WO2003101491A1

WO2003101491A1 - Moyens preventifs et/ou therapeutiques destines a des sujets presentant l'expression ou l'activation de her2 et/ou egfr

Info

Publication number: WO2003101491A1
Application number: PCT/JP2003/006988
Authority: WO
Inventors: Tsuyoshi Suzuki; Yasunori Kitano; Shinji Yano
Original assignee: Mitsubishi Pharma Corporation
Priority date: 2002-06-03
Filing date: 2003-06-03
Publication date: 2003-12-11
Also published as: AU2003241898A1; JPWO2003101491A1; EP1510221A1; US20050148607A1; EP1510221A4

Description

明細書

Her2又は/及び EGFR発現又は活性化対象に用いる予防又は/及び治療剤

技術分野

本発明は、被検対象に対して Her2又は/及び EGFRの発現又は活性化診断を行い、それらの発現が確認された被検対象を治療の対象とする一連の治療方法に使用する薬剤に関する。

背景技術

従来、抗癌剤の標的分子は DNAや RNAの合成に関与する分子そして細胞分裂に関与する分子が主であった。これらの抗癌剤は、標的分子が癌細胞特異的ではないため、骨髄毒性などの重篤な副作用を引き起こすことが知られている。

近年、分子腫瘍学の発展により癌の発生は癌遺伝子、癌抑制遺伝子の異常によつて引き起こされることが明らかになった。最もよく知られた癌遺伝子として上皮増殖因子受容体（epidermal growth factor receptor、以下 EGFRと略す。）とその類縁の human EGFR type2 (以下 Her2と略す。別名 erbB- 2とも呼ぶ。）が挙げられる。

EGFRと Her2はそれぞれ分子量 170kD、 185kDの膜貫通型糖蛋白質である。 EGFRと Her2 の細胞内ドメインにはチロシンキナーゼドメインが存在し、リン酸化反応を通して信号を核へ伝えている。互いのキナーゼドメインのァミノ酸配列は約 80%の相同性を持ち構造的によく似ている力 C末端にある自己リン酸化ドメインの相同性は約 30% と低く両レセプターの信号伝達機構に質的違いがあることが推察される。

EGFRは食道癌に 89%と極めて高い頻度で発現している [J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1993 119， 401-407] ₀ 一方、その他の癌種では非小細胞肺癌の 45%に EGFRの過剰発現 [Cancer Res. 1993 53， 2379-2385]、グリオブラスト一マの 50%に EGFRの遺伝子増幅 [Cancer Res. 2000 60, 1383-1387]などの報告がある。

Her2に関しては乳癌の 39%に遺伝子増幅 [J. Clin. Oncol. 1993 11， 1936-1942] 、卵巣癌の 32%に過剰発現 [Cancer Res. 1990 50， 4087-4091]、ホルモン抵抗性前立腺癌の 67%に過剰発現 [Clinical Cancer Res. 2001 7, 2643- 2647]などの報告がある EGFRや Her2は様々な臓器癌に過剰発現しているが、これらによる癌化の分子機構の実態はリン酸化反応を介した信号伝達であり、 EGFRや Her2の発現量の程度と独立にこの信号伝達機能が過剰に活性化することによっても臨床的に癌の進行を悪化させることがある。したがって、標的の発現が癌種によって異なる以上、これらを標的とする治療は当然ながら個別の治療を必要とする。そして癌の性質を診断し標的分子の発現や活性化の有無に合わせて薬剤を選択すべきである。これにより効果的かつ合理的な治療が達成できる。

EGFRと Her2は互いにへテロ複合体を形成し機能的な相互作用が見られる [ Clin. Oncol. 2001 19 (18s) , 32s- 40s]。そして、 EGFRと Her2の共発現により EGFR 単独による癌化がさらに加速されることが知られている [Cell 1987 58， 287-292] 。また、乳癌、口腔癌、肺癌等において EGFRと Her2の共発現があると予後不良になるとの報告もある [Clin. Cancer Res. 1999 5， 4164-4174]。

したがって、 EGFRと Her2両方を阻害する薬剤（以下、単にデュアル阻害剤とも称す。）はどちらか一方にしか作用しない薬剤に比べて適応疾患が広がる有利性があるのみならず、デュアル阻害の相乗作用によって共発現癌に対して効果的な治療を期待できる点でも優れている。

EGFRと Her2の診断技術は既に広く知られている。そして EGFRに結合する抗体に蛍光色素をコンジュゲイトさせて口腔癌の前癌病変を早期に検出する試みも最近報告された [Cancer Res. 2001 61, 4490-4496] ₀ 一方、乳癌患者の Her2発現の有無によりアントラサイクリン系抗癌剤の抗腫瘍効果が予測できることを示唆する報告も出てきた [Clin. Cancer Res. 2001 7, 1577-1581]。したがって、 EGFRや Her2の診断は病気を早期発見する役割と個々の患者に有効で適切な薬剤を選択するために有益となる可能性がある。

EGFR阻害剤としては中和抗体とチロシンキナーゼ阻害剤が抗癌剤の臨床開発段階にある。 Her2阻害剤では中和抗体ハーセプチン（Herceptin：商品名、 Roche社）力 S 転移性乳癌に対する治療剤として既に各国で上市されているが、チロシンキナーゼ阻害剤は抗癌剤の臨床開発段階にある。同様に EGFRと Her2のデュアル阻害剤も研究開発されているがまだ実用化には至つていない。

抗 Her2抗体ハーセプチンは Her2の発現診断ハーセプテスト（Herceptest：商品名 ) で治療対象患者の選別を既に行っているが、適応癌種は乳癌に限定されている。

EGFRキナーゼ阻害剤ィレッサ（Iressa :商品名、 A. Zeneca社）には従来の抗癌剤が持つ骨髄毒性などの重篤な副作用がないこと、そして、非小細胞肺癌に有効であることが臨床試験で示されてきた [Clin. Cancer Res. 2001 7， 3780s]。し力し、ィレッサの臨床試験では治験対象患者の選択のために EGFR発現を事前に確認する作業は行われていない。

EGFRと Her2のデュアル阻害剤は、いずれかの標的分子が発現している癌であれば適応範囲とする事ができるため、幅広い臓器癌を対象とする。し力し、既に記述したように、より正確には標的蛋白の発現又は活性化を診断することにより治療対象患者を適切に選別した上での処方が望ましく、デュアル阻害剤によるこの一連の治療法は医療現場において未だ確立されたものではない。

癌組織中の標的分子の発現と抗癌剤の感受性に関する別の例としては、乳癌組織中のチミジル酸合成酵素（Thymidylate synthase： TS) 発現量及びジヒドロピリミジン脱水素酵素（Dihydropyrimidine dehydrogenase) 活性値と 5FU感受性は関連があるとの報告がある [日本癌治療学会誌 2000 35, 340] o しかし、実際に治療法として 5FU処方前に TS発現診断を行うには至っていない。

上記のように、抗癌剤の処方にあたり、薬剤の標的分子を診断して効果的な治療法を予測することが切望されている。

発明の開示

本発明者らは、前述の事情に鑑み上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、被検対象に対して Her2又はノ及び EGFRの発現又は活性診断を行い、それらの発現又は活性が確認された被検対象に対して Her2又はノ及び EGFR阻害剤を投与することにより、一連の治療法を確立し得ることを見出すに至った。

すなわち、本発明は、このような一連の治療法において投与される Her2又は Z及び EGFR阻害剤、該阻害剤を有効成分とする医薬組成物、該阻害剤を被検対象に投与することを特徴とする予防又は/及び治療方法関し、さらに詳細には以下のとおりである。

本発明は、

(1) Her2又は Z及び EGFR発現又は活性を検出するための検査により被検対象の Her2又は/及び EGFR発現又は活性を診断し、その結果、 Her 2又は/及び EGFRが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して投与するための Her2又は及び EGFR阻害剤、

(2) Her2又は/及び EGFRの活性を検出するための検查により被検対象の Her2又は Z及び EGFRの活性を診断し、その結果、 Her2又は Z及び EGFRが活性化していると判断された被検対象に対して投与するための前記（1) に記載の阻害剤。

(3) Her2及び EGFR発現又は活性を検出するための検査により被検対象の Her2及び EGFR発現又は活性を診断し、その結果、 Her2及び EGFRが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して投与される Her2及び EGFR阻害剤である前記（ 1 ) に記載の阻害剤、

(4) Her2及び EGFRの活性を検出するための検査により被検対象の Her2及び EGFRの活性を診断し、その結果、 Her2及び EGFRが活性化していると判断された被検対象に対して投与するための前記（3) に記載の阻害剤。

(5) 被検対象が、 Her2又は及び EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患を患つていると予想されるものである前記（1) に記載の阻害剤、

(6) 被検対象が、 Her2及び EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患を患っていると予想されるものである前記（3) に記載の阻害剤、

(7) 被検対象がヒトである、前記（1) から（6) のいずれか 1に記載の阻害剤 (8) Her2又は/及ぴ EGFR発現又は活性を検出するための検査が体外検査である前記（1) に記載の阻害剤、

(9) Her2及び EGFR発現又は活性を検出するための検査が体外検査である前記（3 ) に記載の阻害剤、

(10) Her2阻害剤及び EGFR阻害剤からなる合剤である前記（3) に記載の阻害剤

(1 1) Her2阻害剤及び EGFR阻害剤を同時に、別々に、又は経時的に間隔を置いて投与するための前記（3) に記載の阻害剤、

(12) 体外検査が、抗体を用いた免疫学的方法又は核酸及び核酸誘導体を用いたハイブリダィゼーシヨン法である前記（8) 又は（9) に記載の阻害剤、

(13) 抗体を用いた免疫学的方法が、固相酵素免疫検定法、酵素一結合免疫アツセィ法、ラジオィムノアッセィ法、免疫組織化学的方法、及ぴウェスタンプロット法からなる群より選ばれる方法である前記（1 2) に記載の阻害剤、

(14) 核酸及び核酸誘導体を用いたハイブリダィゼーシヨン法が、 RT— PCR 法、 I SH法、 F I SH法、ノーザンブロット法、及びサザンブロット法からなる群より選ばれる方法である前記（1 2) に記載の阻害剤、

(15) 下記一般式（I)

{式中、 Xは N又は CHであり； Yが CR¹であって、 Vが Nであるか；又は Yが Nであって、 Vが CR¹であるか；又は Yが CR¹であって、 Vが CR²であるか；又は Yが CR²であって、 Vが CR¹であり； R¹は Ci— 4アルキル、 — 4アルコキシ、 CH₃ S O₂CH₂CH₂NHCH₂— A r _ (ここで、 Arはフエニル、フラン、チォフェン、ピロ一ル及びチアゾ一ルから選択され、その各々は所望により 1もしくは 2個のハロゲン、 Ci— ₄アルキル又は Cト ₄アルコキシで置換されていてもよレ、。）又は一 C≡C— C (R⁶) (R⁷) (R⁸) (ここで、 R⁶、 R⁷、 R⁸はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ、ハロゲン、 Ci-4アルキル又は Ci— ₄アルコキシ、又は、環が水素原子又は C — 4アルキルで置換されていてもよく、環内に O

、 S又は Nから選ばれる 1から 2個のへテロ原子を含んでいてもよい C₃_₆のシク口アルキルを表す。）を表し； R²は水素、ハロゲン、ヒドロキシ、。アルキル、アルコキシ、。アルキルァミノ、ジ [Ci アルキル] アミノ及ぴ一N

HCO-R⁹ (ここで、 R⁹はじいアルキル、じ ₄アルコキシ、 C₂— ₄アルケニル又は C₂_₄アルキニルを示す。）からなる群から選択され； Uは R³基で置換され、かっさらに所望により独立に選択される少なくとも 1個の R⁴基で置換されていてもよいフエニル、ピリジル、 3H—イミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インドリニノレ、イソインドリニノレ、 1H—インダゾリノレ、 2, 3—ジヒドロー 1 H—インダゾリノレ、 1 H—べンズイミダゾリノレ、 2, 3—ジヒドロ一 1 H—ベンズイミダゾリル又は 1H—ベンゾトリアゾリル基を表し； R ³はベンジル、ハロー、ジハ口一及びトリハロベンジル、ベンゾィル、ピリジルメチル、ピリジルメトキシ、フエノキシ、ベンジルォキシ、ハロー、ジハロー及ぴトリハロベンジルォキシならびにベンゼンスルホニルからなる群から選択されるか；又は R³はトリハロメチルベンジル又はトリハロメチルベンジルォキシを表すか；又は R ³は上記式（a) の基を表し（式中、 R⁵は各々独立にハロゲン、 C — ₄アルキル及ぴ Ci_₄アルコキシから選択され；かつ、 nは 0〜3である）； R⁴は各々独立にヒドロキシ、ハロゲン、 — 4アルキル、 C ₂— ₄アルケニル、 C₂_₄アルキニル、 — 4アルコキシ、ァミノ、 Ci アルキルァミノ、ジ [。卜アルキル] ァミノ、 Ci_₄アルキルチオ、 — ₄アルキルスルフィニル、 C i— ₄アルキルスルホニル、 Ci_₄アルキルカルボ二ル、カルボキシ、力ルバモイル、 C i_₄アルコキシカルボニル、 Ci— ₄アルカノィルァミノ、 N— (じ ₄アルキル）カルパモイル、 N, N—ジ（じアルキル）力ルバモイル、シァノ、ニトロ及びトリフルォロメチルである。 } で示される置換へテロ芳香族化合物、もしくはその薬学的に許容される塩、それらの水和物もしくは溶媒和物、それらの光学活性体もしくはラセミ体、又は、それらのジァステレオマ一混合物である前記（1) 又はから（14) のいずれか 1に記載の阻害剤、 (1 6) (4— （3 _フルォロベンジルォキシ）一フヱニル）一（6— (5 - ((2 一メタンスルホ二ル一ェチルァミノ）メチル）一フラン一2—ィル）一ピリド [3 , 4 - d] ピリミジン _ 4一ィル）一ァミン；

(4—ベンジルォキシフエニル） - (6— （5— （（2—メタンスルホニル一ェチルァミノ）ーメチル）一フラン一 2—ィル）一キナゾリン一 4一ィル）一ァミン； N— { 4 - [(3—フルォロベンジル）ォキシ] フ: 二ル} - 6 - [5 - ({[2— ( メチルスルホ -ル）ェチル] アミノ } メチル）一 2—フリル] —4ーキナゾリンァミン；

N— [4一（ベンジルォキシ）フエニル] — 7—メトキシ _6— [5— ({[2 - ( メチルスルホ -ル）ェチル] アミノ} メチル） _ 2—フリル] —4—キナゾリンァミン；

N- ( 1—ベンジル— 1 H—インダゾ一ル一 5—ィル）一7—メトキシ一 6— [5 ― ({[2— （メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル）一 2—フリル] ー4一キナゾリンァミン；

N- { 3—フルォロ一 4一 [(3—フルォロベンジル）ォキシ] フエ二ル} -6- [

5 - ({[2- (メチルスルホニル）ェチル] アミノ } メチル） _ 2—フリル] 一 4 ーキナゾリンァミン；

N- [1— (3—フルォロベンジル）一 1 H—インダゾール一 5—ィル] - 6 - [ 2— （{[2— (メチルスルホ -ル）ェチル] アミノ} メチル）一 1, 3—チアゾ一ル一4一ィル] —4—キナゾリンァミン；

6 - [5— ({[2 - (メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル）一2—フリル

1 - N- [4— (フエニルスルホニル）フエニル] —4ーキナゾリンァミン； N- { 3—フルォロ一 4— [(3—フルォロベンジル）ォキシ] フエ二ル} — 6— [

2— ({[2— (メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル）一 1, 3—チアゾールー 4ーィル ] —4—キナゾリンァミン；

N- (1—ベンジル— 1H—インダゾール一 5—ィル）一6— [2— ({[2— （メチノレスルホニル）ェチル] アミノ } メチル） - 1 , 3 _チアゾ一ルー 4—ィル] ― 4ーキナゾリンァミン；

N— （3 _フルオロー 4 _ベンジルォキシフエニル）一 6— [5— （{[2— (メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル）一 4一フリル] 一 4—キナゾリンァミン N— (3—クロ口一 4—ベンジルォキシフエニル）一6— [2— ({[2 - (メチノレスルホニル）ェチル] ァミノ）メチル）一4—フリル] 一 4—キナゾリンァミン； N- {3—クロロー 4一 [(3—フルォロベンジル）ォキシ] フエ二ル} —6— [5 一 ({[2 - (メチルスルホニル）ェチル] アミノ } メチル）一 2—フリル] — 4一キナゾリンァミン；

N— ( 1 _ベンジルー 1 H—インダゾ一ル一 5 fル）一7—フルォロ一 6— [5 ― ({[2 - (メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル）一2—フリル] —4一キナゾリンァミン；

N— (3 _トリフノレオロメチノレ一 4—ペンジノレオキシフエ二ノレ） - 6 - [5— ({[ 2— （メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル）一 4—フリル] —4—キナゾリンァミン；

N— [4— (3—クロ口一 4—フルオロフェニル）ァミノ一 7— [3— (4—モルホリニル）プロボキシ] キナゾリン一 6—ィル] アクリルアミド；

N— { 4 - [(3—クロ口一 4—フルオロフェニル）ァミノ] _7_ [3—メチノレー 3— (4 _メチル一 1—ピぺラジュル）一 1—プチニル] —6—キナゾリエル）ァタリルァミド；又は

N— {3—クロ口一 4— [(3—フノレオ口べンジノレ）ォキシ] フエ二ノレ }— 6_ [5— ({ [2- (メタンスルホニル）ェチル] ァミノ）メチル）一 2—フリル] —4ーキナゾリンァミンもしくはその薬学的に許容される塩、それらの水和物もしくは溶媒和物、それらの光学活性体もしくはラセミ体、又は、それらのジァステレオマー混合物である前記（1) から (15) のいずれか 1に記載の阻害剤、

(1 7) N- [4— (3—クロ口一 4—フルオロフェニル）ァミノ] —7— [3—

(4一モルホリニル）プロポキシ] キナゾリン一 6—ィル] アクリルアミド、又は N— {3—クロ口一 4— [(3—フルォロベンジル）ォキシ] フエニル }ー6— [5— ({ [2- (メタンスルホニル）ェチル] アミノ}メチル）一2—フリル] —4ーキナゾリンアミンもしくはその薬学的に許容される塩、それらの水和物もしくは溶媒和物、それらの光学活性体もしくはラセミ体又はそれらのジァステレオマー混合物である前記（1) から（16) のいずれか 1に記載の阻害剤、

(18) 前記（1) から（1 7) のいずれか 1に記載の阻害剤を有効成分として含有し、かつ製薬上許容され得る担体を含有する医薬組成物、

(1 9) Her2又はノ及ぴ EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又はノ及ぴ治療薬である前記（1 8) に記載の医薬組成物、

(20) Her2又は及ぴ EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及ぴ肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である前記（19) に記載の医薬組成物、

(21) Her2又はノ及ぴ EGFR発現又は活性を検出するための検査により被検対象の Her2又は及び EGFR発現又は活性を診断し、その結果、 Her2又は Z及び EGFRが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して投与するための、 Her2又は //及び EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又はノ及び治療薬、

(22) Her2又はノ及び EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である前記（21) に記載の予防又は/及び治療薬、

(23) Her2又はノ及び EGFR発現又は活性を検出するための検査により被検対象の Her2又は/及び EGFR発現又は活性を診断し、その結果、 Her2又は Z及び EGFRが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して有効量の Her2又は Z及び EGFR阻害剤を投与することを特徴とする、 Her2又は/及び EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は及び治療方法、

(24) Her2又はノ及び EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生

、動脈硬化、又は乾癬である前記（23) に記載の予防又は Z及び治療方法、 ( 2 5 ) 前記（1 8 ) 力ら（2 0 ) のいずれか 1に記載の医薬組成物、及び該医薬組成物を Her2又は/及び EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は/及び治療に使用し得るか又は使用すべきであることを記載した書類とを含む商業的パッケージ、

( 2 6 ) Her2又は/及び EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及ぴ肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である前記（2 5 ) に記載の商業的パッケージ、に関する。本発明における各定義は次の通りである。

「Her2又は/及び EGFR発現を検出するための検査」としては、 Her2又は Z及び EGFR に対する抗体を用いた免疫学的方法、又は、核酸及び核酸誘導体を用いたハイプリダイゼーシヨン法が挙げられ、免疫学的方法のより好ましい具体例としては、固相酵素免疫検定法、酵素一結合免疫アツセィ法、ラジオィムノアッセィ法、免疫組織化学的方法、又はウェスタンプロット法等が挙げられ、ハイブリダィゼーシヨン法のより好ましい具体例としては、 RT- PCR法、 ISH法、 FISH法、ノーザンブロット法、又はサザンプロット法等が挙げられる。

「固相酵素免疫検定法 (ELISA = enzyme-1 inked immuno solvent assay)」とは、固相で行う酵素一結合免疫アツセィ法（EIA) であり、抗原または抗体に共有結合で酵素を標識し、抗体または抗原の存在を、酵素活性を利用して検出する酵素一結合免疫ァッセィ法を固相で行なう方法である。この方法は 1971年 E. Engvalらによって開発されたラジオィムノアッセィ（放射性免疫測定法： RIA) の抗原、抗体のいずれかに標識する放射性同位体を非放射性の酵素に置き換えたもので、 1990年にゼプトモル（zeptomole ： 10— ²¹モル）レベルの抗原の測定も可能な方法として開発された。

ELISA法には直接抗体法、間接抗体法、競合法、二抗体サンドィツチ法などがあり、測定目的にあった方法が選択される。固相にはァガロース、マイクロタイターゥエル、ラテックス粒子などが利用され、標識酵素には、西洋ヮサビ由来のペルォキシダーゼが最もよく利用される。その他の酵素としては、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダ一ゼ等も使われる。なお、本発明においては、免疫組織化学的方法も適用可能である。

「ウェスタンプロット法」とは、 PVDF膜などのメンブランに転写された蛋白質を抗体をつかって検出する方法である。抗体と坑原の特異的結合を利用するためサンプルは微量で済み、特異的にタ一ゲットとする蛋白質を検出できる。

「ハイプリダイゼーシヨン」とは、相補核酸鎖の相互作用を意味する。 DNAは相補的相互作用（Cは G、 Aは Tと常に結合）による二本鎖構造をとつているため、相補鎖を分離するとお互いに好んでリア-—ル、すなわち "ハイブリダィズ" する。これは 2本の DNA鎖や、塩基配列が充分に相補的な DNA鎖と RNA鎖の間でも生じる。ハイブリダイゼーションは、複製や転写など全ての DNAの生理的反応において生じ、サザンプロッティングゃノーザンプロッティング、 PCR等多くの分子生物学的手法の基礎をなす。

「PCR (Polymerase Chain Reaction)」とは、 DNA Polymeraseの反応を連続的、連鎖的に実行することにより、 1セットの primerの間にはさまれる DNA断片を特異的に増幅する反応である。中でも、逆転写反応と PCRを組み合わせた「RT-PCR (reverse transcription— polymerase chain reactionノ法」はもつとも感度; 0 i¾い。

iSH (in situハイブリダイゼーション）法」は組織断片での遺伝子発現の検出法として有効な手段である。本法と蛍光検出法とを組み合わせたものが FISH法である

「ノーザンプロット法」とは、 mRNAの解析を目的とした技術である。 2次構造をとりやすい RNAを変成条件下で電気泳動し、メンブレン（ナイロンやニトロセルロース等）にトランスファ一する。変成方法によって 1.ホルムアミドとホルムアルデヒドを用いる方法、 2.グリオキサールを用いる方法、又は 3.水酸化メチル水銀を用いる方法等がある。

「サザンブロット法」とは、 1975年に Southernによって記載された転写の手法であり、標識された核酸プローブと相補的な塩基配列を持つ、転写された DMの領域を検出するものである。

Her2又は/及び EGFRの発現又は活性を検出するには、患者から採取した組織（癌組織、血管壁組織、皮膚、口腔粘膜等）あるいは体液（血液、リンパ液）などを上記で挙げたような検査方法に付して Her2又はノ及び EGFRの発現又は活性を検出する

「Her2又は Z及び EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患」の具体例としては、脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、食道癌、胃癌、大腸癌、非小細胞肺癌、膝癌、胆管癌、胆嚢癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、皮膚癌、小児固形癌、骨腫瘍、血管腫等の癌、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、乾癬等が挙げられ、脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、食道癌、胃癌、大腸癌、非小細胞肺癌、膝癌、胆管癌、胆嚢癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、皮膚癌等が好ましく、脳腫瘍、胃癌、大腸癌、非小細胞肺癌、脬癌、腎癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌等がより好ましい。

「Her2又は/及び EGFRの過剰発現又は活性化」とは、生体の恒常性（ホメォスタシス）にとつて必要な発現量又は活性以上の発現又は活性であり、同一起源の正常組織にとって必要な発現量又は活性以上の発現又は活性である。

「Her2又は及び EGFRが過剰発現又は活性化している患者」とは、 Her2又は EGFR の少なくとも一方が過剰発現又は活性化している患者、好ましくは両方が過剰発現又は活性化している患者である。本発明の Her2又は/及ぴ EGFR阻害剤は、上記のような Her2又は /及び EGFRが過剰発現又は活性化している患者の治療のために投与することを特徴とする。

本発明の「Her2又は Z及び EGFR阻害剤」としては、 Her2及び EGFRが過剰発現又は活性化している患者に対して投与する Her2及び EGFR阻害剤であることが好ましく、 Her2阻害剤及び EGFR阻害剤からなる合剤であつても良く、 Her2阻害剤及び EGFR阻害剤を同時に、別々に、又は、経時的に間隔を置いて使用することも可能である。即ち、 Her2阻害剤と EGFR阻害剤とを種々異なるルートにより同時に、別々に、あるいは、例えば同じ日に時間をずらして投与したり、数日から数週間又は数ケ月にわたり、所定間隔で投与することも可能である。

本発明において使用する Her2阻害剤としては、抗 Her2抗体ハーセプチン（Roche) 、 TAK-165 (武田）、 ETH-102 (ExonHit Ther. ) 等が挙げられ、また、本発明において使用する EGFR阻害剤としては、ィレッサ（A. Zeneca)、 OSI- 774 (Roche) , ΡΚΙ-166 (Novartis)、 ΕΚΒ-569 (Wyeth)等が挙げられる。これらの製造等に関しては、 TAK- 165 については WO02/06249号公報、特開 2001- 348385号公報、特開 2002-69070号公報、特開平 9-136877号公報、特開平 11- 60571号公報等に、ィレッサについては W O 96/33980号公報、特許第 3040486号公報に、 0SI- 774については WO96/30347号公報に、 PKI- 166については W O 97/02266号公報に、 EKB-569については米国特許第 6， 002, 008号に記載されている。

これらを Her2阻害剤及び EGFR阻害剤からなる合剤とする場合、それぞれの阻害剤から、 1つ又は複数ずつを選択し適宜公知の方法により合剤を製造して使用することが出来る。

図面の簡単な説明

図 1は、実施例 4の化学発光をルミノ C C Dカメラで撮影した図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明の阻害剤としては、デュアル阻害剤が好ましく、具体例としては、当該酵素の蛋白質キナーゼ活性の阻害に基づき作用する阻害剤、当該 Her2又はノ及び EGFR の細胞内蛋白質含量を減少させることにより作用する阻害剤、又は当該 Her2又は/ 及び EGFRと信号伝達分子との物理的結合の阻害剤等が挙げられる。

「デュアル阻害剤」のより具体的な化合物の例としては、 WO 9 9 / 3 5 1 4 6 号公報（特表 2 0 0 2 _ 5 0 0 2 2 5号公報）に開示されている下記一般式（I )

(R^s) _n (a)

{式中、 Xは N又は C Hであり； Yが C R ¹であって、 Vが Nであるか；又は Yが Nであって、 Vが CR¹であるか；又は Yが CR¹であって、 Vが CR²であるか；又は Yが CR²であって、 Vが CR¹であり； R¹は CH₃S0₂CH₂CH₂NHCH ₂— Ar—基（ここで、 A rはフエニル、フラン、チォフェン、ピロール及びチアゾールから選択され、その各々は所望により 1もしくは 2個のハロゲン、 Ci-4ァルキル又はアルコキシ基で置換されていてもよい）を表し； R²は水素、ハロゲン、ヒドロキシ、。卜アルキル、 — ₄アルコキシ、 Ci_₄アルキルアミノ及ぴジ [Ci アルキル] ァミノからなる群から選択され； Uは R ³基で置換され、かつさらに所望により独立に選択される少なくとも 1個の R⁴基で置換されていてもよいフエニル、ピリジル、 3 H—イミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インドリ二ノレ、イソインドリニル、 1H—インダゾリル、 2， 3—ジヒドロー 1H—ィンダゾリル、 1 H—ベンズイミダゾリル、 2， 3—ジヒドロー 1 H—ベンズイミダゾリル又は 1 H—ベンゾトリアゾリル基を表し； R³はベンジル、ハロー、ジハロ一及びトリハロベンジル、ベンゾィル、ピリジルメチル、ピリジルメトキシ、フエノキシ、ベンジルォキシ、ハロー、ジハ口一及ぴトリハ口べンジルォキシならびにベンゼンスルホニルからなる群から選択されるか；又は R³はトリハロメチルベンジル又はトリハロメチルベンジルォキシを表すか；又は R ³は上記式（a) の基を表し（式中、 R ⁵は各々独立にハロゲン、 C — ₄アルキル及ぴじ卜 ₄アルコキシから選択され；かつ、 nは 0〜3である）； R⁴は各々独立にヒドロキシ、ハロゲン、 C 丄一 ₄アルキル、 C₂_₄アルケニル、 C₂_₄アルキニル、じ ₄アルコキシ、ァミノ、じいアルキルァミノ、ジ [じアルキル] ァミノ、じ ₄アルキルチオ、 C — ₄ アルキルスルフィエル、 C卜 ₄アルキルスルホニル、 C — ₄アルキルカルボニル、カルボキシ、力ルバモイル、 C卜₄アルコキシカルボニル、 — ₄アルカノィルァミノ、 N— (C — ₄アルキル）カルパモイル、 N, N—ジ（じ ₄アルキル）カルバモイ Λ シァノ、ニトロ及びトリフルォロメチルである。} で示される置換へテロ芳香族化合物、特に好ましくは、 Ν— {3—クロロー 4一 [(3—フルォ口べンジル

) ォキシ] フエ二ル}— 6— [5 - ({ [2— (メタンスルホニル）ェチル] アミノ} メチル） —2—フリル] —4ーキナゾリンァミン等が、又は WO00/3 1048 号公報に開示されている N— [ 4— （3—クロロー 4—フルオロフェニル）ァミノ ] - 7 - [ 3— （4—モルホリエル）プロボキシ] キナゾリン一 6—ィル] アタリルアミド等が挙げられる。

一般式（I ) の化合物は、薬学的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物、幾何異性体、光学異性体もしくはラセミ体、又はジァステレオマー混合物のいずれの形態であってもよい。薬学的に許容される塩としては、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸おょぴ硫酸などの無機酸塩、ギ酸、酢酸、酒石酸、トリフノレオ口酢酸、クェン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、安息香酸、フタル酸、グリコーノレ酸、グノレクロン酸、グノレコン酸、コハク酸、メタンスノレホン酸、 p - トルエンスルホン酸、イセチオン酸などの有機酸塩、ナトリウム、カリウム、マグネシゥム、カルシウムなどのアルカリ金属 'アルカリ土類金属塩、アンモニゥム、テトラメチノレアミン、トリェチルァミン、ベンジルァミン、フエネチルァミン、モノエタノ一レアミン、ジェタノ一ルァミン、トリス（ヒドロキシェチルァミン）などの有機塩基塩、リジン、アルギニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸などのアミノ酸塩が挙げられる。

一般式（I) の化合物の製造方法及ぴデュアル阻害作用については WO 9 9 / 3 5 1 4 6号公報に、 N— [ 4 - ( 3—クロ口一 4 _フルオロフェニル）ァミノ一 7— [ 3— （4一モルホリニル）プロボキシ] キナゾリン一 6 _ィル] アクリルアミドの製造方法及びデュアル阻害作用については WO O 0 / 3 1 0 4 8号公報に記載されている。

本発明に係るデュアル阻害薬には上記した全ての化合物の他に、デュアル阻害作用を有するその他の化合物（例えば、 WO 0 2 / 0 6 6 4 5 1に記載されている化合物）が含まれる。

本発明の阻害剤を医薬として用いる場合、本発明の阻害剤を製薬上許容しうる担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、矯味剤、矯臭剤、乳化剤、希釈剤、溶解補助剤等）と混合して得られる医薬組成物あるいは製剤（錠剤、ピル剤、カプセル剤、顆粒剤

、散剤、シロップ剤、ェマルジヨン剤、エリキシル剤、懸濁剤、溶液剤、注射剤、点滴剤あるいは坐剤等）の形態で経口的又は非経口的に投与することができる。本発明において、非経口とは、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射あるいは点滴法等を含むものである。

経口投与用の固形投与剤型としては、散剤、顆粒剤、錠剤、ピル剤、カプセル剤等の上記したものがあげられる。そのような剤型において、活性成分化合物は薬学上許容され得る少なくとも一つの添加物（不活性希釈剤、滑沢剤、保存剤、抗酸化剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味付与剤、フレーバー付与剤、パーフユーム剤等）を含むことができる。

経口投与用の液剤は、医薬として許容されるェマルジヨン剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤、溶液剤等が挙げられ、それらは当該分野で普通に用いられる不活性希釈剤を含んでいてもよい。

注射用調剤（無菌注射用水性懸濁物あるいは油性懸濁物等）は、適当な分散化剤又は湿化剤及び懸濁化剤等を用いて当該分野で知られた方法で調製することができる。その無菌注射用調剤は、また、希釈剤あるいは溶剤を用いた無菌の注射のできる溶液または懸濁液であってもよい。さらに、通常溶剤又は懸濁化溶媒として無菌の不揮発性油も用いることができる。このためには、いかなる不揮発性油も脂肪酸も使用できる。

直腸投与用の坐剤は、その薬物と適当な非刺激性の補形剤、例えば常温では固体であるが、腸管の温度では液体で、直腸内で融解し、薬物を放出するもの等と混合して製造することができる。

投与量は、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組合せ、治療を行っている患者のそのときの病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。例えば上記一般式（I) で表される化合物を使用する場合、その 1日の投与量は、患者の状態や体重、化合物の種類、投与経路等によって異なるが、経口的には 0. 0 1〜1 0 0 O in g Z k g体重 Z日

、好ましくは 0. 0 5〜5 0 O m g / k g体重/日を、一日 1〜数回に分けて投与する。また、非経口的には、皮下、静脈内、筋肉内又は直腸内に、約 0 . 0 1〜5 0 m g/k g体重日、好ましくは 0. 01〜201118ノ¾: ₈体重 Z日投与するのが好ましい。

本発明の Her2又は及び EGFRの発現又は活性化した患者に用いる予防又はノ及び治療剤は、 Her2又は及び EGFRの発現又は活性を検査し、 Her2又はノ及ぴ EGFRが過剰発現又は活性化していると判断された場合には、 Her2又は及ぴ EGFRの発現又は活性化に起因する疾患を患っていると判定し、当該患者に使用し得るか若しくは使用すべきであることを記載した書類とともにパッケージすることによって、好適に医薬品として提供される。

(実施例）

以下、本発明について実施例を挙げて詳細に説明するが、その要旨を超えない限り、本発明は以下に限定されるものではない。

実施例 1

EGFRチロシンキナーゼ阻害作用

(方法）

試験に用いた薬剤 PD 0183805は、 EGFRチロシンキナーゼを阻害し EGFR過剰発現癌 A431に対して in vivo制癌効果を示すことが知られている "。また、 PD 0183805の 2 塩酸塩 CI-1033は MDA- MB- 453細胞をハーレギュリン刺激した時の Her2、 erbB3そして erbB4のチロシンリン酸化を阻害することが報告されている ²⁾。

以下の記載において PD 0183805を PD、 PD 0183805の 2塩酸塩 CI- 1033を PD · 2HC1 と略す。 PDの化学名及び化学構造は下記のとおりである。

N- [4 - (3—クロロー 4—フノレオロフェニノレ）アミノー 7_ [3— （4—モノレホリニル）プロポキシ] キナゾリン一 6—ィル] アクリルアミド

7 また、 PD及ぴ PD · 2HC1の合成は、 WO 00/3 1 048号公報に記載された方法に準じて行なった。

1) Vincent, P. W.， Patmore, S. J. , Bridges, A. J., Kirkish, し S. , Dudeck, R. C. , Leopold, W. R. , Zhou, H. , Elliott, W. L. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. , 40： 117, 1999.

2) Slichenmyer, . J. , Elliott, . L. and Fry, D. W. Semin. Oncol. , 28： 80, 2001.

ヒト類表皮癌細胞 A431 (東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センタ一より供与；カタ口グ番号 TKG-0182、または ATCCより購入の場合； ATCC番号 CRL- 1555) より得られた部分的に精製された EGFRを用い、 Linda J. Pikeらのチ口シンキナーゼ活性測定方法 (Proceedings of the National Academy of Science of the U. S. A.， 1982, 79, 1433)を改良して行った。詳しい方法は以下の通りである。

A431細胞を 10%FBS添加 DMEM培地中で 3 Ί。じ、 5%炭酸ガス下で培養し、この細胞を 10 mM HEPES緩衝液（pH7.4)、 0.25 Mサッカロース、 0.1 mM EDTAを含む溶液中でホモジネート後、 3， 000 XGで 5分間遠心分離し、更にその上清を 100，000XGで 3 0分間遠心分離を行い A431細胞膜画分を得、これを酵素源である部分精製 EGFRとして測定に供した。

A431細胞膜画分（1 0〜1 5 β g), 30 mM HEPES緩衝液（pH7.4)、 2 mM MnCl₂ 、 100 μΜ Na₃V0_4N 及ぴジメチルスルホキシド (DMS0)に溶解した薬剤の反応混液（終濃度 1% DMS0) に、 1 00 n gの EG Fを加えた後、合成基質アンジォテンシン I I (Asp- Arg- Val- Tyr - lie- His - Pro- Phe) 50 μ g、アデノシン三リン酸（γ - ^{3 2} Ρ -標識体 3 7KBqを含む）最終濃度 1 O Mを加えて反応を開始した。この時の容量は 60 μ Lである。

反応は氷中にて 30分間行い、 1 0 mg/mL牛血清アルブミンを 6 Lと 20 %トリクロ口酢酸 25 μ L加えて反応を停止し、そのまま氷中に 3 0分間放置したその後 5000Gで 2分間遠心した後、上清を 40 μ Lサンプリングして Ρ 8 1 ホスホセルロースペーパーに吸着させた。これを 0. 75%リン酸水に 5分間浸して洗浄する操作を 4回繰り返した後ぺ一パ一を取り出し、液体シンチレーションカゥンターで³² Pのカウントを測定し、この値を Aとした。

同時に薬剤を添加しない反応、薬剤および E G F共に添カ卩しない反応の力ゥントも測定し、それぞれ B、 Cとした。

これらの値から、チロシンキナーゼ阻害率は、下記の式により求められる。阻害率（％)= 100- {(A-C) I (B-C)} X 100

薬剤の添加濃度を変化させて得られた阻害率より I C₅₀値（50%阻害濃度）を算出した。結果を下記表に示す。

(表 1)

実施例 2

細胞 He r 2チロシンキナーゼ阻害作用

(方法）

細胞は 659番目のパリンをグルタミン酸に置換することにより恒常的に活性化した変異 C- _erbB2で形質転換した NIH3T3マウス繊維芽細胞株 (東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより供与；カタログ番号 TKG-0298) を用いた（以下 A4細胞と記す。）。この細胞株は 10%FBS添加 DMEM/F12混合培地（以下アツセィ培地と記す。）により 37°C、 5%炭酸ガス下でプラスチック培養皿中で培養維持した。

アツセィ培地に懸濁した A4細胞を 1 2ゥエルプレートに 3X10⁵/well蒔き込み、コンフレントになった細胞を薬剤とともに 2時間 37°Cで培養した。細胞を PBSで 1回洗浄した後、細胞溶解バッファ（60 mM トリス（pH6.8)、 2% SDS、 10% グリセロール、 5%ベータメルカプトエタノール、 0.001%ブロモフエノールブルー）に再懸濁し、超音波処理したものを全細胞溶解液としてウェスタンプロット法に用いた。

蛋白量 25 g分の全細胞溶解液を 7.5% SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、 PVDF膜に転写した。膜をブロッキングした後、 0. 1%ツイーン 20添カ卩トリス緩衝液中で抗ホスホチロシンマウスモノクローナル抗体 PY20 (Transduction Laboratories, カタ口グ番号 P11120)とィンキュベーシヨンし、次に HRP標識抗マゥス 2次抗体（DAK0、カタ口グ番号 P0447)で処理した。膜を化学発光試薬 ECL western blotting detection reagents (Amersham pharmacia biotech、ス-タロク番号 RPN2209) で処理し化学発光をルミノ C C Dカメラで撮影した。化学発光の撮影と画像解析は Macintosh版デンシトグラフ（ATT0、製品型式 AE- 6930)を用いて行った。

得られたリン酸化シグナルを定量化し、化合物非添加時のシグナルを 1 0 0 %コントロールとし、パックグラウンドシグナルを 0 %とし、薬剤によるリン酸化阻害を％コントロールで評価した。結果を下記表に示す。

(表 2 )

実施例 1、 2の結果より、 PDは Her2又は EGFRのいずれに対しても阻害作用を示すこと、即ち、 PDが Her2又は Z及び EGFR阻害剤として作用することが理解できる。実施例 3

in vivo制癌効果

(方法）

ヒト膝癌 HPAC (ATCC番号 CRL-2119)、ヒト大腸癌 LS174T (ATCC番号 CL- 188) そしてヒト肺癌 NCI- H520 (ATCC番号 HTB - 182) は ATCCより購入した。ヒト子宮頸癌 E180は東北大学加齢医学研究所 ·医用細胞資源センターより供与いただいた（カタログ番号 TKG- 0437、 ATCCより購入の場合は ATCC番号 HTB- 33)。 Balbん雌ヌードマウス（ Balbん AJcl- nuマウス、日本クレア社、入荷時 5週令）の背部皮下に P B Sに懸濁した培養ヒト癌細胞を 5 Χ 10⁶/100 /ί 1移植し、 7日前後経過して移植腫瘍の平均体積がほぼ 100 賺 ³となった時点で各群の平均腫瘍体積値が一定になるように 1群 4匹ずつ群分けを行った。

腫瘍体積値はノギスで長径と短径を測定し、 [ (短径） ² Χ (長径ノ2 ) ] =腫瘍体積 [讓 ³]とした。群分けを行った日から 14日間連日薬剤を 1日 1回強制経口投与し、対照群のマウスには薬剤を与えなかった。投与開始日の腫瘍体積値を 1とした相対腫瘍増殖率を対照群と薬剤処理群で算出した。制癌効果を％コントロールで示した。％コントロールは下記式により算出した。

%コントロール = [(薬剤処理群の最終日の平均相対腫瘍増殖率一 1) / (対照群の最終 3の平均相対腫瘍増殖率一 1)] X I 00

結果を下記表に示す。

(表 3)

(表 4)

(表 5)

(表 6)

上記各表に示した結果から、 Her2又はノ及び EGFR阻害剤は、（EGFR、. Her2両陽性）、 (EGFR陽性、 Her2陰性）又は（EGFR陰性、 Her2陽性）の癌細胞に対して増殖抑制効果を示すこと、即ち、 Her2又は/及び EGFR阻害剤は Her2又は及び EGFRの過剰発現

2 又は活性化による疾患の予防 ·治療に有効であることが理解できる。

実施例 4

ウェスタンブロット法による EGFR又は Her2の発現確認

(方法）

ヒト膝癌 HPAC (ATCC番号 CRL- 2119)、 PANC1 (ATCC番号 CRL- 1469)、ヒトリンフォーマ Daudi (ATCC番号 CCL- 213)、ヒト大腸癌 LS174T (ATCC番号 CL- 188) は ATCCより購入した。ヒト外陰癌 A431 (カタログ番号 TKG- 0182)、ヒト子宮頸癌 ME180 (カタログ番号 TKG-0437)、ヒト舌癌 HSC- 3 (カタ口グ番号 TKG-0484)、 ( -4(カタ口グ番号 TKG- 0489 ) は東北大学加齢医学研究所 ·医用細胞資源センターより供与いただいた。

100應培養皿でほぼコンフレントになるまで細胞培養した。 100匪培養皿の培地を除去し PBSで 1回洗浄した後に約 0. 6mLの RIPAバッファ（50mM トリス（pH7. 4)、 150mM 塩化ナトリゥム、 1% NP- 40、 0. 25%デォキシコール酸、 lmM EDTA、プロテアーゼィンヒビターカクテル）を添加し、氷上で 1 0分間静置した。細胞溶解液を 1. 5mL遠心チューブに回収して 10, OOOrpmで 10分間冷却遠心した。上清を別なチユーブに移してこの細胞溶解液をウェスタンブロット法に用いた。

蛋白量 25 g分の細胞溶解液を 7. 5% SDS-ポリアクリルアミド電気泳動にかけた後 PVDF膜に転写した。膜をプロッキングした後、 0. 1%ツイ一ン 20添カ卩トリス緩衝液中で EGFRに対する特異抗体（Santa Cruz Biotechnology, カタログ番号 sc- 03)または Her2に対する特異抗体（Upstate biotechnology カタログ番号 06- 562)とインキュべーシヨンし、次に HRP標識抗ゥサギ 2次抗体（ICN Pharmaceuticals カタログ番号 55689)で処理した。膜を化学発光試薬 ECL western blotting detection reagents (Amersham pharmacia biotech、カタ口グ番号固 2209)で処理しィ匕学発光をルミノ C C Dカメラで撮影した。

図 1に画像を示した。また、下記表に図 1中の各レーンの説明を示した。 (表 7 )

レーン細胞株上段図下段図

EGra発現 Her2発現

1 HPAC 陽性陽性

2 PANC1 陽性陽性

3 ME180 陽性陰性

4 Daudi 陰性陰性

5 A431 陽性

6 LS174T 陰性陽性

7 HSC3 陽性

8 HSC4 陽性陽性

実施例 5

RT - PCR法による EGFR又は Her2の発現確認

(方法）

Molecular Cloning, A Laboratory Manual Vol. 1, Second Editionに従レヽ実験行なった。以下に詳細に記述する。

癌細胞から S. N. A. P. ™ total RNA isolation kit (invitrogen, カタログ番号 45-0472) により total RNAを抽出した。得られた total RNAのうち 1 gを用い逆転写反応を行なった。逆転写反応は 1st Strand cDNA Synthesis Kit for RT- PCR (Roche 、カタログ番号 1 483 188) を用いて行なった。

このときのプライマーとしてはランダムプライマー p (dN) 6を用いた。得られた cDNAの 1 μ Lを用いて PCRを行った。 EGFR mRNAの検出時はプライマーは Human Epidermal growth factor receptor and GAPDH genes Dual - PCR kit (Maxim Biotech 、カタログ番号 DP- 10065- G) 添付のプライマーを用い、酵素は TaKaRa Ex Taq™ (宝酒造、カタログ番号 RR001A)を用いた。反応条件は 96°C 1分 1サイクル、％°C 1分 58 °C 1分 30秒 30サイクル、 72°C 10分 1サイクルで行なった。 Her2 mRNAの検出時はプライマーは RT- PCR primer set HUMAN erb - B2 (CLP, カタログ番号 5254· H) 添付のプライマーを用い、酵素は TaKaRa Ex Taq™ (宝酒造、カタログ番号 RR001A) を用いた。反応条件は 94°C 5分 60°C 5分 1サイクル、 72°C 2分 94°C 1分 60°C 1分 40サイクル、 72°C10分 1サイクルで行なった。得られた PCR産物についてァガロース電気泳動を行い、発現の有無の確認を行なった。上記実施例 4、 5の結果から、ウェスタンプロット法や RT-PCR法により Her2又は

EGFRの発現確認が可能であることがわかる。

また、上記実施例 2、 4の結果から、 Her2又は EGFR活性化の検査が可能であることが分かる。このような検査法を用いて患者における Her2又は及び EGFRの発現又は活性を検査し、 Her2又はノ及ぴ EGFRが過剰発現又は活性化していると判断された場合には、 Her2又はノ及ぴ EGFRの発現又は活性化に起因する疾患を患っていると判定し、本発明の医薬品を投与する。

産業上の利用可能性

本発明の阻害剤は、上記のように癌患者に対する有効な治療法であることに加え、前立腺癌や乳癌でのホルモン感受性癌から抵抗性癌への移行を防ぐための予防又は Z及び治療薬としても期待できる。更に、固形癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、乾癬等の予防又は及び治療薬としても期待できる。本出願は、日本で出願された特願 2 0 0 2 - 1 6 2 1 3 0を基礎としており、それらの内容は、本明細書に全て包含される。

Claims

請求の範囲

1 . Her2又は Z及ぴ EGFRの発現又は活性を検出するための検査により被検対象の Her2又は Z及ぴ EGFRの発現又は活性を診断し、その結果、 Her2又は/及び EGFRが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して投与するための Her2又は /及び EGFR阻害剤。

2 . Her2又は Z及び EGFRの活性を検出するための検查により被検対象の Her2又は /及び EGFRの活性を診断し、その結果、 Her2又は Z及ぴ EGFRが活性化していると判断された被検対象に対して投与するための請求の範囲 1に記載の阻害剤。

3 . Her2及び EGFRの発現又は活性を検出するための検查により被検対象の Her2及ぴ EGFRの発現又は活性を診断し、その結果、 Her2及び EGFRが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して投与するための請求の範囲 1に記載の阻害剤

4 . Her2及ぴ EGFRの活性を検出するための検査により被検対象の Her2及ぴ EGFR の活性を診断し、その結果、 Her2及び EGFRが活性化していると判断された被検対象に対して投与するための請求の範囲 3に記載の阻害剤。

5 . 被検対象が、 Her2又は/及び EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患を患つていると予想される患者である、請求の範囲 1から 4のいずれか 1項に記載の阻害剤。

6 . 被検対象が、 Her2及び EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患を患っていると予想される患者である、請求の範囲 1カゝら 4のいずれか 1項に記載の阻害剤。

7 . 被検対象がヒトである、請求の範囲 1から 6のいずれか 1項に記載の阻害剤

8 . Her2又は Z及ぴ EGFRの発現又は活性を検出するための検査が体外検査である請求の範囲 1から 4のいずれか 1項に記載の阻害剤。

9 . Her2及ぴ EGFRの発現又は活性を検出するための検査が体外検査である請求の範囲 1から 4のいずれか 1項に記載の阻害剤。

1 0 . Her2阻害剤及び EGFR阻害剤からなる合剤である請求の範囲 3に記載の阻害剤。

1 1. Her2阻害剤及び EGFR阻害剤を同時に、別々に、又は経時的に間隔を置いて投与するための請求の範囲 1力ら 9のいずれか 1項に記載の阻害剤。

1 2. 体外検査が、抗体を用いた免疫学的方法又は核酸及び核酸誘導体を用いたハイブリダイゼーション法である請求の範囲 8又は 9に記載の阻害剤。

1 3. 抗体を用いた免疫学的方法が、固相酵素免疫検定法、酵素一結合免疫アツセィ法、ラジオィムノアッセィ法、免疫組織化学的方法、及びウェスタンプロット法からなる群より選ばれる方法である請求の範囲 12に記載の阻害剤。

14. 核酸及ぴ核酸誘導体を用いたハイブリダィゼーシヨン法が、 RT— PCR 法、 I SH法、 F I SH法、ノーザンプロット法、及びサザンブロット法からなる群より選ばれる方法である請求の範囲 1 2に記載の阻害剤。

1 5. 下記一般式（I)

(R"n (a)

{式中、 Xは N又は CHであり； Yが CR¹であって、 Vが Nであるか；又は Yが Nであって、 Vが CR¹であるか；又は Yが CR¹であって、 Vが CR²であるか；又は Yが CR²であって、 Vが CR¹であり； R¹はアルキル、 Ci_₄アルコキシ、 CH₃S0₂CH₂CH₂NHCH₂— A r _ (ここで、 Arはフエニル、フラン、チォフェン、ピロール及びチアゾールから選択され、その各々は所望により 1もしくは 2個のハロゲン、 C ₄アルキル又は Ci_₄アルコキシで置換されていてもょレ、。）又は一 C≡C— C (R⁶) (R⁷) (R⁸) (ここで、 R⁶、 R⁷、 R⁸はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ、ハロゲン、 C _₄アルキル又はアルコキシ、又は、環が水素原子又はアルキルで置換されていてもよく、環内に O 、 S又は Nから選ばれる 1から 2個のへテロ原子を含んでいてもよい C₃— ₆のシク口アルキルを表す。）を表し； R²は水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、じいアルコキシ、じアルキルァミノ、ジ [。アルキル] アミノ及ぴ一N HCO-R⁹ (ここで、 R⁹は Ci— ₄アルキル、アルコキシ、 C₂— ₄ァルケ二ル又は C₂_₄アルキニルを示す。）からなる群から選択され； Uは R³基で置換され、かつさらに所望により独立に選択される少なくとも 1個の R⁴基で置換されていてもよいフエニル、ピリジル、 3H—イミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インドリニノレ、イソインドリ-ル、 1H—インダゾリル、 2， 3—ジヒドロ一 1 H—インダゾリル、 1 H—ベンズイミダゾリル、 2， 3—ジヒドロ _ 1 H—ベンズイミダゾリル又は 1 H—ベンゾトリアゾリル基を表し； R³はベンジル、ハロー、ジハ口一及ぴトリハロベンジル、ベンゾィル、ピリジルメチル、ピリジルメトキシ、フエノキシ、ベンジルォキシ、ハロー、ジハロー及びトリハロベンジルォキシならびにベンゼンスルホ-ルからなる群から選択されるか；又は R³はトリハロメチルベンジル又はトリハロメチルベンジルォキシを表すか；又は R ³は上記式（a) の基を表し（式中、 R⁵は各々独立にハロゲン、 Ci_₄アルキル及び Ci_₄アルコキシから選択され；かつ、 nは 0〜3である）； R⁴は各々独立にヒドロキシ、ハロゲン、 ₄アルキル、 C₂_₄アルケニル、 C₂_₄アルキニル、アルコキシ、ァミノ、じ卜アルキルァミノ、ジ [じアルキル] ァミノ、 ₄アルキルチオ、。丄— ₄アルキルスルフィニル、 C卜₄アルキルスルホニル、 Ci— ₄アルキルカルボ- ル、カルボキシ、力ルバモイル、 C卜 ₄アルコキシカルボニル、 ₄アルカノィルァミノ、 N— ( いアルキル）カルパモイル、 N, N—ジ（Ci アルキル）カルパモイル、シァノ、ニトロ及びトリフルォロメチルである。 } で示される置換へテロ芳香族化合物、もしくはその薬学的に許容される塩、それらの水和物もしくは溶媒和物、それらの光学活性体もしくはラセミ体、又は、それらのジァステレオマ —混合物である請求の範囲 1から 14のいずれ力 1項に記載の阻害剤。

16. (4— (3—フルォロベンジルォキシ）一フエニル）一（6— (5— ((

2—メタンスホニルーェチルァミノ）メチル）一フラン一 2—ィル）一ピリド [ 3, 4 - d] ピリミジン一 4—ィル）一ァミン；

(4—ベンジルォキシフエ-ル）一（6— (5— ((2—メタンスノレホニルーェチルァミノ）一メチル）一フラン一 2-ィル）一キナゾリン一 4—ィル）一ァミン； N- {4一 [(3—フルォロベンジル）ォキシ] フエ二ル} —6— [5 - ({[2 - ( メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル）一2—フリル] —4—キナゾリンァミン；

N- [4— (ベンジルォキシ）フエニル] _ 7—メトキシー 6— [5 - ({[2 - ( メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル） _2—フリル] —4—キナゾリンァミン；

N— ( 1 _ベンジル一 1 H—インダゾール一 5—ィノレ）一7—メトキシ一 6— [5 - ({[2- (メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル）一2—フリル] —4一キナゾリンァミン；

N- {3—フルオロー 4一 [(3—フルォロベンジル）ォキシ] フエ二ル} -6- [

5 - ({[2 - (メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル）一2—フリル] _4 —キナゾリンァミン；

N— [ 1 - (3—フルォロベンジル）一 1 H—インダゾール— 5—ィル] ー6— [ 2- ({[2 - (メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル）一 1， 3 _チアゾール一4一ィル] —4—キナゾリンァミン；

6 - [5 - ({[2_ (メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル）一2—フリル ] 一 N— [4 - (フエニノレスノレホニノレ）フエ二ノレ] 一 4ーキナゾリンァミン；

N— {3—フルオロー 4一 [(3—フルォロベンジル）ォキシ] フエ二ル} —6— [ 2- ({[2- (メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル）ー 1， 3—チアゾ一ルー 4—ィル] 一 4—キナゾリンァミン；

N- ( 1—ベンジル _ 1 H—インダゾールー 5—ィル）一6— [2— （{[2— （メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル）一 1, 3—チアゾ一ノレ _ 4—ィル] - 4ーキナゾリンァミン；

N— （3—フルォロ 4一べンジルォキシフエニル）一6— [5— ({[2— (メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル）一4一フリル] —4—キナゾリンァミン

N- (3—クロ口 _ 4一べンジルォキシフエニル）一6— [2- ({[2— (メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル）一4—フリル] —4—キナゾリンァミン； N— {3—クロ口一4— [(3—フルォロベンジル）ォキシ] フエ二ル} —6— [5 一 ({[2- (メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル） _2—フリル] 一 4— キナゾリンァミン；

N— ( 1—ベンジ/レ一 1 H—インダゾール一 5—ィノレ）一7—フノレオロー 6— [5 一 ({[2 - (メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル）一2—フリル] _4一キナゾリンァミン；

N- (3—トリフノレオロメチルー 4—ペンジノレオキシフエニル）一 6— [5 - ({[ 2 - (メチルスルホニル）ェチル] アミノ} メチル）一4一フリル] —4—キナゾリンァミン；

N- [4— (3—クロ口一 4—フノレオロフェニノレ）ァミノ一 7— [3— （4—モノレホリニル）プロボキシ] キナゾリン一 6—ィル] アクリルアミド；

N- {4- [(3—クロ口一 4—フルオロフェニノレ）ァミノ] —7— [3—メチノレ一 3— (4—メチルー 1—ピぺラジュル） _ 1—ブチュル] 一 6—キナゾリ二ル} ァクリルアミド；又は

N— {3—クロ口一 4— [(3—フルォロベンジノレ）ォキシ] フエ二ル}— 6— [5— ({ [2- (メタンスルホニル）ェチル] アミノ}メチル）一 2—フリル] —4ーキナゾリンァミンもしくはその薬学的に許容される塩、それらの水和物もしくは溶媒和物、それらの光学活性体もしくはラセミ体、又は、それらのジァステレオマー混合物である請求の範囲 1から 15のいずれか 1項に記載の阻害剤。

1 7. N- [4— (3—クロ口一 4一フルオロフヱニル）ァミノ] —7— [3— (4—モルホリニル）プロボキシ] キナゾリン一 6—ィル] アクリルアミド、又は

N— {3—クロロー 4— [(3—フルォロベンジノレ）ォキシ] フエニル }— 6— [5—

({ [2- (メタンスルホニル）ェチル] アミノ}メチル） _2—フリル] —4ーキナゾリンァミンもしくはその薬学的に許容される塩、それらの水和物もしくは溶媒和物、それらの光学活性体もしくはラセミ体又はそれらのジァステレオマ一混合物である請求の範囲 1から 1 6のいずれか 1項に記載の阻害剤。

1 8 . 請求の範囲 1から 1 7のいずれか 1項に記載の阻害剤を有効成分として含有し、かつ製薬上許容され得る担体を含有する医薬組成物。

1 9 . Her2又は Z及び EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は/及ぴ治療薬である請求の範囲 1 8に記載の医薬組成物。

2 0 . Her2又は Z及び EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である請求の範囲 1 9に記載の医薬組成物。

2 1 . Her2又は及び EGFRの発現又は活性を検出するための検査により被検対象の Her2又は Z及び EGFRの発現又は活性を診断し、その結果、 Her2又は Z及ぴ EGFRが過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して投与するための、 Her2 又は/及び EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は及ぴ治療薬。

2 2 . Her2又はノ及び EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及ぴ肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である請求の範囲 2 1に記載の予防又は/及び治療薬。

2 3 . Her2又は/ /及び EGFRの発現又は活性を検出するための検査により被検対象の Her2又は//及ぴ EGFRの発現又は活性を診断し、その結果、 Her2又は/及び EGI¾が過剰発現又は活性化していると判断された被検対象に対して有効量の Her2又は/及ぴ EGFR阻害剤を投与することを特徴とする、 Her2又は及ぴ EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は/及び治療方法。

2 4 . Her2又は及び EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及び肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である請求の範囲 2 3に記載の予防又は/及ぴ治療方法。

2 5 . 請求の範囲 1 8から 2 0のいずれか 1項に記載の医薬組成物、及ぴ該医薬組成物を Her2又は/及ぴ EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患の予防又は/及び治療に使用し得るか又は使用すべきであることを記載した書類とを含む商業的パッケージ。

2 6 . Her2又は/及び EGFRの過剰発現又は活性化に起因する疾患が癌、癌及ぴ肉腫の成長に伴う血管新生、癌転移に伴う血管新生、糖尿病性網膜症に伴う血管新生、動脈硬化、又は乾癬である請求の範囲 2 5に記載の商業的パッケージ。

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