発現する腫瘍におけるＥＧＦＲに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖の可変領域が、配列番号：３３、３４および３５に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含み、ならびに該軽鎖の可変領域が、配列番号：３８、３９および４０に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含むものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する腫瘍（該腫瘍の細胞は、ＥＧＦＲ遺伝子の多数のコピーを含有する。）におけるおよびトランケートされたバージョンのＥＧＦＲ受容体ｄｅ２−７を発現する腫瘍におけるＥＧＦＲに結合することができる単離された抗体であって、
配列番号：１３のアミノ酸配列から成るｄｅ２−７ＥＧＦＲ接合点ペプチドに結合しないものである；
ヒト野生型ＥＧＦＲの残基２８７−３０２の配列内のエピトープに結合するものである；
軽鎖および重鎖を含み、該軽鎖の可変領域が、
式Ｉに示すアミノ酸配列：
ＨＳＳＱＤＩＸａａ１ＳＮＩＧ （Ｉ）
（式中、Ｘａａ１は、非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸残基である。）（配列番号：１５１）
に対応するアミノ酸配列を有する第一のポリペプチド結合ドメイン領域と、
式ＩＩに示すアミノ酸配列：
ＨＧＴＮＬＸａａ２Ｄ （ＩＩ）
（式中、Ｘａａ２は、荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸残基である。）（配列番号：１５２）
に対応するアミノ酸配列を有する第二のポリペプチド結合ドメイン領域と、
式ＩＩＩに示すアミノ酸配列：
ＶＱＹＸａａ３ＱＦＰＷＴ （ＩＩＩ）
（式中、Ｘａａ３は、Ａ、Ｇ、およびＡまたはＧが保存的に置換されているアミノ酸残基から成る群より選択される。）（配列番号：１５３）
に対応するアミノ酸配列を有する第三のポリペプチド結合ドメイン領域とを含み、ならびに該重鎖の可変領域が、
式ＶＩに示すアミノ酸配列：
ＳＤＸａａ４ＡＷＮ （ＩＶ）
（式中、Ｘａａ４は、Ｆ、Ｙ、およびＦまたはＹが保存的に置換されているアミノ酸残基から成る群より選択される。）（配列番号：１５４）
に対応するアミノ酸配列を有する第一のポリペプチド結合ドメイン領域と、
式Ｖ、式ＶＩまたは式ＶＩＩに示すアミノ酸配列：
ＹＩＳＹＳＧＮＴＲＹＸａａ５ＰＳＬＫＳ （Ｖ）
（式中、Ｘａａ５は、非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸残基である。）（配列番号：１５５）、
ＹＩＳＹＳＸａａ６ＮＴＲＹＮＰＳＬＫＳ （ＶＩ）
（式中、Ｘａａ６は、Ｇ、Ａ、およびＧまたはＡが保存的に置換されているアミノ酸残基から成る群より選択される。）（配列番号：１５６）
ＹＩＳＹＳＧＮＴＲＹＮＰＳＬＸａａ７Ｓ （ＶＩＩ）
（式中、Ｘａａ７は、塩基性アミノ酸残基である。）（配列番号：１５７）
に対応するアミノ酸配列を有する第二のポリペプチド結合領域と、
式ＶＩＩＩに示すアミノ酸配列：
Ｘａａ８ＴＡＧＲＧＦＰＹ （ＶＩＩＩ）
（式中、Ｘａａ８は、Ｖ、Ａ、およびＶまたはＡが保存的に置換されているアミノ酸残基から成る群より選択される。）（配列番号：１５８）
に対応するアミノ酸配列を有する第三のポリペプチド結合ドメイン領域と
を含むものである；ならびに
配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列を含まず、および配列番号：４に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列を含まないものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、Ｘａａ１は、Ｎであり；Ｘａａ２は、Ｄであり；Ｘａａ３は、Ａであり；Ｘａａ４は、Ｆであり；Ｘａａ５は、非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸残基であり；Ｘａａ６は、Ｇであり；Ｘａａ７は、Ｋであり；およびＸａａ８は、Ｖである。
もう１つの態様において、Ｘａａ５は、ＮまたはＱである。
もう１つの態様において、Ｘａａ１は、ＮまたはＳである。
もう１つの態様において、Ｘａａ２は、ＤまたはＥである。
もう１つの態様において、Ｘａａ３は、ＡまたはＧである。
もう１つの態様において、Ｘａａ４は、ＦまたはＹである。
もう１つの態様において、Ｘａａ５は、ＮまたはＱである。
もう１つの態様において、Ｘａａ６は、ＧまたはＡであり、およびＸａａ７は、独立してＫまたはＲである。
もう１つの態様において、Ｘａａ８は、ＶまたはＡである。
もう１つの態様において、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する腫瘍（該腫瘍の細胞は、ＥＧＦＲ遺伝子の多数のコピーを含有する。）におけるおよびトランケートされたバージョンのＥＧＦＲ受容体ｄｅ２−７を発現する腫瘍におけるＥＧＦＲに結合することができる単離された抗体であって、配列番号：１３のアミノ酸配列から成るｄｅ２−７接合点ペプチドに結合しないものである；ヒト野生型ＥＧＦＲの残基２７３−５０１の配列内のエピトープに結合するものである；軽鎖および重鎖を含み、該軽鎖の可変領域が、アミノ酸配列ＨＳＳＱＤＩＮＳＮＩＧ（配列番号：１８）を有する第一のポリペプチド結合ドメイン領域と、アミノ酸配列ＨＧＴＮＬＤＤ（配列番号：１９）を有する第二のポリペプチド結合ドメイン領域と、アミノ酸配列ＶＱＹＡＱＦＰＷＴ（配列番号：２０）を有する第三のポリペプチド結合ドメイン領域とを含み、
該重鎖の可変領域が、アミノ酸配列ＳＤＦＡＷＮ（配列番号：１５）を有する第一のポリペプチド結合ドメイン領域と、式ＩＸに示すアミノ酸配列：
ＹＩＳＹＳＧＮＴＲＹＸａａ９ＰＳＬＫＳ （ＩＸ）
（式中、Ｘａａ９は、非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸残基である。）（配列番号：１５９）、
に対応するアミノ酸配列を有する第二のポリペプチド結合ドメイン領域と、アミノ酸配列ＶＴＡＧＲＧＦＰＹ（配列番号：１７）を有する第三のポリペプチド結合ドメイン領域とを含むものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、前記抗体は、ヒト野生型ＥＧＦＲの残基２８７−３０２の配列（配列番号：１４）内のエピトープに結合する。
もう１つの態様において、Ｘａａ９は、ＮまたはＱである。
もう１つの態様において、前記結合ドメイン領域は、ヒト抗体フレームワークによって保持される。
もう１つの態様において、前記ヒト抗体フレームワークは、ヒトＩｇＧ１抗体フレームワークである。
もう１つの態様において、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する腫瘍（該腫瘍の細胞は、ＥＧＦＲ遺伝子の多数のコピーを含有する。）におけるおよびトランケートされたバージョンのＥＧＦＲ受容体ｄｅ２−７を発現する腫瘍におけるＥＧＦＲに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が、配列番号：２に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有し、および該軽鎖が、配列番号：４に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有するものである抗体を提供する。
もう１つの態様において、前記抗体の重鎖は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含み、およびこの場合、前記抗体の軽鎖は、配列番号：４に示すアミノ酸配列を含む。
もう１つの態様において、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する腫瘍（該腫瘍の細胞は、ＥＧＦＲ遺伝子の多数のコピーを含有する。）におけるおよびトランケートされたバージョンのＥＧＦＲ受容体ｄｅ２−７を発現する腫瘍におけるＥＧＦＲに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖の可変領域が、配列番号：１５、１６および１７に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含む、ならびに該軽鎖の可変領域が、配列番号：１８、１９および２０に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含むものである抗体を提供する。
他の目的および利点は、以下の例証となる図面、および添付の請求項を参照して行われる、後続の「詳細な記述」の精査から当業者に明らかになるであろう。
図１は、神経膠腫細胞系のフローサイトメトリー分析の結果を提示するものである。Ｕ８７ＭＧ（薄灰色ヒストグラム）およびＵ８７ＭＧ．Δ２−７（濃灰色ヒストグラム）細胞を、示されているとおり、無関係なＩｇＧ２ｂ抗体（白（ｏｐｅｎ）ヒストグラム）、ＤＨ８．３（ｄｅ２−７ ＥＧＦＲに特異的）、ｍＡｂ８０６または５２８（野生型とｄｅ２−７ ＥＧＦＲの両方を結合する。）いずれかで染色した。 図２Ａ−Ｄは、ｍＡｂ８０６、ｍＡｂＤＨ８．３およびｍＡｂ５２８のＥＬＩＳＡの結果を提示するものである。（Ａ）ｓＥＧＦＲコートＥＬＩＳＡプレートへの漸増濃度のｍＡｂ８０６（▲）ＤＨ８．３（●）または５２８（■）の結合。（Ｂ）溶液中の漸増濃度の可溶性ＥＧＦＲ（ｓＥＧＦＲ）によるｓＥＧＦＲコートＥＬＩＳＡプレートへのｍＡｂ８０６およびｍＡｂ５２８の結合の阻害。（Ｃ）ｄｅ２−７接合点ペプチドへの漸増濃度のＤＨ８．３の結合により、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ５２８についての固定化野生型ｓＥＧＦＲへの結合曲線（Ｄ）が説明される。 図２Ｅおよび２Ｆは、Ｃ末端ビオチン化ペプチドを使用する、および本発明のモノクローナル抗体を他の公知抗体（これらの中で、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ突然変異体の接合点ペプチドを認識するＬ８Ａ４抗体）および対照と一緒に含む、ＢＩＡｃｏｒｅ結合研究の結果をグラフで提示するものである。 図３は、ｍＡｂ８０６およびＤＨ８．３抗体の内在化を描写するものである。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞をｍＡｂ８０６（▲）またはＤＨ８．３（●）と共に４℃で前保温し、３７℃に移し、ＦＡＣＳによって内在化を判定した。データは、３回（ＤＨ８．３）または４回（ｍＡｂ８０６）の独立した実験の各時点での平均内在化±ＳＥを表す。 図４Ａおよび４Ｂは、Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片を有するヌードマウスにおける放射標識（ａ）１２５Ｉ−ｍＡｂ８０６および（ｂ）１３１Ｉ−ＤＨ８．３の生体内分布（％ＩＤ／ｇ腫瘍組織）を図示するものである。各点は、１時間（ｎ＝４）を除く５匹のマウスの平均±ＳＥを表す。 図５Ａおよび５Ｂは、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片を有するヌードマウスにおける（ａ）腫瘍：血液または（ｂ）腫瘍：肝臓比として表示した放射標識１２５Ｉ−ｍＡｂ８０６（白棒）および１３１Ｉ−ＤＨ８．３（黒棒）抗体の生体内分布を図示するものである。各棒は、１時間（ｎ＝４）を除く５匹のマウスの平均±ＳＥを表す。 図６Ａ−Ｃは、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する細胞系のフローサイトメトリー分析を図示するものである。Ａ４３１細胞をｍＡｂ８０６、ＤＨ８．３または５２８のいずれかで染色し（黒ヒストグラム）、無関係なＩｇＧ２ｂ抗体（白ヒストグラム）と比較した。 図７Ａおよび７Ｂは、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＡ４３１異種移植片を有するヌードマウスにおける放射標識（ａ）１２５Ｉ−ｍＡｂ８０６および（ｂ）１３１Ｉ−５２８の生体内分布（％ＩＤ／ｇ腫瘍組織）を図示するものである。 図８Ａ−Ｄは、（Ａ、Ｃ）Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７および（Ｂ、Ｄ）Ａ４３１異種移植片を有するヌードマウスにおける（Ａ、Ｂ）腫瘍：血液または（Ｃ、Ｄ）腫瘍：肝臓比として表示した放射標識１２５Ｉ−ｍＡｂ８０６（白棒）および１３１Ｉ−５２８（黒棒）ならびに抗体の生体内分布を図示するものである。 図９Ａおよび９Ｂは、予防的モデルにおける（Ａ）Ｕ８７ＭＧおよび（Ｂ）Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片成長率に対するｍＡｂ８０６の抗腫瘍効果を図示するものである。週齢４−６週ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、（ｎ＝５）、の両側腹部に、第０日に、３×１０６ Ｕ８７ＭＧまたはＵ８７ＭＧ．Δ２−７細胞をｓ．ｃ．注射した。腫瘍細胞接種の１日前に開始して１ｍｇのｍＡｂ８０６（●）；０．１ｍｇのｍＡｂ８０６（▲）；またはビヒクル（○）のいずれかをマウスにｉ．ｐ．注射した。矢印により示すように２週間、週３回、注射を施した。平均腫瘍容積±Ｓ．Ｅ．としてデータを表示する。 図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃは、確率モデルにおける（Ａ）Ｕ８７ＭＧ，（Ｂ）Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７および（Ｃ）Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片に対するｍＡｂ８０６の抗腫瘍効果を図示するものである。週齢４−６週ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、（ｎ＝５）、の両側腹部に、３×１０６ Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７またはＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞をｓ．ｃ．注射した。腫瘍が６５−８０ｍｍ３の平均腫瘍容積に達したときに開始して１ｍｇ用量のｍＡｂ８０６（●）；０．１ｍｇ用量のｍＡｂ８０６（▲）；またはビヒクル（○）のいずれかをマウスにｉ．ｐ．注射した。矢印により示すように２週間、週３回、注射を施した。平均腫瘍容積±Ｓ．Ｅ．としてデータを表示する。 図１１Ａおよび１１Ｂは、（Ａ）予防的モデルおよび（Ｂ）確率モデルにおけるＡ４３１異種移植片に対するｍＡｂ８０６の抗腫瘍効果を図示するものである。週齢４−６週ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス、（ｎ＝５）、の両側腹部に、３×１０６ Ａ４３１細胞をｓ．ｃ．注射した。予防的モデルの場合は腫瘍細胞接種の１日前に開始して、または腫瘍が２００ｍｍ３の平均腫瘍容積に達したときに開始して、１ｍｇ用量のｍＡｂ８０６（●）；またはビヒクル（○）のいずれかをマウスにｉ．ｐ．注射した。矢印により示すように２週間、週３回、注射を施した。平均腫瘍容積±Ｓ．Ｅ．としてデータを表示する。 図１２は、予防的モデルにおけるＡ４３１異種移植片に対するＡＧ１４７８での治療と組み合わせたｍＡｂ８０６での治療の抗腫瘍効果を図示するものである。平均腫瘍容積±Ｓ．Ｅ．としてデータを表示する。 図１３は、漸増濃度（０．５μＭおよび５μＭ）のＡＧ１４７８の存在下でのＡ４３１細胞へのｍＡｂ８０６の結合を描写するものである。 図１４Ａおよび１４Ｂは、８０６ＶＨ鎖遺伝子の（Ａ）核酸配列および（Ｂ）このアミノ酸翻訳（それぞれ、配列番号：１および配列番号：２）を図示するものである。 図１５Ａおよび１５Ｂは、８０６ＶＬ鎖遺伝子の（Ａ）核酸配列および（Ｂ）このアミノ酸翻訳（それぞれ、配列番号：３および配列番号：４）を図示するものである。 図１６は、Ｋａｂａｔに従って番号付けしたＶＨ鎖配列（配列番号：２）を示すものであり、ＣＤＲ（配列番号：１５、１６および１７）に下線を引く。ＶＨ鎖配列（配列番号：２）の鍵残基は、２４、３７、４８、６７および７８である。 図１７は、Ｋａｂａｔに従って番号付けしたＶＬ鎖配列（配列番号：４）を示すものであり、ＣＤＲ（配列番号：１８、１９および２０）に下線を引く。ＶＬ鎖配列（配列番号：４）の鍵残基は、３６、４６、５７および７１である。 図１８Ａ−１８Ｄは、併用抗体療法、特にｍＡｂ８０６および５２８抗体、の治療効果を判定するために計画したインビボ研究の結果を示すものである。マウスにＵ８７ＭＧ．Ｄ２−７（ＡおよびＢ）、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ（Ｃ）、またはＡ４３１（Ｄ）細胞の接種を施した。 図１９Ａ−Ｄは、電子顕微鏡検査による内在化の分析を示すものである。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞を４℃で、ｍＡｂ８０６またはＤＨ８．３と共に、続いて金コンジュゲート型抗マウスＩｇＧと共に前保温し、３７℃に移し、電子顕微鏡検査によって様々な時点で内在化を検査した。（Ａ）５分後の被覆小窩（矢印）へのＤＨ８．３抗体の局在化；（Ｂ）２分後のマクロピノサイトーシス（矢印）によるｍＡｂ８０６の内在化；（Ｃ）２０分後のリソソーム（矢印）へのＤＨ８．３の局在化；（Ｄ）３０分後のリソソーム（矢印）へのｍＡｂ８０６の局在化。すべての画像についての原倍率は、３０，０００倍である。 図２０は、１２５Ｉ−ｍＡｂ８０６の注射の８時間後に採集したＵ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植切片のオートラジオグラフィーを示すものである。 図２１は、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する細胞系のフローサイトメトリー分析を示すものである。ＨＭ５およびＭＤＡ−４６８細胞を、無関係なＩｇＧ２ｂ抗体（破線での白ヒストグラム）、ｍＡｂ８０６（黒ヒストグラム）または５２８（閉線での白ヒストグラム）で染色した。ＤＨ８．３抗体は、両方の細胞系に対して完全に陰性であった（データを示さない。）。 図２２は、細胞系からのＥＧＦＲの免疫沈降を示すものである。ｍＡｂ８０６、ｓｃ−０３抗体またはＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照で３５Ｓ標識Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７またはＡ４３１細胞からＥＧＦＲを免疫沈降させた。側面の矢印は、ｄｅ２−７およびｗｔＥＧＦＲの位置を示す。３回の独立した実験において同一のバンディングパタンが得られた。 図２３は、１２５Ｉ−ｍＡｂ８０６の注射の２４時間後に採集したＡ４３１異種移植切片のオートラジオグラフィーを示すものであり、生組織への局在領域を指摘する（矢印）。 図２４Ａおよび２４Ｂは、全身ｍＡｂ８０６治療を施した頭蓋内Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ（Ａ）およびＬＮ−Ｚ３０８．ΔＥＧＦＲ（Ｂ）異種移植片を有するヌードマウスの生存延長を示すものである。Ｕ８７ＭＧ．ＥＧＦＲ細胞（１×１０５）またはＬＮ−Ｚ３０８．ΔＥＧＦＲ細胞（５×１０５）をヌードマウスの脳に内植し、内植後第０日から第１４日まで、これらの動物を、ｍＡｂ８０６、ＰＢＳ、またはアイソタイプＩｇＧのいずれかで治療した。 図２４Ｅは、腫瘍内ｍＡｂ８０６治療を施した頭蓋内Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ異種移植片を有するヌードマウスの生存延長を示すものである。説明したようにＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲを内植した。第１日に開始して１日おきに５回、５μＬの体積で１０ｍｇのｍＡｂ８０６またはアイソタイプＩｇＧ対照を腫瘍注射部位に注射した。 図２４Ｃおよび２４Ｄは、ｍＡｂ８０６治療による頭蓋内腫瘍の成長阻害を示すものである。ｍＡｂ８０６またはアイソタイプＩｇＧ対照のいずれかで治療したヌードマウス（１群あたり５匹）を、Ｕ８７ＭＧ．ＥＧＦＲ（Ｃ）については第９日に、およびＬＮ−Ｚ３０８．ΔＥＧＦＲ（Ｄ）については第１５日に安楽死させ、これらの脳を回収し、固定し、切開した。対照の腫瘍容積を１００％と考えることによってデータを計算した。値は、平均±ＳＤである。＊＊＊、Ｐ＜０．００１；対照対ｍＡｂ８０６。矢じり、腫瘍組織。 図２５Ａ、２５Ｂおよび２５Ｃは、ｍＡｂ８０６が、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ脳腫瘍を有するマウスの生存を延長するが、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫまたはＵ８７ＭＧ脳腫瘍を有するマウスの生存を延長しないことを示すものである。Ｕ８７ＭＧ（Ａ）、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ（Ｂ）、またはＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ（Ｃ）細胞（５×１０５）をヌードマウスの脳に内植し、内植後第０日から第１４日までｍＡｂ８０６で治療し、その後、治療中止後、観察した。 図２６Ａは、Ｕ８７ＭＧ細胞系でのｍＡｂ８０６の反応性のＦＡＣＳ分析を示すものである。Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ、およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞を、抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ５２８、ＥＧＦＲ．１および抗ΔＥＧＦＲ抗体、ｍＡｂ８０６で染色した。モノクローナルＥＧＦＲ．１抗体は、ｗｔＥＧＦＲを排他的に認識し、ならびにモノクローナル５２８抗体は、ｗｔＥＧＦＲおよびΔＥＧＦＲ両方と反応した。ｍＡｂ８０６は、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲおよびＵ８７ＭＧ．ＤＫと強く反応し、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲとは弱く反応した。横座標上のバー、一次抗体不在下での細胞の最大染色。結果は、３回の異なる実験で再現された。 図２６Ｂは、ＥＧＦＲ形態のｍＡｂ８０６免疫沈降を示すものである。突然変異体およびｗｔＥＧＦＲを、（レーン１）Ｕ８７ＭＧ、（レーン２）Ｕ８７Δ．ＥＧＦＲ、（レーン３）Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ、および（レーン４）Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞から、抗ＥＧＦＲ抗体、５２８、ＥＧＦＲ．１、または抗ΔＥＧＦＲ抗体、ｍＡｂ８０６で免疫単離し（ｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｅｄ）、その後、抗ｐａｎ ＥＧＦＲ抗体、Ｃ１３でのウエスタンブロッティングによって検出した。 図２７Ａおよび２７Ｂは、ｍＡｂ８０６での全身治療が、ΔＥＤＦＲのリン酸化、およびＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ脳腫瘍におけるＢｃｌ−ＸＬ発現を減少させることを示すものである。Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ腫瘍をｍＡｂ８０６治療の第９日に切除し、直ちに液体窒素で凍結させ、腫瘍溶解産物調製まで−８０℃で保管した。 （Ａ）ΔＥＧＦＲの発現および自己リン酸化度のウエスタンブロット分析。３０μｇの腫瘍溶解産物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにさらし、ニトロセルロース膜に転写し、抗ホスホチロシンｍＡｂでプローブし、その後、ストリッピングし、抗ＥＧＦＲ抗体、Ｃ１３で再プローブした。 （Ｂ）（Ａ）の場合と同じ腫瘍溶解産物を使用することによるＢｃｌ−ＸＬのウエスタンブロッティング。抗ヒトＢｃｌ−Ｘポリクローナル抗体で膜をプローブした。レーン１および２、アイソタイプ対照で治療したＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ脳腫瘍；レーン３および４、ｍＡｂ８０６で治療したＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ脳腫瘍。 図２８は、ｍＡｂ８０６治療が、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ腫瘍において、成長および脈管形成の減少、ならびにアポトーシスおよびマクロファージ蓄積の増加をもたらすことを示すものである。腫瘍切片をＫｉ−６７について染色した。各群４匹のマウスからの頭蓋内腫瘍における４つのランダムに選択した高倍率視野（４００倍）からＫｉ−６７陽性であった全細胞の百分率によって、細胞増殖指数を評定した。データは、平均±ＳＥである。アポトーシス細胞をＴＵＮＥＬアッセイによって検出した。各群４匹のマウスからの頭蓋内腫瘍における４つのランダムに選択した高倍率視野（４００倍）からのＴＵＮＥＬ陽性細胞：全細胞数の比によって、アポトーシス指数を評定した。データは、平均±ＳＥである。腫瘍切片を抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した。各群４匹のマウスからの頭蓋内腫瘍における４つのランダムに選択した視野（２００倍）からのコンピュータ画像解析によって、ＭＶＡを分析した。ｍＡｂ８０６治療Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ腫瘍におけるマクロファージの腫瘍周辺浸潤。腫瘍切片を抗Ｆ４／８０抗体で染色した。 図２９は、親Ｕ８７ＭＧ神経膠腫細胞系およびトランスフェクトされたＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞系のフローサイトメトリー分析を示すものである。示されているとおり、無関係なＩｇＧ２ｂ抗体（白ヒストグラム）または５２８抗体またはｍＡｂ８０６（黒ヒストグラム）のいずれかで細胞を染色した。 図３０は、細胞系からのＥＧＦＲの免疫沈降を示すものである。ＥＧＦＲを、３５Ｓ標識Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７、およびＡ４３１細胞から、ｍＡｂ８０６（８０６）、ｓｃ−０３抗体（ｃ−ｔｅｒｍ）、またはＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照（ｃｏｎ）で免疫沈降させた。矢印、ｄｅ２−７およびｗｔＥＧＦＲの位置。 図３１は、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片の代表Ｈ＆Ｅ染色パラフィン切片を示すものである。上の図１０において説明したように治療したマウスからＵ８７ＭＧ．Δ２−７（腫瘍接種の２４日後に採集）およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ（腫瘍接種の４２日後に採集）異種移植片を切除し、Ｈ＆Ｅで染色した。ビヒクル治療Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７（腫瘍接種の１８日後に採集）およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ（腫瘍接種の３７日後に採集）異種移植片は、壊死を殆ど示さなかった（左パネル）が、ｍＡｂ８０６で治療したＵ８７ＭＧ．Δ２−７とＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲの両方において広範な壊死（矢印）が観察された（右パネル）。 図３２は、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片から採取した凍結切片におけるＥＧＦＲ発現の免疫組織化学的分析を示すものである。上の図３１において説明した時点で切片を採集した。異種移植切片を５２８抗体（左パネル）およびｍＡｂ８０６（右パネル）で免疫染色した。ｗｔＥＧＦＲ、増幅されたＥＧＦＲ、またはｄｅ２−７ ＥＧＦＲのいずれに対する免疫反応性減少も、ｍＡｂ８０６で治療した異種移植片では観察されなかった。インビトロデータと一致して、親Ｕ８７ＭＧ異種移植片は、５２８抗体について陽性であったが、ｍＡｂ８０６染色については陰性であった。 図３３は、産生されるバイシストロン性発現構築物の略図を示すものである。キメラ抗体鎖の転写を伸長因子−１プロモーターによって開始させ、強力な人工終結配列によって終結させる。軽鎖のコーディング領域とＮｅｏＲのコーディング領域の間、および重鎖のコーディング領域とｄｈｆｒ遺伝子のコーディング領域の間に、ＩＲＥＳ配列を導入した。 図３４Ａおよび３４Ｂは、Ｕ８７ＭＧ−ｄｅ２−７異種移植腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて（Ａ）１２５Ｉまたは（Ｂ）１１１Ｉｎのいずれかで放射標識したｃｈ８０６の生体内分布分析を行ったことを示すものである。５μｇの放射標識抗体をマウスに注射し、８、２８、４８または７４時間、いずれかの時点で、１時点につき４匹のマウスの群で犠牲にした。器官を採集し、計量し、ガンマカウンターで放射能を測定した。 図３５Ａおよび３５Ｂは、（Ａ）％ＩＤグラム腫瘍組織および（Ｂ）腫瘍対血液比を描写するものである。インジウム−１１１抗体は、おおよそ３０％のＩＤ／グラム組織および４．０の腫瘍対血液比を示す。 図３６は、確率腫瘍モデルにおけるキメラ抗体ｃｈ８０６の治療効力を描写するものである。週齢４−６週の雌ヌードマウスの両側腹部に、１００μＬのＰＢＳ中の３×１０６ Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞をｓ．ｃ．接種した。ｍＡｂ８０６を陽性対照として含めた。腫瘍が５０ｍｍ３の平均容積に達したとき治療を開始し、この治療は、示されている日での合計５回の注射についてのｉ．ｐ．で施した１ｍｇのｃｈ８０６またはｍＡｂ８０６から成った。データを各治療群について平均腫瘍容積±Ｓ．Ｅ．として提示する。 図３７は、抗ＥＧＦＲキメラＩｇＧＩ抗体ｃｈ８０６および対照ｃＧ２５０についてのターゲット（Ａ）Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７および（Ｂ）Ａ４３１細胞に対するＣＤＣ活性を示すものである。三重反復判定の細胞傷害性平均（バー；±ＳＤ）パーセントを提示する。 図３８は、ｃｈ８０６およびアイソタイプ対照ｃＧ２５０（０−１０μｇ／ｍＬ）によって媒介される５０：１のエフェクター：ターゲット細胞比でのターゲット（Ａ）Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７および（Ｂ）Ａ４３１細胞に対するＡＤＣＣを示すものである。三重反復判定の細胞傷害性平均（バー；±ＳＤ）パーセントとして結果を提示する。 図３９は、ターゲットＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−７細胞に対する１μｇ／ｍＬの親ｍＡｂ８０６およびｃｈ８０６によって媒介されるＡＤＣＣをある範囲のエフェクター：ターゲット比に関して示すものである。三重反復判定の平均（バー；±ＳＤ）を提示する。 図４０は、ｃｈ８０６を結合するがｈｕＩｇＧを結合しない抗体を生産する２５のハイブリドーマを最初に選択したことを示すものである。その後、高親和性結合を有するこれらの抗ｃｈ８０６ハイブリドーマのうちの４つ（クローン３Ｅ３、５Ｂ８、９Ｄ６および４Ｄ８）を制限希釈により単個細胞からのクローン増殖について追跡し、それぞれ、Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（ＬＭＨ）−１１、−１２、−１３および−１４と呼んだ。加えて、ｈｕＩｇＧに特異的なｍＡｂを生産する２つのハイブリドーマもクローニングし、さらに特性づけした：クローン２Ｃ１０（ＬＭＨ−１５）および２Ｂ８（ＬＭＨ−１６）。 図４１Ａ、４１Ｂおよび４１Ｃは、クローン増殖後、ハイブリドーマ培養上清を、ｓＥＧＦＲ６２１でｃｈ８０６またはｍＡｂ８０６抗原結合活性を中和する能力についてＥＬＩＳＡにより三重反復で検査した。平均（±ＳＤ）結果は、ｓＥＧＦＲでコーティングしたプレートへのｃｈ８０６およびマウスｍＡｂ８０６両方の結合の溶解状態での遮断で抗イディオタイプｍＡｂ ＬＭＨ−１１、−１２、−１３および−１４のアンタゴニスト活性を明示した（ＬＭＨ−１４を示さない。）。 図４２Ａ、４２Ｂは、１０μｇ／ｍＬの精製（Ａ）ＬＭＨ−１１、（Ｂ）ＬＭＨ−１２および（Ｃ）ＬＭＨ−１３でコーティングしたマクロタイタープレートを示すものである。これら３種の精製クローンを、血清または１％ＦＣＳ／培地中のｃｈ８０６またはｍＡｂ８０６を捕捉するこれらの能力について比較した。その後、結合したｃｈ８０６またはｍＡｂ８０６を検出する。二次コンジュゲートアビジン−ＨＲＰおよびＡＢＴＳ基質のための対照に加えて、血清および１％ＦＣＳ／培地中のアイソタイプ対照抗体ｈｕ３Ｓ１９３およびｍ３Ｓ１９３を含めた。検出のためにビオチン化ＬＭＨ−１２（１０μｇ／ｍＬ）を使用して三重反復試験サンプルの平均（±ＳＤ）として結果を提示する。これらの結果は、捕捉および検出のために使用したＬＭＨ−１２が、血清中のｃｈ８０６（３ｎｇ／ｍＬ）に対する最高の感受性と無視できる程度のバックグラウンド結合を有したことを示している。 ４２Ｃは、１０μｇ／ｍＬの精製（Ａ）ＬＭＨ−１１、（Ｂ）ＬＭＨ−１２および（Ｃ）ＬＭＨ−１３でコーティングしたマクロタイタープレートを示すものである。これら３種の精製クローンを、血清または１％ＦＣＳ／培地中のｃｈ８０６またはｍＡｂ８０６を捕捉するこれらの能力について比較した。その後、結合したｃｈ８０６またはｍＡｂ８０６を検出する。二次コンジュゲートアビジン−ＨＲＰおよびＡＢＴＳ基質のための対照に加えて、血清および１％ＦＣＳ／培地中のアイソタイプ対照抗体ｈｕ３Ｓ１９３およびｍ３Ｓ１９３を含めた。検出のためにビオチン化ＬＭＨ−１２（１０μｇ／ｍＬ）を使用して三重反復試験サンプルの平均（±ＳＤ）として結果を提示する。これらの結果は、捕捉および検出のために使用したＬＭＨ−１２が、血清中のｃｈ８０６（３ｎｇ／ｍＬ）に対する最高の感受性と無視できる程度のバックグラウンド結合を有したことを示している。 図４３は、１μｇ／ｍＬの抗イディオタイプＬＭＨ−１２および１μｇ／ｍＬのビオチン化ＬＭＨ−１２をそれぞれ捕捉および検出のために使用する、最適な薬物動力学的ＥＬＩＳＡ条件の妥当性検証を示すものである。３回の独立したＥＬＩＳＡを四重反復で行って、３人の健常ドナーからのドナー血清中のｃｈ８０６（●）または１％ＢＳＡ／培地中のｃｈ８０６（■）を、血清中のアイソタイプ対照ｈｕ３Ｓ１９３（▲）または１％ＢＳＡ／培地中のアイソタイプ対照ｈｕ３Ｓ１９３（▼）と共に測定した。二次コンジュゲートアビジン−ＨＲＰについての対照（◆）およびＡＢＴＳ基質についての対照（六角形）単独も各ＥＬＩＳＡに含めた。平均（±ＳＤ）結果は、３ｎｇ／ｍＬの検出限界で血清中のｃｈ８０６（２μｇ／ｍＬ−１．６ｎｇ／ｍＬ）の測定について非常に再現性のある結合曲線を明示する（ｎ＝１２；１−１００ｎｇ／ｍＬ、変動係数＜２５％；１００ｎｇ／ｍＬ−５μｇ／ｍＬ、変動係数＜１５％）。試験した３つの血清のいずれに関してもはっきりわかるバックグラウンド結合はなく、および無視できる程度の結合がアイソタイプ対照ｈｕ３Ｓ１９３に関して観察された。 図４４は、ｍＡｂ８０６でブロットした、ＣＨＯ細胞において発現された組換えｓＥＧＦＲの免疫ブロットを描写するものである。組換えｓＥＧＦＲをＰＮＧａｓｅＦで処理して、Ｎ結合型グリコシル化（脱グリコシル化したもの）または未処理のもの（未処理のもの）を除去し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、膜に転写し、ｍＡｂ８０６で免疫ブロットした。 図４５は、異なる抗体（ＳＣ−０３、８０６および５２８抗体）での３５Ｓ標識細胞系（Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７、Ｕ８７ＭＧ−ｗｔＥＧＦＲ、およびＡ４３１）からのＥＧＦＲの免疫沈降を描写するものである。 図４６は、３５Ｓメチオニン／システインでのパルス標識後、異なる時点（時間０から２４０分）での異なる細胞（Ａ４３１およびＵ８７ＭＧ．Δ２−７）からのＥＧＦＲの免疫沈降を描写するものである。抗体５２８および８０６を免疫沈降に使用する。 図４７は、高マンノース型炭水化物を除去するためのＥｎｄｏ Ｈ消化の不在下（−）でのおよびＥｎｄｏ Ｈ消化後（＋）の様々な抗体（ＳＣ−０３、８０６および５２８）での様々な細胞系（Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７、Ｕ８７ＭＧ−ｗｔＥＧＦＲ、およびＡ４３１）からのＥＧＦＲの免疫沈降を描写するものである。 図４８は、Ａ４３１およびＵ８７ＭＧ．Δ２−７細胞系の細胞表面ヨウ素化後の８０６抗体での、およびＥｎｄｏ Ｈ消化を伴うまたは伴わない、免疫沈降を描写するものであり、この図により、Ａ４３１細胞の細胞表面にｍＡｂ８０６によって結合されたＥＧＦＲがＥｎｄｏＨ感受性形態であることが確証される。 図４９−１は、ｐＲＥＮ ｃｈ８０６ ＬＣ Ｎｅｏ Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：７）を示すものである。 図４９−２は、ｐＲＥＮ ｃｈ８０６ ＬＣ Ｎｅｏ Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：７）を示すものである。 図４９−３は、ｐＲＥＮ ｃｈ８０６ ＬＣ Ｎｅｏ Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：７）を示すものである。 図４９−４は、ｐＲＥＮ ｃｈ８０６ ＬＣ Ｎｅｏ Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：７）を示すものである。 図４９−５は、ｐＲＥＮ ｃｈ８０６ ＬＣ Ｎｅｏ Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：７）を示すものである。 図４９−６は、ｐＲＥＮ ｃｈ８０６ ＬＣ Ｎｅｏ Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：７）を示すものである。 図５０−１は、ｐＲＥＮ ｃｈ８０６ ＨＣ ＤＨＦＲ Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：８）を示すものである。 図５０−２は、ｐＲＥＮ ｃｈ８０６ ＨＣ ＤＨＦＲ Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：８）を示すものである。 図５０−３は、ｐＲＥＮ ｃｈ８０６ ＨＣ ＤＨＦＲ Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：８）を示すものである。 図５０−４は、ｐＲＥＮ ｃｈ８０６ ＨＣ ＤＨＦＲ Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：８）を示すものである。 図５０−５は、ｐＲＥＮ ｃｈ８０６ ＨＣ ＤＨＦＲ Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：８）を示すものである。 図５０−６は、ｐＲＥＮ ｃｈ８０６ ＨＣ ＤＨＦＲ Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：８）を示すものである。 図５０−７は、ｐＲＥＮ ｃｈ８０６ ＨＣ ＤＨＦＲ Ｖｅｃｔｏｒ（配列番号：８）を示すものである。 図５１Ａ−Ｂは、ｍＡｂ１２４ ＶＨおよびＶＬ鎖核酸配列（それぞれ、配列番号：２１および２６）およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号：２２および２７）を示すものである。 図５１Ｃ−Ｄは、ｍＡｂ１２４ ＶＨおよびＶＬ鎖核酸配列（それぞれ、配列番号：２１および２６）およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号：２２および２７）を示すものである。 図５２Ａ−Ｂは、ｍＡｂ１１３３ ＶＨおよびＶＬ鎖核酸配列（それぞれ、配列番号：３１および３６）およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号：３２および３７）を示すものである。 図５２Ｃ−Ｄは、ｍＡｂ１１３３ ＶＨおよびＶＬ鎖核酸配列（それぞれ、配列番号：３１および３６）およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号：３２および３７）を示すものである。 図５３は、ｈｕ８０６Ｈ（ＶＨ＋ＣＨ）発現カートリッジを含有するｐＥＥ１２．４とｈｕ８０６Ｌ（ＶＬ＋ＣＬ）発現カートリッジを含有するｐＥＥ６．４とを含む複合２遺伝子ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡプラスミド図を示すものである。 図５４−１は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体 配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである： （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列； （ラベンダー）：ｈｕ８０６ ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域； （ピンク）：ｈｕ８０６ ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域； （緑色）：ｈｕ８０６ ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および （黄色）：ｈｕ８０６ ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。 図５４−２は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体 配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである： （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列； （ラベンダー）：ｈｕ８０６ ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域； （ピンク）：ｈｕ８０６ ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域； （緑色）：ｈｕ８０６ ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および （黄色）：ｈｕ８０６ ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。 図５４−３は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体 配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである： （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列； （ラベンダー）：ｈｕ８０６ ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域； （ピンク）：ｈｕ８０６ ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域； （緑色）：ｈｕ８０６ ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および （黄色）：ｈｕ８０６ ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。 図５４−４は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体 配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである： （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列； （ラベンダー）：ｈｕ８０６ ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域； （ピンク）：ｈｕ８０６ ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域； （緑色）：ｈｕ８０６ ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および （黄色）：ｈｕ８０６ ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。 図５４−５は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体 配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである： （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列； （ラベンダー）：ｈｕ８０６ ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域； （ピンク）：ｈｕ８０６ ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域； （緑色）：ｈｕ８０６ ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および （黄色）：ｈｕ８０６ ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。 図５４−６は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体 配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである： （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列； （ラベンダー）：ｈｕ８０６ ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域； （ピンク）：ｈｕ８０６ ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域； （緑色）：ｈｕ８０６ ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および （黄色）：ｈｕ８０６ ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。 図５４−７は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体 配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである： （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列； （ラベンダー）：ｈｕ８０６ ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域； （ピンク）：ｈｕ８０６ ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域； （緑色）：ｈｕ８０６ ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および （黄色）：ｈｕ８０６ ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。 図５４−７は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体 配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである： （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列； （ラベンダー）：ｈｕ８０６ ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域； （ピンク）：ｈｕ８０６ ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域； （緑色）：ｈｕ８０６ ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および （黄色）：ｈｕ８０６ ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。 図５４は、図５３に記載した複合ＬｏｎｚａプラスミドのＤＮＡ配列（配列番号：４１；補体 配列番号：１６２）を示すものである。この配列は、ｈｕ８０６抗体に関連したすべての翻訳（配列番号：４２−５１および１６３−１６６）も示す。このプラスミドを配列検証し、コーディング配列および翻訳を確認した。関心のある領域を識別するために配列の区画に影をつけた；影のついた領域は、実際のスプライス接合部に対応する。カラーコードは、次のとおりである： （灰色）：シグナル領域、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方で見つけられる最初のコーディング配列； （ラベンダー）：ｈｕ８０６ ＶＨ鎖、ベニアリングされた重鎖可変領域； （ピンク）：ｈｕ８０６ ＣＨ鎖、コドン最適化された重鎖定常領域； （緑色）：ｈｕ８０６ ＶＬ鎖、ベニアリングされた軽鎖可変領域；および （黄色）：ｈｕ８０６ ＣＬ鎖、コドン最適化軽鎖定常領域。 図５５Ａおよび５５Ｂは、ｈｕ８０６翻訳アミノ酸配列（配列番号：１６４および１６６のＶＨおよびＶＬ鎖ならびに配列番号：１６３および１６５のこれらそれぞれのシグナルペプチド；配列番号：４３および４８のＣＨおよびＣＬ鎖）を示す、ならびにＶＨおよびＶＬ鎖（それぞれ、配列番号：１６４および１６５）についてのＫａｂａｔ番号を与えるものであり、ＣＤＲ（配列番号：４４−４６および４９−５１）に下線を引く。 図５６Ａおよび５６Ｂは、ベニアリング設計における最初の段階、表面露出についてのｍＡｂ８０６配列（配列番号：１６７のＶＨ鎖および配列番号：１２のＶＬ鎖）内のアミノ酸残基の等級づけを示すものである。等級を各残基の上にアスタリスク（＊）の数で与え、最大露出残基は３つのアスタリスクを有する。これらの図は、最初のオリゴヌクレオチド（ＶＨ鎖：図５６Ｃならびに配列番号：５２および１６９−１７７；ＶＬ鎖：図５７Ｃならびに配列番号：６２、６６、６８および１８１−１８７）がどのようにオーバーラップして、第一のベニアリングされた産物（配列番号：１６８のＶＨ鎖および配列番号：１８０のＶＬ鎖）を形成するかを示す設計図を含む。 図５６Ｃは、ベニアリング設計における最初の段階、表面露出についてのｍＡｂ８０６配列（配列番号：１６７のＶＨ鎖および配列番号：１２のＶＬ鎖）内のアミノ酸残基の等級づけを示すものである。等級を各残基の上にアスタリスク（＊）の数で与え、最大露出残基は３つのアスタリスクを有する。これらの図は、最初のオリゴヌクレオチド（ＶＨ鎖：図５６Ｃならびに配列番号：５２および１６９−１７７；ＶＬ鎖：図５７Ｃならびに配列番号：６２、６６、６８および１８１−１８７）がどのようにオーバーラップして、第一のベニアリングされた産物（配列番号：１６８のＶＨ鎖および配列番号：１８０のＶＬ鎖）を形成するかを示す設計図を含む。 図５７Ａおよび５７Ｂは、ベニアリング設計における最初の段階、表面露出についてのｍＡｂ８０６配列（配列番号：１６７のＶＨ鎖および配列番号：１２のＶＬ鎖）内のアミノ酸残基の等級づけを示すものである。等級を各残基の上にアスタリスク（＊）の数で与え、最大露出残基は３つのアスタリスクを有する。これらの図は、最初のオリゴヌクレオチド（ＶＨ鎖：図５６Ｃならびに配列番号：５２および１６９−１７７；ＶＬ鎖：図５７Ｃならびに配列番号：６２、６６、６８および１８１−１８７）がどのようにオーバーラップして、第一のベニアリングされた産物（配列番号：１６８のＶＨ鎖および配列番号：１８０のＶＬ鎖）を形成するかを示す設計図を含む。 図５７Ｃは、ベニアリング設計における最初の段階、表面露出についてのｍＡｂ８０６配列（配列番号：１６７のＶＨ鎖および配列番号：１２のＶＬ鎖）内のアミノ酸残基の等級づけを示すものである。等級を各残基の上にアスタリスク（＊）の数で与え、最大露出残基は３つのアスタリスクを有する。これらの図は、最初のオリゴヌクレオチド（ＶＨ鎖：図５６Ｃならびに配列番号：５２および１６９−１７７；ＶＬ鎖：図５７Ｃならびに配列番号：６２、６６、６８および１８１−１８７）がどのようにオーバーラップして、第一のベニアリングされた産物（配列番号：１６８のＶＨ鎖および配列番号：１８０のＶＬ鎖）を形成するかを示す設計図を含む。 図５８−１は、コドン最適化ｈｕＩｇＧ１重鎖ＤＮＡ配列（配列番号：８０；補体 配列番号：１７８）およびアミノ酸翻訳（配列番号：４３）のマップを示すものである。 図５８−２は、コドン最適化ｈｕＩｇＧ１重鎖ＤＮＡ配列（配列番号：８０；補体 配列番号：１７８）およびアミノ酸翻訳（配列番号：４３）のマップを示すものである。 図５９は、ｈｕ８０６ ＶＨ＋ＣＨアミノ酸配列（８Ｃ６５ＡＡＧ ｈｕ８０６ ＶＨ＋ＣＨ；配列番号：８１）とｍＡｂ８０６ ＶＨ鎖（配列番号：１６７）についての原参照ファイルを比較するタンパク質アラインメントを示すものである。強調表示領域は、ＶＨ鎖内の保存アミノ酸配列を示す。ＣＤＲに下線を引く。アスタリスクは、初期べニアリング方法において計画し、実行した変更を表す。番号がついている部位は、後の修飾への参照である。 図６０は、ｍＡｂ８０６ ＶＬ鎖（配列番号：１７９）についての原参照ファイルへのｈｕ８０６ ＶＬ＋ＣＬアミノ酸配列（８Ｃ６５ＡＡＧ ｈｕ８０６シグナル＋ＶＬ＋ＣＬ；配列番号：８３）についての対応するアラインメントを示すものである。これは、修飾番号７でなされる変更を図示するために含めた追加のファイル（ｒ２ｖｋ１ ｈｕ８０６シグナル＋ＶＬ＋ＣＬ；配列番号：８２）、前駆体構築物を含有する。 図６１は、ｈｕ８０６ シグナル＋ＶＬおよびＣＬ配列（８Ｃ６５ＡＡＧ ｈｕ８０６ Ｖｌ＋Ｃｌ；配列番号：１９０および１８８）と対応するｃｈ８０６配列（ｐＲＥＮ ｃｈ８０６ ＬＣ Ｎｃｏ；ＬＩＣＲ；配列番号：１８９）のヌクレオチドおよびアミノ酸アラインメントを示すものである。図６２において説明するように、これを修飾し、アノテートする。 図６２は、ｈｕ８０６シグナル＋ＶＨ配列（８Ｃ６５ＡＡＧ ｈｕ８０６ ＶＨ鎖；配列番号：１９２）と対応するｍＡｂ８０６配列［コドン変更（ｃｃ）およびベニアリング（ｖｅｎ）前のｍＡｂ８０６ ＶＨ鎖；配列番号：１９１］のヌクレオチドアラインメントを示すものである。図５９および６０のアミノ酸変更の後のヌクレオチド変更を図示し、ならびにアミノ酸の無変更につながった保存的核酸変更も示す。より容易に検分できるように、ｈｕ８０６におけるシグナルおよびＶＨ鎖間のイントロンを除去した。シグナル配列およびＣＤＲに下線を引く。対応するアミノ酸配列（配列番号：４２）を前記アラインメントに重ね合わせた。 図６３は、Ｂｉａｃｏｒｅによって判定したときの、一過性トランスフェクタント２９３細胞から得た精製ｈｕ８０６抗体の組換えＥＧＦＲ−ＥＣＤへの結合を示すものである。精製対照ヒトＩｇＧ１抗体でではＥＧＦＲ−ＥＣＤへの結合は観察されなかった。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 ＩｇＧ１ 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ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列（配列番号：４１）およびアノテーションのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを示すものである。 図６５は、ｍＡｂ８０６（配列番号：１５−１８、２０および１９３）およびｍＡｂ１７５（配列番号：１３０−１３２、１３５および１９４−１９５）からのＣＤＲについてのアミノ酸配列のアラインメントを示すものである。２抗体間の配列の相違を太字にする。 図６６Ａおよび６６Ｂは、ｍＡｂ１７５での細胞系および正常ヒト肝臓の免疫組織化学的染色を示すものである。（Ａ）Ａ４３１細胞（ｗｔＥＧＦＲを過発現する。）、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞（Δ２−７ＥＧＦＲを発現する。）およびＵ８７ＭＧ細胞（ｗｔＥＧＦＲを中程度レベルで発現する。）を含有するブロックから調製した切片を、ビオチン化ｍＡｂ１７５を使用して染色した。（Ｂ）ｍＡｂ１７５（左パネル）、アイソタイプ対照（中央パネル）および二次抗体対照（右パネル）での正常ヒト肝臓の染色（４００倍）。特異的洞様毛細血管または肝細胞染色は観察されなかった。 図６７Ａ、６７Ｂおよび６７Ｃは、酵母に提示されたＥＧＦＲの断片とｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５の反応性を示すものである。（Ａ）酵母提示ＥＧＦＲ断片のｍＡｂ１７５およびｍＡｂ８０６標識の平均蛍光シグナルを描写する代表フローサイトメトリーヒストグラム。酵母ディスプレイでは、細胞のある割合は、これらの表面でタンパク質を発現せず、その結果、２つのヒストグラムピークが得られる。すべての断片が線状Ｃ末端ｃ−ｍｙｃタグを含有するので、９Ｅ１０抗体を陽性対照として使用する。（Ｂ）様々なＥＧＦＲ断片に結合する抗体の概要。（Ｃ）酵母ペレットを３０分間、８００℃に加熱することによって、ＥＧＦＲ断片を変性させた。すべての事例で、ｃ−ｍｙｃタグは、９Ｅ１０抗ｍｙｃ抗体により依然として認識された。このことは、熱処理が酵母表面提示タンパク質を損なわせないことを明示している。高次構造感受性ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ２２５を使用して変性を確認した。 図６８Ａ、６８Ｂ、６８Ｃおよび６８Ｄは、脳および前立腺癌異種移植片に対するｍＡｂ１７５の抗腫瘍効果を示すものである。（Ａ）Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片を有するマウス（ｎ＝５）に、ＰＢＳ、１ｍｇのｍＡｂ１７５またはｍＡｂ８０６（陽性対照）と共に、２週間、週３回、出発腫瘍容積が１００ｍｍ３であったときには第６、８、１０、１３、１５および１７日に、ｉ．ｐ．注射した。データを平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。（Ｂ）２つの無関係な抗体（青色、塗りつぶし、および緑色、中空）、全ＥＧＦＲのためのｍＡｂ ５２８（ピンク色、塗りつぶし）、ｍＡｂ８０６（薄青色、中空）およびｍＡｂ１７５（オレンジ色、中空）で細胞を染色し、その後、ＦＡＣＳによって分析した。（Ｃ）ＤＵ１４５細胞を溶解し、ｍＡｂ ５２８、ｍＡｂ８０６、ｍＡｂ１７５または２つの独立した無関係な抗体でのＩＰに付し、その後、ＥＧＦＲについて免疫ブロットした。（Ｄ）ＤＵ１４５異種移植片を有するマウス（ｎ＝５）に、ＰＢＳ、１ｍｇのｍＡｂ１７５またはｍＡｂ８０６を１日１回、出発腫瘍容積が８５ｍｍ３であったときには第１８−２２、２５−２９および３９−４３日に、ｉ．ｐ．注射した。データを平均腫瘍容積±ＳＥとして表示する。 図６９Ａ、６９Ｂ、６９Ｃ、６９Ｄ、６９Ｅおよび６９Ｆは、Ｆａｂ断片に結合したＥＧＦＲペプチド２８７−３０２の結晶構造を示すものである。（Ａ）軽鎖、赤色；重鎖、青色；結合ペプチド、黄色；およびＥＧＦＲからの重ねたＥＧＦＲ２８７−３０２、紫色での、Ｆａｂ ８０６のコンピュータプリントアウト画像。（Ｂ）軽鎖、黄色；重鎖、緑色；結合ペプチド、ライラック色；およびＥＧＦＲ（ＤＩ−３）からのＥＧＦＲ２８７−３０２、紫色での、Ｆａｂ １７５のコンピュータプリントアウト画像。（Ｃ）ＦＡＢ １７５に結合したペプチドへの該受容体内のＥＧＦＲ２８７−３０２の類似性を示す、（Ｂ）の詳細。ペプチド骨格をＣαトレースとして、および相互作用している側鎖をスティックとして示す。主鎖に関して、Ｏ原子を赤色に彩色する；Ｎ、青色；Ｓ、オレンジ色；およびＣ。（Ｄ）空間的オーバーラップを示す、Ｆａｂ１７５：ペプチド複合体とＥＧＦＲの重ね合わせ。ＥＧＦＲ１８７−２８６の表面を青緑色に彩色して、（Ｃ）の場合のように彩色。（Ｅ）不透明青色で示すＥＧＦＲ１８７−２８６および透明な軽鎖表面（オレンジ色）および重鎖表面（緑色）での、（Ｄ）に対する直交図。（Ｆ）抗原結合部位を調べる１７５Ｆａｂ複合体の詳細な立体図。（Ｃ）の場合のように彩色し、水素結合を黒色の点々で示す。複合体を形成して隠れている水分子を赤色の球として示す。 図７０Ａ、７０Ｂ、７０Ｃおよび７０Ｄは、ＥＧＦＲに結合するｍＡｂ８０６に対する２７１−２８３システイン結合の影響を示すものである。（Ａ）ｗｔＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ−Ｃ２７１Ａ、ＥＧＦＲ−Ｃ２８３ＡまたはＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ突然変異体でトランスフェクトした細胞をｍＡｂ５２８で（塗りつぶしピンク色ヒストグラム）、ｍＡｂ８０６で（青色線）、または二次抗体のみで（紫色）染色し、その後、ＦＡＣＳによって分析した。クラスを合わせた無関係な抗体を使用して、ゲインを設定した。（Ｂ）ＥＧＦＲ−Ｃ２７１ＡまたはＣ２７１／２８３Ａ ＥＧＦＲを発現するＢａＦ３細胞を、説明したようなＭＴＴアッセイにおいてＥＧＦへのこれらの応答について検査した。データ点のＢｏｌｚｍａｎフィットを用いて、ＥＣ５０Ｓを導出した。三重反復測定の平均およびｓｄとしてデータを表す。（Ｃ）野生型またはＥＧＦＲ−Ｃ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａを発現するＢａＦ３細胞をＩＬ−３および血清飢餓させ、その後、ＥＧＦまたはビヒクル対照に暴露した。全細胞溶解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗ホスホチロシン抗体（上方パネル）または抗ＥＧＦＲ抗体（下方パネル）で免疫ブロットした。（Ｄ）野生型（左パネル）またはＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ（右パネル）ＥＧＦＲを発現するＢａＦ３細胞を、抗体不在下（中白記号）、ｍＡｂ ５２８（灰色丸）またはｍＡｂ８０６（黒色三角）の存在下（両方とも１０μｇ／ｍＬ）、漸増濃度のＥＧＦで刺激した。三重反復測定の平均およびｓｄとしてデータを表す。 図７１Ａ、７１Ｂおよび７１Ｃは、（Ａ）声帯の転移性扁平上皮細胞癌腫を有する患者における１１１Ｉｎ ｃｈ８０６の生体内分布の全身ガンマカメラ画像［右頚部（矢印）における腫瘍への定量的な高い取り込み量を示している。血液プール活性、および肝臓における遊離１１１Ｉｎの小さな異化も見られる］。（Ｂ）この患者の頚部の単一光子コンピュータ断層撮影（Ｓｉｎｇｌｅ Ｐｈｏｔｏｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＳＰＥＣＴ）画像［生存腫瘍（矢印）での１１１Ｉｎの取り込みと、壊死を示す中心部取り込み減少を示している］。（Ｃ）対応する頚部ＣＴスキャン［大きな右頚部腫瘍量（矢印）と中心性壊死を明示している］を示すものである。 図７２Ａおよび７２Ｂは、テザリングされていないＥＧＦＲ１−６２１の構造の立体モデルを示すものである。受容体骨格を青色で、およびリガンドＴＧＦ−αを赤色で描く。ｍＡｂ８０６／１７５エピトープを青緑色で、およびジスルフィド結合を黄色で描写する。エピトープを受容体に結び付けるジスルフィド結合の原子を空間充填形式で示す。テザリングされた高次構造からのＥＧＦＲ−ＥＣＤ ＣＲ２ドメインをテザリングされていないＥＧＦＲ単量体の構造にこのリガンドの存在下でドッキングさせることによって、このモデルを構築した。 図７３は、ＥＧＦＲの断片とｍＡｂ８０６の反応性を示すものである。可溶性１−５０１ ＥＧＦＲ断片またはＣＨ／ＥＧＦＲ断片融合タンパク質（ＧＨ−２７４−５０１、ＧＨ−２８２−５０１、ＧＨ−２９０−５０１およびＧＨ−２９８−５０１）を発現するベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞からの溶解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分割し、膜に転写し、ｍＡｂ８０６（左パネル）または抗ｍｙｃ抗体９Ｂ１１（右パネル）で免疫ブロットした。 図７４Ａおよび７４Ｂは、ｍＡｂ１７５ ＶＨ鎖核酸配列（配列番号：１２８）およびアミノ酸配列（単数または複数）（配列番号：１２９）をそれぞれ示すものである。 図７５Ａおよび７５Ｂは、ｍＡｂ１７５ ＶＬ鎖核酸配列（配列番号：１３３）およびアミノ酸配列（単数または複数）（配列番号：１３４）をそれぞれ示すものである。 図７６Ａおよび７６Ｂは、小規模（１００ｍＬ）振盪フラスコ培養でのＧＳ−ＣＨＯ（１４Ｄ８、１５Ｂ２および４０Ａ１０）およびＧＳ−ＮＳ０（３６）ｈｕ８０６トランスフェクタントの（Ａ）体積産物濃度および（Ｂ）生細胞濃度［８０６抗イディオタイプをコーティング抗体としておよびｃｈ８０６ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌｏｔ：Ｊ０６０２４を標準物質として使用してＥＬＩＳＡにより産物の濃度を推定した。］；（Ｃ）１５Ｌ攪拌タンク型バイオリアクターにおけるＧＳ−ＣＨＯ ４０Ａ１０トランスフェクタント細胞成長および体積生産量［生細胞密度（◆ｘ１０５細胞／ｍＬ）、細胞生存度（■）および生産量（▲ｍｇ／Ｌ）］を示すものである。 ７６Ｃは、小規模（１００ｍＬ）振盪フラスコ培養でのＧＳ−ＣＨＯ（１４Ｄ８、１５Ｂ２および４０Ａ１０）およびＧＳ−ＮＳ０（３６）ｈｕ８０６トランスフェクタントの（Ａ）体積産物濃度および（Ｂ）生細胞濃度［８０６抗イディオタイプをコーティング抗体としておよびｃｈ８０６ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌｏｔ：Ｊ０６０２４を標準物質として使用してＥＬＩＳＡにより産物の濃度を推定した。］；（Ｃ）１５Ｌ攪拌タンク型バイオリアクターにおけるＧＳ−ＣＨＯ ４０Ａ１０トランスフェクタント細胞成長および体積生産量［生細胞密度（◆ｘ１０５細胞／ｍＬ）、細胞生存度（■）および生産量（▲ｍｇ／Ｌ）］を示すものである。 図７７Ａ、７７Ｂおよび７７Ｃは、小規模培養により生産したプロテインＡ精製ｈｕ８０６抗体構築物ならびに対照ｃｈ８０６およびｍＡｂ８０６のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｂｉｏｓｅｐ ＳＥＣ−Ｓ３０００）分析を示すものである。各図の上方パネルにＡ２１４ｎｍでのクロマトグラムをおよび下方パネルにＡ２８０ｎｍでのクロマトグラムを提示する。 ７７Ｄおよび７７Ｅは、小規模培養により生産したプロテインＡ精製ｈｕ８０６抗体構築物ならびに対照ｃｈ８０６およびｍＡｂ８０６のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｂｉｏｓｅｐ ＳＥＣ−Ｓ３０００）分析を示すものである。各図の上方パネルにＡ２１４ｎｍでのクロマトグラムをおよび下方パネルにＡ２８０ｎｍでのクロマトグラムを提示する。 図７８は、大規模生産およびプロテインＡ精製後のプロテインＡ精製ｈｕ８０６抗体構築物４０Ａ１０のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｂｉｏｓｅｐ ＳＥＣ−Ｓ３０００）分析を示すものである。１．２％の凝集物が存在する９８．８％の純度を示す、２１４ｎｍでのクロマトグラムを提示する。 図７９は、Ｎｏｖｅｘ，ＵＳＡからのプレキャスト４−２０％Ｔｒｉｓ／グリシンゲルを標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で使用して、精製トランスフェクタントｈｕ８０６標品（５μｇ）ＧＳ ＣＨＯ（１４Ｄ８、１５Ｂ２および４０Ａ１０）およびＧＳ−ＮＳ０（３６）ｈｕ８０６を還元条件下で分析したことを示すものである。クマシーブルー染色剤によって検出したタンパク質。 図８０は、プレキャスト４−２０％Ｔｒｉｓ／グリシンゲルを標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で使用して、精製トランスフェクタントｈｕ８０６標品（５μｇ）ＧＳ ＣＨＯ（１４Ｄ８、１５Ｂ２および４０Ａ１０）およびＧＳ−ＮＳ０（３６）を非還元条件下で分析したことを示すものである。クマシーブルー染色剤によって検出したタンパク質。 図８１は、プレキャスト４−２０％Ｔｒｉｓ／グリシンゲルを標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で使用して、精製トランスフェクタントｈｕ８０６ ＧＳ ＣＨＯ ４０Ａ１０（５μｇ）を大規模生産後に分析したことを示すものである。クマシーブルー染色剤によって検出したタンパク質。 図８２は、１５Ｌ生産後の精製トランスフェクタントｈｕ８０６ ＧＳ ＣＨＯ ４０Ａ１０（５μｇ）の等電点電気泳動ゲル分析を示すものである。クマシーブルー染色によって検出したタンパク質。レーン１、ｐＩマーカー；レーン２、ｈｕ８０６（３つのアイソフォーム、ｐＩ８．６６から８．８２）；レーン３、ｐＩマーカー。 図８３は、Ａ４３１細胞への結合を示すものである：プロテインＡ精製ｈｕ８０６抗体標品（２０μｇ／ｍＬ）およびアイソタイプ対照ｈｕＡ３３（２０μｇ／ｍＬ）のフローサイトメトリー分析。対照は、二次抗体単独（緑色）およびｃｈ８０６（赤色）を含む。Ｈｕ８０６構築物を小規模培養によって生産した。 図８４は、Ａ４３１細胞への結合を示すものである：示すとおりの、細胞表面の野生型ＥＧＦＲの〜１０％を結合する精製ｍＡｂ８０６、ｃｈ８０６およびｈｕ８０６ ４０Ａ１０抗体標品（２０μｇ／ｍＬ）、５２８（野生型ＥＧＦＲとｄｅ２−７ ＥＧＦＲの両方を結合する。）および無関係な対照抗体（２０μｇ／ｍＬ）のフローサイトメトリー分析。 図８５は、Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７神経膠腫細胞への結合を示すものである。精製ｍＡｂ８０６、ｃｈ８０６およびｈｕ８０６ ４０Ａ１０抗体標品（２０μｇ／ｍＬ）ならびに５２８抗ＥＧＦＲおよび無関係な対照抗体（２０μｇ／ｍＬ）のフローサイトメトリー分析。 図８６は、（Ａ）Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７神経膠腫細胞および（Ｂ）Ａ４３１癌腫細胞への１２５Ｉ放射標識８０６抗体構築物の特異的結合を示すものである。 図８７は、スキャッチャード解析を示すものである：Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７細胞への１２５Ｉ放射標識（Ａ）ｃｈ８０６および（Ｂ）ｈｕ８０６抗体構築物の結合。 図８８は、スキャッチャード解析を示すものである：Ａ４３１細胞への１２５Ｉ放射標識（Ａ）ｃｈ８０６および（Ｂ）ｈｕ８０６抗体構築物の結合。 図８９Ａおよび図８９Ｂは、２８７−３０２ ＥＧＦＲ ８０６ペプチドエピトープへの該固定化ペプチド上を通過する５０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭおよび３００ｎＭの漸増濃度の（Ａ）ｈｕ８０６および（Ｂ）ｃｈ８０６による結合についてのＢＩＡｃｏｒｅ分析を示すものである。 図９０Ａおよび図９０Ｂは、（Ａ）エフェクター対ターゲット細胞比範囲（Ｅ：Ｔ＝０．７８：１から１００：１）にわたって１μｇ／ｍＬの各抗体で；（Ｂ）ターゲットＡ４３１に対して各抗体の濃度範囲（３．１５ｎｇ／ｍＬ−１０μｇ／ｍＬ）にわたってＥ：Ｔ＝５０：１で判定した、ターゲットＡ４３１細胞に対するｃｈ８０６媒介およびｈｕ８０６媒介抗体依存性細胞傷害性を示すものである。 図９１は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける確率したＡ４３１異種移植片の治療を示すものである。５匹のマウスの群に６×１ｍｇの用量での２週間にわたる抗体療法を示すとおり（矢印）に施した。研究終了までの平均±ＳＥＭ腫瘍容積を提示する。 図９２は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける確率したＵ８７Ｍｇ．ｄｅ２−７異種移植片の治療を示すものである。５匹のマウスの群に６×１ｍｇの用量での２週間にわたる抗体療法を示すとおり（矢印）に施した。研究終了までの平均±ＳＥＭ腫瘍容積を提示する。 図９３は、ｍＡｂ８０６ペプチド（Ａ）Ｎ、（Ｂ）ＨＮおよび（Ｃ）ＨＡについてのランダムコイル化学シフト値からの偏差を示すものである。ｐＨ６．８の５％ ２Ｈ２Ｏ、７０ｍＭ ＮａＣｌおよび５０ｍＭ ＮａＰＯ４を含有するＨ２Ｏ溶液中でペプチドを調製した。逐次的割当てに用いたすべてのスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ５００おいて２９８Ｋで獲得した。 図９４Ａ、９４Ｂ、９４Ｃ、９４Ｄ、９４Ｅおよび９４Ｆは、１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の注入後第５日におけるＡ）腹側、およびＢ）背側の患者７の前進ガンマカメラ像を示すものである。肺（矢印）における転移病変での１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の高い取り込み量がはっきりわかる。Ｃ）およびＤ）は、ＣＴスキャンで転移病変を示すものである。Ｅ）胸部の３Ｄ ＳＰＥＣＴ画像、およびＦ）転移病変（矢印）での１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の特異的取り込みを示すＳＰＥＣＴとＣＴの位置合わせした（ｃｏ−ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ）断層画像。 図９５Ａ、９５Ｂ、９５Ｃ、９５Ｄ、９５Ｅおよび９５Ｆは、１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の注入後、Ａ）第０日、Ｂ）第３日およびＣ）第７日に得た患者８の頭頸部の平面画像を示すものである。最初の血液プール活性が第０日に見られ、右前頭葉における退形成性星状細胞腫での１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の取り込みが第３日（矢印）にははっきりわかり、第７日まで増加する。１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の特異的取り込みは、Ｄ）脳（矢印）のＳＰＥＣＴ画像において確認され、Ｅ）１８Ｆ−ＦＤＧ ＰＥＴ、およびＦ）ＭＲＩでは腫瘍部位（矢印）ではっきりわかる。 図９６Ａ、９６Ｂ、９６Ｃおよび９６Ｄは、患者４と比較して患者３において、選別腫瘍サンプルにおける８０６抗原発現の差にもかかわらず、腫瘍での１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の同様の取り込みがはっきりわかることを示すものである。Ａ）はっきりわかる心血液プール活性（Ｂ）を伴う、患者４に関するＳＰＥＣＴ断層画像における肺転移（矢印）の１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６局在。Ｂ）対応するＣＴスキャン。保存腫瘍は、８０６発現について陽性率＜１０％を有することが明らかになった。Ｃ）はっきりわかる心血液プール活性（Ｂ）を伴う、患者３に関する肺転移（矢印）の１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６局在。Ｄ）対応するＣＴスキャン。保存腫瘍は、８０６発現について５０−７５％の陽性率を有することが明らかになった。 図９７は、ＥＬＩＳＡによって測定したｃｈ８０６タンパク質についてのプールされた集団の薬物動態を示すものである。注入後の時間（時）に対する実測および予測ｃｈ８０６（％ＩＤ／Ｌ）。 図９８Ａおよび９８Ｂは、５ｍｇ／ｍ２（■）、１０ｍｇ／ｍ２（△）、２０ｍｇ／ｍ２（▽）、および４０ｍｇ／ｍ２（◆）用量レベルでの１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６のＡ）正規化された全身クリアランスおよびＢ）肝クリアランスについての個々の患者の結果を示すものである。各パネルに示したデータセットについての線形回帰［Ａ）ｒ２＝０．９５９５；Ｂ）ｒ２＝０．９４１５］。
詳細な記述
本発明に従って、当該技術分野における技能の範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を利用することができる。このような技術は、文献において十分説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−Ｅ［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）］；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，ｅｄ．（１９９４））］；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）］；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）］；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）］；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）を参照のこと。
本明細書において用いる場合、以下の用語は、限定ではないが、与える定義を有すると考える。
用語「特異的結合メンバー」は、互いに結合特異性を有する分子ペアのメンバーを記述するものである。特異的結合ペアのメンバーは、天然に由来する場合があり、または完全にもしくは部分的に合成生産されることがある。前記分子ペアの一方のメンバーは、この分子ペアの他方のメンバーの特定の空間および極性機構に特異的に結合する、従って相補的である、この表面上のエリア、またはキャビティーを有する。従って、前記ペアのメンバーは、互いに特異的に結合する特性を有する。特異的結合ペアのタイプの例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質である。本出願は、抗原−抗体タイプの反応に関する。
この様々な文法形式での用語「異常な発現」は、非過発現状態とは対照的に、いずれの１回においてもより多くのタンパク質が存在するまたは検出され得るような、発現もしくは翻訳増進、タンパク質の促進因子もしくは調節因子の修飾、タンパク質についての遺伝子の増幅、または半減期もしくは安定性向上をはじめとする任意の手段によって引き起こされる、組織におけるタンパク質の任意の発現上昇もしくは改変または過発現、例えばタンパク質の量の増加を意味するおよび含むものであり得る。異常な発現は、配列改変、欠失もしくは挿入に起因する突然変異タンパク質もしくは変異体の場合のような改変されたタンパク質、改変されたフォールディングが発現されるシナリオまたは改変を含めて、細胞におけるタンパク質発現または翻訳後修飾機構が、タンパク質の発現増進またはレベルもしくは量増加に起因して酷使されるかでなければ破壊される任意のシナリオまたは改変を含み、考えている。
用語「異常な発現」が、異常（通常、増加された）量／レベルのタンパク質が存在する状態を、この異常量またはレベルの動因に関係なく、包含するために本明細書において特に選択されたことを理解することは重要である。例えば、異常量のタンパク質は、遺伝子増幅不在でのタンパク質の過発現の結果として生ずることがあり、これは、例えば、癌を有する被験者の頭頸部から採取した多くの細胞／組織サンプルにおける場合であるが、他のサンプルは、遺伝子増幅に帰する異常タンパク質レベルを呈示する。
この後者に関連して、本発明を例証するために本明細書に提示する本発明者らの研究の幾つかは、サンプルの分析を含み、該サンプルのうちの幾つかは、ＥＦＧＲの増幅に起因して異常タンパク質レベルを呈示する。従って、このことが、増幅について言及する実験所見の本明細書での発表の、ならびにＥＦＧＲの異常レベルを記述する場合の用語「増幅／増幅された」およびこれらに類するものの使用の説明となる。しかし、これは、本発明の結合メンバーに頼ることによるような臨床的介入が考えられる環境または状況を規定する前記タンパク質の異常量またはレベルの観察であり、このため、本明細書では、用語「異常な発現」が、ＥＦＧＲレベルの対応する異常性を生じさせる原因となる環境をより広く捕えるものであると考える。
従って、これらの様々な文法形式での用語「過発現」および「増幅」は、異なる技術的意味を有すると解されるが、これらは、本発明に関連して異常ＥＦＧＲタンパク質レベルが存在する状態を表す限り、互いに等価であるとみなされる。従って、用語「異常な発現」は、ここでの目的のためにこの範囲内に用語「過発現」および「増幅」を包含すると考えられるように選択されたものであり、そのため、本明細書において用いる場合、すべての用語を互いに等価とみなすことができる。
用語「抗体」は、天然のものであろうと、または部分的にもしくは完全に合成生産されたものであろうと、免疫グロブリンを記述する。この用語は、抗体結合ドメインであるまたは抗体結合ドメインに相同性である結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質も包含する。ＣＤＲグラフト化抗体もこの用語により考えられる。
抗体を多数の方法で修飾できるが、用語「抗体」は、必要な特異性を有する結合ドメインを有する任意の結合メンバーまたは基質を包含すると解釈すべきである。従って、この用語は、天然のものであろうと、完全にまたは部分的に合成のものであろうと、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体断片、抗体の誘導体、機能的等価物およびホモログを包含する。従って、別のポリペプチドに融合した、免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子、または等価物を含む。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３ならびに米国特許番号４，８１６，３９７および米国特許番号４，８１６，５６７に記載されている。
全抗体の断片が、結合抗原の機能を果たす場合があることは証明されている。結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成るＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４−５４６）；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価断片；（ｖｉｉ）抗原結合部位を形成するように２つのドメインを会合させることができるペプチドリンカーによってＶＨドメインとＶＬドメインが連結されている、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４２，４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ．８５，５８７９−５８８３）；（ｖｉｉｉ）多価抗体断片（ｓｃＦｖ二量体、三量体および／または四量体（Ｐｏｗｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４２，１９３−２０４））；（ｉｘ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）および（ｘ）「ダイアボディー」、遺伝子融合によって構築された多価または多重特異性断片（ＷＯ９４／１３８０４；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，６４４４−６４４８）である。
「抗体結合部位（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）」は、抗原に特異的に結合する軽鎖または重および軽鎖可変領域および超可変領域で構成された抗体分子の構造部分である。
本明細書において用いる場合のこの様々な文法形式での「抗体分子」というフレーズは、インタクトな免疫グロブリン分子と免疫グロブリン分子の免疫活性部分の両方を考えている。
例示的抗体分子は、インタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、およびパラトープを含有する免疫グロブリン分子の部分であり、前記部分としては、当該技術分野においてＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）ＺおよびＦ（ｖ）として公知の部分が挙げられ、これらの部分は、本明細書に記載する治療方法での使用に好ましい。
抗体は、二重特異性であることもあり、この場合、この抗体の１つの結合ドメインは、本発明の特異的結合メンバーであり、および他の結合ドメインは、例えばエフェクター機能またはこれらに類するものを補充するために、異なる特異性を有する。本発明の二重特異性抗体は、この抗体の１つの結合ドメインが、本発明の特異的結合メンバー［この断片を含む］であり、および他の結合ドメインが、異なる抗体またはこの断片［異なる抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、抗体５２８（米国特許番号４，９４３，５３３）、キメラおよびヒト化２２５抗体（米国特許番号４，９４３，５３３およびＷＯ／９６４０２１０）、抗ｄｅ２−７抗体、例えばＤＨ８．３（Ｈｉｌｌｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．６３（４），５３７−５４３）、抗体Ｌ８Ａ４およびＹ１０（Ｒｅｉｓｔ，ＣＪ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（１９）：４３７５−４３８２；Ｆｏｕｌｏｎ ＣＦ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０（１６）：４４５３４４６０）、ＩＣＲ６２（Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊａｎ−Ｊｕｎ；２２（１−３）：１２９−４６；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐ．Ａ．Ａ．Ｃ．Ｒ．５５（１４）：３１４０−３１４８、またはＷｉｋｓｔｒａｎｄらの抗体（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ Ｃ．ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（１４）：３１４０−３１４８）のものを含む］、二重特異性抗体を含む。他の結合ドメインは、神経または神経膠細胞特異的抗体の場合のような、特定の細胞タイプを認識するまたはターゲットにする抗体である場合がある。本発明の二重特異的抗体の場合、本発明の抗体の１つの結合ドメインを、例えば、免疫調節成分（例えば、インターロイキン（単数または複数））、成長調節成分またはサイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、および特に、この全体が本明細書に組み込まれる、２００２年２月１３日に出願された米国特許出願番号６０／３５５，８３８において論証されているＴＮＦ二重特異性の種類）または毒素（例えばリシン）または抗有糸分裂もしくはアポトーシス剤もしくは因子のような、特定の細胞受容体を認識するおよび／または特定の様式で細胞を調節させる、他の結合ドメインまたは分子と、結合させることができる。
抗体分子のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２部分は、周知である方法による実質的にインタクトな抗体分子に対する、それぞれ、パパインおよびペプシンのタンパク質分解反応によって調製することができる。例えば、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓらの米国特許番号４，３４２，５６６を参照のこと。Ｆａｂ’抗体分子部分も周知であり、これらをＦ（ａｂ’）２部分から生産し、その後、メルカプトエタノールなどで２つの重鎖部分を連結しているジスルフィド結合を還元する、およびその後、得られたタンパク質メルカプタンをヨードアセトアミドなどの試薬でアルキル化する。インタクトな抗体分子を含有する抗体が、本明細書では好ましい。
この様々な文法形式での「モノクローナル抗体」というフレーズは、特定の抗原と免疫反応することができる抗体結合部位の種類を１種類しか有さない抗体を指す。従って、モノクローナル抗体は、これが免疫反応するいずれの抗原に対しても単一の結合親和性しか概して提示しない。モノクローナル抗体は、それぞれが異なる抗原に対して免疫特異的な複数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば、二重特異性（キメラ）モノクローナル抗体も含むことがある。
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部またはすべてに特異的に結合するおよび抗原の一部またはすべてに相補的であるエリアを含む抗体の一部を記述するものである。抗原が大きい場合、抗体は、抗原の特定の部分にしか結合できず、この部分をエピトープと呼ぶ。抗原結合ドメインは、１つ以上の抗体可変ドメインによって与えられることがある。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
「翻訳後修飾」は、翻訳が完了した後、およびリボソームからまたは未完成ポリペプチド上に同時翻訳的に放出された後にタンパク質が経験する、共有結合修飾をはじめとする、修飾（単数または複数）の任意の１つまたは組み合わせを包含し得る。翻訳後修飾としては、リン酸化、ミリスチル化、ユビキチン化、グリコシル化、補酵素付着、メチル化およびアセチル化が挙げられるが、これらに限定されない。翻訳後修飾は、タンパク質の活性、この細胞内もしくは細胞外目的地、この安定性もしくは半減期、および／またはリガンド、受容体もしくは他のタンパク質によるこの認識を調節するまたはこれらに影響を及ぼす場合がある。翻訳後修飾は、細胞小器官において発生する場合があり、核もしくは細胞質において発生する場合があり、または細胞外で発生する場合がある。
用語「特異的」は、特異的結合ペアの一方のメンバーが、この特異的結合パートナー（単数または複数）以外の分子への有意な結合を一切示さないであろう状況を指すために用いることができる。この用語は、例えば、抗原結合ドメインが、多数の抗原により保持されている特定のエピトープに特異的である場合にも適用され、この場合、前記抗原結合ドメインを保持する特異的結合メンバーは、このエピトープを保持する様々な抗原に結合することができるであろう。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、一般に含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）の意味で用いており、即ち、１つ以上の特徴または成分の存在を許容する。
用語「から本質的に成る」は、大きな産物に共有結合で付いていない被定義残基数の産物、特にペプチド配列を指す。しかし、上で言及した本発明のペプチドの場合、該ペプチドのＮまたはＣ末端への小さな修飾、例えば、保護基またはこれらに類するものを付加させるための末端の化学修飾、例えばＣ末端のアミド化が考えられることは、当業者には理解されるであろう。
用語「単離された」は、本発明に従って、本発明の特異的結合メンバー、またはこのような結合メンバーをコードする核酸がなるであろう状態を指す。メンバーおよび核酸には、これらが、これらの自然な環境において、またはこれらを調製する環境（例えば、細胞培養）において（このような調製がインビトロもしくはインビボで実施される組換えＤＮＡ技術によるとき）見つけられる、他のポリペプチドまたは核酸などの、これらが自然に随伴する材料がない、または実質的にないであろう。メンバーおよび核酸は、希釈剤またはアジュバントと調合されることがあり、それでもなお実際には、単離されていることがある−例えば、通常、前記メンバーは、イムノアッセイにおいて用いるためのマイクロタイタープレートをコーティングするために使用される場合にはゼラチンもしくは他の担体と混合されるであろう、または診断もしくは療法において使用されるときには医薬的に許容される担体もしくは希釈剤と混合されるであろう。特異的結合メンバーは、自然にもしくは異種真核細胞の系によりグリコシル化されることがあり、または（例えば、真核細胞における発現によって生産される場合）グリコシル化されないことがある。
また、本明細書において用いる場合、用語「グリコシル化」および「グリコシル化された」は、オリゴ糖の付加による、糖タンパク質と呼ばれるタンパク質の翻訳後修飾を含むおよび包含する。特に、Ｎ結合型オリゴ糖およびＯ結合型オリゴ糖をはじめとする、オリゴ糖は、糖タンパク質におけるグリコシル化部位で付加される。Ｎ結合型オリゴ糖は、特にＡｓｎ残基が配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ（Ｘは、ＰｒｏまたはＡｓｐであり得ない。）で存在する場合、Ａｓｎ残基に付加され、および糖タンパク質において見つけられる最も一般的なものである。Ｎ結合型糖タンパク質の生合成において、高マンノース型オリゴ糖（一般に、ドリコール、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノースおよびグルコースから成るが小胞体（ＥＲ）において最初に形成される。その後、この高マンノース型糖タンパク質は、ＥＲからゴルジに輸送され、そこでさらにこのオリゴ糖のプロセッシングおよび修飾が発生する。Ｏ結合型オリゴ糖は、ＳｅｒまたはＴｈｒ残基のヒドロキシル基に付加される。Ｏ結合型オリゴ糖の場合、Ｎ−アセチルグルコサミンが、ＥＲにおいてアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼによりＳｅｒまたはＴｈｒ残基に最初に移送される。その後、このタンパク質は、ゴルジに移動し、そこでさらなる修飾および連鎖伸長が発生する。Ｏ結合型修飾は、ＳｅｒまたはＴｈｒ部位でのＯＧｌｃＮＡｃ単糖類単独の単純付加で発生する場合があり、この修飾は、別の条件下では、グリコシル化でなくリン酸化である場合もある。
本明細書において用いる場合、「ｐｇ」は、ピコグラムを意味し、「ｎｇ」は、ナノグラムを意味し、「ｕｇ」または「μｇ」は、マイクログラムを意味し、「ｍｇ」は、ミリグラムを意味し、「ｕＬ」または「μＬ」は、マイクロリットルを意味し、「ｍＬ」は、ミリリットルを意味し、「Ｌ」は、リットルを意味する。
用語「８０６抗体」、「ｍＡｂ８０６」、「ｃｈ８０６」、および具体的に列挙していない任意の変異体は、本明細書では交換可能に用いることがあり、ならびに本出願および請求項を通して用いる場合、単数または多数のタンパク質を含むタンパク質性材料を指し、ならびに本明細書に記載するならびに配列番号：２および配列番号：４に提示するアミノ酸配列データ、ならびに配列番号：７および８に組み込まれているならびに配列番号：７および８の一部を構成するキメラ抗体ｃｈ８０６、ならびに本明細書および請求項に示す活性のプロフィールを有するタンパク質にわたる。従って、実質的に等価のまたは改変された活性を提示するタンパク質は、同様に考えられる。これらの修飾は、例えば部位特異的突然変異誘発により得られる修飾のような計画的なものであることがあり、またはこの複合体の生産体である宿主における突然変異によって得られるものもしくはこの指名サブユニットのような偶発的なものであることがある。また、用語「８０６抗体」、「ｍＡｂ８０６」および「ｃｈ８０６」は、本明細書に具体的に列挙するタンパク質ならびに実質的に相同な類似体および対立遺伝子変種を、これらの範囲内に含むことを、意図したものである。
用語「ヒト化８０６抗体」、［ｈｕ８０６」、および「ベニアリングされた８０６抗体」、ならびに具体的に列挙しない任意の変異体は、本明細書で交換可能に用いることがあり、ならびに本出願および請求項を通して用いる場合、単数または多数のタンパク質を含むタンパク質性材料を指し、ならびに本明細書に記載するならびに配列番号：４２および配列番号：４７に提示するアミノ酸配列データ、ならびに本明細書および請求項に示す活性のプロフィールを有するタンパク質にわたる。従って、実質的に等価のまたは改変された活性を提示するタンパク質は、同様に考えられる。これらの修飾は、例えば部位特異的突然変異誘発により得られる修飾のような計画的なものであることがあり、またはこの複合体の生産体である宿主における突然変異によって得られるものもしくはこの指名サブユニットのような偶発的なものであることがある。また、用語「ヒト化８０６抗体」、［ｈｕ８０６」、および「ベニアリングされた８０６抗体」は、本明細書に具体的に列挙するタンパク質ならびに実質的に相同性の類似体および対立遺伝子変種を、これらの範囲内に含むことを、意図したものである。
用語「１７５抗体」および「ｍＡｂ１７５」、ならびに具体的に列挙しない任意の変異体は、本明細書で交換可能に用いることがあり、ならびに本出願および請求項を通して用いる場合、単数または多数のタンパク質を含むタンパク質性材料を指し、ならびに本明細書に記載するならびに配列番号：１２９および配列番号：１３４に提示するアミノ酸配列データ、ならびに本明細書および請求項に示す活性のプロフィールを有するタンパク質にわたる。従って、実質的に等価のまたは改変された活性を提示するタンパク質は、同様に考えられる。これらの修飾は、例えば部位特異的突然変異誘発により得られる修飾のような計画的なものであることがあり、またはこの複合体の生産体である宿主における突然変異によって得られるものもしくはこの指名サブユニットのような偶発的なものであることがある。また、用語「１７５抗体」および「ｍＡｂ１７５」は、本明細書に具体的に列挙するタンパク質ならびに実質的に相同性の類似体および対立遺伝子変種を、これらの範囲内に含むことを、意図したものである。
用語「１２４抗体」および「ｍＡｂ１２４」、ならびに具体的に列挙しない任意の変異体は、本明細書で交換可能に用いることがあり、ならびに本出願および請求項を通して用いる場合、単数または多数のタンパク質を含むタンパク質性材料を指し、ならびに本明細書に記載するならびに配列番号：２２および配列番号：２７に提示するアミノ酸配列データ、ならびに本明細書および請求項に示す活性のプロフィールを有するタンパク質にわたる。従って、実質的に等価のまたは改変された活性を提示するタンパク質は、同様に考えられる。これらの修飾は、例えば部位特異的突然変異誘発により得られる修飾のような計画的なものであることがあり、またはこの複合体の生産体である宿主における突然変異によって得られるものもしくはこの指名サブユニットのような偶発的なものであることがある。また、用語「１２４抗体」および「ｍＡｂ１２４」は、本明細書に具体的に列挙するタンパク質ならびに実質的に相同性の類似体および対立遺伝子変種を、これらの範囲内に含むことを、意図したものである。
用語「１１３３抗体」および「ｍＡｂ１１３３」、ならびに具体的に列挙しない任意の変異体は、本明細書で交換可能に用いることがあり、ならびに本出願および請求項を通して用いる場合、単数または多数のタンパク質を含むタンパク質性材料を指し、ならびに本明細書に記載するならびに配列番号：３２および配列番号：３７に提示するアミノ酸配列データ、ならびに本明細書および請求項に示す活性のプロフィールを有するタンパク質にわたる。従って、実質的に等価のまたは改変された活性を提示するタンパク質は、同様に考えられる。これらの修飾は、例えば部位特異的突然変異誘発により得られる修飾のような計画的なものであることがあり、またはこの複合体の生産体である宿主における突然変異によって得られるものもしくはこの指名サブユニットのような偶発的なものであることがある。また、用語「１１１３３抗体」および「ｍＡｂ１１３３」は、本明細書に具体的に列挙するタンパク質ならびに実質的に相同性の類似体および対立遺伝子変種を、これらの範囲内に含むことを、意図したものである。
本明細書に記載するアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体型であることが好ましい。しかし、免疫グロブリン結合の望ましい機能特性がこのポリペプチドにより保持される限り、「Ｄ」異性体型の残基で任意のＬ−アミノ酸残基を置換することができる。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。標準的なポリペプチド命名法、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９（１９６９）に準拠して、アミノ酸残基についての略語を以下の対応表に示す：
Figure 0006317780
 すべてのアミノ酸残基配列が、本明細書では、この左右の向きがアミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向である式によって表われていることに留意すべきである。さらに、アミノ酸残基配列の始点または終点のダッシュが、１つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列に結合したペプチドを示すことに、留意すべきである。本明細書において代わる代わる現れることがある３文字および１文字表記を相関させるために上の表を提示する。
「レプリコン」は、インビボでＤＮＡ複製の独立単位として機能する、即ち、この独自制御下で複製できる、任意の遺伝要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
「ベクター」は、別のＤＮＡセグメントを取り付けて、この取り付けられたセグメントの複製を引き起こすことができるレプリコン、例えばプラスミド、ファージまたはコスミド、である。
「ＤＮＡ分子」は、この一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのいずれかでの、重合形態のデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミジン、またはシトシン）を指す。この用語は、該分子の一次および二次構造のみを指し、これをいずれの特定の三次形態にも限定しない。従って、この用語は、なかんずく、線状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミドおよび染色体において見つけられる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を論じる際、非転写ＤＮＡ鎖（即ち、ｍＲＮＡに相同性の配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向でもっぱら配列を与える通常の慣習に従って本明細書に配列を記載することがある。
「複製起点」は、ＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を指す。
ＤＮＡ「コーディング配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、インビボでポリペプチドに転写および翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コーディング配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳停止コドンによって決められる。コーディング配列としては、原核配列、真核ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核（例えば、哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、およびさらに合成ＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コーディング配列に対して３’に位置するであろう。
転写および翻訳制御配列は、宿主細胞におけるコーディング配列の発現に備えるＤＮＡ調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、およびこれらに類するもの、である。
「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼに結合することができるおよび下流（３’方向）コーディング配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的で、プロモーター配列は、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始させるために必要な最低数の塩基または要素を含むように、転写開始部位によってこの３’末端で結合され、上流（５’方向）にわたる。プロモーター配列内には、転写開始部位（従来、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングによって定義される。）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に責任を負うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）があるであろう。真核プロモーターは、常にではないが、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。原核プロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加えて、Ｓｈｉｎｃ Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含有する。
「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。コーディング配列は、ＲＮＡポリメラーゼが該コーディング配列をｍＲＮＡに転写し、その後、これが、該コーディング配列によってコードされたタンパク質に翻訳されるとき、細胞内の転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。
「シグナル配列をコーディング配列の前に含めることができる。この配列は、ポリペプチドを細胞表面に向けるようにまたはポリペプチドを培地に分泌するように宿主細胞に通信するシグナルペプチド、ポリペプチドに対してＮ末端をコードし、このシグナルペプチドは、該宿主細胞により、このタンパク質がこの細胞を離れる前に、クリッピングされる。原核生物および真核生物由来の様々なタンパク質に関連してシグナル配列を見つけることができる。
本発明のプローブに言及する際に本明細書において用いる場合の用語「オリゴヌクレオチド」は、２つ以上、好ましくは３つ以上、のリボヌクレオチド、で構成された分子と定義する。この正確なサイズは、多くの要因に依存し、該要因もまた、このオリゴヌクレオチドの最終的な機能および用途に依存するであろう。
本明細書において用いる場合の用語「プライマー」は、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成を誘導する条件下に、即ち、ヌクレオチドおよび誘導剤、例えばＤＮＡポリメラーゼ、の存在下、ならびに適する温度およびｐＨに置かれたとき、合成の開始点として作用することができる、精製制限消化において自然に発生するものであろうと、合成生産されたものであろうと、オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、一本鎖であることがあり、または二本鎖であることがあり、および誘導剤の存在下で所望の伸長産物の合成を始動するために十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源、およびこの方法の使用をはじめとする多くの要因に依存するであろう。例えば、診断用途については、ターゲット配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、概して１５−２５以上のヌクレオチドを含有するが、より少ないヌクレオチドを含有することもある。
本明細書におけるプライマーは、特定のターゲットＤＮＡ配列の異なる鎖に「実質的に」相補的であるように選択される。これは、プライマーが、これらそれぞれの鎖とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列がテンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片をプライマーの５’端に付けることができ、このプライマー配列の残部は、前記鎖に相補的である。または、非相補的塩基またはより長い配列をプライマーに散在させることができるが、但し、このプライマー配列が、前記鎖の配列とハイブリダイズし、これによって伸長産物の合成のためのテンプレートを形成するために十分な、前記鎖の配列との相補性を有することを条件とする。
本明細書において用いる場合、用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、細菌酵素であって、これらのそれぞれが二本鎖ＤＮＡを特定のヌクレオチド配列でまたは付近で切断するものを指す。
細胞は、外因性または異種ＤＮＡにより、このようなＤＮＡが該細胞内に導入されているとき、「形質転換」されている。前記形質転換ＤＮＡは、前記細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれている（共有結合で連結されている。）ことがあり、または組み込まれていないことがある。例えば、原核細胞、酵母および哺乳動物細胞では、形質転換ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソーム要素上に維持されることがある。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれて、染色体複製によって娘細胞により受け継がれるものである。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の集団から成る細胞系またはクローンを確率する真核細胞の能力によって実証される。「クローン」は、有糸分裂により単個細胞または共通祖先から誘導された細胞の集団である。「細胞系」は、何世代にもわたってインビトロで安定な成長ができる初代細胞のクローンである。
２つのＤＮＡ配列は、ヌクレオチドの少なくとも約７５％（好ましくは少なくとも約８０％、および最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）が、これらの核酸配列の被定義長にわたってマッチしているとき、「実質的に相同性」である。実質的に相同性である配列は、配列データバンクにおいて入手できる標準的なソフトウェアを使用して配列を比較することにより、または例えばこの特定のシステムについて定義されたとおりのストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で、同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当該技術分野の技能の範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，上記文献；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．Ｉ ＆ ＩＩ，上記文献；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，上記文献を参照のこと。
本開示配列を有する抗体をコードするが、このような配列に縮重した、本発明の特異的結合メンバー（抗体）をコードするＤＮＡ配列も本発明の範囲内であることは、理解されるはずである。「に縮重した」とは、異なる３文字コドンを用いて、特定のアミノ酸を明記することを意味する。それぞれの特定のアミノ酸をコードするために以下のコドンを交換可能に用いることができることは、当該技術分野において周知である。
フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ） ＵＵＵまたはＵＵＣ
ロイシン（ＬｅｕまたはＬ） ＵＵＡまたはＵＵＧまたはＣＵＵまたはＣＵＣまたはＣＵＡまたはＣＵＧ
イソロイシン（ＨｅまたはＩ） ＡＵＵまたはＡＵＣまたはＡＵＡ
メチオニン（ＭｅｔまたはＭ） ＡＵＧ
バリン（ＶａｌまたはＶ） ＧＵＵまたはＧＵＡのＧＵＣまたはＧＵＧ
セリン（ＳｅｒまたはＳ） ＵＣＵまたはＵＣＣまたはＵＣＡまたはＵＣＧまたはＡＧＵまたはＡＧＣ
プロリン（ＰｒｏまたはＰ） ＣＣＵまたはＣＣＣまたはＣＣＡまたはＣＣＧ
トレオニン（ＴｈｒまたはＴ） ＡＣＵまたはＡＣＣまたはＡＣＡまたはＡＣＧ
アラニン（ＡｌａまたはＡ） ＧＣＵまたはＧＣＧまたはＧＣＡまたはＧＣＧ
チロシン（ＴｙｒまたはＹ） ＵＡＵまたはＵＡＣ
ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ） ＣＡＵまたはＣＡＣ
グルタミン（ＧｌｎまたはＱ） ＣＡＡまたはＣＡＧ
アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ） ＡＡＵまたはＡＡＣ
リシン（ＬｙｓまたはＫ） ＡＡＡまたはＡＡＧ
アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ） ＧＡＵまたはＧＡＣ
グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ） ＧＡＡまたはＧＡＧ
システイン（ＣｙｓまたはＣ） ＵＧＵまたはＵＧＣ
アルギニン（ＡｒｇまたはＲ） ＣＧＵまたはＣＧＣまたはＣＧＡまたはＣＧＧまたはＡＧＡまたはＡＧＧ
グリシン（ＧｌｙまたはＧ） ＧＧＵまたはＧＧＣまたはＧＧＡまたはＧＧＧ
トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ） ＵＧＧ
終結コドン ＵＡＡ（オーカー）またはＵＡＧ（アンバー）またはＵＧＡ（オパール）
上に明記したコドンがＲＮＡ配列についてのものであることは、理解されるはずである。ＤＮＡについての対応するコドンは、Ｕの代わりにＴを有する。
例えば、特定のコドンが異なるアミノ酸をコードするコドンに変更されるように、本発明の抗体の開示配列を突然変異させることができる。このような突然変異は、一般に、最も少ないヌクレオチド変更を可能にすることにより行うことができる。この種の置換突然変異を非保存的手法で（即ち、特定のサイズまたは特性を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から、別の分類に属するアミノ酸に、このコドンを変更することにより）または保存的手法で（即ち、特定のサイズまたは特性を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から、同じ分類に属するアミノ酸に、このコドンを変更することにより）行って、結果として得られるタンパク質中のアミノ酸を変更することができる。このような保存的変更は、結果として得られるタンパク質の構造および機能の変化を一般には殆どもたらさない。非保存的変更は、結果として得られるタンパク質の構造、活性または機能を改変する可能性がより高い。本発明は、結果として得られるタンパク質の活性または結合特性を有意に改変しない保存的変更を含有する配列を含むものと考えるべきである。
以下は、アミノ酸の様々な分類の一例である：
非極性Ｒ基を有するアミノ酸
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン
非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸
グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン
荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（Ｐｈ６．０で負電荷を有する。）
アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正電荷を有する。）
リシン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０で）
もう１つの分類は、フェニル基を有するアミノ酸であり得る：
フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
もう１つの分類は、分子量（即ち、Ｒ基のサイズ）によるものであり得る：
グリシン ７５
アラニン ８９
セリン １０５
プロリン １１５
バリン １１７
トレオニン １１９
システイン １２１
ロイシン １３１
イソロイシン １３１
アスパラギン １３２
アスパラギン酸 １３３
グルタミン １４６
リシン １４６
グルタミン酸 １４７
メチオニン １４９
ヒスチジン（ｐＨ６．０で） １５５
フェニルアラニン １６５
アルギニン １７４
チロシン １８１
トリプトファン ２０４
特に好ましい置換は、
− 正電荷を維持できるように、Ａｒｇの代わりにＬｙｓおよびこの逆；
− 負電荷を維持できるように、Ａｓｐの代わりにＧｌｕおよびこの逆；
− 遊離−ＯＨを維持できるように、Ｔｈｒの代わりにＳｅｒ；ならびに
− 遊離ＮＨ２を維持できるようにＡｓｎの代わりにＧｉｎ
である。
特に好ましい特性を有するアミノ酸を代用するためにアミノ酸置換を導入することもできる。例えば、Ｃｙｓを、別のＣｙｓとのジスルフィド架橋の潜在的部位に導入することができる。Ｈｉｓを、特に「触媒性の」部位として導入することができる（即ち、Ｈｉｓは、酸または塩基として作用することができ、ならびに生化学的触媒の中で最も一般的なアミノ酸である。）。誘導する、この特に平面的な構造のため、Ｐｒｏを導入することができる。（タンパク質構造内で３回転）。
２つのアミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも約７０％（好ましくは少なくとも約８０％、および最も好ましくは少なくとも９０または９５％）が同一である、または保存的置換を表すとき、「実質的に相同性」である。
ＤＮＡ構築物の「非相同性」領域は、より大きなＤＮＡ分子内の、自然にはこのより大きな分子に付随して見つけられない、ＤＮＡの同定可能なセグメントである。従って、非相同性領域が哺乳動物遺伝子をコードするとき、この遺伝子は、この供給源生物のゲノム内ではこの哺乳動物ゲノムＤＮＡに隣接していないＤＮＡに、通常、隣接しているであろう。相同性コーディング配列のもう１つの例は、コーディング配列これ自体が、自然には見つけられない構築物（例えば、ゲノムコーディング配列がイントロンを含有するｃＤＮＡ、または天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。対立遺伝子変異または自然発生突然変異事象は、本明細書において定義する場合のＤＮＡの非相同性領域を生じさせない。
「医薬的に許容される」というフレーズは、生理的に許容可能であり、ヒトに投与したときアレルギーまたは類似した有害反応、例えば急性胃蠕動、めまいおよびこれらに類するものを一般に生じさせない、分子エンティティーおよび組成物を指す。
「治療有効量」というフレーズは、ターゲット細胞集団、癌細胞群もしくは腫瘍の成長もしくは進行もしくは有糸分裂活性、または病態の他の特徴の臨床的に有意な変化を予防するために、および好ましくは少なくとも約３０パーセント、好ましくは少なくとも５０パーセント、好ましくは少なくとも７０パーセント、好ましくは少なくとも８０パーセント、好ましくは少なくとも９０％減少させるために十分な量を意味するために本明細書では用いる。例えば、ＥＧＦＲ活性化度、またはＥＧＦＲ陽性細胞の、特に、抗体または結合メンバー活性もしくは陽性細胞の、活性もしくは量もしくは数を減少させることができる。
ＤＮＡ配列は、発現制御配列に、該発現制御配列が該ＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節するとき、「作動するように連結されている」。用語「作動するように連結される」は、発現制御配列の制御下でのＤＮＡ配列の発現およびＤＮＡ配列によってコードされた所望の産物の生産を可能にするために、発現されるＤＮＡ配列の前に適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有することおよび正しいリーディングフレームを維持することを含む。組換えＤＮＡ分子に挿入することを望む遺伝子が、適切な開始シグナルを含有しない場合、このような開始シグナルをこの遺伝子の前に挿入することができる。
用語「標準ハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーションと洗浄の両方について５×ＳＳＣおよび６５℃に実質的に相当する塩および温度条件を指す。しかし、このような「標準ハイブリダイゼーション条件」が、バッファー中のナトリウムおよびマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列長および濃度、ミスマッチ率、ホルムアミドのパーセントおよびこれらに類するものをはじめとする、個々の条件に依存することは、当業者には理解されるであろう。ハイブリダイズする二配列が、ＲＮＡ−ＲＮＡであるのか、ＤＮＡ−ＤＮＡであるのか、またはＲＮＡ−ＤＮＡであるのかも、「標準ハイブリダイゼーション条件」の決定において重要である。このような標準ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションが一般に予測または確定Ｔｍより１０−２０℃下であり、所望される場合にはより高いストリンジェンシーの洗浄を伴う周知の原則に従って、当業者によって容易に決定される。
本発明は、腫瘍形成性、高増殖性または異常細胞において見つけられるＥＧＦＲエピトープであって、前記細胞において異常な翻訳後修飾に基づいて強化されまたははっきりわかり、正常または野生型細胞では検出できないエピトープを認識する、新規特異的結合メンバー、特に抗体またはこの断片（免疫原性断片を含む。）を提供する。特別な、しかし非限定的な、実施形態において、前記結合メンバー、例えば抗体は、単純な炭水化物修飾または早期グリコシル化に基づいて強化されまたははっきりわかり、複雑な炭水化物修飾またはグリコシル化の存在下では低減されるまたははっきりわからない、ＥＧＦＲエピトープを認識する。前記特異的結合メンバー、例えば抗体またはこの断片は、過発現の不在下および正常なＥＧＦＲ翻訳後修飾の存在下では正常または野生型ＥＧＦＲエピトープを含有する正常または野生型細胞に結合しない、または該細胞を認識しない。
本発明は、腫瘍形成性、高増殖性または異常細胞において顕示されるＥＧＦＲエピトープであって、前記細胞において強化され、露呈され、またははっきりわかり、正常または野生型細胞では検出できないエピトープ、特にＥＧＦＲペプチド（２８７ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ３０２（配列番号：１４））を認識する、新規抗体８０６、１７５、１２４、１１３３、ｃｈ８０６およびｈｕ８０６ならびにこれらの断片（免疫原性断片を含む。）を提供する。特別な、しかし非限定的な、実施形態において、前記抗体は、単純な炭水化物修飾または早期グリコシル化に基づいて強化されまたははっきりわかり、複雑な炭水化物修飾またはグリコシル化の存在下では低減されるまたははっきりわからない、ＥＧＦＲエピトープを認識する。前記抗体またはこの断片は、過発現、増幅、または腫瘍形成性事象の不在下では、正常または野生型ＥＧＦＲエピトープを含有する正常または野生型細胞に結合しない、または該細胞を認識しない。
本発明の特別な態様において、および上で述べたように、本発明者らは、増幅された野生型ＥＧＦＲおよびｄｅ２−７ ＥＧＦＲを特異的に認識し、しかもなお、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ突然変異の特有の接合点ペプチドとは異なるエピトープに結合する、新規モノクローナル抗体８０６、１７５、１２４、１１３３、ｃｈ８０６およびｈｕ８０６を発見した。加えて、ｍＡｂ８０６、ｍＡｂ１７５、ｍＡｂ１２４、ｍＡｂ１１３３、およびｈｕ８０６は、神経膠腫細胞の細胞表面で発現される正常、野生型ＥＧＦＲを認識しないが、ＥＬＩＳＡプレートの表面に固定されたＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、このことは、ポリペプチド態様を有する高次構造エピトープを示す。
重要なことに、ｍＡｂ８０６、ｍＡｂ１７５、ｍＡｂ１２４、ｍＡｂ１１３３、ｃｈ８０６およびｈｕ８０６は、殆どの他の正常組織においてより高いレベルの内因性ｗｔＥＧＦＲを発現するが、ＥＧＦＲが過発現または増幅されない、肝臓および皮膚などの、正常組織に有意に結合しない。従って、ｍＡｂ８０６、ｍＡｂ１７５、ｍＡｂ１２４、ｍＡｂ１１３３、およびｈｕ８０６は、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲおよび増幅されたＥＧＦＲを認識するが、正常な、野生型ＥＧＦＲ、またはｄｅ２−７ ＥＧＦＲに特有である特有の接合点ペプチドを認識しない、新規の有用な特異性を明示する。好ましい態様において、本発明のｍＡｂ８０６、ｍＡｂ１７５、ｍＡｂ１２４、ｍＡｂ１１３３、およびｈｕ８０６は、図１４Ｂおよび１５Ｂ；７４Ｂおよび７５Ｂ；５１Ｂおよび５１Ｄ；５２Ｂおよび５２Ｄ；ならびに５５Ａおよび５５Ｂにそれぞれ図示するＶＨおよびＶＬ鎖ＣＤＲドメインアミノ酸配列（それぞれ、配列番号：２および４、１２９および１３４、２２および２７、３２および３７、ならびに４２および４７；配列番号：１６３および１６４のｈｕ８０６ ＶＨ鎖シグナルペプチドおよびＶＨ鎖配列をそれぞれ含む配列番号：４２；ならびに配列番号：１６５および１６６のｈｕ８０６ ＶＬ鎖シグナルペプチドおよびＶＬ鎖配列をそれぞれ含む配列番号：４７）を含む。
もう１つの態様において、本発明は、１７５抗体のＶＨおよびＶＬ鎖配列（それぞれ、配列番号：１２９および１３４）を有する抗体の少なくとも１０％が、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲへの結合から、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてこのような抗体との競合により遮断される条件下で、１７５抗体と競合することができる抗体を提供する。上に示したように、抗イディオタイプ抗体がここでは考えられる。
本発明は、増幅されたＥＧＦＲを発現するまたはｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する細胞中に存在し、正常なまたは野生型ＥＧＦＲを発現する細胞において、特に正常な翻訳後修飾の存在下で、検出できない、ＥＧＦＲエピトープを認識する、特異的結合メンバー、特に抗体またはこれらの断片に関する。
本発明の抗体の追加の非限定的観察または特徴は、早期グリコシル化または単純炭水化物修飾に特有である、高マンノース基の存在下でのこれらのエピトープのこれらの認識であることを、さらに述べ、本明細書において実証する。例えば、改変されたまたは異常なグリコシル化は、抗体エピトープの存在および／もしくは認識を助長する、または抗体エピトープの一部を含む。
グリコシル化は、オリゴ糖の付加による、糖タンパク質と呼ばれるタンパク質の翻訳後修飾を含む、および包含する。特にＮ結合型オリゴ糖およびＯ結合型オリゴ糖をはじめとする、オリゴ糖は、糖タンパク質におけるグリコシル化部位に付加される。Ｎ結合型オリゴ糖は、特にＡｓｎ残基が配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ（この場合のＸは、ＰｒｏおよびＡｓｐではあり得ない。）で存在する場合、Ａｓｎ残基に付加され、および糖タンパク質において見つけられる最も一般的なものである。Ｎ結合型糖タンパク質の生合成において、高マンノース型オリゴ糖（一般に、ドリコール、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノースおよびグルコースから成るが小胞体（ＥＲ）において最初に形成される。その後、この高マンノース型糖タンパク質は、ＥＲからゴルジに輸送され、そこでさらにこのオリゴ糖のプロセッシングおよび修飾が、通常、発生する。Ｏ結合型オリゴ糖は、ＳｅｒまたはＴｈｒ残基のヒドロキシル基に付加される。Ｏ結合型オリゴ糖の場合、Ｎアセチルグルコサミンが、ＥＲにおいてアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼによりＳｅｒまたはＴｈｒ残基に最初に移送される。その後、このタンパク質は、ゴルジに移動し、そこでさらなる修飾および連鎖伸長が発生する。
本発明の特別な態様において、および上で述べたように、本発明者らは、増幅された野生型ＥＧＦＲおよびｄｅ２−７ ＥＧＦＲを特異的に認識するがこのｄｅ２−７ ＥＧＦＲ突然変異の特有の接合点ペプチドとは異なるエピトープに結合する、ｍＡｂ８０６（およびこのキメラｃｈ８０６）、ｍＡｂ１７５、ｍＡｂ１２４、ｍＡｂ１１３３およびｈｕ８０６と呼ぶ抗体により本明細書において例示する、新規モノクローナル抗体を発見した。本発明の抗体は、増幅されたＥＧＦＲおよび（本明細書においてｄｅ２−７突然変異により例示する）突然変異体ＥＧＦＲを含めて、過発現されたＥＧＦＲを、特に、異常な翻訳後修飾に基づいて、特異的に認識する。加えて、これらの抗体は、神経膠腫細胞の細胞表面で発現される正常、野生型ＥＧＦＲを認識しないが、ＥＬＩＳＡプレートの表面に固定されたＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、このことは、ポリペプチド態様を有する高次構造エピトープを示す。重要なことに、これらの抗体は、殆どの他の正常組織におけるより高いレベルの内因性ｗｔＥＧＦＲを発現するが、ＥＧＦＲを過発現および増幅しない肝臓および皮膚などの正常組織に有意に結合しない。従って、これらの抗体は、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲおよび増幅されたＥＧＦＲを認識するが、正常、野生型ＥＧＦＲ、またはｄｅ２−７ ＥＧＦＲの特徴である特有の接合点ペプチドを認識しない、新規の有用な特異性を明示する。
好ましい態様において、前記抗体は、本発明者らが同定および特性づけした抗体の特徴、特に、増幅されたＥＧＦＲおよびｄｅ２−７ＥＧＦＲを認識する特徴を有するものである。特に好ましい態様において、前記抗体は、ｍＡｂ８０６、ｍＡｂ１７５、ｍＡｂ１２４、ｍＡｂ１１３３、およびｈｕ８０６、またはこれらの活性断片である。さらなる好ましい態様において、本発明の抗体は、図１６および１７；７４Ｂおよび７５Ｂ；５１Ｂおよび５１Ｄ；５２Ｂおよび５２Ｄ；ならびに５５Ａおよび５５Ｂにそれぞれ図示する、ＶＨおよびＶＬ鎖アミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記特異的結合メンバーまたは抗体のエピトープは、成熟正常または野生型ＥＧＦＲ配列の残基２７３−５０１を含む領域内に位置し、および好ましくは、前記エピトープは、成熟正常または野生型ＥＧＦＲ配列の残基２８７−３０２（配列番号：１４）を含む。従って、ＥＧＦＲ配列の残基２７３−５０１を含む、およびＥＧＦＲ配列の残基２８７−３０２（配列番号：：１４）を含む領域内に位置するエピトープでｄｅ２−７ ＥＧＦＲに結合する特異的結合タンパク質、例えば抗体も提供する。前記エピトープは、当業者に公知の任意の従来のエピトープマッピング技術によって決定することができる。または、残基２７３−５０１および２８７−３０２（配列番号：１４）をコードするＤＮＡ配列を消化し、得られた断片を適する宿主において発現させることができよう。上で述べたように抗体結合を決定することができる。
特に、前記メンバーは、成熟正常または野生型ＥＧＦＲの残基２７３−５０１を含む、およびより具体的には残基２８７−３０２（配列番号：１４）を含む、エピトープに結合するであろう。しかし、同じまたは実質的に同様の反応性パタンを示す他の抗体も本発明の態様を構成する。このことは、配列番号：２および４；１２９および１３４；２２および２７；３２および３７；ならびに４２および４７にそれぞれ示すＶＨおよびＶＬ鎖ドメインを含む抗体とこのようなメンバーを比較することによって判定することができる。概して、この比較は、細胞の核標本から作製した二重反復ブロットに結合メンバーを結び付けて、結合パタンを直接比較する、ウエスタンブロットを用いて行われるであろう。
もう１つの態様において、本発明は、ｍＡｂ８０６と、このような抗体の１つについてのＶＨおよびＶＬ鎖配列を有する抗体の少なくとも１０％が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてこのような抗体との競合によりｄｅ２−７ＥＧＦＲへの結合から遮断される条件下で、競合することができる抗体を提供する。上で述べたように、抗イディオタイプ抗体が考えられ、これらを本明細書において例証する。
もう１つの態様において、本発明は、ｍＡｂ１７５、ｍＡｂ１２４、および／またはｍＡｂ１１３３と、このような抗体の１つについてのＶＨおよびＶＬ鎖配列を有する抗体の少なくとも１０％が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてこのような抗体との競合によりｄｅ２−７ＥＧＦＲへの結合から遮断される条件下で、競合することができる抗体を提供する。上で述べたように、抗イディオタイプ抗体が考えられ、これらを本明細書において例証する。
もう１つの態様において、本発明は、ｍＡｂ８０６、ｍＡｂ１７５、ｍＡｂ１２４、ｍＡｂ１１３３および／またはｈｕ８０６と、このような抗体の１つについてのＶＨおよびＶＬ鎖配列を有する抗体の少なくとも１０％が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてこのような抗体との競合によりｄｅ２−７ＥＧＦＲへの結合から遮断される条件下で、競合することができる抗体を提供する。上で述べたように、抗イディオタイプ抗体が考えられ、これらを本明細書において例証する。
成熟野生型ＥＧＦＲの残基２７３−５０１を含むおよびさらに具体的には残基２８７−３０２（配列番号：１４）を含むエピトープから本質的に成る単離されたポリペプチドが、本発明のもう１つの態様を構成する。本発明のペプチドは、診断アッセイまたはキットにおいて、および抗腫瘍または抗癌ワクチンを含めて、治療的にまたは予防的に、特に有用である。従って、本発明のペプチド組成物は、医薬組成物および免疫原性組成物を含む。
診断および治療用途
本発明の特異的結合メンバー、特に抗体またはこれらの断片、の特有の特性であって、それにより該結合メンバー（単数または複数）が、腫瘍形成性、高増殖性または異常細胞において見つけられるおよび正常または野生型細胞では検出できないＥＧＦＲエピトープを認識する、ならびに該エピトープが、異常な翻訳後修飾に基づいて強化されるまたははっきりわかる、ならびに前記メンバー（単数または複数）が、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲおよび増幅されたＥＧＦＲに結合するがｗｔＥＧＦＲに結合しないという特性は、以前から知られているＥＧＦＲ抗体で見られることがある正常組織取り込みに関連した問題を伴わない、多数の腫瘍形成性細胞タイプおよび腫瘍タイプ、例えば頭頸部、乳房、肺、膀胱または前立腺腫瘍および神経膠腫を同定する、特性づけする、ターゲットにするおよび治療する、減少させるまたは排除する、診断および治療用途をもたらす。従って、（例えば、突然変異体または変異体ＥＧＦＲの増幅または発現により）ＥＧＦＲを過発現する細胞、特に、異常な翻訳後修飾を明示するものを、本発明の結合メンバー（単数または複数）、特に抗体（単数もしくは複数）もしくはこの（これらの）断片を利用して、認識する、単離する、特性づけする、ターゲットにする、および治療するまたは排除することができる。
本発明のさらなる態様において、ｍＡｂ８０６、ｍＡｂ１７５、ｍＡｂ１２４、ｍＡｂ１１３３および／またはｈｕ８０６の投与を含む、腫瘍、癌性状態、前癌性状態、および高増殖性細胞成長に関連したまたは高増殖性細胞成長の結果として生ずる任意の状態を治療する方法を提供する。
従って、本発明の抗体は、ＥＧＦＲ過発現、特に増幅、および／またはＥＧＦＲ突然変異、特にｄｅ２−７ＥＧＦＲが存在する腫瘍または細胞を染色するまたは別様に認識することにより、ＥＧＦＲ腫瘍または腫瘍形成性細胞の性質を特異的に類別することができる。さらに、ｍＡｂ８０６（およびキメラ抗体ｃｈ８０６）、ｍＡｂ１７５、ｍＡｂ１２４、ｍＡｂ１１３３およびｈｕ８０６によって例示されるような、本発明の抗体は、増幅されたＥＧＦＲを含有する腫瘍に対しておよびｄｅ２−７ ＥＧＦＲ陽性異種移植片に対して有意なインビボ抗腫瘍活性を明示する。
上で略述したように、本発明者らは、本発明の特異的結合メンバーが、正常細胞において発現されたときのＥＧＦＲの腫瘍関連形態（ｄｅ２−７ ＥＧＦＲおよび増幅されたＥＧＦＲ）を認識し、正常、野生型受容体を認識しないことを発見した。抗体認識は、ＥＧＦＲ遺伝子の過発現を呈示する細胞において発現されるＥＧＦＲの異常な翻訳後修飾（例えば、特有のグリコシル化、アセチル化またはリン酸化変異体）に依存すると考えられる。
下で説明するように、本発明の抗体を治療法の研究において使用し、これらは、過発現している（例えば、増幅された）ヒト腫瘍のＥＧＦＲ異種移植片およびヒトｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現性異種移植片の増殖を阻害することならびにこのような腫瘍内で有意な壊死を誘導することが明らかになった。
さらに、本発明の抗体は、予防的モデルにおいて頭蓋内腫瘍の成長を阻害する。このモデルは、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する神経膠腫細胞をヌードマウスに注射すること、および次に、抗体を同日にまたは１から３日以内に、場合により反復投与で、頭蓋内注射することを含む。抗体の用量は、適切には約１０μｇである。抗体を注射したマウスを対照と比較し、治療したマウスの生存率が有意に増加されたことが判明した。
従って、本発明のさらなる態様において、本発明の特異的結合メンバーの投与を含む、腫瘍、癌性状態、前癌性状態、および高増殖性細胞成長に関連したまたは高増殖性細胞成長の結果として生ずる任意の状態を治療する方法を提供する。
本発明の抗体は、ヒトまたは動物被験者における腫瘍、特に上皮性腫瘍、の診断および治療方法において使用されるように設計されている。これらの腫瘍は、神経膠腫、乳房、肺、前立腺、頭部または頚部腫瘍をはじめとする（しかし、これらに限定されない）任意のタイプの一次または二次充実性腫瘍であり得る。
結合メンバーおよび抗体産生
ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作るための一般的な方法論は周知である。融合以外の技術、例えば、発癌性ＤＮＡでのＢリンパ球の直接形質転換、またはＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスでのトランスフェクションによって、不死、抗体生産細胞系を作ることもできる。例えば、Ｍ． Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」（１９８０）；Ｈａｍｍｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（１９８０）を参照のこと；米国特許番号４，３４１，７６１；米国特許番号４，３９９，１２１；米国特許番号４，４２７，７８３；米国特許番号４，４４４，８８７；米国特許番号４，４５１，５７０；米国特許番号４，４６６，９１７；米国特許番号４，４７２，５００；米国特許番号４，４９１，６３２；および米国特許番号４，４９３，８９０も参照のこと。
ＥＦＧＲに対して生産されたモノクローナル抗体のパネルを、様々な特性、即ちアイソタイプ、エピトープ、親和性などについてスクリーニングすることができる。ＥＦＧＲまたはこのサブユニットの活性を模倣するモノクローナル抗体は、特に興味深い。このようなモノクローナル抗体は、特異的結合メンバー活性アッセイで容易に同定することができる。天然または組換え特異的結合メンバーの免疫親和性精製が可能であるときには、高親和性抗体も有用である。
ポリクローナル抗ＥＦＧＲ抗体を生産するための方法は、当該技術分野において周知である。Ｎｅｓｔｏｒらの米国特許番号４，４９３，７９５参照。有用な抗体分子のＦａｂおよび／またはＦ（ａｂ’）２部分を概して含有するモノクローナル抗体を、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）（これは、参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されているハイブリドーマ技術を用いて調製することができる。簡単に言うと、モノクローナル抗体組成物が生産されるハイブリドーマを形成するために、適切なＥＧＦＲでの高免疫処置を施した哺乳動物の脾臓から得たリンパ球と黒色腫または他の自己不滅化細胞系を融合させる。
典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００を使用して脾細胞を黒色腫細胞と融合させる。融合したハイブリッドを、ＨＡＴに対するこれらの感度により選択する。本発明の実施に有用なモノクローナル抗体を生産するハブリドーマを、本発明の抗体または結合メンバーと免疫反応するこれらの能力、およびターゲット細胞における指定腫瘍形成または高増殖活性を阻害するこれらの能力によって同定する。
適切な抗原特異性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを含有する栄養培地を含むモノクローナル抗体ハイブリドーマ培養を開始させることにより、本発明の実施に有用なモノクローナル抗体を生産することができる。ハイブリドーマが抗体分子を培地に分泌するために十分な条件下でおよび期間にわたって培養物を維持する。その後、抗体含有培地を回収する。その後、周知の技術により抗体分子をさらに単離することができる。
これらの組成物の調製に有用な培地は、当該技術分野において周知でもあり、市販されてもおり、ならびに合成培地、近交系マウスおよびこれらに類するものを含む。例示的合成培地は、４．５ｇｍ／Ｌ グルコース、２０ｍｍ グルタミン、および２０％ウシ胎仔血清を補足した、ダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ；Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．８：３９６（１９５９））である。例示的近交系マウス株は、Ｂａｌｂ／ｃである。
モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体を生産するための方法も当該技術分野において周知である。Ｎｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：４９４９−４９５３（１９８３）を参照のこと。典型的に、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を生産するための、以前に記載されている手順では、ＥＧＦＲまたはペプチド類似体を単独で使用するか、免疫原としての免疫原性担体にコンジュゲートさせる。腫瘍形成、異常または高増殖性細胞中に存在するＥＧＦＲと免疫反応する抗体を生産する能力についてこれらのハイブリドーマをスクリーニングする。他の抗ＥＧＦＲ抗体としては、Ｇｅｎｍａｂ／ＭｅｄａｒｅｘからのＨｕＭＡＸ−ＥＧＦｒ抗体、１０８抗体（ＡＴＣＣ ＨＢ９７６４）および米国特許番号６，２１７，８６６、ならびにＳｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧからの抗体１４Ｅ１（米国特許番号５，９４２，６０２）が挙げられるが、これらに限定されない。
組換え結合メンバー、キメラ、二重特異性および断片
一般に、それぞれ配列番号：２および４；１２９および１３４；２２および２７；３２および３７；ならびに４２および４７のＣＤＲ１領域として実質的に示すようなアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域は、腫瘍抗原への該ＣＤＲ１領域の結合を可能にする構造内に保持されるであろう。例えば配列番号：４のＣＤＲ１領域の場合、このＣＤＲ１領域は、好ましくは、配列番号：４のＶＬ鎖領域によって（および他の列挙した配列についても同様に）保持される。
一般に、それぞれ配列番号：２および４；１２９および１３４；２２および２７；３２および３７；ならびに４２および４７のＣＤＲ２領域として実質的に示すようなアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域は、腫瘍抗原への該ＣＤＲ２領域の結合を可能にする構造内に保持されるであろう。例えば配列番号：４のＣＤＲ２領域の場合、このＣＤＲ２領域は、好ましくは、配列番号：４のＶＬ鎖領域によって（および他の列挙した配列についても同様に）保持される。
一般に、それぞれ配列番号：２および４；１２９および１３４；２２および２７；３２および３７；ならびに４２および４７のＣＤＲ３領域として実質的に示すようなアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域は、腫瘍抗原への該ＣＤＲ３領域の結合を可能にする構造内に保持されるであろう。例えば配列番号：４のＣＤＲ３領域の場合、このＣＤＲ３領域は、好ましくは、配列番号：４のＶＬ鎖領域によって（および他の列挙した配列についても同様に）保持される。
「実質的に示すような」とは、本発明のこのＣＤＲ領域、例えばＣＤＲ３領域が、それぞれ配列番号：２および４；１２９および１３４；２２および２７；３２および３７；ならびに４２および４７の指定領域と同一または高相同性であるであろうことを意味する。「高相同性の」とは、ＣＤＲの１つ以上においてほんの少数の置換、好ましくは１から８、好ましくは１から５、好ましくは１から４、または１から３または１もしくは２の置換がなされていることがあることが考えられる。このような用語は、結果として生ずる抗体が、ｍＡｂ８０６、ｍＡｂ１７５、ｍＡｂ１２４、ｍＡｂ１１３３およびｈｕ８０６によって示されるような、本明細書において論ずる抗体クラスの特有の特性を示す限り、ＣＤＲに対するトランケーションを含むとも考えられる。
本発明のＣＤＲ、特にＣＤＲ３を保持するための構造は、一般に、該ＣＤＲ領域が、再配列免疫グロブリン遺伝子によってコードされた自然に存在するＶＨおよびＶＬ鎖抗体可変ドメインのＣＤＲ領域に対応する位置にある抗体重もしくは軽鎖配列またはこれらの実質的な部分の構造であろう。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．１９８７、および今ではインターネットで入手できるこの最新版（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕ番号ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ））への参照により決定することができる。さらに、当業者には公知であるように、ＣＤＲ決定を様々な方法で行うことができる。例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａおよび併用ドメイン決定分析を用いることができる。これに関しては、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／＃ｃｄｒｉｄを参照のこと。
好ましくは、本発明の抗体におけるＶＨ鎖ＣＤＲ残基として実質的に示すようなアミノ酸配列は、ヒト重鎖可変ドメインまたはこの実質的な部分におけるものであり、ならびに本発明の抗体におけるＶＬ鎖ＣＤＲ残基として実質的に示すアミノ酸配列は、ヒト軽鎖可変ドメインまたはこの実質的な部分におけるものである。
前記可変ドメインは、任意の生殖細胞系もしくは再配列ヒト可変ドメインに由来することがあり、または公知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列に基づく合成可変ドメインであることがある。例えば上記段落で定義したような本発明のＣＤＲ３由来の配列を、組換えＤＮＡ技術を用いて、ＣＤＲ３領域を欠く可変ドメインのレパートリーに導入することができる。
例えば、Ｍａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：７７９−７８３）には、可変ドメインエリアの５’端に向けられたまたは可変ドメインエリアの５’端に隣接したコンセンサスプライマーを、ヒトＶＨ遺伝子の第三フレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと共に用いて、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを生じさせる、抗体可変ドメインのレパートリーを生産する方法が記載されている。Ｍａｋｓらは、このレパートリーを特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせる方法をさらに記載している。類似の技術を用いて、本発明のＣＤＲ３由来配列を、ＣＤＲ３を欠くＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャフリングすることができ、シャフリングされた完全ＶＨまたはＶＬドメインを同源ＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせて、本発明の特異的結合メンバーを生じさせることができる。その後、ＷＯ９２／０１０４７のファージディスプレイなどの適する宿主系においてこのレパートリーを提示させて、適する特異的結合メンバーを選択することができる。レパートリーは、１０４以上の個々のメンバーからの、例えば１０６から１０８または１０１０のメンバーからの、いずれかから成り得る。
類似のシャフリングまたはコンビナトリアル技術もＳｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３７０：３８９−３９１）によって開示されており、彼は、ｐ−ラクタマーゼ遺伝子に関しての技術を記載しているが、このアプローチを抗体の産生に用いることができると述べている。
さらなる選択肢は、例えばｍＡｂ８０６ ＶＨまたはＶＬ遺伝子のランダム突然変異誘発を用いて全可変ドメイン内で突然変異を発生させて、本発明のＣＤＲ３由来配列を有する新規ＶＨまたはＶＬ領域を生じさせることである。このような技術は、Ｇｒａｍら（１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０）によって記載されており、彼は、エラープローンＰＣＲを用いた。
用いることができるもう１つの方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に対する突然変異誘発を誘導することである。このような技術は、Ｂａｒｂａｓら（１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：３８０９−３８１３）およびＳｃｈｉｅｒら （１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７）によって開示されている。
上に記載したすべての技術は、これら自体、公知であり、本質的に、本発明の一部を構成しない。当業者は、当該技術分野において常例的な方法論を用いて本発明の特異的結合メンバーを生じさせるためにこのような技術を用いることができるであろう。
免疫グロブリン可変ドメインの実質的な部分は、少なくとも３つのＣＤＲをこれらの介在フレームワーク領域と共に含むであろう。好ましくは、前記部分は、第一および第四のフレームワーク領域のいずれかまたは両方の少なくとも約５０％も含むであろう。前記５０％は、第一フレームワーク領域のＣ末端５０％および第四フレームワーク領域のＮ末端５０％である。可変ドメインの実質的な部分のＮ末端またはＣ末端における追加の残基は、自然に存在する可変ドメイン領域に通常は随伴されないものであることがある。例えば、組換えＤＮＡ技術によってなされる本発明の特異的結合メンバーの構築は、クローニングまたは他の操作工程を助長するために導入されるリンカーによりコードされたＮまたはＣ末端残基の導入を生じさせる結果となることがある。他の操作工程としては、免疫グロブリン重鎖を含むさらなるタンパク質配列、他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディーの生産において）、またはさらに詳細に下で論じるようなタンパク質標識に本発明の可変ドメインを接合するためのリンカーの導入が挙げられる。
本発明の好ましい態様において、それぞれ配列番号：２および４；１２９および１３４；２２および２７；３２および３７；ならびに４２および４７に実質的に示す配列に基づく結合ドメインのペアを含む特異的結合メンバーは好ましいが、これらの配列に基づく単一結合ドメインが本発明のさらなる態様を構成する。ＶＨ鎖における実質的に示した配列に基づく結合ドメインの場合、このような結合ドメインは、免疫グロブリンＶＨドメインが特異的様式でターゲット抗原に結合できることは公知であるので、腫瘍抗原のターゲッティング剤として使用することができる。
一本鎖特異的結合ドメインのいずれかの場合、これらのドメインは、本明細書に開示するｍＡｂ８０６、ｃｈ８０６、ｍＡｂ１７５、ｍＡｂ１２４、ｍＡｂ１１３３およびｈｕ８０６抗体と同様に良好なまたは等しいインビボ特性を有する２ドメイン特異的結合メンバーを形成することができる相補ドメインについてスクリーニングするために使用することができる。
この使用は、米国特許番号５，９６９，１０８に開示されているようないわゆる階層的二重コンビナトリアルアプローチを用いるファージディスプレイスクリーニング法によって果たすことができ、これらの方法では、ＨまたはＬ鎖クローンのいずれかを含有する個々のコロニーを用いて、他方の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全ライブラリーを感染させ、結果として得られる二本鎖特異的結合メンバーを、この参考文献に記載されているものなどのファージディスプレイ技術に従って選択する。この技術は、Ｍａｒｋｓら、同書にも開示されている。
本発明の特異的結合メンバーは、抗体定常領域またはこれらの一部をさらに含むことがある。例えば、ＶＬ鎖配列に基づく特異的結合メンバーを、ヒトＣｋまたはＣλ鎖、好ましくはＣλ鎖を含む抗体軽鎖定常ドメインにこれらのＣ末端で取り付けることができる。同様に、ＶＨ鎖配列に基づく特異的結合メンバーを、任意の抗体アイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＭならびに該アイソタイプのサブクラスのいずれか（特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ４が好ましい。）に由来する免疫グロブリン重鎖のすべてまたは一部にこれらのＣ末端で取り付けることができる。ＩｇＧ１が好ましい。
２５年前のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）技術の出現は、有用な研究試薬の莫大なレパートリーをもたらし、癌療法、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、抗ウイルス予防における認可された製薬試薬としておよび抗血栓薬として抗体を使用する機会を作った（Ｇｌｅｎｎｉｅ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，２０００）。キメラｍＡｂ（マウスＶ領域、ヒトＣ−領域）におよびｍＡｂ相補性決定領域（ＣＤＲ）のみがマウス由来のものであるヒト化試薬にマウスｍＡｂを変換する分子工学の適用は、ｍＡｂ療法の臨床的成功にとって極めて重要なものであった。この分子工学で作られたｍＡｂは、著しい低減した免疫原性または免疫原性欠如、増加された血清半減期を有し、このｍＡｂのヒトＦｃ部分は、補体の免疫エフェクターおよび細胞毒細胞を動員する可能性を増す（Ｃｌａｒｋ ２０００）。臨床投与されたｍＡｂの生体内分布、薬物動態および該ｍＡｂに対する免疫応答の任意の誘導の調査は、製剤タンパク質と内因性タンパク質を区別するための分析の開発を必要とする。
前記抗体またはこれらの任意の断片を、任意の細胞毒、細菌または他のもの、例えばシュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）内毒素、リシンもしくはジフテリア毒素にコンジュゲートさせるまたは組換え融合させることもできる。使用する毒素の部分は、全毒素である場合もあり、またはこの毒素の任意の特別なドメインである場合もある。このような抗体−毒素分子は、異なる種類の癌のターゲッティングおよび治療法にうまく用いられている。例えば、Ｐａｓｔａｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９７ Ｏｃｔ ２４；１３３３（２）：Ｃ１−６；Ｋｒｅｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００１ Ｊｕｌ ２６；３４５（４）：２４１−７；Ｓｃｈｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０００ Ｊａｎ；１４（１）：１２９−３５；Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１ Ｊｕｌ；１８（３）：２５１−６８を参照のこと。
二重および三重特異性多量体を異なるｓｃＦｖ分子の会合によって形成することができ、ならびに腫瘍へのＴ細胞補充（免疫療法）、ウイルスリターゲッティング（遺伝子療法）のための架橋試薬として、および赤血球凝集剤として（免疫診断）設計されている。例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００１ Ｆｅｂ １；２４８（ｌ−２）：４７−６６；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０００；３２６：４６１−７９；ＭｃＣａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ Ｍａｙ １５；１６６（１０）：６１１２−７を参照のこと。
ヒト免疫グロブリン重および軽鎖の大部分を有するトランスジェニックマウスに免疫処置を施すことによって、完全ヒト抗体を調製することができる。これらのマウスは、当該技術分野において周知であり、このようなマウスの例は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）（米国特許番号６，０７５，１８１および米国特許番号６，１５０，５８４）、ＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．／ＧｅｎＰｈａｒｍ）（米国特許番号５，５４５，８０６および米国特許番号５，５６９，８２５）、ＴｒａｎｓＣｈｒｏｍｏ Ｍｏｕｓｅ（Ｋｉｒｉｎ）およびＫＭ Ｍｏｕｓｅ（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｋｉｒｉｎ）である。
次に、例えば、標準的なハイブリドーマ技術により、またはファージディスプレイにより、抗体を調製することができる。このとき、これらの抗体は、完全ヒトアミノ酸配列のみを含有するであろう。
ヒトライブラリーからのファージディスプレイを用いて、完全ヒト抗体を産生することもできる。ファージディスプレイは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ａｎｄ Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＨＲ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７（２）：３８１−８；Ｍａｒｋｓ ＪＤ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（３）：５８１−９７；ならびにまた、米国特許番号５，８８５，７９３および米国特許番号５，９６９，１０８）におけるような、当業者に周知の方法を用いて行うことができる。
治療用抗体および使用
本発明の特異的結合メンバーの、特に腫瘍：血液比およびクリアランス率に関する、インビボ特性は、ｍＡｂ８０６に少なくとも匹敵するであろう。このような特異的結合メンバーをヒトまたは動物被験者に投与すると、＞１：１のピーク腫瘍対血液比を示すであろう。好ましくは、このような比で、前記特異的結合メンバーは、１：１より大きい、好ましくは２：１より大きい、さらに好ましくは５：１より大きい腫瘍対器官比も有するであろう。好ましくは、このような比で、前記特異的結合メンバーは、腫瘍部位から離れている器官において、＜１：１の器官対血液比も有するであろう。これらの比は、投与した特異的結合メンバーの異化および分泌器官を除外する。従って、ｓｃＦｖおよびＦａｂの場合（添付の実施例に示すように）、結合メンバーは、腎臓によって分泌され、他の器官より多くここに存在する。全ＩｇＧの場合、クリアランスは、少なくとも一部は肝臓によるであろう。インタクトな抗体のピーク局在比は、通常、特異的結合メンバーの投与後、１０時間と２００時間の間で達成される。さらに詳細には、この比は、無胸腺ヌードマウスの一方の側腹部に皮下形成された約０．２−１．０ｇの腫瘍異種移植片において測定することができる。
本発明の抗体を検出可能なまたは機能性標識で標識することができる。検出可能な標識としては、放射標識、例えば同位体３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、６７ＣＵ、２２５Ａｃ、２１３Ｂｉ、９９Ｔｃおよび１８６Ｒｅが挙げられるがこれらに限定されず、これらを、抗体イメージング技術分野において公知の従来の化学を用いて、本発明の抗体に取り付けることができる。標識としては、蛍光標識、およびＭＲＩ−ＣＴイメージング技術分野において従来用いられている標識も挙げられる。さらに、標識としては、特定の同源検出可能部分、例えば標識されたアビジンへの結合により検出することができる化学的部分、例えばビオチンが挙げられる。
機能性標識は、腫瘍組織の破壊を生じさせるために腫瘍部位をターゲットにするように設計される物質を含む。このような機能性標識としては、腫瘍部位でプロドラックから活性薬物に変換することができる細胞傷害性薬物、例えば５−フルオロウラシルまたはリシン、および酵素、例えば細菌カルボキシペプチターゼまたはニトロレダクターゼが挙げられる。
また、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を含む抗体、ならびに前記特異的結合メンバー、抗体および／またはこれらのサブユニットの生産または活性を調節する薬物は、一定の診断用途を有することができ、例えば、癌、前癌病変、高増殖性細胞成長に関連したもしくは起因する状態、またはこれらに類するものなどの状態を検出および／または測定する目的で利用することができる。例えば、前記特異的結合メンバー、抗体またはこれらのサブユニットは、例えば融合したマウス脾臓リンパ球および骨髄腫細胞を利用するハイブリドーマ技術などの公知の技術により、様々な培養基においてこれら自体に対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を生産するために使用することができる。同様に、本発明の特異的結合メンバーの活性（単数または複数）を模倣するまたは該活性に拮抗する小分子を発見または合成することができ、これらを診断および／または治療プロトコルにおいて使用することができる。
放射標識された特異的結合メンバー、特に抗体およびこれらの断片は、インビトロ診断技術においておよびインビボ放射線イメージング技術において、および放射免疫療法において有用である。インビボイメージングの場合、本発明の特異的結合メンバーを、放射性同位体（単数または複数）ではなく、磁気共鳴画像向上剤をはじめとする（しかし、これに限定されない）イメージング剤にコンジュゲートさせることがあり、この場合、例えば、キレート形成基（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）によってより多数の常磁性イオンを抗体分子に負荷する。キレート形成基の例としては、ＥＤＴＡ、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテルおよびポリオキシムが挙げられる。常磁性イオンの例としては、ガドリニウム、鉄、マンガン、レニウム、ユーロピウム、ランタニウム、ホルミウムおよびエルビウムが挙げられる。本発明のさらなる態様において、放射標識された特異的結合メンバー、特に抗体およびこれらの断片、特に放射免疫コンジュゲートは、放射免疫療法において、特に、癌療法のための放射標識抗体として、有用である。なお、さらなる態様において、放射標識された特異的結合メンバー、特に抗体およびこれらの断片は、放射免疫ガイド外科手術技術において有用であり、この場合、これらは、癌細胞、前癌性細胞、腫瘍細胞および高増殖性細胞の存在および／または位置を、このような細胞を除去するための外科手術前、中または後に、特定するおよび示すことができる。
本発明の特異的結合メンバー、特に抗体およびこれらの断片を他の分子または薬剤にコンジュゲートさせるまたは取り付ける、本発明の免疫複合体または抗体融合タンパク質としては、さらに、化学的アブレーション剤、毒素、免疫調節物質、サイトカイン、細胞傷害性薬剤、化学療法剤または薬にコンジュゲートさせた結合メンバーが挙げられるが、これらに限定されない。
放射免疫療法（ＲＡＩＴ）は、診療所に参入しており、様々な抗体免疫複合体を使用して効力を実証している。１３１１標識ヒト化抗胎児癌抗原（抗ＣＥＡ）抗体ｈＭＮ−１４は、結腸直腸癌において評価されており（Ｂｅｈｒ ＴＭ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｃａｎｃｅｒ ９４（４ Ｓｕｐｐｌ）：１３７３−８１）、９０Ｙ標識を有する同抗体は、髄様甲状腺癌腫において評定されている（Ｓｔｅｉｎ Ｒ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｃａｎｃｅｒ ９４（１）：５１−６１）。モノクローナル抗体を使用する放射免疫療法も非ホジキンリンパ腫および膵臓癌について評定され、報告されている（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ＤＭ（２００１）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３９（ｌ−２）：１９５−２０１；Ｇｏｌｄ ＤＶ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３９（１−２）１４７−５４）。特定の抗体を用いる放射免疫療法の方法も米国特許番号６，３０６，３９３および米国特許番号６，３３１，１７５に記載されている。抗ＣＥＡ抗体および腫瘍関連抗原に対する抗体の使用を含む、放射免疫ガイド外科手術（ＲＩＧＳ）も診療所に参入しており、効力および有用性を実証している（Ｋｉｍ ＪＣ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｊｕｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９７（４）：５４２−７；Ｓｃｈｎｅｅｂａｕｍ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｓｕｒｇ．２５（１２）：１４９５−８；Ａｖｉｔａｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ ８９（８）：１６９２−８；ＭｃＩｎｔｏｓｈ ＤＧ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１２（４）：２８７−９４）。
本発明の抗体は、治療の必要がある患者に、任意の適する経路により、通常は血流もしくはＣＳＦへの注射によって投与することができ、または腫瘍部位に直接投与することができる。正確な用量は、抗体が診断用であるのかまたは治療用であるのか、腫瘍のサイズおよび位置、抗体の正確な性質（全抗体であるのか、断片であるのか、ダイアボディーであるのかなど）、ならびに抗体に取り付ける検出可能なまたは機能性標識をはじめとする、多数の要因に依存するであろう。放射性核種（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉａ）を療法に使用する場合、適する最大１回量は、約４５ｍＣｉ／ｍ２であり、最大約２５０ｍＣｉ／ｍ２までである。好ましい投薬量は、１５から４０ｍＣｉの範囲であり、さらに好ましい投薬範囲は２０から３０ｍＣｉ、または１０から３０ｍＣｉである。このような療法は、骨髄または幹細胞置換を必要とすることがある。腫瘍イメージングまたは腫瘍治療のいずれかのための典型的な抗体用量は、Ｆ（ａｂ’）２形態での抗体０．５から４０ｍｇの範囲、好ましくは１から４ｍｇであろう。裸の抗体を、好ましくは、１回あたりタンパク質２０から１０００ｍｇ、または１回あたりタンパク質２０から５００ｍｇ、または１回あたりタンパク質２０から１００ｍｇの用量で投与する。この用量は、成人患者の単回治療のための用量であり、比例して小児および乳児に合せることができ、ならびに分子量に比例して他の抗体形態に合わせることもできる。毎日、週２回、週または月間隔で、医師の指示で治療を繰り返すことができる。
これらの調合物は、第二の結合タンパク質、例えば上で説明したＥＧＰＲ結合タンパク質を含むことがある。特に好ましい形態でのこの第二の結合タンパク質は、上で論じた、５２８または２２５などのモノクローナル抗体である。
医薬組成物および治療用組成物
本発明の特異的結合メンバーは、該特異的結合メンバーに加えて少なくとも１つの成分を含むことがある医薬組成物の形態で通常は投与されるであろう。
従って、本発明の医薬組成物、および本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性成分に加えて、医薬的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者に周知の他の材料を含むことがある。このような材料は、非毒性であるべきであり、および活性成分の効力に干渉すべきでない。担体または他の材料の正確な性質は、経口的であることもありまたは注射による、例えば静脈内、であることもある、投与経路に依存するであろう。
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体形態であり得る。錠剤は、固体担体、例えばゼラチン、またはアジュバントを含むことがある。液体医薬組成物は、一般に、液体担体、例えば水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油を含む。生理食塩溶液、デキストロースもしくは他の糖類溶液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールを含むことがある。
静脈内注射または苦痛部位への注射のための活性成分は、発熱物質不含であり、適するｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態であろう。関連当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー液、乳酸加リンガー液などの等張性ビヒクルを使用して、適する溶液を調製することが十分できる。必要に応じて、保存薬、安定剤、緩衝剤、抗酸化物質および／または他の添加剤を含むことがある。
前記組成物を単独で、または他の治療、療法薬または薬剤と併用で、治療すべき状態に依存して同時にまたは逐次的に、投与することができる。加えて、本発明は、本明細書に記載する結合メンバー、特に抗体またはこの断片と他の薬剤または療法、例えば抗癌剤もしくは療法薬、ホルモン、抗ＥＧＦＲ剤もしくは抗体または免疫調節成分とを含む組成物を考えており、含む。さらに一般的には、これらの抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤もしくはリン酸化カスケード阻害剤、翻訳後調節物質、細胞成長もしくは分裂阻害剤（例えば、抗有糸分裂剤）、またはシグナル伝達阻害剤であり得る。他の治療または療法としては、疼痛寛解薬、例えば非ステロイド系抗炎症薬（例えば、アスピリン、パラセタモール、イブプロフェンもしくはケトプロフェン）またはオピエート、例えばモルフィン、または制吐薬の適する用量の投与を挙げることができる。前記組成物をチロシンキナーゼ阻害剤（ＡＧ１４７８およびＺＤ１８３９、ＳＴＩ５７１、ＯＳＩ−７７４、ＳＵ−６６６８を含むが、これらに限定されない。）、ドキソルビシン、テモゾロミド、シスプラチン、カルボプラチン、ニトロソウレア、プロカルバジン、ビンクリスチン、ヒドロキシウレア、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エピポドフィロトキシン、カルムスチン、ロムスチン、および／または他の化学療法薬と併用で（逐次的に（即ち、前もしくは後に）または同時に）投与することができる。例えば、これらの薬剤は、抗ＥＧＦＲ特異的薬剤、またはチロシンキナーゼ阻害剤、例えばＡＧ１４７８、ＺＤ１８３９、ＳＴＩ５７１、ＯＳＩ−７７４、もしくはＳＵ−６６６８である場合があり、またはより一般的な抗癌剤および抗新生物剤、例えばドキソルビシン、シスプラチン、テモゾロミド、ニトロソウレア、プロカルバジン、ビンクリスチン、ヒドロキシウレア、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エピポドフィロトキシン、カルムスチン、もしくはロムスチンである場合がある。加えて、前記組成物を、免疫応答をおよび癌細胞または腫瘍の減少または排除を刺激するホルモン、例えばデキサメタゾン、免疫調節成分、例えばインターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）または他の成長因子またはサイトカインと共に投与することができる。
免疫調節成分、例えばＴＮＦを、本発明の抗体によって認識されるＥＧＦＲエピトープを認識するばかりでなくＴＮＦ受容体に結合する二重特異性抗体の形態の本発明のメンバーと併用することがある。前記組成物は、抗ＥＧＦＲ抗体５２８、２２５、ＳＣ−０３、ＤＲ８．３、Ｌ８Ａ４、Ｙ１０、ＩＣＲ６２およびＡＢＸ−ＥＧＦをはじめとする（しかし、これらに限定されない）他の抗ＥＧＦＲ抗体と共に投与されることもあり、または該他の抗ＥＧＦＲ抗体との合剤を含むこともある。
以前に、ドキソルビシンおよびシスプラチンなどの薬剤と抗ＥＧＦＲ抗体の併用は、強化された抗腫瘍活性を生じさせた（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ，１９９３；Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ，１９９３）。ドキソルビシンとｍＡｂ ５２８の併用は、確率したＡ４３１異種移植片の完全根絶を生じさせる結果となったが、いずれかのみの薬剤での治療は、一時的なインビボ成長阻害しか生じさせなかった（Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ，１９９３）。同様に、シスプラチンとｍＡｂ５２８または２２５のいずれかとの併用も十分に確率したＡ４３１異種移植片の根絶のもたらし、いずれかの薬剤での治療を用いたときにはこれが観察されなかった（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ，１９９３）。
従来の放射線療法
加えて、本発明は、前記結合メンバーと従来の放射線療法の併用のための治療用組成物を考えており、含む。ＥＧＦ受容体をターゲットにする抗体での治療は、従来の放射線療法の効果を向上させることができることが指摘されている（Ｍｉｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００ Ｆｅｂ：６（２）：７０１，Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００ Ｊｕｎ：６（６）：２１６６）。
本明細書において実証するように、本発明の結合メンバー、特に、抗体またはこの断片、特に、ｍＡｂ８０６、ｃｈ８０６、ｍＡｂ１７５、ｍＡｂ１２４、ｍＡｂ１１３３もしくはｈｕ８０６またはこれらの断片と、抗癌療法薬、特に抗ＥＧＦＲ療法薬（他の抗ＥＧＦＲ抗体を含む。）との併用は、異種移植腫瘍に対する有効な療法、および特に外科手術を実証する。実施例において、例えば、ＡＧ１４７８およびｍＡｂ８０６の併用は、いずれかの薬剤単独での治療と比較してＡ４３１異種移植腫瘍容積の低減を有意に増進させる結果となることを実証する。ＡＧ１４７８（４−（３−クロロアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン）は、ＥＧＦ受容体キナーゼの強力な選択的阻害剤であり、米国特許番号５，４５７，１０５に詳細に記載されており、この特許はこの全体が参照により本明細書に組み込まれる（Ｌｉｕ，Ｗ．ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１２：２４０９；Ｅｇｕｃｈｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：８８９０；Ｌｅｖｉｔｓｋｙ，Ａ．ａｎｄ Ｇａｚｉｔ，Ａ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１７８２も参照のこと）。本明細書実施例は、本発明の抗体と他の抗ＥＧＦＲ抗体との、特に５２８抗ＥＧＦＲ抗体との、治療相乗作用をさらに実証する。
本発明は、本発明の治療法の実施に有用な治療用組成物をさらに考えている。本治療組成物は、医薬的に許容される賦形剤（担体）と、活性成分としての本明細書に記載するとおりの特異的結合メンバー、このポリペプチド類似体またはこれらの断片の１つ以上とを混合物で含む。好ましい実施形態において、前記組成物は、ターゲット細胞と本結合メンバー／抗体の特異的結合を調節することができる抗原を含む。
活性成分としてポリペプチド、類似体または活性断片を含有する治療用組成物の調製は、当該技術分野において十分に理解されている。典型的に、このような組成物は、注射剤として、溶液または懸濁液のいずれかとして、調製される。しかし、注射前の液体への溶解または懸濁に適する固体形態も調製することができる。調製品を乳化させることもできる。活性治療成分は、医薬的に許容される、および活性薬剤と相溶性である、賦形剤と混合されることが多い。適する賦形剤は、例えば、水、食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノール、またはこれらに類するもの、およびこれらの組み合わせである。加えて、所望される場合には、前記組成物は、活性成分の有効性を向上させる少量の補助物質、例えば湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤を含有することがある。
ポリペプチド、類似体または活性断片を、中和された医薬的に許容される塩の形態としての治療用組成物に調合することができる。医薬的に許容される塩としては、酸付加塩（ポリペプチドまたは抗体分子の遊離アミノ基とで形成されたもの）ならびに例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸およびこれらに類するもののような有機酸とで形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基から形成される塩を、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウムまたは第二鉄などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインおよびこれらに類するもののような有機塩基から誘導することもできる。
治療用ポリペプチド含有、類似体含有または活性断片含有組成物は、従来、静脈内投与、例えば、単位用量の注射により投与される。本発明の治療組成物に関して用いるときの用語「単位用量」は、ヒトのための単一投薬量として適する物理的に別個の単位であって、それぞれが、必要希釈剤、即ち担体、またはビヒクルと共同で所望の治療効果を生じさせるように計算された所定量の活性材料を含有するものである単位を指す。
前記組成物を、投薬用製剤と適合性の手法で、および治療有効量で投与する。投与する量は、治療を受ける被験者、前記活性成分を利用するこの被験者の免疫系の能力、および所望されるＥＧＦＲ結合能力の程度に依存する。投与のために必要とされる活性成分の正確な量は、担当医の判断に依存し、各個体に固有である。しかし、適する投薬量は、１日につき個体の体重１キログラムあたり活性成分約０．１から２０、好ましくは約０．５から約１０、およびさらに好ましくは１から数ミリグラムにわたるおよび投与経路に依存するであろう。初回投与およびブースター接種に適するレジメも様々であるが、典型的な例は、初回投与、続いて、後続注射または他の投与による１時間以上の間隔での反復投与である。または、血液中１０ナノモルから１０マイクロモルの濃度を維持するために十分な持続点滴静注が考えられる。
経口投与のための医薬組成物は、タブレット、カプセル、粉末または液体形態である場合がある。錠剤は、固体担体、例えばゼラチン、またはアジュバントを含むことがある。液体医薬組成物は、一般に、液体担体、例えば水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油を含む。生理食塩溶液、デキストロースもしくは他の糖類溶液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールを含むことがある。
静脈内注射または苦痛部位への注射のための活性成分は、発熱物質不含であり、適するｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態であろう。関連当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー液、乳酸加リンガー液などの等張性ビヒクルを使用して、適する溶液を調製することが十分できる。必要に応じて、保存薬、安定剤、緩衝剤、抗酸化物質および／または他の添加剤を含むことがある。
診断アッセイ
本発明は、本発明の特異的結合メンバーによって認識されるこれらの能力を参照することにより、異常発現されるＥＧＦＲなどの刺激の存在を検出するための方法を含む、様々な診断利用にも関する。前に述べたように、ＥＧＦＲは、様々な公知技術によりこれ自体に対する抗体を生産するために用いることができ、その後、このような抗体を単離し、例えば、疑わしいターゲット細胞における特定のＥＧＦＲ活性の存在についての試験において利用することができよう。
本発明の特異的結合メンバー、特に抗体およびこれらの断片、の診断利用は、当業者には周知および通例であって本明細書に基づくものである、インビトロおよびインビボ利用を含む。ＥＧＦＲステータスの、特にＥＧＦＲの異常な発現に関する、インビトロ評定および評価のための診断アッセイおよびキットは、癌、前癌状態、高増殖性細胞成長に関連した状態を有することがわかっているもしくは疑われるものまたは腫瘍サンプルからのものをはじめとする、患者サンプルを診断、評価およびモニターするために利用することができる。ＥＧＦＲステータスの評定および評価は、薬物の臨床治験についての、または異なる薬剤または結合メンバーに対して、特定の化学療法薬または本発明の特異的結合メンバー、特に抗体（これらの合剤を含む。）の投与についての、患者の適正の判定にも有用である。このタイプの診断モニタリングおよび評定は、乳癌においてＨＥＲ２タンパク質に対する抗体を既に実際に利用しており（Ｈｅｒｃｅｐ Ｔｅｓｔ、Ｄａｋｏ Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、この場合のアッセイは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎを使用する抗体療法について患者を評価するためにも用いられる。インビボ利用としては、腫瘍のイメージングまたは個体の癌ステータスを評定（放射線イメージングを含む。）が挙げられる。
前に提案したように、本発明の診断方法は、ＥＦＧＲ／タンパク質に対するアンタゴニスト、例えば、抗ＥＦＧＲ抗体、好ましくはアフィニティー精製されたポリクローナル抗体、およびさらに好ましくはｍＡｂ、の有効量を含むアッセイによる細胞サンプルまたは培地の検査を含む。加えて、ここで用いる抗ＥＦＧＲ抗体分子は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦ（ｖ）部分または全抗体分子の形態であることが好ましい。前に論じたように、この方法の恩恵を受けることができる患者としては、癌、前癌性病変、ウイルス感染症、高増殖性細胞成長を含むもしくは高増殖性細胞成長に起因する病態または他の同様の病的障害に罹患している患者が挙げられる。ＥＦＧＲを単離するおよび抗ＥＦＧＲ抗体を誘導するための方法ならびにターゲット細胞の検査を支援する抗ＥＦＧＲ抗体の能力を判定するおよび最適化するための方法は、すべて、当該技術分野において周知である。
好ましくは、本発明の診断方法において用いられる抗ＥＦＧＲ抗体は、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体である。さらに好ましくは、前記抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。加えて、ここで用いる抗ＥＦＧＲ抗体分子は、全抗体分子のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦ（ｖ）部分の形態である場合がある。
上で詳細に説明したように、周知のハイブリドーマ技術をはじめとする標準的な方法によってＥＧＦＲに対する抗体（単数または複数）を生産および単離することができる。便宜上、ＥＧＦＲに対する抗体（単数または複数）を本明細書ではＡｂ１と呼び、別の種において産生された抗体（単数または複数）をＡｂ２と呼ぶ。
細胞内のＥＧＦＲの存在は、このような判定に適用できる通常のインビトロまたはインビボ免疫学的手順によって突き止めることができる。多数の有用な手順が公知である。特に有用である３つのこのような手順は、検出可能な標識で標識したＥＧＦＲ、検出可能な標識で標識した抗体Ａｂ、または検出可能な標識で標識した抗体Ａｂ２を用いる。これらの手順は、次の方程式（式中、アスタリスクは、この粒子が標識されていることを示し、および「Ｒ」は、ＥＧＦＲを表す。）によって要約することができる：
Ａ． Ｒ＊＋Ａｂ１＝Ｒ＊Ａｂ１、
Ｂ． Ｒ＋Ａｂ＊＝ＲＡｂ１ ＊
Ｃ． Ｒ＋Ａｂ１＋Ａｂ２ ＊＝ＲＡｂ１Ａｂ２ ＊
前記手順およびこれらの利用は、すべて、当業者によく知られており、従って、本発明の範囲内で用いることができる。「競合」手順、手順Ａは、米国特許番号３，６５４，０９０および米国特許番号３，８５０，７５２に記載されている。手順Ｃ、「サンドイッチ」手順は、米国特許番号ＲＥ３１，００６および米国特許番号４，０１６，０４３に記載されている。さらに他の手順、例えば「二重抗体」または「ＤＡＳＰ」手順が公知である。
上の各事例において、ＥＧＦＲは、１つ以上の抗体または結合パートナーと複合体を形成し、この複合体の１つのメンバーが、検出可能な標識によって標識される。複合体形成されたことおよび所望される場合にはこれらの量を、標識の検出に適用できる公知の方法によって判定することができる。
上述のことから、Ａｂ２の特徴的特性は、これがＡｂ１と反応することであることがわかるであろう。この特性は、哺乳動物種において産生されたＡｂ１を、別の種において抗体Ａｂ２を産生させるために抗原として使用したためである。例えば、ウサギ抗体を抗原として使用してヤギにおいてＡｂ２を産生させることができる。従って、Ａｂ２は、ヤギにおいて産生された抗ウサギ抗体であるであろう。本明細書および請求項のために、Ａｂ１は、一次または抗ＥＧＦＲ抗体を指すであろう、およびＡｂ２は、二次または抗Ａｂ１抗体を指すであろう。
これらの研究のために最も一般的に用いられる標識は、放射性元素、酵素、紫外線に暴露されたときに蛍光を発する化学物質、およびその他である。
多数の蛍光材料が公知であり、これらを標識として用いることができる。これらとしては、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＡＭＣＡブルーおよびＬｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗが挙げられる。特別な検出材料は、ヤギにおいて調製され、イソチオシアナートによりフルオレセインにコンジュゲートされた、抗ウサギ抗体である。
ＥＧＦＲまたはこの結合パートナー（単数または複数）、例えば本特異的結合メンバーを放射性元素でまたは酵素で標識することもできる。この放射性標識を、現在利用できる計数手順のいずれかによって検出することができる。好ましい同位体を、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、６７ＣＵ、２２５Ａｃ、２１３Ｂｉ、９９Ｔｃおよび１８６Ｒｅから選択することができる。
酵素標識は、同じく有用であり、および現在利用されている比色、分光測光、蛍光分光測光、電流測定またはガス定量技術のいずれかによって検出することができる。架橋分子、例えばカルボジイミド、ジイソシアナート、グルタルアルデヒドおよびこれらに類するものとの反応により、選択された粒子に酵素をコンジュゲートさせることができる。これらの手順に使用することができる多くの酵素が公知であり、これらを利用することができる。ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが好ましい。米国特許番号３，６５４，０９０；米国特許番号３，８５０，７５２；および米国特許番号４，０１６，０４３を、例として、代替標識材料および方法のこれらの開示について参照する。
本発明に従って有利に利用することができる特定なアッセイ系は、受容体アッセイとして公知である。受容体アッセイでは、前記特異的結合メンバーなどのアッセイすべき材料を適切に標識し、その後、一定の細胞試験コロニーに、標識された材料と未標識の材料の両方の量を接種し、その後、結合研究を行って、標識された材料が細胞受容体に結合する程度を判定する。このようにして、材料間の親和性の差を突き止めることができる。
従って、前記特異的結合メンバーの精製量を、例えば、これに対する抗体または他の阻害剤で標識すること、またはこれに対する抗体または他の阻害剤と化合させることができ、その後、結合研究を行うこととなる。次に、標識されたおよび未標識未化合の特異的結合メンバーの様々な量を含有する溶液を調製し、その後、細胞サンプルに接種し、その後、温置する。次に、結果として生ずる細胞単層を洗浄し、可溶化し、その後、＜５％の標準誤差を生じさせるために十分な時間長にわたってガンマカウンターで計数する。次に、これらのデータをスキャッチャード解析に付し、その後、材料活性に関する観察および結論を引き出す。上記は、例示的なものであるが、アッセイした材料の細胞結合能力が識別特性として役立つことができる場合、受容体アッセイを行うことができ、利用することができる手法を示す。
本発明に従って有用なおよび考えられるアッセイは、「シス／トランス」アッセイとして公知である。簡単に言うと、このアッセイは、２つの遺伝子構築物を利用し、一般に、これらの一方は、適切な細胞系にトランスフェクトされたとき関心のある特定の受容体を継続的に発現するプラスミドであり、およびこれらのもう一方は、受容体／リガンド複合体の制御下でルシフェラーゼなどの受容体を発現するプラスミドである。従って、例えば、化合物を特定の受容体に対するリガンドとして評価することが望まれる場合、前記プラスミドの一方は、選択された細胞系においてこの受容体の発現を生じさせる結果となる構築物であるであろうし、およびもう一方のプラスミドは、この特定の受容体に対する応答要素が挿入されるルシフェラーゼ遺伝子に連結されたプロモーターを有するであろう。試験している化合物が、前記受容体のアゴニストである場合、このリガンドは、この受容体と複合体化し、結果として生じる複合体が、前記応答要素と結合し、ルシフェラーゼ遺伝子の転写を開始させるであろう。その後、この結果として生ずる化学発光を測光法で測定し、用量応答曲線を得、公知リガンドのものと比較する。上述のプロトコルは、米国特許番号４，９８１，７８４およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ８８／０３１６８に記載されており、このために当業者に参照される。
本発明のさらなる実施形態では、疑いのあるターゲット細胞におけるＥＧＦＲの異常な発現（増幅されたＥＧＦＲおよび／またはＥＧＦＲ突然変異を含むが、これらに限定されない。）の存在または不在を判定するために、医療専門家による使用に適する市販試験キットを作製することができる。上で論じた試験技術に従って、このようなキットの１つのクラスは、標識されたＥＧＦＲまたはこの結合パートナー、例えばこれに対して特異的な抗体、および説明書を少なくとも含有するが、勿論、選択される方法、例えば、「競合的」、「サンドイッチ」、「ＤＡＳＰ」およびこれらに類するものに依存するであろう。前記キットは、末梢的試薬、例えば緩衝剤、安定剤なども含有することがある。
従って、ＥＧＦＲの異常な発現または翻訳後修飾についての存在または細胞の能力を実証するための試験キットであって、
（ａ）本特異的結合メンバーまたはこれに対する特異的結合パートナーを検出可能な標識に直接または間接的に取り付けることによって得られる少なくとも１つの標識された免疫化学反応性成分の所定量；
（ｂ）他の試薬；および
（ｃ）該キットの使用説明書
を含む試験キットを作製することができる。
より具体的には、前記診断試験キットは、
（ａ）一般には固相に結合して免疫吸着剤を形成する、または代案では、適するタグ、もしくは多数のこのような末端生成物など（もしくはこれらの結合パートナー）、それぞれのうちの１つに結合する、上で説明したとおりの特異的結合メンバー（または結合パートナー）の既知量；
（ｂ）必要な場合には、他の試薬；および
（ｃ）概試験キットの使用説明書
を含む。
さらなる変形形態では、所定のプロトコル（例えば、「競合的」、「サンドイッチ」、「二重抗体」、など）に従って動作する、ならびに
（ａ）検出可能な標識に前記特異的結合メンバーをカップリングさせることによって得た、標識された成分と；
（ｂ）１つ以上の追加の免疫化学試薬［これらのうちの少なくとも１つの試薬は、リガンドまたは固定されたリガンドであり、このリガンドは、
（ｉ）標識された成分（ａ）と結合することができるリガンド；
（ｉｉ）標識された成分（ａ）の結合パートナーと結合することができるリガンド；
（ｉｉｉ）判定すべき成分（単数または複数）の少なくとも１つと結合することができるリガンド；および
（ｉｖ）判定すべき成分（単数または複数）の少なくとも１つの結合パートナーの少なくとも１つと結合することができるリガンド
から成る群より選択される。］と；
（ｃ）ＥＧＦＲ、前記特異的結合メンバー、およびこれに対する特異的結合パートナーの間の免疫化学反応の１つ以上の成分の検出および／または決定のためのプロトコルを実施するための説明書と
を含む、試験キットを作製し、上で述べた目的のために使用することができる。
上記に従って、ＥＧＦＲの活性、ＥＧＦＲの異常な発現もしくは翻訳後修飾、および／または前記特異的結合メンバーの活性または結合を調節させるために有効な可能性のある薬物をスクリーニングするためのアッセイ系を作製することができる。前記受容体または結合メンバーを試験系に導入し、見込みのある薬物も、この結果として得られる細胞培養物に導入し、その後、この培養物を検査して、該見込みのある薬物単独の添加、または既知薬剤（単数もしくは複数）の添加量の作用、いずれかに起因する、これらの細胞のＳ期活性の一切の変化を観察する。
核酸
本発明は、本発明の特異的結合メンバーをコードする単離された核酸をさらに提供する。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。好ましい態様において、本発明は、本発明の抗体のＶＨおよびＶＬ鎖のＣＤＲ残基として示すようなポリペプチドをはじめとする、上で定義したとおりの本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。
本発明は、上述のとおりの少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、プラスミド、ベクター、転写産物または発現カセットの形態の構築物も提供する。
本発明は、上述のとおりの１つ以上の構築物を含む組換え宿主細胞も提供する。提供する任意の特異的結合メンバーをコードする核酸これ自体が本発明の態様を構成し、前記特異的結合メンバーの生産方法であって、これをコードする核酸から発現させることを含むものである方法も本発明の態様を構成する。前記核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより、発現を適便に果たすことができる。発現による生産後、任意の適する技術を用いて特異的結合メンバーを単離および／または精製することができ、その後、適宜、使用することができる。
本発明による特異的結合メンバーおよびコードする核酸分子およびベクターであって、例えばこれらの天然の環境から、単離および／または精製されたもの、実質的に純粋なもしくは均質な形態でのもの、または核酸の場合には、必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸または遺伝子起点がないまたは実質的にないものを提供することができる。本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことがあり、および完全にまたは部分的に合成のものであることがある。
様々な異なる宿主細胞のクローニングおよび発現のための系が周知である。適する宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母およびバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野において利用できる哺乳動物細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞および多くの他のものが挙げられる。一般的で好ましい細菌宿主は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞における抗体および抗体断片の発現は、当該技術分野において十分に確立されている。総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５−５５１（１９９１）を参照のこと。培養での真核細胞における発現も、特異的結合メンバーの生産の選択肢として、当業者は利用することができる。最近の総説については、例えば、Ｒａｆｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３−５７６；Ｔｒｉｌｌ Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ６：５５３−５６０を参照のこと。
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を適宜含む、適切な調節配列を含有する、適するベクターを選択または構築することができる。ベクターは、適宜、プラスミド、ウイルス、例えばファージまたはファージミドである場合がある。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、シークエンシング、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現における核酸の操作、ならびにタンパク質の分析についての、多くの公知の技術およびプロトコルが、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらの前記開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
従って、本発明のさらなる態様は、本明細書に開示する核酸を含有する宿主細胞を提供する。なお、さらなる態様は、このような核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。この導入は、任意の利用可能な技術を利用することができる。真核細胞について、適する技術としては、レトロウイルスまたは他のウイルス、例えばワクシニアもしくは、昆虫細胞については、バキュロウイルスを使用する、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気泳動法、リポソーム媒介トランスフェクションおよび形質導入を挙げることができる。細菌細胞について、適する技術としては、バクテリオファージを使用する、塩化カルシウム形質転換、電気泳動法およびトランスフェクションを挙げることができる。
この導入の後、例えば、この遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からからの発現を生じさせることまたは可能にすることができる。
１つの実施形態では、本発明の核酸を宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に組み込む。標準的な技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列を含めることにより、組み込みを促進することができる。
本発明は、上で述べた構築物を発現系において使用して、上述のとおりの特異的結合メンバーまたはポリペプチドを発現させることを含む方法も提供する。
上で述べたように、本発明は、配列番号：２および４；１２９および１３４；２２および２７；３２および３７；ならびに／または４２および４７に示すアミノ酸配列を有する特異的結合メンバー、特に抗体またはこの断片をコードする組換えＤＮＡ分子もしくはクローン化遺伝子、またはこれらの変性変異体にも関し、好ましくは、前記結合メンバーまたは抗体をコードする核酸分子、特に組換えＤＮＡ分子またはクローン化遺伝子は、ヌクレオチド配列を有し、またはこのような配列の１つをコードするＤＮＡ配列に相補的である。
本発明のもう１つの特徴は、本明細書に開示するＤＮＡ配列の発現であろう。当該技術分野において周知であるように、ＤＮＡ配列は、これらを、適切な発現ベクター内の発現制御配列に作動するように連結させること、およびこの発現ベクターを用いて適切な単細胞宿主を形質転換させることによって、発現させることができる。
発現制御配列への本発明のＤＮＡ配列のこのような作動するような連結は、勿論、既に該ＤＮＡ配列の一部ではない場合、該ＤＮＡ配列の上流の正しいリーディングフレーム内に開始コドン、ＡＴＧの提供を含む。
野生品種の宿主／発現ベクターの組み合わせを本発明のＤＮＡ配列の発現に利用することができる。例えば、有用な発現ベクターは、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントから成ることがある。適するベクターとしては、ＳＶ４０および公知の細菌プラスミドの誘導体、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびこれらの誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ファージＸの非常に多数の誘導体、例えばＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３および糸状一本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、例えば、２ｕプラスミドまたはこの誘導体；真核細胞において有用なベクター、例えば、昆虫または哺乳動物細胞において有用なベクター；プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせから誘導されたベクター、例えば、ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を利用するために修飾されたプラスミド；ならびにこれらに類するものが挙げられる。
様々な発現制御配列−これに作動するように連結されたＤＮＡ配列の発現を制御する配列−のいずれかをこれらのベクターにおいて使用して、本発明のＤＮＡ配列を発現させることができる。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマまたはアデノウイルスの初期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、ファージλの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素のためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母接合因子のプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、ならびにこれらの様々な組み合わせが挙げられる。
様々な単細胞宿主細胞も、本発明のＤＮＡ配列の発現に有用である。これらの宿主としては、周知の真核および原核宿主、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、真菌、例えば酵母、および動物細胞、例えばＣＨＯ、ＹＢ／２０、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、Ｒ１．１、Ｂ−ＷおよびＬ−Ｍ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およびＢＭＴ１０）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、ならびにヒト細胞および植物細胞（組織培養でのもの）を挙げることができる。
すべてのベクター、発現制御配列および宿主が、本発明のＤＮＡ配列を発現するために同等に良好に機能するとは限らないであろうことは、理解されるであろう。同じ発現系を用いてすべての宿主が同等に良好に機能するとも限らないであろう。しかし、当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく所望の発現を果たすために過度な実験を伴わずに適切なベクター、発現制御配列、および宿主を選択することができるであろう。例えば、ベクターを選択する際、宿主を考慮しなければならない。ベクターはこの中で機能しなければならないからである。ベクターのコピー数、このコピー数を制御する能力、およびこのベクターによってコードされた任意の他のタンパク質、例えば抗生物質マーカー、の発現も、考慮されるであろう。
発現制御配列を選択する際、通常、様々な要因が考慮されるであろう。これらとしては、例えば、系の相対強度、この制御能力、および発現される特定のＤＮＡ配列または遺伝子との、特に、可能性のある二次構造に関しての、この適合性が挙げられる。適する単細胞宿主は、例えば、選択したベクターとこれらの適合性、これらの選択特性、タンパク質を正しくフォールディングするこれらの能力、およびこれらの発酵要件、ならびに発現されるＤＮＡ配列によってコードされた産物の宿主に対する毒性、および発現産物の精製の容易さを考慮することによって選択されるであろう。
これらおよび他の要因を考慮して、当業者は、発酵を用いてまたは大規模動物培養で本発明のＤＮＡ配列を発現させることとなる様々なベクター／発現制御配列／宿主の組み合わせを構築することができるであろう。
本発明の範囲内で誘導されるタンパク質複合体／サブユニットのヌクレオチド配列から特異的結合メンバー類似体を調製できることをさらに意図している。断片などの類似体は、例えば、特異的結合メンバー材料のペプシン消化によって生産することができる。ムテインなどの他の類似体は、特異的結合メンバーコーディング配列の標準的な部位特異的突然変異誘発によって生産することができる。プロモーターとして機能しようと、阻害剤として機能しようと、小分子などの「特異的結合メンバー活性」を呈示する類似体を、公知のインビボおよび／またはインビトロアッセイによって同定することができる。
上で述べたように、特異的結合メンバーをコードするＤＮＡ配列を、クローニングするのではなく、合成的に調製することができる。特異的結合メンバーアミノ酸配列についての適切なコドンを有するＤＮＡ配列を設計することができる。一般に、この配列を発現に用いることとなる場合、所期の宿主のために好ましいコドンを選択することとなる。標準的な方法によって調製したオリゴヌクレオチドをオーバーラップさせることから完全配列を組み立てて、完全コーディング配列に組み立てる。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：７５６（１９８１）；Ｎａｍｂａｉｒ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３：１２９９（１９８４）；Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：６３１１（１９８４）参照のこと。
合成ＤＮＡ配列は、特異的結合メンバー類似体または「ムテイン」を発現するであろう遺伝子の適便な構築を可能にする。または、天然特異的結合メンバー遺伝子またはｃＤＮＡの部位特異的突然変異誘発によってムテインをコードするＤＮＡを作製することができ、および従来のポリペプチド合成を用いてムテインを直接作製することができる。
タンパク質への非天然アミノ酸の部位特異的組み込みのための一般的な方法は、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｊ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２−１８８（Ａｐｒｉｌ １９８９）に記載されている。この方法を使用して非天然アミノ酸との類似体を作成することができる。
本発明は、翻訳レベルでＥＧＦＲの発現に干渉するために使用することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの調製にわたる。このアプローチは、アンチセンス核酸およびリボザイムを利用して、特定のｍＲＮＡの翻訳を、このｍＲＮＡをアンチセンス核酸でマスクすることまたはリボザイムで開裂させることのいずれかによって阻止する。
アンチセンス核酸は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的であるＤＮＡまたはＲＮＡ分子である（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９９０；Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ，１９８８を参照のこと）。細胞内で、これらは、このｍＲＮＡにハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する。細胞は、この二本鎖形のｍＲＮＡを翻訳しない。従って、アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡのタンパク質への発現に干渉しない。ＡＵＧ開始コドンにハイブリダイズする約１５ヌクレオチドおよび分子のオリゴマーは、特に有効である。これらは、合成が容易であり、および生産細胞に導入すると、より大きな分子より提起する問題が少ない可能性が高いからである。インビトロで多くの遺伝子の発現を阻害するためにアンチセンス法が用いられている（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ，１９８８；Ｈａｍｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。
リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに多少類似した様式で他の一本鎖ＲＮＡ分子を特異的に開裂させる能力を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、一定のｍＲＮＡがこれら特有のイントロンを切除する能力を有するという観察から発見された。これらのＲＮＡのヌクレオチド配列を修飾することにより、研究者らは、ＲＮＡ分子内の特定のヌクレオチド配列を認識し、これを切断する分子を遺伝子工学で作製することができた（Ｃｅｃｈ，１９８８）。これらは配列特異的であるので、特定の配列を有するｍＲＮＡだけが不活性化される。
研究者は、リボザイムの２つのタイプ、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）タイプと「ハンマーヘッド」タイプを同定した（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８８）。テトラヒメナタイプのリボザイムは、４塩基配列を認識し、この一方で「ハンマーヘッド」タイプは、１１から１８塩基配列を認識する。認識配列が長いほど、ターゲットｍＲＮＡ種において排他的に発生する可能性が高い。従って、特異的ｍＲＮＡ配列を不活性化するにはハンマーヘッドタイプのリボザイムのほうがテトラヒメナタイプのリボザイムより好ましく、１８塩基認識配列のほうが、より短い認識配列より好ましい。
このように、本明細書に記載するＤＮＡ配列を使用して、ＥＧＦＲおよびこれらのリガンドについてのｍＲＮＡに対するアンチセンス分子、および該ｍＲＮＡを切断するリボザイムを調製することができる。
本発明を例示するものとして提供する以下の非限定的実施例を参照することにより、本発明をよりよく理解できる。本発明の好ましい実施形態をより十分に例証するために以下の実施例を提示するが、これらを、いかなる点においても、本発明の広い範囲を限定するものとみなしてはならない。
抗体の産生および単離
細胞系
免疫及び特異性分析のために、天然のものである、または正常、野生型もしくは「ｗｔＥＧＦＲ」遺伝子でまたはΔ２−７欠失突然変異を有するΔＥＧＦＲ遺伝子でトランスフェクトされたものである、幾つかの細胞系を使用した：マウス線維芽細胞系ＮＲ６、ＮＲ６ΔＥＧＦＲ（ΔＥＧＦＲでトランスフェクトされたもの）およびＮＲ６ｗｔＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲでトランスフェクトされたもの）、ヒト膠芽腫細胞系Ｕ８７ＭＧ（低レベルの内因性ｗｔＥＧＦＲを発現しているもの）、Ｕ８７ＭＧｗｔＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲでトランスフェクトされたもの）、Ｕ８７ＭＧΔＥＧＦＲ（ΔＥＧＦＲでトランスフェクトされたもの）、ならびにヒト扁平上皮細胞癌腫細胞系Ａ４３１（高レベルのｗｔＥＧＦＲを発現する。）。
免疫および特異性分析のために、天然のものである、または正常、野生型もしくは「ｗｔＥＧＦＲ」遺伝子でまたはｄｅ２０７もしくはΔ２−７欠失突然変異を有するΔＥＧＦＲ遺伝子でトランスフェクトされたものである、幾つかの細胞系を使用した：マウス線維芽細胞系ＮＲ６、ＮＲ６ΔＥＧＦＲ（ΔＥＧＦＲでトランスフェクトされたもの）およびＮＲ６ｗｔＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲでトランスフェクトされたもの）、ヒト膠芽腫細胞系Ｕ８７ＭＧ（低レベルの内因性ｗｔＥＧＦＲを発現しているもの）、Ｕ８７ＭＧｗｔＥＧＦＲまたは「Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ」（ｗｔＥＧＦＲでトランスフェクトされたもの）、Ｕ８７ＭＧΔＥＧＦＲまたは「Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７」（ΔＥＧＦＲでトランスフェクトされたもの）、ならびにヒト扁平上皮細胞癌腫細胞系Ａ４３１（高レベルのｗｔＥＧＦＲを発現する。）。ＮＲ６、ＮＲ６ΔＥＧＦＲ、およびＮＲ６ｗｔＥＧＦＲ細胞系は、以前に記載されている（Ｂａｔｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，Ｕｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ，Ｃｅｌｌ−Ｔｒａｎｆｏｒｍｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｎｔ ＥＧＦＲｖＩＩＩ Ｇｅｎｅ．Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．６（１０）：１２５１−１２５９）。ＮＲ６細胞系には正常内因性ＥＧＦＲがない（Ｂａｔｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。Ｕ８７ＭＧ細胞系およびトランスフェクションは、以前に記載されている（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａ ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ ｃｏｎｆｅｒｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，７７２７−７７３１）。
低レベルのｗｔＥＧＦＲを内因的に発現するＵ８７ＭＧ星状細胞腫細胞系（Ｐｏｎｔｅｎ，Ｊ．ａｎｄ Ｍａｃｉｎｔｙｒｅ，Ｅ．Ｈ．（１９６８）Ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｇｌｉａ．Ａｃｔａ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．７４，４６５−８６）を、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを含有するレトロウイルスで感染させて、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞系を生産した（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。トランスフェクトされた細胞系Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲを、Ｎａｇａｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６，５０７９−５０８６に記載されているように生産した。Ｕ８７ＭＧ細胞は、おおよそ１×１０５のＥＧＦＲを発現するに対して、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞は、おおよそ１×１０６のＥＧＦＲを発現し、従って、遺伝子増幅で見られる状況によく似ている。いずれの公知ＥＧＦＲ関連分子も発現しないマウスプロＢ細胞系ＢａＦ／３もｄｅ２−７ ＥＧＦＲでトランスフェクトし、結果としてＢａＦ／３．Δ２−７細胞系を得た（Ｌｕｗｏｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｒｉｄ ｄｅ２−７ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃｅｌｌｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ＥＧＦＲ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３：６０９５−６１０４）。ヒト扁平上皮癌腫Ａ４３１細胞をＡＴＣＣ（メリーランド州ロックヴィル）から入手した。類表皮癌腫細胞系Ａ４３１は、以前に記載されている（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓａｙ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４６，６３−８１）。
１０％ＦＣＳ（ＣＳＬ，オーストラリア、メルボルン）；２ｍＭ グルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州グランドアイランド）を補足したＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、オーストラリア、メルボルンおよびニューヨーク州グランドアイランド）を伴うＤＭＥＭ／Ｆ−１２において、すべての細胞系を培養した。加えて、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞系を、４００ｍｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、オーストラリア、ヴィクトリア州メルボルン）中で維持した。細胞系を５％ＣＯ２の未変性雰囲気において３７℃で成長させた。
試薬
ｄｅ２−７ ＥＧＦＲユニーク接合点ペプチドは、アミノ配列：ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨ（配列番号：１３）を有する。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲからビオチン化された特有の接合点ペプチド（ビオチン−ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨ（配列番号：５）およびＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨ−ビオチン（配列番号：６））を標準的なＦｍｏｃケミストリーによって合成し、逆相ＨＰＬＣおよび質量スペクトル分析（Ａｕｓｐｅｐ、オーストラリア、メルボルン）によって純度（＞９６％）を判定した。
研究において使用した抗体
他の試薬での本発明者らの調査結果と比較するために、本発明者らの研究に追加のｍＡｂを含めた。これらの試薬は、ｗｔＥＧＦＲに対するｍＡｂ５２８（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１（５），５１１−５２９）、およびΔ２−７ ＥＧＦＲ欠失突然変異の接合点配列にわたる合成ペプチドに対して産生されたＤＨ８．３であった。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲに対して特異的である前記ＤＨ８．３抗体（ＩｇＧ１）は、以前に記載されており（Ｈｉｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ，ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．６３，５３７−４３，１９９５）、およびｄｅ２−７ ＥＧＦＲにおいて見つけられる特有の接合点ペプチドでのマウスの免疫処置（Ｈｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５）後に該抗体を得た。
ｄｅ２−７ ＥＧＦＲと野生型ＥＧＦＲの両方を認識する５２８抗体は、以前に記載されており（Ｍａｓｕｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｔｈｙｍｉｃ ｍｉｃｅ ｂｙ ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４４，１００２−７）、および米国微生物系統保存機関（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（メリーランド州ロックヴィル）から入手したハイブリドーマ（ＡＴＣＣ ＨＢ−８５０９）を使用してＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅｒｃｈ（オーストラリア、メルボルン）において該抗体を生産した。ポリクローナル抗体ＳＣ−０３は、ＥＧＦＲのカルボキシ末端ペプチドに対して産生されたアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体である（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）。
抗体産生
マウス線維芽細胞系ＮＲ６ΔＥＧＦＲを免疫原として使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに２から３週間隔でアジュバント中の５×１０５−２×１０６個の細胞での免疫処置を５回、皮下的に施すことにより、マウスハイブリドーマを産生させた。完全フロイントアジュバントを初回注射に使用した。その後、不完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ（商標）、カンザス州ローレンスのＶｏｉｇｔ Ｇｌｏｂａｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を使用した。免疫処置を施したマウスからの脾細胞をマウス骨髄腫細胞系ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７６：２６９−２７０）と融合させた。新たに産生されたクローンの上清を、血球吸着アッセイにおいて、ＮＲ６、ＮＲ６ｗｔＥＧＦＲおよびＮＲ６ΔＥＧＦＲとの反応性についてスクリーニングし、ヒト膠芽腫細胞系Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧｗｔＥＧＦＲおよびＵ８７ＭＧΔＥＧＦＲを用いて血球吸着アッセイにより分析した。その後、選択されたハイブリドーマ上清をウエスタンブロッティングによって試験し、免疫組織化学によってさらに分析した。予想した反応性を示した、新たに産生されたｍＡｂを精製した。
５つのハイブリドーマを確率し、ロゼット赤血球凝集アッセイにおけるＮＲ６ΔＥＧＦＲでの高い力価（１：２５００）ならびにＮＲ６およびＮＲ６ｗｔＥＧＦＲ細胞の低いバックグラウンドに基づくさらなる特性づけのために３つのクローン、１２４（ＩｇＧ２ａ）、８０６（ＩｇＧ２ｂ）および１１３３（ＩｇＧ２ａ）を先ず選択した。第四のクローン、その後、１７５（ＩｇＧ２ａ）をさらに特性づけした。これは、別途、下の実施例２３において論ずる。その後の赤血球凝集分析において、これらの抗体は、天然ヒト膠芽腫細胞系Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧｗｔＥＧＦＲとの反応性を示さなかった（未希釈上清≦１０％）が、Ｕ８７ＭＧΔＥＧＦＲとの強反応性であり；Ａ４３１との反応性は、あまり見られなかった。対照的に、ＦＡＣＳ分析では、８０６は天然Ｕ８７ＭＧと非反応性であり、Ｕ８７ＭＧΔＥＧＦＲを強く染色し、より低い程度にＵ８７ＭＧｗｔＥＧＦＲを染色した。このことは、ΔＥＧＦＲとｗｔＥＧＦＲの両方への８０６の結合を示している（下記参照）。
次に、ウエスタンブロットアッセイにおいて、ｍＡｂ１２４、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１１３３をｗｔＥＧＦＲおよびΔＥＧＦＲとの反応性について分析した。洗剤溶解産物をＮＲ６ΔＥＧＦＲ、Ｕ８７ＭＧΔＥＧＦＲからならびにＡ４３１から抽出した。３つのｍＡｂすべてが、ｗｔＥＧＦＲタンパク質（１７０ｋＤａ）とΔＥＧＦＲタンパク質（１４０ｋＤａ）の両方を染色する細胞溶解産物に類似した反応性パタンを示した。基準試薬として、ｗｔＥＧＦＲと反応性であることが公知である（Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０（２），１４９−１６１）ｍＡｂＲ．Ｉ．を、ウエスタンブロット分析において非反応性であることが公知であるｍＡｂ５２８の代わりに使用した。ｍＡｂＲ．Ｉ．は、野生型およびΔＥＧＦＲとの反応性を示した。３つの新たに酸性されたクローンすべてが、ΔＥＧＦＲとの反応性およびｗｔＥＧＦＲとのあまり強くない反応性を示した。Ｕ８７ＭＧΔＥＧＦＲおよびＮＲ６ΔＥＧＦＲの溶解産物においてＤＨ８．３のみが陽性であった。
異種移植片腫瘍Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧΔＥＧＦＲおよびＡ４３１に関するクローン１２４、８０６および１１３３ならびにｍＡｂ５２８およびｍＡｂＤＨ８．３の免疫組織化学分析を表１に示す。すべてのｍＡｂが、異種移植片Ｕ８７ＭＧΔＥＧＦＲの強い染色を示した。ｍＡｂ５２８だけは、天然Ｕ８７ＭＧ異種移植片において弱い反応性を示した。Ａ４３１異種移植片では、ｍＡｂ５２８は、強い均質な反応性を示した。ｍＡｂ１２４、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１１３３は、Ａ４３１の扁平上皮細胞癌腫の主として基底部に位置する細胞との反応性を見せ、上部細胞層および角化成分とは反応しなかった。ＤＨ８．３は、Ａ４３１異種移植片において陰性であった。
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 内因性マウス抗体の検出のため微量間質染色
シークエンシング
ｍＡｂ８０６、ｍＡｂ１２４およびｍＡｂ１１３３の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）をシークエンシングし、これらの相補性決定領域（ＣＤＲ）を下記のとおり同定した：
ｍＡｂ８０６
ｍＡｂ８０６ＶＨ鎖：核酸配列（配列番号：１）、およびシグナルペプチドを伴うアミノ酸配列（配列番号：２）を図１４Ａおよび１４Ｂにそれぞれ示す（図１４Ｂではシグナルペプチドに下線を引く）。図１６では下線を引くことにより相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（それぞれ、配列番号：１５、１６および１７）を指摘する。このシグナルペプチドなしでのｍＡｂ８０６ ＶＨ鎖アミノ酸配列（配列番号：１１）を図１６に示す。
ｍＡｂ８０６ ＶＬ鎖：核酸配列（配列番号：３）、およびシグナルペプチドを伴うアミノ酸配列（配列番号：４）を図１５Ａおよび１５Ｂにそれぞれ示す（図１５Ｂではシグナルペプチドに下線を引く）。図１７では下線を引くことにより相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（それぞれ、配列番号：１８、１９および２０）を指摘する。このシグナルペプチドなしでのｍＡｂ８０６ ＶＬ鎖アミノ酸配列（配列番号：１２）を図１７に示す。
ｍＡｂ１２４
ｍＡｂ１２４ ＶＨ鎖：核酸（配列番号：２１）アミノ酸（配列番号：２２）配列を図５１Ａおよび５１Ｂにそれぞれ示す。下線を引くことにより相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（それぞれ、配列番号：２３、２４および２５）を指摘する。
ｍＡｂ１２４ ＶＬ鎖：核酸（配列番号：２６）アミノ酸（配列番号：２７）配列を図５１Ｃおよび５１Ｄにそれぞれ示す。下線を引くことにより相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（それぞれ、配列番号：２８、２９および３０）を指摘する。
ｍＡｂ１１３３
ｍＡｂ１１３３ ＶＨ鎖：核酸（配列番号：３１）アミノ酸（配列番号：３２）配列を図５２Ａおよび５２Ｂにそれぞれ示す。下線を引くことにより相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（それぞれ、配列番号：３３、３４および３５）を指摘する。
ｍＡｂ１１３３ ＶＬ鎖：核酸（配列番号：３６）アミノ酸（配列番号：３７）配列を図５２Ｃおよび５２Ｄにそれぞれ示す。下線を引くことにより相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（それぞれ、配列番号：３８、３９および４０）を指摘する。
ＦＡＣＳによる細胞系への抗体の結合
本明細書および以下の実施例に示すように、さらなる特性づけのためにｍＡｂ８０６を先ず選択した。下の実施例２６において論じるように、ｍＡｂ１２４およびｍＡｂ１１３３もさらなる特性づけのために選択し、ここで論ずるｍＡｂ８０６の特有の特性に対応する特性を有することが判明した。
ｍＡｂ８０６の特異性を判定するために、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞へのこの結合を、ｆｌｏｗ活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって分析した。簡単に言うと、以前に記載されている（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）ように、細胞を適切な抗体（１０μｇ／ｍＬ）で標識し、その後、フルオレセインコンジュゲート型ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１００希釈；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国、カリフォルニア州サンディエゴ；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、米国、カリフォルニア州サンディエゴ）によって標識した。Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ Ｅｌｉｔｅ ＥＳＰを用いて最低５，０００事象を観察することによってＦＡＣＳデータを得、Windows(登録商標）用ＥＸＰＯ（バージョン２）を使用して分析した。無関係なＩｇＧ２ｂをｍＡｂ８０６のためのアイソタイプ対照として含め、ｄｅ２−７とｗｔＥＧＦＲの両方を認識するので５２８抗体を含めた。
５２８抗体のみが親Ｕ８７細胞系を染色することができた（図１）。このことは、これらの細胞がｗｔＥＧＦＲを発現することを実証した以前の報告（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ，１９９４）と一致している。ｍＡｂ８０６およびＤＨ８．３は、対照抗体に類似した結合レベルを有した。このことは、これらが野生型受容体に結合できないことを明示している（図１）。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞へのアイソタイプ対照抗体の結合は、Ｕ８７ＭＧ細胞について観察されたものと類似していた。
ｍＡｂ８０６は、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞を染色した。このことは、ｍＡｂ８０６がｄｅ２−７ ＥＧＦＲおよび増幅されたＥＧＦＲを特異的に認識することを示している（図１）。ＤＨ８．３抗体は、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞を染色した。このことにより、ＤＨ８．３抗体がｄｅ２−７ ＥＧＦＲを特異的に認識することが確証される（図１）。予想どおり、５２８抗体は、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞系を両方とも染色した（図１）。予想どおり、５２８抗体は、親細胞より高い強度でＵ８７ＭＧ．Δ２−７を染色した。これが、これらの細胞で共発現されるｄｅ２−７および野生型受容体両方に結合するからである（図１）。ターゲット細胞へのヒト赤血球（Ｏ型）でコーティングされたプロテインＡの出現により表面結合ＩｇＧを検出するプロテインＡ混合血球吸着を用いて、類似した結果を得た。モノクローナル抗体８０６は、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７と反応性であったが、野生型ＥＧＦＲを発現するＵ８７ＭＧとの有意な反応性を示さなかった（未希釈上清 １０％未満）。重要なことに、ｍＡｂ８０６は、ＢａＦ／３．Δ２−７細胞系にも結合した。このことは、ｗｔＥＧＦＲの共発現がｍＡｂ８０６反応性の必要条件でないことを明示している（図１）。
アッセイにおける抗体の結合
ｍＡｂ８０６およびＤＨ８．３抗体の特異性をさらに特性づけするために、これらの結合をＥＬＩＳＡによって検査した。２つのタイプのＥＬＩＳＡを用いて抗体の特異性を判定した。第一のアッセイでは、プレートをｓＥＧＦＲ（０．１Ｍ炭酸バッファーｐＨ９．２中、１０μｇ／ｍＬ）で２時間コーティングし、その後、ＰＢＳ中の２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）でブロックした。ｓＥＧＦＲは、野生型ＥＧＦＲの組換え細胞外ドメイン（アミノ酸１−６２１）であり、これを以前に記載されたとおりに生産した（Ｄｏｍａｇａｌａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ，ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ．１８，１１−２９）。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中２％ＨＳＡ中の漸増濃度で抗体をウエルに三重反復で添加した。基質としてＡＢＴＳ（Ｓｉｇｍａ、オーストラリア、シドニー）と４０５ｎｍで測定した吸光度とを使用して、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート型ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｌｅｎｕｓ、オーストラリア、メルボルン）により、結合抗体を検出した。
ｍＡｂ８０６抗体と５２８抗体の両方が、固定化野生型ｓＥＧＦＲに対して用量依存性の飽和結合曲線を提示した（図２Ａ）。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲにおいて見つけられる特有の接合点ペプチドはｓＥＧＦＲに含有されないので、ｍＡｂ８０６は、野生型ＥＧＦＲ配列内に位置するエピトープに結合していなければならない。５２８抗体の結合は、ｍＡｂ８０６抗体について観察されたものより低かった。おそらく、これが高次構造決定基を認識するからである。予想どおり、ＤＨ８．３抗体は、１０μｇ／ｍＬまでの濃度でさえ、野生型ｓＥＧＦＲに結合しなかった（図２Ａ）。溶解状態のｓＥＧＦＲは、固定化ｓＥＧＦＲへの５２８抗体の結合を用量依存様式で阻害したが、ｍＡｂ８０６への結合を阻害することができなかった（図２Ｂ）。このことは、ｍＡｂ８０６が、ＥＬＩＳＡプレートに固定化されると野生型ＥＧＦＲにしか結合できないこと、高次構造変化を誘導し得る方法を示唆している。ＢＩＡｃｏｒｅを用いて、ｍＡｂ８０６は固定化ｓＥＧＦＲに結合するが、固定化ｍＡｂ８０６は溶解状態のｓＥＧＦＲに結合できないという同様の結果が観察された（図２Ｃ）。
１０分間９５℃での加熱による変性後、溶解状態のｓＥＧＦＲは、固定化ｓＥＧＦＲへのｍＡｂ８０６の結合を阻害できなかった（図２Ｃ）。このことにより、ｍＡｂ８０６は一定の条件下で野生型ＥＧＦＲに結合できることが確証される。興味深いことに、変性されたｓＥＧＦＲは、５２８抗体の結合を阻害できなかった（図２Ｃ）。このことは、この抗体が高次構造エピトープを認識することを明示している。ＤＨ８．３抗体は、特有のｄｅ２−７ ＥＧＦＲペプチドへの用量依存的な可飽和結合を示した（図２Ｄ）。ｍＡｂ８０６抗体と５２８抗体の両方が、ＤＨ８．３の飽和結合を達成するために用いられるものより高い濃度ででさえ、前記ペプチドに結合しなかった。このことは、ｍＡｂ８０６がこのペプチド内のエピトープ決定基を認識しないことを、さらに示している。
第二のアッセイにおいて、ビオチン化ｄｅ２−７特異的ペプチド（ビオチンＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨ（配列番号：５））は、ストレプタビジンでプレコートされたＥＬＩＳＡプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）に結合しなかった。第一のアッセイの場合のように抗体を結合させ、検出した。ｍＡｂ８０６抗体と５２８抗体の両方が、ＤＨ８．３の飽和結合を達成するために用いたものより高い濃度ででさえ、前記ペプチドに結合しなかった。このことは、ｍＡｂ８０６がこのペプチド内のエピトープ決定基を認識しないことを、さらに示している。
ｍＡｂ８０６が、前記接合点ペプチドとは異なるエピトープを認識することをさらに実証するために、追加の実験を行った。Ｃ末端ビオチン化ｄｅ２−７ペプチド（ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨ−ビオチン（配列番号：６））を、ｍＡｂ８０６およびこのｄｅ２−７ペプチドに対して産生させたｍＡｂＬ８Ａ４（Ｒｅｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（１９），４３７５−４３８２；Ｆｏｕｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０（１６），４４５３−４４６０）と共に、研究において用いた。
ペプチド研究において用いた試薬
接合点ペプチド：ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨ−ＯＨ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、カリフォルニア州カマリロ）；
ペプチドＣ：ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨ（Ｋ−Ｂｉｏｔ）−ＯＨ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、カリフォルニア州カマリロ）；
ｓＥＧＦＲ：野生型ＥＧＦＲのＣＨＯ細胞由来組換え可溶性細胞外ドメイン（アミノ酸１−６２１）（ＬＩＣＲ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）；
ｍＡｂ８０６：マウスモノクローナル抗体、ＩｇＧ２ｂ（ＬＩＣＲ ＮＹＢ）；
ｍＡｂＬ８Ａ４：マウスモノクローナル抗体、ＩｇＧ１（Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；
ＩｇＧ１アイソタイプ対照ｍＡｂ；
ＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照ｍＡｂ。
ペプチドＣをストレプタビジン・マイクロセンサー・チップに３５０ＲＵ（＋／−３０ＲＵ）の表面密度で固定化した。ｍＡｂの系列希釈物をこのペプチドとの反応について試験した。非ビオチン化ペプチドを使用する遮断実験を行って、特異性を評定した。
ｍＡｂＬ８Ａ４は、低い抗体濃度（６．２５Ｍ）ででさえ、ペプチドＣとの強い反応性を示した（図２Ｅ）。ｍＡｂ８０６は、１００ｎＭ（試験した最高濃度）の抗体濃度までペプチドＣとの検出可能な特異的反応性を示さなかった（図２Ｅおよび２Ｆ）。ｍＡｂＬ８Ａ４がペプチドＣと反応することは予想された。このペプチドをｍＡｂＬ８Ａ４の産生の際に免疫原として使用したからである。接合点ペプチド（非ビオチン化、５０μｇ／ｍＬ）の添加は、ｍＡｂＬ８Ａ４とペプチドＣの反応性を完全に遮断する。このことにより、接合点ペプチドエピトープに対するこの抗体の特異性が確証される。
ＢＩＡｃｏｒｅ実験の第二のセットでは、ｓＥＧＦＲをＣＭマイクロセンサーチップ上に、〜４０００ＲＵの表面密度で固定化した。ｍＡｂの系列希釈物をｓＥＧＦＲとの反応性について試験した。
ｍＡｂ８０６は、変性されたｓＥＧＦＲと強反応性であったが、ｍＡｂＬ８Ａ４は、変性されたｓＥＧＦＲと反応しなかった。変性されたｓＥＧＦＲとｍＡｂ８０６の反応性は、抗体濃度の減少に伴って減少する。ｍＡｂＬ８Ａ４がｓＥＧＦＲと反応しないことは予想された。接合点ペプチドを免疫原として使用してｍＡｂＬ８Ａ４を産生させたからであり、ｓＥＧＦＲは接合点ペプチドを含有しないからである。
ドットブロット免疫染色実験も行った。ペプチドの系列希釈物をＰＶＤＦまたはニトロセルロース膜上に０．５μＬでスポッティングした。ＰＢＳ中の２％ＢＳＡで膜をブロックし、その後、８０６、Ｌ８Ａ４、ＤＨ８．３および対照抗体でプローブした。抗体Ｌ８Ａ４およびＤＨ８．３は、膜上のペプチドに結合した（データを示さない。）。ｍＡｂ８０６は、Ｌ８Ａ４が結合を明確に示した濃度で、ペプチドに結合しなかった（データを示さない。）。対照抗体もペプチド結合について陰性であった。
ｍＡｂ８０６は、免疫ブロッティングに従って細胞溶解産物中のｗｔＥＧＦＲに結合した（結果を示さない。）。このことは、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲと反応するがｗｔＥＧＦＲと反応しないＤＨ８．３抗体で得られた結果とは異なる。従って、ｍＡｂ８０６は、変性後にｗｔＥＧＦＲを認識することができるが、この受容体がこの天然状態で細胞表面にあるときには認識することができない。
スキャッチャード解析
各抗体の相対親和性を判定するために、免疫反応についての補正後、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞を使用するスキャッチャード解析を行った。抗体をＣｈｌｏｒａｍｉｎｅ Ｔ法により１２５Ｉ（Ａｍｒａｄ、オーストラリア、メルボルン）で標識し、Ｌｉｎｄｍｏアッセイ（Ｌｉｎｄｍｏ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｌｉｎｅａｒ ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｔ ｉｎｆｉｎｉｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｃｅｓｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．７２，７７−８９）により免疫反応性を判定した。
１％ＨＳＡ／ＰＢＳ中で、１−２×１０６の生Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７またはＡ４３１細胞を用いて、９０分間、４℃で穏やかに回転させながらすべての結合アッセイを行った。１０ｎｇ／ｍＬの設定濃度の１２５Ｉ標識抗体を、漸増濃度の適切な未標識抗体の存在下で使用した。１０，０００倍過剰の未標識抗体の存在下で非特異的結合を判定した。１２５Ｉ放射標識ｍＡｂ８０６およびＤＨ８．３Ｈ抗体両方が、親Ｕ８７ＭＧ細胞に結合しなかった。温置が完了した後、細胞を洗浄し、ＣＯＢＲＡ ＩＩガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、米国、コネチカット州メリデン）を使用して結合１２５Ｉ標識抗体について計数した。
ｍＡｂ８０６およびＤＨ８．３抗体両方が、ヨウ素化されたとき高い免疫反応性を保持し、典型的に、ｍＡｂ８０６については９０％より大きく、およびＤＨ８．３抗体については４５−５０％であった。ｍＡｂ８０６は、１．１×１０９Ｍ−１のｄｅ２−７ ＥＧＦＲ受容体に対する親和性を有したのに対し、ＤＨ８．３の親和性は、１．０×１０８Ｍ−１で数１０倍低かった。ヨウ素化された抗体もＵ８７ＭＧ親細胞に結合しなかった。ｍＡｂ８０６は、１細胞につき平均で２．４×１０５の結合部位を認識し、ＤＨ８．３抗体は、平均で５．２×１０５部位に結合した。このように、抗体間に受容体数の良好な一致があるばかりでなく、以前の報告（Ｒｅｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｎｔ ＩＩＩ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ａｆｔｅｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ５−ｉｏｄｏ−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７，１５１０−５）では同じ細胞系に対して異なるｄｅ２−７ ＥＧＦＲ特異的抗体により測定して１細胞につき２．５×１０５のｄｅ２−７受容体を示した。
Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞による抗体の内在化
ターゲット細胞への結合後の抗体内在化率は、この腫瘍ターゲッティング特性と治療選択肢の両方に影響を及ぼす。それ故、本発明者らは、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞への結合後のｍＡｂ８０６およびＤＨ８．３抗体の内在化をＦＡＣＳによって検査した。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞をｍＡｂ８０６抗体またはＤＨ８．３抗体（１０μｇ／ｍＬ）のいずれかと共に１時間、ＤＭＥＭ中、４℃で温置した。洗浄後、３７℃に予熱したＤＭＥＭに細胞を移し、３７℃での温置後の様々な時点でアリコートを取った。氷冷した洗浄バッファー（１％ＨＳＡ／ＰＢＳ）でアリコートを直ちに洗浄することにより、内在化を停止させた。この時間経過の完了時、上で説明したようにＦＡＣＳにより細胞を染色した。式：内在化した抗体＝（時間ｘでの平均蛍光−バックグラウンド蛍光）／（時間０での平均蛍光−バックグラウンド蛍光）×１００を用いて様々な時点での表面抗体染色をゼロ時と比較することにより、内在化百分率を算出した。この方法を、以前に記載されているような（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｎａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２９２７−３５）内在化を測定するためにヨウ素化抗体（ｍＡｂ８０６）を使用する１つのアッセイにおいて検証した。異なる時点での内在化率の差を、スチューデントｔ検定を用いて比較した。この研究を通して、ウィルコキソン分析により分析したインビボ生存アッセイを除き、データをスチューデントｔ検定により有意性について分析した。
両方の抗体は、ｍＡｂ８０６については１０分およびＤＨ８．３については３０分で定常状態レベルに達する、比較的急速な内在化を示した（図３）。ＤＨ８．３の内在化のほうが、率（ｍＡｂ８０６についての３６．８％と比較して１０分の時点で内在化されたＤＨ８．３ ８０．５％、ｐ＜０．００１）の点でも、６０分の時点で内在化された総量（９３．５％対３０．４％、ｐ＜０．００１）の点でも、有意に高かった。ｍＡｂ８０６は、行った４つすべてのアッセイにおいて２０分と比較して３０および６０分で有意に低い内在化レベルを示した（図３）。このことは、ヨウ素化ｍＡｂ８０６に基づく内在化アッセイを用いても確認された（データを示さない。）。
抗体内在化の電子顕微鏡分析
抗体間の内在化率に関する上で述べた差にかんがみて、電子顕微鏡を用いて抗体細胞内輸送の詳細な分析を行った。
Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞を、ゼラチンコートチャンバースライド（Ｎｕｎｃ、イリノイ州ネーパーヴィル）で集密度８０％に成長させ、その後、氷冷ＤＭＥＭで洗浄した。その後、細胞をｍＡｂ８０６またはＤＨ８．３抗体と共にＤＭＥＭ中で４５分間、４℃で温置した。洗浄後、細胞をさらに３０分間、金コンジュゲート型（２０ｎｍ粒子）抗マウスＩｇＧ（ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、英国、カーディフ）と共に４℃で温置した。さらなる洗浄後、予熱したＤＭＥＭ／１０％ＰＣＳを細胞に添加し、これを３７℃で、１−６０分の様々な時間、温置した。氷冷培地により抗体の内在化を停止させ、ＰＢＳ／０．１％ＨＳＡ中の２．５％グルタルアルデヒドで細胞を固定し、その後、２．５％四酸化オスミウムで後固定した。アセトンの段階的系列による脱水後、サンプルをＥｐｏｎ／Ａｒａｌｄｉｔｅ樹脂に包埋し、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｕｌｔｒａｃｕｔ−Ｓマイクロトーム（Ｌｅｉｃａ）で超薄切片として切断し、ニッケルグリッドで回収した。これらの切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した後、Ｐｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１２透過型電子顕微鏡を用いて８０ｋＶで視検した。カイ二乗検定を用いて、被覆小窩内に含有された金粒の統計解析を行った。
ＤＨ８．３抗体は、主に被覆小窩により内在化された一方で、ｍＡｂ８０６は、マクロピノサイトーシスによって内在化されるように見えた（図１９）。実際、ｍＡｂ８０６と共に温置した細胞において形成された３２の被覆小窩の詳細な分析は、これらのいずれも抗体を含有しないことを示した。対照的に、ＤＨ８．３と共に温置した細胞からのすべての被覆小窩の約２０％は、抗体について陽性であり、多数の金粒を含有するものがあった。被覆小窩内に含有される金粒の総数の統計解析により、この差は非常に有意である（ｐ＜０．０１）であることが判明した。２０−３０分後、両方の抗体を形態学的にリボソームに似ている構造で見ることができた（図１９Ｃ）。これらの構造内の細胞破壊片の存在もこれらのリボソーム性と一致していた。
腫瘍保有ヌードマウスにおける抗体の生体内分布
Ｕ８７ＭＧ異種移植片を一方の体側におよびＵ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片を他方の体側に有するヌードマウスにおいて、ｍＡｂ８０６およびＤＨ８．３抗体の生体内分布を比較した。ＤＨ８．３抗体が４−２４時間の間に腫瘍ターゲッティングのピークレベルを示すことが以前の報告（Ｈｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ， ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．６３，５３７−４３）により実証されているので、この研究に比較的短期間を選んだ。
ヌードＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて３×１０６ Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７またはＡ４３１細胞のｓ．ｃ．注射により腫瘍異種移植片を確率した。様々な時点で免疫組織化学により測定して、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片におけるｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現は、生体分布期間全体を通して安定したままであった（データを示さない。）。Ａ４３１細胞は、免疫組織化学により判定して、腫瘍異種移植片として成長したときこれらのｍＡｂ８０６反応性を保持していた。Ｕ８７ＭＧまたはＡ４３１細胞を一方の体側に注射し、この７−１０日後にＵ８７ＭＧ．Δ２−７細胞を他方の体側に注射した。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現性異種移植片のほうが、成長速度が速いからである。上で説明したように抗体を放射標識して免疫反応性について評定し、腫瘍が１００−２００ｍｇの重量になったら眼窩後方経路によりマウスに注射した。各マウスが２つの異なる抗体（１抗体につき２μｇ）を受けた：２μＣｉの１２５Ｉ−標識ｍＡｂ８０６および２μＣｉの１３１Ｉ−標識ＤＨ８．３または５２８。指示されていない限り、５匹の群を注射後の様々な時点で犠牲にし、心穿刺により血液を得た。腫瘍、肝臓、脾臓、腎臓および肺を切開により得た。すべての組織を計量し、デュアル・チャネル・カウンティングＷｉｎｄｏｗを用いて１２５Ｉおよび１３１Ｉ活性についてアッセイした。データを、それぞれの抗体について、注射用量標準との比較により決定した％ＩＤ／ｇ腫瘍として表すか、腫瘍対血液／肝臓比（即ち、％ＩＤ／ｇ血液もしくは肝臓で割った％ＩＤ／ｇ腫瘍）に変換した。群間の差をスチューデントｔ検定によって分析した。放射標識ｍＡｂ８０６の注射後、一部の腫瘍をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、５，μｍ切片に切断し、その後、Ｘ線フィルム（ＡＧＦＡ、ベルギー、モルツェル）に感光させて、オートラジオグラフィーにより抗体局在を判定した。
％ＩＤ／ｇ腫瘍の点から見ると、ｍＡｂ８０６は、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片において８時間で１８．６％ｍ／ｇ腫瘍のこのピークレベルに達し（図４）、血液を除く他のいずれの組織より相当高度であった。ＤＨ８．３も８時間でピーク腫瘍レベルを示したが、このレベルは、ｍＡｂ８０６と比較して統計的に（ｐ＜０．００１）低い８．８％ｍ／ｇ腫瘍であった（図４Ｂ）。両方の抗体のレベルは、２４および４８時間でゆっくりと低下した。１２５Ｉ標識ｍＡｂ８０６を単独で注射した８時間後に収集したＵ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片組織切片のオートラジオグラフィーは、生存腫瘍への抗体の局在を明らかに示している（図２０）。いずれの抗体もＵ８７ＭＧ親異種移植片の特異的ターゲッティングを示さなかった（図４Ａおよび４Ｂ）。腫瘍対血液／肝臓比に関して、ｍＡｂ８０６は、２４時間の時点で血液（１．３の比）および肝臓（６．１の比）の両方に対する最高比率を示した（図５Ａおよび５Ｂ）。ＤＨ８．３抗体は、この最高比を血液に関しては８時間で（０．３８の比）および肝臓に関しては２４時間で（１．５の比）示した（図５Ａおよび５Ｂ）。これらの用法が、ｍＡｂ８０６について得られた値より相当低い。
上で説明したように、腫瘍におけるｍＡｂ８０６のレベルは、８時間でピークに達した。このピークは、多くの腫瘍ターゲッティング抗体と比較して相対的に早いが、これは、同様の容量の抗体を使用して注射後４−２４時間の時点ですべてがピークを示すｄｅ２−７ ＥＧＦＲ特異的抗体を使用する他の研究（Ｈｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｒｅｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｒｅｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ５−ｉｏｄｏ−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６，４９７０−７）と完全に一致している。実際には、以前の報告とは異なり、抗体ターゲッティングが急速にピークに達するであろうという仮定のもとに、８時間時点を含めた。ｍＡｂ８０６で見られた％ＩＤ／ｇ腫瘍は、標準的なヨウ素化技術を用いて他のｄｅ２−７ ＥＧＦＲ特異的抗体について報告されたもの（Ｈｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｒｅｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｎｔ ＩＩＩ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｙｒａｍｉｎｅ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５，４３７５−８２）に類似していた。
この早期ピークの理由は、おそらく二通りある。第一に、トランスフェクトされたＵ８７ＭＧ細胞を含む、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する腫瘍は、腫瘍異種移植片として極めて急速に成長する。従って、これらの生体内分布研究において使用した比較的短い期間の間でさえ、腫瘍サイズは、成長の緩慢な腫瘍と比較して％ＩＤ／ｇ腫瘍が低減されるような程度まで増加する（４日間で質量の５−１０倍増加）。第二に、ｍＡｂ８０６の内在化は、ＤＨ８．３と比較すると相対的に緩慢であったが、多くの他の腫瘍抗体／抗原系に対しては依然として急速であった。内在化された抗体は、細胞から排出される分解産物での急速なタンパク質分解を受ける（Ｐｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ｉｏｎｏｐｈｏｒｅｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０，１２４３−５０）。内在化、分解および排出のこの方法が、細胞内に保持されたヨウ素化抗体の量を減少させる。この結果、内在化する抗体は、これらの内在化しない対応品より低いターゲッティングレベルを示す。本明細書において報告する電子顕微鏡データは、内在化されたｍＡｂ８０６がリソソームに急速に輸送される、そこで急速な分解がおそらく発生することを明示している。この観察は、細胞からのヨウ素の迅速な排除と一致する。
ｄｅ２−７ ＥＧＦＲにおいて見つけられる特有の接合点ペプチドに対する以前に記載されているＬ８Ａ４モノクローナル抗体は、ｍＡｂ８０６に類似した様式で動作する（Ｒｅｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ｍｕｒｉｎｅ ｐａｒｅｎｔ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２４，６３９−４７）。ｄｅ２−７ ＥＧＦＲでトランスフェクトされたＵ８７ＭＧ細胞を使用すると、この抗体は、類似した内在化率（ｍＡｂ８０６についての１時間で３０％と比較して１時間で３５％）を有し、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲでトランスフェクトされた３Ｔ３線維芽細胞を使用すると匹敵するインビボターゲッティング（ｍＡｂ８０６についての８時間で１８％ＩＤ／ｇ腫瘍と比較して２４時間で２４％ＩＤ／ｇ腫瘍のピーク）を示した（Ｒｅｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｎｔ ＩＩＩ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ａｆｔｅｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ５−ｉｏｄｏ−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７，１５１０−５）。
興味深いことに、腫瘍異種移植片におけるこの抗体のインビボ保持は、５−ヨード−３−ピリジンカルボン酸Ｎ−スクシミジル（Ｒｅｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７）で標識したとき、増進された。この標識された接合団は、リソソームｐＨで正電荷を有し、それ故、細胞保持を増進した（Ｒｅｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｒａｄｉｏｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ５−ｉｏｄｏ−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６，４９７０−７）。増進された保持は、放射線免疫療法のために抗体を考慮するとき有用である可能性を秘めており、この方法は、ヨウ素化ｍＡｂ８０６またはこの断片の保持を向上させるために用いることができよう。
増幅されたＥＧＦＲを含有する細胞へのｍＡｂ８０６の結合
増幅された受容体遺伝子を含有する細胞において発現されたＥＧＦＲをｍＡｂ８０６が認識できるかどうかを検査するために、Ａ４３１細胞へのこの結合を分析した。以前に説明したように、Ａ４３１細胞は、ヒト扁平上皮癌腫細胞であり、高レベルのｗｔＥＧＦＲを発現する。Ａ４３１細胞へのｍＡｂ８０６の低いが非常に再現性のある結合が、ＦＡＣＳ分析によって観察された（図６）。ＤＨ８．３抗体は、Ａ４３１細胞を結合しなかった。このことは、ｍＡｂ８０６の結合が低レベルのｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現の結果ではなかったことを示している（図６）。予想どおり、抗ＥＧＦＲ ５２８抗体は、Ａ４３１細胞の強い染色を示した（図６）。この結果にかんがみて、Ａ４３１細胞へのｍＡｂ８０６の結合をスキャッチャード解析によって特性づけした。ヨウ素化ｍＡｂ８０６の結合は、比較的低かったが、スキャッチャードのための一貫したデータを得ることができた。３つのこのような実験の平均により、１細胞につき２．５×１０５受容体で、９．５×１０７Ｍ−１の親和性についての値を得た。従って、この受容体に対する親和性は、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲに対する親和性より数１０倍低かった。さらに、ｍＡｂ８０６は、Ａ４３１細胞の表面において見つけられるＥＧＦＲの小部分しか認識しないようである。５２８抗体は、１細胞につきおおよそ２×１０６の受容体を判断した。このことは、非常に多数の他の研究（Ｓａｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａ４３１ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６，４７０１−５）と一致している。
これらの結果がＡ４３１細胞系に単に限定されないことを保証するために、ｍＡｂ８０６反応性を、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を示す２つの他の細胞系において検査した。ＨＮ５頭頸部細胞系（Ｋｗｏｋ ＴＴ ａｎｄ Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ ＲＭ（１９９１）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ＥＧＦ ｒｅｌａｔｅｄ ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｎｄ ｌｏｗ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．６４，２５１−４）とＭＤＡ−４６８乳癌細胞系（Ｆｉｌｍｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）ＭＤＡ−４６８，ａ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ａ ｈｉｇｈ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ， ｈａｓ ａｎ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｓ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ＥＧＦ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２８，８９８−９０５）の両方は、ＥＧＦＲ遺伝子の多数のコピーを含有することが報告されている。これらの報告と一致して、５２８抗体は、両方の細胞系の強い染色を提示した（図２１）。Ａ４３１細胞系と同様に、ｍＡｂ８０６は、５２８抗体で観察されたものより低レベルでだが、両方の細胞系を明確に染色した（図２１）。従って、ｍＡｂ８０６結合は、単にＡ４３１限定されず、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を含有する細胞について一般的に観察されることであるようである。
ｍＡｂ８０６による野生型ｓＥＧＦＲの認識は、エピトープを露出させるためにこの受容体の何らかの変性を明確に必要とする。必要とされる変性の程度は、ほんのわずかである。プラスチック表面への野生型ｓＥＧＦＲの吸着でさえＥＬＩＳＡアッセイにおいてｍＡｂ８０６の頑丈な結合を誘導するからである。ｍＡｂ８０６は、Ａ４３１細胞の表面のＥＧＦＲのおおよそ１０％しか結合しないので、受容体のこのサブセットは、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲトランケーションによって誘導されるものに類似した改変高次構造を有するであろうと推測したくなる。実際、Ａ４３１細胞における遺伝子増幅によって媒介されるＥＧＦＲの極めて高い発現は、一部の受容体を不正確にプロセッシングする原因となり、これが改変高次構造につながる。興味深いことに、ｍＡｂ８０６でのＡ４３１細胞溶解産物の半定量的免疫ブロッティングは、これが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタントランスファー従ってＡ４３１ ＥＧＦ受容体の大部分を認識し得ることを示した。この結果は、ｍＡｂ８０６が、改変高次構造を有するＡ４３１細胞の表面の受容体のサブセットに結合するという主張のさらなる裏付けとなる。Ａ４３１細胞におけるこれらの観察は、ｍＡｂ８０６が、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する神経膠腫を結合することを実証する免疫組織化学データと一致する。ｍＡｂ８０６結合は、親Ｕ８７ＭＧ細胞に対して完全に陰性であるので、増幅されたＥＧＦＲを含有する細胞にこの現象を限定することができるように見えるであろうが、Ｕ８７ＭＧ細胞の表面の「変性された」受容体のレベルが検出レベルより下である場合がある。しかし、ヨウ素化されたｍＡｂ８０６は、１×１０７以下の細胞を含有するＵ８７ＭＧ細胞ペレットに結合しなかったので、この可能性は低いと思われる。
ｍＡｂ８０６によるＡ４３１細胞のインビボターゲッティング
第二の生体内分布研究をｍＡｂ８０６で行って、これがＡ４３１腫瘍異種移植片をターゲットにすることができるかどうかを判定した。この研究は、すべてのマウスに陽性対照として含めたｍＡｂ８０６によるＵ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片のターゲッティングに関してより多くの情報を得るために、より長い時間経過にわたって行った。加えて、抗ＥＧＦＲ ５２８抗体をＡ４３１異種移植片についての陽性対照として含めた。以前の研究により、ヌードマウスにおいて成長させたＡ４３１細胞へのこの抗体の低いが有意なターゲッティングが実証されていたからである（Ｍａｓｕｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｔｈｙｍｉｃ ｍｉｃｅ ｂｙ ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４４，１００２−７）。
最初の４８時間の間、ｍＡｂ８０６は、最初の実験において観察されたものとほぼ同一のターゲッティング特性を提示した（図４Ａと比較した図７Ａ）。％ＩＤ／ｇ腫瘍の点から見て、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片におけるｍＡｂ８０６のレベルは、２４時間後、ゆっくりと低下したが、正常組織において検出されるレベルより高いレベルを常に維持した。Ａ４３１異種移植片への取り込みは、比較的低かったが、最初の２４時間の間に、肝臓、脾臓、腎臓および肺などの正常組織では観察されない％ＩＤ／ｇ腫瘍の小さな増加があった（図７Ａ）。５２８抗体の取り込みは、一部は、この抗体の血液からのより早いクリアランスのため、％ＩＤ／ｇ腫瘍で表したとき、両方の異種移植片において非常に低かった（図７Ｂ）。１２５Ｉ放射標ｍＡｂ８０６を単独で注射した２４時間後に採集したＡ４３１異種移植片組織切片のオートラジオグラフィーは、腫瘍の辺縁付近の生存腫瘍への抗体の局在化をはっきりと示すが、中心壊死領域への抗体の局在を示さない（図２３）。腫瘍対血液比の点から見ると、ｍＡｂ８０６は、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片については７２時間でおよびＡ４３１異種移植片については１００時間でピークに達した（図８Ａ、Ｂ）。ｍＡｂ８０６についての腫瘍対血液比は、Ａ４３１腫瘍に関しては１．０を決して超えなかったが、これは、全時間経過を通して増加し（図８Ｂ）、検査したすべての他の組織より高かった（データを示さない。）。このことは、低いターゲッティングレベルを示している。
５２８抗体についての腫瘍対血液比は、ｍＡｂ８０６に類似したプロフィールを示したが、Ａ４３１異種移植片でのより高いレベルに注目された（図８Ａ、Ｂ）。ｍＡｂ８０６は、７２時間の時点でＵ８７ＭＧ．Δ２−７において７．６のピーク腫瘍対肝臓比を有した。このことは、正常組織と比較してこれらの腫瘍における優先的な取り込みをはっきりと明示している（図８Ｃ）。ｍＡｂ８０６についての他の腫瘍対器官比は、肝臓において観察されたものに類似していた（データを示さない。）。Ａ４３１異種移植片におけるｍＡｂ８０６についてのピーク腫瘍対肝臓比は、１００時間の時点で２．０であった。このこともまた、正常組織と比較して腫瘍におけるわずかに優先的な取り込みを示している（図８Ｄ）。
治療法研究
ｍＡｂ８０６の効果を疾患の２つの異種移植片モデル−予防的モデルと確率腫瘍モデル−において評定した。
異種移植片モデル
以前の報告（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１（１６），７７２７−７７３１）と一致して、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲでトランスフェクトされたＵ８７ＭＧ細胞は、親細胞およびｗｔＥＧＦＲでトランスフェクトされたＵ８７ＭＧ細胞より急速に成長した。従って、同じマウスにおいて両方の細胞タイプを成長させることはできなかった。
１００ｍＬのＰＢＳ中の腫瘍細胞（３×１０６）を週齢４−６週の雌ヌードマウス（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、オーストラリア、ウエスタンオーストラリア州）の両側腹部に皮下接種した。ｍＡｂ８０６の治療効力を予防的モデルと確率腫瘍モデルの両方において調査した。予防的モデルでは、それぞれが２つの異種移植片を有する５匹のマウスを、腫瘍細胞接種の前日に開始して、１または０．１ｍｇのｍＡｂ８０６またはビヒクル（ＰＢＳ）のいずれかで腹腔内治療した。治療を２週間、週３回、合計６回にわたって続けた。確率モデルでは、腫瘍が６５±６．４２ｍｍ３（Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７）、８４±９．０７ｍｍ３（Ｕ８７ＭＧ）、７３±７．５ｍｍ３（Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ）または２０１±１９．０９ｍｍ３（Ａ４３１腫瘍）の平均容積に達したときに治療を開始した。式（長さ×幅２）／２（式中、長さは、最長軸であり、幅は、長さに対して直角での測定であった）を用いて、ｍｍ３で腫瘍容積を決定した（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｎｔｉ−Ｌｅｗｉｓ（ｙ）ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ３ Ｓ １９３ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ａ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ：ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｈｅｎ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｔａｘｏｌ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６，３６２１−３６２８）。各治療群について平均腫瘍容積±Ｓ．Ｅ．としてデータを表した。スチューデントｔ検定を用いて所与の時点で統計解析を行った。異種移植片が１．５ｃｍ３の近似容積に達したとき、動物を安楽死させ、組織検査のために腫瘍を切除した。この研究プロジェクトは、ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ａｕｓｔｉｎ ａｎｄ Ｒｅｐａｔｒｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅにより承認された。
腫瘍異種移植片の組織検査
異種移植片を切除し、二等分した。一方の半分を１０％ホルマリン／ＰＢＳで固定した後、パラフィンに包埋した。その後、４マイクロメートル切片を切断し、常例的組織検査のためにヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。他の半分をＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ（登録商標）ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、カリフォルニア州トランス）に包埋し、液体窒素で凍結させ、−８０℃で保管した。薄い（５マイクロメートル）クリオスタット用切片を切断し、１０分間、氷冷アセトンで固定し、その後、さらに１０分間、空気乾燥させた。切片を１０分間、タンパク質ブロッキング試薬（Ｌｉｐｓｈａｗ Ｉｍｍｕｎｏｎ、米国、ピッツバーク）でブロッキングし、その後、ビオチン化一次抗体（１ｍｇ／ｍＬ）と共に３０分間、室温（ＲＴ）で温置した。ＥＣＬタンパク質ビオチン化モジュール（Ａｍｅｒｓｈａｍ、オーストラリア、ボウルクハム・ヒルズ（Ｂａｕｌｋｈａｍ Ｈｉｌｌｓ））をこの製造業者の説示どおりに使用して、すべての抗体をビオチン化した。ＰＢＳですすいだ後、切片をストレプタビジン・ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体と共にさらに３０分間温置した（Ｓｉｌｅｎｕｓ、オーストラリア、メルボルン）。最終ＰＢＳ洗浄後、これらの切片を３０分間、過酸化水素の存在下、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（３−ａｍｉｎｏ−９−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｚｏｌｅ）（ＡＥＣ）基質（０．１Ｍ酢酸、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．０２Ｍ ＡＥＣ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス））に暴露した。切片を水ですすぎ、５分間、ヘマトキシリンで対比染色し、マウントした。
予防的モデルにおけるｍＡｂ８０６の効力
ｍＡｂ８０６を予防的異種移植片モデルにおいてＵ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ．Δ２−７に対する効力について検査した。腫瘍接種の前日に抗体またはビヒクルをｉ．ｐ．投与し、２週間、週３回与えた。ｍＡｂ８０６は、注射１回につき１ｍｇの用量で、ｗｔＥＧＦＲを発現する親Ｕ８７ＭＧ異種移植片の成長に対して効果がなかった（図９Ａ）。対照的に、ｍＡｂ８０６は、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片を用量依存的様式で有意に阻害した（図９Ｂ）。対照動物を犠牲にした第２０日の時点で、平均腫瘍容積は、対照群については１６３７±１７８．９８ｍｍ３であり、注射１回につき０．１ｍｇの群については統計的により小さい５２６±９４．７４ｍｍ３であり（ｐ＜０．０００１）、１ｍｇ注射群については１９７±４２．０６ｍｍ３であった（ｐ＜０．０００１）。治療群を第２４日の時点で犠牲にし、この時点での平均腫瘍容積は、０．１ｍｇ治療群については１２８７±２４３．０３ｍｍ３、および１ｍｇ群については４９２±１００．８ｍｍ３であった。
確率異種移植片モデルにおけるｍＡｂ８０６の効力
予防的異種移植片モデルにおけるｍＡｂ８０６の効力にかんがみて、次に、確率腫瘍異種移植片の成長を阻害するこの能力を検査した。抗体治療は、腫瘍が、Ｕ８７ＭＧ．Δ２０７異種移植片については６５±６．４２ｍｍ３および親Ｕ８７ＭＧ異種移植片については８４±９．０７ｍｍ３の平均腫瘍容積に達したときにこれを開始したことを除き、予防的モデルにおいて説明したとおりであった。もう一度繰り返して、ｍＡｂ８０６は、注射１回につき１ｍｇの容量で親Ｕ８７ＭＧ異種移植片の成長に効果がなかった（図１０Ａ）。対照的に、ｍＡｂ８０６は、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片の成長を用量依存様式で有意に阻害した（図１０Ｂ）。第１７日の時点で、対照動物を犠牲にする前日、平均腫瘍容積は、対照群については９３５±２１５．０４ｍｍ３であり、注射１回につき０．１ｍｇの群については３８６±５７．５１ｍｍ３であり（ｐ＜０．０１）、１ｍｇ注射群については２１７±５８．１７ｍｍ３であった（ｐ＜０．００２）。
ｍＡｂ８０６で観察される成長阻害が、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する細胞に限定されるのかどうかを検査するために、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ腫瘍異種移植片に対するこの効力を確率モデルにおいて検査した。これらの細胞は、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現のないＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する腫瘍についてのモデルとして役立つ。腫瘍が７３±７．５ｍｍ３の平均腫瘍容積に達したとき、ｍＡｂ８０６治療が開始した。ｍＡｂ８０６は、ビヒクルで治療した対照腫瘍と比較したとき、確率Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片の成長を有意に阻害した（図１０Ｃ）。対照動物を犠牲にした当日、この平均腫瘍容積は、対照群については９６０±２６８．９ｍｍ３であり、１ｍｇ注射で治療した群については４６８±７８．３８ｍｍ３であった（ｐ＜０．０４）。
確率腫瘍の組織学的および免疫組織化学的分析
ｍＡｂ８０６治療および対照Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片（それぞれ、第２４および４２日に採集したもの）間の可能性のある組織学的相違を評価するために、ホルマリン固定、パラフィン包埋切片をＨ＆Ｅで染色した。ｍＡｂ８０６で治療したＵ８７ＭＧ．Δ２−７（治療終了の３日後に採集したもの）およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片（治療終了の９日後に採集したもの）両方からの切片において壊死エリアが見られた。この結果が多数の腫瘍異種移植片（ｎ＝４）において一貫して観察された。しかし、対照で治療した異種移植片からの切片の分析は、ｍＡｂ８０６治療で見られたのと同じ壊死エリアを示さなかった。ｍＡｂ８０６または対照治療Ｕ８７ＭＧ異種移植片からの切片をＨ＆Ｅで染色もし、これらは二群間での細胞生存度に差がないことを示した。このことは、ｍＡｂ８０６結合が、腫瘍異種移植片内の低減された細胞生存度／壊死を誘導するという仮説のさらなる裏付けとなる。
Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片切片の免疫組織化学的分析を行って、ｍＡｂ８０６治療後のｄｅ２−７およびｗｔＥＧＦＲ発現レベルを判定した。上のように第２４および４２日の時点で切片を採集し、５２８および８０６抗体で免疫染色した。予想どおり、５２８抗体は、すべての異種移植片切片を染色し、治療した腫瘍と対照腫瘍の間に強度の明らかな低下はなかった。Ｕ８７ＭＧ切片の染色は、ｍＡｂ８０６では検出不能であったが、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片切片の陽性染色が観察された。対照および治療Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片の間にｍＡｂ８０６染色密度の差はなかった。このことは、抗体治療がｄｅ２−７またはｗｔＥＧＦＲ発現を減少しないことを示唆している。
ｍＡｂ８０６でのＡ４３１異種移植片の治療
ｍＡｂ８０６の抗腫瘍効果がＵ８７ＭＧ細胞に限定されないことを実証するために、Ａ４３１異種移植片を有するマウスにこの抗体を投与した。これらの細胞は、増幅されたＥＧＦＲ遺伝子を含有し、１細胞につきおおよそ２×１０６の受容体を発現する。上で説明したように、ｍＡｂ８０６は、これらのＥＧＦＲの約１０％を結合し、Ａ４３１異種移植片をターゲットにする。ｍＡｂ８０６は、前に説明した予防的異種移植片モデルにおいて検査したとき、Ａ４３１異種移植片の成長を有意に阻害した（図１１Ａ）。対照動物を犠牲にした第１３日の時点で、平均腫瘍容積は、対照群では１３５±１４７．５４ｍｍ３であり、および１ｍｇ注射治療群については２６０±６０．３３ｍｍ３であった（ｐ＜０．０００１）。
別の実験では、０．１ｍｇのｍＡｂ用量も予防的モデルにおいてＡ４３１異種移植片の成長を有意に阻害した。
予防的Ａ４３１異種移植片モデルの効力にかんがみて、確率腫瘍異種移植片の成長を阻害するこの能力を検査した。抗体治療は、腫瘍が２０１±１９．０９ｍｍ３の平均腫瘍容積に達するまでこれを開始しなかったことを除き、予防的モデルにおいて説明したとおりであった。ｍＡｂ８０６は、確率腫瘍異種移植片の成長を有意に阻害した（図１１Ｂ）。対照動物を犠牲にした第１３日の時点で、平均腫瘍容積は、対照群については１１４２±１２０．０６ｍｍ３であり、および１ｍｇ注射群については４５１±６５．５８ｍｍ３であった（ｐ＜０．０００１）。
要約すると、ここで説明したｍＡｂ８０６での治療法研究により、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片成長の用量依存性阻害が明らかに実証された。対照的に、親Ｕ８７ＭＧ異種移植片の阻害は、これらがインビボでｗｔＥＧＦＲを発現し続けるという事実にもかかわらず、観察されなかった。ｍＡｂ８０６は、異種移植片容積を有意に減少させたばかりでなく、腫瘍内に有意な壊死も誘導した。これは、神経膠腫異種移植片を発現するヒトｄｅ２−７ ＥＧＦＲに対するこのような抗体のインビボでの治療的使用の成功を証明する最初の報告である。
ＥＧＦＲの遺伝子増幅は、多数の異なる腫瘍において報告されており、神経膠腫のおおよそ５０％において観察される（Ｖｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。受容体遺伝子増幅によって媒介されるその後のＥＧＦＲ過発現は、細胞内シグナリングおよび細胞成長を増加させることにより、成長有利性をもたらすことができることが提案された（Ｆｉｌｍｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。Ｕ８７ＭＧ細胞系をｗｔＥＧＦＲでトランスフェクトして、ＥＧＦＲ遺伝子増幅の方法を模倣する神経膠腫細胞を生産した。ｍＡｂ８０６での確率Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片の治療は、結果として有意な成長阻害を生じさせた。従って、ｍＡｂ８０６は、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する細胞に対してもインビボ抗腫瘍活性を媒介する。興味深いことに、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片のｍＡｂ８０６阻害は、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７腫瘍で観察されるものより効果が低いようである。このことは、ｍＡｂ８０６が、増幅されたＥＧＦＲに対してより低い親和性を有し、細胞表面で発現された受容体の小率にしか結合しないという事実をおそらく反映している。しかし、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片容積に対する小さな効果にもかかわらず、ｍＡｂ８０６治療は、これらの異種移植片内に大きな壊死エリアを生じさせた。
ｍＡｂ８０６がＵ８７ＭＧ由来細胞系の阻害のみを媒介するという可能性を除くために、本発明者らは、Ａ４３１異種移植片に対するこの効力を試験した。この扁平上皮細胞癌腫由来細胞系は、インビトロでもインビボでも保持される有意なＥＧＦＲ遺伝子増幅を有する。ｍＡｂ８０６でのＡ４３１異種移植片の治療は、予防的モデルにおいても確率モデルにおいても有意な成長阻害を生じさせた。このことは、ｍＡｂ８０６の抗腫瘍効果が、トランスフェクトされたＵ８７ＭＧ細胞系に限定されないことを示している。
ｍＡｂ８０６およびＡＧ１４７８でのＡ４３１異種移植片の併用療法治療
ＡＧ１４７８と併用でのｍＡｂ８０６の抗腫瘍効果を、Ａ４３１異種移植片を有するマウスにおいて試験した。ＡＧ１４７８（４−（３−クロロアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン）は、ＨＥＲ２−ｎｅｕに対するＥＧＦＲキナーゼの強力で選択的な阻害剤であり、血小板由来成長因子受容体キナーゼである（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃａｔ．番号６５８５５２）。３つの対照を含めた；ビヒクルのみ、ビヒクル＋ｍＡｂ８０６のみ、およびビヒクル＋ＡＧ１４７８のみでの治療。結果を図１２に示す。０．１ｍｇのｍＡｂ８０６を、異種移植の１日前ならびに異種移植後１、３、６、８および１０日の時点で投与した。４００μｇのＡＧ１４７８を、異種移植後０、２、４、７、９および１１日の時点で投与した。
ＡＧ１４７８とｍＡｂ８０６は、両方とも、単独で投与したとき、腫瘍容積の有意な減少を生じさせた。しかし、併用すると、腫瘍容積の減少が大きく増進された。
加えて、Ａ４３１細胞のＥＧＦＲへのｍＡｂ８０６の結合をＡＧ１４７８の不在および存在下で評価した。細胞を無血清培地中に一晩置き、その後、ＡＧ１４７８で１０分間、３７℃で治療し、ＰＢＳで２回洗浄し、その後、１％Ｔｒｉｔｏｎで溶解し、溶解産物を遠心分離により１０分間、１２，０００ｇで調製した。その後、Ｓｃｈｏｏｌｅｒ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７７，１３５−１４２（２０００）により記載されたアッセイの改良版でのＥＬＩＳＡにより、溶解産物を８０６反応性について評定した。プレートをＰＢＳ／ＥＤＴＡ中の１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ８０６で一晩、室温でコーティングし、その後、２回洗浄した。その後、プレートを１０％血清アルブミン／ＰＢＳで２時間、３７℃でブロックし、２回洗浄した。１：２０の細胞溶解産物を１０％血清アルブミン／ＰＢＳに１時間、３７℃で添加し、その後、４回洗浄した。１０％血清アルブミン／ＰＢＳ中の抗ＥＧＦＲ（ＳＣ−０３；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を９０分、室温で反応させ、このプレートを４回洗浄し、１０％血清アルブミン／ＰＢＳ中の抗ウサギ−ＨＲＰ（Ｓｉｌｅｎｕｓからの場合は１：２０００）を９０分間、室温で添加し、４回洗浄し、ＡＢＴＳを基質として使用して発色させた。ｍＡｂ８０６結合は、漸増量のＡＧ１４７８の存在下で有意に増加されることが判明した（図１３）。
ＥＧＦＲステータスについて事前にタイプ分けしたヒト膠芽腫における免疫反応性
膠芽腫におけるＥＧＦＲ発現、増幅および突然変異の高い発生率を考慮して、詳細な免疫組織化学研究を行って、異種移植片以外の腫瘍における８０６の特異性を評定した。１６膠芽腫のパネルを免疫組織化学によって分析した。１６膠芽腫のこのパネルを、増幅された野生型ＥＧＦＲおよびｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現の存在についてＲＴ−ＰＣＲにより事前にタイプ分けした。これらの腫瘍のうち６つは、ｗｔＥＧＦＲ転写産物のみを発現し、１０は、ｗｔＥＧＦＲ遺伝子増幅を有し、これらのうち５つは、野生型ＥＧＦＲ転写産物のみを示し、５つは、野生型ＥＧＦＲおよびｄｅ２−７遺伝子転写産物両方を示した。
組織学スライドに適用し、１０分間、冷アセトン中で固定した新鮮な凍結組織の５ｍｍ切片を使用して、免疫組織化学分析を行った。結合した一次抗体を、ビオチン化ウマ抗マウス抗体、その後のアビジン−ビオチン−複合反応で検出した。ジアミノベンジジン・四塩酸塩（ＤＡＢ）を色原体として使用した。組織における免疫組織化学反応の程度を光学顕微鏡検査によって予測し、次のように２５％増分で免疫反応性細胞数に従って等級づけした：
局限的＝５％未満
＋＝５−２５％
＋＋＝２５−５０％
＋＋＋＝５０−７５％
＋＋＋＋＝＞７５％
５２８細胞は、すべての腫瘍において強い反応性を示したが、ＤＨ８．３免疫染色は、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する腫瘍に限定された（表２）。ＦＡＣＳおよびロゼット形成アッセイでの前の観察と一致して、ｍＡｂ８０６は、非増幅ＥＧＦＲ遺伝子からのｗｔＥＧＦＲ転写産物を発現する膠芽腫と反応しなかった（表２）。ｍＡｂ８０６のこの反応性パタンは、異種移植片研究において観察されたものに類似しており、重ねて、この抗体がｄｅ２−７および増幅されたＥＧＦＲを認識するが、細胞表面で発現されたときのｗｔＥＧＦＲを認識しないことを示唆している。
Figure 0006317780
 ＊局限的染色
正常組織におけるＥＧＦＲ免疫反応性
ｄｅ２−７ ＥＧＦＲが正常組織において発現されるかどうかを判定するために、ｍＡｂ８０６およびＤＨ８．３での免疫組織化学研究を２５組織のパネルで行った。試験したいずれの組織においても、ｍＡｂ８０６との強い免疫反応性も、ＤＨ８．３との強い免疫反応性もなかった。このことは、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲが正常組織に不在であることを示唆している（表３）。表皮の基底細胞層および上皮の粘膜扁平細胞に限定されたｍＡｂ８０６での多少の可変染色が扁桃に存在した。胎盤では、栄養膜上皮の偶発的免疫染色が観察された。興味深いことに、高い内因性レベルのｗｔＥＧＦＲを発現する２つの組織、肝臓および皮膚は、いずれの有意なｍＡｂ８０６反応性を示すこともできなかった。肝臓サンプルでは反応性は全く観察されず、皮膚サンプルにおけるおよび扁桃粘膜の扁平上皮における基底ケラチノサイトにおいて弱い、一貫性のない局限的反応性のみが偶発的に（研究したすべてのサンプルの１０％以下において）検出された。このことにより、この抗体が細胞表面で発現されるｗｔＥＧＦＲをいずれの有意な程度にも結合しないことが、さらに実証される（表３）。すべて補組織が、５２８抗体で見られる普遍的染色により証明されるように、ｗｔＥＧＦＲについて陽性であった（表３）。
Figure 0006317780
 ＊様々な組織において多少の間質染色
様々な腫瘍におけるＥＧＦＲ免疫反応性
１２の異なる悪性病変のパネルを使用して、他の腫瘍タイプにおけるｄｅ２−７ ＥＧＦＲの程度を検査した。５２８抗体は、黒色腫および精上皮腫を除く分析した多くの腫瘍において、多くの場合、均質な染色を示した。存在する場合、ＤＨ８．３免疫反応性は、偶発的病巣腫瘍細胞に限定された。このことは、この検出システムを用いると、脳外の腫瘍におけるｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現は、あったとしてもわずかである（表４）。血管における局限的染色、および一部の腫瘍におけるＤＨ８．３抗体での結合組織の様々な拡散染色もあった（表４）。この染色は、使用する抗体濃度に強く依存し、および非特異的バックグラウンド反応性と考えられた。ｍＡｂ８０６は、頭頸部腫瘍の６４％および肺癌腫の５０％において陽性染色を示した（表４）。症例の３０％が陽性であった泌尿器腫瘍を除く他の場所ではｍＡｂ８０６反応性が殆どなかった。
頭頸部および肺癌は、ＤＨ８．３抗体について陰性であったので、これらの腫瘍においてこのｍＡｂで見られた反応性をＥＧＦＲ遺伝子増幅と関連づけることができる。
Figure 0006317780
 ＊局限的染色
ＥＧＦＲステータスについて未選択のヒト膠芽腫における免疫反応性
ｍＡｂ８０６の特有の特異性を確証するおよび反応性を評価するために、４６膠芽腫の、これらのＥＧＦＲステータスについて事前に選択していない、パネルにおいて、これを５２８およびＤＨ８．３抗体と比較した。５２８抗体は、２つ（番号２７および２９）を除くすべてのサンプルにおいて強くおよび均一に陽性であった（４４／４６、９５．７％）。これら２つの症例は、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂＤＨ８．３についても陰性であった。ｍＡｂ８０６は、２７／４６（５８．７％）症例において陽性であり、これらのうちの２２症例は、この腫瘍の５０％より多くで均質な免疫反応性を呈示した。ＤＨ８．３抗体は、１５／４６（３２．６％）膠芽腫において陽性であり、これらのうちの９症例は、均質な免疫反応性を示した。これらの未選択腫瘍の免疫化学染色を表５に作表する。
１症例（番号３５）を除くあらゆる症例において、ｍＡｂ８０６とＤＨ８．３間に一致があった。ＥＧＦＲ増幅の存在についての分子分析を４４症例において行った（表５）。これらのうち３０症例は、コタイプであり、前に確率されたｍＡｂ８０６免疫反応性パタンを有した：例えば、１６のｍＡｂ８０６陰性症例は、ＥＧＦＲ増幅を示さず、および１４のＥＧＦＲ増幅症例も、ｍＡｂ８０６免疫陽性であった。しかし、８０６免疫反応性を示す１３の症例は、ＥＧＦＲ増幅について陰性であり、その一方で１つのＥＧＦＲ増幅症例は、ｍＡｂ８０６陰性であった。これらの増幅陰性および８０６陽性症例の突然変異ステータスのさらなる分析を下で説明する。この分析により、ＥＧＦＲ増幅について陰性であると共に８０６により認識される１３症例の大部分についての説明が得られる。
その後、ＲＴ−ＰＣＲにより欠失突然変異の分子分析を４１／４６症例に対して行った（表５）。これらのうちの３４症例は、コタイプであり、欠失突然変異について特異的なＤＨ８．３を有した：１２症例は、ＲＴ−ＰＣＲと免疫組織化学の両方において陽性であり、２２症例は、陰性／陰性であった。３症例（番号２、番号３４、および番号４０）は、欠失突然変異についてＤＨ８．３陽性／ＲＴ−ＰＣＲ陰性であり、３症例（番号１２、番号１８、および番号３９）は、ＤＨ８．３陰性／ＲＴ−ＰＣＲ陽性であった。本発明者らの前の特異性分析に基づいて予想されたとおり、１症例（番号３５）を除いてすべてのＤＨ８．３陽性組織においてｍＡｂ８０６免疫反応性が見られた。
症例番号３も、ｄｅ２−７突然変異の配列を含む突然変異（表５においてＡ２と呼ぶ）を示したが、この突然変異は、８０１の塩基が欠如した古典的ｄｅ２−７欠失ではないようであった（データは示さない。）。この症例は、ＤＨ８．３反応性について陰性であったが、８０６との反応性を示した。このことは、８０６が、追加の、ことによると特有のＥＧＦＲ突然変異を認識できることを示している。
Figure 0006317780
Figure 0006317780
＊Ｎ＝増幅されていない、Ａ−増幅
＋ＷＴ＝野生型、５’突然変異
ｎｄ＝行っていない
８０６抗体反応性は、１９／２７においてまたは前記症例の７０％を超えて、増幅されたまたはｄｅ２−７突然変異体ＥＧＦＲコタイプであった。これら８症例のうちの２症例がＤＨ８．３反応性でもあったことは注目に値する。
頭蓋内神経膠腫腫瘍の全身治療および分析
抗ΔＥＧＦＲモノクローナル抗体、ｍＡｂ８０６、の効力を試験するために、本発明者らは、頭蓋内ΔＥＧＦＲ過発現性神経膠腫異種移植片を有するヌードマウスを、ｍＡｂ８０６、このアイソタイプ対照ＩｇＧまたはＰＢＳの注射で治療した。
ヒト膠芽腫の一次外植片は、培養において増幅、再配列受容体の発現を急速に喪失するので、このような発現を呈示する現存膠芽腫細胞系はない。ヒト腫瘍において見られるものに匹敵する発現レベルを維持させるために、Ｕ８７ＭＧ、ＬＮ−Ｚ３０８、およびＡ１２０７（ニューヨーク州ニューヨーク、Ａｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉａｌ ＣｅｎｔｅｒのＤｒ．Ｓ．Ａａｒｏｎｓｏｎからの寄贈品）細胞をΔＥＧＦＲ、キナーゼ欠失ΔＥＧＦＲ（ＤＫ）、または野生型ＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲ）ウイルスに感染させた。以前に記載されているように（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａ ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ ｃｏｎｆｅｒｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１，７７２７−７７３１）、これらのウイルスは、Ｇ４１８に対する耐性も付与した。
類似したレベルの様々なＥＧＦＲ対立遺伝子を発現する集団（これらの発現レベルは、２５遺伝子コピーの増幅レベルにおおよそ対応する；ヒト膠芽腫は、トランケートされた受容体の１０から５０遺伝子コピーの増幅レベルを概して有する。）を、前に記載されているように（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）ＦＡＣＳにより選択し、それぞれ、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ、ＬＮ−Ｚ３０８．ΔＥＧＦＲ、ＬＮ−Ｚ３０８．ＤＫ、ＬＮ−Ｚ３０８．ｗｔＥＧＦＲ、Ａ１２０７．ΔＥＧＦＲ、Ａ１２０７．ＤＫ、およびＡ１２０７．ｗｔＥＧＦＲと呼んだ。それぞれを、Ｇ４１８を含有する培地（Ｕ８７ＭＧ細胞系、４００μｇ／ｍＬ；ＬＮ−Ｚ３０８およびＡ１２０７細胞系、８００μｇ／ｍＬ）中で維持した。
５μＬのＰＢＳ中のＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞（１×１０５）または５×１０５ ＬＮ−Ｚ３０８．ΔＥＧＦＲ、Ａ１２０７．ΔＥＧＦＲ、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ、およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞を、前に記載されているように（Ｍｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｎｏｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７，８４８４−８４８９）ヌードマウスの脳の右線条体に内植した。内植後第０から１４日まで、一日おきに１００μＬの容量で１μｇのｍＡｂをｉ．ｐ．注射することにより、ｍＡｂ８０６、またはＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照、での全身療法を果たした。脳内Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ腫瘍の直接療法については、５μＬの容量で１０μｇのｍＡｂ８０６、またはＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照を、第１日に開始して５日間、１日おきに、腫瘍注射部位に注射した。
ＰＢＳまたはアイソタイプ対照ＩｇＧで治療した動物は、１３日の生存期間中央値を有し、これに対してｍＡｂ８０６で治療したマウスは、２１日までの生存期間中央値の６１．５％増加を有した（ｐ＜０．００１；図２４Ａ）。
腫瘍確率後、内植の３日後のマウスの治療も、対照群のもの（データを示さない。）と比較して、ｍＡｂ８０６治療動物の生存期間中央値を（１３日から１９日；ｐ＜０．０１）４６．１％延長した。
ｍＡｂ８０６のこれらの抗腫瘍効果がＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ異種移植片を越えて延長するかどうかを判定するために、ＬＮ−Ｚ３８０．ΔＥＧＦＲおよびＡ１２０７．ΔＥＧＦＲの他の神経膠腫細胞異種移植片を有する動物に、類似した治療を施した。ＬＮ−Ｚ３０８．ΔＥＧＦＲ異種移植片を有するｍＡｂ８０６治療マウスの生存期間中央値は、対照についての１９日から５８日に延長された（Ｐ＜０．００１；図２４Ｂ）。驚くべきことに、８匹のｍＡｂ８０６治療動物のうちの４匹は、６０日を超えて生存した（図２４Ｂ）。Ａ１２０７．ΔＥＧＦＲ異種移植片を有する動物の生存期間中央値も対照についての２４日から２９日に延長された（Ｐ＜０．０１；データを示さない。）。
ｍＡｂ８０６治療は、ΔＥＧＦＲ過発現性脳腫瘍成長を阻害する
Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲおよびＬＮ−Ｚ３０８．ΔＥＧＦＲ異種移植片を有するマウスを第９日および第１５日にそれぞれ安楽死させた。腫瘍切片を組織病理分析し、腫瘍容積を決定した。動物生存について観察された結果と一致して、ｍＡｂ８０６治療は、対照群のものと比較して異種移植片、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲの容積を約９０％（Ｐ＜０．００１；図２４Ｃ）およびＬＮ−Ｚ３０８．ΔＥＧＦＲを９５％より大きく（Ｐ＜０．００１；図２４Ｄ）減少させた。Ａ１２０７．ΔＥＧＦＲ腫瘍を有する動物について同様の結果を得た（６５％容積減少、Ｐ＜０．０１；データを示さない。）。
ｍＡｂ８０６での腫瘍内治療は、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ脳腫瘍を有するマウスの生存期間を延長する
Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ異種移植片の治療のためのｍＡｂ８０６の直接腫瘍内注射の効力も判定した。腫瘍内植の翌日、ｍＡｂ８０６またはアイソタイプ対照ＩｇＧの腫瘍内注射を動物に施した。対照動物は、１５日間生存し、これに対してｍＡｂ８０６治療マウスは、１８日間、生きたままであった（Ｐ＜０．０１；図２４Ｅ）。ｍＡｂ８０６での腫瘍内治療は、多少効果的であったが、多回頭蓋内注射の困難および注射リスク増加を必然的に伴った。従って、本発明者らは、さらなる研究のために全身治療に焦点を当てた。
ｍＡｂ８０６治療は、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲを有するマウスの生存期間を延長するが、Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ．ＤＫ頭蓋内異種移植片を有するマウスの生存期間を延長しない
ｍＡｂ８０６による成長阻害が、ΔＥＧＦＲを発現するマウスについて選択的であるかどうかを判定するために、本発明者らは、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ（キナーゼ欠失ΔＥＧＦＲ）およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ脳異種移植片を有する動物を治療した。ｍＡｂ８０６治療は、低レベルの内因性野生型ＥＧＦＲ（ｗｔＥＧＦＲ）を発現するＵ８７ＭＧ腫瘍（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｎａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２９２７−２９３５）を内植したマウス、および低レベルの内因性ｗｔＥＧＦＲに加えてキナーゼ欠失ΔＥＧＦＲを過発現するＵ８７ＭＧ．ＤＫ異種移植片を有する動物の生存期間を延長しなかった（図２５）。ｍＡｂ８０６治療は、ｗｔＥＧＦＲを過発現するＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ腫瘍を有するマウスの生存期間をわずかに延長した（Ｐ＜０．０５、対照群についての２６日に対して生存期間中央値２３日）（図２５Ｃ）。
ｍＡｂ８０６反応性はインビボ抗腫瘍効力と相関する
様々なレベルまたは異なるタイプのＥＧＦＲを発現する腫瘍に対するｍＡｂ８０６の異なる効果を理解するために、本発明者らは、ＦＡＣＳにより様々な腫瘍細胞とのｍＡｂ８０６の反応性を判定した。染色された細胞を、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を使用してＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒで分析した。第一の抗体については、次にｍＡｂを使用した：ｍＡｂ８０６、抗ＥＧＦＲ ｍＡｂクローン５２８、およびクローンＥＧＦＲ．１。マウスＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂをアイソタイプ対照として使用した。
以前の報告（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａ ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ ｃｏｎｆｅｒｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１，７７２７−７７３１）と一致して、抗ＥＧＦＲ ｍＡｂ５２８は、ΔＥＧＦＲとｗｔＥＧＦＲの両方を認識し、Ｕ８７ＭＧ細胞と比較して強い染色をＵ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞について明示した（図２５Ａ、５２８）。
対照的に、抗体ＥＧＦＲ．１は、ｗｔＥＧＦＲと反応したが、ΔＥＧＦＲと反応しなかった（Ｎｉｓｈｉｋａｗａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ細胞は、Ｕ８７ＭＧ細胞と同様に弱反応性であったからである（図２６Ａ、パネルＥＧＦＲ．１）。
このＥＧＦＲ．１抗体は、Ｕ８７ＭＧ細胞とより強力にＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲと反応した。Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞は、ｗｔＥＧＦＲを過発現したからである（図２６Ａ、パネルＥＧＦＲ．１）。ｍＡｂ８０６は、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲおよびＵ８７ＭＧ．ＤＫ細胞と強く反応し、Ｕ８７ＭＧ細胞とはしなかったが、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲと弱く反応した。このことは、ｍＡｂ８０６が、ΔＥＧＦＲに対して選択的であり、過発現ｗｔＥＧＦＲへの弱い交差活性を有することを示していた（図２６Ａ、パネルｍＡｂ８０６）。
Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲとのこの反応性レベルは、および抗体治療により媒介される生存期間延長に量的にも質的にも類似していた（図２５Ｃ）。
本発明者らは、免疫沈降によりｍＡｂ８０６特異性をさらに判定した。様々な細胞系におけるＥＧＦＲを抗体ｍＡｂ８０６、抗ＥＧＦＲ ｍＡｂクローン５２８（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、マサチューセッツ州ボストン）またはクローンＥＧＦＲ．１（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で免疫沈降させた。
簡単に言うと、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１０ｍＭ ナトリウムＰＰｉ、１ｍＭ フッ化フェニルメチル（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、５μｇ／ｍＬ ロイペプチンおよび５μｇ／ｍＬ アプロチニンを含有する溶解バッファーで細胞を溶解した。抗体を細胞溶解産物と共に４℃で１時間温置した後、プロテインＡおよびＧセファロースを添加した。免疫沈降物を溶解バッファーで２回、ＨＮＴＧバッファー［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１０％グロセロール］で１回洗浄し、電気泳動に付し、ニトロセルロース膜に転写した。
電気泳動により分離されたタンパク質のブロットを、免疫ブロットでの野生型ＥＧＦＲとΔＥＧＦＲ両方の検出に使用される（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７）抗ＥＧＦＲ抗体、Ｃ１３（カリフォルニア州サンディエゴ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＤｒ．Ｇ．Ｎ．Ｇｉｌｌにより提供されたもの）、でプローブし、ＥＣＬ化学発光検出システム（Ａｍｅｒｃｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）を使用してタンパク質を可視化した。Ｂｃｌ−Ｘに対する抗体（ウサギポリクローナル抗体；Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ケンタッキー州レキシントン）およびホスホチロシン（４Ｇ１０、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ニューヨーク州レークプラシド）を、以前に記載されているように（Ｎａｇａｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ ｂｙ ａ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｃｌ−ＸＬ ａｎｄ ｃａｓｐａｓｅ−３−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，５７２４−５７２９）ウエスタンブロット分析のために使用した。
ＦＡＣＳ分析と一致して、抗体５２８は、ｗｔＥＧＦＲおよび突然変異受容体を認識し（図２６Ｂ−パネルＩＰ：５２８）、これに対して抗体ＥＧＦＲ．１は、ｗｔＥＧＦＲと反応したが突然変異種とは反応しなかった（図２６Ｂ、パネルＩＰ：ＥＧＦＲ．１）。さらに、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲおよびＵ８７ＭＧ．ＤＫ細胞内の突然変異受容体のレベルは、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞内のｗｔＥＧＦＲのものに匹敵した（図２６Ｂ、パネルＩＰ：５２８）。
しかし、抗体ｍＡｂ８０６は、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲおよびＵ８７ＭＧ．ＤＫ細胞から沈降した突然変異受容体のより多くの量と比較してＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞溶解産物から少量のｗｔＥＧＦＲしか沈降させることができず、Ｕ８７ＭＧ細胞からは検出不能な量しか沈降させることができなかった（図２６Ｂ、パネルＩＰ：ｍＡｂ８０６）。まとめると、これらのデータは、ｍＡｂ８０６が、細胞表面で過発現されたときのｗｔＥＧＦＲの小部分の中にも存在するΔＥＧＦＲ内のエピトープを認識することを示唆している（下のｍＡｂ８０６エピトープについてのさらなる考察および言及を参照のこと）。
ｍＡｂ８０６治療は、ΔＥＧＦＲ自己リン酸化を減少させ、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ脳腫瘍におけるＢｃｌ．ＸＬ発現を減少する
ｍＡｂ８０６による成長阻害の基礎をなすメカニズムを次に調査した。ΔＥＧＦＲの構成的に活性なキナーゼ活性およびカルボキシ末端自己リン酸化は、この生物学的機能にとって欠くことのできないものである（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａ ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ ｃｏｎｆｅｒｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，７７２７−７７３１；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｎａｇａｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａ ｃｏｍｍｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｎｆｅｒｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，５０７９−５０８６；Ｎａｇａｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｂｅｒｒａｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１６２（Ｓｕｐｐｌ．１），Ｓ１７−Ｓ２１）ので、ΔＥＧＦＲリン酸化ステータスを治療および対照動物からの腫瘍において判定した。図２７Ａに示すように、ｍＡｂ８０６治療は、ΔＥＧＦＲ自己リン酸化を劇的に低下させたが、受容体レベルは、ｍＡｂ８０６治療異種移植片においてわずかにしか減少されなかった。本発明者らは、受容体自己リン酸化が、ΔＥＧＦＲ過発現性腫瘍のアポトーシスの低下に重要な役割を果たす抗アポトーシス遺伝子、Ｂｃｌ−ＸＬ、のアップレギュレートを引き起こすことを以前に明らかにした（Ｎａｇａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｎａｇａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。従って、Ｂｃｌ−ＸＬ発現に対するｍＡｂ８０６治療の効果を次に判定した。ｍＡｂ８０６治療動物からのΔＥＧＦＲ腫瘍は、低減されたＢｃｌ−ＸＬレベルを実際には示さなかった。
ｍＡｂ８０６治療は、Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ腫瘍において成長および血管新生を減少させ、アポトーシスを増加させる
ｍＡｂ８０６治療によって生ずるインビボ抑制および受容体シグナリングに対するこの生化学的効果に照らして、本発明者らは、対照または治療マウスからの腫瘍の増殖率を判定した。ｍＡｂ８０６治療腫瘍のＫｉ６７染色によって測定した増殖指数は、対照腫瘍のものより有意に低かった（Ｐ＜０．００１；図２８）。
簡単に言うと、これらを、塩化亜鉛を含有する溶液中で固定し、パラフィン包埋し、切断し、モノクローナルラット抗マウスＣＤ３１抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ；１：２００）を使用して免疫染色した。ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織を用いてＫｉ−６７免疫組織化学により腫瘍細胞増殖の評定を行った。脱パラフィンおよび再水和の後、これらの組織切片をメタノール中の３％過酸化水素と共に温置して、内因性ペルオキシダーゼを失活させた。これらの切片を３０分間、ヤギ血清でブロックし、一晩、この一次抗体と共に４℃で温置した。その後、これらの切片をＰＢＳで洗浄し、ビオチン化二次抗体と共に３０分間温置した。ＰＢＳでの数回の洗浄後、ストレプタビジン・ホースラディッシュペルオキシダーゼと共に色原体としてジアミノベンジジンおよび対比染色剤としてヘマトキシリンを使用して、産物を可視化した。増殖の測度として、Ｋｉ−６７標識指数を、高倍率（３４００）視野で標識された核：全核の比として決定した。
系統的無作為サンプリングにより各症例においておおよそ２０００の核を計数した。マクロファージおよびＮＫ細胞染色のために、緩衝４％パラホルムアルデヒド溶液で固定された凍結切片を、ビオチン化ｍＡｂＦ４／８０（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ノースカロライナ州ローリー）およびポリクローナルウサギ抗アシアロＧＭ１抗体（Ｄａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、バージニア州リッチモンド）をそれぞれ使用して免疫染色した。コンピュータ分析を用いて血管新生を血管面積として定量した。このために、抗ＣＤ３１を使用して切片を免疫染色し、対比染色を用いずにコンピュータ画像解析システムを使用して分析した。以前に記載されているように（Ｍｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，２０００）ＣＣＤカラーカメラを使用して３２００倍率で切片のデジタル画像を取り込むことにより、ＭＶＡを判定した。その後、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓバージョン４．０ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、メリーランド州シルバースプリング）を使用して画像を解析し、各切片における染色の総量を測定することによりＭＶＡを決定した。各スライドにつき４視野を評価した。この値を各視野における総面積の百分率として表した。各実験において少なくとも２人の観察者（Ｋ．Ｍ．、Ｈ−Ｊ．Ｓ．Ｈ．）が結果を確認した。
加えて、腫瘍組織内のアポトーシス細胞を、以前に説明されている（Ｍｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，２０００）ようなＴＵＮＥＬ法を使用することにより検出した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞を４００倍で計数した。各視野におけるアポトーシス細胞数：全細胞数の比としてアポトーシス指数を算出した。ＴＵＮＥＬ染色によるアポトーシス指数の分析により、対照腫瘍と比較してｍＡｂ８０６治療腫瘍においてアポトーシス細胞数の有意な増加が実証された（Ｐ＜０．００１；図２８）。
治療および対照検体からの腫瘍のＣＤ３１についての免疫染色により、腫瘍血管新生の程度も分析した。腫瘍血管新生を定量するために、コンピュータ画像解析を用いて微小血管面積（ＭＶＡ）を測定した。ｍＡｂ８０６治療腫瘍は、対照腫瘍が示すより３０％少ないＭＶＡを示した（Ｐ＜０．００１；図２８）。
受容体と抗体の間の相互作用が炎症反応を惹起し得るかどうかを理解するために、本発明者らは、マクロファージマーカー、Ｆ４／８０、およびＮＫ細胞マーカー、アシアロＧＭ１について腫瘍切片を染色した。腫瘍マトリックスによりマクロファージを同定し、これらは、特に、ｍＡｂ８０６治療Ｕ８７ＭＧ．ΔＥＧＦＲ腫瘍辺縁周辺に蓄積していた（図２８）。本発明者らは、腫瘍に浸潤したおよび腫瘍周囲のＮＫ細胞を殆ど観察せず、ｍＡｂ８０６治療腫瘍とアイソタイプ対照腫瘍の間に有意差を観察しなかった（データを示さない。）。
ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ５２８での併用免疫療法
ここに示す実験は、本発明に従って抗体の効力を判定するために計画したインビボ作業を説明するものである。
雌ヌードマウス、週齢４−６週を実験動物として使用した。マウスの各側腹部に３×１０６の腫瘍細胞の皮下接種を施した。
これらの動物に、Ｕ８７ＭＧ．Ｄ２−７、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ、またはＡ４３１細胞（これらはすべて上で説明したものである。）のいずれかを施した。療法は、腫瘍が十分なサイズに成長したときに開始した。
その後、マウスに（ｉ）リン酸緩衝食塩水、（ｉｉ）ｍＡｂ８０６（０．５ｍｇ／注射）、（ｉｉｉ）ｍＡｂ５２８（０．５ｍｇ／注射）、または（ｉｖ）両方のｍＡｂの組み合わせのうちの１つの注射を施した。「（ｉｖ）」に関しては、異なるマウス群に各ｍＡｂの０．５ｍｇ／注射、または各ｍＡｂの０．２５ｍｇ／注射のいずれかを施した。
検査したマウスの第一群は、Ｕ８７ＭＧ．Ｄ２−７注射を受けたマウスであった。治療プロトコルは、接種の９日後に開始し、２週間、週３回、継続した（即ち、動物に細胞を注射した９、１１、１３、１６、１８および２０日後に接種した）。治療プロトコルの開始時点での平均腫瘍サイズは、１１５ｍｍ３であった。各群は、５０匹のマウスを含み、それぞれが２種類の腫瘍を有した。
抗体の組み合わせ（それぞれの０．５ｍｇ／注射）を受けたマウスの群の中で、３つに完全退縮があった。他の群のいずれにおいても退縮はなかった。図１８Ａは、これらの結果を図示するものである。
マウスの第二群において、注射材料は、この併用療法が、注射１回につき各抗体０．２５ｍｇを含んだことを除き、同じであった。細胞を接種した１０、１２、１４、１７、１９および２１日後に注射を施した。この両方の開始時の平均腫瘍サイズは、１１４ｍｍ３であった。結果を図１８Ｂに示す。
マウスの第三群にはＵ８７ＭＧ．ＤＫを施した。治療注射は、細胞を接種した１８日後に開始し、第２０、２２、２５、２７および２９日に継続した。この治療の開始時の平均腫瘍サイズは、１０７ｍｍ３であった。図１８Ｃは、これらの結果をまとめたものである。この治療注射は、第一群の場合と同じであった。
最後に、Ａ４３１細胞を接種したマウスの第四群に、接種後８、１０、１２および１４日の時点で群ＩおよびＩＩＩの場合のように注射を施した。開始時の平均腫瘍サイズは、７１ｍｍ３であった。結果を図１８Ｄに示す。
これらの結果は、併用抗体療法が、腫瘍低減に相乗効果を示すことを示した。図１８Ａ参照。類似した効果が、図１８Ｂのとおり、より低い用量で見られた。このことは、この効果が単に用量レベルによるものでないことを示している。
前記併用療法は、Ｕ８７ＭＧ．ＤＫの成長を阻害しなかった（図１８Ｃ）。このことは、抗体免疫機能が、図１８Ａおよび１８Ｂにおいて見られる減少についての原因でなかったことを示している。
図１８Ｄに示すように、前記併用療法は、Ａ４３１腫瘍に対しても相乗的効力を示し、４用量が６０％完全応答率をもたらした。これらのデータは、ｍＡｂ８０６によって認識されるＥＧＦＲ分子が、５２８によって阻害されるものとは機能的に異なることを示唆している。
腫瘍異種移植片成長のｍＡｂ８０６阻害
本明細書において論じ、本実施例においてさらに実証し、論じるように、ｍＡｂ８０６は、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲまたは増幅されたＥＧＦＲのいずれかを発現するが野生型ＥＧＦＲを発現しない腫瘍異種移植片の成長を阻害することが、図らずも判明した。
実施例１において説明したとおりに細胞系および抗体を調製した。ｍＡｂ８０６の特異性を判定するために、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ．Ｄ２−７、およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞へのこの結合をＦＡＣＳによって分析した。簡単に言うと、５２８、８０６およびＤＨ８．３抗体を使用して、培養した親およびトランスフェクトされたＵ８７ＭＧ細胞系を野生型およびｄｅ２−７ＥＧＦＲについて分析した。細胞（１ ３ １０ ６）を、１％ＨＳＡを含有するＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬの適切な抗体またはアイソタイプ適合陰性対照と共に３０分間４℃で温置した。ＰＢＳ／１％ＨＳＡでの３回の洗浄後、細胞をさらに３０分、４℃で、ＦＴＴＣ結合ヤギ抗マウス抗体（１：１００希釈；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州サンディエゴ）と共に温置した。３回のその後の洗浄の後、細胞をＥｐｉｃｓ Ｅｌｉｔｅ ＥＳＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、フロリダ州ハイアレア）で最低２０，０００事象の観察により分析し、Windows(登録商標）用ＥＸＰＯ（バージョン２）を使用して解析した。無関係なＩｇＧ２ｂ（ヒト抗原Ａ３３に対するｍＡｂ１００−３１０）をｍＡｂ８０６についてのアイソタイプ対照として含め、５２８抗体を、これがｄｅ２−７とｗｔＥＧＦＲの両方を認識するので、含めた。
５２８抗体のみが親Ｕ８７ＭＧ細胞系を染色できた（図２９）。このことは、これらの細胞がｗｔＥＧＦＲを発現することを実証した以前の報告（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａ ｍｕｔａｎｔ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ ｃｏｎｆｅｒｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，７７２７−７７３１）と一致している。ｍＡｂ８０６は、対照抗体に類似した結合レベルを有した。このことは、これがｗｔＥＧＦＲを結合できないことを明確に実証している（図２９）。Ｕ８７ＭＧ．Ｄ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞系へのアイソタイプ対照抗体の結合は、Ｕ８７ＭＧ細胞について観察されたものに類似していた。ｍＡｂ８０６は、Ｕ８７ＭＧ．Ｄ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞を染色した。このことは、ｍＡｂ８０６がｄｅ２−７ ＥＧＦＲおよび過発現されたＥＧＦＲサブセットを特異的に認識することを示している（図２９）。予想どおり、５２８抗体は、Ｕ８７ＭＧ．Ｄ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞系両方を染色した（図２９）。Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞に対する５２８抗体染色の強度は、ｍＡｂ８０６よりはるかに高かった。このことは、ｍＡｂ８０６が、過発現されたＥＧＦＲの一部分しか認識しないことを示唆している。Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞で観察されたｍＡｂ８０６反応性は、Ａ４３１細胞、ｗｔＥＧＦＲ．３を過発現するもう１つの細胞系に類似している。
Ｕ８７ＭＧ．Ｄ２−７およびＡ４３１細胞系を使用してスキャッチャード解析を行って、各細胞系でのｍＡｂ８０６についての相対親和性および結合部位を判定した。実施例４において述べたように、ｍＡｂ８０６は、ｄｅ２−７ＥＧＦＲ受容体に対して１．１×１０９Ｍ−１の親和性を有し、平均（３回の独立した実験）２．４×１０５の結合部位／細胞を認識する。対照的に、実施例８で述べたように、Ａ４３１細胞におけるｗｔＥＧＦＲに対するｍＡｂ８０６の親和性は、たった９．５×１０７Ｍ−１であった。興味深いことに、ｍＡｂ８０６は、Ａ４３１細胞表面の２．３×１０５の結合部位を認識し、この数値は、これらの細胞において見つけられるＥＧＦＲの報告数より数十倍低い。本発明者らのＡ４３１細胞の表面のＥＧＦＲの数を確認するために、本発明者らは、１２５Ｉ標識５２８抗体を使用してスキャッチャード解析を行った。予想どおり、この抗体は、Ａ４３１細胞の表面のおおよそ２×１０６部位に結合した。従って、ｍＡｂ８０６は、Ａ４３１の表面のＥＧＦＲ受容体の一部にしか結合しないようである。重要なことに、１２５Ｉ標識ｍＡｂ８０６は、細胞数を１×１０７に増加させたときでさえ、親Ｕ８７ＭＧ細胞に全く結合しなかった。
ｍＡｂ８０６、ｓｃ−０３（ＥＧＦＲのＣＯＯＨ末端ドメインに対して特異的な市販ポリクローナル抗体）およびＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照を使用する３５Ｓ標識後の免疫沈降により、様々な細胞系においてｍＡｂ８０６反応性をさらに特性づけした。簡単に言うと、５％透析ＦＣＳを捕捉したメチオニン／システインを伴わないＤＭＥＭ中の１００ｍＣｉ／ｍＬのＴｒａｎ ３５Ｓ標識（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、カリフォルニア州アーヴィン）で細胞を１６時間、標識した。ＰＢＳで洗浄後、細胞を１時間、４℃で溶解バッファー（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００μＭ 塩化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニル（ＡＥＢＳＦ）、１５０ｎＭ アプロチニン、１μＭ Ｅ−６４プロテアーゼ阻害剤、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、および１μＭ ロイペプチン、ｐＨ７．４）に入れておいた。１０分間、１２，０００ｇでの遠心分離により溶解産物を清澄化し、その後、５μｇの適切な抗体と共に３０分間、４℃で温置した後、プロテインＡ−セファロースを添加した。溶解バッファーで免疫沈降物を３回洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファーと混合し、４−２０％Ｔｒｉｓ／グリシンゲルを使用するゲル電気泳動により分離し、その後、乾燥させ、Ｘ線フィルムに感光した。
ｓｃ−０３抗体は、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞から３バンドを免疫沈降させた；これらの細胞において観察される２つのｄｅ２−７ ＥＧＦＲバンドに対応する二重線、およびｗｔＥＧＦＲに対応する、より高分子量のバンド（図２２および３０）。対照的に、ｍＡｂ８０６は、２つのｄｅ２−７ ＥＧＦＲバンドを免疫沈降させたが、ｗｔＥＧＦＲは、完全に不在であった。Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲおよびＡ４３１細胞において見られたパタンは、本質的に同一であった。ｓｃ−０３抗体は、Ａ４３１細胞からｗｔＥＧＦＲに対応する単一バンドを免疫沈降させた（図２２および３０）。ｍＡｂ８０６ｍ、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲおよびＡ４３１細胞両方からｗｔＥＧＦＲに対応する単一バンドを免疫沈降させた（図２２および３０）。ＦＡＣＳおよびスキャッチャードデータと一致して、ｍＡｂ８０６により免疫沈降されたＥＧＦＲの量は、細胞表面に存在する全ＥＧＦＲより実質的に少なかった。ｍＡｂ８０６およびｓｃ−０３が類似した量のｄｅ２−７ ＥＧＦＲを免疫沈降させることを考慮すると、これらの結果は、ｍＡｂ８０６が、ＥＧＦＲの一部分しか、該受容体を過発現する抗体において認識しないという見解を裏付けとなる。ｍＡｂ８０６抗体と５２８抗体の比較は、同一の反応性パタンを示した（データを示さない。）。無関係なＩｇＧ２ｂ（ｍＡｂ８０６についてのアイソタイプ対照）は、いずれの細胞系からもＥＧＦＲを免疫沈降させなかった（図２２および３０）。同一条件を用いて、ｍＡｂ８０６は、親Ｕ８７ＭＧ細胞からＥＧＦＲを免疫沈降させなかった（データを示さない。）。
ｍＡｂ８０６を、予防的異種移植片モデルにおいて、Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ．Δ２−７腫瘍に対する効力についても検査した。腫瘍接種前日に抗体またはビヒクルをｉ．ｐ．投与し、２週間、週３回これを施した。１ｍｇ／注射の用量で、ｍＡｂ８０６は、ｗｔＥＧＦＲを発現する親Ｕ８７ＭＧ異種移植片の成長に対して効果がなかった（図９Ａ）。対照的に、ｍＡｂ８０６は、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片の成長を用量依存様式で有意に阻害した（図９Ｂ）。対照動物を犠牲にした腫瘍接種２０日後、平均腫瘍容積は、対照群については１６００±１８０ｍｍ３であり、０．１ｍｇ／注射群については有意に小さい５００±９５ｍｍ３であり（Ｐ＜０．０００１）、および１ｍｇ／注射群については２００±４２ｍｍ３であった（ｐ＜０．０００１）。第２４日の時点で治療群を犠牲にし、この時点でのこの平均腫瘍容積は、０．１ｍｇ治療群については１３００±２４０ｍｍ３であり、および１ｍｇ群については５００±１００ｍｍ３であった（Ｐ＜０．００５）。
予防的異種移植片モデルにおけるｍＡｂ８０６の効力にかんがみて、確率腫瘍異種移植片の成長を阻害するこの能力を検査した。抗体治療は、腫瘍が、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片については６５ｍｍ３の平均腫瘍容積に達したとき（内植の１０日後）および親Ｕ８７ＭＧ異種移植片については８４ｍｍ３の平均腫瘍容積に達したとき（内植の１９日後）に開始したことを除き、予防的モデルに関して説明したとおりであった（実施例１０参照）。もう一度、ｍＡｂ８０６は、１ｍｇ／注射の用量ででさえ、親Ｕ８７ＭＧ異種移植片の成長に対して効果がなかった（図１０Ａ）。対照的に、ｍＡｂ８０６は、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片の成長を用量依存様式で有意に阻害した（図１０Ｂ）。対照動物を犠牲にした前日、第１７日の時点で、平均腫瘍容積は、対照群については９００±２００ｍｍ３であり、０．１ｍｇ／注射群については４００±６０ｍｍ３であり（Ｐ＜０．０１）、および１ｍｇ／注射群については２２０±６０ｍｍ３であった（Ｐ＜０．００２）。ＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照でのＵ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片の治療は、腫瘍成長に対して効果がなかった（データを示さない。）。
ｍＡｂ８０６で観察された成長阻害が、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現される細胞に限定されるのかどうかを検査するために、確率モデルにおいてＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片に対するこの効力も検査した。これらの細胞は、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ発現を伴わないＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有する腫瘍のモデルとして役立つ。ｍＡｂ８０６治療は、腫瘍が７３ｍｍ３の平均腫瘍容積に達したとき（内植の２２日後）に開始した。ｍＡｂ８０６は、ビヒクルで治療した対照腫瘍と比較したとき、確率Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片の成長を有意に阻害した（図１０Ｃ）。対照動物を犠牲にした翌日、平均腫瘍容積は、対照群については１０００±３００ｍｍ３であり、および１ｍｇ／注射で治療した群については５００±８０ｍｍ３であった（Ｐ＜０．０４）。
ｍＡｂ８０６治療および対照Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片間の可能性のある組織学的相違を評価するために、ホルマリン固定、パラフィン包埋切片をＨ＆Ｅで染色した（図３１）。ｍＡｂ８０６治療Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７（ｍＡｂ８０６治療異種移植片を腫瘍接種の２４日後に採集し、１８日の時点のビヒクル治療異種移植片を採集した。）およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片（ｍＡｂ８０６異種移植片を腫瘍接種の４２日後に採集し、３７日の時点でビヒクル治療異種移植片を採集した；図３１）からの切片において壊死エリアが見られた。この結果が多数の腫瘍異種移植片（各細胞系についてｎ＝４）において一貫して観察された。しかし、ビヒクルで治療したＵ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片からの切片は、ｍＡｂ８０６治療後に見られたのと同じ壊死エリアを示さなかった（図３１）。同一時点で除去したビヒクルおよびｍＡｂ８０６治療異種移植片も、腫瘍壊死の点でのこれらの相違を示した（データを示さない。）。従って、観察された壊死の増加の原因は、ｍＡｂ８０６治療異種移植片に用いた、より長い成長期間ではなかった。さらに、ｍＡｂ８０６治療Ｕ８７ＭＧ異種移植片からの切片をＨ＆Ｅで染色もし、一切壊死エリアを示さなかった。このことは、ｍＡｂ８０６結合が、細胞生存度低下を誘導し、結果として腫瘍異種移植片内の壊死増加が生ずるという仮説のさらなる裏付けとなる。
Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片切片の免疫組織化学的分析を行って、ｍＡｂ８０６治療後のｄｅ２−７およびｗｔＥＧＦＲ発現レベルを判定した（図３２）。予想どおり、５２８抗体は、すべての異種移植片切片を染色し、治療腫瘍と対照腫瘍の間で強度の明らかな低下はなかった（図３２）。Ｕ８７ＭＧ切片の染色は、ｍＡｂ８０６では検出不能であったが、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片切片の陽性染色が観察された（図３２）。対照および治療Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ異種移植片間にｍＡｂ８０６染色密度の差はなかった。このことは、抗体治療が、ｍＡｂ８０６活性を欠くクローン変異体の選択につながらないことを示唆している。
ｍＡｂ８０６の抗腫瘍効果がＵ８７ＭＧ細胞に限定されないことを実証するために、Ａ４３１異種移植片を有するマウスに該抗体を投与した。これらの細胞は、増幅されたＥＧＦＲ遺伝子を含有し、おおよそ２×１０６受容体／細胞を発現する。本発明者らは、ｍＡｂ８０６がこれらのＥＧＦＲの〜１０％を結合し、Ａ４３１異種移植片をターゲットにすることを以前に明らかにした（Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ａｌｏｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３，３２１７−３２２０）。ｍＡｂ８０６は、前に説明した予防的異種移植片モデルにおいて検査したとき、Ａ４３１異種移植片の成長を有意に阻害した（図１１Ａ）。対照動物を犠牲にした第１３日の時点で、平均腫瘍容積は、ビヒクル治療群では１４００±１５０ｍｍ３であり、および１ｍｇ／注射治療群については２６０±６０ｍｍ３であった（Ｐ＜０．０００１）。別の実験において、０．１ｍｇのｍＡｂの用量も、予防的モデルにおいてＡ４３１異種移植片の成長を有意に（Ｐ＜０．０５）阻害した（データを示さない。）（実施例１０参照）。
予防的Ａ４３１異種移植片モデルにおけるｍＡｂ８０６の効力にかんがみて、確率腫瘍異種移植片の成長を阻害するこの能力を検査した。抗体治療は、腫瘍が２００±２０ｍｍ３の平均腫瘍容積に達するまでこれを開始しなかったことを除き、予防的モデルにおいて説明したとおりであった。ｍＡｂ８０６は、確率Ａ４３１異種移植片の成長を有意に阻害した（図１１Ｂ）。対照動物を犠牲にした日である第１３日の時点で、平均腫瘍容積は、対照群については１１００±１００ｍｍ３であり、および１ｍｇ／注射群については４５０±７０ｍｍ３であった（Ｐ＜０．０００１）。
キメラ８０６抗体の構築、発現および分析
キメラ抗体は、例えばマウス、ラットまたは他の種の重および軽鎖可変領域をヒト重および軽鎖可変領域に連結させた分子の１つのクラスであり、キメラ抗体は、組換え生産される。キメラ抗体の１つの利点は、これらが異種抗原作用、非ヒト抗体（例えば、マウス、ラットまたは他の種）の特有の免疫原性を減少させることができる点である。加えて、組換えにより作製されるキメラ抗体は、特に、高レベル発現ベクターを利用するとき、多くの場合、大量に生産することができる。
高レベル生産のために、最も広く用いられている哺乳動物発現系は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）欠失（「ｄｈｆｒ−」）チャイニーズハムスター卵巣細胞により提示される遺伝子増幅手順を利用するものである。この系は、当業者に周知である。この系は、ジヒドロ葉酸塩（ｄｅｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ）のテトラヒドロ葉酸塩への転化を触媒する、ＤＨＦＲ酵素をコードする、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）「ｄｈｆｒ」遺伝子に基づく。高い生産量を達成するために、所望のタンパク質をコードする遺伝子と共に機能性ＤＨＦＲ遺伝子を含有する発現ベクターでｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞をトランスフェクトする。この場合の所望のタンパク質は、組換え抗体重鎖および／または軽鎖である。
競合的ＤＨＦＲ阻害剤メトトレキサート（ＭＴＸ）の量を増加させるために、組換え細胞は、ｄｈｆｒ遺伝子の増幅により耐性を生じさせる。標準的な場合、利用される増幅ユニットは、ｄｈｆｒ遺伝子のサイズよりはるかに大きく、結果として、抗体重鎖が共増幅される。
抗体鎖などのタンパク質の大規模生産が所望されるとき、発現レベルと利用される細胞の安定性の両方が重要である。長期培養において、組換えＣＨＯ細胞集団は、これらが単一の親クローンに由来するものであったとしても、増幅中にこれらの特異的抗体生産に関して均質性を喪失する。
バイシストロン性発現ベクターを、キメラ抗体の組換え発現において使用するためにプリペイドした。これらのバイシストロン性発現ベクターは、「内部リボソーム侵入部位」即ち「ＩＲＥＳ」を利用する。キメラ抗ＥＧＦＲの生産のためのこれらの構築物では、免疫グロブリン鎖および選択可能マーカーｃＤＮＡがＩＲＥＳにより連結されている。ＩＲＥＳは、細胞のトランス作用性因子を利用してｍＲＮＡ内の内部開始コドンに小さなリボソームサブユニットを補充する、シス作用性要素である。ＩＲＥＳは、真核細胞内のポリシストロン性転写ユニットからの２つ以上のタンパク質のタンパク質の発現を助長する。選択可能マーカー遺伝子が翻訳されるバイシストロン性発現ベクターのキャップ依存様式での、およびＩＲＥＳ内の関心のある遺伝子のＩＲＥＳ依存様式での使用は、様々な実験的方法に応用されている。ＩＲＥＳ要素は、細胞形質転換のためのベクター、トランスジェニック動物の生産、組換えタンパク質生産、遺伝子療法、遺伝子捕捉、および遺伝子ターゲッティングへの組み込みに成功している。
キメラ抗体８０６（ｃｈ８０６）構築の概要
標準的な分子生物学技術を用いて親マウスハイブリドーマから８０６抗体のＶＨおよびＶＬ鎖をクローニングすることにより、キメラ８０６抗体を産生させた。その後、ＶＨおよびＶＬ抗体をｐＲＥＮ哺乳動物発現ベクターにクローニングし（この構築物を配列番号：７および配列番号：８に示す。）、増幅および発現のためにＣＨＯ（ＤＨＦＲ−／−ｖｃ）細胞にトランスフェクトした。簡単に言うと、トリプシン処理後、標準条件下での電気泳動を用いて、４×１０６のＣＨＯ細胞を、ＬＣおよびＨＣ発現ベクターそれぞれ１０μｇでコトランスフェクトした。室温で１０分静置後、細胞を１５ｍＬの培地（１０％ウシ胎仔血清、ヒポキサンチン／チミジンサプリメントと添加剤）に添加し、１５×１０ｃｍの細胞培養ペトリ皿に移した。その後、これらのプレートを正常条件下で２日間、インキュベーター内に置いた。
この時点で、ゲンタマイシン、５ｎＭ メトトレキサートの添加、透析したウシ胎仔血清でのウシ胎仔血清の置換、およびヒポキサンチン／チミジンの除去により、培地からのＬＣとＨＣの両方で首尾よくトランスフェクトされたクローンについての選択を開始させた。トランスフェクション後第１７日に、キメラ８０６抗体の発現のために選択下成長している個々のクローンを採取しスクリーニングした。ＥＬＩＳＡをスクリーニングに利用し、このＥＬＩＳＡは、変性可溶性ＥＧＦ受容体（変性ＥＧＦＲが８０６結合を可能ならしめることは公知である。）でＥＬＩＳＡプレートを被覆することから成った。このアッセイは、個々のクローンによる生産レベルのスクリーニングを考慮にいれており、スクリーニングされた抗体の機能性も考慮にいれている。すべてのクローンが機能性ｃｈ８０６を生産することが明らかになり、最良の生産体を取って、増幅に発展させた。生産されるｃｈ８０６のレベルを増幅するために、最高生産性クローンをより高いメトトレキサート濃度（１００ｎＭ対５ｎＭ）のもとでの再選択に付した。前述の手順を用いてこの作業に着手した。
その後、１００ｍＭ ＭＴＸで成長しているクローンを、生産レベルの測定、血清の離脱、細胞バンキングの測定のために、オーストラリア、メルボルンのＬｕｄｗｉｇ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙに渡した。この細胞系は、ローラーボトル内で〜１０ｍｇ／リットルを安定して生産することが明らかになった。
ｐＲＥＮ ｃｈ８０６ ＬＣ ｎｅｏベクターの核酸配列を配列番号：７に提供する。ｐＲＥＮ ｃｈ８０６ ＨＣ ＤＨＦＲベクターの核酸配列を配列番号：８に提供する。
図３３は、ＩＲＥＳを利用するベクターｐＲＥＮ−ＨＣおよびｐＲＥＮ−ＬＣを描写するものである。ｐＲＥＮバイシストロン性ベクター系は、２００２年２月１３日に出願された同時係属米国特許出願番号６０／３５５，８３８に記載および開示されており、この出願は、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。
キメラ８０６が、マウス親抗体のものと同一の結合特異性を呈示することを実証するために、ｃｈ８０６をＦＡＣＳ分析によって評定した。野生型細胞（Ｕ８７ＭＧ親細胞）ＥＧＦ受容体を過発現する細胞（Ａ４３１細胞およびＵ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞）およびＵ８７．Δ２−７細胞を使用して分析を行った（データを示さない。）。ＥＧＦＲを過発現する細胞およびｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する細胞を使用して、ｍＡｂ８０６およびｃｈ８０６の類似した結合特異性を得た。野生型細胞において結合は観察されなかった。スキャッチャード解析により、Ｕ８７ＭＧｄｅ２−７細胞を使用して６．４×１０９Ｍ−１の放射標識ｃｈ８０６ついての結合親和性が明らかになった（データは示さない。）。
Ｕ８７ＭＧ−ｄｅ２−７異種移植腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいてｃｈ８０６抗体の生体内分布分析を行った。結果を図３４に示す。マウスに５μｇの放射標識抗体を注射し、８、２４、４８および７４時間の時点で、１時点につき４匹の群で犠牲にした。器官を回収し、計量し、ガンマカウンターで放射能を測定した。１２５Ｉ標識ｃｈ８０６は、７４時間にわたって高い腫瘍取り込み量および累積腫瘍保持量を有する１１１Ｉｎ標識ｃｈ８０６と比較して、腫瘍に対するターゲッティング低減を呈示する。７４時間の時点で、１１１Ｉｎ標識抗体は、おおよそ３０％のＩＤ／グラム 組織および４．０の腫瘍対血液比を呈示する（図３５）。１１１Ｉｎ標識ｃｈ８０６は、肝臓、脾臓および腎臓において多少の非特異的保持量を示す。このことは、この同位体の使用に共通しており、時間と共に減少し、これにより、この結合がｃｈ８０６に非特異的であり、１１１Ｉｎ結合に起因することが裏付けられる。
キメラ抗体ｃｈ８０６を確率腫瘍モデルにおいて治療効力について評定した。１００μＬのＰＢＳ中の３×１０６ Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７を、週齢４−６週の雌ヌードマウス（Ａｎｉｍａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、オーストラリア、ウエスタンオーストラリア州）の両側腹部にｓ．ｃ．接種した。ｍＡｂ８０６を陽性対照として含めた。結果を図３６に描写する。腫瘍が５０ｍｍ３の平均容積に達したときに治療を開始した。治療は、指示された日に合計５回の注射についてのｉ．ｐ．で施した１ｍｇのｃｈ８０６またはｍＡｂ８０６から成った。式（長さ×幅２）／２（式中、長さは、最長軸であり、幅は、長さに対して直角での測定値であった。）を用いて、ｍｍ３で腫瘍容積を決定した。各治療群について平均腫瘍容積±Ｓ．Ｅ．としてデータを表した。ｃｈ８０６およびｍＡｂ８０６は、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７異種移植片に対してほぼ同一の抗腫瘍活性を呈示した。
ｃｈ８０６免疫エフェクター機能の分析
材料および方法
抗体および細胞系
マウス抗ｄｅ２−７ ＥＧＦＲモノクローナルｍＡｂ８０６、キメラ抗体ｃｈ８０６（ＩｇＧ１）、および対照アイソタイプ適合キメラ抗Ｇ２５０モノクローナル抗体ｃＧ２５０は、オーストラリア、メルボルンのＬｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって調製された。補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイは、両方とも、Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７およびＡ４３１細胞をターゲット細胞として利用するものであった。前に記載したＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−７細胞系は、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲを含有するレトロウイルスに感染させたヒト星状細胞腫細胞系である（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，７７２７−３１）。ヒト扁平上皮癌腫Ａ４３１細胞は、米国微生物系統保存機関（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（バージニア州マナッサス）から購入した。すべての細胞系を、１０％熱不活性化ＦＣＳ（ＣＳＬ、オーストラリア、メルボルン）と１００単位／ｍＬ ペニシリンと１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンとを捕捉したＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オーストラリア、メルボルン）を伴うＤＭＥＭ／Ｆ−１２において培養した。レトロウイルスでトランスフェクトされたＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−７細胞についての選択を維持するために、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８を培地に含めた。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）エフェクター細胞の調製
健常ボランティアドナー血からＰＢＭＣを単離した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．、米国オハイオ州）での密度勾配遠心分離により、ヘパリン加全血を分画した。ＰＢＭＣ画分を回収し、５％熱不活性化ＦＣＳを含有する、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンと１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンとを捕捉し、２ｍＭのＬ−グルタミンを捕捉したＲＰＭＩ＋１６４０で３回洗浄した。
ターゲット細胞の調製
以前に公表された方法（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｉｎ：Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇｎａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｄ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ．７．２７．１．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）の変形により、ＣＤＣおよびＡＤＣＣアッセイを行った。簡単に言うと、５×１０６のターゲットＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−７およびＡ４３１細胞を、１×１０６細胞あたり５０μＣｉ５１Ｃｒ（Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ、オーストラリア、アデレード）で標識し、２時間、３７℃で温置した。その後、細胞をＰＢＳ（０．０５Ｍ、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、培養基で４回洗浄した。標識細胞のアリコート（１×１０４細胞／５０μＬ）を９６ウエル・マイクロタイター・プレート（ＮＵＮＣ、デンマーク、ロスキレ）の各ウエルに添加した。
ＣＤＣアッセイ
５０μＬの標識ターゲット細胞に、５０μＬのｃｈ８０６またはアイソタイプ対照抗体ｃＧ２５０を、濃度範囲０．００３１５−１０μｇ／ｍＬにわたって三重反復で添加し、氷の上で５分、温置した。次に、５０μＬの新たに調製した健常ドナー補体（血清）を添加して血清の１：３最終希釈物を生じさせた。これらのマイクロタイタープレートを４時間、３７℃で温置した。遠心分離後、上清に放出された５１Ｃｒを計数した（Ｃｏｂｒａ ＩＩ自動ガンマカウンター、Ｃａｎｂｅｒｒａ Ｐａｃｋａｒｄ、オーストラリア、メルボルン）。特異的溶解百分率を実験５１Ｃｒ放出、全放出（５０μＬターゲット細胞＋１００μＬ １０％Ｔｗｅｅｎ ２０）および自然放出（５０μＬターゲット細胞＋１００μＬ培地）、から算出した。
ＡＤＣＣアッセイ
健常ドナーＰＢＭＣによりもたらされたｃｈ８０６媒介ＡＤＣＣを、２つの４時間５１ｌＣｒ放出アッセイによって測定した。第一のアッセイでは、標識されたターゲット細胞を、エフェクター細胞と共に９６ウエル「Ｕ」底マイクロプレート（ＮＵＮＣ、デンマーク、ロスキレ）に５０：１のエフェクター／ターゲット（Ｅ：Ｔ）細胞比でプレーティングした。ＡＤＣＣ活性測定のために、０．００３１５−１０μｇ／ｍＬ（最終濃度）の試験および対照抗体を各ウエルに三重反復で添加した。第二のＡＤＣＣアッセイでは、ｃｈ８０６のＡＤＣＣ活性を、１μｇ／ｍＬの一定の試験抗体濃度で、あるエフェクター：ターゲット細胞比範囲にわたって、親マウスｍＡｂ８０６と比較した。両方のアッセイにおいて、マイクロタイタープレートを３７℃で４時間温置し、その後、５０μＬの上清を各ウエルから回収し、放出された５１Ｃｒをガンマカウンティング（Ｃｏｂｒａ ＩＩ自動ガンマカウンター、Ｃａｎｂｅｒｒａ Ｐａｃｋａｒｄ、オーストラリア、メルボルン）。これらのアッセイに対照を含めて、自然放出（培地のみ）および全放出（１０％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）について補正した。適切な対照と同じサブクラスの抗体を並行して実行した。
細胞溶解（細胞傷害性）百分率を下記式に従って算出した：
細胞傷害性百分率 ＝ サンプルカウント−自然放出 ×１００
全放出−自然放出
細胞傷害性パーセント（％）を抗体濃度（μｇ／ｍＬ）に対してプロットした。
結果
ＣＤＣ分析の結果を図３７に提示する。アイソタイプ対照ｃＧ２５０で観察されたものに匹敵するＣＤＣを有するｃｈ８０６ １０μｇ／ｍＬ以下の存在下で、最小ＤＣＤ活性が観察された。
５０：１のＥ：Ｔ比でのターゲットＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−７およびＡ４３１細胞に対するｃｈ８０６媒介ＡＤＣＣを図３８に提示する。有効なｃｈ８０６特異的細胞傷害性をターゲットＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−７細胞に対して呈示したが、Ａ４３１細胞に対して最小ＡＤＣＣがｃｈ８０６により媒介された。達成される細胞傷害性レベルは、２つの細胞集団上のｃｈ８０６結合部位の数を反映する。ターゲットＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−７細胞は、ｃｈ８０６により特異的に認識される、〜１×１０６のｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現するが、Ａ４３１細胞上で発現される１×１０６の野生型ＥＧＦＲ分子のサブセットだけがｃｈ８０６によって認識される（上の実施例参照）。
さらなるＡＤＣＣ分析を行って、ターゲットＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−７細胞に対する１μｇ／ｍＬのｃｈ８０６により媒介されるＡＤＣＣと、１μｇ／ｍＬの親マウスｍＡｂ８０６によって果たされるものとを比較した。結果を図３９に提示する。ｍＡｂ８０６のキメラ化は、親マウスｍＡｂによって達成されるＡＤＣＣの著しい向上を果たし、３０％より大きい細胞傷害性がＥ：Ｔ比２５：１および５０：１で果たされた。
親マウスｍＡｂ８０６免疫エフェクター機能の欠如は、キメラ化により著しく向上された。ｃｈ８０６は、良好なＡＤＣＣ、しかし最小のＣＤＣ活性を媒介する。
キメラ抗体ｃｈ８０６に対する抗イディオタイプ抗体の産生
ｍＡｂ８０６またはｃｈ８０６の臨床評価を補助するために、抗体の血清薬物動態をモニターするためのおよびマウス−ヒトキメラ抗体に対する任意の免疫応答を定量するための検査室的アッセイが必要とされる。マウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体（抗ｉｄ）を産生させ、患者血清サンプル中のｃｈ８０６を測定するためのＥＬＩＳＡ試薬としての適性についておよびヒト抗キメラ抗体免疫応答分析における陽性対照としての使用について特性づけした。これらの抗イディオタイプ抗体は、患者において自然な抗ＥＧＦＲ抗体応答を生じさせる、治療または予防用ワクチンとしても有用であり得る。
抗イディオタイプ抗体を産生させるための方法は、当該技術分野において周知である（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ，２００１；Ｕｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，１９９４；Ｓｔｅｆｆｅｎｓ ｅｔ ａｌ，１９９７；Ｓａｆａ ａｎｄ Ｆｏｏｎ，２００１；Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｌｉｎｇ，１９８８）。
簡単に言うと、マウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体（抗ｉｄ）を次のように産生させた。ｃｈ８０６での免疫処置を施したマウスからの脾細胞をＳＰ２／０−ＡＧ１４形質細胞腫細胞と融合させ、抗体産生性ハイブリドーマを、ｃｈ８０６への特異的結合および抗原に対する競合的結合についてＥＬＩＳＡにより選択した（図４０）。２５のハイブリドーマを最初に選択し、ＬＭＨ−１１、−１２、−１３および−１４と呼ぶ４つは、ｃｈ８０６、ｍＡｂ８０６への特異的結合を明示する抗体であってｃｈ８０６またはｍＡｂ８０６抗原結合活性を中和することができるものである抗体を分泌した（図４１）。ｃｈ８０６／ｍＡｂ８０６イディオタイプまたはＣＤＲ領域の認識は、精製ポリクローナルヒトＩｇＧとの交差反応性の欠如により実証された。
血清サンプル中のｃｈ８０６の判定を補助するための容易に入手できる組換え抗原ｄｅ２−７ ＥＧＦＲの不在下、臨床サンプル中のｃｈ８０６を測定するための高感度で特異的なＥＬＩＳＡの開発に、８０６可変領域に同時に結合する新規抗イディオタイプｃｈ８０６抗体の能力を活用した（図４２）。捕捉のためにＬＭＨ−１２および検出のためにビオチン化ＬＭＨ−１２を使用すると、検証済ＥＬＩＳＡは、血清中のｃｈ８０６（２μｇ／ｍＬ−１．６ｎｇ／ｍＬ）の測定についての非常に再現性のある結合曲線を３ｎｇ／ｍＬの検出限界で明示した。（ｎ＝１２；１−１００ｎｇ／ｍＬ、変動係数＜２５％；１００ｎｇ／ｍＬ−５μｇ／ｍＬ、変動係数＜１５％）。試験した３つのドナー血清に関してはっきりわかるバックグラウンド結合はなく、無視できる程度の結合がアイソタイプ対照ｈｕ３Ｓ１９３に関して観察された。ハイブリドーマは、高レベルの抗体ＬＭＨ−１２を生産するので、ｃｈ８０６の測定および臨床サンプル中の任意の免疫応答の定量をできるようにより大規模な生産を計画する（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｌｉｎｇ，１９８８）。
結果
マウス免疫処置および免疫処置前および後血清サンプルのハイブリドーマクローン選択免疫反応性は、高力価のマウス抗ｃｈ８０６および抗ｈｕＩｇＧｍＡｂの発生を示した。ｃｈ８０６に結合するがｈｕＩｇＧにはしない抗体を生産する２５のハイブリドーマを最初に選択した。これらのハイブリドーマの一部についての結合特性を図４２Ａおよび４２Ｂに示す。その後、高親和性結合を有するこれらの抗ｃｈ８０６ハイブリドーマのうちの４つ（クローン３Ｅ３、ＳＢ８、９Ｄ６、および４Ｄ８）を制限希釈により単個細胞からのクローン増殖について追跡し、これらをそれぞれＬｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（ＬＭＨ）−１１、−１２、−１３、および−１４と呼んだ（図４２）。
選択された抗イディオタイプ抗体の結合および遮断活性
２つのｃｈ８０６抗体に同時に結合する抗ｃｈ８０６抗体の能力は、血清ｃｈ８０６レベルを判定するためのＥＬＩＳＡにおける試薬としてのこれらの使用に望ましい特徴である。クローン性ハイブリドーマ、ＬＭＨ−１１、−１２、−１３、および−１４は、同時結合を明示した（データを示さない。）。
クローン増殖後、ハイブリドーマ培養上清を、ｓＥＧＦＲ６２１でｃｈ８０６またはｍＡｂ８０６抗原結合活性を中和する能力について、ＥＬＩＳＡによって検査した。結果は、ｓＥＧＦＲをコーティングしたプレートへのｃｈ８０６およびマウスｍＡｂ８０６結合両方を溶解状態で遮断する、抗イディオタイプｍＡｂＬＭＨ−１１、−１２、−１３、および−１４のアンタゴニスト活性を明示した（ＬＭＨ−１１、−１２、−１３については図４１）。
ローラーボトル内での大規模培養後、確率されたクローン性ハイブリドーマ、ＬＭＨ−１１、−１２、−１３、および−１４、の結合特異性をＥＬＩＳＡによって検証した。マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットにより、ＬＭＨ−１１から−１４までの抗体をアイソタイプＩｇＧ１κとして同定した。
臨床血清サンプル中のｃｈ８０６ 薬物動態ＥＬＩＳＡアッセイ開発
血清サンプル中のｃｈ８０６の判定を補助するために、８０６可変領域を同時に結合する抗イディオタイプｃｈ８０６抗体の能力を、臨床サンプル中のｃｈ８０６についての高感度で特異的なＥＬＩＳＡアッセイの開発に活用した。捕捉のための３つの精製クローンＬＭＨ−１１、−１２、および−１３（図４９Ｂおよび４９Ｃ）を、それぞれ、血清中の結合ｃｈ８０６を捕捉して検出するこれらの能力について比較した。結果は、捕捉のためにＬＭＨ−１２（１０μｇ／ｍＬ）および検出のためにビオチン化ＬＭＨ−１２の使用が、血清（３ｎｇ／ｍＬ）中のｃｈ８０６に対する最高の感受性と無視できる程度のバックグラウンド結合を生じさせることを示した。
１μｇ／ｍＬの抗イディオタイプＬＭＨ−１２および１μｇ／ｍＬのビオチン化ＬＭＨ−１２を捕捉および検出にそれぞれ使用する最適な薬物動態ＥＬＩＳＡ条件を確立して、この方法の検証を行った。３つの独立したＥＬＩＳＡを四重反復で行って、３人の健常ドナーからのドナー血清または１％ＢＳＡ／培地中でｃｈ８０６をアイソタイプ対照ｈｕ３Ｓ１９３と共に測定した。検証結果を図４３に提示する。該結果は、血清中のｃｈ８０６（２μｇ／ｍＬ−１．６ｎｇ／ｍＬ）の測定についての非常に再現性のある結合曲線を３ｎｇ／ｍＬの検出限界で明示した。（ｎ＝１２；１−１００ｎｇ／ｍＬ、変動係数＜２５％；１００ｎｇ／ｍＬ−５μｇ／ｍＬ、変動係数＜１５％）。試験した３つの血清に関してはっきりわかるバックグラウンド結合はなく、無視できる程度の結合がアイソタイプ対照ｈｕ３Ｓ１９３に関して観察された。
炭水化物構造および抗体認識の評定
ｍＡｂ８０６抗体によるＥＧＦＲ（増幅されたＥＧＦＲとｄｅ２−７ ＥＧＦＲの両方）の結合および認識における炭水化物構造の役割をさらに評定するための実験を企てた。
炭水化物構造が、ｍＡｂ８０６エピトープに直接関係するかどうかを判定するために、ＣＨＯ細胞において発現された組換えｓＥＧＦＲをＰＮＧａｓｅ Ｆで処理して、Ｎ結合型グリコシル化を除去した。処理後、このタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動させ、膜に転写し、ｍＡｂ８０６で免疫ブロットした（図４４）。予想どおり、脱グリコシル化ｓＥＧＦＲは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、より速く泳動した。このことは、これらの炭水化物がうまく移動したことを示している。ｍＡｂ８０６抗体は、脱グリコシル化材料を明らかに結合していた。このことは、抗体エピトープが事実上ペプチドであり、単なるグリコシル化エピトープでないことを明示している。
３５Ｓで代謝標識された細胞系から調製した溶解産物を、ＥＧＦＲに対する異なる抗体で免疫沈降させた（図４５）。予想どおり、５２８抗体は、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞から３つのバンド、野生型（ｗｔ）ＥＧＦＲに対応する上方のバンドとｄｅ２−７ ＥＧＦＲに対応する２つの下方のバンドを免疫沈降させた。これらの２つのｄｅ２−７ ＥＧＦＲバンドは、以前に報告されており、異なるグリコシル化を表すと思われている（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．Ｊｕｎ １５；３２４（Ｐｔ３）：８８５−８６１）。対照的に、ｍＡｂ８０６は、２つのｄｅ２−７ ＥＧＦＲバンドしか免疫沈降させず、過度な露出の後でさえ野生型受容体は完全に不在であった（データを示さない。）。興味深いことに、ｍＡｂ８０６は、５２８抗体と比較したとき、下方ｄｅ２−７ ＥＧＦＲバンドとの相対反応性増加を示したが、上方バンドとの反応性減少を示した。ＳＣ−０３抗体、ＥＧＦＲのＣ末端ドメインに対する市販ウサギポリクローナル抗体は、５２８抗体で見られるような３つのＥＧＦＲバンドを免疫沈降させたが、この抗体によって免疫沈降された受容体の総量は、かなり少なかった。ｍＡｂ８０６についての対照として無関係なＩｇＧ２ｂ抗体を使用したとき、バンドは観察されなかった（実施例１８参照）。
５２８抗体は、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞からこの野生型受容体に対応する単一のバンドを免疫沈降させた（図４５）。ｍＡｂ８０６もこれらの細胞から単一のバンドを免疫沈降させたが、このＥＧＦＲバンドは、５２８反応性受容体より明らかに速く泳動した。ＳＣ−０３抗体は、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞から両方のＥＧＦＲ反応性バンドを免疫沈降させた。このことにより、ｍＡｂ８０６および５２８がこれらの細胞からの全細胞溶解産物における異なる形態のＥＧＦＲを認識することがさらに確証される。
Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞で観察されたように、５２８抗体は、Ａ４３１細胞から単一ＥＧＦＲバンドを免疫沈降させた（図４５）。５２８反応性ＥＧＦＲバンドは、これらの低い百分率のゲル（６％）で非常に幅広であり、おそらく、受容体グリコシル化の多様性を反映している。単一ＥＧＦＲバンドがｍＡｂ８０６での免疫沈降後にも見られた。このＥＧＦＲバンドは、５２８の全般的に広幅の反応性バンドよりかなり速くは泳動しなかったが、再現可能な様式で広幅５２８バンドの立ち上がりに位置した。Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞溶解産物とは異なり、Ａ４３１溶解産物からｍＡｂ８０６により免疫沈降されたＥＧＦＲの総量は、５２８抗体でよりかなり少なく、ｍＡｂ８０６がこれらの細胞表面のＥＧＦＲの一部しか認識しないことを示す本発明者らのスキャッチャードデータと一致した結果であった（実施例４参照）。ＳＣ−０３での免疫沈降は、結果として、５１８抗体についてのような単一広幅ＥＧＦＲバンドを生じさせた。類似した結果をＮＨ５細胞で得た（データを示さない。）。考え合わせると、このデータは、ｍＡｂ８０６が、ＥＧＦＲのより早く泳動する種（この受容体の示差グリコシル化形態を表すことがある。）と優先的に反応することを示している。
受容体プロセッシングのどの時期にｍＡｂ８０６活性が現れるかを判定するために、パルス／チェイス実験を行った。Ａ４３１およびＵ８７ＭＧ．Δ２−７細胞を５分間、３５Ｓメチオニン／システインでパルスし、その後、様々な時間、３７℃で温置した後、ｍＡｂ８０６または５２８で免疫沈降させた（図４６）。５２８抗体でのＡ４３１細胞における免疫沈降パタンは、ＥＧＦＲに特異的な高次構造依存性抗体に特有のものであった。少量の受容体が０分の時点で（即ち、５分パルス後に）免疫沈降され、標識ＥＧＦＲ量は各時点で増していった。時間に伴う受容体の分子量も併存した。対照的に、ｍＡｂ８０６反応性ＥＧＦＲ材料は、０分では高レベルで存在し、２０分でピークに達し、その後、さらに進んだ各時点では低下した。従って、ｍＡｂ８０６は、プロセッシングの早期に見つけられるＥＧＦＲの形態を優先的に認識するようである。
パルス標識Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞において観察される抗体反応性は、より複雑であった。０分における５２８抗体での免疫沈降により、少量の下方ｄｅ２−７ ＥＧＦＲバンドが標識されることが明らかになった（図４６）。この少量の５２８反応性ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ下方バンドは、時間に伴って増加し、６０分でピークに達し、２および４時間でゆっくりと下降した。標識上方ｄｅ２−７ ＥＧＦＲバンドの有意な量は６０分まで検出されず、その後、このレベルは、この時間経過の終わりまで増加し続けた。このことは、上方ｄｅ２−７ ＥＧＦＲがこの受容体のより成熟した形態であることを明確に示している。この時間経過研究中のｍＡｂ８０６反応性も様々であったが、ｍＡｂ８０６は、下方ｄｅ２７ ＥＧＦＲバンドを優先的に沈降させた。実際、標識の４時間後まで、有意なレベルのｍＡｂ８０６上方バンドはなかった。
上の実験は、ｍＡｂ８０６が、より未成熟なグリコシル化形態のｄｅ２−７およびｗｔＥＧＦＲと優先的に反応することを示唆している。この可能性を、３５Ｓメチオニン／システインで一晩標識した異なる細胞系からのＥＧＦＲを免疫沈降させること、その後、その結果として生じた沈降物をエンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）消化に付すことによって試験した。この酵素は、タンパク質から高マンノースタイプの炭水化物（即ち、未成熟グリコシル化）を優先的に除去する一方で、複合炭水化物（即ち、成熟グリコシル化）をインタクトで残す。５２８、ｍＡｂ８０６およびＳＣ−０３での標識Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞溶解産物に関する免疫沈降および消化は、類似した結果をもたらした（図４７）。
予測したとおり、下方ｄｅ２−７ ＥＧＦＲバンドは、Ｅｎｄｏ Ｈ消化に対して十分感受性であり、Ｅｎｄ Ｈ消化後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでより早く泳動した。このことは、このバンドが高マンノース形態のｄｅ２−７ ＥＧＦＲを表すことを明示している。上方ｄｅ２−７ ＥＧＦＲバンドは、Ｅｎｄｏ Ｈ消化に対して本質的に耐性であり、Ｅｎｄｏ Ｈ消化後に泳動の非常にわずかな違いしか示さなかった。このことは、この炭水化物構造の大部分が複合タイプのものであることを示している。酵素消化後の上方バンドの分子量の少しだが再現性のある減少は、上方ｄｅ２−７ ＥＧＦＲバンドに関する炭水化物が主として複合タイプのものでありながら、多少の高マンノース構造を有することを示唆している。興味深いことに、これらの細胞は、５２８免疫沈降後にはっきりと見える少量の内因性ｗｔＥＧＦＲも発現する。Ｅｎｄｏ Ｈ消化後に野生型受容体の分子量の少しだが注目に値する減少もあった。このことは、これが高マンノース構造も含有することを示している。
Ｅｎｄｏ Ｈ消化に対する免疫沈降ｗｔＥＧＦＲの感度は、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞とＡ４３１細胞の両方で類似していた（図４７）。５２８抗体により沈降された材料の大半は、Ｅｎｄｏ Ｈ酵素に対して耐性であったが、この材料の少量は、高マンノース形態のものであった。もう一度、Ｅｎｄｏ Ｈ消化後にｗｔＥＧＦＲの分子量の小さな増加があった。このことは、これが多少の高マンノース構造を含有することを示唆している。ＳＣ−０３抗体を使用したときの結果は、５２８抗体と類似していた。対照的に、ｍＡｂ８０６により沈降されたＥＧＦＲの大部分は、Ｕ８７ＭＧ．ｗｔＥＧＦＲ細胞とＡ４３１細胞の両方においてＥｎｄｏ Ｈに対して感受性であった。このことにより、ｍＡｂ８０６が高マンノース形態のＥＧＦＲを優先的に認識することが確証される。類似した結果が、ＮＨ−５細胞で得られ、この場合、ｍＡｂ８０６によって沈降された材料の大部分がＥｎｄｏ Ｈ消化に対して感受性であったが、ｍＡｂ５２８およびＳＣ−０３により沈降された材料は、Ｅｎｄｏ Ｈ消化に対して耐性であった（データを示さない。）。
Ａ４３１細胞系の細胞表面ヨウ素化を１２５Ｉで行い、その後、８０６抗体で免疫沈降させた。表面ヨウ素化についてのプロトコルは、次のとおりであった：細胞溶解、免疫沈降、Ｅｎｄｏ Ｈ消化、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーは、本明細書において上で説明したとおりである。標識のために、１０％ＦＣＳを伴う培地中で細胞を成長させ、ＥＤＴＡで剥離させ、ＰＢＳで２回洗浄し、その後、４００μＬのＰＢＳに再浮遊させた（おおよそ２−３×１０６細胞）。この浮遊液に、１５μＬの１２５Ｉ（１００ｍＣｉ／ｍＬ ストック）、１００μＬウシラクトペルオキシダーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）ストック、１０μＬ Ｈ２Ｏ２（０．１％ストック）を添加し、この溶液を５分間温置した。その後、さらなる１０μＬ Ｈ２Ｏ２を添加し、さらに３分間、温置を継続した。その後、細胞を再び３回、ＰＢＳで洗浄し、１％Ｔｒｉｔｏｎに溶解した。ラクトペルオキシダーゼでのＡ４３１細胞系の細胞表面ヨウ素化、その後の８０６抗体での免疫沈降は、上で説明した全細胞溶解産物のものに類似して、Ａ４３１細胞の細胞表面に結合した８０６によって認識されるＥＧＦＲの主形態は、ＥｎｄｏＨ消化に感受性であった（図４８）。このことにより、Ａ４３１細胞の細胞表面の８０６により結合されたＥＧＦＲの形態は、ＥｎｄｏＨ感受性形態であり、従って、高マンノースタイプであることが確証される。
ヒト化（ベニアリングされた）抗体８０６
Ａ．ｈｕ８０６構築
ヒト化８０６抗体（ｈｕ８０６）のための発現ベクターを構築した。単一ＧＳプロモーター由来遺伝子発現カセット内の完全長ｈｕ８０６についての両方の遺伝子を含有する、８Ｃ６５ＡＡＧ（１１８９１ｂｐ；配列番号：４１）と呼ぶ、ベクターを設計した（図５３および５４）。
重鎖可変（ＶＨ）および定常（ＣＨ）領域（それぞれ、配列番号：４２および４３）を図５５Ａに示し、ＶＨ領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（それぞれ、配列番号：４４、４５および４６）を、下線を引くことにより指摘する。
軽鎖可変（ＶＬ）および定常（ＣＬ）領域（それぞれ、配列番号：４７および４８）を図５５Ｂに示し、ＶＬ領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（それぞれ、配列番号：４９、５０および５１）を、下線を引くことにより指摘する。
ヒト化抗体構築物を得るために、ベニアリング（ｖ）技術（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ，ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ，ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ＣＤ １８ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９（９），２４７１−６；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙの米国特許番号６，７９７，４９２；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．（１９９１）Ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｗｈｉｌｅ ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｔｈｅｉｒ ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（４−５），４８９−９８；ＰａｄｌａｎらのＥｕｒｏｐｅａｎ 特許番号５１９５９６）を用いた。リガンド結合特性を保ちながら８０６抗体可変ドメインの免疫原性を最少にするために、ヒト抗体にいて通常見つけられるものとは異なるフレームワーク領域内の表面露出残基の置換を企てた。この企てを実現するために、マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）８０６のＶＬおよびＶＨ鎖を、遺伝子合成およびオーバーラッピングＰＣＲプライマー技術によって作り直した。ＣＬ（カッパ）鎖を同じ方法で組み立てた。インタクトな結合部位の保存を実証するために、ＥＬＩＳＡにより８０６抗原エピトープを含む合成ペプチドへのおよび表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって測定して組換えＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への良好な結合を明示するｓｃＦｖ形式でもｖＶＬおよびｖＶＨを発現させた。
コドン最適化カッパ−ＬＣおよび新たに設計したコドン−およびスプライス−部位最適化ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を使用してｖ８０６ＶＬおよびｖ８０６ＶＨを完全長ヒトＩｇＧ１コンテキストに作り変えて、ＮＳ０およびＣＨＯ細胞系において安定した遺伝子発現を実現した。この発現系は、ＬＯＮＺＡ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓによって提供されているようなｐＥＥ１２．４およびｐＥＥ６．４重および軽鎖発現ベクターを使用するＬＯＮＺＡ ＧＳ発現系に基づく。
８Ｃ６５ＡＡＧベクターの一過性発現によって得たｈｕ８０６抗体産物（図５５）は、ＳＰＲにより組換えＥＧＦＲ−ＥＣＤと反応性であり、ＥＬＩＳＡにより合成ＥＧＦＲ ８０６ペプチドエピトープと反応性であった。この８Ｃ６５ＡＡＧベクターを、安定なＧＳ−ＮＳ０ ｈｕ８０６の産生のためにＬＩＣＲ Ａｆｆｉｌｉａｔｅ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ Ｒｅｎｎｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｚｕｒｉｃｈ）に、およびＧＳ−ＣＨＯ ｈｕ８０６細胞系の産生のためにＬＩＣＲ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ Ｃｅｎｔｒｅに移した。
ｈｕ８０６抗体遺伝子の構築、増幅およびクローニングのための戦略
ベニアリングおよびコドン最適化
抗体ベニアリングは、ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）応答への拮抗を目的としたヒト化戦略である。マウスｍＡｂは、単回投与時でさえ、患者の免疫系により「異種」抗原とみなされ、免疫反応が誘導されて、これらの患者におけるこの試薬のさらなる使用を妨げる。ｍＡｂ８０６ベニアリング方法の第一段階において、ｍＡｂ８０６におけるＶＬおよびＶＨ鎖のアミノ酸配列を分析し、このｍＡｂ８０６タンパク質配列内の各アミノ酸残基を表面露出について等級づけした（図５６および図５７）。抗体分子の外側に存在するアミノ酸だけを可能な修飾について考慮した。これらは、抗体認識にさらされる唯一のものであったからである。ＢＬＡＳＴを用いて、ｍＡｂ８０６タンパク質配列を３つのヒト抗体配列（ＶＨ３６ｇｅｒｍ、ＣＡＤ２６８１０、およびＡＡＡ３７９４１）と比較した。ｍＡｂ８０６表面残基が、ヒト抗体配列のコンセンサスとマッチしなかったたびに、この残基を同定して、コンセンサス配列に変えた。最初に、ｃｈ８０６のＶＬ内の１２のアミノ酸およびＶＨ鎖内の１４のアミノ酸をベニアリングに付した（図５６および図５７）。
コドン最適化は、抗体の、またはこれらの抗体を発現させるために使用した系のコドンバイアスに基づく他のタンパク質の、非相同発現を改善する手段である。ｈｕ８０６の作成における目的の１つは、コドン最適化を利用してこの抗体についての発現レベルを改善することであった。この発現系は、ＬＯＮＺＡ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓによって提供されているようなｐＥＥ１２．４およびｐＥＥ６．４ ＨＣおよびＬＣ発現ベクターを使用するＬＯＮＺＡ ＧＳ発現系ならびに生産細胞としてのＮＳ０および／またはＣＨＯ細胞に基づく。従って、ＮＳ０／ＣＨＯ発現系においてこのコドンが有利であるかどうかについて考慮して、所与のアミノ酸のためのどのコドンを使用するかを決定した。
ＰＣＲによる８０６ＤＮＡ配列の構築および増幅
ｈｕ８０６抗体の可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）領域の、ベニアリングされコドン最適化されたバージョンの配列を、次の方法で合成した：各領域（ＶＨまたはＶＬ）について、８−１０オリゴヌクレオチドを、オーバーラッピングセンスおよびアンチセンスプライマーとして設計した。これらのオリゴは、シグナル配列、コーディング配列、イントロンを含めて、全ｈｕ８０６ ＶＨまたはＶＬ配列を包含するように、ならびに５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端に３’ＢａｍＨＩ部位を含むように、互いにオーバーラップするであろう。これらのオリゴヌクレオチドマップを図５６Ｂおよび５７Ｂに提示し、プライマーの詳細を下に提供する。
簡単に言うと、ｈｕ８０６ ＶＨまたはＶＬをＰＣＲにより次のように組み立てた：最初に、ｖ８０６ｈｃ−またはｖ８０６ｌｃ−オリゴ１、２、３、４、オリゴ５、６、およびオリゴ７、８、９、１０を３つの独立した反応で結合させた。２５μＬの２×ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）および４８μＬの無ヌクレアーゼ水を含有する５０μＬのＰＣＲ反応に、各隣接オリゴのアリコート（５０ｐｍｏｌ）、および各内部オリゴ ５ｐｍｏｌを加えた。サーモ・サイクル・プログラムは、次のとおりであった：９５℃；１５’’、［９４℃；３０’’、５８℃；３０’’、７２℃：３０’’］×２０サイクル、７２℃；１０’’、４℃。これらの３反応の生成物を、ゲル電気泳動による分離後、切除した。その後、塩カラム（Ｑｉａｇｅｎ−Ｑｉａｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ）を使用してこれらを精製し、併せた。これらの生成物を、プライマー１および１０を使用するＰＣＲによってさらに精製した。この第二の反応の生成物は、発現プラスミドへの挿入を可能にする、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩについての制限酵素部位を含んだ。
Figure 0006317780
ｈｉ８０６ ＣＬ：
定常カッパ軽鎖（ＣＬ）のコドン最適化バージョンを、可変領域について用いたものと同じ手法で調製した。しかし、最初のＰＣＲ段階は、オリゴＶＫｌｃｏｎ−１、２、３、４；および５、６、７、８を使用する２つだけの予備生成物の作成を含んだ。加えて、この生成物についての隣接制限部位は、プラスミド挿入前、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩであった。
Figure 0006317780
ｈｕ８０６ ＣＨ：
ＩｇＧ１定常重鎖（ＣＨ）遺伝子（配列番号：８０）の合成ヒト化バージョンをドイツ、レーゲンスブルクのＧｅｎｅＡｒｔから購入した。この遺伝子をＣＨＯ／ＮＳ０細胞における発現のためにコドン最適化した。この遺伝子配列、制限部位などの詳細を図５８に示す。
発現プラスミドの構築
一過性トランスフェクションおよび予備試験のために、上で説明した手法で調製したｈｕ８０６ ＶＨおよびＶＬ配列を、総称定常領域を含有する発現ベクターにライゲートした。これらのベクターは、ＬＩＣＲ Ａｆｆｉｌｉａｔｅ Ｃｈｒｉｓｏｐｈ Ｒｅｎｎｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）により提供されたものであり、（総称ＣＨを含有する）ｐＥＡＫ８ ＨＣ、および（総称ＣＬを含有する）３３−ｘｍ−ｌｃとして知られていた。ＣＩＰの存在下でＧａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用してベクターを消化し、その後、ｈｕ８０６ ＶＨおよびＶＬを対応するベクターにライゲートした。結果とて得られたプラスミドを使用して、Ｔｏｐ１０ケミカルコンピテントＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）をこの製造業者の指示に従って形質転換した。形質転換されたＥ．コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）をＬＢ＋アンピシリンプレートにプレーティングし、制限消化およびＰＣＲによって耐性クローンをスクリーニングした。一般に、この手法で検出された８の陽性クローンを単離し、さらに増幅した。これらのコロニーから精製したＤＮＡを自動ＤＮＡシークエンシングによって分析した。
ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを使用する制限酵素−消化およびライゲーションにより、これらの構築物に定常領域のコドン最適化バージョンを付加させた。これらの形質転換体を、上で述べたように選択し、シークエンシングし、分析した。完全長抗体鎖をＬｏｎｚａＧＳ系にライゲートする前に、１つの事例では、ＢａｍＨＩを使用する消化、ＤＮＡポリメラーゼを使用するフィルイン、および平滑末端ライゲーションにより、可変領域配列と定常領域配列の間のＢａｍＨＩ部位を破壊した。
その後、ｈｕ８０６（ＶＨ＋ＣＨ）またはｈｕ８０６（ＶＬ＋ＣＬ）を含有する制限断片をＮｏｔＩで消化し、続いてＨｉｎｄＩＩＩで消化した。これらの消化を、ＮｏｔＩ部位に平滑末端を作るように計画し、例えば、順次、以下の手法で行った：先ず、プラスミドをＮｏｔｌで消化した。完全消化（シングルカット）プラスミドを、１％アガロースゲルを使用する電気泳動によって分離した。その後、この生成物を切除し、塩カラムで生成し、ＤＮＡポリメラーゼを使用してフィルインした。この反応の生成物を塩カラム精製し、その後、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。その後、この生成物（ｈｕ８０６（ＶＨ＋ＣＨ）については〜１．３Ｋｂ、およびｈｕ８０６（ＶＬ＋ＣＬ）については〜０．８Ｋｂ）をゲル電気泳動によって分離し、切除し、精製した。
ベクターｐＥＥ１２．４およびｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｐｌｃ、英国、スラウ）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｍｌＩでそれぞれ消化した。ｈｕ８０６（ＶＨ＋ＣＨ）をｐＥＥ１２．４にライゲートしてｐＥＥ１２．４−ｈｕ８０６Ｈを作成し、ｈｕ８０６（ＶＬ＋ＣＬ）をｐＥＥ６．４に例ゲートしてｐＥＥ６．４−ｈｕ８０６Ｌを作成した。
スクリーニング後、ｈｕ８０６重鎖配列とｈｕ８０６軽鎖配列の両方を含有する、複合２遺伝子Ｌｏｎｚａプラスミドを作成した。簡単に言うと、ｐＥＥ１２．４−ｈｕ８０６ＨおよびｐＥＥ６．４−ｈｕ８０６ＬベクターをＮｏｔＩおよびＳａｌＩ制限酵素で消化した。結果として得られた断片であって、ＣＳ転写ユニットおよびｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター、続いてｈｕ８０６重または軽鎖発現カセットを含有する断片を単離し、互いにライゲートした。結果として得られた「複合」Ｌｏｎｚａプラスミド（８Ｃ６５ＡＡＧと呼ぶ）を、ＨＥＫ ２９３系における単一プラスミド一過性トランスフェクションのために、ならびにＮＳ０およびＣＨＯ系における安定したトランスフェクションのために使用した。プラスミドマップを図５３に示す。
構築物に対する修飾
ベニアリングされたｈｕ８０６Ｈｃおよびｈｕ８０６Ｌｃのアミノ酸配列を検証した完全配列をｍＡｂ８０６と比較して図５９および図６０にそれぞれ示す。付録の中のｈｕ８０６配列に隣接して、最初のベニアリング変更を示すアスタリスク（＊）があり、数（１−８）は、本明細書において説明する番号付修飾１番および８番を指す。
図６０に関して、参照ファイル（ｍＡｂ８０６ＬＣ）は、位置９１に正しいチロシン（Ｙ）ではなくヒスチジン（Ｈ）を間違って示している；修飾番号１の主題。位置９１のｈｕ８０６に対して行った必要修飾を説明するために、原、未訂正ファイル配列を図６０に示す。
最初の構築およびシークエンシング段階後に多数の修飾をｈｕ８０６ ｃＤＮＡ配列に対して行った。これらの修飾を行った理由としては、配列修飾目的での４つの制限酵素部位の導入、ＰＣＲ中に導入された配列内の２つのアミノ酸エラーの補正、最初のｍＡｂ８０６ドキュメンテーションから生ずる１つのアミノ酸エラーの補正、および変異体の追加のベニアリングを果たすための４つの追加のアミノ酸変更のエンジニアリングが挙げられた。以下の８段階の修飾を行った：
１．ｈｕ８０６ ＶＬ：ＣＤＲ３ Ｈ９１Ｙ
原ヌクレオチドが作られたドキュメントは、ｍＡｂ８０６ ＶＬ配列のＣＤＲ３内の位置９１にＣＡＣ（ヒスチジン、Ｈ）があると誤って示していた。部位特異的突然変異誘発を用いて、ＴＡＣ（チロシン、Ｙ；特許ＷＯ ０２／０９２７７１）の正しい配列を生成した。アミノ酸配列内のこの位置での必然的変更は、ＣＶＱＨＡＱＦ（配列番号：８４）からＣＶＱＹＡＱＦ（配列番号：８５）であった。採集ＤＮＡおよび翻訳タンパク質配列をｃｈ８０６と比較して図６１に示す。
ｈｕ８０６ ＶＬ領域のヒスチジンからチロシンへの修飾のためのセンスプライマー（ＰＤＶ１；４０量体）
５’−ＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＴＣＣＡＧＴＡＣＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＣＣＴＧＧＡＣ−３’（配列番号：８６）
ｈｕ８０６ ＶＬ領域のヒスチジンからチロシンへの修飾のためのアンチセンスプライマー（ＰＤＶ２；２０量体）
５’−ＣＴＧＧＡＣＧＣＡＧＴＡＧＴＡＴＧＴＧＧ−３’（配列番号：８７）
２．ｈｕ８０６重鎖：制限部位ＤｒａＩＩＩおよびＦｓｅＩの付加
ｈｕ８０６ ＶＨおよびＶＬ領域周辺のイントロンに制限酵素部位を付加した。これらの制限部位（ｐＲＥＮベクター系に特有、ＬＩＣＲ）を、発現カセットに対して修飾を行う方法を容易にするように設計した。最初のシグナル領域を含まないｈｕ８０６ ＶＨ配列をＤｒａＩＩＩに対する単一消化により除去または挿入することができた。加えて、ＦｓｅＩをＮｏｔＩ（ｐＲＥＮ系）またはＥｃｏＲＩ（Ｌｏｎｚａ Ｓｙｓｔｅｍ）と同時に使用して、原配列からＢａｍＨＩの機能を果たす定常領域を切り取ることができた。
２段階ＰＣＲ方法を用いてこれらの修飾を果たす。その後、産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。その後、これらを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化されたコドン最適化定常領域を含有するｐＲＥＮベクターにライゲートした。この再ライゲーション方法は、ＢａｍＨＩ部位を破壊した。
第一のＤｒａＩＩＩ部位の上流の可変領域のためのセンスプライマー（８０６重鎖ＤｒａＩＩＩ Ｕｐ；２６量体）
５’−ＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＧ−３’（配列番号：８８）
ＤｒａＩＩＩ部位Ｉを組み込むアンチセンスプライマー（８０６重鎖ＤｒａＩＩＩ Ｄｏｗｎ；２８量体）
５’−ＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣＴＴＣＧＡＴＧＧＴＧＡＣＣ−３’（配列番号：８９）
２ＤｒａＩＩＩ部位間のＨＣ可変領域のためのセンスプライマー（８０６重鎖ＤｒａＩＩＩ−ＦｓｅＩ Ｕｐ；４９量体）
５’−ＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＧＡＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＣＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＧＧＣＴＴＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＣ−３’（配列番号：９０）
ＤｒａＩＩＩ部位およびＦｓｅＩ部位を組み込みアンチセンスプライマー（８０６重鎖ＤｒａＩＩＩ−ＦｓｅＩ Ｄｏｗｎ；４４量体）
５’−ＣＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＡＣＧＧＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：９１）
３．ｈｕ８０６軽鎖：制限部位ＲｓｒＩＩおよびＰａｃＩの付加
ｈｕ８０６軽鎖について、付加した制限部位は、重鎖におけるＤｒａＩＩＩと同じ機能を有するＲｓｒＩＩ、およびＦｓｅＩの機能に匹敵するＰａｃＩであった。
第一のＲｓｒＩＩ部位の上流の可変領域のためのセンスプライマー（８０６軽鎖ＲｓｒＩＩ Ｕｐ；２２量体）
５’−ＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ−３’（配列番号：９２）
ＲｓｒＩＩ部位Ｉを組み込むアンチセンスプライマー（８０６軽鎖ＲｓｒＩＩ Ｄｏｗｎ；２５量体）
５’−ＣＧＧＴＣＣＧＣＣＣＣＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＴＴＣＧ−３’（配列番号：９３）
２ＲｓｒＩＩ部位間のＬＣ可変領域のためのセンスプライマー（８０６軽鎖ＲｓｒＩＩ−ＰａｃＩ Ｕｐ；４５量体）
５’−ＣＧＡＡＧＣＣＡＧＴＣＡＡＧＧＧＧＧＣＧＧＡＣＣＧＣＴＴＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＣＴＧＴＧＴＣ−３’（配列番号：９４）
ＲｓｒＩＩ部位ＩＩおよびＰａｃＩ部位を組み込むアンチセンスプライマー（８０６軽鎖ＲｓｒＩＩ−ＰａｃＩ Ｄｏｗｎ；５０量体）
５’−ＣＣＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＴＴＡＡＣＧＧＡＣＣＧＣＴＡＣＴＣＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＴＴＴＴＧ−３’（配列番号：９５）
４．ｈｕ８０６ ＶＨ：Ｐ８５Ａのリベニアリング
親ｍＡｂ８０６についてのＶＨアミノ酸８１−８７におけるタンパク質配列は、ＳＶＴＩＥＤＴ（配列番号：９６）である。ベニアリング方法の一部として、ＳＶＴＡＰＤＴ（配列番号：９７；図５６）を読み出すために、位置８４および８５のイソロイシンおよびグルタミン酸をアラニン−プロリンに変更した。さらなる分析により、アラニンは、この場合、プロリンより良好な選択肢であるであろうと判断した。下に挙げるプライマーを使用して、部位特異的突然変異誘発を用いてこの第二の変更を生じさせた（ＳＶＴＡＡＤＴ、配列番号：９８）。最終ＤＮＡおよび翻訳タンパク質配列を図６２に提示する。
センスプライマー（Ｒｘ３；４９量体）
５’−ＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＣＧＴＴＡＣＡＧＣＣＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＣＡＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧ−３’（配列番号：９９）
アンチセンスプライマー（Ｆｘ４；４９量体）
５’−ＣＧＣＡＧＴＡＡＴＡＴＧＴＴＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＡＡＣＧＧＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号：１００）
５．ｈｕ８０６ ＶＨ：追加のベニアリング
ｈｕ８０６重鎖可変領域配列は、最初のベニアリング後に３つのさらなる突然変異を受けた：Ｔ７０Ｓ、Ｓ７６ＮおよびＱ８１Ｋ。位置７６でのセリンからアスパラギンへの変更は、ｍＡｂ８０６分子の原配列に戻る補正を意味した。フレームワーク内での追加の変更を含めた。これらは、マウス抗体において見つけられないがヒト抗体において見つけられる残基を象徴するからである。従って、タンパク質配列ＴＲＤＴＳＫＳＱＦＦＬＱ（配列番号：１０１）をＳＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＫ（配列番号：１０２）にベニアリングした。最終ＤＮＡおよび翻訳タンパク質配列をｍＡｂ８０６と比較して図６２に提示する。
ＨＣ可変領域５’ＰＣＲ断片のためのセンスプライマー（ｈｕ８０６ＨＣｆｘ２−５ｐ−Ｕ；４９量体）
５’−ＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＧＡＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＣＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＧＧＣＴＴＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＣ−３’（配列番号：１０３）
５’ＰＣＲ断片のためのアンチセンスプライマー（このプライマーは、第一の２つの変更を組み込む。）（ｈｕ８０６ＨＣｆｘ２−５ｐ−Ｄ；４５量体）
５’−ＧＡＴＴＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＴＴＧＡＧＡＴＴＧＴＧＡＴＣＣＧＧＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧ−３’（配列番号：１０４）
３’ＰＣＲ断片のためのセンスプライマー（このプライマーは、すべての変更を組み込む。）（ｈｕ８０６ＨＣｆｘ２−３ｐ−Ｕ；５５量体）
５’−ＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＧＡＡＧＡＡＴＣＡＧＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＣＴＣＣＧＴＴＡＣＡＧＣＣＧＣ−３’（配列番号：１０５）
ＨＣ可変領域３’ＰＣＲ断片のためのアンチセンスプライマー（ｈｕ８０６ＨＣｆｘ２−３ｐ−Ｄ；４４量体）
５’−ＣＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＡＣＧＧＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：１０６）
６．ｈｕ８０６ ＶＬ：Ｅ７９Ｑベニアリング
これは、行った唯一の構築後ＶＬベニアリング修飾であった。位置７９で部位特異的突然変異誘発を用いて、配列ＳＳＬＥＰＥ（配列番号：１０７）をＳＳＬＱＰＥ（配列番号：１０８）に補正した。最終ＤＮＡおよび翻訳タンパク質配列をｃｈ８０６と比較して図６１に提示する。
ＬＣ可変領域５’ＰＣＲ断片のためのセンスプライマー（ｈｕ８０６ＬＣ−５ｐ−Ｕ；４５量体）
５’−ＣＧＡＡＧＣＣＡＧＴＣＡＡＧＧＧＧＧＣＧＧＡＣＣＧＣＴＴＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＣＴＧＴＧＴＣ−３’（配列番号：１０９）
５’ＰＣＲ断片のためのアンチセンスプライマー（このプライマーは、意図した突然変異を組み込む。）（ｈｕ８０６ＬＣ−５ｐ−Ｄ；３４量体）
５’−ＣＴＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧＣＴＡＧＡＧＡＴＧＧＴＣＡＧＴＧＴＡＴＡＧ−３’（配列番号：１１０）
ＬＣ可変領域３’ＰＣＲ断片のためのセンスプライマー（このプライマーは、意図した突然変異を組み込む。）（ｈｕ８０６ＬＣ−３ｐ−Ｕ；４５量体）
５’−ＣＣＡＴＣＴＣＴＡＧＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＴＧＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧ−３’（配列番号：１１１）
ＬＣ可変領域３’ＰＣＲ断片のためのアンチセンスプライマー（ｈｕ８０６ＬＣ−３ｐ−Ｄ；５０量体）
５’−ＣＣＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＴＴＡＡＣＧＧＡＣＣＧＣＴＡＣＴＣＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＴＴＴＴＧ−３’（配列番号：１１２）
７．ｈｕ８０６軽鎖：カッパ定常領域スプライス−接合点修飾
この突然変異は、カッパ定常領域のコドン最適化バージョンのスプライシングにおけるエラーを補正するために必要であった。この変更の前に、ＶＹＡＣＥＶＴＨ（配列番号：１１３）で始まりこの分子の末端まで続くアミノ酸鎖部分を最終抗体に含めた（図６０）。
ＬＣ定常カッパ５’ＰＣＲ断片のためのセンスプライマー（Ｆ１；２１量体）
５’−ＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＣ−３’（配列番号：１１４）
ＬＣ定常カッパ５’ＰＣＲ断片のためのアンチセンスプライマー（このプライマーは、補正を組み込む。）Ｆ２；５９量体）
５’−ＧＡＴＧＡＧＴＴＡＣＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＴＡＴＡＣＴＴＴＧＴＧＣＴＴＴＴＣＡＴＡＡＴＣＡＧＣＴＴＴＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣ−３’（配列番号：１１５）
ＬＣ定常カッパ３’ＰＣＲ断片のためのセンスプライマー（このプライマーは、補正を組み込む。）（Ｆ３；２６量体）
５’−ＡＧＴＡＴＡＴＧＣＣＴＧＴＧＡＡＧＴＡＡＣＴＣＡＴＣ−３’（配列番号：１１６）
ＬＣ定常カッパ３’ＰＣＲ断片のためのアンチセンスプライマー（Ｆ４；１７量体）
５’−ＧＣＣＡＣＧＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＣ−３’（配列番号：１１７）
８．ｈｕ８０６ ＶＨ：Ｎ６０Ｑ
構築の初期段階で抗体８０６に対して行ったベニアリング変更に加えて、ＶＨ ＣＤＲ２における位置６０のアスパラギンをこの時点でグルタミンに変更した。Ｎ−グリコシル化は、スキーム：ＮＸＳ／Ｔ（この場合のＸは、任意のアミノ酸である。）に従う。位置６０からのアミノ酸配列は、このスキームに従うＮＰＳであった。しかし、（本発明者らの例におけるような）プロリン、またはシステインが、Ｎ−グリコシル化のためにＸ位置に見つけられる場合がしばしばある。一致性のないグリコシル化が抗体の反応性の変動につながることは、重要なことである。従って、アスパラギンを除去し、この最も近縁のアミノ酸、グルタミンで置換して、この部位がグリコシル化される一切の可能性を除いた（図５９および図６２）。
ベニアリングされたｈｕ８０６抗体８Ｃ６５ＡＡＧ構築物の結合
ベニアリングされたｈｕ８０６抗体８Ｃ６５ＡＡＧ構築物の結合
初期抗原結合検証のために少量のｈｕ８０６の調製を可能にすべく、最終プラスミド８Ｃ６５ＡＡＧでの２９３ＦＴ細胞の一過性トランスフェクションを行った。数回の小規模反復一過性トランスフェクションからの培養上清をプールし、濃縮し、プロテインＡクロマトグラフィー段階を用いてｈｕ８０６抗体を回収した。定量的ｈｕＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡによって測定しておおよそ１−２μｇのｈｕ８０６抗体を得、この抗体を組換えＥＧＦＲ−ＥＣＤへの結合についてＢｉａｃｏｒｅによって分析した（図６３）。細胞培養基からウシ免疫グロブリンがｈｕ８０６と共精製しおよびこれが全ＩｇＧの主画分に相当し、その結果、ｈｕ８０６結合の定量的評定が制限された。
シークエンシングプライマー
ＲｅｎＶｅｃＵＰＳＴＲＥＡＭ：センスプライマー（このプライマーは、ピーク８および３３ｘｍベクターにおける可変領域の上流でシークエンシングを開始する。）。
５’−ＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧＴＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧ−３’（配列番号：１１８）
ＲｅｎＶｅｃＤｗｎｓｔｒｍＨＣ：アンチセンスプライマー（このプライマーは、ピーク８重鎖プラスミド上の可変領域の下流でシークエンシングを開始する。非コドン最適化ＨＣ定常領域内でアニールする。）。
５’−ＧＡＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧ−３’（配列番号：１１９）
ＲｅｎＶｅｃＤｗｎｓｔｒｍＬＣ：アンチセンスプライマー（このプライマーは、３３−ｘｍ−ｌｃ軽鎖プラスミド上の可変領域の顆粒でシークエンシングを開始する。非コドン最適化ＬＣ定常領域内でアニールする。）。
５’−ＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧ−３’（配列番号：１２０）
Ｕｐｓｔｒｍ Ｌｏｎｚａ：センスプライマー（このプライマーは、ＬｏｎｚａベクターｐＥＥ１２．４およびｐＥＥ６．４における可変領域の上流でシークエンシングを開始する。）。
５’−ＣＧＧＴＧＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＡＧＴＣ−３’（配列番号：１２１）
Ｄｎｓｔｒｍ ６−４：アンチセンスプライマー（このプライマーは、ＬｏｎｚａベクターｐＥＥ６．４における定常領域の顆粒でシークエンシングを開始する。）
５’−ＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧ−３’（配列番号：１２２）
Ｄｎｓｔｒｍ １２−４：アンチセンスプライマー（このプライマーは、ＬｏｎｚａベクターｐＥＥ１２．４における定常領域の顆粒でシークエンシングを開始する。）
５’−ＣＡＴＡＣＣＴＡＣＣＡＧＴＴＣＴＧＣＧＣＣ−３’（配列番号：１２３）
Ｃｏｄ−Ｏｐｔ ＬＣ ｃｏｎｓｔ Ｅ：コドン最適化軽鎖ｖ−カッパ定常領域の内部の、センスプライマー
５’−ＣＣＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＣ−３’（配列番号：１２４）
Ｃｏｄ−Ｏｐｔ ＬＣ ｃｏｎｓｔ Ｆ：コドン最適化軽鎖ｖ−カッパ定常領域（ｖｋ）の内部の、アンチセンスプライマー。
５’−ＧＡＣＡＧＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＴＣ−３’（配列番号：１２５）
８０６ＨＣｓｐｅｃ：８０６ＨＣ可変領域のベニアリングされたバージョンの内部のおよび該バージョンに特有の、センスプライマー。
５’−ＧＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＧＡＧＴＧＧＡＣ−３’（配列番号：１２６）
８０６ＬＣｓｐｅｃ：８０６ＬＣ可変領域のベニアリングされたバージョンの内部のおよび該バージョンに特有の、センスプライマー。
５’−ＣＡＧＡＧＴＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＴＧＴＣ−３’（配列番号：１２７）
ＩｇＧ１ ｈｕ８０６をコードするプラスミド８Ｃ６５ＡＡＧの配列およびアノテーションについてのＧｅｎＢａｎｋ形式のテキストドキュメントを図６４に示す。
Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して図５３を作成した。
Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ＡｌｉｇｎＸを使用して図５９−６２を作成した。
考察
８０６抗ＥＧＦ受容体抗体のベニアリングは、哺乳動物ＣＨＯまたはＮＳ０細胞における発現について示したようなコドン最適化に伴う、ＶＨにおける１４のアミノ酸の突然変異（図５９および図６２）およびＶＬ鎖に対する１２の変更（図６０および図６１）を含む。８Ｃ６５ＡＡＧと呼ぶ最終２遺伝子ベクターの配列を検証し、コーディング配列および翻訳をチェックした。一過性発現ｈｕ８０６産物を用いてＢｉａｃｏｒｅ分析により組換えＥＧＦＲ細胞外ドメインへの結合を確認した。
高レベルのインタクトｈｕ８０６抗体を生産する安定した単一クローンをＬＯＮＺＡにより推奨されているような無グルタミン培地で選択した。安定したクローンを血清から徐々に離脱させて、無血清培養物を得た。
Ｂ．ｈｕ８０６のインビトロおよびインビボ特性づけ
より生産性の高い安定したＧＳ−ＣＨＯ ｈｕ８０６トランスフェクタント１４Ｄ８、１５Ｂ２および４０Ａ１０ならびにＧＳ−ＮＳ０ ｈｕ８０６トランスフェクタント３６を発展させ、小規模培養により予備的ｈｕ８０６産物の精製および特性づけが可能になるようにさせた。結果は、類似した物理化学的特性を示した。従って、大規模（１５Ｌ）攪拌タンク培養を最高生産性トランスフェクタント（ＧＳ−ＣＨＯ ｈｕ８０６ ４０Ａ１０）について企て、精製産物をＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−７およびＡ４３１異種移植片モデルでのさらなるインビトロ特性づけおよびインビボ療法研究に付した。
方法論および結果
生産および下流プロセッシング：
小規模
１００ｍＬの細胞培養容積を有するＥ５００振盪フラスコを用いて、振盪フラスコ実験を行った。図７６は、培養中の４つのトランスフェクタントについての細胞製造度および抗体生産性チャートを提示するものである。８０６抗イディオタイプ抗体ＬＭＨ−１２（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ 出願ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ．２２（４），２１９−２８）をコーティング抗体として使用し、ｃｈ８０６ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌｏｔ：Ｊ０６０２４を標準物質として使用して、ＥＬＩＳＡにより産物濃度を推定した。回収時の材料を遠心分離し、上清を０．２μｍフィルターで濾過し、その後、これらの抗体をプロテインＡクロマトグラフィーによってアフィニティー精製した。
大規模
ｈｕ８０６候補クローン４０Ａ１０を発現するＣＨＯ−ＫｌＳＶトランスフェクタント細胞系を、ＣＤ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／２５μＭ Ｌ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ；Ｓｉｇｍａ）／ＧＳサプリメント（Ｓｉｇｍａ）を基礎培地として使用して１６日間、グルコースをショット供給しながら１６Ｌ攪拌タンク内で培養した。図７６Ｃは、１５Ｌ攪拌タンク型バイオリアクターにおける細胞成長および体積生産量を表すものである。最終収量は、ＥＬＩＳＡにより５８ｍｇ／Ｌで１４．７Ｌであった。
回収時の材料を遠心分離し、上清を０．２μｍフィルターで濾過し、その後、Ｐａｌｌ Ｃｅｎｔｒｉｍａｔｅ濃縮機において２×３０Ｋ膜を使用して２Ｌに濃縮した。その後、アリコート（４×５００ｍＬ）を２５０ｍＬのプロテインＡカラムに負荷し、２００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ４．５）で溶出させた。その後、４回の実行からの溶出抗体をプールし、濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に透析した。
前記小および大規模培養からのｈｕ８０６産物をＯＤ Ａ２８０ｎｍにより定量した。ｒプロテインＡから回収した抗体サンプルを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（小規模、図７７；大規模、図７８）、還元および非還元条件下での４−２０％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図７９−８１）によって評定し、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ ＩＩ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓシステムを用いてＡｍｐｈｏｌｉｎｅ ＰＡＧプレート（ｐＨ３．５−９．５）で、この製造業者の説示に従って等電点電気泳動を行った（図８２）。
プロテインＡアフィニティー精製ｈｕ８０６抗体は、対称タンパク質ピーク、およびｃｈ８０６臨床参照材料と同一のＳＥＣ溶出プロフィールを示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルプロフィールは、免疫グロブリンと一致した。ＩＥＦパタンは、タンパク質配列の８．４の算出ｐＩと一致する８．６６から８．８２にわたるｐＩを有する３つのアイソフォームを示した。
結合分析
ＦＡＣＳ分析
ＯＤ Ａ２８０ｎｍにより各サンプルについて決定した抗体濃度の推定値を腺癌細胞系Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ遺伝子増幅を有する。）でのＦＡＣＳ分析に用いた。本発明者らは、ｍＡｂ８０６が、ｗｔＥＧＦＲ特異的ｍＡｂ５２８と比較してＡ４３１腫瘍細胞上で発現される〜２×１０６のｗｔＥＧＦＲのおおよそ１０％を結合することを以前に観察している（Ｊｏｈｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎｏｖｅｌ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅ２−７ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）ｔｈａｔ ａｌｓｏ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｔｈｅ ＥＧＦＲ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＥＧＦＲ ｇｅｎｅ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．９８（３），３９８−４０８）。細胞を４つのｈｕ８０６サンプル、無関係なＩｇＧ２ｂ抗体、または陽性対照ｃｈ８０６のうちのいずれか１つで染色し、それぞれを２０μｇ／ｍＬの濃度で評定した。二次抗体のみについての対照も含めた［ヤギ抗ｈｕ−ＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ＦＩＴＣコンジュゲート型］。複合ＦＡＣＳ結合曲線を図８３に提示する。この曲線は、すべての構築物について等価の染色の証拠となる。
大規模培養により生産されたｈｕ８０６ ４０Ａ１０サンプルの細胞結合特性を、ＦＡＣＳにより、Ａ４３１細胞ならびに変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩ受容体を発現するＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−７神経膠腫細胞（Ｊｏｈｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００２）の結合についても評定した。二重反復分析の代表的結果を図８４および８５にそれぞれ提示する。対照は、示されているように、無関係なＩｇＧ２ｂ抗体（影つきヒストグラム）、ｃｈ８０６または５２８（野生型ＥＧＦＲとｄｅ２−７ ＥＧＦＲの両方を結合する。）を含んだ。
ｃｈ８０６およびｈｕ８０６抗体は、Ａ４３１およびＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−８細胞系の類似した染色を明示した。このことは、ｍＡｂ８０６が、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲおよび過発現ＥＧＦＲサブセットを認識するという本発明者らの以前の観察（Ｌｕｗｏｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ８０６ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｅｉｔｈｅｒ ｔｈｅ ｄｅ２−７ ｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）ｂｕｔ ｎｏｔ ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ＥＧＦＲ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１（１４），５３５５−６１）を裏付ける。予想どおり、５２８抗体は、Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７細胞系とＡ４３１細胞系の両方を染色した（図８４および８５）。
細胞結合分析
Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７細胞系および増幅されたＥＧＦＲ遺伝子を発現するＡ４３１類表皮癌腫細胞系を使用して、細胞吸着アッセイ（Ｌｉｎｄｍｏ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｌｉｎｅａｒ ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｔ ｉｎｆｉｎｉｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｃｅｓｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．７２（１）， ７７−８９）により、放射免疫コンジュゲートの抗原結合能力を評定した。
過剰な抗原の存在下での抗原発現性細胞への結合により、ｈｕ８０６およびｃｈ８０６放射性コンジュゲートの免疫反応性画分を決定した。１２５Ｉ−ｈｕ８０６および１２５Ｉ−ｃｈ８０６のＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−７細胞結合についての結果を、細胞濃度範囲２０×１０６から０．０３×１０６細胞／サンプルにわたって図８６Ａに提示する。１２５Ｉ−ｈｕ８０６および１２５Ｉ−ｃｈ８０６のＡ４３１結合についての結果を、細胞濃度範囲２００×１０６から０．３９×１０６細胞／サンプルにわたって図８６Ｂに提示する。
スキャッチャード解析を用いて、会合定数（Ｋａ）を算出した（Ｌｉｎｄｍｏ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。低レベル（２０ｎｇ）の標識抗体単独での結合を、過剰な未標識抗体の存在下での結合と比較した。以前に記載されているように（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ−Ｌｅｗｉｓ Ｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （ｈｕ３Ｓ１９３）ｉｎ ＭＣＦ−７ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｅｄ ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０（１７），４８０４−１１）、遊離、反応性抗体の量の計算の際に免疫反応性画分を考慮に入れ、特異的結合（ｎＭ；全抗体×％結合抗体）を特異的結合／反応性なし（図８７および８８）に対して図示した。この線の負の傾きから会合定数を決定した。
Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７細胞におけるＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する１２５Ｉ−ｈｕ８０６についての結合親和性を１．１８×１０９Ｍ−１であると判定した。１２５Ｉ−ｃｈ８０６についてのＫａは、１．０６×１０９Ｍ−１であった。これらの観察は、１．１×１０９Ｍ−１の親マウスｍＡｂ８０６のものに非常に匹敵する、それぞれ１．３６×１０９Ｍ−１および１．９０×１０９Ｍ−１の１１１Ｉｎ−および１２５Ｉ−ｃｈ８０６についてのＫａ値の報告されている結果（Ｐａｎｏｕｓｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ８０６（ｃｈ８０６）ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｄｅ２−７ ＥＧＦＲ ｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＥＧＦＲ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．９２（６），１０６９−７７）と一致していた。
Ａ４３１細胞に関するスキャッチャード解析により、これらの細胞上のＥＧＦＲの小集団への両方の８０６構築物による結合の高い親和性が実証された。１２５Ｉ−ｃｈ８０６についてのＫａは、０．６１×１０９Ｍ−１であった；１２５Ｉ−ｈｕ８０６については、Ｋａ＝０．２８×１０９Ｍ−１。
バイオセンサー分析
カルボキシメチルデキストランでコーティングされたセンサーチップ（ＣＭ５）を使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００バイオセンサーで、バイオセンサー分析を行った。標準的アミンカップリング化学を用いて、チップを８０６エピトープペプチド（ＥＧＦＲアミノ酸２８７−３０２；配列番号：１４；２００５年２月１７日に出願された米国特許出願番号１１／０６０，６４６；２００４年２月２０日に出願された米国仮特許出願番号６０／５４６，６０２；および２００４年７月１日に出願された米国仮特許出願番号６０／５８４，６２３参照（これらのそれぞれの開示はこの全体が参照により本明細書に組み込まれる。）でチャネル３に関して誘導体化した。系安定性判定に用いた対照抗原でチャネル２を誘導体化した。エタノールアミンでチャネル１を誘導体化し、屈折率の影響の補正のためのブランク対照チャネルとして使用した。ｈｕ８０６のサンプルをＨＢＳバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；３．４ｍＭ ジＮａ−ＥＤＴＡ；０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で希釈し、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭおよび３００ｎＭを含有するアリコート（１２０μＬ）を３０μＬ／分の流量でセンサーチップ表面に注入した。注入段階の後、６００秒間、チップ表面にＨＢＳバッファーを流すことによって、解離をモニターした。結合抗体を溶出し、２０μＬの１０ｍＭ水酸化ナトリウム溶液の注入によりサンプル間でチップ表面を再生した。陽性対照、ｃｈ８０６を含めた。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアの平衡結合モデルを用いて、結合パラメータを決定した。図８９は、生成したセンサーグラムを提示するものである。
チャネル３においてｈｕ８０６と陽性対照、ｃｈ８０６、の両方で用量依存性結合が観察された。対照チャネル２への適切なモノクローナル抗体の用量依存性結合により、系の適正を確認した。ｈｕ８０６（またはｃｈ８０６）と対照抗体の間で交差反応性は観察されなかった。本発明者らの分析は、見掛けのＫＤ（１／Ｋａ）がｈｕ８０６については３７ｎＭおよびｃｈ８０６については９４ｎＭであると判定した。
抗体依存性細胞傷害性分析
精製ｈｕ８０６抗体４０Ａ１０調製品とターゲットＡ４３１腺癌細胞および新たに単離した健常ドナー末梢血単核エフェクター細胞を使用してＡＤＣＣ分析を行った。簡単に言うと、１）エフェクター対ターゲット細胞比（Ｅ：Ｔ＝０．７８：１から１００：１）の範囲にわたって各抗体 １μｇ／ｍＬを用いて、および２）各抗体の濃度範囲（３．１５ｎｇ／ｍＬ−１０μｇ／ｍＬ）にわたってＥ：Ｔ＝５０：１で、すべての分析を三重反復で行った。抗体アイソタイプ、自然および全細胞傷害性についての対照を三重反復で含め、特異的細胞傷害性についての計算は、以前に記載されたとおり（Ｐａｎｏｕｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）であった。結果を図９０に提示する。
ｈｕ８０６は、キメラｃｈ８０６ＩｇＧ１より優れたＡＤＣＣ活性を一貫して明示した。示した代表実験において、１μｇ／ｍＬのｈｕ８０６は、ｃｈ８０６の５％細胞傷害性とは対照的に３０％細胞傷害性のＡＤＣＣを果たした。
インビボ８０６療法研究
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて確率Ａ４３１腺癌またはＵ８７ＭＧ−ｄｅ２−７神経膠腫異種移植片を使用して、ｈｕ８０６の治療効力を調査した。異種移植片を確率させるために、１００μＬのＰＢＳ中の１×１０６Ａ４３１腺癌細胞または１×１０６Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７神経膠腫細胞をマウスの右および左鼠径部乳線に皮下注射した。式［（長さ×幅２）／２］（式中、長さは、最長軸であり、幅は、長さに対して直角での測定値であった。）を用いて、腫瘍容積（ＴＶ）を算出した。最初の実験では、確率Ａ４３１またはＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−７異種移植片を有する５匹のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの群（ｎ＝１０腫瘍／群）にＩＰ注射による１ｍｇ ｈｕ８０６もしくは１ｍｇ ｃｈ８０６抗体またはＰＢＳビヒクル対照治療を施した。Ａ４３１については第６、８、１１、１３、１５および１８日に、およびＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−７細胞系については第４、６、８、１１、１３および１５日にそれぞれ療法を施した。腫瘍負荷量の倫理的考慮による実験停止までの平均±ＳＥＭ腫瘍容積を、Ａ４３１異種移植片について第２５日まで図９１に、およびＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−７異種移植片について第３１日まで図９２に提示する。
ｈｕ８０６でのインビボ療法評定は、ＰＢＳビヒクル対照と比較してＡ４３１異種移植片成長の顕著な低減を証明した。ｈｕ８０６について観察されたＡ４３１異種移植片成長曲線は、ｃｈ８０６治療群に非常に匹敵した。確率Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７異種移植片に関しては、ＰＢＳ対照群を第２０日に安楽死させた。ｈｕ８０６療法は、第２０日まではＰＢＳ対照と比較して腫瘍容積の有意な低減（Ｐ＜０．００１）、および第２０日後はｃｈ８０６群に類似した継続腫瘍成長低減を明示した。
考察
プロテインＡアフィニティー精製ｈｕ８０６抗体は、ｃｈ８０６臨床参照材料と同一のＳＥ溶出プロフィール、および免疫グロブリンと一致したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルプロフィールを呈示した。ＩＥＦパタンは、８．４の期待ｐＩと一致した。
スキャッチャード細胞結合およびバイオセンサーエピトープ結合分析により、ｈｕ８０６抗体は、ｃｈ８０６抗体に非常に匹敵する結合曲線を明示した。ＥＧＦＲｖＩＩＩおよび過発現野生型ＥＧＦＲに対するｈｕ８０６およびｃｈ８０６の結合親和性は、類似しており、低ナノモル範囲であった。ＦＡＣＳ分析による細胞結合は、これらの観察を裏付けた。
さらに、ｈｕ８０６は、ターゲット抗原陽性Ａ４３１細胞に対してｃｈ８０６構築物より著しく改善されたＡＤＣＣを明示した。
ｈｕ８０６でのインビボ療法評定は、ｃｈ８０６治療群に非常に匹敵する、Ａ４３１異種移植片成長の顕著な低減を示した。確率Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７異種移植片に関して、ｈｕ８０６療法は、第２０日まではＰＢＳ対照と比較して腫瘍成長の有意な低減、および第２０日後はｃｈ８０６群に類似した継続腫瘍成長を明示した。
モノクローナル抗体１７５
実施例１において論じたように、クローン１７５（ＩｇＧ２ａ）をさらなる特性づけに選択した。
ａ．材料および方法
細胞系
Δ２−７ＥＧＦＲでトランスフェクトされたＵ８７ＭＧ．Δ２−７（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２９２７−２９３５）およびＡ４３１細胞系（Ｕｌｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ．３０９，４１８−４２５）は、以前に記載されている。ホルモン依存性前立腺細胞腫ＤＵ１４５（Ｍｉｃｋｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３７，４０４９−４０５８）をＡＴＣＣ（ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から得た。
すべての細胞系を、１０％ＦＣＳ（ＣＳＬ、メルボルン）と２ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、セントルイス）とペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド）とを含有するＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク、グランドアイランド）中で維持した。加えて、Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７細胞を４００ｍｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、グランドアイランド）中で維持した。ＢａＦ／３（Ｐａｌａｃｉｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ．３０９，１２６−１３１）および異なるＥＧＦ受容体を発現するＢａＦ／３細胞系（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２（７９）， ２２３８７−２２３９８）を、１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）とＩＬ−３源としての１０％ ＷＥＨ１−３Ｂ調整培地（Ｙｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ．１９−２５；３１７，２５５−２５８）とを捕捉したＲＰＭＩ １６４０（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中で常例的に維持した。すべての細胞系を３７℃で、空気／ＣＯ２（９５％−５％）雰囲気で成長させた。
抗体およびペプチド
ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５をＬｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＬＩＣＲ）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｒａｎｃｈで産生させ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）において生産および精製した。マウス線維芽細胞系ＮＲ６ΔＥＧＦＲを免疫原として使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに２から３週間間隔で５回、アジュバント中の５×１０５−２×１０６細胞で皮下的に免疫処置を施すことにより、マウスハイブリドーマを産生させた。完全フロイントアジュバントを初回注射に使用した。その後は不完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ）を使用した。免疫処置を施したマウスからの脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞系ＳＰ２／０と融合させた。新たに産生されたクローンの上清を、血球吸着アッセイにおいて細胞系ＮＲ６、ＮＲ６ｗｔＥＧＦＲおよびＮＲ６ΔＥＧＦＲとの反応性についてスクリーニングし、ヒト膠芽腫細胞系Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧｗｔＥＧＦＲ、およびＵ８７ＭＧΔＥＧＦＲでの血球吸着アッセイにより分析した。
活性化パパインを伴うＰＢＳを１：２０の比で用いて、２から３時間、３７℃で、インタクトｍＡｂ（５０ｍｇ）を消化し、ヨードアセトアミドでパパインを不活性化した。その後、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）中のプロテインＡセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のカラムに消化物を通し、Ｍｏｎｏ−Ｓカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のカチオン交換利用によりこのフロースルーをさらに精製した。その後、１０，０００ ＭＷＣＯ遠心濃縮機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してタンパク質を濃縮した。Ｆａｂ−ペプチド複合体については、モル過剰の凍結乾燥ペプチドをＦａｂに調節添加し、２時間、４℃で温置した後、結晶化試験を始めた。
哺乳動物細胞において発現されたＥＧＦＲ断片を使用するｍＡｂ１７５のマッピング
これらの断片でのトランスフェクションの前日に、ヒト２９３Ｔ胎児由来腎臓線維芽細胞を、２ｍＬの培地が入っている６ウエル組織培養プレートに、１ウエルにつき８×１０５で接種した。製造業者の説示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）と複合させたプラスミドＤＮＡ ３−４μｇで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４から４８時間後、細胞培養物を吸引し、細胞単層を２５０μ；の溶解バッファー（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％グリセロール、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＧＴＡおよび完全プロテアーゼ阻害剤ミックス（Ｒｏｃｈｅ））に溶解した。１．５％β−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳサンプルバッファーと細胞溶解産物のアリコート（１０−１５μＬ）を混合し、５分間、１００℃での加熱により変性させ、１０％ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で電気泳動させた。その後、サンプルをニトロセルロース膜に電気転写し、これをＴＢＳＴバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中ですすぎ、２．５％スキムミルクを含有するＴＢＳＴ中で３０分間、室温でブロックした。膜を一晩、４℃で、ブロッキングバッファー中の０．５μｇ／ｍＬのｍＡｂ１７５と共に温置した。並列膜を一晩、ｍＡｂ９Ｂ１１（１：５０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州ダンヴァーズ）でプローブしてｃ−ｍｙｃエピトープを検出した。膜をＴＢＳＴ中で洗浄し、１：５０００希釈でホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート型ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｉｏｒａｄ）を含有するブロッキングバッファー中で２時間、室温で温置した。その後、ブロットをＴＢＳＴ中で洗浄し、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）との温置後、オートラジオグラフフィルムを使用して現像した。
哺乳動物細胞および酵母において発現されたＥＧＦＲ断片を使用するｍＡｂ１７５のマッピング
残基２７４、２８２、２９０および２９８で開始し、すべてアミノ酸５０１で終わる、ならびに成長ホルモンに融合させたものである、一連のオーバーラッピングｃ−ｍｙｃタグ付きＥＧＦＲ外部ドメイン断片は、以前に記載されている（Ｊｏｈｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，３０３７５−３０３８４）。酵母細胞表面でのＥＧＦＲタンパク質の発現を、以前に説明されている（Ｊｏｈｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）とおりに行った。
簡単に言うと、振盪プラットフォーム上の酵母窒素塩基とカゼイン加水分解産物とデキストロースとリン酸バッファーｐＨ７．４とを含有する最小培地中、３０℃で、５−６のＯＤ６００に達するまでおおよそ１日間、形質転換コロニーを成長させた。その後、タンパク質提示のために、ガラクトースを含有する最小培地に移すことにより酵母細胞を誘導し、２４時間、３０℃で振盪しながら温置した。その後、分析まで細胞を４℃で保管した。ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体９Ｅ１０を含有する未加工腹水をＣｏｖａｎｃｅ（カリフォルニア州リッチモンド）から入手した。１×１０６酵母細胞を氷冷ＦＡＣＳバッファー（１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で洗浄し、抗ｃ−ｍｙｃ腹水（１：５０希釈）またはヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）のいずれかと共に５０μＬの最終容積で１時間、４℃で温置した。その後、細胞を氷冷ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、光から保護してフィコエリトリン標識抗マウスＩｇＧ（１：２５希釈）と共に５０μＬの最終容積で１時間、４℃で温置した。酵母細胞を氷冷ＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）で蛍光データを得、ＷｉｎＭＤＩサイトメトリーソフトウェア（Ｊ．Ｔｒｏｔｔｅｒ、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）で分析した。線形対高次構造エピトープの判定のために、酵母細胞を８０℃で３０分間加熱し、その後、冷却し、２０分後に抗体で標識した。表７に列挙する一連のＥＧＦＲ突然変異体は、以前に記載されている（Ｊｏｈｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）
ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００をすべての実験に用いた。アミン、チオールまたはＰｍｓカップリングを５μＬ／分の流量で用いて、ＣＭ５センサーチップに、推定ｍＡｂ８０６エピトープを含有するペプチドを固定した（Ｗａｄｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４８，３１５−３１７）。ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５を２５℃で、５μＬ／分の流量でセンサー表面を通過させた。実行間に１０ｍＭ ＨＣｌを１０μＬ／分の流量で注入することにより表面を再生させた。
免疫沈降およびウエスタンブロッティング
細胞を２０分間、溶解バッファー（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ フッ化４−（２−（アミノエチル）、１５０ｎＭアプロチニン、１ｍＭ Ｅ−６４プロテアーゼ阻害剤、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ｍＭロイペプチン、ｐＨ７．４）で溶解し、３０分間の１４，０００ｘｇでの遠心分離により清澄化し、適切な抗体で６０分間、５μｇ／ｍＬの最終濃度で免疫沈降させ、一晩、セファロース−Ａビーズで捕捉した。その後、サンプルを２Ｘ ＮｕＰＡＧＥ ＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で溶出し、ＮｕＰＡＧＥゲル（３−８％または４−１２％のいずれか）で分割し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ転写膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気転写させ、その後、適切な抗体でプローブした後、化学発光ラジオグラフィーによって検出した。
免疫組織化学
凍結切片を、５μｇ／ｍＬ ｍＡｂ１７５または無関係なアイソタイプ対照で６０分間、室温で染色した。Ｄａｋｏ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋ ＨＲＰ検出システムを製造業者の説示に従って使用して、結合抗体を検出した。最後に切片を水ですすぎ、ヘマトキシリンで対比染色し、マウントした。
異種移植片モデル
１００μＬのＰＢＳ中のＵ８７ＭＧ．Δ２−７細胞（３×１０６）を、週齢４−６週の雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ、オーストラリア、パース）の両側腹部にｓ．ｃ．接種した。すべての研究は、以前に報告されている（Ｐｅｒｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１，６３９０−６３９９）ように確率腫瘍モデルを使用して行った。適切な図の説明文に示されている平均容積に腫瘍が達したら、治療を開始した。式（長さ×幅２）／２（式中、長さは、最長軸であり、幅は、垂直測定値であった）を用いて、ｍｍ３で腫瘍容積を決定した。各治療群について平均腫瘍容積±Ｓ．Ｅ．としてデータを表す。すべてのデータを有意性について片側スチューデントｔ検定により分析し、ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。この研究プロジェクトは、ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｕｓｔｉｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌにより承認された。
ＥＧＦＲ突然変異体構築物を発現する安定した細胞系の産生および特性づけ
部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を使用して、ｗｔＥＧＦＲの突然変異を生じさせた。各突然変異誘発についてのテンプレートは、ヒトＥＧＦＲ ｃＤＮＡ（アクセッション番号ｘ００５８８）（Ｕｌｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ．３０９，４１８−４２５）であった。各構築物の自動ヌクレオチドシークエンシングを行って、ＥＧＦＲ突然変異の完全性を確認した。野生型および突然変異体（Ｃ１７３Ａ／Ｃ２８１Ａ）ＥＧＦＲを電気泳動によりＢａＦ／３細胞にトランスフェクトした。
突然変異体ＥＧＦＲを発現する安定した細胞系を、ネオマイシン含有培地における選択によって得た。最終選択後、ｍＲＮＡを各細胞系から単離し、逆転写し、ＰＣＲによってＥＧＦＲ配列を増幅させた。発現されたＥＧＦＲにおけるすべての突然変異を、ＰＣＲ産物のシークエンシングによって確認した。ＰＢＳ、５％ＦＣＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、中１０μｇ／ｍＬの抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ５２８（Ｍａｓｕｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４４，１００２４００７；Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９，７７５５−７７６０）を使用し、続いてＡｌｅｘａ ４８８標識抗マウスＩｇ（１：４００の最終希釈）を使用して、ＦＡＸＳｔａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレーク）でのＦＡＣＳ分析により、ＥＧＦＲ発現レベルを判定した。クラスを合わせた無関係な一次抗体と共に細胞を温置することにより、バックグラウンド蛍光を決定した。すべての細胞を、ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ、ＷＥＨＩ３Ｂ調整培地および１．５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８中で常例的に継代させた。
突然変異体ＥＧＦＲのＥＧＦ依存性活性化
ｗｔＥＧＦＲまたはＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ−ＥＧＦＲを発現する細胞を洗浄し、血清およびＩＬ−３を伴わない培地中で３時間温置した。遠心分離により細胞を回収し、ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を含有する培地または同等の容積のＰＢＳに再浮遊させた。１５分後、細胞を回収し、ペレット化し、ｐ−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳ／ＰＡＧＥサンプルバッファーに直接溶解した。ＮｕＰＡＧＥ ４−１２％勾配ゲルでサンプルを分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ホスホチロシン（４Ｇ１０、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または抗ＥＧＦＲ抗体（ＬＩＣＲで生産したｍＡｂ８０６）でプローブした。化学発光を用いて反応性バンドを検出した。
細胞増殖に対するＥＧＦおよび抗体の効果
対数期の成長中の細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄して残留ＩＬ−３を除去した。細胞をＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＣＳに再浮遊させ、担体のみと共に、または漸増濃度のＥＧＦと共に、９６ウエルプレートに１０５細胞／ウエルで接種した。適切な場合には、固定濃度（２μｇ／ウエル）のｍＡｂ５２８またはｍＡｂ８０６も培養物に添加した。ＭＴＴアッセイ（ｖａｎ ｄｅ Ｌｏｏｓｄｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１７４，３１１−３２０）を用いて増殖を判定した。
高次構造特異的抗体との反応性
細胞を遠心分離により回収し、対照または試験抗体で染色し（すべて、ＦＡＣＳバッファーで洗浄した氷上で４０分間、ＦＡＣＳバッファー中１０μｇ／ｍＬで）、その後、Ａｌｅｘａ ４８８標識抗マウスＩｇ（１：４００の最終希釈、氷上で２０分）で染色した。氷冷ＦＡＣＳバッファーで細胞を２回洗浄し、遠心分離で回収し、ＦＡＣＳｃａｎで分析した；Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）内の統計ツールを使用して各サンプルについてのピーク蛍光チャネルおよび蛍光中央値を決定した。バックグラウンド（陰性対照）蛍光をすべての測定値から演繹した。ピーク形状および蛍光強度を最も代表するものとして蛍光中央値を選択し、ｍＡｂ８０６結合のｍＡｂ５２８結合に対する比を導出するために用いた。
Ｆａｂ １７５およびＦａｂ８０６、Ｆａｂ−ペプチド複合体の結晶構造決定ならびに溶解状態の８０６ペプチドエピトープのＮＭＲ構造
分子置換、ならびにＦａｂ８０６についてＲ＝０．２２５／Ｒｆｒｅｅ＝０．２８９およびＦａｂ８０６：ペプチドについてＲ＝０．２２６／Ｒｆｒｅｅ＝０．２７９；Ｆａｂ８０６についてＲ＝０．２１０／Ｒｆｒｅｅ＝０．３０５およびＦａｂ８０６：ペプチドについてＲ＝０．２０３／Ｒｆｒｅｅ＝０．２５７で修飾する精密化により、構造を決定した。
１０ｍｇ／ｍＬ Ｆａｂと０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４．６、６−８％ＦＰＥＧ６０００および１５−２０％イソプロパノールが入っているレザバーとを使用する懸滴蒸気拡散により、天然８０６Ｆａｂの結晶を成長させた。データ収集のために、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４．６、１０％ＰＥＧ６０００、１５−２０％イソプロパノールおよび１０％グリセロールを含有する凍結防止溶液に結晶を移した。その後、血症をナイロンループに取り付け、液体窒素に直接入れて瞬間冷凍した。
１０ｍｇ／ｍＬ Ｆａｂ−ペプチド複合体と０．２Ｍ酢酸アンモニウム １６−１８％ＰＥＧ ５，０００モノメチルエーテルが入っているレザバーとを使用する懸滴蒸気拡散により、８０６Ｆａｂ−ペプチド複合体の結晶を成長させて、シーディング技術により結晶品質を向上させた。データ収集のために、２５％グリセロールを補足したレザバーから成る凍結防止溶液に移した。その後、結晶をナイロンループに取り付け、液体窒素に直接入れて瞬間冷凍した。
１７５Ｆａｂ−ペプチド複合体の結晶を、先ず、Ｔｏｐａｚ結晶化システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、サンフランシスコ）を使用する自由界面拡散によって成長させた。微結晶を、類似の条件０．１Ｍビス−トリスプロパンバッファー、０．２Ｍ酢酸アンモニウムおよび１８％ＰＥＧ １０，０００で７ｍｇ／ｍＬ Ｆａｂを使用する用する懸滴蒸気拡散によって成長させた。その後、０．１５ｍぎ酸ナトリウムおよび１５％ＰＥＧ １５００へのストリークシーディングによって微結晶を改善して、小板形結晶を生じさせた。データ収集のために、２５％グリセロールを補足したレザバーから成る凍結防止溶液に移した。その後、結晶をナイロンループに取り付け、液体窒素に直接入れて瞬間冷凍した。
ＡＸＣＯ光学素子を装着したＲｉｇａｋｕ ｍｉｃｒｏｍａｘ−００７発生装置のＲ−ＡＸＩＳ ＩＶ検出器を使用して研究所内で８０６Ｆａｂおよび１７５Ｆａｂ複合体結晶に関する回折データを収集し、その後、ＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒを使用してこれらのデータを処理した。ビームラインＸ２９、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙでＡＤＳＣ ｑｕａｎｔｕｍ３１５ ＣＣＤ検出器を用いて８０６Ｆａｂ−ペプチド複合体データを収集し、これらのデータをＨＫＬ２０００（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．ａｎｄ Ｍｉｎｏｒ，Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｘ−ｒａｙ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｄａｔａ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｅ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））で処理した（データ収集統計を表９に示す。）。Ｆａｂ構造２Ｅ８の座標を用いてプログラムＭＯＬＲＥＰ（Ｖａｇｉｎ， Ａ． ａｎｄ Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，Ａ．（１９９７）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．３０，１０２２−１０２５）を用いる分子置換により天然８０６Ｆａｂを解明し、構造の精密化をＲＥＦＭＡＣ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ａｃｔａ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ ５３，２４０−２５５）およびＣｏｏｔでの分子ビルディング（Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．ａｎｄ Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．（２００４）Ａｃｔａ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ ６０，２１２６−２１３２）で行った。
８０６Ｆａｂ構造の座標を用いてプログラムＭＯＬＲＥＰを用いる分子置換により８０６−ペプチド構造と１７５Ｆａｂ−ペプチド構造の両方を解明し、精密化およびリビルディングを、再び、ＲＥＦＭＡＣ５、ならびにＣＯＯＴおよびＯで行った。最終構造の検証をＰＲＯＣＨＥＣＫ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．２６，２８３−２９１）およびＷＨＡＴＣＨＥＣＫ（Ｈｏｏｆｔ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８１，２７２）で行った。
ＮＭＲ研究
ＮＭＲ研究のために、１５ＮＨ４Ｃｌを補足したナイトハルト（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ）最小培地（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １１９，７３６−７４７）中でＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を成長させたことを除いてＦｉｒｌｉｅらによって以前に記載された方法（Ｆａｉｒｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２６，１７１−１７８）を用いてＳＨＰ２のＳＨ２ドメインへの融合体として１５Ｎ標識ペプチドを組換え生産した。ＣＮＢｒを使用して前記ペプチドを融合パートナーから開裂させ、逆相ＨＰＬＣにより精製し、この素性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析およびＮ末端シークエンシングによって確認した。前記ペプチドこれ自体内ではなく、８０６抗体結合配列内のメチオニン残基をロイシンに突然変異させて、融合パートナーからの開裂を可能にした。
ＮＭＲ研究に使用したサンプルは、５％２Ｈ２Ｏと７０ｍＭ ＮａＣｌと５０ｍＭ Ｎａ２Ｐ０４とを含有するｐＨ６．８のＨ２Ｏ溶液中で調製した。冷凍プローブを使用してＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ５００分光計において２９８Ｋですべてのスペクトルを獲得した。ｍ８０６Ｆａｂの不在下でのペプチドの逐次的割当てを、標準的２Ｄ ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹならびに１５Ｎ編集ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹスペクトルを用いて確立した。ペプチドとｆＡｂ８０６との相互作用を、ｆＡｂ８０６の不在および存在下での該ペプチドの１５Ｎ ＨＳＱＣをモニターすることによって検査した。ｆＡｂ８０６の存在下での前記ペプチドの１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルのスペクトル摂動は、該ペプチドが、存在溶液条件下でｆＡｂ８０６に結合できたことを明確に示す。複合形態の前記ペプチドの詳細な高次構造は、決定しなかった。ｍＡｂ８０６についてのランダムコイル化学シフト値からの偏差を図９３に示す。
患者におけるｃｈＡｂ８０６の生体内分布
インビトロでのｍＡｂ８０６の腫瘍特異性を実証するために、キメラバージョン（ｃｈ８０６）が設計され、ｃＧＭＰ条件生産された（Ｐａｎｏｕｓｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．９２，１０６９−１０７７）。８０６陽性腫瘍を有する患者におけるｃｈ８０６の安全性、生体内分布および免疫応答を評価するための第Ｉ相ファースト・イン・マン治験が行われ、安全性、生体内分布および薬物動態の結果が以前に報告されている（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４，４０７１−４０７６）。患者における正常組織（即ち肝臓）と比較して腫瘍におけるｃｈ８０６の特異性を定義するために、５−７ｍＣｉ（２００−２８０ＭＢｑ）１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の注射後１週間にわたって得た全身ガンマカメラ画像から１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の％注射用量（ＩＤ）を算出することにより、腫瘍および肝臓におけるｃｈ８０６の定量取り込みを行った。個々の患者それぞれにおける関心のある器官に基づいて、肝臓および腫瘍線量計算を行った。累積活性の計算を可能にする、バックグラウンドおよび減弱について補正した、１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６注入画像データセット。注射後１週間にわたって腫瘍および肝臓における１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の濃度を導出するために線量計算を行った。
ｂ．シークエンシング
ｍＡｂ１７５の可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）鎖をシークエンシングし、これらの層布袋決定領域を次のように同定した：
ｍＡｂ１７５ ＶＨ鎖：核酸（配列番号：１２８）およびアミノ酸（配列番号：１２９）配列を図７４Ａおよび７４Ｂにそれぞれ示す。図７４Ｂでは下線を引くことにより相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（それぞれ、配列番号：１３０、１３１および１３２）を指摘する。
ｍＡｂ１７５ ＶＬ鎖：核酸（配列番号：１３３）およびアミノ酸（配列番号：１３４）配列を図７５Ａおよび７５Ｂにそれぞれ示す。図７５Ｂでは下線を引くことにより相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（それぞれ、配列番号：１３５、１３６および１３７）を指摘する。
細胞系がクローン性でなく、従って、この細胞系から多数の配列が得られたので、ｍＡｂ１７５についての配列データは、配列構造と結晶構造の両方に基づく。上で述べたｍＡｂ１７５の配列を結晶構造により確認した。この配列は、標準配列データのみに基づく以前の配列とはＶＬ鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２のそれぞれにおいて１個だけアミノ酸が異なる。最終配列および結晶構造データに基づき、ｍＡｂ１７５の別のアイソタイプ（異常なＩｇＧ２ａアイソタイプ）も得られた。
ｍＡｂ１７５特異性
予備的結合研究は、ｍＡｂ１７５が、ＥＧＦＲに対してｍＡｂ８０６と類似した特異性を呈示することを示唆した。ｍＡｂ８０６（ＩｇＧ２ｂ）およびｍＡｂ１７５（ＩｇＧ２ａ）のＣＤＲ領域におけるアミノ酸配列はほぼ同一であり、それぞれにおけるアミノ酸の差異はたった１個である（図６５；下の実施例２６参照）。すべてのこれらの差異は、側鎖の電荷およびサイズを保存する。明らかに、これらの抗体は、独立して産生した。
ｃ．実験
ｍＡｂ１７５の特異性を分析するために１セットの免疫組織化学実験を行った。ｍＡｂ１７５は。ＥＧＦＲを過発現するＡ４３１異種移植片の切片（図６６Ａ）およびΔ２−７ＥＧＦＲを発現するＵ８７ＭＧ．Δ２−７神経膠腫異種移植片の切片（図６６Ａ）を染色した。対照的に、ｍＡｂ１７５は、Ｕ８７ＭＧ異種移植片切片を染色しなかった。Ｕ８７ＭＧ細胞系は、中程度レベルの野生型ＥＧＦＲしか発現せず（図６６Ａ）、検出可能なＥＧＦＲオートクラインループを有さない。最も重要なことに、ｍＡｂ１７５は、正常肝臓切片に結合しない（図６６Ｂ）。従って、ｍＡｂ１７５は、ｍＡｂ８０６と同じ特異性を有するように見える、即ち、これは過発現されたおよびトランケートされたヒトＥＧＦＲを検出するが、中程度レベルで発現されるｗｔＥＧＦＲを検出しない。
ｍＡｂ１７５エピトープの同定
ｍＡｂ１７５は、アミノ酸６−２７３を検出するΔ２−７ＥＧＦＲ、およびＥＧＦＲ１−５０１も結合するので、ｍＡｂ１７５エピトープは、残基２７４−５０１内に含まれていなければならない。ｍＡｂ８０６のエピトープを決定するとき、本発明者らは、すべてアミノ酸５０１で終わる、ヒトＧＨのカルボキシ末端に融合した一連のｃ−ｍｙｃタグ付きＥＧＦＲ断片を発現させた（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２，５３９−５５０；Ｊｏｈｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，３０３７５−３０３８４）。
ウエスタンブロットではｍＡｂ１７５も２７４−５０１ ＥＧＦＲ断片と２８２−５０１ ＥＧＦＲ断片の両方と反応したが、アミノ酸２９０および２９８で回避する断片を検出しなかった（図７３）。すべてのＧＨ−ＥＧＦＲ融合タンパク質の存在を、ｃ−ｍｙｃ抗体、９ＥＩ０を使用して確認した（図７３）。従って、ｍＡｂ１７５エピトープの重要な決定基は、アミノ酸２９０付近に位置する。最後に、ｍＡｂ８０６エピトープを欠失している（Δ２８７−３０２）２７４−５０１ ＥＧＦＲ断片は、ｍＡｂ１７５結合についても陰性であった（図７３）。このことは、この領域がｍＡｂ１７５結合の大部分を同様に決定したことを示唆している。
第二のアプローチを用いて、ｍＡｂ１７５エピトープをさらに特性づけした。ＥＧＦＲの細胞外ドメインを包含する断片を酵母の表面で発現させ、フローサイトメトリーを使用して間接的免疫蛍光によりｍＡｂ１７５結合について試験した。ｍＡｂ１７５は、Δ２−７ ＥＧＦＲの細胞外ドメインに対応する酵母断片２７３−６２１を認識したが、断片１−１７６、１−２９４、２９４−５４３、および４７５−６２１を認識になかった（図６７Ａおよび図６７Ｂ）。従って、ｍＡｂ１７５エピトープの少なくとも一部は、ＥＧＦＲ断片を使用する免疫ブロッティングデータと一致して、アミノ酸２７４−２９４間の領域内に含まれていなければならない。ｍＡｂ１７５は、２７３−６２１の変性断片に結合する（図６７Ｃ）ので、このエピトープは、事実上、線形でなければならない（図７３）。ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５がＥＧＦＲの類似した領域および高次構造を認識することは、明白である。
表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて、ＥＧＦＲペプチド（２８７ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ３０２；配列番号：１３８）へのｍＡｂ１７５の結合を調査した。アミン、チオール−ジスルフィド交換またはＰｍｓ−Ｓｅｒカップリング化学を用いて、ＥＧＦＲ２８７−３０２をバイオセンサー表面に固定した。後述の方法は、排他的にＮ末端システインによりペプチドを固定する（Ｗａｄｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４８，３１５−３１７）。
ｍＡｂ１７５は、すべての配向でＥＧＦＲ２８７−３０２を結合した（表６）。ＥＧＦＲ２８７−３０２に対するｍＡｂ１７５の親和性は、Ｐｍｓ−セリンカップリングについての３５ｎＭからアミンカップリングについての１５４ｎＭにわたった。すべての場合、ＥＧＦＲ２８７−３０２に対するｍＡｂ１７５の結合親和性は、ｍＡｂ８０６について得られたものより低かった（表６）。本発明者らは、ＥＧＦＲの２つの異なる細胞外断片へのｍＡｂ１７５の親和性も判定した。ｍＡｂ１７５は、１−５０１断片に、ペプチドを用いて得たものに類似した親和性で、結合した（１６ｎＭ対３５ｎＭ）（表６）。予想どおり、テザリングされた高次構造を形成し得る１−６２１完全長細胞外ドメインに対するｍＡｂ１７５の親和性は、はるかに低かった（１８８ｎＭ）。ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５は、ＥＧＦＲ２８７−３０２に対して類似した親和性を有するが、ｍＡｂ１７５は、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに対して、より高い親和性を示すようである（表６）。明らかに、ｍＡｂ１７５エピトープは、ＥＧＦＲ２８７−３０２内に含まれており、およびｍＡｂ８０６と同様、ＥＧＦＲの細胞外ドメインへの結合親和性は、高次構造に依存する。
Figure 0006317780
酵母の表面で発現される、２７３−６２１ ＥＧＦＲ断片の突然変異体のパネル（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２，５３９−５５０；Ｊｏｈｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，３０３７５− ３０３８４）を用いて、ｍＡｂ１７５エピトープの構造を特性づけした。ｍＡｂ１７５およびｍＡｂ８０６は、突然変異体へのほぼ同一の反応性パタンを呈示した（表７）。２８７−３０２ジスルフィド結合のみの破壊は、エピトープ反応性に対して中等度の効果しかなかった。抗体が、Ｃ２８７でのすべての突然変異体に、およびＣ３０２でのすべてではないが多少の突然変異体に結合したからである（表７）。ｍＡｂ１７５結合にとって重量なアミノ酸としては、Ｅ２９３、Ｇ２９８、Ｖ２９９、Ｒ３００およびＣ３０２が挙げられる（表７）。ｍＡｂ１７５は、突然変異Ｖ２９９およびＤ２９７に対する感度のほうが適度に高いようであったが、これらの部位での幾つかの突然変異への結合低減も示した（表７）。重ねて、ｍＡｂ１７５エピトープは、ｍＡｂ８０６によって認識されるエピトープと本質的に同じように見える。
Figure 0006317780
Δ２−７ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲオートクラインループによる刺激を受けた腫瘍異種移植片に対するｍＡｂ１７５の効力
Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７神経膠腫異種移植片に対するｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５のインビボ抗腫瘍活性を検査した。異種移植片を６日間、確率させた後、抗体療法（２週間、週３回、指示された日に）を開始した。この時点で、平均腫瘍容積は、１００ｍｍ３であった（図６８Ａ）。ｍＡｂ１７５治療は、ビヒクルまたはｍＡｂ８０６での治療と比較して全腫瘍成長を低減させる結果となり、対照動物を倫理的理由で犠牲にした、接種後１９日の時点で非常に有意であった（Ｐ＜０．０００１対対照およびＰ＜０．００２対ｍＡｂ８０６）。この時点での平均腫瘍容積は、ビヒクル、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５治療群についてそれぞれ１５３０、３００および１００ｍｍ３であった（図６８Ａ）。このことにより、Δ２−７ ＥＧＦＲを発現する異種移植片に対するｍＡｂ１７５活性の抗腫瘍活性が確証される。
Ｕ８７ＭＧ細胞が、１細胞につきおおよそ１×１０５ＥＧＦＲを発現したとしても、ｍＡｂ８０６は、いずれの表面ＥＧＦＲも認識することができず、および驚くべきことに、Ｕ８７ＭＧインビボ成長を阻害しない。さらに、これらの細胞は、いずれのＥＧＦＲリガンドも共発現しない。ＥＧＦＲエピトープが、一過性発現されるかどうか、ならびに従って、ＥＧＦＲオートクラインループを有する細胞においてｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５によって認識され得るかどうかに関する研究を行った。前立腺細胞系ＤＵ１４５は、Ｕ８７ＭＧ細胞において観察されるのに類似したレベルでｗｔＥＧＦＲを発現するが、Ｕ８７ＭＧ細胞とは異なり、ＤＵ１４５細胞は、ＴＧＦ−α遺伝子の増幅を含み、従って、ＥＧＦＲ／ＴＧＦ−αオートクラインループを示す。ｍＡｂ１７５および８０６は、両方とも、ＦＡＣＳ分析により判定するとＤＵ１４５細胞に結合し（図５８Ｂ）、ならびに両方とも、これらの細胞から抽出されるＥＧＦＲの小率を免疫沈降させることができる（図６８Ｃ）。療法の技術が、ｍＡｂ１７５結合のより多い結合を示したが、Ｌ２ドメインに結合するｍＡｂ５２８と比較したとき、ｍＡｂ１７５およびｍＡｂ８０６は、これらの細胞の表面のＥＧＦＲのサブセットしか結合しない（図６８Ｂおよび６８Ｃ）。第二の前立腺細胞系（ＬｎＣａｐ）；（データを示さない。）および結腸系（ＬＩＭ１２１５）［これらの両方も、ＥＧＦＲオートクラインループを有する（Ｓｉｚｅｌａｎｄ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ａ．Ｗ．（１９９２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３，１２３５−１２４３；Ｓｉｚｅｌａｎｄ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ａ．Ｗ．（１９９１）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１，４００５−４０１４）］に関しても、類似した観察が見られた。明らかに、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５は、オートクライン刺激ループの存在下では細胞上のＥＧＦＲの小率しか認識できない。
ｍＡｂ１７５およびｍＡｂ８０６は、Ｕ８７ＭＧ細胞よりＤＵ１４５細胞において発現されたＥＧＦＲのほうに有効に結合するので、ヌードマウスにおいて成長させたＤＵ１４５異種移植片におけるこれらの抗体の抗腫瘍活性を分析するための研究を行った。異種移植片を１８日間確率させた後、療法（３週間、週３回、指示された日に）を開始した。この時点での平均腫瘍容積は、９０ｍｍ３であった（図６８Ｄ）。ｍＡｂ１７５とｍＡｂ８０６の両方が、ＤＵ１４５異種移植片の成長を阻害した。対照群を第６７日に犠牲にし、この群は、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５群についてのそれぞれ６０５および８１５ｍｍ３（それぞれ、ｐ＜０．００７および０．０２）と比較して、１１４５ｍｍ３の平均腫瘍容積を有した（図６８Ｄ）。
ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５のＦａｂ断片と接触しているＥＧＦＲ２８７−３０２の３Ｄ構造
ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５が、すべてではないが多少高次構造のＥＧＦＲをどのようにして認識できるのかについての分子的詳細を理解するために、両方の抗体についてのＦａｂ断片の結晶構造を、酸化されたＥＧＦＲ２８７−３０２エピトープ（それぞれ、解像度２．０および１．５９Å）との複合体でおよび単独（それぞれ、解像度２．３Åおよび２．８Å）で判定した。両方の場合、遊離Ｆａｂ構造と複合体化Ｆａｂ構造は、本質的に同じであり、これらの抗体のペプチドおよびＣＤＲループの高次構造は、輪郭がはっきりしていた（図６９）。エピトープは、β−リボン構造をとり、このリボンの一端は、Ｆａｂのほうを向いており、Ｖ２９９は、抗原結合部位の中央に埋もれている（図６９Ｃ−Ｅ）。エピトープの両端が溶媒に露出されており。このことは、はるかに長いポリペプチドへのこれらの抗体の結合に矛盾しない。
エピトープと接触している２０の抗体残基のうち、３つは、ｍＡｂ８０６とｍＡｂ１７５とで２つしか置換を有さない（図６５）。ｍＡｂ１７５接触残基は、軽鎖Ｓ３０、Ｓ３１、Ｎ３２、Ｙ４９、Ｈ５０、Ｙ９１、Ｆ９４、Ｗ９６および重鎖Ｄ３２、Ｙ３３、Ａ３４、Ｙ５１、Ｓ５３、Ｙ５４、Ｓ５５、Ｎ５７、Ｒ５９、Ａ９９、Ｇ１００、Ｒ１０１であり；ｍＡｂ８０６接触残基は、同じであるが、軽鎖についてＮ３０および重鎖についてＦ３３の配列の違いがある。ＥＧＦＲ２８７−３０２は、ペプチド残基２９３−３０２間の密接によりＦａｂに結合し、該接触の大部分は、残基２９７と３０２と間でのものある。ＥＧＦＲ２８７−３０２の主鎖原子とＦａｂの間の水素結合だけは、残基３００と３０２についてのものである（図６９Ｆ）。エピトープ配列の認識は、残基Ｅ２９３（ＦａｂのＨ５０およびＲ１０１への）、Ｄ２９７（Ｙ５１およびＮ５７への）、Ｒ３００（Ｄ３２への）およびＫ３０１（水分子によるＹ５１およびＷ９６への）への側鎖水素結合によって起こる。疎水性接触は、Ｇ２９８、Ｖ２９９およびＣ３０２でなされる。
２９３と３０２の間のエピトープ骨格の高次構造は、Ｆａｂ８０６およびＦａｂ１７５結晶において本質的に同一であった（これらの残基にこけるＣα原子について、ｒｍｓ偏差＝０．４Å）。ジスルフィド結合により拘束されるが、ペプチドのＮ末端（２８７−２９２）は、いずれの抗体構造において有意に接触せず、この領域の高次構造は異なる。しかし、Ｆａｂ８０６複合体におけるこのセグメントは、どちらかと言えば不規則に見える。より興味深いことに、抗体と接触しているＥＧＦＲ２８７−３０２エピトープの高次構造は、テザリングされたまたはテザリングされていないＥＧＦＲ構造の骨格内で観察されるＥＧＦＲ２８７−３０２高次構造に相当密接に関連している（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｇａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００２）。Ｆａｂ１７５複合体からのＥＧＦＲ２８７−３０２について、Ｃα位置におけるｒｍｓ偏差は、それぞれ、０．６６および０．７５Åである（図６９）。
ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５によるＥＧＦＲの認識をさらなるに洞察するために、１５Ｎ標識酸化ペプチドＥＧＦＲ２８７−３０２の高次構造を、溶解、遊離状態で、および８０６Ｆａｂの存在下でＮＭＲにより研究した（「材料および方法」参照）。遊離ペプチドについては、共鳴を割当て、ランダムコイルについてのものと比較した。本質的に、遊離ペプチドは、天然ＥＧＦＲにおいて見られるようなベータリボンではなく、ランダムコイル構造をとる（Ｇａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００２Ｃｅｌｌ ２０；１１０，７６３−７７３）。
Ｆａｂを添加すると、共鳴シフトが観察された。しかし、Ｆａｂの添加および複合体の結晶化成功に基づく有意な線幅拡大から生ずる弱いシグナルのため、Ｆａｂ８０６−エピトープ複合体の溶解構造をさらに追跡しなかった。しかし明らかに、ペプチドがｍＡｂ８０６（またはｍＡｂ１７５）のＦａｂ断片に結合すると、Ｆａｂは、天然受容体におけるこのペプチドに匹敵するペプチドの高次構造を選択または誘導するようである。
ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５がＥＧＦＲの一部の高次構造しか認識しない理由を研究するために、ｍＡｂ１７５のＦａｂ断片を、ＥＧＦＲ２８７−３０２をスーパーインポーズすることにより、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン（テザリングされたまたはテザリングされていないモノマー）にドッキングさせた。Δ２−７様断片については、受容体との有意な立体衝突はなかった。テザリングされていない形態では、Ｆａｂの接近可能表面が、より多く埋もれていた（テザリングされた形態での５５０Å２と比較して９２０Å）。従って、この抗原を、酵母発現突然変異体によって示されたように（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２，５３９−５５０）、抗体の非ＣＤＲ領域とさらに接触させることができる。逆に言えば、全ＥＧＦＲ外部ドメインをＦａｂにドッキングさせると、エピトープの前（残基１８７−２８６）のおよびＦａｂの中央にわたるＣＲ１ドメインの一部との実質的な空間的オーバーラップがある（図６９Ｄおよび６９Ｅ）。従って、ＣＲ１ドメインは、テザリングされた高次構造またはテザリングされていない高次構造において本質的に同じ構造を有するので、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５は、いずれの形態のＥＧＦＲにも結合できないであろう。明らかに、ｗＥＧＦＲのいずれかの既知高次構造でのＣＲ１ドメインに関するエピトープの配向と、エピトープ結合を可能異にする配向は、異なるに相違ない。ＣＲ１ドメインの検査は、ＥＧＦＲ２８７−３０２の前のジスルフィド結合（２７１−２８３）が、エピトープへの接近の障害となるポリペプチドを拘束することを示し；このジスルフィドの分解は、これが抗体への直接結合に関与していなかったとしても、ＣＲ１ドメインを部分的にアンフォールディングさせるので、ｍＡｂ１７５またはｍＡｂ８０６がエピトープに接近することができると予想されよう。
ＥＧＦＲ ２７１−２８３ジスルフィド結合の破壊は、ｍＡｂ８０６結合を増加させる
タンパク質中のジスルフィド結合は、構造剛性をもたらすが、一部の細胞表面受容体、特に、サイトカインおよび成長因子についてのものでは、ジスルフィド結合の一過的破壊およびジスルフィド結合変化が受容体の機能を支配する場合がある（Ｈｏｇｇ，Ｐ．Ｊ．（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２８，２１０−２１４）。これは、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５がこれらの結合部位に接近できる１つのメカニズムであったので、位置２７１および２８３のいずれかまたは両方のシステイン残基をアラニン残基に突然変異させること（Ｃ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ）により、エピトープへの接近容易性増大を試みた。完全長Ｃ２７１Ａ−、Ｃ２８３Ａ−またはＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ−ＥＧＦＲを発現することができるベクターをＩＬ−３依存性Ｂａ／Ｆ３細胞系にトランスフェクトした。Ｃ２７１Ａ−およびＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ−ＥＧＦＲ突然変異体をｗｔＥＧＦＲと同等のレベルで発現する、安定したＢａ／Ｆ３クローンを選択した（図７０Ａ）。高レベルの突然変異Ｃ２８３Ａ−ＥＧＦＲを発現するＢａ／Ｆ３細胞は、観察されなかった。前に説明したように、ｗｔＥＧＦＲは、ｍＡｂ８０６とあまり反応しないが、突然変異受容体は、Ｍａｂ５２８、ｍＡｂ８０６および抗ＦＬＡＧ抗体と、同等に強力に反応した。このことは、この受容体が、細胞表面で発現され、正しくフォールディングされること、およびこのような場合、ｍＡｂ８０６がエピトープに完全に接近できることを示唆している。ｍＡｂ８０６が、Ｃ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ突然変異体をｗｔＥＧＦＲより効率的に認識することを確認するために、ｍＡｂ８０６結合のｍＡｂ５２８の結合に対する比を決定した。野生型ＥＢＦＲとＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ ＥＧＦＲの両方にＮ末端ＦＬＡＧタグを付けたので、Ｍ２抗体に対するｍＡｂ８０６およびｍＡｂ５２８結合の比も決定した。前に報告したように、ｍＡｂ８０６は、Ｂａ／Ｆ３細胞の表面で発現された全ｗｔＥＧＦＲの小率しか認識しなかった（ｍＡｂ８０６／５２８結合比は、０．０８である。）（表８）。対照的に、ｍＡｂ８０６は、この細胞表面で発現されたＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ突然変異体ＥＧＦＲの事実上すべてを認識した（１．０１のｍＡｂ８０６／５２８結合比）（図７０Ａおよび表８）。
Figure 0006317780
 ＊４つの独立したクローンについての平均
２つのシステインの突然変異は、ＥＧＦＲ結合および受容体機能を損なわせなかった。Ｃ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ ＥＧＦＲ突然変異体を発現するＢａＦ３細胞は、ＥＧＦの存在下で増殖する（図７０Ｂ）。Ｃ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ突然変異を発現する細胞におけるＥＧＦについての用量応答曲線の左シフトが再現性よく観察された。このことは、リガンドに対してのより高い親和性、または突然変異受容体についての向上されたシグナリング可能性を示唆している。ウエスタンブロット分析により、Ｃ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ突然変異体がｗｔＥＧＦＲに類似したレベルで発現されること、およびＥＧＦＲ刺激に応答してチロシンリン酸化されることが確認された（図７０Ｃ）。他の細胞系での以前の研究と一致して、ｍＡｂ８０６は、ｗｔＥＧＦＲを発現するＧａ／Ｆａ細胞のインビトロＥＧＦ誘導増殖に対して効果がないが、リガンド遮断性ｍＡｂ５２８は、これらの細胞のＥＧＦ誘導増殖を完全に阻害する（図７０Ｄ、左パネル）。対照的に、ｍＡｂ８０６は、Ｃ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ突然変異体を発現するＢａＦ細胞におけるＥＧＦ誘導増殖を完全に除去した（図７０Ｄ、右パネル）。２７１−２８３システインループが破壊されると、ｍＡｂ８０６は、より有効に結合するばかりでなく、一旦結合すると、ｍＡｂ８０６は、リガンド誘導増殖を防止する。
Figure 0006317780
考察
ＥＧＦＲ２８７−３０２エピトープに関する構造研究は、ｍＡｂ８０６とｍＡｂ１７５の両方が、ｗｔＥＧＦＲ構造内の同じ３Ｄ構造モチーフを認識したことを明らかにし、この骨格高次構造が、Δ２−７ＥＧＦＲにも存在し、露出していることを示している。しかし、批判的には、これらの構造内のエピトープの配向は、関連アミノ酸への抗体接近を妨げるであろう。このことは、ｍＡｂ８０６が、生理レベルで細胞表面において発現されたｗｔＥＧＦＲを結合しないという実験観察と一致している。
ＥＧＦＲＣ２７１Ａ／Ｃ２８３Ａ突然変異体での結果は、ＣＲ１ドメインが、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５をこの突然変異受容体に化学量論的に結合させることに利用できようになり得ることを示している。この突然変異受容体は、ＥＧＦ刺激に対して十分な感受性があるので、依然として天然高次構造をとる場合があるが、ｗｔＥＧＦＲとは異なり、ｍＡｂ８０６によって完全に阻害される。この壊れたジスルフィド結合を有するＥＧＦＲのミスフォールディングされた形態が、癌細胞の表面に存在し得る場合、このデータは、これが、細胞シグナリングを開始させることができるであろうことおよびｍＡｂ８０６またはｍＡｂ１７５のいずれかによって阻害されるはずであることを明確に示す。
データのもう１つの説明は、リガンド活性化中、受容体の再配列がエピトープの付近での局所的アンフォールディングを誘導することがあり、この結果、この受容体に、結合を可能にする高次構造をとらせるということである。結晶構造の場合、エピトープは、ＥＧＦＲ外部ドメインの物理的中心付近に位置し、フォールディングされたＣＲ１ドメインとＥＧＦＲ外部ドメインの四次構造の両方によってエピトープへの接近が阻まれる。テザリングされたおよびテザリングされていない高次構造の場合、ＣＲ１ドメインの完全性は、Ｌ１：リガンド：Ｌ２ドメイン（テザリングされていない場合）またはＬ２：ＣＲ２ドメイン（テザリングされいる場合）のいずれかとの追加の相互作用によって安定化される。しかし、エピトープ領域は、外部ドメインにおいて見つけられる最高熱パラメータの幾つかを有する：ｍＡｂ８０６／１７５エピトープは、構造不安定性である。受容体活性化中に、受容体が、テザリングされた高次構造とテザリングされていない高次構造の間での転位を受けると、ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５は、エピトープに接近できる。従って、分子レベルでは、これらのメカニズムは、正常細胞へのｍＡｂ８０６およびｍＡｂ１７５の無視できる程度の結合、ならびに過発現されたおよび／または活性化されたＥＧＦＲを有する腫瘍細胞への実質的により高い結合レベルの一因となり得る。
モノクローナル抗体１２４および１１３３
上の実施例１において論じたように、ｍＡｂ１２４およびｍＡｂ１１３３をｍＡｂ８０６と同時に産生させ、これらが、本明細書において論ずるｍＡｂ８０６の特有の特性に類似した特性、特に、過発現された野生型ＥＧＦＲに対する特異性を呈示することが判明した。
最初のスクリーニングは、ニューヨークで行われた（Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒｓ ｗｉｔｈ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ／Ｏｖｅｒ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＰＮＡＳ．１００，６３９−６４４）。ＥＬＩＳＡ競合評定およびＢｉａｃｏｒｅ分析を行って、ｍＡｂ１２４および／またはｍＡｂ１１３３が、ｍＡｂ８０６と同一のエピトープまたは代替ＥＧＦＲ決定基を認識するかどうかを判定した。
ＦＡＣＳ分析
Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７、Ａ４３１およびＨＮ５細胞への抗体結合をＦＡＣＳによって評定した。すべての抗体が、ｄｅ２−７ ＥＧＦＲへの強い結合および過発現された野生型ＥＧＦＲへの少ない結合を有するｍＡｂ８０６のものと類似した特異性を呈示した。
競合ＥＬＩＳＡ
一連の競合ＥＬＩＳＡを行って、１２４および１１３３抗体がｍＡｂ８０６エピトープと競合するかどうかを判定した。簡単に言うと、ＥＧＦＲ（ｓＥＧＦＲ）の変性可溶性ドメインをＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。その後、未標識１２４、または１１３３抗体を漸増濃度でこのプレートの全域に添加した。洗浄後、ビオチン化ｍＡｂ８０６を各ウエルに添加して、これが依然としてｓＥＧＦＲを結合できるかどうかを判定した。結合しているｍＡｂ８０６の検出は、ストレプタビジンコンジュゲート型ＨＲＰを使用して果たした。抗体が、ｍＡｂ８０６と同じ（または重複する）エピトープに結合する場合には、ｍＡｂ８０６結合は期待されない。
結果を表１０にまとめる。濃度依存性阻害性結合効果が、ｍＡｂ１２４およびｍＡｂ１１３３について観察された：ｍＡｂ８０６結合は、未標識抗体濃度が減少するにつれて増加した。このことは、１２４および１１３３抗体が、ｍＡｂ８０６と同一のエピトープまたは極めて近接しているものを認識することを示唆している。
Figure 0006317780
ＦＡＣＳ分析：細胞結合競合
Ｕ８７ＭＧ．Δ２−７を未標識抗体１２４、１１３３と共に前保温した。陽性対照８０６およびアイソタイプ対照をアッセイに含めた。細胞を洗浄し、その後、Ａｌｅｘａ４４８コンジュゲート型ｍＡｂ８０６で染色し、ＦＡＣＳにより８０６結合レベルを判定した。
結果を表１１にまとめる。１２４および１１３３抗体は、細胞表面へのｍＡｂ８０６の結合を遮断した。このことは、ｍＡｂ８０６または極めて近接しているものの認識を示す。
Figure 0006317780
ＢＩＡｃｏｒｅ分析：ｍＡｂ８０６ペプチドエピトープへの結合
ｍＡｂ８０６エピトープを含有するＥＧＦＲアミノ酸配列２８７ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ３０２（配列番号：１４）をペプチドとして合成し、バイオセンサーチップ上に固定した。このエピトープへの抗体１２４、１１３３および８０６（２００ｎＭ）の結合を測定した。得られた最大結合共鳴ユニット（ＲＵ）を表１２にまとめる。１２４、１１３３は、８０６ペプチドエピトープの認識を確証する、ペプチドへの明確な結合を示した。
Figure 0006317780
考察
本実施例において証明されるように、ｍＡｂ１２４およびｍＡｂ１１３３は、ｍＡｂ８０６によって認識されるＥＧＦＲペプチドに結合し、ならびにＥＧＦＲの細胞外ドメインおよびｄｅ２−７ ＥＧＦＲを発現する細胞へのｍＡｂ８０６の結合を遮断する。従って。これら３つの抗体は、ＥＧＦＲ上の同じ決定基を認識する。
ｃｈ８０６の臨床治験
様々な腫瘍タイプを有する患者における腫瘍ターゲッティング／生体内分布／薬物動態分析においてｃｈ８０６のインビボ特異性を検査するための臨床試験を計画した。
１．材料および方法
治験計画
このファースト・イン・マン治験は、非盲検、用量漸増第Ｉ相試験であった。主目的は、８０６抗原を発現する進行腫瘍を有する患者におけるｃｈ８０６の単回注入の安全性を評価することであった。第二の試験目的は、１１１Ｉｎ−ＣＨ８０６の生体内分布、薬物動態および腫瘍取り込み量を判定すること；ｃｈ８０６に対する患者の免疫応答を判定すること；ならびにｃｈ８０６の臨床活性の初期の証拠を評定することであった。腫瘍上に発現されたＥＧＦＲに対するｃｈ８０６のインビボ特異性を最適に評定するために、単回投与をこの試験に選択した。このプロトコルは、試験開始前にｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｕｓｔｉｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌによる承認を受けた。この治験は、ｔｈｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｇｏｏｄｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｃｌｉｎｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｅｘｅｍｐｔｉｎ（ＣＴＸ）スキームのもとで行った。すべての患者から書面でのインフォームドコンセントを得た。
適格性基準は、以下を含んだ：保管腫瘍サンプルの化学発光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ｉｎ−ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）または免疫組織化学に基づき８０６抗原発現について陽性の進行または転移性腫瘍（保管腫瘍サンプルの免疫組織化学評定が、８０６発現について陽性のいずれかの細胞を示した場合、腫瘍を８０６陽性と定義した、下記参照）；組織学的にまたは細胞学的に証明された悪性；少なくとも１つの病変が≧２ｃｍである、ＣＴスキャンで測定可能な疾患；少なくとも３ヶ月の期待生存期間；カルノフスキー・パフォーマンス・スケール（ＫＰＳ）≧７０；妥当な血液学的、肝臓および腎臓機能；年齢＞１８歳；ならびにインフォームドコンセント提出可能。除外基準は、以下を含んだ：活性中枢神経系転移（妥当な治療を受けており安定しいる場合を除く）；試験登録前４週間以内の化学療法、免疫療法、生物学的療法、または放射合線療法；以前の抗体暴露［ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）の形跡がない場合を除く］；以前の癌療法の作用から完全に回復していないこと；全身性コルチコステロイドまたは免疫抑制剤の併用；管理されていない乾癬または他の重篤疾患；妊娠または授乳期；医学的に許容された避妊手段を使用していない妊娠している可能性のある女性。
生理食塩液／５％ヒト血清アルブミン中の、インジウム−１１１（１１１Ｉｎ、２００−２８ＭＢｑ；５−７ｍＣｉ）で追跡標識したｃｈ８０６の、６０分にわたる静脈内注入による単回注入を患者に施した。計画用量漸増は、患者が４用量レベル：５、１０、２０および４０ｍｇ／ｍ２、のうちの１つに登録することを意味した。腫瘍上に発現されたＥＧＦＲに対するｃｈ８０６の特異性を評定できるように、ならびにいずれかの正常組織コンパートメントがｃｈ８０６結合したかどうか（および薬物動態または生体内分布への影響）をインビボで判定するために、これらの用量を選択した。生体内分布、薬物動態、および免疫応答をすべての患者において評価した。
生体内分布および腫瘍取り込み量の評定のために全身ガンマ・カメラ・イメージングを、１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６注入後第０日、第１日、第２または３日、第４または５日、および第６または７日に行った。薬物動態のための血液サンプルをこれらの時点、ならびに加えて第１４日（±２日）および第２１日（±２日）に採取した。ＨＡＣＡレベルの評定のための血液サンプルは、ベースラインで、および第３０日まで週１回、採取した。各試験訪問時に毒性評定を行った。身体検査ならびに常例的血液学および生化学検査を、試験終了（第３０日）まで週１回行った。第３０日に再び病期分類を行った。
用量漸増基準
各用量レベルの第一の患者を４週間、観察した後、任意の追加の患者が登録した。ｃｈ８０６３の注入の４週間以内に最初に２人の患者のいずれにおいても用量制限毒性（ＤＬＴ）が観察されなかった場合には、４人の患者を次に高い投薬力価で参加させることとなった。２人の患者の任意のコホート内の一方の患者が、初回投与から４週間以内にＤＬＴを経験した場合、追加の４人の患者（最大６人）をこの投薬レベルで参加させた。任意の用量レベルでの６人のうち１人より多くが、グレード３以上の毒性を経験しなかった場合、その後の患者を次の用量レベルで参加させた。
ＮＣＩ有害事象共通用語基準（Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ：ＣＴＣＡＥ ｖ３．０）によって定義されているとおり、グレード３ 非血液毒性、またはグレード４ 血液毒性としてＤＬＴを定義した。最大耐用量（ＭＴＤ）は、６人のうち２人以上の患者がＤＬＴを経験した場合のものより低いｃｈ８０６用量と定義した。
Ｃｈ８０６の放射標識
臨床グレードｃｈ８０６を、オーストラリア、メルボルンのｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅｒｃｈにおいて生産した。以前に記載されている方法（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０，３２５４−３２６１；Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９（１９），３９７６−３９８７）に従って二官能性金属イオンキレートＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡにより１１１Ｉｎ（ＭＤＳ Ｎｏｒｄｉｏｎ、カナダ、カナタ）で抗体ｃｈ８０６を標識した。
ガンマ・カメラ・イメージング
１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６生体内分布の全身画像を、１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の注入後第０日に、および注入後第７日までの少なくとも３回のさらなる機会に、すべての患者に関して得た。既知腫瘍を有する身体領域の単一光子放射コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）画像も、この期間中に少なくとも１回得た。すべてのガンマカメラ画像を二検出器ガンマカメラ（Ｐｉｃｋｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、オハイオ州クリーヴランド）で獲得した。
薬物動態
薬物動態分析用の血液を１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６注入前第０日に採取し；その後、１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６後５分、６０分、２時間および４時間の時点、第１日、第２または３日、第３または５日、および第６または７日に採取した。ｃｈ８０６タンパク質の薬物動態のためのさらなる血液を第１４日（±２日）および第２１日（±２日）および第３０日（±２日）にも得た。
血清サンプルを二つ組で当分し、適切な１１１Ｉｎ標準物質と一緒に、ガンマ・シンチレーション・カウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、オーストラリア、メルボルン）で計数した。血清の結果を％注射用量毎リットル（％ＩＤ／Ｌ）で表示する。各注入後の患者血清ｃｈ８０６タンパク質レベルの測定は、ヒト血清中のｃｈ８０６タンパク質の免疫化学測定についての検証済プロトコル４０を用いて行った。血清サンプル中のｄｈ８０６についての定量限界は、７０ｎｇ／ｍＬであった。すべてのサンプルを三重反復でアッセイし、および少なくとも１：２倍に希釈した。ｃｈ８０６の測定血清レベルをμｇ／ｍＬとして表示する。
曲線適合プログラム（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏ Ｎｏｄｅ ５．０．１、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏ、カリフォルニア州マウンテンヴュー）を使用して、注入後の血清１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６測定値、およびＥＬＩＳＡで決定した患者血清ｃｈ８０６タンパク質レベルを用いて薬物動態計算を行った。次のパラメータについての推定値を決定した：Ｔ１／２αおよびＴ１／２β（体内動態の分布相および消失相の半減期）；Ｖ１、中心コンパートメントの容積；Ｃｍａｘ（最大血清濃度）；ＡＵＣ（無限時間に外挿した血清濃度曲線下面積）；およびＣＬ（全血清クリアランス）。
１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の全血クリアランスならびに腫瘍および臓器線量計測
それぞれの個々の患者の１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６注入画像データセットにおいて関心のある領域に基づき全血および正常器官（肝臓、肺、腎臓および脾臓）線量計算を行い、これによって累積活性を計算すること、およびＯＬＩＮＤＡを使用する最終線量計測結果について分析することができた（Ｓｔａｂｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４６（６），１０２３−１０２７）。バックグラウンドおよび減弱について補正した１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６画像データセットを用いて、各時点で、関心のある領域を適する腫瘍についても定義し、線量計算を行って、腫瘍／ｇｍで１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の濃度を導出した（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１（１３），４８１０−４８１７）。この値を、注入したｍｇ ｃｈ８０６タンパク質用量に基づいて、μｇ ｃｈ８０６／ｇｍ 腫瘍に変換した。
ＨＡＣＡ分析
ＨＡＣＡ評定のための血液サンプルをｃｈ８０６注入前に採取し、その後、ｃｈ８０６注入後３０日まで週１回採取した。前に記載されているように（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ ２２（４），２１９−２８；Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１（１８），６８５−６８５９）、サンプルをＥＬＩＳＡにより、およびＢＩＡｃｏｒｅ２０００計器を使用する表面プラズモン共鳴技術により、分析した。
免疫組織化学的方法
治験中の各患者からのホルマリン固定パラフィン包埋組織を次のように免疫染色した：簡単に言うと、パラフィン包埋組織の４μｍ切片をＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ（登録商標）Ｐｌｕｓスライド（Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｓｅｒ、ドイツ）にマウントし、脱パラフィンし、再水和した後、Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ｐＨ６．０（１０分；Ｄａｋｏ、デンマーク、グロストルプ）中でのマイクロウェーブにより抗原賦活化した。その後、切片を３％Ｈ２Ｏ２で１０分間処理して内因性ペルオキシダーゼを除去し、室温で６０分間、ｍ８０６抗体（４μｇ／ｍＬ）と共にまたはアイソタイプを合わせた適切な濃度の陰性抗体（ＩｇＧ２ｂ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）と共に温置した。ＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ＩｍｍｕｎｏＶｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州ブリスベーン）を使用して抗体結合を検出した。免疫染色の視覚化を可能にするために、切片を色原体３−アミノ−９−エチルカルバゾール（０．４％、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．、米国ミズーリ州）と共に１０分間温置し、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色した。この免疫染色手順についての陰性対照は、一次抗体の除外により調製した。結果を陽性腫瘍細胞染色の百分率として表示した。
化学発光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法
治験中の各患者からのホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織を切断し、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ（登録商標）Ｐｌｕｓスライドにマウントし、脱パラフィンし、再水和した後、ＳｐｏｔＬｉｇｈｔ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）で前処理した。その後、切片にＳｐｏｔＬｉｇｈｔ（登録商標）ＥＧＦＲ ＤＮＡプローブをかぶせ、１０分間、９５℃で変性させ、一晩、３７℃で温置した。ハイブリダイゼーション後、スライドを０．５×ＳＳＣで洗浄した。ＳｐｏｔＬｉｇｈｔ（登録商標）ＣＩＳＨ（商標）Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してプローブの検出を行った。シグナルのクラスタまたは癌細胞の＞２５％において≧５の個別シグナルを示した切片は、ｍ８０６反応性と相関するＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有すると考えた。
２．結果
患者
８人の患者［女性１人および男性７人；平均年齢６１歳（範囲４４−７５歳）］が治験を完了した（表１３）。原発腫瘍部位、以前の治療歴、および試験登録時の疾患部位も表１３に示す。８人すべての患者が、保存腫瘍において８０６抗原陽性を有した（表１３）。
すべての患者が組み入れ基準を満たしており、患者８（原発性脳腫瘍を有した者）を除くすべてが試験登録時に転移性疾患を有した。ターゲット病変として分類した腫瘍部位は、以下を含んだ：肺（５人の患者）、脳（１人の患者）、リンパ節（１人の患者）、声門上（１人の患者）。転移性疾患の他の部位（非ターゲット領域）は、副腎腫瘤、骨およびリンパ節を含んだ（表１３）。カルノフスキー・パフォーマンス・ステータス中央値は９０であった（範囲８０−１００）。
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有害事象およびＨＡＣＡ
ｃｈ８０６に関連した有害事象を表１４および１５に列挙する。注入関連有害事象は、観察されなかった。ＤＬＴはなく、従って、ＭＴＤに達しなかった。治験担当医の意見ではことによるとｃｈ８０６に起因し得る原則毒性（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ）は、一過性そう痒症、軽度悪心、疲労／嗜眠、ならびに血清ＡＬＰおよびＧＧＴレベルに対して起こり得る影響であった。患者５においてＣＴＣグレード２のＧＧＴの上昇が観察されたが、この上昇は、ベースライングレード１上昇のバックグラウンドに基づくものであり、事実上、一過性であった。３つの重篤有害事象（ＳＡＥ）が報告されたが、ｃｈ８０６に起因しなかった。総合的に言えば、ｃｈ８０６は、すべての用量レベルで安全および十分認容性であり、一般に予測可能で管理できる軽症の毒性が観察された。さらなる用量漸増は、この治験に利用できるｃＧＭＰ ｃｈ８０６の限られた量のため、行わなかった。
ｃｈ８０６に対する陽性免疫応答（ＥＬＩＳＡ方法論とＢＩＡｃｏｒｅ方法論の両方の一致を有する。）が、８人の患者のうち１人だけに観察された（患者１）。
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ｃｈ８０６の放射標識
この治験中に投与した１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の注入は、合計８回であった。１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の平均（±ＳＤ）放射化学的純度および免疫反応性をそれぞれ９９．３±０．１％および７７．４±７．０％であると測定した。
ｃｈ８０６の生体内分布
すべての用量レベルでの患者における１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６生体内分布の初期パタンは、時間とともに徐々に除去される、血液プール活性と一致していた。注入後１週間にわたって、肝臓および脾臓における１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の取り込み量は、細網内皮系による１１１Ｉｎ−キレート代謝産物の正常クリアランスと一致していた。肺（患者１、３、４、５および７）、腹部（患者１および２）、および頚部右側の正門上領域（患者６）に位置するターゲット病変を含めて、すべての用量レベルですべての患者のターゲット病変（≧２ｃｍ）に関して１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の特異的局在が観察された（図９４）。脳腫瘍（患者８）における１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の高い取り込み量も実証された（図９５）。重要なことに、腫瘍における１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の取り込み量は、８０６抗原発現レベルに依存しなかった。例えば、患者４は、保存腫瘍における８０６反応性についてのＩＨＣによる＜１０％にもかかわらず。両肺ターゲット領域による高い取り込み量を明示した（図９６）。患者４におけるターゲット病変のこの１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６取り込み度は、腫瘍細胞の５０−７５％が保存サンプル免疫組織化学に基づき８０６抗原染色について陽性であった、患者３において見られたものに匹敵した（図９６）。
薬物動態
１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の単回注入についての個々の患者の薬物動態パラメータＴ１／２αおよびＲ１／２β、Ｖ１、Ｃｍａｘ、ＡＵＣおよびＣＬを表１６に示す。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ順位和検定をアルファおよびβ半減期、Ｖ１およびクリアランスに適用した。用量レベル間の有意差は観察されなかった（Ｐ＞０．０５）。
プールされた集団ＥＬＩＳＡデータにフィッティングした薬物動態曲線を図９７に示す。平均±ＳＤ薬物動態パラメータは、Ｔ１／２α ２９．１６±２１．１２時間、Ｔ１／２β １７２．４０±９０．８５時間、Ｖ１ ２９８４．５９±９１．９１ｍＬ、およびＣＬ １９．４４±４．０５ｍＬ／時間であった。測定ピークおよびトラフｃｈ８０６血清濃度（ＣｍａｘおよびＣｍｉｎ）データを各患者について表１７に提示する。予想どおり、各用量レベルに関してにＣｍａｘおよびＣｍｉｎついて比例関係が観察された。ｃｈ８０６ ＥＬＩＳＡ薬物動態データについて決定した平均±ＳＤ値は、１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６薬物動態データについて得た値とよく一致していた（表１６）。
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１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の線量計測
全身クリアランスは、９４８．６±３７８．６時間の生物学的Ｔ１／２（平均±ＳＤ）で、すべての用量レベルにわたってすべての患者において類似していた。比較的短い物理的半減期のため、生物学的反撃の計算は、有効半減期の小さな変化に極めて敏感であった。用量レベル間に全身クリアランスの統計的有意差はなかった［Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ順位和検定：Ｐ値＝０．５４］（図９８）。
正常器官（肝臓、肺、腎臓および脾臓）からの１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６のクリアランスは、用量レベル間での差を示さず、平均有効Ｔ１／２をそれぞれ７８．３、４８．６、６９．７および６６．２時間であると算出した。これらの正常器官間にクリアランスの統計的有意差はなかった。特に、肝臓クリアランスは用量間での差を示さなかった（図９８）。このことは、肝臓にはｃｈ８０６についての飽和性抗原コンパートメントがないことを示している。
腫瘍線量分析を６人の患者について完了した。患者１および２は、心臓血プールに近いターゲット病変を有し、または幾つかの画像獲得中に動き、これらが正確な分析を妨げた。１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の測定ピーク取り込みは、注入後５−７日に発生し、５．２−１３．７×１０−３％注入用量／ｇｍ 腫瘍組織にわたった。
臨床活動の評定
この１ヶ月試験の完了時、５人の患者は、安定病態を、３人の患者は進行性疾患を有することが判明した（表１３）。興味深いことに、１人の患者（患者７、４０ｍｇ／ｍ２用量レベル）は、置換期間中に（細針穿刺吸引で転移性ＳＣＣであると証明された）触知可能な耳リンパ節の一過性修飾の臨床徴候を有した。このことは、ｃｈ８０６の潜在的生物活性を示唆している。しかし、この患者は、試験完了時にＲＥＣＩＳＴにより進行性疾患が確認された。
追加データ
８人の患者［女性１人および男性７人；６１歳の平均年齢（範囲４４−７５歳）］が、報告（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４，４０７１−４０７６）どおり、この第一相治験を完了した。すべての患者が組み入れ基準を満たしており、患者８（原発性脳腫瘍を有した者）を除くすべてが試験登録時に転移性疾患を有した。腫瘍によるＡｂ取込がすべての患者において見られ、１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６、ｍＡｂ８０６のキメラ化バージョンは、腫瘍における迅速で高レベルの取り込みを明示した（図７１）。正常器官（肝臓、肺、腎臓および脾臓）からの１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６のクリアランスは、用量間での差を示さなかった（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００７）。特に、肝臓クリアランスは用量間での差を示さなかった。このことは、肝臓にはｃｈ８０６についての飽和性抗原コンパートメントがないことを示している。全肝臓取り込みは、注入直後、１４．４５±２．４３％ＩＤの最大値であり、７２時間までに８．４５±１．６３％ＩＤに、および注入後一週間までに３．１８±０．８７％ＩＤに下降した。このことは、注入後３日にわたって肝臓において（４０ｍｇ用量について）３０％ＩＤより上に達することを示した、ｗｔＥＧＦＲ（例えば、２２５）への抗体の取り込み（Ｄｉｖｇｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８３，９７−１０４）と著しく対照的である。１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の測定ピーク腫瘍は、注入後５−７日に発生した。患者１および３における定量的腫瘍取り込み量計算は、心血液プールへのターゲット病変の近接および患者の動きのため、正確に行うことができなかった。腫瘍におけるピークｃｈ８０６取込は、５．２１から１３．７３×１０−３％ＩＤ／ｇｍ 腫瘍組織であった。腫瘍における実際のｃｈ８０６濃度の計算は、（平均±ＳＤ）０．８５±０μｇ／ｇｍ（５ｍｇ／ｍ２）、０．９２±０μｇ／ｇｍ（１０ｍｇ／ｍ２）、３．８０±１．１０μｇ／ｇｍ（２０ｍｇ／ｍ２）、および７．０５±１．４０μｇ／ｇｍ（４０ｍｇ／ｍ２）のピーク値を示した。
考察
本実施例において示すような、本試験は、過発現形態、突然変異体形態またはリガンド活性化形態のＥＧＦＲ上の露出されたエピトープのみに対するキメラ抗体の生体内分布および腫瘍ターゲッティングの最初に報告される証明に相当する。ｃｈ８０６は、すべての患者において腫瘍部位の卓越したターゲッティングを示し、正常組織取り込みの形跡を示さず、および有意な毒性を示さなかった。ｃｈ８０６のこれらのインビトロおよびインビボ特性が、ＥＧＦＲをターゲットにする他のすべての抗体とこれを区別する。
４０ｍｇ／ｍ２以下の用量で、ｃｈ８０６は、十分認容性であり、ＤＬＴは観察されず、ＭＴＤに達しなかった。ｃｈ８０６にことによると起因する原則毒性は、一過性そう痒症、軽度悪心、疲労／嗜眠、ならびに血清ＡＬＰおよびＧＧＴレベルに対して起こり得る影響であった。これらの患者の悪性病変の進行性は、彼らの疾患がこれらの有害事象への寄与因子である場合もあったことを意味した。ことによると治験薬に関連していた有害事象は、すべて軽度であり、多くが自己限定的であり、およびいずれの動的治療も必要とされなかった。重要なことに、最高用量レベルででさえ、いずれの患者においても皮膚発心および胃腸管障害が観察されなかった。この単回投与試験におけるｃｈ８０６の卓越した認容性が、反復投与試験での次の試験段階を正当化した。
すべての患者におけるｃｈ８０６の生体内分布は、血液プール活性の漸進的クリアランスを示し、１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の確定的な正常組織取り込みを示さなかった。すべての患者において、ｃｈ８０６の卓越した腫瘍取り込みも、肺、リンパ節および副腎転移を含めて、ならびに中皮腫および神経膠腫において、顕性であった。この取り込みは、ｗｔＥＧＦＲに対する他の抗体による腫瘍への取り込みを可視化するために必要な用量の十分の一から二十分の一である５ｍｇ／ｍ２（試験した最低用量）３３を含めてすべての用量レベルで観察された。ｗｔＥＧＦＲに対する抗体と比較したｃｈ８０６の取り込みのこの差は、抗原シンクとしてのｗｔＥＧＦＲ作用によるこれらの実質的正常組織（肝臓および皮膚）取り込みに起因し得る３３。加えて、保存腫瘍サンプルの免疫組織化学により評定して８０６の発現が低い患者においてでさえ、１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の局在は高度であった（図９６）。神経膠腫における１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の取り込みは、特に印象的であり（図９７）、ならびに全身注入後、または局所領域的注入後でさえ、脳腫瘍の抗体ターゲッティングに関するいずれの発表データに匹敵しなかった。このデータは、広範な腫瘍により発現されるＥＧＦＲに対するｃｈ８０６の特有の選択性の裏付けとなり、ならびにヒトにおけるこの抗体の正常組織取り込み欠如を確証する。
薬物動態分析により、ｃｈ８０６が、一週間より長い消失相半減期を有する、および１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６の用量依存性を有さないことが明らかになった。ＡＵＣ、ＣｍａｘおよびＣｍｉｎについての比例関係も観察され、１０ｍｇ／ｍ２より上の用量レベルで約１μｇ／ｍＬより上のトラフ血清濃度が達成された。Ｖ１、Ｃｌ、Ｔ１／２αおよびＴ１／２β値は、用量レベル間で一致しており、典型的なＩｇＧ１ヒト抗体（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｓｔｅｆｆｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１５，１５２９−１５３７；Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９（１９），３９７６−３９８７）と合っていた。ｃｈ８０６のクリアランスが、ＥＬＩＳＡ ｃｈ８０６計算値を１１１Ｉｎ−ｃｈ８０６測定値と比較したとき、低いことも判定した。この差は、試験した少ない患者数によって説明できるが、ｃｈ８０６ ＥＬＩＳＡについてのより長いサンプルリング時点は、この値を真のｃｈ８０６クリアランスをより象徴するものとして支持する。ｃｈ８０６についての薬物動態値は、今日まで報告されている他のキメラ抗体に匹敵し（Ｓｔｅｆｆｅｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００１）、ｃｈ８０６の週１回投与計画を支持する。
定量的線量計測および薬物動態結果は、この置換において評定した用量レベルについてｃｈ８０６の飽和性正常組織コンパートメントがないことを示す。重要なことに、薬物動態ならびに全血および肝臓器官クリアランスの用量依存性欠如は、ｗｔＥＧＦＲに対する抗体について報告されているすべての研究（Ｂａｓｅｌｇａ Ｊ．ａｎｄ Ａｒｔｅｇａ Ｃ．Ｌ．（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３，２４４５−２４４９；Ｄｉｖｇｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８３（２），９７−１０４；Ｂａｓｅｌｇａ Ｊ（２００１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３７ Ｓｕｐｐｌ．４，Ｓ１６−２２；Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｌｉｎ．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ ６（１），２９−３１；Ｒｏｗｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２，３００３−３０１５；Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１２（２１），６５１７−６５２２）と著しく対照的であり、ヒトにおけるｃｈ８０６の腫瘍特異性および正常組織結合欠如を支持する。これらの観察は、腫瘍において選択的にＥＧＦＲをターゲットにし、他のＥＧＦＲ抗体およびキナーゼ阻害剤の通常の毒性（特に皮膚）（Ｌａｃｏｕｔｕｒｅ ＡＥ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ６，８０３−８１２；Ａｄａｍｓ Ｇ．Ｐ．ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ Ｌ．Ｍ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（９），１１４７−１１５７）を回避する、およびより大きな治療効果をことによると達成する、ｃｈ８０６（またはヒト化形態）についての可能性の説得力のある証拠となる。さらに、ペイロールデリバリー（腫瘍細胞におけるｍＡｂ８０６の急速な内在化のため）の、ならびに複合毒性を最小にする可能性が高い他の生物製剤、例えばＥＧＦＲ抗体およびチロシンキナーゼ阻害剤との併用治療の可能性が本試験からのデータによって強く裏付けられる。本試験は、腫瘍に特異的であるＥＧＦＲ上のエピトープをターゲットにすることができることの明確な証拠を提供するものであり、癌療法へのこのユニークなアプローチのさらなる臨床開発が進行中である。
配列比較
ｍＡｂ８０６、ｍＡｂ１７５、ｍＡｂ１２４、ｍＡｂ１１３３、およびｈｕ８０６のそれぞれについてのＶＨ鎖およびＶＬ鎖ＣＤＲをここで示し、比較する。
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それぞれの抗体アイソタイプについて上に与えたＣＤＲは、Ｋａｂａｔ分析に基づく。当業者には明らかであるように、ＣＤＲを他の分析、例えば、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の複合に基づいて定義することもできる。例えば、複合ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ分析を上のアイソタイプに適用すると、それぞれのアイソタイプについてのＶＬ鎖 ＣＤＲおよびＶＨ鎖の配列は、表１４に示すとおりである。
Figure 0006317780
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上に示したように、ｍＡｂ８０６、ｍＡｂ１７５、ｍＡｂ１２４およびｍＡｂ１１３３アイソタイプのＣＤＲ配列は、エピトープ認識のために相同的タンパク質フォールディングを生じさせることが予想される高保存的アミノ酸変更を除き、同一である。上の実施例において提供した結合および他のデータに累加して、このデータは、これらのアイソタイプおよびｈｕ８０６が、ｍＡｂ８０６について上で論じたのと同じ特有の特性（過発現、突然変異またはリガンド活性化形態のＥＧＦＲの場合にのみ結合に利用できるＥＧＦＲ上のエピトープへの結合）を呈示する、ならびに異なる可変領域配列の、特に、様々なＣＤＲ配列の、抗体が同じ特性および結合能力を有することを実証する、近縁ファミリーメンバー変異体であることを示す。
Figure 0006317780
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本発明の精神または本質的な特徴を逸脱することなく、本発明を他の形態で具現するまたは他の方法で実施することができる。従って、本開示は、すべての態様において、説明的なものとみなすべきであり、限定的なものとみなすべきではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって示すものであり、この趣旨および同等の範囲に入るすべての変更は、本発明の範囲に包含されると解釈する。
様々な参考文献を本明細書のいたるところで引用しており、上の参考文献リストに提供している。該参考文献のそれぞれは、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (12)

  1. 細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされた組換え抗ヒト上皮成長因子受容体（ｈＥＧＦＲ）モノクローナルＩｇＧ１抗体を含む免疫複合体であって、該抗ｈＥＧＦＲ抗体は、配列番号１６４に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号１６６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、免疫複合体。
  2. 抗体が、配列番号４８に示すアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項１に記載の免疫複合体。
  3. 抗体がＣＨＯ細胞において産生される請求項１または２に記載の免疫複合体。
  4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫複合体を含む、ヒト患者における癌の治療用医薬組成物。
  5. 癌が腫瘍である請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 腫瘍が充実性腫瘍である、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 充実性腫瘍が、上皮性腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、前立腺腫瘍、膀胱腫瘍、頭部腫瘍および頸部腫瘍からなる群より選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 腫瘍がＥＧＦＲを過発現している、請求項４〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  9. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫複合体を含む、ヒト患者における膠芽腫の治療用医薬組成物。
  10. 治療薬をさらに含む、請求項４〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  11. 前記治療薬が、チロシンキナーゼ阻害剤、ドキソルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ニトロソウレア、プロカルバジン、ビンクリスチン、ヒドロキシウレア、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エピポドフィロトキシン、カルムスチンまたはロムスチンである、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 前記治療薬がテモゾロミドである、請求項１０に記載の医薬組成物。
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