JP5525118B2 - タンパク質精製方法 - Google Patents
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Description
このような遺伝子組換え技術によって産生された生理活性タンパク質を含有する製剤においては、宿主DNAやウイルスの汚染による不純物、例えばDNA夾雑物を除去する必要がある。現在、バイオ医薬品におけるDNAの許容量は100pgDNA/一投与量以下であることが世界保健機構(WHO)により示されている。この基準を満たすために、一般には、宿主細胞から得られる生理活性タンパク質を含有する水性培地を陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、もしくはこれらの組合せで処理することによりDNAを除去している。
特に、生理活性タンパク質が哺乳動物細胞を宿主として得られた抗体であるときには、プロテインAもしくはプロテインGがIgGのFc鎖に結合する性質を利用して、プロテインAもしくはプロテインGのアフィニティカラムクロマトグラフィー処理を行った後に種々のクロマトグラフィーで精製している。
例えば、特表平5−504579号では、哺乳動物細胞培養から得られた抗体含有水性培地をプロテインAもしくはプロテインGカラムクロマトグラフィーに適用して抗体をカラムに吸収させ、次いで酸性溶液(濃度約0.1Mのクエン酸、pH3.0−3.5)を用いて抗体を溶出させ、得られる酸性溶出液をイオン交換カラムクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィーに順次適用して精製している。
しかし、これらの各種クロマトグラフィー工程やその組合せは時間、労力、コストがかかり、煩雑であり、また効果も安定していない。
本発明の目的は、より簡単な方法で、確実にDNA夾雑物やウイルスといった不純物を除去でき、しかも生理活性タンパク質の損失が少なく、かつ実施コストの低い生理活性タンパク質、特に抗体の精製方法を提供することである。
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1)以下の段階:
1)生理活性タンパク質含有試料を、該生理活性タンパク質の等電点以下のpHの低伝導度の水溶液状態とし、
2)生じる粒子を除去する、
を含む、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する方法。
(2)低伝導度の水溶液の伝導度が、0〜100mMのモル濃度である前記(1)記載の方法。
(3)低伝導度の水溶液のイオン強度が、0〜0.2である前記(1)又は(2)記載の方法。
(4)低伝導度の水溶液の導電率が、0〜300mS/mである前記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)溶液が塩酸、クエン酸、酢酸の水溶液から選択される前記(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)水溶液のpHが生理活性タンパク質の等電点以下、かつpH2.0以上である前記(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)不純物がDNA夾雑物である(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8)不純物がウイルスである(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(9)DNA夾雑物除去処理後の生理活性タンパク質含有試料中のDNA夾雑物がDNA濃度22.5pg/ml以下である(7)に記載の方法。
(10)生理活性タンパク質が抗体である前記(1)〜(9)のいずれかに記載の方法。
(11)抗体がIgG抗体である前記(10)に記載の方法。
(12)抗体がヒト型化モノクローナル抗体である前記(10)又は(11)に記載の方法。
(13)抗体がヒト型化抗IL−6レセプター抗体である前記(12)記載の方法。
(14)抗体がヒト型化抗HM1.24抗原モノクローナル抗体である前記(12)記載の方法。
(15)抗体がヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体(抗PTHrP抗体)である前記(12)記載の方法。
(16)生理活性タンパク質が顆粒球コロニー刺激因子である前記(1)〜(9)のいずれかに記載の方法
(17)粒子をフィルター濾過によって除去する前記(1)〜(16)のいずれかに記載の方法。
(18)生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし、得られる試料に緩衝液を添加してpHを該生理活性タンパク質の等電点以下のpHに調整することによって1)の工程を行う、(1)の方法。
(19)生理活性タンパク質が抗体であって、該抗体含有試料をプロテインAもしくはプロテインGのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、得られる溶出液に緩衝液を添加してpHを該抗体の等電点以下のpHに調整することによって1)の工程を行う、(1)の方法。
(20)緩衝液がTris水溶液である前記(18)又は(19)記載の方法。
(21)前記(1)〜(20)のいずれかに記載の方法によって得られる精製生理活性タンパク質。
(22)前記(1)〜(20)のいずれかに記載の方法を用いた精製工程を含む、医療用タンパク質製剤の製造方法。
生理活性タンパク質とは、哺乳動物、特にヒトの生理活性タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法により得られたものを含むが、好ましいのは遺伝子組換え法により得られたものである。遺伝子組換え法による生理活性タンパク質は、大腸菌などの細菌類;イースト菌;チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、C127細胞、COS細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。遺伝子組換え法によって得られるタンパク質には天然タンパク質とアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の1又は複数を欠失、置換、付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。さらには、生理活性タンパク質はPEG等により化学修飾されたものも含む。
生理活性タンパク質が糖鎖を有するタンパク質である場合、糖鎖の由来としては、特に制限はないが、哺乳動物細胞に付加される糖鎖が好ましい。哺乳動物細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、BHK細胞、COS細胞、ヒト由来の細胞等があるが、この中でも、CHO細胞が最も好ましい。
生理活性タンパク質がEPOである場合には、EPOはいかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト尿より種々の方法で抽出し、分離精製したもの、遺伝子工学的手法(例えば特開昭61−12288号)により大腸菌などの細菌類、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、BHK細胞、COS細胞、ヒト由来の細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。さらには、PEG等により化学修飾されたEPOも含む(国際特許出願公開番号WO90/12874参照)。さらに、糖鎖のついていないEPOをPEG等により化学修飾したものも含む。また、EPOのアミノ酸配列中のN−結合炭水化物鎖結合部位もしくはO−結合炭水化物鎖結合部位において、1以上のグリコシル化部位の数を増加させるように改変したEPO類似体も含む(例えば、特開平8−151398号、特表平8−506023号参照)。さらには、糖鎖結合部位の数は変化させずに、シアル酸等の含量を増加させることにより糖鎖の量を増加させたものであってもよい。
生理活性タンパク質がG−CSFである場合には、G−CSFは高純度に精製されたG−CSFであれば全て使用できる。本発明におけるG−CSFは、いかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したもの、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌などの細菌類;イースト菌;チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、C127細胞、COS細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。好ましくは大腸菌、イースト菌又はCHO細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。最も好ましくはCHO細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。さらには、PEG等により化学修飾されたG−CSFも含む(国際特許出願公開番号WO90/12874参照)。
生理活性タンパク質がモノクローナル抗体である場合には、モノクローナル抗体はいかなる方法で製造されたものでもよい。モノクローナル抗体は、基本的には公知技術を使用し、感作抗原を通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作成できる。
また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる(例えば、Carl,A.K.Borrebaeck,James,W.Larrick,THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES,Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD,1990参照)。具体的には、ハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域(V領域)のcDNAを合成する。目的とする抗体のV領域をコードするDNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域(C領域)をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のV領域をコードするDNAを、抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ(Chimeric)抗体、ヒト型化(Humanized)抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成(reshaped)ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域(CDR;complementarity determining region)をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域(framework region;FR)を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる(欧州特許出願公開番号EP239400、国際特許出願公開番号WO96/02576参照)。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい(Sato,K.et al.,Cancer Res.(1993)53,851−856)。
このような再構成ヒト型化抗体としてヒト型化抗IL−6レセプター抗体(hPM−1)が好ましく例示される(国際特許出願公開番号WO92−19759を参照)。また、ヒト型化抗HM1.24抗原モノクローナル抗体(国際特許出願公開番号WO98−14580を参照)、ヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体(抗PTHrP抗体)(国際特許出願公開番号WO98−13388を参照)、ヒト型化抗組織因子抗体(国際特許出願公開番号WO99−51743を参照)なども本発明で使用する好ましい抗体である。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる(特公平1−59878参照)。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる(国際特許出願公開番号WO93/12227,WO92/03918,WO94/02602,WO94/25585,WO96/34096,WO96/33735参照)。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体(scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列に基づいて適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、WO92/01047,WO92/20791,WO93/06213,WO93/11236,WO93/19172,WO95/01438,WO95/15388を参考にすることができる。
さらに、トランスジェニック動物等によって作製されたヒト抗体も好ましい。
さらに、抗体にはFab,(Fab’)2,Fc,Fc’,Fdなどの抗体断片や、1価又は2価以上の一本鎖抗体(scFV)などの再構成したものも含む。
本発明では、生理活性タンパク質含有試料もしくは抗体含有試料とは、好ましくは、培養により得られた生理活性タンパク質もしくは抗体を含むCHO細胞などの哺乳動物細胞の培養培地、あるいはこれに部分的精製などの一定の処理を施したものをいう。
本発明の好ましい態様では、以下の段階:
1)生理活性タンパク質含有試料を、該生理活性タンパク質の等電点以下のpHの低伝導度水溶液状態とし、
2)生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。
本発明の方法によって除去される不純物は、目的のタンパク質以外の物質であれば、いかなる物質でもよい。不純物の例としては、DNA夾雑物、ウイルス、プロテインA(カラムからの溶出物)、エンドトキシン、HCP(細胞由来蛋白質)、培地成分であるHy−Fish(FL)、IGFなどを挙げることができるが、好ましくはDNA夾雑物又はウイルスである。ここでDNA夾雑物とは、生理活性タンパク質含有試料中のDNAであり、宿主由来のDNAや汚染したウイルス由来のDNAが含まれる。
本発明の方法によって除去されるウイルスには特に制限はなく、どのようなウイルスを除去してもよく、DNAウイルス及びRNAウイルスが含まれる。RNAウイルスとしては、X−MuLVといったレトロウイルス、Reo3といったレオウイルス、MVMといったパラボウイルスが挙げられる。本発明の方法によって除去されるウイルスの具体的な例としては、例えば、X−MuLV、PRV、Reo3、MVM、VSV、ヘルペスシンプレックス、CHV、シンドビス、ムンプス、ワクチニア、Measle、Rubella、インフルエンザ、ヘルペスゾスター、サイトメガロ、パラ−インフルエンザ、EB、HIV、HA、HB、NANB、ATL、ECHO、バルポなどを挙げることができるが、好ましくは、X−MuLV、Reo3、MVM、PRVである。
本発明において、低伝導度水溶液とは、通常、モル濃度が0〜100mM、好ましくは0〜50mM、さらに好ましくは0〜30mMの水溶液または、イオン強度が0〜0.2、好ましくは0〜0.12の水溶液または、導電率が0〜300mS/m、好ましくは0〜200mS/m、さらに好ましくは0〜150mS/mの水溶液をいう。
生理活性タンパク質の等電点とは、水溶液中において生理活性タンパク質の電荷が見かけ上なくなるpHの値である。等電点は当業者に公知に方法により測定することが可能であり、例えば、種々のpHの溶液中で電気泳動を行い生理活性タンパク質が移動しなくなるpHを求める等電点電気泳動などにより測定することが可能である。生理活性タンパク質の等電点以下のpHは、好ましくは生理活性タンパク質の等電点未満のpHである。
本発明の方法において、不純物がDNAである場合、生理活性タンパク質の等電点以下のpHにすることにより生理活性タンパク質を正に帯電させ、さらにDNAを負に帯電させることが好ましい。
通常、DNAはバックボーン中のリン酸基により非常に強い負イオンの電荷を有している(核酸の強酸性リン酸ジエステル結合内のリン酸基のpK値は約1である)ので、DNAを負に帯電させるpHは特に限定されず、生理活性タンパク質の等電点以下の好ましいpHを用いることが可能である。生理活性タンパク質の等電点以下の好ましいpHは、生理活性タンパク質ごとに異なると考えられるので、当業者は公知の方法(例えば、実施例に記載されているように複数の異なるpHの試料を調製し、DNA除去率やタンパク質回収率などを測定する、などの方法)により生理活性タンパク質の等電点以下の好ましいpHを選択することが可能である。そのようなpHとしては、通常pH2.0以上、好ましくはpH3.0以上、特に好ましくはpH4.0以上である。
DNAが負に帯電していることを確認するには公知の方法、例えば電気泳動によるタイトレーションカーブ(ETC)を用いた方法(Ion Exchange Chromatography Principles and Methods,Pharmacia(現 Amersham Biosciences),p52〜p56)により調べることができる。
さらに、本発明の方法では、生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし、得られる試料に緩衝液を添加してpHを該生理活性タンパク質の等電点以下のpHに調整することも可能である。
従って、本発明の別の好ましい態様では、以下の段階:
1)生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし、
2)得られる試料に緩衝液を添加してpHを該生理活性タンパク質の等電点以下のpHに調整し、
3)生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。本発明の方法によって除去される不純物は、前述の通りである。
本発明における低伝導度の酸性水溶液とは、モル濃度が0〜100mM、好ましくは0〜50mM、さらに好ましくは0〜30mMの水溶液または、イオン強度が0〜0.2、好ましくは0〜0.12の水溶液または、導電率が0〜300mS/m、好ましくは0〜200mS/m、さらに好ましくは0〜150mS/mの水溶液であって、pH2.0〜3.9、好ましくはpH2.0〜3.0の水溶液をいう。酸性水溶液は、塩酸、クエン酸、酢酸などの水溶液から選択してよい。精製しようとする生理活性タンパク質、抗体の種類により、使用する低伝導度の酸性水溶液の種類、伝導度、pHはそれぞれ異なっており、当業者は本明細書に記載の方法に従って予備試験を行うことにより、これらの最適条件を容易に設定できる。
また、本発明の方法で使用する低伝導度のアルカリ性水溶液とは、モル濃度が0〜100mM、好ましくは0〜50mM、さらに好ましくは0〜30mMの水溶液または、イオン強度が0〜0.2、好ましくは0〜0.12の水溶液または、導電率が0〜300mS/m、好ましくは0〜200mS/m、さらに好ましくは0〜150mS/mの水溶液であって、一般にはpH7.5〜13である(pHは精製しようとする生理活性タンパク質、抗体の種類により、それぞれ異なっている)。
本発明の方法では、生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とした後、得られる試料に緩衝液を添加してpHを該生理活性タンパク質の等電点以下のpHに調整する。緩衝液としては、例えばTris−HCl、リン酸、Tris、Na2HPO4、NaOHなどを挙げることができる。
さらに本発明では、例えば、生理活性タンパク質が抗体の場合、一般的に、抗体含有試料をプロテインAもしくはプロテインGのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、得られる溶出液に緩衝液を添加してpHを生理活性タンパク質の等電点以下で好ましいものに調整することが可能である。
従って、本発明のさらに別の好ましい態様では、以下の段階:
1)抗体含有試料をプロテインAもしくはプロテインGのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、
2)得られる溶出液に緩衝液を添加してpHを該生理活性タンパク質の等電点以下のpHに調整し、
3)生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中の不純物を除去する。本発明の方法によって除去される不純物は、前述の通りである。
この方法で使用する低伝導度の酸性水溶液は上記したものを使用することができ、また緩衝液としては、例えばTris−HCl、リン酸、Tris、Na2HPO4、NaOHなどを挙げることができる。
本発明の方法では、上記段階で生理活性タンパク質の等電点以下のpHになった溶液は粒子(白濁)を生じる。この粒子をフィルター濾過によって除去することによって、DNA夾雑物といった不純物を効率よく除去することができる。濾過に用いるフィルターは、例えば、1.0〜0.2μmのCellulose Acetate Filter System(Corning製)もしくはTFFなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
また、上記粒子を除去するための方法としては遠心分離操作等も考えられ、粒子を効率的に除去できる手法であればよく、フィルター濾過に限定されるものではない。
本発明者らは特別の理論に拘束されるものではないが、不純物がDNAである場合、上記粒子は生理活性タンパク質とDNAとによって形成される複合体であると推定している。タンパク質が等電点より低いpHになることにより正に帯電し、一方、DNAが負に帯電することにより、DNAとタンパク質の複合体が形成されると推定している。さらに、低伝導度の水溶液にすることにより、より複合体が形成されやすくなると考えている。粒子をフィルター除去することによってDNA−生理活性タンパク質複合体中に含まれる生理活性タンパク質が少量ロスとなるが、生理活性タンパク質の全体からすると数%であり、後述する実施例に記載するように、生理活性タンパク質の約90%を回収することができた。
また、このDNA−生理活性タンパク質複合体が樹脂上で生じるためにプロテインAもしくはプロテインGカラムクロマトグラフィー単独ではDNA夾雑物とタンパク質の分離が効果的に行えないのではないか、と推測している。本発明の方法により精製された生理活性タンパク質は、さらに陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、もしくはこれらの組合せなどにより精製して医薬製剤に用いることができる。
DNA定量法としてはスレッシュホールド総DNA定量法により測定し、測定に先だってDNA抽出操作を実施するが、これらに限定されるものではない。
ウイルス定量法としては、検出細胞へのウイルス感染力を指標としたTCID50(tissue culture infective dose(50%);50%培養細胞感染量)、並びに画分中のウイルス量を定量できるRT/Q−PCRおよびQ−PCRにより測定するが、これらに限定されるものではない。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
1.1.試験方法
(1)検討材料(抗体含有試料)
hPM−1抗体(ヒト型化抗IL−6レセプター抗体)産生CHO細胞培養上清液(以下CMと略す)(細胞遠心除去済み:−80℃保存)含有試料は、上記CMを0.22μm Cellulose Acetate(CAと略す)Filter System(CORNING)を用いて濾過し、精製検討に使用した。なお、hPM−1抗体は、国際特許出願公開番号WO92/19759号公報の実施例10に記載されたヒトエロンゲーションファクターIαプロモーターを利用し、特開平8−99902号公報の参考例2に記載された方法に準じて作成した(等電点:pH9.0)。
(2)使用機器
塩酸溶出検討時
HPLC :L−6200 Intelligent Pump(HITACHI)
L−4200 UV−VIS Detector(HITACHI)
D−2500 Chromato−Integrator(HITACHI)
カラム :HR5/2(Pharmacia社),5mmI.D.×20mmH
Media:POROS 50A(PerSeptive社),0.4ml
Lot;A250−039,Code;SPECIAL
粒子検討時
HPLC :Waters PrepLC4000 System(Waters)
Waters2000 System Controller(Waters)
Waters486 Tunable Absorbance Detector(Waters)
Waters741 Data Module(Waters)
分光光度計:U−2000(HITACHI)
カラム :XK26(Pharmacia社),26mmI.D.×100mmH
Media:POROS 50A(PerSeptive社),53ml
Lot;A250−039,Code;SPECIAL
(3)分析、定量法
hPM−1定量法:直線濃度勾配法によるPLRP−Sカラム(ポリマーラボラトリーズ社)を用いる逆相HPLCにより定量する。
DNA量測定法:スレッシュホールド総DNA定量法により測定する。測定に先だってDNA抽出操作(DNAエキストラクターキット<和光純薬>等)を実施する。また、測定にはスレッシュホールド総DNA定量キット(モレキュラーデバイス社製)を用いる。
濁度測定法:粒子形成の状況をモニターするために測定サンプルを分光光度計U−2000(HITACHI)に供し、660nmにおける吸収を測定する。
1.2.溶出条件の検討
プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにおいて溶出液として用いる緩衝液組成を変更した検討を行い、hPM−1回収率及び溶出液によるDNA除去状況を確認した。上記抗体含有試料を以下の表1に示す条件でカラムにかけた。表1に示す平衡化緩衝液にてプロテインA樹脂を平衡化し、続いて上記抗体含有試料負荷、その後、洗浄1、洗浄2、溶出と実施する。溶出プロファイルをA280nmで監視し、タンパク質のピークを単離した。なお、表中C−P Bufferはクエン酸−リン酸緩衝液を示す。
溶出法1、2,3において、クロマトグラム上で差異は確認されなかった。
また、各溶出画分を300mM Tris溶液でpH7.0に調整したところ、塩酸溶出画分(溶出法2、溶出法3)では粒子が生じた。更に、粒子形成とhPM−1回収率及び残存DNA量との相関を求める検討をも行った。
粒子相関検討として、溶出法2における溶出液塩酸中にNaClを添加し、添加NaCl濃度(0mM,50mM,100mM)と各種要因との相関を求めた。添加NaCl濃度と各種要因との相関検討として、それぞれのNaCl添加によるProtein A溶出画分を300mM Tris溶液でpH7.0に調整したサンプルを濾過前、そのpH調整後サンプルを0.22μm CA Filterにて濾過したサンプルを濾過後とした。濾過前及び濾過後サンプルを上記測定法でhPM−1回収率(濾過後のみ)を測定し、残存DNA量を測定した。
1.3.回収率
各溶出条件におけるhPM−1回収率を測定した。その結果、溶出法1における回収率は98.6%と良好であった。また溶出法2における回収率では83.8%〜97.1%、溶出法2における回収率では83.5%〜93.7%とばらつきが生じたが、検討スケールが小さい要因(樹脂量:0.4ml)から生じるばらつきであると推測された。そこで、精製スケールをアップした検討(溶出法2)では安定してhPM−1回収率90%以上を示す事を確認した。従って、塩酸溶出の場合であっても、hPM−1の回収率は良好であることが判明した。
1.4.溶出液塩酸中の添加NaCl濃度と各種要因相関
溶出液塩酸中の添加NaCl濃度と各種要因相関を調べた結果を表2に示す。
濾過後のhPM−1回収率は100mM NaCl添加サンプルで88%を示し、順に50mM NaCl添加の86%、0mM NaCl添加の81%であった。残存DNA量に関しては、濾過前後のサンプルでともに、0mM NaCl添加サンプルが低値を示し、特に濾過後の0mM NaCl添加サンプルでは11pg DNA/mg hPM−1と極めて低値であった。
また、pH調整後サンプルにおいて濁度の高値なサンプル程、濾過後のhPM−1回収率及び残存DNA量が低値を示している。この結果は、粒子形成にhPM−1及びDNAが関与している可能性が高い事を示すものである。おそらくpHを7.0に調整する事によりhPM−1とDNAが相互作用し粒子を生じると推測される。hPM−1回収率を高くするという点からは、添加NaCl濃度を増加させることが好ましく、逆に残存DNA量減少を重視するという点からは、溶出液塩酸中にNaClを無添加とすることが望ましい。
実施例2:ヒト型化抗PTHrP抗体の精製
ヒト型化抗PTHrP抗体含有試料(CHO細胞で培養した培養上清を0.45+0.2μm CA SARTOBRAN Pフィルター(sartorius)で濾過したもの)をプロテインAアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の条件により精製した。なお、PTHrP抗体は、国際特許出願公開番号WO98/13388号公報に記載の方法によって作成した(等電点:pH8.3)。
2.1.実験条件
精製装置:AKTA explorer(Amersham Pharmacia Biotech)
カラム:HR5/5,C10,XK−26(Amersham Pharmacia Biotech)
樹脂:rProtein A Sepharose Fast Flow
負荷:培養上清直接負荷(pH6.6〜7.5)
溶出画分調整:1M Tris水溶液により各種pHに調整し、0.2μm Cellulose Acetate(以下CAと略す)フィルター濾過によりDNAを除去(以下の(1)において条件を検討)。
プロテインAカラムを150mM NaCl入りクエン酸−リン酸緩衝液pH7.5で十分に平衡化した後、上記抗体含有CMを負荷した。続いて結合していない不純物を150mM NaCl入りクエン酸−リン酸緩衝液pH7.5で洗浄、更に導電率を下げる目的でクエン酸−リン酸緩衝液pH7.5で洗浄を行い、その後20mMクエン酸水溶液にて溶出を実施した。溶出プロファイルをA280nmで監視し、タンパク質ピークを分取した。このプロテインA溶出画分を用いて以下の条件検討を実施した。
2.2.溶出後の残存DNA除去条件検討
残存DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適pH条件を設定する検討を行った。プロテインA溶出画分を、1.0M Tris水溶液により以下の各検討pH(未調整(2.7),4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5)に調整した。その後、一定時間放置し、0.22um CAフィルター濾過処理を行った。その後1.0M Tris水溶液によりpH7に調整し、DNA定量を行った。表3に各検討pH及び放置時間と残存DNAの結果示す。
表から明らかなように、pH5.5、6.0における0,6,24時間放置すべてにおいてDNAが検出限界以下となった。またDNA除去状況に関してはpH5.5、6.0を中心としてpHが高く、又は低くなるにつれてDNA除去の効率が悪くなることが観察された。
実施例3:ヒト型化抗HM1.24抗原モノクローナル抗体の精製
ヒト型化抗HM1.24抗原モノクローナル抗体含有試料(CHO細胞で培養した培養上清)をプロテインAアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の表4に記載の条件により精製した。なお、HM1.24抗原モノクローナル抗体は、国際特許出願公開番号WO98/14580号公報に記載の方法によって作成した(等電点:pH9.0)。
3.1.実験条件
カラム:rProtein A FF,5mL(16mmID x25mmH)
流速 :5mL/min(150cm/h)
サンプル:培養上清直接負荷
プロテインAカラムを150mM NaCl入りクエン酸−リン酸緩衝液pH7.5で十分に平衡化した後、上記抗体含有CMを負荷した。続いて結合していない不純物を150mM NaCl入りクエン酸−リン酸緩衝液pH7.5で洗浄、更に導電率を下げる目的でクエン酸−リン酸緩衝液pH7.5で洗浄を行い、その後20mMクエン酸水溶液にて溶出を実施した。溶出プロファイルをA280nmで監視し、タンパク質ピークを分取した。このプロテインA溶出画分を用いて以下の条件検討を実施した。
3.2.溶出後の残存DNA除去条件検討
残存DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適pH条件を設定する検討を行った。プロテインA溶出画分を、1.0M Tris水溶液により以下の各検討pH(pH=4.5−7.5)に調整した。その後、一定時間放置し、0.22um CAフィルター濾過処理を行った。その後1.0M Tris水溶液によりpH7に調整し、DNA定量及び逆相カラムによるヒト型化抗HM1.24抗原モノクローナル抗体の定量を行った。表5にDNA量の測定結果を、また表6にヒト型化抗HM1.24抗原モノクローナル抗体の収量測定の結果を示す。
Protein Aアフィニティークロマトグラフィー精製した後のサンプルにおいては大量のDNAが存在していたが、実験1ではpH7.5,6.5,5.5とpHの低下に従ってDNA量が減少しており、また時間は0時間の方がDNA除去率が高い傾向があった。実験2ではpH=4.5,5.0,5.5の条件で同様の実験を行ったが、この間においてはpHおよび時間に関係なく十分にDNAが同程度に除去されていた。更に回収量の計算からヒト型化抗HM1.24抗原モノクローナル抗体はほとんど消失していないことが判明した。
実施例4:顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の精製
G−CSF含有試料(CHO細胞で培養:中外製薬製)を用いて以下の条件検討を実施した(等電点:pH5.5〜5.7)。
4.1.溶出後の残存DNA除去条件検討
残存DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適pH条件を設定する検討を行った。G−CSF含有試料に低伝導度の酸性溶液(2.5mM HCl水溶液)を添加し、更に20%塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、更に試料DNAを添加した。1.0M Tris水溶液により以下の各検討pH(pH=4.3又は6.6)に調整し、続いて0.22um CAフィルター濾過処理を行った。その後、ろ過前後の画分のDNA定量を行った。表8にDNA量の測定結果を示す。
上記検討結果より濾過時pH4.3の場合においてDNAを多量に含んだG−CSF含有試料からDNA量が効率的に減少し定量限界以下であった。
実施例5:hPM−1(ヒト型化抗IL−6レセプター抗体)精製におけるウイルス除去効果
5.1 検討材料(抗体含有試料)
hPM−1抗体(ヒト型化IL−6レセプター抗体)産生CHO細胞培養上清液(CM)(細胞遠心済み:−80℃保存)含有試料に、それぞれX−MuLV、Reo3、MVMを添加後、各CMを0.45μmフィルター(ボトルトップフィルター:CORNING社製)を用いてろ過し、精製検討用に使用した。なお、hPM−1抗体は、実施例1と同様に作成した。なお、使用した各ウイルスはATCC(American Type Culture Collection)から入手した。
5.2 rProtein Column Chromatographyでの精製
5.1で作製したウイルス添加試料をrProtein Column Chromatographyで精製した。具体的な条件は以下の通りである。
樹脂:rProtcinA Sepharosc Fast Flow
機器:AKTAexplorer100、AKTApurifier
カラム:XK16/20、XK16/40
樹脂高:11.5cm
溶出条件
平衡化:1mol/L NaCl,20mmol/L C−P Buffer,
pH7.5±0.2,Conductivity 8.5±0.5S/m
洗浄1:1mol/L NaCl,20mmol/L C−P Buffer,
pH7.5±0.2,Conductivity 8.5±0.5S/m
洗浄2:10mmol/L C−P Buffer,
pH7.7±0.2,Conductivity 165±20mS/m
溶出:2.5mmol/L HCl,
pH2.7±0.2,Conductivity 107±10mS/m
5.3 低pH処理
5.2で得られた溶出画分を1mol/L塩酸でpH3.2±0.1に調整し、室温15±5℃で30分以上保持した。その後、各溶出画分を300mmol/L Tris溶液でpH7.2±0.1に調整した。そのうちの40.0mLを、グラスファイバーフィルター(Millipore社製)(0.2μm、PALL社製)を一次側、バイオイナート(0.2μm、PALL社製)(PALL社製のフィルターホルダーに直径15mmのアジャスターを装着)を二次側になるよう連結したろ過ユニットを用いて0.03±0.01MPaで加圧ろ過した。
5.4 ウイルスの検出
採取したサンプルは全てTCID50で測定を行った。また、X−MuLVおよびMVMのクリアランス能試験では、検出細胞へのウイルス感染力を指標としたTCID50に加え、画分中のウイルス量を定量できるRT/Q−PCRおよびQ−PCRによる測定を行った。
5.5 結果
5.4の測定の結果を以下の表に示す。
以上のように、本発明の精製工程により、いずれのウイルスについても非常に高いLRV(Logarithmic Reduction Value)が得られ、低pH処理・ろ過後では定量限界以下にまで除去されていることが確認された。
Claims (11)
- 1)抗体含有試料をプロテインAもしくはプロテインGのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、モル濃度が0〜50mMであって、pH2.0〜3.9の水溶液で溶出し、得られる溶出液に緩衝液を添加してpHを該抗体の等電点未満かつ4.5以上のpHに調整し、
ここで、pH調整後の溶出液のイオン強度は0〜0.12であり、
2)生じる粒子を除去する、
段階を含む、抗体含有試料中のDNA夾雑物を除去する方法。 - 前記水溶液が塩酸、クエン酸、酢酸の水溶液から選択される請求項1に記載の方法。
- DNA夾雑物除去処理後の抗体含有試料中のDNA夾雑物がDNA濃度22.5pg/ml以下である請求項1または2に記載の方法。
- 前記抗体がIgG抗体である請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体がヒト型化モノクローナル抗体である請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体がヒト型化抗IL−6レセプター抗体である請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体がヒト型化抗HM1.24抗原モノクローナル抗体である請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体がヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体(抗PTHrP抗体)である請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記粒子をフィルター濾過によって除去する請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記緩衝液がTris水溶液である請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法を用いた精製工程を含む、医療用抗体製剤の製造方法。
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