MX2011008767A - Proteinas de enlace especifico y usos de las mismas. - Google Patents

Proteinas de enlace especifico y usos de las mismas.

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Abstract

La presente invención se refiere a miembros de enlace específico, particularmente anticuerpos y fragmentos de los mismos, que enlazan al receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) amplificado y al truncado de2-7 EGFR de EGFR. En particular, el epítope reconocido por los miembros de enlace específico, particularmente anticuerpos y fragmentos de los mismos, se aumenta o es evidente al momento de la modificación post-traducción aberrante. Estos miembros de enlace específicos son útiles en el diagnóstico y tratamiento de cáncer. Los miembros de enlace de la presente invención también se pueden utilizar en terapia y combinación con quimioterapéuticos o agentes anti-cáncer y/o con otros anticuerpos o fragmentos de los mismos.

Description

PROTEINAS DE ENLACE ESPECÍFICO Y USOS DE LAS MISMAS Solicitudes Relacionadas La presente Solicitud de Patente PCT Internacional reclama la prioridad de la solicitud de Patente Norteamericana No. 12/388,504, presentada el 18 de febrero del 2009, cuya descripción está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. La presente Solicitud de Patente PCT Internacional también incorpora en su totalidad como referencia, la descripción de cada una de la Solicitud de Patente Norteamericana No. 10/145,598, presentada el 13 de mayo de 2002 (ahora Patente Norteamericana No. 7,589,180, presentada el 15 de septiembre de 2009); Solicitud de Patente Provisional No. 60/290,410, presentada el 11 de mayo de 2001; Solicitud de Patente Provisional No. 60/326,019, presentada el 28 de septiembre de 2001; Solicitud de Patente Provisional No. 60/342,258, presentada el 21 de diciembre de 2001; Solicitud de Patente PCT Internacional No. PCT/US02/15185, presentada el 13 de mayo de 2002 (Publicada como WO 02/092771 el 21 de noviembre del 2002); Solicitud de Patente PCT Internacional No. PCT/US2008/009771 , presentada el 14 de agosto del 2008 (Publicada como WO 2009/023265 el 19 de febrero del 2009); y Solicitud de Patente Provisional Norteamericana No. 60/964,715, presentada el 14 de agosto del 2007.
Campo de la Invención La presente invención se refiere a miembros de enlace específico, particularmente anticuerpos y fragmentos de los mismos, que enlazan al receptor de factor de crecimiento epidérmico amplificado (EGFR) y a la eliminación dentro del cuadro de los exones 2 a 7 de EGFR, dando como resultado un receptor EGFR truncado con ausencia de 267 aminoácidos del dominio extracelular (de2-7 EGFR). En particular, el epítope reconocido por los miembros de enlace especifico, particularmente anticuerpos y fragmentos de los mismos, se aumenta o es evidente al momento de la modificación posttraducción aberrante. Estos miembros de enlace específico son útiles en el diagnóstico y tratamiento de cáncer. Los miembros de enlace de la presente invención también se pueden utilizar en terapia en combinación con quimioterapéuticos o agentes anti-cáncer y/o con otros anticuerpos o fragmentos de los mismos.
Antecedentes de la Invención El tratamiento de una enfermedad proliferativa, particularmente cáncer, a través de medios quimioterapéuticos con frecuencia depende de explotar las diferencias en las células de proliferación objetivo y otras células normales en el cuerpo humano o de un animal. Por ejemplo, muchos agentes químicos están diseñados para ser tomados por el ADN de réplica rápida, de modo que el proceso de réplica de ADN y la división celular sea interrumpido. Otro método es identificar antígenos en la superficie de células de tumor u otras células anormales que normalmente no son expresadas en tejido humano desarrollado, tal como antígenos de tumor o antígenos embriónicos. Dichos antígenos pueden ser dirigidos con proteínas de enlace tales como anticuerpos que pueden bloquear o neutralizar el antígeno. Además, las proteínas de enlace, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, pueden suministrar un agente tóxico u otra sustancia que tengan la capacidad de activar directa o indirectamente un agente tóxico en el sitio de un tumor.
El EGFR es un objetivo atractivo para terapia de anticuerpo dirigida a tumor debido a que se sobre-expresan muchos tipos de tumores epiteliales (Voldborg y asociados, (1997). El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y las mutaciones EGFR, funcionan y tienen un posible desempeño en pruebas clínicas. Ann Oncol. 8, 1197-206; den Eynde, B. y Scott, A. M. Tumor Antigens. In: P. J. Delves y I. M. Roitt (eds.), Enciclopedia de Inmunología, Segunda Edición, pp. 2424-31. Londres: Academic Press (1998)). Además, la expresión del EGFR está asociada con un pronóstico deficiente en un número de tipos de tumor incluyendo estómago, colon, vejiga urinaria, seno, próstata, endometrio, riñon y cerebro (por ejemplo, glioma). En consecuencia, se ha reportado un número de anticuerpos EGFR en la literatura con diversas evaluaciones clínicas en curso (Baselga y asociados, (2000) Estudios Fase I de Anticuerpo Quimérico de Receptor de Factor de Crecimiento Anti-epidérmico C225 Sólo y en Combinación Con Cisplatin. J. Clin. Oncol. 18, 904; Faillot y asociados, (1996): Estudio fase I de un anticuerpo monoclonal de receptor de factor de crecimiento anti-epidérmico para el tratamiento de gliomas malignos. Neurocirugía 39, 478-83; Seymour, L. (1999) Agentes anti-cáncer novedosos en desarrollo: prospectos estimulantes y nuevos desafíos. Cáncer Treat. Rev. 25, 301-12)).
Han sido estimulantes los resultados de estudios utilizando mAbs EGFR en pacientes con cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón de célula escamosa, gliomas de cerebro y astrocitomas malignos. La actividad anti-tumor de la mayor parte de los anticuerpos EGFR se mejora a través de su capacidad de bloquear el enlace de ligando (Sturgis y asociados, (1994) Efectos de anticuerpo de receptor de factor de crecimiento anti-epidérmico 528 en la proliferación y diferenciación de cáncer cabeza y cuello. Otolaryngol. Head Neck. Surg. 111, 633-43; Goldstein y asociados (1995) Eficacia biológica de un anticuerpo quimérico para el receptor de factor de crecimiento epidérmico en un modelo de xenoinjerto de tumor humano. Clin. Cáncer Res. 1, 1311-8). Dichos anticuerpos pueden transmitir su eficacia a través tanto de la modulación de proliferación celular como de las funciones inmune dependientes de anticuerpo (por ejemplo, activación de complemento). Sin embargo, el uso de estos anticuerpos puede ser limitado por la captación en órganos que tienen altos niveles endógenos de EGFR, tal como el hígado y la piel (Baselga y asociados, 2000; Faillot y asociados, 1996).
Una proporción significativa de tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR (por ejemplo, múltiples copias del gen EGFR) también expresan en conjunto una versión truncada del receptor (Wikstrand y asociados, (1998) Variante clase III del receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR): caracterización y utilización como un objetivo inmunoterapéutico. J. Neurovirol. 4, 148-158) conocido como de2-7 EGFR, AEGFR, o ?2-7 (términos utilizados de manera intercambiable en la presente invención) (Olapade-Olaopa y asociados, (2000) Evidencia de la expresión diferencial de una proteína de receptor EGF variante en cáncer de próstata humano Br. J. Cáncer. 82, 186-94). El reajuste observado en de2-7 EGFR da como resultado un mARN maduro en cuadro que carece de 801 nucleótidos que abarca en los exones 2 a 7 (Wong y asociados, (1992) Alteraciones estructurales del gen de receptor de factor de crecimiento epidérmico en gliomas humanos. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 89, 2965-9; Yamazaki y asociados, (1990) Mutación de eliminación dentro del dominio de enlace de ligando es responsable de la activación del gen de receptor de factor de crecimiento epidérmico en tumores de cerebro humano. Jpn. J. Cáncer Res. 81, 773-9; Yamazaki y asociados, (1988) Amplificación del gen de receptor de factor de crecimiento epidérmico estructural y funcionalmente alterado (c-erbB) en tumores de cerebro humano. Mol. Cell Biol. 8, 1816-20; Sugawa y asociados, (1990) División idéntica de las transcripciones del receptor de factor de crecimiento epidérmico aberrante de genes reajustados amplificados en glioblastomas humanos. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 87, 8602-6). La proteína EGFR correspondiente y tiene una eliminación de 267 aminoácidos que comprende los residuos 6 a 273 del dominio extracelular y un residuo de glicina novedoso en la unión de fusión (Sugawa y asociados, 1990). Esta eliminación, junto con la inserción de un residuo de glicina, produce un péptido de unión único en la interfase de eliminación (Sugawa y asociados, 1990).
El de2-7 EGFR ha sido reportado en una cantidad de tipos de tumor incluyendo glioma, seno, pulmón, ovario, y próstata (Wikstrand y asociados, (1997) Localización en superficie celular y densidad de la variante asociada con tumor del receptor de factor de crecimiento epidérmico, EGFRvIll. Cáncer Res. 57, 4130-40; Olapade-Olaopa y asociados, (2000) Evidencia de la expresión diferencial de una proteína de receptor EGF variante en cáncer de próstata humano Br. J. Cáncer. 82, 186-94; Wikstrand, y asociados, (1995) Anticuerpos monoclonales contra EGFRvIll son específicos de tumor y reaccionan con carcinoma de seno y pulmón y gliomas malignos. Cáncer Res. 55, 3140-8; García de Palazzo y asociados, (1993) Expresión del receptor de factor de crecimiento epidérmico mutado a través de carcinomas de pulmón de célula no pequeña. Cáncer Res. 53, 3217-20). Aunque este receptor truncado no enlaza al ligando, posee baja actividad constitutiva e imparte una ventaja de crecimiento significativa a células de glioma crecidas como xenoinjertos de tumor en ratones desprotegidos (Nishikawa y asociados (1994) El receptor de factor de crecimiento epidérmico muíante común en glioma humano, confiere tumorigenicidad mejorada. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 91, 7727-31) y tiene la capacidad de transformar células NIH3T3 (Batra y asociados, (1995) El ligando del factor de crecimiento epidérmico independiente, desactivado, con potencial para transformar células de un gen EGFRvIll mutante humano que ocurre naturalmente. Cell Growth Differ. 6, 1251-9) y células MCF-7. Los mecanismos celulares utilizados por el de2-7 EGFR en células de glioma, no son definidos completamente, pero se reporta que incluye una disminución en apoptosis (Nagane y asociados, (1996) El receptor de factor de crecimiento epidérmico mutante común confiere tumorigenicidad mejorada en células de glioblastoma humano incrementando la proliferación y reducción de apoptosis. Cáncer Res. 56, 5079-86) y un pequeño aumento de proliferación (Nagane y asociados, 1996).
Ya que la expresión de este receptor truncado se restringe a las células de tumor, representa un objetivo altamente específico para la terapia de anticuerpo. Por consiguiente, una cantidad de laboratorios han reportado la generación de tanto un anticuerpo policlonal (Humphrey y asociados, (1990) Anticuerpo de péptido anti-sintético que reacciona en la unión de fusión de los receptores de factor de crecimiento epidérmico muíante de eliminación Proc. Nati. Acad. Sc¡. U.S. A. 87, 4207-11), como monoclonales (Wikstrand y asociados, (1995) anticuerpos monoclonales contra EGFRvIll que son específicos de tumor y reaccionan con carcinomas y gliomas malignos de seno y pulmón; Okamoto y asociados, (1996) Anticuerpo monoclonal contra la unión de fusión de un receptor de factor de crecimiento epidérmico de muíante de eliminación. Br. J. Cáncer. 73, 1366-72; Hills y asociados, (1995) Dirección específica de un receptor EGF activado, mutaníe encontrado en glioblastoma utilizando un aníicuerpo monoclonal. Int. J. Cáncer. 63, 537-43) Anticuerpos específicos para el péptido único de de2-7 EGFR. Serie de mAbs de ratón, aislados siguiendo la inmunización con el péplido 2-7 único, lodos moslrados selectividad de especificidad para el receplor íruncado y los xenoinsertos positivos de2-7 EGFR dirigidos crecidos en ratones desproíegidos (Wikslrand y asociados, (1995); Reisí y asociados, (1997) Dirección mejorada de un aníicuerpo monoclonal de varianíe III de receptor de factor de crecimiento anti-epidérmico en xenoinjerlos de íumor después de etiquetado utilizando N-succinimidilo 5-yodo-3-piridinacarboxilato. Cáncer Res. 57, 1510-5; Reist y asociados, (1995) Anticuerpos monoclonales de variante III de receptor de factor de crecimiento anti-epidérmico específicos de tumor: el uso del método de radioyodinación de tiramina-celobiosa mejora la retención y captación celular intermitentes de tumor. Cáncer Res. 55, 4375-82).
Sin embargo, un inconveniente potencial de los anticuerpos de2-7 EGFR es que únicamente una proporción de tumores que exhiben amplificación del gen EGFR, también expresa el de2-7EGFR (Ekstrand y asociados, (1992) Genes de receptor de factor de crecimiento epidérmico amplificado y reajustado en glioblastomas humanos revelan las eliminaciones de secuencias que codifican las porciones de las colas N-y/o C-terminales. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 89, 4309-13). El porcentaje exacto de tumores que contienen el de2-7 EGFR no está completamente establecido, debido al uso de diferentes técnicas (por ejemplo, PCR versus inmunohistoquímica) y diversos anticuerpos, han producido un amplio rango de valores reportados para la frecuencia de su presencia. Los datos publicados indican que aproximadamente del 25% al 30% de los gliomas expresan de2-7 EGFR siendo la expresión la más baja en astrocitomas anaplásicos y la más alta en glioblastoma multiforme (Wong y asociados, (1992); Wikstrand y asociados, (1998) La variante clase III de receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR): caracterización y utilización como un objetivo inmunoterapéutico. J. Neurovirol. 4, 148-58; Moscatello y asociados, (1995) Expresión frecuente de un receptor de factor de crecimiento epidérmico muíante en tumores humanos múltiples. Cáncer Res. 55, 5536-9). La proporción de células positivas dentro de gliomas que expresan de2-7 EGFR, ha sido reportada para fluctuar de 37% a 86% (Wikstrand y asociados, (1997)). El 27% de los carcinomas de seno y el 17% de los cánceres de pulmón se encontraron como positivos para el de2-7 EGFR (Wikstrand y asociados, (1997); Wikstrand y asociados, (1995); Wikstrand y asociados, (1998); y Hills y asociados, 1995). Por lo tanto, los anticuerpos específicos de de2-7 EGFR pueden esperarse que sean útiles únicamente en un porcentaje de tumores positivos EGFR.
Por lo tanto, aunque la evidencia existente de la actividad de anticuerpos EGFR es estimulante, aún permanecen limitaciones observadas en el rango de capacidad de aplicación y eficacia reflejadas. Por consiguiente, puede ser deseable desarrollar anticuerpos y agentes similares que demuestran eficacia con un amplio rango de tumores, y esto sea hacia el logro del objetivo al que se dirige la presente invención.
La mención de las referencias anteriores no deberá construirse como una admisión de que las mismas son la técnica anterior a la presente invención.
Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona miembros de enlace específico aislados, particularmente anticuerpos o fragmentos de los mismos, que reconocen un epítope EGFR que no demuestra cualesquiera alteraciones o sustituciones de la secuencia de aminoácido del EGFR tipo natural y que se encuentran en células tumorigénicas, hiperproliferativas o anormales y generalmente no se puede detectar en células normales o tipo silvestre (el término "tipo silvestre" tal como se utiliza en la presente invención, contempla una célula que expresa EGFR endógeno pero no el EGFR 2-7 y el término excluye específicamente una célula que sobre expresa el gen EGFR; el término "tipo silvestre" se refiere a un genotipo o fenotipo u otra característica presente en una célula normal, en lugar de en una célula anormal o tumorigénica). En un aspecto adicional, la presente invención proporciona miembros de enlace específico particularmente anticuerpos o fragmentos del mismo que reconocen un epítope EGFR que se encuentra en células tumorigénicas, hiperproliferativas o anormales, y generalmente no se puede detectar en células normales o tipo natural, en donde el epítope se aumenta o es evidente al momento de la modificación post-traducción aberrante o expresión aberrante. En un ejemplo no limitante particular aquí proporcionado, el epítope EGFR se aumenta o es evidente en donde la modificación post-traducción no es completa o total hasta el punto observado con la expresión normal de EGFR en células tipo silvestre. En un aspecto, el epítope EGFR se aumenta o es evidente al momento de la modificación de carbohidrato inicial o simple o la glucosilación temprana, particularmente una modificación de mañosa de alto nivel, y se reduce o no es evidente en la presencia de una modificación de carbohidrato complejo.
Los miembros de enlace específico, que pueden ser anticuerpos o fragmentos del mismo, tal como fragmentos inmunogénicos del mismo, no enlaza sustancialmente o reconocen células normales o tipo silvestre que contienen un epítope EGFR normal o tipo silvestre en la ausencia de expresión aberrante y en la presencia de modificación posttraducción EGFR normal.
Más particularmente, el miembro de enlace específico de la presente invención, puede ser anticuerpos o fragmentos del mismo, que reconocen un epítope EGFR que está presente en células que sobre-expresan EGFR (por ejemplo, el gen EGFR es amplificado) o sobre-expresan el EGFR de2-7, particularmente en la presencia de modificación post-traducción aberrante, y que generalmente no es detectable en células que expresan EGFR bajo condiciones normales, particularmente en la presencia de modificación post-traducción normal.
Los inventores de la presente invención han descubierto anticuerpos monoclonales novedosos, aquí ejemplificados a través de anticuerpos designados como mAb806, ch806, hu806, mAb175, mAb124, y mAb1133, que reconocen en forma específica el EGFR expresado en forma aberrante. En particular, los anticuerpos de la presente invención reconocen un epítope EGFR que se encuentra en células tumorigénicas, hiperproliferativas o anormales y generalmente no es detectable en células normales o tipo silvestre, en donde el epítope es aumentado o es evidente al momento de la modificación posttraducción aberrante. Los anticuerpos novedosos de la presente invención, también reconocen el EGFR tipo silvestre y el EGFR de2-7, enlazando aún a un epítope distinto al péptido de unión único de la mutación EGFR de2-7. Los anticuerpos de la presente invención, reconocen en forma específica el EGFR expresado en forma aberrante, incluyendo el EGFR amplificado y el EGFR muíante (ejemplificado en la presente invención a través de la mutación de2-7), particularmente al momento de la modificación post-traducción aberrante. Además, aunque estos anticuerpos no reconocen el EGFR cuando se expresa en la superficie celular de una línea de célula de glioma que expresa cantidades normales de EGFR, enlazan al dominio extracelular del EGFR (sEGFR) inmovilizado en la superficie de placas ELISA, indicando el reconocimiento de un epítope de conformación. Estos anticuerpos se enlazan a la superficie de células A431, que tienen una amplificación de gel EGFR pero no expresan el EGFR de2-7. De manera importante, estos anticuerpos no enlazan significativamente péptidos normales tales como hígado y piel, que expresan niveles de EGFR tipo silvestre (wt), endógeno que son mayores en la mayor parte de otros tejidos normales, pero en donde EGFR no se expresa o amplifica en forma aberrante.
Los anticuerpos de la presente invención pueden categorizar en forma específica la naturaleza de tumores EGFR o células tumorigénicas, mediante manchado o reconocimiento de otra manera de dichos tumores o células en donde está presente la expresión EGFR aberrante, incluyendo amplificación EGFR y/o mutación EGFR, particularmente EGFR de2-7. Además, los anticuerpos de la presente invención demuestran actividad anti-tumor in vivo significativa contra tumores que contienen el EGFR amplificado y EGFR de2-7 en xenoinjertos positivos.
La especificidad única de estos anticuerpos para enlazar al EGFR de2-7 y EGFR amplificado pero no al EGFR tipo silvestre normal, proporciona usos de diagnóstico y terapéuticos para identificar, caracterizado y dirigido y número de tipos de tumor, por ejemplo, de cabeza y cuello, seno o de próstata y glioma, sin los problemas asociados con la captación de tejido normal que se puede observar con los anticuerpos EGFR previamente conocidos.
Por consiguiente, la presente invención proporciona proteínas de enlace específico, tal como anticuerpos, que enlazan al EGFR de2-7 en un epítope que es distinto al péptido de unión pero que no enlaza sustancialmente a EGFR en células normales en la ausencia de amplificación del gen EGFR. Por amplificación, se entiende que incluye que las células comprenden múltiples copias del gen EGFR.
Preferentemente el epítope reconocido por los anticuerpos de la presente invención se localiza dentro de la región que comprende los residuos 273 a 501 de la secuencia EGFR normal madura o tipo silvestre, y preferentemente comprende los residuos 287 a 302 (SEC ID NO:14) de la secuencia EGFR normal madura o tipo silvestre. Por consiguiente, también se proporcionan proteínas de enlace específico tal como anticuerpos, que enlazan al EGFR de2-7 en un epítope localizado dentro de la región que comprende los residuos 273 a 501 y/o 287 a 302 (SEC ID NO:14) de la secuencia EGFR. El epítope puede ser determinado por cualesquiera técnicas de mapeo de epítope con encionales conocidas para los expertos en la técnica. Como alternativa, la secuencia de ADN que codifica los residuos 273 a 501 y/o 287 a 302 (SEC ID NO:14) puede ser digerida, y los fragmentos resultantes expresados en un receptor adecuado. Se puede determinar el enlace de anticuerpo como se mencionó anteriormente.
En un aspecto preferido, los anticuerpos son unos que tienen las características de los anticuerpos que los inventores han identificado y caracterizado, en particular reconociendo el EGFR expresado en forma aberrante, tal como se encuentra en EGFR amplificado y EGFR de2-7.
En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos con la capacidad de competir con los anticuerpos de la presente invención, bajo condiciones en las cuales al menos el 10% de un anticuerpo que tiene las secuencias de cadena VH y VL de los anticuerpos de la presente invención, son bloqueados de enlazar al de2-7EGFR mediante competición con dicho anticuerpo en un ensayo ELISA. En particular, los anticuerpos anti-idiotípicos se contemplan y ejemplifican en la presente invención. Los anticuerpos anti-idiotípicos LMH-1 , LMH-12 y LMH-13 se proporcionan en la presente invención.
El enlace de un anticuerpo a su antígeno objetivo se transmite a través de las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) de sus cadenas pesadas y ligeras, siendo el desempeño de CDR3 de particular importancia. Por consiguiente, los miembros de enlace específicos basados en las regiones CDR3 de la cadena pesada o ligera, y preferentemente ambas de los anticuerpos de la presente invención, serán miembros de enlace específico útiles para terapia in vivo.
Por consiguiente, las proteínas de enlace específico tal como anticuerpos que están basados en las CDRs de los anticuerpos de la presente invención identificados, particularmente las regiones CDR3, serán útiles para dirigir tumores con EGFR amplificados sin importar su estado EGFR de2-7. Ya que los anticuerpos de la presente invención no enlazan significativamente al receptor tipo silvestre normal, pueden no ser captados en forma significativa en tejido normal, desarrollándose normalmente una limitación de los anticuerpos EGFR.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de los tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo no enlaza al péptido de unión EGFR de2-7 que consiste en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:13, en donde el anticuerpo enlaza a un epítope dentro de la secuencia de los residuos 287 a 302 (SEC ID NO:14) del EGFR tipo silvestre humano, y en donde el anticuerpo no comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:2 y no comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:4.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, tendiendo la cadena pesada la secuencia de la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:42, y teniendo la cadena ligera la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:47.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, teniendo la cadena pesada la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:129, y teniendo la cadena ligera la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:134.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, teniendo la cadena pesada la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:22, y teniendo la cadena ligera la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:27.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, teniendo la cadena pesada la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:32, y teniendo la cadena ligera la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:37.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena pesada comprende un potipéptido que enlaza regiones de dominio que tiene secuencias de aminoácido altamente homologas con la secuencia de aminoácidos establecidas en las SEC ID NOS:44, 45, y 46.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena ligera comprende un polipéptido que enlaza regiones de dominio que tiene secuencias de aminoácido altamente homologas a la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NOS:49, 50, y 51.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena pesada comprende un polipéptido que enlaza regiones de dominio que tiene secuencias de aminoácido altamente homologas a la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NOS:130, 131, y 132.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena ligera comprende un polipéptido que enlaza regiones de dominio que tiene secuencias de aminoácido altamente homologas a la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NOS:135, 136, y 137.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena pesada comprende un polipéptido que enlaza regiones de dominio que tiene secuencias de aminoácido altamente homologas a la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NOS:23, 24, y 25.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena ligera comprende un polipéptido que enlaza regiones de dominio que tiene secuencias de aminoácido altamente homologas a la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NOS:28, 29, y 30.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena pesada comprende un polipéptido que enlaza regiones de dominio que tiene secuencias de aminoácido altamente homologas a la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NOS.33, 34, y 35.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena ligera comprende un polipéptido que enlaza regiones de dominio que tiene secuencias de aminoácido altamente homologas a la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NOS:38, 39, y 40.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado, en donde el anticuerpo aislado es la forma del anticuerpo F(ab')2, fragmento scFv, diacuerpo, triacuerpo o tetracuerpo.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado que comprende además una etiqueta detectable o funcional.
En otro aspecto, la etiqueta detectable o funcional es un fármaco adherido en forma covalente.
En otro aspecto, la etiqueta es una radioetiqueta.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado, en donde el anticuerpo aislado es pegilado.
En otro aspecto, se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo aislado aquí mencionado.
En otro aspecto, se proporciona un método para preparar un anticuerpo aislado, que comprende expresar un ácido nucleico tal como se mencionó anteriormente y en la presente invención bajo condiciones para proporcionar la expresión del anticuerpo, y recuperar el mismo.
En otro aspecto, se proporciona un método para el tratamiento de un tumor en un paciente humano que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado aquí mencionado.
En otro aspecto, se proporciona un equipo para un diagnóstico de un tumor en el cual EGFR se expresa en forma aberrante o en el cual EGFR se expresa en la forma de una proteína truncada, que comprende un anticuerpo aislado aquí mencionado.
En otro aspecto, el equipo comprende además reactivos y/o instrucciones de uso.
En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo aislado tal como aquí menciona.
En otro aspecto, la composición farmacéutica comprende además un vehículo, transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la composición farmacéutica comprende además un agente anti-cáncer seleccionado del grupo que consiste en agentes quimioterapéuticos, anticuerpos anti-EGFR, agentes radioinmunoterapéuticos, y combinaciones de los mismos.
En otro aspecto, los agentes quimioterapéuticos se seleccionan del grupo que consiste en inhibidores de cinasa de tirosina, inhibidores de cascada de fosforilación, moduladores post-traducción, inhibidores de división o crecimiento celular (por ejemplo, anti-mitóticos), inhibidores de transducción de señal, y combinaciones de los mismos.
En otro aspecto, los inhibidores de cinasa de tirosina se seleccionan del grupo que consiste en AG1478, ZD1839, STI571, OSI-774, SU-6668, y combinaciones de los mismos.
En otro aspecto, los anticuerpos anti-EGFR se seleccionan del grupo que consiste en los anticuerpos anti-EGFR 528,225, SC-03, DR8. 3, L8A4, Y10, ICR62, ABX-EGF, y combinaciones de los mismos.
En otro aspecto, se proporciona un método para prevenir y/o tratar cáncer en mamíferos, en donde el método comprende administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica tal como aquí se menciona.
En otro aspecto, se proporciona un método para el tratamiento de cánceres que residen en el cerebro que producen EGFR expresado en forma aberrante en mamíferos, en donde el método comprende administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva en una composición farmacéutica tal como aquí se menciona.
En otro aspecto, los cánceres que residen en el cerebro se seleccionan del grupo que consiste en glioblastomas, meduloblastomas, meningiomas, astrocitomas neoplásicos y malformaciones arteriovenosas neoplásicos.
En otro aspecto, se proporciona un receptor unicelular transformado con una molécula de ADN recombinante que codifica un anticuerpo aislado aquí mencionado.
En otro aspecto, el receptor unicelular se selecciona del grupo que consiste en E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Estreptomices, levaduras, CHO, YB/20, NSO, SP2/0, R1.1, B-W, L-M , COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, y células BMT10, células de plantas, células de insectos, y células humanas en cultivo de tejido.
En otro aspecto, se proporciona un método para detectar la presencia de EGFR amplificado, EGFR de2-7 o EGFR con glucosilación de mañosa de alto nivel en donde EGFR se mide mediante: (a) contactar una muestra biológica de un mamífero en la cual se sospecha la presencia de EGFR amplificado, EGFR de2-7 o EGFR con glucosilación de mañosa de alto nivel, con un anticuerpo aislado de la reivindicación 1, bajo condiciones que permite que ocurra el enlace de EGFR al anticuerpo aislado; y (b) detectar si ha ocurrido el enlace entre el EGFR de la muestra y el anticuerpo aislado; en donde la detección de enlace indica la presencia o actividad del EGFR en la muestra.
En otro aspecto del método para detectar la presencia de EGFR amplificado, EGFR de2-7 o EGFR con glucosilación de mañosa de alto nivel, la detección de la presencia de EGFR indica la existencia de un tumor o cáncer en el mamífero.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, teniendo la cadena pesada una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:42, y teniendo la cadena ligera una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:47.
En otro aspecto, la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:42, y en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:47.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de tumor contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena pesada comprende regiones de dominio de enlace de polipéptido que tienen secuencias de aminoácido altamente homologas con la secuencia de aminoácidos establecidas en las SEC ID NOS:44, 45, y 46, y en donde la región variable de la cadena ligera, comprende regiones de dominio de enlace de polipéptido que tienen secuencias de aminoácido altamente homologas con las secuencias de aminoácidos tal como se establece en las SEC ID NOS:49, 50, y 51.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de los tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, teniendo la cadena pesada una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:129, y teniendo la cadena ligera una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:134.
En otro aspecto, la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:129, y en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:134.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena pesada comprende regiones de dominio de enlace de polipéptido que tienen secuencias de aminoácido altamente homologas con las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEC ID NOS:130, 131, 30 y 132, y en donde la región variable de la cadena ligera comprende regiones de dominio de enlace de polipéptido que tienen secuencias de aminoácido altamente homologas con las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEC ID NOS:135, 136, y 137.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, teniendo la cadena pesada una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:22, y teniendo la cadena ligera una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:27.
En otro aspecto, la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:22, y en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:27.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de tumores contiene múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena pesada comprende un polipéptido que enlaza regiones de dominio que tiene secuencias de aminoácido altamente homologas a la secuencia de aminoácidos establecida en las SEC ID NOS:23, 24, y 25, y en donde la región variable de la cadena ligera comprende regiones de dominio de enlace de polipéptido que tienen secuencias de aminoácido altamente homologas con las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEC ID NOS:28, 29, y 30.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de tumores contiene múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, teniendo la cadena pesada una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homóloga a la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:32, y teniendo la cadena ligera una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácido establecida en las SEC ID NO:37.
En otro aspecto, la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:32, y en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:37.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de tumor contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena pesada comprende regiones de dominio de enlace de polipéptido tienen secuencias de aminoácido altamente homologas con la secuencia de aminoácidos establecida en las SEC ID NOS:33, 34, y 35, y en donde la región variable de la cadena ligera, comprende regiones de dominio de enlace de polipéptido que tienen secuencias de aminoácido altamente homologas con las secuencias de aminoácidos tal como se establece en las SEC ID NOS:38, 39, y 40.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de los tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo no enlaza al péptido de unión EGFR de2-7 que consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:13, en donde el anticuerpo enlaza a un epítope dentro de la secuencias de los residuos 287 a 302 del EGFR tipo silvestre humano, comprendiendo el anticuerpo una cadena ligera y una cadena pesada, en donde la región variable de la cadena ligera comprende una primera región de dominio de enlace de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a la secuencia de aminoácido establecida en la fórmula I : HSSQDIXaa!SNIG (I), en donde Xaai es un residuo de un residuo de aminoácido que tiene un grupo R polar no cargado (SEC ID NO:151); una segunda región de dominio de enlace de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a la secuencia de aminoácido establecida en la fórmula II: HGTNLXaa2D (II), en donde Xaa2 es un residuo de aminoácido que tiene un grupo R polar cargado (SEC ID NO:152); y una tercera región de dominio de enlace de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a la secuencia de aminoácido establecida en la fórmula III: VQYXaa3QFPWT (III), en donde Xaa^ se selecciona del grupo que consiste en A, G, y un residuo de aminoácido el cual se sustituye en forma conservadora para A o G (SEC ID NO:153); y en donde la región variable de la cadena pesada comprende una primera región de dominio de enlace de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a la secuencia de aminoácido establecida en la fórmula IV: SDXaa4AWN (IV), en donde Xaa4 se selecciona del grupo que consiste en F, Y, y un residuo de aminoácido el cual se sustituye en forma conservadora para F o Y (SEC ID NO:154); una segunda región de dominio de enlace de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a la secuencia de aminoácido establecida en la fórmula V, la fórmula VI, o la fórmula VII: YISYSGNTRYXaa5PSLKS (V), en donde Xaa5 es un residuo de aminoácido que tiene un grupo R polar no cargado (SEC ID NO:155), YISYSXaa6NTRYNPSLKS (VI), en donde Xaa6 se selecciona del grupo que consiste en G, A, y un residuo de aminoácido el cual se sustituye en forma conservadora para G o A (SEC ID NO:156), YISYSGNTRYNPSLXaa7S (VII), y Xaa7 es un residuo de aminoácido básico (SEC ID NO:157); y una tercera región de dominio de enlace de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a la secuencia de aminoácido establecida en la fórmula VIII: Xaa8TAGRGFPY (VIII), en donde Xaa8 se selecciona del grupo que consiste en V, A, y un residuo de aminoácido el cual se sustituye en forma conservadora para V o A (SEC ID NO:158), y en donde el anticuerpo no comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:2 y no comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:4.
En otro aspecto, Xaa es N; Xaa2 es D; Xaa3 es A; Xaa4 es F; Xaa5 es un residuo de aminoácido que tiene un grupo R polar no cargado; Xaa6 es G; Xaa7 es K; y Xaa8 es V.
En otro aspecto, Xaa5 es N o Q.
En otro aspecto, Xaai es N o S.
En otro aspecto, Xaa2 es D o E.
En otro aspecto, Xaa3 es A o G.
En otro aspecto, Xaa4 es F o Y.
En otro aspecto, Xaa5 es N o Q.
En otro aspecto, Xaa8 es G o A, y Xaa7 es independientemente K o R.
En otro aspecto, Xaa8 es V o A.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de los tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo no enlaza al péptido de unión EGFR de2-7 que consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:13, en donde el anticuerpo enlaza a un epítope dentro de la secuencia de residuos 273 a 501 del EGFR tipo silvestre humano, el anticuerpo comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en donde la región variable de la cadena ligera comprende una primera región de dominio de enlace de polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido HSSQDINSNIG (SEC ID NO:18); una segunda región de dominio de enlace de polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido HGTNLDD (SEC ID NO:19); y una tercera región de dominio de enlace de polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido VQYAQFPWT (SEC ID NO:20), en donde la región variable de la cadena pesada comprende una primera región de dominio de enlace de polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido SDFAWN (SEC ID NO:15); una segunda región de dominio de enlace de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a la secuencia de aminoácido establecida en la fórmula IX: YISYSGNTRYXaagPSLKS (IX) en donde Xaa9 es un residuo de aminoácido que tiene un grupo R polar no cargado (SEQ ID NO:159); y una tercera región de dominio de enlace de polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido VTAGRGFPY (SEC ID NO:17).
En otro aspecto, el anticuerpo enlaza a un epítope dentro de la secuencias de residuos 287 a 302 (SEC ID NO:14) del EGFR tipo silvestre humano.
En otro aspecto, Xaa9 es N o Q.
En otro aspecto, la región del dominio de enlace son llevadas por una estructura de anticuerpo humano.
En otro aspecto, la estructura de anticuerpo humano es una estructura de anticuerpo I g G 1 humano.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, teniendo la cadena pesada una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homóloga a la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:2, y teniendo la cadena ligera una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:4.
En otro aspecto, la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:2, y en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:4.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de los tumores contienen múltiple copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena pesada comprende las regiones de dominio de enlace de polipéptido que tienen secuencias de aminoácido altamente homologas con las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEC ID NOS:15, 16, y 17, y en donde la región variable de la cadena ligera comprende regiones de dominio de enlace de polipéptido que tienen secuencias de aminoácido altamente homólogas con la secuencia de aminoácidos establecidas en las SEC ID NOS:18, 19, y 20.
Otros objetos y ventajas podrán ser apreciados por los expertos en la técnica a partir de una revisión de la descripción detallada que se encuentra a continuación, que procede con referencia a los siguientes dibujos ilustrativos y a las reivindicaciones adjuntas.
Breve Descripción de las Figuras La figura 1, presenta el resultado del análisis citométrico de flujo de líneas de célula de glioma. Se mancharon células U87MG 30 (histogramas colores claros) y U87MG.A2-7 (histogramas colores oscuros) ya sea con un anticuerpo lgG2b irrelevante (histogramas abiertos), DH8.3 (específicos de EGFR de2-7), mAb806 o 528 (enlazan tanto a EGFR tipo silvestre como de2-7) tal como se indica.
Las figuras 2A a D, presentan los resultados de ELISA de mAb806, mAbDH8.3 y mAb528. (A) enlace de concentraciones en incremento de anticuerpo mAb806 (A) DH8.3 (·) o 528 (¦) a placas de ELISA recubiertas con sEGFR. (B) inhibición de mAb806 y mAb528 que enlazan a placas de ELISA recubiertas con sEGFR incrementando las concentraciones en la solución de EGFR soluble (sEGFR). (C) enlace de concentraciones en el incremento de DH8.3 al péptido de unión de2-7 ilustra curvas de enlace para mAb806 y mAb528 a tipo silvestre sEGFR inmovilizado (D).
Las figuras 2E y 2F, presentan en forma gráfica los resultados de estudios de enlace BIAcore utilizando péptido biotinilado C-terminal e incluyendo un anticuerpo monoclonal de la presente invención, junto con otros anticuerpos conocidos, entre ellos el anticuerpo L8A4 que reconoce el péptido de unión el mutante EGFR de2-7, y los controles.
La figura 3, ilustra la internalización del anticuerpo mAb806 y DH8.3. Se incubaron previamente células U87MG.A2-7 con mAb806 (A) o DH8.3 (·) a una temperatura de 4°C, se transfirieron a una temperatura de 37°C y se determinó la internalización mediante FACS. Los datos representan la internalización promedio en cada punto de tiempo ± SE de 3 (DH8.3) o 4 (mAb806) experimentos separados.
Las figuras 4A y 4B, ilustran la biodistribución (% ID/g de tejido de tumor) (a) 125l-mAb806 y (b) 31I-DH8.3 radioetiquetado en ratones desprotegidos que contienen xenoinjertos U87MG y U87MG.A2-7. Cada punto representa el promedio de 5 ratones ± SE excepto para 1 hora en donde n = 4.
Las figuras 5A y 5B ilustran la biodistribución de anticuerpos 125l-mAb806 (barra abierta) y 131I-DH8.3 (barra rellena) radioetiquetados expresados como (a) proporciones tumor: sangre o (b) tumor: hígado en ratones desprotegidos que contienen xenoinjertos U87MG.A2-7. Cada barra representa el promedio de 5 ratones + SE excepto para 1 hora en donde n = 4.
Las figuras 6A a C, ilustran análisis citométricos de flujo de líneas celulares que contienen amplificación del gen EGFR. Se mancharon células A431 ya sea con mAb806, DH8.3 o 528 (histogramas color negro) y se compararon con un anticuerpo lgG2b irrelevante (histograma abierto).
Las figuras 7A y 7B, ilustran la biodistribución (% ID/g de tejido de tumor) de (a) 125l-mAb806 y (b) 131l-528 radioetiquetado en ratones desprotegidos que contienen xenoinjertos U87MG.A2-7 y A431.
Las figuras 8A y 8D ilustran biodistribución de anticuerpos 25l-mAb806 (barra abierta) y 13 1-528 (barra rellena) radioetiquetados y expresados como proporciones (A, B) tumor: sangre o (C, D) tumor: hígado en ratones desprotegidos que contienen xenoinjertos (A, C) U87MG.A2-7 y (B, D) A431.
Las figuras 9A y 9B, ilustran el efecto anti-tumor de mAb806 en rangos de crecimiento de xenoinjerto (A) U87MG y (B) U87MG .?2-7 en un modelo preventivo. Se inyectaron s.c. células U87MG o U87MG.A2-7 en ambos flancos de ratones desprotegidos 3 x 106 de 4 a 6 semanas de edad BALB/c, (n = 5) día 0. Los ratones fueron inyectados i.p. ya sea con 1 mg de mAb806 (·); 0.1 mg de mAb806 (? ) ; o vehículo (o) comenzando el día antes de la inoculación de la célula de tumor. Se proporcionaron inyecciones tres veces a la semana durante dos semanas tal como se indica a través de las flechas. Los datos se expresan como un volumen de tumor promedio ±S.E.
Las figuras 10A, 10B, y 10C ilustran el efecto anti-tumor de mAb806 en xenoinjertos (A) U87MG, (B) U87MG.A2-7 y (C) U87 G.wtEGFR en un modelo establecido. Se inyectaron células 3 x 10s U87MG, U87MG.A2-7, o U87MG. wtEGFR s.c. en ambos flancos de ratones desprotegidos BALB/c de 4 a 6 semanas de edad, (n = 5). Los ratones fueron inyectados ya sea con dosis i.p. de 1 mg de mAb806 (·); dosis de 0.1 mg de mAb806 (A); o vehículo (o) comenzando cuando los tumores también alcanzaron un volumen de tumor promedio de 65 - 80 mm3. Las inyecciones se administraron tres veces a la semana durante dos semanas tal como se indica a través de las otras. Los datos se expresan como un volumen de tumor ± S.E promed io .
Las figuras 11A y 11 B ilustran el efecto anti-tumor de xenoinjertos mAb806 en A431 en modelos (A) preventivos y (B) establecidos. Se inyectaron células 3 x 106 A431 s.c. en ambos flancos de ratones desprotegidos BALB/c de 4 a 6 semanas de edad (n = 5). Los ratones fueron inyectados i.p., ya sea con dosis 1 mg de mAb806 (·); o vehículo (o), comenzando un día antes de la inoculación de célula de tumor en el modelo preventivo, o cuando los tumores hayan alcanzado un volumen de tumor promedio de 200 mm3. Se administraron inyecciones tres veces a la semana durante dos semanas tal como se indica a través de las flechas. Los datos se expresan como volumen de tumor ± S.E promedio.
La figura 12, ilustra el efecto antitumor del tratamiento con mAb806 combinado con tratamiento con AG1478 en xenoinjertos A431 en un modelo preventivo. Los datos se expresan como volumen de tumor ± S.E promedio.
La figura 13 ilustra el enlace mAb806 a células A431 en la presencia de concentraciones en incremento de AG1478 (?.dµ? y 5µ?).
Las figuras14A y 14B ilustran (A) la secuencia de ácido nucleico y (B) la traducción de aminoácido del gen de cadena 806 VH (SEC ID NO:1 y SEC ID NO:2, respectivamente).
Las figuras 15A y 15B ilustran (A) la secuencia de ácido nucleico y (B) la traducción de aminoácido del mismo del gen de cadena 806 VL (SEC ID NO:3 y SEC ID NO:4, respectivamente).
La figura 16, muestra la secuencia de cadena VH (SEC ID NO:2) numerada de acuerdo con Kabat, con las CDRs (SEC ID NOS:15, 16 y 17) subrayadas. Los residuos clave de la secuencia de cadena VH (SEC ID NO:2) son 24, 37, 48, 67 y 78.
La figura 17, muestra la secuencia de cadena (SEC ID NO:4) numerada de acuerdo con Kabat, con las CDRs (SEC ID NOS:18, 19 y 20) subrayadas. Los residuos clave de la secuencia de cadena (SEC ID NO:4) son 36, 46, 57 y 71.
Las figuras 18A a 18D muestran los resultados de estudios in vivo designados para determinar el efecto terapéutico de la terapia de anticuerpo de combinación particularmente el anticuerpo Ab806 y 528. Los ratones recibieron inoculaciones de células U87MG.D2-7 (A y B), U87MG.DK (C), o A431 (D).
Las figuras 19A a D demuestran el análisis de internalización mediante microscopio de electrones. Se incubaron previamente células U87MG.A2-7 con mAb806 o DH8.3 seguido de IgG anti-ratón conjugado con oro a una temperatura de 4°C, transferido a una temperatura de 37°C e internalización revisada en varios puntos de tiempo mediante microscopía de electrones. (A) localización del anticuerpo DH8.3 en una picadura recubierta (flecha) después de 5 minutos; (B) internalización de mAb806 mediante macropinocitosis (flecha) después de 2 minutos; (C) localización de DH8.3 a lisosomas (flecha) después de 20 minutos; (D) localización de mAb806 a lisosomas (flecha) después de 30 minutos. La magnificación original para todas las imágenes es de X30.000.
La figura 20 muestra autoradiograf ía de una sección de xenoinjerto U87 G.A2-7 recolectada 8 horas después de la inyección de 125l-mAb806.
La figura 21 muestra un análisis citométrico de flujo de orina celular que contiene amplificación del gen EGFR. Se mancharon células HN5 y MDA-468 con un anticuerpo lgG2b irrelevante (histograma abierto con línea punteada), mAb806 (histograma color negro) o 528 (histograma abierto con líneas cerradas). El anticuerpo DH8.3 fue completamente negativo en ambas líneas celulares (datos no mostrados).
La figura 22 muestra inmunoprecipitación de EGFR de las líneas celulares. El EGFR se inmunoprecipitó a partir de células U87MG.A2-7 o A431 etiquetadas-35S con anticuerpo mAb806, sc-03 o control de isotipo lgG2b. Las flechas en la parte lateral indican la posición de2-7 y EGFR. Se obtuvieron partes de banda idénticas en 3 experimentos independientes.
La figura 23, muestra la autorradiografía de una sección de xenoinjerto A431 recolectada 24 horas después de la inyección de 125l-mAb806, se indican las áreas de localización para el tejido viable (flechas).
Las figuras 24A y 24B, muestran una supervivencia prolongada de ratones desprotegidos que contienen xenoinjertos intracraneales U87MG.AEGFR (A) y LN-Z308.AEGFR (B) con tratamiento mAb806 sistémico. Se implantaron células U87MG.EGFR (1 x 105) o células LN-Z308.AEGFR (5 x 105) en cerebros de ratón desprotegido, y los animales se trataron ya sea con mAb806, PBS, o isotipo IgG de los días 0 al 14 posteriores al implante.
Las figuras 24C y 24D, muestran inhibición de crecimiento de tumores intracraneales mediante tratamiento mAb806. Se eutanizaron ratones desprotegidos (cinco por grupo) tratados ya sea con mAb806 o el control de isotipo IgG, el día 9 para U87MGEGFR (C) y el día 15 para LN-Z308.AEGFR (D), y sus cerebros fueron recolectados, fijados y seccionados. Los datos se calcularon tomando el volumen de tumor del control como el 100%. Los valores son el promedio ± SD. ***, P < 0.001; control versus mAb806. Flechas, tejido de tumor.
La figura 24E, muestra la supervivencia prolongada de ratones desprotegidos que contienen xenoinjertos U87MG.AEGFR intracraneales con un tratamiento mAb806 intratumoral. Las células U87MG.AEGFR se implantaron tal como se describió. Se inyectaron 10 mg de mAb806 o control de isotipo IgG en un volumen de 5 µ? en el sitio de inyección de tumor cada tercer día comenzando el día 1 durante cinco veces.
Las figuras 25A, 25B y 25C muestran que mAb806 prolonga la supervivencia de ratones con tumores cerebrales U87MG.wtEGFR, pero no con tumores cerebrales U87MG.DK. o U87 G. Se implantaron células U87MG (A), U87 G.DK (B), o U87MG.wtEGFR (C) (5 x 105) en cerebros de ratones desprotegidos y los animales se trataron con mAb806 a partir del día 0 hasta el 14 posteriores al implante seguido de observación después de interrumpir la terapia.
La figura 26A muestra el análisis FACS de reactividad mAb806 con líneas celulares U87MG. Se mancharon células U87MG, U87MG.AEGFR, U87MG.DK y U87MG.wtEGFR con mAbs 528 anti-EGFR, EGFR.1 y anticuerpo anti-AEGFR, mAb806. El anticuerpo EGFR.1 monoclonal reconoció exclusivamente wtEGFR, y el anticuerpo 528 monoclonal reaccionó tanto con wtEGFR como con AEGFR. mAb806 reaccionó en forma intensa con U87MG. AEGFR y U87MG.DK y en forma débil con U87MG. wtEGFR. Las barras en la abscisa, muestran el manchado máximo de las células en la ausencia de anticuerpo primario. Los resultados fueron reproducidos en tres experimentos independientes.
La figura 26B muestra inmunoprecipitación mAb806 de las formas EGFR. Se inmunoaislaron wtEGFR y muíante con anticuerpos anti-EGFR, 528, EGFR.1, o anticuerpo anti-AEGFR, mAb806, de células (Columna 1) U87MG, (Columna 2) U87A.EGFR, (Columna 3) U87MG.DK, y (Columna 4) U87MG. wtEGFR, y posteriormente se detectaron mediante manchado Western con anticuerpo anti-pan EGFR, C13.
Las figuras 27A y 27B muestran que el tratamiento sistémico con mAb806 disminuye la fosforilación de la expresión AEGFR y Bel-XL en tumores cerebrales U87MG.AEGFR. Los tumores U87MG.AEGFR fueron reseccionados el día 9 del tratamiento mAb806, congelados inmediatamente en nitrógeno líquido y almacenados a una temperatura de -80°C antes de la preparación del lisado de tumor.
(A) Análisis de expresión de manchado Western y el grado de autofosforilación de AEGFR.
Treinta pg de Usados de tumor fueron sometidos a geles de SDS-poliacrilamida, transferidos a membranas de nitrocelulosa y probados con mAb anti-fosfotirosina, posteriormente se desprendieron y se volvieron a probar con anticuerpo anti-EGFR, C13.
(B) Manchado Western de Bcl-XL utilizando los mismos Usados de tumor como en (A). Las membranas fueron probadas con anticuerpo policlonal Bcl-X anti-humano. Las columnas 1 y 2, tumores cerebrales U87MG.AEGFR fueron tratados con control de isotipo; las columnas 3 y 4, tumores cerebrales U87MG.AEGFR, fueron tratados con mAb806.
La figura 28, muestra que el tratamiento mAb-806 conduce a una disminución en el crecimiento y vasculogenesis, e incrementos en la apoptosis y acumulación de macrófagos en tumores U87MG.AEGFR. Se mancharon las secciones de tumor para Ki-67. Se evaluó el índice proliferativo celular a través del porcentaje de células totales que fueron positivas Ki-67 a partir de cuatro campos de alta energía seleccionados en forma aleatoria (X400) en tumores intracraneales de cuatro ratones de cada grupo. Los datos son el promedio ± SE. Se detectaron células apoptóticas mediante ensayo TUNEL. Se evaluó el índice apoptótico mediante la proporción de células positivas-TUNEL: número total de células de cuatro campos de alta energía seleccionados en forma aleatoria (X400) en tumores intracraneales de cuatro ratones de cada grupo. Los datos son el promedio ± SE. Se inmunomancharon secciones de tumor con anticuerpo anti-CD31. Se analizaron MVAs mediante análisis de imagen computarizada de cuatro campos seleccionados en forma aleatoria (X200) de tumores intracraneales de cuatro ratones de cada grupo. Infiltrados peritumorales de macrófagos en tumores U87MG.AEGFR tratados con mAb806. Las secciones de tumor se mancharon con anticuerpo anti-F4/80.
La figura 29 muestra análisis citométrico de flujo de líneas de célula de glioma U87MG de origen y transfectadas. Las células se mancharon ya sea con un anticuerpo lgG2b ¡rrelevante (histogramas abiertos) o el anticuerpo 528 o mAb806 (histogramas llenos) tal como se indica.
La figura 30, muestra inmunoprecipitación de EGFR de las líneas celulares. El EGFR fue inmunoprecipitado a partir de células U87MG.wtEGFR, U87MG.A2-7 y A431 etiquetadas-35S con anticuerpo mAb806 (806), sc-03 (c-término), o un control de isotipo lgG2b (con). Flechas, posición EGFR de2-7 y wt.
La figura 31 muestra secciones de parafina manchadas con H&E representativas de xenoinjertos U87MG.A2-7 y U87MG.wtEGFR. Los xenoinjertos U87MG.A2-7 (recolectados 24 días después de la inoculación de tumor) y U87MG.wtEGFR (recolectados 42 días después de la inoculación de tumor) fueron cortados de ratones tratados tal como se describe en la figura 10 anterior, y manchados con H&E. Los xenoinjertos U87MG.A2-7 (recolectados 18 días después de la inoculación de tumor) y U87MG.wtEGFR (tratados 37 días después de la inoculación del tumor) tratados con vehículo mostraron muy pocas áreas de necrosis (panel izquierdo) en tanto que se observó una necrosis extensa (flecha) en xenoinjertos tanto U87MG.A2-7 como U87MG.wtEGFR tratados con mAb806 (panel derecho).
La figura 32, muestra el análisis inmunohistoquímico de la expresión EGFR en secciones congeladas derivadas de xenoinjertos U87MG, U87MG.A2-7 y U87MG.wtEGFR. Las secciones se recolectaron en los puntos de tiempo descritos en la figura 31 anterior. Las secciones de xenoinjerto fueron inmunomanchadas con el anticuerpo 528 (panel izquierdo) y mAb806 (panel derecho). No se observó inmunorreactividad disminuida ya sea para wtEGFR, EGFR amplificada o EGFR de2-7 en xenoinjertos tratados con mAb806. En forma consistente con los datos in vitro, los xenoinjertos U87MG de origen fueron positivos para anticuerpo 528, pero fueron negativos para manchado mAb806.
La figura 33, muestra una representación esquemática de construcciones de expresión bicistrónica generada. La transcripción de las cadenas de anticuerpo quiméricas se inicia mediante el promotor de factor-1 de elongación y se termina a través de una secuencia de terminación artificial fuerte. Se introdujeron secuencias IRES entre las regiones de codificación de la cadena ligera y NeoR y la cadena pesada y el gen dhfr.
Las figuras 34A y 34B, muestran el análisis de biodistribución de ch806 radioetiquetado ya sea con (A) 125l o (B) 111ln, que se llevó a cabo en ratones desprotegidos BALB/c que contienen tumores de xenoinjerto U87MG-de2-7. Los ratones fueron inyectados con 5 µg de anticuerpo radioetiquetado y en grupos de 4 ratones por punto de tiempo, sacrificados ya sea a las 8, 28, 48 ó 74 horas. Se recolectaron los órganos, se pesaron y se midió la radioactividad en un contador gamma.
Las figuras 35A y 35B ilustran (A) el % de tejido de tumor gram ID, y (B) la proporción de tumor a sangre. El anticuerpo de lndio-111 muestra aproximadamente el 30% ID/gramo de tejido y una proporción de tumor a sangre de 4.0.
La figura 36, ilustra la eficacia terapéutica del anticuerpo quimérico ch806 en un modelo de tumor establecido. Se inocularon s.c. células 3 x 106 U87MG.A2-7 en 100 µ? de PBS en ambos flancos de ratones desprotegidos hembra de 4 a 6 semanas de edad. Se incluyó mAb806 como un control positivo. El tratamiento comenzó cuando los tumores habían alcanzado un volumen promedio de 50 mm3 y consistió en 1 mg de ch806 o mAb806 administrado i.p. para un total de 5 inyecciones en los días indicados. Los datos fueron expresados como el volumen de tumor ± S.E. promedio para cada grupo de tratamiento.
La figura 37, muestra la actividad CDC en células objetivo (A) U87MG.de2-7 y (B) A431 para anticuerpos IgGI quiméricos anti-EGFR ch806 y control cG250. Se presenta el porcentaje de citotoxicidad promedio (barras; ± SD) de determinaciones en triplicado.
La figura 38 muestra ADCC en las células objetivo (A) U87MG.de2-7 y (B) A431 en la proporción de célula efectora: Objetivo de 50:1 transmitida mediante ch806 y control de isotipo cG250 (0-10 ng/ml). Los resultados se expresan como en porcentaje de citotoxicidad promedio (barras; ± SD) de determinaciones por triplicado.
La figura 39, muestra ADCC transmitido mediante 1 ng/ml de mAb806 y ch.806 de origen en células U87MG.de2-7 objetivo en un rango de proporciones efector: objetivo. Se presentan los promedios (barras; ± SD) de determinaciones en triplicado.
La figura 40 muestra veinticinco anticuerpos que producen hibridomas que enlazan ch806 pero no hulgG que fueron seleccionados inicialmente. Cuatro de estos hibridomas anti-ch806 con alta afinidad de enlace (clones 3E3, 5B8, 9D6 y 4D8) se consiguieron en forma subsecuente para la expansión clonal de células simples limitando la dilución y fueron designados por el Instituto Ludwig de Investigación de Cáncer, como Hibridoma Melbourne (LMH)-11, -12, -13 y -14, respectivamente. Además, dos hibridomas que producen mAbs específicos para hulgG también fueron clonados y caracterizados en forma adicional como clones 2C10 (LMH-15) y 2B8 (LMH-16).
Las figuras 41A, 41B y 41C, muestran que después de la expansión clonal, los sobrenadantes del cultivo de hibridoma fueron revisados por triplicado mediante ELISA para la capacidad de neutralizar la actividad de enlace de antígeno ch806 o mAb806 con sEGFR621. Los resultados promedio (± SD) demostraron la actividad antagonista de los mAbs anti-idiotipo LMH -11, -12, -13 y -14 con el bloqueo en solución tanto de el enlace ch806 como mAb806 de múrido a placas recubiertas con sEGFR (LMH-14 no mostrado).
Las figuras 42A, 42B y 42C, muestran microplacas de titulación recubiertas con 10 ng/ml de (A) LMH-11, (B) LMH-12 y (C) LMH-13 purificados. Los tres clones purificados fueron comparados con respecto a la capacidad para capturar ch806 o mAb806 en suero o 1% FCS/Media y posteriormente detectar ch806 o mAb806 enlazado. Los anticuerpos de control de isotipo hu3S193 y m3S193 en suero y 1% FCS/Medio fueron incluidos además de controles para el conjugado secundario del substrato avidin-HRP y ABTS. Los resultados se presentan como promedio (± SD) de muestras por triplicado utilizando LMH-12-biotinilado (10 ng/ml) para detección, e indican que el LMH-12 utilizado para captura y detección tuvo la sensibilidad más alta para ch806 en suero (3 ng/ml) con enlace de fondo insignificante.
La figura 43, muestra la validación de las condiciones ELISA farmacocinéticas óptimas utilizando 1 ng/ml de LMH-12 anti-idiotipo y 1 ng/ml de LMH-12 biotinilado para captura y detección, respectivamente. Se llevaron a cabo tres ELISAs separados por cuadruplicado para medir ch806 en suero de donador (·) de tres donadores saludables o 1% BSA/medio (¦) con control de isotipo hu3S193 en suero (A) o 1% BSA/medio (?)- Los controles para el conjugado secundario de avidina-HRP (?) y substrato ABTS solo (hexagon) se incluyeron también con cada ELISA. Los resultados promedio (± SD) demuestran curvas de enlace altamente reproducibles para medir ch806 (2 ng/ml - 1.6 ng/ml) en sueros con un límite de detección de 3 ng/ml. (n = 12; 1 - 100 ng/ml, Coeficiente de Variación < 25%; 100 ng/ml - 5 Hg/ml, Coeficiente de Variación < 15%). No fue evidente el enlace de fondo con cualesquiera de los tres sueros probados y se observó enlace insignificante con el control de isotipo hu3S193.
La figura 44, ilustra un inmunomanchado de sEGFR recombinante expresado en células CHO, manchado con mAb806. El sEGFR recombinante se trató con PNGaseF para eliminar la glucosilación enlazada-N (desglucosilada) o la proteína no tratada (no tratada) se corrió en SDS-PAGE, se transfirió a la membrana y se inmunomanchó con mAb806.
La figura 45, ilustra inmunoprecipitación de EGFR de líneas de célula etiquetada-35S (U87MG.A2-7, U87MG-wtEGFR y A431) con diferentes anticuerpos (anticuerpos SC-03, 806 y 528).
La figura 46, ilustra la inmunoprecipitación de EGFR de diferentes células (A431 y U87MG.A2-7) en diferentes puntos de tiempo (tiempo 0 a 24 minutos) después del etiquetado-pulsación con 35S metionina/cisteína. Los anticuerpos 528 y 806 fueron utilizados para inmunoprecipitación.
La figura 47 ilustra la inmunoprecipitación de EGFR de diversas líneas celulares (U87MGA2-7, U87MG- tEGFR y A431) con varios anticuerpos (SC-03, 806 y 528) en la ausencia de (-) y después de la digestión Endo H ( + ) para eliminar los carbohidratos tipo mañosa de alto nivel.
La figura 48, ilustra la yodinación de superficie celular de las líneas de células A431 y U87MG.A2-7 seguido de inmunoprecipitación con el anticuerpo 806, y con o sin digestión Endo H, lo que confirma que EGFR enlazada mediante mAb806 en la superficie celular de células A431, es una forma sensible a EndoH .
La figura 49, muestra el Vector pREN ch806 LC Neo (SEC ID NO: 7).
La figura 50, muestra el Vector pREN ch806 HC DHFR (SEC ID NO: 8).
Las figuras 51A a D, muestran las secuencias de ácido nucleico mAb124 de cadena VH y VL (SEC ID NOS: 21 y 26, respectivamente) y las secuencias de aminoácido (SEC ID NOS: 22 y 27, respectivamente).
Las figuras 52A a D, muestran las secuencias de ácido nucleico mAb1133 de cadena VH y VL (SEC ID NO: 31 y 36, respectivamente) y las secuencias de aminoácido (SEC ID NOS: 32 y 37, respectivamente).
La figura 53, muestra una gráfica de plásmido de ADN del plásmido Lonza del gen doble, combinado incluyendo pEE12.4 que contiene el cartucho de expresión hu806H (VH + CH), y pEE6.4 que contiene el cartucho de expresión hu806L (VL + CL).
La figura 54, muestra la secuencia de ADN (SEC ID NO: 41; complemento SEC ID NO: 162) del plásmido Lonza combinado descrito en la figura 53. Esta secuencia también muestra todas las traducciones (SEC ID NOS: 42-51 y 163-166) relevantes al anticuerpo hu806. El plásmido ha sido verificado mediante secuencia, y la secuencia de codificación y la traducción fueron revisadas. Las secciones de la secuencia han sido sombreadas para identificar las regiones de interés; las regiones sombreadas corresponden a las uniones de división real. El código de color es como se indica a continuación. (gris): región de señal, secuencias de codificación inicial encontradas en regiones variables tanto de cadena pesada como ligera; (lavanda): cadena hu806 VH, región variable de cadena pesada, chapeada (rosa): cadena hu806 CH, región constante de cadena pesada optimizada por codón; (verde): cadena hu806 VL, región variable de cadena ligera chapeada; y (amarillo): cadena hu806 VL, región constante de cadena ligera optimizada por codón.
Las figuras 55A y 55B, muestran las secuencias de aminoácido traducidas hu806 (cadenas VH y VL) de las SEC ID NOS: 164 y 166 y sus péptidos de señal respectivos de las SEC ID NOS: 163 y 165; las cadenas CH y CL de SEC ID NOS: 43 y 48), y proporcionaron los números Kabat para las cadenas VH y VL (SEC ID NOS: 164 y 165, respectivamente), con CDRs (SEC ID NOS: 44-46 y 49-51) subrayadas.
Las figuras 56A, 56B, 56C, 57A, 57B y 57C muestran el paso inicial en el diseño de chapeado, la graduación de los residuos de aminoácido en la secuencia mAb806 (cadena VH de SEC ID NO: 167 y cadena VL de SEC ID NO: 12) para la exposición de la superficie. Los grados se proporcionan en el número de asteriscos (*) arriba de cada residuo, con los residuos más expuestos teniendo tres asteriscos. Estas figuras incluyen un diseño que indica como los oligonucleótidos iniciales (cadena VH: figura 56C y SEC ID NOS: 52 y 169-177; cadena VL: figura 57C y SEC ID NOS: 62, 66, 68 y 181-187) se traslaparon para formar el primer producto chapeado (cadena VH de SEC ID NO: 168 y cadena VL de SEC ID NO: 180).
La figura 58, muestra un mapa de una secuencia de ADN de cadena pesada hulgd optimizada con codón (SEC ID NO: 80; complemento SEC ID NO: 178) y traducción de aminoácido (SEC ID NO: 43).
La figura 59, muestra la alineación de proteína que compara la secuencia de aminoácido hu806 VH + CH (8C65AAG hu806 VH + CH; SEC ID NO: 81) con el archivo de referencia original para la cadena mAb806 VH (SEC ID NO: 167). Las regiones señaladas indican secuencias de aminoácido conservadas en la cadena VH. Las CDRs están subrayadas. Los asteriscos reflejan cambios que fueron planeados y llevados a cabo en el proceso de chapeado inicial. Los sitios números son referencias a las últimas modificaciones.
La figura 60, muestra la alineación correspondiente de la secuencia de aminoácido hu806 VL + CL (señal 8C65AAG hu806 + VL + CL; SEC ID NO: 83) con el archivo de referencia original para la cadena mAb806 VL (SEC ID NO: 179). Contiene un archivo adicional (señal r2vk1 hu806 + VL + CL; SEC ID NO: 82), una construcción precursora, que se incluyó para ilustrar el cambio realizado en la modificación #7.
La figura 61, muestra una alineación de nucleótido y aminoácido de la señal hu806 + secuencias VL y CL (8C65AAG hu806 VI + Cl; SEC ID NOS: 190 y 188) con las secuencias ch806 correspondientes (pREN ch806 LC Neo; LICR; SEC ID NO: 189). Se ha modificado y anotado tal como se describe en la figura 62.
La figura 62, muestra la alineación de nucleótido de la señal hu806 + secuencia VH (cadena 8C65AAG hu806; SEC ID NO: 192) con la secuencia mAb806 correspondiente [cadena mAb806 VH antes del cambio de codón (ce) y chapeado (ven); SEC ID NO: 191]. Se ilustran los cambios de nucleótido detrás de los cambios de aminoácido de las figuras 59 y 60, así como se muestran los cambios de ácido nucleico conservadores que conducen a no cambio en aminoácido. El intrón entre la señal y la cadena VH en hu806 ha sido eliminado para una visión más fácil. Se subraya la secuencia de señal y las CDRs. La secuencia de aminoácido correspondiente (SEC ID NO: 42) ha sido superimpuesta en la alineación.
La figura 63, muestra el enlace del anticuerpo hu806 purificado obtenido de las células 293 transfectantes temporales a EGFR-ECD recombinante tal como se determina mediante Biacore. No se observó enlace a EGFR-ECD con el anticuerpo I g G 1 humano de control purificado.
La figura 64, muestra el documento de texto formateado de GenBank de la secuencia (SEC ID 10 NO: 41) y las anotaciones del 8C65AAG de plásmido que codifican el lgG1 hu806.
La figura 65, muestra la alineación de secuencias de aminoácido de CDRs de mAb806 (SEC ID NOS: 15-18, 20 y 193) y mAb175 (SEC ID NOS: 130-132, 135 y 194-195). Se marcan con letras negritas las diferencias de secuencia entre los dos anticuerpos.
Las figuras 66A y 66B muestran el manchado inmunohistoquímico de líneas celulares y de hígado humano normal con mAb175. (A) Se utilizó mAb175 biotinilado para manchar secciones preparadas de bloques que contienen células A431 (sobreexpresan el wtEGFR), células U87MG.A2-7 (expresan el A2-7EGFR) y células U87MG (expresan el wtEGFR en niveles moderados). (B) Manchado de hígado humano normal (400x) con mAb175 (panel izquierdo), control de isotipo (panel central) y control de anticuerpo secundario (panel derecho). No se observó manchado sinusoidal o de hepatocito específico.
Las figuras 67A, 67B y 67C muestran la reactividad de mAb806 y mAb175 con fragmentos del EGFR desplegado en la levadura. (A) Histogramas de citometría de flujo representativos que ilustran la señal de fluorescencia promedio de etiquetado con mAt>175 y mAb806 de fragmento EGFR desplegados con levadura. Con el despliegue de levadura, un porcentaje de células no expresan proteína en su superficie dando como resultado dos picos de histograma, El anticuerpo 9E10 se utilizó como un control positivo, ya que todos los fragmentos contienen una etiqueta c-myc terminal-C lineal. (B) Resumen de enlace de anticuerpo a diversos fragmentos EGFR. (C) Los fragmentos EGFR fueron desnaturalizados calentando los pelets de levadura a una temperatura de 800°C durante 30 minutos. La etiqueta c-myc fue aún reconocida por el anticuerpo 9E10 anti-myc en todos los casos, demostrando que el tratamiento con calor no compromete la proteína desplegada en la superficie de levadura. Se utilizó el anticuerpo EGFR sensible a la conformación mAb225, para confirmar la desnaturalización.
Las figuras 68A, 68B, 68C y 68D, muestran los efectos antitumor de mAb175 en xenoinjertos de cáncer cerebral y de próstata. (A) Ratones (n = 5) que contienen xenoinjertos U87MG.A2-7 fueron inyectados i.p. con PBS, 1 mg de mAb175 o mAb806 (control positivo), tres veces a la semana durante dos semanas los días 6, 8, 10, 13, 15 y 17 cuando el volumen de tumor de partida fue de 100 mm3. Los datos se expresan como volumen de tumor promedio ± SE. (B) Las células se mancharon con dos anticuerpos irrelevantes (azul, sólido y verde, hueco). mAb 528 para EGFR total (rosa, sólido), mAb806 (azul claro, hueco) y mAb175 (naranja, hueco) y posteriormente se analizaron mediante FACS. (C) Las células DU145 fueron Usadas, sometidos a IP con mAb 528, mAb806, mAb175 o dos anticuerpos irrelevantes independientes y posteriormente inmunomanchadas para EGFR. (D) Ratones (n = 5) que contienen xenoinjertos DU145 fueron inyectados i.p. con PBS, 1 mg de mAb175 o mAb806, diariamente los días 18 a 22, 25 a 29 y 39 a 43, cuando el volumen de tumor de partida fue de 85 mm3. Los datos se expresan como volumen de tumor promedio ± SE.
Las figuras 69A, 69B, 69C, 69D, 69E y 69F muestran las estructuras de cristal del péptido EGFR 287 a 302 enlazado a fragmentos Fab (A) Cartoon de Fab 806, con cadena ligera, rojo; cadena pesada, azul; péptido enlazado, amarillo; y EGFR2B7-302 superimpuestos de EGFR, color púrpura. (B) Cartoon de Fab 175 con cadena ligera, amarillo; cadena pesada, verde; péptido enlazado, lila; y EGFR287-302 de EGFR(DI-3), púrpura. (C) Detalle de (B) que muestra la similitud de EGFR287-302 en el receptor con el péptido enlazado a FAb 175. Los esqueletos de péptido se muestran como trazos Ca y las cadenas laterales de interacción como varas. Los átomos O fueron coloreados de rojo; N, azul; S, naranja y C, como para la cadena principal. (D) Superimposición de EGFR con complejo de Fab175:péptido que muestra el traslape espacial. La coloración como en (C) con la superficie de EGFR187-286 se coloreó turquesa. (E) La vista ortogonal para (D) con EGFR187-286, se mostró en azul opaco, y la superficie de las cadenas ligeras (naranja) y pesadas (verde) transparente. (F) Estereovista detallada de complejo 175 Fab que se observa en el sitio de enlace-antígeno. La coloración como en (C) y enlaces de hidrógeno de cadena lateral se indican con líneas punteadas en color negro. Las moléculas de agua enterradas en la formación del complejo se muestran como esferas color rojo.
Las figuras 70A, 70B, 70C y 70D, muestran la influencia del enlace de cisteína 271-283 en el enlace mAb806 a EGFR. (A) Células transfectadas con wtEGFR, EGFR-C271 A, EGFR-C283A o el mutante C271A/C283A se mancharon con mAb528 (histograma rosa pálido), mAb806 (línea azul) o únicamente el anticuerpo secundario (púrpura) y posteriormente se analizaron mediante FACS. La ganancia se estableció utilizando un anticuerpo relevante correspondido-clase. (B) Células BaF3 que expresan EGFR-C271A o C271/283A EGFR fueron revisadas con respecto a su respuesta a EGF en un ensayo MTT tal como se describe. Se derivaron EC50s utilizando la adaptación Bolzman en los puntos de datos. Los datos representan el promedio y sd de las medidas por triplicado. (C) Las células BaF3 expresan el tipo natural o EGFR-C271 A/C283A se dejaron con inanición de IL-3 y suero, posteriormente se expusieron a EGF o control de vehículo. Los Usados de células completas fueron separados mediante SDS-PAGE e ¡mmunomanchados con anticuerpo de anti-fosfotirosina (panel superior) o anticuerpo anti-EGFR (panel inferior). (D) Células BaF3 que expresan el EGFR tipo natural (panel izquierdo) o C271 A/C283A (panel derecho) se estimularon con concentraciones en incremento de EGFR en la presencia de no anticuerpo (símbolos abiertos), mAb 528 (círculos color gris) o mAb806 (triángulos color negro), ambos en 10 ug/ml. Los datos se expresaron como promedio y estándar de las medidas en triplicado.
Las figuras 71A, 71B y 71C, muestran: (A) Imagen de cámara gamma de cuerpo completo de la biodistribucion de 111ln ch806 en pacientes con carcinoma de célula escamosa metastática de la cuerda vocal, que muestra la captación de alto nivel cuantitativa en tumor en el cuello derecho (flecha). También se observa la actividad de recolección de sangre, y catabolismo menor de 111ln libre en hígado. (B) Imagen de Tomografía Computarizada de Fotones Simples (SPECT) del cuello de este paciente, que muestra la captación de 111ln-ch806 en tumor variable (flecha), con necrosis que indica captación central reducida. (C) Exploración CT correspondiente del cuello que demuestra una masa de tumor de cuello grande de lado derecho (flecha) con necrosis central.
Las figuras 72A y 72B muestran un modelo estéreo de la estructura del EGFR1-621 no atada. El esqueleto de receptor se traza en color azul y el ligando TGF-a en rojo. El epítope mAb806/175 se extra en color turquesa y los enlaces de disulfuro en color amarillo. Los átomos del enlace de disulfuro que atan el epítope nuevamente en el receptor se muestran en el formato para llenar el espacio. El modelo fue construido mediante atracamiento el dominio EGFR-ECD CR2 de la conformación atada en la estructura de un monómero EGFR no atada en la presencia de su ligando.
La figura 73, muestra la reactividad del mAb806 con fragmentos del EGFR. Los Usados de las células 293T transfectadas con vectores que expresan el fragmento 1-501 EGFR soluble o proteínas de fusión de fragmento GH/EGFR (GH-274-501, GH-282-501, GH-290-501 y GH-298-501) se resolvieron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a la membrana y se inmunomancharon con mAb806 (panel izquierdo) o el anticuerpo anti-mic 9B11 (panel derecho).
Las figuras 74A y 74B, muestran la secuencia de ácido nucleico de cadena mAb175 VH (SEC ID NO: 128) y la secuencia [[s]] de aminoácido (SEC ID NO: 129), respectivamente.
Las figuras 75A y 75B, muestran la secuencia de ácido nucleico de cadena mAb175 VL (SEC ID NO: 133) y la secuencia[[s]] de aminoácido (SEC ID NO: 134), respectivamente.
Las figuras 76A, 76B y 76C muestran: (A) Concentración de producto volumétrico y (B) concentración de célula viable de transfectantes hu806 GS-CHO (14D8, 15B2 y 40A10) y GS-NSO (36) en cultivos de frascos de agitación de pequeña escala (100 mL). Se estimó la concentración del producto mediante ELISA utilizando el anti-idiotipo 806 como anticuerpos de recubrimiento y el lote clínico ch806: J06024 como estándar; (C) crecimiento de células transfectante GS-CHO 40A10 y producción volumétrica en un biorreactor de tanque agitado de 15L. Densidad de célula viable (? x 105 célula/mL), viabilidad celular (¦) y producción (Amg/L).
Las figuras 77A, 77B, 77C, 77D y 77E muestran el Análisis de Cromatografía de Exclusión por Tamaño (Biosep SEC-S3000) de construcciones de anticuerpo hu806 purificadas con proteína-A producidas mediante cultivo de pequeña escala y ch806 y mAb 806 de control. Se presentan cromatogramas en A214nm en los paneles superiores y en A280nm en el panel inferior en cada figura.
La figura 78, muestra el Análisis de Cromatografía de Exclusión por Tamaño (Biosep SEC-S3000) de la construcción de anticuerpo hu806 purificada con proteína A 40A10 después de la producción a gran escala y la purificación de Proteína A. Se presenta el cromatograma en A214nm indicando 98.8% de pureza con 1.2% de agregado presente.
La figura 79, muestra que la prefundición de 4 a 20% de Tris/Geles de Glicina de Novex, USA se utilizaron bajo condiciones SDS-PAGE estándar para analizar las preparaciones hu806 de transfectante purificadas (5 ng) GS CHO (14D8, 15B2 y 40A10) y hu806 GS-NSO (36) bajo condiciones reducidas. Las proteínas fueron detectadas mediante Manchado Azul Coomassie.
La figura 80 muestra que la prefundición de 4 a 20% de Tris/Geles de Glicina se utilizaron bajo condiciones SDS-PAGE estándar para analizar las preparaciones hu806 de transfectante purificada (5 ng) de GS CHO (14D8, 15B2 y 40A10) y GS-NSO (36) bajo condiciones no reducidas. Las proteínas fueron detectadas mediante Manchado Azul Coomassie.
La figura 81 muestra que la prefundición de 4 a 20% de Tris/Geles de Glicina se utilizó bajo condiciones SDS-PAGE estándar para analizar el hu806 transfectante purificado GS CHO 40A10 (5 ng) después de la producción a gran escala. Las proteínas fueron detectadas mediante Manchado Azul Coomassie.
La figura 82, muestra el Análisis de gel de Enfoque Isoeléctrico de hu806 GS CHO 40A10 transfectante purificado (5 ng) después de producción de 15L. Proteínas detectadas mediante Manchado Azul Coomassie. Columna 1, marcadores pl, columna 2, hu806 (tres isoformas, pl 8.66 a 8.82); Columna 3, marcadores pl.
La figura 83 muestra el enlace a células A431: Análisis de Citometría de Flujo de preparaciones de anticuerpo hu806 purificado con proteína-A (20 ng/ml), y control de isotipo huA33 (20 ng/ml). Los controles incluyen anticuerpo secundario solo (verde) y ch806 (rojo). Las construcciones Hu806 fueron producidas mediante cultivo de pequeña escala.
La figura 84, muestra enlace a células A431: Análisis de Citometría de Flujo de preparaciones de anticuerpo mAb806, ch806 y hu806 40A10 purificados (20 ng/ml) que enlazan ~ 10% del EGFR de tipo natural en la superficie celular, 528 (enlaza tanto a EGFR tipo natural como de2-7) y anticuerpo de control irrelevante (20 Hg/ml) tal como se indica.
La figura 85, muestra el enlace a células de glioma U87MG.de2-7. Análisis de citometría de flujo de preparaciones de anticuerpo mAb806, ch806 y hu806 40A10 purificado (20 ng/ml) y 528 anti-EGFR y anticuerpos de control irrelevante (20 ng/ml).
La figura 86, muestra el enlace específico de construcciones de anticuerpo 806 radioetiquetado-125! a: (A) células de glioma U87MG.de2-7 y (B) células de carcinoma A431.
La figura 87 muestra Análisis Scatchard: construcciones de anticuerpo (A) ch806 y (B) hu806 radiotiquetado-125! que enlazan a células U87MG .de2-7.
La figura 88 muestra análisis Scatchard: construcciones de anticuerpo (A) ch806 y (B) hu806 radioetiquetadas-125! que enlazan a células A431.
Las figuras 89A y 89B muestran el análisis BIAcore del enlace a epítope de péptido 287 a 302 EGFR 806 mediante (A) hu806 y (B) ch806 pasando sobre el péptido inmovilizado en concentraciones en incremento de 50nM, 100nM, 150nM, 200 nM, 250 nM y 300 nM.
Las figuras 90A y 90B muestran la Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpo transmitida por ch806- o hu806- en células A431 objetivo determinadas en (A) 1 ng/ml de cada anticuerpo en un rango de proporciones de célula efectora a objetivo (E:T = 0.78:1 a 100:1); (B) en E:T = 50:1 en un rango de concentración de cada anticuerpo (3.15 ng/ml - 10 ng/ml) en un A431 objetivo.
La figura 91, muestra el tratamiento de xenoinjertos A431 establecidos en ratones desprotegidos BALB/c. Grupos de 5 ratones recibieron una dosis de 6 x 1 mg durante 2 semanas de terapia de anticuerpo tal como se indica (flechas). Se presenta el volumen de tumor promedio ± SEM hasta el término del estudio.
La figura 92, muestra el tratamiento de xenoinjertos U87MG.de2-7 establecidos en ratones desprotegidos BALB/c.
Grupos de 5 ratones recibieron dosis de 6 x 1 mg durante 2 semanas de terapia de anticuerpo tal como se indica (flechas).
Se presentó el volumen de tumor promedio ± SEM hasta el término del estudio.
La figura 93, muestra desviaciones de valores de cambio químico de bobina aleatoria para el péptido mAb806 (A) N, (B) HN y (C) HA. El péptido se preparó en una solución H20 que contiene 5% 2H20, 70 mM NaCI y 50 mM NaP04 en pH 6.8. Todos los espectros utilizados para asignaciones de secuencias fueron adquiridos en 298K en un Bruker Avance500.
Las figuras 94A, 94B, 94C, 94D, 94E y 94F muestran las imágenes de cámara gamma de cuerpo completo del paciente 7 a) Anterior, y B) Posterior, Día 5 posterior a la infusión de 111ln-ch806. La alta captación de 1 1ln-ch806 en lesiones metastáticas en los pulmones (flechas) es evidente. C) y D) muestran las lesiones metastáticas (flechas) en la exploración CT. E) imágenes 3D SPECT de pecho, y F) imágenes transaxiales co-registradas de SPECT y CT que muestran la captación específica de 1 ln-ch806 en lesiones metastáticas.
Las figuras 95A, 95B, 95C, 95D, 95E y 95F muestran imágenes planas de la cabeza y cuello del paciente 8 obtenidas A) Día 0, B) Día 3 y C) Día 7 posteriores a la infusión de 1 ln-ch806. Se observa la actividad de recolección de sangre inicial el Día 0, y la captación de 111ln-ch806 en un astrocitoma anaplástico en el lóbulo frontal derecho que es evidente el Día 3 (flecha), e incrementa en el Día 7. La captación específica de 11 ln-ch806 está confirmada en D) imagen SPECT del cerebro (flecha), en el sitio de tumor (flecha) evidente en E) 18F-FDG PET, y F) MRI.
Las figuras 96A, 96B, 96C y 96D muestran captación similar de 111ln-ch806 en tumor que es evidente en el Paciente 3 en comparación con el paciente 4, a pesar de las diferencias en la expresión de antígeno 806 en muestras de tumor clasificadas. A) localización 111ln-ch806 en metástasis de pulmón (flecha) en imagen transaxial SPECT en el Paciente 4, con actividad evidente de recolección de sangre cardíaca (B).
B) exploración CT correspondiente. Se muestra el tumor archivado teniendo <10% de positividad para la expresión 806.
C) La localización 1 1ln-ch806 en metástasis de pulmón (flecha) en el Paciente 3, con actividad evidente de recolección de sangre cardíaca (B). D) Exploración CT correspondiente. Se mostró el tumor archivado para tener 50 a 75% de positividad para la expresión 806.
La figura 97, muestra las farmacocinéticas de población recolectadas de proteína ch806 medidas mediante ELISA. ch806 observado y anticipado (%ID/L) tiempo post infusión (horas).
Las figuras 98A y 98B muestran resultados de pacientes individuales para A) Despeje de Cuerpo Completo Normalizado y B) Despeje Hepático de 111ln-ch806 en los niveles de dosificación 5 mg/m2 (¦), 10 mg/m2 (A), 20 mg/m2 (?), y 40 mg/m2 (?). La regresión lineal para los conjuntos de datos se indica en cada panel [A) r2= 0.9595; B) r2 = 0.9415].
Descripción Detallada de la Invención De acuerdo con la presente invención, se puede emplear biología, microbiología molecular convencional y técnicas de ADN recombinante dentro de las habilidades en la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Ver por ejemplo la Publicación de Sambrook y asociados, "Clonación Molecular: Manual de Laboratorio" (1989); "Protocolos Actuales en Biología Molecular" volúmenes l-E [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Biología celular: Manual de Laboratorio" Volúmenes l-lll [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Protocolos Actuales en Inmunología" Volúmenes I a III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Síntesis de Oligonucleótido" (M. J. Gait ed. 1984); "Hibridación de Ácido Nucleico" [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]; "Transcripción y Traducción" [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; "Cultivo Celular de Animales" [R. I. Freshney, ed. (1986)]; "Células Inmovilizadas de Enzimas" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "Guía Práctica para Clonación Molecular" (1984).
Tal como se utiliza en la presente invención, se considera que los siguientes términos tienen, sin limitación, las definiciones proporcionadas.
El término "miembro de enlace específico" describe un miembro de un par de moléculas que tienen especificidad de enlace una con la otra. Los miembros de un par de enlace específico pueden ser derivados naturalmente o producidos completa o parcialmente en forma sintética. Un miembro del par de moléculas tiene un área en su superficie, o cavidad, que enlaza en forma específica a, y por consiguiente es complementario a una organización espacial y polar particular del otro miembro del par de moléculas. Por lo tanto, los miembros del par tienen la propiedad de enlazar específicamente una a la otra. Los ejemplos de tipos de pares de enlace específico son antígeno-anticuerpo, biotina-avidina, receptor de hormona-hormona, receptor-ligando, enzima-substrato. La presente solicitud se refiere a reacciones tipo antígeno-anticuerpo.
El término "expresión aberrante" en sus diversas formas gramaticales, puede significar e incluir cualquier expresión elevada o alterada o sobreexpresión de una proteína en un tejido, por ejemplo, un incremento en la cantidad de una proteína, originado por cualquier medio incluyendo expresión o traducción mejorada, modulación del promotor o regulador de la proteína, amplificación de un gen para la proteína, o vida media o estabilidad mejorada, de modo que exista más de la proteína o pueda ser detectada en cualquier momento, en contraste con un estado no sobreexpresado. La expresión aberrante incluye y contempla cualquier escenario o alteración, en donde la expresión de proteína o maquinaria de modificación posttraducción en una célula se grava o interrumpe de otra manera debido a la expresión mejorada o niveles incrementados o cantidades de una proteína, incluyendo en donde una proteína alterada, como una proteína o variante mutada debido a la alteración, eliminación o inserción de secuencia o doblez alterado se expresa.
Es importante apreciar que el término "expresión aberrante" ha sido elegido en forma específica en la presente invención para comprender el estado en donde las cantidades/niveles anormales (normalmente incrementado) de la proteína están presentes, sin importar la causa eficiente de dicha cantidad o nivel anormal. Por lo tanto, las cantidades anormales de proteína pueden resultar de la sobreexpresion de la proteína en la ausencia de la amplificación de gen, lo cual es el caso por ejemplo en muchas muestras de tejido/células tomadas de cabeza y cuello de sujetos con cáncer, en tanto que otras muestras exhiben niveles de proteína anormales atribuibles a la amplificación de gen.
En esta última conexión, parte de la operación de los inventores que se presenta en la presente invención para ilustrar la misma, incluyen análisis de muestras, ciertas de las cuales exhiben niveles de proteína anormales que resultan de la amplificación de EFGR. Esta por consiguiente abarca la presentación en la presente invención de descubrimientos experimentales en donde se hace referencia a la amplificación y para el uso de los términos "amplificación/amplificado" y similares en la descripción de niveles anormales de EFGR.
Sin embargo, es la observación de las cantidades o niveles anormales de la proteína, lo que define el ambiente o circunstancia en donde la intervención clínica, tal como mediante recurrir a los miembros de enlace de la presente invención se contempla, y por esta razón, la presente especificación considera que el término "expresión aberrante" captura en forma más amplia el ambiente casual que produce la normalidad correspondiente en niveles EFGR.
Por consiguiente, los términos "sobreexpresión" y "amplificación" en sus diversas formas gramaticales se entiende que tienen distintos significados técnicos, serán considerados equivalentes entre sí, ya que representan el estado en donde están presentes niveles de proteína EFGR anormales dentro del contexto de la presente invención. En consecuencia, el término "expresión aberrante" ha sido elegido ya que se considera que incorpora los términos "sobreexpresión" y "amplificación" dentro de su alcance para los propósitos de la presente invención, de modo que todos los términos pueden ser considerados equivalentes entre sí tal como se utiliza en la presente invención.
El término "anticuerpo" describe una inmunoglobulina ya sea natural o parcial o completamente producida en forma sintética. El término también cubre cualquier polipéptido o proteína que tiene un dominio de enlace, el cual es, o es homólogo a, un dominio de enlace de anticuerpo. Los anticuerpos injertados CDR también se contemplan a través de este término.
Ya que los anticuerpos pueden ser modificados en una cantidad de formas, el término "anticuerpo" debe ser construido como cubriendo cualquier miembro de enlace específico o sustancia que tenga un dominio de enlace con la especificidad requerida. Por lo tanto, este término cubre fragmentos de anticuerpos, derivados, equivalentes funcionales u homólogos de anticuerpo, incluyendo cualquier polipéptido que comprende un dominio de enlace de inmunoglobulina, ya sea natural o completa o parcialmente sintético. Las moléculas quiméricas que comprende un dominio de enlace de inmunoglobulina, o equivalente, fusionadas a otro polipéptido por consiguiente están incluidas. La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describe en las Publicaciones de Patente EP-A-0120694 y EP-A-0125023 y en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,816,397 y 4,816,567.
Se ha mostrado que los fragmentos de un anticuerpo total pueden desempeñar la función de antigenos de enlace. Los ejemplos de fragmentos de enlace son (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un anticuerpo simple; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. y asociados, (1989) Nature 341,544-546) que consiste en un dominio VH; (v) regiones aisladas CDR; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados (vii) moléculas Fv de cadena simple (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL se enlazan a través de un enlazador de péptido que permite a los dos dominios asociarse para formar un sitio de enlace de antígeno (Bird y asociados, (1988) Science. 242,423-426; Huston y asociados, (1988) PNAS USA. 85,5879-5883); (viii) fragmentos de anticuerpo multivalente (scFv dímeros, trímeros y/o tetrámeros (Power y Hudson (2000) J. Immunol. Methods 242, 193-204) (ix) dímeros Fv de cadena simple biespecífica (PCT7US92/09965) y (x) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante fusión de gen (W094/13804; P. Holliger y asociados, (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90,6444-6448). c Un "sitio de combinación de anticuerpo" es la porción estructural de una molécula de anticuerpo comprendida de regiones de cadena ligera o regiones variables e hipervariables de cadena pesada o ligera que enlazan específicamente al antígeno.
La frase "molécula de anticuerpo" en sus diversas formas gramaticales, tal como se utiliza en la presente invención contempla tanto una molécula de ¡nmunoglobulina intacta como una porción inmunológicamente activa de una molécula de ¡nmunoglobulina.
Las moléculas de anticuerpo del ejemplo son moléculas de ¡nmunoglobulina intactas, molécula de ¡nmunoglobulina sustancialmente intactas y las porciones de una molécula de ¡nmunoglobulina que contiene el paratope, incluyendo las porciones conocidas en la técnica como Fab, Fab', F(ab') Z y F(v), cuyas porciones son preferidas para utilizarse en los métodos terapéuticos aquí descritos.
Los anticuerpos también pueden ser biespecíficos, en donde un dominio de enlace del anticuerpo es un miembro de enlace específico de la presente invención, y el otro dominio de enlace tiene una especificidad diferente, por ejemplo, reclutar una función efectora o similar. Los anticuerpos biespecíficos de la presente invención incluyen en donde un dominio de enlace del anticuerpo es un miembro de enlace específico de la presente invención, incluyendo un fragmento del mismo, y el otro dominio de enlace es un anticuerpo o fragmento distinto del mismo, incluyendo el de un anticuerpo anti-EGFR distinto, por ejemplo anticuerpo 528 (Patente Norteamericana No. 4,943,533), el anticuerpo 225 quimérico y humanizado (Patente Norteamericana No. 4,943,533 y WO/9640210), y el anticuerpo anti-de2-7 tal como DH8.3 (Hills, D. y asociados (1995) Int. J. Cáncer. 63(4), 537-543), anticuerpo L8A4 y Y10 (Reist, CJ y asociados, (1995) Cáncer Res. 55 (19):4375-4382; Foulon CF y asociados, (2000) Cáncer Res. 60 (16):44534460), ICR62 (Modjtahedi H y asociados, (1993) Cell Biophys. Enero-Junio; 22 (1-3):129-46; Modjtahedi y asociados, (2002) P. A. A. C. R. 55 (14):3140-3148, o el anticuerpo de Wikstrand y asociados (Wikstrand C. y asociados (1995) Cáncer Res. 55 (14):3140-3148). El otro dominio de enlace puede ser un anticuerpo que reconoce o dirige un tipo de célula particular, como en un anticuerpo específico de célula neural o glial. En los anticuerpos biespecíficos de la presente invención, el dominio de enlace del anticuerpo de la presente invención puede combinarse con otros dominios de moléculas de enlace que reconocen receptores de célula particular y/o modulan células en una forma particular, como por ejemplo un modulador inmune (por ejemplo, interleucina(s)), un modulador de crecimiento o citocina (por ejemplo, factor de necrosis de tumor (TNF), y particularmente, la modalidad biespecífica TNF, demostrada en U.S.S.N. 60/355,838 presentada el 13 de febrero del 2002, incorporada a la presente invención en su totalidad) o una toxina (por ejemplo ricina) o un agente anti-mitótico o apoptótico o factor.
Las pociones Fab y F(ab')2 de las moléculas de anticuerpo pueden prepararse a través de las reacción proteolítica de papaína y pepsina, respectivamente en moléculas de anticuerpo sustancialmente intactas a través de métodos que son bien conocidos. Ver por ejemplo la Patente Norteamericana No. 4,342,566 de Theofilopolous y asociados. Las porciones de moléculas de anticuerpo Fab' también son bien conocidas y se producen a partir de porciones F(ab')2 seguido de la reducción de los enlaces de disulfuro que enlazan a las dos porciones de cadena pesada como con el mercaptoetanol , y seguido de alquilación del mercaptano de proteína resultante con un reactivo tal como yodoacetamida. La presente invención se prefiere a un anticuerpo que contiene moléculas de anticuerpo intacto.
La frase "anticuerpo monoclonal" en sus diversas formas gramaticales se refiere a un anticuerpo que tiene únicamente una especie de sitio de combinación de anticuerpo con la capacidad de inmunoreaccionar con un antígeno particular. Por lo tanto, un anticuerpo monoclonal normalmente despliega una afinidad de enlace simple para cualquier antígeno con el cual inmunoreacciona. Un anticuerpo monoclonal también puede contener una molécula de anticuerpo que tiene una pluralidad de sitios de combinación de anticuerpo, cada uno inmunoespecífico para un diferente antígeno, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal biespecífico (quimérico).
El término "dominio de enlace de antígeno" describe la parte de un anticuerpo que comprende el área que enlaza específicamente a, y que es complementaria a la parte o a todo el antígeno. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo puede enlazar una parte particular del antígeno únicamente, cuya parte es denominada un epítope. Se puede proporcionar un dominio de enlace de antígeno a través de uno o más dominios variables de anticuerpo. Preferentemente, un dominio de enlace de antígeno comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH).
La "modificación post-traducción" puede comprender cualquiera de, o una combinación de modificación(s) incluyendo modificación covalente, en donde una proteína que pasa por traducción está completa, y después de ser liberada del ribosoma o en el polipéptido naciente en forma co-traducción. La modificación posterior a la traducción incluye, pero no se limita a fosforilación, miristilación, ubiquitinación, glucosilación, adhesión de coenzima, metilación y acetilación. La modificación post-traducción puede modular o influenciar la actividad de una proteína, su destino intracelular o extracelular, su estabilidad o vida media y/o su reconocimiento mediante ligandos, receptores u otras proteínas. Puede ocurrir la modificación post-traducción en organelos celulares, en el núcleo o citoplasma o en forma extracelular.
El término "específico" se puede utilizar para referirse a la situación en la cual un miembro de un par de miembro específico no muestra cualquier enlace significativo a moléculas además de su parte(s) enlace específica. El término también aplica cuando, por ejemplo, un dominio de enlace de antígeno es específico para un epítope particular que es llevado por un número de antígenos, en cuyo caso el miembro de enlace específico que lleva el dominio de enlace de antígeno tendrá la capacidad de enlazar a los diversos antígenos que llevan el epítope.
El término "comprende" utilizado de manera general en el sentido que incluye, es para decir que permite la presencia de una o más características o componentes.
El término "consiste esencialmente en" se refiere a un producto, particularmente una secuencia de péptido, de un número de residuos definido que no se adhieren en forma covalente a un producto más grande. En el caso del péptido de la presente invención referido anteriormente, los expertos en la técnica apreciarán que se pueden contemplar, sin embargo modificaciones menores al N- o C-terminal del péptido, tal como la modificación química de la terminal para agregar un grupo de protección o similar, por ejemplo la amidación del término-C.
El término "aislado" se refiere al estado en el cual estarán los miembros de enlace específico de la presente invención, o el ácido nucleico que codifica dichos miembros de enlace, de acuerdo con la presente invención. Los miembros de ácido nucleico estarán libres o sustancialmente libres de material con el cual sean asociados naturalmente tal como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los cuales se encuentran en su ambiente natural, o el ambiente en el cual se preparan (por ejemplo cultivo celular) cuando dichas preparaciones mediante tecnología de AD recombinante practicaba in vitro o in vivo. Los miembros de ácido nucleico pueden formularse con diluyentes o adyuvantes y aún para propósitos prácticos aislantes, por ejemplo, los miembros serán mezclados normalmente con gelatina u otros transportadores y se utiliza para recubrir placas de microtitulación para utilizarse en inmunoensayos, o se mezclarán con transportadores o diluyentes farmacéuticamente aceptable cuando se utilizan en diagnóstico o terapia. Los miembros de enlace específico pueden ser glucosilados, ya sea naturalmente o por sistemas de células eucarióticas heterólogas, o pueden ser (por ejemplo, si se producen mediante expresión en una célula preocariótica) no glucosilados.
Asimismo, tal como se utiliza en la presente invención, los términos "glucosilación", y "glucosilado" incluyen y comprenden la modificación pos-traducción de proteínas, denominadas, glucoproteínas, mediante la adición de oligosacáridos. Los oligosacáridos se agregan en sitios de glucosilación en glucoproteínas, particularmente incluyendo oligosacáridos enlazados-N u oligosacáridos enlazados-0. Los oligosacáridos enlazados-N se agregan a un residuo Asn, particularmente en donde el residuo Asn está en la secuencia N-X-S/T, cuando X no puede ser Pro o Asp, y son los más comúnmente encontrados en glucoproteínas. En la biosíntesis de glucoproteínas enlazadas-N, se forma primero un oligosacárido tipo mañosa de alto nivel (generalmente comprendido de dolicol, N-acetilglucosamina, mañosa y glucosa, en el retículo endoplásmico (ER). Las glucoproteínas tipo mañosa de alto nivel posteriormente son transportadas del ER al Golgi, en donde se procesan en forma adicional y ocurre la modificación de los oligosacáridos. Los oligosacáridos enlazados-0 se agregan al grupo hidroxilo de residuos Ser o Thr. En oligosacáridos enlazados-O, se transfiere primero la N-acetilglucosamina al residuo Ser o Thr mediante N-acetilglucosaminiltransferasa en el ER. Posteriormente la proteína se mueve al Golgi, en donde ocurre la modificación y elongación de cadena adicional. Pueden ocurrir modificaciones enlazadas-O con la adición simple del monosacárido OGIcNAc solo en los sitios Ser o Thr que también pueden ser bajo diferentes condiciones fosforilados, en lugar de glucosilados.
Tal como se utiliza en la presente invención, "pg" significa picogramo, "ng" significa nanogramo, "ug" o "µ" significa microgramo, "mg" significa miligramo, "ul" o "µ?" significa microlitro, "mi" significa mililitro, "I" significa litro".
Los términos "806 anticuerpo", "mAb806", "ch806", y cualesquiera variaciones no descritas en forma especifica, se pueden utilizar en la presente invención de manera intercambiable, es tal como se utiliza a lo largo de la presente solicitud y las reivindicaciones, se refiere a material proteináceo incluyendo proteínas simples o múltiples, y que extienden a las proteínas que tienen los datos de secuencia de aminoácido aquí descritos y presentados en las SEC ID NO:2 y SEC ID NO:4, y el anticuerpo quimérico ch806 el cual está incorporado, y forma una parte de las SEC ID NOS:7 y 8, y el perfil de actividades establecida en la presente invención y en las Reivindicaciones. Por consiguiente, se contemplan de igual manera las proteínas que despliegan actividad sustancialmente equivalente o alterada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo, tal como modificaciones obtenidas a través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como los obtenidos a través de mutaciones en huéspedes que son productores del complejo o sus subunidades nombradas. Asimismo, los términos "anticuerpo806", "mAb806" y "ch806" pretenden incluir dentro de su alcance proteínas mencionadas específicamente en la presente invención así como todos los análogos sustancialmente homólogos y variaciones alélicas.
Los términos "anticuerpo 806 humanizado", "hu806", y "anticuerpo 806 chapeado" y cualesquiera variantes descritas en forma específica, se pueden utilizar en la presente invención en forma intercambiable, y tal como se utiliza a lo largo de la presente solicitud y reivindicaciones, se refiere a material proteináceo que incluye proteínas simples o múltiples, y que extienda las proteínas que tiene los datos de secuencia de aminoácido descritos y presentados en las SEC ID NO:42 y SEC ID NO:47, y el perfil de actividades establecida en la presente invención y en las Reivindicaciones. Por consiguiente, las proteínas que despliegan actividad sustancialmente equivalente o alterada de igual manera están contempladas. Otras modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo, tal como modificaciones obtenidas a través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como las obtenidas a través de mutaciones en huéspedes que son productores del complejo o sus subunidades nombradas. Asimismo, los términos "anticuerpo 806 humanizado", "hu806", y "anticuerpo 806 chapeado" pretenden incluir dentro de su alcance proteínas mencionadas en forma específica en la presente invención, así como todos los análogos o variaciones alélicas sustancialmente homologas.
Los términos "anticuerpol 75" y "mAb175", y cualesquiera variantes no descritas en forma específica, se pueden utilizar en la presente invención en forma intercambiable, y tal como se utiliza a lo largo de la presente solicitud y reivindicaciones, se refiere a material proteináceo incluyendo proteínas simples o múltiples, y que extienden a las proteínas que tienen los datos de secuencia de aminoácido aquí descritos y presentados en las SEC ID NO:129 y SEC ID NO:134, y el perfil de actividades establecida en la presente invención y en las Reivindicaciones. Por consiguiente, las proteínas que despliegan actividad sustancialmente equivalente o alterada de igual manera están contempladas. Otras modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo, tal como modificaciones obtenidas a través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como las obtenidas a través de mutaciones en huéspedes que son productores del complejo o sus subunidades nombradas.
Asimismo, los términos "anticuerpo 175" y "mAb175" pretenden incluir dentro de su alcance proteínas mencionadas en forma específica en la presente invención, así como todos los análogos o variaciones alélicas sustancialmente homologas.
Los términos "anticuerpol 24" y "mAb124", y cualesquiera variantes no descritas en forma específica, se pueden utilizar en la presente invención en forma intercambiable, y tal como se utiliza a lo largo de la presente solicitud y reivindicaciones, se refiere a material proteináceo incluyendo proteínas simples o múltiples, y que extienden a las proteínas que tienen los datos de secuencia de aminoácido aquí descritos y presentados en las SEC ID NO:22 y SEC ID NO:27, y el perfil de actividades establecida en la presente invención y en las Reivindicaciones. Por consiguiente, las proteínas que despliegan actividad sustancialmente equivalente o alterada de igual manera están contempladas. Otras modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo, tal como modificaciones obtenidas a través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como las obtenidas a través de mutaciones en huéspedes que son productores del complejo o sus subunidades nombradas. Asimismo, los términos "anticuerpo 124" y "mAb124" pretenden incluir dentro de su alcance proteínas mencionadas en forma específica en la presente invención, así como todos los análogos o variaciones alélicas sustancialmente homologas.
Los términos "anticuerpo 1133" y "mAb 133", y cualesquiera variantes no descritas en forma específica, se pueden utilizar en la presente invención en forma intercambiable, y tal como se utiliza a lo largo de la presente solicitud y reivindicaciones, se refiere a material proteináceo incluyendo proteínas simples o múltiples, y que extienden a las proteínas que tienen los datos de secuencia de aminoácido aquí descritos y presentados en las SEC ID NO:32 y SEC ID NO:37, y el perfil de actividades establecida en la presente invención y en las Reivindicaciones. Por consiguiente, las proteínas que despliegan actividad sustancialmente equivalente o alterada de igual manera están contempladas. Otras modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo, tal como modificaciones obtenidas a través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como las obtenidas a través de mutaciones en huéspedes que son productores del complejo o sus subunidades nombradas. Asimismo, los términos "anticuerpo 11133" y "mAb1133" pretenden incluir dentro de su alcance proteínas mencionadas en forma específica en la presente invención, así como todos los análogos o variaciones alélicas sustancialmente homologas.
Los residuos de aminoácido aquí descritos es preferible que estén en la forma isomérica "L". Sin embargo, los residuos en la forma isomérica "D" pueden ser sustituidos para cualquier residuo de L-aminoácido, siempre que la propiedad funcional deseada del enlace-inmunoglobulina sea retenida por el polipéptido. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el término amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el término carboxi de un polipéptido. Para mantener la nomenclatura de polipéptido estándar, J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969), las abreviaturas para los residuos de aminoácido se muestran en la siguiente tabla de Correspondencia: Tabla de Correspondencia Símbolo Aminoácido 1 -letra 3 letras Y Tyr Tirosina G Gly glicina F Phe fenilalanina M Met metionina A Ala alanina S Ser Serina I He isoleucina L Leu leucina T Thr treonina V Val valina P Pro prolina K Lys lisina H His histidina Q Gln glutamina E Glu ácido glutámico W Trp triptofan R Arg arginina D Asp ácido aspártico N Asn Aspargina C Cys cisteina Se debe observar que las secuencias de residuos de aminoácido estando presentadas en la presente invención a través de las fórmulas cuya orientación izquierda y derecha está en la dirección convencional del término amino al término- carboxi. Además deberá observarse que un punto al comienzo o al final de una secuencia de residuo de aminoácido indica un enlace de péptido para una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácido. La tabla anterior se presenta para correlacionar las mutaciones de tres letras y una letra que pueden aparecer en forma alternativa en la presente invención.
Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de réplica de ADN in vivo; por ejemplo, tiene la capacidad de réplica bajo su propio control.
Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido al cual otro segmento de ADN puede ser adherido para llevar la réplica del segmento adherido.
Un "molécula de ADN" se refiere a la forma polimérica de desoxiribonucleótidos (adenina, guanina, timina, o citosina) ya sea en su forma de hebra simple, o su hélice de hebra doble. Este término se refiere únicamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a cualesquiera en forma terciarias particulares. Por lo tanto, este término incluye ADN de hebra doble encontrado, inter alia, en moléculas de ADN lineal (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. En la descripción de la estructura de moléculas de ADN de hebra doble particulares, se pueden describir secuencias en la presente invención de acuerdo con la convención normal para proporcionar únicamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la hebra no transcrita de ADN (por ejemplo, la hebra que tiene una secuencia homologa al mARN ).
Una "origen de réplica" se refiere a las secuencias de ADN que participan en la síntesis de ADN.
Una "secuencia de codificación" de ADN es una secuencia de ADN de hebra doble que se transcribe y traduce en un polipéptido ¡n vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas. Los límites de las secuencias de codificación son determinados por un codón de inicio en el término 5" (amino) y un codón de detención de traducción en el término 3' (carboxilo). Una secuencia de codificación puede incluir, pero no se limita a secuencias procarióticas, cADN de mARN eucariótico, secuencias de ADN genómicas de ADN eucariótico (por ejemplo mamífero) e incluso secuencias de ADN sintética. Normalmente una secuencia de terminación de transcripción y señal de poliadenilación que será localizada 3' para la secuencia de codificación.
Las secuencias de control de transcripción y traducción son secuencias reguladoras de ADN, tal como promotores, au mentadores, señales de poliadenilación, terminadores y similares que proporcionan la expresión de una secuencia de codificación en una célula huésped.
Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN con la capacidad de enlazar polimerasa de ARN en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación de corriente descendente (dirección 3'). Para los propósitos de definir la presente invención, la secuencia promotora se enlaza en su 3'término a través del sitio de inicio de transcripción y se extiende a la corriente ascendente (dirección 5") para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción en niveles detectables arriba del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de transcripción (dependiendo en forma conveniente mapeando con nucleasa S1), y como dominios de enlace de proteína (secuencias de consenso) responsables del enlace de polimerasa de ARN. Los promotores eucarióticos con frecuencia, pero no siempre contendrán cuadros "TATA" y cuadros "CAT". Los promotores procarióticos contienen secuencias Shine Dalgarno además de las secuencias de consenso -10 y -35.
Una "secuencia de control de expresión" es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y traducción de otra secuencia de ADN. Una secuencia de codificación está "bajo el control" de las secuencias de control de transcripción y traducción en una célula cuando la polimerasa de ARN transcribe la secuencia de codificación en mARN, la cual posteriormente se traduce en la proteína codificada por la secuencia de codificación.
Una "secuencia de señal" puede incluirse antes de la secuencia de codificación. Esta secuencia codifica un péptido de señal, N-terminal para el polipéptido, que se comunica con la célula huésped para dirigir el polipéptido a la superficie celular o secretar el polipéptido en el medio, y su péptido de señal es recortada por la célula huésped antes de que la proteína abandone la célula. Las secuencias de señal se pueden encontrar asociadas con una variedad de proteínas nativas para procariotos y eucariotos.
El término "oligonucleótido", tal como se utiliza en la presente invención en referencia a la sonda de la presente invención, se define como una molécula comprendida de dos o más ribonucleótidos, preferentemente más de tres. Su tamaño y tacto dependerá de muchos factores, los cuales a su vez, dependen de la función y uso final del oligonucleótido.
El término "cebador" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un oligonucleótido, ya que ocurre naturalmente como en una digestión de restricción purificada o se produce en forma sintética, que tiene la capacidad de actuar como un punto de inicio de síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las cuales se induce la síntesis de un producto de extensión de sebador, que es complementario a una hebra de ácido nucleico, es decir, en la presencia de nucleótidos y un agente de inducción tal como polimerasa de ADN y a una temperatura y pH adecuados. El cebador puede ser ya sea de hebra simple o hebra doble y debe ser lo suficientemente largo para imprimar la síntesis del producto de extensión deseado en la presencia del agente de inducción. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, incluyendo temperatura, fuente del cebador y uso del método. Por ejemplo, para situaciones del diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia objetivo, el cebador de oligonucleótido contiene normalmente 15 a 25 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos.
Los cebadores en la presente invención, se seleccionan para ser "sustancialmente" complementarios a diferentes hebras de una secuencia de ADN objetivo particular. Esto significa que los cebadores deben ser lo suficientemente complementarios para hibridar con sus hebras respectivas. Por consiguiente, la secuencia de cebador no necesita reflejar la secuencia exacta de la plantilla. Por ejemplo, se puede adherir un fragmento de nucleótido no complementario al extremo 5' del cebador, con el resto de la secuencia cebadora siendo complementaria para la hebra. Como alternativa, se pueden dispersar internamente en el cebador bases no complementarias o secuencias más largas, siempre que la primera secuencia tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la hebra, para hibridar con la misma y de esta manera formar la plantilla para la síntesis del producto de extensión.
Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "endonucleasa de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta el ADN de hebra doble en o cerca de la frecuencia de nucleótido específica .
Una célula ha sido "transformada" mediante ADN exógeno o heterólogo cuando dicho ADN ha sido introducido dentro de la célula. El ADN de transformación puede o no estar integrado (enlazado en forma covalente) en el ADN cromosomal, haciendo el genoma de la célula. En células procariotas, de levadura y mamífero, por ejemplo, el ADN de transformación puede mantenerse en un elemento episomal, tal como un plásmido. Con respecto a las células eucarióticas, una célula transformada en forma estable es una en la cual el ADN de transformación ha quedado integrado en un cromosoma de modo que es heredado por las células hijas a través de la réplica de cromosoma. Esta estabilidad se demuestra a través de la capacidad de la célula eucariótica para establecer líneas o clones celulares comprendidos de una población de células hijas que contienen el ADN de transformación. Un "clon" es una población de células derivadas de una célula simple o ancestro común mediante mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que tiene la capacidad de crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones.
Dos secuencias de ADN son "sustancialmente homologas" cuando al menos aproximadamente el 75% (preferentemente al menos aproximadamente 80%, y más preferentemente al menos aproximadamente 90% o 95%) de los nucleotidos coinciden con la longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homologas pueden ser identificadas comparando la secuencias utilizando un software estándar disponible en bancos de datos de secuencia, o en un experimento de hibridación Southern, por ejemplo, bajo condiciones estrictas tal como se define para dicho sistema en particular. La definición de las condiciones de hibridación adecuadas está dentro de las habilidades en la técnica. Ver por ejemplo la Publicación de Maniatis y asociados, supra; Clonación de ADN, Volúmenes I & II, supra; Hibridación de Ácido Nucleico, supra.
Deberá apreciarse que también está dentro del alcance de la presente invención secuencias de ADN que codifica un miembro de enlace específico (anticuerpos) de la presente invención, que codifican para anticuerpos que tienen las secuencias descritas pero que se degeneran a dichas secuencias. Por el término "degenerar a" se entiende que se utiliza un codón de tres letras diferentes para especificar un aminoácido particular. Es bien sabido en la técnica que se pueden utilizar los siguientes codones en forma intercambiable para codificar cada aminoácido específico.
Fenilalanina (Fe o F) UUUoUUC Leucina (Leu o L) UUA o UUG o CUU o CUC o CUA o CUG Isoleucina (He o I) AUU o AUC o AUA Metionina (Met o M) AUG Valina (Valor V) GUUoGUCdeGUAoGUG Serina (Ser o S) UCU o UCC o UCA o UCG o AGU o AGC Prolina (Pro o P) CCU o CCC o CCA o CCG Treonina (Thr o T) ACU o ACC o ACA o ACG Alanina (Ala o A) GCU o GCG o GCA o GCG Tirosina (Tyr o Y) UAU o UAC Histidina (His o H) CAU o CAC Glutamina (Gln o Q) CAA o CAG Asparagina (Asn o N) AAUo AAC Usina (Lys o K) AAAo AAG Ácido aspártico (Asp o GAU o GAC Ácido glutámico (Glu o GAA o GAG Cisteína (Cys o C) UGU o UGC Arginina (Arg o R) CGU o CGC o CGA o CGG o AGA o AGG Glicina (Gly o G) GGU o GGC o GGA o GGG Triptofan (Trp o W) UGG Codón de terminación UAA (ocre) o UAG (ámbar) o UGA (opal) Deberá quedar entendido que los codones específicos anteriormente son para secuencias de ARN. Los codones correspondientes para ADN tienen una T sustituida por una U.
Se pueden realizar mutaciones, por ejemplo, en secuencias descritas de anticuerpos de la presente invención, de modo que se cambie un codón particular a un codón que codifica un diferente aminoácido. Dicha mutación generalmente se elabora elaborando los menos posibles cambios de nucleótido. Una mutación de sustitución de esta clase puede realizarse para cambiar un aminoácido en la proteína resultante en una forma no conservadora (por ejemplo cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tienen un tamaño o característica particular a un aminoácido que pertenece a otra agrupación) o en una forma conservadora (por ejemplo, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a una agrupación de aminoácidos que tienen un tamaño o característica particular a un aminoácido que pertenece a la misma agrupación). Dicho cambio conservador generalmente conduce a menos cambio en la estructura y función de la proteína resultante. Es más probable que un cambio no conservador altere la estructura, actividad o función de la proteína resultante. La presente invención debe considerarse que incluye secuencias que contienen cambios conservadores que no alteran significativamente la actividad o características de enlace de la proteína resultante.
A continuación se encuentra un ejemplo de diversos grupos de aminoácidos.
Aminoácidos con grupos R no polares Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina, Prolina, Fenilalanina, Triptofan, Metionina Aminoácidos con grupos R polares no cargados Glicina, Serina, Treonina, Cisteína, Tirosina, Asparagina, Glutamina Aminoácidos con grupos R polares cargados (cargados en forma negativa en 6.0) Ácido aspártico, ácido glutámico, Aminoácidos básicos (cargados en forma positiva en 6.0) Lisina, Arginina, Histidina (en pH 6.0) Otra agrupación puede ser de aminoácidos con grupos fenilo: Fenilalanina, Triptofan, Tirosina Otra agrupación puede ser de acuerdo con el peso molecular (por ejemplo tamaño de grupos R): Glicina 75 Alanina 89 Serina 105 Prolina 115 Valina 117 Threonina 119 Cisteína 121 Leucina 131 Isoleucina 131 Asparagina 132 Ácido aspártico 133 Glutamina 146 Usina 146 Ácido glutámico 147 Metionina 149 Histidina (en pH 6.0) 155 Fenilalanina 165 Arginina 174 Tirosina 181 Triptofan 204 Las sustituciones particularmente preferidas son: - Lys por Arg y vice versa de modo que se pueda mantener una carga positiva; - Glu por Asp y vice versa de modo que se pueda mantener una carga negativa; Ser por Thr de modo que se pueda mantener -OH libre; y Gln por Asn de modo que se pueda mantener NH2 libre.
También se pueden introducir sustituciones de aminoácido para sustituir un aminoácido con una propiedad particularmente preferible. Por ejemplo, se puede introducir un Cys en un sitio potencial para puentes de disulfuro con otro Cys. Se puede introducir un His como un sitio particularmente "catalítico" (por ejemplo, His puede actuar como un ácido o base y es el aminoácido más común en catálisis bioquímica). Se puede introducir Pro debido a la estructura particularmente plana que induce (3 vueltas en la estructura de proteína).
Dos secuencias de aminoácido son "sustancialmente homologa cuando al menos aproximadamente el 70% de los residuos de aminoácido (preferentemente al menos el aproximadamente 80%, y lo más preferentemente al menos aproximadamente el 90 ó 95%) son idénticos, o representan sustituciones conservadoras.
Una región "heteróloga" de la construcción de ADN es un segmento identificable de ADN dentro de la molécula de ADN más grande que no se encuentra en asociación con la molécula más grande en la naturaleza. Por lo tanto, cuando la región heteróloga modifica un gen de mamífero, el gen normalmente estará flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. Otro ejemplo de una secuencia de codificación heteróloga es una construcción en donde la propia secuencia de codificación no se encuentra en la naturaleza por ejemplo un cADN en donde la secuencia de codificación genómica contiene intrones, o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes alternativos). Las variaciones alélicas o eventos de mutación que ocurren naturalmente no dan surgimiento a una región heteróloga de ADN tal como se define en la presente invención.
La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y normalmente no producen una reacción alérgica o similar, tal como naúsea gástrica, mareo y similares, cuando se administra a un humano. La frase "cantidad terapéuticamente efectiva" se utiliza en la presente invención para significar una cantidad suficiente para evitar, y preferentemente reducir en al menos aproximadamente el 30%, preferentemente al menos el 50%, preferentemente al menos el 70%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90%, un cambio clínicamente significativo en el crecimiento o progreso o actividad mitótica de una masa celular objetivo, grupo de células de cáncer de tumor, u otra característica de patología. Por ejemplo, se puede reducir el grado de la activación EGFR o actividad o cantidad o número de células positivas EGFR, particularmente del anticuerpo o miembro de enlace reactivo o células positivas.
Una secuencia de ADN está "enlazada en forma operativa" a una secuencia de control de expresión cuando la secuencia de control de expresión controla y regula la transcripción y traducción de dicha secuencia de ADN. El término "enlazado en forma operativa" incluye que tiene una señal de inicio adecuada (por ejemplo, ATG) al frente de la secuencia de ADN que será expresada y mantiene el cuadro de lectura correcto para permitir la expresión de la secuencia de ADN bajo el control de la secuencia de control de expresión y la producción del producto deseado codificado por la secuencia de ADN. Si un gen que se desea insertar en una molécula de ADN recombinante no contiene una señal de inicio adecuada, dicha señal de inicio puede insertarse en la parte frontal del gen.
El término "condiciones de hibridación estándar" se refiere a condiciones de sal y temperatura sustancialmente equivalentes a 5 x SSC y 65°C tanto para hibridación como lavado. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará que dichas "condiciones de hibridación estándar" dependen de condiciones particulares que incluyen la concentración de sodio y magnesio en el amortiguador, la longitud y concentración de la secuencia de nucleótido, porcentaje de desacoplamiento, porcentaje de formamida y similares. También es importante en la determinación de "condiciones de hibridación estándar" es si las dos secuencias de hibridación son ARN-ARN, ADN-ADN o ARN-ADN. Dichas condiciones de hibridación estándar son determinadas fácilmente por un experto en la técnica de acuerdo con las fórmulas bien conocidas, en donde la hibridación normalmente es a una temperatura de 10°C a 20°C debajo de la Tm anticipada o determinada con lavados de mayor rigurosidad, si se desea.
La presente invención proporciona un miembro de enlace específico novedoso, particularmente un anticuerpo o fragmento del mismo, que incluye fragmentos inmunogénicos, que reconocen un epítope EGFR, el cual se encuentra en células tumurigénicas, hiperproliferativas o anormales, en donde el epítope se aumenta o, es evidente a partir de la modificación post-traducción aberrante y es no detectable en células normales y tipo silvestre. En una modalidad particular aunque no limitante, el miembro de enlace, tal como el anticuerpo, reconoce un epítope EGFR el cual es aumentado o evidente al momento de la modificación de carbohidrato simple o glucosilación temprana, y se reduce, o no es evidente en la presencia de una modificación de carbohidrato complejo o glucosilación. El miembro de enlace específico, tal como el anticuerpo o fragmento del mismo, no enlaza a, o reconoce células normales o tipo silvestre que contienen epítope EGFR normal o tipo silvestre en la ausencia de sobreexpresión, y en la presencia de una modificación post-traducción EGFR normal.
La presente invención proporciona además anticuerpos novedosos 806, 175, 124, 1133, ch806 y hu806 y fragmentos de los mismos, incluyendo fragmentos inmunogénicos, que reconocen un epítope EGFR, particularmente el epítope EGFR (287CGADSYEMEEDGVRKC302 (SEC ID NO: 14)), el cual está expuesto en células tumorigénicas, hiperproliferativas o anormales, en donde el epítope es aumentado, revelado o evidente y no detectable en células normales o tipo silvestre. En una modalidad particular, pero no limitante, el anticuerpo reconoce un epítope EGFR que se aumenta o es evidente en la modificación de carbohidrato simple o glucosilación temprana y se reduce o no es evidente en la presencia de una modificación de carbohidrato complejo o glucosilación. El anticuerpo o fragmento del mismo no enlaza a, o reconoce células normales o tipo silvestre que contienen un epítope EGFR normal o tipo silvestre en la ausencia de sobreexpresión, amplificación o evento tumorigénico.
En un aspecto particular de la presente invención y tal como se describió anteriormente, los inventores de la presente invención han descubierto anticuerpos monoclonales novedosos 806, 175, 124, 1133, ch806 y hu806 que reconocen en forma específica EGFR tipo silvestre amplificado y el EGFR de2-7, que aún enlaza a un epítope distinto al péptido de unión única de la mutación EGFR de2-7. Además, aunque mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133 y hu806 no reconocen el EGFR tipo silvestre, normal expresado en la superficie celular de células de glioma, no enlazan al dominio extracelular del EGFR inmovilizado en la superficie de placas ELISA, indicando un epítope de conformación con un aspecto de polipéptido.
De manera importante, mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133, ch806 y hu806 no enlazan en forma específica a tejidos normales tales como hígado y piel, que expresan niveles de wtEGFR endógeno que son mayores que en la mayor parte de los otros tejidos normales, pero en donde EGFR no se sobreexpresa o amplifica. Por lo tanto mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133 y hu806 demuestran especificidad novedosa y útil, reconociendo EGFR de2-7 y EGFR amplificado, aunque no reconociendo EGFR tipo silvestre, normal o el péptido de unión único el cual es característico de EGFR de2-7. En un aspecto preferido mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133 y hu806 de la presente invención, comprenden las secuencias de aminoácido del dominio CDR de cadena VH y VL ilustradas en las figuras 14B y 15B; 74B y 75B; 51B y 51D; 52B y 52D; y 55A y 55B, respectivamente (SEC ID NOS: 210 y 4; 129 y 134; 22 y 27; 32 y 37; y 42 y 47, respectivamente; SEC ID NO: 42 incluyendo el péptido de señal de cadena hu806 VH y las secuencias de cadena VH de las SEC ID NOS: 163 y 164, respectivamente, y la SEC ID NO: 47, incluyendo el péptido de señal de cadena hu806 VL y las secuencias de cadena VL de las SEC ID NOS: 165 y 166, respectivamente).
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo con la capacidad de competir con el anticuerpo 175, bajo condiciones en las cuales al menos el 10% de un anticuerpo que tiene las secuencias de cadena VH y VL del anticuerpo 175 (SEC ID NOS: 129 y 134, respectivamente) se bloquea de enlazar mediante competición a de2-7EGFR, con dicho anticuerpo en un ensayo ELISA. Tal como se estableció anteriormente, en la presente invención se contemplan anticuerpos anti-idiotipo.
La presente invención se refiere a miembros de enlace específico, particularmente anticuerpos o fragmentos de los mismos, que reconocen un epítope EGFR que está presente en células que expresan EGFR amplificado o expresan el EGFR de2-7 y no son detectables en células que expresan EGFR tipo silvestre o normal, particularmente en la presencia de modificación postraducción normal.
Se observa en forma adicional y en la presente invención se demuestra, que una observación no limitante adicional o característica de los anticuerpos de la presente invención, es su reconocimiento de su epítope en la presencia de grupos de mañosa de alto nivel, que es característico de glucosilación temprana o modificación simple de carbohidrato. Por lo tanto, la glucosilación alterada o aberrante facilita la presencia y/o reconocimiento del epítope de anticuerpo o comprende una porción del epítope de anticuerpo.
La glucosilación incluye y comprende la modificación posttraducción de proteínas, denominadas glucoproteínas mediante la adición de oligosacáridos. Se agregan los oligosacáridos en sitios de glucosilación en glucoproteínas, incluyendo particularmente oligosacáridos enlazados-N y oligosacáridos enlazados-O. Los oligosacáridos enlazados-N se agregan a un residuo Asn, particularmente en donde el residuo Asn, está en la secuencia N-X-S/T, cuando X no puede ser Pro o Asp, y los más comunes se encuentran en glucoproteínas. En la biosíntesis de glucoproteínas enlazadas-N, se forma primero un oligosacárido tipo mañosa de alto nivel (generalmente comprendido de dolicol, N-Acetilglucosamina, mañosa y glucosa en el retículo endoplásmico (ER). Las glucoproteínas tipo mañosa de alto nivel posteriormente se transportan de ER a Golgi, en donde ocurre normalmente el procesamiento y modificación adicional de los oligosacáridos. Se agregan los oligosacáridos enlazados-0 al grupo hidroxi de los residuos Ser o Thr. Los oligosacáridos enlazados-0, N Acetilglucosamina se transfiere primero al residuo Ser o Thr mediante N Acetilglucosaminiltransferasa en el ER. Posteriormente la proteína se mueve hacia el Golgi, en donde ocurre la modificación y elongación de cadena.
En un aspecto particular de la presente invención y tal como se manifestó anteriormente, los inventores de la presente invención han descubierto anticuerpos monoclonales novedosos, ejemplificados en la presente invención a través de los anticuerpos designados mAb806 (y su ch806 quimérico), mAb175, mAb124, mAb1133 y hu806 que reconocen en forma específica el EGFR tipo silvestre amplificado y el EGFR de2-7, aún enlazando a un epítope distinto al péptido de unión única de la mutación EGFR de2-7. Los anticuerpos de la presente invención reconocen específicamente EGFR sobreexpresado , incluyendo EGFR amplificado y EGFR mutante (ejemplificado en la presente invención a través de la mutación de2-7), particularmente en la modificación post-traducción aberrante. Además, aunque estos anticuerpos no reconocen el EGFR tipo silvestre, normal expresado en la superficie celular de células de glioma, no enlazan al dominio extracelular del EGFR inmovilizado en la superficie de placas ELISA, indicando un epítope de conformación con un aspecto de polipéptido. De manera importante, estos anticuerpos no enlazan en forma específica a tejidos normales tales como hígado y piel, que expresan niveles de wtEGFR endógeno que son mayores que en la mayoría de los otros tejidos normales, pero en donde EGFR no se sobreexpresa o amplifica. Por lo tanto, estos anticuerpos demuestran especificidad novedosa y útil, reconociendo el EGFR de2-7 y EGFR amplificado, aunque no reconociendo el EGFR tipo silvestre, normal o el péptido de unión único que es característico de EGFR de2-7.
En un aspecto preferido, los anticuerpos son unos que tienen las características de los anticuerpos que los inventores han identificado y caracterizado, reconociendo en particular EGFR amplificado y EGFR de2-7. En aspectos particularmente preferidos, los anticuerpos son mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133 y hu806 o fragmentos activos de los mismos. En un aspecto preferido adicional, el anticuerpo de la presente invención comprende las secuencias de aminoácido de la cadena VH y VL ilustrada en las figuras 16 y 17; 74B y 75B; 51B y 51D; 52B y 52D; y 55A y 55B, respectivamente.
Preferentemente el epítope de miembro de enlace específico o anticuerpo se localiza dentro de la región que comprende los residuos 273 a 501 de la secuencia EGF tipo silvestre o normal madura, y preferentemente el epítope compre residuos 287 a 302 de la secuencia EGFR tipo silvestre o normal madura (SEC ID NO: 14). Por consiguiente, también se proporcionan proteínas de enlace específico, tal como anticuerpos, que enlazan al EGFR de2-7 en un epítope localizado dentro de la región que comprende los residuos 273 a 501 de la secuencia EGFR, y que comprende los residuos 287 a 302 de la secuencia EGFR (SEC ID NO: 14). El epítope puede ser determinado a través de cualquier técnica de mapeo de epítope convencional conocida para los expertos en la técnica. Como alternativa, las secuencias de ADN que codifican los residuos 273 a 501 y 287 a 302 (SEC ID NO: 14) pueden ser digeridas, y los fragmentos resultantes expresados en un huésped adecuado. Tal como se mencionó anteriormente, se puede determinar el enlace de anticuerpo.
En particular, el miembro enlazará a un epítope que comprende los residuos 273 a 501, y más específicamente que comprende los residuos 287 a 302 (SEC ID NO: 14), del EGFR tipo silvestre o normal maduro. Sin embargo, otros anticuerpos que muestran el mismo patrón de reactividad o uno sustancialmente similar, también forman un aspecto de la presente invención. Esto se puede determinar comparando dichos miembros con un anticuerpo que comprende los dominios de cadena VH y VL mostrados en las SEC ID NOS: 2 y 4; 129 y 134; 22 y 27; 32 y 37; y 42 y 47, respectivamente. La comparación normalmente se realizará utilizando un manchado Western en el cual los miembros de enlace se enlazan a manchados por duplicado preparado de una preparación nuclear de células, de modo que se pueda comparar directamente el patrón de enlace.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo con la capacidad de competir con mAb806 bajo condiciones en las cuales al menos el 10% de un anticuerpo que tiene las secuencias de cadena VH y VL de uno de dichos anticuerpos, se bloquea de enlazar al de2-7EGFR mediante la competición con dicho anticuerpo en un ensayo ELISA. Tal como se estableció anteriormente, se contempla e ilustran en la presente invención anticuerpos anti-idiotipo.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo con la capacidad de competir con mAb175, mAb124 y/o mAb1133 bajo condiciones en las cuales al menos el 10% de un anticuerpo que tiene las secuencias de cadena VH y VL de uno de dichos anticuerpos, se bloquea de enlazar a de2-7EGFR mediante la competición con dicho anticuerpo en un ensayo ELISA. Tal como se estableció anteriormente, se contemplan anticuerpos anti-idiotipo y se ilustran en la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo con la capacidad de competir con mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133 y/o hu806, bajo condiciones en las cuales al menos el 10% del anticuerpo que tiene las secuencias de cadena VH y VL de dichos anticuerpos, se bloquea de enlazar a de2-7EGFR mediante competición con dicho anticuerpo en un ensayo ELISA. Tal como se establece anteriormente, se contemplan anticuerpos anti-idiotipo y se ilustran en la presente invención.
Un polipéptido aislado que consiste esencialmente en el epítope que comprende los residuos 273 a 501 y más específicamente que comprenden los residuos 287 a 302 (SEC ID NO: 14) del EGFR tipo silvestre, maduro, forma otro aspecto de la presente invención. El péptido de la presente invención es particularmente útil en ensayos o equipo de diagnóstico y en forma terapéutica o profiláctica, incluyendo, como una vacuna anti-tumor o anti-cáncer. Por lo tanto las composiciones del péptido de la presente invención incluyen una composición farmacéutica y composiciones inmunogénicas.
Usos de Diagnóstico y Terapéuticos La especificidad única de los miembros de enlace específico, particularmente anticuerpos o fragmentos de los mismos, de la presente invención, mediante lo cual el miembro(s) de enlace reconoce un epítope EGFR que se encuentra en células tumorigénicas, hiperproliferativas o anormales, y no se detecta en células normales o tipo silvestre, y en donde el epítope se aumenta o es evidente al momento de la modificación post-traducción aberrante y en donde el miembro(s) enlaza al EGFR de2-7 y al EGFR amplificado pero no al wtEGFR, proporciona usos de diagnóstico y terapéuticos para identificar, caracterizar, dirigir y tratar, reducir o eliminar un número de tipos de células tumorigénicas y tipos de tumor, por ejemplo tumores de cabeza y cuello, seno, pulmón, vejiga o próstata y glioma, sin los problemas asociados con la captación de tejido normal que se pueden observar con los anticuerpos EGFR conocidos previamente. Por lo tanto, las células que sobreexpresan EGFR (por ejemplo, mediante amplificación o expresión de un EGFR muíante o variante), particularmente los que demuestran modificación post-traducción aberrante pueden ser reconocidos, aislados, caracterizados, dirigidos y tratados o eliminando utilizando el miembro(s) de enlace, particularmente el anticuerpo (s) o fragmentos de los mismos de la presente invención.
En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento de un tumor, o condición cancerígena, una condición precancerígena y cualquier condición relacionada con, o que resulta del crecimiento celular hiperproliferativo, en donde el método comprende la administración de mAb806, mAb175, mAb124, mAb11333 y/o hu806.
Por lo tanto, los anticuerpos de la presente invención pueden caracterizar en forma específica la naturaleza de los tumores EGFR o células tumorigénicas, manchando o reconociendo de otra forma dichos tumores o células en donde está presente la sobreexpresión de EGFR, particularmente amplificación y/o mutación EGFR, particularmente EGFR de2-7. Además, los anticuerpos de la presente invención, tal como se ejemplifica a través de mAb806 (y anticuerpo quimérico ch806), mAb175, mAb124, mAb1133 y hu806, demuestran actividad antitumor in vivo significativa contra tumores que contienen EGFR amplificado y contra xenoinjertos positivos EGFR de2-7.
Tal como se indicó anteriormente, los inventores han descubierto que el miembro de enlace específico de la presente invención, reconoce formas asociadas con tumor de EGFR (EGFR de2-7 y EGFR amplificado) pero no del receptor tipo silvestre, normal cuando se expresan en células normales. Se considera que el reconocimiento de anticuerpo depende de una modificación post-traducción aberrante (por ejemplo una variante de glucosilación, acetilación o fosforilación única) del EGFR expresado en células que exhiben sobreexpresión del gen EGFR.
Tal como se describió anteriormente, los anticuerpos de la presente invención han sido utilizados en estudios terapéuticos y muestran inhibir el crecimiento de sobreexpresión (por ejemplo, amplificado) xenoinjertos EGFR y xenoinjertos de expresión EGFR de2-7 humanos de tumores de humanos e inducen necrosis significativa dentro de dichos tumores.
Además, los anticuerpos de la presente invención inhiben el crecimiento de tumores intracraneales en un modelo preventivo. Este modelo implica inyectar células de glioma que expresan EGFR de2-7 en ratones desprotegidos, y posteriormente inyectando el anticuerpo en forma intracraneal, ya sea el mismo día o de 1 a 3 días después, opcionalmente con dosis repetidas. Las dosis de anticuerpo son en forma adecuada de aproximadamente 10 pg. Los ratones inyectados con anticuerpos son comparados con los controles, y se ha descubierto que se incrementa en forma significativa la supervivencia de los ratones tratados.
Por consiguiente, en un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento de un tumor, condición cancerígena, condición precancerígena y cualquier condición relacionada o que resulta del crecimiento de célula hiperproliferativo que comprende administración de un miembro de enlace específico de la presente invención.
Los anticuerpos de la presente invención están diseñados para ser utilizados en métodos de diagnóstico y tratamiento de tumores en sujetos humanos o animales, particularmente tumores epiteliales. Estos tumores pueden ser tumores sólidos primarios o secundarios de cualquier tipo, incluyendo pero sin limitarse a tumores de glioma, seno, pulmón, próstata, cabeza o cuello.
Miembro de Enlace y Generación de Anticuerpo La metodología general para elaborar anticuerpos monoclonales mediante hibridomas es bien conocida. También se pueden crear líneas celulares que producen anticuerpos, inmortales mediante técnicas diferentes a fusión, tal como transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico, o transfección con virus de Epstein-Barr. Ver por ejemplo la Publicación de "Técnicas de Hibridoma" (1980); Hammering y asociados, "Anticuerpos Monoclonales e Hibridomas de célula T" (1981); Kennett y asociados, "Anticuerpos Monoclonales" (1980); ver también las Patentes Norteamericanas Nos. 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,451,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; y 4,493,890.
Los paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra EFGR pueden ser clasificados por diversas propiedades; por ejemplo, isotipo, epítope, afinidad, etc. Es de particular interés los anticuerpos monoclonales que mimetizan la actividad de EFGR o sus subunidades. Dichos monoclonales pueden ser identificados fácilmente en ensayos de actividad de miembro de enlace específico. También son útiles anticuerpos de afinidad de alto nivel cuando es posible la purificación mediante inmunoafinidad de un miembro de enlace especifico nativo o recombinante.
Los métodos para producir anticuerpos anti-EFGR policlonales son bien conocidos en la técnica. Ver la Patente Norteamericana No. 4,493,795 de Néstor y asociados. Se puede preparar un anticuerpo monoclonal, que contiene normalmente porciones Fab y/o F (ab') 2 de moléculas de anticuerpo útiles, utilizando la tecnología de hibridoma descrita en Antibodies-A Laboratory Manual, Harlow and Lañe, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1988), la cual está incorporada a la presente invención como referencia. En síntesis, para formar el hibridoma del cual se produce la composición de anticuerpo monoclonal, se fusiona un mieloma u otra línea celular de auto-perpetuación con linfocitos obtenidos de bazo de un mamífero hiperinmunizado con un EFGR adecuado.
Los esplenocitos se fusionan típicamente con células de mieloma utilizando polietilenglicol (PEG) 6000. Los híbridos fusionados son seleccionados por su sensibilidad a HAT. Los hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal útil en la práctica de la presente invención son identificados por su capacidad de inmunorreaccionar con el anticuerpo o miembro de enlace de la presente invención, y su capacidad de inhibir la actividad tumorigénica hiperproliferativa específica en células objetivo.
Un anticuerpo monoclonal útil en la práctica de la presente invención, puede ser producido iniciando un cultivo de hibridoma monoclonal que comprende un medio nutriente que contiene un hibridoma que secreta moléculas de anticuerpo de especificidad de antígeno adecuada. El cultivo se mantiene bajo condiciones y durante un período de tiempo suficiente para que el hibridoma secrete las moléculas de anticuerpo en el medio. Posteriormente se recolecta él medio que contiene el anticuerpo. Las moléculas de anticuerpo posteriormente se pueden aislar a través de técnicas bien conocidas.
Los medios útiles para la preparación de estas composiciones son tanto bien conocidos en la técnica como comercialmente disponibles e incluyen medios de cultivo sintéticos, ratones de crianza interna y similares. Un medio sintético de ejemplo es el medio esencial mínimo de Dulbecco (DME ; Dulbecco y asociados, Virol. 8:396 (1959)) suplementado con 4.5 gm/1 de glucosa, 20 mm de glutamina, y 20% de suero de becerro fetal. Una cepa de ratón de crianza interna de ejemplo es la Balb/c.
Los métodos para producir anticuerpos anti-EGFR monoclonales también son conocidos en la técnica. Ver la Publicación de Niman y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80:4949-4953 (1983). Normalmente, el EGFR o el análogo de péptido se utiliza ya sea solo o conjugado con un transportador inmunogénico, como el inmunogen en el procedimiento descrito anteriormente para producir anticuerpos monoclonales anti-EGFR. Los hibridomas se clasifican por su capacidad de producir un anticuerpo que inmunorreacciona con el EGFR presente en células tumorigénicas, anormales o hiperproliferativas. Otros anticuerpos EFGR incluyen pero no se limitan al anticuerpo HuMAX-EGFr de Genmab/Medarex, el anticuerpo 108 (ATCC HB9764) y la Patente Norteamericana No. 6,217,866, y anticuerpo 14E1 de Schering AG (Patente Norteamericana No. 5,942,602).
Miembros de Enlace Recombinante. Quiméricos, Biespecíf icos v Fragmentos En general, las regiones CDR1, que comprende secuencias de aminoácido sustancialmente tal como se establece en las regiones CDR1 de las SEC ID NOS: 2 y 4; 129 y 134; 22 y 27; 32 y 37; y 42 y 47, respectivamente, se llevarán en una estructura que permite el enlace de regiones CDR1 a un antígeno de tumor. En el caso de la región CDR1 de la SEC ID NO: 4, por ejemplo, esto proporciona preferentemente a través de la región de cadena VL de SEC ID NO: 4 (y similarmente para las otras secuencias mencionadas).
En general, las regiones CDR2, que comprenden las secuencias de aminoácido sustancialmente como se establecen en las regiones CDR2 de las SEC ID NOS: 2 y 4; 129 y 134; 22 y 27; 32 y 37; y 42 y 47, respectivamente, se llevará en una estructura que permite el enlace de las regiones CDR2 a un antígeno de tumor. En el caso de la región CDR2 de SEC ID NO: 4, por ejemplo, esto se lleva preferentemente en la región de cadena VL de la SEC ID NO: 4 (y en forma similar para las otras secuencias mencionadas).
En general, las regiones CDR3, que comprenden las secuencias de aminoácido sustancialmente como se establecen en las regiones CDR3 de las SEC ID NOS: 2 y 4; 129 y 134; 22 y 27; 32 y 37; y 42 y 47, respectivamente, se llevará en una estructura que permite el enlace de las regiones CDR3 a un antígeno de tumor. En el caso de la región CDR3 de SEC ID NO: 4, por ejemplo, esto se lleva preferentemente en la región de cadena VL de la SEC ID NO: 4 (y en forma similar para las otras secuencias mencionadas).
Por el término "sustancialmente como se establece" se entiende que las regiones CDR, por ejemplo regiones CDR3, de la presente invención serán ya sea idénticas o altamente homologas a las regiones especificadas de las SEC ID NOS: 2 y 4; 129 y 134; 22 y 27; 32 y 37; y 42 y 47, respectivamente. Por el término altamente homólogo" se contempla que únicamente algunas sustituciones, preferentemente de 1 a 8, preferentemente de 1 a 5, preferentemente de 1 a 4, o de 1 a 3 ó 1 ó 2 sustituciones, se pueden elaborar en una o más de las CDRs. También se contempla que dichos términos incluyan truncados a las CDRs, siempre que el anticuerpo resultante exhiba las propiedades únicas de la clase de anticuerpos aquí descritas, tal como se exhibe mediante mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133 y hu806.
La estructura para llevar las CDRs de la presente invención, en particular CDR3, generalmente será de una secuencia de cadena pesada o ligera de anticuerpo o porción sustancial de la misma, en la cual las regiones CDR se localizan en ubicaciones que corresponden a la región CDR de los dominios variables de anticuerpo de cadena VH y VL que ocurren naturalmente, reajustando los genes de inmunoglobulina. Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina pueden determinarse mediante referencia a la publicación de Kabat, E. A. y asociados, Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico 4o Edición Departamento Norteamericano de Servicios de Salud y Humanos (US Department de Health and Human Services). 1987, y actualizaciones de la misma, ahora disponibles en la Internet (http://immuno.bme.nwu.edu)). Además, tal como lo saben los expertos en la técnica, se pueden realizar las determinaciones CDR en diferentes formas. Por ejemplo, se pueden utilizar análisis de Kabat, Clotia y determinación de dominio combinado. A este respecto ver por ejemplo el sitio web http://www. bioinf.org. uk/abs/#cdrid.
Preferentemente, las secuencias de aminoácido sustancialmente como se establece en los residuos CDR de cadena VH en los anticuerpos de la presente invención, están en un dominio variable de cadena pesada humano o una porción sustancial del mismo, y las secuencias de aminoácido sustancialmente tal como se establecen en los residuos CDR de cadena VL en los anticuerpos de la presente invención, están en un dominio variable de cadena ligera humano o porción sustancial del mismo.
Los dominios variables pueden ser derivados de cualquier dominio de línea germinal o dominio variable humano reajustado, o puede ser un dominio variable sintético con base en las secuencias de consenso de dominios variables humanos conocidos. Las secuencias derivadas de CDR3 de la presente invención, por ejemplo, tal como se definen en el párrafo anterior, se pueden introducir en un repertorio de dominios variables que carecen de regiones CDR3, utilizando tecnología de ADN recombinante.
Por ejemplo, Marks y asociados (Bio/Technology, 1992, 0:779-783) describe métodos para producir repertorios de dominios variables de anticuerpo en los cuales se utilizan cebadores de consenso dirigidos en o adyacentes al extremo 5' del área de dominio variable junto con cebadores de consenso para la tercera región de estructura de los genes VH humanos para proporcionar un repertorio de dominios variables VH que carecen de una CDR3. Marks y asociados describe en forma adicional como este repertorio puede ser combinado con una CDR3 de un anticuerpo particular. Utilizando técnicas análogas, las secuencias derivadas de CDR3 de la presente invención pueden ser revueltas con repertorios de dominios VH o VL que carecen de una CDR3, y los dominios revueltos VL o VH completos combinados con un dominio VH o VL cognato para proporcionar miembros de enlace específico de la presente invención. Posteriormente el repertorio puede desplegarse en un sistema de huésped adecuado tal como el sistema de despliegue de fago de la Publicación Internacional W092/01047, de modo que se pueden seleccionar miembros de enlace específico adecuados. Un repertorio puede consistir en desde cualquiera de 104 miembros individuales hacia arriba, por ejemplo de 1 O6 a 108 o 1010 miembros.
Las técnicas de revoltura o de combinación análogas también son descritas por Stemmer (Nature, 1994,370:389-391), quien describe la técnica en relación con un gen de p-lactamasa, pero observa que el método puede ser utilizado para la generación de anticuerpos.
Una alternativa adicional es generar regiones VH o VL novedosas que llevan las secuencias derivadas de CDR3 de la presente invención, utilizando mutagénesis aleatoria, por ejemplo, de los genes VH o VL mAb806 para generar mutaciones dentro del dominio variable completo. Dicha técnica es descrita por Gram y asociados (1992, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580), quien utiliza PCR de propensión a error.
Otro método que se puede utilizar, es dirigir mutagénesis a las regiones CDR de los genes VH o VL. Dichas técnicas también son descritas por Barbas y asociados, (1994, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813) y Schier y asociados, (1996, J. Mol. Biol. 263:551-567).
Todas las técnicas descritas anteriormente son conocidas en la técnica, y por sí mismas no forman parte de la presente invención. Los expertos en la técnica tendrán la capacidad de utilizar dichas técnicas para proporcionar miembros de enlace específico de la presente invención, utilizando metodología de rutina en la técnica.
Una porción sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina comprenderá al menos tres regiones CDR, junto con sus regiones de estructura de intervención. Preferentemente, la porción también incluirá al menos aproximadamente el 50% de cualquiera de o ambas de las primeras y cuartas regiones de estructura, siendo el 50%, el 50% terminal-C de la primera región de estructura y el 50% de terminal-N de la cuarta región de estructura. Los residuos adicionales en el extremo N-terminal y C-terminal de la parte sustancial del dominio variable, pueden ser los que no se asocian normalmente con regiones de dominio variable que ocurren naturalmente. Por ejemplo, la construcción de miembros de enlace específico de la presente invención elaborada mediante técnicas de ADN recombinante, pueden dar como resultado la introducción de residuos N- o C-terminal codificado para enlazadores introducidos para facilitar la clonación u otros pasos de manipulación. Otros pasos de manipulación incluyen la introducción de enlazadores para unir dominios variables de la presente invención a secuencias de proteína adicionales que incluyen cadenas pesadas de inmunoglobulina, otros dominios variables (por ejemplo en la producción de diacuerpos) o etiquetas de proteína, tal como se describe con mayor detalle más adelante.
Aunque en un aspecto preferido de la presente invención se prefieren miembros de enlace específico que comprenden un par de dominios de enlace con base en las secuencias establecidas sustancialmente en SEC ID NOS: 2 y 4; 129 y 134; 22 y 27; 32 y 37; y 42 y 47, respectivamente, los dominios de enlace simples basados en estas secuencias forman aspectos adicionales de la presente invención. En el caso de dominios de enlace con base en la secuencia establecida sustancialmente en las cadenas VH, dichos dominios de enlace pueden ser utilizados como agentes de dirección para antígenos de tumor, ya que se sabe que los dominios VH de inmunoglobulina tienen la capacidad de enlazar antígenos objetivo en una forma específica.
En el caso de cualesquiera de los dominios de enlace específico de cadena simple, estos dominios se pueden utilizar para clasificar los dominios complementarios con la capacidad de formar un miembro de enlace específico de dos dominios que tiene propiedades in vivo, tan buenas como, o iguales a los anticuerpos mAb806, ch806, mAb175, mAb124, mAb1133 y hu806 aquí descritos.
Esto se puede lograr mediante métodos de clasificación de despliegue de fagos utilizando el llamado método de combinación dual jerárquica, tal como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,969,108, en la cual se utiliza una colonia individual que contiene ya sea un clon de cadena H o L, para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H) y el miembro de enlace específico de dos cadenas resultantes se selecciona de acuerdo con la técnica de despliegue de fago, tal como las descritas en dicha referencia. Esta técnica también se describe en la Publicación de Marks / asociados, ibid.
Los miembros de enlace específico de la presente invención pueden comprender en forma adicional regiones constantes de anticuerpo o partes de las mismas. Por ejemplo, los miembros de enlace específico con base en las secuencias de cadena VL se pueden adherir en su extremo C-terminal a los dominios constantes de cadena ligera de anticuerpo incluyendo las cadenas Ck o CA humanas, preferentemente cadenas CA. En forma similar, los miembros de enlace específico con base en las secuencias de cadena VH, se pueden unir a su extremo C-terminal a toda o una parte de la cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo IgG, IgA, IgE, IgD y IgM y cualesquiera de las subclases de isotipo, particularmente I g G 1 , lgG2b y lgG4. Se prefiere IgG 1.
La llegada hace 25 años de la tecnología de anticuerpo monoclonal (mAb) ha proporcionado un enorme repertorio de reactivos de investigación útiles y ha creado la oportunidad de utiliza anticuerpos como los reactivos farmacéuticos aprobados en terapia de cáncer, trastornos autoinmune, rechazo de trasplante, profilaxis antiviral y como anti-trombóticos (Glennie y Johnson, 2000). La aplicación de ingeniería molecular para convertir mAbs de múrido en mAbs quiméricos (región-V de ratón, región-C de humano) y reactivos humanizados en donde únicamente las regiones de determinación de complementariedad mAb (CDR) son de origen de múrido, han sido importantes para el éxito clínico de la terapia de mAb. Los mAbs construidos tienen una inmunogenicidad marcadamente reducida o ausente, vida media en suero aumentada y la porción Fe humana del mAb incrementa el potencial de reclutar los efectores inmune de las células de complemento y citotóxicas (Clark 2000). Las investigaciones en la biodistribución, farmacocinéticas y cualquier inducción de una respuesta inmune a los mAbs administrados en forma clínica, requiere el desarrollo del análisis para diferenciar entre las proteínas farmacéuticas y endógenas.
Los anticuerpos, o cualesquiera fragmentos de los mismos, también pueden ser conjugados o fusionados en forma recombinante a cualquier toxina celular, bacteria u otra, por ejemplo, exotoxina de pseudomona, ricina o toxina de difteria. La parte de la toxina utilizada puede ser toxina completa, o cualquier dominio particular de la toxina. Dichas moléculas de toxina de anticuerpo han sido utilizadas exitosamente para dirección y terapia de diferentes tipos de cánceres, ver por ejemplo las Publicaciones de Pastan, Biochim Biophys Acta. 1997 Oct 24; 1333 (2):C1-6; Kreitman y asociados, N. Engl. J. Med. 2001 Jul 26; 345 (4):241-7; Schnell y asociados, Leukemia. 2000 Enero; 14 (1 ):129-35; Ghetie y asociados, Mol. Biotechnol. 2001 Jul; 18 (3):251-68.
Se pueden formar multímeros di y tri específicos mediante asociación de diferentes moléculas scFv y han sido designados como reactivos de reticulación para el reclutamiento de célula T en tumores (inmunoterapia), redirección viral (terapia genética) y como reactivos de aglutinación de glóbulos rojos (inmunodiagnóstico), ver por ejemplo las publicaciones de Todorovska y asociados, J. Immunol. Methods. 2001 Feb 1; 248 (1-2):47-66; Tomlinson y asociados, Methods Enzymol. 2000; 326:461-79; McCall y asociados, J. Immunol. 2001 Mayo 15; 166 (10):6112-7.
Se pueden preparar anticuerpos completamente humanos inmunizando ratones transgénicos que llevan grandes porciones de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina humana.
Estos ratones, cuyos ejemplos son el Xenomouse (Abgenix, Inc.) (Patentes Norteamericanas Nos. 6,075,181 y 6,150,584), el HuMAb-Mouse™ (Medarex, I nc./Gen Pharm ) (Patente Norteamericana No. 5,545,806 y 5,569,825), el ratón TransChromo (Kirin) y el ratón KM (Medarex/Kirin), tal como se sabe en la técnica.
Los anticuerpos se pueden preparar posteriormente, por ejemplo, mediante técnica de hibridoma estándar o mediante despliegue de fago. Estos anticuerpos posteriormente contendrán únicamente secuencias de aminoácido completamente humanas.
Los anticuerpos completamente humanos también se pueden generar utilizando despliegue de fago para bibliotecas humanas. El despliegue de fago puede llevarse a cabo utilizando métodos conocidos para los expertos en la técnica, tal como en las Publicaciones de Hoogenboom y asociados, y Marks y asociados, (Hoogenboom HR y Winter G. (1992) J. Mol. Biol. 227 (2):381-8; Marks JD y asociados, (1991) J. Mol. Biol. 222 (3):581-97; y también las Patentes Norteamericanas Nos. 5,885,793 y 5,969,108).
Anticuerpos terapéuticos y sus Usos Las propiedades in vivo, particularmente con respecto a la proporción de tumor: sangre y rango de despeje de los miembros de enlace específico de la presente invención, serán al menos comparables con las de mAb806. Después de la administración a un sujeto humano o animal, dicho miembro de enlace específico mostrará una proporción pico de tumor a sangre de >1:1. Preferentemente, en dicha proporción el miembro de enlace específico tendrá una proporción de tumor a órgano mayor a 1:1, preferentemente mayor a 2:1, más preferentemente mayor a 5:1. Preferentemente en dicha proporción el miembro de enlace específico tendrá una proporción de órgano a sangre <1:1 en los órganos fuera del sitio del tumor. Estas proporciones excluyen órganos de catabolismo y secreción de un miembro de enlace específico administrado. Por lo tanto en el caso de scFvs y Fabs (tal como se muestra en los ejemplos adjuntos), los miembros de enlace son secretados a través de los ríñones y existe una mayor presencia aquí que en otros órganos. En el caso de IgGs completos, el despeje será al menos en parte, a través del hígado. La proporción de localización pico del anticuerpo intacto, normalmente se logrará entre 10 y 200 horas después de la administración del miembro de enlace específico. Más particularmente, la proporción puede ser medida en un xenoinjerto de tumor de aproximadamente 0.2 a 1.0 g formado en forma subcutánea en un flanco del ratón desprotegido atímico.
Los anticuerpos de la presente invención, se pueden etiquetar con una etiqueta detectable o funcional. Las etiquetas detectables incluyen, pero no se limitan a radioetiquetas tales como los isótopos 3H, 1 C, 32P, 35S, 36CI, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 121l, 124l, 125l, 131l, 111ln, 11At, 198Au, 67CU, 225Ac, 213Bi, "Te y 186Re, los cuales pueden ser adheridas a los anticuerpos de la presente invención utilizando química convencional conocida en la técnica de la generación de imágenes de anticuerpo. Las etiquetas también incluyen etiquetas fluorescentes y etiquetas utilizadas convencionalmente en la técnica para imágenes MRI-CT. También incluyen etiquetas de enzima tales como peroxidasa de rábano. Las etiquetas pueden incluir en forma adicional porciones químicas tales como biotina que se pueden detectar a través del enlace a una porción detectable de cognato específica, por ejemplo, avidina etiquetada.
Las etiquetas funcionales incluyen sustancias que son diseñadas para ser dirigidas al sitio de un tumor, para originar la destrucción del tejido de tumor. Dichas etiquetas funcionales incluyen fármacos citotóxicos tales como 5-fluorouracilo o ricina y enzimas tales como carboxipeptidasa bacteriana o nitrorreductasa, que tiene la capacidad de convertir los profármacos en fármacos activos en el sitio de un tumor.
Asimismo, los anticuerpos que incluyen tanto anticuerpos policlonales como monoclonales, y los fármacos que modulan la producción o actividad de los miembros de enlace específico, anticuerpos y/o sus subunidades, pueden poseer ciertas aplicaciones de diagnóstico, y por ejemplo, se pueden utilizar para el propósito de detectar y/o condiciones de medición tal como cáncer, lesiones precancerígenas, condiciones relacionadas con o que resultan del crecimiento de célula hiperproliferativa o similares. Por ejemplo, los miembros de enlace específico, anticuerpos y sus subunidades se pueden utilizar para producir anticuerpos tanto policlonales como monoclonales así mismos en una variedad de medios celulares, mediante técnicas conocidas tales como la técnica de hibridoma que utiliza, por ejemplo, linfocitos de bazo de ratón fusionados y células de mieloma fusionados. De igual manera, se pueden descubrir pequeñas moléculas que mimetizan o antagonizan la actividad (es) de los miembros de enlace específico de la presente invención pueden ser descubiertas o sintetizadas, y se pueden utilizar en protocolos de diagnóstico y/o terapéuticos.
Los miembros de enlace específicos radioetiquetados, particularmente anticuerpos y fragmentos de los mismos, son útiles en técnicas de diagnóstico in vitro y en técnicas de generación de radioimagen in vivo y en radioinmunoterapia. En el caso de generación de imagen in vivo, los miembros de enlace específicos de la presente invención se pueden conjugar a un agente de generación de imagen en lugar de un radioisótopo(s) incluyendo pero sin limitarse a un agente que aumenta la imagen de resonancia magnética, en donde por ejemplo, se carga una molécula de anticuerpo con un gran número de iones paramagnéticos a través de grupos de quelación. Los ejemplos de grupos de quelación incluyen EDTA, porfirinas, poliaminas, ásteres corona y polioximas. Los ejemplos de iones paramagnéticos incluyen gadolinio, hierro, manganeso, renio, europio, lantanio, holmio y erbio. En un aspecto adicional de la presente invención, son útiles los miembros de enlace específicos radioetiquetados, particularmente anticuerpos y fragmentos de los mismos, particularmente radioinmunoconjugados en radioinmunoterapia, particularmente como anticuerpos radioetiquetados para terapia de cáncer. En un aspecto aún adicional, los miembros de enlace específico radioetiquetados, particularmente anticuerpos y fragmentos de los mismos, son útiles en técnicas de cirugía guiada en forma radioinmunológica, en donde pueden identificar e indicar la presencia y/o ubicación de células de cáncer, células precancerígenas, células de tumor y células híperproliferativas antes de, o durante o después de cirugía para eliminar dichas células.
Los inmunoconjugados o proteínas de fusión de anticuerpo de la presente invención, en donde los miembros de enlace específico, particularmente anticuerpos y fragmentos de los mismos de la presente invención se conjugan o adhieren a otras moléculas o agentes incluyen además, pero no se limitan a miembros de enlace conjugados a un agente de extirpación química, toxinas, inmunomoduladores, citocinas, agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos o fármacos.
La radioinmunoterapia (RAIT) ha ingresado la eficacia clínica y demostrada utilizando diversos inmunoconjugados de anticuerpo. El anticuerpo hMN-14 del antígeno anti-carcinoembriónico (anti-CEA) humanizado etiquetado con 1311 ha sido evaluado en cáncer colorrectal (Behr T y asociados (2002) Cáncer 94 (4Suppl): 1373-81 ), y el mismo anticuerpo con etiqueta 90Y ha sido evaluado en carcinoma de tiroides medular (Stein R y asociados (2002) Cáncer 94 ( 1 ) : 51 -61 ) . La radioinmunoterapia utilizando anticuerpos monoclonales también ha sido evaluada y reportada para linfoma de no Hodgkin y cáncer pancreático (Goldenberg DM (2001) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39 ( 1 -2): 195-201 ; Gold DV y asociados, (2001 ) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39 (1-2) 147-54). Los métodos de radioinmunoterapia con anticuerpos monoclonales también se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,306,393 y 6,331,175. La cirugía radioinmunoguiada (RIGS) también ha ingresado la eficacia clínica y la utilidad demostrada, incluyendo el uso de anticuerpos anti-CEA y anticuerpos dirigidos contra antígenos asociados con tumor (Kim JC y asociados (2002) Jut. J. Cáncer 97(4):542-7; Schneebaum, S. y asociados, (2001) World J. Surg. 25( 12 ): 1495-8 ; Avital, S. y asociados, (2000) Cáncer 89(8): 1692-8; Mclntosh DG y asociados (1997) Cáncer Biother. Radiopharm. 12 (4):287-94).
Los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse a un paciente que necesita de tratamiento a través de cualquier ruta adecuada, normalmente mediante inyección en el torrente sanguíneo o CSF, o directamente en el sitio del tumor. La dosis precisa dependerá del número de factores, incluyendo si el anticuerpo es para diagnóstico o para tratamiento, el tamaño y localización del tumor, la naturaleza precisa del anticuerpo del anticuerpo (ya sea anticuerpo completo, fragmento, diacuerpo, etc.), y la naturaleza de la etiqueta detectable o funcional adherida al anticuerpo. Cuando se utiliza un radionúcleo para terapia, una dosis simple máxima adecuada es de aproximadamente 45 mCi/m2, hasta un máximo de aproximadamente 250 mCi/m2. La dosis preferida está dentro del rango de 15 a 40 mCi, con un rango de dosis preferida adicional de 20 a 30 mCi, o 10 a 30 mCi. Dicha terapia puede requerir reemplazo de médula ósea o de célula madre. Una dosis de anticuerpo típica para ya sea generación de imagen de tumor o tratamiento de tumor, estará dentro del rango de 0.5 a 40 mg, preferentemente de ? a 4 mg de anticuerpo en la forma F(ab')2. Los anticuerpos desprotegidos se administran preferentemente en dosis de 20 a 1000 mg de proteina por dosis, o 20 a 500 mg de proteína por dosis, o 20 a 100 mg de proteína por dosis. Esta es una dosis para un tratamiento simple de un paciente adulto, la cual puede ser ajustada proporcionalmente para niños e infantes, y también ajustarse para otros formatos de anticuerpo en proporción al peso molecular. Los tratamientos pueden repetirse diariamente, dos veces a la semana, en forma semanal o mensual, a juicio del especialista.
Estas formulaciones pueden incluir una segunda proteína de enlace, tal como las proteínas de enlace EGPR descritas supra. En una forma especialmente preferida, esta segunda proteína de enlace es un anticuerpo monoclonal tal como 528 ó 225, descrito infra.
Composiciones Farmacéuticas y Terapéuticas Los miembros de enlace específicos de la presente invención normalmente serán administrados en la forma de una composición farmacéutica que puede comprender al menos un componente además del miembro de enlace específico.
Por lo tanto las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención, y para utilizarse de acuerdo con la presente invención, pueden comprender, además del ingrediente activo, un excipiente, transportador, amortiguador, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables conocidos para los expertos en la técnica. Dichos materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del transportador u otro material dependerá de la ruta de administración, la cual puede ser oral, o mediante inyección, por ejemplo, intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden estar en forma de tabletas, cápsulas, polvo o líquido. Una tableta puede comprender un transportador sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas comprenden generalmente un transportador líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceites minerales o aceites sintéticos. Se pueden incluir soluciones salinas fisiológicas, dextrosa u otras soluciones de sacárido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol, glicol o polietilenglicol.
Para inyección intravenosa, o inyección en el sitio del padecimiento, el ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable la cual está libre de pirógeno y tiene un pH, isotinicidad y estabilidad adecuada. Los expertos en la técnica tendrán la capacidad de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Ringer Lactada. Se pueden incluir, según se requieran conservadores, estabilizadores, amortiguadores, antioxidantes y/o otros aditivos.
Se puede administrar una composición sola o en combinación con otros tratamientos, terapéuticos o agentes, ya sea en forma simultánea o en secuencias dependiendo de la condición que será tratada. Además, la presente invención contempla e incluye composiciones que comprenden un miembro de enlace, particularmente anticuerpo o fragmento del mismo, descrito en la presente invención u otros agentes o terapéuticos, tal como agentes anti-cáncer o terapéuticos, hormonas, agentes anti-aEGFR o anticuerpos, o inmunomoduladores inmune. Más generalmente, estos agentes anti-cáncer pueden ser inhibidores de cinasa de tirosina o inhibidores de cascada de fosforilación, moduladores post-traducción, inhibidores de crecimiento o división celular (por ejemplo, anti-mitóticos), o inhibidores de transducción de señal. Otros tratamientos o terapéuticos pueden incluir administración de dosis adecuadas de fármacos de liberación de dolor, tal como fármacos anti-inflamatorios no esteroidales (por ejemplo, aspirina, paracetamol, ibuprofeno o quetoprofeno) u opiatos tales como morfina o anti-heméticos. La composición se puede administrar en combinación (ya sea en secuencias (por ejemplo, antes o después) o en forma simultánea) con inhibidores de cinasa de tirosina incluyendo pero sin limitarse a AG1478 y ZD1839, STI571, OSI-774, SU-6668), doxorubicina, temozolomida, cisplatino, carboplatino, nitrosoureas, procarbazina, vincristina, hidroxiurea, 5-fluoruracilo, arabinosida de citosina, ciclofosfamida, epipodofillotoxin, carmustina, lomustina, y/o otros agentes quimioterapéuticos. Por lo tanto, estos agentes pueden ser agentes específicos anti-EGFR o inhibidores de cinasa de tirosina tales como AG1478, ZD1839, STI571, OSI-774, o SU-6668 o pueden ser agentes anti-cáncer o anti-neoplásticos más generales tales como doxorubicina, cisplatino, temozolomida, nitrosoureas, procarbazina, vincristina, hidroxiurea, 5-fluoruracilo, arabinosida de citosina, ciclofosfamid, epipodofillotoxina, carmustina, o lomustina. Además, la composición puede administrarse con hormonas tales como dexametasona , inmunomoduladores inmune, tales como interleucinas, factor de necrosis de tumor (TNF) u otros factores de crecimiento o citocinas que estimulan la respuesta inmune y la reducción o eliminación de células o tumores de cáncer.
Se puede combinar un modulador inmune tal como TNF junto con un miembro de la presente invención en la forma de un anticuerpo biespecífico que reconoce el epítope EGFR reconocido por los anticuerpos de la presente invención, así como el enlace a receptores TNF. La composición puede administrarse con, o puede incluir combinaciones junto con otros anticuerpos anti-EGFR, incluyendo pero sin limitarse a los anticuerpos anti-EGFR 528, 225, SC-03, DR8. 3, L8A4, Y10, ICR62 y ABX-EGF.
Previamente el uso de los agentes tal como doxorubicina y cisplatino junto con anticuerpos anti-EGFR ha producido actividad anti-tumor mejorada (Fan y asociados 1993; Baselga y asociados 1993). La combinación de doxorubicina y mAb 528 dio como resultado la erradicación total de xenoinjertos A431 establecidos, mientras que el tratamiento con cualquier agente solo originó únicamente una inhibición de crecimiento in vivo temporal (Baselga y asociados 1993). De igual manera, la combinación de cisplatino y cualquiera de mAb528 o 225 también condujo a la erradicación de xenoinjertos A431 bien establecidos, lo cual no se observó cuando se utilizó el tratamiento con cualquier agente (Fan y asociados 1993).
Radioterapia Convencional Además, la presente invención contempla e incluye composiciones terapéuticas para el uso del miembro de enlace en combinación con radioterapia convencional. Se ha indicado que el tratamiento con anticuerpos que dirigen receptores EGF pueden mejorar los efectos de radioterapia convencional (Milas y asociados, Clin. Cáncer Res. 2000 Feb 6 (2):701, Huang y asociados, Clin. Cáncer Res. 2000 Junio 6 (6):2166).
Tal como se muestra en la presente invención, las combinaciones del miembro de enlace de la presente invención, particularmente un anticuerpo o fragmento del mismo, preferentemente el mAb806, ch806, mAb175, mAb124, mAb1133 o hu806 o fragmento del mismo, y terapéuticos anti-cáncer, particularmente terapéuticos anti-EGFR, incluyendo otros anticuerpos anti-EGFR, demuestran terapia efectiva y particularmente sinergia, contra tumores xenoinjertados. En los ejemplos, se demuestran, por ejemplo, que la combinación de AG1478 y mAb806 dio como resultado una reducción significativamente aumentada de volumen de tumor de xenoinjerto A431 en comparación con tratamiento con cualquier agente solo. AG1478 (4-(3-cloroanilino)-6,7-dimetoxiquinazolina) es un inhibidor potente y selectivo de la cinasa de receptor EGF y se describe particularmente en la Patente Norteamericana No. 5,457,105, incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia (ver también las Publicaciones Liu, W. y asociados (1999) J. Cell Sci. 112:2409; Eguchi, S. y asociados (1998) J. Biol. Chem. 273:8890; Levitsky, A. y Gazit, A. (1995) Science 267:1782). Los ejemplos de especificación demuestran además la sinergia terapéutica de anticuerpos de la presente invención con otros anticuerpos anti-EGFR, particularmente con el anticuerpo 528 anti-EGFR.
La presente invención contempla además las composiciones terapéuticas útiles en la práctica de los métodos terapéuticos de la presente invención. Una composición terapéutica en cuestión incluye, en mezcla en adiciones, un excipiente farmacéuticamente aceptable (transportador) y uno o más de un miembro de enlace específico, un análogo de polipéptido del mismo o fragmento del mismo, tal como se describe en la presente invención, como un ingrediente activo. En una modalidad preferida, la composición comprende un antígeno con la capacidad de modular el enlace específico del miembro/anticuerpo de enlace presentes con una célula objetivo.
La preparación de composiciones terapéuticas que contienen polipéptidos, análogos de fragmentos activos como ingredientes activos, está bien entendida en la técnica.
Normalmente, se preparan dichas composiciones como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. Sin embargo, también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquida antes de la inyección. En la preparación también puede ser emulsificada. El ingrediente terapéutico activo con frecuencia se mezcla con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles en el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tal como agentes de humectación o emulsificación, agentes de amortiguación de pH que aumentan la efectividad del ingrediente activo.
Se puede formular un polipéptido, análogo o fragmento activo en la composición terapéutica como formas de sal farmacéuticamente aceptable neutralizadas. Las sales farmacéuticamente aceptable incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido o molécula de anticuerpo) y los cuales se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos hidroclórico o fosfórico, o dichos ácidos orgánicos como acéticos, oxálicos, tartáricos, mandélicos, y similares. Las sales formadas a partir de los grupos carboxilo libre también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y dichas bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidine, procaína, y similares.
Las composiciones terapéuticas que contienen polipéptido, análogo o fragmento activo son administradas convencionalmente en forma intravenosa, o mediante inyección de una dosis de unidad, por ejemplo. El término "dosis de unidad" cuando se utiliza en referencia a una composición terapéutica de la presente invención, se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas como dosificación unitaria para humanos, conteniendo cada unidad un cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido, por ejemplo transportador o vehículo.
Las composiciones se administran en una forma compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad terapéuticamente efectiva. La cantidad que será administrada depende del sujeto que será tratado, la capacidad del sistema inmune del sujeto para utilizar el ingrediente y el grado de capacidad de enlace EFGR deseado. Las cantidades precisas del ingrediente activo requeridas para administrarse dependen del juicio del practicante, y son peculiares para cada individuo. Sin embargo, las dosis adecuadas pueden fluctuar de aproximadamente 0.1 a 20, preferentemente aproximadamente de 0.5 a aproximadamente 10, y más preferentemente de uno a varios miligramos de ingrediente activo por kilogramo de peso corporal del individuo por día, y dependen de la ruta de administración. Los regímenes adecuados para administración inicial y refuerzos también pueden son variables, aunque se tipifican a través de una administración inicial seguida de dosis repetida en uno o más intervalos de hora a través de una inyección subsecuente u otra administración. Como alternativa, se contempla infusión intravenosa continua suficiente para mantener concentraciones en la sangre de 10 nanomolares a 10 micromolares.
Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden estar en forma de tabletas, cápsulas, polvo o forma líquida. Una tableta puede comprender un transportador sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente comprenden un transportador líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Se puede incluir una solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.
Para inyección intravenosa, o inyección en el sitio del padecimiento, el ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que está libre de pirógeno y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la técnica, tendrán la capacidad de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Ringer Lactada. También se puede incluir, según se requieran conservadores, estabilizadores, amortiguadores, antioxidantes y/o otros aditivos.
Ensayos de Diagnóstico La presente invención también se refiere a una variedad de aplicación de diagnostico, incluyendo métodos para detectar la presencia de estímulos tales como EGFR expresado en forma aberrante, mediante referencia a su capacidad para ser reconocido por el miembro de enlace específico de la presente invención. Tal como se mencionó anteriormente, el EGFR se puede utilizar para producir anticuerpos así mismos, a través de una variedad técnicas conocidas y dichos anticuerpos posteriormente pueden ser aislados y utilizados en pruebas para la presencia de actividad EGFR particular en células objetivo sospechosas.
Las aplicaciones de diagnóstico de los miembros de enlace específico de la presente invención, particularmente anticuerpos o fragmentos de los mismos, incluyen aplicaciones in vitro e in vivo conocidas y estándares para los expertos en la técnica y con base en la presente invención. Los ensayos de diagnóstico y equipos para evaluación in vitro y evaluación de estatus EGFR, particularmente con respecto a expresión aberrante de EGFR, se pueden utilizar para diagnóstico, evaluación y monitoreo de muestras de pacientes, incluyendo las que se sabe tienen o se sospecha que tengan cáncer, una condición precancerígena o condición relacionada con crecimiento de célula hiperproliferativo o de una muestra de tumor. La evaluación y análisis del estado EGFR, también es útil para determinar la capacidad de adaptación de un paciente a una prueba clínica de un fármaco o para la administración de un agente quimioterapéutico o miembro de enlace específico en particular, particularmente un anticuerpo, de la presente invención, que incluye combinaciones de los mismos, versus un diferente agente o miembro de enlace. Este tipo de monitoreo y evaluación de diagnóstico ya está en práctica utilizando anticuerpos contra la proteína HER2 en cáncer de seno (Hercep Test, Dako Corporation), en donde también se utiliza el ensayo para evaluar pacientes para terapia de anticuerpo utilizando Herceptina. En aplicaciones in vivo que incluyen generación de imágenes de tumores o evaluación de estado de cáncer de los individuos incluyen radiogeneración de imagen.
Tal como se sugirió previamente, el método de diagnóstico de la presente invención comprende revisar una muestra o medio celular, por medio de un ensayo que incluye una cantidad efectiva de un antagonista a una EFGR/proteína, tal como un anticuerpo anti-EFGR, preferentemente un anticuerpo policlonal purificado con afinidad, y más particularmente mAb. Además, se prefiere que las moléculas de anticuerpo anti-EFGR utilizadas en la presente invención puedan estar en la forma de porciones Fab, Fab', F(ab')2 o F(v) moléculas de anticuerpo completas. Tal como se describió anteriormente, los pacientes con la capacidad de beneficiarse de este método, incluyen los que padecen de cáncer, una lesión precancerígena, una infección viral, patologías que implican o resultan del crecimiento de célula hiperproliferativo u otro tipo de desajuste patológico. Los métodos para aislar EFGR e inducir anticuerpos anti-EFGR y determinar y optimizar la capacidad de los anticuerpos anti-EFGR para ayudar a la revisión de las células objetivo, también son conocidos en la técnica.
Preferentemente, el anticuerpo anti-EFGR utilizado en métodos de diagnóstico de la presente invención, es un anticuerpo policlonal purificado con afinidad. Más preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal (mAb). Además, las moléculas de anticuerpo anti-EFGR aquí utilizadas pueden estar en la forma de porciones Fab, Fab', F(ab')2 o F (v) de moléculas de anticuerpo completas.
Tal como se describe con detalle anteriormente, el anticuerpo(s) para el EGFR se puede producir y aislar a través de métodos estándar incluyendo las técnicas del hibridoma bien conocidas. Por conveniencia, el anticuerpo(s) para el EGFR, será referido en la presente invención como Abi y el anticuerpo(s) elevado en otra especia como Ab2- La presencia de EGFR en células se puede confirmar a través de procedimientos inmunológicos in vitro o in vivo usuales aplicables a dichas determinaciones. Se conoce un número de procedimientos útiles. Tres de dichos procedimientos que son especialmente útiles, utilizan ya sea el EGFR etiquetado con una etiqueta detectable, anticuerpo Ab, etiquetado con una etiqueta detectable o anticuerpo Ab2 etiquetado con una etiqueta detectable. Los procedimientos pueden resumirse a través de las siguientes ecuaciones, en donde el asterisco indica que la partícula es etiquetada, y "R" permanece para EGFR: A. R* + Ab = R*Abi, B. R + Ab* = RAb!* C. R + Ab, + Ab2* = RAb!Ab2* Los procedimientos y su aplicación todos son familiares para los expertos en la técnica y por consiguiente se pueden utilizar dentro del alcance de la presente invención. El "procedimiento competitivo", procedimiento A, se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 3,654,090 y 3,850,752, Procedimiento C, el procedimiento "emparedado", se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. RE 31,006 y 4,016,043. Aún otros procedimientos son conocidos tales como el procedimiento de "anticuerpo doble" o "DASP".
En cada ejemplo anterior, el EGFR forma complejos con uno o más anticuerpo(s) o partes de enlace y un miembro del complejo de etiqueta con una etiqueta detectable. El hecho de que se forme un complejo, si se desea, la cantidad del mismo puede ser determinada a través de métodos conocidos aplicables a la detección de etiquetas.
Se puede apreciar a partir de lo anterior, que una propiedad característica de Ab2 es que reaccionará con Abi. Esto se debe a que Abi elevada en una especie de mamífero, ha sido utilizado en otra especie como un antígeno para elevar el anticuerpo Ab2. Por ejemplo, Ab2 se puede elevar en cabras utilizando anticuerpos de conejo como antígenos. Por consiguiente Ab2 puede ser un anticuerpo anti-conejo elevado en cabras. Para propósitos de la presente descripción y en las reivindicaciones, Ab será referido como un anticuerpo primario o anti-EGFR, y Ab2 será referido como un anticuerpo secundario o anti-Ab!.
Las etiquetas deben emplearse comúnmente para estos estudios y son elementos radioactivos, enzimas, químicos que florecen cuando se exponen a luz ultravioleta y otros.
Se conoce una cantidad de materiales fluorescentes y se pueden utilizar como etiquetas. Estas incluyen, por ejemplo, fluoresceína, rodamina, auramina, Rojo Texas, azul AMCA y Amarillo Lucifer. Un material de detección particular es un anticuerpo anti-conejo preparado en cabras y conjugado con fluoresceína a través de un isotiocianato.
El EGFR o su parte(s) de enlace tal como el miembro de enlace específico de la presente invención, también se puede etiquetar como un elemento radioactivo o con una enzima. La etiqueta radioactiva puede detectarse a través de cualesquiera de sus procedimientos de conteo actualmente disponibles. El isotipo preferido puede seleccionarse de 3H, 14C, 32P, 35S, 36CI, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 21l, 124l, 125l, 13 , 1 1ln, 211At, 198Au, 67Cu 225Ac, 213Bi, 99Tc y 186Re.
Las etiquetas de enzima son igualmente útiles, y se pueden detectar a través de cualesquiera de las técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, amperométricas, o gasométricas actualmente utilizadas. La enzima se conjuga a la partícula seleccionada mediante la reacción con moléculas de puente tal como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehído y similares. Muchas enzimas que se pueden utilizar en procedimientos son conocidas y pueden ser utilizadas. Las preferidas son peroxidasa, ß-glucuronidasa, ß-D-glucosidasa, ß-D-galactosidasa, ureasa, oxidasa de glucosa más peroxidasa y fosfatasa alcalina. Las Patentes Norteamericanas Nos. 3,654,090; 3,850,752; y 4,016,043 son referidas a manera de ejemplo para su descripción de materiales y métodos de etiquetado alterno.
Un sistema de ensayo particular que se puede utilizar en forma conveniente de acuerdo con la presente invención, es conocido como un ensayo receptor. En un ensayo receptor, el material puede ser ensayado, tal como el miembro de enlace específico, se etiqueta en forma adecuada y posteriormente se inoculan ciertas colonias de prueba celular con una cantidad tanto de material etiquetado como no etiquetado después de lo cual se llevan a cabo estudios de enlace para determinar el grado en el cual el material de enlace enlaza a los receptores celulares. De esta forma, se pueden confirmar diferencias en afinidad entre materiales.
Por consiguiente, se puede radioetiquetar una cantidad purificada del miembro de enlace específico y combinarse, por ejemplo, con anticuerpos y otros inhibidores de los mismos, después de lo cual se pueden llevar estudios de un enlace. Posteriormente las soluciones pueden ser preparadas de modo que contengan varias cantidades de un miembro de enlace específico no combinado etiquetado y no etiquetado y posteriormente las muestras de células se pueden inocular y posteriormente incubar. Las monocapas de células resultantes posteriormente son lavadas, solubilizadas y posteriormente contadas en un contador gamma durante una duración de tiempo suficiente para producir un error estándar de <5%. Posteriormente estos datos se someten a análisis de Scatchard después de lo cual se pueden extraer observaciones y conclusiones con respecto a la actividad del material. Aunque lo anterior es de ejemplo, ilustra la forma en la cual se puede llevar a cabo y utilizar un ensayo de receptor en el caso en donde la capacidad de enlace celular del material ensayado puede servir como una característica de distinción.
Un ensayo útil y contemplado de acuerdo con la presente invención es conocido como un ensayo "cis/trans". En síntesis, este ensayo emplea dos construcciones genéticas, una de las cuales normalmente es un plásmido que expresa continuamente un detector de interés particular cuando se transfecta en una línea de célula adecuada, y el segundo de estos es un plásmido que expresa un reportero tal como luciferasa, bajo el control de un complejo de receptor/ligando. Por lo tanto, por ejemplo, si se desea evaluar un compuesto como un ligando para un receptor particular, uno de los plásmidos puede ser una construcción que de cómo resultado la expresión de receptor en la línea celular elegida, en tanto que el segundo plásmido pueda poseer un promotor enlazado al gen de luciferasa en el cual se injerta el elemento de respuesta al receptor particular. Si el compuesto bajo prueba es un agonista para el receptor, el ligando se elaborará en complejo con el receptor, y el complejo resultante enlazará al elemento de respuesta e iniciará la transcripción del gen de luciferasa. Posteriormente la quimioluminiscencia resultante se mide en forma fotométrica, y se obtienen curvas de respuesta a la dosis y se comparan con las de ligandos conocidos. El protocolo anterior se describe con detalle en la Patente Norteamericana No. 4,981,784 y la Publicación Internacional PCT No. WO 88/03168, para lo cual se hace referencia al propósito en la técnica.
En una modalidad adicional de la presente invención, se pueden preparar equipos de prueba comerciales adecuados para ser utilizados por un especialista médico, para determinar la presencia o ausencia de la expresión aberrante de EGFR, incluyendo pero sin limitarse a EGFR amplificado y/o una mutación EGFR en células objetivo sospechosas. De acuerdo con las técnicas de prueba descritas anteriormente, una clase de dichos equipos comprenderá al menos un EGFR etiquetado o su parte de enlace, por ejemplo, un anticuerpo específico del mismo, y direcciones, por supuesto, dependiendo del método seleccionado, por ejemplo, "competitivo", "emparedado", "DASP" y similares. Los equipos también pueden contener reactivos periféricos tales como amortiguadores, estabilizadores, etc.
Por consiguiente, se puede preparar un equipo de prueba para la demostración de la presencia o capacidad de las células, para expresión aberrante o modificación posttraducción de EGFR, que comprende: (a) una cantidad predominante de al menos un componente inmunoquímicamente reactivo etiquetado obtenido mediante adhesión directa o indirecta del miembro de enlace específico de la presente invención o una parte de enlace especifica del mismo, a una etiqueta detectable; (b) otros reactivos; y (c) direcciones para utilizar el equipo.
Más específicamente, el equipo de prueba de diagnóstico puede comprender: (a) una cantidad conocida del miembro de enlace específico tal como se describió anteriormente (o una parte de enlace) generalmente enlazada a una fase sólida para formar un inmunoabsorbente, o como alternativa, enlazar a una etiqueta adecuada, o productos de extremo, etc (o sus partes de enlace) uno de cada uno; (b) si es necesario, otros residuos; y (c) direcciones para el uso de dichos tipos de prueba.
En una variación adicional, el equipo de prueba puede prepararse y utilizarse para los propósitos manifestados anteriormente, los cuales operan de acuerdo con un protocolo predeterminado (por ejemplo "competitivo", "emparedado" "anticuerpo doble", etc), y comprende: (a) un componente etiquetado que ha sido obtenido acoplando el miembro de enlace específico a una etiqueta detectable; (b) uno o más reactivos inmunoquímicos adicionales de los cuales al menos un reactivo es un ligando o un ligando inmovilizado, en donde el ligando se selecciona del grupo que consiste en: (i) un ligando con la capacidad de enlazar con el componente etiquetado (a); (ii) un ligando con la capacidad de enlazar con una parte de enlace del componente etiquetado (a); (¡ii) un ligando con la capacidad de enlazar con al menos uno de los componentes que será determinado; y (iv) un ligando con la capacidad de enlazar con al menos una de las partes de enlace de al menos uno del componente(s) que será determinado; y (c) direcciones para el desempeño de un protocolo para la detección y/o determinación de uno o más componentes de una reacción inmunoquímica entre el EFGR, el miembro de enlace específico y una parte de enlace específico del mismo.
De acuerdo con lo anterior, se puede preparar un sistema de ensayo para clasificar fármacos potenciales efectivos para modular la actividad del EFGR, la expresión aberrante o modificación post-traducción del EGFR, y/o la actividad de enlace del miembro de enlace específico. El receptor o miembro de enlace puede introducirse en el sistema de prueba, y el fármaco prospecto también se puede introducir en el cultivo celular resultante, y el cultivo puede ser revisado posteriormente para observar cualesquiera cambios en la actividad de fase S de las células, debido ya sea a la adición del fármaco prospecto sólo, o debido al efecto de cantidades agregadas del agente(s) conocido. Ácidos Nucleicos La presente invención proporciona además un ácido nucleico aislado que codifica un miembro de enlace específico de la presente invención. El ácido nucleico incluye ADN y ARN. En un aspecto preferido, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención tal como se definió anteriormente, incluyendo un CDR tal como se establece en los residuos de las cadenas VH y VL de los anticuerpos de la presente invención.
La presente invención también proporciona construcciones en la forma de plásmidos, vectores, cartuchos de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido tal como se indicó anteriormente.
La presente invención también proporciona una célula huésped recombinante que comprende una o más construcciones tal como se observó anteriormente. Un ácido nucleico que codifica cualquier miembro de enlace específico tal como se proporciona por sí mismo, forma un aspecto de la presente invención, y también un método de producción del miembro de enlace específico, en donde el método comprende expresión a partir de la codificación del ácido nucleico. La expresión puede lograrse convenientemente cultivando bajo condiciones adecuadas células huésped recombinantes que contienen el ácido nucleico. Después de la producción mediante expresión se puede aislar y/o purificar un miembro de enlace específico utilizando cualquier técnica adecuada, y posteriormente se utilizan como sea adecuado.
Los miembros de enlace específico y moléculas de ácido nucleico de codificación y vectores de acuerdo con la presente invención se pueden proporcionar aislar y/o purificar, por ejemplo desde su ambiente natural, en una forma sustancialmente pura u homogénea, o en el caso de ácido nucleico, libre o sustancialmente libre de ácido nucleico u orígenes de gen además de la secuencia que codifica un polipéptido con la función requerida. El ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, puede comprende ADN o ARN y puede ser completa o parcialmente sintético.
Los sistemas para clonación y expresión en polipéptido en una variedad de diferentes células huésped son bien conocidos. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamífero, levadura y sistemas de baculovirus. Las líneas celulares de mamífero disponibles en la técnica para expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster Chino, células HeLa, células de riñon de hámster bebe, células de melanoma de ratón NSO y muchas otras. Un huésped bacteriano preferido, común es E. coli.
La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo en células procarióticas tal como E. coli, está bien establecido en la técnica. Para revisión ver por ejemplo, la Publicación de Plucktun, A. Bio/Technology 9:545-551 (1991). La expresión de células eucarióticas en cultivo también está disponible para los expertos en la técnica como una opción para la producción de un miembro de enlace específico, para revisiones recientes consultar por ejemplo la Publicación de Raff, M. E. (1993) Curr. Opinión Biotech. 4:573-576; Trill J. J. y asociados, (1995) Curr.
Opinión Biotech 6:553-560.
Se pueden elegir o construir vectores adicionales que contengan secuencias reguladoras adecuadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias aumentadoras, genes marcadores y otras secuencias, según sea adecuado. Los vectores pueden ser plásmidos, virales por ejemplo fago o fagémido, según sea adecuado. Para detalles adicionales ver por ejemplo la Publicación de Clonación Molecular: Manual de Laboratorio: 2o Edición, Sambrook y asociados, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para manipulación de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación en construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión genética, y análisis de proteínas, se describen con detalle en la Publicación de Protocolos Cortos en Biología Molecular, Segunda Edición, Ausubel y asociados, eds., John Wiley & Sons, 1992. Las descripciones de Sambrook y asociados, y Ausubel y asociados, están incorporadas en la presente invención como referencia.
Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención proporciona una célula huésped que contiene un ácido nucleico tal como aquí se describe. Un aspecto aún adicional proporcionar un método que comprende la introducción de ácido nucleico en una célula huésped. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para células eucarióticas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección de fosfato de calcio, DEAE-Dextrano, electroporación , transfección transmitida por liposoma, y transduccion utilizando retrovirus y otros virus, por ejemplo, vacunas o para células de insecto, baculovirus. Para células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación de cloruro de calcio, electroporación y transcripción utilizando bacteriófago.
La introducción puede seguir, originando o permitiendo la expresión del ácido nucleico, por ejemplo cultivando células huésped bajo condiciones para expresión del gen.
En una modalidad, el ácido nucleico de la presente invención se integra en el genoma (por ejemplo, cromosoma) y en la célula huésped. La integración puede ser promovida mediante inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con técnicas estándar.
La presente invención también proporciona un método que comprende utilizar una construcción como se manifestó anteriormente en un sistema de expresión, con el objeto de expresar un miembro de enlace específico o polipéptido tal como se describió anteriormente.
Tal como se manifestó anteriormente, la presente invención se refiere a una molécula de ADN recombinante o gel clonado, o variante degenerado del mismo, que codifica un miembro de enlace específico, particularmente un anticuerpo o fragmento del mismo, que posee una secuencia de aminoácido establecida en las SEC ID NOS:2 y 4; 129 y 134; 22 y 27; 32 y 37; y/o 42 y 47, preferentemente una molécula de ácido nucleico, en particular una molécula de ADN recombinante o gen clonado, que codifica el miembro de enlace o anticuerpo, tiene una secuencia de nucleotido o es complementaria a una secuencia de ADN que codifica una de dichas secuencias.
Otra característica de la presente invención es la expresión de las secuencias de ADN descritas en la presente invención. Tal como se sabe en la técnica, las secuencias de ADN se pueden expresar mediante el enlace de las mismas a una secuencia de control de expresión en un vector de expresión adecuado y el empleo de dicho vector de expresión para transformar un huésped unicelular adecuado.
Dicho enlace operativo de una secuencia de ADN de la presente invención a una secuencia de control de expresión, por supuesto, incluye, si ya no es parte de la secuencia de ADN, la producción de un codón de inicio ATG, en la corriente ascendente del cuadro de lectura correcta de la secuencia de ADN.
Se puede emplear una amplia variedad de combinaciones de huésped/vector de expresión en la expresión de secuencias de ADN de la presente invención. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir en segmentos de secuencias de ADN cromosomal, no cromosomal sintética. Los vectores adecuados incluyen derivados de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos por ejemplo, plásmidos E. coli col E1, pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos tales como RP4; ADNs de fago, por ejemplo, los numerosos derivados de fago X, por ejemplo, NM989, y otro ADN de fago, por ejemplo, M13 y ADN de fago de hebra simple filamentosa; los plásmidos de levadura tales como el plásmido 2u o derivados del mismo; vectores útiles en células eucarióticas tales como vectores útiles en células del insecto o mamífero; vectores derivados de combinaciones de plásmidos sADN de fago, tales como plásmido que han sido modificados para emplear ADN de fago u otras secuencias de control de expresión; y similares.
Cualesquiera de un amplia variedad de secuencias de control de expresión - secuencias que controlan la expresión de la secuencia de ADN enlazado en forma operativa a las mismas - se pueden utilizar en estos vectores para expresión las secuencias de ADN de la presente invención, dichas secuencias de control de expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos o tardíos de SV40, CMV, vacuna, polioma o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el sistema LTR, las regiones operadoras y promotoras mayores del fago ?, las regiones de control de la proteína de recubrimiento fd, el promotor para cinasa de 3-fosfoglicerato y otras enzimas glucolíticas, los promotores de fosfatase de ácido (por ejemplo, Fo5), los promotores de factores de coincidencia de levadura y otras secuencias conocidas para controlar la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas o sus viruses, y varias combinaciones de los mismos.
También es útil una amplia variedad de células huésped unicelulares en la expresión de secuencias de ADN de la presente invención. Estos huéspedes pueden incluir huéspedes eucarioticos y procarioticos bien conocidos, tales como cepas de E. c o I i , Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos tales como levadura, y células animales tales como células CHO, YB/20, NSO, SP2/0, R1.1, B-W y L-M, células de riñon de Mono Verde Africano (por ejemplo, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, y BMT10), células de insecto (por ejemplo, Sf9), y células de humano y células de planta en cultivo de tejido.
Quedará entendido que no todos los vectores, secuencias de control de expresión y huéspedes funcionarán igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de la presente invención. Tampoco todos los huéspedes funcionarán igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto en la técnica tendrá la capacidad de seleccionar los vectores, secuencias de control de expresión y huéspedes adecuados sin experimentación indebida para lograr la expresión deseada sin apartarse del alcance de la presente invención. Por ejemplo, en la selección de un vector, el huésped puede ser considerado debido a que el vector debe funcionar en el mismo. El número de copias del vector, la capacidad de control de dicho número de copias, y la expresión de cualesquiera de otras proteínas codificadas por el vector, tal como marcadores antibióticos también serán consideradas.
En la selección de una secuencia de control de expresión, normalmente se tomarán en cuenta una variedad de factores. Estos incluyen por ejemplo, la fuerza relativa del sistema, su capacidad de control y su compatibilidad con la secuencia de ADN o gen particular que será expresado, particularmente con respecto a estructuras secundarias potenciales. Se seleccionarán los huéspedes unicelulares adecuados mediante consideración, por ejemplo, de su compatibilidad con el vector elegido, sus características de secreción, su capacidad de doblar correctamente las proteínas y sus requerimientos de fermentación, así como la toxicidad para el huésped del producto codificado a través de las secuencias de ADN que serán expresadas y la facilidad de purificación de los productos de expresión.
Considerando estos y otros factores, un experto en la técnica tendrá la capacidad de construir una variedad de combinaciones de huésped/secuencia de control de expresión/vector que expresaran las secuencias de ADN de la presente invención en fermentación o en cultivo animal a gran escala.
Se pretende además que los análogos del miembro de enlace específicos puedan ser preparados de secuencias de nucleótido del complejo/subunidad de proteína derivado dentro del alcance de la presente invención. Se pueden producir, por ejemplo, análogos tales como fragmentos, mediante digestión de pepsina del material del miembro de enlace específico. Otros análogos, tales como muteínas, se pueden producir mediante mutagénesis dirigida al sitio estándar de las secuencias de codificación del miembro de enlace específico. Se pueden identificar análogos que exhiben "actividad de miembro de enlace específico" tal como moléculas pequeñas, ya sea que funcionan como promotores o inhibidores, por medio de ensayos in vivo y/o in vi tro.
Tal como se mencionó anteriormente, se puede preparar en forma sintética, en lugar de clonarse, una secuencia de ADN que codifica un miembro de enlace específico. La secuencia de ADN puede ser diseñada con los codones adecuados para la secuencia de aminoácido del miembro de enlace específico. En general, se seleccionaran codones preferidos para el huésped proyectado, si la secuencia será utilizada para expresión. La secuencia completa es ensamblada de los oligonucleotidos de traslape preparados a través de métodos estándar y ensamblado en una secuencia de codificación completa, ver por ejemplo las Publicaciones de Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair y asociados, Science, 223:1299 (1984); Jay y asociados, J. Biol. Chem., 259:6311 (1984).
Las secuencias de ADN sintético permiten la construcción conveniente de genes que expresarán los análogos o "muteínas" del miembro de enlace específico. Como alternativa, las muteínas que codifican ADN pueden elaborarse mediante mutagénesis dirigida al sitio de genes del miembro de enlace específico nativos o cADNs, y las muteínas se pueden elaborar directamente utilizando síntesis de polipéptido convencional.
Un método general para la incorporación específica en el sitio de aminoácidos no naturales en proteínas se describe en las Publicación de Christofer J. Noren, Spencer J. Antony-Cahill, Michael C. Griffit, Peter G. Schultz, Science, 244:182-188 (Abril 1989). Este método también se puede utilizar para ser análogos con aminoácidos no naturales.
La presente invención se extiende a la preparación de oligonucleótidos antisentido y ribozimas que pueden ser utilizadas para interferir con la expresión del EGFR en el nivel de traducción. Este método utiliza ácido nucleico antisentido y ribozimas para bloquear la traducción de un mARN específico, ya sea cubriendo dicho mARN con un ácido nucleico antisentido o disociándolo con una ribozima.
Los ácidos nucleicos antisentido son moléculas de ADN o ARN que son complementarias para al menos una porción de una molécula de mARN específica (Ver la Publicación de Weintraub, 1990; Marcus-Sekura, 1988). En la célula, hibridan a dicho mARN, formando una molécula de hebra doble. La célula no traduce un mARN en esta forma de hebra doble. Por consiguiente, los ácidos nucleicos antisentido interfieren con la expresión de mARN en la proteína. Los oligómeros de aproximadamente 15 nucleótidos y moléculas que hibridan al codón de inicio AUG serán particularmente eficientes, ya que son fáciles de sintetizar y probablemente poseen menos problemas que las moléculas más grandes cuando se introducen en la producción de células. Se han utilizado métodos antisentido para inhibir la expresión de muchos genes in vitro (Marcus-Sekura, 1988; Hambor y asociados, 1988).
Las ribozimas son moléculas de ARN que poseen la capacidad de disociar específicamente otras moléculas de ARN de hebra simple en una forma un tanto análoga a las endonucleasas de restricción de ADN. Las ribozimas fueron descubiertas desde la observación de que ciertos mARNs tienen la capacidad de extirpar sus propios intrones. A través de la modificación las secuencias de nucleótidos de estas ARNs, los investigadores tienen la capacidad de construir moléculas que reconocen secuencias de nucleótido específicas en moléculas de ARN y disociarlas (Cech, 1988.). Debido a que son específicas de la secuencia, únicamente los mARNs con secuencias particulares son desactivados.
Los investigadores han identificado dos tipos de ribozimas, tipo tetrahimena y tipo "cabeza de martillo" (Hasselhoff y Gerlach, 1988). Las ribozimas tipo tetrahimena reconocen secuencias a base de 4, en tanto que el tipo "cabeza de martillo" reconoce secuencias a base de 11 a 18. Entre más grande es la secuencia de reconocimiento, es más probable que ocurra exclusivamente la especie de mARN objetivo. Por consiguiente, las ribozimas tipo cabeza de martillo son preferibles a las ribozimas tipo tetrahimena para desactivar una especie de mARN específica, y son preferidas las secuencias de reconocimiento de 18 bases a las secuencias de reconocimiento más corto.
Las secuencias de ADN aquí descritas pueden ser utilizadas por lo tanto para preparar moléculas antisentido contra, y ribozimas que disocian los mARNs para EFGRs y sus ligandos.
La presente invención podrá ser mejor comprendida mediante la referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, los cuales se proporcionan como ejemplos de la presente invención. Los siguientes ejemplos se presentan con el objeto de ilustrar en forma más completa las modalidades preferidas de la presente invención, y no deben ser construidos, sin embargo, como limitantes del amplio alcance de la presente invención.
Ejemplo 1 Generación v Aislamiento de Anticuerpos Líneas Celulares Para inmunización y análisis de especificidad, se utilizaron diversas líneas celulares, nativas o transfectadas ya sea con el gen normal, tipo silvestre o "wtEGFR" o el gen AEGFR que lleva la mutación de eliminación ?2-7: Línea de célula de fibroblasto de múrido NR6, NR6¿EGFR (transfectado con AEGFR) y NR6 wtEGFR (transfectado con wtEGFR), línea de célula de glioblastoma humana U87MG (expresión de bajo nivel wtEGFR endógeno), U87MGwtEGFR (transfectado con wtEGFR), U87MGAEGFR (transfectado con AEGFR), y línea de célula de carcinoma de célula escamosa humana A431 (altos niveles de expresión de wtEGFR).
Para inmunización de análisis de especificidad, se utilizaron diversas líneas celulares, nativas o transfectadas ya sea con el gen normal, tipo silvestre o "wtEGFR" el gen AEGFR que lleva la mutación de eliminación ?2-7: Línea de célula de fibroblasto de múrido NR6, NR6AEGFR (transfectado con AEGFR) y NR6wtEGF (transfectado con wtEGFR), línea de célula de glioblastoma humana U87MG (expresión de bajo nivel wtEGFR endógeno), U87MGwtEGFR "U87MG. wtEGFR" (transfectado con wtEGFR), U87MGAEGFR o "U87MG.A2-7" (transfectado con AEGFR), y línea de célula de carcinoma de célula escamosa humano A431 (que expresa altos niveles de wtEGFR). Las líneas celulares NR6, NR6¿EGFR, Y NR6wtEGFR se describieron previamente (Batra y asociados, (1995) Potencial de Transformación Celular, Desactivada, Independiente de Ligando de Factor de Crecimiento Epidérmico de Uso en EGFRvIll Mutante Humano que Ocurre Naturalmente. Cell Growt Differ. 6(10): 1251-1259). La línea celular NR6 carece de EGFR endógeno normal. (Batra y asociados, 1995). Las líneas celulares U87MG y las transfecciones fueron descritas previamente (Nishikawa y asociados, (1994). Un receptor de factor de crecimiento epidérmico mutante es común en glioma humano y confiere tumor y genecidad mejorada. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 91, 7727-7731).
La línea de célula de astrocitoma U87MG (Ponten, J. y Macintyre, E. H. (1968) Cultivo a largo plazo de glia humana normal y neoplástica. Acta. Patol. Microbiol . Scand. 74, 465-86) que expresa en forma endógena a bajos niveles de wtEGFR, se infectó con un retrovirus que contiene el EGFR de2-7 para producir la línea de célula U87MG.A2-7 (Nishikawa y asociados, 1994). La línea de célula transfectada U87MG. wtEGFR fue producida tal como se describe en la Publicación de Nagane y asociados, (1996) Cáncer Res. 56, 5079-5086. Mientras que las células U87MG se expresan aproximadamente 1 x 105 EGFR, las células U87MG. wtEGFR expresan aproximadamente 1 x 106 EGFR, y por lo tanto mimetiza la situación observada con amplificación de gen. La línea de célula pro-B de múrido BaF/3, que no expresa cualesquiera moléculas relacionadas EGFR, conocidas, también se transfectó con EGFR de2-7 dando como resultado la línea de célula BaF/3. ?2-7 (Luwor y asociados, (2004). El receptor de factor de crecimiento epidérmico de2-7 especifico de tumor (EGFR) promueve la supervivencia celular y heterodimeriza con EGFR tipo silvestre, Oncogene 23: 6095-6104). Se obtuvieron células de carcinoma escamoso A431 humano en ATCC (Rockville, MD). La línea de célula de carcinoma epidermoide A431 ha sido descrita anteriormente (Sato y asociados, (1987). Derivación y ensayo de efectos biológicos de anticuerpos monoclonales a receptores de factor de crecimiento epidérmico. Methods Enzymol. 146, 63-81).
Todas las líneas celulares fueron cultivadas en DMEM/F-12 con GlutaMAX™ (Life Technologies, Inc, Melbourne, Australia y Grand Island, NY) suplementado con 10% FCS (CSL, Melbourne, Australia); 2 mM de glutamina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), y penicilina/estreptomicina (Life Technologies, Inc, Grand Island, NY). Además, se mantuvieron las líneas de célula U87MG.A2-7 y U87MG . wtEG FR en 400 mg/ml de geneticina (Life Technologies, Inc, Melbourne, Victoria, Australia). Las líneas celulares se crecieron en 37°C en una atmósfera no modificada de 5% C02.
Reactivos El péptido de unión única EGFR de2-7 tiene la secuencia de aminoácido: LEEKKGNYVVTDH (SEC ID NO:13). Los péptidos de unión única biotinilados (Biotin -LEEKKGNYVVTDH (SEC ID NO:5) y LEEKKGNYVVTDH -Biotin (SEC ID NO:6)) de EGFR de2-7 fueron sintetizados mediante química Fmoc y pureza estándar (>6%) determinados mediante HPLC de fase inversa y análisis de espectro de masa (Auspep, Melbourne, Australia) .
Anticuerpos utilizados en estudios Con el objeto de comparar nuestros descubrimientos con otros reactivos, se incluyeron en estos estudios mAbs adicionales. Estos reactivos fueron mAb528 para wtEGFR (Sato y asociados, (1983) Med. Biol. Med. 1(5), 511-529) y DH8.3, que fue generado contra un péptido sintético que abarca la secuencia de unión de la mutación de eliminación ?2-7 EGFR. El anticuerpo DH8.3 (lgG1), que es específico para EGFR de2-7, ha sido descrito previamente (Hills y asociados, (1995) Dirección específica de un receptor EGF activado, mutante encontrado en glioblastoma utilizando anticuerpo monoclonal. Int. J. Cáncer. 63, 537-43,1995) y se obtuvo después de inmunización de ratones con el péptido de unión único encontrado en EGFR de2-7 (Hills y asociados, 1995).
El anticuerpo 528, que reconoce tanto EGFR de2-7 como tipo silvestre, ha sido descrito previamente (Masui y asociados, (1984) Inhibición de crecimiento de células de tumor humano en ratones atímicos mediante anticuerpos monoclonales de factor de crecimiento anti-epidérmico. Cáncer Res. 44, 1002-7) y se produjo en la Instalación de Producción Biológica del Instituto Ludwig de Cáncer Research (Melbourne, Australia) utilizando un hibridoma (ATCC HB-8509) es obtenido en la Recolección de Tipo Americano (Rockville, MD). El anticuerpo policlonal SC-03 es un anticuerpo policlonal de conejo purificado con afinidad elevado contra un péptido de terminal carboxi del EGFR (Santa Cruz Biotechnology Inc).
Generación de Anticuerpo La línea de fibroblasto de múrido NR6AEGF se utilizó como un inmunogen. Los hibridomas de ratón fueron generados inmunizando ratones BALB/c 5 veces en forma subcutánea en 2 a 3 intervalos de tiempo con células 5 x 105 - 2 x 106 en un adyuvante. El adyuvante completo de Freund fue utilizado para la primera inyección. Posteriormente, el adyuvante de Freund incompleto (Difco™, Voigt Global Distribution, Lawrence, KS) fue utilizado. Las células de bazo de los ratones inmunizados se fusionaron con la línea de célula de mieloma de ratón SP2/0 (Shulman y asociados, (1978) Nature 276:269-270). Los sobrenadantes de clones recientemente generados fueron clasificados en ensayos de hema-absorción para reactividad con la línea celular NR6, N R6W†EGFR y NR6 ? E G FR y posteriormente se analizaron mediante ensayos de hema-absorción con líneas celulares de glioblastoma humano U87MG, U87MGWTEGFR, y U87AEGFR- Los sobrenadantes del hibridoma seleccionados fueron probados en forma subsecuente mediante manchado western y analizados en forma adicional mediante inmunohistoquímica. Los mAbs generaron recientemente que muestran el patrón de reactividad esperado, fueron purificados.
Se establecieron 5 hibridomas y 3 clones, 124 (lgG2a), 806 (lgG2b), y 1133 (lgG2a) fueron seleccionados inicialmente para caracterización adicional de base en un titulador de alto nivel (1:2500) con NR6AEGFR, y UN fondo de bajo nivel en células NR6, NR6wtEGFR, en el ensayo de hemaglutinación de roseta. Posteriormente se caracterizó en forma adicional un cuarto clon 175 (lgG2a), y se describe por separado en el Ejemplo 23, que se encuentra más adelante. En un análisis de hemaglutinación subsecuente, estos anticuerpos no mostraron reactividad (sobrenadante no diluido <10%) con la línea de célula de glioblastoma humana nativo U87MG y U87MGwtEGFR, pero fueron altamente reactivos con U87MGAEGFR; se observó menos reactividad con A431. En contraste, el análisis FACS, 806 fue no reactivo con U87 G nativo y fue manchado en forma intensa U87MG AEGFR) a un menor grado U87MGwtEGFR indicando el enlace de 806 a tanto AEGFR como wtEGFR (ver más adelante).
El ensayo de manchado Western, se analizaron posteriormente mAb124, mAb806 y mAb1133 para reactividad con wtEGFR y AEGFR. Se extractaron lisados de detergente de NR6AEGFR> ?87?T????? así como de A431. Los tres mAbs mostraron un patrón de reactividad similar con lisados celulares que manchan tanto la proteína wtEGFR (170 kDa) como AEGFR (140 kDa). Como un reactivo de referencia, se utilizó mAbR.I. conocido como reactivo con wtEGFR (Waterfield y asociados, (1982) J. Cell Biochem. 20(2), 149-161) en lugar de mAb-528, que es conocido como no reactivo en análisis de manchado western. mAbR.I. mostró reactividad con AEGFR y tipo natural. Los tres clones generados recientemente mostraron actividad con AEGFR y menos intense con wtEGFR. DH8.3 fue únicamente positivo en el lisado de U87MGAEGFR y NR6 AEGFR- El análisis inmunohistoquímico de clones 124, 806, y 1133 así como mAb528 y mAbDH8.3 en tumores de xenoinjerto U87MG, U87MG ÍEGF I y A431 , se muestra en la tabla 1. Todos los mAbs mostraron un fuerte manchado de xenoinjerto U87MAGEGFR- Únicamente mAb528 mostró reactividad débil en el xenoinjerto U87MG nativo. En los xenoinjertos A431, mAb528 mostró fuerte reactividad homogénea. mAb124, mAb806, y mAb1133 revelaron reactividad con casi todas las células localizadas en forma basal del carcinoma de células escamosa de A431 y no reaccionaron con las capas de las células superior o el componente de queratinización. DH8.3 fue negativo en xenoinjertos A431.
Del carcinoma de célula escamosa A431 y no reacciona con las capas superiores de la célula o el componente de queratinización. DH8.3 fue negativo en xenoinjertos A431.
Tabla 1 Análisis Inmunohistoquímico de Anticuerpos 528. DH8.3 v 12.806 v 1133 Anticuerpo Xenoinjerto Xenoinjerto A431 Xenoinjerto AU87MGAEGFR U87MG (nativo) mAb528 pos. pos. pos. (manchado focal) mAb124 pos. pos. (predominantemente - células básales) mAb806 pos. pos. (predominantemente - células básales) mAb1133 pos. pos. (predominantemente - células básales) DH8.3 pos. - - Manchado estromal menor debido a detección de anticuerpos de ratón endógenos.
Secuenciación Las cadenas pesadas variables (VH) y ligeras variables (VL) de mAb806, mAb124 y mAb1133 fueron secuenciadas, y se identificaron sus regiones de determinación de complementariedad (CDRs), tal como se indica a continuación. mAb806 Cadena mAb806 VH: secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO:1) y secuencia de aminoácido, con péptido de señal (SEC ID NO:2) se muestran en las figuras 14A y 14B, respectivamente (el péptido de señal subrayado en la figura 14B). Las regiones de determinación de complementariedad CDR1 , CDR2, y CDR3 (SEC ID NOS: 15, 16, y 17, respectivamente) están indicadas mediante subrayado en la figura 16. La secuencia de aminoácido de cadena mAb806 VH sin su péptido de señal (SEC ID NO:11) se muestra en la figura 16.
Cadena mAb806 VL: secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO:3) y secuencia de aminoácido, con péptido de señal (SEC ID NO:4) se muestran en las figuras 15A y 15B, respectivamente (el péptido de señal subrayado en la figura 15B). Las regiones de determinación de complementariedad CDR1, CDR2, y CDR3 (SES ID NOS: 18, 19, y 20, respectivamente) están indicadas mediante subrayado en la figura 17. La secuencia de aminoácido de cadena mAb806 VL sin su péptido de señal (SEC ID NO:12) se muestra en la figura 17. mAb124 Cadena mAb124 VH: secuencias de ácido nucleico (SEC ID NO:21) y secuencias de aminoácido (SEC ID NO:22) se muestran en las figuras 51A y 51B, respectivamente. Las regiones de determinación de complementariedad CDR1, CDR2, y CDR3 (SEC ID NOS: 23, 24, y 25, respectivamente) se indican mediante subrayado.
Cadena mAb124 VL: secuencias de ácido nucleico (SEC ID NO:26) y secuencias de aminoácido (SEC ID NO:27) se muestran en las figuras 51C y 51D, respectivamente. Las regiones de determinación de complementariedad CDR1, CDR2, y CDR3 (SEC ID NOS: 28, 29, y 30, respectivamente) se indican mediante subrayado. mAb1133 Cadena mAb1113 VH: secuencias de ácido nucleico (SEC ID NO:31) y secuencias de aminoácido (SEC ID NO:32) se muestran en las figuras 52A y 52B, respectivamente. Las regiones de determinación de complementariedad CDR1, CDR2, y CDR3 (SEC ID NOS: 33, 34, y 35, respectivamente) se indican mediante subrayado.
Cadena mAb1133 VL: secuencias ácido nucleico (SEC ID NO:36) y secuencias de aminoácido (SEC ID NO:37) se muestran en las figuras 52C y 52D, respectivamente. Las regiones de determinación de complementariedad CDR1, CDR2, y CDR3 (SEC ID NOS: 38, 39, y 40, respectivamente) se indican mediante subrayado.
Ejemplo 2 Enlace de Anticuerpos a Líneas Celulares mediante FACS Se seleccionó inicialmente mAb806 para caracterización adicional, tal como se establece en la presente invención y en los siguientes Ejemplos. Se seleccionaron también mAb124 y mAb1133 para caracterización adicional tal como se describe en el Ejemplo 26 que se encuentra más adelante, y se descubrió que tienen propiedades que corresponde a las propiedades únicas de mAb806 descrito en el presente documento.
Con el objeto de determinar la especificidad de mAb806, se analizó su enlace a células U87MG, U87MG.A2-7 y U87MG.wtEGFR mediante clasificación de célula activada con flujo (FACS). En síntesis, las células fueron etiquetadas con el anticuerpo relevante (10 ng/ml) seguido de IgG anti-ratón de cabra conjugado con fluoresceína (1 :100 dilución; Calbiochem San Diego, CA, USA; Becton-Dickinson FarMingen, San Diego, CA, US) tal como se describió anteriormente (Nishikawa y asociados, 1994). Se obtuvieron los datos FACS en un Coulter Epics Elite ESP observando un mínimo de 5,000 eventos y analizados utilizando EXPO (versión 2) de Windows. Se incluyó un lgG2b irrelevante como un control de isotipo para mAb806 y se incluyó el anticuerpo 528 ya que reconoce tanto de2-7 como wtEGFR. Únicamente el anticuerpo 528 tuvo la capacidad de manchar la línea de célula U87 G de origen (figura 1) consistente con reportes previos que demuestran que estas células expresan el wtEGFR (Nishikawa y asociadosm 1994). mAb806 y DH8.3 tuvieron niveles de enlace similares al anticuerpo de control, demostrando claramente que no tienen la capacidad de enlazar al receptor tipo silvestre (figura 1). El enlace del anticuerpo de control de isotipo a células U87MG.A2-7 y U87MG. wtEGFR fue similar al observado para las células U87MG. mAb806 manchó células U87MG.A2-7 y U87MG. wtEGFR, indicando que mAb806 reconoce en forma más específica el EGFR de2-7 y EGFR amplificado (figura 1). El anticuerpo DH8.3 manchó células U87MG.A2-7, lo que confirma que el anticuerpo DH8.3 reconoce en forma específica el EGFR de2-7 (figura 1). Tal como se espera, el anticuerpo 528 manchó líneas de célula tanto U87MG.A2-7 como U87M G . wtEG FR (figura 1). Tal como se espera, el anticuerpo 528 manchó U87MG.A2-7 con una mayor intensidad que la célula de origen, ya que enlaza a los receptores tanto de2-7 como tipo natural que se expresan en conjunto en estas células (figura 1). Se obtuvieron resultados similares utilizando una hema-absorción mezclada con proteína A, que detecta el IgG enlazado en la superficie mediante la aparición de la Proteína A recubierta con glóbulos rojos humanos (grupo O) a células objetivo. El anticuerpo monoclonal 806 fue reactivo con células U87MG.A2-7 pero no mostró reactividad significativa (sobrenadante no diluido menor a 10%) con U87MG que expresa EGFR tipo silvestre. De manera importante, mAb806 también enlazó la línea de célula BaF/3.A2-7, demostrando que la expresión conjunta de wtEGFR no es un requerimiento para la reactividad mAb806 (figura 1).
Ejemplo 3 Enlace de Anticuerpos en ensayos Para caracterizar en forma adicional la especificidad de mAb806 y el anticuerpo DH8.3, se revisó su enlace mediante ELISA. Se utilizaron dos tipos de ELISA para determinar la especificidad de los anticuerpos. En el primer ensayo, se recubrieron placas con sEGFR (10 ng/ml en 0.1 M de amortiguador de carbonato pH 9.2) durante 2 horas y posteriormente se bloquearon con 2% de albúmina de suero humano (HSA) en PBS. sEGFR es el dominio extracelular recombinante (aminoácidos 1-621) del EGFR tipo natural), y se produjo tal como se describió previamente (Domagala y asociados, (2000) Análisis de Estequiometria, cinéticos y de enlace de la interacción entre el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) y el Dominio Extracelular del receptor EGF. Growt Factors. 18, 11-29). Se agregaron anticuerpos a los depósitos por triplicado en una concentración en incremento en 2% HSA en solución salina amortiguada por fosfato (PBS). El anticuerpo enlazado se detectó mediante IgG anti-ratón de oveja conjugado con peroxidasa de rábano (Silenus, Melbourne, Australia) utilizando ABTS (Sigma, Sydney, Australia) como un substrato, y la absorbancia se midió en 405 nm.
Los anticuerpos tanto mAb806 y como 528 mostraron curvas de enlace dependientes de la dosis y de saturación al sEGFR tipo silvestre inmovilizado (figura 2A). Ya que el único péptido de unión encontrado en el EGFR de2-7 no estaba contenido dentro de sEGFR, mAb806 debe enlazar a un epítope localizado dentro de la secuencia EGFR tipo silvestre. El enlace del anticuerpo 528 fue menor que el observado para mAb806, debido probablemente a que reconoce un determinante de conformación. Tal como se espera, el anticuerpo DH8.3 no enlaza al sEGFR tipo natural, incluso en concentraciones de hasta 10 Mg/ml (figura 2A). Aunque sEGFR en la solución inhibió el enlace del anticuerpo 528 al sEGFR inmovilizado en una forma dependiente de la dosis, no tuvo la capacidad de inhibir el enlace de mAb806 (figura 2B). Esto sugiere que mAb806 puede enlazar únicamente EGFR tipo silvestre una vez inmovilizado en placas ELISA, un proceso que puede inducir a cambios en la conformación. Se observaron resultados similares utilizando un BIAcore, mediante lo cual mAb806 enlazó a sEGFR inmovilizado, pero mAb806 inmovilizado no tuvo la capacidad de enlazar a sEGFR en la solución (figura 2C).
Después de la desnaturalización calentando durante 10 minutos a una temperatura de 95°C, sEGFR en la solución tuvo la capacidad de inhibir el enlace de mAb806 a sEGFR inmovilizado (figura 2C), confirmando que mAb806 puede enlazar al EGFR tipo silvestre bajo ciertas condiciones. De manera interesante, el sEGFR desnaturalizado no tuvo la capacidad de inhibir el enlace del anticuerpo 528 anticuerpo (figura 2C), lo que demuestra que este anticuerpo reconoce un epítope de conformación. El anticuerpo DH8.3 exhibió enlace dependiente de la dosis y saturable al péptido EGFR de2-7 único (figura 2D). Ni mAb806 ni el anticuerpo 528 enlazaron al péptido, incluso en concentraciones mayores a las utilizadas para obtener el enlace de saturación DH8.3, indicando además que mAb806 no reconoce un determinante de epítope dentro de este péptido.
En el segundo ensayo, el péptido específico de2-7 biotinilado (Biotin-LEEKKGNYVVTDH (SEC ID NO:5)) fue enlazado a placas ELISA recubiertas previamente con estreptavidina (Pierce, Rockford, Illinois). Los anticuerpos fueron enlazados y detectados como en el primer ensayo. Ni mAb806 ni el anticuerpo 528 se enlazaron al péptido, incluso en concentraciones mayores a las utilizadas para obtener el enlace de saturación de DH8.3, indicando además que mAb806 no reconoce un determinante de epítope dentro de este péptido.
Para demostrar en forma adicional que mAb806 reconoce un epítope distinto al péptido de unión, se llevaron a cabos experimentos adicionales. Se utilizó el péptido de2-7 biotinilado C-terminal (LEEKKGNYVVTDH-Biotin (SEC ID NO:6)) en estudios con mAb806 y mAbL8A4, generados contra el péptido de2-7 (Reist y asociados, (1995) Cáncer Res. 55(19), 4375-4382; Foulon y asociados, (2000) Cáncer Res. 60(16), 4453-4460).
Reactivos utilizados en Estudios de Péptido Péptido de unión: LEEKKGNYWTDH-OH (Biosource, Camarillo, CA); Péptido C: LEEKKGNYWTDH(K-Biot)-OH (Biosource, Camarillo CA); sEGFR: dominio extracelular soluble recombinante derivado de células-CHO (aminoácidos 1-621) del EGFR tipo silvestre (LICR Melbourne); mAb806: Anticuerpo monoclonal de ratón lgG2b (LICR NYB); mAbl_8A4: Anticuerpo monoclonal de ratón, IgGi (Duke University); mAb control de isotipo IgGi; mAb control de isotipo lgG2_.; El péptido C fue inmovilizado en un chip de microsensor de estreptavidina en una densidad de superficie de 350RU (+/-30RU). Se probaron diluciones en serie de mAbs para reactividad con el péptido. Se llevaron a cabo experimentos de bloqueo utilizando un péptido no biotinilado para evaluar la especificidad. mAbl_8A4 mostró fuerte reactividad con el Péptido C incluso en concentraciones de anticuerpo de bajo nivel (6.25 nM) (figura 2E). mAb806 no mostró reactividad específica detectable con el Péptido C hasta en concentraciones de anticuerpo de 100 nM (la mayor concentración probada) (figuras 2E y 2F). Se esperó que mAbl_8A4 pudiera reaccionar con Péptido C debido a que el péptido fue utilizado como el inmunogen en la generación de mAbL8A4. Además el Péptido de Unión (no biotinilado, 50 ng/ml) bloquea completamente la reactividad de mAbl_8A4 con Péptido C, confirmando la especificidad del anticuerpo para el epítope del péptido de unión.
En un segundo conjunto de experimentos BIAcore, se inmovilizó sEGFR en un chip de microsensor CM en una densidad de superficie de -4000RU. Se probaron diluciones en serie de mAbs para reactividad con sEGFR. mAb806 fue fuertemente reactivo con sEGFR desnaturalizado, en tanto que mAbl_8A4 no reacciona con sEGFR desnaturalizado. La reactividad de mAb806 con sEGFR desnaturalizado disminuye con la disminución de las concentraciones de anticuerpo. Se esperó que mAbL8A4 no reaccionara con sEGFR debido a que mAbl_8A4 fue generada utilizando el péptido de unión como el inmunogen y sEGFR no contiene el péptido de unión.
También se llevaron a cabo experimentos de manchado inmune de punto-mancha. Se mancharon diluciones en serie de péptido en 0.5 µ? sobre membrana de PVDF o nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con 2% de BSA en PBS, y posteriormente se probaron con 806, L8A4, DH8.3 y anticuerpos de control. Los anticuerpos L8A4 y DH8.3 se enlazaron al péptido en las membranas (datos no mostrados). mAb806 no enlazó al péptido en concentraciones en donde L8A4 mostró claramente enlace (datos no mostrados). Los anticuerpos de control también fueron negativos para el enlace de péptido. mAb806 se enlazó al wtEGFR en Usados celulares después de inmunomanchado (resultados no mostrados). Esto es diferente a los resultados obtenidos en el anticuerpo DH8.3, los cuales reaccionaron con EGFR de2-7 pero no con wtEGFR. Por lo tanto, mAb806 puede reconocer el wtEGFR después de desnaturalización pero no cuando el receptor está en su estado natural en la superficie celular.
Ejemplo 4 Análisis de Rayado Se llevó a cabo un análisis de rayado utilizando células U87MG.A2-7 seguido de corrección para inmunoreactividad con el objeto de determinar la afinidad relativa de cada anticuerpo. Los anticuerpos fueron etiquetados con 125l (Amrad, Melbourne, Australia) mediante el método de Cloramina T y la inmunoreactividad fue determinada mediante ensayo Lindmo (Lindmo y asociados, (1984) Determinación de la fracción inmunoreactiva de anticuerpos monoclonales radioetiquetados mediante extrapolación lineal para enlazar con un exceso infinito de antígeno. J. Immunol. Metods. 72, 77-89).
Todos los ensayos de enlace fueron llevados a cabo en 1% HSA/PBS en 1-2 x 106 de células U87MG.A2-7 o A431 vivas durante 90 minutos a una temperatura de 4°C con rotación suave. Se utilizó una concentración de conjunto de 10 ng/ml de anticuerpo etiquetado con 125l en la presencia de concentraciones en incremento del anticuerpo no etiquetado adecuado. Se determinó el enlace no específico en la presencia de un exceso de 10,000 veces de anticuerpo no etiquetado. Ni el mAb806 radioetiquetado 25l o el anticuerpo DH8.3 enlazó a células U87MG de origen. Después que se completó la incubación, las células fueron lavadas y contadas con respecto a anticuerpo etiquetado 125l enlazado utilizando un contador gamma COBRA II (Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA).
Tanto el mAb806 como el anticuerpo DH8.3 retuvieron la alta inmunoreactividad cuando se yodinaron, y normalmente fue mayor a 90% para mAb806 y 45% a 50% para el anticuerpo DH8.3. mAb806 tuvo un afinidad para el receptor EGFR de2-7 de 1.1 x 109 M 1 en tanto que la afinidad de DH8.3 fue aproximadamente 10 veces menor en 1.0 x 108 M"1. Ningún anticuerpo yodinado enlazó a células de origen U87MG. mAb806 reconoció un promedio de 2.4 x 105 sitios de enlace por célula con el anticuerpo DH8.3 enlazando un promedio de 5.2 x 105 sitios. Por lo tanto, no hubo únicamente un buen acuerdo en el número del receptor entre los anticuerpos, sino también con un reporte previo que muestra 2.5 x 105 receptores de2-7 por célula tal como se mide a través de un diferente anticuerpo específico de EGFR de2-7 en la misma línea celular (Reist y asociados, (1997) Dirección mejorada de un anticuerpo monoclonal de variante III de receptor de factor de crecimiento anti-epidérmico en xenoinjertos de tumor después de etiquetado, utilizando 5-yodo-3-piridinacarboxilato de N-succinimidilo. Cáncer Res. 57, 1510-5).
Ejemplo 5 Internalización de Anticuerpos mediante Células U87MG.A2-7 El rango de internalización de anticuerpo después del enlace a una célula objetivo, influencia tanto sus propiedades de dirección de tumor como opciones terapéuticas. En consecuencia, los inventores revisaron la internalización de mAb806 y el anticuerpo DH8.3 después del enlace a células U87MG.A2-7 mediante FACS. Las células U87MG.A2-7 fueron incubadas ya sea con mAb806 o el anticuerpo DH8.3 (10 ug/ml) durante 1 hora en DMEM a una temperatura de 4°C. Después de lavado, las células fueron transferidas al DMEM templado previamente a una temperatura de 37°C y las alícuotas se tomaron en diversos puntos de tiempo después de la incubación a una temperatura de 37°C. Se detuvo la internalización lavando inmediatamente las alícuotas en amortiguadores de lavado empleado con hielo (1% HSA/PBS). Al término del tiempo, las células fueron manchadas mediante FACS, tal como se describió anteriormente. Se calculó el porcentaje de internalización comparando el manchado de anticuerpo de superficie en varios puntos de tiempo al tiempo cero, utilizando la fórmula: % de anticuerpo internalizado: (fluorescencia promedio en tiempox - fluorescencia de fondo)/(fluorescencia promedio en tiempo0 - fluorescencia de fondo) x 100. Este método fue validado en un ensayo utilizando un anticuerpo yodinado (mAb806), para medir la internalización tal como se describió anteriormente (Huang y asociados, (1997). La actividad tumorigénica mejorada de un receptor de factor de crecimiento epidérmico muíante común en cánceres humanos, se transmite a través de niveles de umbral de fosforilación de tirosina constitutiva y señalización no atenuada. J. Biol. Chem. 272, 2927-35). Las diferencias en el rango de internalización en diferentes puntos de tiempo se compararon utilizando la prueba-t del estudiante. A través de esta investigación, se analizaron datos para significancia mediante prueba-t del estudiante, excepto para los ensayos de supervivencia in vivo, los cuales fueron analizados mediante análisis Wilcoxon.
Ambos anticuerpos mostraron internalización relativamente rápida alcanzando niveles de estado constante en 10 minutos para mAb806 y 30 minutos para DH8.3 (figura 3). La internalización de DH8.3 fue significativamente mayor tanto en términos de rango (80.5% de DH8.3 de internalizado en 10 minutos en comparación con 36.8% para mAb806, p < 0.01) y una cantidad total internalizada en 60 minutos (93.5% versus 30.4%, p < 0.001). mAb806 mostró niveles significativamente menores de internalización a los 30 y 60 minutos en comparación con 20 minutos en los 4 ensayos llevados a cabo (figura 3). Este resultado también fue confirmado utilizando un ensayo de internacionalización basado en mAb806 yodinado (datos no mostrados).
Ejemplo 6 Análisis de Microscopio de Electrón de I nternalización de Anticuerpo Debido a la diferencia probada anteriormente en los rangos de ¡nternalización entre los anticuerpos, se llevó a cabo un análisis detallado del tráfico intracelular de anticuerpo utilizando microscopio de electrones.
Se crecieron células 4U87MGA2-7 en rebanadas de cámara recubiertas con gelatina (Nunc, Naperville, IL) hasta el 80% de confluencia, y posteriormente se lavaron con DMEM enfriado con hielo. Posteriormente las células fueron incubadas con mAb806 y el anticuerpo DH8.3 en DMEM durante 45 minutos a una temperatura de 4°C. Después del lavado, las células fueron incubadas durante 30 minutos adicionales con IgG antiratón conjugado con oro (20 nm partículas) (BBInternational, Cardiff, UK) a una temperatura de 4°C. Después de un lavado adicional, se agregó DMEM/10% PCS templado previamente a las células, las cuales fueron incubadas a una temperatura de 37°C durante varios tiempos de 1 a 60 minutos. La ¡nternalización del anticuerpo fue detenida a través de medios enfriados con hielo y las células se fijaron con glutaraldehído al 2.5% en PBS/0.1% HSA y posteriormente se fijaron en 2.5% tetróxido de osmio. Después de la deshidratación a través de series de acetona graduadas, las muestras fueron incrustadas en resina Epon/Araldite, se cortaron como secciones ultradelgadas con micrótomo Reichert Ultracut-S (Leica) y se recolectaron en rejillas de níquel. Las secciones fueron manchadas con acetato de uranilo y citrato de plomo antes de ser vistas en un microscopio de electrón de transmisión Filips CM12 en 80 kV. El análisis estadístico de los granos de oro contenido en las picaduras recubiertas, se llevó a cabo utilizando una prueba Chi-square.
Aunque el anticuerpo DH8.3 fue internalizado en forma predominante a través de picaduras-recubiertas, mAb806 pareció ser internalizado mediante macropinocitosis (figura 19). De hecho, un análisis detallado de 32 picaduras recubiertas formadas en células incubadas con mAb806, reveló que ninguna de ellas contenía anticuerpo. En contraste, aproximadamente el 20% de todas las picaduras recubiertas de las células incubadas con DH8.3, fueron positivas para el anticuerpo, con un número que contiene múltiples granos de oro. Un análisis estadístico del número total de granos de oro contenido dentro de picaduras recubiertas, encontró que la diferencia fue altamente significativa (p < 0.01). Después de 20 a 30 minutos, ambos anticuerpos se pueden observar en estructuras que asemejan de manera morfológica los lisosomas (figura 19C). La presencia de residuos celulares dentro de estas estructuras también es consistente con su naturaleza de lisosomas.
Ejemplo 7 Biodistribución de Anticuerpos en Ratones Desprotegidos que contiene Tumor La biodistribución de mAb806 y el anticuerpo DH8.3 se comparó en ratones desprotegidos que contienen xenoinjertos U87MG en un lado y xenoinjertos U87MG .?2-7 en el otro. Se eligió un período de tiempo relativamente corto para este estudio, ya que un reporte previo demostró que el anticuerpo DH8.3 muestra niveles pico de dirección de tumor entre 4 a 24 horas (Hills y asociados, (1995) Dirección específica de un receptor EGF activado, muíante encontrado en glioblastoma utilizando anticuerpo monoclonal. Int. J. Cáncer. 63, 537-43).
Los xenoinjertos de tumor fueron establecidos en ratones BALB/c desprotegidos mediante inyección s.c. de 3 x 106 de células U87MG, U87MG .?2-7 o A431. La expresión EGFR de2-7 en xenoinjertos U87MG .?2-7 permaneció estable a lo largo del período de biodistribución, tal como se mide a través de inmunohistoquímica en varios puntos de tiempo (datos no mostrados). Las células A431 retuvieron su reactividad mAb806 cuando crecieron como xenoinjertos de tumor tal como se determina mediante inmunohistoquímica. Se inyectaron células U87MG o A431 en un lado 7 a 10 días antes de que las células U87MG.A2-7 fueran inyectadas en el otro lado debido al rango de crecimiento más rápido observado para xenoinjertos que expresan EGFR de2-7. Los anticuerpos fueron radioetiquetados y evaluados para inmunoreactividad tal como se describió anteriormente, se inyectaron en ratones a través de la ruta retro-orbital cuando los tumores tuvieron un peso de 100 a 200 mg. Cada ratón recibió dos diferentes anticuerpos (2 µ por anticuerpo): de 2 pCi etiquetado 125l mAb806 y de 2 pCi etiquetado 131l DH8.3 o 528. A menos que se indique, se sacrificaron grupos de 5 ratones en varios puntos de tiempo posteriores a la inyección y se obtuvo sangre mediante punción cardiaca. Se obtuvieron los tumores, hígado, bazo, ríñones y pulmones mediante disección. Todos los tejidos fueron pesados y ensayados para la actividad 1 5l y 131l utilizando un conteo de canal doble Window. Los datos fueron expresados para cada anticuerpo como % ID/g tumor determinado por comparación con estándares de dosis inyectados o convertidos en tumor a proporciones de sangre/hígado (por ejemplo, % ID/g de tumor dividido entre % ID/g sangre o hígado). Se analizaron las diferencias entre grupos mediante pruebas-t del estudiante. Después de la inyección de mAb806 radioetiquetado, algunos tumores se fijaron en formalina, se incrustaron en parafina, se cortaron en secciones de 5 pm y posteriormente se expusieron a película de rayos X (AGFA, Mortsel, Bélgica) para determinar la localización de anticuerpo mediante autoradiograf ía.
En términos de % ID/g tumor, mAb806 alcanzó su nivel pico en xenoinjertos U87MG.A2-7 de 18.6% m/g de tumor en 8 horas (figura 4A), considerablemente mayor que cualquier otro tejido, excepto sangre. Aunque DH8.3 también mostró niveles de tumor pico en 8 horas, el nivel fue un 8. 8% m/g de tumor estadísticamente menor (p < 0.001) en comparación mAb806 (figura 4B). Los niveles de ambos anticuerpos disminuyeron lentamente a las 24 y 48 horas. La autoradiograf ía de secciones de tejido de xenoinjerto U87MG.A2-7 recolectadas 8 horas después de la inducción con mAb806 etiquetado 25l y sólo, ilustran claramente la localización del anticuerpo en el tumor viable (figura 20). Ningún anticuerpo mostró dirección específica de xenoinjertos de origen U87MG (figuras4A y 4B). Con respecto a las proporciones de tumor a sangre/hígado, mAb806 mostró la proporción más alta en 24 horas tanto para sangre (proporción de 1.3) como para hígado (proporción de 6.1) (figuras 5A y 5B). El anticuerpo DH8.3 tuvo su mayor proporción en sangre a las 8 horas (proporción de 0.38) y en las 24 horas en hígado (proporción de 1.5) (figuras 5A y 5B), ambas de las cuales son considerablemente menores que los valores obtenidos para mAb806.
Tal como se describió anteriormente, los niveles de mAb806 en el tumor llegaron a su pico en 8 horas. Aunque este pico es relativamente temprano en comparación con muchos anticuerpos de dirección de tumor, es completamente consistente con otros estudios utilizando anticuerpos específicos EGFR de2-7 que todos muestran picos a las 4 a 24 horas posteriores a la inducción, cuando se utilizan una dosis de anticuerpo similar (Hills y asociados, 1995; Reist y asociados, 1997; Reist y asociados, (1996) Radioyodinado de anticuerpos monoclonales de internalización utilizando 5-yodo-3-piridinacarboxilato de N-succinimidilo. Cáncer Res. 56, 4970-7). De hecho, a diferencia de reportes anteriores, el punto de tiempo de 8 horas fue incluido en la suposición de que la dirección del anticuerpo puede llegar a su pico rápidamente. El % ID/g de tumor observado con mAb806 fue similar al reportado para otros anticuerpos específicos EGFR de2-7 cuando se utilizan técnicas de yodinado estándar (Hills y asociados, 1995; Huang y asociados, 1997; Reist y asociados, (1995) Anticuerpos monoclonales de variante III de receptor de factor de crecimiento anti-epidérmico específico de tumores: uso del método de radioyodinación de tiramina-celobiosa aumenta la retención celular y captación en xenoinjertos de tumor. Cáncer Res. 55, 4375-82).
La razón para el pico temprano es probablemente del doble. Primero, los tumores que expresan el EGFR de2-7, incluyendo las células U87 G transf ectadas, crecen extremadamente rápido como xenoinjertos de tumor. Por lo tanto, incluso durante el periodo de tiempo relativamente corto utilizando dichos estudios de biodistribución, el tamaño de tumor incrementa hasta un grado (5 a 10 veces de incremento en masa en 4 días) en el que el % ID/g del tumor se reduce en comparación con tumores de crecimiento lento. En segundo lugar, aunque la internalización de mAb806 fue relativamente lento en comparación con DH8.3, aún es rápida con respecto a otros muchos sistemas de anticuerpo/antígeno de tumor. Los anticuerpos internalizados pasan por rápida proteólisis con productos de degradación siendo excretados de la célula (Press y asociados, (1990) Inhibición de catabolismo de anticuerpos radioetiquetados mediante células de tumor utilizando aminas lisosomotrópicas y ionofóros carboxílicos. Cáncer Res. 50, 1243-50). Este proceso de internalización, degradación y excreción reduce la cantidad de anticuerpos yodinado detenido dentro de la célula. En consecuencia los anticuerpos de internalización despliegan menores niveles de dirección que sus contrapartes de no internalización. Los datos de microscopio de electrones aquí reportados, demuestran que el mAb806 internalizado es transportado rápidamente a lisosomas en donde ocurre presumiblemente una rápida degradación. Esta observación es consistente con la expulsión rápida del yodo de la célula.
El anticuerpo monoclonal L8A4 descrito anteriormente dirigido al péptido de unión único encontrado en EGFR de2-7, se comporta de una manera similar a mAb806 (Reist y asociados, (1997) Comportamiento in vitro e in vivo de anticuerpo monoclonal anti-EGFRvIll quimérico radioetiquetado; comparación con su origen de múrido. Nucí. Med. Biol. 24, 639-47). Utilizando células U87MG transf ectadas con el EGFR de2-7, este anticuerpo tuvo un rango de internalización similar (35% en 1 hora en comparación con 30% en 1 hora para mAb806) y desplegó dirección in vivo comparable cuando se utilizan fibroblastos 3T3 transfectados con EGFR de2-7 (pico de 24% ID/g de tumor en 24 horas en comparación con 18% ID/g de tumor en 8 horas para mAb806) (Reist y asociados, (1997) Dirección mejorada de un anticuerpo monoclonal de variante III de receptor de factor de crecimiento anti-epidérmico en xenoinjertos de tumor después de etiquetado utilizando 5-yodo-3-piridinacarboxilato de N-succinimidilo. Cáncer Res. 57, 1510-5).
En forma interesante, la retención in vivo de este anticuerpo en xenoinjertos de tumor se mejoró cuando se etiquetó con carboxilato de 5-yodo-3-piridina de N-succinimidilo (Reist y asociados, 1997). Este grupo protésico etiquetado se carga en forma positiva en un pH lisosomal y por lo tanto tiene retención celular mejorada (Reist y asociados, (1996) Radioyodinación de anticuerpos monoclonales de internalización utilizando 5-yodo-3-piridinacarboxilato de N-succinimidilo. Cáncer Res. 56, 4970-7). La retención aumentada es potencialmente útil cuando se considera un anticuerpo para radioinmunoterapia, y este método se puede utilizar para mejorar la retención de mAb806 yodinado o sus fragmentos.
Ejemplo 8 Enlace de mAb806 a Células que Contienen EGFR Amplificado Para revisar si mAb806 puede reconocer el EGFR expresado en células que contienen un gen de receptor amplificado, su enlace a células A431 fue analizado. Tal como se describió anteriormente, las células A431 son células de carcinoma escamoso humano y expresan altos niveles de wtEGFR. Se observó un enlace de bajo nivel, aunque altamente reproducible de mAb806 a células A431 mediante análisis FACS (figura 6). El anticuerpo DH8.3 no enlazó a células A431, lo que indica que el enlace de mAb806 no fue el resultado del bajo nivel de expresión EGFR de2-7 (figura 6). Tal como se espera, el anticuerpo anti-EGFR 528 mostró fuerte manchado de células A431 (figura 6). Debido a este resultado el enlace de mAb806 a A431 fue caracterizado mediante análisis de Scatchard. Aunque el enlace del mAb806 yodinado fue comparativamente bajo, es posible obtener datos consistentes para Scatchard. El promedio de tres de dichos experimentos produce un valor para afinidad de 9.5 x 107 M" con 2.4 x 105 receptores por célula. Por lo tanto, la afinidad para este receptor fue de más o menos 10 veces menos que la afinidad para el EGFR de2-7. Además, mAb806 aparece para reconocer únicamente una pequeña porción de EGFR encontrada en la superficie de células A431. El anticuerpo 528 midió aproximadamente 2 x 106 receptores por célula, lo cual está de acuerdo con otros numerosos estudios (Santón y asociados, (1986) Efecto de concentración de receptor de factor de crecimiento epidérmico en tumorigenicidad de células A431 en ratones desprotegidos. Cáncer Res. 46, 4701-5).
Para asegurar que estos resultados no son simplemente restringidos a la línea de célula A431, se revisó la reactividad de mAb806 en otras 2 líneas celulares exhibiendo amplificación del gen EGFR. Tanto la línea de célula de cabeza y cuello HN5 (Kwok TT y Suterland RM (1991) Diferencias en radiosensibilización relacionada con EGF de células de carcinoma escamosa humana con altos y bajos números de receptores EGF. Br. J. Cáncer. 64, 251-4) y como la línea célula de cáncer de seno MDA-468 (Filmus y asociados, (1985) MDA-468, una línea de célula de cáncer de seno humano con alto número de receptores de factor de crecimiento epidérmico (EGF), tiene un gen de receptor EGF amplificado y su crecimiento es inhibido mediante EGF. Biochem. Biofys. Res. Commun. 128, 898-905) han sido reportados por contener múltiples copias del gen EGFR. En forma consistente con estos reportes, el anticuerpo 528 desplegó manchado intenso de ambas líneas celulares (figura 21). Como con la línea celular A431, el mAb806 mancho claramente ambas líneas celulares pero en un menor nivel que el observado con el anticuerpo 528 (figura 21). Por lo tanto, e'l enlace de mAb806 no se restringe simplemente a células A431 sino que parece ser una observación general para células que contienen amplificación del gen EGFR.
El reconocimiento de sEGFR tipo silvestre mediante mAb806 requiere claramente cierta desnaturalización del receptor, con el objeto de exponer el epítope. El grado de desnaturalización requerido es únicamente ligero, ya que la absorción uniforme del sEGFR tipo silvestre sobre la superficie de plástico indujo el enlace robusto de mAb806 en ensayos ELISA. Ya que mAb806 enlazó únicamente aproximadamente el 10% del EGFR en la superficie de las células A431, se intenta especular que este subconjunto de receptores puede tener una conformación alterada similar a la inducida a través del truncado EGFR de2-7. De hecho, la expresión extremadamente alta de EGFR transmitida por la amplificación de gen en células A431 puede originar que ciertos receptores han procesado en forma incorrecta conduciendo a conformación alterada. En forma interesante, el inmunomanchado es semi-cuantitativo de lisados de célula A431 con mAb806 mostró que puede reconocer la mayor parte de los receptores A431 EGF después de SDS-PAGE y transferencia Western. Este resultado soporta además el argumento de que mAb806 está enlazando a un subconjunto de receptores en la superficie de células A431 que tienen una conformación alterada. Estas observaciones en células A431 son consistentes con los datos de inmunohistoquímica que demuestran que mAb806 enlaza a gliomas que contienen amplificación del gen EGFR. Ya que el enlace de mAb806 fue completamente negativo en células U87MG de origen, puede apreciarse que este fenómeno puede ser restringido a células que contienen EGFR amplificado, aunque el nivel del receptor "desnaturalizado" en la superficie de células U87MG puede ser debajo del nivel de detección. Sin embargo, esto puede parecer improbable ya que el mAb806 yodinado no enlaza a peletes de célula U87MG que contienen hasta 1 x 1 O7 células.
Ejemplo 9 Dirección In vivo de Células A431 Mediante mAb806 Se llevó a cabo un segundo estudio de biodistribución con mAb806 para determinar si puede dirigir los xenoinjertos de tumor A431. Este estudio se llevó a cabo durante un curso de tiempo más largo con el objeto de obtener mayor información con respecto a la dirección de xenoinjertos U87MG.A2-7 mediante mAb806, que fueron incluidos en todos los ratones como un control positivo. Además, el anticuerpo anti-EGFR 528 fue incluido como un control positivo para los xenoinjertos A431 , ya que un estudio previo demostró una dirección de bajo nivel, pero significativa de este anticuerpo a células A431 crecidas en ratones desprotegidos (Masui y asociados, (1984) Inhibición de crecimiento de células de tumor humano en ratones atímicos mediante anticuerpos monoclonales de receptor de factor de crecimiento anti-epidérmico. Cáncer Res. 44, 1002-7).
Durante las primeras 48 horas, mAb806 desplegó propiedades de dirección casi idénticas a las observadas en los experimentos iniciales (figura 7A comparada con figura 4A). En los términos de % ID/g de tumor, los niveles de mAb806 en xenoinjertos U87MG.A2-7 mostraron ser disminuidos después de 24 horas pero siempre permanecieron mayores a los niveles detectados en tejido normal. La captación de los xenoinjertos A431 fue comparativamente baja, sin embargo hubo un pequeño incremento en % ID/g de tumor durante las primeras 24 horas no observado en tejidos normales tal como hígado, bazo, riñon y pulmón (figura 7A). La captación del anticuerpo 528 fue muy baja en ambos xenoinjertos cuando se expresaron como % ID/g de tumor (figura 7B), parcialmente debido al despeje más rápido de este anticuerpo de la sangre. La autoradiograf ía de las secciones de tejido de xenoinjerto A431 recolectadas 24 horas después de la inyección con mAb806 solo etiquetado con 1 5l y, ilustra claramente la localización del anticuerpo a un tumor viable alrededor de la periferia del tumor, y no áreas centrales de necrosis (figura 23). En términos de proporción de tumor a sangre mAb806 llegó al pico en 72 horas para xenoinjertos U87MG.A2-7 y 100 horas para xenoinjertos A431 (figuras 8A, B). Aunque la proporción de sangre para mAb806 nunca sobrepasó 1.0 con respecto al tumor A431 , incrementó a lo largo de todo el curso de tiempo (figura 8B) y fue mayor que todos los otros tejidos revisados (datos no mostrados) lo que indica bajos niveles de dirección.
La proporción de tumor a sangre para el anticuerpo 528, mostró un perfil similar a mAb806 aunque se observaron mayores niveles en los xenoinjertos A431 (figuras 8A, B). mAb806 tuvo una proporción pico de tumor a hígado en xenoinjertos U87MG.A2-7 de 7.6 en 72 horas, demostrando claramente una captación preferencial en estos tumores en comparación con tejido normal (figura 8C). Otras proporciones de tumor a órgano para mAb806 fueron similares a las observadas en el hígado (datos no mostrados). La proporción pico de tumor a hígado para mAb806 en xenoinjertos A431 fue de 2.0 en 100 horas, indicando nuevamente una ligera captación preferencial en tumor en comparación con tejido normal (figura 8D).
Ejemplo 10 Estudios de Terapia Se evaluaron los efectos de mAb806 en dos modelos de xenoinjerto de un modelo preventivo de enfermedad-a y un modelo de tumor establecido.
Modelos de xenoinjerto En forma consistente con reportes previos (Nishikawa y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 91 (16), 7727-7731), las células U87MG transfectadas con EGFR de2-7 crecieron más rápidamente que las células de origen y las células U87MG transfectadas con wtEGFR. Por consiguiente, no fue posible crecer ambos tipos celulares en los mismos ratones.
Las células de tumor (3 x 106) en 100 mi de PBS fueron inoculadas en forma subcutánea en ambos flancos de un ratón desprotegido hembra de 4 a 6 semanas (Animal Research Centre, Western Australia, Australia). Se investigó la eficacia terapéutica de mAb806 en modelos tanto preventivos como de tumor establecido. En el modelo preventivo, se trataron 5 ratones con dos xenoinjertos cada uno en forma intraperitoneal ya sea con 1 ó 0.1 mg de mAb806 o vehículo (PBS) comenzando un día antes de la inoculación de la célula de tumor. Se continuó con el tratamiento durante un total de 6 dosis, 3 veces a la semana durante 2 semanas. En el modelo establecido, se inició el tratamiento con tumores que habían alcanzado un volumen promedio de 65 ± 6.42 mm3 (U87MG .?2-7) , 84 ± 9.07 mm3 (U87MG), 73 ± 7.5 mm3 (U87MGwtEG FR) o 201 ± 19.09 mm3 (tumores A431). El volumen de tumor en mm3 fue determinado utilizando la fórmula (longitud x ancho2)/2, en donde la longitud fue el eje más largo, y el ancho la medida en los ángulos rectos a la longitud (Clark y asociados, (2000) Eficacia terapéutica de radioinmunoterapia anti-Lewis (y) humanizada 3S 193 en un modelo de cáncer de seno: actividad mejorada cuando se combina con quimioterapia con Taxol. Clin. Cáncer Res. 6, 3621-3628). Los datos fueron expresados como volumen de tumor promedio ± S.E. para cada grupo de tratamiento. Se llevó el análisis estadístico en puntos de tiempo determinados utilizando la prueba-t del Estudiante. Los animales fueron eutanizados cuando los xenoinjertos alcanzaron un volumen aproximado de 1.5 cm3 y los tumores se extirparon para revisión histológica. Este proyecto de investigación fue aprobado por el Comité de Eticas con Animales del Centro Médico Austin y de Repatriación (Animal Ethics Committee de the Austin and Repatriation Medical Centre) .
Revisión Histológica de Xenoinjertos de Tumor Los xenoinjertos fueron extirpados y biseccionados. Una mitad fue fijada en formalina/PBS al 10% antes de incrustarse en parafina. Posteriormente se cortaron secciones de cuatro mieras y se mancharon con hematoxilina y eosina (H&E) para revisión histológica de rutina. La otra mitad se incrustó en un compuesto Tissue Tek® OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA), se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a una temperatura de -80°C. Se cortaron secciones de criostato delgadas (5 mieras) y se fijaron en acetona enfriada con hielo durante 10 minutos seguido de secado con aire durante 10 minutos adicionales. Las secciones fueron bloqueadas en reactivo de bloqueo de proteína (Lipshaw Immunon, Pittsburgh U.S. A.) durante 10 minutos y posteriormente se incubaron con anticuerpo primario biotinilado (1 mg/ml), durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT). Todos los anticuerpos fueron biotinilados utilizando el módulo de biotinilación de proteína ECL (Amersham , Baulkham Hills, Australia), siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de enjuagar con PBS, las secciones fueron incubadas con un complejo de peroxidasa de rábano de estreptavidina durante 30 minutos adicionales (Silenus, Melbourne, Australia). Después de un lavado final de PBS, las secciones fueron expuestas a substrato de 3-amino-9-etilcarbozol (AEC) (0.1 M de ácido acético, 0.1 M de acetato de sodio, 0.02 M de AEC (Sigma Chemical Co., St Louis, MO)) en la presencia de peróxido de hidrógeno durante 30 minutos. Las secciones fueron enjuagadas con agua y contramanchadas con hematoxilina durante 5 minutos y se montaron.
Eficacia de mAb806 en Modelo Preventivo Se revisó mAb806 para eficacia contra tumores U87MG y U87MG.A2-7 en un modelo de xenoinjerto preventivo. Se administró anticuerpo o vehículo i.p. el día anterior a la inoculación del tumor, y se administró 3 veces a la semana durante 2 semanas. mAb806 no tuvo efecto en el crecimiento de xenoinjertos U87MG de origen, que expresaron el wtEGFR, en una dosis de 1 mg por inyección (figura 9A). En contraste, mAb806 inhibió en forma significativa el crecimiento de xenoinjertos U87MG.A2-7 en una forma dependiente de la dosis (figura 9B). El día 20, cuando se sacrificaron animales de control, el volumen de tumor promedio fue de 1637 ± 178.98 mm3 para el grupo de control, estadísticamente más pequeño 526 ± 94.74 mm3 para el grupo de 0.1 mg por inyección (p < 0.0001) y 197 ± 42.06 mm3 para el grupo de 1 mg por inyección (p < 0.0001). Los grupos de tratamiento fueron sacrificados el día 24, tiempo en el cual los volúmenes de tumor promedio fueron 1287 ± 243.03 mm3 para el 0.1 mg de grupo tratado y 492 ± 100.8 mm3 para el grupo de 1 mg.
Eficacia de mAb806 en Modelo de Xenoinjerto Establecido Debido a la eficacia de mAb806 en el modelo de xenoinjerto preventivo, se revisó posteriormente su capacidad para inhibir el crecimiento de xenoinjertos de tumor establecidos. El tratamiento de anticuerpo fue tal como se describe en el modelo preventivo excepto que comenzó cuando los tumores habían alcanzado un volumen de tumor promedio de 65 ± 6.42 mm3 para los xenoinjertos U87MG.A2-7 y 84 ± 9.07 mm3 para los xenoinjertos U87MG de origen. Una vez más, mAb806 no tuvo efecto en el crecimiento de Xenoinjertos U87MG de origen en una dosis de 1 mg por inyección (figura 10A). En contraste, mAb806 inhibió en forma significativa el crecimiento de xenoinjertos U87MG.A2-7 en una forma dependiente de la dosis (figura 10B). El día 17, un día antes de que se sacrificaran los animales de control, el volumen de tumor promedio fue de 935 ± 215.04 mm3 para el grupo de control, 386 ± 57.51 mm3 para el grupo de 0.1 mg por inyección (p < 0.01) y 217 ± 58.17 mm3 para el grupo de 1 mg por inyección (p < 0.002).
Para revisar si la inhibición de crecimiento observada con mAb806 se restringió a células que expresan EGFR de2-7, se revisó en un modelo establecido su eficacia contra xenoinjertos de tumor U87MG.wtEGFR. Estas células sirven como un modelo para tumores que contienen amplificación del gen EGFR sin la expresión EGFR de2-7. El tratamiento de mAb806 comenzó cuando los tumores habían alcanzado un volumen de tumor promedio de 73 ± 7.5 mm3. mAb806 inhibió en forma significativa el crecimiento de xenoinjertos U87MG.wtEGFR establecidos cuando se comparó con tumores de control tratados con vehículo (figura 10C). El día que los animales de control fueron sacrificados, el volumen de tumor promedio fue de 960 ± 268.9 mm3 para el grupo de control y 468 ± 78.38 mm3 para el grupo tratado con inyecciones de 1 mg (p < 0.04).
Análisis Histológico e Inmunohistoquímico de Tumores Establecidos Para evaluar las diferencias histológicas potenciales entre xenoinjertos U87MG.A2-7 y U87MG.wtEGFR de control y tratados con mAb806 (recolectados los días 24 y 42, respectivamente) se mancharon con H&E secciones incrustadas en parafina, fijadas con formalina. Las áreas de necrosis fueron observadas en secciones de xenoinjertos tanto U87MG.A2-7 (recolectados 3 días después de que terminó el tratamiento) como U87MG.wtEGFR (recolectados 9 días después de que terminó el tratamiento) tratados con mAb806.
Este resultado fue observado en forma consistente en un número de xenoinjertos de tumor (n = 4). Sin embargo, el análisis de secciones de xenoinjertos tratados con control, no muestra las mismas áreas de necrosis observadas con tratamiento mAb806. Las secciones procedentes de mAb806 o xenoinjertos U87MG tratados de control, también fueron manchadas con H&E y no revelaron diferencias en la viabilidad celular entre los dos grupos, soportando además la hipótesis de que el enlace mAb806 induce a una viabilidad celular/necrosis disminuida dentro de los xenoinjertos de tumor.
Se llevó a cabo un análisis inmunohistoquímico de secciones de xenoinjerto U87MG, U87MG .?2-7 y U87MG.wtEGFR para determinar los niveles de expresión de2-7 y wtEGFR después de tratamiento con mAb806. Las secciones fueron recolectadas los días 24 y 42 tal como se describió anteriormente, y fueron inmunomanchadas con anticuerpos 528 y 806. Tal como se esperó, todas las secciones de xenoinjerto manchadas con anticuerpo 528 no tuvieron una disminución obvia, en intensidad entre tumores tratados y de control. El manchado de secciones U87MG no fue detectable con mAb806, sin embargo se observó un manchado positivo de secciones de xenoinjerto U87MG.A2-7 y U87MG. wtEGFR. No hubo diferencia en la densidad de manchado mAb806 entre xenoinjertos U87MG.A2-7 y U87MG. wtEGFR tratados y de control, lo que sugiere que el tratamiento del anticuerpo no desactiva la expresión de de2-7 o wtEGFR.
Tratamiento de Xenoinjertos A431 con mAb806 Para demostrar que los efectos anti-tumor de mAb806 no se restringieron a células U87MG, el anticuerpo fue administrado a los ratones con xenoinjertos A431. Estas células contienen un gen EGFR amplificado y expresan aproximadamente 2 x 106 receptores por célula. Tal como se describió anteriormente, mAb806 se enlaza aproximadamente al 10% de estos EGFR y xenoinjertos A431 objetivo. mAb806 inhibió en forma significativa el crecimiento de xenoinjertos A431 cuando se revisó en el modelo de xenoinjerto preventivo descrito anteriormente (figura 11A). El día 13 cuando se sacrificaron animales, el volumen de tumor promedio fue de 1385 ± 147.54 mm3 en el grupo de control, y de 260 ± 60.33 mm3 para el grupo de tratamiento con inyección de 1 mg (p < 0.0001).
En un experimento separado, una dosis de 0.1 mg de mAb también inhibió en forma significativa el crecimiento de xenoinjertos A431 en un modelo preventivo.
Debido a la eficacia de mAb806 en el modelo de xenoinjerto A431 preventivo, se revisó su capacidad para inhibir el crecimiento de xenoinjertos de tumor establecidos. El tratamiento de anticuerpos fue tal como se describe en el modelo preventivo excepto que no comenzó hasta que los tumores alcanzaron un volumen de tumor promedio de 201 ± 19.09 mm3. mAb806 inhibió en forma significativa el crecimiento de xenoinjertos de tumor establecidos (figura 11 B) . El día 13, cuando se sacrificaron los animales de control, el volumen de tumor promedio fue de 1142 ± 120.06 mm3 para el grupo de control y 451 ± 65.58 mm3 para el grupo de inyección de 1 mg (p < 0.0001).
En síntesis, los estudios de terapia con mAb806 descritos en la presente invención, han demostrado claramente la inhibición dependiente de la dosis del crecimiento de xenoinjerto U87MG .?2-7. En contraste, no se observó inhibición de los xenoinjertos U87MG de origen a pesar del hecho de que continúan expresando wtEGFR in vivo. mAb806 no únicamente redujo en forma significativa el volumen del xenoinjerto, también indujo necrosis significativa dentro del tumor. Este es el primer reporte que muestra el uso terapéutico exitoso de dicho anticuerpo in vivo, contra xenoinjertos de glioma que expresan EGFR de2-7 humano.
La amplificación de gen de EGFR ha sido reportada en una cantidad de diferentes tumores y se observó en aproximadamente el 50% de los gliomas (Voldberg y asociados, 1997). Se ha propuesto que la sobreexpresión EGFR subsecuente transmitida por la amplificación del gen receptor puede conferir una ventaja de crecimiento, incrementando la señalización intracelular y el crecimiento celular (Filmus y asociados, 1987). La línea celular U87 G fue transfectada con el wtEGFR con el objeto de producir una célula de glioma que mimetiza el proceso de la amplificación del gen EGFR. El tratamiento de xenoinjertos U87MG.wtEGFR establecidos con mAb806 dio como resultado una inhibición de crecimiento significativa. Por lo tanto, mAb806 también transmite actividad antitumor in vivo contra células que contienen amplificación del gen EGFR. En forma interesante, la inhibición mAb806 de xenoinjertos U87MG.wtEGFR parece ser menos efectiva que la observada con tumores U87MG.A2-7. Esto refleja probablemente el hecho de que mAb806 tiene afinidad menor para el EGFR amplificado y únicamente enlaza una pequeña proporción de receptores expresados en la superficie celular. Sin embargo, se deberá observar que a pesar del pequeño efecto en volúmenes de xenoinjerto U87MG.wtEGFR, el tratamiento de mAb806 produjo áreas de necrosis grandes dentro de estos xenoinjertos.
Para indicar la posibilidad de que mAb806 transmite únicamente la inhibición de líneas celulares derivadas de U87MG, probamos su eficacia contra xenoinjertos A431. Esta línea celular derivada de carcinoma de célula escamosa contiene una amplificación significativa del gen EGFR, la cual es retenida tanto in vitro como in vivo. El tratamiento de xenoinjertos A431 con mAb806 produjo una inhibición de crecimiento significativa tanto en un modelo preventivo como establecido, indicando que los efectos antitumor de mAb806 no son restringidos a líneas de célula U87MG transfectadas.
Ejemplo 11 Tratamiento de Terapia de Combinación de Xenoiniertos A431 con mAb806 v AG1478 Los efectos anti-tumor de mAb806 combinados AG1478, fueron probados en ratones con xenoinjertos A431. AG1478 (4-(3-cloroanilino)-6,7-dimetoxiquinazolina) es un inhibidor potente y selectivo de la cinasa EGFR versus HER2-neu y la cinasa de receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (Calbiochem Cat. No. 658552). Se incluyeron tres controles: tratamiento únicamente con vehículo, vehículo + mAb806 únicamente y vehículo + AG1478 únicamente. Los resultados se ilustran en la figura 12. Se administró 0.1 mg de mAb806 el día 1 antes del xenoinjerto y 1, 3, 6, 8 y 10 días posteriores al xenoinjerto. Se administraron 400 ug de AG1478 los días 0, 2, 4, 7, 9 y 11 posteriores al xenoinjerto.
Tanto AG1478 como mAb806, cuando se administraron solos, produjeron una reducción significativa de volumen de tumor. Sin embargo, en combinación, la reducción del volumen de tumor fue mejorada en gran parte.
Además, el enlace de mAb806 a EGFR de células A431 fue evaluado en la ausencia y presencia de AG1478. Las células fueron colocadas durante la noche en un medio libre de suero, posteriormente fueron tratadas con AG1478 durante 10 minutos a una temperatura de 37°C, lavadas dos veces en PBS, posteriormente lisadas en Tritón al 1% y se prepararon lisados mediante centrifugación durante 10 minutos en 12,000 g. Posteriormente el lisado fue evaluado para reactividad 806 mediante ELISA en una versión modificada de un ensayo descrito por Schooler y Wiley, Analytical Biochemistry 277, 135-142 (2000). Las placas se recubrieron con 10 ug/ml de mAb806 en PBS/EDTA durante la noche a temperatura ambiente y posteriormente se lavaron dos veces. Posteriormente las placas se bloquearon con albúmina de suero al 10%/PBS durante 2 horas en 37°C y se lavaron dos veces. Se agregó un lisado celular 1 :20 en albúmina de suero al 10%/PBS durante 1 hora a una temperatura de 37°C, posteriormente se lavaron cuatro veces. Se hizo reaccionar anti-EGFR (SC-03; Santa Cruz Biotechnology Inc.) en albúmina de suero al 10%/PBS durante 90 minutos a temperatura ambiente, la placa se lavó cuatro veces, y se agregó anti-conejo-HRP (1:2000 si es de Silenus) en albúmina de suero al 10%/PBS durante 90 minutos a temperatura ambiente, se lavó cuatro veces, y se desarrolló color utilizando ABTS como un substrato. Se encontró que el enlace de mAb806 es incrementado significativamente en la presencia de cantidades en incremento de AG1478 (figura 13).
Ejemplo 12 Inmunorreactividad en Glioblastomas Humanos Pre-Tipificados Para Estatus EGFR Debido a la alta incidencia de expresión EGFR, la amplificación y mutación en glioblastomas, un estudio inmunohistoquímico detallado se llevó a cabo con el objeto de evaluar la especificidad de 806 en tumores además de xenoinjertos. Se analizó un panel de 16 glioblastomas mediante inmunohistoquímica. Este panel de 16 glioblastomas fue tipificado previamente mediante RT-PCR para la presencia de EGFR tipo silvestre amplificado y la expresión EGFR de2-7. Seis de estos tumores expresaron únicamente la transcripción wtEGFR, 10 tuvieron amplificación de gen wtEGFR, con únicamente 5 de éstos mostrando transcripciones EGFR tipo silvestre, y ambos EGFR tipo silvestre y la transcripción del gen de2-7.
Se llevaron a cabo análisis inmunohistoquímicos utilizando secciones de 5 mm de tejido congelado fresco aplicado a rebanadas de histología y se fijaron durante 10 minutos en acetona fría. Se detectó el anticuerpo primario enlazado con anticuerpo anti-ratón de caballo biotinilado seguido de una reacción de complejo de avidina-biotina. Se utilizó tetraclorhidrato de diaminobencidina (DAB) como el cromogen. El grado de reactividad inmunohistoquímica en tejidos se estimó mediante microscopio de luz y se graduó de acuerdo con el número de células inmunorreactivas en incrementos del 25% tal como se indica a continuación.
Focal = menos de 5% + = 5-25% ++ = 25-50% + + + = 50-75% + + + + = > 75% El anticuerpo 528 mostró reactividad intensa en todos los tumores, en tanto que el inmunomanchado DH8.3 estuvo restringido a los tumores que expresan el EGFR de2-7 (tabla 2). En forma consistente con las observaciones previas en FACS de ensayos de rosetas, mAb806 no reaccionó con los glioblastomas que expresan la transcripción wtEGFR de los genes EGFR no amplificados (tabla 2). Este patrón de reactividad para mAb806 es similar al observado en los estudios de xenoinjerto y nuevamente sugiere que este anticuerpo reconoce el EGFR de2-7 y amplificado pero no el wtEGFR cuando se expresa en la superficie celular.
Tabla 2 Inmunorreactividad de mAbs528. DH8.3 v 806 en glioblastomas tipificados previamente para la presencia de EGFR tipo natural y EGFR de2-7 mutado y para su estado de amplificación *machado focal Ejemplo 13 Inmunorreactividad EGFR En Tejido Normal Con el objeto de determinar si el EGFR de2-7 se expresa en tejido normal, se llevó a cabo un estudio inmunohistoquímico con mAb806 y DH8.3 en un panel de 25 tejidos. No hubo inmunorreactiv'idad fuerte ya sea con mAb806 o DH8.3 en cualquier tejido probado, lo que sugiere que el EGFR de2-7 está ausente en tejidos normales (tabla 3). Hubo cierto manchado variable presente en anginas con mAb806 que fue restringido a la capa de célula basal de la epidermis y células escamosas mucosas del epitelio. En placenta, se observó inmunomanchado ocasional del epitelio de trofoblasto. En forma interesante, dos tejidos que expresan niveles altamente endógenos de wtEGFR, el hígado y la piel, fallaron en mostrar cualquier reactividad mAb806 significativa. No se observó reactividad en lo absoluto con las muestras de hígado, y únicamente se detectó en forma ocasional reactividad focal débil e inconsistente (en no más del 10% de las muestras estudiadas en queratinocitos básales en muestras de piel y en el epitelio escamoso de la mucosa de anginas, demostrando además que este anticuerpo no enlaza el wtEGFR expresado en la superficie de células en cualquier grado significativo (tabla 3). Todos los tejidos fueron positivos para el wtEGFR tal como se evidencia a través del manchado universal observado con anticuerpo 528 (tabla 3).
Tabla 3 Reactividad de 528, DH8.3 v 806 en tejidos normales * cierto manchado estromal en diversos tejidos Ejemplo 14 Inmunorreactividad EGFR en Diversos Tumores El grado de EGFR de2-7 en otros tumores fue revisado utilizando un panel de 12 diferentes malignidades. El anticuerpo 528 con frecuencia mostró manchado homogéneo en muchos tumores analizados, excepto melanoma y seminoma. Cuando está presente, se restringió la inmunorreactividad DH8.3 a la célula de tumor focal ocasional que indica que existe en todo caso poca expresión EGFR de2-7 en tumores fuera del cerebro, utilizando este sistema de detección (tabla 4). También hubo manchado focal de vasos sanguíneos y diverso manchado difuso de tejido conectivo con anticuerpo DH8.3 en algunos tumores (tabla 4). Este manchado fue altamente dependiente de la concentración de anticuerpos utilizada y se consideró reactividad de fondo no específica. El mAb806 mostró manchado positivo en el 64% de los tumores de cabeza y cuello y el 50% de carcinomas de pulmón (tabla 4). Hubo poca reactividad mAb806 en todas partes, excepto en tumores urinarios que fueron positivos en el 30% de los casos.
Ya que los cánceres de cabeza y cuello y pulmón fueron negativos para el anticuerpo DH8.3, la reactividad observada con mAb en estos tumores puede estar asociada con amplificación de gen EGFR.
Tabla 4 Anticuerpos monoclonales 528, DH8.3 v 806 en panel de tumor *manchado focal Ejemplo 15 Inmunorreactividad en Glioblastomas Humanos No seleccionados para Estado EGFR Con el objeto de confirmar la especificidad única y para evaluar la reactividad de mAb806, se comparó con los anticuerpos 528 y DH8.3 en un panel de 46 glioblastomas no seleccionados previamente para su estatus EGFR. El anticuerpo 528 fue fuerte y homogéneamente positivo en todas las muestras (excepto dos (Nos. 27 y 29) (44/46, 95.7%). Estos dos casos también fueron negativos para mAb806 y mAbDH8.3. El mAb806 fue positivo en el 27/46 (58.7%) de los casos, 22 de los cuales mostraron inmunorreactividad homogénea en más del 50% del tumor. El anticuerpo DH8.3 fue positivo en 15/46 (32.6%) de los glioblastomas, 9 de los cuales mostraron inmunorreactividad homogénea. El manchado inmunohistoquímico de estos tumores no seleccionados se tabula en la tabla 5.
Hubo concordancia entre mAb806 y DH8.3 en cada caso excepto uno (No. 35). Un análisis molecular para la presencia de amplificación EGFR fue realizada en 44 casos (cuadro 5). De estos, 30 casos fueron tipificados en conjunto con el patrón de inmunorreactividad mAb806 establecido previamente: por ejemplo 16 casos negativos mAb806 revelaron no amplificación EGFR y 14 casos amplificado-EGFR también fueron inmunopositivos mAb806. Sin embargo, 13 casos, los cuales 806 mostraron inmunorreactividad, fueron negativos para amplificación EGFR, en tanto que un caso amplificado con EGFR fue negativo mAb806. El análisis adicional del estatus de mutación de estos casos negativos de amplificación y positivos de 806, se describe más adelante y proporciona la explicación de la mayor parte de los 13 casos que fueron negativos para amplificación EGFR y fueron reconocidos mediante 806.
En forma subsecuente, se llevó a cabo un análisis molecular de mutación de eliminación mediante RT-PCR en 41/46 casos (tabla 5). De éstos, 34 casos fueron tipificados junto con DH8.3 específico para la mutación de eliminación: 12 casos fueron tanto para RT-PCR como inmunohistoquímica y 22 casos fueron negativos/negativos. Tres casos (#2, #34 y #40) fueron positivos DH8.3/negativos RT-PCR para la mutación de eliminación, y tres casos (#12, #18 y #39) fueron negativos DH8.3/positivos RT-PCR. Tal como se espera con base en nuestro análisis de especificidad previo, se observó la inmunorreactividad mAb806 en los tres tejidos positivos DH8.3 excepto en un caso (#35).
El caso #3 también reveló una mutación (designada A2 en la tabla 5), que incluyó las secuencias de la mutación de2-7 pero no pareció ser la eliminación de2-7 clásica con pérdida de las 801 bases (datos no mostrados). Este caso fue negativo para reactividad DH8.3 pero mostró reactividad con 806, indicando que 806 puede reconocer una mutación EGFR adicional y posiblemente única.
Tabla 5 Análisis Inmunohistoquímico de 46 Glioblastomas No Seleccionados Con mAbs 528. 806 v DH8.3 18 ++++ ++++ neg. A 5'MUT 19 ++++ ++++ neg. N WT 20 ++++ neg. neg. N WT 21 ++++ ++++ neg. N WT 22 +++ neg. neg. N WT 23 ++++ ++++ ++ N 5' MUT 24 ++++ ++++ neg. A WT 25 ++++ neg. neg. N WT 26 ++++ ++++ +++ A 5'MUT 27 neg. neg. neg. N WT 28 +++ neg. neg. N WT 29 neg. neg. neg. N WT 30 ++++ ++++ neg. N WT ++++ 31 neg. neg. N nd par det 32 ++ +++ ++ N 5'MUT 33 +++ ++++ ++++ A 5'MUT 34 ++++ +++ ++++ N WT 35 ++++ neg. ++++ A 5'MUT 36 +++ ++ +++ A 5'MUT 37 ++++ + + A 5'MUT 38 ++++ neg. neg. N WT 39 ++ neg. neg. N 5'MUT 40 ++++ ++++ + A WT 41 ++ neg. neg. N WT 42 ++++ ++++ neg. A WT 43 ++++ neg. neg. nd nd 44 ++++ neg. neg. N WT 45 ++++ neg. neg. N WT 46 ++++ neg. neg. N nd *N = no amplificado, A-amplificado, + WT = tipo silvestre, 5'-mut nd = no realizado La reactividad del anticuerpo 806 tipificada junto con EGFR mutante amplificado o de2-7 en 19/27 o aproximadamente el 70% de los casos. Es notable que 2 de estos 8 casos también fueron reactivos DH8.3.
Ejemplo 16 Tratamiento Sistémico y Análisis de Tumores de Glioma Intracraneal Para probar la eficacia del anticuerpo monoclonal anti-AEGFR, mAb806, tratamos ratones desprotegidos que contienen xenoinjertos de glioma que sobreexpresan AEGFR intracraneal con inyecciones intraperitoneales de mAb806, el control de isotipo IgG o PBS.
Debido a que los explantes primarios de glioblastomas humanos pierden rápidamente la expresión de receptores reajustados, amplificados en cultivo, las líneas celulares de glioblastoma existentes no exhiben dicha expresión. Para forzar el mantenimiento de niveles de expresión comparables con los observados en tumores humanos, U87MG, LN-Z308 y A1207 (obsequio de Dr. S. Aaronson, Mount Sinai Medical Center, Nueva York, NY) las células fueron infectadas con AEGFR, AEGFR con deficiencia de cinasa (DK), o virus EGFR tipo silvestre (wtEGFR), lo cual también confiere resistencia a G418 tal como se describió anteriormente (Nishikawa y asociados, (1994). El receptor de factor de crecimiento epidérmico mutante común en glioma humano, confiere tumorigenicidad mejorada. Proc. Nati. Acad. Sc¡. U.S. A., 91, 7727-7731).
Las poblaciones que expresan niveles similares de los diversos alelos EGFR (estos niveles de expresión corresponden aproximadamente a un nivel de amplificación de 25 copias de gen; los glioblastomas humanos normalmente tienen niveles de amplificación de 10 a 50 copias de gen de receptor truncado) fueron seleccionados mediante FACS tal como se describió anteriormente (Nishikawa y asociados, 1994) y designados como U87MG .AEGFR, U87MG.DK, U87MG.wtEGFR, LN-Z308.AEGFR, LN-Z308.DK, LN-Z308.wtEGFR, A1207.AEGFR, A1207.DK y A1207.wtEGFR, respectivamente. Cada uno se mantuvo en un medio que contiene G418 (líneas celulares U87MG, 400 ng/ml; líneas celulares LN-Z308 y A1207, 800 ng/ml).
Las células U87MG.AEGFR (1 x 105) o células 5 x 105 LN-Z308.AEGFR, A1207.AEGFR, U87MG , U87MG.DK, y U87MG.wtEGFR en 5 µ? de PBS, se implantaron en el cuerpo estrato derecho de cerebros de ratones desprotegidos tal como se describió previamente (Mishima y asociados, (2000) Péptido derivado de la región de enlace de no receptor de activador de plasminogen de urocinasa, inhibe el crecimiento de glioblastoma y la angiogénesis in vivo en combinación con cisplatino. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 97, 8484-8489). Se llevó a cabo terapia sistémica con mAb806, o el control de isotipo lgG2b mediante inyección i.p. de 1 ng de mAbs en un volumen de 100 µ? cada tercer día a partir del día 0 posterior al implante hasta el día 14. Para terapia directa de tumores U87 G .AEGFR intracerebrales, se inyectaron 10 ng de mAb806, o el control de isotipo lgG2b en un volumen de 5 µ? en el sitio de inyección-tumor cada tercer día comenzando el día 1, durante 5 días.
Los animales tratados con PBS o IgG de control de isotipo tuvieron una supervivencia promedio de 13 días, mientras que los ratones tratados con mAb806 tuvieron un incremento del 61.5% en la supervivencia promedio de hasta 21 días (P < 0.001 ; figura 24A).
El tratamiento de ratones 3 días posteriores al implante después del establecimiento de tumor, también prolongó la supervivencia promedio de los animales tratados con mAb806 en 46.1% (a partir del día 13 al día 19; P < 0.01) en comparación con el de los grupos de control (datos no mostrados) .
Para determinar si estos efectos antitumor de mAb806 se extienden más allá de los xenoinjertos U87MG.AEGFR, se administraron tratamientos similares a animales que contienen otros xenoinjertos de célula de glioma de LN-Z308.AEGFR y A1207. AEG FR. La supervivencia promedio de ratones tratados con mAb806 que contienen xenoinjertos LN-Z308.AEGFR se prolongó de 19 días para controles, hasta 58 días (P < 0.001; figura 24B). En forma remarcada, cuatro de ocho animales tratados con mAb806 sobrevivieron más de 60 días (figura 24B). La supervivencia promedio de animales que contienen xenoinjertos A1207.AEGFR también se prolongó de 24 días para controles a 29 días (P < 0.01; datos no mostrados).
El Tratamiento mAb806 Inhibe el Crecimiento de Tumor de Cerebro que Sobreexpresa AEGFR Se eutanizaron ratones que contienen xenoinjertos U87MG. AEGFR y LN-Z308. AEGFR el día 9 y el día 15, respectivamente. Las secciones de tumor fueron analizadas en forma inmunohistopatológica y se determinaron los volúmenes de tumor. En forma consistente con los resultados observados para supervivencia de los animales, el tratamiento con mAb806 redujo en forma significativa los volúmenes en aproximadamente 90% de U87MG. AEGFR. (P < 0.001; figura 24C) y LN-Z308. AEGFR en más del 95% (P < 0.001; figura 24D) de los xenoinjertos en comparación con los grupos de control. Se obtuvieron resultados similares para animales que contienen tumores A1207. AEGFR (65% de reducción de volumen, P < 0.01; datos no mostrados).
Tratamiento Intratumoral con mAb806 Prolonga la Supervivencia de Ratones que Contienen Tumores de Cerebro U87MG . AEG FR También se determinó la eficacia de inyección intratumoral directa de mAb806 para el tratamiento de xenoinjertos U87MG .AEGFR. A los animales se les administró inyecciones intratumorales de mAb806 o IgG de control de isotipo un día después del implante. Los animales de control sobrevivieron durante 15 días', en tanto que los ratones tratados con mAb806 permanecieron vivos durante 18 días (P < 0.01; figura 24E). Aunque el tratamiento intratumoral con mAb806 fue un tanto efectivo, contiene las dificultades de las múltiples inyecciones intracraneales y el riesgo incremento de infección. Por consiguiente nos enfocamos en tratamientos sistémicos para estudios adicionales.
El tratamiento con mAb806 Prolonga Ligeramente la Supervivencia de Ratones que Contienen Xenoinjertos Intracraneales U87MG.wtEGFR pero no U87MG o U87MG.DK Para determinar si la inhibición de crecimiento mediante mAb806 fue selectiva para tumores que expresan AEGFR, se trataron animales que contienen xenoinjertos de cerebro U87MG , U87MG.DK (AEG FR con deficiencia de cinasa) y U87MG.wtEGFR. El tratamiento con mAb806 no prolongó la supervivencia de ratones implantados con tumores U87MG (figura 25A), los cuales expresaron un bajo nivel de EGFR tipo silvestre endógeno (wtEGFR) (Huang y asociados, (1997) La actividad tumorigénica aumentada de un receptor de factor de crecimiento epidérmico muíante común en cánceres humanos, es transmitida por niveles de umbral de fosforilación de tirosina constitutiva y señalización no atenuada. J. Biol. Chem., 272, 2927-2935), o animales que contienen xenoinjertos U87MG.DK que sobreexpresaron un AEGFR con deficiencia de cinasa además de un bajo nivel de wtEGFR endógeno (figura 25B). El tratamiento con mAb806 prolongó ligeramente la supervivencia de ratones que contienen tumores U87MG. tEGFR (P < 0.05, supervivencia promedio 23 días versus 26 días para los grupos de control) que sobreexpresaron wtEGFR (figura 25C).
La Reactividad mAb806 se Correlaciona con Eficacia Anti-tumor In vivo Para comprender el efecto diferencial de mAb806 en tumores que expresan diversos niveles o diferentes tipos de EGFR, determinamos la reactividad mAb806 con diversas células de tumor mediante análisis FACS. Las células manchadas fueron analizadas con FACS Calibur utilizando el software Cell Quest (Becton-Dickinson PharMingen) . Para el primer anticuerpo, se utilizaron los siguientes mAbs: mAb806, mAb anti-EGFR clon 528 y clon EGFR.1. Se utilizó lgG2a o lgG2b de ratón como un control de isotipo.
En forma consistente con los reportes previos (Nishikawa y asociados, (1994) El receptor de factor de crecimiento epidérmico mutante común en glioma humano, confiere tumorigenicidad mejorada. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 91, 7727-7731), el mAb528 anti-EGFR reconoció tanto AEG FR como wtEGFR y demostró un manchado más fuerte para células U87MG.AEGFR en comparación con células U87MG (figura 26A, 528).
En contraste, el anticuerpo EGFR.1 reaccionó con wtEGFR pero no con AEGFR (Nishikawara y asociados, 1994), debido a que las células U87MG.AEGFR fueron tan débilmente reactivas como las células U87MG (figura 26A, EGFR.1 del panel).
Este anticuerpo EGFR.1 reaccionó con U87MG . wtEG FR en forma más intensa que con células U87MG, debido a que las células U87MG.wtEGFR sobreexpresaron wtEGFR (figura 26A, EGFR.1 del panel). Aunque mAb806 reaccionó intensamente con células U87MG.AEGFR y U87MG.DK, y no con células U87MG, reaccionó débilmente con U87MG. wtEGFR, lo cual indica que mAb806 es selectivo para AEGFR con una actividad cruzada débil para wtEGFR sobreexpresado (figura 26A, mAb806 del panel) .
Este nivel de reactividad con U87MG. wtEGFR fue cuantitativa y cualitativamente similar a la prolongación de supervivencia transmitida por el tratamiento con anticuerpo (figura 25C).
Hemos determinado la especificidad mAb806 mediante inmunoprecipitación. Los EGFRs en diversas líneas celulares fueron inmunoprecipitados con anticuerpos mAb806, mAb anti-EGFR clon 528 (Oncogene Research Products, Boston, MA), o clon EGFR.1 (Oncogene Research Products).
En síntesis, las células fueron Usadas con amortiguador de lisis que contiene 50 mM HEPES (pH 7.5), 150 m NaCI, 10% glicerol, 1% Tritón X-100, 2 mM EDTA, 0.1% SDS, 0.5% de desoxicolato de sodio, 10 mM de PPi de sodio, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 2 mM de Na3 V04, 5 ng/ml de leupeptina, y 5 Hg/ml de aprotinina. Los anticuerpos fueron incubados con Usados celulares en 4°C durante 1 hora antes de la adición de sefarosa de proteína-A y -G. Los inmunoprecipitados fueron lavados dos veces con amortiguador de lisis y una vez con amortiguador HNTG [50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCI, 0.1% Tritón X-100 y 10% glicerol], electroforados y transferidos a membranas de nitrocelulosa.
Se probaron manchados de proteínas separadas en forma electroforética con el anticuerpo anti-EGFR, C13 (proporcionado por Dr. G. N. Gilí, University de California, San Diego, CA), utilizados para detección tanto de EGFR tipo natural como ?ß? inmunomanchados (Huang y asociados, 1997), y las proteínas se visualizaron utilizando el sistema de detección quimioluminiscente ECL (Amersham Pharmacia Biotech.). Los anticuerpos para Bc1-X (anticuerpo policlonal de conejo; Transduction Laboratories, Lexington, KY) y fosfotirosina (4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) se utilizaron para análisis de manchado Western tal como se describió anteriormente (Nagane y asociados, (1998) Resistencia de fármacos de células de glioblastoma humana conferida por un receptor de factor de crecimiento epidérmico muíante específico de tumor a través de la modulación de Bc1-XL y proteasas tipo caspasa-3 Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 95, 5724-5729).
En forma consistente con el análisis FACS, el anticuerpo 528 reconoció wtEGFR y receptores mutantes (figura 26B-panel IP: 528), en tanto que el EGFR.1 reaccionó con wtEGFR pero no con la especie muíante (figura 26B, panel IP:EGFR.1). Además los niveles de recepíores muíaníes en células U87MG .AEGFR y U87 G.DK, son comparables con los de wtEGFR en las células U87MG.wtEGFR (figura 26B, panel IP: 528).
Sin embargo, el anticuerpo mAb806 también tuvo la capacidad de precipitar únicamente una pequeña cantidad de wtEGFR de los Usados de célula U87MG. wtEGFR en comparación con una mayor cantidad de receptor muíante precipitado de células U87MG .AEGFR y U87MG.DK, y una cantidad no detectable de células U87MG (figura 26B, panel IP:mAb806). En forma colectiva, estos datos sugieren que mAb806 reconoce un epítope en AEGFR que también existe en una pequeña fracción de wtEGFR únicamente, cuando se sobreexpresa en la superficie celular (ver la descripción adicional y las referencias al epítope mAb806 que se encuentran más adelante).
El Tratamiento de mAb806 Reduce la Autofosforilación AEGFR v Desactiva la Expresión Bd .Xi en Tumores de Cerebro U87MG.AEGFR Los mecanismos subyacentes de la inhibición del crecimiento mediante mAb806, posteriormente fueron investigados. Ya que la actividad de cinasa constitutivamente activa y la autofosforilación del término carboxilo de AEGFR son esenciales para sus funciones biológicas (Nishikawa y asociados, (1994) El receptor de factor de crecimiento epidérmico muíante común en glioma humano, confiere íumorigenicidad aumentada. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 91 , 7727-7731; Huang y asociados, 1997; Nagane y asociados (1996) El receptor de factor de crecimiento epidérmico muíante común confiere tumorigenicidad aumentada en células de glioblastoma humano incrementando la proliferación y reduciendo la apoptosis. Cáncer Res., 56, 5079-5086; Nagane y asociados, (2001) Señalización de receptor aberrante en gliomas malignos humanos: mecanismos de implicaciones terapéuticas Cáncer Lett. 162 (Suppl. 1), S17-S21) Se determinó el estado de fosforilación AEGFR en tumores de animales tratados y de control. Tal como se muestra en la figura 27A, el tratamiento de mAb806 redujo en forma dramática la autofosforilación AEGFR, aunque los niveles de receptor fueron únicamente disminuidos en forma ligera en los xenoinjertos tratados con mAb806. Hemos mostrado previamente que la autofosforilación de receptor origina la activación del gen antiapoptótico, BC1-XL, se desempeña un papel clave en la reducción de apoptosis de tumores que sobreexpresan AEGFR (Nagane y asociados, 1996; Nagane y asociados, 2001). Por consiguiente, el efecto del tratamiento mAb806 en expresión Bc1-XL fue determinado posteriormente. De hecho los tumores AEGFR de animales tratados con mAb806 mostraron niveles reducidos de Bc1-XL (figura 27A).
El Tratamiento de mAb806 Disminuye el Crecimiento y Anqioqénesis, e Incrementa la Apoptosis en Tumores U87MG.AEGFR A la luz de la supresión in vivo originada por tratamiento mAb806 y sus efectos bioquímicos en señalización de receptor, determinamos el rango de proliferación de tumores de ratones de control o tratados. El índice de proliferación, medido mediante manchado Ki-67 de los tumores tratados con mAb806 fue significativamente menor que el de los tumores de control (P < 0.001 ; figura 28).
En síntesis, para evaluar la angiogénesis en tumores, se fijaron en una solución que contiene cloruro de zinc, fueron incrustados en parafina, seccionados e inmunomanchados utilizando un anticuerpo CD31 anti-ratón de rata monoclonal (Becton-Dickinson PharMingen; 1:200). Se llevó a cabo la evaluación de la proliferación de célula de tumor mediante inmunohistoquímica Ki-67 en tejidos de tumor incrustados en parafina fijados con formalina. Después de la desparafinación y rehidratación, las secciones de tejido fueron incubadas con 3% de peróxido de hidrógeno en metanol para extinguir la peroxidasa endógena. Las secciones fueron bloqueadas durante 30 minutos con suero de cabra e incubadas durante la noche con el anticuerpo primario a una temperatura de 4°C. Posteriormente las secciones se lavaron con PBS y se incubaron con un anticuerpo secundario biotinilado durante 30 minutos. Después de algunos lavados con PBS, los productos fueron visualizados utilizando peroxidasa de rábano de estreptavidina con diaminobencidina como el cromogen y hematoxilina como el contramanchado. Como una medida de proliferación, se determinó el índice de etiquetado Ki-67 como la proporción de núcleos etiquetados: totales en campos de alta potencia (3400).
Se contaron aproximadamente 200 núcleos en cada caso mediante muestreo aleatorio o sistemático. Para manchado de macrófago y célula NK, se inmunomancharon secciones congeladas, fijadas con solución de paraformaldehído al 4% amortiguadas utilizando mAbF4/80 biotinilado (Serotec, Raleigh, NC) y anticuerpo GM1 anti-asialo de conejo policlonal (Dako Chemicals, Richmond, VA), respectivamente. Se cuantificó la angiogénesis como el área de envase utilizando análisis computarizado. Para este propósito, se inmunomancharon secciones utilizando anti-CD31 y se analizaron utilizando un sistema de análisis de imagen computarizado sin contramanchado. Se determinaron los MVAsn capturando imágenes digitales de secciones en magnificación de 3200 utilizando una cámara de color CCD tal como se describió previamente (Mishima y asociados, 2000). Posteriormente las imágenes fueron analizadas utilizando el software Image Pro Plus versión 4.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) y se determinó MVA midiendo la cantidad total de manchado en cada sección. Se evaluaron cuatro campos para cada rebanada. Este valor fue representado con un porcentaje del área total en cada campo. Los resultados se confirmaron en cada experimento a través de al menos dos observadores (K. M., H-J. S. H).
Además, se detectaron células apoptóticas en tejido de tumor utilizando el método TUNEL tal como se describió anteriormente (Mishima y asociados, 2000). Se contaron las células positivas-TU NEL en X400. Se calculó un índice apoptótico como una proporción del número de células apoptóticas: número de células totales en cada campo. El análisis del índice apoptótico a través de manchado TUNEL, demostró un incremento significativo en el número de células apoptóticas en tumores tratados con mAb806 en comparación con tumores de control (P < 0.001; figura 28).
También se analizó el grado de vascularización de tumor mediante inmunomanchado de tumores de especímenes tratados y de control para CD31. Para cuantificar la vascularización de tumor, se midieron áreas microvasculares (MVAs) utilizando análisis de imagen computarizada. Los tumores tratados con mAb806 mostraron el 30% menos de MVA, que los tumores de control (P < 0.001; figura 28).
Para comprender si la interacción entre el receptor y anticuerpo puede provocar una respuesta inflamatoria, se mancharon secciones de tumor para el marcador de macrófago, F4/80, y el marcador de célula NK, asíalo GM1. Los macrófagos fueron identificados a través de la matriz del tumor y especialmente acumulados alrededor de la periferia de tumor U87MG .AEGFR tratados con mAb806 (figura 28). Hemos observado algunas células NK infiltradas en y alrededor de los tumores y sin diferencia significativa entre tumores de control-isotipo y tratados con mAb806 (datos no mostrados).
Ejemplo 17 Inmunoterapia de combinación con mAb806 y mAb528 Los experimentos aquí establecidos describen trabajo in vivo diseñado para determinar la eficacia de anticuerpos de acuerdo con la presente invención.
Se utilizaron ratones desprotegidos hembra, de 4 a 6 semanas de edad, como animales experimentales. Los ratones recibieron inoculaciones subcutáneas de 3 x 106 células de tumor en cada uno de sus flancos.
Los animales recibieron células ya sea U87MG.D2-7, U87MG.DK O A431, las cuales todas se describen supra. La terapia comenzó cuando los tumores habían crecido a un tamaño suficiente.
Posteriormente los ratones recibieron inyecciones de una de (i) solución salina amortiguada con fosfato, (ii) mAb806 (0.5 mg/inyección) , (Mi) mAb528 (0.5 mg/inyección) , o (iv) una combinación de ambos mAbs. Con respecto a "(iv)," diferentes grupos de ratones recibieron ya sea 0.5 mg/inyección de cada mAb, o 0.25 mg/inyección de cada mAb.
El primer grupo de ratones revisado, fueron los que habían recibido inyecciones U87MG.D2-7. El protocolo de tratamiento comenzó 9 días después de la inoculación, y continuó 3 veces por semana durante 2 semanas (es decir, los animales fueron inoculados 9, 11, 13, 16, 18 y 20 días después de que fueron inyectados con las células). Al inicio del protocolo de tratamiento, el diámetro de tumor promedio fue de 115 mm3. Cada grupo contenía 50 ratones, cada uno con dos tumores.
Dentro del grupo de ratones que recibieron la combinación de anticuerpos (0.5 mg/inyección de cada uno), hubieron tres regresiones completas. No hubieron regresiones en cualesquiera de los otros grupos. La figura 18A muestra gráficamente los resultados.
En un segundo grupo de ratones, los materiales inyectados fueron los mismos, excepto la terapia de combinación que contenía 0.25 mg de cada anticuerpo por inyección. Las inyecciones fueron administradas a los 10, 12, 14, 17, 19 y 21 días posteriores a la inoculación con las células. Al inicio de la terapia, el tamaño de tumor promedio fue de 114 mm3. Los resultados se muestran en la figura 18B.
El tercer grupo de ratones recibió inoculaciones de U87MG.DK. Las inyecciones terapéuticas comenzaron 18 días después de la inoculación con las células, y continuó los días 20, 22, 25, 27 y 29. El tamaño de tumor promedio al inicio de los tratamientos fue de 107 mm3. La figura 18C resume los resultados. Las inyecciones terapéuticas fueron las mismas que en el primer grupo.
Finalmente, el cuarto grupo de ratones, que había sido inoculado con células A431, recibió inyecciones en los grupos I y III, a los 8, 10, 12 y 14 días después de la inoculación. Al inició, el tamaño de tumor promedio fue de 71 mm3. Los resultados se muestran en la figura 18D.
Los resultados indicaron que la terapia de anticuerpo de combinación mostró un efecto sinérgico en la reducción de tumores. Ver figura 18A. Se observó un efecto similar en una dosis menor, como en la figura 18B, que indica que el efecto no se debe simplemente a los niveles de dosificación.
La terapia de combinación no inhibió el crecimiento de U87MG.DK (figura 18C), lo que indica que la función inmune del anticuerpo no fue la causa de la disminución observada en las figuras 18A y 18B.
Tal como se muestra en la figura 18D, se observa que la terapia de combinación también exhibió eficacia sinérgica en tumores A431, con 4 dosis que conducen a un rango de respuesta completa del 60%. Estos datos sugieren que la molécula EGFR reconocida por mAb806, es funcionalmente diferente a la inhiba por 528.
Ejemplo 18 Inhibición de mAb806 de Crecimiento de Xenoinjertos de Tumor Tal como se describe en la presente invención y se demuestra en forma adicional y se describe en este Ejemplo, se ha descubierto inesperadamente que mAb806 inhibe el crecimiento de xenoinjertos de tumor que expresan EGFR ya sea de2-7 o amplificado, pero no EGFR tipo silvestre.
Las líneas celulares y anticuerpos fueron preparados tal como se describe en el Ejemplo 1. Para determinar la especificidad de mAb806, se analizó su enlace a células U87MG, U87MG.D2-7 y U87MG . wtEG FR mediante FACS. En síntesis, se analizaron líneas de célula U87MG transf ectadas y de origen cultivadas para expresión EGFR tipo natural y de2-7 utilizando anticuerpos 528, 806 y DH8.3. Se incubaron células (1 3 10 6) con 5 ug/ml de anticuerpo adecuado o un control negativo cotejado por isotipo en PBS que contiene 1% HSA durante 30 minutos a una temperatura de 4°C. Después de tres lavados con PBS/1% HSA, las células se incubaron 30 minutos adicionales en 4°C con anticuerpo anti-ratón de cabra acoplado con FTTC (dilución 1:100; Calbiochem, San Diego, CA). Después de tres lavados subsecuentes, las células fueron analizadas en un Epics Elite ESP (Beckman Coulter, Hialeah, FL) mediante observación de un mínimo de 20,000 eventos y se analizaron utilizando EXPO (versión 2) para Windows. Se incluyó un lgG2b irrelevante (mAb 100-310 dirigido al antígeno humano A33) como un control de isotipo mAb806, y el anticuerpo 528 fue incluido debido a que reconoce EGFR tanto de2-7 como wt. Únicamente el anticuerpo 528 tuvo la capacidad de manchar la línea de célula U87MG de origen (figura 29), consistente con reportes previos que demuestran que estas células expresan el wtEGFR (Nishikawa y asociados, (1994) El receptor de factor de crecimiento epidérmico muíante común en glioma humano, confiere tumorigenicidad mejorada. Proc. Nati. Acad. Sc¡. U.S. A. 91, 7727-7731). mAb806 tuvo niveles de enlace similares al anticuerpo de control, demostrando claramente que no tiene la capacidad de enlazar a wtEGFR (figura 29). El enlace del anticuerpo de control de isotipo a las líneas celulares U87MG.D2-7 y U87MG . wtEG FR fue similar al observado para células U87MG. mAb806 manchó células U87MG.D2-7 y U87 G. wtEGFR, indicando que mAb806 reconoció en forma específica el EGFR de2-7 y un subconjunto de EGFR sobreexpresado (figura 29). Tal como se espera, el anticuerpo 528 manchó líneas celulares tanto U87MG.D2-7 como U87MG. wtEGFR (figura 29). La intensidad del manchado del anticuerpo 528 en células U87MG. wtEGFR, fue mucho mayor que mAb806, lo que sugiere que mAb806 reconoce únicamente una porción del EGFR sobreexpresado. La reactividad mAb806 observada con células U87MG. wtEGFR es similar a la obtenida con células A431, otra línea celular que sobreexpresa wtEGFR.3.
Se llevó a cabo un análisis de Scatchard utilizando células U87MG . D2-7 y A431 para determinar la afinidad relativa y sitios de enlace de mAb806 en cada línea celular. mAb806 tuvo una afinidad para el receptor de2-7EG FR de 1.1 x 109 M"1 y reconoció un promedio (tres experimentos separados) de 2.4 x 105 sitios/células de enlace, tal como se observa en el Ejemplo 4. En contraste, la afinidad de mAb806 para wtEGFR en células A431 fue únicamente del 9.5 x 107 M"1, tal como se observa en el Ejemplo 8. En forma interesante, mAb806 reconoció 2.3 x 105 sitios de enlace en la superficie de A431, lo cual es más o menos 10 veces menor que el número reportado de EGFR encontrados en estas células. Para confirmar el número de EGFR en la superficie de nuestras células A431, llevamos a cabo un análisis de Scatchard utilizando anticuerpo 528 etiquetado con 125l. Tal como se espera, este anticuerpo enlazó aproximadamente a 2 x 106 sitios en la superficie de células A431. Por lo tanto, parece que mAb806 enlaza únicamente una porción de receptores EGFR en la superficie de las células A431. De manera importante, mAb806 etiquetado con 125l no enlazó a las células U87MG de origen en lo absoluto, incluso cuando el número de células se incrementó a 1 x 107.
La reactividad mAb806 fue caracterizada en forma adicional en diversas líneas celulares mediante inmunoprecipitación después de etiquetado 35S utilizando mAb806, sc-03 (un anticuerpo policlonal comercial específico del dominio terminal-COOH de EGFR) y el control de isotipo lgG2b. En síntesis, las células fueron etiquetadas durante 16 horas con 100 mCi/ml de Tran 35S-Label (ICN Biomedicals, Irvine, CA) en DMEM sin metionina/cisteína suplementado con 5% de FCS dializado. Después de lavar con PBS, las células se colocaron en un amortiguador de lisis (1% Tritón X-100, 30 mM HEPES, 150 mM NaCI, 500 µ? 4-(2-aminoetil)bencensulfonilfluoruro (AEBSF), 150 nM aprotinina, 1 µ? E-64 de inhibidor de proteasa, 0.5 mM EDTA, y 1 µ? leupeptina, pH 7.4) durante 1 hora a una temperatura de 4°C. Los Usados fueron aclarados mediante centrifugación durante 10 minutos en 12,000 g y posteriormente se incubaron con 5 µg de anticuerpo adecuado durante 30 minutos a una temperatura de 4°C antes de la adición de Proteína A-Sefarosa. Los inmunoprecipitados se lavaron tres veces con amortiguador de lisis, se mezclaron con amortiguador de muestra SDS, se separaron mediante electrof oresis de gel utilizando 4 a 20% de un gel de Tris/glicina, el cual posteriormente se secó, y se expuso a película de rayos X.
El anticuerpo sc-03 inmunoprecipitó tres bandas de células U87MG.A2-7; un dobleto que corresponde a dos bandas EGFR de2-7 observadas en estas células y una banda de peso molecular mayor que corresponde wtEGFR (figuras 22 y 30). En contraste, aunque mAb806 inmunoprecipitó las dos bandas EGFR de2-7, wtEGFR estuvo completamente ausente. El patrón observado en células U87MG. wtEGFR y A431 fue esencialmente idéntico. El anticuerpo sc-03 inmunoprecipitó una sola banda que corresponde a wtEGFR de células A431 (figuras 22 y 30). mAb806 también inmunoprecipitó una sola banda que corresponde a wtEGFR de célula tanto U87MG. wtEGFR como A431 (figuras 22 y 30). En forma consistente con los datos FACS y Scatchard, la cantidad de EGFR inmunoprecipitado mediante mAb806, fue sustancialmente menor al EGFR total presente en la superficie celular. Debido a que mAb806 y las cantidades similares inmunoprecipitadas sc-03 del EGFR de2-7, este resultado soporta la observación de que el anticuerpo mAb806 reconoce únicamente una porción de EGFR en células que sobreexpresan el receptor. La comparación es entre mAb806 y el anticuerpo 528, mostraron un patrón de reactividad idéntico (datos no mostrados). Un lgG2b irrelevante (un control de isotipo para mAb806) no inmunoprecipito EGFR de cualquier línea celular (figuras 22 y 30). Utilizando condiciones idénticas, mAb806 no inmunoprecipito el EGFR de las células U87MG de origen (datos no mostrados). mAb806 también fue revisado para eficacia contra tumores U87MG y U87MG.A2-7 en un modelo de xenoinjerto preventivo. El anticuerpo o vehículo fue administrado i.p. el día antes de la inoculación del tumor, y se proporcionó tres veces a la semana durante 2 semanas. En una dosis de 1 mg/inyección, mAb806 no tuvo efecto en el crecimiento de xenoinjertos U87MG de origen que expresan el wtEGFR (figura 9A). En contraste, mAb806 inhibió en forma significativa el crecimiento de xenoinjertos U87MG.A2-7 en una forma dependiente de la dosis (figura 9B). Veinte días después de la inoculación de tumor, cuando se sacrificaron los animales de control, el volumen de tumor promedio fue de 1600 ± 180 mm3 para el grupo de control, un 500 ± 95 mm3 significativamente menor para el grupo de 0.1 mg/inyección (P < 0.0001) y 200 ± 42 mm3 para el grupo de 1 mg/inyección (P < 0.0001). Los grupos de tratamiento fueron sacrificados el día 24, tiempo en el cual los volúmenes de tumor promedio fueron de 1300 ± 240 mm3 para el grupo tratado con 0.1 mg y 500 ± 100 mm3 para el grupo tratado con 1 mg (P < 0.005).
Debido a la eficacia de mAb806 en el modelo de xenoinjerto preventivo, se revisó su capacidad para inhibir el crecimiento de xenoinjertos de tumor establecidos. El tratamiento con anticuerpo fue tal como se describe en el modelo preventivo, excepto que comenzó cuando los tumores habían alcanzado un volumen de tumor promedio de 65 mm3 (10 días después del implante) para los xenoinjertos U87MG.A2-7 y 84 mm3 (19 días después del implante) para los xenoinjertos U87MG de origen (ver Ejemplo 10). Una vez más, mAb806 no tuvo efecto en el crecimiento de xenoinjertos U87MG de origen, incluso en una dosis de 1 mg/inyección (figura 10A). En contraste, mAb806 inhibió en forma significativa el crecimiento de xenoinjertos U87MG.A2-7 en una forma dependiente de la dosis (figura 10B). El día 17, un día antes de que se sacrificaran los animales de control, el volumen de tumor promedio fue de 900 ± 200 mm3 para el grupo de control, 400 ± 60 mm3 para el grupo de 0.1 mg/inyección (P < 0.01), y 220 ± 60 mm3 para el grupo de 1 mg/inyección (P < 0.002). El tratamiento de los xenoinjertos U87MG .?2-7 con control de isotipo lgG2b, no tuvo efecto en el crecimiento de tumor (datos no mostrados).
Para revisar que la inhibición de crecimiento observada con mAb806 se restringió a células que expresan EGFR de2-7, también se revisó en un modelo establecido, su eficacia contra los xenoinjertos U87MG.wtEGFR. Estas células sirven como un modelo para tumores que contienen amplificación ya sea en EGFR sin la expresión de EGFR de2-7. El tratamiento con mAb806 comenzó cuando los tumores habían alcanzado un volumen de tumor promedio de 73 mm3 (22 días después del implante). mAb806 inhibió significativamente el crecimiento de xenoinjertos U87MG.wtEGFR establecidos cuando se comparó con tumores de control tratados con vehículo (figura 10C). El día que se sacrificaron los animales de control, el volumen de tumor promedio fue de 1000 ± 300 mm3 para el grupo de control y 500 ± 80 mm3 para el grupo tratado con 1 mg/inyección (P < 0.04).
Para evaluar las diferencias histológicas potenciales entre xenoinjertos U87MG.A2-7 y U87MG wtEGFR de control y tratados con mAb806, se mancharon con H&E (figura 31) secciones incrustadas en parafina, fijadas en formalina. Las áreas de necrosis se observaron en secciones de xenoinjertos mAb806 tratados con U87MG.A2-7 (xenoinjertos tratados con mAb806 fueron recolectados 24 días después de la inoculación del tumor y los xenoinjertos tratados con vehículo a los 18 días), y xenoinjertos U87MG. wtEGFR (xenoinjertos mAb806 se recolectaron 42 días después de la inoculación del tumor y xenoinjertos tratados con vehículo a los 37 días; figura 31). Este resultado fue observado en forma consistente en un número de xenoinjertos de tumor (n = 4 para cada línea celular). Sin embargo, las secciones de xenoinjertos U87MG.A2-7 y U87MG. wtEGFR tratados con vehículo (n = 5) no muestran las mismas áreas de necrosis observadas después de tratamiento mAb806 (figura 31). Los xenoinjertos de vehículo y tratados con mAb806 eliminados en momentos idénticos, también mostraron estas diferencias en necrosis de tumor (datos no mostrados). Por lo tanto, el incremento en necrosis observado no fue originado por los períodos de crecimiento más largos utilizados para los xenoinjertos tratados con mAb806. Además, las secciones de xenoinjertos U87MG tratados con mAb806 también fueron manchados con H&E y no revelaron cualesquiera áreas de necrosis (datos no mostrados), soportando además la hipótesis de que el enlace de mAb806 induce la viabilidad celular disminuida, dando como resultado necrosis incrementada con xenoinjertos de tumor.
Un análisis inmunohistoquímico de secciones de xenoinjertos U87MG, U87MG.A2-7 y U87MG. wtEGFR, se llevó a cabo para determinar los niveles de expresión de de2-7 y wtEGFR después de tratamiento mAb806 (figura 32). Tal como se esperó, el anticuerpo 528 manchó todas las secciones de xenoinjertos sin disminución obvia en intensidad entre tumores tratados y de control (figura 32). El manchado de secciones U87MG fue indetectable con el mAb806; sin embargo, el manchado positivo de secciones de xenoinjerto U87MG.A2-7 y U87MG.wtEGFR fue observado (figura 32). No hubo diferencia en la intensidad de manchado mAb806 entre xenoinjertos U87MG.A2-7 y U87MG.wtEGFR de control y tratados, lo que sugiere que el tratamiento con anticuerpo no conduce a la selección de variantes clónales que carecen de reactividad mAb806.
Para demostrar que los efectos anti-tumor de mAb806 no fueron restringidos a células U87MG, el anticuerpo fue administrado a ratones que contienen xenoinjertos A431. Estas células contienen un gen EGFR amplificado y expresan aproximadamente 2 x 106 receptores/células. Hemos mostrado previamente que mAb806 enlaza -10% de estos EGFRs y dirige xenoinjertos A431 (García y asociados, (1993) Expresión de receptor de factor de crecimiento epidérmico mutado mediante células no pequeñas a lo largo de carcinomas Cáncer Res. 53, 3217-3220). mAb806 inhibió en forma significativa el crecimiento de xenoinjertos A431 cuando se revisó en el modelo de xenoinjerto preventivo descrito anteriormente (figura 11 A). El día 13, cuando los animales de control fueron sacrificados, el volumen de tumor promedio fue de 1400 ± 150 mm3 en el grupo tratado con vehículo y 260 ± 60 mm3 para el grupo de tratamiento de 1 mg/inyección (P < 0.0001). En un experimento separado, una dosis de 0.1 mg de mAb también inhibió en forma significativa (P < 0.05) el crecimiento de xenoinjertos A431 en un modelo preventivo (datos no mostrados) (ver Ejemplo 10).
Debido a la eficacia de mAb806 en el modelo de xenoinjerto A431 preventivo, se revisó su capacidad de inhibir el crecimiento de xenoinjertos de tumor establecido. El tratamiento con anticuerpos fue tal como se describe en el modelo preventivo, excepto que no comenzó hasta que los tumores habían alcanzado un volumen de tumor promedio de 200 ± 20 mm3. mAb806 inhibió en forma significativa el crecimiento de xenoinjertos A431 establecidos (figura 11B). El día 13, los animales de control fueron sacrificados, el volumen de tumor promedio fue de 1100 ± 100 mm3 para el grupo de control y 450 ± 70 mm3 para el grupo de 1 mg/inyección (P < 0.0001).
Ejemplo 19 Construcción, Expresión y Análisis de Anticuerpo 806 Quimérico Los anticuerpos quiméricos son una clase de moléculas en las cuales las regiones variables de cadena pesada y ligera por ejemplo, de un ratón, rata u otra especie, se unen en regiones de cadena pesada y ligera humanas, los anticuerpos quiméricos se producen en forma recombinante. Una ventaja de anticuerpos quiméricos es que pueden reducir los efectos xenoantigénicos, la inmunogenicidad inherente de anticuerpos no humanos (por ejemplo, ratón, rata u otra especie). Además, anticuerpos quiméricos preparados en forma recombinante con frecuencia pueden ser producidos en grandes cantidades, particularmente cuando se utiliza vectores de expresión de alto nivel.
Para la producción de alto nivel, el sistema de expresión de mamífero más ampliamente utilizado es uno que utiliza el procedimiento de amplificación de gen ofrecido por células de ovario de hámster chino con deficiencia de reductasa de deshidrofolato ("dhfr-"). El sistema es bien conocido para los expertos en la técnica. El sistema está basado en el gen de reductasa de deshidrofolato, que codifica la enzima DHFR, que cataliza la conversión de deshidrofolato a tetrahidrofolato. Con el objeto de lograr una alta producción, las células dhfr-CHO fueron transfectadas con un vector de expresión que contiene un gen DHFR funcional, junto con un gen que codifica una proteína deseada. En este caso, la proteína deseada es anticuerpo recombinante de cadena pesada y/o cadena ligera.
Al incrementar la cantidad de inhibidor DHFR competitivo, metotrexato (MTX), las células recombinantes desarrollan resistente amplificando el gen dhfr. En casos estándar, la unidad de amplificación empleada es mucho mayor que el tamaño del gen dhfr, y como resultado se amplifica en conjunto la cadena pesada de anticuerpo.
Cuando la producción a gran escala de la proteína, tal como la cadena de anticuerpo es deseada, tanto el nivel de expresión como la estabilidad de las células que están siendo empleadas es importante. En un cultivo a largo plazo, las poblaciones de célula CHO recombinante pierden homogeneidad con respecto a su productividad de anticuerpo específica durante amplificación, incluso aunque se deriven de un clon de origen , simple, Se prepararon vectores de expresión bicistrónicos para utilizarse en la expresión recombinante de anticuerpos quiméricos. Estos vectores de expresión bicistrónica, emplean un "sitio de entrada ribosomal interno" o "I ES". En estas construcciones para la producción de anti-EGFR quimérico, se enlazan las cadenas de inmunoglobulina y los marcadores seleccionables cADNs a través de un IRES. IRES son elementos de acción-cis que recluían las subunidades ribosomales pequeñas a un codón iniciador interno en el mARN con la ayuda de factores de trans-actuación celular. IRES facilita la expresión de dos o más proteínas de una unidad de transcripción policistrónica en células eucarióticas. El uso de vectores de expresión bicistrónica en donde el gen marcador seleccionable es traducido en una forma dependiente de cap, el gen de interés en una forma dependiente de IRES, ha sido aplicado a una variedad de métodos experimentales. Los elementos IRES han sido incorporados en forma exitosa en vectores para transformación celular, producción de animales transgénicos, producción de proteína recombinante, terapia genética, atrapamiento de gen y dirección de gen.
Sinopsis de Construcción de Anticuerpo 806 Quimérico (ch806) El anticuerpo 806 quimérico fue generado clonando las cadenas VH y VL del anticuerpo 806 del hibridoma de múrido de origen utilizando técnicas de biología molecular estándar. Las cadenas VH y VL posteriormente fueron clonadas en los vectores de expresión de mamífero pREN, cuya construcción se establece en la SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 8, y se transfectan en células CHO (DHFR-/-ve) para amplificación y expresión. En síntesis, después del tripsinizado, se transfectaron células 4 x 106 CHO junto con 10 de cada uno de los vectores de expresión LC y HC, utilizando electroporación bajo condiciones estándar. Después de un período de descanso de 10 minutos a temperatura ambiente, las células se agregaron a 15 mi de medio (10% de suero de becerro fetal, suplemento de hipoxantina/timidina con aditivos) y se transfirieron a platos de petri de cultivo celular de 15 x 10 cm. Las placas se colectaron posteriormente en el incubador bajo condiciones normales durante 2 días.
En este punto, la adición de gentamicina, 5 nM de metotrexato, el reemplazo de suero de becerro fetal con suero de becerro fetal dializado y la eliminación de hipoxantina/timidina, inició la deleción de clones que fueron transfectados en forma exitosa tanto con LC como HC del medio. El día 17 posterior a la transfección, los clones individuales que crecen bajo selección fueron recolectados y clasificados para expresión del anticuerpo 806. Se utilizó un ensayo ELISA para clasificación y consistió en recubrir una placa ELISA con receptor EGF soluble desnaturalizado (EGFR desnaturalizado es conocido por permitir el enlace 806). Este ensayo permitió la clasificación de niveles de producción mediante clones individuales y también para la funcionalidad del anticuerpo que está siendo clasificado. Todos los clones mostraron producir ch806 funcional y el mejor productor fue tomado y expandido para amplificación. Para amplificar el nivel de ch806 que está siendo producido, se sometió el clon de producción más alta a reselección bajo una concentración de metotrexato superior (100 nM vs. 5 nM). Esto se toma utilizando los procedimientos antes mencionados.
Posteriormente se pasaron los clones que crecen en 100nM MTX a la Instalación de Producción Biológica de Ludwig Institute, Melbourne, Australia para medir los niveles de producción ablactación del suero, y apilado celular. La línea celular ha mostrado producir en forma estable -10 mg/litros en botellas de rodillo.
La secuencia de ácido nucleico del vector neo pREN ch806 LC se proporciona en la SEC ID NO: 7. La secuencia de ácido nucleico del vector pREN ch806 HC DHFR se proporciona en la SEC ID NO: 8.
La figura 33 ilustra los vectores pREN-HC y pREN-LC, que emplean un IRES. El sistema de vector bicistrónico pREN se describe en la Solicitud de Patente Norteamericana también pendiente No. 60/355,838 presentada el 13 de Febrero de 2002, la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. ch806 se evaluó mediante análisis FACS para demostrar que 806 quimérico despliega especificidad de enlace idéntica a la del anticuerpo de origen de múrido. El análisis se llevó a cabo utilizando células tipo silvestre (células de origen U87MG), células que sobreexpresan el receptor EGF (células A431 y células UA87.wtEGFR) y células ???87.?2-7 (datos no mostrados). Se obtuvo especificidad de enlace similar de mAb806 y ch806 utilizando células que sobreexpresan EGFR y células que expresan EGFR de2-7. No se observó enlace en células tipo natural. El análisis de Scatchard reveló una afinidad de enlace para ch806 radioetiquetado de 6.4 x 109 M"1 utilizando células U87MGde2-7 (datos no mostrados).
Se llevó a cabo el análisis de biodistribución del anticuerpo ch806 en ratones desprotegidos BALB/c que contienen tumores de xenoinjerto U87MG-de2-7 y los resultados se muestran en la figura 34. Los ratones se inyectaron con 5 pg de anticuerpo radioetiquetado y se sacrificaron en grupos de cuatro por punto de tiempo a las 8, 24, 48 y 74 horas. Se recolectaron los órganos, se pesaron y la radioactividad se midió en un contador gamma. ch806 etiquetado con I despliega dirección reducida al tumor en comparación con ch806 etiquetado con 11ln, el cual tiene una alta captación de tumor y retención de tumor acumulativa durante un período de tiempo de 74 horas. A las 74 horas, el anticuerpo etiquetado con 11ln despliega aproximadamente 30% ID/gramo de tejido y una proporción de tumor a sangre de 4.0 (figura 35). El ch806 etiquetado con 111ln muestra cierta retención no específica en el hígado, bazo y ríñones. Esto es común para el uso de este isotipo y se disminuye con el tiempo, lo cual soporta que este enlace no es específico para ch806 y se debe al enlace 111ln.
El anticuerpo quimérico ch806 se evaluó para eficacia terapéutica en un modelo de tumor establecido. Se inocularon células 3 x 106 U87MG.A2-7 en 100 µ? de PBS s.c. en ambos flancos de ratones desprotegidos hembra de 4 a 6 semanas de edad (Animal Research Center, Western Australia, Australia). El mAb806 se incluyó como un control positivo. Los resultados se ilustran en la figura 36. El tratamiento se inició cuando los tumores habían alcanzado un volumen promedio de 50 mm3 y consistió en 1 mg de ch806 o mAb806 proporcionado i.p. para un total de 5 inyecciones en los días indicados. El volumen de tumor en mm3 se determinó utilizando la fórmula (longitud x ancho2)/2, en donde la longitud fue el eje más largo y el ancho la medida en ángulos rectos a la longitud. Los datos se expresan como un volumen de tumor promedio +/- SE. para cada grupo de tratamiento. El ch806 y mAb806 desplegó actividad anti-tumor casi idéntica contra xenoinjertos U87MG.A2-7.
Análisis de Función Efectora Inmune Ch806 Materiales v Métodos Anticuerpos v Líneas Celulares Se preparó mAb806 monoclonal anti-EGFR de2-7 de múrido, anticuerpo quimérico ch806 (IgGi) y anticuerpo cG250 monoclonal anti-G250 quimérico cotejado con isotipo de control a través de la Instalación de Producción Biológica de Ludwig Institute for Cáncer Research, Melbourne, Australia. Los ensayos tanto de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), como de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), utilizaron células U87MG.de2-7 y A431 como células objetivo. La línea de célula U87MG.de2-7 descrita anteriormente es una línea de célula de astrocitoma humano infectada con retrovirus que contiene el de2-7EGFR (Nishikawa y asociados, (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 91, 7727-31). Se compraron células A431 de carcinoma escamoso humano en la Recolección de Cultivo Tipo Americana (Manassas, VA). Todas las líneas celulares fueron cultivadas en DMEM/F-12 con Glutamax (Life Technologies, Melbourne, Australia) suplementadas con FCS desactivado con calor al 10% (CSL, Melbourne, Australia), 100 unidades/ml de penicilina y 100 ng/ml de estreptomicina. Para mantener la sección para células U87MG.de2-7 transí ectadas en forma retroviral, se incluyó 400 ng/ml de G418 en el medio.
Preparación de células efectoras. de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) Las PBMCs se aislaron de un donador de sangre voluntario saludable. Se fraccionó la sangre completa heparinizada mediante centrifugación de densidad en Ficoll-Hypaque (ICN Biomedical Inc, Ohio, USA). Las fracciones PBMC se recolectaron y lavaron tres veces con RPMT 1640 suplementado con 100 U/ml de penicilina y 100 ng/ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina que contiene 5% de FCS desactivado con calor.
Preparación de Células Objetivo Se llevaron a cabo ensayos CDC y ADCC a través de una modificación de un método publicado previamente (Nelson, D. L. y asociados, (1991) In: J. E. Colignan, A. M. Kruisbeek, D. D. Margulies, E. M. Shevach, y W. Strober (eds.), Protocolos Actuales en Inmunología pp. 7.27.1. Nueva York: Greene Publishing Wiley Interscience) . En síntesis se etiquetaron 5 x 106 de células U87MG .de2-7 y A431 objetivo con 50 de µ??51?t (Geneworks, Adelaide, Australia) por 1 x 106 células y se incubaron durante 2 horas a una temperatura de 37°C. Posteriormente las células se lavaron tres veces con PBS (0.05M, pH 7.4) y un cuarto lavado con medio de cultivo. Se agregaron alícuotas (1 x 104 células/50 µ?) de las células etiquetadas a cada depósito de placas de microtitulación de 96 depósitos (NUNC, Roskilde, Dinamarca).
Ensayo CDC A 50 µ? de células objetivo etiquetadas, se les agregó 50 µ? de ch806 o anticuerpo de control de isotipo cG250 por triplicado en el rango de concentración de 0.00315 - 10 ng/ml, y se incubaron sobre hielo durante 5 minutos. Posteriormente se agregaron cincuenta µ? de complemento de donador saludable (suero) preparado recientemente para producir una dilución 1:3 final del suero. Las placas de microtitulación se incubaron durante 4 horas a una temperatura de 37°C. Después de la centrifugación, el 51Cr liberado en el sobrenadante fue contado (Contador Gamma Automático Cobra II, Canberra Packard, Melbourne, Australia). Se calculó el porcentaje de lisis específica de la liberación 51Cr experimental, la liberación total (50 µ? de células objetivo + 100 µ? 10% Tween 20) y espontánea (50 µ? de células objetivo + 100 µ? de medio).
Ensayo ADCC ADCC transmitido con ch806 efectuado por PBMCs de donador saludable se midieron a través de dos ensayos de liberación 511Cr de 4 horas. En el primer ensayo, las células objetivo etiquetadas fueron revestidas con células efectoras en microplacas con fondo de "U" de 96 depósitos (NUNC, Roskilde, Dinamarca) en proporciones de célula efectora/objetivo (E:T) de 50:1. Para las medidas de actividad ADCC, se agregaron 0.00315 a 10 ng/ml (concentración final) de anticuerpos de prueba y control por triplicado a cada depósito. En el segundo ensayo ADCC, la actividad ADCC de ch806 fue comparada con mAb806 de múrido de origen en un rango de proporciones de célula efectora: objetivo con la constante de concentración del anticuerpo de prueba en 1 ng/ml. En ambos ensayos, se incubaron placas de microtitulación a una temperatura de 37°C durante 4 horas, posteriormente se recolectaron 50 µ? de sobrenadante de cada depósito y se determinó en 51Cr liberado mediante conteo gamma (Contador Gamma Automático Cobra II, Canberra Packard, Melbourne, Australia). Se incluyeron controles en los ensayos corregidos para liberación espontánea (medio solo) y liberación total (10% Tween20/PBS) . Los controles adecuados con el mismo anticuerpo de subclase se corrieron en paralelo.
Se calculó el porcentaje de lisis celular (citotoxicidad) de acuerdo con la fórmula: Porcentaje de citotoxicidad=Conteos de Muestra - Liberación Espontánea x 100 Liberación total - Liberación Espontánea El porcentaje (%) de citotoxicidad se trazó versus la concentración de anticuerpo (pg/ml).-Resultados Se presentan resultados de los análisis CDC en la figura 37. Se observó una actividad CDC mínima en la presencia de hasta 10 ng/ml de ch806 con CDC comparable con el observado con el control de ¡sotipo cG250.
En la figura 38 se presenta el ADCC transmitido por ch806 en células U87MG.de2-7 y A431 objetivo en una proporción E:T de 50:1. Se desplegó la citotoxicidad específica ch806 efectiva, contra células U87MG.de2-7 objetivo, aunque se transmitió ADCC mínimo mediante células ch806 en A431. Los niveles de citotoxicidad logrados reflejan el número de sitios de enlace ch806 en las dos poblaciones celulares. Las células U87MG.de2-7 objetivo expresan ~ 1 x 106 de de2-7EGFR que son reconocidas en forma específica por ch806, aunque únicamente un subconjunto de 1 x 106 de moléculas EGFR tipo silvestre expresadas en células A431, son reconocidas por ch806 (ver ejemplos anteriores).
Los análisis ADCC adicionales se llevaron a cabo para comparar el ADCC transmitido por 1 Hg/ml de ch806 en células U87MG.de2-7 objetivo con el efectuado mediante 1 ng/ml de mAb806 de múrido de origen. Los resultados se presentan en la figura 39. La quimerización de mAb806 tiene una mejoría marcada efectiva del ADCC logrado a través de ADCC de múrido parenteral, no mayor al 30% de citotoxicidad efectuada en proporciones 30% de E:T y 25:1 y 50:1 La carencia de función efectora inmune mAb806 de múrido de origen ha sido mejorada en forma marcada en la quimerización. ch806 transmite buen ADCC, pero mínima actividad CDC.
Ejemplo 20 Generación de Anticuerpos Anti-ldiotipo Para Anticuerpo Quimérico ch806 Para ayudar a la evaluación clínica de mAb806 o c 806, se requieren ensayos de laboratorio para monitorear las farmacocinéticas de suero de los anticuerpos, y cuantificar las respuestas inmune al anticuerpo quimérico de ratón-humano. Se generaron anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales de ratón (anti-ids) y se caracterizaron para capacidad de adaptación como reactivos ELISA para medir ch806 en muestras de suero de pacientes, y se utilizaron como controles positivos en análisis de respuesta inmune de anticuerpo anti-quimérico humanos.
Los anticuerpos anti-idiotipo también pueden ser útiles como vacunas terapéuticas o profilácticas, generan en los pacientes una respuesta a un anticuerpo anti-EGFR natural.
Los métodos para generar anticuerpos anti-idiotipo son bien conocidos en la técnica (Chatterjee y asociados, 2001; Uemura y asociados, 1994; Steffens y asociados, 1997; Safa y Foon, 2001; Brown y Ling, 1988).
En síntesis, se generaron anticuerpos anti-idiotípicos monoclonales de ratón (anti-ids) como se indica a continuación. Los esplenocitos de ratones inmunizados con ch806 fueron fusionados con células de plasmacitoma, y se seleccionaron hibridomas que producen anticuerpos a través de ch806 para enlace específico a SP2/0-AG14 y enlace competitivo para antígeno ELISA. Se seleccionaron inicialmente 25 hibridomas y cuatro anticuerpos secretados, designados L H-11, -12, -13, y -14, que demostraron enlace específico a ch806, mAb806 y tuvieron la capacidad de neutralizar la actividad de enlace de antígeno ch806 o mAb806 (figura 41). El reconocimiento del idiotipo ch806/mAb806 o región CDR fue demostrado mediante la carencia de reactividad cruzada con IgG humano policlonal purificado.
En la ausencia del antígeno recombinante fácilmente disponible EGFR de2-7, para ayudar a la determinación de ch806 en muestras de suero, se explotó la capacidad de los anticuerpos ch806 anti-idiotipo novedosos para enlazar en forma concurrente a regiones variables 806 en el desarrollo de un ELISA específico, sensible para medir ch806 en las muestras clínicas (figura 42). Utilizando LMH-12 para captura y Biotinylated-LMH-12 para detección, el ELISA validado demostró curvas de enlace altamente reproducibles para medir ch806 (2 ng/ml - 1.6 ng/ml) en sueros con 3 ng/ml de límite de detección. (n = 12; 1-100 ng/ml, Coeficiente de Variación < 25%; 100 ng/ml-5 ug/ml, Coeficiente de Variación < 15%). No fue evidente el enlace de fondo con los tres sueros de donador saludable probados y se observó un enlace insignificante con el control de isotipo hu3S193. El hibridoma produce altos niveles de anticuerpo LMH-12, y se planea una producción a mayor escala para permitir la medida de ch806 y cuantif icación de cualquier respuesta inmune en muestras clínicas (Brown y Ling, 1988).
Resultados La inmunización de ratones y la inmunorreactividad de selección de clon de hibridoma de muestras de suero de pre- y post-inmunización, indicó el desarrollo de mAbs anti-ch806 y anti-hulgG de ratón con titulador de alto nivel. Veinticinco hibridomas que producen anticuerpos que enlazan a ch806, pero no a hulgG, se seleccionaron inicialmente. Las características de enlace de algunos de estos hibridomas se muestran en las figuras 42A y 42B. Cuatro de estos hibridomas anti-ch806 con alta afinidad de enlace (clones 3E3, SB8, 9D6 y 4D8) se obtuvieron subsecuentemente para expansión clonal de células simples limitando la dilución y diseñadas por el Ludwig Institute de Cáncer Research Melbourne, como Hibridoma (LMH) -11, -12, -13, y -14, respectivamente (figura 42).
Actividades de Enlace v Bloqueo de Anticuerpos Anti-ldiotipos Seleccionados La capacidad de anticuerpos anti-ch806 para enlazar en forma concurrente dos anticuerpos ch806, es una característica deseable para su uso como reactivos en un ELISA para determinar los niveles de ch806 en suero. Los hibridomas clónales LMH-11, -12, -13, y -14 demostraron enlace concurrente (datos no mostrados).
Después de la expansión clonal, los sobrenadantes de cultivo de hibridoma se revisaron mediante ELISA con respecto a su capacidad de neutralizar la actividad de enlace de antígeno ch806 o mAb806 con sEGFR621. Los resultados demostraron la actividad antagonista del mAbs anti-idiotipo LMH-11, -12, -13, y -14 con el bloqueo en solución tanto de ch806 y como de mAb806 de múrido que enlaza a placas recubiertas con sEGFR (figura 41 para LMH-11, -12, -13).
Después de un cultivo a mayor escala en botellas de rodillo, se verificaron mediante ELISA la especificidad de enlace de los hibridomas clónales, LMH-11, -12, -13, y -14. Los anticuerpos LMH-11 a -14 fueron identificados como lgG1i de isotipo mediante equipo de isotipif icación de anticuerpo monoclonal de ratón. ch806 en el Desarrollo de Ensayo ELISA Farmacocinético de Muestras de Suero Clínicas Para ayudar a la determinación de ch806 en muestras de suero, se explotó la capacidad de los anticuerpos ch806 anti-idiotipo para enlazar en forma concurrente con la región variable 806 en el desarrollo de un ensayo ELISA sensible y específico para ch806 en muestras clínicas. Los tres clones purificados LMH-11, -12, y -13 (figuras 49B y 49C, respectivamente, fueron comparados con respecto a su capacidad de capturar y posteriormente detectar el ch806 enlazado en suero. Los resultados indicados utilizando LMH-12 (10 ng/ml) para capturar y LMH-12 biotinilado para detección, produjeron la sensibilidad más alta para ch806 en suero (3 ng/ml) con enlace de fondo insignificante.
Habiendo establecido las condiciones ELISA farmacocinéticas óptimas utilizando 1 ng/ml de LMH-12 anti-idiotipo y 1 ng/ml de LMH-12 biotinilado para captura y detección, respectivamente, se llevó a cabo la validación del método. Se llevaron a cabo tres ELISAs separados por cuadruplicado para medir ch806 en suero de donador de tres donadores saludables o 1% de BSA/medio con control de isotipo hu3S193. Los resultados de la validación se presentan en la figura 43 y demuestra curvas de enlace altamente reproducibles para medir ch806 (2 ng/ml - 1.6 ng/ml) en sueros con un límite de detección de 3 ng/ml. (n = 12¡ 1-100 ng/ml, Coeficiente de Variación < 25%; 100 ng/ml- 5 ng/ml, Coeficiente de Variación < 15%). No fue evidente un enlace de fondo con cualesquiera de los tres sueros probados y se observó un enlace insignificante con el control de isotipo hu3S193.
Ejemplo 21 Evaluación de Estructuras de Carbohidrato v Reconocimiento del Anticuerpo Se tomaron experimentos para evaluar en forma adicional el desempeño de estructuras de carbohidrato en el enlace de reconocimiento de EGFR, EGFR tanto amplificado como de2-7 a través del anticuerpo mAb806.
Para determinar si las estructuras de carbohidrato están implicadas directamente en el epítope mAb806, el sEGFR recombinante expresado en células CHO se trató con PNGase para eliminar la glucosilación enlazada-N. Después del tratamiento, la proteína se corrió en SDS-PAGE, se transfirió a una membrana y se inmunomanchó con mAb806 (figura 44). Tal como se espera, el sEGFR desglucosilado corrió más rápido en SDS-PAGE, indicando que los carbohidratos han sido eliminados en forma exitosa. El anticuerpo mAb806 se enlazó claramente al material desglucosilado demostrando que el epítope de anticuerpo es péptido por naturaleza y no solamente un epítope de glucosilación.
Los Usados, preparados de líneas celulares etiquetadas en forma metabólica con 35S, se inmunoprecipitaron con diferentes anticuerpos dirigidos a EGFR (figura 45). Tal como se espera, el anticuerpo 528 inmunoprecipitó tres bandas de células U87MG .?2-7, una banda superior que corresponde al EGFR tipo silvestre (wt) y dos bandas inferiores que corresponden al EGFR de2-7. Estas dos bandas EGFR de2-7 han sido reportadas previamente y se asume que representan glucosilación diferencial (Chu y asociados, (1997) Biochem. J. Jun 15; 324 (Pt 3): 885-861). En contraste, mAb806 únicamente inmunoprecipitó las dos bandas EGFR de2-7 con el receptor tipo silvestre estando completamente ausente incluso después de sobreexposición (datos no mostrados). En forma interesante, mAb806 mostró reactividad relativa incrementada con la banda de EGFR de2-7 inferior pero disminuyó la reactividad con la banda superior cuando se comparó con el anticuerpo 528. El anticuerpo SC-03, un anticuerpo policlonal de conejo comercial dirigido al dominio C-terminal de EGFR, inmunoprecipitó las tres bandas EGFR tal como se observa con el anticuerpo 528, aunque la cantidad total de receptor inmunoprecipitado a través de este anticuerpo fue considerablemente menor. No se observaron bandas cuando se utilizó un anticuerpo lgG2b irrelevante como un control para mAb806 (ver Ejemplo 18).
El anticuerpo 528 inmunoprecipitó una banda simple de células U87MG.wtEGFR que corresponden al receptor tipo silvestre (figura 45). mAb806 también inmunoprecipitó una banda simple de estas células, sin embargo, esta banda EGFR migró claramente más rápido que el receptor reactivo 528. El anticuerpo SC-03 inmunoprecipitó ambas bandas reactivas EGFR de células U87MG.wtEGFR, confirmando en forma adicional que mAb806 y 528 reconocen diferentes formas de EGFR en Usados de célula completa de estas células.
Tal como se observó con células U87MG.wtEGFR, el anticuerpo 528 inmunoprecipitó una banda EGFR simple de células A431 (figura 45). La banda EGFR reactiva 528 es muy amplia en estos bajos porcentajes de gel (6%) y probablemente refleja la diversidad de glucosilación de receptor. También se observó una banda EGFR simple después de inmunoprecipitación con mAb806. Aunque esta banda EGFR no migró considerablemente más rápido que la banda reactiva generalmente amplia 528, se localizó en el borde de conducción de la banda 528 amplia en una forma reproducible. A diferencia de los lisados celulares U87MG.A2-7, la cantidad total de EGFR inmunoprecipitado mediante mAb806 de lisados A431 fue considerablemente menor que con el anticuerpo 528, un resultado consistente con nuestros datos Scatchard que muestran que mAb806 únicamente reconoce una porción de EGFR en la superficie de estas células (ver Ejemplo 4). La inmunoprecipitación con SC-03 dio como resultado una banda EGFR amplia simple como para el anticuerpo 528. Se obtuvieron resultados similares o en células HN5 (datos no mostrados). Tomados juntos, estos datos indican que mAb806 reacciona preferentemente con especies que migran en forma más rápida del EGFR, lo cual puede representar formas glucosiladas en forma diferencial del receptor.
Con el objeto de determinar en que etapa del procesamiento de receptor apareció la reactividad mAb806, se llevó a cabo un experimento de pulsación/seguimiento. Se pulsaron células A431 y U87MG.A2-7 durante 5 minutos con 35S metionina/cisteína, posteriormente se incubaron a un temperatura de 37°C durante varias veces antes de inmunoprecipitación con mAb806 o 528 (figura 46). El patrón de inmunoprecipitación en células A431 con el anticuerpo 528 fue típico de un anticuerpo dependiente de la conformación específica del EGFR. Se inmunoprecipitó una pequeña cantidad de receptor en 0 min (ya sea después de 5 minutos de pulsación) con la cantidad de EGFR etiquetada incrementando en cada punto de tiempo. También hubo un incremento concurrente con el tiempo en el peso molecular del receptor. En contraste, el material EGFR reactivo mAb806 estuvo presente en altos niveles a los 0 minutos, elevándose a los 20 minutos y posteriormente se redujo en cada punto de tiempo adicional. Por lo tanto, parece que mAb806 reconoce preferentemente una forma de EGFR encontrada en una etapa temprana del procesamiento.
La reactividad del anticuerpo observada en células U87MG.A2-7 etiquetadas con pulsación fue más complicada. La inmunoprecipitación con el anticuerpo 528 a los 0 minutos reveló que se etiquetó una pequeña cantidad de la banda EGFR de2-7 inferior (figura 46). La cantidad de banda inferior EGFR de2-7 reactiva 528 incrementó con el tiempo, elevándose a los 60 minutos y disminuyendo lentamente a las 2 y 4 horas. No se detectó cantidad significativa de banda superior etiquetada de EGFR de2-7 hasta los 60 minutos, después de lo cual el nivel continuó incrementando hasta el final del curso de tiempo. Esto indica claramente que el EGFR de2-7 superior es una forma más madura del receptor. También varió la reactividad mAb806 durante el estudio de curso de tiempo, Sin embargo mAb806 precipitó preferentemente la banda inferior del de27 EGFR. De hecho, no hubieron niveles significativos de banda superior mAb806 observados hasta 4 horas después del etiquetado.
Los experimentos anteriores sugieren que mAb806 reacciona preferentemente con una forma de glucosilacion más inmadura del de2-7 y wtEGFR. Esta posibilidad fue probada inmunoprecipitando el EGFR de diferentes líneas celulares etiquetadas durante la noche con 35S metionina/cisteína y posteriormente sometiendo los precipitados resultantes a digestión con Endoglucosidasa H (Endo H). Esta enzima elimina preferentemente carbohidratos tipo mañosa de alto nivel (es decir glucosilacion inmadura) de proteínas, aunque deja intacto los carbohidratos complejos (es decir glucosilacion madura). La inmunoprecipitación y digestión con Endo H de lisado de célula U87MG.A2-7 etiquetados con 528, mAb806 y SC-03 tuvieron resultados similares (figura 47).
Tal como se amplificó, la banda EGFR de2-7 inferior fue completamente sensible a digestión Endo H, migrando en forma más rápida en SDS-PAGE después de digestión Endo H, lo que demuestra que esta banda representa la forma de mañosa de alto nivel de EGFR de2-7. La banda EGFR de2-7 superior fue potencialmente resistente a digestión Endo H, mostrando únicamente una diferencia muy ligera en migración después de digestión Endo H, indicando que la mayor parte de las estructuras de carbohidrato son de tipo complejo. La pequeña pero reproducible disminución en el peso molecular de la banda superior después de la digestión de enzimas, sugiere que aunque los carbohidratos en la banda EGFR de2-7 superior son predominantemente de tipo complejo, no poseen algunas estructuras de mañosa de alto nivel. En forma interesante, las células también expresan bajas cantidades de wtEGFR endógeno que es claramente visible después de la inmunoprecipitación 528. También hubo una pequeña reducción notable en el peso molecular del receptor tipo silvestre después de digestión Endo H, indicando que también contiene estructuras de mañosa de alto nivel.
La sensibilidad del wtEGFR inmunoprecipitado a digestión Endo H fue similar tanto en células U87MG. wtEGFR como A431 (figura 47). El volumen del material precipitado mediante el anticuerpo 528, fue resistente a la enzima Endo H, aunque una pequeña cantidad del material fue de la forma de mañosa de alto nivel. Una vez más hubo una pequeña disminución en el peso molecular de wtEGFR después de digestión Endo H lo que sugiere que contienen ciertas estructuras de mañosa de alto nivel. Los resultados utilizando un anticuerpo SC-03 fueron similares al anticuerpo 528. En contraste, la mayor parte del EGFR precipitado mediante mAb806 fue sensible a Endo H tanto en células U87MG. wtEGFR como A431, lo que confirma que mAb806 reconoce preferentemente la forma de mañosa de alto nivel de EGFR. Se obtuvieron resultados similares con células HN-5, en donde la mayor parte del material precipitado mediante mAb-806 fue sensible a digestión Endo H, aunque la mayor parte del material precipitado mediante mAb528 y SC-03, fue resistente a digestión Endo H (datos no mostrados).
La yodinación de superficie celular en la línea celular A431, se llevó a cabo con 125l seguido de inmunoprecipitación con anticuerpo 806. El protocolo para la yodinación de superficie fue como se indica: La lisis celular, inmunoprecipitación, digestión Endo H, SDS PAGE y autorradiograf ía son tal como se describe anteriormente en la presente invención. Para etiquetado, las células se crecieron en medios con 10% FCS, se separaron con EDTA, se lavaron dos veces con PBS posteriormente se resuspendieron en 400 µ? de PBS (aproximadamente 2-3 x106 células). A este se le agregó 15 µ? de 125l (100 mCi/ml reserva), 100 µ? de reserva de lactoperoxidasa de bovino (1 mg/ml), 10 µ? de H202 (0.1% de reserva) y esto se incubó mediante 5 minutos. Posteriormente se agregaron 10 µ? H202 adicionales y la incubación continuó durante 3 minutos adicionales. Las células se lavaron posteriormente 3 veces con PBS y se Usaron en 1% Tritón. La yodinación de superficie celular en la línea celular A431 con lactoperoxidasa, seguido de inmunoprecipitación con el anticuerpo 806, mostró que, en forma similar a los lisados celulares completos descritos anteriormente, la forma predominante de EGFR reconocida mediante 806, enlazada en la superficie celular de células A431 , fue sensible a digestión EndoH (figura 48). Esto confirma que la forma de EGFR enlazado mediante 806 en la superficie celular de células A431 es una forma sensible EndoH y por lo tanto es el tipo de mañosa de alto nivel.
Ejemplo 22 Anticuerpo (chapeada) humanizado 806 A. Construcción hu80 Se construyó un vector de expresión de un anticuerpo 806 humanizado (hu806). El vector, denominado 8C65AAG (11891 pb; SEC ID NO:41), se diseñó para contener ambos genes para una longitud total, en un cartucho de expresión de gen operado por promotor GS simple (figuras 53 y 54).
Las regiones variables de cadena pesada (VH) y constantes (CH) (SEC ID NOS:42 y 43, respectivamente) se mostraron en la figura 55A, con la región VH CDR1 , CDR2, y CDR3 (SEC ID NOS:44, 45, y 46, respectivamente) indicadas mediante subrayado.
Las regiones variables de cadena ligera (VL) y constantes (CL) (SEC ID NOS:47 y 48, respectivamente) se muestran en la figura 55B, con la región VL CDR1 , CDR2, y CDR3 (SEC ID NOS:49, 50, y 51, respectivamente) indicadas mediante subrayado.
Para obtener la construcción de anticuerpo 806 humanizado, se empleo tecnología de chapeado (v) (Daugherty y asociados, (1991) La reacción de cadena de polimerasa facilita la clonación, injerto-CDR y expresión rápida de un anticuerpo monoclonal de múrido dirigido contra el componente CD18 de integrinas de leucocito. Nucleic Acids Res. 19(9), 2471-6; Patente Norteamericana No. 6,797,492 de Daugherty; Padlan, E.A. (1991) Posible procedimiento para reducir la inmunogenicidad de dominios variables de anticuerpo mientras se conservan sus propiedades de enlace de ligando. Mol. Immunol. 28(4-5), 489-98; Patente Europea No. 519596 de Padlan y asociados) con el objeto de minimizar la inmunogenicidad de los dominios variables de anticuerpo 806, conservando al mismo tiempo las propiedades de enlace de ligando, se tomó el reemplazó de los residuos expuestos en la superficie en las regiones de estructura que difieren de los encontrados normalmente en anticuerpos humanos. Para lograr esto, se ha vuelto a construir la cadena VL y VH del anticuerpo monoclonal de ratón (mAb) 806 mediante síntesis de gen y tecnología de cebador PCR de traslape. Se ensambló la cadena CL (kappa) en la misma forma. Para demostrar la conservación de sitios de enlace intactos, también se expresaron vVL y vVH en un formato scFv que demostró buen enlace al péptido sintético que comprende el epítope antigénico 806 mediante ELISA y al dominio extracelular (ECD) de Receptor EGF recombinante (EGFR), tal como se mide mediante análisis de resonancia de plasmón de superficie (SPR).
Se ha construido v806VL y v806VH en un contexto I g G 1 humano de longitud total utilizando un kappa-LC optimizado por codón y una región constante de cadena pesada I g G 1 humano optimizado por sitio de codón y división recientemente diseñado, para lograr la expresión genética estable en sistemas de célula NSO y CHO. El sistema de expresión está basado en el sistema de expresión LONZA GS que utiliza los vectores de expresión de cadena pesada y ligera pEE12.4 y pEE6.4 tal como lo proporciona LONZA Biologics.
El producto de anticuerpo hu806 (figura 55) obtenido mediante expresión temporal del vector 8C65AAG, fue reactivo con EGFR-ECD recombinante mediante SPR, y con el epítope de péptido EGFR 806 mediante ELISA. El vector 8C65AAG fue transferido a LICR Affiliate Christof Renner (Universidad de Zurich) para generación de líneas de células GS-NSO hu806 estables y a LICR, Melbourne Centre, para la generación de líneas de células GS-CHO hu806.
Estrategia para construcción, amplificación v clonación de genes de anticuerpo Chapeado v optimización de codón El chapeado de anticuerpo es una estrategia de humanización con el objetivo de contrarrestar las respuestas HAMA (anticuerpo anti-ratón humano). Se consideran los mAbs de ratón como antígenos "extraños" por el sistema inmune de un paciente, y que induce una respuesta inmune, incluso al momento de la administración simple, previniendo el uso adicional del reactivo en dichos pacientes. En el primer paso del proceso de chapeado mAb806, las secuencias de aminoácidos de las cadenas VL y VH en mAb806 fueron analizadas, y se graduó cada residuo de aminoácido en la secuencia de proteína mAb806 para exposición en la superficie (figura 56 y figura 57). Únicamente los aminoácidos que residen en la parte externa de la molécula de anticuerpo fueron considerados para una posible modificación, ya que estos fueron los únicos que pueden ser expuestos al reconocimiento de antígeno. Utilizando BLAST, se comparó la secuencia de proteína mAb806 con tres secuencias de anticuerpo humano (VH36germ, CAD26810, y AAA37941). Siempre que un residuo de superficie mAb806 no corresponda con el consenso de la secuencia de anticuerpo humano, el residuo es identificado para ser cambiado a la secuencia de consenso. Inicialmente se sometieron 12 aminoácidos en el VL a chapeado; y 14 en la cadena VH de ch806 (figura 56 y figura 57).
La optimización de codón es un medio para mejorar la expresión heteróloga de anticuerpos u otras proteínas con base en la inclinación de codón del sistema utilizado para expresar estos anticuerpos. Una de las metas en la creación de hu806 fue utilizar optimización de codón para mejorar los niveles de expresión de este anticuerpo. El sistema de expresión está basado en el sistema de expresión LONZA GS utilizando los vectores de expresión HC y LC pEE12.4 y pEE6.4 tal como lo proporciona LONZA Biologics y NSO y/o células CHO como células de producción. Por lo tanto, las decisiones con respecto a que codón utilizar para un aminoácido determinado se elaboraron con consideración de si el codón puede o no ser favorecido en el sistema de expresión NSO/CHO.
Construcción v Amplificación de Secuencias de ADN 806 mediante PCR Las secuencias de versiones optimizadas por codón chapeadas, de las regiones pesadas variables (VH) y ligeras variables (VL) del anticuerpo hu806, fueron sintetizadas en la siguiente forma: Para cada región (VH o VL), se designaron 8 a 10 oligonucleótidos como cebadores sentido y antisentido de traslape. Estos oligos pueden traslapar entre sí de tal forma que se cubra toda la secuencia de VH o VL hu806, incluyendo la secuencia de señal, secuencias de codificación, intrones e incluir un sitio Hindlll en el término 5' de un sitio BamHI en el término 3'. Los mapas de oligonucleótidos se presentan en las figures 56B y 57B, y los detalles se proporcionan más adelante.
En síntesis, se ensambló VH o VL hu806 mediante PCR tal como se indica: Inicialmente se combinaron v806hc-15 o v8061 c-oligos 1, 2, 3, 4, oligos 5, 6, y oligos 7, 8, 9, 10 en tres reacciones separadas. Se agregaron alícuotas (50 pmol) de cada oligo de flanqueo, y 5 pmol de cada oligo interno a 50 µ? de reacción PCR que contiene 25 µ? de 2x HotStar Taq Master Mix (Qiagen) y 48 µ? de agua libre de nucleasa. El programa de termociclo fue como se indica: 95°C; 15", [94°C; 30", 58°C; 30", 72°C; 30"] x 20 ciclos, 72°C; 10", 4°C. Los productos de estas tres reacciones se exterminaron después de separación mediante electroforesis de gel. Posteriormente se purificaron utilizando una columna de sal (Qiagen-Qiaspin Minipreps), y se combinaron. Estos productos fueron amplificados en forma adicional mediante PCR utilizando los cebadores 1 y 10. El producto se esta segunda reacción incluyó los sitios de enzima de restricción para Hindlll y BamHI, permitiendo la inserción en los plásmidos de expresión.
Oliqonucleótidos utilizados para sintetizar PCR las regiones -V hu806: v806 VH: SEQ ID NO: v806hc-l: GAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGACCTGGCGCATTC 52 CCCTTCCTCCTCACTGGGATTTGGCAGCCCCTTACCTGTGGCGGCTGCT v806hc -2: 53 ACCAGAAAGAGAATGCGCCAGGTCCAATCC CCCAGTGAGGAGGAAGGGATCGAAGGTCACCATCGAAGCCAGTCAAG v806hc -3: 54 GGGGCTTCCATCCACTCCTGTGTCTTCTCTAC GACTCGGCTTGACAAGCCCAGGTCCACTCTCTTGGAGCTGCACCTGGCT v806hc -4: 55 GTGGACACCTGTAGAGAAGACACAGGAGTGG GGGCTTGTCAAGCCGAGTCAAACTTTGTCCCTAACATGTACTGTGTCCG v806hc -5: 56 GATACTCTATCTCATCAGATTTTGCGTGGAATTGG CCCAGAGTATGATATGTAGCCCATCCATTCTAAACCTTTCCCTGGTGGC v806hc -6: 57 TGCCTTATCCAATTCCACGCAAAATCTGATG GGGCTACATATCATACTCTGGGAACACCAGATATCAACCCTCTCTGAA v806hc -7: 58 AAGCCGGATCACAATCACTAGGGACACGTCG GCAGTAATATGTTGCTGTGTCTGGGGCTGTAACGGAGTTCAGCTGCAG v806hc -8: 59 GAAGAACTGGCTCTTCGACGTGTCCCTAGTGATTG CCAGACACAGCAACATATTACTGCGTAACCGCTGGCAGAGGCTTCCCC v806hc -9: 60 TATTGGGGACAGGGCACCCTAGTGACAGTGAGC 61 v806hc -10: CACGGATCCATCTTACCGCTGCTCACTGTCACTAGGGTG v806 VL: SEQ ID NO: v8061c -1: GAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTG 62 CTGGGATTTGGCAGCCCCTTACCTGTTGCGGCTGCTACAAGAAACAGTA v8061c 2: 63 TTCTCCAAGTCCAATCCATGGTGGCGGCAAG GGGGCTGCCAAATCCCAGTGAGGAGGAAGGGATCGAAGGTGACCATC v8061c 3: 64 GAAGCCAGTCAAGGGGGCTTCCATCCACTCC CATGCTGGATGGACTCTGAGTCATCTGAATATCACTGTGAACACCTGTA v8061c 4: 65 GAGAAGACACAGGAGTGGATGGAAGCCC CTCAGAGTCCATCCAGCATGTCAGTCTCCGTGGGAGATAGGGTGACGA v8061c 5: 66 TAACCTGTCATTCAAGCCAAGACATCAACTCC GTTCCGTGATAGATTAGTCCTTTGAAGGACTTACCAGGCTTCTGTTGGA v8061c 6: 67 GCCATCCAATATTGGAGTTGATGTCTTGGCTTG CAAAGGACTAATCTATCACGGAACAAACTTGGACGACGGCGTGCCATC v8061c 7: 68 GAGATTTTCAGGGTCTGGCAGCGGGACCGACTATAC GTGCTGGACGCAGTAGTATGTGGCAAAGTCTTCTGGCTCTAAGCTAGA v8061c 8: 69 GATGGTCAGTGTATAGTCGGTCCCGCTG CATACTACTGCGTCCAGCACGCTCAGTTCCCCTGGACATTCGGCGGCGG v8061c -9: 70 CACAAAACTGGAAATCAAACGTGAGTAGGG v8061c 10: CTCGGATCCCTACTCACGTTTGATTTCC 71 CL hu806: Se preparó una versión optimizada por codón de la cadena ligera kappa constante (CL) en una forma similar a la utilizada para las regiones variables. Sin embargo, el paso PCR inicial implicó la creación de únicamente dos productos preliminares utilizando los oligos VK1cons-1, 2, 3, 4; y 5, 6, 7, 8. Además, los sitios de restricción de flanqueo de este producto fueron BamHI y Notl antes de la inserción de plásmido.
Oligonucleotidos utilizados para sintetizar PCR las regiones CL hu806: SEQ ID NO: V 1 cons- 1 : GACGG ATCCTTCT AAACTCTG AGGGGGTCGGATG ACG 72 GGAGCTGCGACGGTTCCTGAGGAAAGAAGCAAACAGGATGGTGTTTAA VKlcons-2: 73 GTAACAATGGCCACGTCATCCGACCCCCTC GGAACCGTCGCAGCTCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCATCCGACGAGC VKlcons-3: AACTGAAGTCAGGCACAGCCTCCGTGGTG 74 GTGCGTTGTCCACTTTCCACTGGACTTTGGCCTCTCTTGGGTAAAAGTT VKlcons-4: ATTAAGGAGGCACACCACGGAGGCTGTGC 75 GTGGAAAGTGGACAACGCACTACAGAGCGGGAACTCTCAGGAAAGCG VKlcons-5: TGACAGAGCAGGACTCAAAAGATTCAACATACAGCC 76 CTTCACAGGCATATACCTTGTGCTTTTCATAATCAGCTTTTGACAGTGTC V lcons-6: AGGGTAGAAGATAGGCTGTATGTTGAATCTTTTGAGTC 77 GCACAAGGTATATGCCTGTGAAGTAACTCATCAGGGACTCAGCAGCCC VKlcons-7: TGTCACTAAAAGTTTTAATAGAG 78 CCTGCGGCCGCTTATCAGCATTCGCCTCTATTAAAACTTTTGGTGAGAG VKlcons-8: GG 79 CH hu806: Se compró una versión humanizada, sintética del gen de cadena pesada (CH) constante IgG 1 (SEC ID NO:80) en GeneArt, Regensburg, Alemania. El gen fue optimizado con codón para la expresión en células CHO/NSO. Los detalles de la secuencia de gen, sitios de restricción, etc se muestran en la figura 58.
Construcción de Plásmidos de Expresión Para la transfección temporal y pruebas preliminares, se ligaron las secuencias VH y VL hu806 preparadas en la forma descrita anteriormente, en vectores de expresión que contienen regiones constantes genéricas. Estos vectores, proporcionados por LICR Affiliate Christof Renner (Universidad de Zurich, Suiza), son conocidas como pEAK8 HC (que contienen CH genérico), y a33-xm-1c (que contiene un CL genérico). Los vectores se digirieron utilizando BamHI y Hindlll en la presencia de CIP, posteriormente VH y VL hu806 se ligaron en vectores correspondientes. Los plásmidos resultantes se utilizaron para transformar de manera químicamente competente Top10 E. coli (Invitrogen) de acuerdo con las direcciones del fabricante. Se revistió E.Coli transformado en placas LB + Ampicilina, y se clasificaron clones resistentes mediante digestión de restricción y PCR. En general, se pueden aislar ocho clones positivos detectados de esta forma y amplificarse en forma adicional. Se analizó ADN purificado de estas colonias mediante secuenciación de ADN automática.
Se agregaron versiones optimizados por codón de las regiones constantes a estas construcciones mediante restricción de digestión de una enzima y ligadura utilizando BamHI y Notl. Estos transformadores se seleccionaron, secuenciaron y analizaron tal como se manifestó anteriormente. Antes de que las cadenas de anticuerpo de longitud total se ligaran en el sistema Lonza GS, se destruyó el sitio BamHI entre las secuencias de región variable y constante, en un caso, mediante digestión utilizando BamHI, llenando utilizando Polimerasa ADN y ligadura de extremo romo.
Posteriormente se digirieron fragmentos de restricción que contienen hu806 (VH + CH) o hu806 (VL + CL) con Notl seguido de Hindlll. Estas digestiones se diseñaron para crear un extremo romo en el sitio Notl, y de esta forma se realizaron en serie en la siguiente forma. El plásmido se digirió primero con Notl. Se separó el plásmido completamente digerido (corte simple) mediante electroforesis utilizando un gel de agarosa al 1%. Este producto se cortó posteriormente y se purificó en una columna de sal y se llenó utilizando Polimerasa de ADN. El producto de esta reacción se purificó con columna de sal y posteriormente se digirió con Hindlll. Este producto (~1.3Kb para hu806 (VH + CH), y -0.8 Kb para hu806 (VL + CL) se separó posteriormente mediante electroforesis de gel, se cortó y purificó.
Se digirieron cada uno de los vectores pEE12.4 y pEE6.4 (Lonza Biologics pie, Slough, UK) en Hindlll y Pmll. Se ligó hu806 (VH + CH) a pEE12.4 para crear pEE12.4-hu806H, y se ligó hu806 (VL + CL) a pEE6.4 para crear pEE6.4-hu806L.
Después de la clasificación, se creó un plásmido Lonza de gen doble, combinado para contener las secuencias tanto de cadena pesada como ligera hu806. En síntesis, se digirieron los vectores pEE12.4-hu806H y pEE6.4-hu806L con enzima de restricción Notl y Salí. Los fragmentos resultantes, que contenían la unidad de transcripción GS y el promotor hC V-MIE, seguido del cartucho de expresión de cadena Pesada o Ligera hu806, se aislaron y se ligaron juntos. El plásmido Lonza "combinado" resultante (Designado 8C65AAG) se utilizó para transfecciones temporales de plásmido simple en un sistema HEK 293 y transfecciones estables en sistemas NSO y CHO. En la figura 53 se muestra un mapa de plásmido.
Modificaciones para Construcciones Se muestran secuencias de aminoácido verificadas por secuencia completa de chapeada hu806 He y hu806Lc encontradas en mAb806 en la figura 59 y figura 60, respectivamente. El flanqueo de la secuencia hu806 dentro de los apéndices son asteriscos (*) que indican cambios de chapeado iniciales y los números (1 a 8) se refieren a las modificaciones numeradas No.1 a No.8 aquí descritas.
Con respecto a la figura 60, el archivo de referencia (mAb806 LC) indica en forma incorrecta Histidina (H), no la Tirosina (Y) correcta en la posición 91; el sujeto de modificación #1. La secuencia de archivo no corregida original se incluye en la figura 60, para ilustrar la modificación necesaria elaborada a hu806 en la posición 91.
Se elaboró el número de modificaciones a las secuencias de cADN hu806 después de la construcción inicial y fase de secuenciación . Las reacciones para elaborar estas modificaciones incluyeron: introducción de 4 sitios de enzima de restricción para propósitos de modificación de secuencia, para corregir 2 errores de aminoácidos en la secuencia introducida durante PCR, para corregir un error de aminoácido que surge de la documentación mAb806 inicial y para construir 4 cambios de aminoácido adicionales para efectuar variantes de chapeado adicionales. Se llevaron a cabo las siguientes 8 etapas de modificación: 1. hu806 VL: CDR3 H91Y El documento del cual se crearon en forma incorrecta los oligonucleótidos originales, manifestó que fue un CAC (Histidina, H) en la posición 91 en la CDR3 de la secuencia mAb806 VL.
Se utilizó mutagénesis dirigida al sitio para generar la secuencia correcta de TAC (Tirosina, Y; Patente WO02/092771 ) . El cambio consecuente en la secuencia de aminoácido en esta posición fue de CVQHAQF (SEC ID NO:84) a CVQYAQF (SEC ID NO:85). El ADN final y secuencia de proteína traducida en comparación con ch806 se muestra en la figura 61.
Cebador de sentido para la modificación de histidina a tirosina de la región hu806 VL (PDV1; 40mer) 5'-CCACATACTACTGCGTCCAGTACGCTCAGTTCCCCTGG AC-3' (SEC ID NO:86).
Cebador antisentido para la modificación de histidina a tirosina de la región hu806 VL (PDV2; 20mer) 5'-CTGGACGCAGTAGTATGTGG -3' (SEC ID NO:87). 2. Cadena Pesada hu806: Adición de Sitios de Restricción Dralll v Fsel Se agregaron sitios de enzima de restricción a los intrones que rodean las regiones de VH y VL hu806. Estos sitios de restricción (únicos en el sistema de vector pREN, LICR) se diseñaron para facilitar el proceso de elaboración de modificaciones a los cartuchos de expresión. La secuencia VH hu806 no incluyendo la región de señal inicial, puede ser eliminada o insertada mediante digestión simple en Dralll. Además, se puede utilizar Fsel, junto con Notl (sistema pREN) o EcoRI (Lonza System) para cortar la región constante, cumpliendo la función de BamHI de la secuencia original.
Estas modificaciones se lograron utilizando un proceso PCR de dos pasos. Posteriormente los productos se digirieron con Hindlll y Bglll. Posteriormente se ligaron en vectores pREN que contienen regiones constantes optimizadas por el codón, que han sido digeridas en Hindlll y BamHI. Este proceso de religadura destruyó el sitio BamHI.
Cebador de sentido para la corriente ascendente de la región variable del primer sitio Dralll (Dralll Up de cadena pesada 806; 26mer) 5'-GAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTG-3' (SEC ID NO:88).
Cebador antisentido que incorpora el sitio I Dralll (Dralll Down de cadena pesada 806; 28mer) 5'-CACTGGGTG ACTGGCTTCG ATGGTGACC-3' (SEC ID NO:89).
Cebador de sentido para la región variable HC entre los dos sitios Dralll (806 cadena pesada Dralll-Fsel Up; 49mer) 5'-GGTCACCATCG AAGCCAGTCACCCAGTG AAGGGGGCTTCCATC CACTCC-3' (SEC ID NO:90) Cebador antisentido que incorpora el sitio II, y el sitio Dralll y el sitio Fsel (Dralll-Fsel Down cadena pesada 806; 44mer) 5'-CCAAGATCTGGCCGGCCACGGTGTGCCATCTTACCGCTGCTCAC -3' (SEC ID NO:91) 3. Cadena ligera hu806: Adición de Sitios de Restricción Rsrll v Pací Para la cadena ligera hu806, lo sitios de restricción agregados fueron Rsrll, teniendo la misma función que Dralll en la cadena pesada, y Pací, que coincidieron con la función de Fsel.
Cebador de sentido para corriente ascendente de región variable del primer sitio Rsrll (Rsrll Up de cadena pesada 806; 22mer) 5'-G AGAAGCTTGCCGCCACCATGG-3' (SEC ID NO:92).
Cebador antisentido que incorpora el sitio I Rsrll (Rsrll Down de cadena ligera 806; 25mer) 5'-CGGTCCGCCCCCTTGACTGGCTTCG-3' (SEC ID NO:93).
Cebador de sentido para la región variable LC entre los dos sitios Rsrll (Rsrll-Pacl Up de cadena ligera 806; 45mer) 5'-CGAAGCCAGTCAAGGGGGCGGACCGCTTCCATCCACTCCTGTG TC-3' (SEC ID NO:94).
Cebador antisentido que incorpora el sitio II Rsrll, y el sitio Pací (Rsrll-Pacl Down de cadena ligera 806: 50mer) 5'-CCAAG ATCTTTAATTAACGG ACCGCTACTCACGTTTG ATTTCCAG TTTTG-3' (SEC ID NO:95). 4. hu806 VH: Re-chapeado P85A La secuencia de proteína para el mAb806 de origen en los aminoácidos VH 81 a 87 es SVTIEDT (SEC ID NO:96). Como parte del proceso chapeado, se cambiaron isoleucina y ácido glutámico en las posiciones 84 y 85 a alanina-prolina para leer SVTAPDT (SEC ID NO:97; figura 56). Al momento del análisis adicional, se decidió que la alanina puede haber sido una mejor elección que la prolina en este caso. Se utilizó mutagénesis dirigida al sitio para generar el cambio secundario (SVTAADT, SEC ID NO:98) utilizando los cebadores que se describen más adelante. En la figura 62 se presentan el ADN final y las secuencias de proteína traducidas.
Cebador de sentido (Fx3; 49mer) 5'-CTGCAGCTG AACTCCGTTACAGCCGCAG ACACAGCAACATATTA CTGCG-3' (SEC ID NO:99).
Cebador antisentido (Fx4; 49mer) 5'-CGCAGTAATATGTTGCTGTGTCTGCGGCTGTAACGG AGTTCAGC TGCAG-3* (SEC ID NO:100). 5. hu806 VH: Chapeado Adicional La secuencia de región variable de cadena pesada hu806 pasó por tres mutaciones adicionales después del chapeado inicial: T70S, S76N y Q81K. El cambio en la posición 76 de serina a asparagina representó una corrección de regreso a la secuencia original de la molécula mAb806. Se incluyeron los cambios adicionales en la estructura debido a que representan residuos que no se encuentran en anticuerpos de ratón pero se encuentran en anticuerpo humanos. Por consiguiente, la secuencia de proteína TRDTSKSQFFLQ (SEC ID NO:101) fue chapeada de SRDTSKNQFFLK (SEC ID NO:102). El ADN final y las secuencias de proteína traducidas en comparación con mAb806 se presentan en la figura 62.
Cebador de sentido para fragmento PCR de región 5' variable HC (hu806HCfx2-5p-U; 49mer) 5'- GGTCACCATCG AAGCCAGTCACCCAGTG AAGGGGGCTTCCATC CACTCC-3' (SEC ID NO:103).
Cebador antisentido para fragmento PCR 5', que incorpora dos cambios (hu806HCfx2-5p-D; 45mer) 5'- GATTCTTCGACGTGTCCCTTG AG ATTGTG ATCCGGCTTTTCAG A G-3' (SEC ID NO:104).
Cebador de sentido para fragmento PCR 3', que incorpora todos los cambios (hu806HCfx2-3p-U ; 55mer) 5'-CAAGGG ACACGTCGAAG AATCAGTTCTTCCTG AAACTG AACTCC GTTACAGCCGC-3' (SEC ID NO:105).
Cebador antisentido para fragmento PCR 3' de región variable HC (hu806HCfx2-3p-D; 44mer) 5'- CCAAGATCTGGCCGGCCACGGTGTGCCATCTTACCGCTGCTCAC -3' (SEC ID NO:106). 6. hu806 VL: chapeado E79Q Esta fue la única modificación VL post-construcción llevada a cabo. En la posición 79 se empleó la mutagénesis dirigida al sitio para corregir la secuencia SSLEPE (SEC ID NO:107) a SSLQPE (SEC ID NO:108). En la figura 61 se presenta el ADN final y las secuencias de proteína traducidas en comparación con ch806.
Cebador de sentido para fragmento PCR 5' de región variable LC (hu806LC-5p-U; 45mer) 5'-CGAAGCCAGTCAAGGGGGCGGACCGCTTCCATCCACTCCTGTG TC-3' (SEC ID NO:109).
Cebador antisentido para fragmento PCR 5', que incorpora mutación proyectada (hu806LC-5p-D; 34mer) 5'-CTCTGGTTGTAAGCTAGAGATGGTCAGTGTATAG-3' (SEC ID NO:110).
Cebador de sentido para fragmento PCR 3' de región variable LC que incorpora mutación proyectada (hu806LC-3p-U ; 45mer) 5'-CCATCTCTAGCTTACAACCAG AGG ACTTTGCCACATACTACTGC G-3" (SEC ID NO:111 ).
Cebador antisentido para fragmento PCR 3' de región variable LC (hu806LC-3p-D; 50mer) 5'- CCAAG ATCTTTAATTAACGG ACCGCTACTCACGTTTG ATTTCCAG TTTTG-3' (SEC ID NO:112). 7. Cadena ligera hu806: modificación de unión-división de región constante kappa Esta mutación de punta fue requerida para corregir un error en la división de la versión optimizada por codón de la región constante kappa. Antes de este cambio, no se pudo incluir en el anticuerpo final (figura 60) en la porción de la cadena de aminoácido comenzando con VYACEVTH (SEC ID NO:113) y continuando con el extremo de la molécula.
Cebador de sentido para fragmento PCR 5' kappa constante LC (F1; 21mer) 5'-GGCGGCACAAAACTGGAAATC-3' (SEC ID NO:114).
Cebador antisentido para fragmento PCR 5' kappa constante LC, que incorpora corrección (F2; 59mer) 5'-GATG AGTTACTTCACAGGCATATACTTTGTGCTTTTCATAATCAG CTTTTGACAGTGTC-3' (SEC ID NO:115).
Cebador de sentido para fragmento PCR 3' kappa constante LC, que incorpora corrección (F3; 26mer) 5'-AGTATATGCCTGTGAAGTAACTCATC-3' (SEC ID NO:116).
Cebador antisentido para fragmento PCR 3' kappa constante LC (F4; 17mer) 5'-GCCACGATGCGTCCGGC- 3' (SEC ID NO: 117). 8. hu806 VH: N60Q Además de los cambios de chapeado elaborados de anticuerpo 806 en las etapas iniciales de construcción, se cambió en este momento la Asparagina en la posición 60 en VH CDR2 a Glutamina. La N-glucosilación sigue el esquema: N X S/T, en donde X es cualquier aminoácido. La secuencia de aminoácido de la posición 60 fue N P S, la cual sigue este esquema. Sin embargo, no es frecuente el caso en el que la prolina (como en nuestro ejemplo) o cisteína se encuentra en una posición X para N-glucosilación. Fue un aspecto importante que la glucosilación inconsistente pudiera conducir a variaciones en la reactividad del anticuerpo. Por lo tanto, se eliminó la asparagina, y se reemplazó con su aminoácido en forma más cercanamente relacionado, glutamina, eliminando cualquier potencial para que este sitio sea glucosilado (figura 59 y figura 62).
Enlace de construcción hu806 de Anticuerpo 8C65AAG Chapeado Se llevó a cabo la transfección temporal de células 293FT con el plásmido final 8C65AAG, para permitir la preparación de las pequeñas cantidades de hu806 para la verificación inicial del enlace de antígeno. Los sobrenadantes de cultivo debido a esas construcciones temporales de réplica a pequeña escala fueron reunidos, concentrados y se recolectó el anticuerpo hu806 utilizando un paso de cromatografía de proteína A. Se obtuvieron aproximadamente 1 a 2 pg de anticuerpo hu806 tal como se mide a través de un ensayo ELISA hulgGI cuantitativo del anticuerpo fue analizado mediante Biacore para enlazar a EGFR-ECD recombinante (figura 63). La inmunoglobulina de bovino del medio de cultivo celular se purificó junto con hu806 y representó la fracción mayor de IgG total, limitando la evaluación cuantitativa del enlace hu806.
Cebadores de Secuenciación RenVecUPSTREA : Cebador de sentido, comienza secuenciando la corriente ascendente de la región variable en peak8, y vectores a33xm. 5'-GCACTTGATGTAATTCTCCTTGG -3' (SEC ID NO:118).
RenVecDwnstrmHC: Cebador antisentido comienza secuenciando la corriente descendente de la región variable en el plásmido de cadena pesada peak8. Endurecimiento dentro de la región constante HC no optimizada con codón. 5 - GAAGTAGTCCTTG ACCAGG -3' (SEC ID NO:119).
RenVecDwnstrmLC: Cebador antisentido, comienza secuenciando la corriente descendente de la región variable en el plásmido de cadena ligera a33-xm-1c. Se endurece dentro de la región constante LC no optimizada con codón. 5 -GAAGATGAAGACAGATGGTGCAG -3' (SEC ID NO:120). Upstrm Lonza: Cebador de sentido, comienza secuenciando la corriente ascendente de la región variable en vectores Lonza pEE 12.4 y pEE 6.4. No se puede utilizar con Lonza combinado debido a que estas es una versión duplicada en el plásmido combinado. 5'-CGGTGGAGGGCAGTGTAGTC-3' (SEC ID NO:121).
Dnstrm 6-4: Cebador antisentido, comienza secuenciando la corriente descendente de la región constante en el vector Lonza pEE 6.4. 5'- GTG ATGCTATTGCTTTATTTG -3' (SEC ID NO:122).
Dnstrm 12-4: Cebador antisentido, comienza secuenciando la corriente descendente de la región constante en vector Lonza pEE12.4.} 5 -CATACCTACCAGTTCTGCGCC-3' (SEC ID NO:123).
Cod-Opt LC const E: Cebador de sentido, para la región constante v-kappa de cadena ligera optimizada con codón. 5'-CCATCCTGTTTGCTTCTTTCC-3' (SEC ID NO:124).
Cod-Opt LC const F: Cebador antisentido, interna para la región constante v-kappa (vk) de cadena ligera optimizada con codón. 5'-GACAGGGCTGCTG AGTC-3' (SEC ID NO:125). 806HCspec: Cebador de sentido, interno y único para la versión chapeada de la región variable 806 HC. 5 -GTGCAGCTCCAAGAGAGTGGAC-3' (SEC ID NO:126). 806LCspec: Cebador de sentido, interno y único para la versión 806 LC de la región variable. 5'-CAGAGTCCATCCAGCATGTC-3' (SEC ID NO:127).
Un documento de texto formateado por GenBank de la secuencia y anotaciones del plásmido que codifica 8C65AAG I g G 1 hu806 es establecida en la figura 64.
La figura 53 fue creada utilizando Vector NT1 (I nvitrogen) .
Las figuras 59 a 62 fueron creadas utilizando Vector NTI AlignX.
Discusión El chapeado del anticuerpo receptor 806 anti-EGF implicó la mutación de 14 aminoácidos en la cadena VH (figura 59 y figura 62), y 12 cambios en la cadena VL (figura 60 y figura 61) con optimización de codón tal como se indica para la expresión en células CHO o NSO de mamíferos. El vector de gen doble final, designado 8C65AAG, ha sido verificado por secuencia, y se revisó la secuencia de codificación y traducción. El enlace al dominio extracelular EGFR recombinante fue confirmado mediante análisis Biacore utilizando el producto hu806 expresado en forma temporal.
Los clones simples estables que producen altos niveles de anticuerpo hu806 intacto han sido seleccionados son un medio libre de glutamina tal como lo recomienda LONZA. Los clones estables han sido ablactados gradualmente de suero para obtener cultivos libres de suero.
B. Caracterización in vitro e in vivo de hu806 Los transfectantes GS-CHO hu806 estables de producción de mayor nivel 14D8, 15B2 y 40A10 y el transfectante GS-NSO hu806 36, progresaron y los cultivos a pequeña escala promovieron permitir la purificación y caracterización del producto hu806 preliminar. Los resultados indicaron propiedades fisicoquímicas similares. Por consiguiente, se tomó un cultivo de tanque agitado de mayor escala (15L) para el transfectante de mayor producción (GS-CHO hu806 40A10) y el producto purificado pasó por estudios de caracterización in vitro y terapia in vivo adicionales en modelos de xenoinjerto U87MG.de2-7 y A431.
Metodología y Resultados Procesamiento de Corriente Descendente v Producción: Pequeña Escala Se llevaron a cabo experimentos de frascos de agitación con frascos de agitación E500 con un volumen de cultivo celular de 100 ml_. La figura 76 presenta la viabilidad celular y las gráficas de productividad de anticuerpo para los cuatro transf ectantes durante el cultivo. Se estimó la concentración del producto mediante ELISA utilizando el anticuerpo anti-idiotipo 806 LMH-12 (Liu y asociados, (2003) Generación de anticuerpos anti-idiotipo para aplicación en análisis clínicos de laboratorio de inmunoterapia. Hybrid Hybridomics. 22(4), 219-28) como el anticuerpo de recubrimiento y ch806 Clínico Lote: J06024 como el estándar. El material en la recolección fue centrifugado y el sobrenadante de 0.2 µ? fue filtrado, posteriormente los anticuerpos fueron purificados por afinidad mediante cromatografía de Proteína A.
Gran Escala La línea de célula transfectante CH0-K1SV que expresa el clon hu806 candidato 40A10 fue cultivado en un bioreactor de tanque agitado 15L con alimentación de disparo de glucosa durante 16 días utilizando CD-CHO (Invitrogen) /25 µ? de sulfoximina de L-Metionina (MSX; S¡gma)/suplementos GS (Sigma) como el medio base. La figura 76C presenta el crecimiento celular y la producción volumétrica en el bioreactor de tanque agitado de 15L. El rendimiento final fue de 14.7L en 58 mg/L mediante ELISA.
El material en la recolección fue centrifugado y el sobrenadante fue de 0.2 µ? filtrado, posteriormente concentrado hasta 2L utilizando membranas 2 x 30K en el concentrador Pall Centrimate. Las alícuotas (4 x 500 mi) fueron aplicadas subsecuentemente a una columna de proteína A de 250 mL diluidas con Citrato de 50m con pH 4.5 que contiene 200 mM de NaCI. Posteriormente se recolectó el anticuerpo eluido de 4 corridas, se concentró y dializó en PBS, pH 7.4.
Los productos hu806 de los cultivos a pequeña y gran escala fueron cuantif icados mediante OD A280 nm. Las muestras de anticuerpo recuperadas de rProteína-A fueron evaluadas mediante Cromatografía de Exclusión por Tamaño (SEC) (pequeña escala, figura 77; gran escala, figura 78), 4-20% Tris-Glicina de SDS-PAGE bajo condiciones reducidas y no reducidas (figuras 79 a 81), y el Enfoque Isoeléctrico se lleva a cabo con un sistema de Electrof oresis Amersham Multifor II en una placa Amfoline PAG (pH 3.5-9.5) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (figura 82).
Los anticuerpos hu806 purificados con afinidad de Proteína A mostraron picos de proteína simétricos y perfiles de elución SEC idénticos al material de referencia clínico ch806. Los perfiles de gel SDS-PAGE fueron consistentes con una ¡nmunoglobulina. El patrón IEF indicó tres isoformas con pl fluctuando de 8.66 a 8.82 que fue consistente con el pl calculado de 8.4 para la secuencia de proteína.
Análisis de Enlace Análisis FACS Los estimados de la concentración de anticuerpo determinado para cada muestra mediante OD A280 nm, fueron utilizados para análisis FACS con las células A431 de la línea de célula de adenocarcinoma (que contiene amplificación de gen EGFR). Hemos observado previamente que mAb806 enlazó aproximadamente 10% del ~ 2 x 106 wtEGFR expresado en células de tumor A431 en comparación con el mAb528 específico de wtEGFR (Johns y asociados, (2002) Anticuerpo monoclonal novedoso específico del receptor de factor de crecimiento epidérmico de2-7 (EGFR) que también reconoce el EGFR expresado en células que contienen amplificación de gen EGFR. Int. J. Cáncer. 98(3), 398-408). Las células se mancharon con cualquiera de las cuatro muestras hu806, un anticuerpo lgG2b irrelevante o un control positivo ch806; cada uno se evaluaron en una concentración de 20 ng/ml. El control para el anticuerpo secundario solo también fue incluido [Conjugado por FITC anti hu-lgG de cabra (específico de Fe)]. En la figura 83 se presentan las curvas de enlace FACS compuestas y demuestran manchado equivalente para todas las construcciones.
Las características de enlace celular de la muestra hu806 40A10 producidas mediante cultivo gran escala también fueron evaluadas mediante FACS para enlace A431, así como células de glioma U87MG.de2-7 que expresan el receptor EGFRvIll variante (Johns y asociados, 2002). Los resultados representativos de los análisis por duplicado se presentan en la figura 84 y figura 85, respectivamente. Los controles incluyeron un anticuerpo lgG2b irrelevante (histogramas sombreado), ch806 o 528 (enlace a EGFR tanto tipo silvestre como de2-7) tal como se indica.
El anticuerpo ch806 y el hu806 demostraron manchado similar de las líneas celulares A431 y U87MG .de2-7 soportando nuestras observaciones previas de que mAb806 reconoció en forma específica el EGFR de2-7 y un subconjunto del EGFR sobre-expresado (Luwor y asociados, (2001) El anticuerpo monoclonal 806 inhibe el crecimiento de xenoinjertos de tumor que expresan el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) ya sea de2-7 o amplificado, pero no EGFR tipo silvestre. Cáncer Res. 61 (14), 5355-61). Tal como se espera, el anticuerpo 528 manchó las líneas de célula U87MG .de2-7 y A431 (figuras 84 y 85).
Análisis de Enlace Celular Se evaluaron las capacidades de enlace de antígeno de radioinmunoconjugados mediante ensayos de absorción celular (Lindmo y asociados, (1984) Determinación de fracción inmunoreactiva de anticuerpos monoclonales radioetiquetados mediante extrapolación lineal para enlazar en un exceso de antígeno infinito. J. Immunol. Metods. 72(1), 77-89) utilizando la línea de célula de glioma U87MG.de2-7 y células de carcinoma epidermoidal A431 que expresan el gen EGFR amplificado.
Se determinaron las fracciones inmunoreactivas de radioconjugados hu806 y ch806 enlazando a células que expresan antígeno en la presencia de un antígeno en exceso. Los resultados del enlace de célula U87MG.de2-7 de 125l-hu806 y 125l-ch806 se presentan en la figura 86A a través del rango de concentración celular 20 x 1 O6 a 0.03 x 106 células/muestra. Los resultados para el enlace de A431 de 125l-hu806 y 125l-ch806 se presentan en la figura 86B, con respecto al rango de concentración celular 200 x 106 a 0.39x 1 O6 células/muestra.
Se utilizaron análisis Scatchard para calcular la constante de asociación (Ka) (Lindmo y asociados, 1984). El enlace de bajos niveles (20 ng) de anticuerpo etiquetado sólo se comparó con el enlace en la presencia de anticuerpo no etiquetado en exceso. La fracción inmunoreactiva se tomó en cuenta en el cálculo de la cantidad de anticuerpo reactivo, libre tal como se describió previamente (Clarke y asociados, (2000) Biodistribucion in vivo de un anticuerpo monoclonal anti-Lewis Y humanizado (hu3S193) en ratones desprotegidos BALB/c xenoinjertados con MCF-7. Cáncer Res. 60(17), 4804-11) y enlace específico (nM; anticuerpo total x% enlazado) se elaboraron en gráfica contra enlace específico/libre de reactivo (figuras 87 y 88). La constante de asociación se determinó a partir de la pendiente negativa de la línea.
La afinidad de enlace para 125l-hu806 que enlaza a EGFRvIll en células U87 G.de2-7, se determinó como 1.18 x 109 IvT1. El Ka para 125l-ch806 fue de 1.06 x 109 M"1. Estas observaciones están de conformidad con los resultados reportados de valores para Ka 111ln y 125l-ch806 de 1.36x 109 M-1 y 1.90 x 109 M~1, respectivamente, que son altamente comparables con los de mAb806 de múrido de origen de 1.1 x 109 M"1 (Panousis y asociados, (2005) Construcción y caracterización de anticuerpo monoclonal quimérico 806 (ch806) para inmunoterapia dirigida de tumores que expresan EGFR de2-7 o EGFR amplificado. Br. J. Cáncer. 92(6), 1069-77).
El análisis de scatchard en células A431 demostró alta afinidad de enlace a través de ambas construcciones 806 a una población menor de EGFR en estas células. El Ka para 1 5l- ch806 fue de 0.61 x 109 M"1; y para 125l-hu806 el Ka = 0.28 x 109 M"1.
Análisis de Biosensor Se llevaron a cabo análisis de biosensor en un biosensor BIAcore 2000 utilizando un chip de sensor recubierto con carboximetildextrano (CM5). El chip fue derivado en el canal 3 con el péptido de epítope 806 (EGFR aminoácidos 287 a 302; SEC ID NO:14; ver Solicitud de Patente Norteamericana No. 11/060,646, presentada el 17 de febrero del 2005; Solicitud de Patente Norteamericana No. 60/546,602, presentada el 20 de febrero del 2004; y Solicitud de Patente Provisional Norteamericana No. 60/584,623, presentada el 1 de julio de 2004, cuya descripción está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia) utilizando química de acoplamiento de amina estándar. El canal 2 fue derivado con un antígeno de control utilizado para determinación de adaptabilidad del sistema. El canal no fue derivado con etanolamina y utilizado como un canal de control en blanco para corrección de efectos de índice de refracción. Se diluyeron muestras de hu806 en amortiguador HBS (10 mM HEPES, pH 7.4; 150 mM NaCI; 3.4 mM di-Na-EDTA; 0.005% Tween-20), y alícuotas (120 µ?) que contienen 50 nM, 100 nM, 150nM, 200 nM, 250 nM y 300 nM se inyectaron en la superficie del chip del sensor en un rango de flujo de 30 µ?/min. Después de la fase de inyección, se monitoreo la disociación fluyendo amortiguador HBS sobre la superficie del chip durante 600s. El anticuerpo enlazado se eluyó y la superficie del chip se regeneró entre las muestras mediante inyección de 20 µ? de 10 mM de solución de hidróxido de sodio. Se incluyó el control positivo, ch806. Se determinaron los parámetros de enlace utilizando el modelo de enlace de equilibrio del software BIAevaluation. La figura 89 presenta los sensorgramas generados.
Se observó en enlace dependiente de la dosis con tanto hu806 como el control positivo, ch806, en el canal 3. Se confirmó la adaptabilidad del sistema mediante enlace dependiente de la dosis del anticuerpo monoclonal adecuado para controlar el canal 2. No se observó reactividad cruzada entre hu806 (o ch806) y el anticuerpo de control. Nuestros análisis determinaron que el KD aparente (1/Ka) fue de 37 nM para hu806 y 94 nM para ch806.
Análisis de Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpo Se llevaron a cabo análisis ADCC utilizando la preparación de anticuerpo hu806 purificado 40A10 con células de adenocarcinoma A431 objetivo y células efectoras mononucleares de sangre periférica de donador saludable recientemente aislados. En síntesis, se llevaron a cabo todos los análisis por triplicado con 1) 1 pg/ml de cada anticuerpo en un rango de proporciones de célula efectora a objetivo. (E:T = 0.78:1 a 100:1) en E:T= 50:1 en un rango de concentración de cada anticuerpo (3.15 mg/ml - 10 pm/ml). Incluimos por triplicado controles para el isotipo de anticuerpo, citotoxicidad espontánea y total, y los cálculos para la citotoxicidad fueron tal como se describieron anteriormente (Panousis y asociados, 2055). Los resultados se presentan en la figura 90.
El hu806 demostró actividad ADCC superior para el I g G 1 ch806 quimérico. En el experimento representativo mostrado, hu806 en 1pg/mL, efectuó un ADCC de 30% de citotoxicidad en contraste con la citotoxicidad del 5% de ch806.
Estudio de Terapia 806 in vivo Se investigó la eficacia terapéutica de hu806 utilizando xenoinjertos de adernocarcinoma A431 o de glioma U87MG-de2-7 establecidos en ratones desprotegidos BALB/c. Para establecer xenoinjertos, a los ratones se les inyectó en forma subutánea en la línea mamaria inguinal derecha e izquierda, 1 x 106 células de adenocarcinoma A431 ó 1 x 106 células de glioma U87MG.de2-7 en 100 µ? de PBS. Se calculó el volumen de tumor (TV) mediante la fórmula [(longitud x ancho2)/2], en donde la longitud fue el eje de longitud más largo, y el ancho, es la medida en los ángulos rectos hacia la longitud. En un experimento inicial, grupos de cinco ratones desprotegidos BALB/c (n = 10 tumores/grupos) con xenoinjertos A431 o U7 G.de2-7 establecidos, recibieron tratamiento de 1 mg de hu806, o 1 mg de anticuerpo ch806 o control de vehículo PBS mediante inyección IP. La terapia se administró los días 6, 8, 11, 13, 15 y 18 para las líneas celulares A431, y los días 4, 6, 8, 11, 13 y 15 para U87MG.de2-7, respectivamente. En la figura 91 se presentan los volúmenes de tumor promedio ± SEM al termino de los experimentos, debido a consideraciones éticas de la carga del tumor para el xenoinjerto A431 hasta el día 25, y en la figura 92 para los xenoinjertos U87MG.de2-7 hasta el día 31.
Las evaluaciones de terapia in vivo con hu806, mostró una reducción marcada en el crecimiento de xenoinjerto A431, en comparación con el control de vehículo PBS. La curva de crecimiento A431 observada para hu806, fue altamente comparabe con el grupo de tratamiento ch806. En los xenoinjertos U87MG.de2-7, el grupo de control PBS fue eutanizado el día 20. La terapia hu806 demostró una reducción significativa en el crecimiento de tumor el día 20 en comparación con los controles PBS (P<0.001), y en el retardó de crecimiento de tumor continuo después del día 20 en forma similar al grupo ch806.
Discusión Los anticuerpos hu806 purificados por afinidad de Proteína-A, desplegaron perfiles de elución SEC idénticos con el material de referencia clínica ch806, y los perfiles de gel SDA-PAGE consistents con un inmunoglobulina. El patrón IEF fue consistente con el pl anticipado de 8.4.
A través de análisis de enlace de célula Scatchard y de enla ce de epitope Biosensor, el anticuerpo hu806 demostró curvas enlace y parámetros de afinidad altamente comparables con el anticuerpo ch806. La afinidad de enlace de hu806 y ch806 a EGFRvIll y EGFR tipo silvestre sobreexpresado, son similares y están en un bajo rango nanomolar. El enlace celular a través de análisis FACS, soportó estas observaciones Además, hu806 demostró un ADCC marcadamente mejorado con respecto a la construcción ch806 en células A431 positivas de antígeno objetivo.
Las evaluaciones terapéuticas ¡n vivo con hu806, mostraron una marcada reducción en el crecimiento de xenoinjerto A431, el cual fue altamente comparable con el grupo de tratamiento ch806. En los xenoinjertos U87MG.de2-7 establecidos, la terapia hu806 demostró una reducción significativa en crecimiento de tumor el día 20, en comparación con los controles PBS y un retardo de crecimiento de tumor continuo, después del día 20, en forma similar al grupo ch806.
Ejemplo 23 Anticuerpo Monoclonar 175 Tal como se describe en el ejemplo 1, el clone 175 (lgG2a) fue seleccionado para caracterización adicional, Materiales y Métodos Líneas celulares Se han descrito anterioremente, las líneas celulares U87MG.A2-7 transfectadas con A2-7EGFR (Huang y asociados (1997) J. Biol. Chem. 272, 2927 2935) y A431 (Ullrich y asociados (1984) Nature. 309, 418-425). La línea de célula de próstata independiente de hormonas DU145 (Mickey y asociados (1977) Cáncer Res. 37, 4049-4058) se obtuvo del ATCC (atcc.org).
Todas las líneas celulares se mantuvieron en DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY) que contiene 10% de FCS (CSL, Melbourne), 2 mM de glutamina (Sigma Chemical Co, St. Louis), y penicilina/estreptomicina (Life Technologies, Grand Island). Además, se mantuvo la línea celular U87MG.A2-7 en 400 mg/ml de Geneticina (Life Technologies, Inc, 5 Grand Island). Las líneas celulares BaF/3 (Palacios y asociados, (1984) Nature. 309, 126-131) y BaF/3 que expresan diferentes receptores EGF (Walker y asociados, (2004) J. Biol. Chem. 2(79), 22387-22398) fueron mantenidas en forma rutinaria en RPMI 1640 (GIBCO BRL) suplementado con 10% de suero de becerro fetal (GIBCO BRL) y 10% de medio acondicionado con WEHI-3B (Ymer y asociados, (1985) Nature. 19-25;317, 255-258) como una fuente de IL-3. Todas las líneas celulares se crecieron a una temperatura de 37°C en una atmósfera de aire/COz (95%-5%).
Anticuerpos y péptidos Se generaron mAb806 y mAb175 en el Instituto Ludwig para la Investigación de Cáncer (Ludwing Institute for Cáncer Research) (LICR) Nueva York Branch y se produjeron y purificación en la Instalación de Producción Biológica (Ludwig Institute for Cáncer Research, elbourne). Se utilizó como inmunogen la línea de fibroblasto de múrido NR6AEGFR- Se generaron hibridomas de ratón inmunizando cinco veces en forma subcutánea ratones BALB/c con intervalos de 2 a 3 semanas, con 5 x 105 - 2 x 106 en adyuvante. Se utilizó adyuvante completo de Freund para la primera inyección. Posteriormente, se utilizó adyuvante de Freund incompleto (Difco). Se fusionaron células de bazo de ratones inmunizados con línea de célula de mieloma de ratón SP2/0. Se clasificaron sobrenadantes de clones recientemente generados en ensayos de hema-absorción para reactividad con la línea celular NR6, NR6 wtEGFR. y R6AEGFRI y P o s t e r i o r ni e n t e se analizaron mediante ensayo de hemaabsorción con líneas de célula de glioblastoma humano U87MG, U87MGW,EGFR, y U87MG AEGFR, Se digirieron mAbs intactos (50 mg) en PBS con papaína activada durante 2 a 3 horas a una temperatura de 37°C en una proporción de 1:20 y la papaína se desactivó con yodoacetamida. Posteriormente la digestión se pasó sobre una columna de sefarosa Proteína-A (Amersham) en 20 mM de amortiguador de fosfato de sodio pH 8.0, con un flujo purificado en forma adicional mediante intercambio de cationes utilizando una columna Mono-S (Amersham). Posteriormente se concentró la proteína utilizando un concentrador de centrifugación de 10,000 MWCO (Millipore). Para complejos de Fab-péptido se agregó directamente un exceso molar de péptido liofilizado al Fab y se incubó durante 2 horas a una temperatura de 4°C antes de preparar las pruebas de cristalización.
Mapeo de mAb175 utilizando fragmentos EGFR expresados en células de mamífero El día previo a la transfección con estos fragmentos, se sembraron fibroblastos de riñón-embriónicos 293T humanos en 8 x 105 por depósito en placas de cultivo de tejido de 6 depósitos que contienen 2 mi de medio. Las células fueron transfectadas con 3 a 4 \ig de ADN de plásmido en compuesto con Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 24 a 48 horas después de la transfección, se aspiraron los cultivos celulares y las mono capas celulares se Usaron en 250 µ de amortiguador de lísis (mezcla de 1% Tritón X-100, 10% glicerol, 150 mM NaCI, 50 mM HEPES pH 7.4, 1 mM EGTA e Inhibidor de Proteasa Completa (Roche). Se mezclaron alícuotas de Usado celular (10 a 15 µ?) con un amortiguador de muestra SDS que contiene 1.5% de ß-mercaptoetanol, desnaturalizado calentando durante 5 minutos a una temperatura de 100°C y se electroforó en 10% de geles NuPAGE Bis-Tris poliacrilamida (Invitrogen). Posteriormente las muestras se electro-transfirieron a membranas de nitrocelulosa que se enjuagaron en amortiguador TBST (10 mM Tris-HCI, pH 8.0, 100 mM NaCI y 0.1% Tween-20) y se bloquearon en TBST que contiene 2.5% de leche descremada durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las membranas se incubaron durante la noche a una temperatura de 4°C con 0.5 pg/ml de mAb175 en amortiguador de bloque. Se probaron membranas paralelas durante la noche con mAb 9B11 (1:5000, Cell Signaling Technology, Danvers, Massachuetts) para detectar el epítope c-myc. Las membranas se lavaron en TBST, y se incubaron en amortiguador de bloqueo que contiene IgG anti-ratón de conejo conjugado con peroxidasa de rábano (Biorad) en una dilución 1:5000 durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente se lavaron los manchados en TBST, y se desarrollaron utilizando una película autoradiográfica después de incubación con Substrato Quimioluminiscente Western Pico (Pierce, Rockford, Illinois).
Mapeo de mAb175 utilizando fragmentos EGFR expresados en células de mamífero y levadura Se han descrito anteriormente (Johns y asociados, (2004) J. Biol. Chem. 279, 30375-30384) una serie de fragmentos de ectodominio EGFR etiquetados con c-myc de traslape, comenzando con los residuos 274, 282, 290 y 298 y terminando todos en el aminoácido 501 y fusionados a hormona de crecimiento. Se llevó a cabo la expresión de proteínas EGFR en la superficie de la célula de levadura tal como se describió anteriormente (Johns y asociados, 2004).
En síntesis, se crecieron colonias transformadas a una temperatura de 30°C en un medio mínimo que contiene base de nitrógeno de levadura, hidrolizado de caseína, dextrosa y amortiguador de fosfato pH 7.4, en una plataforma de agitación durante 30 aproximadamente un día hasta que se alcanzó un OD 6oo de 5-6. Posteriormente se indujeron células de levadura para el despliegue de proteína, transfiriendo un medio mínimo que contiene galactosa, y se incubaron con agitación a una temperatura de 30°C durante 24 horas. Posteriormente los cultivos se almacenaron a una temperatura de 4°C hasta el análisis. Se obtuvo fluido de ascitos sin procesar que contiene el anticuerpo monoclonal c-myc 9E10 en Covance (Richmond, CA). Se lavaron 1 x 106 de células de levadura con amortiguador FACS enfriado con hielo (PBS que contiene 1 mg/ml BSA) y se incubaron ya sea con ascitos anti-c-myc (dilución 1:50), o anticuerpo monoclonal EGFR humano (10 pg/ml) en un volumen final de 50 µ?, durante 1 hora a una temperatura de 4°C. Posteriormente las células se lavaron con amortiguador FACS enfriado con hielo y se incubaron con IgG anti-ratón etiquetado con ficoeritrina (dilución 1:25), en un volumen final de 50 µ? durante 1 hora a una temperatura de 4°C, se protegieron de la luz. Después de lavar las células de levadura con amortiguador FACS enfriado con hielo, se obtuvieron datos de fluorescencia con un citómetro de flujo Coulter Epics XL (Beckman-Coulter), y se analizaron con el software de citometría WinMDI (J. Trotter, Scripps University). Para determinación de epítopes lineales versus de conformación, se calentaron células de levadura a una temperatura de 80°C durante 30 minutos, posteriormente se enfriaron en hielo durante 20 minutos antes del etiquetado con anticuerpos. La serie de mutantes EGFR descritos en la tabla 7, se han descrito previamente (Johns y asociados, 2004).
Resonancia de plasmón de superficie (BIAcore) Para todos los experimentos se utilizó un BIAcore 3000. Los péptidos que contienen el epítope mAb806 putativo fueron inmovilizados en un chip de sensor CM5 utilizando amina, tiol o acoplamiento con Pms en un rango de flujo de 5 µ?/minutos (Wade y asociados, (2006) Anal. Biochem. 348, 315-317). Los mAb806 y mAb175 se pasaron sobre la superficie del sensor en un rango de flujo de 5 µ?/minutos a una temperatura de 25°C. Las superficies se regeneraron entre corridas inyectando 10 mM de HCI en un rango de flujo de 10 pl/min.
Inmunoprecipitación v Manchado Western Se Usaron células con amortiguador de lisis (1% Tritón X-100, 30 mM HEPES, 150 mM NaCI, 500 mM de bencenosulfonilfluoruro de4-(2-aminoetil), 150 nM de aprotinina, 1 mM E-64 de inhibidor de proteasa, 0.5 mM de EDTA, y 1 mM de leupeptina, pH 7.4) durante 20 minutos, se aclararon mediante centrifugación en 14,000 x g durante 30 minutos, se inmunoprecipitaron con anticuerpos relevantes a una concentración final de 5 pg/ml durante 60 minutos y se capturaron durante la noche mediante cuentas de Sefarosa-A. Posteriormente las muestras se eluyeron con Amortiguador de Muestra 2X NuPAGE SDS (Invitrogen), resuelto en geles NuPAGE (ya sea 3% a 8% o 4% a 12%), se electrotransfirieron sobre membrana de transferencia de Immobilon-P (Millipore) posteriormente se probaron con los anticuerpos relevantes antes de la detección mediante radiografía de quimioluminiscencia.
Inmunohistoquímica Se mancharon secciones congeladas con 5 pg/ml de mAb175 o control de isotipo irrelevante durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se detectó anticuerpo enlazado utilizando un sistema de detección Dako Envision+ HRP siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmente se enjuagaron las secciones con agua, se contramancharon con hematoxilina y se montaron.
Modelos de Xenoinierto Se inocularon células U87MG.A2-7 (3 x 106) en 100 µ?_ de PBS s.c. en ambos flancos de ratones desprotegidos Balb/c de 4 a 6 semanas de edad (Animal Research Centre, Pert, Australia). Todos los estudios se llevaron a cabo utilizando modelos de tumor establecidas tal como se reportó previamente (Perera y asociados, (2005) Clin. Cáncer Res 11, 6390-6399). El tratamiento comenzó una vez que los tumores habían alcanzado el volumen promedio indicado en la leyenda de la figura adecuada. Se determinó el volumen del tumor en mm3 utilizando la fórmula (longitud x ancho2)/2, en donde la longitud fue el eje más largo y el ancho fue la medida perpendicular. Los datos se expresan como volumen de tumor promedio ± SE para cada grupo de tratamiento. Todos los datos fueron analizados para significancia a través de una prueba t del estudiante de un lado, en donde p < 0.05 se consideró estadísticamente significativa. Este proyecto de investigación fue aprobado por el Comité de Ética para Animales del Hospital de Austin (Animal Etics Committee of the Austin Hospital).
Generación y caracterización de líneas de célula estable que expresan construcciones de mutante EGFR Se generaron las mutaciones de wtEGFR utilizando un equipo de mutagénesis dirigido al sitio (Stratagene, La J o 11 a , CA). La cantidad para cada mutagénesis fue el cADN EGFR humano (número de acceso x00588) (Ullrich y asociados, (1984) Nature. 309, 418-425). Se llevó a cabo secuenciación de nucleótido automática de cada construcción para confirmar la integridad de mutaciones EGFR. Se transfectaron EGFR tipo silvestre y mutante (C 173A/C28 A) en células BaF/3 mediante electroporación .
Se obtuvieron líneas de célula estable que expresan el EGFR mutante mediante selección en un medio que contiene neomicina. Después de la selección final, se aisló el mARN de cada línea celular, se transcribió en forma inversa y se amplificó la secuencia EGFR mediante PCR. Todas las mutaciones en el EGFR expresado fueron confirmadas mediante secuenciación de los productos PCR. El nivel de expresión EGFR fue determinado mediante análisis FACS en un FACStar (Becton y Dickinson, Franklin Lakes, NJ) utilizando el anticuerpo anti-EGFR mAb528 (Masui y asociados, (1984) Cáncer Res. 44, 1002-1007; Gili y asociados, (1984) J. Biol.
* Chem. 259, 7755-7760) de 10 pg/ml en PBS, 5% FCS, 5 mM EDTA seguido de Ig anti-ratón etiquetado con Alexa 488 (dilución final 1:400). Se determinó la fluorescencia de fondo incubando las células con un anticuerpo primario de clase correspondiente, irrelevante. Todas las células se pasaron en forma rutinaria en RPMI, 10% FCS, 10% de medio acondicionado WEH13B y 1.5 mg/ml de G418.
Activación dependiente de EGF de EGFR mutante Las células que expresan el wtEGFR o C271A/C283A-EGFR fueron lavadas e incubadas durante 3 horas en un medio sin suero o IL-3. Las células se recolectaron mediante centrifugación y se resuspendieron en un medio que contiene EGF (100 ng/ml) o un volumen equivalente de PBS. Las células fueron recolectadas después de 15 minutos, se peletizaron y lisaron directamente en un amortiguador de muestra SDS/PAGE que contiene p-mercaptoetanol. Las muestras se separaron en geles de gradiente NuPAGE 4-12%, se transfirieron a una membrana Immobilon PVDF y se probaron con anti-fosfotirosina (4G10, Upstate Biotechnologies) o anticuerpos anti-EGFR (mAb806, producidos en LICR). Las bandas reactivas se detectaron utilizando quimioluminiscencia.
Efecto de EGF y anticuerpos en proliferación celular Se recolectaron células que crecen en fase log y se lavaron dos veces con PBS para eliminar el IL-3 residual. Las células se resuspendieron en RPMI 1640 más 10% FCS y se sembraron en placas de 96 depósitos en 105 células/depósito con un transportador únicamente o con concentraciones en incremento de EGF. Cuando fue adecuado, también se agregaron a los cultivos una concentración final de mAb528 o mAb806 (2 pg/depósito). Se determinó la proliferación utilizando el ensayo MTT (van de Loosdrecht y asociados, (1994) J. Immunol. Metods. 174, 311-320).
Reactividad con Anticuerpos específicos de conformación Se recolectaron células mediante centrifugación y se mancharon con el control y anticuerpos de prueba (todos en 10 pg/ml en amortiguador FACS durante 40 minutos sobre hielo, se lavaron amortiguador FACS) seguido de Ig anti-ratón etiquetado con Alexa 488 (1:400 dilución final, 20 minutos sobre hielo). Las células se lavaron con amortiguador FACS enfriado con hielo, se recolectaron mediante centrifugación y se analizaron sobre un FACScan; se determinó el canal de fluorescencia pico y la fluorescencia promedio para cada muestra utilizando la herramienta estadística en Quest (Becton y Dickinson). Se dedujo la fluorescencia de fondo (control negativo) de todas las medidas. Se eligieron valores de fluorescencia promedio como el más representativo de la forma e intensidad de fluorescencia pico y se utilizaron para derivar la proporción de enlace mAb806 a mAb528.
Determinaciones de estructura de cristal de Fab 175, y Fab 806, complejos de Fab-péptido y estructura RMN del epítope de péptido 806 en solución Se determinaron estructuras mediante reemplazo molecular y se enfocó en el refinamiento con R = 0.225/Rlibre = 0.289 para Fab806 y R = 0.226/RI¡bre = 0.279 para Fab806:péptido; R = 0.210/Rlibre = 0.305 por Fab806 y R = 0.203/Rlibre = 0.257 por Fab806:péptido.
Se crecieron cristales para 806 Fab nativo mediante difusión de vapor de gota colgante utilizando 10 mg/ml Fab y un depósito que contiene 0.1M de amortiguador de acetato de sodio pH 4.6, 6% a 8% de PEG6000 y 15-20% de Isopropanol. Para la recolección de datos, se transfirieron cristales a una solución crioprotectora que contiene amortiguador de acetato de sodio 0.1M pH 4.6, 10% de PEG6000, 15-20% de Isopropanol y 10% de glicerol. Posteriormente los cristales se montaron en un lazo de nylon y se congelaron instantáneamente directamente en nitrógeno líquido.
Se crecieron cristales del complejo 806 Fab-péptido mediante difusión de vapor de gota colgante utilizando 10 mg/ml de complejo Fab-péptido y un depósito que contiene 0.2M de acetato de amonio 16-18% PEG 5,000 de monometiléter, posteriormente se mejoró la calidad de los cristales a través de técnicas de sembrado. Para la recolección de datos, los cristales se transfirieron a una solución crioprotectora que consiste en un depósito suplementado con 25% de glicerol. Posteriormente los cristales se montaron en un lazo de nylon y se congelaron instantáneamente directamente en nitrógeno líquido.
Se crecieron inicialmente cristales del complejo 175 Fab-péptido mediante difusión de interfase libre utilizando un sistema de cristalización Topaz (Fluidigm, San Francisco). Los microcristales se crecieron mediante difusión de vapor de gota colgante utilizando 7 mg/ml de Fab con condiciones similares 0.1 M Bis-tris de amortiguador de propano, 0.2M de acetato de amonio y 18% PEG 10,000. Posteriormente los microcristales se aumentaron mediante rayado, sembrando en 0.15 m de formato de sodio y 15% de PEG 1500 para producir cristales con forma de placa pequeña. Para la recolección de datos, los cristales se transfirieron a una solución crioprotectora que consiste en un depósito suplementado con 25% de glicerol. Posteriormente los cristales se montaron en un lazo de nylon y se congelaron en forma instantáneamente en nitrógeno liquido.
Se recolectaron datos de difracción en cristales de complejo 806 Fab y 175 Fab en forma de local utilizando un detector R-AXIS IV en un generador Rigaku micromax-007 adaptado con ópticas AXCO, estos datos se procesaron posteriormente utilizando CrystalClear. Se recolectaron datos de complejo 806 Fab-péptido sobre un detector ADSC quantum315 CCD en una línea de rayo X29, Brookhaven National Laboratory, estos datos se procesaron con HKL2000 (Otwinowski, Z. y Minor, W. (1997) Procesamiento de datos de difracción de rayos X recolectados en modo de oscilación . Academic Press (Nueva York)) (estadísticas de recolección de datos se muestran en la tabla 9). Se resolvió el 806 Fab nativo mediante reemplazo molecular utilizando el programa MOLREP (Vagin, A. y Teplyakov, A. (1997) J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025) utilizando coordenadas del refinamiento 2E8 de la estructura Fab de la superficie en REFMAC5 (Murshudov y asociados, (1997) Acta cristalográfica 53, 240-255) y se construyó el modelo en Coot (Emsley, P. y Cowtan, K. (2004) Acta cristalográfica 60, 2126-2132).
Se resolvieron las estructuras tanto de 806-péptido como de 175 Fab-péptido mediante reemplazo molecular utilizando el programa MOLREP utilizando las coordenadas de la estructura 806 Fab, se llevó nuevamente la refinación y reconstrucción en REFMAC5, y COOT y O. Se llevó a cabo la validación de estructuras finales con PROCHECK (Laskowski y asociados, (1993) J. Appl. Cryst. 26, 283-291) y WHATCHECK (Hooft y asociados, (1996) Nature 381, 272).
Estudios RMN Para estudios RMN, se produjo el péptido etiquetado-15N en forma recombinante como una fusión para el dominio SH2 de SHP2 utilizando el método descrito previamente por Fairlie y asociados, (Fairlie y asociados, (2002) Expresión y purificación de proteína 26, 171-178) excepto que se creció E. coli en un medio mínimo de Neidhardt suplementado con 15NH4CI (Neidhardt y asociados, (1974) Revista de bacteriología 119, 736-747). El péptido fue disociado de la parte de fusión utilizando CNBr, se purificó mediante HPLC de fase inversa y se confirmó su identidad mediante espectrometría de masa MALDI-TOF y secuenciación N-terminal. Se mutó el residuo de metionina en las secuencias de enlace de anticuerpo 806 para leucina, para permitir la disociación de la parte de fusión, pero no dentro del propio péptido.
Se prepararon las muestras usadas para estudios RMN en solución H20 que contiene 5% 2H20, 70 mM NaCI y 50 mM NaP04 en pH 6.8. Todos los espectros fueron adquiridos en 298K en un espectrómetro Bruker Avance500 utilizando una criosonda. Se establecieron las asignaciones secuenciales del péptido en ausencia de m806Fab utilizando espectros 2D TOCSY y NOESY estándar así como TOCSY y NOESY editado-15N. Se revisó la interacción entre el péptido y fAb806 monitoreando los espectros 15N HSQC del péptido en la ausencia y presencia de fAb806. La perturbación de espectro del espectro 5N HSQC del péptido en la presencia de fAb806, indica claramente que el péptido tuvo la capacidad de enlazar a fAb806 bajo la presencia de condiciones de solución. No se determinó la conformación detallada del péptido en la forma del complejo. Las derivaciones de los valores de cambio químico de bobina aleatoria para el péptido mAb806 se muestran en la figura 93. Biodistribución de Tumor chAb806 en Pacientes Para demostrar la especificidad de tumor de mAb806 in vivo, se construyó la versión quimérica (ch806) y se produjo bajo condiciones cGMP (Panousis y asociados, (2005) Br. J. Cáncer. 92, 1069-1077). Se llevó a cabo una prueba primero en hombres Fase I para evaluar la seguridad, biodistribución y respuesta inmune de ch806 en pacientes con tumores positivos 806, y se han reportado previamente los resultados de seguridad, biodistribución y farmacocinéticas (Scott y asociados, (2007) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 104, 4071-4076). Para definir la especificidad de ch806 en tumor en comparación con tejido normal (por ejemplo, hígado) en pacientes, se llevó a cabo la captación cuantitativa de ch806 en tumor e hígado mediante el cálculo del % de la dosis inyectada (ID) de 111ln-ch806 de imágenes de cámara gamma de cuerpo completo obtenidas a una semana después de la inyección de 5-7mCi (200-280MBq) 111 n-ch 806. Se llevaron a cabo cálculos de dosimetría de hígado y tumor con base en regiones de interés en cada paciente individual. El conjunto de datos de imagen de infusión 11ln-ch806, corregido para fondo y atenuación, permite el cálculo de la actividad acumulada. Se llevó a cabo el cálculo de dosimetría para derivar la concentración de 111ln-ch806 en tumor e hígado durante un período de una semana después de la inyección, b. Secuenciación Se secuenciaron las cadenas pesadas variables (VH) y ligeras variables (VL) mAb175, y su complementariedad determinando las regiones (CDRs) identificadas como se indica a continuación: Cadena mAb175 VH: secuencias de ácido nucleico (SEC ID NO:128) y aminoácido (SEC ID NO:129) se muestran en las figuras74A y 74B, respectivamente. Se indican las regiones de determinación de complementariedad CDR1, CDR2, y CDR3 (SEC ID NOS:130, 131, y 132, respectivamente) subrayado en la figura 74B.
Se muestran las secuencias de cadena mAb175 VL: ácido nucleico (SEC ID NO:133) y aminoácido (SEC ID NO:134) en las figuras75A y 75B, respectivamente. Se indican las regiones de determinación de complementariedad CDR1, CDR2, y CDR3 (SEC ID NOS: 135, 136, y 137, respectivamente) mediante el subrayado en la figura 75B.
Los datos de secuencia para mAb175 están basados tanto en los datos de secuencia como los datos de estructura de cristal, y la línea celular no es clonal, y por consiguiente se han obtenido múltiples secuencias de la línea celular. Las secuencias de mAb175 establecidas anteriormente han sido confirmadas mediante estructura de cristal, y difieren en un solo aminoácido en cada CDR1 y CDR2 de cadena VL de las secuencias previas basadas en los datos de secuencia estándar solos. También se ha obtenido un diferente isotipo de mAb175 (un isotipo lgG2a inusual) con base en los datos de la secuencia y estructura de cristal finales.
Especificidad mAb175 Los estudios de enlace preliminares sugirieron que mAb175 mostró especificidad similar para EGFR como mAb806. En las regiones CDR mAb806 (lgG2b) y mAb175 (lgG2a), la secuencia de aminoácidos son casi idénticas, únicamente con una diferencia de aminoácido en cada una (figura 65; Ver Ejemplo 26, que se encuentra más adelante). Todas estas diferencias conservan la carga y tamaño de las cadenas laterales. Claramente estos anticuerpos han sido elevados en forma independiente, c. Experimentos Se llevó a cabo un conjunto un experimento de inmunohistoquímico para analizar la especificidad de enlace mAb175. Las secciones de manchas mAb175 de xenoinjertos A431 que sobreexpesan EGFR (figura 66A) y las secciones de xenoinjerto de glioma U87MG.A2-7 que expresan el A2-7EGFR (figura 66A). En contraste, mAb175 no mancha secciones de fibra óptica U87MG. La línea celular U87MG expresa únicamente niveles moderados de EGFR tipo silvestre (figura 66A) y no tiene lazo autocrino EGFR detectable. De manera más importante, mAb175 no enlaza a secciones de hígado humano normal (figura 66B). Por lo tanto, mAb175 parece demostrar la misma especificidad que mAb806, es decir, detecta EGFR humano sobreexpresado y truncado, pero no el wtEGFR expresado en niveles moderados.
Identificación del epítope mAb175 Ya que mAb175 también enlaza el A2-7EGFR, en donde se eliminan los aminoácidos 6 a 273, y EGFR1 -50i , el epítope mAb175 debe estar contenido dentro de los residuos 274 a 501. Cuando se determina el epítope de mAb806, expresamos una serie de fragmentos EGFR etiquetados c-myc fusionados al término carboxi de GH humano, terminando todos en el aminoácido 501 (Chao y asociados, (2004) J. Mol. Biol. 342, 539-550; Johns y asociados, (2004) J. Biol. Chem. 279, 30375-30384).
El mAb175 también reaccionó tanto con fragmentos EGFR 274-501 como 282-501 en manchados Western, pero no detectó fragmentos que comienzan en el aminoácido 290 ó 298 (figura 73). La presencia de todas las proteínas de fusión GH-EGFR está confirmada utilizando el anticuerpo c-myc, 9EI0 (figura 73). Por consiguiente, se localiza una determinante crítica del epítope mAb175 cerca del aminoácido 290. Finalmente, también fue negativo un fragmento 274-501 EGFR con el epítope mAb806 eliminado (?287 a 302) para enlace mAb175 (figura 73), lo que sugiere que esta reacción determinó en forma similar la mayor parte del enlace mAb175.
Se utilizó un segundo método para caracterizar en forma adicional el epítope mAb175. Se expresaron fragmentos que comprenden dominios extracelulares del EGFR en la superficie de levadura y se probaron para enlace mAb175 mediante inmunofluorescencia indirecta utilizando citometría de flujo. El mAb175 reconoció el fragmento de levadura 273-621, que corresponde al dominio extraceiular de ?2-7 EGFR, pero no a los fragmentos 1-176, 1-294, 294-543, ó 475-621 (figura 67A y figura 67B). Por lo tanto, al menos parte del epítope mAb175 debe estar contenido dentro de la región entre los aminoácidos 274 a 294, de acurdo con datos de inmunomanchado utilizando fragmentos EGFR. Ya que mAb175 enlaza al fragmento desnaturalizado del 273-621 (figura 67C), el epítope debe ser lineal por naturaleza (figura 73). Queda claro que mAb806 y mAb175 reconocen una región y conformación similar del EGFR.
Utilizando resonancia de plasmón de superficie (BIAcore), se investigó el enlace de mAb175 al péptido EGFR (287CGADSYEMEEDGVRKC302; SEC ID N0.138)). El EGFR287-302 fue inmovilizado en la superficie de biosensor utilizando amina, intercambio de tiol-disulfuro o químicas de acoplamiento Pms-Ser. El último método inmoviliza el péptido exclusivamente a través de la cisteína N-terminal (Wade y asociados, (2006) Anal. Biochem. 348, 315-317). mAb175 enlazó a EGFR287-302 en todas las orientaciones (tabla 6). La afinidad de mAb175 para EGFR287-302 fluctuó 35 nM para acoplamiento Pms-serina a 154 nM para acoplamiento de amina. En todos los casos, la afinidad de enlace de mAb175 para EGFR287-302 fue menor que la obtenida para mAb806 (Tabla 6). También determinaron la afinidad de mAb175 a dos diferentes fragmentos extracelulares de EGFR. mAb175 enlazó el fragmento 1-501 con una afinidad a la obtenida utilizando el péptido (16 nM versus 35 nM) (tabla 6). Como se espera, la afinidad de mAb175 contra el dominio extraceiuiar de longitud total 1-621, el cual formó la conformación atada, fue mucho menor (188 nM). Aunque mAb806 y mAb 175 tienen afinidades similares para EGFR287-302, mAb175 parece desplegar un mayor afinidad para el dominio extraceiuiar del EGFR (tabla 6). Claramente, el epítope mAb175 está contenido dentro de EGFR287-302 y de igual manera, mAb806, la afinidad de enlace al dominio extraceiuiar del EGFR depende de la conformación.
Tabla 6 Determinación BIAcore de afinidades de anticuerpo para enlace mAb806 v mAb175 o epítope EGFR El panel de mutantes del fragmento 273-621 EGFR, expresado en la superficie de levadura (Chao y asociados, (2004) J. Mol. Biol. 342, 539-550; Johns y asociados, (2004) J. Biol. Chem. 279, 30375-30384) fue utilizado para caracterizar la estructura fina del epítope mAb175. mAb 175 y mAb806 desplegaron un patrón casi idéntico de reactividad para los mutantes (tabla 7). La interrupción del enlace de disulfuro 287 a 302 únicamente tuvo un efecto moderado en la reactividad de epítope ya que el anticuerpo enlazó a todos los mutantes en C287 y algunos pero no todos los mutantes en C302 (tabla 7). Los aminoácidos críticos para enlace mAb175 incluyen E293, G298, V299, R300 y C302 (tabla 7). mAb175 pareció ser moderadamente más sensible a las mutaciones V299 y D297 aunque mAb806 también mostró enlace reducido a algunas mutaciones de estos sitios (tabla 7). Nuevamente, el epítope mAb175 parece ser esencialmente el mismo que el epítope reconocido por mAb806.
Tabla 7 Despliegue de mutaciones 287 a 302 Epítope de EGFR en levadura y calificaciones de enlace para por mAb806 y mAb175 Eficacia de mAb175 contra xenoinjertos de tumor estimulados mediante A2-7EGFR o un lazo autocrino EGFR La actividad anti-tumor in vivo de mAb806 y mAb175 contra U87MG.A2-7 xenoinjertos de glioma fue revisada. Los xenoinjertos se dejaron establecer durante 6 días antes de que comenzara la terapia de anticuerpo (3 veces a la semana durante 2 semanas en los días indicados). En este momento, el volumen de tumor promedio fue de.100 mm3 (figura 68A). El tratamiento de mAb175 dio como resultado una reducción en el rango de crecimiento de tumor comparado con el tratamiento con vehículo o mAb806 el cual también fue significativo el día 19 posterior a la inoculación (P < 0.0001 versus control y P <0.002 versus mAb806), cuando el grupo de control fue sacrificado por razones éticas. El volumen de tumor promedio en este momento fue de 1530, 10 300 y 100 mm3 para el vehículo, grupos de tratamiento con mAb806 y mAb175, respectivamente (figura 68A), confirmando la actividad antitumor de la actividad mAb175 contra xenoinjertos que expresen el A2-7EGFR.
Incluso aunque las células U87MG expresan aproximadamente 1 x 105 EGFR por célula, mAb 806 no tuvo la capacidad de reconocer cualquier EGFR de la superficie, y no sorprendentemente, no inhibió el crecimiento U87MG in vivo. Además, estas célula no expresan en conjunto cualquier ligando EGFR. Se llevó a cabo un estudio para ver si el epítope EGFR es expuesto en forma temporal, y por lo tanto tuvo la capacidad de ser reconocido mediante mAb806 y mAb175 en células que contienen el lazo autocrino EGFR. La línea de célula de próstata DU145, expresa wtEGFR y niveles similares a los observados en células U87MG, sin embargo a diferencia de células U87MG, las células DU145 contienen una amplificación del gen TGF-a y por lo tanto, exhiben un lazo autocrino EGFR/TGF-a. Tanto mAb175 como 806 enlazan a células DU145 tal como se determina mediante análisis FACS (figura 68B) y ambos tienen la capacidad de inmunoprecipitar una pequeña proporción del EGFR extractado a partir de estas células (figura 68C). Ambas técnicas mostraron un mayor enlace mAb175, sin embargo, cuando se comparan con mAb528, que enlaza al dominio L2, mAb175 y mAb806 únicamente enlazan un subconjunto de EGFR en la superficie de estas células (figura 68B y figura 68C). Se observaron detalles similares con una segunda línea de próstata (LnCap); (datos no mostrados) y una de colon (LIM1215) ambas de las cuales también contienen lazos autocrinos EGFR (Sizeland, A. M. y Burgess, A. W. (1992) Mol Cell Biol. 3, 1235-1243; Sizeland, A. M. y Burgess, A. W. (1991) Mol Cell Biol. 11, 4005-4014). Claramente, mAb806 y mAb175 pueden reconocer únicamente una pequeña proporción de EGFR en células en la presencia de un lazo de estimulación autocrino.
Ya que mAb175 y mAb806 enlazan más efectivamente al EGFR expresado en células DU145 en células U87MG, se llevó a cabo un estudio para analizar la actividad anti-tumor de estos anticuerpos en xenoinjertos DU145 crecidos en ratones. Los xenoinjertos se dejaron establecer durante 18 días antes de que comenzara la terapia (3 veces a la semana durante 3 semanas en los días indicados). En este momento, el volumen de tumor promedio fue de 90 mm3 (figura 68D). Tanto mAb175 como mAb806 inhibieron el crecimiento de xenoinjertos DU145. El grupo de control fue sacrificado el día 67 y tuvo un volumen de tumor promedio de 1145 mm3 en comparación con 605 y 815 mm3 por los grupos mAb806 y mAb175, respectivamente (p < 0.007 y 0.02 respectivamente) (figura 68D).
Estructura 3D de EGFR?B7-3n? en contacto con los fragmentos Fab de mAb806 v mAb175 Con el objeto de comprender los detalles molecular de cómo mAb806 y mAb175 pueden reconocer EGFR en algunos, pero no todas las conformaciones, las estructuras de cristal de fragmentos Fab para ambos anticuerpos fueron determinadas en un complejo con el epítope EGFR287-302 oxidado (en 2.0 y 1.59 A respectivamente, figura 69A & 69B) y solos (en 2.3 A y 2.8 A de resolución, respectivamente). En ambos casos, las estructuras Fab libres y el complejo fueron esencialmente las mismas y las conformaciones del epítope y lazos CDR de los anticuerpos fueron bien definidas (figura 69). El epítope adopta una estructura de cinta-ß, con un borde de la cinta apuntando hacia el Fab y V299 enterrado en el centro del sitio de enlace de antígeno (figuras 69C-E). Ambos extremos del epítope se exponen al solvente, en forma consistente con estos anticuerpos que enlazan polipéptidos mucho más largos.
De los 20 residuos de anticuerpo en contacto con el epítope, únicamente existen dos sustituciones entre mAb806 y mAb175 (figura 65). Los residuos de contacto mAb175 son: S30, S31, N32, Y49, H50, Y91, F94, W96 de cadena ligera y D32, Y33, A34, Y51, S53, Y54, S55, N57, R59, A99, G100, R101 de cadena pesada; los residuos de contacto mAb806 son los mismos, con diferencias de secuencia para la cadena ligera, N30 y cadena pesada F33. EGFR287-302 enlaza a Fab a través de contactos cercanos entre los residuos de péptido 293 a 302, con la mayor parte de los contactos entre los residuos 297 y 302. Los únicos enlace de hidrógeno entre átomos de cadena principal de EGFR287-302 y Fab son para los residuos 300 y 302 (figura 69F). El reconocimiento de la secuencia de epítope ocurren a través de los enlaces de hidrógeno de cadena lateral o residuos E293 (a H50 y R101 de Fab), D297 (a Y51 y N57), R300 (a D32) y K301 (a través de moléculas de agua a Y51 y W96). Se realizan contactos hidrofóbicos en G298, V299 y C302.
La conformación del esqueleto de epítope entre 293 y 302 fue esencialmente idéntica en los cristales Fab806 y Fab175 (desviación rms = 0.4 A, para átomos Ca en estos residuos).
Aunque se restringe a través del enlace de disulfuro, el término-N del péptido (287-292) no hace un contacto significativo en cualquier estructura de anticuerpos, y difieren las conformaciones en esta región. Sin embargo, este segmento en el complejo Fab806 parece más bien ser desordenado. En forma más interesante, la conformación del péptido EGFR287-302 en contacto con los anticuerpos está relacionada en forma muy cercana con la conformación EGFR287-302 observada en el esqueleto de las estructuras EGFR atadas y no atadas (Li y asociados, 2005; Garrett y asociados, 2002). Para EGFR287-302 del complejo Fab175, las desviaciones Ca en las posiciones son 0.66 y 0.75 A, respectivamente (figura 69).
Para ganar visión adicional en el reconocimiento de EGFR mediante mAb806 y mAb175, se estudió la conformación del péptido oxidado etiquetado-15N EGFR287-302 mediante espectroscopia RMN en solución, libre y en la presencia de 806 Fab (ver la sección de Materiales y Métodos). Para el péptido libre, las resonancias fueron asignadas y comparadas a las de la bobina aleatoria. Esencialmente, el péptido libre adoptó una estructura de bobina aleatoria, no la cinta beta tal como se observa en EGFR nativo (Garrett y asociados, (2002) Cell 20;110, 763-773).
Al momento de la adición de Fab, se observaron cambios de resonancia. Sin embargo, debido a la señal débil que surge del ensanchamiento de la línea significativa al momento de la adición del Fab y la cristalización exitosa de los complejos, a la estructura de la solución del complejo de epítope-Fab806, no se le dio seguimiento adicional. Aunque claramente cuando el péptido enlaza al fragmento de Fab de mAb806 (o mAM75) parece que Fab selecciona o induce la conformación del péptido que coincide con el péptido en el receptor nativo.
Con el objeto de estudiar cualquier mAb806 y mAb175 reconocido únicamente en ciertas conformaciones de EGFR, el fragmento Fab de mAb175 fue atracado sobre un domino extracelular de EGFR (monómeros atados y no atados) superimponiendo EGFR287-302- Para el fragmento tipo ?2-7 no hubo discrepancia estéricas significativas con el receptor. En la forma no atada hubo un área de superficie sustanciaimente más accesible del Fab enterrado (920 A2 en comparación con 550A2 en la forma atada). Por lo tanto, este antígeno puede hacer contactos adicionales con regiones no CDR del anticuerpo, tal como ha sido indicado mediante mutantes de expresión de levadura (Chao y asociados, (2004) J. Mol. Biol. 342, 539-550). De manera inversa, el atracamiento de todo el ectodominio EGFR en Fab, existe un traslape espacial sustancial con la parte del dominio CR1 que precede el epítope (residuos 187 a 286) y corre a través del centro del Fab (figura 69D y 69E). Por lo tanto, ya que el dominio CR1 tiene esencialmente la misma estructura en conformaciones atadas o no atadas, mAb806 o mAb175 no tendrán la capacidad de enlazar a cualquier forma de EGFR. Claramente, debe haber una diferencia entre la orientación del epítope con respecto al dominio CRI en cualesquiera conformaciones conocidas del wtEGFR, y la orientación que permita al enlace del epítope. la inspección del dominio CRI indicó que el enlace de disulfuro (271 a 283) que precede EGFR287-302, restringe el polipéptido lo cual bloquea el acceso al epítope; la interrupción de este disulfuro, incluso aunque no esté implicada en el enlace directa a los anticuerpos, puede esperar que se permita el desdoblamiento parcial del dominio CR1, de modo que mAb175 o mAb806 puedan ganar acceso al epítope.
Rompimiento del enlace de disulfuro EGFR 271-283 que incrementa enlace mAb806 Los enlaces de disulfuro en proteínas proporcionan rigidez estructural incrementada, aunque en algunos receptores de superficie celular, particularmente los que son para citocinas y factores de crecimiento, el rompimiento temporal de enlaces de disulfuro e intercambio de disulfuro pueden controlar la función del receptor (Hogg, P. J. (2003) Tendencia hacia ciencias químicas 28, 210-214). Ya que este fue un mecanismo a través del cual mAb806 y mAb175 pueden ganar acceso a su sitio de enlace, se intentó el incremento de accesabilidad del epítope mutando cualquiera de o ambos de los residuos de cisteína en las posiciones 271 y 283 a los residuos de alanina (C271 A/C283A). los vectores en la capacidad de expresar EGFR-C271 A-, C283A o C271A/C283A de longitud total fueron transfectados en la línea de célula Ba/F3 dependiente de IL-3. Los clones Ba/F3 estables, que expresan el mutante EGFR C271A- y C271A/C283A en niveles equivalentes al wtEGFR, fueron seleccionados (figura 70A). No se observaron células que expresan altos niveles de Ba/F3 mutante. Se ha consistido previamente, C283A-EGFR reacciona en forma deficiente con wtEGFR; sin embargo, los receptores mutantes reaccionaron de manera igualmente fuerte con mAb528, mAb806 y el anticuerpo anti-FLAG, lo que sugiere que el receptor se expresa en la superficie celular, se dobla correctamente y el epítope para mAb806 es completamente accesible en dichos casos. Para confirmar que mAb806 reconoce el mutante C271A/C283A en forma más eficientemente que wtEGFR, la proporción del enlace mAb806 al enlace de mAb528 fue determinado, ya que tanto EGFR tipo silvestre como C271A/C283A fueron etiquetados-FLAG de terminal-N, también se determinó la proporción del enlace mAb806 y mAb528 al anticuerpo M2. Tal como se reportó anteriormente, mAb806 reconoció una pequeña proporción del wtEGFR total expresado en la superficie de células Ba/F3 (la proporción de enlace mAb806/528 es 0.08) (tabla 8). En contraste, mAb806 reconoció virtualmente todo el eje EGFR mutante C271A/C283A expresado en la superficie celular (una proporción de enlace Ab806/528 de 1.01) (figura 70A y tabla 8).
Tabla 8 Reactividad mAb806 con células que expresan el EGFR tipo silvestre o C271A/C283A * Promedio de cuatro clones independientes La mutación de las dos cisteínas no compromete el enlace EGF o la función de receptor. Las células BaF3 que expresan el r mutante EGFR C271A/C283A proliferan en la presencia de EGF (figura 70B). Un desplazamiento izquierdo en la curva de respuesta de dosis para EGF en células que expresan las mutaciones C271A/C283A se observó en forma reproducible, lo que sugiere ya sea una mayor afinidad para el ligando, o un potencial de señalización aumentado para el receptor mutante. El análisis de manchado Western ha sugerido que el mutante C271A/C283A se expresa a niveles similares al wtEGFR y es fosforilado con tirosina en respuesta al estímulo EGF (figura 70C). en forma consistente con estudios previos en otras líneas celulares, mAb806 no tiene efecto y la proliferación inducida puede ser EGF in vitro de células Ba/F3 que expresan wtEGFR, aunque el bloqueo de ligando mAb528 inhibe completamente la proliferación inducida por EGF de estas células (figura 70D, panel izquierdo). En contraste, mAb806 extirpó completamente la proliferación inducida por EGF-en células BaF3 que expresan el muíante C271A/C283A (figura 70D, panel derecho). Cuando se interrumpió el lazo de cisteína 271-283, no únicamente mAb806 enlaza en forma más efectiva, si no que una vez enlazado, mAb806 evita la proliferación inducida por ligando.
Tabla 9 Recolección de datos y Estadísticas de Refinación Recolección de Datos Refinación Discusión Los estudios estructurales en el epítope EGFR287-302 muestran que tanto mAb806 como mAb175 reconocieron el mismo motivo estructural 3D en las estructuras wtEGFR, lo que indica que esta conformación de esqueleto también ocurre en, y se expone en A2-7EGFR. Sin embargo, en forma crítica, la orientación del epítope en estas estructuras puede prevenir el acceso de anticuerpo a los aminoácidos relevantes. Esto en forma consistente con la observación experimental de que mAb806 no enlaza wtEGFR expresado en la superficie celular en niveles fisiológicos.
Los resultantes con un muíante EGFRC27IA/C283A indican que el dominio CR1 puede abrirse para permitir que mAb806 y mAb175 se enlacen en forma estequiométrica a este receptor muíante. Este receptor mutante puede aún adaptar una conformación nativa ya que responde completamente a la estimulación EGF, pero, a diferencia de wtEGFR, es inhibido completamente por mAb806. Si una forma sin pliegue del EGFR con este enlace de disulfuro rota existe en la superficie de células de cáncer, los datos muestran claramente que puede tener la capacidad de iniciar la señalización celular y debe ser inhibida ya sea mediante mAb806 o mAb175.
Otra explicación de los datos es que durante la activación de ligando el reajuste estructural y el receptor puede inducir el desdoblamiento local en los alrededores del epítope, permitiendo que el receptor adopte una conformación que permita el enlace. En estructuras de cristal, el epítope descansa cerca del centro físico del ectodominio EGFR y el acceso al epítope es bloqueado a través tanto del dominio CR1 doblado como la estructura cuaternaria del ectodominio EGFR. En las conformaciones atadas y no atadas, la integridad del dominio CR1 es estabilizada mediante interacciones adicionales con ya sea los dominios L : ligando: L2 (no atado) o los dominios L2:CR2 (atados). Sin embargo, la región de epítope tiene parte de los parámetros técnicos más altos encontrados en el ectodominio: el epítope mAb806/175 es estructuralmente débil. Durante la activación del receptor, cuando el receptor pasa por una transición entre las conformaciones atadas y no atadas, mAb806 y mAb175 pueden accesar al epítope. Por lo tanto, en el nivel molecular, estos mecanismos pueden contribuir al enlace insignificativo de mAb806 y mAb175 a células normales y a niveles sustancialmente mayores de enlace a células de tumor que tienen EGFR sobreexpresado y/o activado.
Ejemplo 24 Anticuerpos Monoclonales 124 y 1133 Tal como se describe en el Ejemplo 1 anterior, mAb124 y mAb1133 fueron generados al mismo tiempo que mAb806 y se descubrió que despliegan propiedades similares, con una especificidad particular para el EGFR tipo silvestre sobreexpresado, a las propiedades únicas del mAb806 aquí mencionado.
Se llevaron a cabo clasificaciones iniciales en Nueva York (Jungblut y asociados, (2003) Anticuerpo monoclonal que reconoce cánceres humanos con amplificación/sobreexpresión del receptor de factor de crecimiento epidérmico humano PNAS. 100, 639-644. Se llevaron a cabo evaluaciones de competición ELISA y análisis Biacore para determinar si mAb124 y/o mAb1133 reconocen un epítope idéntico a mAb806 o un determinante EGFR alternativo.
Análisis FACS Se evaluó el anticuerpo que enlaza a células U87MG.A2-7, A431 y HN5 mediante FACS. Todos los anticuerpos desplegaron una especificidad similar a la de mAb806 con enlace fuerte al de2-7 EGFR, y un enlace de bajo nivel a EGFR tipo silvestre sobreexpresado.
ELISA de competición Se llevó a cabo una serie de ELISA de competición para determinar si los anticuerpos 124 y 1133 compitieron con el epítope mAb806. En síntesis, se recubrió el dominio soluble desnaturalizado de EGFR (sEGFR) en las placas ELISA. Los anticuerpos 124 ó 1133 no etiquetados posteriormente se agregaron a través de la placa en concentraciones en incremento. Después de lavado, se agregó mAb806 biotinilado a cada depósito para determinar que aún puede enlazar el sEGFR. La detección de mAb806enlazado se logró utilizando HRP conjugado con estreptavidina. Si un anticuerpo enlaza al mismo epítope (o traslapa) como mAb806, entonces no se espera el enlace mAb806.
Se resumen los resultados en la tabla 10. Se observó un efecto de inhibición de enlace dependiente de la concentración para mAb124 y el enlace mAb1133: mAb806 incrementó conforme se disminuyó la concentración del anticuerpo no etiquetado, sugiriendo que los anticuerpos 124 y 1133 reconocen un epítope idéntico a mAb806 o uno en proximidad más cercana.
Tabla 10 Resumen de ELISA de competición mAb124 v mAb1133 que enlaza a sEGFR.
Competición de Análisis FACS: Enlace Celular Se incubaron previamente células U87MG.A2-7 con anticuerpo no etiquetado 124, 1133. Se incluyó en este ensayo el control positive 806 y el control de isotipo. Las células se lavaron, posteriormente se analizaron con mAb806 conjugado con Alexa488 y se determinó el enlace 806 mediante FACS.
Los resultados se resumen en la tabla 11. Los anticuerpos 124 y 1133 bloquearon el enlace mAb806 a la superficie celular lo que indica reconocimiento de un epítope idéntico a mAb806 o uno en proximidad cercana.
Tabla 11 Análisis FACS: Competición de Enlace de Célula U87MG.A2-7 Análisis BIAcore: Enlace al epítope de péptido mAb806 La secuencia de aminoácido EGFR 287CGADSYEMEEDGVRKC302 (SEC ID NO:14) que contiene el epítope mAb806 fue sintetizada como un péptido y se inmovilizó en el chip de biosensor. Se midió el enlace de anticuerpos 124, 1133 y 806 (200 nM) a este péptido. Se resumen unidades de resonancia de enlace máximo (RU) obtenidas en la tabla 12. 124, 1133 mostró enlace claro al péptido lo que confirma el reconocimiento del epítope de péptido 806.
Tabla 12 Análisis BIAcore: Enlace máximo al epítope de péptido mAb806 Discusión Tal como se muestra en este Ejemplo, mAb124 y mAb1133 enlazan al péptido EGFR reconocido por mAb806 y bloquean el enlace de mAb806 al dominio extracelular de EGFR y células que expresan el de2-7EGFR. Por lo tanto, estos tres anticuerpos reconocen la misma determinante en EGFR.
Ejemplo 25 Prueba Clínica de ch806 Se diseñó un estudio clínico para revisar la especificidad in vivo de ch806 en un análisis de dirección de tumor/biodistribución/farmacocinético en pacientes con diversos tipos de tumor. 1. Materiales y Métodos Diseño de prueba Esta prueba primero en el hombre fue un estudio fase I de escalado de dosis, de etiqueta abierta. El objetivo primario fue evaluar la seguridad de una infusión simple de ch806 en pacientes con tumores avanzados que expresan el antígeno 806. Los objetivos secundarios del estudio fueron determinar la biodistribución, farmacocinética y captación de tumor de 1 1ln-ch806; determinar la respuesta inmune del paciente a ch806; y evaluar la evidencia temprana de la actividad clínica de ch806. Se eligió la dosis simple para este estudio con el objeto de evaluar en forma óptima la especificidad in vivo de ch806 para EGFR expresado en el tumor. El protocolo fue aprobado por el Comité de Investigación Éticas humanas del Hospital de Austin (Human Research an Etics Committee of the Austin Hospital) antes de comenzar el estudio. La prueba se llevó a cabo bajo el esquema de la Extensión de Pruebas Clínicas de la Administración Australiana de Bienes Terapéuticos (Australian Therapeutic Goods Administration Clinical Triáis Exemption) (CTX). Todos los pacientes proporcionaron un consentimiento informado por escrito.
Los criterios de elegibilidad incluyeron: tumores avanzados o metastáticos positivos para expresión de antígeno 806 con base en hibridación cromogénica in situ o immunohistoch24 tiene la química de las muestras de tumor archivadas (los tumores se definieron como positivos 806 si la evaluación de inmunohistoquímica de las muestras de tumor archivadas mostraron cualesquiera células positivas para expresión 806, ver más adelante); malignidad probada en forma histológica o psicológica; enfermedad medible en escaneo CT con al menos una lesión de = 2 cm; supervivencia esperada de al menos 3 meses; escala de desempeño Karnofsky (KPS) = 70; función hematológica, hepática y renal adecuada; edad > 18 años; y capacidad de proporcionar consentimiento informado. Los criterios de exclusión incluyeron: metástasis en sistema nervioso central activo (a menos que sea tratado en forma adecuada y estable), quimioterapia, inmunoterapia, terapia biológica o terapia de radiación a las cuatro semanas antes de la entrada del estudio; antes de la exposición al anticuerpo [a menos que no haya evidencia de anticuerpos antiquiméricos humanos (HACA)]; falla para la recuperación en forma total de efectos de la terapia de cáncer previa; uso concurrente de corticoesteroides sistémicos o agentes inmunosupresores; infección no controlada u otra enfermedad severa; embarazo o lactancia; mujeres con potencial de embarazo que no utilizan medios anticonceptivos médicamente aceptables.
Los pacientes recibieron una infusión simple de un residuo ch806 etiquetado con lndio-111 (111ln, 200-280 MBq; 5-7 mCi) mediante infusión intravenosa en solución salina normal/5% de albúmina de suero humano en 60 minutos. El escalado de dosis planeado significa pacientes que fueron inscritos en uno de cuatro niveles de dosis: 5, 10, 20 y 40 mg/m2. Estas dosis fueron elegidas para permitir la evaluación de la especificidad de ch806 a EGFR expresado en tumor, y para determinar si cualquier compartimento de tejido normal enlaza a ch806 (y afecta las farmacocinéticas o biodistribución) in vivo. Se evaluó en todos los pacientes la biodistribución, farmacocinéticas y respuesta inmune.
Se llevó a cabo una generación de imágenes con una cámara gamma de cuerpo completo para evaluación de biodistribución y captación de tumor el Día 0, Día 1, Día 2 ó 3, Día 4 ó 5, y Día 6 ó 7 después de la infusión 1 1ln-ch806. Se obtuvieron muestras de sangre para farmacocinéticas en estos puntos de tiempo y adicionalmente el día 14 (± 2 días) y Día 21 (± 2 días). Las muestras de sangre para evaluación de niveles HACA fueron obtenidas en la línea de base, y en forma semanal hasta el día 30. Se llevó a cabo la evaluación de toxicidad en cada visita del estudio. Se llevó a cabo la revisión física y hematología y bioquímica de rutina en forma semanal hasta el final del estudio (Día 30). Se llevó a cabo una nueva presentación el Día 30.
Criterio de Escalado de Dosis Se observó el primer paciente en cada nivel de dosis durante 4 semanas antes de la inscripción de cualesquiera pacientes adicionales. Si no se observa toxicidad que limite la dosis (DLT) en cualesquiera de los 2 primeros pacientes en las 4 semanas posteriores a la infusión de ch8063, posteriormente se ingresan 4 pacientes en la siguiente hilera de dosificación más alta. Si un paciente en cualquier cohorte de dos pacientes experimentó un DLT a las 4 semanas de la primera dosis, se ingresaron 4 pacientes adicionales (máximo de 6) en dicho nivel de dosificación. Si no más de un paciente de los 6 en cualquier nivel de dosis experimentó toxicidad = Grado 3, se ingresaron pacientes subsecuentes en el siguiente nivel de dosis.
DLT se definió como toxicidad no hematológica Grado 3 o toxicidad hematológica Grado 4 tal como lo define el Criterio de Terminología Común NCI de Eventos Adversos (NCI Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE v3.0). Se definió la dosis máxima Tolerada (MTD) como la dosis ch806 debajo de la cual 2 o más pacientes de 6 experimentaron DLT. Radioetiauetado de Ch806 Se produjo ch806 de grado clínico en la Instalación de Producción Biológica de Ludwig Institute for Cáncer Research, Melbourne, Australia. El anticuerpo ch806 fue etiquetado con 111ln (MDS Nordion, Kanata, Canadá) a través del quelado de ión de metal bifüncional CHX-A"-DTPA de acuerdo con métodos descritos previamente (Scott y asociados, (2000) Cáncer Res 60, 3254-3261; Scott y asociados, (2001) J. Clin. Oncol. 19(19), 3976-3987).
Generación de Imágenes con Cámara Gamma Se obtuvieron imágenes de cuerpo completo de una biodistribución 111ln-ch806 en todos los pacientes el Día 0 después de la infusión de 111ln-ch806, y al menos en 3 ocasiones adicionales hasta el Día 7 después de la infusión. También se obtuvieron imágenes de tomografía computarizada de emisión de fotones simple (SPECT) de una región del cuerpo con tumor conocido en al menos una ocasión durante este período. Se adquirieron todas las imágenes de cámara gamma en una cámara gamma de cabeza doble (Picker I nternanonal , Cleveland, OH).
Farmacocinéticas Se recolectó sangre para análisis farmacocinético el Día 0 - pre infusión 11ln-ch806; posteriormente a los 5 minutos, 60 minutos, 2 horas y 4 horas posteriores a la infusión 11 ln-ch806, el Día 1, Día 2 ó 3, Día 4 ó 5, y Día 6 ó 7. También se obtuvo sangre adicional para farmacocinéticas de proteína ch806 el Día 14 (± 2 días) y Día 21 (± 2 días) y Día 30 (± 2 días).
Se alicuotaron muestras de suero por duplicado y se contaron en un contador de centelleo gamma (Packard Instruments, elbourne, Australia), junto con estándares 11ln adecuados. Los resultados del suero se expresaron como % de dosis inyectada por litro (% ID/L). Se llevó a cabo una medida de niveles de proteína ch806 en sueros del paciente después de cada infusión, utilizando un protocolo validado para la medida inmunohistoquímica de proteína ch806 en suero humano 40. El límite de cuantificación para ch806 en muestras de suero fue de 70 ng/mL. Todas las muestras se ensayaron por triplicado y se diluyeron por un factor de al menos 1:2. Los niveles de suero medido de ch806 fueron expresados como ng/mL.
Se llevaron a cabo cálculos farmacocinéticos en las medidas 111ln-ch806 en suero después de la infusión, y ELISA determinó los niveles de proteína ch806 en los sueros del paciente, utilizando un programa de adaptación de curva (WinNonlin Pro Node 5.0.1, Farsight Co., Mountain View, CA). Se determinaron los estimados para los siguientes parámetros: T½a y T ½ß (vidas medias de las fases de disposición inicial y terminal); V1, volumen de compartimento central; Cmax (concentración máxima de suero); AUC (área bajo la curva de concentración de suero extrapolada al tiempo infinito); y CL (despeje de suero total).
Despeje de Cuerpo Completo y Dosimetría de Tumor u Órgano de 1 1ln-ch806 Se llevaron a cabo cálculos de dosimetría de órgano normal y cuerpo completo (hígado, pulmón, riñon y bazo) con base en regiones de interés en cada conjunto de datos de imagen de infusión de 111ln-ch806 de cada paciente individual, permitiendo el cálculo de actividad acumulada y análisis utilizando OLINDA para resultados de dosimetría final (Stabin y asociados, (2005) J. Nucí. Med. 46(6), 1023-1027). Las regiones de interés también fueron definidas para tumores adecuados en cada punto de tiempo en conjuntos de datos de imagen 11 ln-ch806, corregidos para fondo y atenuación, y el cálculo de dosimetría se llevó a cabo para derivar la concentración de 111ln-ch806 en tumor/gm (Scott y asociados, (2005) Clin. Cáncer Res. 11(13), 4810-4817). Esto se convirtió a g ch806/gm de tumor con base en la dosis de proteína mg ch806 inyectada.
Análisis HACA Se tomaron muestras de sangre para evaluación HACA antes de la infusión ch806, posteriormente en forma semanal hasta los 30 días después de la infusión ch806. Las muestras fueron analizadas mediante ELISA, y mediante tecnología de resonancia de plasmón de superficie utilizando un instrumento BIAcore2000, tal como se describió previamente (Scott y asociados, 2005; Liu y asociados, (2003) Hybrid Hybridomics 22(4), 219-28; Ritter y asociados, (2001) Cáncer Res. 61(18), 685-6859).
Método de Inmunohistoquímica Se inmunomanchó tejido de tumor incrustado en parafina fijado con formalina, de cada paciente en la prueba tal como se indica a continuación: En síntesis, se montaron secciones de 4 pm de tejido incrustado en parafina sobre rebanadas SuperFrost® Plus (Menzel-Glaser, Alemania), se eliminaron de la parafina y se rehidrataron antes de la recuperación de antígeno en microondas en la Solución de Recuperación Objetivo, pH 6.0 (10 minutos; Dako, Glostrup, Denmark). Posteriormente las secciones se trataron con 3% de H202 durante 10 minutos para eliminar la peroxidasa endógena y se incubaron a temperatura ambiente durante 60 minutos con anticuerpo m806 (4 pg/ml) o con una concentración adecuada de anticuerpos de control negativo de isotipo correspondiente (lgG2b; Chemicon, Temecula, CA). Se detectó el enlace de anticuerpo utilizando el equipo PowerVision (ImmunoVision Technologies, Brisbane, CA). Para permitir la visualización del inmunomanchado, las secciones fueron incubadas con el cromogen 3-amino-9-etilcarbazol (0.4%, Sigma Chemical Co. MO, USA) durante 10 minutos y se contramancharon con hematoxilina ayer. Se prepararon controles negativos para el procedimiento de inmunomanchado mediante omisión del anticuerpo primario. Los resultados se expresaron como un porcentaje del manchado de célula de tumor positivo.
Método de hibridación cromoaénico in situ Se seccionó tejido de tumor incrustado con parafina fijado con formalina de cada paciente en la prueba, y se montó sobre rebanadas SuperFrost® Plus, se eliminó la parafina y se rehidrato antes del tratamiento previo con el Equipo de Pre- tratamiento de Tejido SpotLight® (Zymed Laboratories Inc. Sout San Francisco, CA). Posteriormente las secciones se cubrieron con la sonda de ADN EGFR SpotLight®, se desnaturalizaron a una temperatura de 95°C durante 10 minutos y se incubaron durante la noche a una temperatura de 37°C. Después de hibridación, las rebanadas se lavaron en 0.5 X SSC. Se llevó a cabo la detección de la sonda utilizando el Equipo de Detección de Polímero SpotLight® CISH™. Las secciones que muestran conjuntos de señales o = 5 de señales individuales en >25% de células de cáncer, se consideró que tienen una amplificación del gen EGFR que se correlaciona con la reactividad m806. 2. Resultados Pacientes Ocho pacientes (1 mujer y 7 hombres; edad promedio 61 años (rango 44-75)] completó la prueba (Tabla 13). En la Tabla 13 también se muestran los sitios de tumor primario, historia de terapia previa y sitios de enfermedad a la entrada del estudio. Los 8 pacientes tuvieron positividad de antígeno 806 en tumores archivados (Tabla 13).
Todos los pacientes cumplieron con los criterios de inclusión, y excepto el paciente 8 (quien tuvo un tumor de cerebro primario) todos tuvieron enfermedad metastática a la entrada del estudio. Los sitios de enfermedad clasificados como lesiones objetivo incluyeron: pulmón (5 pacientes), cerebro (1 paciente), nodos linfáticos (1 paciente), supraglottis (1 paciente). Otros sitios de enfermedad metastática (lesiones no objetivo) incluyeron una masa supra-renal, nodos linfáticos y hueso (Tabla 13). El estatus de desempeño Karnofsky promedio fue de 90 (rango 80 100).
Tabla 13 Características de Paciente Abreviaturas: F = mujer; = hombre; NSCLC = carcinoma de pulmón de célula no pequeña; SCC = carcinoma de célula escamosa; RT = radioterapia; CT = quimioterapia; LN = nodo linfático; PD = enfermedad progresiva; SD = enfermedad estable * positivo para expresión de2-7 EGFR,† positivo para amplificación de gen EGFR Eventos adversos y HACA En las Tablas 14 y 18 se describen eventos adversos relacionados con ch806. No se observaron efectos adversos relacionados con la infusión. No hubo DLT, y por lo tanto no se alcanzó MTD. Las toxicidades principales que a la opinión del investigador fueron posiblemente atribuibles a ch806 fueron: pruritis temporal, náusea leve, fatiga/letargia y posibles efectos en niveles en suero de ALP y GGT. Se observó una elevación CTC grado 2 en el nivel GGT en Paciente 5, sin embargo esto fue en un fondo de una elevación de línea de base grado 1, y fue de naturaleza temporal. Se reportaron tres eventos adversos severos (SAEs) aunque ninguno atribuido a ch806. En general, ch806 fue seguro y bien tolerado en todos los niveles de dosis con toxicidades generalmente predecibles y manejables siendo observadas. No se llevó a cabo escalado de dosis adicional debido a la cantidad limitada de cGMP ch806 disponible para la prueba.
Se observó una respuesta inmune positiva para ch806 (con concordancia tanto de metodologías ELISA como BIAcore) únicamente en uno de los ocho pacientes (Paciente 1).
Tabla 14 Surgimiento de Eventos Adversos Relacionados con ch806 *Los números representan e número de episodio de cualquier evento en cada nivel de dosis TABLA 15 Distribución de Eventos Adversos Relacionados con el Agente de Estudio *Número de pacientes Radioetiquetado de ch806 Hubo un total de 8 infusiones de 1 1ln-ch806 administradas durante la prueba. Se midió la pureza radioquímica promedio (+. SD) y la inmunoreactividad de 111ln-ch806 para hacer de 99.3 ± 0.1% y 77.4 ± 7.0% respectivamente.
Biodistribución de ch806 El patrón inicial de biodistribución 1 ln-ch806 en pacientes en todos los niveles de dosis fue consistente con la actividad de recolección de sangre, la cual fue despejada gradualmente con el tiempo. En el período de una semana posterior a la inyección, la captación de 111ln-ch806 en hígado y bazo fue consistente con el despeje normal de metabolitos 1111 n-quelado a través del sistema reticuloendotelial. Se observó localización específica de 111ln-ch806 en lesiones objetivo (> 2cm) de todos los pacientes en todos los niveles de dosis (figura 94), incluyendo lesiones objetivo localizados en los pulmones (Pacientes 1, 3, 4, 5, y 7), el abdomen (Pacientes 1 y 2), y la región supraglótica en el lado derecho del cuello (Paciente 6). También se demostró (figura 95) la alta captación de 111ln-ch806 en tumor de cerebro (Paciente 8). De manera importante, la captación de 11 ln-ch806 en tumor no fue dependiente el nivel de expresión de antígeno 806. Por ejemplo, el Paciente 4 demostró alta captación tanto en lesiones objetivo de pulmón, a pesar de <10% de positividad mediante IHC para reactividad 806 en el tumor archivado (figura 96). Este grado de captación de 11ln-ch806 en lesiones objetivo en el Paciente 4 fue comparable con el observado en el Paciente 3, en donde del 50% al 75% de las células de tumor fueron positivas para manchado de antígeno 806 en la inmunohistoquímica de la muestra archivada (figura 96).
Farmacocinéticas En la Tabla 16 se muestran parámetros farmacocinéticos de pacientes individuales T½a y ?½ß, V1, Cmax, AUC y CL para infusión simple de 1 ln-ch806. Se aplicó la prueba de suma de clasificación Kruskal-Wailis a las vidas medias alfa y beta, V1 y despeje. No se observó diferencia significativa entre los niveles de dosis (P>0.05).
La adaptación de la curva farmacocinética a los datos ELISA de la población reunida se muestra en la figura 97. Los parámetros promedio ± SD farmacocinéticos fueron T½a 29.16 ± 21.12 horas, ?1/2ß 172.40 ± 90.85 horas, V1 2984.59 ± 91.91 mi, y CL 19.44 ± 4.05 ml/hr. En la Tabla 17 se presentan, para cada paciente, los datos de concentraciones en suero (C y Cmin) ch806 pico y de niveles más bajos medidos. Tal como se espera, se observaron relaciones lineales para Cmax y Cmin con cada nivel de dosis. Los valores promedio ± SD determinados para los datos farmacocinéticos ELISA ch806 estuvieron de acuerdo con los valores obtenidos para los datos farmacocinéticos 1 ln-ch806 (Tabla 16).
Tabla 16 Estimados de Parámetro Farmacocinéticos Promedio ± SD para 111ln-CHX-A"-DTPA-ch806 en cada Nivel de Dosis v a través de todos los Niveles de Dosis Tabla 17 Niveles ch806 en Suero Cma¾ v Cmm Determinado Mediante Análisis ELISA Dosimetría de 111ln-ch806 El despeje en todo el cuerpo fue similar en todos los pacientes en todos los niveles de dosis, con un Ti/2 biológico (promedio ± SD) de 948.6 ± 378.6 horas. Debido a la vida media física relativamente corta, el cálculo del tiempo medio biológico fue extremadamente sensible a cambios pequeños en el tiempo medio efectivo. No hubo diferencia significativa estadística en el despeje de cuerpo completo entre los niveles de dosis [prueba de suma de clasificación Kruskal-Wailis: valor-P = 0.54] (figura 98).
El despeje de 111ln-ch806 de órganos normales (hígado, pulmones, ríñones y bazos) no mostró diferencia entre los niveles de dosis, y se cálculo el T1 /2 promedio efectivo para ser de 78.3, 48.6, 69.7 y 66.2 horas respectivamente. No hubo diferencia estadísticamente significativamente en el despeje entre estos órganos normales. En particular, el despeje del hígado no mostró diferencia entre los niveles de dosis (figura 98), que indican un compartimento de antígeno saturable en el hígado para ch806.
Se completó el análisis de dosimetría de tumor en 6 pacientes. Los pacientes 1 y 2 tuvieron lesiones objetivo cercanas a la recolección de sangre cardiaca, o movimientos durante ciertas adquisiciones de imagen, que evitó el análisis preciso. La captación de pico medida de 1 1ln-ch806 ocurrió de los 5 a 7 días posteriores a la infusión, y fluctuó de 5.2-13.7 x 10"3% dosis inyectada/gm de tejido de tumor.
Evaluación de Actividad Clínica Al término de este período de estudio de un mes, se descubrió que 5 pacientes tienen enfermedad estable, y 3 pacientes enfermedad progresiva (Tabla 13). En forma interesante, un paciente (Paciente 7, 40 mg/m2 nivel de dosis) tuvo evidencia clínica de contracción temporal de un nodo linfático auricular palpable (probado como SCC metastático al momento de la aspiración con agujas finas) durante el período de estudio, lo cual sugiere una posible actividad biológica de ch806. Sin embargo, este paciente tuvo enfermedad progresiva confirmada mediante RECIST al término del estudio.
Datos Adicionales Ocho pacientes [1 mujer y 7 hombre; edad promedio de 61 años (fluctuación entre 44 y 75)] terminaron esta prueba fase I tal como se reporta (Scott y asociados, (2007) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 104, 4071-4076). Todos los pacientes cumplieron con los criterios de inclusión, y excepto el Paciente 8 (quien tuvo un tumor de cerebro primario), todos tuvieron enfermedad metastática a la entrada del estudio. Se observó en todos los pacientes captación Ab por parte del tumor, y 11ln-ch806, la versión quimerizada de mAb806, demostró una captación rápida y de alto nivel en el tumor (figura 71). El despeje de 111ln-ch806 de los órganos normales (hígado, pulmón, riñon y bazo) no mostró diferencia entre los niveles de dosis (Scott y asociados, 2007). En particular, el despeje en el hígado no mostró diferencia entre los niveles de dosis, indicando un compartimento de antígeno no saturable en el hígado para ch806. La captación de hígado total tuvo un máximo de 14.45 ± 2.43%ID inmediatamente después de la infusión, y disminuyó a 8.45 ± 1.63%ID en 72 horas, y 3.18 ± 0.87%ID en una semana posterior a la infusión. Esto es un contraste marcado con la captación de anticuerpos a wtEGFR (por ejemplo, 225), que habían mostrado alcanzar aproximadamente el 30%ID en hígado (para una dosis de 40 mg) durante 3 días posteriores a la infusión (Divgi y asociados, (1991) J. Nati. Cáncer Inst. 83, 97-104). La captación de tumor pico medida de 111ln-ch806 ocurrió de 5 a 7 días posteriores a la infusión. El cálculo de captación de tumor cuantitativa en los Pacientes 1 y 3, puede no llevarse a cabo en forma precisa debido a la proximidad de la lesión objetivo al almacén de sangre cardiaca y al movimiento del paciente. La captación pico de ch806 en tumor fluctuó de 5.21 a 13.73 x 10"3%ID/gm de tejido de tumor. El cálculo de la concentración real de ch806 en el tumor mostró valores picos de (promedio ± SD) 0.85 ± 0 pg/gm (5 mg/m2), 0.92 ± 0 pg/gm (10 mg/m2), 3.80 ± 1.10 pg/gm (20 mg/m2), y 7.05 ± 1.40 pg/gm (40 mg/m2).
Discusión Tal como se establece en este Ejemplo, este estudio representa la primera demostración reportada de la biodistribución y dirección de tumor de un anticuerpo quimérico contra un epitope expuesto únicamente en formas activadas por ligando o mutante, sobreexpresadas de EGFR. Ch806 mostró excelente dirección de sitios de tumor en todos los pacientes, sin evidencia de captación de tejido normal, y sin toxicidad significativa. Estas características in vitro e in vivo de ch806 se distinguen de todos los otros anticuerpos que se dirigen a EGFR.
En dosis de hasta 40 mg/m2, ch806 fue bien tolerado, sin DLT observado y no se alcanzó MTD. Las toxicidades principales que fueron posiblemente atribuibles a ch806, fueron pruritis, náusea leve fatiga/letargia, y posibles efectos en niveles de ALP y GGT en suero temporales.
La naturaleza avanzada de las malignidades de estos pacientes, significa que su enfermedad pudo haber sido un factor contribuyente a estos eventos adversos. De los eventos adversos que estuvieron posiblemente relacionados con el fármaco de estudio, todos fueron leves, muchos fueron autolimitantes, y ninguno requirió algún tratamiento activo. De manera importante, no se observó erupción en la piel o perturbaciones en el tracto gastrointestinal en algún paciente, incluso en el nivel de dosis más alto. La capacidad de tolerancia excelente de ch806 en este estudio de dosis simple, justifica el siguiente paso de prueba en pruebas de dosis repetitivas.
La biodistribución de ch806 en todos los pacientes mostró despeje gradual de la actividad del almacén de sangre, y una captación de tejido normal no definitiva de 111ln-ch806. La captación de tumor excelente de ch806 también fue evidente en todos los pacientes, incluyendo pulmón, nodo linfático, y metástasis suprarrenales, y en mesotelioma y glioma. Esto fue observado en todos los niveles de dosis incluyendo 5 mg/m2 (la dosis más baja estudiada), la cual es de una décima a una venteaba parte de la dosis requerida para visualizar la captación en tumor a través de otros anticuerpos para wtEGFR33. Esta diferencia en captación de wtEGFR, en comparación con anticuerpos para ch806, puede ser atribuida a su captación de tejido normal sustancial (hígado y piel) debido a que wtEGFR actúa como un sumidero de antígeno33. Además, la localización de 111ln-ch806 fue alta incluso en pacientes sin expresión de 806, se evaluó mediante inmunohistoquímica de muestras de tumor archivadas (figura 96). La captación de 111ln-ch806 en glioma fue particularmente impresionante (figura 97), y comparable con cualesquiera datos publicados en anticuerpos que se dirigen a tumor cerebral después de infusión sistémica o incluso locoregional. Estos datos soportan la selectividad única de ch806 a EGFR expresada a través de un amplio rango de tumores, y conforma la carencia de la captación de tejido normal de este anticuerpo en humanos.
Los análisis farmacocinéticos mostraron que ch806 tiene una vida media terminal de más de una semana, y sin dependencia de la dosis del despeje en suero de 111ln-ch806. Las relaciones lineales también fueron observadas para AUC, Cmax y Cmin, con niveles de dosis arriba de 10 mg/m2 lográndose a través de concentraciones en suero superiores a 1 ng/mL. Los valores V1, C1, T72a y ?72ß fueron consistentes entre niveles de dosis, y en mantenerse con anticuerpos humanos IgGI típicos (Scott y asociados, 2005; Steffens y asociados, (1997) J. Clin. Oncol, 15, 1529-1537; Scott y asociados, (2001) J. Clin. Oncol. 19(19), 3976-3987). El despeje de ch806 también fue determinado para ser más lento cuando los cálculos de ch806 ELISA fueron comparados con las medidas 1 -1ln-ch806. Aunque esta diferencia puede ser explicada a través de un pequeño número de pacientes estudiados, los puntos de tiempo de muestreo más largos para ELISA ch806, pueden soportar este valor como siendo más representativos de un despeje ch806 real. Los valores farmacocinéticos para ch806, son comparables con otros anticuerpos quiméricos reportados hasta la fecha (Steffens y asociados, 1997; Scott y asociados, 2001), y soporta un programa de dosificación semanal de ch806.
Los resultados farmacocinéticos y de dosimetría cuantitativa indican que no existe compartimento de tejido normal saturable para ch806 para niveles de dosis evaluados en esta prueba. De manera importante, la carencia de dependencia de dosificación en la farmacocinética y en el despeje en todo el cuerpo y en el hígado, tiene un contraste marcado para todos los estudios de anticuerpos reportados para wtEGFR (Baselga J. y Artega CL. (2005) J. Clin. Oncol. 23, 2445-2449, Divgi y asociados, J. Nati. Cáncer Inst. 83(2), 97-104; Baselga J (2001) Eur. J. Cáncer 37 Suppl. 4, S16-22; Gibson y asociados, (2006) Clin. Colorectal Cáncer 6(1), 29-31; Rowinsky y asociados, (2004) J. Clin. Oncol. 22, 3003-3015; Tan y asociados, (2006) Clin. Cáncer Res. 12(21), 6517-6522), que soporta la especificidad de tumor y la carencia del enlace de tejido normal de ch806 en humanos. Estas observaciones proporcionan evidencia compilada del potencial de ch806 (o formas humanizadas) para dirigir en forma selectiva EGFR en el tumor, evitar la toxicidad normal de otros anticuerpos EGFR e inhibidores de cinasa (particularmente la piel) (Lacouture AE (2006) Nature Rev. Cáncer 6, 25 803-812; Adams G.P. y Weiner L.M. (2005) Nat. Biotechnol. 23(9), 1147-1157) y lograr en forma potencial un mayor efecto terapéutico. Además, está fuertemente soportada por los datos de esta prueba, la posibilidad del suministro de carga útil (debido a la rápida internalización de mAb 806 en células de tumor), y el tratamiento de combinación con otros biológicos tales como anticuerpos EGFR e inhibidores de cinasa de tirosina cuando es probable que se minimice la toxicidad combinada. Este estudio proporciona una evidencia clara de la capacidad para dirigir un epítope en EGFR que es específico del tumor, y el desarrollo clínico adicional de este método único para terapia de cáncer que está en curso.
Ejemplo 26 Comparaciones de Secuencia Las CDRs de cadena VH y cadena VL, para cada de mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133, y hu806 se establece y compara en la presente invención.
Tabla 13 Isotipo de Anticuerpo de Múrido y Comparaciones de Secuencia CDR (Kabat)1 A. Cadena Ligera Variable B. Cadena Pesada Variable Las diferencias para las secuencias CDR mAb806 están subrayadas Las CDRs proporcionadas anteriormente para los isotipos de anticuerpo respectivos están basadas en un análisis de Kabat. Tal como lo podrán apreciar los expertos en la técnica, las CDRs también pueden ser definidas con base en otros análisis, por ejemplo un compuesto de las definiciones de Kabat y Chotia. Por ejemplo, al aplicar un análisis compuesto de Kabat y Chotia a los isotipos anteriores, las secuencias de las CDRs de cadena VL y las CDRs de cadena VH para sus isotipos respectivos son tal como se establece en la Tabla 14.
Tabla 14 Isotipo de Anticuerpo de Múrido v Comparaciones de Secuencia CDR (Kabat v Chotia Compuesto)1 A. Cadena Ligera Variable B. Cadena Pesada Variable 1Las diferencias para las secuencias CDR mAb806 están subrayadas 2Ver la figura 17 de la Solicitud de Patente Norteamericana también pendiente no. 10/145,598 (Patente Norteamericana No. 7,589,180) 3Ver la figura 16 de la Solicitud de Patente Norteamericana también pendiente no. 10/145,598 (Patente Norteamericana No. 7,589,180).
Tabla 15 Comparaciones de Secuencias CDR mAb806 v hu806 (Kabat)1 A. Cadena Ligera Variable B. Cadena Pesada Variable 1Las diferencias para las secuencias CDR mAb806 están subrayadas.
Tal como se muestra anteriormente, las secuencias CDR de los isotipos mAb806, mAb175, mAb124 y mAb1133 son idénticas excepto para cambios en aminoácido altamente conservadores que puede esperarse que den surgimiento a un pliegue de proteína homólogo para reconocimiento de epítope. Estos datos en forma acumulativa con los datos de enlace y otros datos proporcionados en los Ejemplos anteriores, muestra que estos isotipos y el hu806 son variantes de miembros de la familia cercanamente relacionadas que exhiben las mismas propiedades únicas descritas anteriormente para mAb806 (por ejemplo, enlace a un epítope en la EGFR que es accesible para enlazar únicamente en formas activadas por ligando o mutadas, sobreexpresadas del EGFR, dando como resultado una especificidad única para EGFR, expresado por tumor, pero no wtEGFR en tejido normal) y que demuestra que los anticuerpos de secuencias de región variable distintas, particularmente en secuencias CDR variantes, tienen las mismas características y capacidades de enlace.
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La presente invención puede representarse en otras formas o llevarse a cabo de otra manera sin apartarse del espíritu o características esenciales de la misma. La presente descripción por consiguiente será considerada en todos los aspectos como ilustrativo y no descriptiva, estando indicado el alcance de la presente invención a través de las reivindicaciones adjuntas, y todos los cambios que estén dentro el significado y rango de equivalencia están proyectados para estar comprendidos dentro de las mismas.
Se mencionan diversas referencias a lo largo de la especificación y se proporcionan en la lista de referencias anteriores, cada una de las cuales está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

Claims (86)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde células de los tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan una versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo no enlaza al péptido de unión de2-7 EGFR que consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:13, en donde el anticuerpo enlaza a un epítope dentro de la secuencia de los residuos 287 a 302 (SEC ID NO:14) del EGFR tipo silvestre humano, y en donde el anticuerpo no comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:2 y no comprende secuencia de región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO:4.
2. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:42, y la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:47.
3. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, teniendo la cadena pesada la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:129, y teniendo la cadena ligera la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:134.
4. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, teniendo la cadena pesada la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:22, y teniendo la cadena ligera la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:27.
5. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, teniendo la cadena pesada la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:32, y teniendo la cadena ligera la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:37.
6. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de cadena pesada comprende regiones de dominio que enlazan a un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácido altamente homologas a las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEC ID NOS.44, 45, y 46.
7. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de cadena ligera comprende regiones de dominio que enlazan a un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácido altamente homologas a las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEC ID NOS:49, 50, y 51.
8. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de cadena pesada comprende regiones de dominio que enlazan a un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácido altamente homologas a las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEC ID NOS:130, 131, y 132.
9. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de cadena ligera comprende regiones de dominio que enlazan a un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácido altamente homologas a las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEC ID NOS:135, 136, y 137.
10. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de cadena pesada comprende regiones de dominio que enlazan a un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácido altamente homologas a las secuencias de aminoácidos establecida en las SEC ID NOS:23, 24, y 25.
11. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de cadena ligera comprende regiones de dominio que enlazan a un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácido altamente homologas a las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEC ID NOS:28, 29, y 30.
12. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de cadena pesada comprende regiones de dominio que enlazan a un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácido altamente homologas a las secuencias de aminoácidos establecida en las SEC ID NOS:33, 34, y 35.
13. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de cadena ligera comprende regiones de dominio que enlazan a un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácido altamente homologas a las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEC ID NOS:38, 39, y 40.
14. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anricuerpo aislado es la forma de un anticuerpo F(ab')2, fragmento scFv, diacuerpo, triacuerpo o tetracuerpo.
15. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque que comprende además una etiqueta detectable o funcional.
16. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 15, caracterizado porque la etiqueta detectable funcional es un fármaco adherido en forma covalente.
17. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 15, caracterizado porque la etiqueta es una radioetiqueta.
18. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo aislado es pegilado.
19. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1.
20. Un método para preparar un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque expresa un ácido nucleico bajo condiciones que proporcionan la expresión del anticuerpo, y recuperan el anticuerpo.
21. Un método de tratamiento de un tumor en un paciente humano, en donde el método comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1.
22. Un equipo para el diagnóstico de un tumor en donde EGFR se expresa en forma aberrante o EGFR se expresa en la forma de una proteína truncada, en donde el equipo comprende un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1.
23. Un equipo para el diagnóstico de un tumor en donde EGFR se expresa en forma aberrante o EGFR se expresa en la forma de una proteína truncada tal como se describe en la reivindicación 22, caracterizado porque comprende reactivos y/o instrucciones de uso.
24. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1.
25. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 24, caracterizada porque comprende un vehículo, transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
26. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 24, caracterizada porque comprende un agente anti-cáncer seleccionado del grupo que consiste en agentes quimioterapéuticos, anticuerpos anti-EGFR, agentes radioinmunoterapéuticos, y combinaciones de los mismos.
27. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 26, caracterizada porque los agentes quimioterapéuticos se seleccionan del grupo que consiste en inhibidores de cinasa de tirosina, inhibidores de cascada de fosforilación, moduladores post-traducción , inhibidores de crecimiento o división celular (por ejemplo, anti-mitóticos), inhibidores de transducción de señal, y combinaciones de los mismos.
28. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 27, caracterizada porque los inhibidores de cinasa de tirosina se seleccionan del grupo que consiste en AG1478, ZD1839, STI571, OSI-774, SU-6668, y combinaciones de los mismos.
29. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 26, caracterizada porque los anticuerpos anti-EGFR se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpos anti-EGFR 528,225, SC-03, DR8.3, L8A4, Y10, ICR62, ABX-EGF, y combinaciones de los mismos.
30. Un método para prevenir y/o tratar cáncer en mamíferos, en donde el método comprende administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 24.
31. Un método para el tratamiento de cánceres que residen en el cerebro que producen EGFR expresados en forma aberrante en mamíferos, en donde el método comprende administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 24.
32. Un método para el tratamiento de cánceres que residen en el cerebro que producen EGFR expresados en forma aberrante en mamíferos tal como se describe en la reivindicación 30, caracterizado porque los cánceres que residen en el cerebro se seleccionan del grupo que consiste en glioblastomas, meduloblastomas, meningiomas, astrocitomas neoplásicos y mal formaciones arteriovenosas neoplásicas.
33. Un receptor unicelular transformado con una molécula de ADN recombinante que codifica un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1.
34. Un receptor unicelular transformado con una molécula de ADN recombinante que codifica un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el receptor unicelular se selecciona del grupo que consiste en E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, levadura, células CHO, YB/20, NSO, SP2/0, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, y B T10, células de plantas, células de insectos, y células de humanos en cultivo de tejido.
35. Un método para detectar la presencia de EGFR amplificado, de2-7EGFR o EGFR con glucosilación con alto contenido de mañosa, en donde el EGFR es medido mediante: (a) contactar una muestra biológica del mamífero en donde la presencia del EGFR amplificado, de2-7EGFR o EGFR con glucosilación con alto contenido de mañosa, es sospechada con un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 1, bajo condiciones que permiten que ocurra el enlace del EGFR al anticuerpo aislado; y (b) detectar si ha ocurrido un enlace entre el EGFR de la muestra y el anticuerpo aislado; en donde la detección del enlace indica la presencia o actividad del EGFR en la muestra.
36. Un método por detectar cáncer en mamíferos, en donde el método comprende detectar la presencia o actividad de un EGFR tal como se describe en el método de la reivindicación 35, en donde la detección de la presencia de EGFR, indica la existencia de un tumor o cáncer en el mamífero.
37. Un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de los tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, teniendo la cadena pesada una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:42, y teniendo la cadena ligera una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácido tal como se establece en la SEQ ID NO:47.
38. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 37, caracterizado porque la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:42, y en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en SEC ID NO:47.
39. Un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de los tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena pesada comprende regiones de dominio de enlace de polipéptido que tienen secuencias de aminoácido altamente homologas con las secuencias de aminoácido establecidas en la SEC ID NOS:44, 45, y 46, y en donde la región variable de la cadena ligera comprende regiones de dominio de enlace de polipéptido que tienen secuencias de aminoácido altamente homologas con las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEC ID NOS:49, 50, y 51.
40. Un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de los tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, teniendo la cadena pesada una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:129, y teniendo la cadena ligera secuencia de aminoácido que es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:134.
41. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 40, caracterizado porque la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:129, y en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:134.
42. Un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de los tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena pesada comprende regiones de dominio de enlace de polipéptido que tienen secuencias de aminoácido altamente homologas con las secuencias de aminoácido establecidas en la SEC ID NOS:130, 131, y 132, y en donde la región variable de la cadena ligera comprende regiones de dominio de enlace de polipéptido que tienen secuencias de aminoácido altamente homologas a las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEC ID NOS:135, 136, y 137.
43. Un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de los tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende unacadena pesada y una cadena ligera, teniendo la cadena pesada una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:22, y teniendo la cadena ligera una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:27.
44. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 43, caracterizado porque la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:22, y en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:27.
45. Un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de los tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena pesada comprende regiones de dominio de enlace de polipéptido que tienen secuencias de aminoácido altamente homologas con las secuencias de aminoácido establecidas en la SEC ID NOS:23, 24 y 25, y en donde la región variable de la cadena ligera comprende regiones de dominio de enlace de polipéptido que tienen secuencias de aminoácido altamente homologas con las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEC ID NOS:28, 29, y 30.
46. Un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de los tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, teniendo la cadena pesada una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:32, y teniendo la cadena ligera una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:37.
47. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 46, caracterizado porque la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:32, y en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO:37.
48. Un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de los tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena pesada comprende regiones de dominio de enlace de polipéptido que tienen secuencias de aminoácido altamente homologas con las secuencias de aminoácido establecidas en la SEC ID NOS:33, 34, y 35, y en donde la región variable de la cadena ligera comprende regiones de dominio de enlace de polipéptido que tienen secuencias de aminoácido altamente homologas a las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEC ID NOS:38, 39, y 40.
49. Un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de los tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, caracterizado porque el anticuerpo no enlaza el péptido de unión de2-7 EGFR que consiste en la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO:13, en donde el anticuerpo enlaza a un epítope dentro de la secuencias de residuos 287 a 302 (SEC ID NO:14) de un EGFR tipo silvestre humano, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en donde la región variable de la cadena ligera comprende una primera región de dominio de enlace de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a la secuencia de aminoácido establecida en la fórmula I : HSSQDIXaa1SNIG (I), en donde Xaai es un residuo de aminoácido que tiene un grupo R polar no cargado; una segunda región de dominio de enlace de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a la secuencia de aminoácido establecida en la fórmula II: HGTNLXaa2D (II), en donde Xaa2 es un residuo de aminoácido que tiene un grupo R polar cargado; y una tercera región de dominio de enlace de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a la secuencia de aminoácido establecida en la fórmula III: VQYXaa3QFPWT (III), en donde Xaa3 se selecciona del grupo que consiste en A, G, y un residuo de aminoácido que es sustituido en forma conservadora por A o G; y en donde la región variable de la cadena pesada comprende una primera región de dominio de enlace de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a la secuencia de aminoácido establecida en la fórmula IV: SDXaa4AWN (IV), en donde Xaa4 se selecciona del grupo que consiste en F, Y, y un residuo de aminoácido que es sustituido en forma conservadora por F o Y; una segunda región de dominio de enlace de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a la secuencia de aminoácido establecida en la fórmula V, fórmula VI, o fórmula VII: YISYSGNTRYXaa5PSLKS (V), en donde Xaa5 es un residuo de aminoácido que tiene un grupo R polar no cargado, YISYSXaa6NTRYNPSLKS (VI), en donde Xaae se selecciona del grupo que consiste en G, A, y un residuo de aminoácido el cual es sustituido en forma conservadora por G o A, YISYSGNTRYNPSLXaa7S (VII), y Xaa7 es un residuo de aminoácido básico; y una tercera región de dominio de enlace de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a la secuencia de aminoácido establecida en la fórmula VIII: Xaa8TAGRGFPY (VIII), en donde Xaa8 se selecciona del grupo que consiste en V, A, y un residuo de aminoácido que es sustituido en forma conservadora por V o A, y en donde el anticuerpo no comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO: 2 y no comprende una secuencia de región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácido establecida en la SEC ID NO: 4.
50. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque Xaai es N; Xaa2 es D; Xaa3 es A; Xaa es F; Xaa5 es un residuo de aminoácido que tiene un grupo R polar no cargado; Xaa6 es G; Xaa7 es K; y Xaa8 es V.
51. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 50, caracterizado porque Xaa5 es N o Q.
52. Un anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque Xaai es N o S.
53. Un anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque Xaa2 es D o E.
54. Un anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque Xaa3 es A o G.
55. Un anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque Xaa es F o Y.
56. Un anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque Xaa5 es N o Q.
57. Un anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque Xaa6 es G o A, y Xaa7 es independientemente K o R.
58. Un anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque Xaae es V o A.
59. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque el anticuerpo aislado es la forma de un anticuerpo F(ab')2, un fragmento scFv, un diacuerpo, un triacuerpo o un tetracuerpo.
60. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque comprende además una etiqueta detectable o funcional.
61. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 60, caracterizado porque la etiqueta detectable o funcional es un fármaco adherido en forma covalente.
62. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 60, caracterizado porque la etiqueta es una radioetiqueta.
63. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque el anticuerpo aislado es pegilado.
64. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 49.
65. Un método para preparar un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque comprende expresar un ácido nucleico bajo condiciones que proporcionan la expresión del anticuerpo, y la recuperación del anticuerpo.
66. Un método para el tratamiento de un tumor en un paciente humano, en donde el método comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 49.
67. Un equipo para el diagnóstico de un tumor en donde EGFR se expresa en forma aberrante o EGFR se expresa en la forma de una proteína truncada, en donde el equipo comprende un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 49.
68. Un equipo para el diagnóstico de un tumor en donde EGFR se expresa en forma aberrante o EGFR se expresa en la forma de una proteína truncada tal como se describe en la reivindicación 67, caracterizado porque comprende reactivos y/o instrucciones de uso.
69. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 49.
70. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 69, caracterizado porque comprende un vehículo, transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
71. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 69, caracterizada porque comprende un agente anti-cáncer seleccionado del grupo que consiste en agentes quimioterapéuticos, anticuerpos anti-EGFR, agentes radioinmunoterapéuticos y combinaciones de los mismos.
72. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 71, caracterizada porque los agentes quimioterapéuticos son seleccionados del grupo que consiste en inhibidores de cinasa de tirosina, inhibidores de cascada de fosforilación, moduladores post-traducción, inhibidores de crecimiento o división celular (por ejemplo, anti-mitóticos), inhibidores de transducción de señal y combinaciones de los mismos.
73. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 72, caracterizada porque los inhibidores de cinasa de tirosina se seleccionan del grupo que consiste en AG1478, ZD1839, STI571, OSI-774, SU-6668, y combinaciones de los mismos.
74. Una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 71, caracterizado porque los anticuerpos anti-EGFR se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpos anti-EGFR 528, 225, SC-03, DR8.3, L8A4, Y10, ICR62, ABX-EGF, y combinaciones de los mismos.
75. Un método para prevenir y/o tratar cáncer en mamíferos, en donde el método comprende administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 69.
76. Un método para el tratamiento de cánceres que residen en el cerebro que producen EGFR expresado en forma aberrante en mamíferos, en donde el método comprende administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica tal como se describe en la reivindicación 69.
77. Un método para el tratamiento de cánceres que residen en el cerebro que producen EGFR expresado en forma aberrante en mamíferos tal como se describe en la reivindicación 76, caracterizado porque los cánceres que residen en el cerebro se seleccionan del grupo que consiste en glioblastomas, meduloblastomas, meningiomas, astrocitomas neoplásicos o malformaciones arteriovenosas neoplásicas.
78. Un huésped unicelular transformado con una molécula de ADN recombinante, que codifica un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 49.
79. Un receptor unicelular transformado con una molécula de ADN recombinante que codifica un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 49, caracterizado porque el huésped unicelular se selecciona del grupo que consiste en E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, levaduras, células CHO, YB/20, NSO, SP2/0, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 y B T10, células de plantas, células de insectos y células de humanos en cultivo de tejido.
80. Un método para detectar la presencia de EGFR amplificado, de2-7EGFR o EGFR, con glucosilación con alto contenido de mañosa en donde el EGFR se mide mediante: (a) contactar una muestra biológica de un mamífero en donde la presencia del EGFR amplificado, de2-7EGFR o EGFR con glucosilación de alto contenido de mañosa es sospechada con un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 49 bajo condiciones que permiten que ocurra el enlace del EGFR al anticuerpo aislado; y (b) detectar si ha ocurrido el enlace entre el EGFR de la muestra y el anticuerpo aislado; en donde la detección del enlace indica la presencia o actividad del EGFR en la muestra.
81. Un método para detectar cáncer en mamíferos, en donde el método comprende detectar la presencia o actividad de un EGFR tal como se describe en el método de la reivindicación 80, caracterizado porque la detección de la presencia de EGFR indica la existencia de un tumor o cáncer en el mamífero.
82. Un anticuerpo aislado con la capacidad de enlazar EGFR en tumores que contienen amplificaciones del gen EGFR, en donde las células de los tumores contienen múltiples copias del gen EGFR, y en tumores que expresan la versión truncada del receptor EGFR de2-7, en donde el anticuerpo no enlaza al péptido de unión EGFR de2-7 que consiste en la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 13, en donde el anticuerpo enlaza a un epítope dentro de la secuencia de los residuos 273 a 501 del EGFR tipo silvestre humano, en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en donde la región variable de cadena ligera comprende la primer región de dominio de enlace de polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido HSSQDINSNIG (SEC ID NO: 18); una segunda región de dominio de enlace de polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido HGTNLDD (SEC ID NO: 19); y una tercera región de dominio de enlace de polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido VQYAQFPWT (SEC ID NO: 20), en donde la región variable de la cadena pesada comprende una primera región de dominio de enlace de polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido SDFAWN (SEC ID NO: 15); una segunda región de dominio de enlace de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a la secuencia de aminoácido establecida en la fórmula IX: YISYSGNTRYXaa9PSLKS (IX), en donde Xaag es un residuo de aminoácido que tiene un grupo R polar no cargado; y una tercera región de dominio de enlace de polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido VTAGRGFPY (SEC ID NO: 17).
83. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 82, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a un epítope dentro de la secuencia de los residuos 287 a 302 (SEC ID NO: 14) de un EGFR tipo silvestre humano.
84. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 82, caracterizado porque Xaa9 es N o Q.
85. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 82, caracterizado porque las regiones de dominio de enlace son proporcionadas por una estructura de anticuerpo humano.
86. Un anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 85, caracterizado porque la estructura de anticuerpo humano es una estructura de anticuerpo lgG1 humano.
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