JPWO2003101491A1 - Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現又は活性化対象に用いる予防又は／及び治療剤 - Google Patents
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Abstract
Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現又は活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して投与するためのＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤、及び、かかる阻害剤を含有する医薬組成物。
Description
技術分野
本発明は、被検対象に対してＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性化診断を行い、それらの発現が確認された被検対象を治療の対象とする一連の治療方法に使用する薬剤に関する。
背景技術
従来、抗癌剤の標的分子はＤＮＡやＲＮＡの合成に関与する分子そして細胞分裂に関与する分子が主であった。これらの抗癌剤は、標的分子が癌細胞特異的ではないため、骨髄毒性などの重篤な副作用を引き起こすことが知られている。
近年、分子腫瘍学の発展により癌の発生は癌遺伝子、癌抑制遺伝子の異常によって引き起こされることが明らかになった。最もよく知られた癌遺伝子として上皮増殖因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下ＥＧＦＲと略す。）とその類縁のｈｕｍａｎ ＥＧＦＲ ｔｙｐｅ２（以下Ｈｅｒ２と略す。別名ｅｒｂＢ−２とも呼ぶ。）が挙げられる。
ＥＧＦＲとＨｅｒ２はそれぞれ分子量１７０ｋＤ、１８５ｋＤの膜貫通型糖蛋白質である。ＥＧＦＲとＨｅｒ２の細胞内ドメインにはチロシンキナーゼドメインが存在し、リン酸化反応を通して信号を核へ伝えている。互いのキナーゼドメインのアミノ酸配列は約８０％の相同性を持ち構造的によく似ているが、Ｃ末端にある自己リン酸化ドメインの相同性は約３０％と低く両レセプターの信号伝達機構に質的違いがあることが推察される。
ＥＧＦＲは食道癌に８９％と極めて高い頻度で発現している［Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９３ １１９，４０１−４０７］。一方、その他の癌種では非小細胞肺癌の４５％にＥＧＦＲの過剰発現［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９３ ５３，２３７９−２３８５］、グリオブラストーマの５０％にＥＧＦＲの遺伝子増幅［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００ ６０，１３８３−１３８７］などの報告がある。
Ｈｅｒ２に関しては乳癌の３９％に遺伝子増幅［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９３ １１，１９３６−１９４２］、卵巣癌の３２％に過剰発現［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０ ５０，４０８７−４０９１］、ホルモン抵抗性前立腺癌の６７％に過剰発現［Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１ ７，２６４３−２６４７］などの報告がある。
ＥＧＦＲやＨｅｒ２は様々な臓器癌に過剰発現しているが、これらによる癌化の分子機構の実態はリン酸化反応を介した信号伝達であり、ＥＧＦＲやＨｅｒ２の発現量の程度と独立にこの信号伝達機能が過剰に活性化することによっても臨床的に癌の進行を悪化させることがある。したがって、標的の発現が癌種によって異なる以上、これらを標的とする治療は当然ながら個別の治療を必要とする。そして癌の性質を診断し標的分子の発現や活性化の有無に合わせて薬剤を選択すべきである。これにより効果的かつ合理的な治療が達成できる。
ＥＧＦＲとＨｅｒ２は互いにヘテロ複合体を形成し機能的な相互作用が見られる［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００１ １９（１８ｓ），３２ｓ−４０ｓ］。そして、ＥＧＦＲとＨｅｒ２の共発現によりＥＧＦＲ単独による癌化がさらに加速されることが知られている［Ｃｅｌｌ １９８７ ５８，２８７−２９２］。また、乳癌、口腔癌、肺癌等においてＥＧＦＲとＨｅｒ２の共発現があると予後不良になるとの報告もある［Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９ ５，４１６４−４１７４］。
したがって、ＥＧＦＲとＨｅｒ２両方を阻害する薬剤（以下、単にデュアル阻害剤とも称す。）はどちらか一方にしか作用しない薬剤に比べて適応疾患が広がる有利性があるのみならず、デュアル阻害の相乗作用によって共発現癌に対して効果的な治療を期待できる点でも優れている。
ＥＧＦＲとＨｅｒ２の診断技術は既に広く知られている。そしてＥＧＦＲに結合する抗体に蛍光色素をコンジュゲイトさせて口腔癌の前癌病変を早期に検出する試みも最近報告された［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１ ６１，４４９０−４４９６］。一方、乳癌患者のＨｅｒ２発現の有無によりアントラサイクリン系抗癌剤の抗腫瘍効果が予測できることを示唆する報告も出てきた［Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１ ７，１５７７−１５８１］。したがって、ＥＧＦＲやＨｅｒ２の診断は病気を早期発見する役割と個々の患者に有効で適切な薬剤を選択するために有益となる可能性がある。
ＥＧＦＲ阻害剤としては中和抗体とチロシンキナーゼ阻害剤が抗癌剤の臨床開発段階にある。Ｈｅｒ２阻害剤では中和抗体ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ：商品名、Ｒｏｃｈｅ社）が転移性乳癌に対する治療剤として既に各国で上市されているが、チロシンキナーゼ阻害剤は抗癌剤の臨床開発段階にある。
同様にＥＧＦＲとＨｅｒ２のデュアル阻害剤も研究開発されているがまだ実用化には至っていない。
抗Ｈｅｒ２抗体ハーセプチンはＨｅｒ２の発現診断ハーセプテスト（Ｈｅｒｃｅｐｔｅｓｔ：商品名）で治療対象患者の選別を既に行っているが、適応癌種は乳癌に限定されている。
ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ：商品名、Ａ．Ｚｅｎｅｃａ社）には従来の抗癌剤が持つ骨髄毒性などの重篤な副作用がないこと、そして、非小細胞肺癌に有効であることが臨床試験で示されてきた［Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１ ７，３７８０ｓ］。しかし、イレッサの臨床試験では治験対象患者の選択のためにＥＧＦＲ発現を事前に確認する作業は行われていない。
ＥＧＦＲとＨｅｒ２のデュアル阻害剤は、いずれかの標的分子が発現している癌であれば適応範囲とする事ができるため、幅広い臓器癌を対象とする。しかし、既に記述したように、より正確には標的蛋白の発現又は活性化を診断することにより治療対象患者を適切に選別した上での処方が望ましく、デュアル阻害剤によるこの一連の治療法は医療現場において未だ確立されたものではない。
癌組織中の標的分子の発現と抗癌剤の感受性に関する別の例としては、乳癌組織中のチミジル酸合成酵素（Ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＴＳ）発現量及びジヒドロピリミジン脱水素酵素（Ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）活性値と５ＦＵ感受性は関連があるとの報告がある［日本癌治療学会誌２０００ ３５，３４０］。しかし、実際に治療法として５ＦＵ処方前にＴＳ発現診断を行うには至っていない。
上記のように、抗癌剤の処方にあたり、薬剤の標的分子を診断して効果的な治療法を予測することが切望されている。
発明の開示
本発明者らは、前述の事情に鑑み上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、被検対象に対してＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性診断を行い、それらの発現又は活性が確認された被検対象に対してＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤を投与することにより、一連の治療法を確立し得ることを見出すに至った。
すなわち、本発明は、このような一連の治療法において投与されるＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤、該阻害剤を有効成分とする医薬組成物、該阻害剤を被検対象に投与することを特徴とする予防又は／及び治療方法関し、さらに詳細には以下のとおりである。
本発明は、
（１）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現又は活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現又は活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して投与するためのＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤、
（２）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが活性化していると判断された被検対象に対して投与するための前記（１）に記載の阻害剤。
（３）Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲ発現又は活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２及びＥＧＦＲ発現又は活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して投与されるＨｅｒ２及びＥＧＦＲ阻害剤である前記（１）に記載の阻害剤、
（４）Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲの活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２及びＥＧＦＲの活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲが活性化していると判断された被検対象に対して投与するための前記（３）に記載の阻害剤。
（５）被検対象が、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患を患っていると予想されるものである前記（１）に記載の阻害剤、
（６）被検対象が、Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患を患っていると予想されるものである前記（３）に記載の阻害剤、
（７）被検対象がヒトである、前記（１）から（６）のいずれか１に記載の阻害剤、
（８）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現又は活性を検出するための検査が体外検査である前記（１）に記載の阻害剤、
（９）Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲ発現又は活性を検出するための検査が体外検査である前記（３）に記載の阻害剤、
（１０）Ｈｅｒ２阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤からなる合剤である前記（３）に記載の阻害剤、
（１１）Ｈｅｒ２阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤を同時に、別々に、又は経時的に間隔を置いて投与するための前記（３）に記載の阻害剤、
（１２）体外検査が、抗体を用いた免疫学的方法又は核酸及び核酸誘導体を用いたハイブリダイゼーション法である前記（８）又は（９）に記載の阻害剤、
（１３）抗体を用いた免疫学的方法が、固相酵素免疫検定法、酵素−結合免疫アッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、免疫組織化学的方法、及びウエスタンブロット法からなる群より選ばれる方法である前記（１２）に記載の阻害剤、
（１４）核酸及び核酸誘導体を用いたハイブリダイゼーション法が、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＳＨ法、ＦＩＳＨ法、ノーザンブロット法、及びサザンブロット法からなる群より選ばれる方法である前記（１２）に記載の阻害剤、
（１５）下記一般式（Ｉ）
｛式中、ＸはＮ又はＣＨであり；ＹがＣＲ１であって、ＶがＮであるか；又はＹがＮであって、ＶがＣＲ１であるか；又はＹがＣＲ１であって、ＶがＣＲ２であるか；又はＹがＣＲ２であって、ＶがＣＲ１であり；Ｒ１はＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ＣＨ３ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２−Ａｒ−（ここで、Ａｒはフェニル、フラン、チオフェン、ピロール及びチアゾールから選択され、その各々は所望により１もしくは２個のハロゲン、Ｃ１−４アルキル又はＣ１−４アルコキシで置換されていてもよい。）又は−Ｃ≡Ｃ−Ｃ（Ｒ６）（Ｒ７）（Ｒ８）（ここで、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル又はＣ１−４アルコキシ、又は、環が水素原子又はＣ１−４アルキルで置換されていてもよく、環内にＯ、Ｓ又はＮから選ばれる１から２個のヘテロ原子を含んでいてもよいＣ３−６のシクロアルキルを表す。）を表し；Ｒ２は水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルアミノ、ジ［Ｃ１−４アルキル］アミノ及び−ＮＨＣＯ−Ｒ９（ここで、Ｒ９はＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ２−４アルケニル又はＣ２−４アルキニルを示す。）からなる群から選択され；ＵはＲ３基で置換され、かつさらに所望により独立に選択される少なくとも１個のＲ４基で置換されていてもよいフェニル、ピリジル、３Ｈ−イミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、１Ｈ−インダゾリル、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インダゾリル、１Ｈ−ベンズイミダゾリル、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンズイミダゾリル又は１Ｈ−ベンゾトリアゾリル基を表し；Ｒ３はベンジル、ハロ−、ジハロ−及びトリハロベンジル、ベンゾイル、ピリジルメチル、ピリジルメトキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、ハロ−、ジハロ−及びトリハロベンジルオキシならびにベンゼンスルホニルからなる群から選択されるか；又はＲ３はトリハロメチルベンジル又はトリハロメチルベンジルオキシを表すか；又はＲ３は上記式（ａ）の基を表し（式中、Ｒ５は各々独立にハロゲン、Ｃ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシから選択され；かつ、ｎは０〜３である）；Ｒ４は各々独立にヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルキニル、Ｃ１−４アルコキシ、アミノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、ジ［Ｃ１−４アルキル］アミノ、Ｃ１−４アルキルチオ、Ｃ１−４アルキルスルフィニル、Ｃ１−４アルキルスルホニル、Ｃ１−４アルキルカルボニル、カルボキシ、カルバモイル、Ｃ１−４アルコキシカルボニル、Ｃ１−４アルカノイルアミノ、Ｎ−（Ｃ１−４アルキル）カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−４アルキル）カルバモイル、シアノ、ニトロ及びトリフルオロメチルである。｝で示される置換ヘテロ芳香族化合物、もしくはその薬学的に許容される塩、それらの水和物もしくは溶媒和物、それらの光学活性体もしくはラセミ体、又は、それらのジアステレオマー混合物である前記（１）又はから（１４）のいずれか１に記載の阻害剤、
（１６）（４−（３−フルオロベンジルオキシ）−フェニル）−（６−（５−（（２−メタンスルホニル−エチルアミノ）メチル）−フラン−２−イル）−ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イル）−アミン；
（４−ベンジルオキシフェニル）−（６−（５−（（２−メタンスルホニル−エチルアミノ）−メチル）−フラン−２−イル）−キナゾリン−４−イル）−アミン；
Ｎ−｛４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−［４−（ベンジルオキシ）フェニル］−７−メトキシ−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−７−メトキシ−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−｛３−フルオロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−［１−（３−フルオロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル］−６−［２−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−４−キナゾリンアミン；
６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−Ｎ−［４−（フェニルスルホニル）フェニル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−｛３−フルオロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［２−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−６−［２−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−ベンジルオキシフェニル）−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−４−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（３−クロロ−４−ベンジルオキシフェニル）−６−［２−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−４−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−｛３−クロロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−７−フルオロ−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（３−トリフルオロメチル−４−ベンジルオキシフェニル）−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−４−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］キナゾリン−６−イル］アクリルアミド；
Ｎ−｛４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−メチル−３−（４−メチル−１−ピペラジニル）−１−ブチニル］−６−キナゾリニル｝アクリルアミド；又は
Ｎ−｛３−クロロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メタンスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミンもしくはその薬学的に許容される塩、それらの水和物もしくは溶媒和物、それらの光学活性体もしくはラセミ体、又は、それらのジアステレオマー混合物である前記（１）から（１５）のいずれか１に記載の阻害剤、
（１７）Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］キナゾリン−６−イル］アクリルアミド、又はＮ−｛３−クロロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メタンスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミンもしくはその薬学的に許容される塩、それらの水和物もしくは溶媒和物、それらの光学活性体もしくはラセミ体又はそれらのジアステレオマー混合物である前記（１）から（１６）のいずれか１に記載の阻害剤、
（１８）前記（１）から（１７）のいずれか１に記載の阻害剤を有効成分として含有し、かつ製薬上許容され得る担体を含有する医薬組成物、
（１９）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は／及び治療薬である前記（１８）に記載の医薬組成物、
（２０）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である前記（１９）に記載の医薬組成物、
（２１）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現又は活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現又は活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して投与するための、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は／及び治療薬、
（２２）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である前記（２１）に記載の予防又は／及び治療薬、
（２３）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現又は活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現又は活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して有効量のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤を投与することを特徴とする、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は／及び治療方法、
（２４）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である前記（２３）に記載の予防又は／及び治療方法、
（２５）前記（１８）から（２０）のいずれか１に記載の医薬組成物、及び該医薬組成物をＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は／及び治療に使用し得るか又は使用すべきであることを記載した書類とを含む商業的パッケージ、
（２６）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である前記（２５）に記載の商業的パッケージ、に関する。
本発明における各定義は次の通りである。
「Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現を検出するための検査」としては、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲに対する抗体を用いた免疫学的方法、又は、核酸及び核酸誘導体を用いたハイブリダイゼーション法が挙げられ、免疫学的方法のより好ましい具体例としては、固相酵素免疫検定法、酵素−結合免疫アッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、免疫組織化学的方法、又はウエスタンブロット法等が挙げられ、ハイブリダイゼーション法のより好ましい具体例としては、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＳＨ法、ＦＩＳＨ法、ノーザンブロット法、又はサザンブロット法等が挙げられる。
「固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ＝ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ ｓｏｌｖｅｎｔ ａｓｓａｙ）」とは、固相で行う酵素−結合免疫アッセイ法（ＥＩＡ）であり、抗原または抗体に共有結合で酵素を標識し、抗体または抗原の存在を、酵素活性を利用して検出する酵素−結合免疫アッセイ法を固相で行なう方法である。この方法は１９７１年 Ｅ．Ｅｎｇｖａｌらによって開発されたラジオイムノアッセイ（放射性免疫測定法：ＲＩＡ）の抗原、抗体のいずれかに標識する放射性同位体を非放射性の酵素に置き換えたもので、１９９０年にゼプトモル（ｚｅｐｔｏｍｏｌｅ：１０−２１モル）レベルの抗原の測定も可能な方法として開発された。
ＥＬＩＳＡ法には直接抗体法、間接抗体法、競合法、二抗体サンドイッチ法などがあり、測定目的にあった方法が選択される。固相にはアガロース、マイクロタイターウェル、ラテックス粒子などが利用され、標識酵素には、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが最もよく利用される。その他の酵素としては、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ等も使われる。
なお、本発明においては、免疫組織化学的方法も適用可能である。
「ウエスタンブロット法」とは、ＰＶＤＦ膜などのメンブランに転写された蛋白質を抗体をつかって検出する方法である。抗体と坑原の特異的結合を利用するためサンプルは微量で済み、特異的にターゲットとする蛋白質を検出できる。
「ハイブリダイゼーション」とは、相補核酸鎖の相互作用を意味する。ＤＮＡは相補的相互作用（ＣはＧ、ＡはＴと常に結合）による二本鎖構造をとっているため、相補鎖を分離するとお互いに好んでリアニール、すなわち“ハイブリダイズ”する。これは２本のＤＮＡ鎖や、塩基配列が充分に相補的なＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の間でも生じる。ハイブリダイゼーションは、複製や転写など全てのＤＮＡの生理的反応において生じ、サザンブロッティングやノーザンブロッティング、ＰＣＲ等多くの分子生物学的手法の基礎をなす。
「ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」とは、ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの反応を連続的、連鎖的に実行することにより、１セットのｐｒｉｍｅｒの間にはさまれるＤＮＡ断片を特異的に増幅する反応である。中でも、逆転写反応とＰＣＲを組み合わせた「ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法」はもっとも感度が高い。
「ＩＳＨ（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）法」は組織断片での遺伝子発現の検出法として有効な手段である。本法と蛍光検出法とを組み合わせたものがＦＩＳＨ法である。
「ノーザンブロット法」とは、ｍＲＮＡの解析を目的とした技術である。２次構造をとりやすいＲＮＡを変成条件下で電気泳動し、メンブレン（ナイロンやニトロセルロース等）にトランスファーする。変成方法によって１．ホルムアミドとホルムアルデヒドを用いる方法、２．グリオキサールを用いる方法、又は３．水酸化メチル水銀を用いる方法等がある。
「サザンブロット法」とは、１９７５年にＳｏｕｔｈｅｒｎによって記載された転写の手法であり、標識された核酸プローブと相補的な塩基配列を持つ、転写されたＤＮＡの領域を検出するものである。
Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性を検出するには、患者から採取した組織（癌組織、血管壁組織、皮膚、口腔粘膜等）あるいは体液（血液、リンパ液）などを上記で挙げたような検査方法に付してＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性を検出する。
「Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患」の具体例としては、脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、食道癌、胃癌、大腸癌、非小細胞肺癌、膵癌、胆管癌、胆嚢癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、皮膚癌、小児固形癌、骨腫瘍、血管腫等の癌、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、乾癬等が挙げられ、脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、食道癌、胃癌、大腸癌、非小細胞肺癌、膵癌、胆管癌、胆嚢癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、皮膚癌等が好ましく、脳腫瘍、胃癌、大腸癌、非小細胞肺癌、膵癌、腎癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌等がより好ましい。
「Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化」とは、生体の恒常性（ホメオスタシス）にとって必要な発現量又は活性以上の発現又は活性であり、同一起源の正常組織にとって必要な発現量又は活性以上の発現又は活性である。
「Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化している患者」とは、Ｈｅｒ２又はＥＧＦＲの少なくとも一方が過剰発現又は活性化している患者、好ましくは両方が過剰発現又は活性化している患者である。本発明のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤は、上記のようなＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化している患者の治療のために投与することを特徴とする。
本発明の「Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤」としては、Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化している患者に対して投与するＨｅｒ２及びＥＧＦＲ阻害剤であることが好ましく、Ｈｅｒ２阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤からなる合剤であっても良く、Ｈｅｒ２阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤を同時に、別々に、又は、経時的に間隔を置いて使用することも可能である。即ち、Ｈｅｒ２阻害剤とＥＧＦＲ阻害剤とを種々異なるルートにより同時に、別々に、あるいは、例えば同じ日に時間をずらして投与したり、数日から数週間又は数ヶ月にわたり、所定間隔で投与することも可能である。
本発明において使用するＨｅｒ２阻害剤としては、抗Ｈｅｒ２抗体ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅ）、ＴＡＫ−１６５（武田）、ＥＴＨ−１０２（ＥｘｏｎＨｉｔ Ｔｈｅｒ．）等が挙げられ、また、本発明において使用するＥＧＦＲ阻害剤としては、イレッサ（Ａ．Ｚｅｎｅｃａ）、ＯＳＩ−７７４（Ｒｏｃｈｅ）、ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈ）等が挙げられる。これらの製造等に関しては、ＴＡＫ−１６５についてはＷＯ０２／０６２４９号公報、特開２００１−３４８３８５号公報、特開２００２−６９０７０号公報、特開平９−１３６８７７号公報、特開平１１−６０５７１号公報等に、イレッサについてはＷＯ９６／３３９８０号公報、特許第３０４０４８６号公報に、ＯＳＩ−７７４についてはＷＯ９６／３０３４７号公報に、ＰＫＩ−１６６についてはＷＯ９７／０２２６６号公報に、ＥＫＢ−５６９については米国特許第６，００２，００８号に記載されている。
これらをＨｅｒ２阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤からなる合剤とする場合、１それぞれの阻害剤から、１つ又は複数ずつを選択し適宜公知の方法により合剤を製造して使用することが出来る。
発明を実施するための最良の形態
本発明の阻害剤としては、デュアル阻害剤が好ましく、具体例としては、当該酵素の蛋白質キナーゼ活性の阻害に基づき作用する阻害剤、当該Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの細胞内蛋白質含量を減少させることにより作用する阻害剤、又は当該Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲと信号伝達分子との物理的結合の阻害剤等が挙げられる。
「デュアル阻害剤」のより具体的な化合物の例としては、ＷＯ９９／３５１４６号公報（特表２００２−５００２２５号公報）に開示されている下記一般式（Ｉ）
｛式中、ＸはＮ又はＣＨであり；ＹがＣＲ１であって、ＶがＮであるか；又はＹがＮであって、ＶがＣＲ１であるか；又はＹがＣＲ１であって、ＶがＣＲ２であるか；又はＹがＣＲ２であって、ＶがＣＲ１であり；Ｒ１はＣＨ３ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２−Ａｒ−基（ここで、Ａｒはフェニル、フラン、チオフェン、ピロール及びチアゾールから選択され、その各々は所望により１もしくは２個のハロゲン、Ｃ１−４アルキル又はＣ１−４アルコキシ基で置換されていてもよい）を表し；Ｒ２は水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルアミノ及びジ［Ｃ１−４アルキル］アミノからなる群から選択され；ＵはＲ３基で置換され、かつさらに所望により独立に選択される少なくとも１個のＲ４基で置換されていてもよいフェニル、ピリジル、３Ｈ−イミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、１Ｈ−インダゾリル、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インダゾリル、１Ｈ−ベンズイミダゾリル、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンズイミダゾリル又は１Ｈ−ベンゾトリアゾリル基を表し；Ｒ３はベンジル、ハロ−、ジハロ−及びトリハロベンジル、ベンゾイル、ピリジルメチル、ピリジルメトキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、ハロ−、ジハロ−及びトリハロベンジルオキシならびにベンゼンスルホニルからなる群から選択されるか；又はＲ３はトリハロメチルベンジル又はトリハロメチルベンジルオキシを表すか；又はＲ３は上記式（ａ）の基を表し（式中、Ｒ５は各々独立にハロゲン、Ｃ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシから選択され；かつ、ｎは０〜３である）；Ｒ４は各々独立にヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルキニル、Ｃ１−４アルコキシ、アミノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、ジ［Ｃ１−４アルキル］アミノ、Ｃ１−４アルキルチオ、Ｃ１−４アルキルスルフィニル、Ｃ１−４アルキルスルホニル、Ｃ１−４アルキルカルボニル、カルボキシ、カルバモイル、Ｃ１−４アルコキシカルボニル、Ｃ１−４アルカノイルアミノ、Ｎ−（Ｃ１−４アルキル）カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−４アルキル）カルバモイル、シアノ、ニトロ及びトリフルオロメチルである。｝で示される置換ヘテロ芳香族化合物、特に好ましくは、Ｎ−｛３−クロロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メタンスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン等が、又はＷＯ００／３１０４８号公報に開示されているＮ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］キナゾリン−６−イル］アクリルアミド等が挙げられる。
一般式（Ｉ）の化合物は、薬学的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物、幾何異性体、光学異性体もしくはラセミ体、又はジアステレオマー混合物のいずれの形態であってもよい。薬学的に許容される塩としては、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸および硫酸などの無機酸塩、ギ酸、酢酸、酒石酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、安息香酸、フタル酸、グリコール酸、グルクロン酸、グルコン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、イセチオン酸などの有機酸塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ金属・アルカリ土類金属塩、アンモニウム、テトラメチルアミン、トリエチルアミン、ベンジルアミン、フェネチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリス（ヒドロキシエチルアミン）などの有機塩基塩、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などのアミノ酸塩が挙げられる。
一般式（Ｉ）の化合物の製造方法及びデュアル阻害作用についてはＷＯ９９／３５１４６号公報に、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］キナゾリン−６−イル］アクリルアミドの製造方法及びデュアル阻害作用についてはＷＯ００／３１０４８号公報に記載されている。
本発明に係るデュアル阻害薬には上記した全ての化合物の他に、デュアル阻害作用を有するその他の化合物（例えば、ＷＯ０２／０６６４５１に記載されている化合物）が含まれる。
本発明の阻害剤を医薬として用いる場合、本発明の阻害剤を製薬上許容しうる担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、矯味剤、矯臭剤、乳化剤、希釈剤、溶解補助剤等）と混合して得られる医薬組成物あるいは製剤（錠剤、ピル剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、エマルジョン剤、エリキシル剤、懸濁剤、溶液剤、注射剤、点滴剤あるいは坐剤等）の形態で経口的又は非経口的に投与することができる。
本発明において、非経口とは、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射あるいは点滴法等を含むものである。
経口投与用の固形投与剤型としては、散剤、顆粒剤、錠剤、ピル剤、カプセル剤等の上記したものがあげられる。そのような剤型において、活性成分化合物は薬学上許容され得る少なくとも一つの添加物（不活性希釈剤、滑沢剤、保存剤、抗酸化剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味付与剤、フレーバー付与剤、パーフューム剤等）を含むことができる。
経口投与用の液剤は、医薬として許容されるエマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤、溶液剤等が挙げられ、それらは当該分野で普通に用いられる不活性希釈剤を含んでいてもよい。
注射用調剤（無菌注射用水性懸濁物あるいは油性懸濁物等）は、適当な分散化剤又は湿化剤及び懸濁化剤等を用いて当該分野で知られた方法で調製することができる。その無菌注射用調剤は、また、希釈剤あるいは溶剤を用いた無菌の注射のできる溶液または懸濁液であってもよい。さらに、通常溶剤又は懸濁化溶媒として無菌の不揮発性油も用いることができる。このためには、いかなる不揮発性油も脂肪酸も使用できる。
直腸投与用の坐剤は、その薬物と適当な非刺激性の補形剤、例えば常温では固体であるが、腸管の温度では液体で、直腸内で融解し、薬物を放出するもの等と混合して製造することができる。
投与量は、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組合せ、治療を行っている患者のそのときの病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。例えば上記一般式（Ｉ）で表される化合物を使用する場合、その１日の投与量は、患者の状態や体重、化合物の種類、投与経路等によって異なるが、経口的には０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．０５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重／日を、一日１〜数回に分けて投与する。また、非経口的には、皮下、静脈内、筋肉内又は直腸内に、約０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重／日投与するのが好ましい。
本発明のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性化した患者に用いる予防又は／及び治療剤は、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性を検査し、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化していると判断された場合には、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性化に起因する疾患を患っていると判定し、当該患者に使用し得るか若しくは使用すべきであることを記載した書類とともにパッケージすることによって、好適に医薬品として提供される。
（実施例）
以下、本発明について実施例を挙げて詳細に説明するが、その要旨を超えない限り、本発明は以下に限定されるものではない。
実施例１
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害作用
（方法）
試験に用いた薬剤ＰＤ ０１８３８０５は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼを阻害しＥＧＦＲ過剰発現癌Ａ４３１に対してｉｎ ｖｉｖｏ制癌効果を示すことが知られている１）。また、ＰＤ ０１８３８０５の２塩酸塩ＣＩ−１０３３はＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞をハーレギュリン刺激した時のＨｅｒ２、ｅｒｂＢ３そしてｅｒｂＢ４のチロシンリン酸化を阻害することが報告されている２）。
以下の記載においてＰＤ ０１８３８０５をＰＤ、ＰＤ ０１８３８０５の２塩酸塩ＣＩ−１０３３をＰＤ・２ＨＣｌと略す。ＰＤの化学名及び化学構造は下記のとおりである。
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］キナゾリン−６−イル］アクリルアミド
また、ＰＤ及びＰＤ・２ＨＣｌの合成は、ＷＯ００／３１０４８号公報に記載された方法に準じて行なった。
１）Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｐ．Ｗ．，Ｐａｔｍｏｒｅ，Ｓ．Ｊ．，Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ａ．Ｊ．，Ｋｉｒｋｉｓｈ，Ｌ．Ｓ．，Ｄｕｄｅｃｋ，Ｒ．Ｃ．，Ｌｅｏｐｏｌｄ，Ｗ．Ｒ．，Ｚｈｏｕ，Ｈ．，Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｗ．Ｌ．Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４０：１１７，１９９９．
２）Ｓｌｉｃｈｅｎｍｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．，Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｗ．Ｌ．ａｎｄ Ｆｒｙ，Ｄ．Ｗ．Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２８：８０，２００１．
ヒト類表皮癌細胞Ａ４３１（東北大学加齢医学研究所 医用細胞資源センターより供与；カタログ番号ＴＫＧ−０１８２、またはＡＴＣＣより購入の場合；ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５５５）より得られた部分的に精製されたＥＧＦＲを用い、Ｌｉｎｄａ Ｊ．Ｐｉｋｅらのチロシンキナーゼ活性測定方法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８２，７９，１４３３）を改良して行った。詳しい方法は以下の通りである。
Ａ４３１細胞を１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％炭酸ガス下で培養し、この細胞を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、０．２５Ｍサッカロース、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶液中でホモジネート後、３，０００×Ｇで５分間遠心分離し、更にその上清を１００，０００×Ｇで３０分間遠心分離を行いＡ４３１細胞膜画分を得、これを酵素源である部分精製ＥＧＦＲとして測定に供した。
Ａ４３１細胞膜画分（１０〜１５μｇ）、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、２ｍＭ ＭｎＣｌ２、１００μＭ Ｎａ３ＶＯ４、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した薬剤の反応混液（終濃度 １％ ＤＭＳＯ）に、１００ｎｇのＥＧＦを加えた後、合成基質アンジオテンシンＩＩ（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）５０μｇ、アデノシン三リン酸（γ−３２Ｐ−標識体３７ＫＢｑを含む）最終濃度１０μＭを加えて反応を開始した。この時の容量は６０μＬである。
反応は氷中にて３０分間行い、１０ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミンを６μＬと２０％トリクロロ酢酸２５μＬ加えて反応を停止し、そのまま氷中に３０分間放置した。
その後５０００Ｇで２分間遠心した後、上清を４０μＬサンプリングしてＰ８１ホスホセルロースペーパーに吸着させた。これを０．７５％リン酸水に５分間浸して洗浄する操作を４回繰り返した後ペーパーを取り出し、液体シンチレーションカウンターで３２Ｐのカウントを測定し、この値をＡとした。
同時に薬剤を添加しない反応、薬剤およびＥＧＦ共に添加しない反応のカウントも測定し、それぞれＢ、Ｃとした。
これらの値から、チロシンキナーゼ阻害率は、下記の式により求められる。
阻害率（％）＝１００−｛（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）｝×１００
薬剤の添加濃度を変化させて得られた阻害率よりＩＣ５０値（５０％阻害濃度）を算出した。結果を下記表に示す。
実施例２
細胞Ｈｅｒ２チロシンキナーゼ阻害作用
（方法）
細胞は６５９番目のバリンをグルタミン酸に置換することにより恒常的に活性化した変異ｃ−ｅｒｂＢ２で形質転換したＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞株（東北大学加齢医学研究所 医用細胞資源センターより供与；カタログ番号ＴＫＧ−０２９８）を用いた（以下Ａ４細胞と記す。）。この細胞株は１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２混合培地（以下アッセイ培地と記す。）により３７℃、５％炭酸ガス下でプラスチック培養皿中で培養維持した。
アッセイ培地に懸濁したＡ４細胞を１２ウェルプレートに３×１０５／ｗｅｌｌ蒔き込み、コンフレントになった細胞を薬剤とともに２時間３７℃で培養した。細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、細胞溶解バッファ（６０ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％ベータメルカプトエタノール、０．００１％ブロモフェノールブルー）に再懸濁し、超音波処理したものを全細胞溶解液としてウェスタンブロット法に用いた。
蛋白量２５μｇ分の全細胞溶解液を７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、ＰＶＤＦ膜に転写した。膜をブロッキングした後、０．１％ツイーン２０添加トリス緩衝液中で抗ホスホチロシン マウスモノクローナル抗体ＰＹ２０（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ｐ１１１２０）とインキュベーションし、次にＨＲＰ標識抗マウス２次抗体（ＤＡＫＯ、カタログ番号Ｐ０４４７）で処理した。膜を化学発光試薬ＥＣＬ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＲＰＮ２２０９）で処理し化学発光をルミノＣＣＤカメラで撮影した。化学発光の撮影と画像解析はＭａｃｉｎｔｏｓｈ版デンシトグラフ（ＡＴＴＯ、製品型式ＡＥ−６９３０）を用いて行った。
得られたリン酸化シグナルを定量化し、化合物非添加時のシグナルを１００％コントロールとし、バックグラウンドシグナルを０％とし、薬剤によるリン酸化阻害を％コントロールで評価した。結果を下記表に示す。
実施例１、２の結果より、ＰＤはＨｅｒ２又はＥＧＦＲのいずれに対しても阻害作用を示すこと、即ち、ＰＤがＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤として作用することが理解できる。
実施例３
ｉｎ ｖｉｖｏ制癌効果
（方法）
ヒト膵癌ＨＰＡＣ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２１１９）、ヒト大腸癌ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ番号ＣＬ−１８８）そしてヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ５２０（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１８２）はＡＴＣＣより購入した。ヒト子宮頸癌ＭＥ１８０は東北大学加齢医学研究所・医用細胞資源センターより供与いただいた（カタログ番号ＴＫＧ−０４３７、ＡＴＣＣより購入の場合はＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−３３）。Ｂａｌｂ／ｃ雌ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕマウス、日本クレア社、入荷時５週令）の背部皮下にＰＢＳに懸濁した培養ヒト癌細胞を５×１０６／１００μｌ移植し、７日前後経過して移植腫瘍の平均体積がほぼ１００ｍｍ３となった時点で各群の平均腫瘍体積値が一定になるように１群４匹ずつ群分けを行った。
腫瘍体積値はノギスで長径と短径を測定し、［（短径）２×（長径／２）］＝腫瘍体積［ｍｍ３］とした。群分けを行った日から１４日間連日薬剤を１日１回強制経口投与し、対照群のマウスには薬剤を与えなかった。投与開始日の腫瘍体積値を１とした相対腫瘍増殖率を対照群と薬剤処理群で算出した。制癌効果を％コントロールで示した。％コントロールは下記式により算出した。
％コントロール＝［（薬剤処理群の最終日の平均相対腫瘍増殖率−１）／（対照群の最終日の平均相対腫瘍増殖率−１）］×１００
結果を下記表に示す。
上記各表に示した結果から、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤は、（ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２両陽性）、（ＥＧＦＲ陽性、Ｈｅｒ２陰性）又は（ＥＧＦＲ陰性、Ｈｅｒ２陽性）の癌細胞に対して増殖抑制効果を示すこと、即ち、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤はＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化による疾患の予防・治療に有効であることが理解できる。
実施例４
ウェスタンブロット法によるＥＧＦＲ又はＨｅｒ２の発現確認
（方法）
ヒト膵癌ＨＰＡＣ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２１１９）、ＰＡＮＣ１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４６９）、ヒトリンフォーマＤａｕｄｉ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２１３）、ヒト大腸癌ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ番号ＣＬ−１８８）はＡＴＣＣより購入した。ヒト外陰癌Ａ４３１（カタログ番号ＴＫＧ−０１８２）、ヒト子宮頸癌ＭＥ１８０（カタログ番号ＴＫＧ−０４３７）、ヒト舌癌ＨＳＣ−３（カタログ番号ＴＫＧ−０４８４）、ＨＳＣ−４（カタログ番号ＴＫＧ−０４８９）は東北大学加齢医学研究所・医用細胞資源センターより供与いただいた。
１００ｍｍ培養皿でほぼコンフレントになるまで細胞培養した。１００ｍｍ培養皿の培地を除去しＰＢＳで１回洗浄した後に約０．６ｍＬのＲＩＰＡバッファ（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、プロテアーゼインヒビターカクテル）を添加し、氷上で１０分間静置した。細胞溶解液を１．５ｍＬ遠心チューブに回収して１０，０００ｒｐｍで１０分間冷却遠心した。上清を別なチューブに移してこの細胞溶解液をウェスタンブロット法に用いた。
蛋白量２５μｇ分の細胞溶解液を７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけた後ＰＶＤＦ膜に転写した。膜をブロッキングした後、０．１％ツイーン２０添加トリス緩衝液中でＥＧＦＲに対する特異抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ｓｃ−０３）またはＨｅｒ２に対する特異抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号０６−５６２）とインキュベーションし、次にＨＲＰ標識抗ウサギ２次抗体（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、カタログ番号５５６８９）で処理した。膜を化学発光試薬ＥＣＬ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＲＰＮ２２０９）で処理し化学発光をルミノＣＣＤカメラで撮影した。
図１に画像を示した。また、下記表に図１中の各レーンの説明を示した。
実施例５
ＲＴ−ＰＣＲ法によるＥＧＦＲ又はＨｅｒ２の発現確認
（方法）
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｖｏｌ．１，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎに従い実験を行なった。以下に詳細に記述する。
癌細胞からＳ．Ｎ．Ａ．Ｐ．ＴＭｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号４５−０４７２）によりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡのうち１μｇを用い逆転写反応を行なった。逆転写反応は１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１ ４８３ １８８）を用いて行なった。
このときのプライマーとしてはランダムプライマーｐ（ｄＮ）６を用いた。得られたｃＤＮＡの１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＥＧＦＲ ｍＲＮＡの検出時はプライマーはＨｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ＧＡＰＤＨ ｇｅｎｅｓ Ｄｕａｌ−ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｍａｘｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＤＰ−１００６５−Ｇ）添付のプライマーを用い、酵素はＴａＫａＲａ Ｅｘ ＴａｑＴＭ（宝酒造、カタログ番号ＲＲ００１Ａ）を用いた。反応条件は９６℃ １分 １サイクル、９６℃ １分 ５８℃ １分 ３０秒 ３０サイクル、７２℃ １０分 １サイクルで行なった。Ｈｅｒ２ ｍＲＮＡの検出時はプライマーはＲＴ−ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ＨＵＭＡＮ ｅｒｂ−Ｂ２（ＣＬＰ、カタログ番号５２５４．Ｈ）添付のプライマーを用い、酵素はＴａＫａＲａ Ｅｘ ＴａｑＴＭ（宝酒造、カタログ番号ＲＲ００１Ａ）を用いた。反応条件は９４℃ ５分 ６０℃ ５分 １サイクル、７２℃ ２分 ９４℃ １分 ６０℃ １分 ４０サイクル、７２℃ １０分 １サイクルで行なった。得られたＰＣＲ産物についてアガロース電気泳動を行い、発現の有無の確認を行なった。
上記実施例４、５の結果から、ウエスタンブロット法やＲＴ−ＰＣＲ法によりＨｅｒ２又はＥＧＦＲの発現確認が可能であることがわかる。
また、上記実施例２、４の結果から、Ｈｅｒ２又はＥＧＦＲ活性化の検査が可能であることが分かる。このような検査法を用いて患者におけるＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性を検査し、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化していると判断された場合には、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性化に起因する疾患を患っていると判定し、本発明の医薬品を投与する。
産業上の利用可能性
本発明の阻害剤は、上記のように癌患者に対する有効な治療法であることに加え、前立腺癌や乳癌でのホルモン感受性癌から抵抗性癌への移行を防ぐための予防又は／及び治療薬としても期待できる。更に、固形癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、乾癬等の予防又は／及び治療薬としても期待できる。
本出願は、日本で出願された特願２００２−１６２１３０を基礎としており、それらの内容は、本明細書に全て包含される。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例４の化学発光をルミノＣＣＤカメラで撮影した図である。
本発明は、被検対象に対してＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性化診断を行い、それらの発現が確認された被検対象を治療の対象とする一連の治療方法に使用する薬剤に関する。
背景技術
従来、抗癌剤の標的分子はＤＮＡやＲＮＡの合成に関与する分子そして細胞分裂に関与する分子が主であった。これらの抗癌剤は、標的分子が癌細胞特異的ではないため、骨髄毒性などの重篤な副作用を引き起こすことが知られている。
近年、分子腫瘍学の発展により癌の発生は癌遺伝子、癌抑制遺伝子の異常によって引き起こされることが明らかになった。最もよく知られた癌遺伝子として上皮増殖因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下ＥＧＦＲと略す。）とその類縁のｈｕｍａｎ ＥＧＦＲ ｔｙｐｅ２（以下Ｈｅｒ２と略す。別名ｅｒｂＢ−２とも呼ぶ。）が挙げられる。
ＥＧＦＲとＨｅｒ２はそれぞれ分子量１７０ｋＤ、１８５ｋＤの膜貫通型糖蛋白質である。ＥＧＦＲとＨｅｒ２の細胞内ドメインにはチロシンキナーゼドメインが存在し、リン酸化反応を通して信号を核へ伝えている。互いのキナーゼドメインのアミノ酸配列は約８０％の相同性を持ち構造的によく似ているが、Ｃ末端にある自己リン酸化ドメインの相同性は約３０％と低く両レセプターの信号伝達機構に質的違いがあることが推察される。
ＥＧＦＲは食道癌に８９％と極めて高い頻度で発現している［Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９３ １１９，４０１−４０７］。一方、その他の癌種では非小細胞肺癌の４５％にＥＧＦＲの過剰発現［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９３ ５３，２３７９−２３８５］、グリオブラストーマの５０％にＥＧＦＲの遺伝子増幅［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００ ６０，１３８３−１３８７］などの報告がある。
Ｈｅｒ２に関しては乳癌の３９％に遺伝子増幅［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９３ １１，１９３６−１９４２］、卵巣癌の３２％に過剰発現［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０ ５０，４０８７−４０９１］、ホルモン抵抗性前立腺癌の６７％に過剰発現［Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１ ７，２６４３−２６４７］などの報告がある。
ＥＧＦＲやＨｅｒ２は様々な臓器癌に過剰発現しているが、これらによる癌化の分子機構の実態はリン酸化反応を介した信号伝達であり、ＥＧＦＲやＨｅｒ２の発現量の程度と独立にこの信号伝達機能が過剰に活性化することによっても臨床的に癌の進行を悪化させることがある。したがって、標的の発現が癌種によって異なる以上、これらを標的とする治療は当然ながら個別の治療を必要とする。そして癌の性質を診断し標的分子の発現や活性化の有無に合わせて薬剤を選択すべきである。これにより効果的かつ合理的な治療が達成できる。
ＥＧＦＲとＨｅｒ２は互いにヘテロ複合体を形成し機能的な相互作用が見られる［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００１ １９（１８ｓ），３２ｓ−４０ｓ］。そして、ＥＧＦＲとＨｅｒ２の共発現によりＥＧＦＲ単独による癌化がさらに加速されることが知られている［Ｃｅｌｌ １９８７ ５８，２８７−２９２］。また、乳癌、口腔癌、肺癌等においてＥＧＦＲとＨｅｒ２の共発現があると予後不良になるとの報告もある［Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９ ５，４１６４−４１７４］。
したがって、ＥＧＦＲとＨｅｒ２両方を阻害する薬剤（以下、単にデュアル阻害剤とも称す。）はどちらか一方にしか作用しない薬剤に比べて適応疾患が広がる有利性があるのみならず、デュアル阻害の相乗作用によって共発現癌に対して効果的な治療を期待できる点でも優れている。
ＥＧＦＲとＨｅｒ２の診断技術は既に広く知られている。そしてＥＧＦＲに結合する抗体に蛍光色素をコンジュゲイトさせて口腔癌の前癌病変を早期に検出する試みも最近報告された［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１ ６１，４４９０−４４９６］。一方、乳癌患者のＨｅｒ２発現の有無によりアントラサイクリン系抗癌剤の抗腫瘍効果が予測できることを示唆する報告も出てきた［Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１ ７，１５７７−１５８１］。したがって、ＥＧＦＲやＨｅｒ２の診断は病気を早期発見する役割と個々の患者に有効で適切な薬剤を選択するために有益となる可能性がある。
ＥＧＦＲ阻害剤としては中和抗体とチロシンキナーゼ阻害剤が抗癌剤の臨床開発段階にある。Ｈｅｒ２阻害剤では中和抗体ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ：商品名、Ｒｏｃｈｅ社）が転移性乳癌に対する治療剤として既に各国で上市されているが、チロシンキナーゼ阻害剤は抗癌剤の臨床開発段階にある。
同様にＥＧＦＲとＨｅｒ２のデュアル阻害剤も研究開発されているがまだ実用化には至っていない。
抗Ｈｅｒ２抗体ハーセプチンはＨｅｒ２の発現診断ハーセプテスト（Ｈｅｒｃｅｐｔｅｓｔ：商品名）で治療対象患者の選別を既に行っているが、適応癌種は乳癌に限定されている。
ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ：商品名、Ａ．Ｚｅｎｅｃａ社）には従来の抗癌剤が持つ骨髄毒性などの重篤な副作用がないこと、そして、非小細胞肺癌に有効であることが臨床試験で示されてきた［Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１ ７，３７８０ｓ］。しかし、イレッサの臨床試験では治験対象患者の選択のためにＥＧＦＲ発現を事前に確認する作業は行われていない。
ＥＧＦＲとＨｅｒ２のデュアル阻害剤は、いずれかの標的分子が発現している癌であれば適応範囲とする事ができるため、幅広い臓器癌を対象とする。しかし、既に記述したように、より正確には標的蛋白の発現又は活性化を診断することにより治療対象患者を適切に選別した上での処方が望ましく、デュアル阻害剤によるこの一連の治療法は医療現場において未だ確立されたものではない。
癌組織中の標的分子の発現と抗癌剤の感受性に関する別の例としては、乳癌組織中のチミジル酸合成酵素（Ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＴＳ）発現量及びジヒドロピリミジン脱水素酵素（Ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）活性値と５ＦＵ感受性は関連があるとの報告がある［日本癌治療学会誌２０００ ３５，３４０］。しかし、実際に治療法として５ＦＵ処方前にＴＳ発現診断を行うには至っていない。
上記のように、抗癌剤の処方にあたり、薬剤の標的分子を診断して効果的な治療法を予測することが切望されている。
発明の開示
本発明者らは、前述の事情に鑑み上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、被検対象に対してＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性診断を行い、それらの発現又は活性が確認された被検対象に対してＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤を投与することにより、一連の治療法を確立し得ることを見出すに至った。
すなわち、本発明は、このような一連の治療法において投与されるＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤、該阻害剤を有効成分とする医薬組成物、該阻害剤を被検対象に投与することを特徴とする予防又は／及び治療方法関し、さらに詳細には以下のとおりである。
本発明は、
（１）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現又は活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現又は活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して投与するためのＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤、
（２）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが活性化していると判断された被検対象に対して投与するための前記（１）に記載の阻害剤。
（３）Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲ発現又は活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２及びＥＧＦＲ発現又は活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して投与されるＨｅｒ２及びＥＧＦＲ阻害剤である前記（１）に記載の阻害剤、
（４）Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲの活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２及びＥＧＦＲの活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲが活性化していると判断された被検対象に対して投与するための前記（３）に記載の阻害剤。
（５）被検対象が、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患を患っていると予想されるものである前記（１）に記載の阻害剤、
（６）被検対象が、Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患を患っていると予想されるものである前記（３）に記載の阻害剤、
（７）被検対象がヒトである、前記（１）から（６）のいずれか１に記載の阻害剤、
（８）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現又は活性を検出するための検査が体外検査である前記（１）に記載の阻害剤、
（９）Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲ発現又は活性を検出するための検査が体外検査である前記（３）に記載の阻害剤、
（１０）Ｈｅｒ２阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤からなる合剤である前記（３）に記載の阻害剤、
（１１）Ｈｅｒ２阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤を同時に、別々に、又は経時的に間隔を置いて投与するための前記（３）に記載の阻害剤、
（１２）体外検査が、抗体を用いた免疫学的方法又は核酸及び核酸誘導体を用いたハイブリダイゼーション法である前記（８）又は（９）に記載の阻害剤、
（１３）抗体を用いた免疫学的方法が、固相酵素免疫検定法、酵素−結合免疫アッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、免疫組織化学的方法、及びウエスタンブロット法からなる群より選ばれる方法である前記（１２）に記載の阻害剤、
（１４）核酸及び核酸誘導体を用いたハイブリダイゼーション法が、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＳＨ法、ＦＩＳＨ法、ノーザンブロット法、及びサザンブロット法からなる群より選ばれる方法である前記（１２）に記載の阻害剤、
（１５）下記一般式（Ｉ）
（１６）（４−（３−フルオロベンジルオキシ）−フェニル）−（６−（５−（（２−メタンスルホニル−エチルアミノ）メチル）−フラン−２−イル）−ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イル）−アミン；
（４−ベンジルオキシフェニル）−（６−（５−（（２−メタンスルホニル−エチルアミノ）−メチル）−フラン−２−イル）−キナゾリン−４−イル）−アミン；
Ｎ−｛４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−［４−（ベンジルオキシ）フェニル］−７−メトキシ−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−７−メトキシ−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−｛３−フルオロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−［１−（３−フルオロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル］−６−［２−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−４−キナゾリンアミン；
６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−Ｎ−［４−（フェニルスルホニル）フェニル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−｛３−フルオロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［２−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−６−［２−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−ベンジルオキシフェニル）−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−４−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（３−クロロ−４−ベンジルオキシフェニル）−６−［２−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−４−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−｛３−クロロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−７−フルオロ−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（３−トリフルオロメチル−４−ベンジルオキシフェニル）−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−４−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］キナゾリン−６−イル］アクリルアミド；
Ｎ−｛４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−メチル−３−（４−メチル−１−ピペラジニル）−１−ブチニル］−６−キナゾリニル｝アクリルアミド；又は
Ｎ−｛３−クロロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メタンスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミンもしくはその薬学的に許容される塩、それらの水和物もしくは溶媒和物、それらの光学活性体もしくはラセミ体、又は、それらのジアステレオマー混合物である前記（１）から（１５）のいずれか１に記載の阻害剤、
（１７）Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］キナゾリン−６−イル］アクリルアミド、又はＮ−｛３−クロロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メタンスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミンもしくはその薬学的に許容される塩、それらの水和物もしくは溶媒和物、それらの光学活性体もしくはラセミ体又はそれらのジアステレオマー混合物である前記（１）から（１６）のいずれか１に記載の阻害剤、
（１８）前記（１）から（１７）のいずれか１に記載の阻害剤を有効成分として含有し、かつ製薬上許容され得る担体を含有する医薬組成物、
（１９）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は／及び治療薬である前記（１８）に記載の医薬組成物、
（２０）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である前記（１９）に記載の医薬組成物、
（２１）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現又は活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現又は活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して投与するための、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は／及び治療薬、
（２２）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である前記（２１）に記載の予防又は／及び治療薬、
（２３）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現又は活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現又は活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して有効量のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤を投与することを特徴とする、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は／及び治療方法、
（２４）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である前記（２３）に記載の予防又は／及び治療方法、
（２５）前記（１８）から（２０）のいずれか１に記載の医薬組成物、及び該医薬組成物をＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は／及び治療に使用し得るか又は使用すべきであることを記載した書類とを含む商業的パッケージ、
（２６）Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である前記（２５）に記載の商業的パッケージ、に関する。
本発明における各定義は次の通りである。
「Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ発現を検出するための検査」としては、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲに対する抗体を用いた免疫学的方法、又は、核酸及び核酸誘導体を用いたハイブリダイゼーション法が挙げられ、免疫学的方法のより好ましい具体例としては、固相酵素免疫検定法、酵素−結合免疫アッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、免疫組織化学的方法、又はウエスタンブロット法等が挙げられ、ハイブリダイゼーション法のより好ましい具体例としては、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＳＨ法、ＦＩＳＨ法、ノーザンブロット法、又はサザンブロット法等が挙げられる。
「固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ＝ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ ｓｏｌｖｅｎｔ ａｓｓａｙ）」とは、固相で行う酵素−結合免疫アッセイ法（ＥＩＡ）であり、抗原または抗体に共有結合で酵素を標識し、抗体または抗原の存在を、酵素活性を利用して検出する酵素−結合免疫アッセイ法を固相で行なう方法である。この方法は１９７１年 Ｅ．Ｅｎｇｖａｌらによって開発されたラジオイムノアッセイ（放射性免疫測定法：ＲＩＡ）の抗原、抗体のいずれかに標識する放射性同位体を非放射性の酵素に置き換えたもので、１９９０年にゼプトモル（ｚｅｐｔｏｍｏｌｅ：１０−２１モル）レベルの抗原の測定も可能な方法として開発された。
ＥＬＩＳＡ法には直接抗体法、間接抗体法、競合法、二抗体サンドイッチ法などがあり、測定目的にあった方法が選択される。固相にはアガロース、マイクロタイターウェル、ラテックス粒子などが利用され、標識酵素には、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが最もよく利用される。その他の酵素としては、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ等も使われる。
なお、本発明においては、免疫組織化学的方法も適用可能である。
「ウエスタンブロット法」とは、ＰＶＤＦ膜などのメンブランに転写された蛋白質を抗体をつかって検出する方法である。抗体と坑原の特異的結合を利用するためサンプルは微量で済み、特異的にターゲットとする蛋白質を検出できる。
「ハイブリダイゼーション」とは、相補核酸鎖の相互作用を意味する。ＤＮＡは相補的相互作用（ＣはＧ、ＡはＴと常に結合）による二本鎖構造をとっているため、相補鎖を分離するとお互いに好んでリアニール、すなわち“ハイブリダイズ”する。これは２本のＤＮＡ鎖や、塩基配列が充分に相補的なＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の間でも生じる。ハイブリダイゼーションは、複製や転写など全てのＤＮＡの生理的反応において生じ、サザンブロッティングやノーザンブロッティング、ＰＣＲ等多くの分子生物学的手法の基礎をなす。
「ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」とは、ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの反応を連続的、連鎖的に実行することにより、１セットのｐｒｉｍｅｒの間にはさまれるＤＮＡ断片を特異的に増幅する反応である。中でも、逆転写反応とＰＣＲを組み合わせた「ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法」はもっとも感度が高い。
「ＩＳＨ（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）法」は組織断片での遺伝子発現の検出法として有効な手段である。本法と蛍光検出法とを組み合わせたものがＦＩＳＨ法である。
「ノーザンブロット法」とは、ｍＲＮＡの解析を目的とした技術である。２次構造をとりやすいＲＮＡを変成条件下で電気泳動し、メンブレン（ナイロンやニトロセルロース等）にトランスファーする。変成方法によって１．ホルムアミドとホルムアルデヒドを用いる方法、２．グリオキサールを用いる方法、又は３．水酸化メチル水銀を用いる方法等がある。
「サザンブロット法」とは、１９７５年にＳｏｕｔｈｅｒｎによって記載された転写の手法であり、標識された核酸プローブと相補的な塩基配列を持つ、転写されたＤＮＡの領域を検出するものである。
Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性を検出するには、患者から採取した組織（癌組織、血管壁組織、皮膚、口腔粘膜等）あるいは体液（血液、リンパ液）などを上記で挙げたような検査方法に付してＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性を検出する。
「Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患」の具体例としては、脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、食道癌、胃癌、大腸癌、非小細胞肺癌、膵癌、胆管癌、胆嚢癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、皮膚癌、小児固形癌、骨腫瘍、血管腫等の癌、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、乾癬等が挙げられ、脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、食道癌、胃癌、大腸癌、非小細胞肺癌、膵癌、胆管癌、胆嚢癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、皮膚癌等が好ましく、脳腫瘍、胃癌、大腸癌、非小細胞肺癌、膵癌、腎癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌等がより好ましい。
「Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化」とは、生体の恒常性（ホメオスタシス）にとって必要な発現量又は活性以上の発現又は活性であり、同一起源の正常組織にとって必要な発現量又は活性以上の発現又は活性である。
「Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化している患者」とは、Ｈｅｒ２又はＥＧＦＲの少なくとも一方が過剰発現又は活性化している患者、好ましくは両方が過剰発現又は活性化している患者である。本発明のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤は、上記のようなＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化している患者の治療のために投与することを特徴とする。
本発明の「Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤」としては、Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化している患者に対して投与するＨｅｒ２及びＥＧＦＲ阻害剤であることが好ましく、Ｈｅｒ２阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤からなる合剤であっても良く、Ｈｅｒ２阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤を同時に、別々に、又は、経時的に間隔を置いて使用することも可能である。即ち、Ｈｅｒ２阻害剤とＥＧＦＲ阻害剤とを種々異なるルートにより同時に、別々に、あるいは、例えば同じ日に時間をずらして投与したり、数日から数週間又は数ヶ月にわたり、所定間隔で投与することも可能である。
本発明において使用するＨｅｒ２阻害剤としては、抗Ｈｅｒ２抗体ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅ）、ＴＡＫ−１６５（武田）、ＥＴＨ−１０２（ＥｘｏｎＨｉｔ Ｔｈｅｒ．）等が挙げられ、また、本発明において使用するＥＧＦＲ阻害剤としては、イレッサ（Ａ．Ｚｅｎｅｃａ）、ＯＳＩ−７７４（Ｒｏｃｈｅ）、ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈ）等が挙げられる。これらの製造等に関しては、ＴＡＫ−１６５についてはＷＯ０２／０６２４９号公報、特開２００１−３４８３８５号公報、特開２００２−６９０７０号公報、特開平９−１３６８７７号公報、特開平１１−６０５７１号公報等に、イレッサについてはＷＯ９６／３３９８０号公報、特許第３０４０４８６号公報に、ＯＳＩ−７７４についてはＷＯ９６／３０３４７号公報に、ＰＫＩ−１６６についてはＷＯ９７／０２２６６号公報に、ＥＫＢ−５６９については米国特許第６，００２，００８号に記載されている。
これらをＨｅｒ２阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤からなる合剤とする場合、１それぞれの阻害剤から、１つ又は複数ずつを選択し適宜公知の方法により合剤を製造して使用することが出来る。
発明を実施するための最良の形態
本発明の阻害剤としては、デュアル阻害剤が好ましく、具体例としては、当該酵素の蛋白質キナーゼ活性の阻害に基づき作用する阻害剤、当該Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの細胞内蛋白質含量を減少させることにより作用する阻害剤、又は当該Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲと信号伝達分子との物理的結合の阻害剤等が挙げられる。
「デュアル阻害剤」のより具体的な化合物の例としては、ＷＯ９９／３５１４６号公報（特表２００２−５００２２５号公報）に開示されている下記一般式（Ｉ）
一般式（Ｉ）の化合物は、薬学的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物、幾何異性体、光学異性体もしくはラセミ体、又はジアステレオマー混合物のいずれの形態であってもよい。薬学的に許容される塩としては、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸および硫酸などの無機酸塩、ギ酸、酢酸、酒石酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、安息香酸、フタル酸、グリコール酸、グルクロン酸、グルコン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、イセチオン酸などの有機酸塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ金属・アルカリ土類金属塩、アンモニウム、テトラメチルアミン、トリエチルアミン、ベンジルアミン、フェネチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリス（ヒドロキシエチルアミン）などの有機塩基塩、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などのアミノ酸塩が挙げられる。
一般式（Ｉ）の化合物の製造方法及びデュアル阻害作用についてはＷＯ９９／３５１４６号公報に、Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］キナゾリン−６−イル］アクリルアミドの製造方法及びデュアル阻害作用についてはＷＯ００／３１０４８号公報に記載されている。
本発明に係るデュアル阻害薬には上記した全ての化合物の他に、デュアル阻害作用を有するその他の化合物（例えば、ＷＯ０２／０６６４５１に記載されている化合物）が含まれる。
本発明の阻害剤を医薬として用いる場合、本発明の阻害剤を製薬上許容しうる担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、矯味剤、矯臭剤、乳化剤、希釈剤、溶解補助剤等）と混合して得られる医薬組成物あるいは製剤（錠剤、ピル剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、エマルジョン剤、エリキシル剤、懸濁剤、溶液剤、注射剤、点滴剤あるいは坐剤等）の形態で経口的又は非経口的に投与することができる。
本発明において、非経口とは、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射あるいは点滴法等を含むものである。
経口投与用の固形投与剤型としては、散剤、顆粒剤、錠剤、ピル剤、カプセル剤等の上記したものがあげられる。そのような剤型において、活性成分化合物は薬学上許容され得る少なくとも一つの添加物（不活性希釈剤、滑沢剤、保存剤、抗酸化剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味付与剤、フレーバー付与剤、パーフューム剤等）を含むことができる。
経口投与用の液剤は、医薬として許容されるエマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤、溶液剤等が挙げられ、それらは当該分野で普通に用いられる不活性希釈剤を含んでいてもよい。
注射用調剤（無菌注射用水性懸濁物あるいは油性懸濁物等）は、適当な分散化剤又は湿化剤及び懸濁化剤等を用いて当該分野で知られた方法で調製することができる。その無菌注射用調剤は、また、希釈剤あるいは溶剤を用いた無菌の注射のできる溶液または懸濁液であってもよい。さらに、通常溶剤又は懸濁化溶媒として無菌の不揮発性油も用いることができる。このためには、いかなる不揮発性油も脂肪酸も使用できる。
直腸投与用の坐剤は、その薬物と適当な非刺激性の補形剤、例えば常温では固体であるが、腸管の温度では液体で、直腸内で融解し、薬物を放出するもの等と混合して製造することができる。
投与量は、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組合せ、治療を行っている患者のそのときの病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。例えば上記一般式（Ｉ）で表される化合物を使用する場合、その１日の投与量は、患者の状態や体重、化合物の種類、投与経路等によって異なるが、経口的には０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．０５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重／日を、一日１〜数回に分けて投与する。また、非経口的には、皮下、静脈内、筋肉内又は直腸内に、約０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重／日投与するのが好ましい。
本発明のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性化した患者に用いる予防又は／及び治療剤は、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性を検査し、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化していると判断された場合には、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性化に起因する疾患を患っていると判定し、当該患者に使用し得るか若しくは使用すべきであることを記載した書類とともにパッケージすることによって、好適に医薬品として提供される。
（実施例）
以下、本発明について実施例を挙げて詳細に説明するが、その要旨を超えない限り、本発明は以下に限定されるものではない。
実施例１
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害作用
（方法）
試験に用いた薬剤ＰＤ ０１８３８０５は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼを阻害しＥＧＦＲ過剰発現癌Ａ４３１に対してｉｎ ｖｉｖｏ制癌効果を示すことが知られている１）。また、ＰＤ ０１８３８０５の２塩酸塩ＣＩ−１０３３はＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞をハーレギュリン刺激した時のＨｅｒ２、ｅｒｂＢ３そしてｅｒｂＢ４のチロシンリン酸化を阻害することが報告されている２）。
以下の記載においてＰＤ ０１８３８０５をＰＤ、ＰＤ ０１８３８０５の２塩酸塩ＣＩ−１０３３をＰＤ・２ＨＣｌと略す。ＰＤの化学名及び化学構造は下記のとおりである。
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］キナゾリン−６−イル］アクリルアミド
１）Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｐ．Ｗ．，Ｐａｔｍｏｒｅ，Ｓ．Ｊ．，Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ａ．Ｊ．，Ｋｉｒｋｉｓｈ，Ｌ．Ｓ．，Ｄｕｄｅｃｋ，Ｒ．Ｃ．，Ｌｅｏｐｏｌｄ，Ｗ．Ｒ．，Ｚｈｏｕ，Ｈ．，Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｗ．Ｌ．Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４０：１１７，１９９９．
２）Ｓｌｉｃｈｅｎｍｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．，Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｗ．Ｌ．ａｎｄ Ｆｒｙ，Ｄ．Ｗ．Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２８：８０，２００１．
ヒト類表皮癌細胞Ａ４３１（東北大学加齢医学研究所 医用細胞資源センターより供与；カタログ番号ＴＫＧ−０１８２、またはＡＴＣＣより購入の場合；ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５５５）より得られた部分的に精製されたＥＧＦＲを用い、Ｌｉｎｄａ Ｊ．Ｐｉｋｅらのチロシンキナーゼ活性測定方法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８２，７９，１４３３）を改良して行った。詳しい方法は以下の通りである。
Ａ４３１細胞を１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％炭酸ガス下で培養し、この細胞を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、０．２５Ｍサッカロース、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶液中でホモジネート後、３，０００×Ｇで５分間遠心分離し、更にその上清を１００，０００×Ｇで３０分間遠心分離を行いＡ４３１細胞膜画分を得、これを酵素源である部分精製ＥＧＦＲとして測定に供した。
Ａ４３１細胞膜画分（１０〜１５μｇ）、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、２ｍＭ ＭｎＣｌ２、１００μＭ Ｎａ３ＶＯ４、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した薬剤の反応混液（終濃度 １％ ＤＭＳＯ）に、１００ｎｇのＥＧＦを加えた後、合成基質アンジオテンシンＩＩ（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）５０μｇ、アデノシン三リン酸（γ−３２Ｐ−標識体３７ＫＢｑを含む）最終濃度１０μＭを加えて反応を開始した。この時の容量は６０μＬである。
反応は氷中にて３０分間行い、１０ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミンを６μＬと２０％トリクロロ酢酸２５μＬ加えて反応を停止し、そのまま氷中に３０分間放置した。
その後５０００Ｇで２分間遠心した後、上清を４０μＬサンプリングしてＰ８１ホスホセルロースペーパーに吸着させた。これを０．７５％リン酸水に５分間浸して洗浄する操作を４回繰り返した後ペーパーを取り出し、液体シンチレーションカウンターで３２Ｐのカウントを測定し、この値をＡとした。
同時に薬剤を添加しない反応、薬剤およびＥＧＦ共に添加しない反応のカウントも測定し、それぞれＢ、Ｃとした。
これらの値から、チロシンキナーゼ阻害率は、下記の式により求められる。
阻害率（％）＝１００−｛（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）｝×１００
薬剤の添加濃度を変化させて得られた阻害率よりＩＣ５０値（５０％阻害濃度）を算出した。結果を下記表に示す。
細胞Ｈｅｒ２チロシンキナーゼ阻害作用
（方法）
細胞は６５９番目のバリンをグルタミン酸に置換することにより恒常的に活性化した変異ｃ−ｅｒｂＢ２で形質転換したＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞株（東北大学加齢医学研究所 医用細胞資源センターより供与；カタログ番号ＴＫＧ−０２９８）を用いた（以下Ａ４細胞と記す。）。この細胞株は１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２混合培地（以下アッセイ培地と記す。）により３７℃、５％炭酸ガス下でプラスチック培養皿中で培養維持した。
アッセイ培地に懸濁したＡ４細胞を１２ウェルプレートに３×１０５／ｗｅｌｌ蒔き込み、コンフレントになった細胞を薬剤とともに２時間３７℃で培養した。細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、細胞溶解バッファ（６０ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％ベータメルカプトエタノール、０．００１％ブロモフェノールブルー）に再懸濁し、超音波処理したものを全細胞溶解液としてウェスタンブロット法に用いた。
蛋白量２５μｇ分の全細胞溶解液を７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、ＰＶＤＦ膜に転写した。膜をブロッキングした後、０．１％ツイーン２０添加トリス緩衝液中で抗ホスホチロシン マウスモノクローナル抗体ＰＹ２０（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ｐ１１１２０）とインキュベーションし、次にＨＲＰ標識抗マウス２次抗体（ＤＡＫＯ、カタログ番号Ｐ０４４７）で処理した。膜を化学発光試薬ＥＣＬ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＲＰＮ２２０９）で処理し化学発光をルミノＣＣＤカメラで撮影した。化学発光の撮影と画像解析はＭａｃｉｎｔｏｓｈ版デンシトグラフ（ＡＴＴＯ、製品型式ＡＥ−６９３０）を用いて行った。
得られたリン酸化シグナルを定量化し、化合物非添加時のシグナルを１００％コントロールとし、バックグラウンドシグナルを０％とし、薬剤によるリン酸化阻害を％コントロールで評価した。結果を下記表に示す。
実施例３
ｉｎ ｖｉｖｏ制癌効果
（方法）
ヒト膵癌ＨＰＡＣ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２１１９）、ヒト大腸癌ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ番号ＣＬ−１８８）そしてヒト肺癌ＮＣＩ−Ｈ５２０（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１８２）はＡＴＣＣより購入した。ヒト子宮頸癌ＭＥ１８０は東北大学加齢医学研究所・医用細胞資源センターより供与いただいた（カタログ番号ＴＫＧ−０４３７、ＡＴＣＣより購入の場合はＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−３３）。Ｂａｌｂ／ｃ雌ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕマウス、日本クレア社、入荷時５週令）の背部皮下にＰＢＳに懸濁した培養ヒト癌細胞を５×１０６／１００μｌ移植し、７日前後経過して移植腫瘍の平均体積がほぼ１００ｍｍ３となった時点で各群の平均腫瘍体積値が一定になるように１群４匹ずつ群分けを行った。
腫瘍体積値はノギスで長径と短径を測定し、［（短径）２×（長径／２）］＝腫瘍体積［ｍｍ３］とした。群分けを行った日から１４日間連日薬剤を１日１回強制経口投与し、対照群のマウスには薬剤を与えなかった。投与開始日の腫瘍体積値を１とした相対腫瘍増殖率を対照群と薬剤処理群で算出した。制癌効果を％コントロールで示した。％コントロールは下記式により算出した。
％コントロール＝［（薬剤処理群の最終日の平均相対腫瘍増殖率−１）／（対照群の最終日の平均相対腫瘍増殖率−１）］×１００
結果を下記表に示す。
実施例４
ウェスタンブロット法によるＥＧＦＲ又はＨｅｒ２の発現確認
（方法）
ヒト膵癌ＨＰＡＣ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２１１９）、ＰＡＮＣ１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４６９）、ヒトリンフォーマＤａｕｄｉ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２１３）、ヒト大腸癌ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ番号ＣＬ−１８８）はＡＴＣＣより購入した。ヒト外陰癌Ａ４３１（カタログ番号ＴＫＧ−０１８２）、ヒト子宮頸癌ＭＥ１８０（カタログ番号ＴＫＧ−０４３７）、ヒト舌癌ＨＳＣ−３（カタログ番号ＴＫＧ−０４８４）、ＨＳＣ−４（カタログ番号ＴＫＧ−０４８９）は東北大学加齢医学研究所・医用細胞資源センターより供与いただいた。
１００ｍｍ培養皿でほぼコンフレントになるまで細胞培養した。１００ｍｍ培養皿の培地を除去しＰＢＳで１回洗浄した後に約０．６ｍＬのＲＩＰＡバッファ（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、プロテアーゼインヒビターカクテル）を添加し、氷上で１０分間静置した。細胞溶解液を１．５ｍＬ遠心チューブに回収して１０，０００ｒｐｍで１０分間冷却遠心した。上清を別なチューブに移してこの細胞溶解液をウェスタンブロット法に用いた。
蛋白量２５μｇ分の細胞溶解液を７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけた後ＰＶＤＦ膜に転写した。膜をブロッキングした後、０．１％ツイーン２０添加トリス緩衝液中でＥＧＦＲに対する特異抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ｓｃ−０３）またはＨｅｒ２に対する特異抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号０６−５６２）とインキュベーションし、次にＨＲＰ標識抗ウサギ２次抗体（ＩＣＮ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、カタログ番号５５６８９）で処理した。膜を化学発光試薬ＥＣＬ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＲＰＮ２２０９）で処理し化学発光をルミノＣＣＤカメラで撮影した。
図１に画像を示した。また、下記表に図１中の各レーンの説明を示した。
ＲＴ−ＰＣＲ法によるＥＧＦＲ又はＨｅｒ２の発現確認
（方法）
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｖｏｌ．１，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎに従い実験を行なった。以下に詳細に記述する。
癌細胞からＳ．Ｎ．Ａ．Ｐ．ＴＭｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号４５−０４７２）によりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡのうち１μｇを用い逆転写反応を行なった。逆転写反応は１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１ ４８３ １８８）を用いて行なった。
このときのプライマーとしてはランダムプライマーｐ（ｄＮ）６を用いた。得られたｃＤＮＡの１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＥＧＦＲ ｍＲＮＡの検出時はプライマーはＨｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ＧＡＰＤＨ ｇｅｎｅｓ Ｄｕａｌ−ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｍａｘｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＤＰ−１００６５−Ｇ）添付のプライマーを用い、酵素はＴａＫａＲａ Ｅｘ ＴａｑＴＭ（宝酒造、カタログ番号ＲＲ００１Ａ）を用いた。反応条件は９６℃ １分 １サイクル、９６℃ １分 ５８℃ １分 ３０秒 ３０サイクル、７２℃ １０分 １サイクルで行なった。Ｈｅｒ２ ｍＲＮＡの検出時はプライマーはＲＴ−ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ＨＵＭＡＮ ｅｒｂ−Ｂ２（ＣＬＰ、カタログ番号５２５４．Ｈ）添付のプライマーを用い、酵素はＴａＫａＲａ Ｅｘ ＴａｑＴＭ（宝酒造、カタログ番号ＲＲ００１Ａ）を用いた。反応条件は９４℃ ５分 ６０℃ ５分 １サイクル、７２℃ ２分 ９４℃ １分 ６０℃ １分 ４０サイクル、７２℃ １０分 １サイクルで行なった。得られたＰＣＲ産物についてアガロース電気泳動を行い、発現の有無の確認を行なった。
上記実施例４、５の結果から、ウエスタンブロット法やＲＴ−ＰＣＲ法によりＨｅｒ２又はＥＧＦＲの発現確認が可能であることがわかる。
また、上記実施例２、４の結果から、Ｈｅｒ２又はＥＧＦＲ活性化の検査が可能であることが分かる。このような検査法を用いて患者におけるＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性を検査し、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化していると判断された場合には、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性化に起因する疾患を患っていると判定し、本発明の医薬品を投与する。
産業上の利用可能性
本発明の阻害剤は、上記のように癌患者に対する有効な治療法であることに加え、前立腺癌や乳癌でのホルモン感受性癌から抵抗性癌への移行を防ぐための予防又は／及び治療薬としても期待できる。更に、固形癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、乾癬等の予防又は／及び治療薬としても期待できる。
本出願は、日本で出願された特願２００２−１６２１３０を基礎としており、それらの内容は、本明細書に全て包含される。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例４の化学発光をルミノＣＣＤカメラで撮影した図である。
Claims (26)
- Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して投与するためのＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤。
- Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが活性化していると判断された被検対象に対して投与するための請求の範囲１に記載の阻害剤。
- Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲの発現又は活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２及びＥＧＦＲの発現又は活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して投与するための請求の範囲１に記載の阻害剤。
- Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲの活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２及びＥＧＦＲの活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲが活性化していると判断された被検対象に対して投与するための請求の範囲３に記載の阻害剤。
- 被検対象が、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患を患っていると予想される患者である、請求の範囲１から４のいずれか１項に記載の阻害剤。
- 被検対象が、Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患を患っていると予想される患者である、請求の範囲１から４のいずれか１項に記載の阻害剤。
- 被検対象がヒトである、請求の範囲１から６のいずれか１項に記載の阻害剤。
- Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性を検出するための検査が体外検査である請求の範囲１から４のいずれか１項に記載の阻害剤。
- Ｈｅｒ２及びＥＧＦＲの発現又は活性を検出するための検査が体外検査である請求の範囲１から４のいずれか１項に記載の阻害剤。
- Ｈｅｒ２阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤からなる合剤である請求の範囲３に記載の阻害剤。
- Ｈｅｒ２阻害剤及びＥＧＦＲ阻害剤を同時に、別々に、又は経時的に間隔を置いて投与するための請求の範囲１から９のいずれか１項に記載の阻害剤。
- 体外検査が、抗体を用いた免疫学的方法又は核酸及び核酸誘導体を用いたハイブリダイゼーション法である請求の範囲８又は９に記載の阻害剤。
- 抗体を用いた免疫学的方法が、固相酵素免疫検定法、酵素−結合免疫アッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、免疫組織化学的方法、及びウエスタンブロット法からなる群より選ばれる方法である請求の範囲１２に記載の阻害剤。
- 核酸及び核酸誘導体を用いたハイブリダイゼーション法が、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＩＳＨ法、ＦＩＳＨ法、ノーザンブロット法、及びサザンブロット法からなる群より選ばれる方法である請求の範囲１２に記載の阻害剤。
- 下記一般式（Ｉ）
｛式中、ＸはＮ又はＣＨであり；ＹがＣＲ１であって、ＶがＮであるか；又はＹがＮであって、ＶがＣＲ１であるか；又はＹがＣＲ１であって、ＶがＣＲ２であるか；又はＹがＣＲ２であって、ＶがＣＲ１であり；Ｒ１はＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ＣＨ３ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２−Ａｒ−（ここで、Ａｒはフェニル、フラン、チオフェン、ピロール及びチアゾールから選択され、その各々は所望により１もしくは２個のハロゲン、Ｃ１−４アルキル又はＣ１−４アルコキシで置換されていてもよい。）又は−Ｃ≡Ｃ−Ｃ（Ｒ６）（Ｒ７）（Ｒ８）（ここで、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル又はＣ１−４アルコキシ、又は、環が水素原子又はＣ１−４アルキルで置換されていてもよく、環内にＯ、Ｓ又はＮから選ばれる１から２個のヘテロ原子を含んでいてもよいＣ３−６のシクロアルキルを表す。）を表し；Ｒ２は水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルアミノ、ジ［Ｃ１−４アルキル］アミノ及び−ＮＨＣＯ−Ｒ９（ここで、Ｒ９はＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ２−４アルケニル又はＣ２−４アルキニルを示す。）からなる群から選択され；ＵはＲ３基で置換され、かつさらに所望により独立に選択される少なくとも１個のＲ４基で置換されていてもよいフェニル、ピリジル、３Ｈ−イミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、１Ｈ−インダゾリル、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インダゾリル、１Ｈ−ベンズイミダゾリル、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンズイミダゾリル又は１Ｈ−ベンゾトリアゾリル基を表し；Ｒ３はベンジル、ハロ−、ジハロ−及びトリハロベンジル、ベンゾイル、ピリジルメチル、ピリジルメトキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、ハロ−、ジハロ−及びトリハロベンジルオキシならびにベンゼンスルホニルからなる群から選択されるか；又はＲ３はトリハロメチルベンジル又はトリハロメチルベンジルオキシを表すか；又はＲ３は上記式（ａ）の基を表し（式中、Ｒ５は各々独立にハロゲン、Ｃ１−４アルキル及びＣ１−４アルコキシから選択され；かつ、ｎは０〜３である）；Ｒ４は各々独立にヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ２−４アルキニル、Ｃ１−４アルコキシ、アミノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、ジ［Ｃ１−４アルキル］アミノ、Ｃ１−４アルキルチオ、Ｃ１−４アルキルスルフィニル、Ｃ１−４アルキルスルホニル、Ｃ１−４アルキルカルボニル、カルボキシ、カルバモイル、Ｃ１−４アルコキシカルボニル、Ｃ１−４アルカノイルアミノ、Ｎ−（Ｃ１−４アルキル）カルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ１−４アルキル）カルバモイル、シアノ、ニトロ及びトリフルオロメチルである。｝で示される置換ヘテロ芳香族化合物、もしくはその薬学的に許容される塩、それらの水和物もしくは溶媒和物、それらの光学活性体もしくはラセミ体、又は、それらのジアステレオマー混合物である請求の範囲１から１４のいずれか１項に記載の阻害剤。 - （４−（３−フルオロベンジルオキシ）−フェニル）−（６−（５−（（２−メタンスルホニル−エチルアミノ）メチル）−フラン−２−イル）−ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イル）−アミン；
（４−ベンジルオキシフェニル）−（６−（５−（（２−メタンスルホニル−エチルアミノ）−メチル）−フラン−２−イル）−キナゾリン−４−イル）−アミン；
Ｎ−｛４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−［４−（ベンジルオキシ）フェニル］−７−メトキシ−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−７−メトキシ−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−｛３−フルオロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−［１−（３−フルオロベンジル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル］−６−［２−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−４−キナゾリンアミン；
６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−Ｎ−［４−（フェニルスルホニル）フェニル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−｛３−フルオロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［２−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−６−［２−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−１，３−チアゾール−４−イル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（３−フルオロ−４−ベンジルオキシフェニル）−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−４−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（３−クロロ−４−ベンジルオキシフェニル）−６−［２−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−４−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−｛３−クロロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（１−ベンジル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−７−フルオロ−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−（３−トリフルオロメチル−４−ベンジルオキシフェニル）−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−４−フリル］−４−キナゾリンアミン；
Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］キナゾリン−６−イル］アクリルアミド；
Ｎ−｛４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−メチル−３−（４−メチル−１−ピペラジニル）−１−ブチニル］−６−キナゾリニル｝アクリルアミド；又は
Ｎ−｛３−クロロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メタンスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミンもしくはその薬学的に許容される塩、それらの水和物もしくは溶媒和物、それらの光学活性体もしくはラセミ体、又は、それらのジアステレオマー混合物である請求の範囲１から１５のいずれか１項に記載の阻害剤。 - Ｎ−［４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［３−（４−モルホリニル）プロポキシ］キナゾリン−６−イル］アクリルアミド、又はＮ−｛３−クロロ−４−［（３−フルオロベンジル）オキシ］フェニル｝−６−［５−（｛［２−（メタンスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フリル］−４−キナゾリンアミンもしくはその薬学的に許容される塩、それらの水和物もしくは溶媒和物、それらの光学活性体もしくはラセミ体又はそれらのジアステレオマー混合物である請求の範囲１から１６のいずれか１項に記載の阻害剤。
- 請求の範囲１から１７のいずれか１項に記載の阻害剤を有効成分として含有し、かつ製薬上許容され得る担体を含有する医薬組成物。
- Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は／及び治療薬である請求の範囲１８に記載の医薬組成物。
- Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である請求の範囲１９に記載の医薬組成物。
- Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して投与するための、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は／及び治療薬。
- Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である請求の範囲２１に記載の予防又は／及び治療薬。
- Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性を検出するための検査により被検対象のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの発現又は活性を診断し、その結果、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して有効量のＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲ阻害剤を投与することを特徴とする、Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は／及び治療方法。
- Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である請求の範囲２３に記載の予防又は／及び治療方法。
- 請求の範囲１８から２０のいずれか１項に記載の医薬組成物、及び該医薬組成物をＨｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は／及び治療に使用し得るか又は使用すべきであることを記載した書類とを含む商業的パッケージ。
- Ｈｅｒ２又は／及びＥＧＦＲの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である請求の範囲２５に記載の商業的パッケージ。
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