JP2018148887A - 特異的結合タンパク質およびこれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本国際PCT特許出願は、2009年2月18日に出願された米国特許出願番号12/388,504の優先権を主張するものであり、該米国特許出願の開示は、この全体が参照により本明細書に組み込まれる。本国際PCT出願は、2002年5月13日に出願された米国特許出願番号10/145,598(2009年9月15日に公開された米国特許番号7,589,180);2001年5月11日に出願された米国仮特許出願番号60/290,410;2001年9月28日に出願された米国仮特許出願番号60/326,019;2001年12月21日に出願された米国仮特許出願番号60/342,258;2002年5月13日に出願された国際PCT特許出願番号PCT/US02/15185(2002年11月21日にWO 02/092771として公開された);2008年8月14日に出願された国際PCT特許出願番号PCT/US2008/009771(2009年2月19日にWO 2009/023265として公開された);および2007年8月14日に出願された米国仮特許出願番号60/964,715のそれぞれの開示もまたこの全体を参照により組み込む。
本発明は、増幅された上皮成長因子受容体(EGFR)に結合する特異的結合メンバー、特に抗体およびこれらの断片に関し、ならびに細胞外ドメインから267個のアミノ酸を欠如しているトランケートされたEGFR受容体(de2−7EGFR)を生じさせる結果となるEGFRのエキソン2から7のインフレーム欠失に関する。詳細には、前記特異的結合メンバー、特に抗体およびこれらの断片によって認識されるエピトープは、異常な翻訳後修飾に基づいて強化されるまたははっきりわかる。これらの特異的結合メンバーは、癌の診断および治療に有用である。本発明の結合メンバーは、治療の際に化学療法薬もしくは抗癌剤とおよび/または他の抗体もしくはこれらの断片と併用することもできる。
化学療法手段による増殖性疾患、特に癌、の治療は、人体および動物体内のターゲット増殖性細胞と他の正常細胞の相違の利用に依存することが多い。例えば、多くの化学薬品は、急速に複製するDNAにより取り込まれてDNA複製方法および細胞分裂方法を中断させるように設計される。もう1つのアプローチは、発達したヒト組織において通常は発現されない腫瘍細胞または他の異常細胞の表面の抗原、例えば腫瘍抗原または胚抗原を同定することである。このような抗原を、この抗原を遮断または中和できる抗体などの結合タンパク質でターゲッティングすることができる。加えて、抗体およびこれらの断片をはじめとする結合タンパク質は、毒剤、または腫瘍部位でこの毒剤を直接または間接的に活性化することができる他の物質を送達することができる。
本発明は、野生型EGFRからの一切のアミノ酸配列改変または置換を明示しない、ならびに腫瘍形成性、高増殖性または異常細胞において見つけられるが正常または野生型細胞では一般に検出することができない、単離された特異的結合メンバー、特に抗体またはこれらの断片を提供する(本明細書において用いる場合の用語「野生型細胞」は、内因性EGFR発現するがde2−7 EGFRを発現しない細胞を考えており、およびこの用語は、特にEGFR遺伝子を過発現する細胞を除外する;用語「野生型」は、異常または腫瘍形成性細胞にではなく正常細胞に存在する遺伝子型もしくは表現型または他の特性を指す。)。さらなる態様において、本発明は、腫瘍形成性、高増殖性または異常細胞において見つけられるが正常または野生型細胞では一般に検出することができないEGFRエピトープであって、異常な翻訳後修飾または異常な発現に基づいて強化されるまたははっきりわかるものであるエピトープを認識する特異的結合メンバー、特に抗体またはこれらの断片を提供する。本明細書に提供する特定の非限定的例示において、翻訳後修飾が完全でないまたは野生型細胞におけるEGFRの正常な発現で見られるほどに十分でないEGFRエピトープは、強化されるまたははっきりわかる。1つの態様において、EGFRエピトープは、初期のもしくは単純な炭水化物修飾または早期グリコシル化、特に高マンノース修飾に基づいて強化されるまたははっきりわかり、および複雑な炭水化物修飾が存在する場合には低減されるまたははっきりわからない。
配列番号:13のアミノ酸配列から成るde2−7EGFR接合点ペプチドに結合しないものである;
ヒト野生型EGFRの残基287−302の配列内のエピトープに結合するものである;
軽鎖および重鎖を含み、該軽鎖の可変領域が、
式Iに示すアミノ酸配列:
HSSQDIXaa1SNIG (I)
(式中、Xaa1は、非荷電極性R基を有するアミノ酸残基である。)(配列番号:151)
に対応するアミノ酸配列を有する第一のポリペプチド結合ドメイン領域と、
式IIに示すアミノ酸配列:
HGTNLXaa2D (II)
(式中、Xaa2は、荷電極性R基を有するアミノ酸残基である。)(配列番号:152)
に対応するアミノ酸配列を有する第二のポリペプチド結合ドメイン領域と、
式IIIに示すアミノ酸配列:
VQYXaa3QFPWT (III)
(式中、Xaa3は、A、G、およびAまたはGが保存的に置換されているアミノ酸残基から成る群より選択される。)(配列番号:153)
に対応するアミノ酸配列を有する第三のポリペプチド結合ドメイン領域とを含み、ならびに該重鎖の可変領域が、
式VIに示すアミノ酸配列:
SDXaa4AWN (IV)
(式中、Xaa4は、F、Y、およびFまたはYが保存的に置換されているアミノ酸残基から成る群より選択される。)(配列番号:154)
に対応するアミノ酸配列を有する第一のポリペプチド結合ドメイン領域と、
式V、式VIまたは式VIIに示すアミノ酸配列:
YISYSGNTRYXaa5PSLKS (V)
(式中、Xaa5は、非荷電極性R基を有するアミノ酸残基である。)(配列番号:155)、
YISYSXaa6NTRYNPSLKS (VI)
(式中、Xaa6は、G、A、およびGまたはAが保存的に置換されているアミノ酸残基から成る群より選択される。)(配列番号:156)
YISYSGNTRYNPSLXaa7S (VII)
(式中、Xaa7は、塩基性アミノ酸残基である。)(配列番号:157)
に対応するアミノ酸配列を有する第二のポリペプチド結合領域と、
式VIIIに示すアミノ酸配列:
Xaa8TAGRGFPY (VIII)
(式中、Xaa8は、V、A、およびVまたはAが保存的に置換されているアミノ酸残基から成る群より選択される。)(配列番号:158)
に対応するアミノ酸配列を有する第三のポリペプチド結合ドメイン領域と
を含むものである;ならびに
配列番号:2に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列を含まず、および配列番号:4に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列を含まないものである抗体を提供する。
該重鎖の可変領域が、アミノ酸配列SDFAWN(配列番号:15)を有する第一のポリペプチド結合ドメイン領域と、式IXに示すアミノ酸配列:
YISYSGNTRYXaa9PSLKS (IX)
(式中、Xaa9は、非荷電極性R基を有するアミノ酸残基である。)、
に対応するアミノ酸配列を有する第二のポリペプチド結合ドメイン領域と、アミノ酸配列VTAGRGFPY(配列番号:17)を有する第三のポリペプチド結合ドメイン領域とを含むものである抗体を提供する。
本発明に従って、当該技術分野における技能の範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えDNA技術を利用することができる。このような技術は、文献において十分説明されている。例えば、Sambrook et al.,「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」(1989);「Current Protocols in Molecular Biology」Volumes I−E[Ausubel,R.M.,ed.(1994)];「Cell Biology:A Laboratory Handbook」Volumes I−III[J.E.Celis,ed.(1994))];「Current Protocols in Immunology」Volumes I−III[Coligan,J.E.,ed.(1994)];「Oligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait ed.1984);「Nucleic Acid Hybridization」[B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985)];「Transcription And Translation」[B.D.Hames & S.J.Higgins,eds.(1984)];「Animal Cell Culture」[R.I.Freshney,ed.(1986)];「Immobilized Cells And Enzymes」[IRL Press,(1986)];B.Perbal,「A Practical Guide To Molecular Cloning」(1984)を参照のこと。
ロイシン(LeuまたはL) UUAまたはUUGまたはCUUまたはCUCまたはCUAまたはCUG
イソロイシン(HeまたはI) AUUまたはAUCまたはAUA
メチオニン(MetまたはM) AUG
バリン(ValまたはV) GUUまたはGUAのGUCまたはGUG
セリン(SerまたはS) UCUまたはUCCまたはUCAまたはUCGまたはAGUまたはAGC
プロリン(ProまたはP) CCUまたはCCCまたはCCAまたはCCG
トレオニン(ThrまたはT) ACUまたはACCまたはACAまたはACG
アラニン(AlaまたはA) GCUまたはGCGまたはGCAまたはGCG
チロシン(TyrまたはY) UAUまたはUAC
ヒスチジン(HisまたはH) CAUまたはCAC
グルタミン(GlnまたはQ) CAAまたはCAG
アスパラギン(AsnまたはN) AAUまたはAAC
リシン(LysまたはK) AAAまたはAAG
アスパラギン酸(AspまたはD) GAUまたはGAC
グルタミン酸(GluまたはE) GAAまたはGAG
システイン(CysまたはC) UGUまたはUGC
アルギニン(ArgまたはR) CGUまたはCGCまたはCGAまたはCGGまたはAGAまたはAGG
グリシン(GlyまたはG) GGUまたはGGCまたはGGAまたはGGG
トリプトファン(TrpまたはW) UGG
終結コドン UAA(オーカー)またはUAG(アンバー)またはUGA(オパール)
上に明記したコドンがRNA配列についてのものであることは、理解されるはずである。DNAについての対応するコドンは、Uの代わりにTを有する。
非極性R基を有するアミノ酸
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン
非荷電極性R基を有するアミノ酸
グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン
荷電極性R基を有するアミノ酸(Ph6.0で負電荷を有する。)
アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性アミノ酸(pH6.0で正電荷を有する。)
リシン、アルギニン、ヒスチジン(pH6.0で)
フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
グリシン 75
アラニン 89
セリン 105
プロリン 115
バリン 117
トレオニン 119
システイン 121
ロイシン 131
イソロイシン 131
アスパラギン 132
アスパラギン酸 133
グルタミン 146
リシン 146
グルタミン酸 147
メチオニン 149
ヒスチジン(pH6.0で) 155
フェニルアラニン 165
アルギニン 174
チロシン 181
トリプトファン 204
− 正電荷を維持できるように、Argの代わりにLysおよびこの逆;
− 負電荷を維持できるように、Aspの代わりにGluおよびこの逆;
− 遊離−OHを維持できるように、Thrの代わりにSer;ならびに
− 遊離NH2を維持できるようにAsnの代わりにGin
である。
本発明の特異的結合メンバー、特に抗体またはこれらの断片、の特有の特性であって、それにより該結合メンバー(単数または複数)が、腫瘍形成性、高増殖性または異常細胞において見つけられるおよび正常または野生型細胞では検出できないEGFRエピトープを認識する、ならびに該エピトープが、異常な翻訳後修飾に基づいて強化されるまたははっきりわかる、ならびに前記メンバー(単数または複数)が、de2−7 EGFRおよび増幅されたEGFRに結合するがwtEGFRに結合しないという特性は、以前から知られているEGFR抗体で見られることがある正常組織取り込みに関連した問題を伴わない、多数の腫瘍形成性細胞タイプおよび腫瘍タイプ、例えば頭頸部、乳房、肺、膀胱または前立腺腫瘍および神経膠腫を同定する、特性づけする、ターゲットにするおよび治療する、減少させるまたは排除する、診断および治療用途をもたらす。従って、(例えば、突然変異体または変異体EGFRの増幅または発現により)EGFRを過発現する細胞、特に、異常な翻訳後修飾を明示するものを、本発明の結合メンバー(単数または複数)、特に抗体(単数もしくは複数)もしくはこの(これらの)断片を利用して、認識する、単離する、特性づけする、ターゲットにする、および治療するまたは排除することができる。
ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作るための一般的な方法論は周知である。融合以外の技術、例えば、発癌性DNAでのBリンパ球の直接形質転換、またはEpstein−Barrウイルスでのトランスフェクションによって、不死、抗体生産細胞系を作ることもできる。例えば、M. Schreier et al.,「Hybridoma Techniques」(1980);Hammering et al.,「Monoclonal Antibodies And T cell Hybridomas」(1981);Kennett et al.,「Monoclonal Antibodies」(1980)を参照のこと;米国特許番号4,341,761;米国特許番号4,399,121;米国特許番号4,427,783;米国特許番号4,444,887;米国特許番号4,451,570;米国特許番号4,466,917;米国特許番号4,472,500;米国特許番号4,491,632;および米国特許番号4,493,890も参照のこと。
一般に、それぞれ配列番号:2および4;129および134;22および27;32および37;ならびに42および47のCDR1領域として実質的に示すようなアミノ酸配列を含むCDR1領域は、腫瘍抗原への該CDR1領域の結合を可能にする構造内に保持されるであろう。例えば配列番号:4のCDR1領域の場合、このCDR1領域は、好ましくは、配列番号:4のVL鎖領域によって(および他の列挙した配列についても同様に)保持される。
本発明の特異的結合メンバーの、特に腫瘍:血液比およびクリアランス率に関する、インビボ特性は、mAb806に少なくとも匹敵するであろう。このような特異的結合メンバーをヒトまたは動物被験者に投与すると、>1:1のピーク腫瘍対血液比を示すであろう。好ましくは、このような比で、前記特異的結合メンバーは、1:1より大きい、好ましくは2:1より大きい、さらに好ましくは5:1より大きい腫瘍対器官比も有するであろう。好ましくは、このような比で、前記特異的結合メンバーは、腫瘍部位から離れている器官において、<1:1の器官対血液比も有するであろう。これらの比は、投与した特異的結合メンバーの異化および分泌器官を除外する。従って、scFvおよびFabの場合(添付の実施例に示すように)、結合メンバーは、腎臓によって分泌され、他の器官より多くここに存在する。全IgGの場合、クリアランスは、少なくとも一部は肝臓によるであろう。インタクトな抗体のピーク局在比は、通常、特異的結合メンバーの投与後、10時間と200時間の間で達成される。さらに詳細には、この比は、無胸腺ヌードマウスの一方の側腹部に皮下形成された約0.2−1.0gの腫瘍異種移植片において測定することができる。
本発明の特異的結合メンバーは、該特異的結合メンバーに加えて少なくとも1つの成分を含むことがある医薬組成物の形態で通常は投与されるであろう。
加えて、本発明は、前記結合メンバーと従来の放射線療法の併用のための治療用組成物を考えており、含む。EGF受容体をターゲットにする抗体での治療は、従来の放射線療法の効果を向上させることができることが指摘されている(Milas et al.,Clin.Cancer Res.2000 Feb:6(2):701,Huang et al.,Clin.Cancer Res.2000 Jun:6(6):2166)。
本発明は、本発明の特異的結合メンバーによって認識されるこれらの能力を参照することにより、異常発現されるEGFRなどの刺激の存在を検出するための方法を含む、様々な診断利用にも関する。前に述べたように、EGFRは、様々な公知技術によりこれ自体に対する抗体を生産するために用いることができ、その後、このような抗体を単離し、例えば、疑わしいターゲット細胞における特定のEGFR活性の存在についての試験において利用することができよう。
A. R*+Ab1=R*Ab1、
B. R+Ab*=RAb1 *
C. R+Ab1+Ab2 *=RAb1Ab2 *
(a)本特異的結合メンバーまたはこれに対する特異的結合パートナーを検出可能な標識に直接または間接的に取り付けることによって得られる少なくとも1つの標識された免疫化学反応性成分の所定量;
(b)他の試薬;および
(c)該キットの使用説明書
を含む試験キットを作製することができる。
(a)一般には固相に結合して免疫吸着剤を形成する、または代案では、適するタグ、もしくは多数のこのような末端生成物など(もしくはこれらの結合パートナー)、それぞれのうちの1つに結合する、上で説明したとおりの特異的結合メンバー(または結合パートナー)の既知量;
(b)必要な場合には、他の試薬;および
(c)概試験キットの使用説明書
を含む。
(a)検出可能な標識に前記特異的結合メンバーをカップリングさせることによって得た、標識された成分と;
(b)1つ以上の追加の免疫化学試薬[これらのうちの少なくとも1つの試薬は、リガンドまたは固定されたリガンドであり、このリガンドは、
(i)標識された成分(a)と結合することができるリガンド;
(ii)標識された成分(a)の結合パートナーと結合することができるリガンド;
(iii)判定すべき成分(単数または複数)の少なくとも1つと結合することができるリガンド;および
(iv)判定すべき成分(単数または複数)の少なくとも1つの結合パートナーの少なくとも1つと結合することができるリガンド
から成る群より選択される。]と;
(c)EGFR、前記特異的結合メンバー、およびこれに対する特異的結合パートナーの間の免疫化学反応の1つ以上の成分の検出および/または決定のためのプロトコルを実施するための説明書と
を含む、試験キットを作製し、上で述べた目的のために使用することができる。
本発明は、本発明の特異的結合メンバーをコードする単離された核酸をさらに提供する。核酸は、DNAおよびRNAを含む。好ましい態様において、本発明は、本発明の抗体のVHおよびVL鎖のCDR残基として示すようなポリペプチドをはじめとする、上で定義したとおりの本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。
細胞系
免疫及び特異性分析のために、天然のものである、または正常、野生型もしくは「wtEGFR」遺伝子でまたはΔ2−7欠失突然変異を有するΔEGFR遺伝子でトランスフェクトされたものである、幾つかの細胞系を使用した:マウス線維芽細胞系NR6、NR6ΔEGFR(ΔEGFRでトランスフェクトされたもの)およびNR6wtEGFR(wtEGFRでトランスフェクトされたもの)、ヒト膠芽腫細胞系U87MG(低レベルの内因性wtEGFRを発現しているもの)、U87MGwtEGFR(wtEGFRでトランスフェクトされたもの)、U87MGΔEGFR(ΔEGFRでトランスフェクトされたもの)、ならびにヒト扁平上皮細胞癌腫細胞系A431(高レベルのwtEGFRを発現する。)。
de2−7 EGFRユニーク接合点ペプチドは、アミノ配列:LEEKKGNYVVTDH(配列番号:13)を有する。de2−7 EGFRからビオチン化された特有の接合点ペプチド(ビオチン−LEEKKGNYVVTDH(配列番号:5)およびLEEKKGNYVVTDH−ビオチン(配列番号:6))を標準的なFmocケミストリーによって合成し、逆相HPLCおよび質量スペクトル分析(Auspep、オーストラリア、メルボルン)によって純度(>96%)を判定した。
他の試薬での本発明者らの調査結果と比較するために、本発明者らの研究に追加のmAbを含めた。これらの試薬は、wtEGFRに対するmAb528(Sato et al.(1983)Mol.Biol.Med.1(5),511−529)、およびΔ2−7 EGFR欠失突然変異の接合点配列にわたる合成ペプチドに対して産生されたDH8.3であった。de2−7 EGFRに対して特異的である前記DH8.3抗体(IgG1)は、以前に記載されており(Hilles et al.(1995)Specific targeting of a mutant,activated EGF receptor found in glioblastoma using a monoclonal antibody.Int.J.Cancer.63,537−43,1995)、およびde2−7 EGFRにおいて見つけられる特有の接合点ペプチドでのマウスの免疫処置(Hills et al.,1995)後に該抗体を得た。
マウス線維芽細胞系NR6ΔEGFRを免疫原として使用した。BALB/cマウスに2から3週間隔でアジュバント中の5×105−2×106個の細胞での免疫処置を5回、皮下的に施すことにより、マウスハイブリドーマを産生させた。完全フロイントアジュバントを初回注射に使用した。その後、不完全フロイントアジュバント(Difco(商標)、カンザス州ローレンスのVoigt Global Distribution)を使用した。免疫処置を施したマウスからの脾細胞をマウス骨髄腫細胞系SP2/0(Shulman et al.(1978)Nature 276:269−270)と融合させた。新たに産生されたクローンの上清を、血球吸着アッセイにおいて、NR6、NR6wtEGFRおよびNR6ΔEGFRとの反応性についてスクリーニングし、ヒト膠芽腫細胞系U87MG、U87MGwtEGFRおよびU87MGΔEGFRを用いて血球吸着アッセイにより分析した。その後、選択されたハイブリドーマ上清をウエスタンブロッティングによって試験し、免疫組織化学によってさらに分析した。予想した反応性を示した、新たに産生されたmAbを精製した。
mAb806、mAb124およびmAb1133の可変重鎖(VH)および可変軽鎖(VL)をシークエンシングし、これらの相補性決定領域(CDR)を下記のとおり同定した:
mAb806
mAb806VH鎖:核酸配列(配列番号:1)、およびシグナルペプチドを伴うアミノ酸配列(配列番号:2)を図14Aおよび14Bにそれぞれ示す(図14Bではシグナルペプチドに下線を引く)。図16では下線を引くことにより相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3(それぞれ、配列番号:15、16および17)を指摘する。このシグナルペプチドなしでのmAb806 VH鎖アミノ酸配列(配列番号:11)を図16に示す。
mAb124 VH鎖:核酸(配列番号:21)アミノ酸(配列番号:22)配列を図51Aおよび51Bにそれぞれ示す。下線を引くことにより相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3(それぞれ、配列番号:23、24および25)を指摘する。
mAb1133 VH鎖:核酸(配列番号:31)アミノ酸(配列番号:32)配列を図52Aおよび52Bにそれぞれ示す。下線を引くことにより相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3(それぞれ、配列番号:33、34および35)を指摘する。
本明細書および以下の実施例に示すように、さらなる特性づけのためにmAb806を先ず選択した。下の実施例26において論じるように、mAb124およびmAb1133もさらなる特性づけのために選択し、ここで論ずるmAb806の特有の特性に対応する特性を有することが判明した。
mAb806およびDH8.3抗体の特異性をさらに特性づけするために、これらの結合をELISAによって検査した。2つのタイプのELISAを用いて抗体の特異性を判定した。第一のアッセイでは、プレートをsEGFR(0.1M炭酸バッファーpH9.2中、10μg/mL)で2時間コーティングし、その後、PBS中の2%ヒト血清アルブミン(HSA)でブロックした。sEGFRは、野生型EGFRの組換え細胞外ドメイン(アミノ酸1−621)であり、これを以前に記載されたとおりに生産した(Domagala et al.(2000)Stoichiometry,kinetic and binding analysis of the interaction between Epidermal Growth Factor(EGF)and the Extracellular Domain of the EGF receptor.Growth Factors.18,11−29)。リン酸緩衝食塩水(PBS)中2%HSA中の漸増濃度で抗体をウエルに三重反復で添加した。基質としてABTS(Sigma、オーストラリア、シドニー)と405nmで測定した吸光度とを使用して、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート型ヒツジ抗マウスIgG(Silenus、オーストラリア、メルボルン)により、結合抗体を検出した。
接合点ペプチド:LEEKKGNYVVTDH−OH(Biosource、カリフォルニア州カマリロ);
ペプチドC:LEEKKGNYVVTDH(K−Biot)−OH(Biosource、カリフォルニア州カマリロ);
sEGFR:野生型EGFRのCHO細胞由来組換え可溶性細胞外ドメイン(アミノ酸1−621)(LICR Melbourne);
mAb806:マウスモノクローナル抗体、IgG2b(LICR NYB);
mAbL8A4:マウスモノクローナル抗体、IgG1(Duke University);
IgG1アイソタイプ対照mAb;
IgG2bアイソタイプ対照mAb。
各抗体の相対親和性を判定するために、免疫反応についての補正後、U87MG.Δ2−7細胞を使用するスキャッチャード解析を行った。抗体をChloramine T法により125I(Amrad、オーストラリア、メルボルン)で標識し、Lindmoアッセイ(Lindmo et al.(1984)Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess.J.Immunol.Methods.72,77−89)により免疫反応性を判定した。
ターゲット細胞への結合後の抗体内在化率は、この腫瘍ターゲッティング特性と治療選択肢の両方に影響を及ぼす。それ故、本発明者らは、U87MG.Δ2−7細胞への結合後のmAb806およびDH8.3抗体の内在化をFACSによって検査した。U87MG.Δ2−7細胞をmAb806抗体またはDH8.3抗体(10μg/mL)のいずれかと共に1時間、DMEM中、4℃で温置した。洗浄後、37℃に予熱したDMEMに細胞を移し、37℃での温置後の様々な時点でアリコートを取った。氷冷した洗浄バッファー(1%HSA/PBS)でアリコートを直ちに洗浄することにより、内在化を停止させた。この時間経過の完了時、上で説明したようにFACSにより細胞を染色した。式:内在化した抗体=(時間xでの平均蛍光−バックグラウンド蛍光)/(時間0での平均蛍光−バックグラウンド蛍光)×100を用いて様々な時点での表面抗体染色をゼロ時と比較することにより、内在化百分率を算出した。この方法を、以前に記載されているような(Huang et al.(1997)The enhanced tumorigenic activity of a mutant epidermal growth factor receptor common in human cancers is mediated by threshold levels of constitutive tyrosine phosphorylation and unattenuated signaling.J.Biol.Chem.272,2927−35)内在化を測定するためにヨウ素化抗体(mAb806)を使用する1つのアッセイにおいて検証した。異なる時点での内在化率の差を、スチューデントt検定を用いて比較した。この研究を通して、ウィルコキソン分析により分析したインビボ生存アッセイを除き、データをスチューデントt検定により有意性について分析した。
抗体間の内在化率に関する上で述べた差にかんがみて、電子顕微鏡を用いて抗体細胞内輸送の詳細な分析を行った。
U87MG異種移植片を一方の体側におよびU87MG.Δ2−7異種移植片を他方の体側に有するヌードマウスにおいて、mAb806およびDH8.3抗体の生体内分布を比較した。DH8.3抗体が4−24時間の間に腫瘍ターゲッティングのピークレベルを示すことが以前の報告(Hills et al.(1995)Specific targeting of a mutant, activated EGF receptor found in glioblastoma using a monoclonal antibody.Int.J.Cancer.63,537−43)により実証されているので、この研究に比較的短期間を選んだ。
増幅された受容体遺伝子を含有する細胞において発現されたEGFRをmAb806が認識できるかどうかを検査するために、A431細胞へのこの結合を分析した。以前に説明したように、A431細胞は、ヒト扁平上皮癌腫細胞であり、高レベルのwtEGFRを発現する。A431細胞へのmAb806の低いが非常に再現性のある結合が、FACS分析によって観察された(図6)。DH8.3抗体は、A431細胞を結合しなかった。このことは、mAb806の結合が低レベルのde2−7 EGFR発現の結果ではなかったことを示している(図6)。予想どおり、抗EGFR 528抗体は、A431細胞の強い染色を示した(図6)。この結果にかんがみて、A431細胞へのmAb806の結合をスキャッチャード解析によって特性づけした。ヨウ素化mAb806の結合は、比較的低かったが、スキャッチャードのための一貫したデータを得ることができた。3つのこのような実験の平均により、1細胞につき2.5×105受容体で、9.5×107M−1の親和性についての値を得た。従って、この受容体に対する親和性は、de2−7 EGFRに対する親和性より数10倍低かった。さらに、mAb806は、A431細胞の表面において見つけられるEGFRの小部分しか認識しないようである。528抗体は、1細胞につきおおよそ2×106の受容体を判断した。このことは、非常に多数の他の研究(Santon et al.(1986)Effects of epidermal growth factor receptor concentration on tumorigenicity of A431 cells in nude mice.Cancer Res.46,4701−5)と一致している。
第二の生体内分布研究をmAb806で行って、これがA431腫瘍異種移植片をターゲットにすることができるかどうかを判定した。この研究は、すべてのマウスに陽性対照として含めたmAb806によるU87MG.Δ2−7異種移植片のターゲッティングに関してより多くの情報を得るために、より長い時間経過にわたって行った。加えて、抗EGFR 528抗体をA431異種移植片についての陽性対照として含めた。以前の研究により、ヌードマウスにおいて成長させたA431細胞へのこの抗体の低いが有意なターゲッティングが実証されていたからである(Masui et al.(1984)Growth inhibition of human tumor cells in athymic mice by anti−epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies.Cancer Res.44,1002−7)。
mAb806の効果を疾患の2つの異種移植片モデル−予防的モデルと確率腫瘍モデル−において評定した。
以前の報告(Nishikawa et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91(16),7727−7731)と一致して、de2−7 EGFRでトランスフェクトされたU87MG細胞は、親細胞およびwtEGFRでトランスフェクトされたU87MG細胞より急速に成長した。従って、同じマウスにおいて両方の細胞タイプを成長させることはできなかった。
異種移植片を切除し、二等分した。一方の半分を10%ホルマリン/PBSで固定した後、パラフィンに包埋した。その後、4マイクロメートル切片を切断し、常例的組織検査のためにヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色した。他の半分をTissue Tek(登録商標)OCT化合物(Sakura Finetek、カリフォルニア州トランス)に包埋し、液体窒素で凍結させ、−80℃で保管した。薄い(5マイクロメートル)クリオスタット用切片を切断し、10分間、氷冷アセトンで固定し、その後、さらに10分間、空気乾燥させた。切片を10分間、タンパク質ブロッキング試薬(Lipshaw Immunon、米国、ピッツバーク)でブロッキングし、その後、ビオチン化一次抗体(1mg/mL)と共に30分間、室温(RT)で温置した。ECLタンパク質ビオチン化モジュール(Amersham、オーストラリア、ボウルクハム・ヒルズ(Baulkham Hills))をこの製造業者の説示どおりに使用して、すべての抗体をビオチン化した。PBSですすいだ後、切片をストレプタビジン・ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体と共にさらに30分間温置した(Silenus、オーストラリア、メルボルン)。最終PBS洗浄後、これらの切片を30分間、過酸化水素の存在下、3−アミノ−9−エチルカルバゾール(3−amino−9−ethylcarbozole)(AEC)基質(0.1M酢酸、0.1M酢酸ナトリウム、0.02M AEC(Sigma Chemical Co.、ミズーリ州セントルイス))に暴露した。切片を水ですすぎ、5分間、ヘマトキシリンで対比染色し、マウントした。
mAb806を予防的異種移植片モデルにおいてU87MGおよびU87MG.Δ2−7に対する効力について検査した。腫瘍接種の前日に抗体またはビヒクルをi.p.投与し、2週間、週3回与えた。mAb806は、注射1回につき1mgの用量で、wtEGFRを発現する親U87MG異種移植片の成長に対して効果がなかった(図9A)。対照的に、mAb806は、U87MG.Δ2−7異種移植片を用量依存的様式で有意に阻害した(図9B)。対照動物を犠牲にした第20日の時点で、平均腫瘍容積は、対照群については1637±178.98mm3であり、注射1回につき0.1mgの群については統計的により小さい526±94.74mm3であり(p<0.0001)、1mg注射群については197±42.06mm3であった(p<0.0001)。治療群を第24日の時点で犠牲にし、この時点での平均腫瘍容積は、0.1mg治療群については1287±243.03mm3、および1mg群については492±100.8mm3であった。
予防的異種移植片モデルにおけるmAb806の効力にかんがみて、次に、確率腫瘍異種移植片の成長を阻害するこの能力を検査した。抗体治療は、腫瘍が、U87MG.Δ207異種移植片については65±6.42mm3および親U87MG異種移植片については84±9.07mm3の平均腫瘍容積に達したときにこれを開始したことを除き、予防的モデルにおいて説明したとおりであった。もう一度繰り返して、mAb806は、注射1回につき1mgの容量で親U87MG異種移植片の成長に効果がなかった(図10A)。対照的に、mAb806は、U87MG.Δ2−7異種移植片の成長を用量依存様式で有意に阻害した(図10B)。第17日の時点で、対照動物を犠牲にする前日、平均腫瘍容積は、対照群については935±215.04mm3であり、注射1回につき0.1mgの群については386±57.51mm3であり(p<0.01)、1mg注射群については217±58.17mm3であった(p<0.002)。
mAb806治療および対照U87MG.Δ2−7およびU87MG.wtEGFR異種移植片(それぞれ、第24および42日に採集したもの)間の可能性のある組織学的相違を評価するために、ホルマリン固定、パラフィン包埋切片をH&Eで染色した。mAb806で治療したU87MG.Δ2−7(治療終了の3日後に採集したもの)およびU87MG.wtEGFR異種移植片(治療終了の9日後に採集したもの)両方からの切片において壊死エリアが見られた。この結果が多数の腫瘍異種移植片(n=4)において一貫して観察された。しかし、対照で治療した異種移植片からの切片の分析は、mAb806治療で見られたのと同じ壊死エリアを示さなかった。mAb806または対照治療U87MG異種移植片からの切片をH&Eで染色もし、これらは二群間での細胞生存度に差がないことを示した。このことは、mAb806結合が、腫瘍異種移植片内の低減された細胞生存度/壊死を誘導するという仮説のさらなる裏付けとなる。
mAb806の抗腫瘍効果がU87MG細胞に限定されないことを実証するために、A431異種移植片を有するマウスにこの抗体を投与した。これらの細胞は、増幅されたEGFR遺伝子を含有し、1細胞につきおおよそ2×106の受容体を発現する。上で説明したように、mAb806は、これらのEGFRの約10%を結合し、A431異種移植片をターゲットにする。mAb806は、前に説明した予防的異種移植片モデルにおいて検査したとき、A431異種移植片の成長を有意に阻害した(図11A)。対照動物を犠牲にした第13日の時点で、平均腫瘍容積は、対照群では135±147.54mm3であり、および1mg注射治療群については260±60.33mm3であった(p<0.0001)。
AG1478と併用でのmAb806の抗腫瘍効果を、A431異種移植片を有するマウスにおいて試験した。AG1478(4−(3−クロロアニリノ)−6,7−ジメトキシキナゾリン)は、HER2−neuに対するEGFRキナーゼの強力で選択的な阻害剤であり、血小板由来成長因子受容体キナーゼである(Calbiochem.Cat.番号658552)。3つの対照を含めた;ビヒクルのみ、ビヒクル+mAb806のみ、およびビヒクル+AG1478のみでの治療。結果を図12に示す。0.1mgのmAb806を、異種移植の1日前ならびに異種移植後1、3、6、8および10日の時点で投与した。400μgのAG1478を、異種移植後0、2、4、7、9および11日の時点で投与した。
膠芽腫におけるEGFR発現、増幅および突然変異の高い発生率を考慮して、詳細な免疫組織化学研究を行って、異種移植片以外の腫瘍における806の特異性を評定した。16膠芽腫のパネルを免疫組織化学によって分析した。16膠芽腫のこのパネルを、増幅された野生型EGFRおよびde2−7 EGFR発現の存在についてRT−PCRにより事前にタイプ分けした。これらの腫瘍のうち6つは、wtEGFR転写産物のみを発現し、10は、wtEGFR遺伝子増幅を有し、これらのうち5つは、野生型EGFR転写産物のみを示し、5つは、野生型EGFRおよびde2−7遺伝子転写産物両方を示した。
局限的=5%未満
+=5−25%
++=25−50%
+++=50−75%
++++=>75%
de2−7 EGFRが正常組織において発現されるかどうかを判定するために、mAb806およびDH8.3での免疫組織化学研究を25組織のパネルで行った。試験したいずれの組織においても、mAb806との強い免疫反応性も、DH8.3との強い免疫反応性もなかった。このことは、de2−7 EGFRが正常組織に不在であることを示唆している(表3)。表皮の基底細胞層および上皮の粘膜扁平細胞に限定されたmAb806での多少の可変染色が扁桃に存在した。胎盤では、栄養膜上皮の偶発的免疫染色が観察された。興味深いことに、高い内因性レベルのwtEGFRを発現する2つの組織、肝臓および皮膚は、いずれの有意なmAb806反応性を示すこともできなかった。肝臓サンプルでは反応性は全く観察されず、皮膚サンプルにおけるおよび扁桃粘膜の扁平上皮における基底ケラチノサイトにおいて弱い、一貫性のない局限的反応性のみが偶発的に(研究したすべてのサンプルの10%以下において)検出された。このことにより、この抗体が細胞表面で発現されるwtEGFRをいずれの有意な程度にも結合しないことが、さらに実証される(表3)。すべて補組織が、528抗体で見られる普遍的染色により証明されるように、wtEGFRについて陽性であった(表3)。
12の異なる悪性病変のパネルを使用して、他の腫瘍タイプにおけるde2−7 EGFRの程度を検査した。528抗体は、黒色腫および精上皮腫を除く分析した多くの腫瘍において、多くの場合、均質な染色を示した。存在する場合、DH8.3免疫反応性は、偶発的病巣腫瘍細胞に限定された。このことは、この検出システムを用いると、脳外の腫瘍におけるde2−7 EGFR発現は、あったとしてもわずかである(表4)。血管における局限的染色、および一部の腫瘍におけるDH8.3抗体での結合組織の様々な拡散染色もあった(表4)。この染色は、使用する抗体濃度に強く依存し、および非特異的バックグラウンド反応性と考えられた。mAb806は、頭頸部腫瘍の64%および肺癌腫の50%において陽性染色を示した(表4)。症例の30%が陽性であった泌尿器腫瘍を除く他の場所ではmAb806反応性が殆どなかった。
mAb806の特有の特異性を確証するおよび反応性を評価するために、46膠芽腫の、これらのEGFRステータスについて事前に選択していない、パネルにおいて、これを528およびDH8.3抗体と比較した。528抗体は、2つ(番号27および29)を除くすべてのサンプルにおいて強くおよび均一に陽性であった(44/46、95.7%)。これら2つの症例は、mAb806およびmAbDH8.3についても陰性であった。mAb806は、27/46(58.7%)症例において陽性であり、これらのうちの22症例は、この腫瘍の50%より多くで均質な免疫反応性を呈示した。DH8.3抗体は、15/46(32.6%)膠芽腫において陽性であり、これらのうちの9症例は、均質な免疫反応性を示した。これらの未選択腫瘍の免疫化学染色を表5に作表する。
抗ΔEGFRモノクローナル抗体、mAb806、の効力を試験するために、本発明者らは、頭蓋内ΔEGFR過発現性神経膠腫異種移植片を有するヌードマウスを、mAb806、このアイソタイプ対照IgGまたはPBSの注射で治療した。
U87MG.ΔEGFRおよびLN−Z308.ΔEGFR異種移植片を有するマウスを第9日および第15日にそれぞれ安楽死させた。腫瘍切片を組織病理分析し、腫瘍容積を決定した。動物生存について観察された結果と一致して、mAb806治療は、対照群のものと比較して異種移植片、U87MG.ΔEGFRの容積を約90%(P<0.001;図24C)およびLN−Z308.ΔEGFRを95%より大きく(P<0.001;図24D)減少させた。A1207.ΔEGFR腫瘍を有する動物について同様の結果を得た(65%容積減少、P<0.01;データを示さない。)。
U87MG.ΔEGFR異種移植片の治療のためのmAb806の直接腫瘍内注射の効力も判定した。腫瘍内植の翌日、mAb806またはアイソタイプ対照IgGの腫瘍内注射を動物に施した。対照動物は、15日間生存し、これに対してmAb806治療マウスは、18日間、生きたままであった(P<0.01;図24E)。mAb806での腫瘍内治療は、多少効果的であったが、多回頭蓋内注射の困難および注射リスク増加を必然的に伴った。従って、本発明者らは、さらなる研究のために全身治療に焦点を当てた。
mAb806による成長阻害が、ΔEGFRを発現するマウスについて選択的であるかどうかを判定するために、本発明者らは、U87MG、U87MG.DK(キナーゼ欠失ΔEGFR)およびU87MG.wtEGFR脳異種移植片を有する動物を治療した。mAb806治療は、低レベルの内因性野生型EGFR(wtEGFR)を発現するU87MG腫瘍(Huang et al.(1997)The enhanced tumorigenic activity of a mutant epidermal growth factor receptor common in human cancers is mediated by threshold levels of constitutive tyrosine phosphorylation and unattenuated signaling.J.Biol.Chem.,272,2927−2935)を内植したマウス、および低レベルの内因性wtEGFRに加えてキナーゼ欠失ΔEGFRを過発現するU87MG.DK異種移植片を有する動物の生存期間を延長しなかった(図25)。mAb806治療は、wtEGFRを過発現するU87MG.wtEGFR腫瘍を有するマウスの生存期間をわずかに延長した(P<0.05、対照群についての26日に対して生存期間中央値23日)(図25C)。
様々なレベルまたは異なるタイプのEGFRを発現する腫瘍に対するmAb806の異なる効果を理解するために、本発明者らは、FACSにより様々な腫瘍細胞とのmAb806の反応性を判定した。染色された細胞を、Cell Questソフトウェア(Becto−Dickinson PharMingen)を使用してFACS Caliburで分析した。第一の抗体については、次にmAbを使用した:mAb806、抗EGFR mAbクローン528、およびクローンEGFR.1。マウスIgG2aまたはIgG2bをアイソタイプ対照として使用した。
mAb806による成長阻害の基礎をなすメカニズムを次に調査した。ΔEGFRの構成的に活性なキナーゼ活性およびカルボキシ末端自己リン酸化は、この生物学的機能にとって欠くことのできないものである(Nishikawa et al.(1994)A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91,7727−7731;Huang et al.,1997;Nagane et al.(1996)A common mutant epidermal growth factor receptor confers enhanced tumorigenicity on human glioblastoma cells by increasing proliferation and reducing apoptosis.Cancer Res.,56,5079−5086;Nagane et al.(2001)Aberrant receptor signaling in human malignant gliomas:mechanisms and therapeutic implications.Cancer Lett.162(Suppl.1),S17−S21)ので、ΔEGFRリン酸化ステータスを治療および対照動物からの腫瘍において判定した。図27Aに示すように、mAb806治療は、ΔEGFR自己リン酸化を劇的に低下させたが、受容体レベルは、mAb806治療異種移植片においてわずかにしか減少されなかった。本発明者らは、受容体自己リン酸化が、ΔEGFR過発現性腫瘍のアポトーシスの低下に重要な役割を果たす抗アポトーシス遺伝子、Bcl−XL、のアップレギュレートを引き起こすことを以前に明らかにした(Nagane et al.,1996;Nagane et al.,2001)。従って、Bcl−XL発現に対するmAb806治療の効果を次に判定した。mAb806治療動物からのΔEGFR腫瘍は、低減されたBcl−XLレベルを実際には示さなかった。
mAb806治療によって生ずるインビボ抑制および受容体シグナリングに対するこの生化学的効果に照らして、本発明者らは、対照または治療マウスからの腫瘍の増殖率を判定した。mAb806治療腫瘍のKi67染色によって測定した増殖指数は、対照腫瘍のものより有意に低かった(P<0.001;図28)。
ここに示す実験は、本発明に従って抗体の効力を判定するために計画したインビボ作業を説明するものである。
本明細書において論じ、本実施例においてさらに実証し、論じるように、mAb806は、de2−7 EGFRまたは増幅されたEGFRのいずれかを発現するが野生型EGFRを発現しない腫瘍異種移植片の成長を阻害することが、図らずも判明した。
キメラ抗体は、例えばマウス、ラットまたは他の種の重および軽鎖可変領域をヒト重および軽鎖可変領域に連結させた分子の1つのクラスであり、キメラ抗体は、組換え生産される。キメラ抗体の1つの利点は、これらが異種抗原作用、非ヒト抗体(例えば、マウス、ラットまたは他の種)の特有の免疫原性を減少させることができる点である。加えて、組換えにより作製されるキメラ抗体は、特に、高レベル発現ベクターを利用するとき、多くの場合、大量に生産することができる。
標準的な分子生物学技術を用いて親マウスハイブリドーマから806抗体のVHおよびVL鎖をクローニングすることにより、キメラ806抗体を産生させた。その後、VHおよびVL抗体をpREN哺乳動物発現ベクターにクローニングし(この構築物を配列番号:7および配列番号:8に示す。)、増幅および発現のためにCHO(DHFR−/−vc)細胞にトランスフェクトした。簡単に言うと、トリプシン処理後、標準条件下での電気泳動を用いて、4×106のCHO細胞を、LCおよびHC発現ベクターそれぞれ10μgでコトランスフェクトした。室温で10分静置後、細胞を15mLの培地(10%ウシ胎仔血清、ヒポキサンチン/チミジンサプリメントと添加剤)に添加し、15×10cmの細胞培養ペトリ皿に移した。その後、これらのプレートを正常条件下で2日間、インキュベーター内に置いた。
材料および方法
抗体および細胞系
マウス抗de2−7 EGFRモノクローナルmAb806、キメラ抗体ch806(IgG1)、および対照アイソタイプ適合キメラ抗G250モノクローナル抗体cG250は、オーストラリア、メルボルンのLudwig Institute for Cancer Research、Biological Production Facilityによって調製された。補体依存性細胞傷害性(CDC)および抗体依存性細胞傷害性(ADCC)アッセイは、両方とも、U87MG.de2−7およびA431細胞をターゲット細胞として利用するものであった。前に記載したU87MG.de2−7細胞系は、de2−7 EGFRを含有するレトロウイルスに感染させたヒト星状細胞腫細胞系である(Nishikawa et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91,7727−31)。ヒト扁平上皮癌腫A431細胞は、米国微生物系統保存機関(the American Type Culture Collection)(バージニア州マナッサス)から購入した。すべての細胞系を、10%熱不活性化FCS(CSL、オーストラリア、メルボルン)と100単位/mL ペニシリンと100μg/mL ストレプトマイシンとを捕捉したGlutamax(Life Technologies、オーストラリア、メルボルン)を伴うDMEM/F−12において培養した。レトロウイルスでトランスフェクトされたU87MG.de2−7細胞についての選択を維持するために、400μg/mLのG418を培地に含めた。
健常ボランティアドナー血からPBMCを単離した。Ficoll−Hypaque(ICN Biomedical Inc.、米国オハイオ州)での密度勾配遠心分離により、ヘパリン加全血を分画した。PBMC画分を回収し、5%熱不活性化FCSを含有する、100U/mLのペニシリンと100μg/mLのストレプトマイシンとを捕捉し、2mMのL−グルタミンを捕捉したRPMI+1640で3回洗浄した。
以前に公表された方法(Nelson,D.L.et al.(1991)In:J.E.Colignan,A.M.Kruisbeek,D.D.Margulies,E.M.Shevach,and W.Strober(eds.),Current Protocols in Immunology,pp.7.27.1.New York:Greene Publishing Wiley Interscience)の変形により、CDCおよびADCCアッセイを行った。簡単に言うと、5×106のターゲットU87MG.de2−7およびA431細胞を、1×106細胞あたり50μCi51Cr(Geneworks、オーストラリア、アデレード)で標識し、2時間、37℃で温置した。その後、細胞をPBS(0.05M、pH7.4)で3回洗浄し、培養基で4回洗浄した。標識細胞のアリコート(1×104細胞/50μL)を96ウエル・マイクロタイター・プレート(NUNC、デンマーク、ロスキレ)の各ウエルに添加した。
50μLの標識ターゲット細胞に、50μLのch806またはアイソタイプ対照抗体cG250を、濃度範囲0.00315−10μg/mLにわたって三重反復で添加し、氷の上で5分、温置した。次に、50μLの新たに調製した健常ドナー補体(血清)を添加して血清の1:3最終希釈物を生じさせた。これらのマイクロタイタープレートを4時間、37℃で温置した。遠心分離後、上清に放出された51Crを計数した(Cobra II自動ガンマカウンター、Canberra Packard、オーストラリア、メルボルン)。特異的溶解百分率を実験51Cr放出、全放出(50μLターゲット細胞+100μL 10%Tween 20)および自然放出(50μLターゲット細胞+100μL培地)、から算出した。
健常ドナーPBMCによりもたらされたch806媒介ADCCを、2つの4時間51lCr放出アッセイによって測定した。第一のアッセイでは、標識されたターゲット細胞を、エフェクター細胞と共に96ウエル「U」底マイクロプレート(NUNC、デンマーク、ロスキレ)に50:1のエフェクター/ターゲット(E:T)細胞比でプレーティングした。ADCC活性測定のために、0.00315−10μg/mL(最終濃度)の試験および対照抗体を各ウエルに三重反復で添加した。第二のADCCアッセイでは、ch806のADCC活性を、1μg/mLの一定の試験抗体濃度で、あるエフェクター:ターゲット細胞比範囲にわたって、親マウスmAb806と比較した。両方のアッセイにおいて、マイクロタイタープレートを37℃で4時間温置し、その後、50μLの上清を各ウエルから回収し、放出された51Crをガンマカウンティング(Cobra II自動ガンマカウンター、Canberra Packard、オーストラリア、メルボルン)。これらのアッセイに対照を含めて、自然放出(培地のみ)および全放出(10%Tween20/PBS)について補正した。適切な対照と同じサブクラスの抗体を並行して実行した。
細胞傷害性百分率 = サンプルカウント−自然放出 ×100
全放出−自然放出
細胞傷害性パーセント(%)を抗体濃度(μg/mL)に対してプロットした。
CDC分析の結果を図37に提示する。アイソタイプ対照cG250で観察されたものに匹敵するCDCを有するch806 10μg/mL以下の存在下で、最小DCD活性が観察された。
mAb806またはch806の臨床評価を補助するために、抗体の血清薬物動態をモニターするためのおよびマウス−ヒトキメラ抗体に対する任意の免疫応答を定量するための検査室的アッセイが必要とされる。マウスモノクローナル抗イディオタイプ抗体(抗id)を産生させ、患者血清サンプル中のch806を測定するためのELISA試薬としての適性についておよびヒト抗キメラ抗体免疫応答分析における陽性対照としての使用について特性づけした。これらの抗イディオタイプ抗体は、患者において自然な抗EGFR抗体応答を生じさせる、治療または予防用ワクチンとしても有用であり得る。
マウス免疫処置および免疫処置前および後血清サンプルのハイブリドーマクローン選択免疫反応性は、高力価のマウス抗ch806および抗huIgGmAbの発生を示した。ch806に結合するがhuIgGにはしない抗体を生産する25のハイブリドーマを最初に選択した。これらのハイブリドーマの一部についての結合特性を図42Aおよび42Bに示す。その後、高親和性結合を有するこれらの抗ch806ハイブリドーマのうちの4つ(クローン3E3、SB8、9D6、および4D8)を制限希釈により単個細胞からのクローン増殖について追跡し、これらをそれぞれLudwig Institute for Cancer Research Melbourne Hybridoma(LMH)−11、−12、−13、および−14と呼んだ(図42)。
2つのch806抗体に同時に結合する抗ch806抗体の能力は、血清ch806レベルを判定するためのELISAにおける試薬としてのこれらの使用に望ましい特徴である。クローン性ハイブリドーマ、LMH−11、−12、−13、および−14は、同時結合を明示した(データを示さない。)。
血清サンプル中のch806の判定を補助するために、806可変領域を同時に結合する抗イディオタイプch806抗体の能力を、臨床サンプル中のch806についての高感度で特異的なELISAアッセイの開発に活用した。捕捉のための3つの精製クローンLMH−11、−12、および−13(図49Bおよび49C)を、それぞれ、血清中の結合ch806を捕捉して検出するこれらの能力について比較した。結果は、捕捉のためにLMH−12(10μg/mL)および検出のためにビオチン化LMH−12の使用が、血清(3ng/mL)中のch806に対する最高の感受性と無視できる程度のバックグラウンド結合を生じさせることを示した。
mAb806抗体によるEGFR(増幅されたEGFRとde2−7 EGFRの両方)の結合および認識における炭水化物構造の役割をさらに評定するための実験を企てた。
A.hu806構築
ヒト化806抗体(hu806)のための発現ベクターを構築した。単一GSプロモーター由来遺伝子発現カセット内の完全長hu806についての両方の遺伝子を含有する、8C65AAG(11891bp;配列番号:41)と呼ぶ、ベクターを設計した(図53および54)。
ベニアリングおよびコドン最適化
抗体ベニアリングは、HAMA(ヒト抗マウス抗体)応答への拮抗を目的としたヒト化戦略である。マウスmAbは、単回投与時でさえ、患者の免疫系により「異種」抗原とみなされ、免疫反応が誘導されて、これらの患者におけるこの試薬のさらなる使用を妨げる。mAb806ベニアリング方法の第一段階において、mAb806におけるVLおよびVH鎖のアミノ酸配列を分析し、このmAb806タンパク質配列内の各アミノ酸残基を表面露出について等級づけした(図56および図57)。抗体分子の外側に存在するアミノ酸だけを可能な修飾について考慮した。これらは、抗体認識にさらされる唯一のものであったからである。BLASTを用いて、mAb806タンパク質配列を3つのヒト抗体配列(VH36germ、CAD26810、およびAAA37941)と比較した。mAb806表面残基が、ヒト抗体配列のコンセンサスとマッチしなかったたびに、この残基を同定して、コンセンサス配列に変えた。最初に、ch806のVL内の12のアミノ酸およびVH鎖内の14のアミノ酸をベニアリングに付した(図56および図57)。
hu806抗体の可変重(VH)および可変軽(VL)領域の、ベニアリングされコドン最適化されたバージョンの配列を、次の方法で合成した:各領域(VHまたはVL)について、8−10オリゴヌクレオチドを、オーバーラッピングセンスおよびアンチセンスプライマーとして設計した。これらのオリゴは、シグナル配列、コーディング配列、イントロンを含めて、全hu806 VHまたはVL配列を包含するように、ならびに5’末端にHindIII部位および3’末端に3’BamHI部位を含むように、互いにオーバーラップするであろう。これらのオリゴヌクレオチドマップを図56Bおよび57Bに提示し、プライマーの詳細を下に提供する。
定常カッパ軽鎖(CL)のコドン最適化バージョンを、可変領域について用いたものと同じ手法で調製した。しかし、最初のPCR段階は、オリゴVKlcon−1、2、3、4;および5、6、7、8を使用する2つだけの予備生成物の作成を含んだ。加えて、この生成物についての隣接制限部位は、プラスミド挿入前、BamHIおよびNotIであった。
IgG1定常重鎖(CH)遺伝子(配列番号:80)の合成ヒト化バージョンをドイツ、レーゲンスブルクのGeneArtから購入した。この遺伝子をCHO/NS0細胞における発現のためにコドン最適化した。この遺伝子配列、制限部位などの詳細を図58に示す。
一過性トランスフェクションおよび予備試験のために、上で説明した手法で調製したhu806 VHおよびVL配列を、総称定常領域を含有する発現ベクターにライゲートした。これらのベクターは、LICR Affiliate Chrisoph Renner(University of Zurich、スイス)により提供されたものであり、(総称CHを含有する)pEAK8 HC、および(総称CLを含有する)33−xm−lcとして知られていた。CIPの存在下でGamHIおよびHindIIIを使用してベクターを消化し、その後、hu806 VHおよびVLを対応するベクターにライゲートした。結果とて得られたプラスミドを使用して、Top10ケミカルコンピテントE.コリ(E.coli)(Invitorgen)をこの製造業者の指示に従って形質転換した。形質転換されたE.コリ(E.Coli)をLB+アンピシリンプレートにプレーティングし、制限消化およびPCRによって耐性クローンをスクリーニングした。一般に、この手法で検出された8の陽性クローンを単離し、さらに増幅した。これらのコロニーから精製したDNAを自動DNAシークエンシングによって分析した。
ベニアリングされたhu806Hcおよびhu806Lcのアミノ酸配列を検証した完全配列をmAb806と比較して図59および図60にそれぞれ示す。付録の中のhu806配列に隣接して、最初のベニアリング変更を示すアスタリスク(*)があり、数(1−8)は、本明細書において説明する番号付修飾1番および8番を指す。
1.hu806 VL:CDR3 H91Y
原ヌクレオチドが作られたドキュメントは、mAb806 VL配列のCDR3内の位置91にCAC(ヒスチジン、H)があると誤って示していた。部位特異的突然変異誘発を用いて、TAC(チロシン、Y;特許WO 02/092771)の正しい配列を生成した。アミノ酸配列内のこの位置での必然的変更は、CVQHAQF(配列番号:84)からCVQYAQF(配列番号:85)であった。採集DNAおよび翻訳タンパク質配列をch806と比較して図61に示す。
5’−CCACATACTACTGCGTCCAGTACGCTCAGTTCCCCTGGAC−3’(配列番号:86)
hu806 VL領域のヒスチジンからチロシンへの修飾のためのアンチセンスプライマー(PDV2;20量体)
5’−CTGGACGCAGTAGTATGTGG−3’(配列番号:87)
hu806 VHおよびVL領域周辺のイントロンに制限酵素部位を付加した。これらの制限部位(pRENベクター系に特有、LICR)を、発現カセットに対して修飾を行う方法を容易にするように設計した。最初のシグナル領域を含まないhu806 VH配列をDraIIIに対する単一消化により除去または挿入することができた。加えて、FseIをNotI(pREN系)またはEcoRI(Lonza System)と同時に使用して、原配列からBamHIの機能を果たす定常領域を切り取ることができた。
5’−GAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTG−3’(配列番号:88)
DraIII部位Iを組み込むアンチセンスプライマー(806重鎖DraIII Down;28量体)
5’−CACTGGGTGACTGGCTTCGATGGTGACC−3’(配列番号:89)
2DraIII部位間のHC可変領域のためのセンスプライマー(806重鎖DraIII−FseI Up;49量体)
5’−GGTCACCATCGAAGCCAGTCACCCAGTGAAGGGGGCTTCCATCCACTCC−3’(配列番号:90)
DraIII部位およびFseI部位を組み込みアンチセンスプライマー(806重鎖DraIII−FseI Down;44量体)
5’−CCAAGATCTGGCCGGCCACGGTGTGCCATCTTACCGCTGCTCAC−3’(配列番号:91)
hu806軽鎖について、付加した制限部位は、重鎖におけるDraIIIと同じ機能を有するRsrII、およびFseIの機能に匹敵するPacIであった。
5’−GAGAAGCTTGCCGCCACCATGG−3’(配列番号:92)
RsrII部位Iを組み込むアンチセンスプライマー(806軽鎖RsrII Down;25量体)
5’−CGGTCCGCCCCCTTGACTGGCTTCG−3’(配列番号:93)
2RsrII部位間のLC可変領域のためのセンスプライマー(806軽鎖RsrII−PacI Up;45量体)
5’−CGAAGCCAGTCAAGGGGGCGGACCGCTTCCATCCACTCCTGTGTC−3’(配列番号:94)
RsrII部位IIおよびPacI部位を組み込むアンチセンスプライマー(806軽鎖RsrII−PacI Down;50量体)
5’−CCAAGATCTTTAATTAACGGACCGCTACTCACGTTTGATTTCCAGTTTTG−3’(配列番号:95)
親mAb806についてのVHアミノ酸81−87におけるタンパク質配列は、SVTIEDT(配列番号:96)である。ベニアリング方法の一部として、SVTAPDT(配列番号:97;図56)を読み出すために、位置84および85のイソロイシンおよびグルタミン酸をアラニン−プロリンに変更した。さらなる分析により、アラニンは、この場合、プロリンより良好な選択肢であるであろうと判断した。下に挙げるプライマーを使用して、部位特異的突然変異誘発を用いてこの第二の変更を生じさせた(SVTAADT、配列番号:98)。最終DNAおよび翻訳タンパク質配列を図62に提示する。
5’−CTGCAGCTGAACTCCGTTACAGCCGCAGACACAGCAACATATTACTGCG−3’(配列番号:99)
アンチセンスプライマー(Fx4;49量体)
5’−CGCAGTAATATGTTGCTGTGTCTGCGGCTGTAACGGAGTTCAGCTGCAG−3’(配列番号:100)
hu806重鎖可変領域配列は、最初のベニアリング後に3つのさらなる突然変異を受けた:T70S、S76NおよびQ81K。位置76でのセリンからアスパラギンへの変更は、mAb806分子の原配列に戻る補正を意味した。フレームワーク内での追加の変更を含めた。これらは、マウス抗体において見つけられないがヒト抗体において見つけられる残基を象徴するからである。従って、タンパク質配列TRDTSKSQFFLQ(配列番号:101)をSRDTSKNQFFLK(配列番号:102)にベニアリングした。最終DNAおよび翻訳タンパク質配列をmAb806と比較して図62に提示する。
5’−GGTCACCATCGAAGCCAGTCACCCAGTGAAGGGGGCTTCCATCCACTCC−3’(配列番号:103)
5’PCR断片のためのアンチセンスプライマー(このプライマーは、第一の2つの変更を組み込む。)(hu806HCfx2−5p−D;45量体)
5’−GATTCTTCGACGTGTCCCTTGAGATTGTGATCCGGCTTTTCAGAG−3’(配列番号:104)
3’PCR断片のためのセンスプライマー(このプライマーは、すべての変更を組み込む。)(hu806HCfx2−3p−U;55量体)
5’−CAAGGGACACGTCGAAGAATCAGTTCTTCCTGAAACTGAACTCCGTTACAGCCGC−3’(配列番号:105)
HC可変領域3’PCR断片のためのアンチセンスプライマー(hu806HCfx2−3p−D;44量体)
5’−CCAAGATCTGGCCGGCCACGGTGTGCCATCTTACCGCTGCTCAC−3’(配列番号:106)
これは、行った唯一の構築後VLベニアリング修飾であった。位置79で部位特異的突然変異誘発を用いて、配列SSLEPE(配列番号:107)をSSLQPE(配列番号:108)に補正した。最終DNAおよび翻訳タンパク質配列をch806と比較して図61に提示する。
5’−CGAAGCCAGTCAAGGGGGCGGACCGCTTCCATCCACTCCTGTGTC−3’(配列番号:109)
5’PCR断片のためのアンチセンスプライマー(このプライマーは、意図した突然変異を組み込む。)(hu806LC−5p−D;34量体)
5’−CTCTGGTTGTAAGCTAGAGATGGTCAGTGTATAG−3’(配列番号:110)
LC可変領域3’PCR断片のためのセンスプライマー(このプライマーは、意図した突然変異を組み込む。)(hu806LC−3p−U;45量体)
5’−CCATCTCTAGCTTACAACCAGAGGACTTTGCCACATACTACTGCG−3’(配列番号:111)
LC可変領域3’PCR断片のためのアンチセンスプライマー(hu806LC−3p−D;50量体)
5’−CCAAGATCTTTAATTAACGGACCGCTACTCACGTTTGATTTCCAGTTTTG−3’(配列番号:112)
この突然変異は、カッパ定常領域のコドン最適化バージョンのスプライシングにおけるエラーを補正するために必要であった。この変更の前に、VYACEVTH(配列番号:113)で始まりこの分子の末端まで続くアミノ酸鎖部分を最終抗体に含めた(図60)。
5’−GGCGGCACAAAACTGGAAATC−3’(配列番号:114)
LC定常カッパ5’PCR断片のためのアンチセンスプライマー(このプライマーは、補正を組み込む。)F2;59量体)
5’−GATGAGTTACTTCACAGGCATATACTTTGTGCTTTTCATAATCAGCTTTTGACAGTGTC−3’(配列番号:115)
LC定常カッパ3’PCR断片のためのセンスプライマー(このプライマーは、補正を組み込む。)(F3;26量体)
5’−AGTATATGCCTGTGAAGTAACTCATC−3’(配列番号:116)
LC定常カッパ3’PCR断片のためのアンチセンスプライマー(F4;17量体)
5’−GCCACGATGCGTCCGGC−3’(配列番号:117)
構築の初期段階で抗体806に対して行ったベニアリング変更に加えて、VH CDR2における位置60のアスパラギンをこの時点でグルタミンに変更した。N−グリコシル化は、スキーム:NXS/T(この場合のXは、任意のアミノ酸である。)に従う。位置60からのアミノ酸配列は、このスキームに従うNPSであった。しかし、(本発明者らの例におけるような)プロリン、またはシステインが、N−グリコシル化のためにX位置に見つけられる場合がしばしばある。一致性のないグリコシル化が抗体の反応性の変動につながることは、重要なことである。従って、アスパラギンを除去し、この最も近縁のアミノ酸、グルタミンで置換して、この部位がグリコシル化される一切の可能性を除いた(図59および図62)。
ベニアリングされたhu806抗体8C65AAG構築物の結合
初期抗原結合検証のために少量のhu806の調製を可能にすべく、最終プラスミド8C65AAGでの293FT細胞の一過性トランスフェクションを行った。数回の小規模反復一過性トランスフェクションからの培養上清をプールし、濃縮し、プロテインAクロマトグラフィー段階を用いてhu806抗体を回収した。定量的huIgG1 ELISAによって測定しておおよそ1−2μgのhu806抗体を得、この抗体を組換えEGFR−ECDへの結合についてBiacoreによって分析した(図63)。細胞培養基からウシ免疫グロブリンがhu806と共精製しおよびこれが全IgGの主画分に相当し、その結果、hu806結合の定量的評定が制限された。
RenVecUPSTREAM:センスプライマー(このプライマーは、ピーク8および33xmベクターにおける可変領域の上流でシークエンシングを開始する。)。
5’−GCACTTGATGTAATTCTCCTTGG−3’(配列番号:118)
5’−GAAGTAGTCCTTGACCAGG−3’(配列番号:119)
5’−GAAGATGAAGACAGATGGTGCAG−3’(配列番号:120)
5’−CGGTGGAGGGCAGTGTAGTC−3’(配列番号:121)
5’−GTGATGCTATTGCTTTATTTG−3’(配列番号:122)
5’−CATACCTACCAGTTCTGCGCC−3’(配列番号:123)
5’−CCATCCTGTTTGCTTCTTTCC−3’(配列番号:124)
5’−GACAGGGCTGCTGAGTC−3’(配列番号:125)
5’−GTGCAGCTCCAAGAGAGTGGAC−3’(配列番号:126)
5’−CAGAGTCCATCCAGCATGTC−3’(配列番号:127)
806抗EGF受容体抗体のベニアリングは、哺乳動物CHOまたはNS0細胞における発現について示したようなコドン最適化に伴う、VHにおける14のアミノ酸の突然変異(図59および図62)およびVL鎖に対する12の変更(図60および図61)を含む。8C65AAGと呼ぶ最終2遺伝子ベクターの配列を検証し、コーディング配列および翻訳をチェックした。一過性発現hu806産物を用いてBiacore分析により組換えEGFR細胞外ドメインへの結合を確認した。
より生産性の高い安定したGS−CHO hu806トランスフェクタント14D8、15B2および40A10ならびにGS−NS0 hu806トランスフェクタント36を発展させ、小規模培養により予備的hu806産物の精製および特性づけが可能になるようにさせた。結果は、類似した物理化学的特性を示した。従って、大規模(15L)攪拌タンク培養を最高生産性トランスフェクタント(GS−CHO hu806 40A10)について企て、精製産物をU87MG.de2−7およびA431異種移植片モデルでのさらなるインビトロ特性づけおよびインビボ療法研究に付した。
生産および下流プロセッシング:
小規模
100mLの細胞培養容積を有するE500振盪フラスコを用いて、振盪フラスコ実験を行った。図76は、培養中の4つのトランスフェクタントについての細胞製造度および抗体生産性チャートを提示するものである。806抗イディオタイプ抗体LMH−12(Liu et al.(2003)Generation of anti−idiotype antibodies for 出願in clinical immunotherapy laboratory analyses.Hybrid Hybridomics.22(4),219−28)をコーティング抗体として使用し、ch806 Clinical Lot:J06024を標準物質として使用して、ELISAにより産物濃度を推定した。回収時の材料を遠心分離し、上清を0.2μmフィルターで濾過し、その後、これらの抗体をプロテインAクロマトグラフィーによってアフィニティー精製した。
hu806候補クローン40A10を発現するCHO−KlSVトランスフェクタント細胞系を、CD−CHO(Invitrogen)/25μM L−メチオニンスルホキシミン(MSX;Sigma)/GSサプリメント(Sigma)を基礎培地として使用して16日間、グルコースをショット供給しながら16L攪拌タンク内で培養した。図76Cは、15L攪拌タンク型バイオリアクターにおける細胞成長および体積生産量を表すものである。最終収量は、ELISAにより58mg/Lで14.7Lであった。
FACS分析
OD A280nmにより各サンプルについて決定した抗体濃度の推定値を腺癌細胞系A431細胞(EGFR遺伝子増幅を有する。)でのFACS分析に用いた。本発明者らは、mAb806が、wtEGFR特異的mAb528と比較してA431腫瘍細胞上で発現される〜2×106のwtEGFRのおおよそ10%を結合することを以前に観察している(Johns et al.(2002)Novel monoclonal antibody specific for the de2−7 epidermal growth factor receptor(EGFR)that also recognizes the EGFR expressed in cells containing amplification of the EGFR gene.Int.J.Cancer.98(3),398−408)。細胞を4つのhu806サンプル、無関係なIgG2b抗体、または陽性対照ch806のうちのいずれか1つで染色し、それぞれを20μg/mLの濃度で評定した。二次抗体のみについての対照も含めた[ヤギ抗hu−IgG(Fc特異的)FITCコンジュゲート型]。複合FACS結合曲線を図83に提示する。この曲線は、すべての構築物について等価の染色の証拠となる。
U87MG.de2−7細胞系および増幅されたEGFR遺伝子を発現するA431類表皮癌腫細胞系を使用して、細胞吸着アッセイ(Lindmo et al.(1984)Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess.J.Immunol.Methods.72(1), 77−89)により、放射免疫コンジュゲートの抗原結合能力を評定した。
カルボキシメチルデキストランでコーティングされたセンサーチップ(CM5)を使用して、BIAcore 2000バイオセンサーで、バイオセンサー分析を行った。標準的アミンカップリング化学を用いて、チップを806エピトープペプチド(EGFRアミノ酸287−302;配列番号:14;2005年2月17日に出願された米国特許出願番号11/060,646;2004年2月20日に出願された米国仮特許出願番号60/546,602;および2004年7月1日に出願された米国仮特許出願番号60/584,623参照(これらのそれぞれの開示はこの全体が参照により本明細書に組み込まれる。)でチャネル3に関して誘導体化した。系安定性判定に用いた対照抗原でチャネル2を誘導体化した。エタノールアミンでチャネル1を誘導体化し、屈折率の影響の補正のためのブランク対照チャネルとして使用した。hu806のサンプルをHBSバッファー(10mM HEPES、pH7.4;150mM NaCl;3.4mM ジNa−EDTA;0.005%Tween−20)で希釈し、50nM、100nM、150nM、200nM、250nMおよび300nMを含有するアリコート(120μL)を30μL/分の流量でセンサーチップ表面に注入した。注入段階の後、600秒間、チップ表面にHBSバッファーを流すことによって、解離をモニターした。結合抗体を溶出し、20μLの10mM水酸化ナトリウム溶液の注入によりサンプル間でチップ表面を再生した。陽性対照、ch806を含めた。BIAevaluationソフトウェアの平衡結合モデルを用いて、結合パラメータを決定した。図89は、生成したセンサーグラムを提示するものである。
精製hu806抗体40A10調製品とターゲットA431腺癌細胞および新たに単離した健常ドナー末梢血単核エフェクター細胞を使用してADCC分析を行った。簡単に言うと、1)エフェクター対ターゲット細胞比(E:T=0.78:1から100:1)の範囲にわたって各抗体 1μg/mLを用いて、および2)各抗体の濃度範囲(3.15ng/mL−10μg/mL)にわたってE:T=50:1で、すべての分析を三重反復で行った。抗体アイソタイプ、自然および全細胞傷害性についての対照を三重反復で含め、特異的細胞傷害性についての計算は、以前に記載されたとおり(Panousis et al.,2005)であった。結果を図90に提示する。
BALB/cヌードマウスにおいて確率A431腺癌またはU87MG−de2−7神経膠腫異種移植片を使用して、hu806の治療効力を調査した。異種移植片を確率させるために、100μLのPBS中の1×106A431腺癌細胞または1×106U87MG.de2−7神経膠腫細胞をマウスの右および左鼠径部乳線に皮下注射した。式[(長さ×幅2)/2](式中、長さは、最長軸であり、幅は、長さに対して直角での測定値であった。)を用いて、腫瘍容積(TV)を算出した。最初の実験では、確率A431またはU87MG.de2−7異種移植片を有する5匹のBALB/cヌードマウスの群(n=10腫瘍/群)にIP注射による1mg hu806もしくは1mg ch806抗体またはPBSビヒクル対照治療を施した。A431については第6、8、11、13、15および18日に、およびU87MG.de2−7細胞系については第4、6、8、11、13および15日にそれぞれ療法を施した。腫瘍負荷量の倫理的考慮による実験停止までの平均±SEM腫瘍容積を、A431異種移植片について第25日まで図91に、およびU87MG.de2−7異種移植片について第31日まで図92に提示する。
プロテインAアフィニティー精製hu806抗体は、ch806臨床参照材料と同一のSE溶出プロフィール、および免疫グロブリンと一致したSDS−PAGEゲルプロフィールを呈示した。IEFパタンは、8.4の期待pIと一致した。
実施例1において論じたように、クローン175(IgG2a)をさらなる特性づけに選択した。
細胞系
Δ2−7EGFRでトランスフェクトされたU87MG.Δ2−7(Huang et al.(1997)J.Biol.Chem.272,2927−2935)およびA431細胞系(Ullrich et al.(1984)Nature.309,418−425)は、以前に記載されている。ホルモン依存性前立腺細胞腫DU145(Mickey et al.(1977)Cancer Res.37,4049−4058)をATCC(atcc.org)から得た。
mAb806およびmAb175をLudwig Institute for Cancer Research(LICR)New York Branchで産生させ、Biological Production Facility(Ludwig Institute for Cancer Research、Melbourne)において生産および精製した。マウス線維芽細胞系NR6ΔEGFRを免疫原として使用した。BALB/cマウスに2から3週間間隔で5回、アジュバント中の5×105−2×106細胞で皮下的に免疫処置を施すことにより、マウスハイブリドーマを産生させた。完全フロイントアジュバントを初回注射に使用した。その後は不完全フロイントアジュバント(Difco)を使用した。免疫処置を施したマウスからの脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞系SP2/0と融合させた。新たに産生されたクローンの上清を、血球吸着アッセイにおいて細胞系NR6、NR6wtEGFRおよびNR6ΔEGFRとの反応性についてスクリーニングし、ヒト膠芽腫細胞系U87MG、U87MGwtEGFR、およびU87MGΔEGFRでの血球吸着アッセイにより分析した。
これらの断片でのトランスフェクションの前日に、ヒト293T胎児由来腎臓線維芽細胞を、2mLの培地が入っている6ウエル組織培養プレートに、1ウエルにつき8×105で接種した。製造業者の説示に従ってLipofectamine 2000(Invtrogen)と複合させたプラスミドDNA 3−4μgで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの24から48時間後、細胞培養物を吸引し、細胞単層を250μ;の溶解バッファー(1%Triton X−100、10%グリセロール、150mM NaCl、50mM HEPES pH7.4、1mM EGTAおよび完全プロテアーゼ阻害剤ミックス(Roche))に溶解した。1.5%β−メルカプトエタノールを含有するSDSサンプルバッファーと細胞溶解産物のアリコート(10−15μL)を混合し、5分間、100℃での加熱により変性させ、10%NuPAGE Bis−Trisポリアクリルアミドゲル(Invitrogen)で電気泳動させた。その後、サンプルをニトロセルロース膜に電気転写し、これをTBSTバッファー(10mM Tris−HCl、pH8.0、100mM NaClおよび0.1%Tween−20)中ですすぎ、2.5%スキムミルクを含有するTBST中で30分間、室温でブロックした。膜を一晩、4℃で、ブロッキングバッファー中の0.5μg/mLのmAb175と共に温置した。並列膜を一晩、mAb9B11(1:5000、Cell Signaling Technology、マサチューセッツ州ダンヴァーズ)でプローブしてc−mycエピトープを検出した。膜をTBST中で洗浄し、1:5000希釈でホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート型ウサギ抗マウスIgG(Biorad)を含有するブロッキングバッファー中で2時間、室温で温置した。その後、ブロットをTBST中で洗浄し、Western Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce、イリノイ州ロックフォード)との温置後、オートラジオグラフフィルムを使用して現像した。
残基274、282、290および298で開始し、すべてアミノ酸501で終わる、ならびに成長ホルモンに融合させたものである、一連のオーバーラッピングc−mycタグ付きEGFR外部ドメイン断片は、以前に記載されている(Johns et al.(2004)J.Biol.Chem.279,30375−30384)。酵母細胞表面でのEGFRタンパク質の発現を、以前に説明されている(Johns et al.,2004)とおりに行った。
BIAcore 3000をすべての実験に用いた。アミン、チオールまたはPmsカップリングを5μL/分の流量で用いて、CM5センサーチップに、推定mAb806エピトープを含有するペプチドを固定した(Wade et al.(2006)Anal.Biochem.348,315−317)。mAb806およびmAb175を25℃で、5μL/分の流量でセンサー表面を通過させた。実行間に10mM HClを10μL/分の流量で注入することにより表面を再生させた。
細胞を20分間、溶解バッファー(1%Triton X−100、30mM HEPES、150mM NaCl、500mM フッ化4−(2−(アミノエチル)、150nMアプロチニン、1mM E−64プロテアーゼ阻害剤、0.5mM EDTA、および1mMロイペプチン、pH7.4)で溶解し、30分間の14,000xgでの遠心分離により清澄化し、適切な抗体で60分間、5μg/mLの最終濃度で免疫沈降させ、一晩、セファロース−Aビーズで捕捉した。その後、サンプルを2X NuPAGE SDS Sample Buffer(Invitrogen)で溶出し、NuPAGEゲル(3−8%または4−12%のいずれか)で分割し、Immobilon−P転写膜(Millipore)に電気転写させ、その後、適切な抗体でプローブした後、化学発光ラジオグラフィーによって検出した。
凍結切片を、5μg/mL mAb175または無関係なアイソタイプ対照で60分間、室温で染色した。Dako Envision+ HRP検出システムを製造業者の説示に従って使用して、結合抗体を検出した。最後に切片を水ですすぎ、ヘマトキシリンで対比染色し、マウントした。
100μLのPBS中のU87MG.Δ2−7細胞(3×106)を、週齢4−6週の雌Balb/cヌードマウス(Animal Research Centre、オーストラリア、パース)の両側腹部にs.c.接種した。すべての研究は、以前に報告されている(Perera et al.(2005)Clin.Cancer Res.11,6390−6399)ように確率腫瘍モデルを使用して行った。適切な図の説明文に示されている平均容積に腫瘍が達したら、治療を開始した。式(長さ×幅2)/2(式中、長さは、最長軸であり、幅は、垂直測定値であった)を用いて、mm3で腫瘍容積を決定した。各治療群について平均腫瘍容積±S.E.としてデータを表す。すべてのデータを有意性について片側スチューデントt検定により分析し、p<0.05を統計的に有意とみなした。この研究プロジェクトは、the Animal Ethics Committe of the Austin Hospitalにより承認された。
部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene、カリフォルニア州ラホーヤ)を使用して、wtEGFRの突然変異を生じさせた。各突然変異誘発についてのテンプレートは、ヒトEGFR cDNA(アクセッション番号x00588)(Ullrich et al.(1984)Nature.309,418−425)であった。各構築物の自動ヌクレオチドシークエンシングを行って、EGFR突然変異の完全性を確認した。野生型および突然変異体(C173A/C281A)EGFRを電気泳動によりBaF/3細胞にトランスフェクトした。
wtEGFRまたはC271A/C283A−EGFRを発現する細胞を洗浄し、血清およびIL−3を伴わない培地中で3時間温置した。遠心分離により細胞を回収し、EGF(100ng/mL)を含有する培地または同等の容積のPBSに再浮遊させた。15分後、細胞を回収し、ペレット化し、p−メルカプトエタノールを含有するSDS/PAGEサンプルバッファーに直接溶解した。NuPAGE 4−12%勾配ゲルでサンプルを分離し、Immobilon PVDF膜に転写し、抗ホスホチロシン(4G10、Upstate Biotechnologies)または抗EGFR抗体(LICRで生産したmAb806)でプローブした。化学発光を用いて反応性バンドを検出した。
対数期の成長中の細胞を回収し、PBSで2回洗浄して残留IL−3を除去した。細胞をRPMI 1640+10%FCSに再浮遊させ、担体のみと共に、または漸増濃度のEGFと共に、96ウエルプレートに105細胞/ウエルで接種した。適切な場合には、固定濃度(2μg/ウエル)のmAb528またはmAb806も培養物に添加した。MTTアッセイ(van de Loosdrecht et al.(1994)J.Immunol Methods.174,311−320)を用いて増殖を判定した。
細胞を遠心分離により回収し、対照または試験抗体で染色し(すべて、FACSバッファーで洗浄した氷上で40分間、FACSバッファー中10μg/mLで)、その後、Alexa 488標識抗マウスIg(1:400の最終希釈、氷上で20分)で染色した。氷冷FACSバッファーで細胞を2回洗浄し、遠心分離で回収し、FACScanで分析した;Cell Quest(Becton and Dickinson)内の統計ツールを使用して各サンプルについてのピーク蛍光チャネルおよび蛍光中央値を決定した。バックグラウンド(陰性対照)蛍光をすべての測定値から演繹した。ピーク形状および蛍光強度を最も代表するものとして蛍光中央値を選択し、mAb806結合のmAb528結合に対する比を導出するために用いた。
分子置換、ならびにFab806についてR=0.225/Rfree=0.289およびFab806:ペプチドについてR=0.226/Rfree=0.279;Fab806についてR=0.210/Rfree=0.305およびFab806:ペプチドについてR=0.203/Rfree=0.257で修飾する精密化により、構造を決定した。
NMR研究のために、15NH4Clを補足したナイトハルト(Neidhardt)最小培地(Neidhardt et al.(1974)Journal of bacteriology 119,736−747)中でE.コリ(E.coli)を成長させたことを除いてFirlieらによって以前に記載された方法(Fairlie et al.(2002)Protein expression and purification 26,171−178)を用いてSHP2のSH2ドメインへの融合体として15N標識ペプチドを組換え生産した。CNBrを使用して前記ペプチドを融合パートナーから開裂させ、逆相HPLCにより精製し、この素性をMALDI−TOF質量分析およびN末端シークエンシングによって確認した。前記ペプチドこれ自体内ではなく、806抗体結合配列内のメチオニン残基をロイシンに突然変異させて、融合パートナーからの開裂を可能にした。
インビトロでのmAb806の腫瘍特異性を実証するために、キメラバージョン(ch806)が設計され、cGMP条件生産された(Panousis et al.(2005)Br.J.Cancer.92,1069−1077)。806陽性腫瘍を有する患者におけるch806の安全性、生体内分布および免疫応答を評価するための第I相ファースト・イン・マン治験が行われ、安全性、生体内分布および薬物動態の結果が以前に報告されている(Scott et al.(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104,4071−4076)。患者における正常組織(即ち肝臓)と比較して腫瘍におけるch806の特異性を定義するために、5−7mCi(200−280MBq)111In−ch806の注射後1週間にわたって得た全身ガンマカメラ画像から111In−ch806の%注射用量(ID)を算出することにより、腫瘍および肝臓におけるch806の定量取り込みを行った。個々の患者それぞれにおける関心のある器官に基づいて、肝臓および腫瘍線量計算を行った。累積活性の計算を可能にする、バックグラウンドおよび減弱について補正した、111In−ch806注入画像データセット。注射後1週間にわたって腫瘍および肝臓における111In−ch806の濃度を導出するために線量計算を行った。
mAb175の可変重(VH)および可変軽(VL)鎖をシークエンシングし、これらの層布袋決定領域を次のように同定した:
mAb175 VH鎖:核酸(配列番号:128)およびアミノ酸(配列番号:129)配列を図74Aおよび74Bにそれぞれ示す。図74Bでは下線を引くことにより相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3(それぞれ、配列番号:130、131および132)を指摘する。
予備的結合研究は、mAb175が、EGFRに対してmAb806と類似した特異性を呈示することを示唆した。mAb806(IgG2b)およびmAb175(IgG2a)のCDR領域におけるアミノ酸配列はほぼ同一であり、それぞれにおけるアミノ酸の差異はたった1個である(図65;下の実施例26参照)。すべてのこれらの差異は、側鎖の電荷およびサイズを保存する。明らかに、これらの抗体は、独立して産生した。
mAb175の特異性を分析するために1セットの免疫組織化学実験を行った。mAb175は。EGFRを過発現するA431異種移植片の切片(図66A)およびΔ2−7EGFRを発現するU87MG.Δ2−7神経膠腫異種移植片の切片(図66A)を染色した。対照的に、mAb175は、U87MG異種移植片切片を染色しなかった。U87MG細胞系は、中程度レベルの野生型EGFRしか発現せず(図66A)、検出可能なEGFRオートクラインループを有さない。最も重要なことに、mAb175は、正常肝臓切片に結合しない(図66B)。従って、mAb175は、mAb806と同じ特異性を有するように見える、即ち、これは過発現されたおよびトランケートされたヒトEGFRを検出するが、中程度レベルで発現されるwtEGFRを検出しない。
mAb175は、アミノ酸6−273を検出するΔ2−7EGFR、およびEGFR1−501も結合するので、mAb175エピトープは、残基274−501内に含まれていなければならない。mAb806のエピトープを決定するとき、本発明者らは、すべてアミノ酸501で終わる、ヒトGHのカルボキシ末端に融合した一連のc−mycタグ付きEGFR断片を発現させた(Chao et al.(2004)J.Mol.Biol.342,539−550;Johns et al.(2004)J.Biol.Chem.279,30375−30384)。
U87MG.Δ2−7神経膠腫異種移植片に対するmAb806およびmAb175のインビボ抗腫瘍活性を検査した。異種移植片を6日間、確率させた後、抗体療法(2週間、週3回、指示された日に)を開始した。この時点で、平均腫瘍容積は、100mm3であった(図68A)。mAb175治療は、ビヒクルまたはmAb806での治療と比較して全腫瘍成長を低減させる結果となり、対照動物を倫理的理由で犠牲にした、接種後19日の時点で非常に有意であった(P<0.0001対対照およびP<0.002対mAb806)。この時点での平均腫瘍容積は、ビヒクル、mAb806およびmAb175治療群についてそれぞれ1530、300および100mm3であった(図68A)。このことにより、Δ2−7 EGFRを発現する異種移植片に対するmAb175活性の抗腫瘍活性が確証される。
mAb806およびmAb175が、すべてではないが多少高次構造のEGFRをどのようにして認識できるのかについての分子的詳細を理解するために、両方の抗体についてのFab断片の結晶構造を、酸化されたEGFR287−302エピトープ(それぞれ、解像度2.0および1.59Å)との複合体でおよび単独(それぞれ、解像度2.3Åおよび2.8Å)で判定した。両方の場合、遊離Fab構造と複合体化Fab構造は、本質的に同じであり、これらの抗体のペプチドおよびCDRループの高次構造は、輪郭がはっきりしていた(図69)。エピトープは、β−リボン構造をとり、このリボンの一端は、Fabのほうを向いており、V299は、抗原結合部位の中央に埋もれている(図69C−E)。エピトープの両端が溶媒に露出されており。このことは、はるかに長いポリペプチドへのこれらの抗体の結合に矛盾しない。
タンパク質中のジスルフィド結合は、構造剛性をもたらすが、一部の細胞表面受容体、特に、サイトカインおよび成長因子についてのものでは、ジスルフィド結合の一過的破壊およびジスルフィド結合変化が受容体の機能を支配する場合がある(Hogg,P.J.(2003)Trends in biochemical sciences 28,210−214)。これは、mAb806およびmAb175がこれらの結合部位に接近できる1つのメカニズムであったので、位置271および283のいずれかまたは両方のシステイン残基をアラニン残基に突然変異させること(C271A/C283A)により、エピトープへの接近容易性増大を試みた。完全長C271A−、C283A−またはC271A/C283A−EGFRを発現することができるベクターをIL−3依存性Ba/F3細胞系にトランスフェクトした。C271A−およびC271A/C283A−EGFR突然変異体をwtEGFRと同等のレベルで発現する、安定したBa/F3クローンを選択した(図70A)。高レベルの突然変異C283A−EGFRを発現するBa/F3細胞は、観察されなかった。前に説明したように、wtEGFRは、mAb806とあまり反応しないが、突然変異受容体は、Mab528、mAb806および抗FLAG抗体と、同等に強力に反応した。このことは、この受容体が、細胞表面で発現され、正しくフォールディングされること、およびこのような場合、mAb806がエピトープに完全に接近できることを示唆している。mAb806が、C271A/C283A突然変異体をwtEGFRより効率的に認識することを確認するために、mAb806結合のmAb528の結合に対する比を決定した。野生型EBFRとC271A/C283A EGFRの両方にN末端FLAGタグを付けたので、M2抗体に対するmAb806およびmAb528結合の比も決定した。前に報告したように、mAb806は、Ba/F3細胞の表面で発現された全wtEGFRの小率しか認識しなかった(mAb806/528結合比は、0.08である。)(表8)。対照的に、mAb806は、この細胞表面で発現されたC271A/C283A突然変異体EGFRの事実上すべてを認識した(1.01のmAb806/528結合比)(図70Aおよび表8)。
EGFR287−302エピトープに関する構造研究は、mAb806とmAb175の両方が、wtEGFR構造内の同じ3D構造モチーフを認識したことを明らかにし、この骨格高次構造が、Δ2−7EGFRにも存在し、露出していることを示している。しかし、批判的には、これらの構造内のエピトープの配向は、関連アミノ酸への抗体接近を妨げるであろう。このことは、mAb806が、生理レベルで細胞表面において発現されたwtEGFRを結合しないという実験観察と一致している。
上の実施例1において論じたように、mAb124およびmAb1133をmAb806と同時に産生させ、これらが、本明細書において論ずるmAb806の特有の特性に類似した特性、特に、過発現された野生型EGFRに対する特異性を呈示することが判明した。
U87MG.Δ2−7、A431およびHN5細胞への抗体結合をFACSによって評定した。すべての抗体が、de2−7 EGFRへの強い結合および過発現された野生型EGFRへの少ない結合を有するmAb806のものと類似した特異性を呈示した。
一連の競合ELISAを行って、124および1133抗体がmAb806エピトープと競合するかどうかを判定した。簡単に言うと、EGFR(sEGFR)の変性可溶性ドメインをELISAプレートにコーティングした。その後、未標識124、または1133抗体を漸増濃度でこのプレートの全域に添加した。洗浄後、ビオチン化mAb806を各ウエルに添加して、これが依然としてsEGFRを結合できるかどうかを判定した。結合しているmAb806の検出は、ストレプタビジンコンジュゲート型HRPを使用して果たした。抗体が、mAb806と同じ(または重複する)エピトープに結合する場合には、mAb806結合は期待されない。
U87MG.Δ2−7を未標識抗体124、1133と共に前保温した。陽性対照806およびアイソタイプ対照をアッセイに含めた。細胞を洗浄し、その後、Alexa448コンジュゲート型mAb806で染色し、FACSにより806結合レベルを判定した。
mAb806エピトープを含有するEGFRアミノ酸配列287CGADSYEMEEDGVRKC302(配列番号:14)をペプチドとして合成し、バイオセンサーチップ上に固定した。このエピトープへの抗体124、1133および806(200nM)の結合を測定した。得られた最大結合共鳴ユニット(RU)を表12にまとめる。124、1133は、806ペプチドエピトープの認識を確証する、ペプチドへの明確な結合を示した。
本実施例において証明されるように、mAb124およびmAb1133は、mAb806によって認識されるEGFRペプチドに結合し、ならびにEGFRの細胞外ドメインおよびde2−7 EGFRを発現する細胞へのmAb806の結合を遮断する。従って。これら3つの抗体は、EGFR上の同じ決定基を認識する。
様々な腫瘍タイプを有する患者における腫瘍ターゲッティング/生体内分布/薬物動態分析においてch806のインビボ特異性を検査するための臨床試験を計画した。
治験計画
このファースト・イン・マン治験は、非盲検、用量漸増第I相試験であった。主目的は、806抗原を発現する進行腫瘍を有する患者におけるch806の単回注入の安全性を評価することであった。第二の試験目的は、111In−CH806の生体内分布、薬物動態および腫瘍取り込み量を判定すること;ch806に対する患者の免疫応答を判定すること;ならびにch806の臨床活性の初期の証拠を評定することであった。腫瘍上に発現されたEGFRに対するch806のインビボ特異性を最適に評定するために、単回投与をこの試験に選択した。このプロトコルは、試験開始前にthe Human Research and Ethics Committee of the Austin Hospitalによる承認を受けた。この治験は、the Australian Therapeutic Goods Administration Clincal Trial Exemptin(CTX)スキームのもとで行った。すべての患者から書面でのインフォームドコンセントを得た。
各用量レベルの第一の患者を4週間、観察した後、任意の追加の患者が登録した。ch8063の注入の4週間以内に最初に2人の患者のいずれにおいても用量制限毒性(DLT)が観察されなかった場合には、4人の患者を次に高い投薬力価で参加させることとなった。2人の患者の任意のコホート内の一方の患者が、初回投与から4週間以内にDLTを経験した場合、追加の4人の患者(最大6人)をこの投薬レベルで参加させた。任意の用量レベルでの6人のうち1人より多くが、グレード3以上の毒性を経験しなかった場合、その後の患者を次の用量レベルで参加させた。
臨床グレードch806を、オーストラリア、メルボルンのthe Biological Production Facility of the Ludwig Institute for Cancer Reserchにおいて生産した。以前に記載されている方法(Scott et al.(2000)Cancer Res 60,3254−3261;Scott et al.(2001)J.Clin.Oncol.19(19),3976−3987)に従って二官能性金属イオンキレートCHX−A’’−DTPAにより111In(MDS Nordion、カナダ、カナタ)で抗体ch806を標識した。
111In−ch806生体内分布の全身画像を、111In−ch806の注入後第0日に、および注入後第7日までの少なくとも3回のさらなる機会に、すべての患者に関して得た。既知腫瘍を有する身体領域の単一光子放射コンピュータ断層撮影(SPECT)画像も、この期間中に少なくとも1回得た。すべてのガンマカメラ画像を二検出器ガンマカメラ(Picker International、オハイオ州クリーヴランド)で獲得した。
薬物動態分析用の血液を111In−ch806注入前第0日に採取し;その後、111In−ch806後5分、60分、2時間および4時間の時点、第1日、第2または3日、第3または5日、および第6または7日に採取した。ch806タンパク質の薬物動態のためのさらなる血液を第14日(±2日)および第21日(±2日)および第30日(±2日)にも得た。
それぞれの個々の患者の111In−ch806注入画像データセットにおいて関心のある領域に基づき全血および正常器官(肝臓、肺、腎臓および脾臓)線量計算を行い、これによって累積活性を計算すること、およびOLINDAを使用する最終線量計測結果について分析することができた(Stabin et al.(2005)J.Nucl.Med.46(6),1023−1027)。バックグラウンドおよび減弱について補正した111In−ch806画像データセットを用いて、各時点で、関心のある領域を適する腫瘍についても定義し、線量計算を行って、腫瘍/gmで111In−ch806の濃度を導出した(Scott et al.(2005)Clin.Cancer Res.11(13),4810−4817)。この値を、注入したmg ch806タンパク質用量に基づいて、μg ch806/gm 腫瘍に変換した。
HACA評定のための血液サンプルをch806注入前に採取し、その後、ch806注入後30日まで週1回採取した。前に記載されているように(Scott et al.,2005;Liu et al.(2003)Hybrid Hybridomics 22(4),219−28;Ritter et al.(2001)Cancer Res.61(18),685−6859)、サンプルをELISAにより、およびBIAcore2000計器を使用する表面プラズモン共鳴技術により、分析した。
治験中の各患者からのホルマリン固定パラフィン包埋組織を次のように免疫染色した:簡単に言うと、パラフィン包埋組織の4μm切片をSuperFrost(登録商標)Plusスライド(Menzel−Glaser、ドイツ)にマウントし、脱パラフィンし、再水和した後、Target Retrieval Solution、pH6.0(10分;Dako、デンマーク、グロストルプ)中でのマイクロウェーブにより抗原賦活化した。その後、切片を3%H2O2で10分間処理して内因性ペルオキシダーゼを除去し、室温で60分間、m806抗体(4μg/mL)と共にまたはアイソタイプを合わせた適切な濃度の陰性抗体(IgG2b;Chemicon、カリフォルニア州テメキュラ)と共に温置した。PowerVision Kit(ImmunoVision Technologies、カリフォルニア州ブリスベーン)を使用して抗体結合を検出した。免疫染色の視覚化を可能にするために、切片を色原体3−アミノ−9−エチルカルバゾール(0.4%、Sigma Chemicals Co.、米国ミズーリ州)と共に10分間温置し、Mayerのヘマトキシリンで対比染色した。この免疫染色手順についての陰性対照は、一次抗体の除外により調製した。結果を陽性腫瘍細胞染色の百分率として表示した。
治験中の各患者からのホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織を切断し、SuperFrost(登録商標)Plusスライドにマウントし、脱パラフィンし、再水和した後、SpotLight(登録商標)Tissue Pre−treatment Kit(Zymed Laboratories Inc.カリフォルニア州サウスサンフランシスコ)で前処理した。その後、切片にSpotLight(登録商標)EGFR DNAプローブをかぶせ、10分間、95℃で変性させ、一晩、37℃で温置した。ハイブリダイゼーション後、スライドを0.5×SSCで洗浄した。SpotLight(登録商標)CISH(商標)Polymer Detection Kitを使用してプローブの検出を行った。シグナルのクラスタまたは癌細胞の>25%において≧5の個別シグナルを示した切片は、m806反応性と相関するEGFR遺伝子の増幅を有すると考えた。
患者
8人の患者[女性1人および男性7人;平均年齢61歳(範囲44−75歳)]が治験を完了した(表16)。原発腫瘍部位、以前の治療歴、および試験登録時の疾患部位も表16に示す。8人すべての患者が、保存腫瘍において806抗原陽性を有した(表16)。
ch806に関連した有害事象を表17および18に列挙する。注入関連有害事象は、観察されなかった。DLTはなく、従って、MTDに達しなかった。治験担当医の意見ではことによるとch806に起因し得る原則毒性(principle toxicities)は、一過性そう痒症、軽度悪心、疲労/嗜眠、ならびに血清ALPおよびGGTレベルに対して起こり得る影響であった。患者5においてCTCグレード2のGGTの上昇が観察されたが、この上昇は、ベースライングレード1上昇のバックグラウンドに基づくものであり、事実上、一過性であった。3つの重篤有害事象(SAE)が報告されたが、ch806に起因しなかった。総合的に言えば、ch806は、すべての用量レベルで安全および十分認容性であり、一般に予測可能で管理できる軽症の毒性が観察された。さらなる用量漸増は、この治験に利用できるcGMP ch806の限られた量のため、行わなかった。
この治験中に投与した111In−ch806の注入は、合計8回であった。111In−ch806の平均(±SD)放射化学的純度および免疫反応性をそれぞれ99.3±0.1%および77.4±7.0%であると測定した。
すべての用量レベルでの患者における111In−ch806生体内分布の初期パタンは、時間とともに徐々に除去される、血液プール活性と一致していた。注入後1週間にわたって、肝臓および脾臓における111In−ch806の取り込み量は、細網内皮系による111In−キレート代謝産物の正常クリアランスと一致していた。肺(患者1、3、4、5および7)、腹部(患者1および2)、および頚部右側の正門上領域(患者6)に位置するターゲット病変を含めて、すべての用量レベルですべての患者のターゲット病変(≧2cm)に関して111In−ch806の特異的局在が観察された(図94)。脳腫瘍(患者8)における111In−ch806の高い取り込み量も実証された(図95)。重要なことに、腫瘍における111In−ch806の取り込み量は、806抗原発現レベルに依存しなかった。例えば、患者4は、保存腫瘍における806反応性についてのIHCによる<10%にもかかわらず。両肺ターゲット領域による高い取り込み量を明示した(図96)。患者4におけるターゲット病変のこの111In−ch806取り込み度は、腫瘍細胞の50−75%が保存サンプル免疫組織化学に基づき806抗原染色について陽性であった、患者3において見られたものに匹敵した(図96)。
111In−ch806の単回注入についての個々の患者の薬物動態パラメータT1/2αおよびR1/2β、V1、Cmax、AUCおよびCLを表19に示す。Kruskal−Wallis順位和検定をアルファおよびβ半減期、V1およびクリアランスに適用した。用量レベル間の有意差は観察されなかった(P>0.05)。
全身クリアランスは、948.6±378.6時間の生物学的T1/2(平均±SD)で、すべての用量レベルにわたってすべての患者において類似していた。比較的短い物理的半減期のため、生物学的反撃の計算は、有効半減期の小さな変化に極めて敏感であった。用量レベル間に全身クリアランスの統計的有意差はなかった[Kruskal−Wallis順位和検定:P値=0.54](図98)。
この1ヶ月試験の完了時、5人の患者は、安定病態を、3人の患者は進行性疾患を有することが判明した(表16)。興味深いことに、1人の患者(患者7、40mg/m2用量レベル)は、置換期間中に(細針穿刺吸引で転移性SCCであると証明された)触知可能な耳リンパ節の一過性修飾の臨床徴候を有した。このことは、ch806の潜在的生物活性を示唆している。しかし、この患者は、試験完了時にRECISTにより進行性疾患が確認された。
8人の患者[女性1人および男性7人;61歳の平均年齢(範囲44−75歳)]が、報告(Scott et al.(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104,4071−4076)どおり、この第一相治験を完了した。すべての患者が組み入れ基準を満たしており、患者8(原発性脳腫瘍を有した者)を除くすべてが試験登録時に転移性疾患を有した。腫瘍によるAb取込がすべての患者において見られ、111In−ch806、mAb806のキメラ化バージョンは、腫瘍における迅速で高レベルの取り込みを明示した(図71)。正常器官(肝臓、肺、腎臓および脾臓)からの111In−ch806のクリアランスは、用量間での差を示さなかった(Scott et al.,2007)。特に、肝臓クリアランスは用量間での差を示さなかった。このことは、肝臓にはch806についての飽和性抗原コンパートメントがないことを示している。全肝臓取り込みは、注入直後、14.45±2.43%IDの最大値であり、72時間までに8.45±1.63%IDに、および注入後一週間までに3.18±0.87%IDに下降した。このことは、注入後3日にわたって肝臓において(40mg用量について)30%IDより上に達することを示した、wtEGFR(例えば、225)への抗体の取り込み(Divgi et al.(1991)J.Natl.Cancer Inst.83,97−104)と著しく対照的である。111In−ch806の測定ピーク腫瘍は、注入後5−7日に発生した。患者1および3における定量的腫瘍取り込み量計算は、心血液プールへのターゲット病変の近接および患者の動きのため、正確に行うことができなかった。腫瘍におけるピークch806取込は、5.21から13.73×10−3%ID/gm 腫瘍組織であった。腫瘍における実際のch806濃度の計算は、(平均±SD)0.85±0μg/gm(5mg/m2)、0.92±0μg/gm(10mg/m2)、3.80±1.10μg/gm(20mg/m2)、および7.05±1.40μg/gm(40mg/m2)のピーク値を示した。
本実施例において示すような、本試験は、過発現形態、突然変異体形態またはリガンド活性化形態のEGFR上の露出されたエピトープのみに対するキメラ抗体の生体内分布および腫瘍ターゲッティングの最初に報告される証明に相当する。ch806は、すべての患者において腫瘍部位の卓越したターゲッティングを示し、正常組織取り込みの形跡を示さず、および有意な毒性を示さなかった。ch806のこれらのインビトロおよびインビボ特性が、EGFRをターゲットにする他のすべての抗体とこれを区別する。
mAb806、mAb175、mAb124、mAb1133、およびhu806のそれぞれについてのVH鎖およびVL鎖CDRをここで示し、比較する。
Claims (86)
- EGFR遺伝子の増幅を有する腫瘍(該腫瘍の細胞は、EGFR遺伝子の多数のコピーを含有する。)におけるおよびトランケートされたバージョンのEGFR受容体de2−7を発現する腫瘍におけるEGFRに結合することができる単離された抗体であって、配列番号:13のアミノ酸配列から成るde2−7接合点ペプチドに結合しないものであり;ヒト野生型EGFRの残基287−302の配列(配列番号:14)内のエピトープに結合するものであり;ならびに配列番号:2に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列を含まず、および配列番号:4に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列を含まないものである抗体。
- 重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が配列番号:42に示すアミノ酸配列を有し、および該軽鎖が配列番号:47に示すアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の単離された抗体。
- 重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が配列番号:129に示すアミノ酸配列を有し、および該軽鎖が配列番号:134に示すアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の単離された抗体。
- 重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が配列番号:22に示すアミノ酸配列を有し、および該軽鎖が配列番号:27に示すアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の単離された抗体。
- 重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が配列番号:32に示すアミノ酸配列を有し、および該軽鎖が配列番号:37に示すアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の単離された抗体。
- 重鎖および軽鎖を含み、該重鎖の可変領域が、配列番号:44、45および46に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含む、請求項1に記載の単離された抗体。
- 重鎖および軽鎖を含み、該軽鎖の可変領域が、配列番号:49、50および51に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含む、請求項1に記載の単離された抗体。
- 重鎖および軽鎖を含み、該重鎖の可変領域が、配列番号:130、131および132に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含む、請求項1に記載の単離された抗体。
- 重鎖および軽鎖を含み、該軽鎖の可変領域が、配列番号:135、136および137に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含む、請求項1に記載の単離された抗体。
- 重鎖および軽鎖を含み、該重鎖の可変領域が、配列番号:23、24および25に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含む、請求項1に記載の単離された抗体。
- 重鎖および軽鎖を含み、該軽鎖の可変領域が、配列番号:28、29および30に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含む、請求項1に記載の単離された抗体。
- 重鎖および軽鎖を含み、該重鎖の可変領域が、配列番号:33、34および35に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含む、請求項1に記載の単離された抗体。
- 重鎖および軽鎖を含み、該軽鎖の可変領域が、配列番号:38、39および40に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含む、請求項1に記載の単離された抗体。
- 抗体F(ab’)2、scFv断片、ダイアボディー、トリアボディーまたはテトラボディーの形態である、請求項1に記載の単離された抗体。
- 検出可能または機能性標識をさらに含む、請求項1に記載の単離された抗体。
- 前記検出可能または機能性標識が、共有結合で付けられる薬物である、請求項15に記載の単離された抗体。
- 前記標識が、放射標識である、請求項15に記載の単離された抗体。
- PEG化されている、請求項1に記載の単離された抗体。
- 請求項1に記載の単離された抗体をコードする配列を含む単離された核酸。
- 請求項1に記載の単離された抗体を調製する方法であって、該抗体の発現を引き起こす条件下で核酸を発現させること、および該抗体を回収することを含むものである方法。
- ヒト患者における腫瘍の治療方法であって、請求項1に記載の単離された抗体の有効量を該患者に投与することを含むものである方法。
- 請求項1の単離された抗体を含む、EGFRが異常発現されるまたはEGFRがトランケートされたタンパク質形態で発現される腫瘍の診断のためのキット。
- 試薬および/または使用のための説示をさらに含む、請求項22に記載の、EGFRが異常発現されるまたはEGFRがトランケートされたタンパク質形態で発現される主要の診断のためのキット。
- 請求項1に記載の単離された抗体を含む医薬組成物。
- 医薬的に許容されるビヒクル、担体または希釈剤をさらに含む、請求項24に記載の医薬組成物。
- 化学療法薬、抗EGFR抗体、放射免疫療法薬およびこれらの組み合わせから成る群より選択される抗癌剤をさらに含む、請求項24に記載の医薬組成物。
- 前記化学療法薬が、チロシンキナーゼ阻害剤、リン酸化カスケード阻害剤、翻訳後調節物質、細胞成長または分裂阻害剤(例えば、抗有糸分裂剤)、シグナル伝達阻害剤およびこれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項26に記載の医薬組成物。
- 前記チロシンキナーゼ阻害剤が、AG1478、ZD1839、STI571、OSI−774、SU−6668およびこれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項27に記載の医薬組成物。
- 前記抗EGFR抗体が、抗EGFR抗体528、225、SC−03、DR8.3、L8A4、Y10、ICR62、ABX−EGFおよびこれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項26に記載の医薬組成物。
- 請求項24に記載の医薬組成物の治療有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における癌を予防および/または治療する方法。
- 請求項24に記載の医薬組成物の治療有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において異常発現EGFRを生産する脳内在性の癌の治療のための方法。
- 請求項30に記載の哺乳動物における異常発現EGFRを生産する脳内在性の癌を治療するための方法であって、該脳内在性の癌が、膠芽腫、髄芽腫、髄膜腫、新生物性星状細胞種および新生物性動静脈奇形から成る群より選択されるものである方法。
- 請求項1の単離された抗体をコードする組換えDNA分子で形質転換された単細胞宿主。
- E.コリ(E.coli)、シュードモナス(Pseudomonas)、バチルス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、酵母、CHO、YB/20、NSO、SP2/0、R1.1、B−W、L−M、COS 1、COS 7、BSC1、BSC40およびBMT10細胞、植物細胞、昆虫細胞ならびにヒト細胞(組織培養でのもの)から成る群より選択される、請求項1の単離された抗体をコードする組換えDNA分子で形質転換された単細胞宿主。
- 増幅されたEGFR、de2−7EGFR、または高マンノースグリコシル化を有するEGFRの存在を検出するための方法であって、前記EGFRが、(a)増幅されたEGFR、de2−7EGFR、または高マンノースグリコシル化を有するEGFRの存在が疑われる哺乳動物からの生体サンプルと請求項1の単離された抗体とを、該EGFRの該単離された抗体への結合を可能ならしめる条件下で接触させること;および(b)前記サンプルからの前記EGFRと前記単離された抗体との間で結合が発生したかどうかを検出することによって測定され、結合の検出が、前記サンプル中の前記EGFRの存在または活性を示すものである方法。
- 哺乳動物における癌を検出するための方法であって、請求項35の方法に従ってEGFRの存在または検出することを含み、EGFRの存在の検出が、該哺乳動物における腫瘍または癌の存在を示すものである方法。
- EGFR遺伝子の増幅を有する腫瘍(該腫瘍の細胞は、EGFR遺伝子の多数のコピーを含有する。)におけるおよびトランケートされたバージョンのEGFR受容体de2−7を発現する腫瘍におけるEGFRに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖が配列番号:42に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有する、および前記軽鎖が配列番号:47に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有するものである抗体。
- 請求項37に記載の単離された抗体であって、前記抗体の前記重鎖が、配列番号:42に示すアミノ酸配列を含み、および前記抗体の前記軽鎖が配列番号:47に示すアミノ酸配列を含む、抗体。
- EGFR遺伝子の増幅を有する腫瘍(該腫瘍の細胞は、EGFR遺伝子の多数のコピーを含有する。)におけるおよびトランケートされたバージョンのEGFR受容体de2−7を発現する腫瘍におけるEGFRに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖の可変領域が、配列番号:44、45および46に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含み、ならびに該軽鎖の可変領域が、配列番号:49、50および51に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメインを含むものである抗体。
- EGFR遺伝子の増幅を有する腫瘍(該腫瘍の細胞は、EGFR遺伝子の多数のコピーを含有する。)におけるおよびトランケートされたバージョンのEGFR受容体de2−7を発現する腫瘍におけるEGFRに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が配列番号:129に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有し、および該軽鎖が、配列番号:134に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有するものである抗体。
- 請求項40に記載の単離された抗体であって、前記抗体の前記重鎖が、配列番号:129に示すアミノ酸配列を含み、および前記抗体の前記軽鎖が、配列番号:134に示すアミノ酸配列を含む、抗体。
- EGFR遺伝子の増幅を有する腫瘍(該腫瘍の細胞は、EGFR遺伝子の多数のコピーを含有する。)におけるおよびトランケートされたバージョンのEGFR受容体de2−7を発現する腫瘍におけるEGFRに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖の可変領域が、配列番号:130、131および132に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含み、ならびに該軽鎖の可変領域が、配列番号:135、136および138に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメインを含むものである抗体。
- EGFR遺伝子の増幅を有する腫瘍(該腫瘍の細胞は、EGFR遺伝子の多数のコピーを含有する。)におけるおよびトランケートされたバージョンのEGFR受容体de2−7を発現する腫瘍におけるEGFRに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が、配列番号:22に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有し、および該軽鎖が、配列番号:27に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有するものである抗体。
- 請求項43に記載の単離された抗体であって、前記抗体の前記重鎖が、配列番号:22に示すアミノ酸配列を含み、および前記抗体の前記軽鎖が、配列番号:27に示すアミノ酸配列を含む、抗体。
- EGFR遺伝子の増幅を有する腫瘍(該腫瘍の細胞は、EGFR遺伝子の多数のコピーを含有する。)におけるおよびトランケートされたバージョンのEGFR受容体de2−7を発現する腫瘍におけるEGFRに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖の可変領域が、配列番号:23、24および25に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含み、ならびに該軽鎖の可変領域が、配列番号:28、29および30に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメインを含むものである抗体。
- EGFR遺伝子の増幅を有する腫瘍(該腫瘍の細胞は、EGFR遺伝子の多数のコピーを含有する。)におけるおよびトランケートされたバージョンのEGFR受容体de2−7を発現する腫瘍におけるEGFRに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖が、配列番号:32に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有し、および該軽鎖が、配列番号:37に示すアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を有するものである抗体。
- 請求項46に記載の単離された抗体であって、前記抗体の前記重鎖が、配列番号:32に示すアミノ酸配列を含み、および前記抗体の前記軽鎖が、配列番号:37に示すアミノ酸配列を含む、抗体。
- EGFR遺伝子の増幅を有する腫瘍(該腫瘍の細胞は、EGFR遺伝子の多数のコピーを含有する。)におけるおよびトランケートされたバージョンのEGFR受容体de2−7を発現する腫瘍におけるEGFRに結合することができる単離された抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖の可変領域が、配列番号:33、34および35に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメイン領域を含み、ならびに該軽鎖の可変領域が、配列番号:38、39および40に示すアミノ酸配列に高相同性のアミノ酸配列を有するポリペプチド結合ドメインを含むものである抗体。
- EGFR遺伝子の増幅を有する腫瘍(該腫瘍の細胞は、EGFR遺伝子の多数のコピーを含有する。)におけるおよびトランケートされたバージョンのEGFR受容体de2−7を発現する腫瘍におけるEGFRに結合することができる単離された抗体であって、
配列番号:13のアミノ酸配列から成るde2−7接合点ペプチドに結合しないものであり;
ヒト野生型EGFRの残基287−302の配列(配列番号:14)内のエピトープに結合するものであり;
軽鎖および重鎖を含み、該軽鎖の可変領域が、
式Iに示すアミノ酸配列:
HSSQDIXaa1SNIG (I)
(式中、Xaa1は、非荷電極性R基を有するアミノ酸残基である。)
に対応するアミノ酸配列を有する第一のポリペプチド結合ドメイン領域、
式IIに示すアミノ酸配列:
HGTNLXaa2D (II)
(式中、Xaa2は、荷電極性R基を有するアミノ酸残基である。)
に対応するアミノ酸配列を有する第二のポリペプチド結合ドメイン領域、および
式IIIに示すアミノ酸配列:
VQYXaa3QFPWT (III)
(式中、Xaa3は、A、G、およびAまたはGが保存的に置換されているアミノ酸残基から成る群より選択される。)
に対応するアミノ酸配列を有する第三のポリペプチド結合ドメイン領域を含み、ならびに該重鎖の可変領域が、
式VIに示すアミノ酸配列:
SDXaa4AWN (IV)
(式中、Xaa4は、F、Y、およびFまたはYが保存的に置換されているアミノ酸残基から成る群より選択される。)
に対応するアミノ酸配列を有する第一のポリペプチド結合ドメイン領域、
式V、式VIまたは式VIIに示すアミノ酸配列:
YISYSGNTRYXaa5PSLKS (V)
(式中、Xaa5は、非荷電極性R基を有するアミノ酸残基である。)、
YISYSXaa6NTRYNPSLKS (VI)
(式中、Xaa6は、G、A、およびGまたはAが保存的に置換されているアミノ酸残基から成る群より選択される。)
YISYSGNTRYNPSLXaa7S (VII)
(式中、Xaa7は、塩基性アミノ酸残基である。)
に対応するアミノ酸配列を有する第二のポリペプチド結合領域、および
式VIIIに示すアミノ酸配列:
Xaa8TAGRGFPY (VIII)
(式中、Xaa8は、V、A、およびVまたはAが保存的に置換されているアミノ酸残基から成る群より選択される。)
に対応するアミノ酸配列を有する第三のポリペプチド結合ドメイン領域
を含むものであり;
ならびに配列番号:2に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域配列を含まず、および配列番号:4に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列を含まないものである抗体。 - Xaa1が、Nであり;Xaa2が、Dであり;Xaa3が、Aであり;Xaa4が、Fであり;Xaa5が、非荷電極性R基を有するアミノ酸残基であり;Xaa6が、Gであり;Xaa7が、Kであり;およびXaa8が、Vである、請求項49に記載の単離された抗体。
- Xaa5が、NまたはQである、請求項50に記載の単離された抗体。
- Xaa1が、NまたはSである、請求項49に記載の抗体。
- Xaa2が、DまたはEである、請求項49に記載の抗体。
- Xaa3が、AまたはGである、請求項49に記載の抗体。
- Xaa4が、FまたはYである、請求項49に記載の抗体。
- Xaa5が、NまたはQである、請求項49に記載の抗体。
- Xaa6が、GまたはAであり、およびXaa7が、独立してKまたはRである、請求項49に記載の抗体。
- Xaa8が、VまたはAである、請求項49に記載の抗体。
- 抗体F(ab’)2、scFv断片、ダイアボディー、トリアボディーまたはテトラボディーの形態である、請求項49に記載の単離された抗体。
- 検出可能または機能性標識をさらに含む、請求項49に記載の単離された抗体。
- 前記検出可能または機能性標識が、共有結合で付けられる薬物である、請求項60に記載の単離された抗体。
- 前記標識が、放射標識である、請求項60に記載の単離された抗体。
- PEG化されている、請求項49に記載の単離された抗体。
- 請求項49の単離された抗体をコードする配列を含む単離された核酸。
- 請求項49に記載の単離された抗体を調製する方法であって、該抗体の発現を引き起こす条件下で核酸を発現させること、および該抗体を回収することを含むものである方法。
- ヒト患者における腫瘍の治療方法であって、請求項49に記載の単離された抗体の有効量を該患者に投与することを含むものである方法。
- 請求項49の単離された抗体を含む、EGFRが異常発現されるまたはEGFRがトランケートされたタンパク質形態で発現される腫瘍の診断のためのキット。
- 試薬および/または使用のための説明書をさらに含む、請求項67に記載の、EGFRが異常発現されるまたはEGFRがトランケートされたタンパク質形態で発現される腫瘍の診断のためのキット。
- 請求項49に記載の単離された抗体を含む医薬組成物。
- 医薬的に許容されるビヒクル、担体または希釈剤をさらに含む、請求項69に記載の医薬組成物。
- 化学療法薬、抗EGFR抗体、放射免疫療法薬およびこれらの組み合わせから成る群より選択される抗癌剤をさらに含む、請求項69に記載の医薬組成物。
- 前記化学療法薬が、チロシンキナーゼ阻害剤、リン酸化カスケード阻害剤、翻訳後調節物質、細胞成長または分裂阻害剤(例えば、抗有糸分裂剤)、シグナル伝達阻害剤およびこれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項71に記載の医薬組成物。
- 前記チロシンキナーゼ阻害剤が、AG1478、ZD1839、STI571、OSI−774、SU−6668およびこれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項72に記載の医薬組成物。
- 前記抗EGFR抗体が、抗EGFR抗体528、225、SC−03、DR8.3、L8A4、Y10、ICR62、ABX−EGFおよびこれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項71に記載の医薬組成物。
- 請求項69に記載の医薬組成物の治療有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における癌を予防および/または治療する方法。
- 請求項69に記載の医薬組成物の治療有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における異常発現EGFRを生産する脳内在性の癌の治療のための方法。
- 請求項76に記載の哺乳動物における異常発現EGFRを生産する脳内在性の癌を治療するための方法であって、該脳内在性の癌が、膠芽腫、髄芽腫、髄膜腫、新生物性星状細胞種および新生物性動静脈奇形から成る群より選択されるものである方法。
- 請求項49の単離された抗体をコードする組換えDNA分子で形質転換された単細胞宿主。
- E.コリ(E.coli)、シュードモナス(Pseudomonas)、バチルス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、酵母、CHO、YB/20、NSO、SP2/0、R1.1、B−W、L−M、COS 1、COS 7、BSC1、BSC40およびBMT10細胞、植物細胞、昆虫細胞ならびにヒト細胞(組織培養でのもの)から成る群より選択される、請求項49の単離された抗体をコードする組換えDNA分子で形質転換された単細胞宿主。
- 増幅されたEGFR、de2−7EGFR、または高マンノースグリコシル化を有するEGFRの存在を検出するための方法であって、前記EGFRが、(a)増幅されたEGFR、de2−7EGFR、または高マンノースグリコシル化を有するEGFRの存在が疑われる哺乳動物からの生体サンプルと請求項49に記載の単離された抗体とを、該EGFRの該単離された抗体への結合を可能ならしめる条件下で接触させること;および(b)前記サンプルからの前記EGFRと前記単離された抗体との間で結合が発生したかどうかを検出することによって測定され、結合の検出が、前記サンプル中の前記EGFRの存在または活性を示すものである方法。
- 哺乳動物における癌を検出するための方法であって、請求項80の方法に従ってEGFRの存在または検出することを含み、EGFRの存在または検出が、該哺乳動物における腫瘍または癌の存在を示すものである方法。
- EGFR遺伝子の増幅を有する腫瘍(該腫瘍の細胞は、EGFR遺伝子の多数のコピーを含有する。)におけるおよびトランケートされたバージョンのEGFR受容体de2−7を発現する腫瘍におけるEGFRに結合することができる単離された抗体であって、配列番号:13のアミノ酸配列から成るde2−7接合点ペプチドに結合しないものであり;ヒト野生型EGFRの残基273−501の配列内のエピトープに結合するものであり;軽鎖および重鎖を含み、該軽鎖の可変領域が、アミノ酸配列HSSQDINSNIG(配列番号:18)を有する第一のポリペプチド結合ドメイン領域、アミノ酸配列HGTNLDD(配列番号:19)を有する第二のポリペプチド結合ドメイン領域、およびアミノ酸配列VQYAQFPWT(配列番号:20)を有する第三のポリペプチド結合ドメイン領域を含み、および該重鎖の可変領域が、アミノ酸配列SDFAWN(配列番号:15)を有する第一のポリペプチド結合ドメイン領域、式IXに示すアミノ酸配列:
YISYSGNTRYXaa9PSLKS (IX)
(式中、Xaa9は、非荷電極性R基を有するアミノ酸残基である。)、
に対応するアミノ酸配列を有する第二のポリペプチド結合領域、およびアミノ酸配列VTAGRGFPY(配列番号:17)を有する第三のポリペプチド結合ドメイン領域を含むものである抗体。 - ヒト野生型EGFRの残基287−302の配列(配列番号:14)内のエピトープに結合する、請求項82に記載の単離された抗体。
- Xaa9が、NまたはQである、請求項82に記載の単離された抗体。
- 前記結合ドメイン領域が、ヒト抗体フレームワークによって保持される、請求項82に記載の単離された抗体。
- 前記ヒト抗体フレームワークが、ヒトIgG1抗体フレームワークである、請求項85に記載の単離された抗体。
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