PT2913344T - Proteínas de ligação específica e suas utilizações - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO "PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA E SUAS UTILIZAÇÕES"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a membros de ligação especifica, i. e.r anticorpos e seus fragmentos, os quais se ligam ao recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) amplificado e à supressão em grelha dos exões 2 a 7 do EGFR, resultando num recetor EGFR truncado que carece de 267 aminoácidos do domínio extracelular (des2-7 EGFR). Em particular, o epítopo reconhecido pelos membros de ligação específica, i. e., anticorpos e seus fragmentos, é aumentado ou evidenciado após modificação pós-tradução aberrante. Estes membros de ligação específica são úteis no diagnóstico e tratamento de cancro. Os membros de ligação da presente invenção podem ser também utilizados em terapia em associação com agentes quimioterapêuticos ou anticancerígenos e/ou com outros anticorpos ou seus fragmentos.
ANTECEDENTES DA TECNOLOGIA RELACIONADA 0 tratamento de doença proliferativa, particularmente cancro, por meios quimioterapêuticos assenta frequentemente na exploração de diferenças entre as células alvo em proliferação e outras células normais no corpo humano ou animal. Por exemplo, muitos agentes químicos são concebidos para serem captados por ADN em replicação rápida para que o processo de replicação de ADN e divisão celular seja interrompido. Outra abordagem consiste em identificar antigénios na superfície das células tumorais ou outras células anormais que não são normalmente expressos em tecido humano desenvolvido, tais como antigénios tumorais ou antigénios embrionários. Tais antigénios podem ser visados por proteínas de ligação, tal como anticorpos, os quais podem bloquear ou neutralizar o antigénio. Além disso, as proteínas de ligação, incluindo anticorpos e seus fragmentos, podem administrar um agente tóxico ou outra substância que é capaz de ativar direta ou indiretamente um agente tóxico no sítio de um tumor. 0 EGFR é um alvo atrativo para terapia de anticorpos dirigida a tumores porque está sobreexpresso em muitos tipos de tumores epiteliais (Voldborg et al. (1997). Epidermal growth factor receptor (EGFR) and EGFR mutations, function and possible role in clinical trials. Ann Oncol. 8, 1197-206; den Eynde, B. e Scott, A. M. Tumor Antigens. In: P. J. Delves and I. M. Roitt (eds.), Encyclopedia of Immunology, Segunda Edição, pp. 2424-31. London: Academic Press (1998)). Além do mais, a expressão do EGFR está associada a mau prognóstico num número de tipos de tumores incluindo estômago, cólon, bexiga urinária, mama, próstata, endométrio, rim e cérebro (e. g., glioma) . Consequentemente, um número de anticorpos contra o EGFR foi descrito na literatura, encontrando-se vários em avaliação clínica (Baselga et al. (2000) Phase I Studies of Anti-Epidermal Growth factor receptor Chimeric Antibody C225 Alone and in Combination With Cisplatin. J. Clin. Oncol. 18, 904; Faillot et al. (1996) : A phase I study of an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody for the treatment of malignant gliomas. Neurosurgery. 39, 478-83; Seymour, L. (1999)
Novel anti-cancer agents in development: exciting prospects and new challenges. Cancer Treat. Rev. 25, 301-12)).
Os resultados de estudos utilizando mAbs contra o EGFR em doentes com cancro da cabeça e pescoço, cancro do pulmão de células escamosas, gliomas cerebrais e astrocitomas malignos têm sido encorajadores. A atividade antitumoral da maioria dos anticorpos contra o EGFR é melhorada pela sua capacidade para bloquear a ligação de ligandos (Sturgis et al. (1994) Effects of antiepidermal growth factor receptor antibody 528 on the proliferation and differentiation of head and neck cancer. Otolaryngol. Head Neck. Surg. Ill, 633-43; Goldstein et al. (1995) Biological efficacy of a chimeric antibody to the epidermal growth factor receptor in a human tumour xenograft model. Clin. Cancer Res. 1, 1311-8) . Tais anticorpos podem mediar a sua eficácia através da modulação da proliferação celular e funções imunes dependentes de anticorpos (e. g. ativação do complemento) . No entanto, a utilização destes anticorpos pode ser limitada pela captação em órgãos que têm níveis endógenos elevados de EGFR, tais como o fígado e pele (Baselga et al., 2000; Faillot et al., 1996).
Uma proporção significativa de tumores contendo amplificações do gene de EGFR (í. e., múltiplas cópias do gene EGFR) também co-expressa uma versão truncada do recetor (Wikstrand et al. (1998) The class III variant of the epidermal growth factor receptor (EGFR): characterization and utilization as an immunotherapeutic target. J. Neurovirol. 4, 148-158) conhecida como des2-7 EGFR, AEGFR, ou Δ2-7 (termos aqui utilizados indistintamente) (Olapade-Olaopa et al. (2000)
Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer. Br. J. Cancer. 82, 186-94) . 0 rearranjo observado no des2-7 EGFR resulta num ARNm maduro em grelha que carece de 801 nucleótidos que atravessa os exões 2-7 (Wong et al. (1992) Structural alterations of the epidermal growth factor receptor gene in human gliomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 2965-9; Yamazaki et al. (1990) A deletion mutation within the ligand binding domain is responsible for activation of epidermal growth factor receptor gene in human brain tumours. Jpn. J. Cancer Res. 81, 77 3-9; Yamazaki et al. (1988) Amplification of the structurally and functionally altered epidermal growth factor receptor gene (c-erbB) in human brain tumours. Mol. Cell Biol. 8, 1816-20;
Sugawa et al. (1990) Identical splicing of aberrant epidermal growth factor receptor transcripts from amplified rearranged genes in human glioblastomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 8602-6). A proteína EGFR correspondente tem uma supressão de 267 aminoácidos compreendendo os residuos 6-273 do dominio extracelular e um novo resíduo de glicina na junção de fusão (Sugawa et al., 1990). Esta supressão, em conjunto com a inserção de um residuo de glicina, produz um péptido de junção único na interface de supressão (Sugawa et al., 1990). O des2-7 EGFR foi descrito num número de tipos de tumores incluindo glioma, mama, pulmão, ovário e próstata (Wikstrand et al. (1997) Cell surface localization and density of the tumour-associated variant of the epidermal growth factor receptor, EGFRvIII. Cancer Res. 57, 4130-40; Olapade-Olaopa et al. (2000) Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer. Br. J. Cancer. 82, 186-94; Wikstrand, et al. (1995) Monoclonal antibodies against EGFRvIII in are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55, 3140-8; Garcia de Palazzo et al. (1993) Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-small cell lung carcinomas. Cancer Res. 53, 3217-20). Apesar deste recetor truncado não ligar o ligando, possui baixa atividade constitutiva e confere uma vantagem de crescimento significativa a células de glioma cultivadas como xenoenxertos tumorais em ratinhos nude (Nishikawa et al. (1994) A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7727-31) e é capaz de transformar células NIH3T3 (Batra et al. (1995) Epidermal growth factor ligand independent, unregulated, celltransforming potential of a naturally occurring human mutant EGFRvIII gene. Cell Growth Differ. 6, 1251-9) e células MCF-7. Os mecanismos celulares utilizados pelo des2-7 EGFR nas células de glioma não estão completamente definidos, mas têm sido referidos como incluindo uma diminuição da apoptose (Nagane et al. (1996) A common mutant epidermal growth factor receptor confers enhanced tumorigenicity on human glioblastoma cells by increasing proliferation and reducing apoptosis. Cancer Res. 56, 5079-86) e uma pequena melhoria da proliferação (Nagane et al. , 1996).
Dado que a expressão deste recetor truncado se restringe às células tumorais, este representa um alvo altamente especifico para terapia de anticorpos. Por conseguinte, um número de laboratórios descreveu a produção de anticorpos policlonais (Humphrey et al. (1990) Anti-synthetic peptide antibody reacting at the fusion junction of deletion mutant epidermal growth factor receptors in human glioblastoma. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 4207-11) e monoclonais (Wikstrand et al. (1995) Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas; Okamoto et al. (1996) Monoclonal antibody against the fusion junction of a deletion-mutant epidermal growth factor receptor. Br. J. Cancer. 73, 1366-72; Hills et al. (1995) Specific targeting of a mutant, activated EGF receptor found in glioblastoma using a monoclonal antibody. Int. J. Cancer. 63, 537-43) específicos para o péptido único de des2-7 EGFR. Uma série de mAbs de ratinho, isolados após imunização com o péptido des2-7 único, mostraram todos seletividade e especificidade para o recetor truncado e visaram xenoenxertos positivos para des2-7 EGFR introduzidos em ratinhos nude (Wikstrand et al. (1995); Reist et al. (1997) Improved targeting of an anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibody in tumour xenografts after labeling using N-succinimidyl 5-iodo-3-pyridinecarboxylate. Cancer Res. 57, 1510-5; Reist et al. (1995) Tumour-specific anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibodies: use of the tyramine-cellobiose radioiodination method enhances cellular retention and uptake in tumour xenografts. Cancer Res. 55, 4375-82).
No entanto, uma lacuna potencial dos anticorpos contra o des2-7 EGFR é que apenas uma proporção dos tumores que apresentam amplificação do gene de EGFR também expressam o des2-7 EGFR (Ekstrand et al. (1992) Amplified and rearranged epidermal growth factor receptor genes in human glioblastomas reveal deletions of sequences encoding portions of the N-and/or C-terminal tails. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 4309-13). A percentagem exata de tumores que contêm o des2-7 EGFR não está completamente estabelecida, porque a utilização de diferentes técnicas (i. e. PCR versus imuno-histoquímica) e vários anticorpos, tem produzido uma grande gama de valores reportados para a frequência da sua presença. Os dados publicados indicam que aproximadamente 25-30% dos gliomas expressam des2-7 EGFR, sendo a expressão mais baixa nos astrocitomas anaplásticos e mais alta no glioblastoma multiforme (Wong et al. (1992); Wikstrand et al. (1998) The class III variant of the epidermal growth factor receptor (EGFR): characterization and utilization as an immunotherapeutic target. J. Neurovirol. 4, 148-58;
Moscatello et al. (1995) Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in multiple human tumors. Cancer Res. 55, 5536-9). A proporção de células positivas dentro dos gliomas que expressam des2-7 EGFR foi descrita como variando desde 37-86% (Wikstrand et al. (1997)). Verificou-se que 27% dos carcinomas da mama e 17% dos cancros do pulmão são positivos para o des2-7 EGFR (Wikstrand et al. (1997); Wikstrand et al. (1995); Wikstrand et al., (1998); e Hills et al., 1995). Assim, espera-se que os anticorpos específicos contra o des2-7 EGFR sejam úteis apenas numa percentagem de tumores positivos para EGFR.
Portanto, apesar da evidência existente sobre a atividade dos anticorpos contra o EGFR ser encorajadora, permanecem as limitações observadas na gama de aplicabilidade e eficácia refletidas acima. Por conseguinte, seria desejável desenvolver anticorpos e agentes semelhantes que demonstrassem eficácia para uma vasta gama de tumores, e a presente invenção é dirigida para se conseguir esse objetivo. A citação de referências aqui, não deve ser interpretada como uma admissão de que tal é técnica anterior à presente invenção.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Com base na divulqação aqui contida, a presente invenção proporciona um anticorpo isolado anti-Recetor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR) para utilização no tratamento de um cancro residente no cérebro de um mamifero, em que o cancro localizado no cérebro é selecionado do grupo consistindo em glioblastoma, meduloblastoma, meningioma, astrocitoma neoplásico e malformação arteriovenosa neoplásica, e em que o referido anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 164, compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 166, e é conjugado com um agente selecionado do grupo consistindo em agente de ablação química, toxina, imunomodulador, citocina, agente citotóxico, agente quimioterapêutico e fármaco.
Noutro aspeto, a presente invenção proporciona um anticorpo isolado anti-Recetor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR) para utilização no tratamento de um tumor num doente humano, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 164, compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 166, e é conjugado com um agente citotóxico. A presente invenção e as suas formas de realização são definidas nas reivindicações anexas. A presente invenção proporciona membros de ligação especifica isolados, i. e., anticorpos ou seus fragmentos, os quais reconhecem um epitopo de EGFR que não demonstra quaisquer alterações ou substituições da sequência de aminoácidos do EGFR de tipo selvagem e que está presente em células tumorigénicas, hiperproliferativas ou anormais e não é geralmente detetável em células normais ou de tipo selvagem (a expressão "célula de tipo selvagem" como aqui utilizada considera uma célula que expressa EGFR endógeno mas não o des2-7 EGFR e a expressão exclui especificamente uma célula que sobreexpressa o gene de EGFR; a expressão "tipo selvagem" refere-se a um genótipo ou fenótipo ou outra caracteristica presente numa célula normal em vez de uma célula anormal ou tumorigénica) . Num outro aspeto, a presente invenção proporciona membros de ligação especifica, i. e.f anticorpos ou seus fragmentos, os quais reconhecem um epitopo de EGFR que está presente em células tumorigénicas, hiperproliferativas ou anormais e não é geralmente detetável em células normais ou de tipo selvagem, em que o epitopo é aumentado ou evidenciado após modificação pós-tradução aberrante ou expressão aberrante. Num exemplo não limitativo particular aqui proporcionado, o epitopo de EGFR é aumentado ou evidenciado, em que a modificação pós-traducional não é completa ou total na extensão observada para a expressão normal de EGFR nas células de tipo selvagem. Numa forma de realização, o epitopo de EGFR é aumentado ou evidenciado após modificação inicial ou simples com hidratos de carbono ou glicosilação precoce, particularmente modificação com alto teor de manose, e é reduzido ou não evidente na presença de modificação complexa com hidratos de carbono.
Os membros de ligação especifica, i. e. anticorpos ou seus fragmentos, tal como os seus fragmentos imunogénicos, não se ligam substancialmente nem reconhecem células normais ou de tipo selvagem contendo epítopo de EGFR normal ou de tipo selvagem na ausência de expressão aberrante e na presença de modificação pós-traducional de EGFR normal.
Mais particularmente, o membro de ligação especifica da invenção, i. e., anticorpos ou seus fragmentos, o qual reconhece um epitopo de EGFR que está presente nas células que sobreexpressam EGFR (e. g., gene de EGFR é amplificado) ou expressando o des2-7 EGFR, particularmente na presença de modificação pós-tradução aberrante, e que não é geralmente detetável nas células expressando EGFR sob condições normais, particularmente na presença de modificação pós-traducional normal.
Os presentes inventores descobriram novos anticorpos monoclonais, aqui exemplificados pelos anticorpos designados mAb806, ch806, hu806, mAbl75, mAbl24 e mAbll33, os quais reconhecem especificamente o EGFR expresso de forma aberrante. Em particular, os anticorpos da presente invenção reconhecem um epitopo de EGFR que está presente em células tumorigénicas, hiperproliferativas ou anormais e não é geralmente detetável em células normais ou de tipo selvagem, em que o epitopo é aumentado ou evidenciado após modificação pós-traducional aberrante. Os novos anticorpos da invenção também reconhecem o EGFR de tipo selvagem amplificado e o des2-7 EGFR e, mesmo assim, ligam-se a um epitopo distinto do péptido de junção único da mutação des2-7 EGFR. Os anticorpos da presente invenção reconhecem especificamente o EGFR expresso de forma aberrante, incluindo o EGFR amplificado e EGFR mutante (aqui exemplificado pela mutação des2-7), particularmente após modificação pós-traducional aberrante. Adicionalmente, embora estes anticorpos não reconheçam o EGFR quando expresso na superfície celular de uma linha de células de glioma que expressa quantidades normais de EGFR, estes ligam-se ao domínio extracelular do EGFR (sEGFR) imobilizado na superfície de placas ELISA, indicando o reconhecimento de um epitopo conformacional. Estes anticorpos ligam-se à superfície de células A431, as quais têm uma amplificação do gene de EGFR mas não expressam o des2-7 EGFR. É importante dizer que estes anticorpos não se ligam significativamente a tecidos normais, tais como fígado e pele, que expressam níveis de EGFR de tipo selvagem (ts) endógeno que são superiores à maioria dos outros tecidos normais, mas em que o EGFR não é expresso de forma aberrante ou amplificada.
Os anticorpos da presente invenção podem classificar especificamente a natureza das células tumorais ou tumorigénicas de EGFR, por revelação ou reconhecendo de outro modo aqueles tumores ou células em que está presente a expressão aberrante de EGFR, incluindo amplificação de EGFR e/ou mutação de EGFR, particularmente des2-7 EGFR. Além disso, os anticorpos da presente invenção demonstram atividade antitumoral significativa in vivo contra tumores que contêm EGFR amplificado e contra xenoenxertos positivos para des2-7 EGFR. A especificidade única destes anticorpos para se ligarem ao des2-7 EGFR e EGFR amplificado, mas não ao EGFR de tipo selvagem, normal proporciona utilizações em diagnóstico e terapia para identificar, caracterizar e visar um número de tipos de tumores, por exemplo, tumores da cabeça e pescoço, mama ou próstata, e glioma, sem os problemas associados à captação pelo tecido normal que podem ser observados com anticorpos contra o EGFR anteriormente conhecidos.
Por conseguinte, a invenção proporciona proteínas de ligação específica, i. e. anticorpos, as quais se ligam ao des2-7 EGFR num epítopo que é distinto do péptido de junção mas que não se ligam substancialmente ao EGFR em células normais na ausência de amplificação do gene de EGFR. Por amplificação pretende-se referir que a célula compreende múltiplas cópias do gene de EGFR.
De um modo preferido, o epítopo reconhecido pelos anticorpos da invenção está localizado dentro da região compreendendo os resíduos 273-501 da sequência de EGFR normal ou de tipo selvagem madura e, de um modo preferido, compreende os resíduos 287-302 (SEQ ID N° : 14) da sequência de EGFR normal ou de tipo selvagem madura. Por conseguinte, são também proporcionadas proteínas de ligação específica, i. e., anticorpos, que se ligam ao des2-7 EGFR num epítopo localizado dentro da região compreendendo os resíduos 273-501 e/ou 287-302 (SEQ ID N°: 14) da sequência de EGFR. O epítopo pode ser determinado por quaisquer técnicas de mapeamento de epítopos convencionais conhecidas do especialista na técnica. Alternativamente, a sequência de ADN codificando os resíduos 273-501 e/ou 287-302 (SEQ ID N°: 14) poderia ser digerida e os fragmentos resultantes expressos num hospedeiro adequado. A ligação do anticorpo poderia ser determinada como mencionado acima.
Os anticorpos são aqueles que têm as características dos anticorpos que os inventores identificaram e caracterizaram, em particular que reconhecem o EGFR expresso de forma aberrante, como presente no EGFR amplificado e des2-7 EGFR.
Num outro exemplo, a divulgação proporciona anticorpos capazes de competir com os anticorpos da invenção, em condições em que, pelo menos, 10% de um anticorpo tendo as sequências das cadeias VH e VL dos anticorpos da invenção são bloqueados de se ligar ao des2-7 EGFR por competição com um tal anticorpo num ensaio ELISA. Em particular, os anticorpos anti-idiotípicos são aqui considerados e exemplificados. Os anticorpos anti-idiotípicos LMH-11, LMH-12 e LMH-13 são aqui proporcionados. A ligação de um anticorpo ao seu antigénio alvo é mediada através das regiões determinantes de complementaridade (CDR) das suas cadeias pesada e leve, sendo o papel da CDR3 de particular importância. Por conseguinte, os membros de ligação específica com base nas regiões CDR3 da cadeia pesada ou leve e, de um modo preferido, ambas, dos anticorpos da invenção serão membros de ligação específica úteis para terapia in vivo.
Por conseguinte, as proteínas de ligação específica tais como anticorpos que se baseiam nas CDR dos anticorpos da invenção identificados, em particular, as regiões CDR3, serão úteis para visar tumores com EGFR amplificado independentemente do seu estado de des2-7 EGFR. Como os anticorpos da invenção não se ligam significativamente ao recetor de tipo selvagem, normal, não haveria captação significativa no tecido normal, uma limitação dos anticorpos contra o EGFR que estão atualmente em desenvolvimento. É proporcionado um anticorpo isolado capaz de ligar o EGFR em tumores que contêm amplificações do gene de EGFR, em que as células dos tumores contêm múltiplas cópias do gene de EGFR e em tumores que expressam a versão truncada do recetor EGFR des2-7, em que o anticorpo não se liga ao péptido de junção des2-7 EGFR que consiste da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° : 13, em que o anticorpo liga-se a um epítopo dentro da sequência de resíduos 287-302 (SEQ ID N°: 14) do EGFR de tipo selvagem humano e em que o anticorpo não compreende uma sequência de região variável da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° : 2 e não compreende uma sequência de região variável da cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 4.
Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 42, e em que a cadeia leve possui a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 47. É proporcionado um anticorpo isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende regiões de domínios de ligação de polipéptidos possuindo as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID N°: 44, 45 e 46. É proporcionado um anticorpo isolado, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia leve compreende regiões de domínios de ligação de polipéptidos possuindo as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID N°: 49, 50 e 51.
Numa forma de realização, o anticorpo isolado é a forma de um anticorpo F(ab')2, fragmento scFv, diacorpo, triacorpo ou tetracorpo.
Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo isolado compreendendo ainda um marcador detetável ou funcional.
Numa forma de realização, o marcador detetável ou funcional é um fármaco ligado covalentemente.
Numa forma de realização, o marcador é um marcador radioativo.
Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo isolado, em que o anticorpo isolado está peguilado.
Num caso, é proporcionado um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que codifica um anticorpo isolado aqui especificado.
Noutro caso, é proporcionado um método de preparação de um anticorpo isolado, compreendendo a expressão de um ácido nucleico como especificado acima e condições especificadas abaixo para desencadear a expressão do anticorpo, e recuperação do anticorpo.
Noutro caso, é proporcionado um método de tratamento de um tumor num doente humano que compreende a administração ao doente de uma quantidade eficaz de um anticorpo isolado aqui especificado.
Noutro caso, é proporcionado um kit para o diagnóstico de um tumor no qual o EGFR é expresso de forma aberrante ou no qual o EGFR é expresso na forma de um proteína truncada, compreendendo um anticorpo isolado aqui especificado.
Noutro caso, o kit compreende ainda reagentes e/ou instruções de utilização.
Numa forma de realização, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo isolado como aqui especificado.
Numa forma de realização, a composição farmacêutica compreende ainda um veículo, transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
Numa forma de realização, a composição farmacêutica compreende ainda um agente anticancerígeno selecionado do grupo consistindo de agentes quimioterapêuticos, anticorpos anti-EGFR, agentes radioimunoterapêuticos e suas combinações.
Numa forma de realização, os agentes quimioterapêuticos são selecionados do grupo consistindo de inibidores de tirosina-cinase, inibidores da cascata de fosforilação, moduladores de pós-tradução, inibidores da divisão ou crescimento celular (e. g. antimitóticos), inibidores da transdução de sinal, e suas combinações.
Numa forma de realização, os inibidores de tirosina-cinase são selecionados do grupo consistindo de AG1478, ZD1839, STI571, OSI-774, SU-6668, e suas combinações.
Numa forma de realização, os anticorpos anti-EGFR são selecionados do grupo consistindo dos anticorpos anti-EGFR 528, 225, SC-03, DR8.3, L8A4, Y10, ICR62, ABX-EGF, e suas combinações.
Noutro caso, é proporcionado um método de prevenção e/ou tratamento de cancro em mamíferos, compreendendo administrar a um mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica como aqui especificada.
Noutro caso, é proporcionado um método para o tratamento de cancros localizados no cérebro que produzem EGFR expresso de forma aberrante em mamíferos, compreendendo administrar a um mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica como aqui especificada.
Noutro caso, os cancros localizados no cérebro são selecionados do grupo consistindo de glioblastomas, meduloblastomas, meningiomas, astrocitomas neoplásicos e malformações arteriovenosas neoplásicas.
Noutro caso, é proporcionado um hospedeiro unicelular transformado com uma molécula de ADN recombinante que codifica um anticorpo isolado aqui especificado.
Noutro caso, o hospedeiro unicelular é selecionado do grupo consistindo de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, leveduras, células CHO, YB/20, NSO, SP2/0, Rl.l, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 e BMT10, células vegetais, células de insetos e células humanas em cultura de tecido.
Noutro caso, é proporcionado um método para detetar a presença de EGFR amplificado, des2-7 EGFR ou EGFR com alto teor de glicosilação com manose, em que o EGFR é medido: (a) colocando em contacto uma amostra biológica de um mamifero em que se suspeita a presença de EGFR amplificado, des2-7 EGFR ou EGFR com alto teor de glicosilação com manose, com um anticorpo isolado da reivindicação 1 sob condições que permitam que ocorra a ligação do EGFR ao anticorpo isolado; e (b) detetar se ocorreu ligação entre o EGFR da amostra e o anticorpo isolado; em que a deteção de ligação indica a presença ou atividade do EGFR na amostra.
Noutro caso do método de deteção da presença de EGFR amplificado, des2-7 EGFR ou EGFR com alto teor de glicosilação com manose, a deteção da presença de EGFR indica a existência de um tumor ou cancro no mamifero.
Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo isolado capaz de ligar EGFR em tumores que contêm amplificações do gene de EGFR, em que as células dos tumores contêm múltiplas cópias do gene de EGFR e em tumores que expressam a versão truncada do recetor EGFR des2-7, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, possuindo a cadeia pesada a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 42, e a cadeia leve possuindo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 47.
Numa forma de realização, a cadeia pesada do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 42 e a cadeia leve do anticorpo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°: 47.
Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo isolado capaz de ligar o EGFR em tumores que contêm amplificações do gene de EGFR, em que as células dos tumores contêm múltiplas cópias do gene de EGFR, e em tumores que expressam a versão truncada do recetor EGFR des2-7, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende regiões de domínios de ligação de polipéptidos possuindo as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID N°: 44, 45 e 46, e em que a região variável da cadeia leve compreende regiões de domínios de ligação de polipéptidos possuindo as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID N°: 49, 50, e 51.
Outros objetivos e vantagens tornar-se-ão evidentes para os especialistas na técnica a partir de uma revisão da descrição detalhada que se segue, a qual se descreve com referência aos desenhos ilustrativos e reivindicações em anexo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 apresenta os resultados de análise por citometria
de fluxo de linhas de células de gliomas. As células U87MG (histogramas cinzento-claros) e U87MG.A2-7 (histogramas cinzento-escuros) foram revelados com um anticorpo de IgG2b irrelevante (histogramas vazios), DH8.3 (especifico para des2-7 EGFR), mAb806 ou 528 (liga o EGFR de tipo selvagem e des2-7 EGFR) como indicado.
As FIG. 2A-D apresentam os resultados de ELISA de mAb806, mAbDH8.3 e mAb528. (A) ligação de concentrações crescentes de anticorpo mAb806
a placas de ELISA revestidas com sEGFR. (B) inibição da ligação de mAb806 e mAb528 às placas de ELISA revestidas com sEGFR por concentrações crescentes de EGFR solúvel (sEGFR) em solução. (C) ligação de concentrações crescentes de DH8.3 ao péptido de junção des2-7 ilustra curvas de ligação de mAb806 e mAb528 ao sEGFR de tipo selvagem imobilizado (D).
As FIG. 2E e 2F apresentam graficamente os resultados de estudos de ligação BIAcore utilizando péptido biotinilado C-terminal e incluindo um anticorpo monoclonal da divulgação, juntamente com outros anticorpos conhecidos, entre os quais o anticorpo L8A4 que reconhece o péptido de junção do mutante des2-7 EGFR, e controlos. A FIG. 3 representa a internalização de mAb806 e do anticorpo DH8.3. As células U87MG.A2-7 foram pré-incubadas com mAb806
a 4 °C, transferidas para 37 °C e a internalização determinada por FACS. Os dados representam a internalização média em cada ponto no tempo ±EP de 3 (DH8.3) ou 4 (mAb806) experiências separadas.
As FIG. 4A e 4B ilustram a biodistribuição (% ID/g de tecido tumoral) de (a) 125I-mAb806 e (b) 131I-DH8.3 marcados radioativamente em ratinhos nude, portadores de xenoenxertos de U87MG e U87MG.A2-7. Cada ponto representa a média de 5 ratinhos ± EP, excepto para a 1 h, onde n = 4.
As FIG. 5A e 5B ilustram a biodistribuição de anticorpos 125I-mAb806 (barra vazia) e 131I-DH8.3 (barra a cheio) marcados radioativamente expressos como razões (a) tumor:sangue ou (b) tumor:fígado em ratinhos nude portadores de xenoenxertos U87MG.A2-7. Cada barra representa a média de 5 ratinhos ± EP exceto para a 1 h, onde n = 4
As FIG. 6A-C ilustram a análise por citometria de fluxo de linhas de células que contêm a amplificação do gene de EGFR. As células A431 foram reveladas com mAb806, DH8.3 ou 528 (histogramas pretos) e em comparação com um anticorpo de IgG2b irrelevante (histograma vazio).
As FIG. 7A e 7B ilustram a biodistribuição (% de ID/g de tecido tumoral) de (a) 125I-mAb806 e (b) 131I-528 marcados radioativamente em ratinhos nude portadores de xenoenxertos U87MG.A2-7 e A431.
As FIG. 8A-D ilustram a biodistribuição de 125I-mAb806 (barra vazia) e 131I-528 (barra a cheio) marcados radioativamente e anticorpos expressos como razões (A, B) tumor:sangue ou (C, D) tumor:fígado em ratinhos nude portadores de xenoenxertos de (A, C) U87MG.A2-7 e (B, D) A431.
As FIG. 9A e 9B ilustram o efeito antitumoral de mAb806 nas taxas de crescimento dos xenoenxertos (A) U87MG e (B) U87MG.A2-7 num modelo preventivo. 3 χ 106 células U87MG ou U87MG.A2-7 foram injetadas s.c. em ambos os flancos de ratinhos nude BALB/c com 4-6 semanas de idade, (n = 5) no dia 0. Os ratinhos foram injetados i.p. com 1 mg de mAb806
; ou veiculo (o) começando um dia antes à inoculação com células tumorais. As injeções foram dadas três vezes por semana, durante duas semanas, como indicado pelas setas. Os dados são expressos como volume tumoral médio ± E.P.
As FIG. 10A, 10B e 10C ilustram o efeito antitumoral de mAb806 em xenoenxertos (A) U87MG, (B) U87MG.A2-7 e (C) U87MG.tsEGFR num modelo estabelecido. 3 χ 106 células U87MG, U87MG.A2-7 ou U87MG.tsEGFR, foram injetados s.c. em ambos os flancos de ratinhos nude BALB/c com 4-6 semanas de idade, (n = 5) . Os ratinhos foram injetados i.p. com doses de 1 mg de mAb8 0 6
ou veiculo (o) começando quando os tumores atingiram um volume tumoral médio de 65 - 80 mm3. As injeções foram dadas três vezes por semana durante duas semanas como indicado pelas setas. Os dados são expressos como volume tumoral médio ± E.P.
As FIG. 11A e 11B ilustram o efeito antitumoral de mAb806 nos xenoenxertos de A431 em modelos (A) preventivos e (B) estabelecidos. 3 χ 106 células A431 foram injetadas s.c. em ambos os flancos de ratinhos nude BALB/c com 4-6 semanas de idade (n = 5) . Os ratinhos foram injetados i.p. com doses de 1 mg de mAb806
ou veículo (o), começando um dia antes à inoculação com células tumorais no modelo preventivo ou quando os tumores atingiram um volume tumoral médio de 200 mm3. As injeções foram dadas três vezes por semana durante duas semanas como indicado pelas setas. Os dados são expressos como volume tumoral médio ± E.P. A FIG. 12 ilustra o efeito antitumoral do tratamento com mAb806 combinado com o tratamento com AG 1478 em xenoenxertos de A431 num modelo preventivo. Os dados são expressos como volume tumoral médio ± E.P. A FIG. 13 representa a ligação de mAb806 a células A431 na presença de concentrações crescentes de AG1478 (0,5 μΜ e 5 μΜ) .
As FIG. 14A e 14B ilustram a (A) sequência de ácido nucleico e (B) a sua tradução de aminoácidos do gene da cadeia VH de 806 (SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 2, respetivamente).
As FIG. 15A e 15B ilustram a (A) sequência de ácido nucleico e a (B) sua tradução de aminoácidos do gene da cadeia VL de 806 (SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4, respetivamente). A FIG. 16 mostra a sequência da cadeia VH (SEQ ID N° : 2) numerada de acordo com Rabat, com as CDR (SEQ ID N°: 15, 16 e 17) sublinhadas. Os resíduos chave da sequência da cadeia VH (SEQ ID N°: 2) são 24, 37, 48, 67 e 78. A FIG. 17 mostra a sequência da cadeia VL (SEQ ID N°: 4) numerada de acordo com Rabat, com as CDR (SEQ ID N°: 18, 19 e 20) sublinhadas. Os resíduos chave da sequência da cadeia VL (SEQ ID N°: 4) são 36, 46, 57 e 71.
As FIG. 18A-18D mostram os resultados de estudos in vivo concebidos para determinar o efeito terapêutico da terapia de associação de anticorpos, em particular mAb806 e o anticorpo 528. Os ratinhos receberam inoculações de células U87MG.D2-7 (A e B), U87MG.DK (C) ou A431 (D).
As FIG. 19A-D mostram a análise da internalização por microscopia eletrónica. As células U87MG.A2-7 foram pré-incubadas com mAb806 ou DH8.3, seguido de IgG anti-ratinho conjugado com ouro, a 4 °C, transferidas para 37 °C e a internalização examinada em vários pontos no tempo por microscopia eletrónica. (A) localização do anticorpo DH8.3 numa cavidade revestida (seta) após 5 min; (B) internalização do mAb806 por macropinocitose (seta) após 2 min; (C) localização de DH8.3 nos lisossomas (seta) após 20 min; (D) localização de mAb806 nos lisossomas (seta) após 30 min. A ampliação original de todas as imagens é X30 000. A FIG. 20 mostra a auto-radiografia de uma secção de xenoenxerto de U87MG.A2-7 recolhida 8 h após injeção de 125I-m-Ab80 6. A FIG. 21 mostra a análise por citometria de fluxo de linhas de células que contêm amplificação do gene de EGFR. As células HN5 e MDA-468 foram reveladas com um anticorpo de IgG2b irrelevante (histograma vazio com linha a tracejado), mAb806 (histograma a preto) ou 528 (histograma vazio com linhas continuas). 0 anticorpo DH8.3 foi completamente negativo em ambas as linhas de células (dados não apresentados). A FIG. 22 mostra a imunoprecipitação de EGFR a partir de linhas de células. 0 EGFR foi imunoprecipitado a partir de células U87MG.A2-7 ou A431 marcadas com 35S com mAb806, anticorpo sc-03 ou um IgG2b de controlo de isotipo. As setas de lado indicam a posição do des2-7 e ts EGFR. Foram obtidos padrões de bandas idênticos em 3 experiências independentes. A FIG. 23 mostra a auto-radiografia de uma secção de xenoenxerto de A431 recolhido 24 h após injeção de 125I-mAb806, são indicadas as áreas de localização para tecido viável (setas).
As FIG. 24A e 24B mostram sobrevivência prolongada de ratinhos nude portadores de xenoenxertos U87MG.AEGFR (A) e LN-Z308.AEGFR (B) intracranianos com tratamento sistémico com mAb806. Células U87MG.EGFR (1 χ 105) ou células LN-Z308.AEGFR (5 χ 105) foram implantadas em cérebros de ratinhos nude e os animais foram tratados com mAb806, PBS ou IgG isotipo desde os dias 0 até 14 após implantação.
As FIG. 24C e 24D mostram a inibição do crescimento de tumores intracranianos por tratamento com mAb806. Ratinhos nude (cinco por grupo), tratados com mAb806 ou o controlo de IgG de isotipo, foram sacrificados no dia 9 para U87MG.EGFR (C) e no dia 15 para LN-Z308. AEGFR (D) , e os seus cérebros foram recolhidos, fixos e seccionados. Os dados foram calculados considerando o volume tumoral de controlo como 100%. Os valores são a média ± DP. ***, p < 0,001; controlo versus mAb806. Pontas das setas, tecido tumoral. A FIG. 24E mostra a sobrevivência prolongada de ratinhos nude portadores de xenoenxertos U87MG.AEGFR intracranianos com tratamento intratumoral com mAb806. As células U87MG.AEGFR foram implantadas como descrito. Foram injetados 10 mg de mAb806 ou controlo de IgG de isotipo num volume de 5 yL no sitio de injeção do tumor a cada dois dias começando no dia 1 durante cinco vezes.
As FIG. 25A, 25B e 25C mostram que o mAb806 prolonga a sobrevivência de ratinhos com tumores cerebrais U87MG.tsEGFR, mas não com tumores cerebrais U87MG.DK ou U87MG. As células U87MG (A), U87MG.DK (B) ou U87MG.tsEGFR (C) (5 x 105) foram implantadas em cérebros de ratinhos nude e os animais foram tratados com mAb806 desde os dias 0 até 14 após implantação, seguido de observação após interrupção da terapia. A FIG. 26A mostra a análise por FACS da reatividade do mAb806 com linhas de células U87MG. As células U87MG, U87MG.AEGFR, U87MG.DK e U87MG.tsEGFR foram reveladas com mAbs anti-EGFR 528, EGFR.l e anticorpo anti-AEGFR, mAb806. O anticorpo monoclonal EGFR.l reconheceu anticorpo o tsEGFR exclusivamente e anticorpo monoclonal 528 reagiu com ambos, tsEGFR e AEGFR. O mAb806 reagiu intensamente com U8 7MG.AEGFR e U87MG.DK e fracamente com U87MG.tsEGFR. Barras na abcissa, revelação máxima de células na ausência de anticorpo primário. Os resultados foram reproduzidos em três experiências independentes. A FIG. 26B mostra a imunoprecipitação de mAb806 de formas de EGFR. Mutante e tsEGFR foram imunoisolados com anticorpos anti-EGFR, 528, EGFR.l ou anticorpo anti-AEGFR, mAb806, a partir de células (Banda 1) U87MG, (Banda 2) U87A.EGFR, (Banda 3) U87MG.DK, e (Banda 4) U87MG.tsEGFR e foram, em seguida, detetados por transferência de Western com anticorpo anti-pan contra o EGFR, C13.
As FIG. 27A e 27B mostram que o tratamento sistémico com mAb806 diminui a fosforilação da expressão de AEGFR e Bel-XL em tumores cerebrais U87MG.AEGFR. Os tumores U87MG.AEGFR foram removidos no dia 9 do tratamento com mAb806, imediatamente congelados em azoto líquido e conservados a -80 °C antes da preparação do lisado tumoral. (A) Análise de transferência de Western da expressão e o grau de autofosforilação de AEGFR. Trinta yg de lisados tumorais foram submetidos a geles de SDS-poliacrilamida, transferidos para membranas de nitrocelulose, e testados com mAb anti-fosfotirosina, em seguida foram removidos da banda e retestados com anticorpo anti-EGFR, C13. (B) A transferência de Western de Bcl-XL utilizando os mesmos lisados tumorais como em (A). As membranas foram testadas com anticorpo policlonal anti-Bcl-X humano.
Bandas 1 e 2, tumores cerebrais U87MG.AEGFR tratados com controlo de isotipo; Bandas 3 e 4, tumores cerebrais U87MG.AEGFR tratados com mAb806. A FIG. 2 8 mostra que o tratamento com mAb8 0 6 leva a uma diminuição no crescimento e vasculogénese e a um aumento na apoptose e acumulação de macrófagos em tumores U87MG.AEGFR. As secções tumorais foram reveladas para Ki-67. 0 índice proliferativo celular foi avaliado pela percentagem de células totais que foi positiva para Ki-67 a partir de quatro campos de grande ampliação (X400) selecionados aleatoriamente em tumores intracranianos de quatro ratinhos de cada grupo. Os dados são a média ± EP. As células apoptóticas foram detetadas pelo ensaio TUNEL. 0 índice apoptótico foi avaliado pela proporção de células positivas para TUNEL: número total de células de quatro campos de grande ampliação (X400) selecionados aleatoriamente em tumores intracranianos de quatro ratinhos de cada grupo. Os dados são a média ± EP. As secções tumorais foram imunorreveladas com anticorpo anti-CD31. As MVA foram analisadas através de análise de imagem computorizada a partir de quatro campos (X200) selecionados aleatoriamente a partir de tumores intracranianos de quatro ratinhos de cada grupo. Infiltrados peritumorais de macrófagos em tumores U87MG.AEGFR tratados com mAb806. As secções tumorais foram reveladas com anticorpo anti-F4/80. A FIG. 29 mostra a análise por citometria de fluxo de linhas de células de gliomas U87MG parentais e transfetadas. As células foram reveladas com um anticorpo de IgG2b irrelevante (histogramas vazios) ou o anticorpo 528 ou mAb806 (histogramas a cheio) como indicado. A FIG. 30 mostra a imunoprecipitação de EGFR a partir de linhas de células. O EGFR foi imunoprecipitado a partir de células U87MG.tsEGFR, U87MG.A2-7 e A431 marcadas com 35S com mAb806 (806), anticorpo sc-03 (c-term), ou um IgG2b de controlo de isotipo (con) . Seta, posição do des2-7 e ts EGFR.
A FIG. 31 mostra secções em parafina de xenoenxertos de U87MG.A2-7 e U87MG.tsEGFR reveladas com H&amp;E representativas. Os xenoenxertos U87MG.A2-7 (recolhido 24 dias após inoculação do tumor) e U87MG.tsEGFR (recolhido 42 dias após inoculação do tumor) foram excisados a partir de ratinhos tratados como descrito na FIG.10 acima e revelados com H&amp;E. Os xenoenxertos U87MG.A2-7 (recolhido 18 dias após inoculação do tumor) e U87MG.tsEGFR (recolhido 37 dias após inoculação do tumor) tratados com veiculo apresentaram muito poucas áreas de necrose (painel da esquerda), enquanto foi observada necrose extensa (setas) em xenoenxertos U87MG.A2-7 e U87MG.tsEGFR tratados com mAb806 (painel da direita).
A FIG. 32 mostra a análise imuno-histoquímica da expressão de EGFR em secções congeladas provenientes de xenoenxertos U87MG, U87MG.A2-7 e U87MG.tsEGFR. Foram recolhidas secções nos pontos no tempo descritos na FIG.31 acima. As secções de xenoenxerto foram imunorreveladas com o anticorpo 528 (painel da esquerda) e mAb806 (painel da direita). Não foi observada imunorreatividade reduzida para tsEGFR, EGFR amplificado ou des2-7 EGFR em xenoenxertos tratados com mAb806. Coerente com os dados in vitro, os xenoenxertos de U87MG parental foram positivos para o anticorpo 528 mas foram negativos para a revelação com mAb806.
A FIG. 33 mostra uma representação esquemática das construções de expressão bicistrónicas produzidas. A transcrição das cadeias de anticorpo quimérico é iniciada pelo promotor do Fator de Alongamento-1 e terminada por uma sequência de terminação artificial forte. Foram introduzidas sequências IRES entre as regiões codificantes de cadeia leve e NeoR e o gene da cadeia pesada e dhfr.
As FIG. 34A e 34B mostram a análise da biodistribuição do ch806 marcado radioativamente com (A) 125I ou (B) 11]-In realizada em ratinhos nude BALB/c portadores de tumores de xenoenxerto U87MG-des2-7. Os ratinhos foram injetados com 5 yg de anticorpo marcado radioativamente e em grupos de 4 ratinhos por ponto no tempo, sacrificados às 8, 28, 48 ou 74 horas. Os órgãos foram recolhidos, pesados e a radioatividade medida num contador gama.
As FIG. 35A e 35B representam (A) a % ID grama de tecido tumoral e (B) a razão tumor para sangue. 0 anticorpo de índio-111 mostra aproximadamente 30% de ID/grama de tecido e uma razão tumor para sangue de 4,0. A FIG. 36 representa a eficácia terapêutica do anticorpo quimérico ch806 num modelo de tumor estabelecido. Foram inoculadas s.c. 3 χ 106 células U87MG.A2-7 em 100 yL de PBS em ambos os flancos de ratinhos nude fêmeas com 4-6 semanas de idade. 0 mAb806 foi incluído como um controlo positivo. 0 tratamento foi iniciado quando os tumores tinham atingido um volume médio de 50 mm3 e consistiu de 1 mg de ch806 ou mAb806 administrado i.p. durante um total de 5 injeções nos dias indicados. Os dados foram expressos como volume tumoral médio ± E.P. para cada grupo de tratamento. A FIG. 37 mostra a atividade CDC em células (A) U87MG.des2-7 e (B) A431 alvo para anticorpos de IgGl quiméricos anti-EGFR ch806 e de controlo cG250. É apresentada a percentagem de citotoxicidade média (barras; ± DP) de determinações em triplicado. A FIG. 38 mostra a ADCC em células (A) U87MG.des2-7 e (B) A431 alvo a razões Efector:Célula alvo de 50:1 mediada por ch806 e controlo de isotipo cG250 (0-10 yg/mL). Os resultados são expressos como a percentagem de citotoxicidade média (barras; ± DP) de determinações em triplicado. A FIG. 39 mostra a ADCC mediada por 1 yg/mL de mAb806 parental e ch806 em células U87MG.des2-7 alvo na gama de razões Efector:Alvo. É apresentada a média (barras; ± DP) de determinações em triplicado. A Figura 40 mostra vinte e cinco anticorpos produtores de hibridomas que ligaram ch806 mas não huIgG inicialmente selecionados. Quatro destes hibridomas anti-ch806 com alta afinidade de ligação (clones 3E3, 5B8, 9D6 e 4D8) foram subsequentemente utilizados para expansão clonal a partir de células únicas por diluição limitante e designados pelo Ludwig Institute for Cancer Research Melbourne Hibridomas (LMH) -11, -12, -13 e -14, respetivamente. Além disso, dois hibridomas que produziram mAbs específicos para huIgG foram também adicionalmente clonados e caracterizados: clones 2C10 (LMH-15) e 2B8 (LMH-16).
As FIG. 41A, 41B, e 41C mostram que após expansão clonal, os sobrenadantes das culturas de hibridoma foram examinados em triplicado por ELISA quanto à aptidão para neutralizar a atividade de ligação ao antigénio do ch806 ou mAb806 com SEGFR621. Os resultados da média (± DP) demonstraram a atividade antagonista dos mAbs anti-idiótipos LMH -11, -12, -13 e -14 com o bloqueio em solução da ligação de ch806 e mAb806 murídeo a placas revestidas com sEGFR (LMH-14 não mostrado). A FIG. 42A, 42B e 42C mostram placas de microtitulação que foram revestidas com 10 pg/mL de (A) LMH-11, (B) LMH -12 e (C) LMH-13 purificados. Os três clones purificados foram comparados quanto à sua aptidão para capturar ch806 ou mAb806 em soros ou 1% de FCS/Meio e, em seguida, detetar ch806 ou mAb806 ligado. Foram incluídos anticorpos de controlo de isotipo hu3S193 e m3S193 em soro e 1% de FCS/Meio, além dos controlos para o conjugado secundário avidina-HRP e substrato ABTS. Os resultados são apresentados como a média (± DP) de amostras em triplicado utilizando biotinilado-LMH-12 (10 pg/mL) para deteção e indicam que o LMH-12 utilizado para captura e deteção tinha a sensibilidade mais elevada para o ch806 no soro (3 ng/mL) com ligação de fundo insignificante. A FIG. 43 mostra a validação das condições de ELISA farmacocinética ideais utilizando 1 yg/mL de LMH-12 anti-idiótipo e 1 yg/mL de LMH-12 biotinilado para captura e deteção, respetivamente. Foram realizados três ELISA separados em quadruplicado para medir o ch806 no soro dador
de três dadores saudáveis ou 1% de BSA/meio
com controlo de isotipo hu3S 193 em soro
ou 1% de BSA/meio
Foram também incluídos controlos para o conjugado secundário avidina-HRP
e substrato ABTS (hexágono) sozinho com cada ELISA. Os resultados da média (± DP) demonstram curvas de ligação altamente reprodutíveis para medir o ch806 (2 yg/mL - 1,6 ng/mL) em soros com um limite de deteção de 3 ng/mL. (n = 12; 1 - 100 ng/mL, Coeficiente de Variação < 25%; 100 ng/mL - 5 yg/mL, Coeficiente de
Variação < 15%). Não foi evidente qualquer ligação de fundo com qualquer dos três soros testados e foi observada ligação insignificante com o controlo de isotipo hu3S193. A FIG. 44 representa uma imunotransferência de sEGFR recombinante expresso em células CHO, transferido com mAb806. O sEGFR recombinante foi tratado com PNGaseF para remover a glicosilação ligada a N (desglicosilado) ou não tratado (não tratado), a proteína foi analisada em SDS-PAGE, transferida para membrana e imunotransferida com mAb 8 0 6. A FIG. 45 representa a imunoprecipitação de EGFR a partir de linhas de células (U87MG.A2-7, U87MG-tsEGFR e A431) marcadas com 35S, com anticorpos diferentes (anticorpos SC-03, 806 e 528). A FIG. 46 representa a imunoprecipitação de EGFR a partir de diferentes células (A431 e U87MG.A2-7) em diferentes pontos no tempo (tempo 0 a 240 minutos) após marcação por impulso com 35S metionina/cisteina. Os anticorpos 528 e 806 são utilizados para imunoprecipitação. A FIG. 47 representa a imunoprecipitação de EGFR a partir de várias linhas de células (U87MGA2-7, U87MG-tsEGFR e A431) com vários anticorpos (SC-03, 806 e 528) na ausência de (-) e após digestão com Endo H (+) para remover hidratos de carbono do tipo com altos teores de manose. A FIG. 48 representa a iodação da superfície celular das linhas de células A431 e U87MG.A2-7, seguida de imunoprecipitação com o anticorpo 806 e com ou sem digestão com Endo H, que confirma que o EGFR ligado pelo mAb806 na superfície celular de células A431 é uma forma sensível a EndoH. A FIG. 49 mostra o vetor Neo LC pREN ch806 (SEQ ID N°: 7). A FIG .50 mostra o vetor DHFR HC pREN ch806 (SEQ ID N°: 8).
As FIG. 51A-D mostram as sequências de ácidos nucleicos das cadeias VH e VL de mAbl24 (SEQ ID N°: 21 e 26, respetivamente) e as sequências de aminoácidos (SEQ ID N°: 22 e 27, respetivamente).
As FIG. 52A-D mostram as sequências de ácidos nucleicos das cadeias VH e VL de mAbll33 (SEQ ID N°: 31 e 36, respetivamente) e as sequências de aminoácidos (SEQ ID N°: 32 e 37, respetivamente). A FIG. 53 mostra um gráfico do plasmideo de ADN do plasmideo do duplo gene Lonza, combinado que inclui pEEl2.4 contendo o cartucho de expressão hu806H (VH + CH) e pEE6.4 contendo o cartucho de expressão hu806L (VL + CL). A FIG. 54 mostra a sequência de ADN (SEQ ID N°: 41; complemento SEQ ID N° : 162) do plasmideo Lonza combinado descrito na FIG.53. Esta sequência mostra também todas as traduções (SEQ ID N°: 42-51 e 163-166) relevantes para o anticorpo hu806. 0 plasmideo foi verificado quanto à sequência e a sequência codificante e tradução verificadas. Secções da sequência foram sombreadas para identificar regiões de interesse; as regiões sombreadas correspondem às junções de excisão-união efetivas. 0 código de cor é como se segue: (cinzento): região sinal, sequências codificantes iniciais presentes em ambas as regiões variáveis das cadeias pesada e leve; (alfazema): cadeia VH de hu806, região variável da cadeia pesada recoberta; (cor-de-rosa): cadeia CH de hu806, região constante da cadeia pesada de codão otimizado; (verde): cadeia VL de hu806, região variável da cadeia leve recoberta; e (amarelo): cadeia CL de hu806, região constante da cadeia leve de codão otimizado.
As FIG. 55A e 55B mostram as sequências de aminoácidos traduzidas do hu806 (cadeias VH e VL da SEQ ID N°: 164 e 166 e seus respectivos péptidos sinal da SEQ ID N°: 163 e 165; cadeias CH e CL da SEQ ID N°: 43 e 48), e proporcionam os números Rabat para as cadeias VH e VL (SEQ ID N°: 164 e 165, respetivamente), com CDR (SEQ ID N° : 44-46 e 49-51) sublinhadas .
As FIG. 56A, 56B, 56C, 57A, 57B e 57C mostram o passo inicial na conceção de recobrimento, a classificação dos residuos de aminoácidos da sequência de mAb806 (cadeia VH da SEQ ID N° : 167 e cadeia VL da SEQ ID N° : 12) quanto à exposição superficial. As classificações são dadas pelo número de asteriscos (*) acima de cada resíduo, com a maioria dos resíduos expostos possuindo três asteriscos.
Estas figuras incluem um desenho que indica como os oligonucleótidos (cadeia VH: FIG.56C e SEQ ID N°: 52 e 169-177; cadeia VL: FIG.57C e SEQ ID N°: 62, 66, 68 e 181-187) se sobrepunham para formar o primeiro produto recoberto (cadeia VH da SEQ ID N°: 168 e cadeia VL de SEQ ID N°: 180). A FIG. 58 mostra um mapa da sequência de ADN da cadeia pesada de huIgGl de codão otimizado (SEQ ID N°: 80; complemento SEQ ID N°: 178) e tradução de aminoácidos (SEQ ID N°: 43). A FIG. 59 mostra o alinhamento de proteínas que compara a sequência de aminoácidos das VH + CH de hu806 (VH + CH de 8C65AAG hu806; SEQ ID N° : 81) com o ficheiro de referência original para a cadeia VH de mAb806 (SEQ ID N°: 167) . As regiões destacadas indicam sequências de aminoácidos conservadas na cadeia VH. As CDR estão sublinhadas. Os asteriscos refletem alterações que foram planeadas e realizadas no processo de recobrimento inicial. Os sitios numerados são referências a modificações posteriores. A FIG. 60 mostra o alinhamento correspondente para as sequências de aminoácidos das VL + CL de hu806 (sinal + VL + CL de 8C65AAG hu806; SEQ ID N° : 83) com o ficheiro de referência original para a cadeia VL de mAb806 (SEQ ID N°: 179) . Esta contém um ficheiro adicional (sinal + VL + CL de r2vkl hu806; SEQ ID N°: 82), uma construção precursora, que foi incluída para ilustrar a alteração feita na modificação N° 7. A FIG. 61 mostra um alinhamento de nucleótidos e aminoácidos das sequências sinal+VL e CL de hu806 (V1+ Cl de 8C65AAG hu806; SEQ ID N° : 190 e 188) com as sequências correspondentes de ch806 (Neo LC pREN ch806; LICR; SEQ ID N°: 189) . Foi modificada e anotada como se descreve na FIG. 62. A FIG. 62 mostra o alinhamento de nucleótidos da sequência sinal+VH de hu806 (cadeia VH de 8C65AAG hu806; SEQ ID N°: 192) com a sequência correspondente de mAb806 [cadeia VH de mAb806 antes da alteração de codão (cc) e recobrimento (ven); SEQ ID N°: 191]. São ilustradas as alterações de nucleótidos por detrás das alterações de aminoácidos das FIG.59 e 60, assim como mostradas as alterações conservadoras de ácidos nucleicos que não conduzem a qualquer alteração dos aminoácidos. O intrão entre o sinal e a cadeia VH no hu806 foi removido para maior facilidade de visualização. A sequência sinal e CDR estão sublinhadas. A sequência de aminoácidos (SEQ ID N°: 42) correspondente foi sobreposta no alinhamento. A FIG. 63. mostra a ligação de anticorpo hu806 purificado obtido de células 293 transfetantes transitórias ao EGFR-ECD recombinante como determinado por Biacore. Não foi observada ligação ao EGFR-ECD com anticorpo de IgGl humano de controlo purificado. A FIG. 64 mostra o documento de texto no formato GenBank da sequência (SEQ ID N°: 41) e as anotações do plasmideo 8C65AAG que codifica a IgGl hu806. A FIG. 65 mostra o alinhamento das sequências de aminoácidos para as CDR de mAb806 (SEQ ID N°: 15-18, 20 e 193) e mAb175 (SEQ IDNOS:130-132, 135 e 194-195). As diferenças da Sequências entre os dois anticorpos encontram-se a negrito.
As FIG. 66A e 66B mostram a revelação imuno-histoquímica de linhas de células e fígado humano normal com mAbl75. (A) O mAbl75 biotinilado foi utilizado para revelar secções preparadas a partir de blocos contendo células A431 (sobreexpressam o tsEGFR), células U87MG.A2-7 (expressam o A2-7EGFR) e células U87MG (expressam o tsEGFR a níveis moderados). (B) A revelação de fígado humano normal (400x) com mAbl75 (painel da esquerda), controlo de isotipo (centro painel) e controlo de anticorpo secundário (painel da direita). Não foi observada revelação sinusoidal ou de hepatócitos especifica.
As FIG. 67A, 67B, e 67C mostram a reatividade de mAb806 e mAbl75 com os fragmentos do EGFR apresentados em levedura. (A) Histogramas de citometria de fluxo representativos que representam o sinal de fluorescência médio de marcação com mAbl75 e mAb806 de fragmentos de EGFR apresentados em levedura. Com a apresentação em levedura, uma percentagem das células não expressam proteína na sua superfície resultando em 2 picos no histograma. 0 anticorpo 9E10 é utilizado como um controlo positivo, já que todos os fragmentos contêm um marcador c-myc C-terminal linear. (B) Sumário da ligação de anticorpo a vários fragmentos de EGFR. (C) Os fragmentos de EGFR foram desnaturados aquecendo os sedimentos de levedura a 800 °C durante 30 min. O marcador c-myc continuava a ser reconhecido pelo anticorpo anti-myc 9E10 em todos os casos, o que demonstra que o tratamento térmico não compromete a proteína apresentada na superfície da levedura. O anticorpo contra o EGFR sensível à conformação mAb225 foi utilizado para confirmar a desnaturação.
As FIG. 68A, 68B, 68C, e 68D mostram os efeitos antitumorais de mAbl75 em xenoenxertos de cancro do cérebro e da próstata. (A) Ratinhos (n = 5) portadores de xenoenxertos de U87MG.A2-7 foram injetados i.p. com PBS, 1 mg de mAbl75 ou mAb806 (controlo positivo), três vezes por semana durante duas semanas nos dias 6, 8, 10, 13, 15 e 17 quando o volume tumoral inicial era de 100 mm3. Os dados são expressos como volume tumoral médio ± EP. (B) As células foram reveladas com dois anticorpos irrelevantes (azul, sólido e verde, vazio), mAb 528 para o EGFR total (cor-de-rosa, sólido), mAb806 (azul-claro, vazio) e mAbl75 (laranja, vazio) e em seguida analisadas por FACS. (C) As células DU145 foram submetidas a lise, submetidas a IP com mAb 528, mAb806, mAbl75 ou dois anticorpos irrelevantes independentes e, em seguida, imunotransferidas para EGFR. (D) Ratinhos (n = 5) portadores de xenoenxertos de DU145 foram injetados i.p. com PBS, 1 mg de mAbl75 ou mAb806, diariamente nos dias 18-22, 25-29 e 39-43 quando o volume tumoral inicial era de 85 mm3. Os dados são expressos como volume tumoral médio ± EP.
As FIG. 69A, 69B, 69C, 69D, 69E e 69F mostram as estruturas cristalinas do péptido de EGFR 287-302 ligado aos fragmentos Fab (A) Esboço de Fab 806, com a cadeia leve, vermelha; cadeia pesada, azul; péptido ligado, amarelo; e o EGFR287-302 sobreposto a partir do EGFR, púrpura. (B) Esboço de Fab 175 com a cadeia leve, amarela; cadeia pesada, verde; péptido ligado, lilás; e EGFR287-302 de EGFR (Dl-3) , púrpura. (C) Pormenor de (B) que mostra a semelhança de EGFR287-302 no recetor com o péptido ligado ao FAb 175. Os esqueletos peptídicos são mostrados como perfis Ca e as cadeias laterais interatuantes como bastões. Os átomos de O são de cor vermelha; N, azul; S, laranja e C, como para a cadeia principal. (D) Sobreposição de EGFR com o complexo Fabl75:péptido que mostra sobreposição espacial. Coloração como em (C) com a superfície de EGFR187-286 colorida de turquesa. (E) Corte ortogonal a (D) com EGFR187-286 apresentado em azul opaco e a superfície das cadeias leve (laranja) e pesada (verde) transparentes. (F) Plano estereoquímico detalhado do complexo de Fab 175 olhando para o sítio de ligação de antigénio. Coloração como em (C) e ligações de hidrogénio da cadeia lateral ponteadas a preto. As moléculas de água enterradas após formação do complexo são mostradas como esferas vermelhas.
As FIG. 70A, 70B, 70C e 70D mostram a influência da ligação de cisteína 271-283 na ligação do mAb806 ao EGFR. (A) As células transfetadas com tsEGFR, EGFR-C271A, EGFR-C283A ou o mutante C271A/C283A foram revelados com mAb528 (histograma cor-de-rosa sólido), mAb806 (linha azul) ou apenas o anticorpo secundário (púrpura) e, em seguida, analisados por FACS. 0 ganho foi ajustado utilizando um anticorpo irrelevante de classe condizente. (B) Células BaF3 que expressam o EGFR- C271A ou C271/283A EGFR foram examinadas quanto à sua resposta ao EGF num ensaio MTT como descrito. As ECso foram derivadas utilizando o ajuste de Bolzman dos pontos de dados. Os dados representam a média e dp de medições em triplicado. (C) Células BaF3 que expressam o tipo selvagem ou o EGFR-C271A/C283A foram privadas de IL-3 e soro, em seguida, expostas a EGF ou controlo de veículo. Os Usados de células inteiras foram separados por SDS-PAGE e imunotransferidos com anticorpo anti-fosfotirosina (painel superior) ou anticorpo anti-EGFR (painel inferior). (D) Células BaF3 que expressam o EGFR de tipo selvagem (painel da esquerda) ou C271A/ C283A (painel da direita) foram estimuladas com concentrações crescentes de EGF na ausência de anticorpo (símbolos vazios), mAb 528 (círculos cinzentos) ou mAb806 (triângulos pretos), ambos a 10 yg/mL. Os dados são expressos como a média e dp de medições em triplicado.
As FIG. 71A, 71B e 71C mostram: (A) Imagem de câmara gama de todo o corpo da biodistribuição de niIn ch806 num doente com carcinoma de células escamosas metastático das cordas vocais, que mostra captação quantitativa alta no tumor no lado direito do pescoço (seta). São também visíveis a atividade da mistura de sangue e o catabolismo secundário de 11]-In livre no fígado. (B) Imagem de Tomografia
Computorizada de Fotão Único (SPECT) do pescoço deste doente, a qual mostra a captação de 11]-In-ch806 em tumor viável (seta), com captação central reduzida que indica necrose. (C) Varrimento CT correspondente do pescoço que mostra uma massa tumoral grande do lado direito do pescoço (seta) com necrose central.
As FIG. 72A e 72B mostram um modelo estereoquímico da estrutura do EGFRl-621 não ligado. A estrutura do recetor é desenhada a azul e o ligando TGF-α a vermelho. 0 epítopo de mAb806/175 é desenhado a turquesa e as ligações dissulfureto a amarelo. Os átomos da ligação dissulfureto que prendem o epítopo ao recetor são mostrados no formato de preenchimento do espaço. 0 modelo foi construído fixando o domínio CR2 de EGFR-ECD a partir da conformação fixa na estrutura de um monómero de EGFR não fixo na presença do seu ligando. A FIG. 73 mostra a reatividade de mAb806 com fragmentos do EGFR. Os lisados de células 293T transfetadas com vetores que expressam o fragmento de EGFR 1-501 solúvel ou proteínas de fusão do fragmento GH/EGFR (GH-274-501, GH-282-501, GH-290-501 e GH-298-501) foram resolvidos por SDS- PAGE, transferidos para membrana e imunotransferidos com mAb806 (painel da esquerda) ou o anticorpo anti-myc 9B11 (painel da direita).
As FIG. 74A e 74B mostram a sequência de ácido nucleico da cadeia VH do mAbl75 (SEQ ID N°: 128) e a(s) sequência(s) de aminoácidos (SEQ ID N°: 129), respetivamente.
As FIG. 75A e 75B mostram a sequência de ácido nucleico da cadeia VL do mAbl75 (SEQ ID N°: 133) e a(s) sequência(s) de aminoácidos (SEQ ID N°: 134), respetivamente. A FIG. 76A, 76B e 76C mostram: (A) Concentração volumétrica de produto e (B) concentração de células viáveis de transfetantes de hu806 GS-CHO (14D8, 15B2 e 40A10) e GS-NSO (36) em culturas em balões de agitação de pequena escala (100 mL) . A concentração de produto foi estimada por ELISA utilizando o anti-idiótipo 806 como anticorpo de revestimento e o Lote Clinico: J06024 de ch806 como padrão; (C) Crescimento de células transfecantes GS-CHO 40A10 e produção volumétrica num tanque biorreactor agitado de 15L. Densidade de células viáveis
χ 105 célula/mL), viabilidade das células
As FIG. 77A, 77B, 77C, 77D e 77E mostram a Análise por Cromatografia de Exclusão Molecular (Biosep SEC-S3000) de construções de anticorpo hu806 purificadas por Proteína-A produzidas por cultura em pequena escala e ch806 de controlo e mAb 806. Os cromatogramas a A214nm são apresentados nos painéis superiores e a A280nm no painel inferior de cada Figura. A FIG. 78 mostra a Análise por Cromatografia de Exclusão Molecular (Biosep SEC-S3000) da construção de anticorpo hu806 40A10 purificada por Proteína A após produção em grande escala e purificação por Proteína A. É apresentado o cromatograma a A214nm que indica 98,8% de pureza com 1,2% de agregado presente. A FIG. 79 mostra que Geles de 4-20% de Tris/Glicina pré moldados da Novex, EUA foram utilizados em condições de SDS-PAGE convencionais para analisar preparações de hu806 transfetantes purificadas (5 pg) GS CHO (14D8, 15B2 e 40A10) e GS-NSO (36) hu806 sob condições redutoras.
Proteínas detetadas por revelação com Azul de Coomassie. A FIG. 80 mostra que Geles de 4-20% de Tris/Glicina pré-moldados foram utilizados em condições de SDS-PAGE convencionais para analisar preparações de hu806 transfetantes purificadas (5 pg) GS CHO (14D8, 15B2 e 40A10) e GS-NSO (36) sob condições não redutoras. Proteínas detetadas por revelação com Azul de Coomassie. A FIG. 81 mostra que Geles de 4-20% de Tris/Glicina pré-moldados foram utilizados em condições de SDS-PAGE convencionais para analisar hu806 transfetante purificado GS CHO 40A10 (5 pg) após produção em grande escala.
Proteínas detetadas por revelação com Azul de Coomassie. A FIG. 82 mostra a análise por gel de Focagem Isoeléctrica do transfetante hu806 purificado GS CHO 40A10 (5 pg) após produção de 15L. Proteínas detetadas por Revelação com Azul de Coomassie. Banda 1, marcadores pi; Banda 2, hu806 (três isoformas, pi 8,66 a 8,82); Banda 3, marcadores pi. A FIG. 83 mostra a ligação a células A431: Análise por Citometria de Fluxo de preparações de anticorpo hu806 purificadas (20 yg/mL) por Proteína A e controlo de isotipo huA33 (20 yg/mL). Os controlos incluem o anticorpo secundário sozinho (verde) e ch806 (vermelho). As construções de hu806 foram produzidas por cultura em pequena escala. A FIG .84 mostra a ligação a células A431: Análise por citometria de fluxo de preparações de anticorpos mAb806, ch806 e hu806 40A10 purificadas (20 yg/mL) que ligam -10% de EGFR de tipo selvagem na superfície celular, 528 (liga o tipo selvagem e o des2-7 EGFR) e anticorpo irrelevante de controlo (20 yg/mL) como indicado. A FIG. 85 mostra a ligação a células de glioma U87MG.des2-7. Análise por Citometria de Fluxo de preparações de anticorpo mAb806, ch806 e hu806 40A10 purificadas (20 yg/mL) e anticorpo anti-EGFR 528 e irrelevante de controlo (20 yg/mL). A FIG. 86 apresenta ligação específica de construções de anticorpo 806 marcadas radioativamente com 125I a: (A) células de glioma U87MG.des2-7 e (B) células de carcinoma A431. A FIG. 87 mostra Análises de Scatchard: construções de anticorpos (A) ch806 e (B) hu806 marcados radioativamente com 125I que se ligam a células U87MG. des2-7. A FIG. 88 mostra Análises de Scatchard: Construções de anticorpos (A) ch806 e (B) hu806 marcados radioativamente 125I que se ligam a células A431. A FIG. 89 mostra a análise BIAcore da ligação ao epítopo do péptido 806 287-302 EGFR por passagem de (A) hu806 e (B) ch806 sobre o péptido imobilizado em concentrações crescentes de 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM e 300 nM. A FIG. 90 mostra a Citotoxicidade Celular Dependente de
Anticorpo mediada por ch806 e hu806 em células A431 alvo determinada a (A) 1 yg/mL de cada anticorpo ao longo da gama de razões de efetor para célula alvo (E:T = 0,78:1 a 100:1); (B) a E:T = 50:1 ao longo de uma gama de concentrações de cada anticorpo (3,15 ng/mL - 10 yg/mL) em A431 alvo. A FIG. 91 mostra o tratamento de xenoenxertos de A431 estabelecidos em ratinhos nude BALB/c. Grupos de 5 ratinhos receberam 6 doses χ 1 mg ao longo de 2 semanas de terapia de anticorpo como indicado (setas). É apresentada a Média ± EPM do volume tumoral até à finalização do estudo. A FIG. 92 mostra o tratamento de xenoenxertos de U87MG.des2-7 estabelecidos em ratinhos nude BALB/c. Grupos de 5 ratinhos receberam 6 doses χ 1 mg ao longo de 2 semanas de terapia de anticorpo como indicado (setas). É apresentada a Média ± EPM do volume tumoral até à finalização do estudo. A FIG. 93 mostra as divergências dos valores de desvio químico do enrolamento aleatório para o péptido mAb806 (A) N, (B) HN e (C) HA. 0 péptido foi preparado em solução de H2O contendo 5% de 2H2O, NaCl 70 mM e NaPCb 50 mM a pH 6,8. Todos os espectros utilizados para atribuições sequenciais foram adquiridos a 298K num Bruker Avance500.
As FIG. 94A, 94B, 94C, 94D, 94E e 94F mostram imagens da câmara gama de todo o corpo do Doente 7 A) Anterior, e B) Posterior, Dia 5 após infusão de 11]-In-ch806. É evidente a captação elevada de 11]-In-ch806 em lesões metastáticas nos pulmões (setas) C) e D) mostram lesões metastáticas (setas) em varrimentos CT. E) Imagens 3D por SPECT do peito, e F) imagens transaxiais co-registadas de SPECT e CT que mostram captação específica de 11]-In-ch806 em lesões metastáticas.
As FIG. 95A, 95B, 95C, 95D, 95E e 95F mostram imagens planares da cabeça e pescoço do Doente 8 obtidas no A) Dia O, B) Dia 3 e C) Dia 7 após infusão de 11]-In-ch806. É observada atividade inicial da mistura de sangue no Dia 0, e a captação de 11]-In-ch806 num astrocitoma anaplástico no lobo frontal direito é evidente no Dia 3 (seta) e aumenta no Dia 7. A captação específica de inIn-ch806 é confirmada na D) imagem SPECT do cérebro (seta) no sítio do tumor (seta) evidente em E) 18F-FDG PET, e F) MRI.
As FIG. 96A, 96B, 96C e 96D mostram captação semelhante evidente de 11]-In-ch806 no tumor no Doente 3 em comparação com o Doente 4, apesar das diferenças na expressão do antigénio de 806 nas amostras de tumor rastreadas. A) Localização do niIn-ch806 em metástases pulmonares (seta) na imagem SPECT transaxial do Doente 4, com atividade evidente na mistura de sangue cardíaco (B) . B) varrimento CT correspondente. Foi demonstrado que o tumor arquivado tem <10% positividade para a expressão de 806. C)
Localização de niIn-ch806 em metástases pulmonares (seta) no Doente 3, com atividade evidente na mistura de sangue cardíaco (B). D) varrimento CT correspondente. Foi demonstrado que o tumor arquivado tem 50-75% de positividade para a expressão de 806. A FIG. 97 mostra a farmacocinética de população combinada da proteína ch806 medida por ELISA. ch806 (%ID/L) vs. tempo após infusão (h) observado e previsto.
As FIG. 98A e 98B mostram os resultados de doentes individuais para a A) Eliminação Normalizada a partir de Todo o Corpo e B) Eliminação Hepática de inIn-ch806 aos níveis de dose de 5 mg/m2
10 mg/m2(A), 20 mg/m2 (V) e 40 mg/m2
Regressão linear para os conjuntos de dados indicados em cada painel [A) r2= 0,9595; B) r2 = 0,9415].
DESCRIÇÃO DETALHADA
De acordo com a presente invenção pode utilizar-se biologia molecular convencional, microbiologia e técnicas de ADN recombinante no âmbito do conhecimento da técnica. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-E [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames &amp; S. J. Higgins eds. (1985) ]; "Transcription And Translation" [B. D. Hames &amp; S. J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R. I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986) ]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984) .
Como aqui utilizados, os seguintes termos são considerados como tendo, sem limitação, as definições proporcionadas. A expressão "membro de ligação especifica" descreve um membro de um par de moléculas que têm especificidade de ligação um para o outro. Os membros de um par de ligação especifica podem ser de origem natural ou produzidos total ou parcialmente por síntese. Um membro do par de moléculas tem uma área na sua superfície, ou uma cavidade, a qual se liga especificamente e é, por conseguinte, complementar a uma organização espacial e polar particular do outro membro do par de moléculas. Assim, os membros do par têm a propriedade de se ligar especificamente um ao outro. Os exemplos de tipos de pares de ligação específica são antigénio-anticorpo, biotina-avidina, hormona-recetor de hormona, recetor-ligando, enzima-substrato. Esta aplicação refere-se a reações do tipo antigénio-anticorpo. A expressão "expressão aberrante" nas suas várias formas gramaticais pode significar e incluir qualquer expressão aumentada ou alterada ou sobreexpressão de uma proteina num tecido, e. g., um aumento na quantidade de uma proteina, provocada por qualquer meio incluindo aumento da expressão ou tradução, modulação do promotor ou um regulador da proteina, amplificação de um gene para uma proteina, ou aumento da semivida ou estabilidade, pelo que existe ou pode ser detetada mais proteina em qualquer altura, em contraste com um estado não sobreexpressado. A expressão aberrante inclui e considera qualquer cenário ou alteração em que a maquinaria de expressão ou modificação pós-tradução de uma proteina numa célula é sobrecarregada ou, de outro modo, rompida devido ao aumento da expressão ou ao aumento dos níveis ou quantidades de uma proteína, incluindo quando é expressa uma proteína alterada, como uma proteína mutada ou variante devido a alteração, supressão ou inserção na sequência, ou dobragem alterada. É importante entender-se que a expressão, "expressão aberrante" foi aqui especificamente escolhida para abranger o estado em que estão presentes quantidades/níveis anormais (geralmente aumentados) da proteína, independentemente da causa efetiva dessa quantidade ou nível anormal. Assim, as quantidades anormais de proteína podem resultar da sobreexpressão da proteína na ausência de amplificação do gene, o que é o caso, e. g. , em muitas amostras celulares/tecidulares retiradas da cabeça e pescoço de indivíduos com cancro, enquanto outras amostras exibem proteína anormais de proteínas atribuíveis à amplificação do gene.
Neste último caso, algum do trabalho da requerente que é aqui apresentado para ilustrar a invenção, inclui a análise de amostras, algumas das quais exibem níveis anormais de proteínas resultantes da amplificação de EFGR. Portanto, isto é responsável pela apresentação aqui de observações experimentais onde é feita referência a amplificação e pela utilização dos termos "amplificação/amplifiçado", e semelhantes, ao descrever níveis anormais de EFGR. No entanto, é a observação de quantidades ou níveis anormais de proteína que define o ambiente ou circunstância em que é considerada a intervenção clínica com recurso aos membros de ligação da invenção e, por esta razão, a presente descrição considera que a expressão, "expressão aberrante" captura de forma mais lata o ambiente causal que produz a anormalidade correspondente nos níveis de EFGR.
Por conseguinte, enquanto os termos "sobreexpressão" e "amplificação" nas suas várias formas gramaticais são entendidos como tendo significados técnicos distintos, estes devem ser considerados equivalentes um ao outro, na medida em que representam o estado em que estão presentes níveis anormais da proteína EFGR no contexto da presente invenção. Consequentemente, a expressão, "expressão aberrante" foi escolhida uma vez que se entende que agrupa os termos "sobreexpressão" e "amplificação" dentro do seu âmbito para os fins aqui explicitados, para que todos os termos possam ser considerados equivalentes uns aos outros como aqui utilizados. 0 termo "anticorpo" descreve uma imunoglobulina quer seja natural ou produzida parcial ou totalmente por via sintética. 0 termo também abrange qualquer polipéptido ou proteína possuindo um domínio de ligação que é, ou é homólogo a, um domínio de ligação de anticorpo. Os anticorpos enxertados com CDR são também considerados para este termo.
Uma vez que os anticorpos podem ser modificados de várias maneiras, o termo "anticorpo" deve ser interpretado como abrangendo qualquer membro ou substância de ligação específica possuindo um domínio de ligação com a especificidade necessária. Assim, este termo abrange fragmentos de anticorpos, derivados, equivalentes funcionais e homólogos de anticorpos, incluindo qualquer polipéptido que compreende um domínio de ligação de imunoglobulina, quer seja natural, ou total ou parcialmente sintético. Por conseguinte, estão incluídas moléculas quiméricas compreendendo um domínio de ligação de imunoglobulina, ou equivalente, fundido com outro polipéptido. A clonagem e expressão de anticorpos quiméricos são descritas nos documentos EP-A-0120694 e EP-A-0125023 e Patente U.S. N° 4816397 e 4816567.
Foi demonstrado que os fragmentos de um anticorpo inteiro podem realizar a função de ligação de antigénios. Os exemplos de fragmentos de ligação são (i) o fragmento Fab que consiste dos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) o fragmento Fd que consiste dos domínios VH e CHI; (iii) o fragmento Fv que consiste dos domínios VL e VH de um único anticorpo; (iv) o fragmento dAb (Ward, E.S. et al. (1989) Nature 341,544-546) que consiste de um domínio VH; (v) regiões CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados (vii) moléculas Fv de cadeia simples (scFv) , em que um domínio VH e um domínio VL estão ligados por uma unidade de ligação peptídica que permite que os dois domínios se associem para formar um sítio de ligação de antigénio (Bird et al. (1988)
Science. 242,423-426; Huston et al. (1988) PNAS USA. 85,5879-5883); (viii) fragmentos de anticorpos multivalentes (dímeros, trímeros e/ou tetrâmeros de scFv (Power e Hudson (2000) J. Immunol. Methods 242, 193-204) (ix) dímeros biespecíficos de Fv de cadeia simples (PCT/US92/09965) e (x) "diacorpos", fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão de genes (documento WO94/13804; P. Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90,6444-6448).
Um "sítio de combinação de anticorpo" é aquela porção estrutural de uma molécula de anticorpo constituída pelas regiões variáveis e hipervariáveis da cadeia leve ou cadeia pesada e leve que ligam especificamente o antigénio. A frase "molécula de anticorpo" nas suas várias formas gramaticais, como aqui utilizada, considera uma molécula de imunoglobulina intacta e uma porção imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina.
As moléculas de anticorpo ilustrativas são moléculas de imunoglobulina intactas, moléculas de imunoglobulina substancialmente intactas e aquelas porções de uma molécula de imunoglobulina que contêm o paratopo, incluindo aquelas porções conhecidas na técnica como Fab, Fab', F(ab')Z e F(v), porções essas que são preferidas para utilização nos métodos terapêuticos aqui descritos.
Os anticorpos podem ser também biespecíficos, em que um domínio de ligação do anticorpo é um membro de ligação específica da invenção, e o outro domínio de ligação tem uma especificidade diferente, e. g. , recrutar uma função efetora ou semelhante. Os anticorpos biespecíficos da presente invenção incluem aqueles em que um domínio de liqação do anticorpo é um membro de ligação específica da presente invenção, incluindo um seu fragmento, e o outro domínio de ligação é um anticorpo distinto ou seu fragmento, incluindo aquele de um anticorpo anti-EGFR distinto, por exemplo anticorpo 528 (Patente U.S. N° 4943533), o anticorpo 225 quimérico e humanizado (Patente U.S. N° 4943533 e WO/9640210), um anticorpo anti-des2-7 tal como DH8.3 (Hills, D. et al. (1995) Int. J. Cancer. 63(4), 537-543), anticorpo L8A4 e Y10 (Reist, CJ et al. (1995) Cancer Res. 55 (19):4375-4382; Foulon CF et al. (2000) Cancer Res. 60 (16):44534460), ICR62 (Modjtahedi H et al. (1993) Cell Biophys. Jan-Jun; 22 (1-3) :129-46; Modjtahedi et al. (2002) P. A. A. C. R. 55(14) :3140-3148, ou o anticorpo de Wikstrand et al. (Wikstrand C. et al. (1995) Cancer Res. 55(14):3140-3148). Ο outro domínio de ligação pode ser um anticorpo que reconhece ou visa um tipo de célula particular, como um anticorpo específico para células nervosas ou gliais. Nos anticorpos biespecíficos da presente invenção o domínio de ligação do anticorpo da invenção pode ser combinado com outros domínios ou moléculas de ligação que reconhecem recetores celulares particulares e/ou modulam células de uma maneira particular, como, por exemplo, um modulador imunológico (e. g., interleucina (s)), um modulador de crescimento ou citocina (e. g. , fator de necrose tumoral (TNF), e, particularmente, a modalidade biespecífica de TNF demonstrada no documento U.S.S.N. 60/355838 apresentado em 13 de Fevereiro de 2002) ou uma toxina (e. g., ricina) ou agente ou fator antimitótico ou apoptótico.
As porções Fab e F(ab')2 das moléculas de anticorpo podem ser preparadas pela reação proteolítica de papaína e pepsina, respetivamente, sobre moléculas de anticorpo substancialmente intactas por métodos que são bem conhecidos. Ver, por exemplo, Patente U.S. N° 4342566 de Theofilopolous et al. As porções Fab' das moléculas de anticorpo são também bem conhecidas e são produzidas a partir de porções F(ab')2, seguida de redução das ligações dissulfureto que ligam as duas porções da cadeia pesada, tal como com mercaptoetanol, e seguida de alquilação do mercaptano da proteína resultante com um reagente tal como iodoacetamida. É aqui preferido um anticorpo contendo moléculas de anticorpo intacto. A frase "anticorpo monoclonal" nas suas várias formas gramaticais refere-se a um anticorpo que tem apenas uma espécie de sítio de combinação de anticorpo capaz de imunorreagir com um antigénio particular. Assim, um anticorpo monoclonal apresenta tipicamente uma afinidade de ligação simples para qualquer antigénio com o qual imunorreage. Um anticorpo monoclonal pode conter também uma molécula de anticorpo possuindo uma multiplicidade de sítios de combinação de anticorpos, cada um imunoespecífico para um antigénio diferente; e. g., um anticorpo monoclonal biespecífico (quimérico). A expressão "domínio de ligação ao antigénio" descreve a parte de um anticorpo que compreende a área que se liga especificamente e é complementar a parte ou totalidade de um antigénio. Quando um antigénio é grande, um anticorpo pode ligar-se apenas a uma parte particular do antigénio, parte essa que é denominada um epítopo. Um domínio de ligação ao antigénio pode ser proporcionado por um ou mais domínios variáveis de anticorpo. De um modo preferido, um domínio de ligação ao antigénio compreende uma região variável da cadeia leve do anticorpo (VL) e uma região variável da cadeia pesada do anticorpo (VH). "Modificação pós-traducional" pode abranger qualquer uma ou uma combinação de modificações, incluindo modificação covalente, que uma proteína sofre depois da tradução estar concluída e depois de ser libertada do ribossoma ou simultaneamente com a tradução no polipéptido nascente. A modificação pós-traducional inclui, mas não está limitada a fosforilação, miristilação, ubiquitinação, glicosilação, fixação de coenzima, metilação e acetilação. A modificação pós-traducional pode modular ou influenciar a atividade de uma proteína, o seu destino intracelular ou extracelular, a sua estabilidade ou semivida, e/ou o seu reconhecimento pelos ligandos, recetores ou outras proteínas. A modificação pós-traducional pode ocorrer em organitos celulares, no núcleo ou citoplasma ou extracelularmente. 0 termo "específica" pode ser utilizado para referir a situação em que um membro de um par de ligação específica não apresentará qualquer ligação significativa a moléculas diferentes do seu parceiro ou parceiros de ligação específica. 0 termo é também aplicável, e. g. , quando um domínio de ligação a antigénio é específico para um epítopo particular que é detido por um número de antigénios, em cujo caso o membro de ligação específica que tem o domínio de ligação ao antigénio será capaz de se ligar aos vários antigénios que têm o epítopo. 0 termo "compreendem" é geralmente utilizado no sentido de incluem, ou seja, permitem a presença de uma ou mais características ou componentes. A expressão "consistindo essencialmente de" refere-se a um produto, particularmente uma sequência peptidica, de um número definido de residuos que não está ligado covalentemente a um produto maior. No caso do péptido da invenção referido acima, os especialistas na técnica aperceber-se-ão que podem ser contudo consideradas modificações menores na extremidade N- ou C-terminal do péptido, tal como a modificação química da extremidade para adicionar um grupo de proteção ou semelhantes, e. g. , a amidação da extremidade C-terminal. 0 termo "isolado" refere-se ao estado em que se encontrarão os membros de ligação específica da invenção, ou ácidos nucleicos que codificam tais membros de ligação, de acordo com a presente invenção. Os membros e ácidos nucleicos estarão isentos ou substancialmente isentos de material com o qual estão naturalmente associados, tais como outros polipéptidos ou ácidos nucleicos com os quais estão presentes no seu ambiente natural, ou o ambiente no qual são preparados (e. g., cultura de células) quando essa preparação é por tecnologia de ADN recombinante praticada in vitro ou in vivo. Os membros e ácidos nucleicos podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e continuar, em termos práticos, a estar isolados, por exemplo, os membros serão normalmente misturados com gelatina ou outros veículos se forem utilizados para revestir placas de microtitulação a serem utilizadas em imunoensaios ou serão misturados com veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis quando utilizados em diagnóstico ou terapia. Os membros de ligação específica podem ser glicosilados, naturalmente ou por sistemas de células eucarióticas heterólogas, ou podem ser (por exemplo, se produzidos por expressão numa célula procariótica) não glicosilados.
De igual modo, como aqui utilizados, os termos "glicosilação" e "glicosilado" incluem e abrangem a modificação pós-traducional de proteínas, designadas glicoproteínas, por adição de oligossacáridos. Os oligossacáridos são adicionados em sítios de glicosilação das glicoproteínas, particularmente incluindo oligossacáridos ligados por N e oligossacáridos ligados por 0. Os oligossacáridos ligados por N são adicionados a um resíduo Asn, particularmente em que o resíduo Asn está na sequência N-X-S/T, em que X não pode ser Pro ou Asp, e são aqueles que se encontram com mais frequência em glicoproteínas. Na biossíntese de glicoproteínas ligadas por N, forma-se inicialmente um oligossacárido com alto teor de manose (geralmente constituído por dolicol, N-Acetilglucosamina, manose e glucose no retículo endoplasmático (ER). As glicoproteínas com alto teor de manose são em seguida transportadas do ER para o Golgi, onde ocorre processamento adicional e modificação dos oligossacáridos. São adicionados oligossacáridos ligados por 0 ao grupo hidroxilo dos resíduos de Ser ou Thr. Nos oligossacáridos ligados por 0, a N-Acetilglucosamina é primeiro transferida para o resíduo de Ser ou Thr pela N-Acetilglucosaminiltransferase no ER. A proteína desloca-se em seguida para o Golgi onde ocorre modificação adicional e alongamento da cadeia. As modificações ligadas por 0 podem ocorrer com a adição simples do monossacárido OGlcNAc sozinho naqueles sítios de Ser ou Thr que, em condições diferentes, podem ser também fosforilados em vez de glicosilados.
Como aqui utilizado, "pg" significa picograma, "ng" significa nanograma, "ug" ou "yg" significam micrograma, "mg" significa miligrama, "uL" ou "yL" significam microlitro, "mL" significa mililitro, "L" significa litro. A expressão "anticorpo 806" e os termos "mAb806", "ch806", e quaisquer variantes não especificamente listadas, podem ser aqui utilizados indistintamente, e como utilizados ao longo do presente pedido e reivindicações referem-se a material proteico incluindo proteínas simples ou múltiplas e estendem-se àquelas proteínas possuindo os dados da sequência de aminoácidos aqui descritos e apresentados na SEQ ID N°: 2 e SEQ ID N° : 4, e o anticorpo quimérico ch806 que é incorporado e faz parte das SEQ ID N°: 7 e 8, e o perfil de atividades aqui estabelecido e nas reivindicações. Por conseguinte, as proteínas que apresentam atividade substancialmente equivalente ou alterada são igualmente consideradas. Estas modificações podem ser deliberadas, por exemplo, tal como as modificações obtidas através de mutagénese específica de um lócus, ou podem ser acidentais, tais como aquelas obtidas através de mutações em hospedeiros que são produtores do complexo ou suas subunidades denominadas. Também, a expressão "anticorpo 806" e os termos "mAb806" e "ch806" destinam-se a incluir no seu âmbito proteínas aqui especificamente apresentadas bem como todos os análogos substancialmente homólogos e variações alélicas. A expressão "anticorpo 806 humanizado", o termo "hu806", e a expressão "anticorpo 806 recoberto" e quaisquer variantes não especificamente listadas, podem ser aqui indistintamente utilizadas, e como utilizados ao longo do presente pedido e reivindicações referem-se a material proteico incluindo proteínas simples ou múltiplas, e alargam-se àquelas proteínas que têm os dados da sequência de aminoácidos aqui descritos e apresentados na SEQ ID N°: 42 e SEQ ID N° : 47, e o perfil de atividades aqui estabelecido e nas reivindicações. Por conseguinte, as proteínas que apresentam atividade substancialmente equivalente ou alterada são igualmente consideradas. Estas modificações podem ser deliberadas, por exemplo, tais como as modificações obtidas através de mutagénese específica de um lócus, ou podem ser acidentais, tais como aquelas obtidas através de mutações em hospedeiros que são produtores do complexo ou suas subunidades denominadas. De igual modo, a expressão "anticorpo 806 humanizado", o termo "hu806" e a expressão "anticorpo 806 recoberto" destinam-se a incluir dentro do seu âmbito proteínas aqui especificamente especificadas bem como todos os análogos substancialmente homólogos e variações alélicas. A expressão "anticorpo 175" e o termo "mAbl75", e quaisquer variantes não especificamente listadas, podem ser aqui indistintamente utilizados, e como utilizados ao longo do presente pedido e reivindicações referem-se a material proteico incluindo proteínas simples ou múltiplas, e alargam-se àquelas proteínas possuindo os dados da sequência de aminoácidos aqui descritos e apresentados na SEQ ID N°: 129 e SEQ ID N°: 134, e o perfil de atividades aqui estabelecido e nas reivindicações. Por conseguinte, as proteínas que apresentam atividade substancialmente equivalente ou alterada são igualmente consideradas. Estas modificações podem ser deliberadas, por exemplo, tal como as modificações obtidas através de mutagénese específica de um lócus, ou podem ser acidentais, tais como aquelas obtidas através de mutações em hospedeiros que são produtores do complexo ou suas subunidades denominadas. De igual modo, a expressão "anticorpo 175" e o termo "mAbl75" destinam-se a incluir dentro do seu âmbito proteínas aqui especificamente apresentadas bem como todos os análogos substancialmente homólogos e variações alélicas. A expressão "anticorpo 124" e o termo "mAbl24", e quaisquer variantes não especificamente listadas, podem ser aqui indistintamente utilizados, e como utilizados ao longo do presente pedido e reivindicações referem-se a material proteico incluindo proteínas simples ou múltiplas, e alargam-se àquelas proteínas possuindo os dados da sequência de aminoácidos aqui descritos e apresentados na SEQ ID N° : 22 e SEQ ID N° : 27, e o perfil de atividades aqui estabelecido e nas reivindicações. Por conseguinte, as proteínas que apresentam atividade substancialmente equivalente ou alterada são igualmente consideradas. Estas modificações podem ser deliberadas, por exemplo, tal como modificações obtidas através de mutagénese específica de um lócus, ou podem ser acidentais, tais como aquelas obtidas através de mutações em hospedeiros que são produtores do complexo ou suas subunidades denominadas. Também, a expressão "anticorpo 124" e o termo "mAbl24" destinam-se a incluir dentro do seu âmbito proteínas aqui especificamente apresentadas bem como todos os análogos substancialmente homólogos e variações alélicas. A expressão "anticorpo 1133" e o termo "mAbll33", e quaisquer variantes não especificamente listadas, podem ser aqui indistintamente utilizados, e como utilizados ao longo do presente pedido e reivindicações referem-se a material proteico incluindo proteínas simples ou múltiplas, e estendem-se àquelas proteínas possuindo os dados da sequência de aminoácidos aqui descritos e apresentados na SEQ ID N° : 32 e SEQ ID N° : 37, e o perfil de atividades aqui estabelecido e nas reivindicações. Por conseguinte, as proteínas que apresentam atividade substancialmente equivalente ou alterada são igualmente consideradas. Estas modificações podem ser deliberadas, por exemplo, tal como modificações obtidas através de mutagénese específica de um lócus, ou podem ser acidentais, tais como aquelas obtidas através de mutações em hospedeiros que são produtores do complexo ou suas subunidades denominadas. Também, a expressão "anticorpo 11133" e o termo "mAbll33" destinam-se a incluir dentro do seu âmbito proteínas aqui especificamente apresentadas bem como todos os análogos substancialmente homólogos e variações alélicas.
Prefere-se que os resíduos de aminoácidos aqui descritos estejam na forma isomérica "L". No entanto, qualquer resíduo de L-aminoácido pode estar substituído por resíduos na forma isomérica "D", desde que a propriedade funcional desejada de ligação de imunoglobulina seja retida pelo polipéptido. NH2 refere-se ao grupo amino livre presente na extremidade amino de um polipéptido. COOH refere-se ao grupo carboxilo livre presente na extremidade carboxilo de um polipéptido. De forma condizente com a nomenclatura de polipéptidos convencional, J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969), as abreviaturas dos resíduos de aminoácidos são mostradas na seguinte tabela de Correspondência:
Tabela de Correspondência
Deve referir-se que todas as sequências de resíduos de aminoácidos são aqui representadas pelas fórmulas cuja orientação para a esquerda e direita é na direção convencional da extremidade amino para a extremidade carboxilo. Além disso, deve referir-se que um traço no início ou fim de uma sequência de resíduos de aminoácidos indica uma ligação peptídica para uma outra sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos. A Tabela acima é apresentada para correlacionar as notações de três letras e uma letra que possam aqui surgir alternativamente.
Um "replicão" é qualquer elemento genético (e. g., plasmídeo, cromossoma, vírus) que atua como uma unidade autónoma de replicação de ADN in vivo; i. e., capaz de replicação sob o seu próprio controlo.
Um "vetor" é um replicão, tais como plasmídeo, fago ou cosmídeo, ao qual se pode ligar outro segmento de ADN de forma a realizar a replicação do segmento ligado.
Uma "molécula de ADN" refere-se à forma polimérica de desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina ou citosina) na sua forma de cadeia simples ou hélice de cadeia dupla. Este termo refere-se apenas à estrutura primária e secundária da molécula, e não a limita a quaisquer formas terciárias particulares. Assim, este termo inclui ADN de cadeia dupla presente, inter alia, em moléculas de ADN linear (e. g., fragmentos de restrição), vírus, plasmídeos e cromossomas. Ao discutir a estrutura de moléculas de ADN de cadeia dupla particulares, as sequências podem ser aqui descritas de acordo com a convenção normal de se proporcionar apenas a sequência na direção de 5' para 3' ao longo da cadeia de ADN não transcrita (i. e., a cadeia que tem uma sequência homóloga ao ARNm).
Uma "origem de replicação" refere-se àquelas sequências de ADN que participam na síntese de ADN.
Uma "sequência codificante" de ADN é uma sequência de ADN de cadeia dupla que é transcrita e traduzida num polipéptido in vivo quando colocada sob o controlo das sequências reguladoras apropriadas. Os limites da sequência codificante são determinados por um codão de iniciação na extremidade 5' (amino) e um codão de paragem da tradução na extremidade 3' (carboxilo). Uma sequência codificante pode incluir, mas não está limitada a sequências procarióticas, ADNc de ARNm eucariótico, sequências de ADN genómico de ADN eucariótico (e. g., mamífero) e até mesmo sequências de ADN sintético. Um sinal de poliadenilação e sequência de terminação da transcrição estarão geralmente localizados 3' em relação à sequência codificante.
As sequências de controlo da transcrição e tradução são sequências reguladoras de ADN, tais como promotores, intensificadores, sinais de poliadenilação, sequências de terminação e semelhantes, que proporcionam a expressão de uma sequência codificante numa célula hospedeira.
Uma "sequência promotora" é uma região reguladora de ADN capaz de ligar ARN polimerase numa célula e iniciar a transcrição de uma sequência codificante a jusante (direção 3' ) . Para efeitos de definição da presente divulgação, a sequência promotora está ligada na sua extremidade 3' pelo sítio de início da transcrição e prolonga-se a montante (direção 5') para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição a níveis detetáveis acima do fundo. Na sequência promotora encontrar-se-á um sítio de início da transcrição (convenientemente definido pelo mapeamento com nuclease Sl), bem como domínios de ligação de proteínas (sequências consenso) responsáveis pela ligação de ARN polimerase. Os promotores eucarióticos conterão frequentemente, mas nem sempre, caixas "TATA" e caixas "CAT". Os promotores procarióticos contêm sequências Shine Dalgarno além das sequências consenso -10 e -35.
Uma "sequência de controlo da expressão" é uma sequência de ADN que controla e regula a transcrição e tradução de outra sequência de ADN. Uma sequência codificante está "sob o controlo" das sequências de controlo da transcrição e tradução numa célula quando a ARN polimerase transcreve a sequência codificante para ARNm, o qual é depois traduzido para a proteina codificada pela sequência codificante.
Uma "sequência sinal" pode ser incluída antes da sequência codificante. Esta sequência codifica um péptido sinal, N-terminal ao polipéptido, que comunica com a célula hospedeira para dirigir o polipéptido para a superfície celular ou segregar o polipéptido para o meio, e este péptido sinal é cortado pela célula hospedeira antes da proteína deixar a célula. As sequências sinal podem ser encontradas associadas a uma variedade de proteínas nativas aos procariotas e eucariotas. O termo "oligonucleótido", como aqui utilizado ao referir-se à sonda da presente divulgação, é definido como uma molécula constituída por dois ou mais ribonucleótidos, de um modo preferido, mais do que três. O seu tamanho exato dependerá de muitos fatores que, por sua vez, dependem da função e utilização finais do oligonucleótido. O termo "iniciador", como aqui utilizado refere-se a um oligonucleótido, quer ocorra naturalmente como num produto de digestão por restrição purificado ou produzido sinteticamente, o qual é capaz de atuar como um ponto de inicio de síntese quando colocado sob condições em que é induzida a síntese de um produto de extensão do iniciador, o qual é complementar a uma cadeia de ácido nucleico, i. e., na presença de nucleótidos e um agente de indução, tal como uma ADN polimerase e a uma temperatura e pH adequados. 0 iniciador pode ser de cadeia simples ou cadeia dupla e tem de ser suficientemente longo para iniciar a síntese do produto de extensão desejado na presença do agente de indução. 0 comprimento exato do iniciador dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, fonte de iniciador e utilização do método. Por exemplo, para aplicações em diagnóstico, dependendo da complexidade da sequência alvo, o iniciador oligonucleotídico contém tipicamente 15-25 ou mais nucleótidos, embora possa conter menos nucleótidos.
Os iniciadores são aqui selecionados para serem "substancialmente" complementares a diferentes cadeias de uma sequência de ADN alvo particular. Isto significa que os iniciadores têm de ser suficientemente complementares para hibridizar com as suas respetivas cadeias. Por conseguinte, a sequência iniciadora não tem de refletir a sequência exata da cadeia molde. Por exemplo, um fragmento de nucleótido não complementar pode ser ligado à extremidade 5' do iniciador, sendo o resto da sequência iniciadora complementar à cadeia. Alternativamente, bases não complementares ou sequências mais longas podem ser intercaladas no iniciador, na condição de que a sequência iniciadora possua complementaridade suficiente com a sequência da cadeia a hibridizar com a mesma e, desse modo, forme a cadeia molde para a síntese do produto de extensão.
Como aqui utilizados, as expressões "endonucleases de restrição" e "enzimas de restrição" referem-se a enzimas bacterianas, cada uma das quais corta o ADN de cadeia dupla sobre ou próximo de uma sequência de nucleótidos especifica.
Uma célula foi "transformada" pelo ADN exógeno ou heterólogo quando esse ADN foi introduzido dentro da célula. 0 ADN transformante pode, ou não, ser integrado (ligado covalentemente) no ADN cromossómico que constitui o genoma da célula. Nas células procariotas, de levedura e mamíferos, por exemplo, o ADN transformante pode ser mantido num elemento epissómico, tal como um plasmídeo. Em relação às células eucarióticas, uma célula transformada de forma estável é aquela em que o ADN transformante foi integrado num cromossoma pelo que é herdado pelas células-filha através de replicação do cromossoma. Esta estabilidade é demonstrada pela aptidão da célula eucariótica para estabelecer linhas de células ou clones constituídos por uma população de células-filha contendo o ADN transformante. Um "clone" é uma população de células derivadas de uma única célula ou antepassado comum por mitose. Uma "linha de células" é um clone de uma célula primária que é capaz de crescimento estável in vitro durante muitas gerações.
Duas sequências de ADN são "substancialmente homólogas" quando pelo menos cerca de 75% (de um modo preferido, pelo menos cerca de 80% e, de um modo muito preferido pelo menos cerca de 90 ou 95%) dos nucleótidos condizem ao longo do comprimento definido das sequências de ADN. As sequências que são substancialmente homólogas podem ser identificadas comparando as sequências utilizando software padrão disponível em bancos de dados da sequências, ou numa experiência de hibridação de
Southern, por exemplo, sob condições restringentes como definidas para esse sistema particular. A definição das condições de hibridação apropriadas está dentro do conhecimento da técnica. Ver, e. g. , Maniatis et ai., supra; ADN Cloning, Vols. I &amp; II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
Deve ser entendido que também no âmbito da presente divulgação encontram-se sequências de ADN que codificam membros de ligação específica (anticorpos) da invenção que codificam anticorpos possuindo as sequências divulgadas mas que são degeneradas em relação a essas sequências. Por "degenerada em relação a" entende-se que é utilizado um codão de três letras diferentes para especificar um aminoácido particular. É bem conhecido na técnica que os seguintes codões podem ser utilizados indistintamente para codificar cada aminoácido específico:
Fenilalanina (Phe ou F) UUU ou UUC
Leucina (Leu ou L) UUA ou UUG ou CUU ou CUC ou CUA ou CUG
Isoleucina (He ou I) AUU ou AUC ou AUA
Metionina (Met ou M) AUG
Valina (Vai ou V) GUU ou GUC of GUA ou GUG
Serina (Ser ou S) UCU ou UCC ou UCA ou UCG ou AGU ou AGC
Prolina (Pro ou P) CCU ou CCC ou CCA ou CCG
Treonina (Thr ou T) ACU ou ACC ou ACA ou ACG
Alanina (Ala ou A) GCU ou GCG ou GCA ou GCG
Tirosina (Tyr ou Y) UAU ou UAC
Histidina (His ou H) CAU ou CAC
Glutamina (Gin ou Q) CAA ou CAG
Asparagina (Asn ou N) AAU ou AAC
Lisina (Lys ou K) AAA ou AAG
Ácido Aspártico (Asp ou GAU ou GAC D)
Ácido Glutâmico (Glu ou GAA ou GAG E)
Cisteina (Cys ou C) UGU ou UGC
Arginina (Arg ou R) CGU ou CGC ou CGA ou CGG ou AGA ou AGG
Glicina (Gly ou G) GGU ou GGC ou GGA ou GGG
Triptofano (Trp ou W) UGG
Codão de terminação UAA (ocre) ou UAG (âmbar) ou UGA (opala)
Deve ser entendido que os codões especificados acima são para sequências de ARN. Os codões correspondentes para ADN têm um U substituído por T.
Podem ser feitas mutações, por exemplo, nas sequências de anticorpos divulgadas da presente invenção, de tal modo que um codão particular é mudado para um codão que codifica um aminoácido diferente. Uma tal mutação é geralmente feita efetuando o menor número possível de alterações de nucleótidos. Uma mutação de substituição deste tipo pode ser feita para mudar um aminoácido na proteína resultante de uma maneira não conservadora (i. e., mudando o codão de um aminoácido que pertence a um agrupamento de aminoácidos possuindo um tamanho ou característica particular para um aminoácido que pertence a outro agrupamento) ou de uma maneira conservadora (i. e., mudando o codão de um aminoácido que pertence a um agrupamento de aminoácidos que tem um tamanho ou característica particular para um aminoácido que pertence ao mesmo agrupamento) . Uma tal alteração conservadora conduz geralmente a uma menor alteração da estrutura e função da proteína resultante. Uma alteração não conservadora tem maior probabilidade de alterar a estrutura, atividade ou função da proteína resultante. A presente divulgação deve ser considerada como incluindo sequências contendo alterações conservadoras que não alteram significativamente a atividade ou características de ligação da proteína resultante. 0 que se segue é um exemplo de vários agrupamentos de aminoácidos:
Aminoácidos com grupos R apoiares
Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina, Prolina,
Fenilalanina, Triptofano, Metionina
Aminoácidos com grupos R polares não carregados
Glicina, Serina, Treonina, Cisteína, Tirosina, Asparagina,
Glutamina
Aminoácidos com grupos R polares carregados (negativamente carregados a pH 6,0) Ácido aspártico, Ácido glutâmico
Aminoácidos básicos (positivamente carregados a pH 6,0) Lisina, Arginina, Histidina (a pH 6,0)
Outro agrupamento podem ser aqueles aminoácidos com grupos fenilo: Fenilalanina, Triptofano, Tirosina
Outro agrupamento pode ser de acordo com o peso molecular (i. e., tamanho dos grupos R):
Glicina 75
Alanina 89
Serina 105
Prolina 115
Valina 117
Treonina 119
Cisteina 121
Leucina 131
Isoleucina 131
Asparagina 132 Ácido aspártico 133
Glutamina 146
Lisina 146 Ácido glutâmico 147
Metionina 149
Histidina (a pH 6,0) 155
Fenilalanina 165
Arginina 174
Tirosina 181
Triptofano 204
As substituições particularmente preferidas são: - Lys para Arg e vice-versa para que possa ser mantida uma carga positiva; - Glu para Asp e vice-versa para que possa ser mantida uma carga negativa; - Ser para Thr para que possa ser mantido um -OH livre; e - Gin para Asn para que possa ser mantido um NH2 livre.
Podem ser também introduzidas substituições de aminoácidos para substituir um aminoácido com uma propriedade particularmente preferida. Por exemplo, uma Cys pode ser introduzida num sitio potencial para pontes dissulfureto com outra Cys. Uma His pode ser introduzida como um sitio particularmente "catalítico" (i. e., His pode atuar como um ácido ou base e é o aminoácido mais comum em catálise bioquímica). A Pro pode ser introduzida devido à estrutura particularmente planar que induz. (3 voltas na estrutura da proteína.
Duas sequências de aminoácidos são "substancialmente homólogas" quando pelo menos cerca de 70% dos resíduos de aminoácidos (de um modo preferido, pelo menos, cerca de 80%, e de um modo muito preferido, pelo menos, cerca de 90 ou 95%) são idênticos, ou representam substituições conservadoras.
Uma região "heteróloga" da construção de ADN é um segmento identificável de ADN dentro de uma molécula de ADN maior que não se encontra associada com a molécula maior na natureza. Assim, quando a região heteróloga codifica um gene de mamífero, o gene estará geralmente flanqueado por ADN que não flanqueia o ADN genómico do mamífero no genoma do organismo fonte. Outro exemplo de uma sequência codificante heteróloga é uma construção em que a própria sequência codificante não se encontra na natureza (e. g., um ADNc em que a sequência codificante genómica contém intrões, ou sequências sintéticas possuindo codões diferentes do gene nativo). As variações alélicas ou eventos de mutação natural não dão origem a uma região de ADN heteróloga como aqui definida. A frase "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades e composições moleculares que são fisiologicamente toleráveis e tipicamente não produzem uma reação alérgica ou inconveniente semelhante, tais como distúrbio gástrico, tonturas e semelhantes, quando administrada a um humano. A frase "quantidade terapeuticamente eficaz" é aqui utilizada para significar uma quantidade suficiente para prevenir e, de um modo preferido, reduzir em pelo menos cerca de 30 por cento, de um modo preferido, em pelo menos 50 por cento, de um modo preferido, em pelo menos 70 por cento, de um modo preferido, em pelo menos 80 por cento, de um modo preferido, em pelo menos 90%, uma alteração clinicamente significativa no crescimento ou progressão ou atividade mitótica de uma massa celular alvo, grupo de células cancerígenas ou tumor, ou outra característica da patologia. Por exemplo, o grau de ativação ou atividade de EGFR ou a quantidade ou número de células positivas para EGFR, particularmente de anticorpo ou membro de ligação reativo ou células positivas pode ser reduzido.
Uma sequência de ADN está "operacionalmente ligada" a uma sequência de controlo da expressão quando a sequência de controlo da expressão controla e regula a transcrição e tradução dessa sequência de ADN. A expressão "operacionalmente ligada" inclui ter um sinal de início apropriado (e. g., ATG) antes da sequência de ADN a ser expressa e manter a grelha de leitura correta para permitir a expressão da sequência de ADN sob o controlo da sequência de controlo da expressão e produção do produto desejado codificado pela sequência de ADN. Se um gene que se deseja inserir numa molécula de ADN recombinante não contém um sinal de início apropriado, um tal sinal de início pode ser inserido na frente do gene. A expressão "condições de hibridação convencionais" refere-se a condições de sal e temperatura substancialmente equivalentes a 5 x SSC e 65 °C, durante a hibridação e lavagem. No entanto, um especialista na técnica aperceber-se-á que tais "condições de hibridação convencionais" são dependentes das condições particulares incluindo a concentração de sódio e magnésio no tampão, comprimento e concentração da sequência de nucleótidos, percentagem de desemparelhamento, percentagem de formamida e semelhantes. Também importante na determinação de "condições de hibridação convencionais" é se as duas sequências que hibridizam são ARN-ARN, ADN-ADN ou ARN-ADN. Tais condições de hibridação convencionais são facilmente determinadas por um especialista na técnica de acordo com fórmulas bem conhecidas, em que a hibridação é tipicamente 10-20 °C inferior à Tm prevista ou determinada com lavagens de maior restringência, se desej ado. A presente invenção proporciona um novo membro de ligação específica, i. e. um anticorpo ou seu fragmento, o qual reconhece um epítopo de EGFR que está presente em células tumorigénicas, hiperproliferativas ou anormais em que o epítopo é aumentado ou evidenciado após modificação pós-traducional aberrante e não é detetável em células normais ou de tipo selvagem. Numa forma de realização particular, mas não limitativa, o membro de ligação, i. e.f o anticorpo, reconhece um epítopo de EGFR que é aumentado ou evidenciado após modificação simples de hidrato de carbono ou glicosilação precoce e é reduzido ou não evidente na presença de modificação complexa com hidratos de carbono ou glicosilação. 0 membro de ligação específica, i. e., o anticorpo ou seu fragmento, não se liga ou reconhece células normais ou de tipo selvagem contendo epítopo de EGFR normal ou de tipo selvagem na ausência de sobreexpressão e na presença de modificação pós-tradução do EGFR normal. A presente divulgação proporciona ainda novos anticorpos 806, 175, 124, 1133, ch806 e hu806 e seus fragmentos, incluindo fragmentos imunogénicos, os quais reconhecem um epítopo de EGFR, particularmente o péptido EGFR (287CGADSYEMEEDGVRKC302 (SEQ ID N° : 14)), o qual está exposto em células tumorigénicas, hiperproliferativas ou anormais em que o epítopo é aumentado, revelado ou evidenciado e não detetável em células normais ou de tipo selvagem. Num caso particular mas não limitativo, o anticorpo reconhece um epítopo de EGFR que é aumentado ou evidenciado após modificação simples de hidrato de carbono ou glicosilação precoce e é reduzido ou não evidente na presença de modificação complexa com hidratos de carbono ou glicosilação. O anticorpo ou seu fragmento não se liga nem reconhece células normais ou de tipo selvagem que contêm o epítopo de EGFR normal ou de tipo selvagem na ausência de sobreexpressão, amplificação, ou um evento tumorigénico.
Num caso particular da divulgação e como indicado acima, a actual requerente descobriu os novos anticorpos monoclonais 806, 175, 124, 1133, ch806, e hu806 que reconhecem especificamente o EGFR de tipo selvagem amplificado e o des2-7 EGFR, ligando-se, contudo, a um epítopo distinto do péptido de junção único da mutação des2-7 EGFR. Adicionalmente, enquanto os mAb806, mAbl75, mAbl24, mAbll33 e hu806 não reconhecem o EGFR normal, de tipo selvagem expresso na superfície celular das células de glioma, eles ligam-se ao domínio extracelular do EGFR imobilizado na superfície de placas de ELISA, indicando um epítopo conformacional com um aspeto polipéptido. É importante referir que os mAb806, mAbl75, mAbl24, mAbll33, ch806 e hu806 não se ligam significativamente a tecidos normais tais como fígado e pele, os quais expressam níveis de tsEGFR endógeno que são superiores à maioria de outros tecidos normais, mas em que o EGFR não está sobreexpresso ou amplificado. Assim, os mAb806, mAbl75, mAbl24, mAbll33 e hu806 demonstram especificidade nova e útil, que reconhece o des2-7 EGFR e o EGFR amplificado, enquanto não reconhecem o EGFR normal, de tipo selvagem ou o péptido de junção único que é característico de des2-7 FGER. Num caso preferido, os mAb806, mAbl75, mAbl24, mAbll33 e hu806 da presente divulgação compreendem as sequências de aminoácidos do domínio CDR das cadeias VH e VL representadas nas FIG. 14B e 15B; 74B e 75B; 51B e 51D; 52B e 52D; e 55A e 55B, respetivamente (SEQ ID N°: 2 e 4; 129 e 134; 22 e 27; 32 e 37; e 42 e 47, respetivamente; SEQ ID N°: 42 incluindo as sequências do péptido sinal da cadeia VH de hu806 e cadeia VH da SEQ ID N°: 163 e 164, respetivamente, e SEQ ID N° : 47 incluindo as sequências do péptido sinal da cadeia VL de hu806 e cadeia VL da SEQ ID N°: 165 e 166, respetivamente).
Noutro caso, a divulgação proporciona um anticorpo capaz de competir com o anticorpo 175, sob condições em que pelo menos 10% de um anticorpo possuindo as sequências das cadeias VH e VL do anticorpo 175 (SEQ ID N°: 129 e 134, respetivamente) é impedido de se ligar ao des2-7 EGFR por competição com um tal anticorpo num ensaio ELISA. Como estabelecido acima são aqui considerados os anticorpos anti-idiotipicos. A presente invenção refere-se a membros de ligação especifica, i. e., anticorpos ou seus fragmentos que reconhecem um epitopo de EGFR que está presente nas células que expressam EGFR amplificado ou que expressa o des2-7 EGFR e não é detetável nas células que expressam EGFR normal ou de tipo selvagem, particularmente na presença de modificação pós-traducional normal. É ainda assinalado e aqui demonstrado que uma observação ou caracteristica não limitativa adicional dos anticorpos da presente invenção é o reconhecimento do seu epitopo na presença de altos teores de grupos manose, o que é uma caracteristica da glicosilação precoce ou modificação de hidratos de carbono simples. Assim, a glicosilação alterada ou aberrante facilita a presença e/ou reconhecimento do epitopo de anticorpo ou compreende uma porção do epitopo de anticorpo. A glicosilação inclui e abrange a modificação pós-tradução de proteínas, designadas glicoproteínas, por adição de oligossacáridos. Os oligossacáridos são adicionados em sítios de glicosilação em glicoproteínas, particularmente incluindo oligossacáridos ligados por N e oligossacáridos ligados por 0. Os oligossacáridos ligados por N são adicionados a um resíduo Asn, particularmente em que o resíduo Asn está na sequência N-X-S/T, em que X não pode ser Pro ou Asp, e são aqueles mais comuns presentes em glicoproteínas. Na biossíntese de glicoproteínas ligadas por N, forma-se primeiro um oligossacárido com alto teor de manose (geralmente constituído por dolicol, N-Acetilglucosamina, manose e glucose no retículo endoplasmático (ER) . As glicoproteínas com alto teor de manose são, em seguida, transportadas do ER para o Golgi, onde ocorre normalmente o processamento e modificação adicional dos oligossacáridos. Os oligossacáridos ligados por 0 são adicionados ao grupo hidroxilo de resíduos de Ser ou Thr. Nos oligossacáridos ligados por 0, a N-Acetilglucosamina é primeiro transferida para o resíduo Ser ou Thr pela N-Acetilglucosaminiltransferase no ER. A proteína desloca-se em seguida para o Golgi onde ocorre modificação adicional e alongamento da cadeia.
Num caso particular da divulgação e como indicado acima, a presente requerente descobriu novos anticorpos monoclonais, aqui exemplificados pelos anticorpos designados mAb806 (e o seu ch806 quimérico), mAbl75, mAbl24, mAbll33 e hu806, os quais reconhecem especificamente o EGFR de tipo selvagem amplificado e o des2-7 EGFR, ligando-se, contudo, a um epítopo distinta do péptido de junção único da mutação des2-7 EGFR. Os anticorpos da presente divulgação reconhecem especificamente EGFR sobreexpressado, incluindo EGFR amplificado e EGFR mutante (exemplificado aqui pela mutação des2-7), particularmente após modificação pós-tradução aberrante. Adicionalmente, enquanto estes anticorpos não reconhecem o EGFR normal, de tipo selvagem expresso na superfície celular de células de glioma, estes ligam-se ao domínio extracelular do EGFR imobilizado na superfície de placas ELISA, o que indica um epítopo conformacional com um aspeto de polipéptido. É importante dizer que, estes anticorpos não se ligam significativamente a tecidos normais, tais como fígado e pele, os quais expressam níveis de tsEGFR endógeno que são superiores à maioria de outros tecidos normais, mas em que o EGFR não é sobreexpressado ou amplificado. Assim, estes anticorpos demonstram uma especificidade nova e útil, que reconhece o des2-7 EGFR e EGFR amplificado, enquanto não reconhece o EGFR normal, de tipo selvagem ou o péptido de junção único que é caracteristico de des2-7 EGFR.
Num caso preferido, os anticorpos são aqueles que têm as caracteristicas dos anticorpos que a requerente identificou e caracterizou, em particular que reconhecem EGFR amplificado e des2-7 EGFR. Em casos particularmente preferidos, os anticorpos são mAb806, mAbl75, mAbl24, mAbll33 e hu806 ou seus fragmentos ativos. Num caso mais preferido, o anticorpo da presente divulgação compreende as sequências de aminoácidos das cadeias VH e VL representadas nas FIG.16 e 17; 74B e 75B; 51B e 51D; 52B e 52D; e 55A e 55B, respetivamente.
De um modo preferido, o epítopo do membro de ligação especifica, i. e. anticorpo está localizado dentro da região que compreende os resíduos 273-501 da sequência de EGFR normal ou de tipo selvagem madura e, de um modo preferido, o epítopo compreende os resíduos 287-302 da sequência de EGFR normal ou tipo selvagem madura (SEQ ID N°: 14). Por conseguinte, são também proporcionadas proteínas de ligação específica, í. e., anticorpos, os quais se ligam ao des2-7 EGFR num epítopo localizado dentro da região que compreende os resíduos 273-501 da sequência de EGFR, e que compreende os resíduos 287-302 da sequência de EGFR (SEQ ID N° : 14) . O epítopo pode ser determinado por quaisquer técnicas de mapeamento de epítopos convencionais conhecidas do especialista na técnica.
Alternativamente, as sequências de ADN que codificam os resíduos 273-501 e 287-302 (SEQ ID N° : 14) poderiam ser digeridas e os fragmentos resultantes expressos num hospedeiro adequado. 0 anticorpo ligação poderia ser determinado como mencionado acima.
Em particular, o membro ligar-se-á a um epítopo que compreende os resíduos 273-501 e mais especificamente compreende os resíduos 287-302 (SEQ ID N° : 14), do EGFR normal ou de tipo selvagem maduro. No entanto, outros anticorpos que mostram o mesmo ou um padrão de reatividade substancialmente semelhante também constituem um caso da divulgação. Isto pode ser determinado comparando tais membros com um anticorpo compreendendo os domínios das cadeias VH e VL mostrados nas SEQ ID N°: 2 e 4; 129 e 134; 22 e 27; 32 e 37; e 42 e 47, respetivamente. A comparação será tipicamente feita utilizando uma transferência de Western na qual os membros de ligação são ligados a transferências duplicadas preparadas a partir de uma preparação nuclear de células para que o padrão de ligação possa ser diretamente comparado.
Noutro caso, a divulgação proporciona um anticorpo capaz de competir com o mAb806 sob condições em que pelo menos 10% de um anticorpo possuindo as sequências das cadeias VH e VL de um desses anticorpos é bloqueado de ligar-se ao des2-7 EGFR por competição com um tal anticorpo num ensaio ELISA. Como estabelecido acima, os anticorpos anti-idiotípicos são considerados e são aqui ilustrados.
Noutro caso, a divulgação proporciona um anticorpo capaz de competir com o mAbl75, mAbl24 e/ou mAbll33 sob condições em que, pelo menos, 10% de um anticorpo possuindo as sequências das cadeias VH e VL de um desses anticorpos é bloqueado de ligar-se ao des2-7 EGFR por competição com um tal anticorpo num ensaio ELISA. Como estabelecido acima, os anticorpos anti-idiotípicos são considerados e são aqui ilustrados.
Noutro caso, a divulgação proporciona um anticorpo capaz de competir com o mAb806, mAbl75, mAbl24, mAb 1133 e/ou hu806, sob condições em que pelo menos 10% de um anticorpo possuindo as sequências das cadeias VH e VL de um desses anticorpos é bloqueado de ligar-se ao des2-7 EGFR por competição com um tal anticorpo num ensaio ELISA. Como estabelecido acima, os anticorpos anti-idiotípicos são considerados e são aqui ilustrados.
Um polipéptido isolado que consiste essencialmente do epítopo compreendendo os resíduos 273-501 e mais especificamente compreendendo os resíduos 287-302 (SEQ ID N°: 14) do EGFR de tipo selvagem maduro constitui outro caso da presente divulgação. O péptido da divulgação é particularmente útil em ensaios de diagnóstico ou kits e terapeuticamente ou profilacticamente, incluindo como uma vacina antitumoral ou anticancerígena. Assim, as composições do péptido da presente divulgação incluem composição farmacêutica e composições imunogénicas.
Utilizações em Diagnóstico e Terapia A especificidade única dos membros de ligação específica, í. e., anticorpos ou seus fragmentos, da presente invenção, de acordo com a qual o(s) membro (s) de ligação reconhecem um epítopo de EGFR que está presente em células tumorigénicas, hiperproliferativas ou anormais e não é detetável em células normais ou de tipo selvagem e em que o epitopo é aumentado ou evidenciado após modificação pós-tradução aberrante e em que o(s) membro(s) ligam-se ao des2-7 EGFR e EGFR amplificado mas não ao tsEGFR, proporciona utilizações em diagnóstico e terapia para identificar, caracterizar, visar e tratar, reduzir ou eliminar um número de tipos de células tumorigénicas e tipos de tumores, por exemplo, tumores da cabeça e pescoço, mama, pulmão, bexiga ou próstata e glioma, sem os problemas associados à captação pelo tecido normal que pode ser observada com os anticorpos contra o EGFR anteriormente conhecidos. Assim, as células que sobreexpressam EGFR (e. g,. por amplificação ou expressão de um mutante ou variante EGFR), em particular, aquelas que demonstra modificação pós-tradução aberrante podem ser reconhecidas, isoladas, caracterizadas, visadas e tratadas ou eliminadas utilizando o(s) membro(s) de ligação, i. e., anticorpo(s) ou seus fragmentos da presente invenção.
Num outro aspeto da divulgação, é proporcionado um método de tratamento de um tumor, um estado cancerígeno, um estado pré-cancerígeno, e qualquer estado relacionado ou resultante do crescimento hiperproliferativo de células compreendendo a administração de mAb806, mAbl75, mAbl24, mAbll33 e/ou hu806.
Os anticorpos da presente invenção podem, desse modo, classificar especificamente a natureza das células tumorais ou tumorigénicas de EGFR, revelando ou reconhecendo de outro modo aqueles tumores ou células em que está presente a sobreexpressão de EGFR, em particular, a amplificação e/ou mutação de EGFR, particularmente des2-7 EGFR. Além disso, os anticorpos da presente invenção demonstram atividade antitumoral in vivo significativa contra tumores que contêm EGFR amplificado e contra xenoenxertos positivos para des2-7 EGFR.
Como delineado acima, a requerente determinou que o membro de ligação especifica da invenção reconhece formas associadas a tumores do EGFR (des2-7 EGFR e EGFR amplificado) mas não o recetor de tipo selvagem, normal quando expresso em células normais. Pensa-se que o reconhecimento pelo anticorpo é dependente de uma modificação pós-tradução aberrante (e. g., uma variante de glicosilação, acetilação ou fosforilação única) do EGFR expresso nas células que apresentam sobreexpressão do gene de EGFR.
Como descrito abaixo, os anticorpos da presente invenção foram utilizados em estudos terapêuticos e demonstrou-se que inibem o crescimento de xenoenxertos que sobreexpressam (e. g. amplificam) EGFR e xenoenxertos que expressam des2-7 EGFR humano de tumores humanos e induzem necrose significativa dentro desses tumores.
Além do mais, os anticorpos da presente invenção inibem o crescimento de tumores intracranianos num modelo preventivo. Este modelo envolve a injeção de células de gliomas que expressam des2-7 EGFR em ratinhos nude e a injeção em seguida do anticorpo por via intracraniana no mesmo dia ou dentro de 1 a 3 dias, opcionalmente com doses repetidas. As doses de anticorpo são de modo adequado de cerca de 10 yg. Os ratinhos injetados com anticorpo são comparados com controlos, e verificou-se que a sobrevivência dos ratinhos tratados é significativamente aumentada.
Por conseguinte, num outro caso da divulgação, é proporcionado um método de tratamento de um tumor, um estado cancerígeno, um estado pré-cancerígeno e qualquer estado relacionado ou resultante do crescimento hiperproliferativo de células compreendendo a administração de um membro de ligação específica da invenção.
Os anticorpos da presente invenção são concebidos para serem utilizados em métodos de diagnóstico e tratamento de tumores em indivíduos humanos ou animais, particularmente tumores epiteliais. Estes tumores podem ser tumores sólidos primários ou secundários de qualquer tipo incluindo, mas não estando limitados a glioma, tumores da mama, pulmão, próstata, cabeça ou pescoço.
Membro de Ligação e Produção de Anticorpos A metodologia geral de preparação de anticorpos monoclonais por hibridomas é bem conhecida. As linhas de células produtoras de anticorpos, imortais podem ser também produzidas por técnicas diferentes da fusão, tais como transformação direta de linfócitos B com ADN oncogénico ou transfeção com vírus Epstein-Barr. Ver, e. g. , M. Schreier et al., "Hybridoma Techniques" (1980); Hammering et al., "Monoclonal Antibodies And T cell Hybridomas" (1981); Kennett et al. , "Monoclonal Antibodies" (1980); ver também Patentes U.S. N° 4341761; 4399121; 4427783; 4444887; 4451570; 4466917; 4472500; 4491632; e 4493890.
Os painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra EFGR podem ser pesquisados em relação a várias propriedades; i. e., isotipo, epitopo, afinidade, etc. De interesse particular são os anticorpos monoclonais que imitam a atividade de EFGR ou suas subunidades. Tais monoclonais podem ser facilmente identificados em ensaios de atividade de membros de ligação especifica. Os anticorpos de alta afinidade são também úteis quando é possível a purificação por imunoafinidade do membro de ligação específica nativo ou recombinante.
Os métodos de produção de anticorpos anti-EFGR policlonais são bem conhecidos na técnica. Ver Patente U.S. N° 4493795 de Nestor et al. Um anticorpo monoclonal, contendo tipicamente porções Fab e/ou F(ab')2 de moléculas de anticorpo úteis, pode ser preparado utilizando a tecnologia de hibridoma descrita em Antibodies-A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque (1988). Resumidamente, para preparar o hibridoma a partir do qual é produzida a composição de anticorpo monoclonal, uma linha de células de mieloma ou outra linha de células autoperpetuadora é fundida com linfócitos obtidos do baço de um mamífero hiperimunizado com um EGFR apropriado.
Os esplenócitos são tipicamente fundidos com células de mieloma utilizando polietilenoglicol (PEG) 6000. Os híbridos fundidos são selecionados quanto à sua sensibilidade ao HAT. Os hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal útil na prática desta invenção são identificados quanto à sua aptidão para imunorreagir com o presente anticorpo ou membro de ligação e quanto à sua aptidão para inibir hiperatividade tumorigénica ou proliferativa especificada em células alvo.
Um anticorpo monoclonal útil na prática da presente invenção pode ser produzido iniciando uma cultura de hibridoma monoclonal compreendendo um meio nutriente que contém um hibridoma que segrega moléculas de anticorpo da especificidade de antigénio apropriada. A cultura é mantida sob condições e durante um intervalo de tempo suficiente para o hibridoma segregar as moléculas de anticorpo para o meio. 0 meio contendo anticorpo é, em seguida, recolhido. As moléculas de anticorpo podem ser, em seguida, adicionalmente isoladas por técnicas bem conhecidas.
Os meios úteis para a preparação destas composições são ambos bem conhecidos na técnica e comercialmente disponíveis e incluem meios de cultura sintéticos, ratinhos consanguíneos e semelhantes. Um meio sintético ilustrativo é o meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM; Dulbecco et al.f Virol. 8:396 (1959)) suplementado com 4,5 g/L de glucose, glutamina 20 mm e 20% de soro fetal de vitelo. Uma estirpe de ratinho consanguíneo ilustrativa é o Balb/c.
Os métodos de produção de anticorpos monoclonais anti-EGFR são também bem conhecidos na técnica. Ver Niman et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:4949-4953 (1983). Tipicamente, o EGFR ou um análogo de péptidos é utilizado sozinho ou conjugado com um veículo imunogénico, como o imunogénio no procedimento anteriormente descrito para produzir anticorpos monoclonais anti-EGFR. Os hibridomas são pesquisados quanto à aptidão para produzir um anticorpo que imunorreage com o EGFR presente em células tumorigénicas, anormais ou hiperproliferativas. Outros anticorpos anti-EGFR incluem mas não estão limitados ao anticorpo HuMAX-EGFr de Genmab/Medarex, o anticorpo 108 (ATCC HB9764) e Patente U.S. N° 6217866, e anticorpo 14E1 da Schering AG (Patente U.S. N° 5942602).
Membros de Ligação Recombinantes, Quiméricos, Biespecificos e Fragmentos
Em geral, as regiões CDRl, compreendendo sequências de aminoácidos substancialmente como apresentadas como as regiões CDRl da SEQ ID N° : 2 e 4; 129 e 134; 22 e 27; 32 e 37; e 42 e 47, respetivamente, serão transportadas numa estrutura que permite a ligação das regiões CDRl a um antigénio tumoral. No caso da região CDRl da SEQ ID N°: 4, por exemplo, isto é de um modo preferido, realizado pela região da cadeia VL de SEQ ID N° : 4 (e de modo semelhante para as outras sequências especificadas).
Em geral, as regiões CDR2, compreendendo sequências de aminoácidos substancialmente como apresentadas como regiões CDR2 da SEQ ID N°: 2 e 4; 129 e 134; 22 e 27; 32 e 37; e 42 e 47, respetivamente, serão transportadas numa estrutura que permite a ligação das regiões CDR2 a um antigénio tumoral. No caso da região CDR2 da SEQ ID N°: 4, por exemplo, isto é de um modo preferido, realizado pela região da cadeia VL da SEQ ID N°: 4 (e de modo semelhante para as outras sequências especificadas).
Em geral, as regiões CDR3, compreendendo sequências de aminoácidos substancialmente como apresentadas como regiões CDR3 da SEQ ID N°: 2 e 4; 129 e 134; 22 e 27; 32 e 37; e 42 e 47, respetivamente, serão transportadas numa estrutura que permite a ligação das regiões CDR3 a um antigénio tumoral. No caso da região CDR3 da SEQ ID N° : 4, por exemplo, isto é, de um modo preferido, realizado pela região da cadeia VL da SEQ ID N°: 4 (e de modo semelhante para as outras sequências especificadas).
Por "substancialmente como apresentadas" entende-se que essas regiões CDR, por exemplo regiões CDR3, da divulgação serão idênticas ou altamente homólogas às regiões especificadas da SEQ ID N°: 2 e 4; 129 e 134; 22 e 27; 32 e 37; e 42 e 47, respetivamente. Por "altamente homóloga" considera-se que podem ser feitas apenas algumas substituições, de um modo preferido desde 1 a 8, de um modo preferido, desde 1 a 5, de um modo preferido, desde 1 a 4 ou desde 1 a 3 ou 1 ou 2 substituições em uma ou mais das CDR. Considera-se também que tais termos incluem truncamentos às CDR, desde que o anticorpo resultante exiba as propriedades únicas da classe de anticorpos aqui discutidas, como apresentadas pelos mAb806, mAbl75, mAbl24, mAbll33 e hu806. A estrutura para transportar as CDR da divulgação, em particular CDR3, será geralmente a sequência da cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou porção substancial desta, na qual as regiões CDR são localizadas em localizações correspondentes à região CDR dos domínios variáveis das cadeias VH e VL do anticorpo natural codificados por genes da imunoglobulina rearranjados. As estruturas e localizações dos domínios variáveis de imunoglobulina podem ser determinadas por referência a Rabat, E. A. Et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4a Edição. US Department of Health and Human Services., 1987, e as suas actualizações, presentemente disponível na Internet (http://immuno.bme.nwu.edu)). Além do mais, como é conhecido dos especialistas na técnica, as determinações da CDR podem ser feitas de vários modos. Por exemplo, pode utilizar-se análises de Rabat, Chotia e de determinação de domínio combinado. A este respeito, ver por exemplo http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid.
As sequências de aminoácidos substancialmente como apresentadas como resíduos de CDR da cadeia VH nos anticorpos da invenção estão num domínio variável da cadeia pesada humana ou uma porção substancial da mesma, e as sequências de aminoácidos substancialmente como apresentadas como resíduos de CDR da cadeia VL nos anticorpos da invenção estão num domínio variável da cadeia leve humana ou uma sua porção substancial.
Os domínios variáveis podem ser provenientes de qualquer linha germinal ou domínio variável humano rearranjado, ou podem ser um domínio variável sintético com base em sequências consenso de domínios variáveis humanos conhecidos. As sequências derivadas de CDR3 da divulgação, por exemplo, como definidas no parágrafo anterior, podem ser introduzidas num reportório de domínios variáveis que carecem das regiões CDR3, utilizando tecnologia de ADN recombinante.
Por exemplo, Marks et al. (Bio/Technology, 1992,10:779-783) descreve métodos de produção de reportórios de domínios variáveis de anticorpo em que iniciadores consenso dirigidos para ou adjacentes à extremidade 5 da área do domínio variável são utilizados em conjunto com iniciadores consenso para a terceira região estrutural dos genes da VH humana para proporcionar um reportório de domínios variáveis VH que carecem de uma CDR3. Marks et al. descrevem ainda como este reportório pode ser combinado com uma CDR3 de um anticorpo particular.
Utilizando técnicas análogas, as sequências derivadas de CDR3 da presente divulgação podem ser misturadas de forma aleatória com reportórios de domínios VH ou VL que carecem de uma CDR3, e os domínios VH ou VL completos misturados de forma aleatória combinados com um domínio VL ou VH cognato para proporcionar membros de ligação específica da divulgação. 0 reportório pode ser também apresentado num sistema hospedeiro adequado tal como o sistema de apresentação em fago da W092/01047 para que se possam selecionar os membros de ligação específica adequados. Um reportório pode consistir de qualquer número desde 104 membros individuais até, por exemplo, desde 106 a 108 ou 1010 membros. Técnicas de recombinação aleatória ou combinatórias análogas são também divulgadas por Stemmer (Nature, 1994,370:389-391), o qual descreve a técnica em relação a um gene de p-lactamase mas refere que a abordagem pode ser utilizada para a produção de anticorpos.
Uma outra alternativa consiste em produzir regiões VH ou VL novas que têm as sequências derivadas de CDR3 da divulgação utilizando mutagénese aleatória, por exemplo, dos genes da VH ou VL do mAb806 para produzir mutações dentro de todo o domínio variável. Uma tal técnica é descrita por Gram et ai. (1992, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 89:3576-3580) que utilizaram PCR propensa a erro.
Outro método que pode ser utilizado é dirigir a mutagénese para regiões CDR dos genes da VH ou VL. Tais técnicas são divulgadas por Barbas et ai. (1994, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 91:3809-3813) e Schier et ai. (1996, J. Mol. Biol. 263:551-567).
Todas as técnicas descritas acima são conhecidas na técnica e, por si só, não fazem parte da presente invenção. 0 especialista será capaz de utilizar tais técnicas para proporcionar membros de ligação especifica da invenção utilizando metodologia de rotina na técnica.
Uma porção substancial de um domínio variável de imunoglobulina compreenderá, pelo menos, as três regiões CDR, em conjunto com as suas regiões estruturais intercaladas. De um modo preferido, a porção incluirá também, pelo menos, cerca de 50% de qualquer uma ou de ambas da primeira e quarta regiões estruturais, sendo os 50% os 50% C-terminais da primeira região estrutural e os 50% N-terminais da quarta região estrutural. Os resíduos adicionais na extremidade N-terminal ou C-terminal da parte substancial do domínio variável podem ser aqueles não normalmente associados às regiões dos domínios variáveis naturais. Por exemplo, a construção de membros de ligação específica da presente invenção feita por técnicas de ADN recombinante pode resultar na introdução de resíduos N ou C-terminais codificados pelas unidades de ligação introduzidas para facilitar a clonagem ou outros passos de manipulação. Os outros passos de manipulação incluem a introdução de unidades de ligação para ligar domínios variáveis da invenção a outras sequências de proteínas incluindo cadeias pesadas de imunoglobulina, outro domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos) ou marcadores proteicos como discutidos em mais pormenor abaixo.
Embora num caso preferido da divulgação, sejam preferidos membros de ligação específica compreendendo um par de domínios de ligação com base em sequências substancialmente apresentadas nas SEQ ID N°: 2 e 4; 129 e 134; 22 e 27; 32 e 37; e 42 e 47, respetivamente, os domínios de ligação simples com base nestas sequências constituem outros casos da divulgação. No caso dos domínios de ligação com base na sequência substancialmente apresentada nas cadeias VH, tais domínios de ligação podem ser utilizados como agentes de direcionamento para antigénios tumorais, uma vez que se sabe que os domínios VH de imunoglobulina são capazes de ligar antigénios alvo de uma maneira específica.
No caso de quaisquer domínios de ligação específica da cadeia simples, estes domínios podem ser utilizados para pesquisar domínios complementares capazes de formar um membro de ligação específica de dois domínios que tem propriedades in vivo tão boas ou iguais aos anticorpos mAb806, ch806, mAbl75, mAbl24, mAbll33 e hu806 aqui divulgados.
Isto pode ser conseguido por métodos de triagem de apresentação em fagos que utilizam a chamada abordagem combinatória dupla hierárquica como divulgada na Patente U.S. 5969108, na qual uma colónia individual contendo um clone da cadeia H ou L é utilizada para infetar uma biblioteca completa de clones que codificam a outra cadeia (L ou H) e o membro de ligação específica de duas cadeias resultante é selecionado de acordo com técnicas de apresentação em fagos, tal como aquelas descritas nessa referência. Esta técnica é também divulgada em Marks et al., ibid.
Os membros de ligação específica da presente invenção podem compreender ainda regiões constantes de anticorpos ou partes das mesmas. Por exemplo, os membros de ligação específica com base nas sequências das cadeias VL podem ser ligados na sua extremidade C-terminal aos domínios constantes da cadeia leve de anticorpo incluindo as cadeias Ck ou CX humanas, de um modo preferido cadeias CX. De modo semelhante, os membros de ligação específica com base nas sequências das cadeias VH podem ser ligados na sua extremidade C-terminal à totalidade ou parte de uma cadeia pesada de imunoglobulina derivada de qualquer isotipo de anticorpo, e. g. , IgG, IgA, IgE, IgD e IgM e quaisquer das subclasses de isotipo, em particular IgGl, IgG2b e IgG4. A IgGl é preferida. 0 aparecimento da tecnologia de anticorpos monoclonais (mAb) há 25 anos proporcionou um reportório enorme de reagentes de investigação úteis e criou a oportunidade de utilizar anticorpos como reagentes farmacêuticos aprovados na terapia do cancro, distúrbios auto-imunes, rejeição de transplantes, profilaxia antiviral e como antitrombóticos (Glennie e Johnson, 2000) . A aplicação de manipulação molecular para converter mAbs murídeos em mAbs quiméricos (região V de ratinhos, região C humana) e reagentes humanizados em que apenas as regiões determinantes de complementaridade (CDR) do mAb são de origem murídea tem sido crítica para o sucesso clínico da terapia de mAb. Os mAbs manipulados têm reduzido ou eliminado a imunogenicidade, aumentado a semivida no soro e a porção Fc humana do mAb aumenta o potencial para recrutar os efetores imunológicos do complemento e células citotóxicas (Clark 2000). A investigação da biodistribuição, farmacocinética e qualquer indução de uma resposta imunológica aos mAbs clinicamente administrados requer o desenvolvimento de análises para discriminar entre as proteínas farmacêuticas e endógenas.
Os anticorpos, ou quaisquer fraqmentos dos mesmos, podem ser também conjugados ou fundidos de modo recombinante com qualquer toxina celular, bacteriana ou outra, e. g. exotoxina de pseudomonas, ricina ou toxina da difteria. A parte da toxina utilizada pode ser a totalidade da toxina, ou qualquer domínio particular da toxina. Tais moléculas anticorpo-toxina têm sido utilizadas com sucesso para visar e para a terapia de diferentes tipos de cancros, ver, e. g., Pastan, Biochim Biophys Acta. 1997 Oct 24; 1333 (2):Cl-6; Kreitman et al. , N. Engl. J. Med. 2001
Jul 26; 345 (4) :241-7; Schnell et al., Leukemia. 2000 Jan; 14 (1) :129-35; Ghetie et al., Mol. Biotechnol. 2001 Jul; 18 (3) :251-68.
Os multímeros bi- e triespecíficos podem ser preparados por associação de diferentes moléculas de scFv e têm sido concebidos como reagentes de reticulação para o recrutamento de células T para os tumores (imunoterapia) , redireccionamento virai (terapia genética) e como reagentes de aglutinação de glóbulos vermelhos (imunodiagnóstico), ver e. g. Todorovska et al., J. Immunol. Methods. 2001 Feb 1; 248 (1-2) :47-66; Tomlinson et al. , Methods
Enzymol. 2000; 326:461-79; McCall et al. , J. Immunol. 2001 May 15; 166 (10) :6112-7 .
Os anticorpos totalmente humanos podem ser preparados imunizando ratinhos transgénicos que têm grandes porções das cadeias pesada e leve da imunoglobulina humana. Estes ratinhos, exemplos de tais ratinhos são o Xenomouse™ (Abgenix, Inc.) (Patente U.S. N° 6075181 e 6150584), o HuMAb-Mouse™ (Medarex, Inc./GenPharm) (patente U.S. 5545806 e 5569825), o Ratinho TransChromo (Kirin) e o Ratinho KM (Medarex/Kirin), são bem conhecidos na técnica.
Os anticorpos podem ser em seguida preparados, e. g. pela técnica de hibridoma convencional ou por apresentação em fagos. Estes anticorpos conterão então apenas sequências de aminoácidos completamente humanas.
Os anticorpos totalmente humanos podem ser também produzidos utilizando apresentação em fagos a partir de bibliotecas humanas. A apresentação em fagos pode ser realizada utilizando métodos bem conhecidos do especialista, como em Hoogenboom et al. e Marks et al. (Hoogenboom HR e Winter G. (1992) J. Mol. Biol. 227 (2):381-8,- Marks JD et al. (1991) J. Mol. Biol. 222 (3):581-97; e também Patentes U.S. 5885793 e 5969108) .
Anticorpos Terapêuticos e Utilizações
As propriedades in vivo, particularmente no que diz respeito às razões tumor:sangue e taxa de eliminação, dos membros de ligação especifica da invenção serão pelo menos comparáveis às do mAb806. Após administração a um indivíduo humano ou animal um tal membro de ligação específica apresentará uma razão de tumor para sangue máxima > 1:1. De um modo preferido, a uma tal razão o membro de ligação específica terá também uma razão de tumor para órgão maior do que 1:1, de um modo preferido maior do que 2:1, de um modo mais preferido, maior do que 5:1. De um modo preferido, a uma tal razão o membro de ligação específica terá também uma razão de órgão para sangue de < 1:1 em órgãos afastados do sítio do tumor. Estas razões excluem os órgãos de catabolismo e secreção do membro de ligação específica administrado. Assim, no caso de scFvs e Fabs (como se mostra nos exemplos apensos), os membros de ligação são segregados através dos rins e há maior presença aqui do que noutros órgãos. No caso de IgGs completas, a eliminação será, pelo menos em parte, através do fígado. A razão de localização máxima do anticorpo intacto será normalmente conseguida entre 10 e 200 horas após administração do membro de ligação específica. Mais particularmente, a razão pode ser medida num xenoenxerto de tumor com cerca de 0,2-1,0 g formado por via subcutânea num flanco de um ratinho nude atímico.
Os anticorpos da invenção podem ser marcados com um marcador detetável ou funcional. Os marcadores detetáveis incluem, mas não estão limitados a marcadores radioativos, tais como os isótopos 3H, 14C, 32P, 35S, 36C1, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 121I, 124I, 125I, 131I, 211At, 198Au, 67CU, 225Ac, 213Bi, 99Tc e 186Re, os quais podem ser ligados aos anticorpos da invenção utilizando química convencional conhecida na técnica de visualização de anticorpos. Os marcadores incluem também marcadores fluorescentes e marcadores convencionalmente utilizados na técnica de imagiologia por MRI-CT. Aqueles incluem também marcadores enzimáticos tais como peroxidase de rábano-silvestre. Os marcadores incluem ainda unidades químicas tal como biotina que podem ser detetadas através da ligação a uma unidade detetável cognata específica, e. g. , avidina marcada.
Os marcadores funcionais incluem substâncias que são concebidas para serem dirigidas para o sítio de um tumor para originar a destruição de tecido tumoral. Tais marcadores funcionais incluem fármacos citotóxicos, tais como 5-fluorouracilo ou ricina e enzimas, tais como carboxipeptidase bacteriana ou nitro-redutase, as quais são capazes de converter profármacos em fármacos ativos no sitio de um tumor.
De igual modo, os anticorpos, incluindo anticorpos policlonais e monoclonais, e os fármacos que modulam a produção ou atividade dos membros de ligação especifica, anticorpos e/ou suas subunidades podem possuir determinadas aplicações em diagnóstico e, por exemplo, podem ser utilizados para detetar e/ou medir condições, tais como cancro, lesões pré-cancerígenas, estados relacionados ou resultantes de crescimento hiperproliferativo de células ou semelhantes. Por exemplo, os membros de ligação específica, anticorpos ou as suas subunidades podem ser utilizados para produzir anticorpos policlonais e monoclonais para os próprios numa variedade de meios celulares, por técnicas conhecidas tal como a técnica de hibridoma utilizando, por exemplo, linfócitos de baço de ratinho e células de mieloma fundidos. Do mesmo modo, moléculas pequenas que mimetizam ou antagonizam a(s) atividade(s) dos membros de ligação específica da invenção podem ser descobertas ou sintetizadas, e podem ser utilizadas em diagnóstico e/ou protocolos terapêuticos.
Os membros de ligação específica marcados radioativamente, i. e., anticorpos e seus fragmentos, são úteis em técnicas de diagnóstico in vitro e em técnicas de radioimagiologia in vivo e em radioimunoterapia. No caso de imagiologia in vivo, os membros de ligação específica da presente invenção podem ser conjugados com um agente de contraste em vez de um radioisótopo(s), incluindo mas não estando limitados a um agente de melhoria de imagem para ressonância magnética, em que, por exemplo, uma molécula de anticorpo é carregada com um grande número de iões paramagnéticos através de grupos quelantes. Os exemplos de grupos quelantes incluem EDTA, porfirinas, poliaminas, éteres de coroa e polioximas. Os exemplos de iões paramagnéticos incluem gadolínio, ferro, manganês, rénio, európio, lantânio, hólmio e érbio. Numa outra forma de realização da invenção, os membros de ligação específica marcados radioativamente, i. e., anticorpos e seus fragmentos, particularmente radioimunoconjugados, são úteis em radioimunoterapia, em particular, como anticorpos marcados radioativamente para terapia de cancro. Ainda numa outra forma de realização, os membros de ligação específica marcados radioativamente, í. e.r anticorpos e seus fragmentos, são úteis em técnicas de cirurgia orientadas por radioimunologia, em que podem identificar e indicar a presença e/ou localização de células cancerígenas, células pré-cancerígenas, células tumorais e células hiperproliferativa, antes, durante ou após cirurgia para a remoção de tais células.
Os imunoconjugados ou proteínas de fusão de anticorpos da presente invenção, em que os membros de ligação específica, i. e. anticorpos e seus fragmentos, da presente invenção são conjugados ou ligados a outras moléculas ou agentes incluem ainda, mas não estão limitados a membros de ligação conjugados com um agente de ablação química, toxina, imunomodulador, citocina, agente citotóxico, agente quimioterapêutico ou fármaco. A radioimunoterapia (RAIT) entrou em fase clínica e demonstrou eficácia utilizando vários imunoconjugados de anticorpos. 0 anticorpo anti-antigénio carcinoembrionário (anti-CEA) humanizado marcado com 131I hMN-14 foi avaliado no cancro colorrectal (Behr TM et al. (2002) Cancer 94 (4Suppl):1373-81) e o mesmo anticorpo com marcador 90Y foi avaliado no carcinoma medular da tireoide (Stein R et al. (2002)
Cancer 94 (1):51-61). A radioimunoterapia utilizando anticorpos monoclonais foi também avaliada e descrita para o linfoma não-Hodgkin e cancro pancreático (Goldenberg DM (2001) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39 (1-2) :195-201; Gold DV et al. (2001) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39 (1-2) 147-54). Métodos de radioimunoterapia com anticorpos particulares são também descritos nas Patentes U.S. N° 6306393 e 6331175. A cirurgia guiada por radioimunologia (RIGS) entrou também em fase clinica e demonstrou eficácia e utilidade, incluindo utilizando anticorpos anti-CEA e anticorpos dirigidos contra antigénios associados a tumores (Kim JC et al. (2002) Jut. J. Cancer 97(4):542-7,- Schneebaum, S. et al. (2001) World J. Surg. 25(12):14 95-8,- Avital, S. et al. (2000) Cancer 8 9(8):1692-8,-McIntosh DG et al. (1997) Cancer Biother. Radiopharm. 12 (4) :287-94) .
Os anticorpos da presente invenção podem ser administrados a um doente necessitado de tratamento através de qualquer via adequada, geralmente por injeção na corrente sanguínea ou CSF, ou diretamente no sítio do tumor. A dose exata dependerá de um número de fatores, incluindo se o anticorpo é para diagnóstico ou para tratamento, o tamanho e localização do tumor, a natureza exata do anticorpo (se é anticorpo inteiro, fragmento, diacorpo, etc) e a natureza do marcador detetável ou funcional ligado ao anticorpo. Quando se utiliza um radionuclídeo para terapia, uma dose única máxima adequada é cerca de 45 mCi/m2, até um máximo de cerca de 250 mCi/m2. A dosagem preferida situa-se na gama de 15 a 40 mCi, com uma gama de dosagem mais preferida de 20 a 30 mCi, ou 10 a 30 mCi. Tal terapia pode requerer substituição de medula óssea ou células estaminais. Uma dose de anticorpo típica para visualização de tumores ou tratamento de tumores situar-se-á na gama desde 0,5 a 40 mg, de um modo preferido, desde 1 a 4 mg de anticorpo na forma de F(ab')2. Os anticorpos nus são de um modo preferido, administrados em doses de 20 a 1000 mg de proteína por dose, ou 20 a 500 mg de proteína por dose, ou 20 a 100 mg de proteína por dose. Esta é uma dose para um único tratamento de um doente adulto, a qual pode ser proporcionalmente ajustada para crianças e bebés, e também ajustada para outros formatos de anticorpos em proporção ao peso molecular. Os tratamentos podem ser repetidos em intervalos diários, de duas vezes por semana, semanalmente ou mensalmente, pela prescrição do médico.
Estas formulações podem incluir uma segunda proteína de ligação, tal como as proteínas de ligação de EGPR descritas supra. Numa forma especialmente preferida, esta segunda proteína de ligação é um anticorpo monoclonal, tais como 528 ou 225, discutido infra.
Composições Farmacêuticas e Terapêuticas
Os membros de ligação específica da presente invenção serão geralmente administrados na forma de uma composição farmacêutica, a qual pode compreender pelo menos um componente além do membro de ligação específica.
Assim, as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, e para utilização de acordo com a presente invenção, podem compreender, além do ingrediente ativo, um excipiente, veículo, tampão, estabilizante ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos dos especialistas na técnica. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente ativo. A natureza exata do veículo ou outro material dependerá da via de administração, a qual pode ser oral ou por injeção, e. g. , intravenosa.
As composições farmacêuticas para administração oral podem estar na forma de comprimido, cápsula, pó ou líquido. Um comprimido pode compreender um veículo sólido, tais como gelatina ou um adjuvante. As composições farmacêuticas líquidas compreendem geralmente um veículo líquido, tais como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Pode ser incluído soro fisiológico, dextrose ou outra solução de sacáridos, ou glicóis tais como etileno glicol, propilenoglicol ou polietilenoglicol.
Para injeção intravenosa ou injeção no sítio afectado, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que é apirogénica e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os especialistas na técnica são capazes de preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotónicos, tais como injeção de Cloreto de Sódio, injeção de Ringer, injeção de Ringer com Lactato. Podem ser incluídos conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos, conforme necessário.
Uma composição pode ser administrada sozinha ou em associação com outros tratamentos, terapêuticas ou agentes, simultaneamente ou sequencialmente dependente do estado a ser tratado. Além disso, a presente invenção considera e inclui composições compreendendo o membro de ligação, i. e., anticorpo ou seu fragmento, aqui descrito e outros agentes ou terapêuticas tais como agentes ou terapias anticancerigenos, hormonas, agentes ou anticorpos anti-EGFR, ou moduladores imunológicos. Mais geralmente, estes agentes anticancerigenos podem ser inibidores de tirosina-cinase ou inibidores da cascata de fosforilação, moduladores de pós-tradução, inibidores da divisão ou crescimento celular (e. g. , antimitóticos) ou inibidores da transdução de sinal. Outros tratamentos ou terapêuticas podem incluir a administração de doses adequadas de fármacos de alivio da dor, tais como fármacos anti-inflamatórios não esteróides (e. g., aspirina, paracetamol, ibuprofeno ou cetoprofeno) ou opiáceos, tal como morfina, ou antieméticos. A composição pode ser administrada em associação (sequencialmente (i. e. antes ou depois) ou simultaneamente) com inibidores de tirosina-cinase (incluindo, mas não estando limitados a AG1478 e ZD1839, STI571, OSI-774, SU-6668), doxorrubicina, temozolomida, cisplatina, carboplatina, nitrossoureias, procarbazina, vincristina, hidroxiureia, 5-fluoruracilo, citosina arabinósida, ciclofosfamida, epipodofilotoxinaa, carmustina, lomustina e/ou outros agentes quimioterapêuticos. Assim, estes agentes podem ser agentes específicos anti-EGFR, ou inibidores de tirosina-cinase tal como AG1478, ZD1839, STI571, OSI-774 ou SU-6668, ou podem ser agentes anticancerigenos e antineoplásicos mais gerais tais como doxorrubicina, cisplatina, temozolomida, nitrossoureias, procarbazina, vincristina, hidroxiureia, 5-fluoruracilo, citosina arabinósida, ciclofosfamida, epipodofilotoxinaa, carmustina ou lomustina. Além disso, a composição pode ser administrada com hormonas, tais como dexametasona, moduladores imunológicos, tais como interleucinas, fator de necrose tumoral (TNF) ou outros fatores de crescimento ou citocinas que estimulam a resposta imunológica e redução ou eliminação de células cancerígenas ou tumores.
Um modulador imunológico tal como TNF pode ser combinado em conjunto com um membro da invenção na forma de um anticorpo biespecifico que reconhece o epítopo de EGFR reconhecido pelos anticorpos da invenção, além de se ligar aos recetores de TNF. A composição pode ser também administrada ou pode incluir associações em conjunto com outros anticorpos anti-EGFR, incluindo mas não estando limitados aos anticorpos anti-EGFR 528, 225, SC-03, DR8.3, L8A4, Y10, ICR62 e ABX-EGF.
Anteriormente a utilização de agentes, tais como doxorrubicina e cisplatina em conjunto com anticorpos anti-EGFR produziu atividade antitumoral melhorada (Fan et al., 1993; Baselga et al., 1993) . A associação de doxorrubicina e mAb 528 resultou na erradicação total de xenoenxertos de A431 estabelecidos, enquanto o tratamento com agente sozinho provocou apenas inibição temporária do crescimento in vivo (Baselga et al., 1993) . Do mesmo modo, a associação de cisplatina e mAb528 ou 225 conduziu também à erradicação de xenoenxertos A431 bem estabelecidos, o que não foi observado quando foi utilizado tratamento com qualquer um dos agentes (Fan et al., 1993) .
Radioterapia Convencional
Além disso, a presente invenção considera e inclui composições terapêuticas para a utilização do membro de ligação em associação com radioterapia convencional. Foi indicado que o tratamento com anticorpos que visam recetores de EGF pode melhorar os efeitos da radioterapia convencional (Milas et al., Clin. Cancer Res. 2000 Feb:6 (2) :701, Huang et al., Clin. Cancer Res. 2000 Jun:6 (6):2166).
Como aqui demonstrado, as associações do membro de ligação da presente divulgação, 1. e., um anticorpo ou seu fragmento, de um modo preferido, o mAb806, ch806, mAbl75, mAbl24, mAbll33 ou hu806 ou um seu fragmento, e terapêuticas anticancerigenas, em particular terapêuticas anti-EGFR, incluindo outros anticorpos anti-EGFR, demonstram terapia eficaz, e particularmente sinergia, contra tumores xenoenxertados. Nos exemplos, é demonstrado, por exemplo, que a associação de AG 1478 e mAb806 resulta numa redução significativamente maior do volume tumoral do xenoenxerto A431 em comparação com o tratamento com qualquer um dos agentes sozinho. O AG1478 (4-(3-cloroanilino)-6,7-dimeto-xiquinazolina) é um inibidor potente e seletivo da cinase do recetor de EGF e é particularmente descrito na Patente dos Estados Unidos N° 5457105 (ver também, Liu, W. et al. (1999) J. Cell Sei. 112:2409; Eguchi, S. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:8890; Levitsky, A. e Gazit, A. (1995) Science 267:1782). Os Exemplos da Descrição demonstram ainda mais a sinergia terapêutica dos anticorpos da presente divulgação com outros anticorpos anti-EGFR, particularmente com o anticorpo anti-EGFR 528. A presente invenção considera ainda composições terapêuticas úteis na prática dos métodos terapêuticos desta divulgação. Uma composição terapêutica objeto inclui, em combinação, um excipiente (veículo) farmaceuticamente aceitável e um ou mais de um membro de ligação específica, seu análogo polipeptídico ou seu fragmento, como aqui descrito como um ingrediente ativo. Numa forma de realização preferida, a composição compreende um antigénio capaz de modular a ligação especifica do presente membro de ligação/anticorpo com uma célula alvo. A preparação de composições terapêuticas que contêm polipéptidos, análogos ou fragmentos ativos como ingredientes ativos é bem entendida na técnica. Tipicamente, tais composições são preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões liquidas. No entanto, podem ser também preparadas formas sólidas adequadas para solução ou suspensão num liquido antes da injeção. A preparação pode ser também emulsionada. 0 ingrediente terapêutico ativo é frequentemente misturado com excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo. Os excipientes adequados são, por exemplo, água, soro fisiológico, dextrose, glicerol, etanol ou semelhantes e suas combinações. Além disso, se desejado, a composição pode conter quantidades mais pequenas de substâncias auxiliares, tais como humetantes ou emulsionantes, agentes tampão de pH que melhoram a eficácia do ingrediente ativo.
Um polipéptido, análogo ou fragmento ativo, pode ser formulado na composição terapêutica como formas de sal farmaceuticamente aceitáveis neutralizadas. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (preparados com os grupos amino livres da molécula de polipéptido ou anticorpo) e que se formam com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácidos fosfóricos, ou ácidos orgânicos, tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico, e semelhantes. Os sais preparados a partir dos grupos carboxilo livres podem ser também derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férrico, e bases orgânicas, tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaina e semelhantes.
As composições contendo polipéptidos, análogos ou fragmentos ativos terapêuticos são convencionalmente administrados por via intravenosa, como, por exemplo, por injeção de uma dose unitária. A expressão "dose unitária" quando utilizada em referência a uma composição terapêutica da presente invenção, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como doses unitárias para humanos, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o diluente necessário; i. e., transportador ou veiculo.
As composições são administradas de uma maneira compatível com a formulação da dose, e numa quantidade terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, capacidade do sistema imunitário do indivíduo para utilizar o ingrediente ativo, e grau da capacidade de ligação de EFGR desejado. As quantidades exatas de ingrediente ativo que têm de ser administradas dependem da avaliação do médico e são peculiares a cada individual. No entanto, as doses adequadas podem variar desde cerca de 0,1 a 20, de um modo preferido, cerca de 0,5 a cerca de 10 e, de um modo mais preferido, cerca de um a vários miligramas de ingrediente ativo por quilograma de peso corporal do indivíduo por dia e dependem da via de administração. Os regimes adequados para administração inicial e reforços são também variáveis, mas são tipificados por uma administração inicial seguida de doses repetidas em intervalos de uma ou mais horas por uma injeção subsequente ou outra administração. Alternativamente, é considerada uma infusão intravenosa continua suficiente para manter concentrações de dez nanomolar até dez micromolar no sangue.
As composições farmacêuticas para administração oral podem estar na forma de comprimido, cápsula, pó ou liquido. Um comprimido pode compreender um veiculo sólido, tais como gelatina ou um adjuvante. As composições farmacêuticas liquidas compreendem geralmente um veiculo liquido tal como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Pode ser incluído soro fisiológico, dextrose ou outra solução de sacárido, ou glicóis, tais como etileno glicol, propilenoglicol ou polietilenoglicol.
Para injeção intravenosa ou injeção no sítio afetado, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que é apirogénica e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os especialistas na técnica são capazes de preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotónicos, tais como injeção de Cloreto de Sódio, injeção de Ringer, injeção de Ringer com Lactato. Podem ser incluídos conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outro aditivos, conforme necessário.
Ensaios de Diagnóstico A presente divulgação refere-se também a uma variedade de aplicações em diagnóstico, incluindo métodos para detetar a presença de estímulos, tal como EGFR expresso de forma aberrante, por referência à sua aptidão para ser reconhecido pelo presente membro de ligação especifica. Como mencionado antes, o EGFR pode ser utilizado para produzir anticorpos contra si mesmo por uma variedade de técnicas conhecidas, e tais anticorpos podem ser depois isolados e utilizados como em ensaios para a presença de atividade EGFR particular em células alvo suspeitas.
As aplicações em diagnóstico dos membros de ligação especifica da presente invenção, i. e.f anticorpos e seus fragmentos, incluem aplicações in vitro e in vivo bem conhecidas e convencionais para o especialista e com base na presente descrição. Ensaios e kits de diagnóstico para exame e avaliação in vitro do estado do EGFR, particularmente no que diz respeito à expressão aberrante de EGFR, podem ser utilizados para diagnosticar, avaliar e monitorizar amostras do doente, incluindo aqueles que se sabe que têm ou que se suspeita que tenham um cancro, um estado pré-cancerigeno, um estado relacionado com crescimento hiperproliferativo de células ou de uma amostra de tumor. 0 exame e avaliação do estado do EGFR é também útil para determinar a aptidão de um doente para um ensaio clinico de um fármaco ou para a administração de um agente quimioterapêutico ou membro de ligação especifica, i. e. um anticorpo, da presente invenção, particular incluindo associações dos mesmos, versus um agente ou membro de ligação diferente. Este tipo de diagnóstico, monitorização e avaliação já se encontra em prática na utilização de anticorpos contra a proteína HER2 no cancro da mama (Hercep Test, Dako Corporation), onde o ensaio é também utilizado para avaliar doentes quanto à terapia de anticorpo utilizando Herceptina. As aplicações in vivo incluem a visualização de tumores ou avaliação do estado do cancro em indivíduos, incluindo radioimagiologia.
Como anteriormente sugerido, o método de diagnóstico da presente divulgação compreende a análise de uma amostra celular ou meio através de um ensaio incluindo uma quantidade eficaz de um antagonista para um EFGR/proteína, tal como um anticorpo anti-EFGR, de um modo preferido, um anticorpo policlonal purificado por afinidade e, de um modo mais preferido, um mAb. Além disso, é preferido que as moléculas de anticorpo anti-EFGR aqui utilizadas estejam na forma de porções Fab, Fab', F (ab')2 ou F (v) ou moléculas de anticorpo inteiro. Como anteriormente discutido, os doentes capazes de beneficiar deste método incluem aqueles que sofrem de cancro, uma lesão pré-cancerígena, uma infecção virai, patologias que envolvem ou resultam de crescimento hiperproliferativo de células ou outros transtornos patológicos semelhantes. Os métodos para isolar EFGR e induzir anticorpos anti-EFGR e para determinar e otimizar a aptidão dos anticorpos anti-EFGR para auxiliar no exame das células alvo são todos bem conhecidos na técnica.
De um modo preferido, o anticorpo anti-EFGR utilizado nos métodos de diagnóstico desta divulgação é um anticorpo policlonal purificado por afinidade. De um modo mais preferido, o anticorpo é um anticorpo monoclonal (mAb). Além disso, as moléculas de anticorpo anti-EFGR aqui utilizadas podem estar na forma de porções Fab, Fab', F(ab')2 ou F (v) das moléculas de anticorpo inteiro.
Como descrito em pormenor acima, o(s) anticorpo(s) contra o EGFR podem ser produzidos e isolados por métodos correntes incluindo as técnicas bem conhecidas de hibridoma. Por conveniência, o(s) anticorpo(s) contra o EGFR será(ão) aqui referido(s) como Abi e o(s) anticorpo(s) produzido(s) contra outra espécie como Ab2. A presença de EGFR nas células pode ser apurada pelos procedimentos imunológicos in vitro ou in vivo habituais aplicáveis a essas determinações. É conhecido um número de procedimentos úteis. Três desses procedimentos que são especialmente úteis utilizam o EGFR marcado com um marcador detetável, anticorpo Ab, marcado com um marcador detetável ou anticorpo Ab2 marcado com um marcador detetável. Os procedimentos podem ser resumidos pelas seguintes equações em que o asterisco indica que a partícula está marcada, e "R" significa o EGFR:
Os procedimentos e sua aplicação são totalmente familiares para os especialistas na técnica e, por conseguinte, podem ser utilizados no âmbito da presente invenção. 0 procedimento "competitivo", Procedimento A, é descrito nas Patentes U.S. N° 3654090 e 3850752. O Procedimento C, o procedimento "sanduíche", é descrito nas Patentes U.S. N° RE 31006 e 4016043. Ainda são conhecidos outros procedimentos tal como o procedimento de "anticorpo duplo" ou "DASP".
Em cada caso acima, o EGFR forma complexos com um ou mais anticorpo(s) ou parceiros de ligação e um membro do complexo é marcado com um marcador detetável. 0 facto de um complexo se formar e, se desejado, a quantidade do mesmo, podem ser determinados por métodos conhecidos aplicáveis à deteção de marcadores.
Será evidente do anterior, que uma propriedade caracteristica de Ab2 é que reagirá com Abi. Isto é porque o Abi produzido numa espécie de mamífero foi utilizado noutra espécie como um antigénio para produzir o anticorpo Ab2. Por exemplo, Ab2 pode ser produzido em cabras utilizando anticorpos de coelho como antigénios. Por conseguinte, o Ab2 seria um anticorpo anti-coelho produzido em cabras. Para os fins desta descrição e reivindicações, Abi será referido como um anticorpo primária ou anti-EGFR, e Ab2 será referido como um anticorpo secundário ou anti-Abi.
Os marcadores mais geralmente utilizados para estes estudos são elementos radioativos, enzimas, produtos químicos que emitem fluorescência quando expostos a luz ultravioleta, e outros.
Um número de materiais fluorescentes é conhecido e pode ser utilizado como marcador. Estes incluem, por exemplo, fluoresceína, rodamina, auramina, Vermelho do Texas, azul AMCA e Amarelo Lucifer. Um material de deteção particular é o anticorpo anti-coelho produzido em cabras e conjugado com fluoresceína através de um isotiocianato. 0 EGFR ou seu (s) parceiro(s) de ligação, tal como o presente membro de ligação específica, pode(m) ser também marcado (s) com um elemento radioativo ou com uma enzima. 0 marcador radioativo pode ser detetado por qualquer dos procedimentos de contagem atualmente disponíveis. 0 isótopo preferido pode ser selecionado de 3H, 14C, 32P, 35S, 36C1, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 121I, 124I, 125I, 131I, 211At, 198At, 67Cu 225Ac, 213Bi, 99Tc e 186Re.
Os marcadores enzimáticos são igualmente úteis, e podem ser detetados por qualquer uma das técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperométricas ou gasométricas presentemente utilizadas. A enzima é conjugada com a partícula selecionada por reação com moléculas de ligação, tais como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldeído e semelhantes. Muitas enzimas que podem ser utilizadas nestes procedimentos são conhecidas e podem ser utilizadas. As preferidas são peroxidase, β-glucuronidase, β-D-glucosidase, β-D-galactosidase, urease, glucose-oxidase mais peroxidase e fosfatase alcalina. As Patentes U.S. N° 3654090; 3850752; e 4016043 são referidas, a título de exemplo, quanto à sua divulgação de materiais e métodos marcadores alternativos.
Um sistema de ensaio particular que pode ser vantajosamente utilizado de acordo com a presente invenção é conhecido como um ensaio de recetor. Num ensaio de recetor, o material a ser analisado tal como o membro de ligação específica, é apropriadamente marcado e em seguida certas colónias de ensaio celulares são inoculadas com uma quantidade de material marcado e não marcado, após o que são realizados estudos de ligação para determinar a extensão em que o material marcado se liga aos recetores celulares. Deste modo, podem ser apuradas diferenças na afinidade entre materiais.
Por conseguinte, uma quantidade purificada do membro de ligação especifica pode ser marcada radioativamente e combinada, por exemplo, com anticorpos ou outros inibidores daquele, após o que seriam realizados estudos de ligação. Em seguida, seriam preparadas soluções que conteriam várias quantidades de membro de ligação especifica não combinado, não marcado e marcado e, em seguida, seriam inoculadas amostras de células e, depois disso, incubadas. As monocamadas de células resultantes são em seguida lavadas, solubilizadas e depois contadas num contador gama durante um intervalo de tempo suficiente para produzir um erro padrão < 5%. Estes dados são em seguida submetidos a análise de Scatchard, após o que podem ser efetuadas observações e retiradas conclusões relativamente à atividade do material. Apesar do que está atrás ser ilustrativo, ele ilustra o modo como se pode realizar e utilizar um ensaio de recetor, no caso de a aptidão de ligação celular do material analisado poder servir como uma caracteristica distintiva.
Um ensaio útil e considerado de acordo com a presente invenção é conhecido como um ensaio "cis/trans". Resumidamente, este ensaio utiliza duas construções genéticas, uma das quais é tipicamente um plasmídeo que expressa continuamente um recetor de interesse particular quando transfetado numa linha de células apropriada e a segunda das quais é um plasmídeo que expressa um repórter tal como a luciferase, sob o controlo de um complexo recetor/ligando. Assim, por exemplo, se se desejar avaliar um composto como um ligando para um recetor particular, um dos plasmídeos seria uma construção que resulta na expressão do recetor na linha de células escolhida, enquanto o segundo plasmídeo possuiria um promotor ligado ao gene da luciferase no qual é inserido o elemento de resposta para o recetor particular. Se o composto em ensaio é um agonista para o recetor, o ligando complexará com o recetor, e o complexo resultante ligará o elemento de resposta e iniciará a transcrição do gene da luciferase. A quimioluminescência resultante é, em seguida, medida fotometricamente e são obtidas curvas dose-resposta e comparadas com as de ligandos conhecidos. 0 protocolo anterior é descrito em pormenor na Patente U.S. N° 4981784 e Publicação Internacional PCT N° WO 88/03168, para as quais o especialista é remetido.
Num outro caso desta divulgação, podem ser preparados kits de ensaio comerciais adequados para utilização por um especialista em medicina para determinar a presença ou ausência de expressão aberrante de EGFR, incluindo, mas não estando limitada a EGFR amplificado e/ou uma mutação de EGFR, em célula alvos suspeitas. De acordo com as técnicas de ensaio discutidas acima, uma classe de tais kits conterá pelo menos o EGFR marcado ou seu parceiro de ligação, por exemplo, um anticorpo específico daquele e instruções, evidentemente, dependendo do método selecionado, e. g., "competitivo", "sanduíche", "DASP" e semelhantes. Os kits podem conter também reagentes periféricos, tais como tampões, estabilizantes, etc.
Por conseguinte, pode ser preparado um kit de ensaio para demonstração da presença ou capacidade das células para expressão aberrante ou modificação pós-traducional de EGFR, compreendendo: (a) uma quantidade predeterminada de pelo menos um componente reativo marcado imunoquimicamente obtido pela fixação direta ou indireta do presente membro de ligação especifica ou um seu parceiro de ligação especifica, a um marcador detetável; (b) outros reagentes; e (c) instruções de utilização do referido kit.
Mais especificamente, o kit de ensaio de diagnóstico pode compreender: (a) uma quantidade conhecida do membro de ligação especifica como descrito acima (ou um parceiro de ligação) geralmente ligado a uma fase sólida para formar um imunoabsorvente ou, em alternativa, ligado a um marcador adequado, ou vários desses produtos finais, etc. (ou seus parceiros de ligação) um de cada; (b) se for necessário, outros reagentes; e (c) instruções de utilização do referido kit de ensaio.
Numa outra variante, o kit de ensaio pode ser preparado e utilizado para os fins especificados acima, o qual funciona de acordo com um protocolo predeterminado (e. g., "competitivo", "sanduíche", "anticorpo duplo", etc.), e compreende: (a) um componente marcado que foi obtido acoplando o membro de ligação específica a um marcador detetável; (b) um ou mais reagentes imunoquímicos adicionais dos quais, pelo menos, um reagente é um ligando ou um ligando imobilizado, ligando esse que é selecionado do grupo que consiste de: (i) um ligando capaz de ligar-se ao componente (a) marcado; (ii) um ligando capaz de ligar-se a um parceiro de ligação do componente (a) marcado; (iii) um ligando capaz de ligar-se a, pelo menos, um do(s) componente(s) a ser determinado; e (iv) um ligando capaz de ligar-se a, pelo menos, um dos parceiros de ligação de, pelo menos, um do(s) componente(s) a ser(em) determinado(s); e (c) instruções para a realização de um protocolo para a deteção e/ou determinação de um ou mais componentes de uma reação imunoquímica entre o EFGR, o membro de ligação especifica e um seu parceiro de ligação especifica.
De acordo com o anterior, pode preparar-se um sistema de ensaio para a seleção de fármacos potencialmente eficazes para modular a atividade do EFGR, a expressão aberrante ou modificação pós-tradução do EGFR, e/ou a atividade ou ligação do membro de ligação especifica. 0 recetor ou o membro de ligação pode ser introduzido num sistema de ensaio e o potencial fármaco pode ser também introduzido na cultura de células resultante e a cultura depois disso examinada para observar quaisquer alterações na atividade da fase S das células, devido à adição do potencial fármaco sozinho, ou devido ao efeito das quantidades adicionadas do(s) agente(s) conhecido(s). Ácidos Nucleicos A presente divulgação proporciona ainda um ácido nucleico isolado que codifica um membro de ligação específica da presente invenção. 0 ácido nucleico inclui ADN e ARN. Num caso preferido, a presente divulgação proporciona um ácido nucleico que codifica um polipéptido da invenção como definido acima, incluindo um polipéptido explicitado como os resíduos de CDR das cadeias VH e VL dos anticorpos da invenção. A presente divulgação também proporciona construções na forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem pelo menos um polinucleótido como acima. A presente divulgação também proporciona uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções como acima. Um ácido nucleico que codifica qualquer membro de ligação específica como proporcionado constitui por si só um caso da presente divulgação, assim como um método de produção do membro de ligação específica, cujo método compreende a expressão do ácido nucleico codificante para esse fim. A expressão pode ser convenientemente conseguida cultivando em condições apropriadas células hospedeiras recombinantes contendo o ácido nucleico. Após produção por expressão, um membro de ligação específica pode ser isolado e/ou purificado utilizando qualquer técnica adequada, em seguida utilizado conforme apropriado.
Os membros de ligação específica e as moléculas de ácido nucleico codificantes e vetores de acordo com a presente divulgação podem ser proporcionados isolados e/ou purificados, e. g., a partir do seu ambiente natural, na forma substancialmente pura ou homogénea, ou, no caso de ácido nucleico, livre ou substancialmente isento de ácido nucleico ou genes com origem diferente da sequência que codifica um polipéptido com a função necessária. 0 ácido nucleico de acordo com a presente divulgação pode compreender ADN ou ARN e pode ser total ou parcialmente sintético.
Os sistemas para clonagem e expressão de um polipéptido numa variedade de células hospedeiras diferentes são bem conhecidos. As células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células de mamíferos, levedura e sistemas de baculovírus. As linhas de células de mamíferos disponíveis na técnica para expressão de um polipéptido heterólogo incluem células de ovário de hamster Chinês, células HeLa, células de rim de cria de hamster, células de melanoma de ratinho NSO e muitas outras. Um hospedeiro bacteriano comum, preferido, é a E. coli. A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpos em células procarióticas, tal como E. coli é bem estabelecida na técnica. Para uma revisão, ver por exemplo Pluckthun, A. Bio/Technology 9:545-551 (1991). A expressão em células eucarióticas em cultura está também disponível para os especialistas na técnica como uma opção para a produção de um membro de ligação específica, ver para revisões recentes, por exemplo Raff, Μ. Ε. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4:573-576; Trill J. J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6:553-560.
Podem ser escolhidos ou construídos vetores adequados, contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências de terminação, sequências de poliadenilação, sequências intensificadoras, genes marcadores e outras sequências, conforme apropriado. Os vetores podem ser plasmídeos, virais, e. g. , fago ou fagomídeo, conforme apropriado. Para mais detalhes ver, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edição, Sambrook et al. , 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para a manipulação de ácidos nucleicos, por exemplo na preparação de construções de ácidos nucleicos, mutagénese, sequenciação, introdução de ADN nas células e expressão de genes, e análise de proteínas, são descritos em pormenor em Short Protocols in Molecular Biology, Segunda Edição, Ausubel et al. eds., John Wiley &amp; Sons, 1992.
Assim, um outro caso da presente divulgação proporciona uma célula hospedeira contendo ácido nucleico como aqui divulgado. Um outro caso proporciona um método compreendendo a introdução desse ácido nucleico numa célula hospedeira. A introdução pode utilizar qualquer técnica disponível. Para as células eucarióticas, as técnicas adequadas podem incluir transfeção com fosfato de cálcio, DEAE-Dextrano, electroporação, transfeção mediada por lipossomas e transdução utilizando retrovirus ou outro vírus, e. g. vaccinia ou, para células de insetos, baculovírus. Para as células bacterianas, as técnicas adequadas podem incluir a transformação com cloreto de cálcio, electroporação e transfeção utilizando bacteriófagos. A introdução pode ser seguida da indução ou permissão da expressão do ácido nucleico, e. g. , cultivando as células hospedeiras sob condições de expressão do gene.
Num caso, o ácido nucleico da divulgação é integrado no genoma (e. g. , cromossoma) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida pela inclusão da Sequências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas convencionais. A presente divulgação também proporciona um método que compreende a utilização de uma construção como indicada acima num sistema de expressão para expressar um membro de ligação especifica ou polipéptido como acima.
Como indicado acima, a presente divulgação refere-se também a uma molécula de ADN recombinante ou gene clonado ou uma sua variante degenerada, o qual codifica um membro de ligação especifica, i. e. anticorpo ou um seu fragmento, que possui uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID N°: 2 e 4; 129 e 134; 22 e 27; 32 e 37; e/ou 42 e 47, de um modo preferido uma molécula de ácido nucleico, em particular uma molécula de ADN recombinante ou gene clonado que codifica o membro de ligação ou anticorpo tem uma sequência de nucleótidos ou é complementar a uma sequência de ADN que codifica uma dessas sequências.
Outra caracteristica desta divulgação é a expressão das sequências de ADN aqui divulgadas. Como é bem conhecido na técnica, as sequências de ADN podem ser expressas ligando-as operacionalmente a uma sequência de controlo da expressão num vetor de expressão apropriado e utilizando esse vetor de expressão para transformar um hospedeiro unicelular apropriado.
Essa ligação operatória de uma sequência de ADN desta divulgação a uma sequência de controlo da expressão inclui, evidentemente, se já não fizer parte da sequência de ADN, a provisão de um codão de inicio, ATG, na grelha de leitura correcta a montante da sequência de ADN.
Uma grande variedade de combinações de hospedeiro/vetor de expressão pode ser utilizada na expressão das sequências de ADN desta divulgação. Por exemplo, os vetores de expressão úteis podem consistir de segmentos da Sequências de ADN cromossómico, não cromossómico e sintético. Os vetores adequados incluem derivados de SV40 e plasmídeos bacterianos conhecidos, e. g., os plasmideos de E. coli col Ei, pCRl, pBR322, pMB9 e seus derivados, plasmideos, tal como RP4; ADN de fagos, e. g., os numerosos derivados do fago X, e. g., NM989, e outros ADN de fagos, e. g., M13 e ADN de fagos filamentosos de cadeia simples; plasmideos de levedura, tal como o plasmídeo 2u ou seus derivados; vetores úteis em células eucarióticas, tais como os vetores úteis em células de insetos ou mamíferos; vetores derivados de combinações de plasmídeos e ADNs de fagos, tais como plasmídeos que foram modificados para utilizar ADN de fagos ou outras sequências de controlo da expressão; e semelhantes.
Qualquer de uma grande variedade de sequências de controlo da expressão - sequências que controlam a expressão de uma sequência de ADN operacionalmente ligada às mesmas - pode ser utilizada nestes vetores para expressar as sequências de ADN desta divulgação. Tais sequências de controlo da expressão incluem, por exemplo, os promotores precoces ou tardios de SV40, CMV, vaccinia, polioma ou adenovirus, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC, o sistema TRC, o sistema LTR, o operador principal e regiões promotoras de fago λ, as regiões de controlo da proteína de revestimento fd, o promotor para a 3-fosfoglicerato-cinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores da fosfatase ácido (e. g., Pho5), os promotores dos fatores de acasalamento de leveduras, e outras sequências conhecidas como controlando a expressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus, e várias suas combinações.
Uma grande variedade de células hospedeiras unicelulares é também útil na expressão das sequências de ADN desta divulgação. Estes hospedeiros podem incluir hospedeiros eucarióticos e procarióticos bem conhecidos, tais como estirpes de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungos tais como leveduras, e células de animais, tais como as células CHO, YB/20, NSO, SP2/0, Rl.l, B-W e L-M, células de rim de Macaco Verde Africano (e. g. , COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 e BMT10), células de insetos (e. g., Sf9), e células humanas e células vegetais em cultura de tecidos.
Será entendido que nem todos os vetores, sequências de controlo da expressão e hospedeiros funcionarão igualmente bem para expressar as sequências de ADN desta divulgação. Nem todos os hospedeiros funcionarão igualmente bem com o mesmo sistema de expressão. No entanto, um especialista na técnica será capaz de selecionar os vetores, sequências de controlo da expressão e hospedeiros apropriados sem experimentação excessiva para conseguir a expressão desejada sem se sair do âmbito desta divulgação. Por exemplo, ao selecionar um vetor tem de se considerar o hospedeiro porque o vetor tem de funcionar no mesmo. 0 número de cópias do vetor, a aptidão para controlar esse número de cópias e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, tal como os marcadores de antibióticos, serão também considerados.
Ao selecionar uma sequência de controlo da expressão será normalmente considerada uma variedade de fatores. Estes incluem, por exemplo, a potência relativa do sistema, a sua controlabilidade e a sua compatibilidade com a sequência de ADN ou gene particular a ser expresso, em particular, quanto às estruturas secundárias potenciais. Os hospedeiros unicelulares adequados serão selecionados tendo em consideração, e. g., a sua compatibilidade com o vetor escolhido, as suas características de secreção, a sua aptidão para dobrar corretamente as proteínas e os seus requisitos de fermentação, bem como a toxicidade para o hospedeiro do produto codificado pelas sequências de ADN a serem expressas e a facilidade de purificação dos produtos de expressão.
Considerando estes e outros fatores um especialista na técnica será capaz de construir uma variedade de combinações de vetor/sequência de controlo da expressão/hospedeiro que expressará as sequências de ADN desta divulgação por fermentação ou numa cultura animal em grande escala. É ainda pretendido que os análogos do membro de ligação específica possam ser preparados a partir da Sequências de nucleótidos do complexo/subunidade de proteína derivada no âmbito da presente divulgação. Os análogos, tal como fragmentos, podem ser produzidos, por exemplo, por digestão de material do membro de ligação especifica com pepsina. Outros análogos, tais como muteinas, podem ser produzidos por mutagénese especifica de um lócus convencional de sequências de codificação do membro de ligação especifica. Os análogos que exibem "atividade do membro de ligação especifica", tal como moléculas pequenas, quer atuem como promotores ou inibidores, podem ser identificados por ensaios in vivo e/ou in vitro conhecidos.
Como mencionado acima, uma sequência de ADN que codifica um membro de ligação especifica pode ser preparada sinteticamente em vez de clonada. A sequência de ADN pode ser concebida com os codões apropriados para a sequência de aminoácidos do membro de ligação especifica. Em geral, serão selecionados os codões preferidos para o hospedeiro pretendido, se a sequência for utilizada para expressão. A sequência completa é reunida a partir de oligonucleótidos sobrepostos preparados por métodos correntes e reunidos numa sequência codificante completa. Ver, e. g. , Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et al., Science, 223:1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984).
As sequências de ADN sintéticas permitem a construção conveniente de genes que expressarão análogos dos membros de ligação especifica ou "muteinas". Alternativamente, o ADN que codifica as muteinas pode ser preparado por mutagénese especifica de um lócus de genes ou ADNc de membros de ligação especifica nativos, e as muteinas podem ser preparadas diretamente utilizando síntese convencional de polipéptidos.
Um método geral para a incorporação específica num sítio de aminoácidos não naturais em proteínas é descrito em Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, Science, 244:182-188 (abril de 1989). Este método pode ser utilizado para produzir análogos com aminoácidos não naturais . A presente divulgação alarga-se à preparação de oligonucleótidos antimensageiros e ribozimas que podem ser utilizados para interferir com a expressão do EGFR ao nivel da tradução. Esta abordagem utiliza ácido nucleico antimensageiro e ribozimas para bloquear a tradução de um ARNm especifico, mascarando esse ARNm com um ácido nucleico antimensageiro ou dissociando-o com uma ribozima.
Os ácidos nucleicos antimensageiros são moléculas de ADN ou ARN que são complementares a, pelo menos, uma porção de uma molécula de ARNm especifica (ver Weintraub, 1990; Marcus-Sekura, 1988.) . Na célula, hibridizam com esse ARNm, formando uma molécula de cadeia dupla. A célula não traduz um ARNm nesta forma de cadeia dupla. Portanto, os ácidos nucleicos antimensageiros interferem com a expressão de ARNm em proteína. Os oligómeros com cerca de quinze nucleótidos e as moléculas que hibridam como codão de início AUG serão particularmente eficazes, uma vez que são fáceis de sintetizar e têm maior probabilidade de colocar menos problemas do que as moléculas maiores quando são introduzidos em células produtoras. Os métodos antimensageiros foram utilizados para inibir a expressão de muitos genes in vitro (Marcus-Sekura, 1988; Hambor et ai., 1988) .
As ribozimas são moléculas de ARN que têm a aptidão para dissociar especificamente outras moléculas de ARN de cadeia simples de um modo algo semelhante às endonucleases de restrição de ADN. As ribozimas foram identificadas a partir da observação de que determinados ARNm têm a aptidão para cortar os seus próprios intrões. Através da modificação da sequência de nucleótidos destes ARN, os investigadores foram capazes de manipular por engenharia moléculas que reconhecem sequências de nucleótidos especificas numa molécula de ARN e dissociá-las (Cech, 1988.)· Uma vez que elas são especificas em relação à sequência, apenas os ARNm com sequências particulares são inativados.
Os investigadores identificaram dois tipos de ribozimas, de tipo Tetrahymena e de tipo "em cabeça de martelo" (Hasselhoff e Gerlach, 1988). As ribozimas de tipo "tetrahymena" reconhecem sequências de quatro bases, enquanto as de tipo "em cabeça de martelo" reconhecem sequências de onze a dezoito bases. Quanto mais comprida a sequência de reconhecimento, maior é a probabilidade de ocorrer exclusivamente na espécie de ARNm alvo. Por conseguinte, as ribozimas de tipo em "cabeça de martelo" são preferidas em relação às ribozimas de tipo "Tetrahymena" para inativar uma espécie de ARNm especifica, e as sequências de reconhecimento de dezoito bases são preferidas a sequências de reconhecimento mais curtas.
As sequências de ADN aqui descritas podem ser assim utilizadas para preparar moléculas antimensageiras contra, e ribozimas que dissociam ARNm para, EFGR e os seus ligandos. A invenção pode ser melhor entendida por referência aos seguintes exemplos não limitativos, os quais são proporcionados como ilustrativos da invenção. Os seguintes exemplos são apresentados de modo a ilustrar mais pormenorizadamente as formas de realização preferidas da invenção e não devem, contudo, de modo nenhum ser interpretados como limitando o âmbito lato da invenção.
Exemplo 1
Produção e Isolamento de Anticorpos
Linhas de células
Para imunização e análises de especificidade foram utilizadas várias linhas de células nativas ou transfetadas com o gene normal, de tipo selvagem ou "tsEGFR" ou o gene de AEGFR portador da mutação por supressão Δ2-7: Linha de células de fibroblastos murideos NR6, NR6aegfr (transfetada com AEGFR) e NR6tsEGFR (transfetada com tsEGFR) , linha de células de glioblastoma humano U87MG (que expressam níveis baixos de tsEGFR endógeno) , U87MGtsEGFR (transfetada com tsEGFR) , U87MGaegfr (transfetada com AEGFR), e linha de células de carcinoma humano A431 de células escamosas (que expressam níveis altos de tsEGFR).
Para imunização e análises de especificidade foram
utilizadas várias linhas de células nativas ou transfetadas com o gene normal, de tipo selvagem ou "tsEGFR" ou o gene AEGFR portador da mutação por supressão des2-7 ou Δ2-7: Linha de células de fibroblastos murideos NR6, NR6aegfr (transfetada com LEGFR) e NR6tsEGFR (transfetada com tsEGFR) , linha de células de glioblastoma humano U87MG (que expressam níveis baixos de tsEGFR
endógeno), U87MGtsEGFR ou "U87MG. tsEGFR" (transfetada com tsEGFR) , U87MGaegfr ou "U87MG.A2-7" (transfetada com AEGFR), e linha de células de carcinoma humano A431 de células escamosas (que expressam níveis altos de tsEGFR). As linhas de células NR6, NR6aegfr e NR6tsEGFR foram anteriormente descritas (Batra et ai. (1995) Epidermal Growth factor Ligand-independent, Unregulated, Cell-Transforming Potential of a Naturally Occurring Human Mutant EGFRvIII Gene. Cell Growth Differ. 6(10): 1251-1259). A linha de células NR6 carece do EGFR endógeno normal. (Batra et al. , 1995). As linhas de células U87MG e transfecções foram anteriormente descritas (Nishikawa et al. (1994) A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7727-7731). A linha de células de astrocitoma U87MG (Ponten, J. e Macintyre, E. H. (1968) Long term culture of normal and neoplastic human glia. Acta. Pathol. Microbiol. Scand. 74, 465-86) a qual expressa endogenamente níveis baixos de tsEGFR, foi infetada com um retrovirus contendo o des2-7 EGFR para produzir a linha de células U87MG.A2-7 (Nishikawa et al., 1994). A linha de células transfetada U87MG.tsEGFR foi produzida como descrito em Nagane et al. (1996) Cancer Res. 56, 5079-5086.
Enquanto as células U87MG expressam, aproximadamente, 1χ105 EGFR, as células U87MG.tsEGFR expressam, aproximadamente, ΙχΙΟ6 EGFR e mimetizam assim a situação observada com a amplificação de genes. A linha de células pró-B murídea BaF/3, a qual não expressa quaisquer moléculas relacionadas com o EGFR conhecidas, foi também transfetada com des2-7 EGFR resultando na linha de células BaF/3.Δ2-7 (Luwor et al. (2004) The tumor-specific des2-7 epidermal growth factor receptor (EGFR) promotes cells survival and heterodimerizes with the wild-type EGFR, Oncogene 23: 6095-6104). As células A431 de carcinoma escamoso humano foram obtidas de ATCC (Rockville, MD) . A linha de células de carcinoma epidermóide A431 foi anteriormente descrita (Sato et al. (1987) Derivation and assay of biological effects of monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptors. Methods Enzymol. 146, 63-81).
Todas as linhas de células foram cultivadas em DMEM/F-12 com GlutaMAX™ (Life Technologies, Inc., Melbourne, Austrália e Grand Island, NY) suplementado com 10% de FCS (CSL, Melbourne, Austrália); glutamina 2 mM (Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO), e penicilina/estreptomicina (Life Technologies, Inc., Grand Island, NI). Além disso, as linhas de células U87MG.A2-7 e U87MG.tsEGFR foram mantidas em 400 mg/mL de geneticina (Life
Technologies, Inc., Melbourne, Victoria, Austrália). As linhas de células foram cultivadas a 37 °C, numa atmosfera de 5% de CO2 não modificada.
Reagentes O péptido da junção única de des2-7 EGFR tem a sequência de aminoácidos: LEEKKGNYVVTDH (SEQ ID N° : 13). Os péptidos de junção única biotinilados (Biotina-LEEKKGNYVVTDH (SEQ ID N° : 5) e LEEKKGNYVVTDH-Biotina (SEQ ID N° : 6)) de des2-7 EGFR foram sintetizados por química Fmoc convencional e a pureza (> 96%) foi determinada por HPLC de fase inversa e análise por espetrometria de massa (Auspep, Melbourne, Austrália).
Anticorpos utilizado nos estudos
Para comparar as observações da requerente com outros reagentes foram incluídos mAbs adicionais no estudo da requerente. Estes reagentes foram o mAb528 para o tsEGFR (Sato et al. (1983) Mol. Biol. Med. 1(5), 511-529) e DH8.3, o qual foi produzido contra um péptido sintético que atravessa a sequência da junção da mutação por supressão Δ2-7 EGFR. 0 anticorpo DH8.3 (IgGl), o qual é especifico para o des2-7 EGFR, foi anteriormente descrito (Hills et al. (1995) Specific targeting of a mutant, ativated EGF recetor found in glioblastoma using a monoclonal antibody. Int. J. Cancer. 63, 537-43,1995) e foi obtido após imunização de ratinhos com o péptido da junção única presente no des2-7 EGFR (Hills et al., 1995). 0 anticorpo 528, o qual reconhece o des2-7 e o EGFR de tipo selvagem, foi anteriormente descrito (Masui et al. (1984) Growth inhibition of human tumor cells in athymic mice by anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies. Cancer Res. 44, 1002-7) e foi produzido na Biological Production Facility, Ludwig Institute for Cancer Research (Melbourne, Austrália) utilizando um hibridoma (ATCC HB-8509) obtido de American Type Culture Collection (Rockville, MD) . O anticorpo policlonal SC-03 é um anticorpo policlonal de coelho purificado por afinidade produzido contra um péptido carboxi-terminal do EGFR (Santa Cruz Biotechnology Inc.).
Produção de Anticorpo A linha de fibroblastos murídeos NR6aegfr foi utilizada como imunogénio. Os hibridomas de ratinho foram produzidos imunizando ratinhos BALB/c cinco vezes por via subcutânea em intervalos de 2 a 3 semanas, com 5χ105 - 2χ106 células em adjuvante. Foi utilizado adjuvante completo de Freund para a primeira injeção. Depois disso, foi utilizado adjuvante incompleto de Freund (Difco™, Voigt Global Distribution, Lawrence, KS) . As células do baço de ratinhos imunizados foram fundidas com a linha de células de mieloma de ratinho SP2/0 (Shulman et al. (1978) Nature 276:269-270). Os sobrenadantes dos clones recém-produzidos foram pesquisados em ensaios de hemoadsorção quanto à reatividade com as linhas de células NR6, NR6tsEGFR e NR6aegfr e em seguida analisados por ensaios de hemoadsorção com linhas de células de glioblastoma humano U87MG, U87MGtsEGFR e U87Aegfr. Os sobrenadantes de hibridoma selecionados foram subsequentemente testados por transferência de Western e subsequentemente analisados por imuno-histoquímica. Os mAbs recém-produzidos que apresentam o padrão de reatividade esperado foram purificados.
Foram estabelecidos cinco hibridomas e três clones, 124 (IgG2a), 806 (IgG2b) e 1133 (IgG2a) foram inicialmente selecionados para caracterização adicional com base no título alto (1:2500) com NR6aegfr e fundo baixo em células NR6 e NR6tsEGFR no ensaio de hemaglutinação de rosácea. Um quarto clone, 175 (IgG2a) foi subsequentemente caracterizado e é discutido separadamente no Exemplo 23, abaixo. Numa análise de hemaglutinação posterior, estes anticorpos não apresentaram qualquer reatividade (sobrenadante não diluído d 10%) com a linha de células nativa de glioblastoma humano U87MG e U87MGtsEGFR, mas foram fortemente reativas com a U87MGaegfr; foi observada menos reatividade com a A431. Em contrapartida, na análise por FACS, o 806 não reagiu com a U87MG nativa e revelou intensamente a U87MGaegfr e num grau menor a U87MGtsEGFR indicando ligação do 806 a ambas, AEGFR e tsEGFR (ver abaixo).
Nos ensaios de transferência de Western, os mAbl24, mAb806 e mAbll33 foram em seguida analisados quanto à reatividade com tsEGFR e AEGFR. Foram extraídos lisados de detergente de NR6aegfr, U87MGaegfr bem como de A431. Todos os três mAbs apresentaram um padrão de reatividade semelhante, com os lisados celulares a revelar ambas as proteínas tsEGFR (170 kDa) e AEGFR (140 kDa) . Como um reagente de referência foi utilizado mAbR.I., conhecido como sendo reativo com o tsEGFR (Waterfield et al. (1982) J. Cell Biochem. 20(2), 149-161), em vez de mAb528, o qual é conhecido como sendo não reativo na análise de transferência de Western. O mAbR.I. apresentou reatividade com o tipo selvagem e AEGFR. Todos os três clones recém-produzidos apresentaram reatividade com AEGFR e menos intensa com tsEGFR. O DH8.3 foi exclusivamente positivo no lisado de U87MGaegfr e NR6aegfr. A análise imuno-histoquímica dos clones 124, 806 e 1133, bem como mAb528 e mAbDH8.3 em xenoenxertos de tumores U87MG, U87MGaegfr e A431 são mostrados na Tabela 1. Todos os mAbs apresentaram forte revelação do xenoenxerto U87MGaegfr. Apenas o mAb528 apresentou reatividade fraca no xenoenxerto de U87MG nativo. Nos xenoenxertos de A431, o mAb528 apresentou forte reatividade homogénea. Os mAbl24, mAb806 e mAbll33 revelaram reatividade com a maioria das células localizadas basalmente do carcinoma de células escamosas de A431 e não reagem com as camadas de células superiores ou o componente queratinizante. 0 DH8.3 foi negativo em xenoenxertos de A431.
Tabela 1
Análise Imuno-histoquímica dos Anticorpos 528, DH8.3 e 124, 806 e 1133
revelação pequena do estroma devido a deteção de anticorpos de ratinho endógenos.
Sequenciação
As cadeias pesada variável (VH) e leve variável (VL) do mAb806, mAbl24 e mAbll33 foram sequenciadas, e as suas regiões determinantes de complementaridade (CDR) identificadas, como se segue: mAb 8 0 6
Cadeia VH de mAb806: a sequência de ácido nucleico (SEQ ID N° : 1) e a sequência de aminoácidos, com péptido sinal (SEQ ID N° : 2) são mostradas nas FIG.14A e 14B, respetivamente (péptido sinal sublinhado na FIG.14B). As regiões determinantes de complementaridade CDRl, CDR2 e CDR3 (SEQ ID N° : 15, 16 e 17,
respetivamente) são indicados pelo sublinhado na FIG.16. A sequência de aminoácidos da cadeia VH do mAb806 sem o seu péptido sinal (SEQ ID N°: 11) é mostrada na FIG.16.
Cadeia VL de mAb806: a sequência de ácido nucleico (SEQ ID N° : 3) e sequência de aminoácidos, com péptido sinal (SEQ ID N° : 4) são mostradas nas FIG.15A e 15B, respetivamente (péptido sinal sublinhado na FIG.15B). As regiões determinantes de complementaridade CDRl, CDR2 e CDR3 (SEQ ID N° : 18, 19 e 20,
respetivamente) são indicadas pelo sublinhado na FIG.17. A sequência da cadeia VL de aminoácidos do mAb806 sem o seu péptido sinal (SEQ ID N°: 12) é mostrada na FIG.17. mAb124
Cadeia VH de mAbl24: as sequências de ácido nucleico (SEQ ID N° : 21) e aminoácidos (SEQ ID N° : 22) são mostradas nas FIG.51A e 51B, respetivamente. As regiões determinantes de complementaridade CDRl, CDR2 e CDR3 (SEQ ID N° : 23, 24 e 25, respetivamente) são indicadas pelo sublinhado.
Cadeia VL de mAbl24: as sequências de ácido nucleico (SEQ ID N° : 26) e aminoácidos (SEQ ID N° : 27) são mostradas nas FIG.51C e 51D, respetivamente. As regiões determinantes de complementaridade CDRl, CDR2 e CDR3 (SEQ ID N° : 28, 29 e 30, respetivamente) são indicadas pelo sublinhado. mAb1133
Cadeia VH de mAblll3: as sequências de ácido nucleico (SEQ ID N° : 31) e aminoácidos (SEQ ID N° : 32) são mostradas nas FIG.52A e 52B, respetivamente. As regiões determinantes de complementaridade CDRl, CDR2 e CDR3 (SEQ ID N° : 33, 34 e 35, respetivamente) são indicadas pelo sublinhado.
Cadeia VL de mAblll3: as sequências de ácido nucleico (SEQ ID N°: 36) e aminoácidos (SEQ ID N°: 37) são mostradas nas FIG.52C e 52D, respetivamente. As regiões determinantes de complementaridade CDRl, CDR2 e CDR3 (SEQ ID N° : 38, 39, e 40, respetivamente) são indicadas pelo sublinhado.
Exemplo 2
Ligação de Anticorpos às Linhas de Células por FACS O mAb806 foi inicialmente selecionado para caracterização adicional, como estabelecido aqui e nos Exemplos seguintes. Os mAbl24 e mAbll33 foram também selecionados para caracterização adicional, como discutido Exemplo 26 abaixo, e determinou-se que têm propriedades correspondentes às propriedades únicas do mAb806 aqui discutido.
Para determinar a especificidade do mAb806, a sua ligação às células U87MG, U87MG.A2-7 e U87MG.tsEGFR, foi analisada por triagem celular ativada por fluxo (FACS). Resumidamente, as células foram marcadas com o anticorpo relevante (10 yg/mL), seguido de IgG anti-ratinho de cabra conjugada com fluoresceina (diluição 1:100; Calbiochem San Diego, CA, EUA; Becton-Dickinson PharMingen, San Diego, CA, EUA) como anteriormente descrito (Nishikawa et al., 1994) . Os dados de FACS foram obtidos num Coulter Epics Elite ESP observando um mínimo de 5000 eventos e analisados utilizando o EXPO (versão 2) para Windows. Uma IgG2b irrelevante foi incluída como um controlo de isotipo para o mAb806 e foi incluído o anticorpo 528 já que reconhece o des2-7 e o tsEGFR.
Apenas o anticorpo 528 foi capaz de revelar a linha de células U87MG parental (FIG.l) coerente com relatórios anteriores que demonstram que estas células expressam o tsEGFR (Nishikawa et al., 1994) . O mAb806 e o DH8.3 tiveram níveis de ligação semelhantes ao anticorpo de controlo, demonstrando claramente que não são capazes de ligar o recetor de tipo selvagem (FIG.l) . A ligação do anticorpo de controlo de isotipo às células U87MG.A2-7 e U87MG.tsEGFR foi semelhante àquela observada para as células U87MG. O mAb806 revelou células U87MG.A2-7 e U87MG.tsEGFR, indicando que o mAb806 reconhece especificamente o des2-7 EGFR e EGFR amplificado (FIG.l). O anticorpo DH8.3 revelou células U87MG.A2-7, confirmando que o anticorpo DH8.3 reconhece especificamente o des2-7 EGFR (FIG.l). Como esperado, o anticorpo 528 revelou as linhas de células U87MG.A2-7 e U87MG.tsEGFR (FIG.l). Como esperado, o anticorpo 528 revelou o U87MG.A2-7 com uma intensidade maior do que a célula parental, já que liga os recetores des2-7 e de tipo selvagem que são co-expressos nestas células (FIG.l). Foram obtidos resultados semelhantes utilizando uma hemoadsorção misturada com proteína A que deteta IgG ligada na superfície pelo aspeto da Proteína A revestida com glóbulos vermelhos humanos (grupo 0) para visar células. 0 anticorpo monoclonal 806 foi reativo com células U87MG.A2-7 mas não apresentou qualquer reatividade significativa (sobrenadante não diluído menos de 10%) com U87MG que expressa o EGFR de tipo selvagem. É importante dizer que, o mAb806 também ligou a linha de células BaF/3.A2-7, demonstrando que a co-expressão de tsEGFR não é um requisito para a reatividade do mAb 8 0 6 (FIG.l) .
Exemplo 3
Ligação de Anticorpos em Ensaios
Para caracterizar adicionalmente a especificidade do mAb806 e do anticorpo DH8.3, a sua ligação foi examinada por ELISA. Foram utilizados dois tipos de ELISA para determinar a especificidade dos anticorpos. No primeiro ensaio, as placas foram revestidas com sEGFR (10 yg/mL em tampão de carbonato 0,1 M, pH 9,2) durante 2 h e, em seguida, bloqueadas com albumina de soro humano (HSA) a 2% em PBS. 0 sEGFR é o domínio extracelular recombinante (aminoácidos 1-621) do EGFR de tipo selvagem) e foi produzido como anteriormente descrito (Domagala et al. (2000) Stoichiometry, kinetic and binding analysis of the interaction between Epidermal Growth factor (EGF) and the Extracellular Domain of the EGF receptor. Growth factors. 18, 11-29). Os anticorpos foram adicionados aos poços em triplicado em concentração crescente em 2% de HSA em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). 0 anticorpo ligado foi detetado por IgG anti-ratinho de ovelhas conjugada com peroxidase de rábano-silvestre (Silenus, Melbourne, Austrália) utilizando ABTS (Sigma, Sidney, Austrália) como um substrato e a absorvância medida a 405 nm. O mAb806 e o anticorpo 528 apresentaram curvas de ligação dependentes da dose e com saturação para o sEGFR de tipo selvagem imobilizado (FIG.2A). Como o péptido da junção única presente no des2-7 EGFR não está contido no sEGFR, o mAb806 tem de estar a ligar-se a um epítopo localizado dentro da sequência do EGFR de tipo selvagem. A ligação do anticorpo 528 foi inferior àquela observada para o mAb806, provavelmente porque reconhece um determinante conformacional. Como esperado, o anticorpo DH8.3 não ligou o sEGFR de tipo selvagem mesmo a concentrações até 10 yg/mL (FIG.2A). Embora o sEGFR em solução tenha inibido a ligação do anticorpo 528 ao sEGFR imobilizado de uma maneira dependente da dose, ele foi incapaz de inibir a stligação de mAb806 (FIG.2B). Isto sugere que o mAb806 apenas pode ligar o EGFR de tipo selvagem uma vez imobilizado em placas de ELISA, um processo que pode induzir alterações conformacionais. Foram observados resultados semelhantes utilizando um BIAcore de acordo com o que o mAb806 ligado imobilizou o sEGFR, mas o mAb806 imobilizado não foi capaz de ligar o sEGFR em solução (FIG.2C).
Após desnaturação, aquecendo durante 10 min, a 95 °C, o sEGFR em solução foi capaz de inibir a ligação de mAb806 ao sEGFR imobilizado (FIG.2C), confirmando que o mAb806 pode ligar o EGFR de tipo selvagem sob certas condições. Curiosamente, o sEGFR desnaturado foi incapaz de inibir a ligação do anticorpo 528 (FIG.2C), demonstrando que este anticorpo reconhece um epitopo conformacional. 0 anticorpo DH8.3 exibiu ligação dependente da dose e saturável com o péptido de des2-7 EGFR único (FIG.2D) . Nem o mAb806, nem o anticorpo 528 se ligaram ao péptido, mesmo a concentrações superiores àquelas utilizadas para obter ligação de saturação de DH8.3, indicando ainda que o mAb806 não reconhece um epitopo determinante dentro deste péptido.
No segundo ensaio, o péptido especifico des2-7 biotinilado (Biotina LEEKKGNYVVTDH (SEQ ID N°: 5)) foi ligado a placas ELISA pré-revestidas com estreptavidina (Pierce, Rockford, Illinois). Os anticorpos foram ligados e detetados como no primeiro ensaio. Nem o mAb806, nem o anticorpo 528 se ligaram ao péptido, mesmo a concentrações superiores àquelas utilizadas para obter ligação de saturação de DH8.3, indicando ainda que o mAb806 não reconhece um epitopo determinante dentro deste péptido.
Para demonstrar ainda mais que o mAb806 reconhece um epitopo distinto do péptido de junção, foram realizadas experiências adicionais. 0 péptido des2-7 biotinilado na extremidade C-terminal (LEEKKGNYVVTDH-Biotina (SEQ ID N°: 6)) foi utilizado em estudos com mAb806 e mAbL8A4 produzidos contra o péptido des2-7 (Reist et al. (1995) Cancer Res. 55(19), 4375-4382; Foulon et al. (2000) Cancer Res. 60(16), 4453-4460).
Reagentes utilizados em Estudos de Péptidos Péptido de LEEKKGNYVVTDH-OH (Biosource, Camarillo, CA);
Junção : Péptido C: LEEKKGNYVVTDH(K-Biot)-OH (Biosource, Camarillo, CA); sEGFR : domínio extracelular solúvel recombinante (aminoácidos 1-621) do EGFR de tipo selvagem (LICR Melbourne) derivado de células CHO; mAb806: anticorpo monoclonal de ratinho, IgG2b (LICR NYB); mAbL8A4: anticorpo monoclonal de ratinho, IgGi (Duke
University);
IgGi mAb de controlo de isotipo;
IgG2b mAb de controlo de isotipo. 0 Péptido C foi imobilizado num microssensor de Estreptavidina a uma densidade superficial de 350RU (+/- 30RU).
Foram testadas diluições sucessivas de mAbs quanto à reatividade com o péptido. Foram realizadas experiências de bloqueio utilizando péptido não biotinilado para avaliar a especificidade. 0 mAbL8A4 apresentou forte reatividade com Péptido C mesmo a concentrações baixas de anticorpo (6,25 nM) (FIG.2E). 0 mAb806 não apresentou reatividade específica detetável com o Péptido C até concentrações de anticorpo de lOOnM (concentração mais alta testada) (FIG.2E e 2F) . Era esperado que o mAbL8A4 reagisse com o Péptido C porque o péptido foi utilizado como o imunogénio na produção de mAbL8A4. A adição do Péptido de Junção (não biotinilado, 50 pg/mL) bloqueia completamente a reatividade do mAbL8A4 com o Péptido C, confirmando a especificidade do anticorpo para o epítopo peptídico da junção.
Num segundo conjunto de experiências BIAcore, o sEGFR foi imobilizado num chip microssensor com CM a uma densidade superficial de -4000UR. Diluições sucessivas de mAbs foram testadas quanto à reatividade com sEGFR. 0 mAb806 foi fortemente reativo com o sEGFR desnaturado, enquanto o mAbL8A4 não reagiu com o sEGFR desnaturado. A reatividade do mAb806 com o sEGFR desnaturado diminui com concentrações decrescentes de anticorpo. Era esperado que o mAbL8A4 não reagisse com o sEGFR porque o mAbL8A4 foi produzido utilizando o péptido de junção como o imunogénio e o sEGFR não contém o péptido de junção.
Foram também realizadas experiências de imunorrevelação por transferência de mancha (dot-blot). Diluições sucessivas do péptido foram aplicadas em 0,5 yL sobre membranas de PVDF ou nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com 2% de BSA em PBS e, em seguida, testada com anticorpos 806, L8A4, DH8.3 e de controlo. Os anticorpos L8A4 e DH8.3 ligaram-se ao péptido nas membranas (dados não apresentados). O mAb806 não ligou o péptido a concentrações em que o L8A4 apresentou claramente ligação (dados não apresentados). Os anticorpos de controlo foram também negativos quanto à ligação ao péptido. O mAb806 ligou-se ao tsEGFR em lisados celulares após imunotransferência (resultados não apresentados). Isto é diferente dos resultados obtidos com o anticorpo DH8.3, o qual reagiu com o des2-7 EGFR mas não com o tsEGFR. Assim, o mAb806 pode reconhecer o tsEGFR após desnaturação, mas não quando o recetor está no seu estado natural na superfície celular.
Exemplo 4
Análise de Scatchard
Foi realizada uma análise de Scatchard utilizando células U87MG.A2-7 após correção para a imunorreatividade para determinar a afinidade relativa de cada anticorpo. Os anticorpos foram marcados com 125I (Amrad, Melbourne, Austrália) pelo método da Cloramina Tea imunorreatividade determinada pelo ensaio de Lindmo (Lindmo et al. (1984) Determination of the immunoreative fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess. J. Immunol. Methods. 72, 77-89).
Todos os ensaios de ligação foram realizados em 1% de HSA/PBS sobre 1-2 χ 106 células de U87MG.A2-7 ou A431 vivas durante 90 min, a 4 °C com rotação ligeira. Foi utilizado uma concentração fixa de anticorpo marcado com 125I de 10 ng/mL na presença de concentrações crescentes do anticorpo não marcado apropriado. A ligação não específica foi determinada na presença de um excesso de 10000 vezes de anticorpo não marcado. Nem o mAb806 marcado radioativamente com 125I, nem o anticorpo DH8.3 ligaram-se às células U87MG parentais. Depois de a incubação estar concluída, as células foram lavadas e contadas quanto ao anticorpo marcado com 125I ligado utilizando um contador gama COBRA II (Packard Instrument Company, Meriden, CT, EUA). O mAb806 e o anticorpo DH8.3 retiveram alta imunorreatividade quando iodados e foi tipicamente maior do que 90% para o mAb806 e 45-50% para o anticorpo DH8.3. 0 mAb806 tinha uma afinidade para o recetor des2-7 EGFR de 1,1 χ 109 M_1 enquanto a afinidade do DH8.3 foi cerca de 10 vezes inferior a 1,0 χ 108 M_1. Nenhum dos anticorpos iodados se ligou às células U87MG parentais. O mAb806 reconheceu uma média de 2,4 χ 105 sítios de ligação por célula com o anticorpo DH8.3 a ligar-se a uma média de 5,2 χ 105 sítios. Assim, não só houve uma boa concordância no número de recetores entre os anticorpos, mas também com um relatório anterior que apresenta 2,5 χ 105 recetores des2-7 por célula como medido por um anticorpo específico contra o des2-7 EGFR diferente na mesma linha de células (Reist et ai. (1997) Improved targeting of an anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibody in tumour xenografts after labelling using N-succinimidyl 5-iodo-3-pyridinecarboxylate. Cancer Res. 57, 1510-5).
Exemplo 5
Internalização de Anticorpos pelas Células U87MG.A2-7 A taxa de internalização de anticorpo após ligação a uma célula alvo influencia as suas propriedades de direcionamento para tumores e as opções terapêuticas. Consequentemente, a requerente examinou a internalização de mAb806 e do anticorpo DH8.3 após ligação a células U87MG.A2-7 por FACS. As células U87MG.A2-7 foram incubadas com mAb806 ou o anticorpo DH8.3 (10 yg/mL) durante 1 h, em DMEM, a 4 °C. Depois de lavar, as células foram transferidas para DMEM pré-aquecido até 37 °C e foram retiradas alíquotas em vários pontos no tempo, após incubação a 37 °C. A internalização foi parada lavando imediatamente as alíquotas em tampão de lavagem gelado (1% de HSA/PBS). No final do curso de tempo, as células foram reveladas por FACS como descrito acima. A percentagem de internalização foi calculada comparando a revelação de anticorpo na superfície em vários pontos no tempo com o tempo zero utilizando a fórmula: percentagem de anticorpo internalizada = (fluorescência média ao tempox-fluorescência de fundo)/(fluorescência média ao tempoo -fluorescência de fundo) χ 100. Este método foi validado num ensaio utilizando um anticorpo iodado (mAb806) para medir a internalização como anteriormente descrito (Huang et ai. (1997) A atividade tumorigénica aumentada de um recetor do fator de crescimento epidérmico mutante comum em cancros humanos é mediada por níveis limiares de fosforilação da tirosina constitutiva e sinalização não atenuada. J. Biol. Chem. 272, 2927-35). As diferenças na taxa de internalização em diferentes pontos no tempo foram comparadas utilizando o teste t de Student. Ao longo desta investigação, os dados foram analisados quanto à significância pelo teste t de Student, exceto para os ensaios de sobrevivência in vivo, os quais foram analisados por análise de Wilcoxon.
Ambos os anticorpos apresentaram internalização relativamente rápida atingindo níveis de estado estacionário aos 10 min para o mAb806 e 30 min para o DH8.3 (FIG.3). A
internalização de DH8.3 foi significativamente maior em termos de taxa (80,5% de DH8.3 internalizado aos 10 min em comparação com 36,8% para o mAb806, p < 0,01) e quantidade total internalizada aos 60 min (93,5% versus 30,4%, p < 0,001). O mAb806 apresentou níveis ligeiramente mais baixos de internalização aos 30 e 60 min em comparação com os 20 min em todos os 4 ensaios realizados (FIG.3). Este resultado foi também confirmado utilizando um ensaio de internalização com base em mAb806 iodado (dados não apresentados).
Exemplo 6
Análise por Microscopia Electrónica da Internalização de Anticorpos
Dada a diferença assinalada acima nas taxas de internalização entre os anticorpos, foi realizada uma análise detalhada do trânsito intracelular de anticorpos utilizando microscopia eletrónica.
As células U87MG.A2-7 foram cultivadas em lâminas de câmara revestidas com gelatina (Nunc, Naperville, IL) até 80% da confluência e em seguida lavadas com DMEM gelado. As células foram em seguida incubadas com mAb806 ou o anticorpo DH8.3 em DMEM durante 45 min, a 4 °C. Depois de lavar, as células foram incubadas durante mais 30 min com IgG anti-ratinho conjugada com ouro (partículas de 20 nm) (BBInternational, Cardiff, RU) a 4 °C. Após uma lavagem adicional, foi adicionado DMEM/10% de PCS pré-aguecido às células, as guais foram incubadas a 37 °C durante várias vezes desde 1-60 min. A internalização do anticorpo foi parada por meio gelado e as células fixas com 2,5% de glutaraldeído em PBS/0,1% de HSA e, em seguida, pós-fixas em tetróxido de ósmio a 2,5%. Após desidratação através de uma série graduada de acetona, as amostras foram embutidas em resina de Epon/Araldite, cortadas como secções ultrafinas com um micrótomo Reichert Ultracut-S (Leica) e recolhidas em redes de níguel. As secções foram reveladas com acetato de uranilo e citrato de chumbo antes de serem visualizadas num microscópio eletrónico de transmissão Philips CM 12 a 80 kV. A análise estatística dos grãos de ouro contidos dentro das cavidades revestidas foi realizada utilizando um teste de qui-quadrado.
Enquanto o anticorpo DH8.3 foi internalizado predominantemente via cavidades revestidas, o mAb806 pareceu ser internalizado por macropinocitose (FIG.19). De facto, uma análise detalhada de 32 cavidades revestidas que se formaram nas células incubadas com mAb806 revelou que nenhuma delas continha anticorpo. Em contraste, cerca de 20% de todas as cavidades revestidas das células incubadas com DH8.3 eram positivas para o anticorpo, com um número contendo múltiplos grãos de ouro. Uma análise estatística do número total de grãos de ouro contidos dentro das cavidades revestidas determinou que a diferença era altamente significativa (p < 0,01). Após 20-30 min ambos os anticorpos poderiam ser observados em estruturas que se assemelhavam morfologicamente a lisossomas (FIG.19C). A presença de detritos celulares dentro destas estruturas foi também coerente com a sua natureza lisossómica.
Exemplo 7
Biodistribuição de Anticorpos em Ratinhos Nude Portadores de Tumores A biodistribuição de mAb806 e do anticorpo DH8.3 foi comparada em ratinhos nude contendo xenoenxertos de U87MG por um lado e xenoenxertos de U87MG.A2-7 por outro. Foi escolhido um intervalo de tempo relativamente curto para este estudo já que um relatório anterior demonstrou que o anticorpo DH8.3 apresenta níveis máximos de direcionamento para o tumor entre 4-24 h (Hills et al. (1995) Specific targeting of a mutant, activated EGF receptor found in glioblastoma using a monoclonal antibody. Int. J. Cancer. 63, 537-43).
Foram estabelecidos xenoenxertos de tumores em ratinhos BALB/c nude por injeção s.c. fr 3 χ 106 células de U87MG, U87MG.A2-7 ou A431. A expressão de des2-7 EGFR em xenoenxertos de U87MG.A2-7 permaneceu estável ao longo do período de biodistribuição como medida por imuno-histoquímica em vários pontos no tempo (dados não apresentados). As células A431 retiveram a sua reatividade ao mAb806 quando cultivadas como xenoenxertos de tumores como determinado por imuno-histoquímica. As células U87MG ou A431 foram injetadas de um lado 7-10 dias antes das células U87MG.A2-7 terem sido injetadas do outro lado devido à velocidade de crescimento mais rápida observada para os xenoenxertos que expressam des2-7 EGFR. Os anticorpos foram marcados radioativamente e avaliados quanto à imunorreatividade como descrito acima e foram injetados nos ratinhos pela via retroorbital quando os tumores tinham 100-200 mg de peso. Cada ratinho recebeu dois anticorpos diferentes (2 yg por anticorpo): 2 yCi de mAb8 0 6 marcado com 125I e 2 yCi de DH8.3 ou 52 8 marcado com 131I. A menos que indicado, os grupos de 5 ratinhos foram sacrificados em vários pontos no tempo após injeção e o sangue obtido por punção cardíaca. Os tumores, fígado, baço, rins e pulmões foram obtidos por disseção. Todos os tecidos foram pesados e analisados quanto à atividade de 125I e 131I utilizando uma Janela de contagem de duplo canal. Os dados foram expressos para cada anticorpo como % ID/g de tumor determinada por comparação com os padrões de dose injetados ou convertidos em razões de tumor para sangue/fígado (í. e. % ID/g de tumor dividido pela % ID/g de sangue ou fígado) . As diferenças entre grupos foram analisadas pelo teste t de Student. Após injeção de mAb806 marcado radioativamente, alguns tumores foram fixos em formalina, embutidos em parafina, cortados em secções de 5 pm e em seguida expostos a películas de raios X (AGFA, Mortsel, Bélgica) para determinar a localização do anticorpo por auto-radiografia.
Em termos de % ID/g de tumor, o mAb806 atingiu o seu nível máximo em xenoenxertos de U87MG.A2-7 de 18,6% m/g de tumor às 8 h (FIG.4A), consideravelmente superior a qualquer outro tecido excepto o sangue. Apesar do DH8.3 apresentar também níveis máximos no tumor às 8 h, o nível foi estatisticamente inferior (p < 0,001) 8,8% m/g de tumor em comparação com o mAb806 (FIG.4B). Os níveis de ambos os anticorpos decaíram lentamente às 24 e 48 h. A auto-radiografia de secções de tecido de xenoenxerto de U87MG.A2-7 recolhidas 8 h após injeção com mAb806 marcado com 125I sozinho, ilustra claramente a localização do anticorpo em relação ao tumor viável (FIG. 20). Nenhum dos anticorpos mostrou direcionamento específico para os xenoenxertos de U87MG parental (FIG. 4A e 4B) . No que se refere às razões de tumor para sangue/fígado, o mAb806 apresentou a razão mais alta às 24 h para o sangue (razão de 1,3) e fígado (razão de 6,1) (FIG. 5A e 5B) . O anticorpo DH8.3 teve a sua razão mais alta no sangue às 8 h (razão de 0,38) e às 24 h no fígado (razão de 1,5) (FIG. 5A e 5B), os quais são ambos consideravelmente inferiores aos valores obtidos para o mAb806.
Como descrito acima, os níveis de mAb806 no tumor atingiram um pico às 8 horas. Enquanto este pico é relativamente cedo em comparação com muitos outros anticorpos dirigidos para tumores, ele é completamente coerente com outros estudos que utilizam anticorpos específicos contra o des2-7 EGFR, os quais mostram todos picos às 4-24 horas após injeção quando se utiliza uma dose semelhante de anticorpo (Hills et al. , 1995; Reist et al. , 1997; Reist et al. (1996) Radioiodination of internalizing monoclonal antibodies using N-succinimidyl 5-iodo-3-pyridinecarboxylate. Cancer Res. 56, 4970-7). De facto, ao contrário dos relatórios anteriores, o ponto no tempo de 8 h foi incluído no pressuposto de que o direcionamento do anticorpo atingiria rapidamente um pico. A % ID/g de tumor observada com o mAb806 foi semelhante à relatada para outros anticorpos específicos contra o des2-7 EGFR quando se utilizam técnicas de iodação convencionais (Hills et al. , 1995; Huang et al. , 1997; Reist et al. (1995) Tumour-specific anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibodies: use of the tyramine-cellobiose radioiodination method enhances cellular retention and uptake in tumour xenografts. Cancer Res. 55, 4375-82) . A razão para o pico cedo é provavelmente dupla. Primeiro, os tumores que expressam o des2-7 EGFR, incluindo as células U87MG transfetadas, crescem de forma extremamente rápida como xenoenxertos de tumores. Assim, mesmo durante o intervalo de tempo relativamente curto utilizado nestes estudos de biodistribuição, o tamanho do tumor aumenta de tal modo (aumento de 5-10 vezes em massa ao longo de 4 dias) que a % ID/g de tumor é reduzida em comparação com tumores de crescimento lento. Segundo, enquanto a internalização do mAb806 foi relativamente lenta em comparação com o DH8.3, continua a ser rápida em relação a muitos outros sistemas anticorpo contra tumores/antigénio. Os anticorpos internalizados sofrem proteólise rápida com os produtos de degradação a serem excretados da célula (Press et al. (1990) Inhibition of catabolism of radiolabeled antibodies by tumor cells using lysosomotropic amines and carboxylic ionophores. Cancer Res. 50, 1243-50). Este processo de internalização, degradação e excreção reduz a quantidade de anticorpo iodado retido dentro da célula. Consequentemente, os anticorpos de internalização apresentam níveis mais baixos de direcionamento do que os seus homólogos não internalizados. Os dados de microscopia eletrónica aqui descritos demonstram que o mAb806 internalizado é rapidamente transportado para os lisossomas onde ocorre presumivelmente degradação rápida. Esta observação é coerente com a expulsão rápida de iodo a partir da célula. O anticorpo monoclonal L8A4 anteriormente descrito dirigido ao péptido da junção única presente no des2-7 EGFR, comporta-se de um modo semelhante ao mAb806 (Reist et al. (1997) In vitro and in vivo behavior of radiolabeled chimeric anti-EGFRvIII monoclonal antibody: comparison with its murine parent. Nucl. Med. Biol. 24, 639-47). Utilizando células U87MG transfetadas com o des2-7 EGFR, este anticorpo tinha uma taxa de internalização semelhante (35% à 1 hora em comparação com 30% à 1 hora para o mAb806) e apresentava direcionamento in vivo comparável quando se utilizam fibroblastos 3T3 transfetados com des2-7 EGFR (pico de 24% ID/g de tumor às 24 horas em comparação com 18% ID/g de tumor às 8 horas para o mAb806) (Reist et al. (1997) Improved targeting of an anti-epidermal growth factor receptor variant III monoclonal antibody in tumour xenografts after labelling using N-succinimidyl 5-iodo-3-pyridinecarboxylate. Cancer Res. 57, 1510-5).
Curiosamente, a retenção deste anticorpo in vivo em xenoenxertos de tumores foi aumentada quando marcado com 5-iodo-3-piridinacarboxilato de N-succinimidilo (Reist et al. , 1997). Este grupo protético marcado está carregado positivamente ao pH lisossómico e tem, por isso, retenção celular aumentada (Reist et al. (1996) Radioiodination of internalizing monoclonal antibodies using N-succinimidyl 5-iodo-3-pyridinecarboxylate. Cancer Res. 56, 4970-7). O aumento da retenção é potencialmente útil quando se considera um anticorpo para radioimunoterapia e este método poderia ser utilizado para melhorar a retenção do mAb806 iodado ou seus fragmentos.
Exemplo 8
Ligação de mAb806 a Células Contendo EGFR Amplificado
Para examinar se o mAb806 poderia reconhecer o EGFR expresso em células contendo um gene de recetor amplificado, foi analisada a sua ligação a células A431. Como anteriormente descrito, as células A431 são células de carcinoma escamoso humano e expressam níveis altos de tsEGFR. Foi observada ligação baixa, mas altamente reprodutível, do mAb806 às células A431 através de análise por FACS (FIG.6). O anticorpo DH8.3 não ligou as células A431, o que indica que a ligação do mAb806 não resultou da expressão de baixo nível de des2-7 EGFR (FIG.6). Como esperado, o anticorpo 528 anti-EGFR apresentou forte revelação das células A431 (FIG.6). Dado este resultado, a ligação do mAb806 a A431 foi caracterizada através de análise de Scatchard. Apesar da ligação do mAb806 iodado ser comparativamente baixa, foi possível obter dados coerentes para
Scatchard. A média de três dessas experiências deu um valor para a afinidade de 9,5 χ 107 M_1 com 2,4 χ 105 recetores por célula. Assim, a afinidade para este recetor foi cerca de 10 vezes inferior à afinidade para o des2-7 EGFR. Além disso, o mAb806 parece reconhecer apenas uma pequena porção do EGFR presente na superfície das células A431. O anticorpo 528 mediu aproximadamente 2 χ 106 recetores por célula, o que está de acordo com numerosos outros estudos (Santon et al. (1986) Effects of epidermal growth factor receptor concentration on tumorigenicity of A431 cells in nude mice. Cancer Res. 46, 4701-5) .
Para garantir que estes resultados não se restringiam apenas à linha de células A431, a reatividade do mAb806 foi examinada em 2 outras linhas de células que apresentam amplificação do gene de EGFR. As linha de células da cabeça e pescoço HN5 (Kwok TT e Sutherland RM (1991) Differences in EGF related radiosensitisation of human squamous carcinoma cells with high and low numbers of EGF recetors. Br. J. Cancer. 64, 251-4) e a linha de células de cancro da mama MDA-468 (Filmus et al. (1985) MDA-468, a human breast Cancer Cell line with a high number of epidermal growth factor (EGF) receptors, has an amplified EGF recetor gene and is growth inhibited by EGF. Biochem. Blophys. Res. Commun. 128, 898-905) têm sido referidas como contendo múltiplas cópias do gene de EGFR. Coerente com estes relatórios, o anticorpo 528 apresentou revelação intensa de ambas as linhas de células (FIG.21) . Como com a linha de células A431, o mAb806 revelou claramente ambas as linhas de células mas a um nível mais baixo do que o observado com o anticorpo 528 (FIG.21). Assim, a ligação do mAb806 não se restringe apenas às células A431 mas parece ser uma observação geral para as células que contêm amplificação do gene de EGFR. 0 reconhecimento do sEGFR de tipo selvagem pelo mAb806 requer claramente alguma desnaturação do recetor para expor o epitopo. A extensão da desnaturação necessária é apenas ligeira, já que até mesmo a absorção do sEGFR de tipo selvagem sobre uma superfície plástica induziu ligação robusta do mAb806 em ensaios ELISA. Uma vez que o mAb806 ligou apenas, aproximadamente, 10% do EGFR na superfície das células A431, é tentador especular que este subconjunto de recetores pode ter uma conformação alterada semelhante à induzida pelo truncamento des2-7 EGFR. De facto, a expressão extremamente alta do EGFR mediada pela amplificação do gene em células A431 pode fazer com que alguns recetores sejam incorretamente processados conduzindo a conformação alterada. Curiosamente, a imunotransferência semiquantitativa de Usados das células A431 com mAb806 mostrou que este poderia reconhecer a maioria dos recetores EGF das A431 após SDS-PAGE e transferência de Western. Este resultado suporta ainda mais o argumento de que o mAb806 se liga a um subconjunto de recetores na superfície das células A431 que têm uma conformação alterada. Estas observações nas células A431 são coerentes com os dados de imuno-histoquímica que demonstram que o mAb806 liga gliomas que contêm amplificação do gene de EGFR. Uma vez que a ligação do mAb806 foi completamente negativa em células U87MG parentais, pareceria que este fenómeno poderia estar restringido às células contendo EGFR amplificado, apesar do nível de recetor "desnaturado" na superfície das células U87MG poder situar-se abaixo do nível de deteção. No entanto, isto parece improvável já que o mAb806 iodado não se ligou aos sedimentos de células U87MG contendo até 1 χ 107 células.
Exemplo 9
Abordagem in vivo de Células A431 pelo mAb806
Foi realizado um segundo estudo de biodistribuição com o mAb806 para determinar se pode visar xenoenxertos de tumor A431. 0 estudo foi realizado ao longo de um intervalo de tempo mais prolongado para se obter mais informação relativamente à abordagem de xenoenxertos de U87MG.A2-7 pelo mAb806, os quais foram incluídos em todos os ratinhos como um controlo positivo. Além disso, o anticorpo 528 anti-EGFR foi incluído como um controlo positivo para os xenoenxertos de A431, uma vez que um estudo anterior demonstrou um direcionamento baixo, mas significativo deste anticorpo para células A431 cultivadas em ratinhos nude (Masui et al. (1984) Growth inhibition of human tumour cells in athymic mice by anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies. Cancer Res. 44, 1002-7).
Durante as primeiras 48 h, o mAb806 apresentou propriedades de direcionamento quase idênticas àquelas observadas nas experiências iniciais (FIG.7A em comparação com a FIG.4A). Em termos de % ID/g de tumor, os níveis de mAb806 em xenoenxertos de U87MG.A2-7 declinaram lentamente após 24 h, mas permaneceram sempre superiores aos níveis detetados no tecido normal. A captação nos xenoenxertos de A431 foi comparativamente baixa, contudo houve um pequeno aumento na % ID/g de tumor durante as primeiras 24 h não observado em tecidos normais, tais como fígado, baço, rim e pulmão (FIG. 7A) . A captação do anticorpo 528 foi muito baixa em ambos os xenoenxertos quando expressa como % ID/g de tumor (FIG. 7B) , em parte devido à eliminação mais rápida deste anticorpo a partir do sangue. A auto-radiografia de secções de tecido do xenoenxerto de A431 recolhidas 24 h após injeção com mAb806 marcado com 125I sozinho, ilustra claramente a localização do anticorpo no tumor viável em torno da periferia do tumor e não nas áreas centrais de necrose (FIG. 23) . Em termos de razão de tumor para sangue, o mAb806 atingiu um pico às 72 h para os xenoenxertos de U87MG.A2-7 e às 100 h para os xenoenxertos de A431 (FIG. 8A, B). Apesar da razão de tumor para sangue para o mAb806 nunca ter ultrapassado o 1,0 em relação ao tumor A431, aquela aumentou ao longo de todo o intervalo de tempo (FIG. 8B) e foi superior a todos os outros tecidos examinados (dados não apresentados) o que indica níveis baixos de direcionamento. A razão de tumor para sangue para o anticorpo 528 mostrou um perfil semelhante ao mAb806, embora tenham sido observados níveis mais altos nos xenoenxertos de A431 (FIG.8A, B). O mAb806 teve uma razão de tumor para fígado máxima nos xenoenxertos de U87MG.A2-7 de 7,6 às 72 h, demonstrando claramente a captação preferencial nestes tumores em comparação com o tecido normal (FIG. 8C) . As outras razões de tumor para órgão para o mAb806 foram semelhantes às observadas no fígado (dados não apresentados). A razão de tumor para fígado máxima para o mAb806 em xenoenxertos A431 foi de 2,0 às 100 h, indicando novamente uma captação preferencial ligeira pelo tumor em comparação com o tecido normal (FIG. 8D) .
Exemplo 10
Estudos de Terapia
Os efeitos do mAb806 foram avaliados em dois modelos de xenoenxerto de doença - um modelo preventivo e um modelo de tumor estabelecido.
Modelos de Xenoenxerto
Coerente com relatórios anteriores (Nishikawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91(16), 7727-7731), as células U87MG transfetadas com des2-7 EGFR cresceram mais rapidamente do que as células parentais e as células U87MG transfetadas com o tsEGFR. Por conseguinte, não foi possível crescer ambos os tipos de células nos mesmos ratinhos. Células tumorais (3 χ 106) em 100 mL de PBS foram inoculadas por via subcutânea em ambos os flancos de ratinhos nude fêmeas com 4-6 semanas de idade (Animal Research Centre, Western Australia, Austrália). A eficácia terapêutica do mAb806 foi investigada nos modelos preventivo e de tumor estabelecido. No modelo preventivo, 5 ratinhos com dois xenoenxertos cada foram tratados por via intraperitoneal com 1 ou 0,1 mg de mAb806 ou veículo (PBS) começando no dia antes da inoculação com células tumorais. O tratamento foi prosseguido durante um total de 6 doses, 3 vezes por semana durante 2 semanas. No modelo estabelecido, o tratamento foi começado quando os tumores tinham atingido um volume médio de 65 ± 6,42 mm3 (U87MG.Δ2-7), 84 ± 9,07 mm3 (U87MG) , 73 ± 7,5 mm3 (U87MG. tsEGFR) ou 201 ± 19,09 mm3 (tumores A431). 0 volume tumoral em mm3 foi determinado utilizando a fórmula (comprimento χ largura2)/2, onde o comprimento foi o eixo mais comprido e a largura a medição em ângulos rectos ao comprimento (Clark et ai. (2000) Therapeutic efficacy of anti-Lewis (y) humanized 3S 193 radioimmunotherapy in a breast cancer model: enhanced ativity when combined with Taxol chemotherapy. Clin. Cancer Res. 6, 3621-3628) . Os dados foram exprimidos como o volume tumoral médio ± E.P. para cada grupo de tratamento. A análise estatística foi realizada em determinados pontos no tempo utilizando o teste t de Student. Os animais foram sacrificados quando os xenoenxertos atingiram um volume aproximado de 1,5 cm3 e os tumores excisados durante o exame histológico. Este projeto de investigação foi aprovado pelo Animal Ethics Committee do Austin and Repatriation Medical Centre .
Exame Histológico dos Xenoenxertos de Tumores
Os xenoenxertos foram excisados e bissectados. Metade foi fixa em 10% de formalina/PBS antes de ser embutida em parafina. Foram em seguida cortadas quatro secções micrométricas e reveladas com hematoxilina e eosina (H&amp;E) para exame histológico de rotina. A outra metade foi embutida em composto Tissue Tek® OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA), congelada em azoto líquido e conservada a -80 °C. Foram cortadas secções criostáticas finas (5 micron) e fixas em acetona gelada durante 10 min, seguida de secagem ao ar durante mais 10 min. As secções foram bloqueadas no reagente de bloqueio de proteínas (Lipshaw Immunon,
Pittsburgh E.U.A.) durante 10 min e em seguida incubadas com anticorpo primário biotinilado (1 mg/mL), durante 30 min à temperatura ambiente (TA). Todos os anticorpos foram biotinilados utilizando o ECL módulo de biotinilação de proteínas (Amersham, Baulkham Hills, Austrália) , de acordo com as instruções do fabricante. Depois de lavar com PBS, as secções foram incubadas com um complexo de estreptavidina e peroxidase de rábano-silvestre durante mais 30 min (Silenus, Melbourne, Austrália) . Após uma lavagem final com PBS, as secções foram expostas ao substrato 3-amino-9-etilcarbozole (AEC) (ácido acético 0,1 M, acetato de sódio 0,1 M, AEC 0,02 M (Sigma
Chemical Co., St Louis, MO)) na presença de peróxido de hidrogénio durante 30 min. As secções foram lavadas com água e submetidas a revelação de contraste com hematoxilina durante 5 min e montadas.
Eficácia do mAb806 no Modelo Preventivo
O mAb806 foi examinado quanto à eficácia contra os tumores U87MG e U87MG.A2-7 num modelo preventivo de xenoenxerto. O anticorpo ou veículo foi administrado i.p. no dia anterior à inoculação do tumor e foi administrado 3 vezes por semana durante 2 semanas. O mAb806 não teve qualquer efeito no crescimento de xenoenxertos de U87MG parental, os quais expressam o tsEGFR, a uma dose de 1 mg por injeção (FIG.9A) . Em contrapartida, o mAb806 inibiu significativamente o crescimento de xenoenxertos de U87MG.A2-7 de uma maneira dependente da dose (FIG.9B). No dia 20, quando os animais de controlo foram sacrificados, o volume tumoral médio era de 1637 ± 178,98 mm3 para o grupo de controlo, um estatisticamente mais pequeno 526 ± 94,74 mm3 para o grupo de injeção de 0,1 mg (p < 0,0001) e 197 ± 42,06 mm3 para o grupo de injeção de 1 mg (p < 0,0001). Os grupos de tratamento foram sacrificados no dia 24, altura em que os volumes tumorais médios eram de 1287 ± 243,03 mm3 para o grupo tratado com 0,1 mg e 492 ± 100,8 mm3 para o grupo de 1 mg.
Eficácia do mAb806 no Modelo de Xenoenxerto Estabelecido
Dada a eficácia do mAb806 no modelo preventivo de xenoenxerto foi então examinada a sua aptidão para inibir o crescimento de xenoenxertos de tumores estabelecidos. O tratamento com anticorpo foi como descrito no modelo preventivo, exceto que foi iniciado quando tumores tinham atingido um volume tumoral médio de 65 ± 6,42 mm3 para os xenoenxertos de U87MG.A2-7 e 84 ± 9,07 mm3 para os xenoenxertos de U87MG parental. Mais uma vez, o mAb806 não teve qualquer efeito no crescimento de xenoenxertos de U87MG parental a uma dose de 1 mg por injeção (FIG. 10A) . Em contraste, o mAb806 inibiu significativamente o crescimento de xenoenxertos de U87MG.A2-7 de uma maneira dependente da dose (FIG. 10B) . No dia 17, um dia antes dos animais de controlo terem sido sacrificados, o volume tumoral médio era de 935 ± 215,04 mm3 para o grupo de controlo, 386 ± 57,51 mm3 para o grupo de 0,1 mg por injeção (p < 0,01) e 217 ± 58,17 mm3 para o grupo de injeção de 1 mg (p < 0,002).
Para examinar se a inibição de crescimento observado com o mAb806 se restringia às células que expressam des2-7 EGFR, foi examinada a sua eficácia contra xenoenxertos de tumor U87MG.tsEGFR num modelo estabelecido. Estas células servem como um modelo para tumores que contêm amplificação do gene de EGFR sem a expressão de des2-7 EGFR. O tratamento com mAb806 foi iniciado quando os tumores tinham atingido um volume tumoral médio de 73 ± 7,5 mm3. 0 mAb806 inibiu significativamente o crescimento de xenoenxertos de U87MG.tsEGFR estabelecidos quando comparado com tumores de controlo tratados com veiculo (FIG.10C) . No dia em que os animais de controlo foram sacrificados, o volume tumoral médio era de 960 ± 268,9 mm3 para o grupo de controlo e 468 ± 78,38 mm3 para o grupo tratado com injeções de 1 mg (p < 0,04).
Análise Histológica e Imuno-histoguimica de Tumores Estabelecidos
Para avaliar as diferenças histológicas potenciais entre xenoenxertos de U87MG.A2-7 e U87MG.tsEGFR de controlo e tratados com mAb806 (recolhidos nos dias 24 e 42, respetivamente), secções fixas em formalina, embutidas em parafina foram reveladas com H&amp;E. Foram observadas áreas de necrose nas secções de xenoenxertos de U87MG.A2-7 (recolhidos 3 dias depois do tratamento ter terminado) e U87MG.tsEGFR (recolhidos 9 dias depois do tratamento ter terminado) tratados com mAb806. Este resultado foi consistentemente observado num número de xenoenxertos de tumores (n=4). No entanto, a análise de secções de xenoenxertos tratados com controlo não apresentam as mesmas áreas de necrose observadas com o tratamento com mAb806. Secções de xenoenxertos de U87MG tratados com controlo ou mAb806 foram também reveladas com H&amp;E e revelaram que não há qualquer diferença na viabilidade das células entre os dois grupos, apoiando ainda mais a hipótese de que a ligação do mAb806 induz uma diminuição da viabilidade/necrose celular nos xenoenxertos de tumores.
Foi realizada uma análise imuno-histoquímica de secções de xenoenxertos de U87MG, U87MG.A2-7 e U87MG.tsEGFR para determinar os níveis de expressão de des2-7 e tsEGFR após tratamento com mAb806. Foram recolhidas secções nos dias 24 e 42 como acima, e foram imunorreveladas com os anticorpos 528 ou 806. Como esperado, o anticorpo 528 revelou todas as secções de xenoenxerto sem qualquer diminuição evidente da intensidade entre os tumores tratados e de controlo. A revelação de secções de U87MG não foi detetável com o mAb806, contudo foi observada revelação positiva de secções de xenoenxerto de U87MG.A2-7 e U87MG.tsEGFR. Não houve qualquer diferença na densidade de revelação do mAb806 entre os xenoenxertos de U87MG.A2-7 e U87MG.tsEGFR de controlo e tratados o que sugere que o tratamento com anticorpo não regula negativamente a expressão de des2-7 ou tsEGFR.
Tratamento de Xenoenxertos de A431 com mAb806
Para demonstrar que os efeitos antitumorais do mAb806 não se restringiam às células U87MG, o anticorpo é administrado a ratinhos com xenoenxertos de A431. Estas células contêm um gene de EGFR amplificado e expressam aproximadamente 2 χ 106 recetores por célula. Como descrito acima, o mAb806 liga cerca de 10% destes EGFR e visa os xenoenxertos de A431. O mAb806 inibiu significativamente o crescimento de xenoenxertos de A431 quando examinados no modelo preventivo de xenoenxerto anteriormente descrito (FIG.11A). No dia 13, quando animais de controlo foram sacrificados, o volume tumoral médio foi de 1385 ± 147,54 mm3 no grupo de controlo e 260 ± 60,33 mm3 para o grupo de tratamento de injeção de 1 mg (p < 0,0001).
Numa experiência separada, uma dose de 0,1 mg de mAb inibiu também significativamente o crescimento de xenoenxertos de A431 num modelo preventivo.
Dada a eficácia do mAb806 no modelo de xenoenxerto de A431 preventivo foi examinada a sua aptidão para inibir o crescimento de xenoenxertos de tumores estabelecidos. O tratamento com anticorpo foi como descrito no modelo preventivo exceto que não foi iniciado até os tumores terem atingido um volume tumoral médio de 201 ± 19,09 mm3. O mAb806 inibiu significativamente o crescimento de xenoenxertos de tumores estabelecidos (FIG.11B). No dia 13, quando os animais de controlo foram sacrificados, o volume tumoral médio era de 1142 ± 120,06 mm3 para o grupo de controlo e 451 ± 65,58 mm3 para o grupo de injeção de 1 mg (p < 0, 0001) .
Em resumo, os estudos de terapia com mAb806 aqui descritos demonstrado claramente inibição dependente da dose do crescimento do xenoenxerto de U87MG.A2-7. Em contrapartida, não foi observada qualquer inibição dos xenoenxertos de U87MG parental apesar de continuarem a expressar o tsEGFR in vivo. O mAb806 não só reduziu significativamente o volume do xenoenxerto, como induziu também necrose significativa dentro do tumor. Este é o primeiro relatório que mostra a utilização terapêutica bem-sucedida de um tal anticorpo in vivo contra xenoenxertos de gliomas que expressam des2-7 EGFR humano. A amplificação do gene de EGFR foi relatada num número de tumores diferentes e é observada em, aproximadamente, 50% dos gliomas (Voldberg et ai., 1997). Foi proposto que a sobreexpressão posterior de EGFR mediada pela amplificação do gene do recetor pode conferir uma vantagem de crescimento ao aumentar a sinalização intracelular e crescimento de células (Filmus et al. , 1987) . A linha de células U87MG foi transfetada com o tsEGFR a fim de produzir uma célula de glioma que mimetiza o processo de amplificação do gene de EGFR. 0 tratamento de xenoenxertos de U87MG.tsEGFR estabelecidos com mAb806 resultou em inibição significativa do crescimento. Assim, o mAb806 também medeia a atividade antitumoral in vivo contra células contendo a amplificação do gene de EGFR. Curiosamente, a inibição dos xenoenxertos de U87MG.tsEGFR pelo mAb806 parece ser menos eficaz do que a observada com tumores U87MG.A2-7. Provavelmente, isto reflete o facto de o mAb806 ter uma afinidade inferior para o EGFR amplificado e apenas ligas uma pequena proporção de recetores expressos na superfície celular. No entanto, deve referir-se que apesar do pequeno efeito nos volumes dos xenoenxertos de U87MG.tsEGFR, o tratamento com mAb806 produziu grandes áreas de necrose dentro destes xenoenxertos. A fim de excluir a possibilidade de que o mAb806 medeia apenas a inibição das linhas de células derivadas de U87MG, a requerente testou a sua eficácia contra xenoenxertos de A431. Esta linha de células derivada de carcinoma de células escamosas contém amplificação significativa do gene de EGFR que é retida in vitro e in vivo. 0 tratamento de xenoenxertos de A431 com mAb806 produziu inibição significativa do crescimento num modelo preventivo e estabelecido, o que indica que os efeitos antitumorais do mAb806 não se restringem às linhas de células U87MG transfetadas.
Exemplo 11
Tratamento com Terapia de Associação de Xenoenxertos de A431 com mAb806 e AG1478
Os efeitos antitumorais do mAb806 combinado com AG1478 foram testados em ratinhos com xenoenxertos de A431. 0 AG1478 (4-(3-Cloroanilino)-6,7-dimetoxiquinazolina) é um inibidor potente e seletivo da EGFR-cinase versus a cinase do HER2-neu e do recetor do fator de crescimento derivado de plaquetas (Calbiochem Cat. N° 658552). Foram incluídos três controlos: tratamento com veículo apenas, veículo + mAb806 apenas, e veículo + AG1478 apenas. Os resultados são ilustrados na FIG. 12. Foi administrado 0,1 mg de mAb806 no dia 1 antes do xenoenxerto e nos dias 1, 3, 6, 8 e 10 após o xenoenxerto. Foi administrado 400 pg de AG1478 nos dias 0, 2, 4, 7, 9 e 11 após xenoenxerto. O AG1478 e o mAb806, quando administrados sozinhos, produziram uma redução significativa do volume tumoral. No entanto, em associação, a redução de volume tumoral foi muito aumentada.
Além disso, a ligação de mAb806 ao EGFR de células A431 foi avaliado na ausência e presença de AG1478. As células foram colocadas em meios isentos de soro de um dia para o outro, em seguida tratadas com AG1478 durante 10 min a 37 °C, lavada duas vezes em PBS, em seguida submetidas a lise em 1% de Triton e os lisados preparados por centrifugação durante 10 min a 12000 g. O lisado foi em seguida avaliado quanto à reatividade para o 806 por um ELISA numa versão modificada de um ensaio descrito por
Schooler e Wiley, Analytical Biochemistry 277, 135-142 (2000).
As placas foram revestidas com 10 yg/mL de mAb806 em PBS/EDTA de um dia para o outro à temperatura ambiente e em seguida lavadas duas vezes. As placas foram então bloqueadas com 10% de albumina de soro/PBS durante 2 horas a 37 °C e lavadas duas vezes. Foi adicionado um lisado celular a 1:20 em 10% de albumina de soro/PBS, durante 1 hora, a 37 °C, em seguida lavado quatro vezes. Anti-EGFR (SC-03; Santa Cruz Biotechnology Inc.) em 10% de albumina de soro/PBS foi feito reagir durante 90 min à temperatura ambiente, a placa lavada quatro vezes e foi adicionado anti-coelho-HRP (1:2000 da Silenus) em 10% de albumina de soro/PBS durante 90 min à temperatura ambiente, lavada quatro vezes e desenvolvida cor utilizando ABTS como um substrato. Verificou-se que a ligação do mAb806 é significativamente aumentada na presença de quantidades crescentes de AG1478 (FIG.13).
Exemplo 12
Imunorreatividade em Glioblastomas Humanos Pré-Tipifiçados Quanto ao Estado de EGFR
Dada a alta incidência de expressão, amplificação e mutação de EGFR em glioblastomas foi realizado um estudo imuno-histoquímico detalhado a fim de avaliar a especificidade do 806 em tumores diferentes de xenoenxertos. Um painel de 16 glioblastomas foi analisado por imuno-histoquímica. Este painel de 16 glioblastomas foi pré-tipifiçado por RT-PCR quanto à presença de EGFR de tipo selvagem amplificado e expressão de des2-7 EGFR. Seis destes tumores expressavam apenas o transcrito de tsEGFR, 10 tinham amplificação do gene de tsEGFR com 5 destes a apresentar apenas transcritos de EGFR de tipo selvagem e 5 transcritos do gene de EGFR de tipo selvagem e des2-7. A análise imuno-histoquímica foi realizada utilizando secções de 5 mm de tecido congelado de fresco aplicado em lamelas de histologia e fixos durante 10 minutos em acetona fria. O anticorpo primário ligado foi detetado com anticorpo anti-ratinho de cavalo biotinilado, seguido de uma reação com o complexo de avidina-biotina. O tetracloridrato de diaminobenzidina (DAB) foi utilizado como cromogénio. A extensão da imuno-historreatividade química nos tecidos foi estimada por microscopia óptica e classificada de acordo com o número de células imunorreativas em incrementos de 25% como se segue:
Focal = menos de 5%
O anticorpo 528 apresentou reatividade intensa em todos os tumores, enquanto a imunorrevelação com DH8.3 se restringiu àqueles tumores que expressam o des2-7 EGFR (Tabela 2) . Coerente com as observações anteriores em FACS e ensaios de roseta, o mAb806 não reagiu com os glioblastomas que expressam o transcrito de tsEGFR a partir dos genes de EGFR não amplificados (Tabela 2) . Este padrão de reatividade para o mAb806 é semelhante ao observado nos estudos de xenoenxerto e sugere novamente que este anticorpo reconhece o des2-7 e EGFR amplificado, mas não o tsEGFR quando expresso na superfície celular.
Tabela 2
Imunorreatividade de mAbs528. DH8.3 e 806 em glioblastomas pré-tipifiçados quanto à presença de EGFR de tipo selvagem e des2-7 EGFR mutado e quanto ao seu estado de amplificação
Exemplo 13
Imunorreatividade de EGFR em Tecido Normal A fim de determinar se o des2-7 EGFR é expresso em tecido normal foi realizado um estudo imuno-histoquímico com mAb806 e DH8.3 num painel de 25 tecidos. Não houve imunorreatividade forte com mAb806 ou DH8.3 em qualquer tecido testado, o que sugere que o des2-7 EGFR está ausente em tecidos normais (Tabela 3). Houve alguma revelação variável presente nas amígdalas com mAb806 que se restringiu à camada de células basais da epiderme e células escamosas do epitélio da mucosa. Na placenta foi observada imunorrevelação ocasional do epitélio do trofoblasto. Curiosamente, dois tecidos que expressam níveis endógenos elevados de tsEGFR, o fígado e pele, falharam em apresentar qualquer reatividade mAb806 significativa. Não foi observada de todo qualquer reatividade com as amostras de fígado e foi apenas detetada ocasionalmente reatividade focal fraca e inconsistente (em não mais do que 10% de todas as amostras estudadas) nos queratinócitos basais de amostras de pele e no epitélio escamoso da mucosa da amígdala, demonstrando adicionalmente que este anticorpo não se liga ao tsEGFR expresso na superfície de células em qualquer grau significativo (Tabela 3). Todos os tecidos foram positivos para o tsEGFR como evidenciado pela revelação universal observada com o anticorpo 528 (Tabela 3).
Tabela 3
Reatividade de 582. DH8.3 e 806 em tecidos normais
(continuação)
Exemplo 14
Imunorreatividade de EGFR em Vários Tumores 0 grau de des2-7 EGFR noutros tipos de tumores foi examinado utilizando um painel de 12 malignidades diferentes. 0 anticorpo 528 apresentou frequentemente revelação homogénea em muitos tumores analisados exceto no melanoma e seminoma. Quando presente, a imunorreatividade de DH8.3 restringiu-se às células tumorais focais ocasionais, o que indica que há pouca, se é que alguma, expressão de des2-7 EGFR em tumores fora do cérebro utilizando este sistema de deteção (Tabela 4). Houve também revelação focal de vasos sanguíneos e uma revelação difusa variável do tecido conjuntivo com o anticorpo DH8.3 em alguns tumores (Tabela 4). Esta revelação foi fortemente dependente da concentração de anticorpo utilizada e foi considerada reatividade de fundo não específica. 0 mAb806 apresentou revelação positiva em 64% dos tumores da cabeça e pescoço e 50% dos carcinomas do pulmão (Tabela 4) . Houve pouca reatividade do mAb806 nos outros locais, exceto nos tumores urinários que foram positivos em 30% dos casos.
Uma vez que os cancros da cabeça e pescoço e do pulmão foram negativos para o anticorpo DH8.3, a reatividade observada com o mAb nestes tumores pode estar associada à amplificação do gene de EGFR.
Tabela 4
Anticorpos monoclonais 528, DH8.3 e 806 no painel de tumores
Exemplo 15
Imunorreatividade em Glioblastomas Humanos Não selecionados Quanto ao Estado do EGFR A fim de confirmar a especificidade única e para avaliar a reatividade do mAb806, este foi comparado com os anticorpos 528 e DH8.3 num painel de 46 glioblastomas não pré-selecionados quanto ao estado do seu EGFR. 0 anticorpo 528 foi forte e homogeneamente positivo em todas as amostras excepto duas (N° 27 e 29) (44/46, 95, 7%) . Estes dois casos foram também negativos para o mAb806 e o mAbDH8.3. 0 mAb806 foi positivo em 27/46 (58,7%) casos, 22 dos quais apresentaram imunorreatividade homogénea em mais do que 50% do tumor. O anticorpo DH8.3 foi positivo em 15/46 (32,6%) glioblastomas, 9 dos quais apresentaram imunorreatividade homogénea. A revelação imunoquímica destes tumores não selecionados é indicada na Tabela 5.
Houve concordância entre o mAb806 e o DH8.3 em todos os casos excepto um (N° 35) . Uma análise molecular para a presença de amplificação de EGFR foi efectuada em 44 casos (Tabela 5) . Destes, 30 casos co-tipifiçaram com o padrão de imunorreatividade do mAb806 anteriormente estabelecido: e. g., 16 casos negativos para mAb806 não revelaram qualquer amplificação do EGFR e 14 casos com amplificação do EGFR foram também imunopositivos para mAb806. No entanto, 13 casos que apresentaram imunorreatividade para 806 foram negativos para a amplificação de EGFR, enquanto um caso com amplificação de EGFR foi negativo para o mAb806. Uma análise adicional do estado de mutação destes casos de amplificação negativa e positivos para 806 é descrita abaixo e proporciona uma explicação para a maioria dos 13 casos que foram negativos para a amplificação de EGFR, mas foram reconhecidos pelo 806.
Subsequentemente foi realizada uma análise molecular da mutação por supressão por RT-PCR em 41/46 casos (Tabela 5) . Destes, 34 cases co-tipifiçaram com o DH8.3 especifico para a mutação por supressão: 12 casos foram positivos na RT-PCR e imuno-histoquímica e 22 casos foram negativos/negativos. Três casos (N° 2, N° 34 e N° 40) foram positivos para DH8.3/negativos por RT-PCR para a mutação por supressão e três casos (N° 12, N° 18 e N° 39) foram negativos para DH8.3/positivos por RT-PCR. Como esperado com base na nossa análise de especificidade anterior, foi observada imunorreatividade para o mAb806 em todos os tecidos positivos para DH8.3 exceto num caso (N° 35). O caso N° 3 também revelou uma mutação (designada A2 na Tabela 5) , a qual incluia as sequências da mutação des2-7 mas não parecia ser a supressão des2-7 clássica com perda de 801 bases (dados não apresentados) . Este caso foi negativo para a reatividade com DH8.3 mas apresentou reatividade com 806, o que indica que o 806 pode reconhecer uma mutação adicional e possivelmente única do EGFR.
Tabela 5
Análise Imuno-histoquímica de 46 Glioblastomas Não selecionados com os mAbs 528, 806, e DH8.3
(continuação)
(continuação)
A reatividade do anticorpo 806 co-tipificou com EGFR amplificado ou mutante des2-7 em 19/27 ou mais do que 70% dos casos. É notável que 2 destes 8 casos foram também reativos com DH8.3.
Exemplo 16
Tratamento Sistémico e Análise de Tumores de Gliomas Intracranianos
Para testar a eficácia do anticorpo monoclonal anti-AEGFR, mAb806, a requerente tratou ratinhos nude portadores de xenoenxertos de gliomas que sobreexpressam AEGFR intracranianos com injeções intraperitoneais de mAb806, IgG de controlo de isotipo ou PBS.
Uma vez que os explantes primários de glioblastomas humanos perdem rapidamente a expressão de recetores rearranjados, amplificados em cultura, nenhuma das linhas de células de glioblastomas existentes exibem essa expressão. Para forçar a manutenção de níveis de expressão comparáveis àqueles observados em tumores humanos, células U87MG, LN-Z308 e A1207 (oferta de Dr. S. Aaronson, Mount Sinai Medical Center, New York, NY) foram infectadas com vírus com AEGFR, AEGFR deficiente em cinase (DK) ou EGFR de tipo selvagem (tsEGFR), os quais também conferiram resistência ao G418 como anteriormente descrito (Nishikawa et ai. (1994) A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 7727-7731).
Populações que expressam níveis semelhantes dos vários alelos de EGFR (estes níveis de expressão correspondem aproximadamente a um nível de amplificação de 25 cópias do gene; os glioblastomas humanos têm tipicamente níveis de amplificação desde 10 a 50 cópias do gene do recetor truncado) foram selecionadas por FACS como anteriormente descrito (Nishikawa et al. , 1994) e designadas como U87MG.AEGFR, U87MG.DK, U87MG.tsEGFR, LN-Z308.AEGFR, LN-Z308.DK, LN-Z30 8.tsEGFR, A1207.AEGFR, A1207.DK e A1207.tsEGFR, respetivamente. Cada uma foi mantida em meio contendo G418 (linhas de células U87MG, 400 pg/mL; linhas de células LN-Z308 e A1207, 800 pg/mL). Células U87MG.AEGFR (1 χ 105) ou 5 χ 105 células de LN- Z308.AEGFR, A1207.AEGFR, U87MG, U87MG.DK e U87MG.tsEGFR em 5 pL de PBS foram implantadas no corpo estriado direito de cérebros de ratinhos nude como anteriormente descrito (Mishima et al. (2000) A peptide derived from the non-recetor binding region of urokinase plasminogen ativator inhibits glioblastoma growth and angiogenesis in vivo in combination with cisplatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 8484-8489). A terapia sistémica com mAb806, ou a IgG2b de controlo de isotipo, foi realizada por injeção i.p. de 1 pg de mAbs num volume de 100 pL a cada dois dias a partir do dia 0 após implantação até ao 14. Para a terapia direta de tumores U87MG.AEGFR intracerebrais, 10 pg de mAb806 ou da IgG2b de controlo de isotipo foram injetados num volume de 5 pL no sitio de injeção do tumor a cada dois dias começando no dia 1 e durante 5 dias.
Os animais tratados com PBS ou a IgG de controlo de isotipo tiveram uma sobrevivência mediana de 13 dias, enquanto os ratinhos tratados com mAb806 tiveram um aumento de 61,5% da sobrevivência mediana até 21 dias (P < 0,001; FIG.24A). O tratamento de ratinhos 3 dias após implantação, após estabelecimento do tumor, também prolongou a sobrevivência mediana dos animais tratados com mAb806 em 46,1% (desde 13 dias para 19 dias; P < 0,01) em comparação com aquela dos grupos de controlo (dados não apresentados).
Para determinar se estes efeitos antitumorais do mAb806 se alargavam para além dos xenoenxertos de U87MG.AEGFR, tratamentos semelhantes foram administrados a animais portadores de outros xenoenxertos de células de glioma de LN-Z308.AEGFR e A1207.AEGFR. A sobrevivência mediana de ratinhos portadores de xenoenxertos de LN-Z308.AEGFR tratados com mAb806 foi prolongada de 19 dias para os controlos para 58 dias (P < 0,001; FIG. 24B). Extraordinariamente, quatro dos oito animais tratados com mAb806 sobreviveram mais de 60 dias (FIG. 24B). A sobrevivência mediana de animais portadores de xenoenxertos de A1207.AEGFR foi também prolongada de 24 dias para os controlos para 29 dias (P < 0,01; dados não apresentados).
O Tratamento com mAb806 Inibe o Crescimento de Tumores Cerebrais que sobreexpressam AEGFR
Os ratinhos portadores de xenoenxertos de U87MG.AEGFR e LN-Z308. AEGFR foram sacrificados no dia 9 e dia 15, respetivamente. Secções dos tumores foram analisadas histopatologicamente e foram determinados os volumes tumorais. Coerente com os resultados observados para a sobrevivência animal, o tratamento com mAb806 reduziu significativamente os volumes dos xenoenxertos em cerca de 90% para o U87MG.AEGFR. (P < 0,001; FIG.24C) e o LN-Z308. AEGFR em mais do que 95% (P < 0,001; FIG.24D) em comparação com os dos grupos de controlo. Foram obtidos resultados semelhantes para animais portadores de tumores A1207.AEGFR (65% de redução do volume, P < 0,01; dados não apresentados).
Tratamento Intratumoral com mAb806 Prolonga a Sobrevivência de Ratinhos Portadores de Tumores Cerebrais U87MG.AEGFR
Foi também determinada a eficácia da injeção intratumoral direta de mAb806 para o tratamento de xenoenxertos de U87MG.AEGFR. Os animais foram administrados com injeções intratumorais de mAb806 ou IgG de controlo de isotipo um dia após implantação. Os animais de controlo sobreviveram durante 15 dias, enquanto os ratinhos tratados com mAb806 permaneceram vivos durante 18 dias (P < 0,01; FIG. 24E). Apesar do tratamento intratumoral com mAb806 ter sido algo eficaz, este implicava as dificuldades das injeções intracranianas múltiplas e um maior risco de infeção. Por conseguinte, a requerente focou-se em tratamentos sistémicos para estudos adicionais.
Tratamento com mAb806 Prolonga Ligeiramente a Sobrevivência de Ratinhos Portadores de Xenoenxertos Intracranianos de U87MG.tsEGFR, mas não de U87MG ou U87MG.DK A fim de determinar se a inibição do crescimento pelo mAb806 era seletiva para tumores que expressam AEGFR, a requerente tratou animais portadores de xenoenxertos cerebrais de U87MG, U87MG.DK (AEGFR deficiente em cinase) e U87MG.tsEGFR. O tratamento com mAb806 não prolongou a sobrevivência de ratinhos implantados com tumores U87MG (FIG.25A), os quais expressavam um nivel baixo de EGFR de tipo selvagem (tsEGFR) endógeno (Huang et al. (1997) The enhanced tumorigenic ativity of a mutant epidermal growth factor receptor common in human cancers is mediated by threshold levels of constitutive tyrosine phosphorylation and unattenuated signaling. J. Biol. Chem., 272, 2927-2935), ou animais portadores de xenoenxertos de U87MG.DK, os quais sobreexpressavam um AEGFR deficiente em cinase além de um nivel baixo de tsEGFR endógeno (FIG.25B). 0 tratamento com mAb806 prolongou ligeiramente a sobrevivência de ratinhos portadores de tumores U87MG.tsEGFR (P < 0,05, sobrevivência mediana 23 dias versus 26 dias para os grupos de controlo), os quais sobreexpressavam tsEGFR (FIG.25C).
Reatividade do mAb806 Correlaciona com a Eficácia Antitumoral In vivo A fim de compreender o efeito diferenciado do mAb806 sobre tumores que expressam vários niveis ou tipos diferentes de EGFR, a requerente determinou a reatividade do mAb806 com várias células tumorais através de análise por FACS. As células reveladas foram analisadas com um FACS Calibur utilizando o software Cell Quest (Becton-Dickinson PharMingen). Para o primeiro anticorpo foram utilizados os seguintes mAbs: mAb806, clone 528 e clone EGFR.l do mAb anti-EGFR. IgG2a ou IgG2b de ratinho foi utilizada como um controlo de isotipo.
Coerente com relatórios anteriores (Nishikawa et al. (1994) A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 7727-7731), o mAb528 anti-EGFR reconheceu o AEGFR e o tsEGFR e demonstrou uma revelação mais forte para as células U87MG.AEGFR em comparação com as células U87MG (FIG.26A, 528).
Em contrapartida, o anticorpo EGFR.l reagiu com o tsEGFR, mas não com o AEGFR (Nishikawara et al., 1994), porque as células U87MG.AEGFR foram tão fracamente reativas quanto as células U87MG (FIG.26A, painel EGFR.l).
Este anticorpo EGFR.l reagiu com U87MG.tsEGFR de forma mais intensa do que com as células U87MG, porque as células U87MG.tsEGFR sobreexpressavam tsEGFR (FIG.26A, painel EGFR.l). Embora o mAb806 reagisse intensamente com as células U87MG.AEGFR e U87MG.DK e não com as células U87MG, ele reagiu fracamente com U87MG. tsEGFR, o que indicada que o mAb806 é seletivo para AEGFR com uma atividade cruzada fraca para o tsEGFR sobreexpresso (FIG.26A, painel mAb806).
Este nível de reatividade com U87MG.tsEGFR foi quantitativa e qualitativamente semelhante ao prolongamento da sobrevivência mediado pelo tratamento com anticorpo (FIG.25C). A requerente determinou ainda a especificidade do mAb806 por imunoprecipitação. Os EGFR em várias linhas de células foram imunoprecipitados com anticorpos mAb806, clone 528 (Oncogene Research Products, Boston, MA) ou clone EGFR.l (Oncogene Research Products) do mAb anti-EGFR.
Resumidamente, as células foram sujeitas a lise com tampão de lise contendo HEPES 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 10% de glicerol, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, 0,1% de SDS, 0,5% de desoxicolato de sódio, PPi de sódio 10 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, NasVCh 2 mM, 5 yg/mL de leupeptina e 5 yg/mL de aprotinina. Os anticorpos foram incubados com os lisados celulares a 4 °C durante 1 h, antes da adição de Sepharose de Proteina A e G. Os imunoprecipitados foram lavados duas vezes com tampão de lise e uma vez com tampão HNTG [HEPES 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% de Triton X-100 e 10% de glicerol], submetidos a eletroforese e transferidos para membranas de nitrocelulose.
As transferências das proteínas separadas eletroforeticamente foram testadas com o anticorpo anti-EGFR, C13 (proporcionado pelo Dr. G. N. Gill, University of
California, San Diego, CA) , utilizado para deteção de EGRF de tipo selvagem e AEGFR nas imunotransferências (Huang et al. , 1997), e as proteínas foram visualizadas utilizando o sistema de deteção quimioluminescente ECL (Amersham Pharmacia Biotech.)· Os anticorpos para Bcl-X (anticorpo policlonal de coelho;
Transduction Laboratories, Lexington, KY) e fosfotirosina (4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NI) foram utilizados para análise de transferência de Western como anteriormente descrito (Nagane et al. (1998) Drug resistance of human glioblastoma cells conferred by a tumor-specific mutant epidermal growth factor receptor through modulation of Bcl-XL and caspase-3-like proteases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 5724-5729).
Coerente com a análise por FACS, o anticorpo 528 reconheceu o tsEGFR e os recetores mutantes (FIG.26B-painel IP: 528), enquanto o anticorpo EGFR.l reagiu com tsEGFR mas não com a espécie mutante (FIG. 26B, painel IP:EGFR.l). Além do mais, os níveis de recetores mutantes em células U87MG.AEGFR e U87MG.DK são comparáveis àqueles do tsEGFR nas células U87MG.tsEGFR (FIG.26B, painel IP: 528).
No entanto, o anticorpo mAb806 foi capaz de precipitar apenas uma quantidade pequena do tsEGFR a partir dos lisados celulares de U87MG.tsEGFR em comparação com a quantidade maior de recetor mutante precipitado a partir de células U87MG.AEGFR e U87MG.DK e uma quantidade não detetável a partir das células U87MG (FIG.26B, painel IP:mAb806). Colectivamente, estes dados sugerem que o mAb806 reconhece um epitopo no AEGFR que também existe numa pequena fracção de tsEGFR apenas quando é sobreexpresso na superfície celular (ver discussão adicional e referências ao epitopo de mAb806 abaixo).
Tratamento com mAb806 Reduz a Autofosforilação de AEGFR e Regula Negativamente a Expressão de BcI.Xl em Tumores Cerebrais U87MG.AEGFR
Os mecanismos subjacentes à inibição do crescimento pelo mAb806 foram investigados a seguir. Uma vez que a atividade cinase constitutivamente ativa e a autofosforilação da extremidade carboxilo do AEGFR são essenciais para as suas funções biológicas (Nishikawa et al. (1994) A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7727-7731;
Huang et al., 1997; Nagane et al. (1996) A common mutant epidermal growth factor receptor confers enhanced tumorigenicity on human glioblastoma cells by increasing proliferation and reducing apoptosis. Cancer Res., 56, 5079-5086; Nagane et al. (2001) Aberrant recetor signaling in human malignant gliomas: mechanisms and therapeutic implications. Cancer Lett. 162 (Suppl.l), S17-S21) foi determinado o estado de fosforilação do AEGFR em tumores de animais tratados e de controlo. Como se mostra na FIG.27A, o tratamento com mAb806 reduziu dramaticamente a autofosforilação de AEGFR, apesar dos níveis de recetor terem sido apenas ligeiramente diminuídos nos xenoenxertos tratados com mAb806. A requerente demonstrou anteriormente que a autofosforilação do recetor origina a regulação positiva do gene antiapoptótico, Bc1-Xl, o qual desempenha um papel chave na redução da apoptose de tumores que sobreexpressam AEGFR (Nagane et al. , 1996; Nagane et al. , 2001). Por conseguinte, foi em seguida determinado o efeito do tratamento com mAb806 na expressão de Bc1-Xl. Os tumores AEGFR de animais tratados com mAb806 exibiram, de facto, níveis reduzidos de Bc1-Xl (FIG. 27A).
Tratamento com mAb806 Diminui o Crescimento e Angiogénese, e Aumenta a Apoptose em Tumores U87MG.AEGFR À luz da supressão in vivo provocada por tratamento com mAb806 e os seus efeitos bioquímicos na sinalização do recetor, a requerente determinou a velocidade de proliferação de tumores de ratinhos de controlo ou tratados. O índice proliferativo, medido por revelação com Ki-67 dos tumores tratados com mAb806, foi significativamente inferior ao dos tumores de controlo (P < 0,001; FIG. 28).
Resumidamente, para avaliar a angiogénese em tumores, eles foram fixos numa solução contendo cloreto de zinco, embutidos em parafina, seccionados e imunorrevelados utilizando um anticorpo monoclonal de rato anti-CD31 de ratinho (Becton-Dickinson PharMingen; 1:200) . A avaliação da proliferação de células tumorais foi realizada por imuno-histoquímica com Ki-67 de tecidos tumorais fixos em formalina, embutidos em parafina. Após desparafinação e reidratação, as secções de tecido foram incubadas com peróxido de hidrogénio a 3% em metanol para desativar a peroxidase endógena. As secções foram bloqueadas durante 30 min com soro de cabra e incubadas de um dia para o outro com o anticorpo primário a 4 °C. As secções foram em seguida lavadas com PBS e incubadas com um anticorpo secundário biotinilado durante 30 min. Após várias lavagens com PBS, os produtos foram visualizados utilizando estreptavidina-peroxidase de rábano-silvestre com diaminobenzidina como cromogénio e hematoxilina como o revelador de contraste. Como uma medição da proliferação, o índice de marcação com Ki-67 foi determinado como a razão de núcleos marcados: núcleos totais em campos de alta potência (3400).
Aproximadamente 2000 núcleos foram contados em cada caso por amostragem aleatória sistemática. Para a revelação de macrófagos e células NK, secções congeladas, fixas com solução de paraformaldeído a 4% tamponada, foram imunorreveladas utilizando mAbF4/80 biotinilado (Serotec, Raleigh, NC) e anticorpo policlonal de coelho anti-asialo GMl (Dako Chemicals, Richmond, VA), respetivamente. A angiogénese foi quantificada como a área dos vasos utilizando análise computorizada. Para este efeito, secções foram imunorreveladas utilizando anti-CD31 e foram analisadas utilizando um sistema de análise de imagem computorizada sem revelador de contraste. As MVA foram determinadas capturando imagens digitais das secções a uma ampliação de 3200 utilizando uma câmara de CCD a cores como anteriormente descrito (Mishima et al. , 2000). As imagens foram em seguida analisadas utilizando o software Imagem Pro Plus versão 4.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) e a MVA foi determinada medindo a quantidade total de revelação em cada secção. Foram avaliados quatro campos para cada secção. Este valor foi representado como uma percentagem da área total em cada campo. Os resultados foram confirmados em cada experiência por pelo menos dois observadores (K. M., H-J. S. H.).
Além disso, as células apoptóticas no tecido tumoral foram detetadas utilizando o método de TUNEL como anteriormente descrito (Mishima et al., 2000) . As células positivas para TUNEL foram contadas a X400. O índice apoptótico foi calculado como uma razão do número de células apoptóticas: número total de células em cada campo. A análise do índice apoptótico através de revelação de TUNEL demonstrou um aumento significativo no número de células apoptóticas em tumores tratados com mAb806 em comparação com os tumores de controlo (P < 0,001; FIG. 28) . O grau de vascularização do tumor foi também analisado por imunorrevelação de tumores a partir de espécimes tratados e de controlo para CD31. Para quantificar a vascularização do tumor, as áreas microvasculares (MVA) foram medidas utilizando análise de imagem computorizada. Os tumores tratados com mAb806 apresentaram menos 30% de MVA do que os tumores de controlo (P < 0,001; FIG. 28).
Para compreender se a interação entre o recetor e anticorpo pode desencadear uma resposta inflamatória, a requerente revelou secções de tumor em relação ao marcador macrófago, F4/80, e ao marcador de células NK, asialo GMl. Os macrófagos foram identificados ao longo da matriz do tumor e acumularam-se especialmente em torno da periferia do tumor U87MG.AEGFR tratado com mAb806 (FIG. 28) . A requerente observou algumas células NK infiltradas e em torno dos tumores e não houve qualquer diferença significativa entre os tumores trados com mAb806 e de controlo de isotipo (dados não apresentados).
Exemplo 17
Imunoterapia de Associação com mAb806 e mAb528
As experiências aqui estabelecidas descrevem trabalho in vivo concebido para determinar a eficácia dos anticorpos de acordo com esta divulgação.
Ratinhos nude fêmeas, com 4-6 semanas de idade, foram utilizados como animais experimentais. Os ratinhos receberam inoculações subcutâneas de 3 χ 106 células tumorais em cada um dos seus flancos.
Os animais receberam células U87MG.D2-7, U87MG.DK ou A431, as quais são todas descritas, supra. A terapia coemçou quando os tumores tinham crescido até um tamanho suficiente.
Em seguida, os ratinhos receberam injeções de um de (i) soro fisiológico tamponado com fosfato, (ii) mAb806 (0,5 mg/injeção), (iii) mAb528 (0,5 mg/injeção) ou (iv) uma associação de ambos os mAbs. Em relação a "(iv)", diferentes grupos de ratinhos receberam 0,5 mg/injeção de cada mAb ou 0,25 mg/injeção de cada mAb. 0 primeiro grupo de ratinhos examinados foram aqueles que receberam injeções de U87MG.D2-7. 0 protocolo de tratamento começou 9 dias após inoculação e prosseguiu 3 vezes por semana durante 2 semanas (i. e., os animais foram inoculados 9, 11, 13, 16, 18 e 20 dias depois de terem sido injetados com as células). No inicio do protocolo de tratamento, o diâmetro médio do tumor era 115 mm3. Cada grupo continha 50 ratinhos, cada com dois tumores.
No grupo de ratinhos que receberam a associação de anticorpos (0,5 mg/injeção de cada), existiram três regressões completas. Não existiram regressões em quaisquer dos outros grupos. A FIG.18A mostra os resultados graficamente.
Num segundo grupo de ratinhos, os materiais injetados foram os mesmos, exceto que a terapia de associação continha 0,25 mg de cada anticorpo por injeção. As injeções foram dadas 10, 12, 14, 17, 19 e 21 dias após inoculação com as células. No inicio da terapia o tamanho médio do tumor era de 114 mm3. Os resultados são mostrados na FIG.18B. O terceiro grupo de ratinhos recebeu inoculações de U87MG.DK. As injeções terapêuticas começaram 18 dias após inoculação com as células, e prosseguiu nos dias 20, 22, 25, 27 e 29. O tamanho médio do tumor no inicio do tratamento era de 107 mm3. A FIG.18C resume os resultados. As injeções terapêuticas foram as mesmas que no primeiro grupo.
Finalmente, o quarto grupo de ratinhos, o qual tinha sido inoculado com células A431, recebeu injeções como nos grupos I e
Ill, nos 8, 10, 12 e 14 dias após inoculação. No início, ο tamanho médio do tumor era de 71 mm3. Os resultados são mostrados na FIG.18D.
Os resultados indicaram que a terapia de associação de anticorpos apresentava um efeito sinérgico na redução de tumores. Ver FIG.18A. Um efeito semelhante foi observado a uma dose menor, conforme a FIG.18B, indicando que o efeito não é simplesmente devido aos níveis de administração. A terapia de associação não inibiu o crescimento de U87MG.DK (FIG.18C), indicando que a função imunológica do anticorpo não era a causa da diminuição observada nas FIG.18A e 18B.
Assinale-se que, como se mostra na FIG.18D, a terapia de associação também exibiu eficácia sinérgica nos tumores A431, com 4 doses a conduzir a uma taxa de resposta 60% completa.
Estes dados sugerem que a molécula de EGFR reconhecida pelo mAb806 é funcionalmente diferente daquela inibida pelo 528.
Exemplo 18
Inibição do Crescimento de Xenoenxertos de Tumores pelo mAb8 0 6
Como aqui discutido e adicionalmente demonstrado e discutido neste exemplo, constatou-se inesperadamente que o mAb806 inibe o crescimento de xenoenxertos de tumores que expressam des2-7 ou EGFR amplificado, mas não o EGFR de tipo selvagem.
As linhas de células e anticorpos foram preparadas como descrito no Exemplo 1. Para determinar a especificidade do mAb806 foi analisada a sua ligação às células U87MG, U87MG.D2-7 e U87MG.tsEGFR por FACS. Resumidamente, linhas de células U87MG parentais e transfetadas cultivadas foram analisadas quanto à expressão do EGFR de tipo selvagem e des2-7 utilizando os anticorpos 528, 806 e DH8.3. As células (1 3 10 6) foram incubadas com 5 yg/mL do anticorpo apropriado ou um controlo negativo de isotipo condizente em PBS contendo 1% de HSA durante 30 min, a 4 °C. Após três lavagens com PBS/1% de HSA, as células foram incubadas mais 30 min, a 4 °C, com anticorpo anti-ratinho de cabra acoplado a FTTC (diluição 1:100; Calbiochem, San Diego, CA) . Após três lavagens subsequentes, as células foram analisadas num Epics Elite ESP (Beckman Coulter, Hialeah, FL) observando um mínimo de 20000 eventos e analisadas utilizando o EXPO (versão 2) para Windows. Uma IgG2b irrelevante (mAb 100-310 dirigido ao antigénio humano A33) foi incluída como um controlo de isotipo para o mAb806, e o anticorpo 528 foi incluído porque reconhece o des2-7 e o tsEGFR.
Apenas o anticorpo 528 foi capaz de revelar a linha de células U87MG parental (FIG.29), coerente com relatórios anteriores que demonstram que estas células expressam o tsEGFR (Nishikawa et al. (1994) A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7727-7731). O mAb806 tinha níveis de ligação semelhantes ao anticorpo de controlo, o que demonstra claramente que não é capaz de ligar o tsEGFR (FIG.29) . A ligação do anticorpo de controlo de isotipo às linhas de células U87MG.D2-7 e U87MG.tsEGFR foi semelhante ao observado para as células U87MG. 0 mAb806 revelou as células U87MG.D2-7 e U87MG.tsEGFR, o que indica que o mAb806 reconheceu especif icamente o des2-7 EGFR e um subconjunto do EGFR sobreexpresso (FIG. 29). Como esperado, o anticorpo 528 revelou ambas as linhas de células U87MG.D2-7 e U87MG.tsEGFR (FIG. 29) . A intensidade de revelação com anticorpo 528 nas células U87MG.tsEGFR foi muito superior ao mAb806, sugerindo que o mAb806 reconhece apenas uma porção do EGFR sobreexpresso. A reatividade do mAb806 observado com células U87MG.tsEGFR é semelhante à obtida com células A431, outra linha de células que sobreexpressa o tsEGFR.3.
Foi realizada uma análise de Scatchard utilizando células U87MG.D2-7 e A431 para determinar a afinidade relativa e sítios de ligação para o mAb806 em cada linha de células. 0 mAb806 teve uma afinidade para o recetor des2-7 EGFR de 1,1 χ 109 M_1 e reconheceu uma média (três experiências separadas) de 2,4 χ 105 sítios de ligação/célula, como se assinala no Exemplo 4. Em contraste, a afinidade do mAb806 para o tsEGFR em células A431 foi apenas de 9,5 χ 107 M_1, como se refere no Exemplo 8.
Curiosamente, o mAb806 reconheceu 2,3 χ 105 sítios de ligação na superfície de A431, a qual é cerca de 10 vezes inferior ao número de EGFR relatado presente nestas células. Para confirmar o número de EGFR na superfície das nossas células A431, a requerente realizou uma análise Scatchard utilizando anticorpo 528 marcado com 125I. Como esperado, este anticorpo ligou-se a aproximadamente 2 χ 106 sítios na superfície das células A431. Assim, parece que o mAb806 liga apenas uma porção dos recetores EGFR na superfície das células A431. É importante dizer que, o mAb806 marcado com 125I não se ligou de todo às células U87MG parentais, mesmo quando o número de células foi aumentado até 1 x 107. A reatividade do mAb806 foi ainda caracterizada nas várias linhas de células por imunoprecipitação após marcação com 35S utilizando mAb806, sc-03 (um anticorpo policlonal comercial específico para o domínio COOH-terminal do EGFR) e uma IgG2b de controlo de isotipo. Resumidamente, as células foram marcadas durante 16 h com 100 mCi/mL de Tran 35S-Label (ICN Biomedicals, Irvine, CA) em DMEM sem metionina/cisteína suplementado com 5% de FCS dialisado. Depois de lavar com PBS, as células foram colocadas em tampão de Use (1% de Triton X-100, HEPES 30 mM, NaCl 150 mM, fluoreto de 4-(2-aminoetil)benzenossulfonilo (AEBSF) 500 μΜ, aprotinina 150 nM, inibidor de protéase E-64 1 μΜ, EDTA 0,5 mM e leupeptina 1 μΜ, pH 7,4) durante 1 h a 4 °C. Os Usados foram tornados transparentes por centrifugação durante 10 min a 12000 g e, em seguida, incubados com 5 pg de anticorpo apropriado durante 30 min a 4 °C, antes da adição de
Sepharose de Proteína A. Os imunoprecipitados foram lavados três vezes com tampão de lise, misturados com tampão SDS de amostras, separados por electroforese em gel utilizando um gel de 4-20% de Tris/glicina que foi, em seguida, seco e exposto a película de raios X. O anticorpo sc-03 imunoprecipitou três bandas de células U87MG.A2-7; um dupleto correspondente às bandas de 2 des2-7 EGFR observadas nestas células e uma banda de peso molecular mais alto correspondente ao tsEGFR (FIG. 22 e 30). Em contrapartida, enquanto o mAb806 imunoprecipitou as duas bandas de des2-7 EGFR, o tsEGFR estava completamente ausente. O padrão observado nas células U87MG.tsEGFR e A431 foi essencialmente idêntico. 0 anticorpo sc-03 imunoprecipitou uma única banda correspondente ao tsEGFR das células A431 (FIG. 22 e 30) . O mAb806 também imunoprecipitou uma única banda correspondente ao tsEGFR de ambas as células U87MG.tsEGFR e A431 (FIG.22 e 30). Coerente com os dados de FACS e Scatchard, a quantidade de EGFR imunoprecipitada pelo mAb806 foi substancialmente inferior ao EGFR total presente na superfície celular. Uma vez que o mAb806 e o sc-03 imunoprecipitaram quantidades semelhantes do des2-7 EGFR, este resultado apoia a ideia de que o anticorpo mAb806 apenas reconhece uma porção do EGFR nas células que sobreexpressam o recetor. Comparações entre o mAb806 e o anticorpo 528 mostraram um padrão de reatividade idêntico (dados não apresentados). Uma IgG2b irrelevante (um controlo de isotipo para o mAb806) não imunoprecipita o EGFR de qualquer uma das linha de células (FIG. 22 e 30). Utilizando condições idênticas, o mAb806 não imunoprecipita o EGFR das células U87MG parentais (dados não apresentados). O mAb806 foi também examinado quanto à eficácia contra os tumores U87MG e U87MG.A2-7 num modelo preventivo de xenoenxerto. O anticorpo ou veículo foi administrado i.p. no dia anterior à inoculação do tumor e foi administrado três vezes por semana durante 2 semanas. A uma dose de 1 mg/injeção, o mAb806 não teve qualquer efeito no crescimento de xenoenxertos de U87MG parental que expressam o tsEGFR (FIG.9A). Em contraste, o mAb806 inibiu significativamente o crescimento de xenoenxertos de U87MG.A2-7 de uma maneira dependente da dose (FIG.9B) . Vinte dias após inoculação do tumor, quando os animais de controlo foram sacrificados, o volume tumoral médio era 1600 ± 180 mm3 para o grupo de controlo, um significativamente mais pequeno 500 ± 95 mm3 para o grupo de 0,1 mg/injeção (P < 0, 0001) e 200 ± 42 mm3 para o grupo de 1 mg/injeção (P < 0, 0001) . Os grupos de tratamento foram sacrificados no dia 24, altura em que os volumes tumorais médios eram de 1300 ± 240 mm3 para o grupo tratado com 0,1 mg e 500 ± 100 mm3 para o grupo de 1 mg (P < 0,005).
Dada a eficácia do mAb806 no modelo preventivo de xenoenxerto, foi examinada a sua aptidão para inibir o crescimento de xenoenxertos de tumores estabelecidos. O tratamento com anticorpo foi como descrito no modelo preventivo, excepto que começou quando os tumores tinham atingido um volume tumoral médio de 65 mm3 (10 dias após implantação) para os xenoenxertos de U87MG.A2-7 e 84 mm3 (19 dias após implantação) para os xenoenxertos de U87MG parental (ver Exemplo 10) . Mais uma vez, o mAb806 não teve qualquer efeito no crescimento de xenoenxertos de U87MG parental, mesmo a uma dose de 1 mg/injeção (FIG.10A). Em contraste, o mAb806 inibiu significativamente o crescimento de xenoenxertos de U87MG.A2-7 de uma maneira dependente da dose (FIG. 10B) . No dia 17, um dia antes dos animais de controlo serem sacrificados, o volume tumoral médio era de 900 ± 200 mm3 para o grupo de controlo, 400 ± 60 mm3 para o grupo de 0,1 mg/injeção (P < 0,01) e 220 ± 60 mm3 para o grupo de 1 mg/injeção (P < 0,002) . O tratamento de xenoenxertos de U87MG.A2-7 com uma IgG2b de controlo de isotipo não teve qualquer efeito no crescimento de tumores (dados não apresentados).
Para examinar se a inibição do crescimento observado com mAb806 se restringia às células que expressam des2-7 EGFR, a sua eficácia contra os xenoenxertos de U87MG.tsEGFR foi também examinada num modelo estabelecido. Estas células servem como um modelo para tumores que contêm amplificação do gene de EGFR sem expressão de des2-7 EGFR. 0 tratamento com mAb806 começou quando os tumores tinham atingido um volume tumoral médio de 73 mm3 (22 dias após implantação). 0 mAb806 inibiu significativamente o crescimento de xenoenxertos de U87MG.tsEGFR estabelecidos quando comparado com tumores de controlo tratados com veiculo (FIG.10C) . No dia em que os animais de controlo foram sacrificados, o volume tumoral médio era de 1000 ± 300 mm3 para o grupo de controlo e 500 ± 80 mm3 para o grupo tratado com 1 mg/injeção (P < 0,04) .
Para avaliar diferenças histológicas potenciais entre os xenoenxertos de U87MG.A2-7 e U87MG.tsEGFR de controlo e tratados com mAb806, secções fixas em formalina, embutidas em parafina foram reveladas com H&amp;E (FIG.31) . Foram observadas áreas de necrose em secções de xenoenxertos de U87MG.A2-7 (os xenoenxertos tratados com mAb806 foram recolhidos 24 dias após inoculação do tumor e os xenoenxertos tratados com veiculo aos 18 dias) e U87MG.tsEGFR (os xenoenxertos com mAb806 foram recolhidos 42 dias após inoculação do tumor e os xenoenxertos tratados com veiculo aos 37 dias; FIG.31) tratados com mAb806. Este resultado foi consistentemente observado num número de xenoenxertos de tumores (n = 4 para cada linha de células) . No entanto, as secções de xenoenxertos de U87MG.A2-7 e U87MG.tsEGFR tratados com veiculo (n = 5) não apresentaram as mesmas áreas de necrose observadas após tratamento com mAb806 (FIG. 31) . Os xenoenxertos tratados com veiculo e mAb806 removidos em alturas idênticas também apresentaram estas diferenças na necrose dos tumores (dados não apresentados). Assim, o aumento observado na necrose não foi provocado pelos intervalos de crescimento mais compridos utilizados para os xenoenxertos tratados com mAb806. Além disso, secções de xenoenxertos de U87MG tratados com mAb806 foram também revelados com H&amp;E e não revelaram quaisquer áreas de necrose (dados não apresentados), suportando ainda mais a hipótese de que a ligação do mAb806 induz uma diminuição da viabilidade celular, o que resulta num aumento da necrose nos xenoenxertos de tumores.
Foi realizada uma análise imuno-histoquímica de secções dos xenoenxertos de U87MG, U87MG.A2-7 e U87MG.tsEGFR para determinar os niveis de expressão de des2-7 e tsEGFR após tratamento com mAb806 (FIG.32). Como esperado, o anticorpo 528 revelou todas as secções dos xenoenxertos sem qualquer diminuição óbvia da intensidade entre tumores tratados e de controlo (FIG.32). A revelação de secções de U87MG não foi detetável com o mAb806; contudo, foi observada revelação positiva das secções de xenoenxertos de U87MG.A2-7 e U87MG.tsEGFR (FIG. 32) . Não houve qualquer diferença na intensidade de revelação com mAb806 entre os xenoenxertos de U87MG.A2-7 e U87MG.tsEGFR de controlo e tratados, o que sugere que o tratamento com anticorpo não conduz à selecção de variantes clonais que carecem de reatividade com mAb8 0 6.
Para demonstrar que os efeitos antitumorais do mAb806 não se restringiam às células U87MG, o anticorpo é administrado a ratinhos contendo xenoenxertos de A431. Estas células contêm um gene de EGFR amplificado e expressam aproximadamente 2 x 106 recetores/células. A requerente demonstrou anteriormente que o mAb806 liga -10% destes EGFRs e visa os xenoenxertos de A431 (Garcia et al. (1993) Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-small cell along carcinomas.
Cancer Res. 53, 3217-3220). O mAb806 inibiu significativamente ο crescimento de xenoenxertos de A431 quando examinados no modelo preventivo de xenoenxerto anteriormente descrito (FIG. 11A) . No dia 13, quando os animais de controlo foram sacrificados, o volume tumoral médio era de 1400 ± 150 mm3 no grupo tratado com veiculo e 260 ± 60 mm3 para o grupo de tratamento de 1 mg/injeção (P < 0, 0001) . Numa experiência separada, uma dose de 0,1 mg de mAb também inibiu significativamente (P < 0,05) o crescimento de xenoenxertos de A431 num modelo preventivo (dados não apresentados) (ver Exemplo 10).
Dada a eficácia do mAb806 no modelo preventivo de xenoenxerto de A431, foi examinada a sua aptidão para inibir o crescimento de xenoenxertos de tumores estabelecidos. O tratamento com anticorpo foi como descrito no modelo preventivo, excepto que não foi iniciado até os tumores terem atingido um volume tumoral médio de 200 ± 2 0 mm3. O mAb8 0 6 inibiu significativamente o crescimento de xenoenxertos de A431 estabelecidos (FIG.11B) . No dia 13, o dia em que os animais de controlo foram sacrificados, o volume tumoral médio era de 1100 ± 100 mm3 para o grupo de controlo e 450 ± 70 mm3 para o grupo de 1 mg/injeção (P < 0,0001).
Exemplo 19
Construção, Expressão e Análise do Anticorpo 806 Quimérico
Os anticorpos quiméricos são uma classe de moléculas em que regiões variáveis das cadeias pesada e leve, por exemplo, de um ratinho, rato ou outra espécie são unidas com regiões das cadeias pesada e leve humanas. Os anticorpos quiméricos são produzidos de modo recombinante. Uma vantagem dos anticorpos quiméricos é que podem reduzir os efeitos xenoantigénicos, a imunogenicidade inerente de anticorpos não humanos (por exemplo, ratinho, rato ou outra espécie) . Além disso, os anticorpos quiméricos preparados de modo recombinante podem ser frequentemente produzidos em grandes quantidades, em particular quando se utilizam vetores de expressão de alto nivel.
Para a produção de alto nivel, o sistema de expressão mamifero mais amplamente utilizado é um que utiliza o procedimento de amplificação de gene proporcionado pelas células de ovário de hamster Chinês deficientes em desidrofolato-redutase ("dhfr-"). 0 sistema é bem conhecido do especialista. 0 sistema baseia-se no gene da desidrofolato-redutase "dhfr", o qual codifica a enzima DHFR, a qual catalisa a conversão de desidrofolato em tetra-hidrofolato. Para se conseguir uma produção elevada, as células dhfr-CHO são transfetadas com um vetor de expressão que contém um gene DHFR funcional, em conjunto com um gene que codifica uma proteína desejada. Neste caso, a proteína desejada é a cadeia pesada e/ou cadeia leve do anticorpo recombinante.
Ao aumentar a quantidade do inibidor de DHFR competitivo, metotrexato (MTX), as células recombinantes desenvolvem resistência amplificando o gene dhfr. Em casos convencionais, a unidade de amplificação utilizada é muito maior do que o tamanho do gene dhfr, e como consequência a cadeia pesada do anticorpo é co-amplifiçada.
Quando é desejada a produção em grande escala da proteína, tal como a cadeia de anticorpo, o nível de expressão e a estabilidade das células a serem utilizadas são críticos. Na cultura a longo prazo, as populações de células CHO recombinantes perdem homogeneidade em relação à produtividade do seu anticorpo específico durante a amplificação, ainda que derivem de um único clone parental.
Foram preparados vetores de expressão bicistrónicos para serem utilizados na expressão recombinante dos anticorpos quiméricos. Estes vetores de expressão bicistrónicos utilizam um "sítio de entrada ribossómica interno" ou "IRES". Nestas construções para a produção de anti-EGFR quimérico, as cadeias de imunoglobulina e ADNc marcadores seleccionáveis são ligados através de um IRES. Os IRES são elementos de actuação cis que recrutam as pequenas subunidades ribossómicas para um codão iniciador interno no ARNm com a ajuda de fatores celulares de actuação trans. Os IRES facilitam a expressão de duas ou mais proteínas a partir de uma unidade de transcrição policistrónica em células eucarióticas. A utilização de vetores de expressão bicistrónicos, nos quais o gene marcador seleccionável é traduzido de um modo dependente de cap e o gene de interesse de uma maneira dependente de IRES, foi aplicada a uma variedade de métodos experimentais. Os elementos IRES têm sido incorporados com sucesso em vetores para transformação celular, produção de animais transgénicos, produção de proteínas recombinantes, terapia genética, captura de genes e abordagem seletiva de genes.
Sinopse da Construção do Anticorpo Quimérico 806 (ch806) O anticorpo 806 quimérico foi produzido por clonagem das cadeias VH e VL do anticorpo 806 a partir do hibridoma murideo parental utilizando técnicas de biologia molecular convencionais. As cadeias VH e VL foram, em seguida, clonadas nos vetores de expressão mamíferos pREN, cujas construções são apresentadas nas SEQ ID N°: 7 e SEQ ID N°: 8, e transfetadas em células CHO (DHFR-/-ve) para amplificação e expressão. Resumidamente, após tripsinização, 4 χ 106 células de CHO foram co-transferidas com 10 yg de cada um dos vetores de expressão LC e HC utilizando electroporação em condições convencionais. Após um período de repouso de 10 min à temperatura ambiente, as células foram adicionadas a 15 mL de meio (10% de soro fetal de vitelo, hipoxantina/timidina suplementado com aditivos) e transferidas para placas petri de cultura de células de 15 χ 10cm. As placas foram, em seguida, colocadas numa incubadora em condições normais durante 2 dias.
Nesta altura, a adição de gentamicina, metotrexato 5 nM, a substituição de soro fetal de vitelo por soro fetal de vitelo dialisado e a remoção de hipoxantina/timidina, iniciou a seleção dos clones que foram transfetados com sucesso com o LC e o HC a partir do meio. No dia 17 após transfeção, os clones individuais a crescer na seleção foram escolhidos e pesquisados quanto à expressão do anticorpo 806 quimérico. Foi utilizado um ELISA para pesquisa, o qual consistiu em revestir uma placa de ELISA com o recetor de EGF solúvel desnaturado (sabe-se que o EGFR desnaturado permite a ligação do 806). Este ensaio permite pesquisar os níveis de produção por clones individuais e também a funcionalidade do anticorpo a ser selecionado. Foi demonstrado que todos os clones produzem ch806 funcional e o melhor produtor foi selecionado e expandido para amplificação. Para amplificar o nível de ch806 a ser produzido, o clone de produção mais alta foi submetido a nova seleção numa concentração mais elevada de metotrexato (100 nM vs. 5 nM) . Isto foi realizado utilizando os procedimentos supramencionados.
Os clones que crescem em MTX lOOnM foram em sequida transferidos para a Biological Production Facility, Ludwig Institute, Melbourne, Austrália para medição dos níveis de produção, desmame de soro, introdução no banco de células. Foi demonstrado que a linha de células produz de forma estável ~10 mg/litro em frascos rotativos. A sequência de ácido nucleico do vetor Neo LC pREN ch806 é proporcionada na SEQ ID N° : 7. A sequência de ácido nucleico do vetor DHFR HC pREN ch806 é proporcionada na SEQ ID N°: 8. A FIG.33 representa os vetores pREN-HC e pREN-LC, os quais utilizam um IRES. O sistema de vetor bicistrónico pREN é descrito e divulgado no Pedido de Patente dos Estados Unidos copendente N° 60/355838 apresentada em 13 de Fevereiro de 2002. O ch806 foi avaliado através de análise por FACS para demonstrar que o 806 quimérico apresenta especificidade de ligação idêntica à do anticorpo parental murídeo. A análise foi realizada utilizando células de tipo selvagem (células U87MG parentais), células que sobreexpressam o recetor de EGF (células A431 e células UA87.tsEGFR) e células UA87.A2-7 (dados não apresentados). Foi obtida especificidade de ligação semelhante de mAb806 e ch806 utilizando células que sobreexpressam o EGFR e células que expressam o des2-7 EGFR. Não foi observado ligação em células de tipo selvagem. A análise Scatchard revelou uma afinidade de ligação para o ch806 marcado radioativamente de 6,4 x 109 M_1 utilizando células U87MGdes2-7 (dados não apresentados). A análise da biodistribuição do anticorpo ch806 foi realizada em ratinhos nude BALB/c portadores de tumores de xenoenxerto U87MG-des2-7 e os resultados são mostradas na FIG.34. Os ratinhos foram injetados com 5 yg de anticorpo marcado radioativamente e foram sacrificados em grupos de quatro por ponto no tempo às 8, 24, 48 e 74 horas. Os órgãos foram recolhidos, pesados e a radioatividade medida num contador gama. 0 ch806 marcado com 125I apresenta direcionamento reduzido para o tumor em comparação com o ch806 marcado com o qual apresenta uma captação alta pelo tumor e retenção acumulativa no tumor ao longo do intervalo de tempo de 74 horas. Às 74 horas, o anticorpo marcado com inIn apresenta aproximadamente 30% ID/grama de tecido e uma razão de tumor para sangue de 4,0 (FIG. 35) . O ch806 marcado com 11]-In apresenta alguma retenção não específica no fígado, baço e rins. Isto é comum para a utilização deste isótopo e diminui com o tempo, o que apoia que esta ligação é não específica para o ch806 e é devida à ligação do 11]-In. O anticorpo quimérico ch806 foi avaliado quanto à eficácia terapêutica num modelo de tumor estabelecido. Foram inoculados s.c. 3 x 106 células de U87MG.A2-7 em lOOyL de PBS em ambos os flancos de ratinhos nude fêmeas com 4-6 semanas de idade (Animal Research Center, Western Australia, Austrália). O mAb806 foi incluído como um controlo positivo. Os resultados são representados na FIG.36. 0 tratamento foi iniciado quando os tumores tinham atingido um volume médio de 50 mm3 e consistiu de 1 mg de ch806 ou mAb806 administrado i.p. durante um total de 5 injeções nos dias indicados. O volume tumoral em mm3 foi determinado utilizando a fórmula (comprimento χ largura2)/2, onde comprimento foi o eixo mais comprido e largura a medição em ângulos retos relativamente ao comprimento. Os dados foram expressos como volume tumoral médio +/-E.P. para cada grupo de tratamento. O ch806 e o mAb806 apresentaram atividade antitumoral quase idêntica contra os xenoenxertos de U87MG.A2-7.
Análise da Função Efetora Imunológica do Ch806
Materiais e Métodos
Anticorpos e Linhas de Células
Os mAb806 monoclonal anti-des2-7 EGFR murideo, anticorpo quimérico ch806 (IgGi) e anticorpo monoclonal anti-G250 quimérico de controlo de isotipo condizente cG250 foram preparados pelo Biological Production Facility, Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne, Austrália. Os ensaios de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) utilizaram células U87MG.des2-7 e A431 como células alvo. A linha de células U87MG.des2-7 anteriormente descrita é uma linha de células de astrocitoma humano infetada com um retrovirus contendo o des2-7 EGFR (Nishikawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91, 7727-31) . As células A431 do carcinoma escamoso humano foram adquiridas do American Type Culture Collection (Manassas, VA) .
Todas as linhas de células foram cultivadas em DMEM/F-12 com Glutamax (Life Technologies, Melbourne, Austrália) suplementado com 10% de FCS termicamente inativado (CSL, Melbourne,
Austrália), 100 unidades/mL de penicilina e 100 yg/mL de estreptomicina. Para manter a seleção para células U87MG.des2-7 transfetadas retroviralmente foram incluídos 400 yg/mL de G418 no meio.
Preparação de Células Efetoras de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC)
As PBMC foram isoladas a partir de sangue de dadores voluntários saudáveis. O sangue inteiro heparinizado foi fracionado por centrifugação de densidade em Ficoll-Hypaque (ICN Biomedical Inc., Ohio, EUA). As frações de PBMC foram recolhidas e lavadas três vezes com RPMI + 1640 suplementado com 100 U/mL de penicilina e 100 yg/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, contendo 5% de FCS termicamente inativado.
Preparação de Células Alvo
Os ensaios de CDC e ADCC foram realizados por uma modificação de um método anteriormente publicado (Nelson, D. L. et al. (1991) Em: J. E. coliqnan, A. M. Kruisbeek, D. D. Margulies, E. M. Shevach, e W. Strober (eds.), Current
Protocolos in Immunology, pp. 7.27.1. Nova Iorque: Greene
Publishing Wiley Interscience). Resumidamente, 5 χ ΙΟ6 células U87MG.des2-7 e A431 alvo foram marcadas com 50 yCi de 51Cr (Geneworks, Adelaide, Austrália) por 1 χ 106 células e incubadas durante 2 h, a 37 °C. As células foram, em seguida, lavadas três vezes com PBS (0,05 M, pH 7,4) e uma quarta lavagem com meio de cultura. Foram adicionadas alíquotas (1 χ 104 células/50 pL) das células marcadas a cada poço das placas de microtitulação de 96 poços (NUNC, Roskilde, Dinamarca).
Ensaio de CDC A 50 pL de células alvo marcadas foram adicionados em triplicado 50 pL de ch806 ou anticorpo de controlo de isotipo cG250 ao longo da gama de concentração 0,00315 - 10 pg/mL, e incubadas sobre gelo 5 min. Foram então adicionados cinquenta pL de complemento (soro) de dador saudável recém-preparado para produzir uma diluição final de 1:3 do soro. As placas de microtitulação foram incubadas durante 4 h a 37 °C. Após centrifugação, o 51Cr libertado no sobrenadante foi contado (Contador gama automatizado Cobra II, Canberra Packard, Melbourne, Austrália). A percentagem de lise específica foi calculada a partir da libertação experimental de 51Cr, da libertação total (50 pL de células alvo + 100 pL de Tween 20 a 10%) e espontânea (50 pL de células alvo + 100 pL de meio).
Ensaio de ADCC A ADCC mediada por ch806 efetuada pelas PBMCs de dadores saudáveis foi medida por dois ensaios de libertação de 51Cr de 4 h. No primeiro ensaio, células alvo marcadas foram aplicadas com as células efetoras em microplacas de 96 poços de fundo em "U" (NUNC, Roskilde, Dinamarca) em proporções efetor/célula alvo (E:T) de 50:1. Para medição da atividade ADCC, foram adicionados em triplicado 0,00315 - 10 yg/mL (concentração final) de anticorpos de ensaio e controlo a cada poço. No segundo ensaio de ADCC, a atividade ADCC do ch8 0 6 foi comparada com o mAb8 0 6 murideo parental ao longo de uma gama de proporções Efector: Célula alvo com a concentração do anticorpo de ensaio constante a 1 yg/mL. Em ambos os ensaios, as placas microtitulo foram incubadas a 37 °C durante 4 horas, em seguida foram colhidos 50 yL de sobrenadante de cada poço e o 51Cr libertado foi determinado por contagem gama (Contador Gama automatizado Cobra II, Canberra Packard, Melbourne, Austrália). Os controlos incluídos nos ensaios corrigiram a libertação espontânea (só meio) e libertação total (10% de Tween20/PBS) . Controlos apropriados com a mesma subclasse de anticorpo foram analisados em paralelo. A percentagem de lise celular (citotoxicidade) foi calculada de acordo com a fórmula:
A percentagem (%) de citotoxicidade foi representada graficamente contra a concentração de anticorpo (yg/mL).
Resultados
Os resultados das análises de CDC são apresentados na FIG.37. Foi observada atividade CDC mínima na presença de até 10 yg/mL de ch80 6 com CDC comparável à observada com o controlo de isotipo cG250. A ADCC mediada por ch806 em células U87MG.des2-7 e A431 alvo a razões E:T de 50:1 é apresentada na FIG.38. Foi observada citotoxicidade especifica de ch806 efetiva contra células alvo U87MG.des2-7, mas a ADCC minima foi mediada por ch806 em células A431. Os níveis de citotoxicidade conseguidos refletem o número de sítios de ligação de ch806 nas duas populações de células. As células U87MG.des2-7 alvo expressam ~1 χ 106 des2-7 EGFR que são especificamente reconhecidos pelo ch806, enquanto apenas um subconjunto das 1 χ 106 moléculas de EGFR de tipo selvagem expressas nas células A431 são reconhecidas pelo ch806 (ver Exemplos acima).
Foram realizadas análises de ADCC adicionais para comparar a ADCC mediado por 1 yg/mL de ch806 em células U87MG.des2-7 alvo com aquela efetuada por 1 yg/mL de mAb806 murídeo parental. Os resultados são apresentados na FIG.39. A quimerização de mAb806 efetuou um melhoramento acentuado da ADCC conseguida pelo mAb murídeo parental com mais do que 30% da citotoxicidade efetuada a razões E:T de 25:1 e 50:1. A ausência de função efetora imunológica do mAb806 murídeo parental foi acentuadamente melhorada após quimerização. A ch806 medeia uma boa atividade ADCC, mas CDC mínima.
Exemplo 20
Produção de Anticorpos Anti-Idiotípicos para o Anticorpo Quimérico ch806
Para auxiliar a avaliação clínica de mAb806 ou ch806 são necessários ensaios laboratoriais para monitorizar a farmacocinética dos anticorpos no soro e quantificar quaisquer respostas imunológicas ao anticorpo quimérico ratinho-humano. Anticorpos anti-idiotípicos monoclonais de ratinho (anti-ids) foram produzidos e caracterizados quando à aptidão como reagentes de ELISA para medir o ch806 em amostras de soros de doente e utilizados como controlos positivos em análises da resposta imunológica humana anti-anticorpos quiméricos. Estes anticorpos anti-idiotípicos podem ser também úteis como vacinas terapêuticas ou profilácticas, produzindo uma resposta de anticorpos anti-EGFR natural em doentes.
Os métodos para produzir anticorpos anti-idiotípicos são bem conhecidos na técnica (Chatterjee et al. , 2001; Uemura et al. , 1994; Steffens et al. , 1997; Safa e Foon, 2001; Brown e Ling, 1988).
Resumidamente, anticorpos anti-idiotípicos monoclonais de ratinho (anti-ids) foram produzidos como se segue. Os esplenócitos de ratinhos imunizados com ch806 foram fundidos com células de plasmocitoma SP2/0-AG 14 e os hibridomas produtores de anticorpos foram selecionados através de ELISA para a ligação específica a ch806 e ligação competitiva ao antigénio (FIG.40). Vinte e cinco hibridomas foram inicialmente selecionados e quatro, designados LMH-11, -12, -13 e -14, segregaram anticorpos que demonstraram ligação específica a ch806, mAb806 e foram capazes de neutralizar a atividade de ligação ao antigénio do ch806 ou mAb806 (FIG.41). 0 reconhecimento do idiotopo ou região CDR do ch806/mAb806 foi demonstrado pela ausência de reatividade cruzada com a IgG policlonal humana purificada.
Na ausência de antigénio des2-7 EGFR recombinante prontamente disponível para ajudar na determinação do ch806 em amostras de soro, a aptidão dos novos anticorpos ch806 anti-idiótipos para ligar simultaneamente regiões variáveis de 806 foi explorada no desenvolvimento de um ELISA específico, sensível para medir o ch806 em amostras clínicas (FIG.42). Utilizando LMH-12 para captura e Biotinilado-LMH-12 para deteção, o ELISA validado apresentou curvas de ligação altamente reprodutíveis para medir o ch806 (2 yg/mL - 1,6 ng/mL) em soros com um limite de deteção de 3 ng/mL. (n=12; 1-100 ng/mL, Coeficiente de Variação < 25% ; 100 ng/mL-5 yg/mL, Coeficiente de Variação < 15%). Não houve qualquer ligação de fundo evidente com os três soros de dadores saudáveis testados e foi observado ligação insignificante com o controlo de isotipo hu3S193. O hibridoma produz níveis altos de anticorpo LMH-12, e encontra-se planeada uma produção em grande escala para possibilitar a medição de ch806 e quantificação de quaisquer respostas imunológicas em amostras clínicas (Brown e Ling, 1988) .
Resultados A imunização de ratinhos e seleção de clones de hibridoma, e a imunorreatividade de amostras de soros de pré- e pós-imunização indicaram o desenvolvimento de títulos altos de mAbs anti-ch806 e anti-huIgG de ratinho. Foram inicialmente selecionados vinte e cinco anticorpos produtores de hibridomas que ligavam o ch806, mas não o huIgG. As caracteristicas de ligação de alguns destes hibridomas são mostradas nas FIG.42A e 42B. Quatro destes hibridomas anti-ch806 com alta afinidade de ligação (clones 3E3, SB8, 9D6 e 4D8) foram subsequentemente prosseguidos para expansão clonal a partir de células únicas por diluição limitante e designados pelo Ludwig Institute for Cancer Research Melbourne como Hibridoma (LMH)-ll, -12, -13 e -14, respetivamente (FIG. 42).
Atividades de Ligação e Bloqueio de Anticorpos Anti-Idiotipicos selecionados A aptidão de anticorpos anti-ch806 para ligar simultaneamente dois anticorpos ch806 é uma caracteristica desejável para a sua utilização como reagentes num ELISA para determinar os níveis de ch806 no soro. Os hibridomas clonais, LMH-11, -12, -13 e -14 apresentaram ligação simultânea (dados não apresentados).
Após expansão clonal, os sobrenadantes das culturas de hibridoma foram examinados por ELISA quanto à aptidão para neutralizar a atividade de ligação ao antigénio do ch806 ou mAb806 com SEGFR621. Os resultados demonstraram a atividade antagonista dos mAbs anti-idiótipos LMH-11, -12, -13 e -14 com o bloqueio em solução da ligação do ch806 e do mAb806 murídeo a placas revestidas com sEGFR (FIG.41 para LMH-11, -12, -13).
Após cultura em maior escala em frascos rotativos, as especificidades de ligação dos hibridomas clonais estabelecidos, LMH-11, -12, -13 e -14 foram verificadas por ELISA. Os anticorpos LMH-11 a -14 foram identificados como sendo de isotipo IgGlK pelo kit de isotipagem de anticorpos monoclonais de ratinho.
ch806 em Amostras Clínicas de Soro. Desenvolvimento do Ensaio de Farmacocinética por ELISA
Para auxiliar na determinação do ch806 em amostras de soro, a aptidão dos anticorpos ch806 anti-idiótipos para ligar simultaneamente a região variável de 806 foi explorada no desenvolvimento de um ensaio ELISA sensível e específico para ch806 em amostras clínicas. Os três clones purificados LMH-11, -12 e -13 (FIG.49B e 49C, respetivamente foram comparados quanto à sua aptidão para capturar e em seguida detetar ch806 ligado em soros. Os resultados indicaram que a utilização de LMH-12 (10 yg/mL) para captura e LMH-12 biotinilado para deteção produzia a sensibilidade mais elevada para ch806 no soro (3 ng/mL) com ligação de fundo insignificante.
Tendo-se estabelecido as condições de farmacocinética ideais por ELISA utilizando 1 yg/mL de LMH-12 anti-idiótipo e 1 yg/mL de LMH-12 biotinilado para captura e deteção, respetivamente, foi realizada a validação do método. Foram realizados três ELISAs separados em quadruplicado para medir o ch806 no soro dador de três dadores saudáveis ou em 1% de BSA/meio com controlo de isotipo hu3S193. Os resultados da validação são apresentados na FIG.43 e apresentam curvas de ligação altamente reprodutíveis para medir o ch806 (2 yg/mL - 1,6 ng/mL) em soros com um limite de deteção de 3 ng/mL. (n=12; 1-100 ng/mL, Coeficiente de Variação < 25%; 100 ng/mL- 5 yg/mL,
Coeficiente de Variação < 15%) . Não foi evidente qualquer ligação de fundo com qualquer um dos três soros testados e foi observada ligação insignificante com o controlo de isotipo hu3Sl93.
Exemplo 21
Avaliação das Estruturas de Hidratos de Carbono e Reconhecimento de Anticorpos
Foram realizadas experiências para avaliar melhor o papel das estruturas de hidratos de carbono na ligação e reconhecimento do EGFR, amplificado e des2-7 EGFR, pelo anticorpo mAb806. A fim de determinar se as estruturas de hidrato de carbono estão diretamente envolvidas no epítopo de mAb806, o sEGFR recombinante expresso em células CHO foi tratado com PNGase F para remover a glicosilação ligada a N. Após tratamento, a proteína foi analisada sobre SDS-PAGE, transferida para membrana e imunotransferida com mAb806 (FIG.44). Como esperado, o sEGFR desglicosilado avança mais depressa no SDS-PAGE, indicando que os hidratos de carbono foram removidos com sucesso. O anticorpo mAb806 ligou claramente o material desglicosilado, o que demonstra que o epítopo do anticorpo é de natureza peptídica e não é exclusivamente um epítopo de glicosilação.
Os lisados, preparados a partir de linhas de células marcadas metabolicamente com 35S, foram imunoprecipitados com anticorpos diferentes dirigidos para o EGFR (FIG.45). Como esperado, o anticorpo 528 imunoprecipitou três bandas de células U87MG.A2-7, uma banda superior correspondente ao EGFR de tipo selvagem (ts) e duas bandas inferiores correspondentes ao des2-7 EGFR. Estas duas bandas de des2-7 EGFR foram anteriormente descritas e presume-se que representam glicosilação diferencial (Chu et al. (1997) Biochem. J. Jun 15; 324 (Pt 3): 885-861). Em contraste, o mAb806 apenas imunoprecipitou as duas bandas de des2-7 EGFR, estando o recetor de tipo selvagem completamente ausente mesmo após sobreexposição (dados não apresentados). Curiosamente, o mAb806 apresentou maior reatividade relativa com a banda inferior do des2-7 EGFR, mas menor reatividade com a banda superior quando comparado com o anticorpo 528. 0 anticorpo sc-03, um anticorpo policlonal de coelho comercial dirigido para o domínio C-terminal do EGFR, imunoprecipitou as três bandas do EGFR como se observou com o anticorpo 528, embora a quantidade total de recetor imunoprecipitado por este anticorpo seja consideravelmente menor. Não foram observadas bandas quando se utiliza um anticorpo de IgG2b irrelevante como um controlo para o mAb806 (ver Exemplo 18). 0 anticorpo 528 imunoprecipitou uma única banda a partir das células U87MG.tsEGFR, correspondente ao recetor de tipo selvagem (FIG.45). 0 mAb806 também imunoprecipitou uma única banda a partir destas células, contudo, esta banda de EGFR migrou claramente mais depressa do que o recetor reativo ao 528. 0 anticorpo sc-03 imunoprecipitou ambas as bandas reativas de EGFR a partir de células U87MG.tsEGFR, confirmando ainda mais que o mAb806 e o 528 reconhecem formas diferentes do EGFR nos lisados de células inteiras a partir destas células.
Como observado com as células U87MG.tsEGFR, o anticorpo 528 imunoprecipitou uma única banda EGFR de células A431 (FIG.45). A banda de EGFR reativa ao 528 é muito larga nestes geles de percentagem baixa (6%) e reflete provavelmente a diversidade de glicosilação do recetor. Foi também observada uma única banda de EGFR após imunoprecipitação com mAb806. Embora esta banda de EGFR não migrasse consideravelmente mais depressa do que a banda reativa larga global do 528, ela estava localizada na extremidade frontal da banda larga do 528 de uma maneira reprodutível. Ao contrário dos lisados celulares de U87MG.A2-7, a quantidade total de EGFR imunoprecipitado pelo mAb806 a partir de lisados de A431 foi consideravelmente menor do que com o anticorpo 528, um resultado coerente com os nossos dados de Scatchard que mostram que o mAb806 reconhece apenas uma porção do EGFR na superfície destas células (ver Exemplo 4) . A imunoprecipitação com SC-03 resultou numa única banda larga do EGFR como para o anticorpo 528. Foram obtidos resultados semelhantes com células HN5 (dados não apresentados). No seu conjunto, estes dados indicam que o mAb806 reage, de um modo preferido, com espécies do EGFR que migram mais depressa, o que pode representar formas do recetor glicosiladas de forma diferenciada.
Para determinar em que fase do processamento do recetor surgia a reatividade com o mAb806, foi realizada uma experiência de impulso/pesquisa. Células A431 e U87MG.A2-7 foram tratadas intermitente durante 5 min com 35S-metionina/cisteína, em seguida, incubadas várias vezes a 37 °C, antes da imunoprecipitação com mAb806 ou 528 (FIG.46). 0 padrão de imunoprecipitação em células A431 com o anticorpo 528 foi típico para um anticorpo dependente da conformação, específico para o EGFR. Uma pequena quantidade de recetor estava imunoprecipitada aos 0 min (i. e.f após o impulso de 5 min) com a quantidade de EGFR marcado a aumentar em cada ponto no tempo. Houve também um aumento simultâneo no peso molecular do recetor com o tempo. Em contraste, o material de EGFR reativo para o mAb806 estava presente em níveis altos aos 0 min, atingiu o máximo aos 20 min e, em seguida, reduziu em cada ponto no tempo adicional. Assim, parece que o mAb80 6 reconhece, de um modo preferido, uma forma do EGFR presente numa fase inicial do processamento. A reatividade ao anticorpo observada em células U87MG.A2-7 marcadas por impulso era mais complicada. A imunoprecipitação com o anticorpo 528 aos 0 min revelou que uma quantidade pequena da banda inferior do des2-7 EGFR estava marcada (FIG.46). A quantidade da banda inferior de des2-7 EGFR reativo ao 528 aumentou com tempo, atingindo o máximo aos 60 min e decrescendo lentamente às 2 e 4 h. Não foi detetada quantidade significativa da banda superior marcada de des2-7 EGFR até aos 60 min, após o que o nível continuou a aumentar até ao final do curso de tempo. Isto indica claramente que o des2-7 EGFR superior é uma forma mais madura do recetor. A reatividade do mAb806 também variou durante o estudo do curso de tempo, contudo o mAb806 precipitou de um modo preferido a banda inferior do de27 EGFR. De facto, não foram observados níveis significativos de banda superior no mAb806 até às 4 h após marcação.
As experiências acima sugerem que o mAb806 reage de um modo preferido com uma forma de glicosilação mais imatura do des2-7 e tsEGFR. Esta possibilidade foi testada immunoprecipitando o EGFR de diferentes linhas de células marcadas de um dia para o outro com 35S metionina/cisteina e submetendo, em seguida, os precipitados resultantes a digestão com Endoglicosidase H (Endo H) . Esta enzima remove de um modo preferido hidratos de carbono do tipo com altos teores de manose (i. e. glicosilação imatura) a partir de proteínas, enquanto deixa os hidratos de carbono complexos (i. e., glicosilação madura) intactos. A imunoprecipitação e digestão com Endo H de lisados de células U87MG.A2-7 marcadas com 528, mAb806 e SC-03 deu resultados semelhantes (FIG.47).
Como previsto, a banda inferior de des2-7 EGFR foi completamente sensível à digestão com Endo H, migrando mais depressa em SDS-PAGE após digestão com Endo Η, o que demonstra que esta banda representa a forma com alto teor de manose do des2-7 EGFR. A banda superior do des2-7 EGFR foi essencialmente resistente à digestão com Endo H, exibindo apenas um diferença muito ligeira na migração após digestão com Endo Η, o que indica que a maioria das estruturas de hidrato de carbono é do tipo complexo. A diminuição pequena mas reprodutível no peso molecular da banda superior após digestão com enzima sugere que apesar dos hidratos de carbono da banda superior do des2-7 EGFR serem predominantemente do tipo complexo, eles possuem algumas estruturas com alto teor de manose. Curiosamente, estas células também expressam quantidades baixas de tsEGFR endógeno que é claramente visível após imunoprecipitação com 528. Houve também uma redução pequena, mas perceptível, no peso molecular do recetor de tipo selvagem após digestão com Endo H, indicando que também contém estruturas com alto teor de manose. A sensibilidade do tsEGFR imunoprecipitado para digestão com Endo H foi semelhante em ambas as células U87MG.tsEGFR e A431 (FIG.47). A maioria do material precipitado pelo anticorpo 528 foi resistente à enzima Endo H, apesar de uma pequena quantidade do material estar na forma de alto teor de manose. Mais uma vez, houve uma pequena diminuição no peso molecular do tsEGFR após digestão com Endo Η, o que sugere que contêm algumas estruturas com alto teor de manose. Os resultados utilizando o anticorpo sc-03 foram semelhantes ao anticorpo 528. Em contraste, a maioria do EGFR precipitado pelo mAb806 foi sensivel à Endo H em ambas as células U87MG.tsEGFR e A431, o que confirma que o mAb806 reconhece de um modo preferido a forma de alto teor de manose do EGFR. Foram obtidos resultados semelhantes com células HN-5, em que a maioria do material precipitado pelo mAb806 foi sensivel à digestão com Endo H, enquanto a maioria do material precipitado com mAb528 e SC-03 foi resistente à digestão com Endo H (dados não apresentados). A iodação da superfície celular da linha de células A431 foi realizada com 125I seguida de imunoprecipitação com o anticorpo 806. O protocolo para a iodação da superfície foi como se segue: A lise celular, imunoprecipitação, digestão com Endo H, SDS-PAGE e auto-radiografia são como aqui descritas acima. Para marcação, as células foram cultivadas em meio com 10% de FCS, desincrustadas com EDTA, lavadas duas vezes com PBS, em seguida ressuspensas em 400 pL de PBS (aprox. 2-3 χ 106 células). A esta foram adicionados 15 pL de 125I (solução-mãe a 100 mCi/mL), 100 pL de solução-mãe de lactoperoxidase bovina (1 mg/mL), 10 pL de H2O2 (solução-mãe a 0,1%) e foram incubados durante 5 min. Foram então adicionados mais 10 pL de H2O2 e a incubação prosseguida durante mais 3 min. As células foram em seguida novamente lavadas 3 vezes com PBS e lisadas em 1% de Triton. A iodação da superfície celular de linha de células A431 com lactoperoxidase, seguida de imunoprecipitação com o anticorpo 806, mostrou que, de modo semelhante aos Usados de células inteiras descritos acima, a forma predominante do EGFR reconhecido pelo 806 ligado na superfície celular de células A431 foi sensível à digestão com EndoH (FIG.48). Isto confirma que a forma de EGFR ligada pelo 806 na superfície celular de células A431 é uma forma sensível à EndoH e, desse modo, é do tipo com alto teor de manose.
Exemplo 22
Anticorpo 806 (recoberto) humanizado A. Construção de hu806
Foi construído um vetor de expressão para um anticorpo 806 humanizado (hu806) . O vetor, designado 8C65AAG (11891 pb; SEQ ID N°: 41), foi concebido para conter ambos os genes para um hu806 inteiro numa única cassete de expressão de genes coordenada pelo promotor GS (FIG. 53 e 54).
As regiões variável (VH) e constante (CH) da cadeia pesada (SEQ ID N°: 42 e 43, respetivamente) são mostradas nas FIG. 55A, com as CDRl, CDR2 e CDR3 (SEQ ID N° : 44, 45, e 46, respetivamente) da região VH indicadas pelo sublinhado.
As regiões variável (VL) e constante (CL) da cadeia leve (SEQ ID N°: 47 e 48, respetivamente) são mostradas nas FIG. 55B, com as CDRl, CDR2 e CDR3 (SEQ ID N° : 49, 50, e 51, respetivamente) da região VL indicadas pelo sublinhado.
Para obter uma construção de anticorpo 806 humanizado foi utilizada a tecnologia de recobrimento (v) (Daugherty et al. (1991) Polymerase chain reaction facilitates the cloning, CDR-grafting, and rapid expression of a murine monoclonal antibody directed against the CD 18 component of leukocyte integrins. Nucleic Acids Res. 19(9), 2471-6; Patente U.S. 6797492 de Daugherty; Padlan, E.A. (1991) A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties. Mol. Immunol. 28(4-5), 489-98; Patente Europeia N° 519596 de Padlan et al.). Para minimizar a imunogenicidade dos domínios variáveis do anticorpo 806, mantendo as propriedades de ligação a ligando, foi efetuada a substituição de resíduos expostos na superfície de regiões estruturais que diferem daqueles geralmente presentes em anticorpos humanos. Para conseguir isto, as cadeias VL e VH do anticorpo monoclonal (mAb) 806 de ratinho foram manipuladas por síntese de genes e tecnologia de iniciadores de PCR sobrepostos. A cadeia CL (kappa) foi montada do mesmo modo. Para demonstrar a manutenção dos sítios de ligação intactos, as vVL e vVH foram também expressas num formato scFv que demonstrou boa ligação ao péptido sintético que compreende o epítopo antigénico do 806 por ELISA e ao domínio extracelular (ECD) do recetor de EGF recombinante (EGFR) como medida através de análise por ressonância plasmónica superficial (SPR).
As v806VL e v806VH foram manipuladas num contexto de IgGl humana de comprimento total utilizando uma kappa-LC de codão otimizado e uma região constante da cadeia pesada de IgGl humana com codão e sítio de excisão-união otimizados, concebida de novo para conseguir a expressão estável de genes em sistemas de células NSO e CHO. 0 sistema de expressão baseia-se no sistema de expressão LONZA GS utilizando os vetores de expressão das cadeias pesada e leve pEEl2.4 e pEE6.4 como proporcionados pelo LONZA Biologies. 0 produto de anticorpo hu806 (FIG.55) obtido por expressão transitória do vetor 8C65AAG foi reativo com o EGFR-ECD recombinante por SPR e com o epítopo peptídico do EGFR sintético para o 806 por ELISA. O vetor 8C65AAG foi transferido para LICR Affiliate Christoph Renner (University of Zurich) para produção de linhas de células GS-NSO hu806 estáveis e para LICR, Melbourne Centre, para a produção de linhas de células GS-CHO hu80 6.
Estratégia para construção, amplificação e clonagem dos genes do anticorpo hu806
Recobrimento e otimização do codão 0 recobrimento de anticorpos é uma estratégia de humanização com o objetivo de neutralizar respostas HAMA (anticorpo anti-ratinho humano). Os mAbs de ratinho são considerados antigénios "estranhos" por o sistema imunitário de um doente e é induzida uma resposta imunológica, mesmo após uma administração única, impedido a utilização posterior do reagente nesses doentes. No primeiro passo do processo de recobrimento do mAb806, as sequências de aminoácidos das cadeias VL e VH do mAb806 foram analisadas, e cada resíduo de aminoácido na sequência de proteína do mAb806 foi classificada quanto à exposição superficial (FIG.56 e FIG.57). Apenas aqueles aminoácidos que residiam do lado de fora da molécula de anticorpo foram considerados para possível modificação, já que estes eram os únicos que ficaram expostos ao reconhecimento pelo anticorpo. Utilizando BLAST, a sequência de proteína do mAb806 foi comparada com três sequências de anticorpos humanos (VH36qerm, CAD26810 e AAA37941). Sempre que um resíduo da superfície do mAb806 não coincidisse com o consenso das sequências dos anticorpos humanos, esse resíduo era identificado para ser modificado para a sequência consenso. Inicialmente 12 aminoácidos na VL foram submetidos a recobrimento; e 14 na cadeia VH do ch806 (FIG.56 e FIG.57). A otimização do codão é um meio de melhoramento da expressão heteróloga de anticorpos ou outras proteínas com base no desvio do codão do sistema utilizado para expressar estes anticorpos. Um dos objetivos da criação do hu806 foi utilizar a otimização de codão para melhorar os níveis de expressão para este anticorpo. 0 sistema de expressão baseia-se no sistema de expressão LONZA GS utilizando os vetores de expressão de HC e LC pEEl2.4 e pEE6.4 como fornecidos pela LONZA Biologies e células NSO e/ou CHO como células de produção. Assim, as decisões sobre que codão utilizar para um dado aminoácido foram tomadas tendo em consideração se esse codão seria, ou não, favorecido nos sistemas de expressão de NSO/CHO.
Construção e Amplificação das Sequências de ADN de 806 por
PCR
As sequências para as versões recobertas, de codão optimizado das regiões pesada variável (VH) e leve variável (VL) do anticorpo hu806 foram sintetizadas da seguinte maneira: Para cada região (VH ou VL) , 8-10 oligonucleótidos foram concebidos como iniciadores mensageiros e antimensageiros sobrepostos. Estes oligos sobrepor-se-iam uns com os outros de modo a cobrir a sequência VH ou VL do hu806 completo, incluindo a sequência sinal, sequências codificantes, intrões e incluem um sitio HindIII na extremidade 5' e um sitio 3' BamHI na extremidade 3'. Os mapas dos oligonucleótido são apresentados nas FIG. 56B e 57B, e os detalhes do iniciador são proporcionados abaixo.
Resumidamente, a VH ou VL do hu806 foi reunida por PCR como se segue: Inicialmente, os v806hc- ou v8061c-oligos 1, 2, 3, 4, oligos 5, 6, e oligos 7, 8, 9, 10 foram combinados em três reações separadas. Alíquotas (50 pmol) de cada oligo flanqueador e 5 pmol de cada oligo interno foram adicionados a uma reação de PCR em 50 pL contendo 25 pL de 2x HotStar Taq Master Mix (Qiagen) e 48 pL de água isenta de nuclease. O programa do ciclo térmico foi como se segue: 95 °C; 15", [94 °C; 30", 58 °C; 30", 72 °C; 30"] x 20 ciclos, 72 °C; 10", 4 °C. Os produtos destas três reações foram excisados após separação por gel eletroforese. Estes foram, em seguida, purificados utilizando uma coluna de sal (Qiagen-Qiaspin Minipreps) e combinados. Estes produtos foram adicionalmente amplificados por PCR utilizando os iniciadores 1 e 10. O produto desta segunda reação incluía sítios de enzimas de restrição para HindIII e BamHI, possibilitando a inserção em plasmídeos de expressão.
Oligonucleótidos utilizados para sintetizar as regiões V do hu806 por PCR:
hu806 CL:
Uma versão de codão optimizado da cadeia leve constante kappa (CL) foi preparada de uma maneira semelhante à utilizada para as regiões variáveis. No entanto, o passo de PCR inicial envolveu a criação de apenas dois produtos preliminares utilizando oligos VKlcons- 1, 2, 3, 4; e 5, 6, 7, 8. Além disso, os sítios de restrição flanqueadores para este produto foram BamHI e Notl antes da inserção do plasmídeo.
Oligonucleótidos utilizados para sintetizar as regiões CL do hu806 por PCR:
CH de hu806:
Uma versão sintética, humanizada do gene da cadeia pesada constante (CH) da IgGl (SEQ ID N°: 80) foi adquirida de GeneArt, Regensburg, Alemanha. O gene era de codão optimizado para a expressão em células CHO/NSO. Os detalhes da sequência do gene, sítios de restrição, etc, são mostrados nas FIG.58.
Construção dos Plasmídeos de Expressão
Para transfeção transitória e avaliação preliminar, as sequências VH e VL de hu806 preparadas do modo descrito acima foram ligadas em vetores de expressão contendo regiões constantes genéricas. Estes vetores, fornecidos pela LICR Affiliate Christoph Renner (University of Zurich, Suíça), foram conhecidos como pEAK8 HC (o qual continha uma CH genérica), e a33-xm-lc (o qual continha uma CL genérica) . Os vetores foram digeridos utilizando BamHI e HindIII na presença de CIP, em seguida as VH e VL do hu806 foram ligadas nos vetores correspondentes. Os plasmídeos resultantes foram utilizados para transformar E. coli quimicamente competente ToplO (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. As E.Coli transformadas foram aplicadas em placas LB fAmpicilina, e os clones resistentes foram selecionados por digestão de restrição e PCR. Em geral, seriam isolados oito clones positivos detetados desta maneira e adicionalmente amplificados. Os ADN purificados destas colónias foram analisados por sequenciação de ADN automatizada.
As versões de codão otimizado das regiões constantes foram adicionadas a estas construções por digestão com enzimas de restrição e ligação utilizando BamHI e NotI. Estes transformantes foram selecionados, sequenciados e analisados como indicado acima. Antes das cadeias de anticorpo de comprimento total serem ligadas no sistema Lonza GS o sitio BamHI entre as sequências das regiões variável e constante foi destruído, num caso, por digestão utilizando BamHI, preenchido utilizando ADN Polimerase e ligação de extremidade romba.
Os fragmentos de restrição contendo hu806 (VH + CH) ou hu806 (VL + CL) foram em seguida digeridos com NotI, seguida de HindIII. Estas digestões foram concebidas para criar uma extremidade romba no sítio NotI, e foram assim feitas em série do seguinte modo: 0 plasmídeo foi primeiro digerido com NotI. 0 plasmídeo completamente digerido (corte único) foi separado por electroforese utilizando um gel de agarose a 1%. Este produto foi em seguida excisado e purificado numa coluna de sal e preenchido utilizando ADN Polimerase. 0 produto desta reação foi purificado por coluna de sal e, em seguida, digerido com HindIII. Este produto (~l,3Kb para o hu806 (VH + CH), e ~0,8 Kb para o hu806 (VL + CL) foi, em seguida, separado por electroforese sobre gel, excisado e purificado.
Os vetores pEEl2.4 e pEE6.4 (Lonza Biologies pic, Slough, RU) foram, cada, digeridos sobre HindIII e PmlI. 0 hu806 (VH + CH) foi ligado ao pEEl2.4 para produzir o pEEl2.4-hu806H, e o hu806 (VL + CL) foi ligado ao pEE6.4 para produzir o pEE6.4-hu8 0 6L.
Após seleção foi produzido um plasmídeo Lonza de duplo gene, combinado contendo as sequências das cadeias pesada e leve do hu806. Resumidamente, os vetores pEEl2.4-hu806H e pEE6.4-hu806L foram digeridos com as enzimas de restrição Notl e Sail. Os fragmentos resultantes, os quais continham a unidade de transcrição GS e promotor hCMV-MIE, seguidos da cassete de expressão da cadeia pesada ou leve de hu806, foram isolados e ligados em conjunto. 0 plasmídeo Lonza "combinado" resultante (Designado 8C65AAG) foi utilizado para transfecções transitórias de plasmídeo único num sistema HEK 293 e transfeções estáveis em sistemas NSO e CHO. Um mapa do plasmídeo é mostrado na FIG.53.
Modificações às Construções
As sequências de aminoácidos verificadas para a sequência completa dos hu806Hc e hu806Lc recobertos, são mostradas em comparação com o mAb806 nas FIG. 59 e FIG.60, respetivamente. A flanquear a sequência de hu806 dentro dos apêndices encontram-se asteriscos (*) que indicam alterações de recobrimento iniciais e os números (1-8) referem-se às modificações numeradas desde o N° 1 ao N° 8, aqui descritas.
No que diz respeito à FIG.60, o ficheiro de referência (mAb806 LC) indica incorretamente Histidina (H) , não a Tirosina (Y) correta na posição 91; o objeto da modificação N° 1. 0 ficheiro da sequência original, não corrigido está incluído na FIG.60, para ilustrar a modificação necessária feita ao hu806 na posição 91.
Um número de modificações foi feito nas sequências de ADNc do hu806 após a construção inicial e a fase da SEQuenciação. As razões para fazer estas modificações incluíram: introdução de 4 sítios de enzimas de restrição para efeitos de modificação da sequência, para corrigir 2 erros de aminoácidos na sequência introduzidos durante a PCR, para corrigir um erro de aminoácido resultante da documentação inicial do mAb806, e para manipular por engenharia 4 alterações de aminoácidos adicionais para obter variantes de recobrimento adicionais. Foram realizadas as seguintes 8 fases de modificações:
1. VL de hu8 0 6: CDR3 H91Y 0 documento a partir do qual foram produzidos os oligonucleótidos originais especificava incorretamente que havia um CAC (Histidina, H) na posição 91 da CDR3 da sequência da VL do mAb806. Foi utilizada mutagénese específica de um lócus para produzir a sequência correta de TAC (Tirosina, Y; Patente W002/092771). A alteração consequente na sequência de aminoácidos nesta posição foi de CVQHAQF (SEQ ID N° : 84) para CVQYAQF (SEQ ID N° : 85) . 0 ADN final e a sequência de proteína traduzida em comparação com o ch806 são mostrados na FIG.61.
Iniciador mensageiro para a modificação de histidina para tirosina da região VL de hu806 (PDV 1; 40mero) 5'- CCACATACTACTGCGTCCAGTACGCTCAGTTCCCCTGGAC-3' (SEQ ID N°: 86)
Iniciador antimensageiro para a modificação de histidina para tirosina da região VL de hu806 (PDV2; 20mero) 5'- CTGGACGCAGTAGTATGTGG-3' (SEQ ID N°: 87) 2. Cadeia Pesada de hu806: Adição dos Sítios de Restrição Drain e Fsel
Foram adicionados sítios de enzimas de restrição aos intrões circundantes às regiões VH e VL de hu806. Estes sítios de restrição (únicos no sistema vetor pREN, LICR) foram concebidos para facilitar o processo de preparação de modificações às cassetes de expressão. A sequência VH de hu806, sem incluir a região sinal inicial, pode ser removida ou inserida por digestão única em Drain. Além disso, a Fsel pode ser utilizada, em combinação com Notl (sistema pREN) ou EcoRI (Sistema Lonza) para cortar a região constante, cumprindo a função de BamHI da sequência original.
Estas modificações foram conseguidas utilizando um processo de PCR de dois passos. Os produtos foram, em seguida, digeridos com HindlII e BglII. Estes foram então ligados em vetores pREN contendo regiões constantes de codão optimizado, as quais tinham sido digeridas em HindIII e BamHI. Este processo de religação detruiu o sitio BamHI.
Iniciador mensageiro para a região variável a montante do primeiro sitio de Drain (cadeia pesada de 806 Drain para cima; 2 6mero) 5'-GAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTG-3' (SEQ ID N°: 88)
Iniciador antimensageiro que incorpora o sitio I de Drain (cadeia pesada de 806 Drain para baixo; 28mero) 5'-CACTGGGTGACTGGCTTCGATGGTGACC-3' (SEQ ID N°: 89)
Iniciador mensageiro para a região variável da HC entre os dois sítios Drain (cadeia pesada de 806 DralII-Fsel para cima; 4 9mero) 5'-GGTCACCATCGAAGCCAGTCACCCAGTGAAGGGGGCTTCCATCCACTCC-3' (SEQ ID N°: 90)
Iniciador antimensageiro que incorporas o sítio II de Drain e o sítio Fsel (cadeia pesada de 806 DralII-Fsel para baixo; 44mero) 5'-CCAAGATCTGGCCGGCCACGGTGTGCCATCTTACCGCTGCTCAC-3' (SEQ ID N°: 91) 3. Cadeia Leve de hu806: Adição de Sítios de Restrição RsrII e Pad
Para a cadeia leve de hu806, os sítios de restrição adicionados foram Rsrll, que tem a mesma função que o Drain na cadeia pesada, e Pad, que coincide com a função de Fsel.
Iniciador mensageiro para a região variável a montante do primeiro sítio de Rsrll (cadeia leve de 806 Rsrll para cima; 22mero) 5'-GAGAAGCTTGCCGCCACCATGG-3' (SEQ ID N°: 92)
Iniciador antimensageiro que incorpora o sítio I de Rsrll (cadeia leve de 806 Rsrll para cima; 25mero) 5'-CGGTCCGCCCCCTTGACTGGCTTCG-3' (SEQ ID N°: 93)
Iniciador mensageiro para a região variável LC entre os dois sítios Rsrll (cadeia leve de 806 RsrlI-PacI para cima; 45mero) 5'-CGAAGCCAGTCAAGGGGGCGGACCGCTTCCATCCACTCCTGTGTC-3' (SEQ ID N°: 94)
Iniciador antimensageiro que incorpora o sítio II de Rsrll e o sítio Pad (cadeia leve de 806 RsrlI-PacI para baixo: 50mero) 5'-CCAAGATCTTTAATTAACGGACCGCTACTCACGTTTGATTTCCAGTTTTG-3' (SEQ ID N°: 95)
4. VH de hu806: Recobrimento de P85A A sequência de proteína para o mAb806 parental nos aminoácidos 81-87 da VH é SVTIEDT (SEQ ID N°: 96). Como parte do processo de recobrimento, a isoleucina e o ácido glutâmico nas posições 84 e 85 foram mudados para alanina-prolina para ler SVTAPDT (SEQ ID N° : 97; FIG.56) . Após análise adicional, foi decidido que, neste caso, a alanina poderia ter sido uma melhor escolha do que a prolina. Foi utilizada mutagénese específica de um lócus para produzir esta alteração secundária (SVTAADT, SEQ ID N° : 98) utilizando os iniciadores listados abaixo. As sequências do ADN final e da proteína traduzida são apresentadas na FIG.62.
Iniciador mensageiro (Fx3; 49mero) 5'-CTGCAGCTGAACTCCGTTACAGCCGCAGACACAGCAACATATTACTGCG-3' (SEQ ID N° : 99)
Iniciador antimensageiro (Fx4; 49mero) 5'-CGCAGTAATATGTTGCTGTGTCTGCGGCTGTAACGGAGTTCAGCTGCAG-3' (SEQ ID N°: 100) 5. hu806 VH: Recobrimento Adicional A sequência da região variável da cadeia pesada de hu806 sofreu três mutações adicionais após o recobrimento inicial: T70S, S76N e Q81K. A alteração na posição 76 de serina para asparagina representou uma correção de retorno à sequência original da molécula de mAb806. As alterações adicionais na região estrutural foram incluídas porque representam resíduos que não estão presentes nos anticorpos de ratinho mas estão presentes em anticorpos humanos. Por conseguinte, a sequência de proteína TRDTSKSQFFLQ (SEQ ID N° : 101) foi recoberta para SRDTSKNQFFLK (SEQ ID N°: 102). As sequências do ADN final e proteína traduzida em comparação com o mAb806 são apresentadas na FIG. 62.
Iniciador mensageiro para o fragmento de PCR 5' da região variável da HC (hu806HCfx2-5p-U; 49mero) 5'-GGTCACCATCGAAGCCAGTCACCCAGTGAAGGGGGCTTCCATCCACTCC-3' (SEQ ID N°: 103)
Iniciador antimensageiro para o fragmento de PCR 5', incorpora as primeiras duas alterações (hu806HCfx2-5p-D; 45mero) 5'-GATTCTTCGACGTGTCCCTTGAGATTGTGATCCGGCTTTTCAGAG-3' (SEQ ID N°: 104)
Iniciador mensageiro para o fragmento de PCR 3' , incorpora todas as alterações (hu806HCfx2-3p-U; 55mero) 5'-CAAGGGACACGTCGAAGAATCAGTTCTTCCTGAAACTGAACTCCGTTACAGCCGC-3 ' (SEQ ID N°: 105)
Iniciador antimensageiro para o fragmento de PCR 3' da região variável da HC (hu806HCfx2-3p-D; 44mero) 5'-CCAAGATCTGGCCGGCCACGGTGTGCCATCTTACCGCTGCTCAC-3' (SEQ ID N°: 106)
6. hu806 VL: Recobrimento de E79Q
Esta foi a única modificação de recobrimento da VL
pós-construção realizada. Na posição 79 foi utilizada mutagénese especifica de um lócus para corrigir a sequência SSLEPE (SEQ ID N°: 107) para SSLQPE (SEQ ID N°: 108). As sequências do ADN final e proteína traduzida em comparação com o ch806 são apresentadas na FIG.61.
Iniciador mensageiro para o fragmento de PCR 5' da região variável da LC (hu806LC-5p-U; 45mero) 5'-CGAAGCCAGTCAAGGGGGCGGACCGCTTCCATCCACTCCTGTGTC-3' (SEQ ID N°: 109)
Iniciador antimensageiro para o fragmento de PCR 5', incorpora a mutação pretendida (hu806LC-5p-D; 34mero) 5'-CTCTGGTTGTAAGCTAGAGATGGTCAGTGTATAG-3' (SEQ ID N°: 110)
Iniciador mensageiro para o fragmento de PCR 3' da região variável da LC, incorpora a mutação pretendida (hu806LC-3p-U; 45mero) 5'-CCATCTCTAGCTTACAACCAGAGGACTTTGCCACATACTACTGCG-3' (SEQ ID N°: 111)
Iniciador antimensageiro para o fragmento de PCR 3' da região variável da LC (hu806LC-3p-D; 50mero) 5'-CCAAGATCTTTAATTAACGGACCGCTACTCACGTTTGATTTCCAGTTTTG-3' (SEQ ID N°: 112) 7. cadeia leve de hu806: modificação de excisão-união da região constante kappa
Esta mutação pontual foi necessária para corrigir um erro na excisão-união da versão de codão optimizado da região constante kappa. Antes desta alteração, a porção da cadeia de aminoácidos que começava com VYACEVTH (SEQ ID N°: 113) e prosseguia até ao final da molécula não teria sido incluída no anticorpo final (FIG. 60).
Iniciador mensageiro para o fragmento de PCR 5' da constante kappa da LC (Fl; 21 mero) 5'-GGCGGCACAAAACTGGAAATC-3' (SEQ ID N°: 114)
Iniciador antimensageiro para o fragmento de PCR 5' da constante kappa da LC, incorpora a correcção (F2; 59mero) 5 ' - GATGAGTTACTTCACAGGCATATACTTTGTGCTTTTCATAATCAGCTTTTGACAGTGTC-3' (SEQ ID N°: 115)
Iniciador mensageiro para o fragmento de PCR 3' da constante kappa da LC, incorpora a correção (F3; 26mero) 5'-AGTATATGCCTGTGAAGTAACTCATC-3' (SEQ ID N°: 116)
Iniciador antimensageiro para o fragmento de PCR 3' da constante kappa da LC. (F4; 17mero) 5'-GCCACGATGCGTCCGGC-3' (SEQ ID N°: 117)
8. VH de hu8Ο6: N60Q
Além das alterações de recobrimento feitas ao anticorpo 806 nas fases inicias da construção, a Asparagina na posição 60 da CDR2 de VH foi mudada para Glutamina nesta altura. A N-glicosilação segue o esquema: N X S/T, em que X é qualquer aminoácido. A sequência de aminoácidos da posição 60 era N P S, o que segue este esquema. No entanto, não é frequente encontrar-se uma prolina (como no nosso exemplo) ou cisteína na posição X para N-glicosilação. Houve alguma preocupação de que a glicosilação inconsistente pudesse levar a variações da reatividade do anticorpo. Assim, a asparagina foi removida, e substituída pelo aminoácido mais estreitamente relacionado, glutamina, eliminando qualquer potencial para este sitio ser glicosilado (FIG. 59 e FIG.62).
Ligação da construção de Anticorpo hu806 Recoberto 8C65AAG A transfeção transitória de células 293FT com o plasmideo final 8C65AAG foi realizada para possibilitar a preparação de quantidades pequenas de hu806 para verificação inicial da ligação ao antigénio. Os sobrenadantes das culturas de várias transfeções transitórias repetidas em pequena escala foram agrupados, concentrados e anticorpo hu806 foi recolhido utilizando um passo de cromatografia em proteína A. Foi obtido, aproximadamente, 1-2 yg de anticorpo hu806 como medido por um ELISA de huIgGl quantitativo e o anticorpo foi analisado por Biacore em relação à ligação ao EGFR-ECD recombinante (FIG.63). A imunoglobulina bovina do meio de cultura de células co-purificou com o hu806 e representava a fração principal da
IgG total, limitando a avaliação quantitativa da ligação do hu80 6.
Iniciadores da Seguenciação
RenVecAUPSTREAM: Iniciador mensageiro, começa a sequenciar a montante da região variável dos vetores peak8 e a33xm. 5'-GCACTTGATGTAATTCTCCTTGG-3' (SEQ ID N°: 118)
RenVecDwnstrmHC: Iniciador antimensageiro, começa a sequenciar a jusante da região variável no plasmídeo da cadeia pesada peak8. Emparelha dentro da região constante da HC de codão não otimizado. 5'-GAAGTAGTCCTTGACCAGG-3' (SEQ ID N°: 119)
RenVecDwnstrmLC: Iniciador antimensageiro, começa a sequenciar a jusante da região variável no plasmídeo da cadeia leve a33-xm-lc. Emparelha dentro da região constante da LC de codão não otimizado. 5'-GAAGATGAAGACAGATGGTGCAG-3' (SEQ ID N°: 120)
Upstrm Lonza: Iniciador mensageiro, começa a sequenciar a montante da região variável nos vetores Lonza pEE 12.4 e pEE 6.4. Não pode ser utilizado com Lonza combinado porque esta é uma região duplicada no plasmídeo combinado. 5'-CGGTGGAGGGCAGTGTAGTC-3' (SEQ ID N°: 121)
Dnstrm 6-4: Iniciador antimensageiro, começa a sequenciar a jusante da região constante no vetor Lonza pEE 6.4 5'-GTGATGCTATTGCTTTATTTG-3' (SEQ ID N°: 122)
Dnstrm 12-4: Iniciador antimensageiro, começa a sequenciar a jusante da região constante no vetor Lonza pEE 12.4 5'-CATACCTACCAGTTCTGCGCC-3' (SEQ ID N°: 123)
Cod-Opt LC const E: Iniciador mensageiro, interno à região constante kappa v da cadeia leve de codão optimizado 5'-CCATCCTGTTTGCTTCTTTCC-3' (SEQ ID N°: 124)
Cod-Opt LC const F: Iniciador antimensageiro, interno à região constante kappa v da cadeia leve de codão optimizado (vk) . 5'-GACAGGGCTGCTGAGTC-3' (SEQ ID N°: 125) 806HCspec: Iniciador mensageiro, interno e único à versão recoberta da região variável da HC de 806. 5'-GTGCAGCTCCAAGAGAGTGGAC-3' (SEQ ID N°: 126) 806LCspec: Iniciador mensageiro, interno e único à versão recoberta da região variável da LC de 806. 5'-CAGAGTCCATCCAGCATGTC-3' (SEQ ID N°: 127)
Um documento de texto no formato GenBank da sequência e anotações do plasmídeo 8C65AAG que codifica a IgGl hu806 é explicitado na FIG. 64. A FIG. 53 foi criada utilizando o vetor NTI (Invitrogen).
As FIG. 59-62 foram criadas utilizando o vetor NTI AlignX.
Discussão 0 recobrimento do anticorpo anti-recetor de EGF 806 envolveu a mutação de 14 aminoácidos na VH (FIG. 59 e FIG. 62) e 12 alterações à cadeia VL (FIG. 60 e FIG.61) com otimização de codão como indicado para expressão em células de mamífero CHO ou NSO. O vetor de gene duplo final, designado 8C65AAG, foi verificado em relação à sequência, e a sequência codificante e tradução verificadas. A ligação ao domínio extracelular do EGFR recombinante foi confirmada através de análises por Biacore utilizando o produto hu806 expresso transitoriamente.
Os clones únicos estáveis que produzem níveis altos de anticorpo hu806 intacto foram selecionados em meio isento de glutamina como recomendado por LONZA. Os clones estáveis foram gradualmente desmamados de soro para obter culturas isentas de soro. B. Caracterização do hu806 in vitro e in vivo
Os transfetantes de GS-CHO hu806, 14D8, 15B2 e 40A10, e transfetante de GS-NSO hu806, 36, estáveis de produção mais elevada foram prosseguidos e fomentadas culturas em pequena escala para possibilitar a purificação e caracterização do produto de hu806 preliminar. Os resultados indicaram propriedades fisico-quimicas semelhantes. Por conseguinte, foi efetuada uma cultura em tanque agitado em maior escala (15 L) para o transfetante de produção mais elevada (GS-CHO hu806 40A10) e o produto purificado foi sujeito a caracterização adicional in vitro e estudos de terapia in vivo em modelos de xenoenxertos de U87MG.des2-7 e A431.
Metodologia e Resultados
Produção e Processamento a Jusante:
Pequena Escala
As experiências com balões agitados foram realizadas com balões de agitação E500 com um volume de cultura de células de 100 mL. A FIG.76 apresenta a viabilidade celular e gráficos de produtividade de anticorpo para os quatro transfetantes durante a cultura. A concentração de produto foi estimada por ELISA utilizando o anticorpo anti-idiotípico 806 LMH-12 (Liu et al. (2003) Generation of anti-idiotype antibodies for application in clinical immunotherapy laboratory analyses. Hybrid Hybridomics. 22(4), 219-28) como anticorpo de revestimento e o ch806 Lote
Clinico: J06024 como padrão. Na colheita, o material foi centrifugado e o sobrenadante foi filtrado através de 0,2 ym, em seguida os anticorpos foram purificados por afinidade através de cromatografia em Proteína A.
Grande Escala A linha de células transfetante CHO-K1SV que expressa o clone de hu806 candidato 40A10 foi cultivada num biorreactor de tanque agitado de 15 L com alimentação pontual de glucose durante 16 dias utilizando CD-CHO (Invitrogen)/L-Metionina sulfoximina 25 yM (MSX; Sigma)/suplementos GS (Sigma) como o meio de base. A FIG.76C apresenta o crescimento de células e produção volumétrica no biorreator de tanque agitado de 15 L. O rendimento final foi 14,7 L a 58 mg/L por ELISA.
Na colheita, o material foi centrifugado e o sobrenadante foi filtrado através de 0,2 ym, em seguida concentrado até 2L utilizando 2 χ membranas de 30K num concentrador Pali Centrimate. Alíquotas (4 χ 500 mL) foram subsequentemente aplicadas numa coluna de Proteína A de 250 mL e eluídas com Citrato 50 mM, pH 4,5 contendo NaCl 200 mM. O anticorpo eluído a partir de 4 separações foi então agrupado, concentrado e submetido a diálise para PBS, pH 7,4.
Os produtos de hu806 das culturas em pequena e grande escala foram quantificados por DO A280 nm. As amostras de anticorpo recuperadas a partir de Proteína A foram avaliadas por cromatografia de exclusão molecular (SEC) (pequena escala, FIG.77; grande escala, FIG.78), SDS-PAGE com 4-20% de Tris-Glicina sob condições redutoras e não redutoras (FIG. 79-81), e a Focagem Isoeléctrica foi realizada com um sistema de Electroforese Amersham Multiphor II numa placa Ampholine PAG (pH 3,5-9,5) de acordo com as instruções do fabricante (FIG. 82) .
Os anticorpos hu806 purificados por afinidade em Proteína A apresentaram picos simétricos de proteína e perfis de eluição de SEC idênticos ao material de referência clínico ch806. Os perfis do gel de SDS-PAGE foram coerentes com uma imunoglobulina. 0 padrão de IEF indicou três isoformas com pi que variam desde 8,66 a 8,82, o que foi coerente com o pi calculado de 8,4 para a sequência de proteína.
Análises de Ligação
Análise por FACS
As estimativas de concentração de anticorpo determinadas para cada amostra pela DO A280 nm foram utilizadas para as análises por FACS com as células A431 da linha de células de adenocarcinoma (contendo a amplificação do gene de EGFR). A requerente observou anteriormente que o mAb806 ligava aproximadamente 10% dos ~2 χ 106 tsEGFR expressos nas células tumorais A431 em comparação com o mAb528 específico para o tsEGFR (Johns et al. (2002) Novel monoclonal antibody specific for the de2-7 epidermal growth factor receptor (EGFR) that also recognizes the EGFR expressed in cells containing amplification of the EGFR gene. Int. J. Cancer. 98(3), 398-408). As células foram reveladas com uma das quatro amostras de hu806, um anticorpo de IgG2b irrelevante ou controlo positivo ch806; cada um foi avaliado a uma concentração de 20 yg/mL. Foi também incluído um controlo para o anticorpo secundário sozinho [anti-huIgG de Cabra (específico para Fc) conjugado com FITC] . A curvas de ligação compósitas por FACS são apresentadas na FIG. 83 e demonstram revelação equivalente para todas as construções.
As características de ligação de células da amostra hu806 40A10 produzida em cultura de grande escala foram também avaliadas por FACS quanto à ligação a células A431 bem como células de glioma U87MG.des2-7 que expressam o recetor EGFRvIII variante (Johns et al., 2002). Resultados representativos de análises em duplicado são apresentados nas FIG.84 e FIG.85, respetivamente. Os controlos incluíram um anticorpo de IgG2b irrelevante (histogramas sombreados), o ch806 ou 528 (liga o EGFR de tipo selvagem e des2-7) como indicado. O anticorpo ch806 e o anticorpo hu806 demonstraram revelação semelhante das linhas de células A431 e U87MG.des2-7, o que apoia as observações anteriores da requerente, de que o mAb806 reconhecia especificamente o des2-7 EGFR e um subconjunto do EGFR sobreexpresso (Luwor et al. (2001) Monoclonal antibody 806 inhibits the growth of tumor xenografts expressing either the de2-7 or amplified epidermal growth factor receptor (EGFR) but not wild-type EGFR. Cancer Res. 61(14), 5355-61). Como esperado, o anticorpo 528 revelou ambas as linhas de células U87MG.des2-7 e A431 (FIG. 84 e 85).
Análises de Ligação a Células
As capacidades de ligação ao antigénio dos radioimunoconjugados foram avaliadas por ensaios de adsorção celular (Lindmo et al. (1984) Determination of the immunoreative fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess. J. Immunol. Methods. 72(1), 77-89) utilizando a linha de células U87MG.des2-7 de glioma e as células de carcinoma epidermbide A431 que expressam o gene de EGFR amplificado.
As frações imunorreativas dos radioconjugados de hu806 e ch806 foram determinadas por ligação a células que expressam antigénios na presença de antigénio em excesso. Os resultados para a ligação de 125I-hu806 e 125I-ch806 às células U87MG.des2-7 são apresentados na FIG.86A ao longo da gama de concentração celular de 20χ106 a 0,03><106 células/amostra. Os resultados para a ligação de 125I-hu806 e 125I-ch806 às células A431 são apresentados na FIG.86B ao longo da gama de concentração celular de 200xl06a 0,39χ106 células/amostra.
Foram utilizadas análises Scatchard para calcular a constante de associação (Ka) (Lindmo et al. , 1984) . A ligação de níveis baixos (20 ng) de anticorpo marcado sozinho foi comparada com a ligação na presença de anticorpo não marcado em excesso. A fração imunorreativa foi tida em consideração ao calcular a quantidade de anticorpo reativo, livre como anteriormente descrito (Clarke et al. (2000) In vivo biodistribution of a humanized anti-Lewis Y monoclonal antibody (hu3S193) in MCF-7 xenografted BALB/c nude mice. Cancer Res. 60(17), 4804-11) e a ligação específica (nM; total anticorpo χ % ligada) foi representada graficamente contra a ligação especifica/livre reativa (FIG.87 e 88). A constante de associação foi determinada a partir do declive negativo da linha. A afinidade de ligação para a ligação de 125I-hu806 ao EGFRvIII em células U87MG.des2-7 foi determinada como sendo 1,18 x 109 M-1. 0 Ka para o 125I-ch806 foi de 1,06 χ 109 M_1. Estas observações estão em concordância com os resultados relatados de valores de Ka para niIn- e 125I-ch806 de l, 36x 109 M-l e 1,90 χ 109 M-1, respetivamente, o qual é altamente comparável ao do mAb806 murideo parental de 1,1 χ 109 M_1 (Panousis et ai. (2005) Engineering and characterization of chimeric monoclonal antibody 806 (ch806) for targeted immunotherapy of tumours expressing de2-7 EGFR or amplified EGFR. Br. J. Cancer. 92(6), 1069-77). A análise scatchard sobre células A431 demonstrou alta afinidade de ligação por ambas as construções de 806 para uma população menor de EGFR nestas células. O Ka para o 125I-ch806 foi de 0,61 χ 109 M_1; e para o 125I-hu806, o Ka = 0,28 χ 109 M_1.
Análise de Biossensor
As análises de biossensor foram realizadas num biossensor BIAcore 2000 utilizando um chip sensor revestido com carboximetildextrano (CM5). O chip foi derivatizado no canal 3 com o péptido do epítopo de 806 (aminoácidos 287-302 do EGFR; SEQ ID N° : 14; ver Pedido de Patente U.S. N° 11/060646, apresentado em 17 de fevereiro de 2005; Pedido de Patente Provisório U.S. N° 60/546602, apresentado em 20 de Fevereiro de 2004; e Pedido de Patente Provisório U.S. N° 60/584623, apresentado em 1 de Julho de 2004), utilizando química de acoplamento de amina convencional. O canal 2 foi derivatizado com um antigénio de controlo utilizado para determinar a aptidão do sistema. O canal 1 foi derivatizado com etanolamina e utilizado como um canal de controlo branco para correcção dos efeitos de índices refrativos. As amostras de hu806 foram diluídas em tampão HBS (HEPES 10 mM, pH 7,4; NaCl 150 mM; di-Na-EDTA 3,4 mM; 0,005 % de Tween-20) e alíquotas (120 yL) contendo 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM e 300 nM foram injetadas sobre a superfície do chip sensor a um caudal de 30 yL/min. Após a fase de injeção, a dissociação foi seguida fazendo passar tampão de HBS sobre a superfície do chip durante 600s. O anticorpo ligado foi eluído e a superfície do chip regenerada entre amostras por injeção de 20 yL de solução de hidróxido de sódio 10 mM. Foi incluído um controlo positivo, ch806. Os parâmetros de ligação foram determinados utilizando o modelo de ligação de equilíbrio do software BIAevaluation. A FIG. 89 apresenta os sensorgramas produzidos.
Foi observada ligação dependente da dose com o hu806 e o controlo positivo, ch806, no canal 3. A aptidão do sistema foi confirmada pela ligação dependente da dose do anticorpo monoclonal apropriado para controlar o canal 2. Não foi observada reatividade cruzada entre o hu806 (ou ch806) e o anticorpo de controlo. As análises da requerente determinaram que o Kd aparente (1/Ka) era de 37 nM para o hu806 e 94 nM para o ch80 6.
Análises da Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo
As análises de ADCC foram realizadas utilizando a preparação de anticorpo hu806 purificado 40A10 com células de adenocarcinoma A431 alvo e células efetoras mononucleares de sangue periférico de dadores saudáveis, isoladas de fresco. Resumidamente, todas as análises foram realizadas em triplicado com 1) 1 yg/mL de cada anticorpo ao longo da gama de razões de efetor para célula alvo (E:T = 0,78:1 a 100:1) e também 2) a E:T = 50:1 ao longo de uma gama de concentrações de cada anticorpo (3,15 ng/mL - 10 yg/mL). Foram incluídos controlos para o isotipo de anticorpo, citotoxicidade espontânea e total em triplicado e os cálculos para a citotoxicidade específica foram como anteriormente descritos (Panousis et al., 2005). Os resultados são apresentados na FIG.90. O hu806 apresentou consistentemente atividade ADCC superior à IgGl ch806 quimérica. Na experiência representativa apresentada, o hu806 a 1 yg/mL efectuou uma ADCC de 30 % de citotoxicidade em contraste com os 5% de citotoxicidade do ch80 6.
Estudo de Terapia com 806 in vivo A eficácia terapêutica do hu806 foi investigada utilizando xenoenxertos de adenocarcinoma A431 ou glioma U87MG-des2-7 estabelecidos em ratinhos nude BALB/c. Para estabelecer os xenoenxertos, os ratinhos foram injetados por via subcutânea na linha mamária inguinal direita e esquerda com 1 χ 106 células de adenocarcinoma A431 ou 1 χ 106 células de glioma U87MG.des2-7 em 100 yL de PBS. 0 volume tumoral (TV) foi calculado pela fórmula [(comprimento χ largura2)/2] onde comprimento foi o eixo mais comprido e largura a medição em ângulos retos em relação ao comprimento. Numa experiência inicial, grupos de cinco ratinhos nude BALB/c (n = 10 tumores /grupo) com xenoenxertos de A431 ou U87MG.des2-7 estabelecidos receberam tratamento com 1 mg de hu806, ou 1 mg de anticorpo ch806 ou controlo de veiculo de PBS por injeção IP. A terapia foi administrada nos dias 6, 8, 11, 13, 15 e 18 para as linhas de células A431 e dias 4, 6, 8, 11, 13 e 15 para as linhas de células U87MG.des2-7, respetivamente. Os volumes tumorais Médios ± EPM até à conclusão das experiências devido a considerações éticas da carga tumoral são apresentados na FIG.91 para o xenoenxerto de A431 até ao dia 25, e na FIG.92 para os xenoenxertos de U87MG.des2-7 até ao dia 31.
As avaliações da terapia in vivo com hu806 mostraram uma redução acentuada no crescimento do xenoenxerto de A431 em comparação com o controlo de veiculo de PBS. A curva de crescimento do xenoenxerto de A431 observada para o hu806 foi altamente comparável com o grupo de tratamento ch806. Nos xenoenxertos de U87MG.des2-7 estabelecidos, o grupo de controlo de PBS foi sacrificado no dia 20. A terapia com hu806 demonstrou uma redução significativa no crescimento de tumores pelo dia 20 em comparação com os controlos de PBS (P<0,001), e continuou a retardar o crescimento de tumores após o dia 20, semelhante ao grupo de ch806.
Discussão
Os anticorpos hu806 purificados por afinidade em Proteína A apresentaram perfis de eluição de SEC idênticos ao material de referência clínico ch806, e perfis de SDS-PAGE em gel coerentes com uma imunoglobulina. 0 padrão de IEF foi coerente com o pi antecipado de 8,4.
Através das análises de ligação a células Scatchard e ligação a epítopos Biossensor, o anticorpo hu806 demonstrou curvas de ligação e parâmetros de afinidade altamente comparáveis ao anticorpo ch806. A afinidade de ligação do hu806 e ch806 ao EGFRvIII e EGFR de tipo selvagem sobreexpresso são semelhantes e na gama nanomolar baixa. A ligação a células através de análises por FACS suportou estas observações.
Além disso, o hu806 demonstra ADCC acentuadamente melhorada em relação à construção ch806 em células A431 positivas para o antigénio alvo.
As avaliações terapêuticas in vivo com hu806 apresentaram uma redução acentuada no crescimento do xenoenxerto de A431, que foi altamente comparável ao grupo de tratamento ch806. Nos xenoenxertos de U87MG.des2-7 estabelecidos, a terapia com hu806 demonstrou uma redução significativa no crescimento de tumores pelo dia 20 em comparação com os controlos de PBS e continuou a retardar o crescimento de tumores depois do dia 20, semelhante ao grupo ch806.
Exemplo 23
Anticorpo monoclonal 175
Como discutido no Exemplo 1, o clone 175 (IgG2a) foi selecionado para caracterização adicional. a. Materiais e Métodos
Linhas de células
As linhas de células U87MG.A2-7 transfetadas com A2-7EGFR (Huang et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 2927-2935) e as linhas de células A431 (Ullrich et al. (1984) Nature. 309, 418-425) foram descritas anteriormente. A linha de células da próstata independente de hormonas DU145 (Mickey et al. (1977) Cancer Res. 37, 4049-4058) foi obtida da ATCC (atcc.org).
Todas as linhas de células foram mantidas em DMEM (Life Technologies, Grand Island, NI) contendo 10% de FCS (CSL, Melbourne), glutamina 2 mM (Sigma Chemical Co, St. Louis) e penicilina/estreptomicina (Life Technologies, Grand Island). Além disso, a linha de células U87MG.A2-7 foi mantida em 400 mg/mL de Geneticina (Life Technologies, Inc, Grand Island). BaF/3 (Palacios et al. (1984) Nature. 309, 126-131) e as linhas de células BaF/3 que expressam recetores de EGF diferentes (Walker et al. (2004) J. Biol. Chem. 2(79), 22387-22398) foram mantidas rotineiramente em RPMI 1640 (GIBCO BRL) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (GIBCO BRL) e 10% de meio condicionado WEHI-3B (Ymer et al. (1985) Nature. 19-25;317, 255-258) como uma fonte de IL-3. Todas as linhas de células foram cultivadas a 37 °C, numa atmosfera de ar/CCh (95%-5%) .
Anticorpos e péptidos
Os mAb806 e mAbl75 foram produzidos no Ludwig Institute for Cancer Research (LICR) Filial de Nova Iorque e foram produzidos e purificados no Biological Production Facility (Ludwig
Institute for Cancer Research, Melbourne). A linha de fibroblastos murídeos NR6aegfr foi utilizada como imunogénio. Os hibridomas de ratinho foram produzidos imunizando ratinhos BALB/c cinco vezes por via subcutânea em intervalos de 2 a 3 semanas, com 5 χ 105 2 χ 106 células em adjuvante. Foi utilizado adjuvante completo de Freund para a primeira injeção. Depois disso, foi utilizado adjuvante incompleto de Freund (Difco). As células do baço de ratinhos imunizados foram fundidas com a linha de células de mieloma de ratinho SP2/0. Os sobrenadantes de clones recém-produzidos foram pesquisados em ensaios de hemoadsorção quanto à reatividade com a linha de células NR6, NR6tsEGFR e NR6aegfr e em seguida analisados por ensaios de hemoadsorção com linhas de células de glioblastoma humano U8 7MG, U8 7MGtsEGFR e U8 7MGaegfr.
Os mAbs intactos (50 mg) foram digeridos em PBS com papaína ativada durante 2-3 horas a 37 °C numa proporção de 1:20 e a papaína foi inativada com iodoacetamida. A digestão foi em seguida feita passar sobre uma coluna de sepharose de Proteína A (Amersham) em tampão de fosfato de sódio 20 mM, pH 8,0, com o eluente adicionalmente purificado por troca catiónica utilizando uma coluna Mono-S (Amersham). A proteína foi então concentrada utilizando um concentrador centrífugo de 10000 MWCO (Millipore). Para os complexos de Fab-péptido, um excesso molar de péptido liofilizado foi diretamente adicionado ao Fab e incubado durante 2 horas a 4 °C antes de preparar ensaios de cristalização.
Mapeamento do mAb!75 utilizando fragmentos de EGFR expressos em células de mamíferos
No dia anterior à transfeção com estes fragmentos, fibroblastos renais embrionários 293T humanos foram aplicados a 8 x 105 por poço em placas de cultura de tecidos de 6 poços contendo 2 mL de meio. As células foram transfetadas com 3-4 pg de ADN de plasmídeo complexado com Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Vinte e quatro a 48 h após transfeção, as culturas de células foram aspiradas e as monocamadas de células sujeitadas a lise em 250 μ; de tampão de lise (1 % de Triton X-100, 10% de glicerol,
NaCl 150 mM, HEPES 50 mM, pH 7,4, EGTA 1 mM e mistura Inibidora de Protéase Completa (Roche). Alíquotas do lisado celular (10-15 pL) foram misturadas com tampão de SDS de amostra contendo 1,5% de β-mercaptoetanol, desnaturadas aquecendo durante 5 min a 100 °C e submetidas a electroforese sobre geles de poliacrilamida com 10% de NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen). As amostras foram em seguida eletrotransferidas para membranas de nitrocelulose que foram lavadas em tampão de TBST (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM e 0,1% de Tween-20) e bloqueadas em TBST contendo 2,5% de leite desnatado durante 30 min à temperatura ambiente. As membranas foram incubadas de um dia para o outro, a 4 °C, com 0,5 pg/mL de mAbl75 em tampão de bloqueio. Membranas paralelas foram testadas de um dia para o outro com mAb 9B11 (1:5000, Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts) para detetar o epitopo c-myc. As membranas foram lavadas em TBST, e incubadas em tampão de bloqueio contendo IgG anti-ratinho de coelho conjugada com peroxidase de rábano-silvestre (Biorad) a uma diluição de 1:5000 durante 2 h, à temperatura ambiente. As transferências foram em seguida lavadas em TBST e desenvolvidas utilizando película auto-radiográfica após incubação com Substrato Quimioluminescente Western Pico (Pierce, Rockford, Illinois) .
Mapeamento de mAb!75 utilizando fragmentos de EGFR expressos em células de mamíferos e levedura
Uma série de fragmentos de ectodomínio de EGFR marcados com c-myc sobrepostos, começando nos resíduos 274, 282, 290 e 298 e terminando todos no aminoácido 501 e fundidos com hormona do crescimento foram anteriormente descritos (Johns et ai. (2004) J. Biol. Chem. 279, 30375-30384). A expressão de proteínas de EGFR na superfície de células de levedura foi realizada como anteriormente descrito (Johns et al., 2004).
Resumidamente, colónias transformadas foram cultivadas a 30 °C, em meio mínimo contendo base de azoto para levedura, caseína hidrolisada, dextrose e tampão de fosfato pH 7,4, numa plataforma de agitação durante, aproximadamente, um dia até ser atingida uma DCboo de 5-6. As células de levedura foram em seguida induzidas para a apresentação da proteína transferindo para meio mínimo contendo galactose, e incubadas com agitação a 30 °C durante 24 h. As culturas foram em seguida conservadas a 4 °C até análise. O líquido ascítico em bruto contendo o anticorpo monoclonal contra c-myc 9E10 foi obtido de Covance (Richmond, CA) . 1 χ 106 células de levedura foram lavadas com tampão FACS gelado (PBS contendo 1 mg/mL de BSA) e incubadas com ascite anti-c-myc (diluição a 1:50) ou anticorpo monoclonal contra o EGFR humano (10 pg/mL) num volume final de 50 pL, durante 1 h a 4 °C. As células foram em seguida lavadas com tampão FACS gelado e incubadas com IgG anti-ratinho marcada com ficoeritrina (diluição a 1:25), num volume final de 50 pL durante 1 h a 4 °C, protegidas da luz. Depois de lavar as células de levedura com tampão FACS gelado, os dados de fluorescência foram obtidos com um citómetro de fluxo Coulter Epics XL (Beckman-Coulter), e analisados com o software de citometria WinMDI (J. Trotter, Scripps University). Para a determinação de epítopos lineares versus conformacionais, as células de levedura foram aquecidas, a 80 °C, durante 30 min, em seguida arrefecidas sobre durante 20 min antes da marcação com com anticorpos. A série de mutantes de EGFR listada na Tabela 7 foi anteriormente descrita (Johns et al., 2004).
Ressonância plasmónica superficial (BIAcore)
Foi utilizado um BIAcore 3000 para todas as experiências. Os péptidos contendo o epítopo mAb806 putativo foram imobilizados num chip sensor CM5 utilizando acoplamento com amina, tiol ou Pms a um caudal de 5 pL/min (Wade et al. (2006) Anal. Biochem. 348, 315-317) . O mAb806 e o mAbl75 foram feitos passar sobre a superfície do sensor a um caudal de 5 pL/min a 25 °C. As superfícies foram regeneradas entre ensaios injetando HCI 10 mM a um caudal de 10 pL/min.
Imunoprecipitação e transferência de Western
As células foram Usadas com tampão de Use (1% de Triton X-100, HEPES 30 mM, NaCl 150 mM, fluoreto de 4-(2-aminoetil)benzenossulfonilo 500 mM, aprotinina 150 nM, inibidor de protéase E-64 1 mM, EDTA 0,5 mM e leupeptina 1 mM, pH 7,4) durante 20 minutos, tornadas transparentes por centrifugação a 14000 * g durante 30 minutos, imunoprecipitadas com os anticorpos relevantes a uma concentração final de 5 yg/mL durante 60 minutos e capturadas por esférulas de Sepharose-A de um dia para o outro. As amostras foram em seguida eluídas com Tampão de Amostra 2X NuPAGE SDS (Invitrogen), resolvidas em geles de NuPAGE (3-8% ou 4-12%), electrotransferidas para uma membrana de transferência Immobilon-P (Millipore), em seguida testadas com os anticorpos relevantes antes da deteção por radiografia de quimioluminescência.
Imuno-histoquímica
Secções congeladas foram reveladas com 5 yg/mL de mAbl75 ou controlo de isotipo irrelevante durante 60 min à temperatura ambiente. O anticorpo ligado foi detetado utilizando o sistema de deteção Dako Idealizar+ HRP conforme as instruções do fabricante. As secções foram finalmente lavadas com água, submetidas a revelação de contraste com hematoxilina e montadas.
Modelos de Xenoenxertos Células U87MG.A2-7 (3 χ 106) em 100 yL de PBS foram inoculados s.c. em ambos os flancos de ratinhos nude Balb/c fêmeas com 4 a 6 semanas de idade, (Animal Research Centre, Perth, Austrália). Todos os estudos foram realizados utilizando modelos de tumores estabelecidos como anteriormente descrito (Perera et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11, 6390-6399). Ο tratamento começou assim que os tumores atingiram o volume médio indicado na legenda da figura apropriada. O volume tumoral em mm3 foi determinado utilizando a fórmula (comprimento χ largura2)/2, onde comprimento foi o eixo mais comprido e largura foi a medição perpendicular. Os dados são expressos como volume tumoral médio ± EP para cada grupo de tratamento. Todos os dados foram analisados quanto à significância pelo teste t de Student unilateral, em que p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Este projecto de investigação foi aprovado pelo Animal Ethics Committee do Austin Hospital.
Produção e caracterização de linhas de células estáveis que expressam construções mutantes de EGFR
As mutações do tsEGFR foram produzidas utilizando um kit de mutagénese específica de um lócus (Stratagene, La Jolla, CA) . A cadeia molde para cada mutagénese foi o ADNc de EGFR humano (número de acesso x00588) (Ullrich et al. (1984) Nature. 309, 418-425) . Foi efetuada a sequenciação de nucleótidos automatizada de cada construção para confirmar a integridade das mutações de EGFR. O EGFR de tipo selvagem e mutante (C173A/C28 IA) foram transfetados em células BaF/3 por e1ectroporação.
As linhas de células estáveis que expressam o mutante de EGFR foram obtidas por seleção em meio contendo neomicina. Após selecção final, o ARNm foi isolado a partir de cada linha de células, transcrito de forma inversa e a sequência de EGFR amplificada por PCR. Todas as mutações no EGFR expresso foram confirmadas por sequenciação dos produtos de PCR. 0 nível de expressão do EGFR foi determinado através de análise por FACS num FACStar (Becton and Dickinson, Franklin Lakes, NJ) utilizando o anticorpo anti-EGFR mAb528 (Masui et al. (1984) Cancer Res. 44, 1002-1007; Gill et al. (1984) J. Biol. Chem. 259, 7755-7760) a 10 yg/mL em PBS, 5% de FCS, EDTA 5 mM seguido de Ig anti-ratinho marcada com Alexa 488 (diluição final a 1:400). A fluorescência de fundo foi determinada incubando as células com um anticorpo primário de classe condizente, irrelevante. Todas as células foram rotineiramente passadas em RPMI, 10% de FCS, 10% de meio condicionado WEHI3B e 1,5 mg/mL de G418 .
Ativação dependente de EGF do mutante de EGFR
As células que expressam o tsEGFR ou C271A/C283A-EGFR foram lavadas e incubadas durante 3 h em meio sem soro ou IL-3. As células foram recolhidas por centrifugação e ressuspensas em meio contendo EGF (100 ng/mL) ou um volume equivalente de PBS. As células foram recolhidas após 15 min, sedimentadas e Usadas diretamente em tampão de amostra SDS/PAGE contendo p-mercaptoetanol. As amostras foram separadas em geles com gradiente de 4-12% de NuPAGE, transferidas para membrana de PVDF Immobilon e testadas com anti-fosfotirosina (4G10, Upstate Biotechnologies) ou anticorpos anti-EGFR (mAb806, produzido no LICR) . As bandas reativas foram detetadas utilizando quimioluminescência.
Efeito do EGF e anticorpos na proliferação de células
As células na fase log de crescimento foram colhidas e lavadas duas vezes com PBS para remover IL-3 residual. As células foram ressuspensas em RPMI 1640 mais 10% de FCS e aplicadas em placas de 96 poços a 105 células/poço com veiculo apenas ou com concentrações crescentes de EGF. Quando apropriado, foi também adicionada uma concentração fixa de mAb528 ou mAb806 (2 yg/poço) às culturas. A proliferação foi determinada utilizando o ensaio de MTT (van de Loosdrecht et al. (1994) J. Immunol. Methods. 174, 311-320).
Reatividade com Anticorpos específicos para a Conformação
As células foram recolhidas por centrifugação e reveladas com os anticorpos de controlo ou ensaio (todos a 10 yg/mL em tampão de FACS durante 40 min sobre gelo, lavadas em tampão de FACS) seguida de Ig anti-ratinho marcada com Alexa 488 (diluição final a 1:400, 20 min sobre gelo). As células foram lavadas com
tampão FACS gelado, recolhidas por centrifugação, e analisadas num FACScan; para cada amostra foram determinados o canal de fluorescência máxima e a fluorescência mediana utilizando a ferramenta estatística no Cell Quest (Becton and Dickinson). A fluorescência de fundo (controlo negativo) foi deduzida de todas as medições. Os valores de fluorescência mediana foram escolhidos como os mais representativos da forma do pico e intensidade de fluorescência e foram utilizados para obter a proporção de ligação de mAb806 para mAb528.
Determinações da estrutura cristalina de Fab 175 e Fab 806, complexos de Fab-péptido e a estrutura de RMN do epítopo peptídico de 806 em solução
As estruturas foram determinadas por substituição e refinação molecular em convergência com com R=0,225/Rlivre=0,289 para Fab806 e R=0,226/Rlivre=0,279 para Fab806:péptido; R=0,210/Rlivre=0,305 para Fab806 e R=0,203/Rlivre=0,257 para Fab8 0 6:péptido.
Os cristais de Fab 806 nativo foram produzidos por difusão de vapor de gota pendente utilizando 10 mg/mL de Fab e um reservatório contendo tampão de Acetato de sódio 0,1 M, pH 4,6, 6-8% de PEG6000 e 15-20% de Isopropanol. Para recolha de dados os cristais foram transferidos para uma solução crioprotectora contendo tampão de Acetato de sódio 0,1 M, pH 4,6, 10% de PEG6000, 15-20% de Isopropanol e 10% de glicerol. Os cristais foram em seguida montados numa volta de nylon e congelados de forma instantânea diretamente em azoto líquido.
Os cristais de complexo Fab 806-péptido foram produzidos por difusão de vapor de gota pendente utilizando 10 mg/mL de complexo Fab-péptido e um reservatório contendo acetato de amónio 0,2 M, 16-18% de PEG 5 000 éter monometílico, a qualidade dos cristais foi depois melhorada através de técnicas de nucleação. Para a recolha de dados, os cristais foram transferidos para uma solução crioprotectora consistindo de reservatório suplementado com 25% de glicerol. Os cristais foram em seguida montados numa volta de nylon e congelados de forma instantânea diretamente em azoto liquido.
Os cristais de complexo Fab 175-péptido foram inicialmente produzidos por difusão de interface livre utilizando um sistema de cristalização Topaz (Fluidigm, San Francisco). Os microcristais foram produzidos por difusão de vapor de gota pendente utilizando 7 mg/mL de Fab com condições semelhantes, tampão de Bis-tris propano 0,1 M, acetato de amónio 0,2 M e 18% de PEG 10000. Os microcristais foram, em seguida, melhorados por nucleação em Formato de sódio 0,15 M e 15% de PEG 1500 para produzir cristais pequenos em forma de placa. Para a recolha de dados, os cristais foram transferidos para uma solução crioprotectora consistindo de reservatório suplementado com 25% de glicerol. Os cristais foram em seguida montados numa volta de nylon e congelados de forma instantânea diretamente em azoto liquido.
Os dados de difração em cristais de complexos de Fab 806 e Fab 175 foram recolhidos nas instalações próprias utilizando um detetor R-AXIS IV num produzidor Rigaku micromax-007 munido com ótica AXCO, estes dados foram em seguida processados utilizando CrystalClear. Os dados do complexo de Fab 806-péptido foram recolhidos num detetor ADSC quantum315 CCD no feixe de X29, Brookhaven National Laboratory, estes dados foram processados com HKL2000 (Otwinowski, Z. e Minor, W. (1997) Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Academic
Press (Nova Iorque)) (a estatística de recolha de dados é mostrada na Tabela 9) . 0 Fab 806 nativo foi resolvido por substituição molecular utilizando o programa MOLREP (Vagin, A. e Teplyakov, A. (1997) J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025) utilizando as coordenadas da estrutura de Fab 2E8, a refinação da estrutura foi realizada em REFMAC5 (Murshudov et al. (1997) Acta crystallographica 53, 240-255) e construção de modelo em Coot (Emsley, P. e Cowtan, K. (2004) Acta crystallographica 60, 2126-2132).
As estruturas de 806-péptido e Fab 175-péptido foram resolvidas por substituição molecular utilizando o programa MOLREP utilizando as coordenadas da estrutura de Fab 806, a refinação e reconstrução foram novamente realizadas no REFMAC5, e COOT e O. As validações das estruturas finais foram realizadas com PROCHECK (Laskowski et al. (1993) J. Appl. Cryst. 26, 283-291) e WHATCHECK (Hooft et al. (1996) Nature 381, 272).
Estudos de RMN
Para os estudos de RMN, um péptido marcado com 15N foi produzido de modo recombinante como uma fusão ao domínio SH2 de SHP2 utilizando o método anteriormente descrito por Fairlie et al. (Fairlie et al. (2002) Protein expression and purification 26, 171-178) exceto que a E. coll foi cultivada em meio mínimo de Neidhardt suplementado com 15NH4C1 (Neidhardt et al. (1974) Journal of bacteriology 119, 736-747) . O péptido
foi dissociado do parceiro de fusão utilizando CNBr, purificado por HPLC de fase inversa e a sua identidade confirmada por espectrometria de massa MALDI-TOF e sequenciação N-terminal. O resíduo de metionina dentro da sequência de ligação do anticorpo 806 foi mutado para leucina para possibilitar a dissociação do parceiro de fusão, mas não dentro do próprio péptido.
As amostras utilizadas para os estudos de RMN foram preparadas em solução de H2O contendo 5% de 2H20, NaCl 7 0 mM e NaPCP 50 mM a pH 6,8. Todos os espectros foram adquiridos a 298K num espectrómetro Bruker Avance500 utilizando uma criossonda. As atribuições sequenciais do péptido na ausência de m806Fab foram estabelecidas utilizando TOCSY e NOESY 2D convencionais, bem como espectros de TOCSY e NOESY para 15N. A interação entre o péptido e fAb806 foi examinada monitorizando os espectros HSQC de 15N do péptido na ausência e presença de fAb806. A perturbação espectral dos espectros HSQC de 15N do péptido na presença de fAb806 indica claramente que o péptido foi capaz de se ligar ao fAb806 na presença de condições em solução. A conformação detalhada do péptido na forma de complexo não foi determinada. Os desvios dos valores de desvio químico do enrolamento aleatório para o péptido mAb806 são mostrados na FIG.93.
Biodistribuição de chAb806 em Tumores em Doentes
Para demonstrar a especificidade do mAb806 para os tumores in vivo, uma versão quimérica (ch806) foi manipulada por engenharia e produzida em condições de cGMP (Panousis et al. (2005) Br. J. Cancer. 92, 1069-1077) . Foi realizado um ensaio de fase I, primeiro no homem, para avaliar a segurança, biodistribuição e resposta imunológica do ch806 em doentes com tumores positivos para 806, e os resultados de segurança, biodistribuição e farmacocinética foram anteriormente descritos (Scott et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4071-4076). Para definir a especificidade do ch806 em tumores em comparação com tecido normal (i. e., fígado) em doentes, a captação quantitativa de ch806 em tumor e fígado foi realizada através do cálculo da % de dose injetada (ID) de 11]-In-ch806 a partir de imagens de câmara gama de todo o corpo obtidas ao longo de uma semana após injeção de 5-7mCi (200-280MBq) de 11]-In-ch806. Foram realizados cálculos de dosimetria no fígado e tumor com base em regiões de interesse em cada doente particular. O conjunto de imagens de infusão de inIn-ch806, corrigidas para o fundo e atenuação, permitiram calcular a atividade acumulada. O cálculo da dosimetria foi realizado para obter a concentração de 11]-In-ch806 no tumor e fígado ao longo de um período de uma semana após injeção. b. Sequenciação
As cadeias pesada variável (VH) e leve variável (VL) do mAbl75 foram sequenciadas e as suas regiões determinantes de complementaridade (CDR) identificadas, como se segue:
Cadeia VH de mAbl75: as sequências de ácido nucleico (SEQ ID N° : 128) e aminoácidos (SEQ ID N°: 129) são mostradas nas FIG.74A e 74B, respetivamente. As regiões determinantes de complementaridade CDRl, CDR2 e CDR3 (SEQ ID N°: 130, 131 e 132, respetivamente) são indicadas pelo sublinhado na FIG.74B.
Cadeia VL de mAbl75: as sequências de ácido nucleico (SEQ ID N° : 133) e aminoácidos (SEQ ID N° : 134) são mostradas nas FIG.75A e 75B, respetivamente. As regiões determinantes de complementaridade CDRl, CDR2 e CDR3 (SEQ ID N°: 135, 136 e 137, respetivamente) são indicadas pelo sublinhado na FIG.75B.
Os dados da sequência para o mAbl75 baseiam-se em dados da sequência e de estrutura cristalina, uma vez que a linha de células não é clonal e, por conseguinte, foram obtidas múltiplas sequências a partir da linha de células. As sequências de mAbl75 estabelecidas acima foram confirmadas pela estrutura cristalina, e diferem num único aminoácido em cada uma das CDRl e CDR2 da cadeia VL das sequências anteriores com base apenas em dados da sequência convencionais. Um isotipo diferente de mAbl75 (um isotipo IgG2a invulgar) foi também obtido, com base nos dados da sequência final e estrutura cristalina.
Especificidade do mAb!75
Estudos de ligação preliminares sugeriram que o mAbl75 apresentava especificidade semelhante para o EGFR como o mAb806. Nas regiões CDR dos mAb806 (IgG2b) e mAbl75 (IgG2a), as sequências de aminoácidos são quase idênticas, com apenas um aminoácido diferença em cada (FIG.65; Ver Exemplo 26, abaixo). Todas estas diferenças conservam a carga e tamanho das cadeias laterais. Claramente estes anticorpos surgiram independentemente. c. Experiências
Foi realizado um conjunto de experiências imuno-histoguímicas para analisar a especificidade da ligação do mAbl75. 0 mAbl75 revela secções de xenoenxertos de A431 que sobreexpressam o EGFR (FIG.66A) e secções de xenoenxertos de glioma U87MG.A2-7 que expressam o A2-7EGFR (FIG.66A). Em contraste, o mAbl75 não revela secções do xenoenxerto de U87MG. A linha de células U87MG apenas expressa níveis modestos do EGFR de tipo selvagem (FIG.66A) e não tem qualquer volta autócrina de EGFR detetável. Mais importante ainda, o mAbl75 não se liga a secções de fígado humano normal (FIG.66B). Assim, o mAbl75 parece demonstrar a mesma especificidade que o mAb806, 1. e. deteta o EGFR sobreexpresso e EGFR humano truncado, mas não o tsEGFR expresso a níveis modestos.
Identificação do epítopo de mAb!75
Uma vez que o mAbl75 também liga o A2-7EGFR, no qual os aminoácidos 6-273 estão suprimidos, e o EGFR1-501, o epítopo de mAbl75 tem de estar contido dentro dos resíduos 274-501. Quando se determinou o epítopo de mAb806, a requerente expressou uma série de fragmentos de EGFR marcados com c-myc fundidos com a extremidade carboxilo de GH humana, os quais terminavam todos no aminoácido 501 (Chao et al. (2004) J. Mol. Biol. 342, 539-550;
Johns et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 30375-30384). O mAbl75 também reagiu com os fragmentos 274-501 e 282-501 do EGFR em transferências de Western, mas não deteta fragmentos que começam no aminoácido 290 ou 298 (FIG.73) . A presença de todas as proteínas de fusão GH-EGFR foi confirmada utilizando o anticorpo contra c-myc, 9E10 (FIG.73). Por conseguinte, um determinante crítico do epítopo de mAbl75 está localizado próximo do aminoácido 290. Finalmente, um fragmento 274-501 do EGFR com o epítopo de mAb806 suprimido (Δ287-302) foi também negativo para a ligação de mAbl75 (FIG.73), sugerindo que, de modo semelhante, esta região determinou a maioria da ligação do mAb175.
Foi utilizada uma segunda abordagem para caracterizar ainda mais o epitopo de mAbl75. Fragmentos que abrangem os domínios extracelulares do EGFR foram expressos na superfície de levedura e testados quanto à ligação do mAbl75 por imunofluorescência indireta utilizando citometria de fluxo. 0 mAbl75 reconheceu o fragmento de levedura 273-621, o qual corresponde ao domínio extracelular do Δ2-7 EGFR, mas não os fragmentos 1-176, 1-294, 294-543 ou 475-621 (FIG.67A e FIG.67B). Assim, pelo menos parte do epítopo de mAbl75 tem de estar contido dentro da região entre os aminoácidos 274-294, o que concorda com os dados de imunotransferência utilizando fragmentos de EGFR. Uma vez que o mAbl75 liga-se ao fragmento desnaturado do 273-621 (FIG.67C), o epítopo tem de ser de natureza linear (FIG.73). É evidente que o mAb806 e mAbl75 reconhecem uma região e conformação semelhante do EGFR.
Utilizando ressonância plasmónica superficial (BIAcore) a ligação do mAbl75 ao péptido EGFR (287CGADSYEMEEDGVRKC302; SEQ ID N° : 138)) foi investigada. 0 EGFR287-302 foi imobilizado na superfície do biossensor utilizando químicas de acoplamento com amina, troca tiol-dissulfureto ou Pms-Ser. 0 último método imobiliza o péptido exclusivamente através da cisteína N-terminal (Wade et al. (2006) Anal. Biochem. 348, 315-317). O mAbl75 ligou o EGFR287-302 em todas as orientações (Tabela 6) . A afinidade do mAbl75 para o EGFR287-302 variou desde 35 nM para o acoplamento com Pms-serina até 154 nM para o acoplamento com amina. Em todos os casos, a afinidade de ligação do mAbl75 para o EGFR287-302 foi inferior à obtida para o mAb806 (Tabela 6). A requerente também determinou a afinidade do mAbl75 para dois fragmentos extracelulares diferentes do EGFR. 0 mAbl75 ligou o fragmento 1-501 com uma afinidade semelhante à obtida utilizando o péptido (16 nM versus 35 nM) (Tabela 6) . Como esperado, a afinidade do mAbl75 contra o domínio extracelular inteiro 1-621, o qual pode formar a conformação fixa, foi muito inferior (188 nM) . Embora o mAb806 e o mAb 175 possuam afinidades semelhantes para o EGFR287-302, o mAbl75 parece apresentar uma afinidade mais elevada para o domínio extracelular do EGFR (Tabela 6) . Claramente, o epítopo de mAbl75 está contido dentro do EGFR287-302 e, como o mAb806, a afinidade de ligação ao domínio extracelular do EGFR é dependente da conformação.
Tabela 6
Determinação das afinidades de ligação aos epítopos de EGFR pelos anticorpos mAb806 e mAb!75 por BIAcore
0 painel de mutantes do fragmento 273-621 do EGFR, expresso na superfície de levedura (Chao et al. (2004) J. Mol. Biol. 342, 539-550; Johns et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 30375-30384)
foi utilizado para caracterizar a estrutura fina do epitopo de mAbl75. O mAb 175 e o mAb806 apresentaram um padrão de reatividade quase idêntico aos mutantes (Tabela 7) . A rutura da ligação dissulfureto 287-302 apenas teve um efeito moderado sobre a reatividade do epitopo já que o anticorpo ligou-se a todos os mutantes em C287 e a alguns mas não todos os mutantes em C302 (Tabela 7) . Os aminoácidos críticos para a ligação de mAbl75 incluem E293, G298, V299, R300 e C302 (Tabela 7) . O mAbl75 pareceu moderadamente mais sensível a mutações V299 e D297 mas o mAb806 também mostrou ligação reduzida a algumas mutações nestes sítios (Tabela 7) . Mais uma vez, o epitopo do mAbl75 parece ser essencialmente o mesmo que o epitopo reconhecido pelo mAb806.
Tabela 7
Apresentação de mutações 287-302 do Epitopo de EGFR em levedura e as pontuações de ligação para mAb806 e mAb!75
(continuação)
Eficácia de mAb!75 contra xenoenxertos de tumores estimulado por A2-7EGFR ou uma volta autócrina de EGFR
Foi examinada a atividade antitumoral in vivo de mAb806 e mAbl75 contra xenoenxertos de glioma U87MG.A2-7. Os xenoenxertos foram deixados estabelecer-se durante 6 dias antes de começar a terapia de anticorpo (3 vezes por semana durante 2 semanas nos dias indicados). Nesta altura, o volume tumoral médio era de 100 mm3 (FIG. 68A). O tratamento com mAbl75 resultou numa redução da taxa de crescimento tumoral global em comparação com o tratamento com veiculo ou mAb806 e foi altamente significativa no dia 19 pós-inoculação (P < 0,0001 versus controlo e P <0,002 versus mAb806), quando o grupo de controlo foi sacrificado por razões éticas. O volume tumoral médio nesta altura era de 1530, 300 e 100 mm3 para o veiculo, e grupos de tratamento com mAb806 e mAbl75, respetivamente (FIG.68A), o que confirma a atividade antitumoral de mAbl75 contra xenoenxertos que expressam ο Δ2-7 EGFR.
Apesar das células U87MG expressarem aproximadamente 1 χ 105 EGFR por célula, o mAb 806 não é capaz de reconhecer nada do EGFR da superfície, e sem ser surpreendentemente, não inibe o crescimento de U87MG in vivo. Além disso, estas células não co-expressam qualquer ligando de EGFR. Foi realizado um estudo para determinar se o epítopo de EGFR é transitoriamente exposto e, desse modo, capaz de ser reconhecido pelo mAb806 e mAbl75 nas células contendo uma volta autócrina de EGFR. A linha de células da próstata DU145 expressa o tsEGFR a níveis semelhante ao observado nas células U87MG, contudo ao contrário das células U87MG, as células DU145 contêm uma amplificação do gene de TGF-a e exibem, desse modo, uma volta autócrino de EGFR/TGF-α. O mAbl75 e o 806 ligam-se a células DU145 como determinado por análise através de FACS (FIG.68B) e ambos são capazes de imunoprecipitar uma pequena proporção do EGFR extraído a partir destas células (FIG.68C). Ambas as técnicas mostraram maior ligação de mAbl75, contudo, quando em comparação com mAb528, o qual se liga ao domínio L2, o mAbl75 e o mAb806 apenas ligam um subconjunto de EGFR na superfície destas células (FIG. 68B e FIG. 68C) . Observações semelhantes foram observadas com uma segunda linha de células da próstata (LnCap); (dados não apresentados) e uma linha de cólon (LIM1215), as quais também contêm ambas voltas autócrinas de EGFR (Sizeland, A. M. e Burgess, A. W. (1992) Mol Cell Biol. 3, 1235-1243; Sizeland, A. M. e Burgess, A. W. (1991) Mol Cell Biol. 11, 4005-4014) .
Claramente, o mAb806 e o mAbl75 podem reconhecer apenas uma pequena proporção do EGFR nas células na presença de uma volta de estimulação autócrina.
Uma vez que o mAbl75 e o mAb806 se ligam mais eficazmente ao EGFR expresso em células DU145 do que em células U87MG, foi realizado um estudo para analisar a atividade antitumoral destes anticorpos em xenoenxertos de DU 145 cultivados em ratinhos nude. Os xenoenxertos foram deixadas estabelecer-se durante 18 dias antes de começar a terapia (3 vezes por semana durante 3 semanas nos dias indicados). Nesta altura, o volume tumoral médio era de 90 mm3 (FIG.68D). O mAbl75 e o mAb806 inibiram ambos o crescimento de xenoenxertos de DU145. O grupo de controlo foi sacrificado no dia 67 e tinha um volume tumoral médio de 1145 mm3 em comparação com 605 e 815 mm3 para os grupos de mAb806 e mAbl75, respetivamente (p < 0,007 e 0,02, respetivamente) (FIG.68D).
Estrutura 3D de EGFR287-302 em contacto com os fragmentos Fab de mAb 8 0 6 e mAb17 5
Para compreender os detalhes moleculares de como o mAb806 e o mAbl75 podem reconhecer o EGFR em algumas, mas não em todas as conformações, as estruturas cristalinas dos fragmentos Fab para ambos os anticorpos foram determinados na forma de complexo com o epítopo EGFR.287-302 oxidado (a resolução de 2,0 e 1,59 Ã, respetivamente, FIG.69A &amp; 69B) e sozinhos (a resolução de 2,3 Ã e 2,8 Ã, respetivamente). Em ambos os casos, as estruturas de Fab livre e complexado foram essencialmente as mesmas e as conformações do péptido e voltas de CDR dos anticorpos foram bem definidas (FIG. 69) . O epítopo adopta uma estrutura em fita β, com uma extremidade da fita a apontar para o Fab e V299 enterrados no centro do sítio de ligação de antigénio (FIG. 69C-E) . Ambas as extremidades do epítopo estão expostas ao solvente, coerente com estes anticorpos ligarem polipéptidos muito mais longos.
Dos 20 resíduos de anticorpo em contacto com o epítopo, existem apenas duas substituições entre mAb806 e mAbl75 (FIG. 65) . Os resíduos de contacto do mAbl75 são: cadeia leve S30, S31, N32, Y49, H50, Y91, F94, W96 e cadeia pesada D32, Y33, A34, Y51, S53, Y54, S55, N57, R59, A99, G100, R101; os resíduos de contacto do mAb806 são os mesmos, com diferenças da sequência para a cadeia leve, N30 e cadeia pesada, F33. O EGFR287-302 liga-se ao Fab através de contactos próximos entre os resíduos de péptido 293-302, sendo a maior parte dos contactos entre os resíduos 297 e 302. As únicas ligações de hidrogénio entre os átomos da cadeia principal do EGFR287-302 e do Fab são para os resíduos 300 e 302 (FIG.69F). O reconhecimento da sequência do epítopo ocorre através das ligações de hidrogénio da cadeia lateral para os resíduos E293 (aos H50 e R101 do Fab), D297 (aos Y51 e N57), R300 (ao D32) e K301 (através de moléculas de água aos Y51 e W96). Os contactos hidrófobos são feitos em G298, V299 e C302. A conformação do esqueleto do epítopo entre 293 e 302 foi essencialmente idêntica nos cristais de Fab806 e Fabl75 (desvio de rms = 0,4 Ã, para os átomos de Ca nestes resíduos) . Embora restringida pela ligação dissulfureto, a extremidade N-terminal do péptido (287-292) não estabelece contacto significativo em qualquer estrutura e conformações de anticorpo nesta região diferente. No entanto, este segmento no complexo Fab806 parece estar bastante desordenado. Mais curiosamente, a conformação do péptido EGFR287-302 em contacto com os anticorpos está muito estreitamente relacionada como a conformação de EGFR287-302 observada no esqueleto das estruturas ligadas ou não ligadas de EGFR (Li et al. , 2005; Garrett et al. , 2002). Para o EGFR287-302 do complexo Fabl75, os desvios de rms nas posições Ca são 0,66 e 0,75 Ã, respetivamente (FIG.69).
Para obter mais conhecimentos sobre o reconhecimento do EGFR pelos mAb806 e mAbl75, foi estudada a conformação do péptido EGFR287-302 oxidado marcado com 15N por espectroscopia de RMN em solução, livre e na presença de Fab 806 (ver Materiais e Métodos). Para o péptido livre, as ressonâncias foram atribuídas e comparadas com aquelas do enrolamento aleatório. Essencialmente, o péptido livre adoptou uma estrutura de enrolamento aleatório, não uma fita beta como se observa no EGFR nativo (Garrett et al. (2002) Cell 20;110, 763-773).
Após adição de Fab foram observados desvios na ressonância. No entanto, devido ao sinal fraco que resulta do alargamento de linha significativo após adição do Fab e cristalização bem-sucedida dos complexos, a estrutura do complexo Fab806-epítopo em solução não foi continuada. Contudo, claramente, quando o péptido se liga ao fragmento Fab de mAb806 (ou mAbl75) parece que o Fab seleciona ou induz a conformação do péptido que coincide com esse péptido no recetor nativo.
Para estudar a razão por que o mAb806 e o mAbl75 reconhecem apenas algumas conformações de EGFR, o fragmento Fab de mAbl75 foi unido a um domínio extracelular de EGFR (monómeros ligados e não ligados) por sobreposição de EGFR287-302. Para um fragmento semelhante a Δ2-7 não existiram confrontos estéricos significativos com o recetor. Na forma não ligada houve substancialmente mais área superficial acessível do Fab enterrado (920 Â2 comparado com 550 Â2 na forma ligada) . Por conseguinte, este antigénio pode estabelecer contactos adicionais com regiões não-CDR do anticorpo, como foi indicado pelos mutantes de expressão em levedura (Chao et al. (2004) J. Mol. Biol. 342, 539-550). Contrariamente, ao fixar todo o ectodomínio de EGFR no Fab, há sobreposição espacial substancial com a parte do domínio CRI que precede o epítopo (resíduos 187-286) e que vai até ao centro do Fab (FIG.69D e 69E) . Assim, como o domínio CRI tem essencialmente a mesma estrutura nas conformações ligadas ou não ligadas, o mAb806 ou mAbl75 será incapaz de se ligar a qualquer uma das formas de EGFR.
Claramente, tem de existir uma diferença entre a orientação do epítopo em relação ao domínio CRI em qualquer uma das conformações conhecidas para o tsEGFR e a orientação que permite a ligação do epítopo. A inspeção do domínio CRI indicou que a ligação dissulfureto (271-283) que precede o EGFR287-302 restringe o polipéptido que bloqueia o acesso ao epítopo; esperar-se-ia que a rutura deste dissulfureto, ainda que não esteja envolvido na ligação direta aos anticorpos, permitisse o desdobramento parcial do domínio CRI para que o mAbl75 ou mAb806 pudesse ganhar acesso ao epítopo.
Quebra da ligação dissulfureto 271-283 do EGFR aumenta a ligação de mAb806
As ligações dissulfureto nas proteínas proporcionam um aumento da rigidez estrutural mas em alguns recetores da superfície celular, particularmente aqueles para citocinas e fatores de crescimento, a quebra transitória das ligações dissulfureto e troca de dissulfureto podem controlar a função do recetor (Hogg, P. J. (2003) Trends in biochemical sciences 28, 210-214) . Como este era um mecanismo através do qual o mAb806 e mAbl75 poderiam ganhar acesso ao seu sítio de ligação, o aumento da acessibilidade do epítopo foi tentada através da mutação de qualquer um ou ambos os resíduos de cisteína nas posições 271 e 283 para resíduos de alanina (C271A/C283A). Os vetores capazes de expressar C271A-, C283A- ou C271A/C283A-EGFR de comprimento total foram transfetados na linha de células Ba/F3 dependente de IL-3. Foram selecionados os clones estáveis de Ba/F3 que expressavam o mutante C271A- e C271A/C283A-EGFR em níveis equivalentes ao tsEGFR (FIG.70A. Não foram observadas células de Ba/F3 que expressam níveis altos do mutante C283A-EGFR. Como anteriormente descrito, o tsEGFR reage mal com o mAb806; contudo, os recetores mutantes reagiram de forma igualmente forte com mAb528, mAb806 e o anticorpo anti-FLAG, o que sugere que o recetor é expresso na superfície celular, está dobrado corretamente e que o epítopo para o mAb806 está completamente acessível nesses casos. Para confirmar que o mAb806 reconhece o mutante C271A/C283A mais eficazmente do que o tsEGFR, foi determinada a proporção de ligação de mAb806 para ligação de mAb528. Uma vez que o EGFR de tipo selvagem e C271A/C283A-EGFR estavam marcados com FLAG na posição N-terminal, foi também determinada a proporção de ligação de mAb806 e mAb528 ao anticorpo M2. Como anteriormente referido, o mAb806 reconheceu apenas uma pequena proporção do tsEGFR total expresso na superfície de células Ba/F3 (a proporção de ligação mAb806/528 é 0,08) (Tabela 8) . Em contraste, o mAb806 reconheceu praticamente todos os mutantes C271A/C283A EGFR expressos na superfície celular (uma proporção de ligação mAb806/528 de 1,01) (FIG.70A e Tabela 8).
Tabela 8
Reatividade de mAb806 com células que expressam o EGFR de tipo selvagem ou C271A/C283A EGFR
*Média para quatro clones independentes
A mutação das duas cisteínas não comprometeu a ligação ao EGF ou a função do recetor. As células BaF3 que expressam o mutante C271A/C283A EGFR proliferam na presença de EGF (FIG.70B). Foi observado de forma reprodutível um desvio para a esquerda na curva dose-resposta para o EGF em células que expressam as mutações C271A/C283A, sugerindo maior afinidade para o ligando ou potencial de sinalização aumentado para o recetor mutante. A análise de transferência de Western confirmou que o mutante C271A/C283A é expresso em níveis semelhantes ao tsEGFR e é fosforilado na tirosina em resposta à estimulação com EGF (FIG.70C). Coerente com estudos anteriores noutras linhas de células, o mAb806 não tem qualquer efeito na proliferação induzida por EGF in vitro de células Ba/F3 que expressam o tsEGFR, enquanto o bloqueio do mAb528 pelo ligando inibe completamente a proliferação induzida por EGF destas células (FIG.70D, painel da esquerda). Em contraste, o mAb806 eliminou totalmente a proliferação induzida por EGF em células BaF3 que expressam o mutante C271A/C283A (FIG.70D, painel da direita). Quando a volta de cisteína 271-283 é rompida, não só o mAb806 se liga mais eficazmente, como também, uma uma vez ligado, o mAb806 previne a proliferação induzida pelo ligando.
Tabela 9
Recolha de Dados e Estatística de Refinação Recolha de Dados
Refinamento
Refinamento
Discussão
Estudos estruturais com o epítopo EGFR287-302 mostram que o mAb806 e o mAbl75 reconheceram o mesmo motivo estrutural 3D nas estruturas de tsEGFR, o que indica que esta conformação do esqueleto também ocorre e está exposto no A2-7EGFR. No entanto, de forma critica, a orientação do epítopo nestas estruturas impediria o acesso do anticorpo aos aminoácidos relevantes. Isto é coerente com a observação experimental de que o mAb806 não liga o tsEGFR expresso na superfície celular aos níveis fisiológicos.
Os resultados com o mutante EGFRc271a/c283a indicam que o domínio CRI pode abrir para permitir que o mAb806 e mAbl75 se liguem estequiometricamente a este recetor mutante. Este recetor mutante pode continuar a adotar uma conformação nativa, já que é completamente sensível à estimulação por EGF mas, ao contrário do tsEGFR, é completamente inibido pelo mAb806. Se existisse uma forma incorretamente dobrada do EGFR com esta ligação dissulfureto quebrada na superfície de células cancerosas, os dados mostram claramente que seria capaz de iniciar a sinalização celular e deve ser inibida pelo mAb806 ou mAbl75.
Outra explicação dos dados é que durante a ativação do ligando o rearranjo estrutural do recetor poderia induzir desdobramento local na vizinhança do epítopo, permitindo ao recetor adotar uma conformação que permite ligação. Nas estruturas cristalinas, o epítopo fica próximo do centro físico do ectodomínio do EGFR e o acesso ao epítopo é bloqueado pelo domínio CRI dobrado e pela estrutura quaternária do ectodomínio do EGFR. Nas conformações ligada e não ligada, a integridade do domínio CRI é estabilizada por interações adicionais com os domínios Ll:ligando:L2 (não ligado) ou os domínios L2:CR2 (ligado). No entanto, a região do epítopo tem alguns dos parâmetros térmicos mais elevados presentes no ectodomínio: o epítopo mAb806/175 é estruturalmente instável. Durante a ativação do recetor, quando o recetor sofre uma transição entre as conformações ligada e não ligada, o mAb806 e o mAbl75 podem aceder ao epítopo. Assim, ao nível molecular, estes mecanismos poderiam contribuir para a ligação insignificante de mAb806 e mAbl75 a células normais e a níveis substancialmente mais altos de ligação a células tumorais que têm EGFR sobreexpresso e/ou ativado.
Exemplo 24
Anticorpos Monoclonais 124 e 1133
Como discutido no Exemplo 1 acima, o mAbl24 e o mAbll33 foram produzidos ao mesmo tempo que o mAb806 e foi determinado que apresentavam propriedades semelhantes, em particular especificidade para o EGFR de tipo selvagem sobreexpresso, às propriedades únicas do mAb806 aqui discutido.
Foram realizadas triagens iniciais em Nova Iorque (Jungbluth et ai. (2003) A Monoclonal Antibody Recognizing Human Cancers with Amplification/Over-Expression of the Human
Epidermal Growth factor receptor PNA. 100, 639-644. Foram realizadas avaliações por competição ELISA e análises Biacore para determinar se o mAbl24 e/ou mAbll33 reconhecem um epítopo idêntico ao mAb806 ou um determinante de EGFR alternativo.
Análise por FACS A ligação do anticorpo a células U87MG.A2-7, A431 e HN5 foi avaliada por FACS. Todos os anticorpos apresentaram uma especificidade semelhante à do mAb806 com forte ligação ao des2-7 EGFR e baixa ligação ao EGFR de tipo selvagem sobreexpresso. ELISA de Competição
Uma série de ELISA de competição foram realizadas para determinar se os anticorpos 124 e 1133 competiam com o epitopo de mAb806. Resumidamente, o domínio solúvel desnaturado do EGFR (sEGFR) foi revestido em placas ELISA. Os anticorpos 124 ou 1133 não marcados foram então adicionados ao longo da placa em concentrações crescentes. Após lavagem, foi adicionado mAb806 biotinilado a cada poço para determinar se continuaria a ligar o sEGFR. A deteção de mAb806 ligado foi conseguida utilizando HRP conjugada com estreptavidina. Se um anticorpo liga o mesmo epitopo (ou sobreposto) que o mAb806, então não é esperada ligação do mAb806.
Os resultados são resumidos na Tabela 10. Foi observado um efeito de ligação inibidor dependente da concentração para o mAbl24 e mAbll3: a ligação de mAb806 aumentou à medida que a concentração de anticorpo não marcado era diminuída, sugerindo que os anticorpos 124 e 1133 reconhecem um epitopo idêntico ao mAb806 ou um muito próximo.
Tabela 10
Resumo da ligação dos mAb!24 e mAb!133 ao sEGFR por ELISA de Competição.
Análise FACS: Competição de Ligação de Células
As células U87MG.A2-7 foram pré-incubadas com anticorpo 124, 1133 não marcado. No ensaio foram incluídos controlo positivo 806 e controlo de isotipo. As células foram lavadas, em seguida reveladas com mAb806 conjugado com Alexa488 e o nível de ligação de 806 foi determinado por FACS.
Os resultados são resumidos na Tabela 11. Os anticorpos 124 e 1133 bloquearam a ligação de mAb806 à superfície celular indicando o reconhecimento de um epítopo idêntico ao mAb806 ou um muito próximo.
Tabela 11
Análise por FACS: Competição de Ligação em Células U87MG.A2-7
Análise BIAcore: Ligação ao epítopo peptídico de mAb806 A sequência de aminoácidos do de EGFR 287CGADSYEMEEDGVRKC302 (SEQ ID N°: 14) contendo o epítopo de mAb806 foi sintetizada como um péptido e imobilizada sobre o chip biossensor. Foi medida a ligação dos anticorpos 124, 1133 e 806 (200nM) a este péptido. As unidades de ressonância (RU) de ligação máxima obtidas são resumidas na Tabela 12. 0 124, 1133 apresentaram ligação evidente ao péptido, confirmando o reconhecimento do epitopo peptidico de 806.
Tabela 12
Análise BIAcore: Ligação máxima ao epitopo peptidico de mAb806
Discussão
Como se mostra neste exemplo, o mAbl24 e o mAbll33 ligam-se ao péptido EGFR reconhecido pelo mAb806 e bloqueiam a ligação de mAb806 ao domínio extracelular de EGFR e às células que expressam o des2-7 EGFR. Assim, estes três anticorpos reconhecem o mesmo determinante no EGFR.
Exemplo 25
Avaliação Clínica do ch806
Foi concebido um estudo clínico para examinar a especificidade in vivo do ch806 numa análise de abordagem do tumor/biodistribuição/farmacocinética em doentes com vários tipos de tumores. 1. Materiais e Métodos
Conceção do Ensaio
Este ensaio realizado primeiro no homem foi um estudo de Fase I aberto, com aumento de dose. 0 objectivo principal foi avaliar a segurança de uma única infusão de ch806 em doentes com tumores avançados que expressam o antigénio de 806. Os objetivos secundários do estudo foram determinar a biodistribuição, farmacocinética e captação de 11]-In-ch806 pelo tumor; determinar a resposta imunológica do doente ao ch806; e avaliar a evidência inicial da atividade clinica do ch806. Foi escolhida uma dose única para este estudo para avaliar de forma ideal a especificidade in-vivo do ch806 para o EGFR expresso no tumor. O protocolo foi aprovado pelo Human Research and Ethics Committee do Austin Hospital antes do inicio do estudo. O ensaio foi realizado sob o esquema do Australian Therapeutic Goods Administration Clinical Trials Exemption (CTX). Todos os doentes deram consentimento de modo informado.
Os critérios de elegibilidade incluíram: tumores avançados ou metastáticos positivos para a expressão do antigénio de 806 com base em hibridação cromogénica in-situ ou imuno-histoquímica de amostras de tumor conservadas (tumores foram definidos como positivos para 806 se a avaliação imuno-histoquímica de amostras de tumor conservadas apresentasse quaisquer células positivas para a expressão de 806, ver abaixo); malignidade comprovada histológica ou citologicamente; doença mensurável em varrimento de CT com pelo menos uma lesão > 2 cm; sobrevivência esperada de pelo menos 3 meses; escala de desempenho de Karnofsky (KPS) > 70; função hematológica, hepática e renal adequadas; idade > 18 anos; e capaz de dar consentimento informado. Os critérios de exclusão incluíram: metástases ativas no sistema nervoso central (a menos que tratadas de modo adequado e estáveis); quimioterapia, imunoterapia, terapia biológica ou terapia de radiação dentro de quatro semanas antes da entrada no estudo; exposição anterior ao anticorpo [a menos que não haja evidência de anticorpos anti-quiméricos humanos (HACA)]; incapacidade de recuperar completamente dos efeitos da terapia de cancro anterior; utilização simultânea de corticosteróides sistémicos ou agentes imunossupressores; infeção descontrolada ou outra doença grave; gravidez ou lactação; mulheres férteis que não utilizam meios medicamente aceitáveis de contraceção.
Os doentes receberam uma única infusão de ch806 marcado com índio-111 (11]-In, 200-280 MBq; 5-7 mCi) por infusão intravenosa em soro fisiológico normal/5% de albumina de soro humano ao longo de 60 minutos. Os doentes destinados a aumento de dose planeado foram integrados em um de quatro níveis de dose: 5, 10, 20 e 40 mg/m2. Estas doses foram escolhidas para permitir a avaliação da especificidade do ch806 para o EGFR expresso no tumor, e para determinar se algum compartimento do tecido normal liga ch806 (e afeta a farmacocinética ou biodistribuição) in vivo. A biodistribuição, farmacocinética e resposta imunológica foram avaliadas em todos os doentes.
Foram obtidas imagens de corpo inteiro com câmara gama para avaliação da biodistribuição e captação pelo tumor no Dia 0, Dia 1, Dia 2 ou 3, Dia 4 ou 5, e Dia 6 ou 7 após infusão com 11]-In-ch806. Foram obtidas amostras de sangue para farmacocinética nestes pontos no tempo e, adicionalmente, no Dia 14 (± 2 dias) e Dia 21 (± 2 dias). Foram obtidas amostras de sangue para avaliação dos níveis de HACA de fundo e semanalmente até ao Dia 30. Foi efetuada avaliação da toxicidade em cada visita do estudo. Foram realizados exame físico, e hematologia e bioquímica de rotina semanalmente até ao final do estudo (Dia 30). A reclassificação foi realizada no Dia 30.
Critérios de Aumento de Dose O primeiro doente em cada nível de dose foi observado durante quatro semanas antes do recrutamento de quaisquer doentes adicionais. Se não fosse observada qualquer toxicidade limitante da dose (DLT) em qualquer um dos primeiros 2 doentes dentro de 4 semanas da infusão de ch8063, 4 doentes eram, em
seguida, introduzidos no nível de dosagem mais alta seguinte. Se um doente em qualquer coorte de 2 doentes sofresse uma DLT dentro de 4 semanas da primeira dose, mais 4 doentes (máximo de 6) eram introduzidos nesse nível de dosagem. Se não mais do que um doente de 6 em qualquer nível de dose sofresse toxicidade > Grau 3, os doentes seguintes eram introduzidos no nível de dose seguinte. A DLT foi definida como toxicidade não hematológica de Grau 3, ou toxicidade hematológica de Grau 4 como definida pelo NCI Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE v3.0). A dose tolerada máxima (MTD) foi definida como a dose de ch806 abaixo daquela em que 2 ou mais doentes de 6 sofreram DLT.
Radiomarcação do Ch806 0 ch806 de qualidade clínica foi produzido no Biological
Production Facility do Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne, Austrália. 0 anticorpo ch806 foi marcado com 11]-In (MDS Nordion, Kanata, Canadá) através do quelato de ião metálico bifuncional CHX-A"-DTPA de acordo com métodos anteriormente descritos (Scott et al. (2000) Cancer Res 60, 3254-3261; Scott et al. (2001) J. Clin. Oncol. 19(19), 3976-3987).
Imagem com Câmara Gama
Imagens de corpo inteiro da biodistribuição de 11]-In-ch806 foram obtidas em todos os doentes no Dia 0 após infusão de inIn-ch806, e em, pelo menos, 3 ocasiões posteriores até ao Dia 7 após infusão. As imagens de tomografia computorizada por emissão de fotão único (SPECT) de uma região do corpo com tumor conhecido foram também obtidas em, pelo menos, uma ocasião durante este período. Todas as imagens de câmara gama foram adquiridas numa câmara gama de cabeça dupla (Picker International, Cleveland, OH).
Farmacocinética O sangue para análise da farmacocinética foi recolhido no Dia 0 - pré-infusão com 11]-In-ch806; em seguida aos 5 minutos, 60 minutos, 2 h e 4 h pós-infusão 11]-In-ch806, Dia 1, Dia 2 ou 3,
Dia 4 ou 5, e Dia 6 ou 7. Sangue adicional para farmacocinética da proteína ch806 foi também obtido no Dia 14 (± 2 dias) e Dia 21 (± 2 dias) e Dia 30 (± 2 dias).
Foram retiradas alíquotas em duplicado de amostras de soro e contadas num contador de cintilação gama (Packard Instruments, Melbourne, Austrália) , juntamente com padrões de 11]-In apropriados. Os resultados do soro foram expressos como % da dose injetada por litro (% de ID/L) . A medição dos níveis da proteína ch806 no soro do doente após cada infusão foi realizada utilizando um protocolo validado para medição imunoquímica da proteína ch806 em soro humano40. O limite de quantificação para o ch806 em amostras de soro foi de 70 ng/mL. Todas as amostras foram analisadas em triplicado e foram diluídas por um fator de pelo menos 1:2. Os níveis de ch806 medidos no soro foram expressos como yg/mL.
Os cálculos da farmacocinética foram realizados em medições de 11]-In-ch806 no soro após a infusão e níveis de proteína ch806 nos soros de doentes determinados por ELISA, utilizando um programa de ajuste de curva (WinNonlin Pro Node 5.0.1, Pharsight Co., Mountain View, CA) . Foram determinadas estimativas para os seguintes parâmetros: ΎΉα e Τ^β (semividas das fases inicial e terminal da disposição); VI, volume do compartimento central; Cmax (concentração sérica máxima); AUC (área sob a curva de concentração sérica extrapolada até ao tempo infinito); e CL (eliminação sérica total).
Eliminação em Todo o Corpo e Dosimetria de 11]-In-ch8 0 6 no Tumor e Órgão
Os cálculos de dosimetria em todo o corpo e órgãos normais (fígado, pulmões, rim e baço) foram realizados com base em regiões de interesse em cada conjunto de imagens de infusão de 11]-In-ch806 para cada doente individual, que permitem o cálculo da atividade acumulada e análise utilizando OLINDA para os resultados de dosimetria final (Stabin et al. (2005) J. Nucl. Med. 46(6), 1023-1027). As regiões de interesse foram também definidas para tumores adequado em cada ponto no tempo em conjuntos de imagens de 11]-In-ch806, corrigidas para o fundo e atenuação, e o cálculo de dosimetria foi realizado para se obter a concentração de niIn-ch806 no tumor/g (Scott et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11(13), 4810-4817). Esta foi convertida em yg de ch806/g de tecido tumoral com base na dose injetada em mg de proteína ch806.
Análise de HACA
Amostras de sangue para avaliação da HACA foram colhidas antes da infusão com ch806, em seguida semanalmente até 30 dias após a infusão com ch806. As amostras foram analisadas por ELISA e por tecnologia de ressonância plasmónica superficial utilizando um instrumento BIAcore2000, como anteriormente descrito (Scott et al. , 2005; Liu et al. (2003) Hybrid
Hybridomics 22(4), 219-28; Ritter et al. (2001) Cancer Res. 61 (18), 685-6859) . Método Imuno-histoquímico
Tecido tumoral fixo em formalina, embutido em parafina de cada doente no ensaio foi imunorrevelado como se segue: Resumidamente, secções de 4 pm de tecido embutido em parafina foram montadas em lâminas SuperFrost® Plus (Menzel-Glaser, Alemanha), desparafinadas e reidratadas antes da recuperação de antigénio por micro-ondas em Solução de Recuperação de Alvo, pH 6,0 (10 min; Dako, Glostrup, Dinamarca). As secções foram em seguida tratadas com H202 a 3% durante 10 min, para eliminar peroxidase endógena e incubadas à temperatura ambiente durante 60 min com anticorpo m806 (4 pg/mL) ou com concentração apropriada de anticorpo de controlo negativo de isotipo condizente (IgG2b; Chemicon, Temecula, CA). A ligação de anticorpo foi detetada utilizando o Kit PowerVision (ImmunoVision Technologies, Brisbane, CA). Para permitir a visualização da imunorrevelação, as secções foram incubadas com o cromogénio 3-amino-9-etilcarbazole (0,4%, Sigma Chemical Co. MO, USA) durante 10 min e submetidas a revelação de contraste com hematoxilina de Mayer's. Os controlos negativos para o procedimento de imunorrevelação foram preparados por omissão do anticorpo primário. Os resultados foram expressos como uma percentagem de revelação de células tumorais positivas. Método Cromogénico de Hibridação in situ
Tecido tumoral fixo em formalina, embutido em parafina de cada doente no ensaio foi seccionado e montado em lâminas SuperFrost® Plus, desparafinado e reidratado antes do pré-tratamento com o Kit de Pré-tratamento de Tecido SpotLight® (Zymed Laboratories Inc. South San Francisco, CA) . As secções foram em seguida cobertas com a sonda de ADN SpotLight® EGFR, desnaturadas a 95 °C durante 10 min e incubadas de um dia para o outro a 37 °C. Após hibridação, as lâminas foram lavadas em 0,5 X SSC. A deteção da sonda foi efetuada utilizando o Kit de deteção de Polímero SpotLight® CISH™. As secções que apresentaram agregados de sinais ou >5 sinais individuais em >25 % das células cancerosas foram consideradas como tendo uma amplificação do gene de EGFR que correlacionou com a reatividade do m806. 2. Resultados
Doentes
Oito doentes (1 feminino e 7 masculinos; idade média de 61 anos (gama 44-75)] completaram o ensaio (Tabela 16) . Os sítios do tumor primário, história terapêutica anterior e sitios de patologia aquando da entrada para o estudo são também mostrados na Tabela 16. Todos os 8 doentes tinham positividade para o antigénio 806 em tumores conservados (Tabela 16).
Todos os doentes preenchiam os critérios de inclusão e, exceto para o Doente 8 (que tinha um tumor cerebral primário), tinham todos doença metastática quando entraram para o estudo. Os sítios de patologia classificados como lesões alvo incluíram: pulmão (5 doentes), cérebro (1 doente), gânglios linfáticos (1 doente), supraglote (1 doente) . Outros sítios de patologia metastática (lesões não alvo) incluíram uma massa supra-renal, osso e gânglios linfáticos (Tabela 16) . A mediana do estado de desempenho de Karnofsky foi de 90 (gama 80-100) .
Tabela 16
Características do Doente
Eventos Adversos e HACA
Os eventos adversos relacionados com ch806 são listados nas Tabelas 17 e 18. Não foram observados eventos adversos relacionados com a infusão. Não houve DLT e, por isso, a MTD não foi atingida. As toxicidades principais que na opinião do investigador podiam ser possivelmente atribuídas ao ch806 foram: prurido transitório, náusea ligeira, fadiga/letargia, e possíveis efeitos nos níveis de ALP e GGT no soro. Foi observado um aumento CTC de grau 2 no nível de GGT no Doente 5, contudo isto foi com base num aumento de grau 1 de base, e foi de natureza transitória. Foram descritos três eventos adversos graves (SAE) mas nenhum deles foi atribuído ao ch806. Em geral, o ch806 foi seguro e bem tolerado a todos os níveis de dose, sendo observadas toxicidades menores geralmente previsíveis e geríveis. Não foi realizado um aumento adicional da dose devido à quantidade limitada de cGMP ch806 disponível para ensaio.
Uma resposta imunológica positiva ao ch806 (com concordância das metodologias ELISA e BIAcore) foi observada apenas em um dos oito doentes (Doente 1).
Tabela 17
Ocorrência de Eventos Adversos Relacionados com ch806
*Números representam o número de episódios de qualquer evento a cada nível de dose
Tabela 18
Distribuição dos Eventos Adversos Relacionados com o Agente em Estudo
*Número de doentes
Radiomarcação de ch806
Existiu um total de 8 infusões de inIn-ch806 administradas durante o ensaio. A pureza radioquímica média (± DP) e imunorreatividade do 11]-In-ch806 foram medidas como sendo 99,3 ± 0,1% e 77,4 ± 7,0%, respetivamente.
Biodistribuição de ch806 O padrão inicial de biodistribuição de 11]-In-ch806 em doentes a todos os níveis de dose foi coerente com atividade no volume sanguíneo, que foi gradualmente eliminada com tempo. Ao longo do período de uma semana após injeção, a captação de 11]-In-ch806 no fígado e baço foi coerente com a eliminação normal de metabolitos do quelato de 11]-In através de o sistema reticuloendotelial. Foi observada localização específica de 11]-In-ch806 nas lesões alvo (> 2cm) de todos os doentes a todos os níveis de dose (FIG.94), incluindo lesões alvo localizadas nos pulmões (Doentes 1, 3, 4, 5, e 7), no abdómen (Doentes 1 e 2) e na região supraglótica no lado direito do pescoço (Doente 6) . Foi também demonstrada captação alta de 11]-In-ch806 num tumor cerebral (Doente 8) (FIG.95). É importante dizer que, a captação de 11]-In-ch806 no tumor não foi dependente do nível de expressão do antigénio de 806. Por exemplo, o Doente 4 demonstrou captação alta por ambas as lesões pulmonares alvo, apesar da positividade <10% por IHC durante a reatividade ao 806 em tumores conservados (FIG.96). Este grau de captação de inIn-ch806 em lesões alvo no Doente 4 foi comparável com o observado no Doente 3, onde 50-75% das células tumorais foram positivas para revelação ao antigénio de 806 na amostra imuno-histoquímica conservada (FIG.96).
Farmacocinética
Os parâmetros farmacocinéticos Tha e Τ4β, VI, Cmax, AUC e CL dos doentes individuais para a única infusão de 11]-In-ch806 são mostrados na Tabela 19. O teste de Kruskal-Wallis da soma dos números de ordem foi aplicado às semividas alfa e beta, VI e eliminação. Não foi observada qualquer diferença significativa entre os níveis de dose (P>0,05). O ajuste da curva de farmacocinética aos dados de ELISA da população agrupada é mostrado na FIG.97. Os parâmetros f armacocinéticos médios ± DP foram Tha. 29,16 ± 21,12 h, Τ^β 172,40 ± 90,85 h, VI 2984,59 ± 91,91 mL e CL 19,44 ± 4,05 mL/h. Os dados das concentrações séricas de pico e vale medidos para ch806 (Cmax e Cmin) são apresentados na Tabela 20 para cada doente. Como esperado, foram observadas relações lineares para as Cmax e Cmin com cada nível de dose. Os valores médios ± DP determinados para os dados de farmacocinética do ch806 por ELISA estavam em boa concordância com os valores obtidos para os dados de farmacocinética de 11]-In-ch806 (Tabela 19).
Tabela 19
Estimativas dos Parâmetros Farmacocinéticos Média ± DP para 11]-In-CHX-A"-DTPA-ch806 em cada Nível de Dose e ao longo de todos os Níveis de Dose.
Tabela 20 Níveis Cmax e Cmin de ch806 no Soro Determinados através de Análise por ELISA.
* Cmax = 60 min após injeção.; Cmin = Dia 7 t Nível sérico Dia 8
Dosimetria de 11]-In-ch806 A eliminação em todo o corpo foi semelhante em todos doentes ao longo de todos os níveis de dose, com um T1/2 biológico (média ± DP) de 948,6 ± 378,6 h. Devido à semivida física relativamente curta, o cálculo da semivida biológica foi extremamente sensível a pequenas alterações da semivida efectiva. Não houve diferenças estatísticas significativas na eliminação a partir de todo o corpo entre os níveis de dose [teste Kruskal-Wallis da soma dos números de ordem: valor P = 0,54] (FIG.98). A eliminação de 11]-In-ch806 a partir de órgãos normais (fígado, pulmões, rim e baço) não mostrou qualquer diferença entre os níveis de dose, e o Ti/2efectivo médio foi calculado como sendo 78,3, 48,6, 69,7 e 66,2 h, respetivamente. Não houve qualquer diferença estatisticamente significativa na eliminação entre estes órgãos normais. Em particular, a eliminação a partir do fígado não mostrou qualquer diferença entre os níveis de dose (FIG.98), o que indica que não existe qualquer compartimento saturável com antigénio no fígado para o ch806. A análise de dosimetria tumoral foi finalizada para 6 doentes. Os doentes 1 e 2 tinham lesões alvo próximas do volume sanguíneo cardíaco, ou o movimento durante algumas aquisições de imagem, as quais impediram uma análise exata. A captação máxima medida de 11]-In-ch806 ocorreu 5-7 dias após infusão, e variou desde 5,2-13,7 χ 10_3% da dose injetada/g de tecido tumoral.
Avaliação da Atividade Clínica
No final deste período de estudo de um mês, verificou-se que 5 doentes tinham doença estável e 3 doentes doença progressiva (Tabela 16) . Curiosamente, um doente (Doente 7, nível de dose de 40 mg/m2) tinha evidência clínica de redução transitória de um gânglio linfático auricular palpável (que se comprovou ser um SCC metastático nas aspiração com agulha fina) durante o período do estudo, o que sugere uma possível atividade biológica do ch806. No entanto, este doente tinha doença progressiva confirmada por RECIST no final do estudo.
Dados Adicionais
Oito doentes [1 feminino e 7 masculinos; idade média de 61 anos (gama 44-75)] completaram este ensaio de fase 1 como descrito (Scott et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 104, 4071-4076) . Todos os doentes preencheram os critérios de inclusão e, excepto para o Doente 8 (que tinha um tumor cerebral primário), todos tinham doença metastática aquando da entrada para o estudo. Foi observada captação de Ab pelo tumor em todos os doentes, e o mInch806, a versão quimerizada de mAb806, demonstrou captação imediata e nível alto para o tumor (FIG.71). A eliminação de 11]-In-ch806 a partir de órgãos normais (fígado, pulmões, rim e baço) não mostrou qualquer diferença entre níveis de dose (Scott et al. , 2007) . Em particular, a eliminação a partir do fígado não mostrou qualquer diferença entre níveis de dose, o que indica que não existe qualquer compartimento saturável com antigénio no fígado para o ch806. A captação total no fígado teve um máximo de 14,45 ± 2,43 %ID imediatamente após infusão, e diminuiu para 8,45 ± 1,63 %ID às 72 horas, e 3,18 ± 0,87 %ID cerca de uma semana após infusão. Isto está em contraste claro com a captação de anticorpos para tsEGFR (e. g. , 225) , que se demonstrou que atingia mais do que 30 %ID no fígado (para uma dose de 40 mg) durante mais de 3 dias após infusão
(Divgi et ai. (1991) J. Natl. Cancer Inst. 83, 97-104). A captação tumoral máxima medida de niInch806 ocorreu 5-7 dias após infusão. O cálculo da captação quantitativa pelo tumor nos Doentes 1 e 3 não pôde ser realizado com exatidão devido à proximidade da lesão alvo do volume sanguíneo cardíaco e movimentação do doente. A captação máxima de ch806 no tumor variou desde 5,21 a 13,73 χ 10“3 %ID/g de tecido tumoral. O cálculo da concentração efetiva de ch806 no tumor mostrou valores máximos de (média ± DP) 0,85 ± 0 yg/gm (5 rng/m2) , 0,92 ± 0 yg/gm (10 rng/m2) . 3,80 ± 1,10 yg/gm (20 mg/m2) , e 7,05 ± 1,40 yg/gm (40 mg/m2).
Discussão
Como estabelecido neste Exemplo, este estudo representa o primeiro relatório que demonstra a biodistribuição e direcionamento para o tumor de um anticorpo quimérico contra um epítopo apenas exposto nas formas sobreexpressas, mutantes ou ativadas por ligando do EGFR. O Ch806 apresentou excelente direcionamento para os sítios de tumores em todos os doentes, sem evidência de captação pelo tecido normal, e sem toxicidade significativa. Estas características in vitro e in vivo do ch806 distinguem-no de todos os outros anticorpos que visam o EGFR. A doses até 40 mg/m2, o ch806 foi bem tolerado, não foi observada DLT e não foi atingida a MTD. As toxicidades principais que eram possivelmente atribuíveis ao ch806 foram prurido transitório, náusea ligeira, fadiga/letargia e possíveis efeitos nos níveis séricos de ALP e GGT. A natureza avançada das malignidades destes doentes significa que a sua doença poderia ter também fatores que contribuíssem para estes eventos
adversos. Dos eventos adversos que estavam possivelmente relacionados com o fármaco em estudo, todos eles foram ligeiros, muitos foram auto-limitados e nenhum requereu qualquer tratamento ativo. É importante dizer que, não foram observadas erupção cutânea ou perturbações do tracto gastrointestinal em qualquer doente, mesmo ao nível de dose mais alto. A tolerabilidade excelente do ch806 neste estudo de dose única justifica o passo seguinte de avaliação em ensaios de dose repetida. A biodistribuição do ch806 em todos os doentes mostrou uma eliminação gradual da atividade no volume sanguíneo, e nenhuma captação definida de 11]-In-ch806 pelo tecido normal. A excelente captação de ch806 pelo tumor foi também evidente em todos os doentes, incluindo as metástases do pulmão, gânglio linfático e supra-renal, e no mesotelioma e glioma. Isto foi observado a todos os níveis de dose que incluem 5 mg/m2 (a dose mais baixa estudada) , a qual é um décimo a um vigésimo da dose necessária para visualizar a captação no tumor de outros anticorpos para o tsEGFR33. Esta diferença na captação de ch806 em comparação com os anticorpos para o tsEGFR pode ser atribuída à sua captação substancial no tecido normal (fígado e pele) devido ao tsEGFR atuar como uma bacia de antigénio33. Além disso, a localização de 11]-In-ch806 foi elevada mesmo em doentes com baixa expressão de 806 avaliada através de imuno-histoquímica de amostras de tumor conservadas (FIG.96) . A captação de 11]-In-ch806 no glioma foi particularmente impressionante (FIG.97) e comparável a quaisquer dados publicados sobre anticorpos que visam o tumor cerebral após infusão sistémica ou até mesmo locorregional. Estes dados suportam a seletividade única do ch806 para o EGFR expresso por uma gama lata de tumores e confirma a ausência de captação deste anticorpo pelo tecido normal em humanos.
As análises da farmacocinética mostraram que o ch806 tem uma semivida terminal de mais do que uma semana, e nenhuma dependência com a dose da eliminação sérica de 11]-In-ch80 6. Foram também observadas relações lineares para a AUC, Cmax e Cmin, atingindo os níveis de dose acima de 10 mg/m2 concentrações mínimas séricas superiores a 1 yg/mL. Os valores de VI, Cl, Tha. e Ί^β foram coerentes entre níveis de dose, e semelhantes a anticorpos de IgGl humanos (Scott et ai., 2005; Steffens et al. (1997) J. Clin. Oncol 15, 1529-1537; Scott et al. (2001) J.
Clin. Oncol. 19(19), 3976-3987). A eliminação de ch806 foi também determinada ser mais lenta quando os cálculos de ELISA ch806 foram comparados com as medições de 11]-In-ch806 . Embora esta diferença possa ser explicada pelo pequeno número de doentes estudados, os pontos de amostragem no tempo mais distantes para o ch806 ELISA suportaria este valor como sendo mais representativo da verdadeira eliminação de ch806. Os valores de farmacocinética para o ch806 são comparáveis com outros anticorpos quiméricos descritos até à data (Steffens et al., 1997; Scott et al., 2001) e sustenta um plano de administração semanal para o ch806.
Os resultados da dosimetria quantitativa e farmacocinética indicam que não há compartimento saturável no tecido normal para o ch806 aos níveis de dose avaliados neste ensaio. É importante dizer que a ausência de dependência da dose na farmacocinética e eliminação a partir de todo o corpo e do órgão fígado está em claro contraste com todos os estudos de anticorpos para tsEGFR relatados (Baselga J. e Artega C.L. (2005) J. Clin. Oncol. 23, 2445-2449; Divgi et al. J. Natl. Cancer Inst. 83(2), 97-104;
Baselga J (2001) Eur. J. Cancer 37 Supl. 4, S16-22; Gibson et al. (2006) Clin. Colorectal Cancer 6(1), 29-31; Rowinsky et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22, 3003-3015; Tan et al. (2006)
Clin. Cancer Res. 12(21), 6517-6522), o que sustenta a especificidade para o tumor e ausência de ligação ao tecido normal do ch806 em humanos. Estas observações proporcionam evidência imperiosa do potencial do ch806 (ou formas humanizadas) para visar selectivamente o EGFR em tumores, evitar a toxicidade normal de outros anticorpos contra o EGFR e inibidores de cinase (particularmente pele) (Lacouture AE (2006) Nature Rev. Cancer 6, 803-812; Adams G.P. e Weiner L.M. (2005)
Nat. Biotechnol. 23(9), 1147-1157) e conseguir potencialmente um maior efeito terapêutico. Além do mais, a possibilidade de administração útil (devido à internalização rápida do mAb 806 nas células tumorais) e tratamento de associação com outros produtos biológicos tais como anticorpos contra o EGFR e inibidores de tirosina-cinase, onde a toxicidade combinada é provavelmente minimizada, é fortemente suportada pelos dados deste ensaio. Este estudo proporciona evidência clara da aptidão para visar um epitopo no EGFR que é especifico para o tumor, e está em curso desenvolvimento clinico desta abordagem única para a terapia de cancro.
Exemplo 26
Comparações da Sequências
As CDR da cadeia VH e cadeia VL para cada um de mAb8 0 6, mAbl75, mAbl24, mAbll33 e hu806 são aqui apresentadas e comparadas.
Tabela 13
Comparações dos Isotipos dos Anticorpos Murídeos e das Sequências das CDR (Rabat)1 A. Cadeia Leve Variável
B. Cadeia Pesada Variável
1As diferenças para as sequências de CDR do mAb806 estão sublinhadas
As CDR dadas acima para os respetivos isotipos de anticorpo baseiam-se numa análise Rabat. Como será evidente para os especialistas na técnica, as CDR podem ser também definidas com base noutras análises, por exemplo uma combinação das definições de Rabat e Chotia. Por exemplo, aplicando uma análise combinada de Rabat e Chotia aos isotipos acima, as sequências das CDR da cadeia VL e das CDR das cadeias VH para os respetivos isotipos são como apresentadas na Tabela 14.
Tabela 14
Comparações dos Isotipos dos Anticorpos Murídeos e das Sequências das CDR (Combinações Rabat e Chothia)1 A. Cadeia Leve Variável
A. Cadeia Pesada Variável
1As diferenças para as sequências da CDR do mAb806 CDR estão sublinhadas 2Ver FIG.17 do Pedido de patente U.S. n.° 10/145598
Copendente (Patente U.S. N° 7589180) 3Ver FIG.16 do Pedido de patente U.S. n.° 10/145598
Copendente (Patente U.S. N° 7589180)
Tabela 15
Comparações das sequências de CDR de mAb806 e hu806 (Rabat)1 A. Cadeia Leve Variável
A. Cadeia Pesada Variável
1 As diferenças para as sequências de CDR do mAb806 estão sublinhadas
Como se mostra acima, as sequências das CDR dos isotipos mAb806, mAbl75, mAbl24 e mAbll33 são idênticas exceto para alterações de aminoácidos altamente conservadoras que se espera que originem uma dobragem homóloga da proteína para reconhecimento do epítopo. Estes dados, cumulativamente com os dados de ligação e outros proporcionados nos exemplos acima, mostram que estes isotipos e o hu806 são variantes de membros de família estreitamente relacionados que apresentam as mesmas propriedades únicas discutidas acima para o mAb806 (e. g., ligação a um epítopo no EGFR que está acessível para ligação apenas em formas sobreexpressas, mutadas ou ativadas por ligando do EGFR, que resultam em especificidade única para o EGFR expresso em tumores, mas não para o tsEGFR em tecido normal) e que demonstram que anticorpos da Sequências de região variável distintas, em particular da Sequências de CDR variáveis, têm as mesmas características e capacidades de ligação.
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Met Arg Val Leu He Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Val X 5 10 15 '
Leu Ser Asp Vs1 Gin Leu Gin Giu Ser Gly feu Ser Leu Val Lys Pro 20 25 30
Ser Gun Ser Leu Ser Leu; Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr 35 40 45
Ser Asp Phe Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin Ph© pro Gly Asn Lys Leu 50 55 60
Giu Trp Met Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Arg: Tyr Asn Pro 65 70 75 :80
Ser Leu Lys Ser Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin 85 90 95
Phe Phe Leu Gin Leu Asn Ser Val Thr lie Giu Asp Thr Ala Thr Tyr 100 105 110
Tyr Cvs Val Thr Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gih Gly Thr 115 120 125
Leu Val Thr Val Ser; Ala
ISO
<210> 3 <211> 384 <212> ADN <213> Mus musculus <4Ο0> 3 atggtgtcca eagçtcaglt cettgcattc ctgttgcttfc :gg£ltccagg tgcaagatgt 60 " ’ gacatcetga tgacecaat.e tccatcctcc atgtetgtat ctctgggaga eaeagtcagc 120........................................................... atgaettgcG átteáãgtGa ggaeatít.aac agtaatatag ggtggttgca gcagagacca 180............' «ggaaatcat ttaagggcct: gâtctafccat ggaaccaâct tggacgatga agtitècàfeca 240 aggtteágtg gcagtggafeG tggagccgat tattct&amp;tcâ ccatcagcag aeiggaatGl 300............. gaagafct'fclg cagactatta ctgtgtacag tatgctcagt ttccgtggac gttGggtgga 3:60'' ' ...........' ggcaccaagc tggaas tcaa acgt 3;é.4............................
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<210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> biotinilada na posição 13 <400> 6
Leu Glu Glu Lys L-ys Gly Asrt Tyr Vai Vai Thr Asp His ;l 5 1Q
<210> 7 <211> 6149 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> vetor sintético gcctcgfcgct tgagttgagg cetggcetgg gcgctggggc ogeegegtge gaatctggtg 600 gcaccttggc gectgtot.cg etgetttcga taagfeçtçta.: gccatttaaa attttfcgatg 660 ácctgetgcg acgcr.tt.ttt tctggcaagá tagtcttgtà ^áatgcgggce :aàgà:tctgéa ? 2 0 tíáçfeggtat.t:1 tcggtttttg gggccgeggg egâcgácggg gcccgtgcgt cçcagcgçaa 780 atgttrcggeg âggcggggee tgcgàgágcg gccácegâgà átcggãcggg ggtâgtctcã 840 efccgagágég iggeag&amp;gag:<; gcaasgcaat. taatgOgagt feagctcactc. attaggeatec SO: ecaggcitta eaetfctatgç MeGgggteg tatgtOgtgt ggagattgtg agcggafcaae 120 aatttçàéàç agaattcgtg aggcfeccggt gpepgtgagt gggçâgâgçg: pâeãfeògeeç 180 açagtcecçg agaagttggg gggaggggtc; ggcaar. r.gaa ccggtgceta: gagaaggfegg 2 40 ggcggggtaa actgggaaag tgatgtggtg tàctggçtec gcct.ttt;tcG cgagggtggg 300 ggagááccgt aOaliaagtegii agtagtcgcc gtgagcgttc trfetttegpaa egggÊttgoç •360 géeaggâege aggtaáglgg cgÇgtgtggt fcacègcgggc ctggeçt.ett taçgggttat 4 20 ' ......' ggcçcttgcg tgçpttgáat tacttccacg cccctggctg çagtaçgitga tifecttgafçç 430 cgagcttcgg gttggaagtg. ggtgggagag ttcgaggect tgegcttaag gagcecettc 540: agctggccgg cctgctctçg tgèetggcct cgçgccgccg tegfcátggccc gge.cgfeggge 900 ggcaaggctg gcccggtcgq caccagCtgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc 960 tgctgcaggg agctcaaaat ggaggacgcg gcgctGggga gagegggcgg gtgagtcacc 1020 cacacaaagg aaaagggcet ttcegtGGtc aggcgtcgct. tcatgtgact ccacggagta 1080 ccgggcgccg tccaggcacc: fccgattagtt; 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Gaggtatçáç gaggcccttt cgtcttGac 6149..............
<210> 8 <211> 6625 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> vetor sintético <4Ο0> 8 ctcgagagcg ggcagtgagg gcaaegc.aat taafegtgagt tagcfecactc attaggcace 60 ccaggcttta eactfefcatge tcccggctcg tafcgttgtgt :ggagat:tgtg agcggataac 120 aatttcacac agaattegtg aggctccggt gcccgteagt gggcagagcg eacategccc 180 aGagfcccecg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg £40 cgcggggtag actgggaaag tgatgtcgtg feaGtggetGc gcctttttcc egagggtggg 300 ggagaaèíígt atataagtgc agtagfcegcc gtgaacgtte: tttttegcaa cgggtttgcc 360 gccsgaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt teecgeggge :ctggccfcctt taegggtiat. 420 ' ggcec-t-tgcg tgccMgaatS: taGtteeaeg eecctggetg cagtacgtga ttcttgatee 480 cgagcttGgg gttggaagtg ggtgggagag: tfecgaggcGt tgcgettaag gagcceettc 540 geetjsgtgct tgagttgagg cctggcctgg gcgctggggc egccgGgtge gaatctggtg 600 gcaccttcgc gGctgtctcg. efegefettega taagtetcta gceatttaaa atitettgatg 660 scotgc-tgcg aGgctttttt tetggeaaga tagtcttgta aatgcgggec aagatetgea 72Q: caetggt.atfc: tcggtttttg gggecgcggg Gggegaeggg gcce.gtgGgt cccagcgeae 780 ' atgttcggcg aggeggggee tgcgagcgcg gccacegaga atcggaGggg ggiagtictea 84 0 agctggGGgg GCfegGKctgg tgCGtggeét ccjcgccgcca tgtatcgecc cgGGCÊgggc 900 ggcaaggctg geccggtegg éaceagttge gtgagcggáa ggatggcege CtcGcggecc gêo tgútgcaggg agctcaaaat ggaggacgcg gcgetcggga gagcgggcgg gtgagtcacc 2.02:0':.......
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SASO gctgetãecg ctegcçgGag: cegaaeguGe gagegeagcg agtcagtgag cgággaagcg 654 0............... gaagagcgee cuataegcaa acogcetete: cecgegcgtt ggecgattca ttautgcagg: è&amp;QÕ tatcaegagg eccttrcgte Ltcac 6625
<210> 9 <211> 234 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> vetor sintético <400> 9
Met Vai Ser Thr Ala Gin Phe Leu Ala Phe Leu Leu Leu Tcp Phe Pro 1 5 10 Í5
Giy Ala Arg: Cys Asp lie Leu Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Met Ser 20 25 30
Vai Ser Leu Gly Asp Thr Vál Ser Ile Thr Cys His Ser Ser Gin Asp 35 40 45 lie Asn ;Ser ft$h lie Gly Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly Lys Ser Phe 50 55 60
Ly$ Gly Leu Lie Tyr; His Gly Thr Ash Leu Asp Asp Giu Vai :pro Ser 65 ....... 70 ................... 75 ............ 80
Arg Phe Ser Giy Ser Gly: Sei Gly Alá Asp Tyr Ser Leu Thr lie- Ser S5 90 95
Ser Leu Glu Ssr Glu Asp Phe Alá: Asp Tyr Tyr Cys 'Vai Gin His Ala 100 105 110
Gift Phe Pro Tfcp Thr Phe Giy Gly Gly lhe Lys Leu Glu Tie Lys Arg 115. 120 125
Th t: Vai Ala Ala Pro Sot Vai. Phe lie Phe Fr o Pio Sér Asp Glu: Gin 130 135 1AQ
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Léu Asn Asn Phe Tyr 145 ISO 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp: Asn, Ala Leu Gin Ser 165 170 175 G.1 y Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 18:0 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 1.95 200 205
His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr Hi.s Gin: Gly Leu: Ser Ser Pro 210 215 220
Vai Thr Lys Ser Phe Asn Aru Cly rlu Cys 225: 230
<210> 10 <211> 463 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> vetor sintético <4 Ο 0> 10
Met Arg: Val Seu lie tea. Leu; Tip tea Phe Thr Alá Ph# Pro i;GIy Val 1 5 10 15
Leu Ser Asp Val Gin Lèu Gl-h Glu Ser Gty Pro Ser tea Val Lys Pro 2Q 2S 30
Ser Gin Thr- tea Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr 35 40 45
Ser Asp Phe Ala Trp Asn Ttp lie Arg Gin Phe Pro Gly Ssn lys: Leu 50 55 60
Glu Τχ:ρ Met Gly Tyr 1 le Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Arg: Tyr Asti Pro
65 70 75 8 Q
Ser Leu Lys Ser Arg I le Ser lie Thr &amp;:rg Asp Thr Ser Lys Ash Gin 85 90 ' 95
Phe Phe Leu Gin; Leu Asn Ser Val Thr He Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 100 105 110
Tyr Cys Val Thr Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 11.5 12 0 125 tea Val Thr; Val; Ser Ala Ser Thr Lys G Ly Pro Ser Va 1 Phe Pro ter: 130 135 140
Ala Pro; Ser S;er tys Ser Thr ;Ser Gly Gly Thr Ale Ala Ley. Gly Gys 145 150 155 160
Leu Val tys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp. Asn Ser 165 170 175
Gly Ala tea Thr Ser Gly Val Els Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser 180 185 I90
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Tyr Ser Val Pro Ser Ser Ser
19$ 200 SOS
Leu Gly Thr Gin Thr Tyr: lie Cys Asn Val Asn His tys Pro Ser Asn 210 215 220
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Gin Pro- Lys Ser Cys Asp Lys: Thr His 225 230 235 240 TAP Cys: Pro Pro Cys POO Alá Pro Glu Leu Lew Giy Giy Pro Ser Val 245 250 255
Phe Lou Phe Pro Pro Lys Pro: Lyg Asp Thr Leu Met lie Ser ArO Thr :260 265 270:
Pro Glu Val Thr CyS: Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro: ¢1¾ 275 280 ............. 285
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Giy Val Glu Val Sis Asn Ala Lys 290 295: 300
Thr Lys Pro .Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Va1 Ser 305 310 31:5 320
Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Giy Lys: Glu Tyr Lys 325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie 340 ' 345 350
Ser Lys: Ala Lys Giy Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr The Leu pro 355 360 365
Pro Ser .Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 3:75 360
Val Lys Giy phe: Tyr Pro Ser Asp lie Ala: Val Glu Trp Glu Ser Asn :385: 390 395 400
Giy Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 405 410 415
Asp Giy Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys: Leu Thr Val Asp: Lys Ser Arg 4:20 4:25 430
Trp ;Gin Gin Giy Asn Vál Phe Ser .Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445
His Asn His Tyr Thr Gin :Lys Ser Leu Ser Leu Get Pro Gly Lys 4^0 455 4-6:0:
<210> 11 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 11
Asp Val Gin Leu, Gin Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro: Ser Gin 1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Gys Thr Val Thr Sly Tyr Ser lie Thr Ser Asp 20 25 30
Phe Ala Trp Asn Trp Tie Arg Gin Phe Pro Sly Asn Lys' Leu Glu Trp 35 40 45
Met: Gly Tyr lie: Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60
Lys Ser Arg Tie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Sin Phe Phe 65 70 75 80
Leu Gift Leu Asn Ser Val Thr lie Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Gys 85 90 95
Val Thr Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 1Ó0 105 110
Thr Val Ser Ala 115'
<210> 12 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <4 Ο 0> 12
Asp lie Leu Met Thr Gin Ser Pro: Ser See Met: Ser Val Ser Leu Gly I 5 10 .....15
Asp Thr Val See lie Thr Cys His Ser Ser Gin Asp lie Asn Ser ftsn 20 25 30 lie Gly Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly Lys. Ser Phe Lys Gly Leu lie 35 ’ 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Asp: Asp Glu Val Pro Ser Arg: phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Ser
:65 70 75 SO
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gin Tyr Ala Gin Phe Pro Trp 85 90 95
Thr The Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg 100 105
<210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 13
Leti Glu Glu Lys; Lys Gly Ash; Tyr Vai Val Thr Asp His 1 5 10 <210> 14 <211> 16
<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 14
Cys Giy Álá Asp Ser fyr Glu Met Sis Glu Asp Gly Va1 »rg Lys Cys 1 5 10 15
<210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 15
Ser Asp' Phe Ala I rp 1 5
<210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 16
Tyr lie Ser Tyr Ser Cv Asn Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lvs Ser 1 5 10 15
<210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <4 Ο 0> 17 ¥al Thr Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr 1 ..........5......
<210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 18
His Ser Ser Sl.fi Asp lie Asn Ser Asn lie Gly 1 5 10
<210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 19
Bis Gly Ihr Asn: leu Asp Asp X 5
<210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 ¥al SiA Tyr Ala Gin Phe Pro Trp Thr 1 5 <213> Mus musculus <400> 21 <210> 21 <211> 348
<212> ADN gatgtgeagc ttoaggagts gggacctage ctggtgaaac ettctcagtc tctgtccctc 60 acctgcaccg tcâetggeta etc&amp;at.cAttc agtgactatg ectggaactg gatccggcag 120 ttteeaggaa acasaetgga gtggatgggo tacat.aagtt aeagtgofcaa eae&amp;aggtae 180 aacccatctc teaáaagteg aAtetctatc aetegágaoa gaÊeçâagaa ecaattcttc 240 ctgeagttga afctctgtgàc taetgaggae acagccàèat attactgtge aacggcggga 3ΘΟ cgcgggcttc cttaotgggg oeaagggaet etggtdâctg tetotgea 34 8
<210> 22 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22
Asp. Val Gin Leu Gin: Glu Ser Gly Pro Ser Leu Vai Lys Pró Ser Giít 1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Gys Thr Val Thr Gly Tyr Ser íle Thr Ser Asp 20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40: 45
Met Gly Tyr II© Ser Tyr Ser Ala Asn Thr Afg Tyií Asn Pro. Ser Leu 50 55 60
Lys Sec Arg lie Ser lie 31½ Arg Asp Thr Ser :.Lys Ash: gin.: ph®: Fhe 65 70 75 80
Leu Gin Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr' Tyr Cys 85 90 95
Ala Thr. Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100: 105 * 110
Thr Val Ser Ala 115.
<210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn 1 5
<210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24
Tyr Tie Ser Tyr Ser Ala Asn Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys: Ser 1 5 10 15
<210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <4Ο0> 25
Ala G.l y Arg: Gly phe Piro t y r 1 5
<210> 26 <211> 324 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 26 gaCât&amp;Gtga tçjacccaacc tccatcctcc atgtchctat ctctgqgaga cacagtcagt 60 atcacttgcc attcaagtca ggacattaac agtaatatag ggtggttgca cjcagaaacca 1:20 gggaaatcat ttaagggcct gatctatc&amp;fe ggaaecaact tggacgatgg agttceahea 180 agcrfeteagtg geagtggatc tggagccgat tattetctoa ccatcagcag cctggaatct M:d gaagattttg tagactátta ctgtgtacag tatggtcagt ttccgtggac gttcggtgga 300 ggeaceaag« tggaaatoaa acgg 324
<210> 27 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27
Asp lie Leu Met Thr Gin. Ser Pro Ser Ser Met Ser Leu Ser Leu Giy 1 5 .10 15
Asp Thr Vai Ser lie Thr Cys His Ser Ser Gin Asp ΤΜ Aan Ser Asn .........20 " 25 30 lie Sly Trp Leu Gin Gin: Lys Pro G1 y Lys Ser Phe Lys Giy Leu lie 35 40 45
Tyr His Giy The Asn Leu Asp Asp Giy Val -Pro Ser Arg Mie Ser Gly 50 55 60
Ser Giy Ser Gly Ala Asp Tyr Ser tea Tter lie Ser Ser Leu Giu Ser 65 70 75 80
Slu Asp Phe V:al Asp Tyr Tyr Cys Wal Gin Tyr Gly Gin Phe Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lrs Lea Giu Tie Lys Arg 1.00 105
<210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28
His Ser Ser Gin Asp Tie Asp Ser Asn He Gly 1 5: 1.0
<210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29
His Gly Thr Asn. Leu. Asp Asp
<210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <4Ο0> 30
Vai Gin lye Gly Gin :Phe Pro Trp The 1 5
<210> 31 <211> 348 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 31 gat'gfcgcagc ttcagggstP gggaôtótàgo. e.feggtgaàaó htlctcáçftô tètgteccte 60 açètgtísátg; tcaétggdtá élçãatèáce1 agfcgattatg cctggasctg gateeggeag 120........... tttccaggaa aáaaAergga gtggatgggò: táça:táagct ãcagfcggtaa cáct.agalac 180............... áaccoatctç tcagaagtcg aatetetate actcgagacá eatpeaagáa ccaattcttc 2 40 ctgcagttga. afctosgtgaç tactgaggaç açagçç&amp;eat .âttaetgtgç: aáOggcggga 300 cgcggaritc cttactgggg ecaagggaet ctggee.aotg le&amp;ctgea 348
<210> 32 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32
Asp Vai Gin Leu Gl.n Gly Ser Gly Pro Ser Leu Vai Lys Pro Ser Gin 1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Thr Gly Tyr Ser lie ’Thr Ser Asp 20; 25 30
Tyr Ala Trp Asa Trp lie: Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu: Glu ÍErp 35 40 4 5 Mèt· Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly Asn. .Thr Arg Tyr Asa :tro Ser Leu 50 55 60
Arg Ser Arg lie Sèr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Ph©: Fhe 65 70 75 80
Leu Gin Leu Asn Ser Vai Thr Thr Glu ft$p Thr Ala Thr Tyr Tyr Gys 85 '90' 95
Ala Thr Ala GLy Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Glfi iGly Thr Leu Vai 100 105 110
Thr Vâi Ser Ala 115
<210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn 1 5
<210> 34 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly A$n Thr Arg Tyr Asa Pr© Ser Leu Arg Ser 1 5 10 15
<210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <4Ο0> 35
Ala, Thr Ala Glv Arg Sly Phe Pro Tyr I 5:
<210> 36 <211> 322 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 36
gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtetgtgt ctctgggaga cacagtcaac 6G atcacttgcc attcaagtca ggacattaac agcaatatag ggtggttgca geagAaacca 120 gggaaatcat ttaagg'gfeCjt. gatccatcat ggaaccaact tggacgatgg agLt -catca 180 aggttcagtg gea.gtggatG tggagdcgat -tattctrtcft. ecateagGag GGtggaatct 240 gagga.etttg: cagactatta ctgtgLaGag t.atggtcágt ttccgtggac gtteggtgga 300"" ggcaccaagc tggaaatcaa ac 322
<210> 37 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37
Asp lie Leu Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Met Ser Gal Ser Leu Gly 1 5 :10 15
Asp Thr Va1 sn lie The Cys His Ser Ser Gin Asp lie Asn Ser Am ?Q 25 30
He Gly lip ten Gin Sin Lys Pro S.ly Lys -Ser Phe Lys Sly Leu lie 35 m 4:5
Tyr His: ©ly Thr Asn. Leu Asp Asp Sly Va 1 Pro Ser Arg Phe Ser Sty 50 55 60
Ser Giy Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser leh GIO: Ser
65 ........... 70 .......... 75 .............SO
Glu Asp Phe Ala Asp Typ Tyr Cys Val Gin Tyr Gly Gin Phe Pro Trp 85 90 :9 5
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105
<210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38
His Ser Ser Gin Asp He Asn Ser Asn lie Gly 1 5 10
<210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4Ο0> 39
His Gif Thr Ash Leu Asp Asp 1 5
<210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 40
Val Gin- Tfr Gif Gin Phe Pro: *irp fHr 1 5
<210> 41 <211> 11891 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> vetor sintético <400> 41 aagcf t-gceg ccaccatgga ttggaeetgs egcattetet ttctggtagc agccgccaca
SO ggtaagggge tg.Gcaaatcc cagtqaggag gaagggateg eaggtcacca tcgaagccag 120...... toacccagt:g: aagggggctt ccaiceaefiC ctgtgtettg tctaeaggtg: tPcacagcca 180 ggtgcagcto ea&amp;gagagtg gacctgggct tgtcaagccg agicaaaett tgtpectaaé: 240 atgtacfgtg tccggatast Gtafctcatç agattttgcg tggaattgga taaggcagcc 300 accagggaaa ggtttagaat ggatgggcta catatCatae tGtgggaaca ccagatatca 360 aecttetetg aaaagccqga lcacaatc-c aagggaeaeg tcgaagaatc agttéttccfe 42Q............ gaaa^taaae tccgtíacàg ccgcagacac agcaacatafe tactgcgtsa Gcgclggeag 480 aggctfeccec tattfeggggac: agggcaccct agtgacagtg agcagcggta agatggeàea 34 0 ccgtggccgg cctctgcgcc tgggoccagc tctgtcccac aecgeggtea catggoaGct 600 tttgtcttee agéctccacç aágggftpccá. gcgigtfccee GetggcGGEc agcagcaage 660 gcaccagcgg eggcacagoc; gecctgggct geetggtgaa ggagtagStc Gcegagcecg 720 tgaccgtgag ctggaacago ggagccGiga cetceggegt gçaéaccttc: cGcgGcgtgc 780
tgcagagcag cggGGtgeaG agccfegagGa gegfeggtgaG cgtgecGagG ageagcGtgg 84-Q gcaceGagás GlacafecGgc; aaegtgaaec acaagcceag caaeaGgaag gtggacaaga 900 aggtqgagcc eaagagetgc: gacaagacee: apaocÈgGGG eccGfegecGa, ggceeagagG 960 tgcugggcgg: acGctGcgtg ttcct.gttcc cccccaagce Ggaggacacc ctgatgafcGa 1020.......... gcaggacccc cgaggtgaGc t.gçg:feggtgg tggacgtgag eeacgaggae eGagaggtga 1080 agttcaattg gtatgtggae ggcgtggagg tgeaGaacge caagaccaag GGcagagaag :1140 agcagtacaa cagcacctac agggtggtgt ccgtgcljgac Ggfcgctgcao esggactggc 1200 tgaacggcaa ggaatacaaa tgcaaggtct ccaacaaggc cctgccagcc cccategaaa 1260 agaccatcag eaaggeeaag ggccagccac gggagcccca ggtglacacG etgGGecect. 1320 cccgggacga gtgcaccaag aaecaggtgt GGetgaccGg tctggfegsag ggcttctacc 138Q: ccagcgacat :cgccgtggag tgggagagca acggcGagec cgagaaeaae laeaagacea 1440:: eeccceeagt getggacagc gaçggeagct tctkcetgta cagcaagctg accgtggaca 1500 agagcagqtg gcagçàggge: agcgtgttea gotgcagegt gatgcacgag gggctgcaca: 560 aeeaetaGae ceagaagagc ctgagcttgt ccéeçggcaà gtgatggega; cgcggccgtg ϊ62θ cggacgaceg aattcattga tcataatGag ccataccaca tttgtagagg tttt&amp;ettgc. 1680 tttaaaaaaC: cteecacaec tgeceGtgaa cccgaaacat aaaatgaatg1 iGaattgttgt 17· 4:0·: .tgttaaattg tt.tattgcag. cttatastgg ttaeaaataa ageaatagca, Icaeaaattt 1800 cagaaataaa gçatfcttttt cac:t;gcattô tsgttgtggt ttgtGçaáac tcatéaalgt 186ΰ::............................... atcttatcat glctggcgge cgocgatatt: tgaaaatatg gcatattgaa aaigtegccg :1920 atgtgagttt. etgtgtaaci gatatcgcca tttttccaaâ àgtgatttit gggcatacgc 1980 gatatctggc gatagcgctc ataccgttta egggggatgg Ggalagacgagctttggtgac 2040 tfcgggegatt etgtgtgtcg càaàtatGgc agtttcgata taggtgacag acgatatgag 2ÍÒÒ..... getalatcg.G; ggatagaggg gagatcasgc tggoacatgg coaatgoata tcgatctata 2160: eattgaatàà atattggGca ttagceatat tat taattgg ttatatagca taaatéaata 2220 ttggátattg gctattgcat aGgttgtatc catatcataa tatgtacafcc t»tattgg;et:: 2280 catgtccaac attaecgcca tgttgaeatt gattattgaG tagtiattaa tagtaatcaa 2340 ttacggggtc attagttcat agcccatats tggagttccg cgttacataa cttaGggfcaa 2400 atggccegcc tggetgaeeg cccaacgacc cccgcccatt: gacgtcàatâ âtgácgtãtg 24 60 ttcccatagt aaegecaata gggaGtttec attgacgtea atgggtggag tatttacggt 2520 aaactgccca Gttggeagta. cateaagtgt attatatgec aagtaGgcGC ectattgaeg 2580 ucaatgacgg táaatggccc gcctçgcatt Mgscc&amp;gfca catgaoctta tgggat tt„c ctacttggca gtacatctac gtattagtca tegctattae: catggtgatg eggttttgge 2700 agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt. etccacceca 2760 ttgacgtcaa tgggagtttg: ttttggcacc aaaatcaacg ggaetttqea, aaatgtcgta 2820 acaaetccge cgeattgacg:Caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag qtótatat&amp;â 2880: geagaqctcg tttagtgaae cgtcagatcg efâtgg:aga.çg ccatecacge tgtfcttgacg 2MI; tecatagaag agaecgggaG cgatceagec tccgcggeeg ggaaeggtgc attggaac.ge 3000 .................... ggattccceg tgccaagagt :gaegtaagta ccgcctatag agtctatagg :cecaeccc:Gt: M60
Gggettctta tgcatgetát aetgtttefetg gcttggggtG tataeaccce; Ggcttcctca. 3120 tgttataggt gatggtatag ettagcetat aggtgfegggt fcattgaccat tattgaccac 3180 tececfattg gtgacgafe&amp;e: fcttccat'tac taatGcataa eatggetctt tgceacaact 3240 ctctttatfcg gctafcatgcc aat&amp;cactgt ccttcagaga etgacacgga Gtetgtattfc 3300 ttacaggatg gggtctcalt tattatttac aaafcteaqqt atacaacacc accgtcccca .3360. gtgcccgcãg tttttattaa acataacgfcg ggatc.teçâe gcgaatctcg ggtaegtgtt 3420 ccggacatgg gctcttctcc ggtagcqgcg gagcttctac atccgageec tgeteccatg 3480 icctceagqga. ctsatggtcg etcggcagct ecttgctect aacagtggag gccagactta 3540 ggcacagcac gatgcecace: aceaccagtg tgccgcacaa ggccqtggcg gi:.agqgt:atg 3600 tgtctgaaaa tgagcteggg gacc gggctt gcaccgetga cgeatttgga agacttaagg 3660 eageggeaga agaagatgca ggcagctgag ttgfetgtgtt ct.gataa.gag teagaggtaa 3720 dtCGcgtt^c ggtgGtgfefea.; aeggtggagg gcagtgtagt ctgagcagta cfeegttgetg: mm ccgcgdgcgc caccàgacat aatagctgae agactaacag àéÊgfetccfet tècatgggte 3840 ttttctgcag tcaccgfecct tgacacgaag ettgccgcca ccatggattg gacttggaga 3900 atactgtttc ttgtagcagG cgcaacaggt gaggggctgG eaaaCGecag tgaggaggaa 3960 gggatcgaag gfegacsatcg aagccagtea agggggcgga ccgcttceat ecactcctgt 4 020 gtxttctcta caggtgttca cagfegatatfc cagatgaete agagteGate cagcatgtca 4080 gtcu^zgtgg gagatagggt gacgataace tgtcatfceaa gccaagaeat caactccaat 4140 attggãtggG: fcccáãcágaã goetggtaag tGefetcaàag gacfcaatcfca teaeggaaea 4200: aacttggâcg aeggcgtgec âfe:Cgagattt teagggtctg gcagcgggac cgactataea 4260 ’ iotgaeGatct: ctagettaca; aeeagaggaG ttfcgeeaGãt. aetaetgcgt ecagtaegct 4320: eagtfcceecfe ggaeattcgg eggcggcaca aaaetggaaa tGaasegfega gtagcggtcc 4.380 gttaafctaaa gatectteta a.aGfcetgagg gggteggatg aegfeggccafe tgtfcaeifeaa 4440: aGâGGatGGt: gfetfegetfeet iteetcagga aceg-tcgcag Gteee'teegt: gfeteatette 4500
CecGcatccg aegagcaadt gaagtoagge aeagcctecg feggfegtgGGfe cettaataae 4560; ttttacccaa gagaggccaa ãgtccagtgg aaagtggacá aegcáGtaca: gagegggaâc 4:620: tetcaggaa-a gegfegacaga gcaggactca aaagattçaa Gafeaçagcct atefetetacG 4680 cfegacactgt: caaaagctga ttatgaaaag caeaaagtat atgcctgtga agtaactcat 474 0 cagggaefeca gcagc.ccfegt cactaaaagt tttaatagag gegaatgefeg ataagcggçç 4800 gtgeggaega cGgàátfecat tgateataat eagceatacc acatttgtag aggi:11tact 4860 tgctttaaaa aacctcccac açeteccçct gaacctgaaa cataaaatga; atgèãâttgt <%0 tgttgtfcaac ttgt£tatt.;g çagcttataa tggttacaaa taaagcaat.a gcatcacaaa 4980
tttcacaaaK aaagcatf-tt fet*®:cactgca ttectagttgt: ggttfcgtcea aactcatcaa 504 D tgtatcttat catgtctgga tectetaege cggacgcafcc gtggccggea tcaccggcgc 5100 _acc-ggtgcg gtfigctggeg ggtatatggc çgaçatieaéG gâtggggaag at.cgggeteg: 5160 eGaetteggg etcatgagcg ct-tgtttggg cgtgggtatg gtggcaggGe cegtggçcgg; 5220 ' gggactgttg ggcggcatcfc ecttgeatge aeeatte-ett geggeggegg tgetcaaegg 5280 cctcaaecla efeactgggct gctteetaat gcaggagtcg eataagggag agogtcgace 5340 tcgggccggg ttgctggcgt: tttSGeatag g&amp;tçegeèee: cétgaGgago stGacaááaa, 5400' tcgacgctea agtcagaggt ggegaaacce gacaggacta tãaagata;ce aggegtttee 5460 ecctggaagc tceetcgtgg gotefecctgt tcegaccétg cegcCtaccg ga£acctg£c 5520 égcetfefcctc· cgttegggas gcgfcggcgst: tteteatage: tcaegctgta: ggtateftcag 5580 tetttggtgtag' gtegítcget' cèaagçt.ggg e£g£gtgeae gaacçec-ceg ttcagcccga 564:0 ccgctgegec ttatccggta: actatcgtet tgagtcgaac: ecggtaagsc acgaestate 5200 gccactggea geagccactg gtaaeaggat tagcagageg aggtatgtag geggtgGtae 5760: agagttcttg aagtggtgge ctaaetacgg etaeactaga agaaeagtat ttggtatetg 5820 cgctctgctg àagéOâgtfcá ecttcggaaa aagagttggt acrctcttgat ccggcaaaca 5880 aaecaccgct ggtagcggtg gtttfctttgfc ttgeaagcag 'eagat'fcacgc geágaaaaaa 5940 aggatGfeeaa: gaagateett tgaitettttc taeggggtet gaegcteagt ggaacgaaaa 6000 ctgaegttiaa. gggatttligg tcatgggatt atcaaaaagg atcttcacaC agat'Ccttt't 6060 aaattaaaaa: tgasgttt-ta saieaafccta aágtãtatate gagtaãgctt ggtctgacag €128 6taecaat.ge itaatcagtg aggaaecfeat ctcagegate fegtctattte gfcteatcGat 6180 agttgcctga ctGCcegtGg tgtagataac taegataegg gagggsttao eatctggcGc 6240 cagtgetgca atgataccgG gagaeecaeg ctsaccggGt. ccagatttat GagGaataaa 6360 CGagceagéc ggaagggccg agegcagaag tggtqctgca actittatccg ectccatGca 6360 gtetattaat: tgttgecggg: aagGtagagt aagtggtizcg ecagttgata g-ettgegGaa 6420 egttgttgec atfcgctgcag gGategtggt gfisaggeteg tcgtttfeggta tggcttGat.t. 6480 eagcfcc-eggt tc.ccaaGgafc eaaggegagt tacatgatGC: cccatgttgc gcaaaaaagc 6540 ggttsgctcG izfccggtcctas egafcegttgt eagaagtaag ttggccgcag tgfc-tateaot 6600: eatggttatg gGagqeçtgG ataáttGtet taG.tgtGatg ccatcegtaa: gadgettetfcs 6866' tgísgáGtggfe gagtaetcaa eesagteatt ctgagaatag tgtatgGggc; gaecgagttg 6720
Gtsttgeccg gcgtcaatac· gggataatac cgegceacat- ageagaaett: ta&amp;aagfcgct 6780 catcattgga aaaegttGtt:: cggggcgaaa actcteaagg gtattaccgc tgttgagatc 6840 cagttcgatg taaGGcacfcG gtgeaGceaa otgatettca gGatctttta etttegGcag 6606 cgtttetggg tgagcáaaaa caggaaggea aaatgeegea aaaaagggaa taagggcgac 6360 a:çggaaat:gt tgaafcâceca tâcítettcGt1 fcfc-tfeg&amp;á-fcáifc ^atfcg&amp;agea tttatcaggg 7020 tta^tgfcctc atzgsgcggat acagáçttga atgtafcttag :àaaaatâaâç aaatagggg't; 7080 t-rrqcgcacá ttfececegaa àagtqccacç tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgae 7140 attaacctat aaaaataggc gtatGaegag gGcctgaigg cfeqtttgegg eacceategt 7200 tcgtaatg-tt eegtggsa.cc gaggacaacc etcaagagaa aaOgtaafcea cactggctca 7260 cctT.cgggtg ggeetfctctg égttfeatàag gagacacttt &amp;tgt:ttaagâ aggfetggtag 7320 atteetigcg gettiggeag ccaagchaga tccggctgfeg gaatgtgtgt cagttagggt '738.0............................................... gtggaaagtc ccgaggctcG eeagGaggca gaagtatgea. aagcatgca® otea.attagt: 7440.................................................... cagcaaccag gtgtggaaag fccceeaggct. ccecagcagg cagaagtatg ca.aagcatge 7500 atcrcaatta gtcageaaG.G afcagtccege GGGtaactcc geq.eateeog eccctaaetc: 7360 cgci'cagt.tc Ggeeeáttet: ccgaGecstg gefe.gaeteaat tttttttatt'. tafcggagsgg: 762:8 ccgaggeegc eteggegtot, gagctifi:tfccE: agsagt&amp;gtg aggaggcttt tfetfgaggce 3 68 θ' tâggçttttg caaaaagctia gcttggggGc accg&amp;tcagâ gcaccttcGa ccatggGcac: 7740........... cfceagcaagt tcee&amp;cttga sGaaaaasat Gaagc.aaatg tacttgtgcc tgccccaggg: 7808 :tgagaaagtc caageéatgt: atatgt,gggt;: Ogatggtaçí;. ggagaaggaG tegqgGtgcaa: 7860 ascccgcacc ctggactgtg agccGasgtg tgeagasgag ttaçctgagt ggaattttga 7920 tggcÊGtâgt aectMcagt: ctgagggctc caacagtgac atgfcateica gccctgttgc 7980 catgfcttGgg gaccecttisc geagagatcc icaacaagctg: gfegtfcctgtg aagttttcaa 6040 gtacaacogg aagectgsag àgaccaã;ttt· aaggcactGg tgtaaacgga taatggacat 8100 ggtgàgcaáç qageaeteccfc· ggttítgg.aat ggaacaggag tãtactctgà: tgggáaéaga 8160 tgggcaccct tttggttggG cttccaatgg çttteGtggg ececaaggOG cgtattactg 8220 tggtgfcggge gcagacaaag cGtatggeag ggatafcegtg gsggctcae.t accgcgcç.tg 8780 crtgtatgct ggggtcaaga ttacagg&amp;&amp;c aaatgctgag gtGatgeGtg eceagfeggga 83-10 actccaaata ggaccctgtg aaggaatccg catgggagat cafcctcr,ggg tggeeggtifct 8400 catcttgcat cgagtatgtg aagactttgg ggtaatagca acett-tgacg coaagGccat-: 84 60 tcctgggaac tggaatggtg caggctgcca taecaacttt agcaceaagg ccatgcggga 8520' ggagaatggt: é:tgáâgcaca: tegaggaggc catcgagaaa. ctaagcaage ggcaccggta 8580
CeáGatfcega; gggtàôgátc: cçaagggggg GGlggaçagt geccgtggte tgaçtgggtt 8640 ooacgaaa:cg tceaac.atc&amp; acgacfetttc tgetggtgfcc gceaafcegca gtgccageat 8700 cegcattcec cggactgtcg gécággagaa gaaaggttac tttgaagacc gcggeecGte 8760 tlgccaattgt; gacGÇÇtttg çagtgacaga agecSfccgte cgoacatgcg t'fcGtcaatga 882¾ gãcfeggcgac gagGccitGG áataGâaâSa c-taattagac fct-tgagtg.áfc ettigágGCtt 8 860 tccaagttca cccracceogr- seGeagagag afcGtttgtga aggaacetta c.ttctgtggt 8940 gtgàGal-ãat tggaçaaàefc: acctaeagag &amp;fciltsaagc:t: Gtaàggtaaa tàt:aáaat'tt 9000 ttaagfcgtafc aatgtgftaa actaetgat-t ctaattgttít: gtglatttta gattceàacc 9060 tatggaactg atgaatggga geagtggtgg aatgccttta atgaggaaaa .cctgtSt.tgG 91:20: teágaagsãa.: tgccaSGtag tgatgatgag gctact.gGtg; àctetcaaca ttetactect 9180......... ccaaaaaaga sgagaaaggt agaagacccc aaggaGttte cttcagaafefc gctaàfttt-t 9240 t;tgágt.Gàtg· ctgtgtttag taatagaaet ctigctfcgct ttgctattta GaGcaeaaag 0300 gaaaaagetg cactgctata câagáaaatC atggaaaaat attctgtaac ctttatáagt: 9360 aggcataaea gtfeafeaatca taáéatâetg Êtfetttctfca ctccacacag géatíagagtg: 9MS· tefegetatta ãtaacfcâtgG tcaaaaattg tgtaècEt:ta: gctttttagi:: ttgtaaaggg 9480 gttaafcaagg aafca:t:t:tga:t: gtatagtgee tigaetagag atcataatca gccataecac 9540 atttgtagag gttitaettg ctttgaaaag. cctçecaoaG; etccceçtga acctgaaaca 9800 tdaaatgaat gcaatfcgttg ttgttaaett gttOatftgca géttatâatg gitacaâàtà 9<S60 aagcastagc atcacaaatc tcacaaataa agcaOttttt tGsctgcafct ctagttgtgg 9720 tttgtceaàa ctca:teaatg tatettatca tgtctggatc tagcttcgtg tcaaggacgg 97«0 tgactgcagt gaataataag atgtgOgttt gtccgaaata egágfctttgâ: gatttgtgte· 9840 gecgaetaaa ttcatgtcgc gsgatagigg tgttfcafecgc cgalàgagãt ggcgatsttg 9S0Ó gaaaaatega tafe-ttgaaaa feafeggcatat tgaaaatgtc gccgatgtga gtitctgtgt 996:0 aácfgáteaOç gGealOtiitG caaaagtgat ttttgggcat; acgcgatatc tggogalagc 1,002:0 gòttatafccg tfetacggggg: atggcgatag acgacfcttgg IgaGtfcgggc: gattstgtgt. 10080 gtcgcaaats tGgeagttfeG ga'tat.aggtg aeagacgatea tgaggetata tegcegafeag: 10140 aggcgacatc aagctggcac atggccaatg catatcgatc tatacatfega: atcaatattg 10200 gccattaggc at:attat;t::ga ttggttatat ageaitaa.ate aat.attggct attggccatt 10260 geatasgttg tatcçatatc ataatalgta cattiatatt :ggcfccatgtG eaaçattaçe :.103:20 gccatgttga cattgatltat tgactagtta ttaatagtaa teaatfcaegg ggtcattagt 10380 t-càOâgecea tatatggagt: occgcgt.Eae ataa.cttacg gtáà.átggec cg.cctggc^g 10 ¢40 accgcccaac gaçccccgée: cattgacgte aataatgacg tatgttGeca tagtaaegce 10500 aataggcact ttPGattgaG gtcaatgggt ggagfeattta :cggtaaactg ee.cactiggc 10560 agtaeatcaa gtgtâtcatia tgccaagtac gcecectatt gacgtcaatg acggtaastg 10020 gcccgcct.gg catiatgcec agtaeatgae cttatgggae tttcetacfct ggcagtacat 106:80 cracgtaLta gfccatcgota ttaccatggt gatgcggttt: tggcagtaca tcaatgggeg ioiio tggatagcgg tttgactcae ggggatttce. ;aagt:s;tcçac: eeeattgaeg teaatgggag 10:800' ' tttgrtttgg caecaaaate âségggaett ÊGaaaaatgt cgtaa.caaot ccgccccatt Í0860 gaegcaaatg ggcggtagge gtgtaeggtg ggaggtetat ataageagag ctcgtttagt iogm gaacc-qtcag atcgcctgga ga&amp;gccatcG acgctgttfcfe gacctccata gaagaeaceg 10980 ggaeggatec agettccgcg gcGgggaacg gtgeattgga acgcggattg éécgtgeçaa 11049 gsgtgâcgtâ agtaccgcét âtagagtótâ taggcccacfe CGcrtggett cttatgaatg 11100
Gtatactgtit tttggcfcigg ggtctataea cccccgcttc cteatgttat: afgtgatggt 11160 atagcttagc Gtataggtgt gggttattga gcattattgà cçactocòct: atiggtgaeg 11220 atafcfcttgca ttactaãtGC âtágeatgge tatttg:c;càe: aactctcttt attggctáfcã 11280 tgccaataca ctgcccrtca gagastgaca Gggaeitetgt attittacag; gatggggtict 11340 catttattat ttâcaãâttc acata.tacaa caccae-cgtc eácagtgccc gcagttttta 11400 ttaaacataa cgfegggatct Gcacqcgaat ctcgggtacg tgrtccggac; atgggctett 11460 ctrcggtagc ggcggagctt ataeatcega. gecatgct-se catgect:cca: gcgacteatg 115-20 gtcgetGggc âgctcettga tcGtaacagt ggaggccaga cttSaggeaGa gèacgatgcG 11580 caccaccacc agtgtgcegc acaaggccgt ggcggtaggg tatar.gc.cta aaaatgagct 11640 cggggagcgg geltgcaccg etgaegcatt fcggaagactt aaggcagccig :cagaagaa:ga 11700 tgcaggcagc tgagttgttg: t^tt^tgata àfagtcagag gtaactccçf ttgcggtgct 11760 gttaacggtg gagggcagtg tagtctgagc agtactcgtt gctgccgcgc gcgccaccag 11820 acataatagc tgacagaeta acagactgtt cctttccatg ggccttttct gcagtcaccg 118 80 tccttgacac g 11891
<210> 42 <211> 135 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> sintético <400> 42 Mé.t Asp Trp Thr Trp Arf lie Leu í%e Leu Vai Ala: Ala Ala Thr: Gly 1 5 1Q 15
Vai Hís Set Sln Vai Glh Léu: Sln Glu Ser: GlyiPho Gly Leu Vai Lys '20: 2 5 30: pro Ser G1 o Thr Leu: Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Tyr Ser lie 35 40 45 ,Sér Ser Asp Phe Ala Trp Asn Trp lie. Arg Glh Pro Pro Giy Lys '6:1 y-50 55 :60
Leu Glu Trp Met Gly Tyr lie Ser Tyr Séft Sly Asn Thr Arg Tyr Gift #................ 70 15 80
Pro Ssr Leu Lys: Ser Arg lie Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ash 85 90 95
Sin; Phe Eh© Leu Lys Leu Ash Ser Val Thr Ala Ala. Asp Thr Ala Thr 100 10b no
Tyt Tyr Cvs Val Thr Ala Giy Arg Gly Phs Pro Tyr Xrp Gly Gin Gly 115 12Õ 125
Thr; Leu Val Thr Val, Ser Ser 130 135
<210> 43 <211> 330 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <400> 43
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val PhS: Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
:1 5 10 IS
Ser Thr Ser Giy Gly Thr Ala Ala Leu Gly Gys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro SIM Pro Val Thr Val Ser Trp Ash Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His; Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Vai Pro Ser Ser Ser Léu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80
Tyr lie Cys Ash Val Asn His Lys; Pro Ser Ash Thr Lys·: Val Asp Lys 85 ........ 90 ........:95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp: Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly G! y Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 11:5 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Sex Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu ASP Pró Glu; Val LyS: phe Asti Tip 145 150 155 160
Tyr Val Asp; GI y Val Glu Val His Ash Ala Lys Thr Lys Pro Are *_lu 155" 170 " 115·
Glu Gin fyr Asn: Sex Thr Tyr Arg Val Val Sex Val Leu: Thr Val Leu 180: 185 ISO
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 185 2Õ0 2Ô5
Lys Ala Leu: Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lvs Gly 210 2-5 220
Gin Pro Arg: Clu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser .Arg Asp Glu :225 230 235 240
Cys Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val. Lys Giv Phe Tyr 245 250 255
Pro Sex Asp lie Ala Val Glu Trp Glu: Sex Asn Gly Gin Pro Glu .Asn 2 SO 265 270
Ash Tyr Lys Thr Thr Pro /Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe. 275 280 285
Leu Tyr: Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys: Ser Arg Trp Gin; Gin Gly Asn 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu :Hls Asn His Tyr Thr 305 310 315 320:
Gin Lys Ser Léu Sé® Leu Ser PtQ Giy Lys 3.?5 330
<210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <400> 44
Ser Asp Phè Ala Trp Asn 1 5
<210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <400> 45
Ty® Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Airg Tyr Gin Pro Se® Leu Lys Ser 1 .5 " 10 15
<210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <223> sintético <400> 4 6 <22 0>
Va 1 Thr Ala Gly Arg Gly Bhe Pro Tyr 1 5
<210> 47 <211> 127 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <400> 47
Met Asp Ttp: Thr Trp Arg lie Leg Phe Leu Val Alá Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15
VaI· His Ser Asp lie Sin Met Thr Gin Set Pro Set Ser Met Ser Val .....20 ;2'5 30
Ser Val Gly Asp: Arg Val Thr H© Thr GysHiS Ser Set Gin Asp He 35 ........ 40 4:5
Asn. Ser Asn lie Gly Trp: Lea Gin Glh Lys Pro Gly I,ys Ser Phe Lys 50 55 60
Gly Leu lie Tyr His G.iy Thr Asn Leu Asp Asp Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Tht Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser Ser 85 90 95
Leu Gin Pro Giu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr C\.s Val Gin Tyr Ala Gin 100 105 110
Phe Pro Tip Thr Pile Gly Gly Gly Thr Lys Leu ©Xu lie: Lys Arg 115 1:20 125
<210> 48 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <400> 48
Thr Vai Ala Ála Pró Ser Val Phe lie Phe Pro Pro "Sex Asp Glu Gin 1 5 IQ X5: feu Lys Ser Gly Thr .Ala Ser Val Val Cys Leu Leu A.sn Asn Phe Tyr 20 2r> 30
Pro' Axg Glu Ala Lys Val Gin: Trp Lys Val Asp Ask, Ala Leu Gin Ser 35 40 :4 5'
Gly Asn Ser Gin- Giú Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60
Tyr Ser Leu; Ser Ser Thr Leu Thr Léu Sér Lys Alá Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80
His Lys: Val. Tyr Ala Cys Glu Val Thr His; Gin Gly Leu Ser Seir Pro 85 ........... 9Ú..............95.......
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Gys 100 105
<210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> sintético <400> 49
Sis Sex Ser Gin Asp: lie Asm Sec Asw lie Gly 1 5 10
<210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <400> 50
His Giy Thr Asn Hey Asp Asp 1 5
<210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <400> 51
Val Gin Tyr Ala Gin Phe Pro T cp ¥hr I S <210> 52 <211> 40
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 52 gagâagctfg eegeeàecaf ggatfgg&amp;e© fggegfeattg 40:
<210> 53 <211> 79 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 53 ^cettcctcc feactgggat ttggcagccc ettacetgfeg gcggctgcta ccagaaagag 60 aatgcgccag gtccaatcc 79
<210> 54 <211> 79 <212> ADN <213> Sequência Artificial <223> oligonucleótido sintético <400> 54 <22 0> cGgagtgagg acgaagggat cgaaggtcac catcgaagse agtcaagggg gottceatce; 60 actcctgtgt. cttctctac 79
<210> 55 <211> 80 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 55 gaetcggctt gacaagccca ggtceacfcct Gfefcggsgetg eacGtggctg tggaeaectg 60 tagagaagac acaggagtgg 80
<210> 56 <211> 84 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4Ο0> 56 ggfcttgitca agçegagtéa aaett^gteG ctaaeatgia etgtgtccgg ataotefcate 60 icatcagatfc t tgcg t ggaa ttgg 84
<210> 57 <211> 80 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 57 cccagagtat gatatgtage ccatccattc taaac ettte cetggtgget gccttatcca 60 attccacgca aaatctgatg 80
<210> 58 <211> 79 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 58 gggctacafca tcatactctg ggaasâeç&amp;g atateaaecc tetctgaaaa gccggatcac 60.................................................................. aateaetagg ga.cacgtcg 7 9 <213> Sequência Artificial <22 0> <210> 59 <211> 83
<212> ADN <223> oligonucleótido sintético <400> 59 gcagtaatat gttgctgtgt ctggggetgt aacogagtte agctggagge. agaactggc.t 60......................... cfctcgacgtg tccctagtga ttg 83
<210> 60 <211> 81 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 60 ccagacacag eáacátãt.ta étgfâgtaâee: gctggcagag gcftccccta fctggggacag :6:0 ggcaccetag tgacagtgag c 81
<210> 61 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 61 çacggâteea tcttaeegçt gçtcactgte: acfagggtg 39.....
<210> 62 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 62 gagaagcttg ccgrççáficaít ggattg 26
<210> 63 <211> 80 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 63 etgggattfg gcagcGCCtt acstgttgcg gctgcfeacaa: gasacagtat. tgtfâfâáagte 60 caatccatgg tggcggcaag 80 <210> 64 <211> 78
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido sintético <400> 64 gggyctgcea -iatv.'cCAgtg aggacrgaagg gàtegaaggi gaccafecgaa gccagteaag 6Ô ggggcttcCa tccactcc 78
<210> 65 <211> 77 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 65 eatgctggat ggactetgàg teatétgàat atcactgtga açãectgtàg agaagacaca 6:Q: ggagtggatg gaàgcec 77
<210> 6 6 <211> 80 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 66 ctcagagtcc atccagcatg tcaacctccg tgggagafeag gcrtgacgata aectgtcatt 60 caagccaaga catcaactcc 80
<210> 67 <211> 82 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 67 gtfcggtgat agáttagtcc tttga-aggae ttaeeaggct retgttggag ccatccaata 60 ttggagtBga tgfcettggct tg:
SO
<210> 68 <211> 84 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 68 caaaggacta atctatcacg gaacaaactt ggaegacggc gtgccatcga gattttcagg 60 gtctggcagc gggaccgact atac 84
<210> 69 <211> 76 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 6 9 gtggtggagg çagtàgt&amp;fcg tggeáaàgtee ftctggetct, aagctagaga tggfceagtgt
W atagteggtç ccgctg 76
<210> 70 <211> 79 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 70 satactaGtg cgteeageac gctcagttçc cctggaeatt cggèggGgge aeaaaactgg so............ aastcaaaGg tgagtaggg 7 9............ <210> 71 <211> 28
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 71 çtcggãtdde taetcaègtt tgatttee· 28
<210> 72 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 72 gacggatcct, tctaaactqt: gagggggtcg gatgacg 37
<210> 73 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 73 ggagctgcga cggtfcctga ggaaagaagc aaacaggatg gtgtttaagt aacaatggcc 50 acgfesatceg acescetc 7¾ '
<210> 74 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 74 ggaaccgLeg cagctccctc qgtgtteatg ttccccccat ccxjacgagca actgaagtca 60 ggcacagcct ccgtggtg 78
<210> 75 <211> 78 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 75 gtgegttgtc caettteeag tggactttgg eetetettggsgta^aaagtta tfcàaggaggó 60 acaccaegga ggctgtgc 78
<210> 76 <211> 83 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 76 gtggaaagtg gacaacgcac tacagagcgg gaactctcag gaaagegtga cagagcagga 60 ctcaaaagat tcaacataeã. gee; S3
<210> 77 <211> 88 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 77 cttcacaggc atataccttg tgetttfccat aateagettt tgacagtgtc agggtagaag 60 ataggctgta tgttgaafcsi tttgagte 88
<210> 78 <211> 71 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4Ο0> 78 ggacaaggta tatgcctgtg aagtaaefcca teagggaetc agcageectg tcactaaaag m ttttaataga g 71
<210> 79 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <400> 79 QCtgcggceg cttatGagea ttcgcctcta ttáãaãettfc tggtgagagg g 51
<210> 80 <211> 1128 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <400> 80 aagatggcac accgtggecg gcctctgcgc ctqggcccag cnctgtccca caccgcggtc
6C acatggcacc trttcrrttc òageçteçac eaagggecec agcgtgttcc ccctggcccc 120 oagcagcsag agcaGGagGg: gcggeaeagc cgccccgggfí: tgcctggtga aggaetactt: 150 eccrasgecc gtgaGcgtga gctggaaca? eggàgccctg acctcGggcg1 tgeacàcctt 240 ccccgccgtg atgeagagea gcggcctgta gagectgage agcgtggtga gcgCgcceag. 300 cagcagc-ctg ggcacccaga cctasatGtg eaacgtgaac cacaàgecea: geaaca&amp;eaa: 360 ggtggâcaag aaggtggagc:: ccaagagctg: Ggacaagaee cacaectgcc: Gcccct.gecc 420 agccccagag ctgctgggeg gacçctecgt, §ttcç:tgtt,G: ecccccaagc cGaaggacàc 480 cctgatgatc: ageaggacGG ecgaggtgac ctgcgtggtg gtggacgtga ge.éácgagga 540 gecagãggtg aagitsaatt ggfcatgtgga cggcgtcjgag gtgeacaacg ecaagaceaa 600 gcecagagaa gagGagta.ea asageaceta cagggtggtg: t-eegtgctga ccgtgetgca :660: ccaggactgg ctgaaeggca aggaataeaa atgeaaggtC: tceaaeaagg eGctgeeagc 720 ccccategaa aagaceatea gcaaggceaa gggccagces cgggagccce aggtgtacac 780 cctgccecee tecGgggacg agtggaccaa gaaecaggfeg tecGtgaeet gtctggtgaa 840 gggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggccagc ecgagaacaa 900 ctaeaagacc acGcccccag tgctggacag cgacgggage ttcttcGtgt aoageáàgct 960 gaccgtggag aagagcaggt ggeaacaggg caacgtgttc agctgcagcg tgafcgcacga 1020 ggccctgcac saccactaca GGGãgaaggg gctgageçtg' tcccccggca agtgatgaeg 3.08:0: acgcggccgt gcggacgacc gaattcattg atcataatca gccatacc 1128
<210> 81 <211> 465 <212> PRT <213> Sequência Artificial <223> sintético <400> 81 <22 0>
Met: Asp Trp Thr Trp Arg lie Leu Pile Leu Val Ala Ala Ala: Thr Sly 1 Si IS 15
Val His Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Giy Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30
Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie 35 40 45
Ser Ser Asp Phe Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly 50 55 60
Leu: Glu Trp Met Gly Tyr lie Ser T:yr Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Gin 65 7 0 75 80
Pro Ser Leu Lys Ser Arg lie :fhx lie Ser Arg: Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95
Gin Phe Phe Leu Lys: Leu Asn Ser Val: Thr Ala Ala Asp: Thr Ala Thr loo :i05: no
Tyr Tyr Cys Val Thr: Ala: Gly Arg Giy Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly 115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Giy Pro Ser Val Phe 130 135 140
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 145 150 155 160¾
Giy Cys Leu: Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val -Ser Trp 165 176 175
Ash Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala val Leu 180 tm ASS::
Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser teu Ssr Ssr Vai Vai Thr Vai Sro Ser 195 200 205
Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Aan Vai Aan His Lys Pro 210 215 ; ’ 220
Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pr» Ly$ Ser Gys Aep tys 225 235 ' ' 240
Thr His Thr Cys Pro Fro Cys Pro Al*a Pro Sly L®y Lau Gly Gly Prose 45 250 255 $e,r Val Phe Leu Phe Pro pro Lys-: Fro Lys Asp Thr Leu Mat He Ser 260 265 270
Arq Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Par Hxs Glu Asp 275 ' 2B0 ' 205
Pro Glu Val Lys Phe Aan Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val HLn Asn iAXa-Lys Thr ttys tr© Acg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 :'"'T^·
Val Ser Val Leu Thr Val Leo His Gin Asp Trp Leu Asa Gly Lys Glu 0f$ ................ 335
Tvr Lvs Cys Lvs Val Aer Asn Lys <V!a Lay Pro Ala Pro lie Glu Lys 340 34¾ 350 '^h¾^íTi:a¾^@a!r:;¾:ye::&amp;ia Lys Pro Gin %&amp;X-TfPrThr" 355: 36G 365
Lav Pro Pro Ser Ary Asp Glu Cys Thr Lys Asη Gin Val Ser Leu Thr 370 375 * 380
Cys Leu Val Lys Gly Ffee Tyr Prc Ser Asp Ha Ala Val Glu Trp Giu tas-’' ' 300 “ ' Ιίδ 01¾ Pro 0ΓΟ: : VAÍ : :ίίβ»:;
405: 410 4 IS
Asp Set Ásp: Gly Ser Phe Phe Leu lyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys 42Õ ’ 4-25 ........430
Ser At:g Trp Sin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu 435 440: 445
Ala Leu His As« His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 4 55 460:
Lys 465:
<210> 82 <211> 209 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <400> 82
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu phe Leu Vai AI a Ala Ala ThP Gly 1 5 10 15
Vai Hxs Ser Asp Lie: Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Met Ser Vai 20 25 30
Ser Vai Sly Asp Arg Va1 Thr lie Thr Cys His Ser Ser Gin Asp Ile '35:..... 40 45
Ash: Ser As:n lie Gly Trp Leu Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys 50 55 60
Gly Leu ile Tvr His Gly Thr &amp;sn Leu Asp Aso Gly Vai Pro Ser Arg 65 70 75’ 80
Phe. Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 §0 95 'Ley . Glut Pro Glu Asp Phe Ale Thr Tyr Tyr Gys Val Sin firs Ala, Gin 100 105 U0
Phe Pro Trp Thr: phè Sly Sly Sly Thr LyS: Lea, Glu lie Lys Apg Thr 115 120 125
Val Ala Ala; Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu 130 135 140:
Lys Ser Gly Thr Ala s ·* ?al. Val Cy? Leu tei »<m Asn Phe Tyr Pro 14S 150 155 160
Arg Glu Ala, Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly 165 170 175
Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser LyS Ala. Asp Tyr Glu Lys His 155 200 205
Lys
<210> 83 <211> 233 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <400> 83
Mfefc Asp Trp Thr Trp Arg lie Leu Phe Leu Val Ala: Ala Ala Thr Gly 1 5..... 10 ..................... IS......
Val -His Ser Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Met Ser Val
20 25 SO
Ser Vai Giy Asp: Arg Vâl Thr Xle Thr Gys His Ser Ser Gin Asp Ile 35 4 0 -45
Asn Seç Asri He; Giy Trp Céu Gin Gin Lys Pro-Giy Lys Sér Phé Lys 50........55 60
Giy Leu Ile Tyr His Giy Thr Asn Leu Asp Asp Giy Vai Pró Ser Arg 65 70 75 80
Phe Set Giy Ser Giy Ser Giy Thr Asp Tyr The Leu Thr ile Ser Ser 85 90 95
Leu; Gin Pro Gin Asp: Phe Ala Thr Tyr. Tyr Gys Val Gin Tyr Ala Gin 100 TO5 110
Phe Pro Trp Thr Phe Giy Gly Giy Thr Lys Leu Glu lie :Lys Arg Thfc 115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro; Ser Asp Glu Gin Leu. 130 135 140
Lys Ser Giy Thr Ala: Set Vai Val Cvs Leu Leu Asp: Ash Phe Tyr Pro 145 150 15;5: 160
Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Giy 165 170 175
Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr ISO 185 190
Set- Leu Ser Ser Thr Leu: Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 2ÓS
Lys Val Tyr Ala Gys Glu Val Thr His Gin Giy Leu Ser Ser pro Val 210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Giy Glu Cys 225 /it <210> 84 <211> 7
<212> PRT <213> Mus musculus <400> 84
Cys Val Gin Bis Ala Gin Bhe 1 5
<210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 85
Gys Val Gift Tyr AlS Gin Phe 1......... 5
<210> 86 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <400> 86 ecaeafcacts eigcgtecag: tacgetoagt tceeetggac 40
<210> 87 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <400> 87 etggaçgcag tagta.fcgtg§ 20
<210> 88 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <400> 88 gagaagcttg: ccsgscsGcat ggattg' 26
<210> 89 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <400> 89 cactgggtqa rtggcttcga tggtgacc 28 <210> 90 <211> 49
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <400> 90 ggtcaccatc gaagecagtc acccagtgâa; ggaggcttcc atccactcc 49
<210> 91 <211> 44 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <400> 91 ecaagatetg gceggceacg gtgtgccatc ttacccjctgc tcae 44
<210> 92 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <400> 92 gagsagctfg ccsccaccat gg 22 <210> 93 <211> 25
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <400> 93 qggteegcec ecttgaetgg ctteg 25
<210> 94 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <400> 94 cgaagccagt caagggggcg gaccgcttcc atccactcct gtgtc m
<210> 95 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4Ο0> 95 ceaagatctt taattaacgg accgctactc acgtttgatt tceagttttg 50
<210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 6
Set :Val· thr tie Glu Asp The 1 5
<210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <400> 97 Sèr i?a.l thr Alia Pro Asp Thr Ϊ 5
<210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 Ο Ο> 98
Ser Val Tbr Ãla Ala. Asp Thr 1 5
<210> 99 <211> 49 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <400> 99 ctgcagctga actcegttac: agccgcagac aeagcaaeat attactgeg 49
<210> 100 <211> 49 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 100 cgcagtaata tgttgctgtg tctgcggctg taacggagtt eagetgqag 49
<210> 101 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <223> sintético <4 0 0> 101 <22 0>
Thy Afg Asp Thr Set: Lys Set: Sin Phe Phe lieu Gin 1 5 10
<210> 102 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 102
Sen Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe: Leu Lys 1 5: 10
<210> 103 <211> 49 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 103 ggtcaceate gaagccagtc acccagtgaa gggggcttcc atccactcc 49 <213> Sequência Artificial <22 0> <210> 104 <211> 45
<212> ADN <223> iniciador sintético <4 0 0> 104 gafcfectfceqta egtgtccett gagatfgtga tecggçtttt çagag 45
<210> 105 <211> 55 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 105 caagggaeac gtcgaagaat cagttcttcc tgaaactgaa ctcegtisea gecgc 55
<210> 106 <211> 44 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 106 eqaagatctg gCeggeeacg; gtgtgecate ttaccgctgc teat 44 <210> 107 <211> 6
<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 107
Ser Ser let Giu fro Giu 1 ' 5
<210> 108 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 108
Ser Ser Leu Gin fero Glu 1 5
<210> 109 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 Ο 0> 109 egaagecagt Gasgggggcg gaesgettce atecactcet gtgtc 45
<210> 110 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 110
Gtctggttgt aagct.agaga tggteagtgt, a tag m
<210> 111 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <400> 111 ccaLctctag ettacaaecà gaggactttg ccacatact.a ctgeg 45
<210> 112 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 112
Cftaagatctt taattaacgg accgctsqt© acgtttgatt tcGagttttg
<210> 113 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 113
Val Tyr Ala Cys Giu Vai Thr His 1 5
<210> 114 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 114 ggcggcacaa aactggaaat c :21 <210> 115 <211> 59
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 115 gatg&amp;gttac ttcacaggca tatactttgt gcttttcata atcagct.ttt. gàçãgtgte 5$
<210> 116 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 116 agtafcatgec tgtgaggtaa ctcatc 26
<210> 117 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 Ο 0> 117 gccaegatgc gtceggo 17
<210> 118 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 118 gcacttgatg faattetccfc tgg 23
<210> 119 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 119 gaagtagtCG: ttgaccagg 19
<210> 120 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 120 gaagatgaag acagatggtg eag 23
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<210> 122 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 122 gtgatgGtat tgetttattt g 21 <210> 123 <211> 21 <213> Sequência Artificial <22 0>
<212> ADN <223> iniciador sintético <4 0 0> 123 cat acctacc «gtfctçfefc c 21
<210> 124 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 124 ècatecfgtt c 21
<210> 125 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 125 gacagggctg ctgagtc 17 <210> 126 <211> 22
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 126 gtgeagctcc aagagagtgg ac m
<210> 127 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 127 cagágtccàt: Gcagèàtgtc: 20
<210> 128 <211> 363 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 128 ttagtcaage tgeaggagte tggacctagc ciggtgaaac ettcteagtc: tetgtece.te St acG.tgcaetg tcaGtggcta st^aatcacç: agtgãçtafcg -cçtggaaefcg: gatccggeag 120 tttceaggaa acaa^Ctgga grçgatgggc Laggtaagrt.. agaftgGtaa east&amp;ggfeac 18Θ aacccátet.c tcaaeagiog· aatetcLatc:; actegagaga eatccaagaa ccSaticfcte 240
ctgcagttga arLctgrgac tactgaggac acagecaQat attactgtgc aaeggcggga 30C rccgggttte cttaetgggg ccaagggact ctggtcactg tctr-hgcagc caaaacgaca ^60 ÇGC· 363
<210> 129 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 129
Leu Val Lys lieu Glh Glu Ser Gly Pro Ser Leu Wal Lys Pro Ser Gin 1 S 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cvs Thr Vai Thr Sly Tyr ggr lie Thr Ser Asp- 20 25 30
Tyr Ala Irp; Asn Trp lie: Arg Gin Phe Pro Gl y Asn Lys Leu Glu Trp: 35 4:0 45
Met Gly fyr Ile Ser Tyr Ser Alá Asn :Thr Arg Tyr Asn Pro Ser LeU: 50* 55 " 60
Lys; Ser Arg I le Ser .l ie TLP /Arg ASP: Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe. 65 7 0 7.5 80
Leu Gin Leu Asn Ser Va1 Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Thr :Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr gal· Ser Ala 115 <213> Mus musculus <4 0 0> 130 <210> 130 <211> 6
<212> PRT
Ser Asp Tyr Ala Trp Asrt 1 5
<210> 131 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 131
Tyr I'le Seir Tyr. Ser A_a Asn Thr Arg Tyr ftsn pro. Ser .Lett Ays: Ser 1 5 ' 10 15
<210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 132
Ala Thr Ala Gly Àrg G1y Phe Pro Tyr .1 5
<210> 133 <211> 324 <212> ADN <213> Mus musculus <4 Ο 0> 133 gáGattgtigc: tgagceagtc: rccatcctcc aigtcfcciat etèhgggága eaeagfccagfc 60 ateacttgcc átteaàgtGá ggátíattaac ágtaataiag ggfcggttgca gcagaaacea 1:0 gggaaatcai: ttaagggcct gatctatçat ggaaceaact tggacgatgg agitccatea 180 aggihcagtg gcagtggatC: tggágcegat tattctcfcca ceatpageag cetggaatct 240 qaagattttg tagaetatta ctgtgtacag ratggtgagt: ttccgtggac gticggtgga 300 gucaccaagc tggaaafeoaá acgg 324
<210> 134 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 134
Asp Ile Vai Le« ThrlGln Ser Pro Ser Ser Met Ser Leu Ser Leu Gly 1 5 10 15: .A&amp;p Thr Vai Ser ile Thr Gys Bis Ser Ser Gin Asp lie Ser Ash lie 20: 25 30
Gly Trp Beil Gin G1 η T ys Pro Gly Lys Sei: Phe lys Gly: tètí lle: Tyr 35 40 45
Hxs Gly Thr: Asn teu Glu Asp Gly Vai Pro Ser Arg: Phe Ser Gly Ser 30 55 60
Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser teu Thr Ile Ser Ser teu Glu Ser Glu 65 70 75 80
Asp Phe Vai Asp Tyr Tyr Cys Vai Gin Tyr Gly Gin Phe Pro Trp Thr 85 BÒ 95
Phe (Sly Gly (Sly Thr: Lys leu GlU lie Lys Arg iOO 10S
<210> 135 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 135
His Ser Ser Gin Asp lie Ser Sec Ash lie Gly 1 5 10
<210> 136 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 136
His Gly Thr Asn lieu Gin Asp 1 S'
<210> 137 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 137
Gys Val Gin Tyr Gly Sin: Phe Pro Trp Thr 1 5 10
<210> 138 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 138
Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu 01« Asp GTy Vai Arg Lys Cvs 1 5 10 15
<210> 139 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 139
His Gly T&amp;r Asia Leu Asp Asp 1 5
<210> 140 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 140
Hi®: ;Gly Tb r Asp leu Asp: Asp 1 5
<210> 141 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <4 Ο 0> 141
Sis! G1 V Thr Ash Leu :GI.B: Asp 1 5
<210> 142 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 142
His: Gdy Thr A$n Leru Asp Asp 1 5:
<210> 143 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 143
Gly Tyr S;er lie Tfer Ser Asp Phe Ala Trp Asn 1 5. 10
<210> 144 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 144
Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Gly Ashi Thr Ar'g Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 1 S 10 15
Ser <213> Mus musculus <4 0 0> 145 <210> 145 <211> 11
<212> PRT
Gly Tyr Ssi lie Thr Sear Asp : Tyr Ala T;rp: Asn i 5: :o
<210> 146 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 146
Gly Tyir lie Set Tyr Ser Ala Asn Ifei Arg Tyr Asn Pro S.er leu Lys 1 5 ID 15
Ser
<210> 147 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 147
Gly Tyr Ser He Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn 15 10 <213> Mus musculus <4 0 0> 148 <210> 148 <211> 17
<212> PRT
Sly Tyr lie Ser Tyr Ser Ala :As:n Thr &amp;rg Tyr Asn Pro: Sex- 1¾¾. Ly® 1 5 10 15
Ser
<210> 149 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 149
Sly Tyr Set lie Thr Ser Asp Tyr Ala Tip Asp 1............5............10
<210> 150 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 150
Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Sly Ash Thr Arg Tyr Asp: Pro Ser Lee Arg 1 5 10 15
Ser
<210> 151 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (7) . . (7) <223> Xaa é um resíduo de aminoácido possuindo um grupo R polar não carregado <4 0 0> 151 ffis iSèr Ser Gliv Ãsp Ilèi Xaa Mà Ala Ser Asn Xis Gly 1 5 IQi
<210> 152 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (6)..(6) <223> Xaa é um resíduo de aminoácido possuindo um grupo R polar carregado <4 0 0> 152
HiA: Siy T.h;r Asn féU: Xaá Alá Ala Asp 1 5 <210> 153 <211> 11
<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (4)..(4) <223> Xaa é seleccionado do grupo que consiste de Ala, Gly, e um resíduo de aminoácido que é conservadoramente substituído por Ala ou Gly <4 0 0> 153
Val Siri Tyr Xaa AÍá: Ala Gin Pho Pro Trp Tht: 1 5 10
<210> 154 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (3) .. (3) <223> Xaa é seleccionado do grupo que consiste de Phe, Tyr, e um resíduo de aminoácido que é conservadoramente substituído por Phe ou Tyr <4 0 0> 154
Ser Asp Xaa A ia Alá Ala: Trp Asn 1 ' " 5
<210> 155 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (11) .. (11) <223> Xaa é um resíduo de aminoácido possuindo um grupo R polar não carregado <4 0 0> 155
Tyr Tie Ser Tir Ser Sly Asn Thr Àrq Tyr Xaa Ala Ala Pro Ser Leu 1 5 10 15
Lyq ser
<210> 156 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (6)..(6) <223> Xaa é seleccionado do grupo que consiste de Gly, Ala, e um resíduo de aminoácido que é conservadoramente substituído por
Gly ou Ala <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (6)..(6) <223> Xaa é seleccionado do grupo que consiste de Gly, Ala, e um resíduo de aminoácido que é conservadoramente substituído por
Gly ou Ala <4 0 0> 156
Tyr Ile Se* Tyr Ser Xaa Ala Ala Asn Thr Arg Tyr Asa Pro Ser Leu 1 5 10 .......15
Lys Ser'
<210> 157 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (15) .. (15) <223> Xaa é um aminoácido básico resíduo <4 0 0> 157
Tyr lie Ser Tys: Ser Gly &amp;sn Thr Arcf Tyr Aso Pro Ser Leu Xaa Ala 1 5 10 15
Ala Ser
<210> 158 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0> <221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (1) .. (1) <223> Xaa é selecionado do grupo que consiste de Vai, Ala, e um resíduo de aminoácido que é conservadoramente substituído por Vai ou Ala <4 0 0> 158
Xaa Ala Ala Tht: AM Gly Arg. Gly Phe Pro Tyr 1 5 ' 1Q
<210> 159 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <22 0>
<221> CARACTERÍSTICA_MISTA <222> (11) . . (11) <223> Xaa é um resíduo de aminoácido possuindo um grupo R polar não carregado <4 0 0> 159
Tyr Ile SeE Tyr Ser Gly Asn Tftr Aíg Tyr 'Xaa Ma Ala Pro Ser teu 1 5 10 15 ftys Ser
<210> 160 <211> 128 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> vetor sintético <4 0 0> 160 :«èt Va i Ser Thr Ala Gift Phe Leu Ala Ffte: Leu Leu Leu Trp Pfte Pro 1 5 10 15
Gly Ala: Arg Cys Asp lie Leu Met TSit Gin :Ser Pro Ser Ser Met Ser £0 25 30
Vai Sertteu Gly Asp Thr V&amp;l Set: lie Thr Cys His Ser Ser Gin Asp 35 m 45 lie.:.Ash Ser Asn lie Gly :Trp Lsu Gin Gin Arg Pro Sly Lys Ser Phe 50 55 60
Lys Gly -Leu He Tyr His; Gly Thr Asn Leu Asp Asp SIu V®.i Pro Sec o5 7 0 75 SO:
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr He Ser 85 90 95
Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Gys Vai Gin His Ala 100 105 110
Gin Phe Pro Tcp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu, Slu lie Lys Arg 115 120 125
<210> 161 <211> 134 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> vetor sintético <4 0 0> 161
Met Arg Val Leu He Leu Leu Tip Leu Phe Thr Ala Phe: Pro Gly Val 1 5 10 1-5
LeU Ser Asp Val Gin Leu Glh: Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro 20 25 30
Ser Gin Thr: Leu Ser: Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser He Thr 35 4 0 45
Ser Asp Phe Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin She -Pro Gly Asn Lys Leu SO: 55 60
Giu Trp Met Gly Tyr He Ser Tyr Set Gly Asn Thr: Arg Tyr Asn Pro 65 70 75 80
Ser Leu Lys Ser Arg lie Ser lie The Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin S3 90 m
Phe Phe Lem Gin Leu Asa Ser Vai Thr lie Giu Asp Tht: Ala Thr Tyr 100 105 ilè
Tyr Cys Vai Thr. Ala Gly Arg Glv Phe Pro Tyr Trp Sly Gift Gíy Thr 115 120 125
Leu Vai Thr Vai Ser Ala 130
<210> 162 <211> 11891 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> plasmídeo <4 0 0> 162 ttcgaacgge: ggtggtacct aacctggacc gcgtaagaga aagaccafccg fceggeggtgt. S0
GcattGceeg âGgghttagg gteactcete GttCGCtagc: rtccagtggt agct tcggtc 120 agtgggtcac ttcccccgaa ggtaggtgag gacacagaag agatgtccac aggLcrtcggt 180 ccacgtcgag gfcfctctcac ctggacccga aesgttcggc tcàgttfgaa aGâgggattg 240 tacatgacac aggcctatga gatagagtag tet.aaaacgc accttaacct afetGGgtcfg 300
KggtGecttt: ceaáatettà cetaGcegat gtatâgtátg i.agàccGttgt ggtetahagt: 360 tggãagagae ttttcggcGt agtgttagag tií;ccG:t:.gfe:gc: agettcfeteag f caagaagga 420
GttÊgacÊtg aggeaatgtc ggcgtefegfcg tcgtfcgtafca atgaegeatf ggcgacegtc 480 tesgaagggg ataaecextg tcccgtggga tcactgtgac £cgtGgocat tGfeacegtgt. 540 ggcaccggcc ggagaegegg açeègggteg agaeagggtg tggcgceagt gtacggtgga 600 aaagagaaqq tcggaggçgg tteccggggt cgcacaaggg ggaecggggg t.cgfe.cg.tt-efc 660 qgtggtcgcG: gecgtgtcgg egggãcccga cggaccactt cctgatgaag gqgct.cgggc 720 actggcactc gacgttgtgg cgtcgggâèt ggaggesgea cgtgtggaag^ gggggg.Gaeg 780 acgtctegt-iC: gceggacatg teggactcgt cgcaceaetg geaGgggfccg tggtcggacc 840:
Ggtgggfcctg gatgtagacg fctgeacttgg tgfetcgggtc gtfcgtggttc: cacetgttct 900 £ce:aóc£Ggg: gttetcgàeg ctgttctggg tgtggacggg ggggacgggt: Gggggteteg: 960 acgacccgcc tgggaggcag aaggacaagg gggggttcgy gl.feGcigtgg: gaefeac£agt 1020 rgfc-^utgggg gGtccâGtgg acgcaccacc aGctgcactG ggtgGÉcetg: ggtetccaGfe iO80 tcaagttayC catacacctg ccgcacGtGc aGgtgttgcg gttCtggttG gggtctcttc 1140 tcgtcatgtt gtcgtggatg tcccaccaca ggcacgactg gcacgacgtg gtGGtgaèeg 1200 acttgccgtt ccttatgfctr acgttccaga ggttgttccg ggacggtcgg gggtagcttt 1260 tctggtagtc gctccggttc cqggtcggtg GGcfccggggt ccaGatgtgg gacgggggga 1320 ' gggccctgct cacgtggttc t-tiggtecaga gggactggac agacçactte: ccgaagatgg 1380 ggtegctgta: gcggcacctc áGÇGtetcgii tgGcggtegg gctcttgfctg atgttetgqt 1440 gggggggtGá cgaGctyticg ctgccgtcgâ agaaggacat: gtcgttcgac tgqcacctgt 1500: tGÈcgteGae cgtegtoecg ttgcaGaagt cgacgtcgca c£acgtgctG: cgggacgtgt 1560: tggtgatgtg ggtGttetcg gactcggaca gggggeegtt caGtactgct gegccggcac 1620 gGOtgcOggc Êtaagtâact ãgtattagte ggtáSggtgt íaâaeatCEGG aa'aaGgaacg 1680 aaàtlttttg gagggtgtgg agggggftott ggactt ugta ttttãcttaè gttaacaaôa :1T4Ô acaattgaáç aaaÈaaGgtç gaataltaGc âafcgtttatt fcGgttatGgt ;agt:g£ttaaà 18W................................... gtgtttattc Gglâaaaaaa: gtgaegOaag atG&amp;acaeca aâeaggtttg· agtagtt&amp;Ga 1860 £agaa£a.gta Gàgacçgcòg gcggctàxaa acttttatac GgfcafcaaGtG ihtáGagcggc 1920 taGàGtoàaa gacaeat:£ga: çtâtageggi: aaaéaggttt teaetàaa&amp;â Gcogt&amp;tigGg 1980 CMtagaccg GtaMgGgaa tatagcaáat: gcccceGàee gçtatçtgct gaaaceactg' 2.040: : aacccgctaa ga.caca cage gttfeaOagGg t caaagcta t atGcactgtic tgetat act G 2.100; cgstatagcg getatctecg ctgtagttcg accgfcgtaçc ggttacgtat agetagatat 2160 gtaáGÊtagt tataacGggt aatcggtata ataagtaacc aatatatcgt: afci&amp;agfcfeat 2220 aaccgataae cggtaacgta tgcaacatag gtatagtatt atacatgtaa atataaccga 2280 gtáGâggttg taatggcggt. aeaactgtaa ctaata&amp;g.tg ateaataatt ateattagfct 2340 aatgcegcag gaatcaagta fcGgggtatat aGceeaàggG gcaatigeatt gaatgccatt :2400 taccgggegg accgactggc gggttgefcgg gggegggtaa ctgcagttat. tactgeatae 2460 sagggtatca ttgcggtcat cectgaaagg taa.Gtgcagt: tacccaectc ataaatgcca 2820 tttgacgggt gaaccgtcat gtagttcaca tagfcafeacgg tteatgeggg" ggataactge 2580 agttactgec: áÈfctàccggf ég.gac.cgfeaa tac.gggfccat gtactggaat acectgaaag 2640 gatgaaccgt catgtágafcg cataateagt agegataatg gfcacGac.feac gccaaaaecg 2700 tqatgfeagtt aéqegçaeçtfc átcgeeaaaq tgagtgqccrq taaaggttca gaggtggggt; 27 60 aacLgcagtt aecetesage aaaaqqgtgg ttttágtfcgc cqifegaaaggt: tfefeacagcat 2820 tgttgaggcg gggta&amp;Gtgc gtttaceegc eaiccgcaca. tgccaccctc eagatatatfe 288θ" cgtsiegagc aâatcacqtg gcagtcfeagc ggaectetgc ggtaggtgeg acaaaáqtgg 2940 aggtatcrttc qgtggcccfcg getaggtcgg aggcgcGgge ecttgccsacg fcaacefetgçg 3000 cctaaggggc acggttctea ctgcattGat ggcggatale teagatafecc gggfeggggga 3060 accgaagaat acgtacgata tgaeaaaaac qgaacceGag atafcgtgggg gcgaaggâgt 3120 acaatateca ctaccafcatc gaatcggata fccGacaecca ataactggta ataactggtg 3180 aggggataae caotgetatg aaaggtaatg atfeaggtatt gtaccgagaa aqggtgttga 3240 gagaaataac cgatataegg ttatgfcgaGà ggaagtçtet; gâc^gtgcGt; gagaqataaa 33Ò0 aatgtcctac cceagagtâa: ataataaatg tttaagtgta tatgttgtgg tggcaggggt 3360 cacgggcgfce:: aaaaataatt tgtattgGac cctagaggtg egs£t;agagg ecatgeaeaa 3420 ggcctgtacc cgagaagagg ccatcgccgc ctcgaagatg taggctoggg acgagggtac 3480 ggaggtcgqt gagtiaqeágtí gagccgtcga ggaacgagga titgteãcGtC: cggtctgaafc 3540 ccgt.gtcgtg ctaegggtgg tggtggteac acggcgtgtt ccggcaccgc cat^aca lac 3600 acagaetttt aetcgagcce ctcgcccgaa egtggcgaqt gcgtaaacct tctgaattcc 3»»ú gtcgccgicti tettcfcaqgfe: cqgtcgactc aacaacacaa gactattctc agtctccatt 3720 gagçgcaacg ccacgacaat tgccacctec egfcqacatca gaetegtqat gagcaacgac: 3780 ggcgcgcgcg gtggtctgta fctat.cgac.tg tc.tgattgtc tgacaaggaa aggtaceeag 3840: aaaagacgtc agtggcàgga actgtgGtte gaacggcggt ggtàGcta&amp;c ctgaaeetct 3900 tatgacaaag aacatsgteg: gcgttgteea. ttceeega.tig fgtt-tafggtc: aetoGteefct 3960 ccctagcttc eactggt&amp;gc: tteggtcagt tcgcccgeet: ggcgaaggta ggfcgaggaca 4020· cagaagagat gfcccacaagt, gtcactataa. gtetactg.ag tetcaggtag gtcgtacagt 4080 gagaggcacc: étcfatcega otgctattgg agagtasgtt cggtteti.gta gttgaggtta 4140 taacctaccg aggttgtctt cggaegafctc aggaagtttG ctgattagat agtgGcttgfc 4200 ttgâàicetgc.: tgccgcaegg tagctctaaa agtcccagac cgtcgeGstg gctgatstgt 4260 gacaggtaga gatGgaatgt fcggtctcctg laaacggtgta tgafegaegea ggtcafegcga 4320 gtcaagggga cotgtaagcc gGcgccgtgt tttgacctitO agtttgeact eategecagg: 4380 caattaattt ctaggaagat. itfegagactec ceeagcctae: tgcaacggta acaatgaatt 4:44:0 tgtggOágga eaaacgaaga aaggagtcct tggcagcgtc gagggaggca caagtagaag 4000 gggggtaggc tgcfcegtfcga cttoagtocg tgteggaggG accacacgga ggaattattg '4:500 " aaaatgggtt ctctccggtt tcaggtcacc tttcacctgt tgcgtgatgt ctcgcccttg 4620 .i^agtccttt egcactgtct cgtcctgagt ttte-taagtt gtatgtcgga tagaagatgg 4680 gaetgtgaga gt fcittcgaet :&amp;ataGtttfec gtgtttcafca tacggagagt tcatt:gagta 4740 gtcGctgagt cgtegggaea gtgattttca aaafctatetc egegtacgaç ^át.tcggçgg 4800 cacgcefcgGt gacntaagta actagtatta gtcggtatgg fcgtgaaeatie tcGaaaatga 48:60 aegaaafettt ttggagggtg: tggaggggga etfeggaettt g:t:a£tt:tac£ taegttaacà 4920 áfeâàèMtfcçr aãcgaaGagp gtggaatàtt: acgaatgt^t. atttegttat, Ggtagtgttt; 4980 aaagtgttta; fcttcgtáaaa aaagtgaegt aagafeeaaea ccaaacaggit ttgagtagitt 5d40 aeatagãata: gt&amp;GagacGt aggagatgeg gGetgsgtag eaccggecgt agtggcegcg |:|Õ0. gtgfccacgc caacgaCGgG: ggatátagcg gGtgtagtgg etaeGpptte tageccgage 5160 ggtgaageçtí gagt.actpgc gààcaaàgGG' gcâcceãtaG caccgfccGgg gg:Gacçgg,ec 5220 çGçtgacaac ccgoggtsga ggaacgtacg tggtàaggaa cgcggccgGc aegagttgGC: mm-
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Ggggcggacc gtaatacggc tçâfcgtaetg gaataçcctçf aaaggàtgaa: ccgtcatgta: 10SSO gatçcataat cagtagcgat aatggtâccà Gtacgceaaa aceg:tea:£gt afttacGcgc: iomo ' ' ' ................................. acetafeccrce aaactgagtg ereectaaagg tteagaggtg gggta&amp;etgG agttagcGtc 1Ô8CJÒ aaacaaaacc gtggttttag ttgGegtfsa aggfefcttaea gçattsttga ggsggggtaa 10860 ctgcgttf.ac Gcgecafcccg eacatgceac ccteeagata tattcgtetc gagGãaátGa 10920
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<210> 163 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <400> 163
Met Asp Trp Thr Trp: Arg lie leu Bhé lea Vai Ala Ala Ata. Tfor Gly 1 5...........10 ............15 '
Vai His Ser:
<210> 164 <211> 116 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 Ο 0> 164
Gin. Val Sin; Ley Gin Glu Ser Sly Pro Gly Leu Va.1 Lys Pro Ser Sin 1 5 10 15
Thr Ieu Ser: Leu Thr Cys Tfer Val Ser Gly Tyr Ser lie Ser Ser Asp 20 25 M
Pfte Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp: 35 40 45
Met Gly Tyr He Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Gin Pro Ser Leu 50 55 60
Lys Ser Arg He: Thr He Ser Ar;g: Asp Thr Ser Lys Asn Gin Fhe .Ph® 65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn ser Val Thr A.la Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Gy® 85 :90 95
Val Thr Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Va1 Ser Ser-115
<210> 165 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 165
Met Asp Trp Thr Trp: Arg lie Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5: 10 15
Val His Ser <210> 166 <211> 108
<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 166
Asp tie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Set Met Ser yal Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Ttir tie lifer Gys His Ser Ser Gin Asp lie Asn Ser Asa 20 25 30 lie Gly frp leu Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Phé Lys Giy Leu lie 35 40 45
Tyr Hi.s Gly Thr Asn Leu Asp Asp Gly Val Pro Ser Arg pfeé Ser Gly 50 ..............55 60
Ser Gly Ser Gly TfeP Asp Tyr Thr Leti Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 7 0 75 80
Glu Asp Fbe Ala Thr Tyr Tyr Cys val Gin Tyr Ala Gin Phe Pro Trp 85: 90 95
Thr the Gly Gly Giy Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100: 105
<210> 167 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 167
Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gin 1 5 10 15
Thr Léu hei. Leu Thr Gys Thr Vai Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Set Asp 20 25 ,30
Phe Ala Trp Asn Trp .Tie Arg Gin Phe Pro Gly Aso. Lys lea Glu Trp 35 49 15 ........
Met Gly Tyr lie Ser Tyr Ser Sly Asn Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu 50 " 55 60
Tys Ser Arg ile Ser Ile: Thr Arg Asp Thr Ser hys Aso Gin Phe :Phe 65 70 75 S0
Leu Glò Leu Asn Ser Vai Thr ile GIU Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Gys 85 9:0 95
Vai Thr Ala. CLy ArgGly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai IGO 105 110
Thr Vai Ser Ala 115
<210> 168 <211> 116 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 168
Gin Vai Gin Leu Gin Glu S.er Gly Pró Gly Léu vai Lys Pro Ser Gin 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cy;> Thr Vai Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Asp 20 25 3;df
Ph®: Ala Trp Asn Trp lie Arg Gin Pro pro Gly Ly.s Gly Leu Glu Trp 35 ' 40 45
Met; Glv Tyr lie Ser Tyr Ser Gly Asa Thr Arg Tyr Gin Pro Set Leu 50 55 60
Lys Ser Axf He Thr lie: Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gin Phe Phe 65 70 75 8:0
Leu Gin tea Ass Ser Val Thr Ala Pro Asp Thr A3.a Thr Tyr Tyr 6ys: 85 90 95
Val Thr Ala G1 y Arg Glv Phe Pro Tyr Trp Gly Gin; Gly Thr Leu ?al 100 105 U0
Thr Val Ser Ser .11:5
<210> 169 <211> 80 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4 0 0> 169 ucctaacctg gaecgegtaa gagaaagacc atcgtcggcg gtgtgsáttç ceçgacggtt 60 t agggtea ct eatcat tecc 80
<210> 170 <211> 81 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4 Ο 0> 170 ateeeagtg» ggaggàaggg atcgaaggtc aGcatcgaag ccagtcaagg gggcttcGat 60 ecactcctgfe: gtettctcta c «1
<210> 171 <211> 80 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4 0 0> 171 ggtgaggaea c&amp;gaagagat gfceGáGaggfc gfcggtcGaç gtçgàggffe tetcacctgg 60 ââecgaacag ttcggctoag 80
<210> 172 <211> 85 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4 0 0> 172 tgggcttgtG aagecgagtc aaactttgtG eetaseatgt actgtgtccg gatactctat 60 GEcatcagat tttgcgtgga attgg 85 <210> 173 <211> 82
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4 0 0> 173 gagtàgfeta aãaegeacet taaççtattG cgtcggtggt ccctxtceaa atetLaectd 6Õ cccgatgtat agtatgagaç ce 82
<210> 174 <211> 80 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4 0 0> 174 gggetacàta. tc&amp;tacictg ggaaeaiecag aiafaaaôèa tictctgaaáa gceggafccae 60 aatcactagg gâeaggtcga. £6”
<210> 175 <211> 83 <212> ADN <213> Sequência Artificial <223> oligonucleótido sintético <4 0 0> 175 <22 0>
gttagtgate Gctgtgcagc ttcteggtca agaaggacgt. cgacttgagg caatgtcggg •SO gtctgt.gtcg tetgtataatg acg 83
<210> 176 <211> 82 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4 0 0> 176 ccayacaeag Gaacatatiia ctgcgtaacc gctggcagag gcttccccta ttggggaeag 60 ggcaccctag tgacagtgag ca 82
<210> 177 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4 Ο 0> 177 gtgggatcac tgteaetcgt :cgccatteta cetaggeac ? 9
<210> 178 <211> 1128 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 178 ttGtaccgtg tggcaeegge çggàgaegeg gaeftcgggte gagacagggt; gtggcgcéag 60 tgtaccgtgg asaagagaag gtcggággtg gttçeegggg tggcac&amp;agg: gggagcgggg 120 gtGgtegtt© tcgtggtcgc cgccgtgfeGg qcgggacccg acggaacact tcctgatgaa 180 ggggctcggg caGtggcact cgaeettgte gcetGgggae tggaggeegs: aegtgtggaa 240 gqggeggcae ga.egtctcgt cgceggaeat gteggactcg tcgcaceact ggcaGgggte 300 gtegtcggac Gcgtgggtcf: ggatgtâgae gttgcact.tg gtgttcgggt cgttgtggtt 360 ccacctgttc ttcGacctcg ggttetG.gac gctar.tctgg g t g t g ga c g g g g g g ga c a g g 420
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<210> 179 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 179
Asp l'le Leu Met T:hr Gin Sèr Pro Ser Ser Bet Ser: Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 :Mp Th:r; ¥al Ser Ilg Thr GyS fils Ser Ser Gin Asp lie Asn Ser Asn 20 " 25 39
He Gly Tpp Leu Gin Gin Arg: Pro Gif Lys Ser The: Lys: Gly Leu lie 35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Asp Asp Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 5.0 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr .Cys V&amp;l Gln; His Ala Gin Phe Pro Trp 85 90 m
Thr Phs Gly Gly Sly Thr Lys Leu Glu lie Lys 10Q 105
<210> 180 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 180
Asp lie Leu Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Met Sec Val Ser Leu Gly 1 " 5 10 15
Asp Thr Val Ser Tie Thr Cys His Ser Ser Gin Asp Tie Asn Ser Asn .......... 20........ 25 30 lie Sly Trp Leu Gin Gin Arg Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu lie 35 40 45:
Tyr His Gly Thr Asn Leu Asp Asp Glu Val Pro Ser A,rg Phe Ser Gly 50 55 60
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Glu Asp Phe Ala Thh Tyr Tyr Cys Val Gin Tyr Ala Gin Phe Pro Trp 85 90 95
Thr Phe: Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu ; He Lys 100 105
<210> 181 <211> 80 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4 0 0> 181 gáacggcggt ggfacçt&amp;ac etgaacctct tatíjãoasag aágatGgtcg gcgttgtcca 60 11ccGcCf.acg gtttagggtc. 80
<210> 182 <211> 80 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4 0 0> 182 aaggggGtge caaàtcGcag tgàggaggaa gggatcgaag gtgaccatcg aagccagtca 60 ..... agggggctt. c ca teeactcc 80’
<210> 183 <211> 80 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4 Ο 0> 183 teccccgaag gtaggtgagg acacagáágâ gatgteeraca agtgteacta taagtctaot 60 gagtetcagg taqgucgtac 80
<210> 184 <211> 82 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4 0 0> 184 gttcggttct gtagttgagg ttataaccta ccgaggrtgt cttcggacca tteaggaagt 60 ttcctgatta gatagtgcct eg 82
<210> 185 <211> 80 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4 0 0> 185 gaecqtcgec ctggctgata fcgtggcfcggt agagategaa teteggtett efgaaacggfe 60 gtatgatgac gcaggtcgtg 80 <210> 186 <211> 80
<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4 0 0> 186 cátaetãctgi cgtccageae: gcrcagtccc cctggacatt eggeggcggc acaaaactgg 60 aaatcaaaeg tga.gtagfgá so............
<210> 187 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4 0 0> 187 ceftfcagttf. geacteatee. etaggete 28
<210> 188 <211> 233 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 Ο 0> 188
Met Asp Trp Thr Trp Arg: I le I.èu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr 01¾ .1 5 10 15
Val ai.S: Set: Asp lie Gin:: Met Thr Gin Sec Pro Set Ser Met Set Val 20 ' 25 30
Ser Val Gly Asp Acg: Val Thr He Thr: Cys His Set Ser Gin Asp lie 35 40 45
Ash Set Ash: lie Gly Trp Leu Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys 50 55 60
Gly Leu He Tyr His Gly Thr Ash Leu Asp Asp Gly Val Pro Ser Aig
65 70 75 oO
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser 85 90 95
Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gin Tyr Ala Gin 100 105 110
Phe Pro Trp; Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Tie Lys Srg Thr 115 " 120 125
Val Ala Ala Pro: Set Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu 130; 135 140
Lys Set Gly Thr: Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Ash Ash Val Tyr Pro 145 150 155 *' 160
Arg Glu Ala. Lys Val Gin Trp Lys Val Asp: ASA Ala Leu GIL Ser Gly 165 17Õ 175
Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu :Gln Asp Sèr Lys Asp Ser Thr Tyr ISO:..........185:.......... 190
Ser Leu Ser Set Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Gly 195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin His Lea Ser Ser Pro Va-I 21© 215 220 th* Lys Ser Fhs Asa Arg @ly Glu Cys 225 2 30
<210> 189 <211> 704 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 189 atggtgtcca cagctcagtt. ccttgcattc ttgttgcttt ggtttecagg tgcaagatgt 60 ’ gacatcctga tgacecaaic: teeateefecG: atgtcfcgt&amp;t ctetcjggaga caeagtcagc .120 aucacttgcc attcaagtca, ggacattaac agtaatatag ggtggttgca gcagagacca 180 gggaaateafe tfcaagggeet gatetateat ggaacc..-..-.cL tggacgatga agttccatca 240 aggttcagtg gcagtggatc tggagccgat tattctetca eeatcagcag eetggaatet 300 gaagattttg eagactatta ctgtgtacag tatgcteagt ttcegtggac gttcggtgga 360 ggcãccaagç tggsaateaa, aegaaetgtg gctgeaegaf gtgfctteat cttcqcjgGca 420 tctgatgagc: agttgaaatc tg:g:aaefcgcc tctgttgtgt geetgetgaa taacttctat 4S0..... gòéagagagg cGaâagtaeâ gt^gasgfgtg gátaaggécc tGteaatGggg· taàetççcag'· 54 0 gagagtgtca cagagcagga cagsaaggac agcaectaea geetcagcag caccctgaeg 600 ctgagcaaag cagaefcacga gâààeaeáaâ gtetacgect gcgaagtcag ccatcagggc 660
Gtg&amp;gctGgc ccgtcacaaa: gagcfetGaãc sggggagagt; gttg 704
<210> 190 <211> 702 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 0 0> 190 atggattgga· cttggagaat .actgtttctt. atagcagccg caaeaggtgt tcaeagtgat 60 attoagatga Gtcagagtcc atccageatg toagtctcc.g tgggagatag ggtgacgata 120 acctgtcatt caagccaaga catcaactcc aatat’tggat ggctccáaca gaagcctggt 180 aagtccttGa aaggactaat ctatcacaga acaaacttgg acgacggcgt gccatcgaga 240 t ttcagggt ctggcagcgg gaccgactat acactgacca tctctagctt acaaccagag 300 gactfctgeca cataetaetg cgtccagtae gctcagttcc cctggacatt cggcggeggc 360 aeaaaactgg aaatcaaacg aaccgtcgca gctGGetçcg tgfctGatctt ecceeeaKce 420' gacgagcaae tgaagfeeagg cacagcctcc gtggtgtgcG tçcttaat:aa: ctfittaccca 480
agagaggcca aagtccagtg gagagtggac aaçgeâctaç agagGgggâs ctctcaggaa MO agcgtgaeag agGaggactG: aaaagattGa acatacagcc; tatettctae GetgaGaGtg 600 teaaâagGtg attatggaàã gcaGaaagta tatgGGtgtg aãgtaaGfca: t.cagggactc 660 agcagccctg tcaGtaaaag ttttaat.ága ggcgaatgefe ga 702 <213> Sequência Artificial <22 0> <210> 191 <211> 408
<212> ADN <223> sintético <400> 191 gcGàceàtcf.a gagtgctgat tettittgtgg ótígttéacag:3éétt't'C.èt:gg: tgLcctqtet 6Ó: gatgtgcagc ttgaggagte gggiaegtagc ctggtgaàãc cttctcagáe:: tcfegtcfcotc; 120 acctgcactg tcactqgcta ctcaatcacc aftgatfttg cctggaaetg gatgoggcag 180 tttccaggaa acaagctgga gtggatgggg taeataagtt atagtggiaa. eactaggtac: 240 aacccatctc tcaaaagtcg aatctetate actcgagaca catccaagaa scaattcttc 300 ctgcagfct<ga attotgigae tattgaggae acagceaeat afctactgtgt aacggcggqa :3:60 cgcgggtttc cttattgggg ccaagggact etggteaetg tctctgca 408
<210> 192 <211> 405 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sintético <4 Ο 0> 192 atggattgga cctggcgçat tctctttctg: gtágeàgéég ecacàggtgÊ écâcagèèag 60 gtgcagctcc aagagagtgg acçtgggctt gtcsagccga gfccaaaettt gteèçtaacá 120:
tgrtactgtgt ccggataelic tatetcatca gattfctgcgt ggas££ggat aaggeageea ISO :Ceagggaaag gtttagaatg gatgggetae atáfcea-fcacfe etgggaàeae eagatàfecaa 210 ccttctctga aaagccggat cacaatefcca agggacacgt cgaagaatca gttettcstg 300 aaactgàáot ccgftacagc cgcágacaça geãà.caiaÊÉ actgcgta.ao cfcfcggeaga 360 ggcttccçct àttggggacá gggçãcc-cta gtg&amp;cagtga gcagc 405
<210> 193 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 193
Tyr His ély Thr Asa Leu Asp Asp 1 S
<210> 194 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 194 •Tyr Sis: Sly tkx Asa ieu Gin :Asp 1 5 <210> 195 <211> 9
<212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 195
Veil Gin Tyr ftlct Gin Pile Fro Trp Thr 1 5

Claims (19)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo anti-Recetor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR) isolado para utilização no tratamento de um cancro residente no cérebro num mamífero, em que o cancro residente no cérebro é selecionado do grupo consistindo em glioblastoma, meduloblastoma, meningioma, astrocitoma neoplásico e malformação arteriovenosa neoplásica, e em que o referido anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 164, compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 166, e é conjugado com um agente selecionado do grupo consistindo num agente de ablação química, toxina, imunomodulador, citocina, agente citotóxico, agente quimioterapêutico e fármaco.
  2. 2. Anticorpo isolado para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o cancro residente no cérebro é glioblastoma.
  3. 3. Anticorpo isolado para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido agente é um agente citotóxico.
  4. 4. Anticorpo anti-Recetor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR) isolado para utilização no tratamento de um cancro num doente humano, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 164, compreende uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 166, e é conjugado a um agente citotóxico.
  5. 5. Anticorpo isolado para utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o tumor contém EGFR aumentado.
  6. 6. Anticorpo isolado para utilização de acordo com a reivindicação 5, em que o tumor é selecionado do grupo consistindo num tumor da cabeça, um tumor do pescoço, um tumor mamário, um tumor pulmonar, um tumor da próstata, um tumor da bexiga, e um glioma.
  7. 7. Anticorpo isolado para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, em que a região variável da cadeia pesada está fixada à sua extremidade C-terminal a uma cadeia pesada de um isótipo IgG.
  8. 8. Anticorpo isolado para utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o isótipo da IgG é IgGl.
  9. 9. Anticorpo isolado para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, em que a região variável da cadeia leve está fixada à sua extremidade C-terminal a uma região constante de cadeia leve kappa.
  10. 10. Anticorpo isolado para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, em que o anticorpo compreende uma região constante da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 43.
  11. 11. Anticorpo isolado para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 ou 10, em que o anticorpo compreende uma região constante da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 48.
  12. 12. Anticorpo isolado para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, em que o anticorpo é para ser inj etado.
  13. 13. Anticorpo isolado para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, em que o anticorpo é para ser administrado a uma dose consistindo em cerca de 20 a 1000 mg de proteína por dose, 20 a 500 mg de proteína por dose, ou 20 a 100 mg de proteína por dose.
  14. 14. Anticorpo isolado para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, em que o anticorpo é para ser administrado a uma dose de cerca de 0,1 a 20 miligramas por quilograma de peso corporal ou cerca de 0,5 a 10 miligramas por quilograma de peso corporal.
  15. 15. Anticorpo isolado para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14, para ser utilizado em combinação com um segundo agente.
  16. 16. Anticorpo isolado para utilização de acordo com a reivindicação 15, em que o segundo agente é selecionado do grupo consistindo num inibidor da tirosina cinase, doxorrubicina, temozolamida, cisplatina, carboplatina, nitrosoureia, procarbazina, vincristina, hidroxiureia, 5-fluorouracilo, citosina arabinosido, ciclofosfamida, epipodofilotoxina, carmustina e lomustina.
  17. 17. Composição farmacêutica compreendendo o anticorpo isolado da reivindicação 1, para utilização no tratamento de um cancro residente no cérebro num mamífero, em que o cancro residente no cérebro é selecionado do grupo consistindo em glioblastoma, meduloblastoma, meningioma, astrocitoma neoplásico e malformação arteriovenosa neoplásica.
  18. 18. Composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 17, em que o cancro residente no cérebro é glioblastoma.
  19. 19. Composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 17 ou 18, em que o agente é um agente citotóxico.
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Class et al. Patent application title: SPECIFIC BINDING PROTEINS AND USES THEREOF Inventors: Andrew M. Scott (Kew, AU) Terrance Grant Johns (Clayton, AU) George Mark (New York, NY, US) George Mark (New York, NY, US) Anne Murray (New Rochelle, NY, US) Christoph Renner (Homburg/saar, DE) Christoph Renner (Homburg/saar, DE) Gerd Ritter (New York, NY, US) Gerd Ritter (New York, NY, US) Assignees: LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH LTD.