JP5425489B2 - ホスホリパーゼａ２の酵素活性を阻害するのに有効である可能性がある物質の活性の試験方法 - Google Patents

Description

本発明は本質的に、皮膚炎症を低減することが可能な有効成分、および主に化粧品または医薬の分野におけるその用途に関する。

本発明は本質的に、炎症の分野において有効である可能性のある物質を試験する方法に関する。

本発明は本質的に、酵素ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）を阻害する能力に基づく、炎症の分野において有効である可能性のある物質の探求および同定のための新規試験方法およびその用途に関する。

本発明は本質的に、このようにして検出された炎症の分野において有効である新規物質および化粧品または皮膚薬もしくは医薬分野における、特に皮膚刺激の徴候を低減することができるケアを実施するためのそれらの使用に関する。

技術水準
今日まで研究所で開発された抗炎症製品は皮膚炎症に対抗することを意図したものであるが、これらは皮膚の炎症（発疹、ふけ、乾燥症、しみ）に結びつけられた活性を実証することが可能な条件に適合されていない研究モデルで選択される。

使用されるモデルは実際、せいぜい動物について開発されたものであり、これらのモデルでは発生したストレスが非常に激しい状態で存続するが、その理由は、ストレスとしては
−特定点のＵＶ照射であり、発疹を発生させ、有効であると考えられる製品を塗布した後、この発疹の消失を検査することを目的としたもの、
−リポポリサッカライド（ＬＰＳ）および／またはグアニジンおよび／またはカラゲーンさえもの皮下注射であり、モルモットに浮腫を創出し、次いで有効であると考えられる活性生成物を適用した後、この浮腫の消失を検査するようにしたもの
であり得るからである。

炎症のメディエーターの合成に関与する酵素、ホスホリパーゼＡ２の阻害を扱うインビトロ試験も開発されたが、これらの試験はインビボで遭遇する条件からは非常にかけ離れているため、それほど意義があるものではない。

公知のインビトロ試験の詳細
上記の試験は感度に問題があり、使用しているモデルの構成成分の性質によりインビボで遭遇する状況から非常にかけ離れている。したがって、例えば仏国特許出願公開第２，７５７，３９５号明細書（特許文献１）は炎症反応において遭遇するこの酵素の天然の基質から非常にかけ離れた基質と反応させたホスホリパーゼＡ２の阻害について記載している。この基質、ジミリストイルＬ−ホスファチジルコリン、は実際、２つのＣ１４脂肪酸（炭素数１４の飽和炭化水素脂肪酸鎖）を含むリン脂質である。現在、この基質およびこれらの脂肪酸は炎症のメディエーターを形成する連鎖に関与していないが、その理由は、この場合ホスホリパーゼＡ２により加水分解される不飽和Ｃ２０脂肪酸（アラキドン酸）を保有しているのはリン脂質であるからである。

さらに、この文献においては、ＳＮ２位置の脂肪酸は酵素により加水分解され、この脂肪酸が放出され、３６０ｎｍにおける分光測光で測定される媒質にこの脂肪酸が不溶性であることにより、溶液が曇って見える。この技法はそれほど敏感ではなく、一方では阻害剤の信頼性のある分類を得ることができず、他方ではこの技術は、溶液を曇らせることでホスホリパーゼＡ２の阻害の正確な測定を不可能にする親油性または乳化性分子を検査することができない。

Ａ２ホスホリパーゼ（ＰＬＡ２）類
ホスホリパーゼＡ２は細胞により膜レベルで生成される酵素である。この酵素はマスト細胞のような炎症現象に結びついた細胞中に多い。この酵素は２型求核置換（ＳＮ２）位置の膜リン脂質を加水分解して脂肪酸を放出する。

概略的にいうと、ホスホリパーゼは３つのタイプの機能をその属性として考えることができる。すなわち、消化機能、細胞の構造を維持する役割を果たし、脱アシル化／再アシル化サイクルを含む膜リン脂質の再構築機能、および最後に膜リン脂質から生物活性生成物の産生によるシグナルの導入機能である。したがって、ホスホリパーゼの活性化の調節がシグナル・カスケードの、したがって炎症反応時のシグナル増幅の支配的な要素になるであろう。

ＰＬＡ２類は最初に種々の種、すなわち哺乳動物（膵臓ＰＬＡ２）、ヘビ、昆虫（毒ＰＬＡ２）の細胞外媒質中で同定された。後に５つの群のＰＬＡ２類が定義され、酵素学的および構造機能的の両方により特徴付けられた（表１）。

これらの酵素は同じ基質、すなわちＳＮ２位置でそれらが加水分解するリン脂質が共通して有しており、それらは２−アシルヒドロラーゼであり、この位置に存在する脂肪酸とリソリン脂質とを放出する。

しかしながら、これらの酵素群は機能、存在位置、調節、作用機作、シーケンス、構造、および二価イオン依存性が異なっている。

最初の３つの群は細胞外酵素すなわち分泌されたＰＬＡ２類（ｓＰＬＡ２類）として単離され、多数のジスルフィド架橋、約１５ｋＤａの分子質量を有し、それらの活性のために高濃度のカルシウムを必要とする。

ＰＬＡ２類は、本質的に構造の相同性に基づいてこれら３つの群の一つに分類される。大多数のＰＬＡ２類は非ヒト酵素であるが、ヒト分泌ＰＬＡ２類も滑液（ＩＩ群）またはヒト膵臓（Ｉ群）中に存在する。

もっともよく特徴付けられているＰＬＡ２は、ヒト滑液に由来するＩＩ群の分泌ＰＬＡ２である。ＰＬＡ２類のＩＶ群は細胞質ＰＬＡ２（ｃＰＬＡ２）と呼ばれる高分子量（８５ｋＤａ）の細胞内酵素一種類のみを含み、これはアラキドン酸の担体であるリン脂質に特異的である。このｃＰＬＡ２は細胞質内活性化に適合した濃度のカルシウムを必要とする。

この酵素は細胞質ゾル性であり、細胞活性化の際に膜に転位する。

この酵素はジスルフィド架橋を持たず、ＰＫＣ類のファミリーおよびＭＡＰ類のファミリーのキナーゼにより活性化される。

最後に、第５の群のＰＬＡ２、細胞質内ＰＬＡ２について説明する。分子量４０ｋＤａのこの酵素もアラキドン酸を保有するリン脂質に特異的であり、その活性化のためにカルシウムを必要としない。

非常に概略的にいうと、ＩＶ群のＰＬＡ２は生理学的条件下で優先的に使用される酵素であると考えられ、またｓＰＬＡ２は炎症刺激に応答して合成かつ分泌されて炎症のメディエーターを生成するものと考えられる。

それにもかかわらず、この区別は余りにも概略的である。実際、炎症反応中に起きる細胞活性化の際に、２種類のＰＬＡ２類、すなわちｓＰＬＡ２とｃＰＬＡ２とが誘導され、活性化される。

種々の研究で乾癬において分泌されるＰＬＡ２類の活性の修飾が取り扱われている（フォースター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）他、「ブラジリアン・ジャーナル・オブ・ダーマトロジー（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）」、（ブラジル国）、１９８５年，第ＩＩ２巻、ｐ．１３５−１４７）（非特許文献１）。これらの研究はＰＬＡ２の特定の形態を同定していない。

仏国特許出願公開第２，７５７，３９５号明細書

フォースター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）他、「ブラジリアン・ジャーナル・オブ・ダーマトロジー（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）」、（ブラジル国）、１９８５年，第ＩＩ２巻、ｐ．１３５−１４７

本発明の目的
本発明の目的は、炎症分野における有効成分であって特に皮膚炎症を低減することが可能な有効成分に関する。

本発明の目的は、ホスホリパーゼＡ２の酵素活性を阻害することが可能な炎症分野の有効成分を提供することからなる技術的課題を解決することである。

本発明の目的は、皮膚薬または医薬分野、特に化粧用組成物または皮膚薬用組成物もしくは医薬用組成物を調製するための、これらの有効成分の使用を提供することからなる技術的課題を解決することである。

本発明の目的はホスホリパーゼＡ２の酵素活性を有意に阻害することが可能な、有効である可能性のある物質の活性を試験する方法を提供することからなる技術的課題を解決することである。

本発明は、本質的にＩ型および／またはＩＩ型ホスホリパーゼＡ２に関する。

本発明の目的は、炎症の分野で有効である可能性がある物質を酵素ホスホリパーゼＡ２の阻害の能力に基づいて探求かつ同定するためのこの試験方法の使用からなる新規な技術的課題を解決することである。

本発明の目的は、上記試験方法により同定された有効成分、この有効成分を含む化粧用組成物、または皮膚薬用組成物もしくは医薬用組成物を、特に、多かれ少なかれ外部の物理的作用因子または炎症症候群に結びついた外皮の発疹または発赤、乾燥症または皮膚乾燥、皮膚のはりの弛緩もしくは色調の消失、および非常に乾燥した皮膚に見られるしみ、または小さな破裂した血管の外観、のような皮膚刺激の徴候を低減することができるケアを実施するために提供することからなる技術的課題を解決することである。

本発明は上記の技術的課題のすべてを、特に予期しない仕方で解決することを可能にする。

したがって、本発明は、有意にホスホリパーゼＡ２の酵素活性を阻害することが可能な、有効である可能性がある物質の活性を試験する新規な方法を提供する。

本発明はまた、酵素ホスホリパーゼＡ２を阻害する能力に基づく、炎症の分野において有効である可能性がある物質の探求および同定のための、この試験方法の使用を提供する。

第１の態様に従えば、本発明は、ホスホリパーゼＡ２、好ましくはＩ型またはＩＩ型ホスホリパーゼＡ２の酵素活性を有意に阻害するのに有効である可能性がある物質の活性を試験する方法であって、
ａ）上記有効である可能性がある物質を
−ホスホリパーゼＡ２、および
−エステルの形の少なくとも１種の脂肪酸、好ましくは１５〜２２個の炭素原子を含む長鎖である脂肪酸、さらに好ましくは不飽和または多不飽和である脂肪酸を含むリン脂質である基質であって、その加水分解の際に少なくとも１種の脂肪酸を放出することが可能である基質
との存在下に置くこと、および
ｂ）特に上記放出された脂肪酸の存在を検知すること、および場合によってその量を決定することを含む、上記ホスホリパーゼＡ２の酵素活性を測定することを含む方法を提供する。

上記酵素活性の測定は、好ましくは非エステル化脂肪酸を測定することにより行われる。

本発明者は、本明細書のこの項において「ホスホリパーゼＡ２」という用語をＩ型および／またはＩＩ型ホスホリパーゼＡ２に関連して使用する。

「阻害する」とは、本発明者によれば、上記有効成分がホスホリパーゼＡ２を、温度、接触時間、および操作条件のすべての条件が同等であるかまたは他の点で匹敵するが、有効である可能性のある物質とホスホリパーゼＡ２を接触させずに誘発させた酵素活性よりも少ない酵素活性を誘発させるように阻害することを意味する。

本発明者が本発明の文脈内で好適であると考えるのは、スクリーニングの際の有効である可能性のある分子の選択が、非常に強いとみなされているＰＬＡ２活性の阻害について行うことができることであり、それは、これらの阻害が、温度、接触時間、操作条件のすべての条件が同等であるかまたは他の点で匹敵するが、ＰＬＡ２を有効である可能性のある物質と接触させずに測定した参照活性の５０％以上であるときである。

他の好適な実施形態では、上記試験方法はＩ型ホスホリパーゼＡ２を用いて、特に、ホスホリパーゼＡ２の酵素活性の阻害に関して少なくとも有意に有効である可能性のある物質を予備選択するために行われる。この方法は、再び、ＩＩ型ホスホリパーゼＡ２を用いて、特にＩ型および／またはＩＩ型ホスホリパーゼＡ２の酵素活性を有意に阻害することが可能な、有効である可能性のある物質を確認するために行われる。これは広く入手可能ではなく高価なＩＩ型ホスホリパーゼＡ２の使用を最低限にすることを可能にする。

好適な実施形態によると、酵素Ｉ型および／またはＩＩ型ホスホリパーゼＡ２はセイヨウミツバチ毒に由来し、またはウシの膵臓に由来し、またはストレプトマイセス・ビオラセオルベル酵母に由来し、またはヘビ（トウブダイヤガラガラヘビ、またはニシダイヤガラガラヘビ、またはミナミガラガラヘビ、またはナジャ・モッサンビカ・モッサンビカ）毒に由来し、または人もしくは動物の細胞溶解産物、または人または動物の体液（滑液）に由来し、あるいはこのようにして得られた酵素の任意の可能な混合物の一種に由来する。

本発明の好適な実施形態によると、上記酵素Ｉ型ホスホリパーゼＡ２はブタの膵臓に由来する。

本発明の好適な実施形態によると、上記酵素ＩＩ型ホスホリパーゼＡ２はヒトの滑液に由来するか、またはトウブダイヤガラガラヘビのヘビ毒に由来する。

本発明の好適な実施形態によると、基質は、２型求核置換（ＳＮ２）位に長鎖、好ましくはＣ１５〜Ｃ２２炭素原子の長鎖を有する少なくとも１種の脂肪酸、さらに好ましくは、この脂肪酸は不飽和もしくは多不飽和である脂肪酸を含むリン脂質の性質を有する。

好適な実施形態によると、基質はアラキドン酸の少なくとも１種のエステル誘導体から選ばれ、基質はβ−アラキドノイル−γ−パルミトイル・Ｌ−α−ホスファチジルコリンであるのが好ましい。

好適な実施形態によると、上記方法はホスホリパーゼＡ２の補因子と接触させることを含む。

補因子の濃度は、好ましくは０．０００１％〜１０％である。補因子は二価イオンであるのが好適である。さらに好適には、補因子は特定の補因子、すなわちカルシウムである。

好適な実施形態によると、上記方法は溶解剤と接触させることを含む。溶解剤の濃度は、好ましくは０．００１％〜１０％である。好適には、溶解剤はデオキシコール酸ナトリウムである。

第２の態様によると、本発明は、ホスホリパーゼＡ２、特にＩ型および／またはＩＩ型ホスホリパーゼＡ２の、酵素活性を有意に阻害することが可能な少なくとも１種の有効成分を同定するための、上記または下記の試験方法の使用に関する。

好適には、有効成分の存在下で測定されたホスホリパーゼＡ２活性が、温度、接触時間、および操作条件のすべての条件が同等であるかまたは他の点で匹敵するようにしてホスホリパーゼＡ２を上記有効である可能性のある物質と接触させることなく測定した活性よりも低くなった瞬間からホスホリパーゼＡ２の酵素活性が阻害される。

第３の態様によると、本発明は、ホスホリパーゼＡ２、特にＩ型および／またはＩＩ型ホスホリパーゼＡ２の、酵素活性を有意に阻害することが可能な有効成分に関し、上記ホスホリパーゼＡ２の酵素活性は、ホスホリパーゼＡ２を
−上記有効成分、
−エステルの形の少なくとも１種の脂肪酸、好ましくは１５〜２２個の炭素原子を有する長鎖である脂肪酸、さらに好ましくは不飽和または多飽和である脂肪酸を含むリン脂質である基質であって、その加水分解の際に少なくとも１種の脂肪酸を放出することが可能である基質
と接触させることを行うことで測定される。

上記試験方法の上述の種々の実施形態は、上述のように有効成分を同定および／または選別するために実施することができる。すなわち、特に、下記の通りである。

好適な実施形態によると、酵素Ｉ型および／またはＩＩ型ホスホリパーゼＡ２はセイヨウミツバチ毒に由来し、またはウシの膵臓に由来し、またはストレプトマイセス・ビオラセオルベル酵母に由来し、またはヘビ（トウブダイヤガラガラヘビ、またはニシダイヤガラガラヘビ、またはミナミガラガラ、またはナジャ・モッサンビカ・モッサンビカ）毒に由来し、またはヒトもしくは動物の細胞溶解産物、またはヒトまたは動物の体液（滑液）に由来し、あるいはこのようにして得られた酵素の任意の可能な混合物の１種に由来する。

本発明の好適な実施形態によると、上記酵素Ｉ型ホスホリパーゼＡ２はブタの膵臓に由来する。

本発明の好適な実施形態によると、上記酵素ＩＩ型ホスホリパーゼＡ２はヒトの滑液に由来するか、またはトウブダイヤガラガラヘビのヘビ毒に由来する。

本発明の好適な実施形態によると、基質は、２型求核置換（ＳＮ２）位置に長鎖、好ましくはＣ１５〜Ｃ２２（炭素数１５〜２２）の長鎖を有する少なくとも１種の脂肪酸、さらに好ましくは、この脂肪酸は不飽和もしくは多不飽和である脂肪酸を含むリン脂質の性質を有する。

好適な実施形態によると、基質はアラキドン酸の少なくとも１種のエステル誘導体から選ばれ、基質はβ−アラキドノイル−γ−パルミトイル・Ｌ−α−ホスファチジルコリンであるのが好ましい。

好適な実施形態によると、上記方法はホスホリパーゼＡ２の補因子と接触させることを含む。

補因子の濃度は、好ましくは０．０００１％〜１０％である。補因子は二価イオンであるのが好適である。さらに好適には、補因子は特定の補因子、すなわちカルシウムである。

好適な実施形態によると、上記方法は溶解剤と接触させることを含む。溶解剤の濃度は、好ましくは０．００１％〜１０％である。好適には、溶解剤はデオキシコール酸ナトリウムである。

第４の態様によると、本発明は、ホスホリパーゼＡ２、特にＩ型および／またはＩＩ型ホスホリパーゼＡ２の、酵素活性を阻害することが可能な、上述の試験方法によって同定される有効成分に関する。

第５の態様によると、本発明は、抗炎症および／または抗痛みおよび／または抗刺激および／または抗チクチク痛および／または抗ヒリヒリ痛および／または抗痒みおよび／または抗発疹および／または抗乾燥症および／または抗しみおよび／または抗皮膚組織弛緩効果を有する有効成分であって、ブドウ種子、クズ抽出物、プネウム・ボルドゥス（ボルド）抽出物、ウサギギク抽出物、レモン抽出物、ヒマワリ抽出物、カモミール抽出物、グルコン酸亜鉛、ガラナ抽出物、および蔓植物（ウンカリア・トメントーサ）抽出物、または上記有効成分の少なくとも２種の組み合わせから得られる配合剤の１種から選ばれ、上記植物抽出物は、好ましくは最終製品の０．１〜３０％（ｗ／ｗ）の濃度で使用されることを特徴とする有効成分に関する。

第６の態様によると、本発明は、ホスホリパーゼＡ２、特にＩ型および／またはＩＩ型ホスホリパーゼＡ２の、酵素活性を有意に阻害することが可能な有効成分であって、ブドウ種子、クズ抽出物、プネウム・ボルドゥス（ボルド）抽出物、ウサギギク抽出物、レモン抽出物、ヒマワリ抽出物、カモミール抽出物、グルコン酸亜鉛、ガラナ抽出物、および蔓植物（ウンカリア・トメントーサ）抽出物、または上記有効成分の少なくとも２種の組み合わせから得られる配合剤の１種から選ばれ、上記植物抽出物は、好ましくは最終製品の０．１〜３０％（ｗ／ｗ）の濃度で使用されることを特徴とする有効成分に関する。

第７の態様によると、本発明は、クズ根の植物抽出物、好ましくは０．１重量％〜２０重量％、さらに好ましくは約５重量％（例えば、１００ｇにする充分量の溶媒中に約５ｇ）の濃度で、例えばブチレングリコールおよび／またはエタノールのようなアルコール／グリコールを例えば０％〜８０％の濃度で、好ましくは約２５％のブチレングリコール、および場合によってメチルパラベンのような防腐剤を０．０１％〜０．５％、好ましくは約０．１％（ｗ／ｗ）の濃度で含有する水溶液中で抽出される植物抽出物に関する。「抽出物１」と呼ばれるこの抽出物は水性抽出物のみから調製される。

第８の態様によると、本発明は、ブドウ種子からなるブドウ種子の植物抽出物、好ましくは０．１重量％〜２０重量％、さらに好ましくは約２重量％（例えば、１００ｇにする充分量の溶媒中に約２ｇ）の濃度で、例えばブチレングリコールおよび／またはエタノールのようなアルコール／グリコールを例えば０％〜８０％の濃度で、好ましくは約２５％のブチレングリコール、および場合によってメチルパラベンのような防腐剤を０．０１％〜０．５％、好ましくは約０．１％（ｗ／ｗ）の濃度で含有する水溶液中で抽出される植物抽出物に関する。「抽出物２」と呼ばれるこの抽出物は水性抽出物のみから調製される。

第９の態様によると、本発明は、ボルド葉から調製されるボルドの植物抽出物、好ましくは、０．１重量％〜２０重量％、さらに好ましくは約２重量％（例えば、１００ｇにする充分量の溶媒中に約２ｇ）の濃度で、例えばブチレングリコールおよび／またはエタノールのようなアルコール／グリコールを例えば０％〜８０％の濃度で、好ましくは約２５％のブチレングリコール、および場合によってメチルパラベンのような防腐剤を０．０１％〜０．５％、好ましくは約０．１％（ｗ／ｗ）の濃度で含有する水溶液中で抽出される植物抽出物に関する。

第１０の態様によると、本発明は、ウサギギク植物から調製されるウサギギクの植物抽出物、好ましくは０．１重量％〜２０重量％、さらに好ましくは約２重量％（例えば、１００ｇにする充分量の溶媒中に約２ｇ）の濃度で、例えばブチレングリコールおよび／またはエタノールのようなアルコール／グリコールを例えば０％〜８０％の濃度で、好ましくは約２５％のブチレングリコール、および場合によってメチルパラベンのような防腐剤を０．０１％〜０．５％、好ましくは約０．１％（ｗ／ｗ）の濃度で含有する水溶液中で抽出される植物抽出物に関する。

第１１の態様によると、本発明は、刺激および／またはチクチク感および／または痒みを低減する目的、および／またはしみが表面に見られることおよび／または小さな破裂した脈管が現れることおよび／または皮膚組織の弛緩および／または皮膚色調の消失および／または皮膚乾燥を制限する目的で使用される組成物、特に化粧用組成物を調製するための、少なくとも一種の上記もしくは下記の有効成分および／または上記もしくは下記の抽出物の使用に関する。

第１２の態様によると、本発明は、炎症および／または痛みおよび／またはヒリヒリ感および／または外部の物理的作用因子または炎症症候群に多かれ少なかれ結びついている外皮の発疹および／または発赤および／または乾燥症を軽減する目的で使用される組成物、特に医薬組成物を調製するための、少なくとも一種の上記もしくは下記の有効成分および／または上記もしくは下記の抽出物の使用に関する。

第１３の態様によると、本発明は、ホスホリパーゼＡ２、特にＩ型および／またはＩＩ型ホスホリパーゼＡ２の酵素活性を阻害する目的で使用される化粧用組成物を調製するための、少なくとも一種の上記もしくは下記の有効成分および／または上記もしくは下記の抽出物の使用に関する。

第１４の態様によると、本発明は、ホスホリパーゼＡ２、特にＩ型および／またはＩＩ型ホスホリパーゼＡ２の酵素活性を阻害する目的で使用される医薬用組成物を調製するための、少なくとも一種の上記もしくは下記の有効成分および／または上記もしくは下記の抽出物の使用に関する。

第１５の態様によると、本発明は、少なくとも一種の上記もしくは下記の有効成分および／または上記もしくは下記の抽出物を含む化粧用組成物に関する。

第１６の態様によると、本発明は、少なくとも一種の上記もしくは下記の有効成分および／または上記もしくは下記の抽出物を含む医薬用組成物に関する。

本発明の有効成分の濃度は全組成物の０．０１重量％〜３０重量％であるのが好ましい。

有効成分は、いくつかの症状を処置するために、または同じ症状をより効果的に処置するために、それら同士の間で有益に組み合わせることができる。

第１７の態様によると、本発明は、上記の化粧用組成物を、それを必要とする人の皮膚の領域に局所塗布することを含む化粧的ケア方法に関する。

好適には、この化粧的ケア方法は、刺激および／またはチクチク感および／または痒みのケア、および／またはしみが表面に見られることおよび／または小さな破裂した脈管が現れることおよび／または皮膚組織の弛緩および／または皮膚色調の消失および／または皮膚乾燥を制限または阻止するためのケアに関する。

好適には、これらの皮膚組織は皮膚を含む。

発明の詳細な説明
ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）の阻害の検討を、インビボで遭遇する状況にできるだけ近似させた反映であることを目標とした無細胞インビトロ・モデルで行う。

Ｉ型およびＩＩ型のＰＬＡ２を、インビトロで、下記を含むモデルにおいて用いた。
１）アラキドン酸のエステル誘導体（例えば、ホスホリパーゼＡ２により加水分解される部位、ＳＮ２位にアラキドン酸を含有するリン脂質である、β−アラキドノイル・γ−パルミトイル・Ｌ−α−ホスファチジルコリン）、具体的には、炎症のメディエーターの合成に関与している脂肪酸、
２）二価イオン、触媒の役割を果たす（例えば、カルシウム）、および
３）アクチベーター、酵素の活性に不可欠であり、反応媒質中で基質の溶解剤の役割を果たし、酵素−基質相互作用を促進することができる（好ましくは、デオキシコール酸ナトリウム）。

この反応混合物を、そのＰＬＡ２阻害活性を試験しようとしている有効である可能性のある種々の物質の存在下に置き、試験後の遊離脂肪酸の含有量を種々の方法（気相クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、比色測定法等）で評価することができ、これにより最良の阻害剤を選別することができる。

本検討モデルにおいて好適に使用されるＰＬＡ２は、入手可能性とコストの理由からブタ膵臓（Ｉ型酵素）に由来し、
−Ｉ型ＰＬＡ２とヒトＩＩ型ＰＬＡ２均等物との間の相同性（Ｔａｔｉｎａ他、「Ｂｌａｓｔ２シーケンス−タンパク質とヌクレオチドの配列を比較する新しいツール（Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」、エフイーエムエス・マイクロバイオロジー・レターズ（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第１７４巻、２４７−２５０（１９９９年））が５４％を超えること、
−並行して行った検討により、本発明者はこれら２種の酵素が、与えられた阻害剤に従って比較的類似する活性スペクトルをもつことを示すことができたこと
が理解される。

ＰＬＡ２を基質、例えば、ホスホリパーゼＡ２により加水分解される部位、ＳＮ２位にアラキドン酸を含有するリン脂質である、β−アラキドノイル・γ−パルミトイル・Ｌ−α−ホスファチジルコリン、具体的には、炎症のメディエーターの合成に関与している脂肪酸、の存在下に置く。

並行して、ホスホリパーゼＡ２の阻害のためのコントロールを取ることができるが、これは、例えば、下記のものであることができる。
−アリストロキン酸（８−メトキシ−６−ニトロフェナントロ（３，４−ｄ）−１，３−ジオキソール−５−カルボン酸）、これは種々のウマノスズクサ属（Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａ）植物種から単離される主要な構成成分であり、ヘビ毒、特にタイワンコブラ（Ｎａｊａ ｎａｊａ ａｔｒａ）およびタイワンアマガサヘビ（Ｂｕｎｇａｒｕｓ ｍｕｌｔｉｃｉｎｃｔｕｓ）由来のヘビ毒を中和するための伝統的医薬中に使用されている。

アリストロキン酸はインビトロでヘビ毒由来のＰＬＡ２の酵素活性および浮腫誘導活性を特異的に阻害することが証明されている（ビシュワナス・ビー．エス．（Ｖｉｓｈｗａｎａｔｈ Ｂ． Ｓ．）「ヒト滑液から精製されたホスホリパーゼＡ２の浮腫誘導活性およびアリストロキン酸による阻害（Ｅｄｅｍａ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ ａｃｉｄ） ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、第１２巻、第６号、５４９−５６１、１９８８年；サンナナイク ビシュワナス ビー（Ｓａｎｎａｎａｉｋ Ｖｉｓｈｗａｎａｔｈ Ｂ）、「アリストロキン酸とラッセルクサリヘビ・ホスホリパーゼＡ２との相互作用：酵素および病理学的活性に対する効果（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ ａｃｉｄ ｗｉｔｈ ｖｉｐｅｒａ Ｒｕｓｓｅｌｌｉ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｐａｓｅ Ａ２： ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｉｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）」、「トクシコム（Ｔｏｘｉｃｏｍ）」、第２５巻、９２９−９３７、１９８７年）；モレノ ジェイジェイ（Ｍｏｒｅｎｏ ＪＪ）、「アラキドン酸カスケードに対するアリストロキン酸の効果および炎症のインビボ・モデル（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｃａｓｃａｄｅ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）」、 インミュノファーマコロジー（Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、第２６巻、１−９、１９９３年）」。

− 臭化ｐ−ブロモフェナシル、これは分泌されたＰＬＡ２類の特異的阻害剤である（マオ−ジアン エム（Ｍａｏ−Ｑｉａｎｇ Ｍ）他、「分泌性ホスホリパーゼＡ２活性が透過性バリアのホメオスタシスに必要である」（Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｂａｒｒｉｅｒ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ、 ザ・ジャーナル・オブ・インベスチゲイティブ・ダーマトロジー（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．）、第１０６巻、１９９６年，５７−６３）。

反応媒質には下記のものも添加される。
− 触媒、好ましくはカルシウム。
− アクチベーター、これは酵素の活性に不可欠であり、例えばデオキシコール酸ナトリウムである。このアクチベーターは反応媒質中の基質の溶解度を増加することが可能であり、そのため酵素−基質相互作用を促進する。

ＰＬＡ２の阻害の検討は２段階で行うのが好ましい。
酵素をその補因子の存在下で所定の時間（例えば、約１５分間）阻害剤とともにインキュベートし、次いで基質、好ましくはβ−アラキドノイル・γ−パルミトイル・Ｌ−α−ホスファチジルコリン、およびアクチベーター、好ましくはデオキシコール酸ナトリウム、の存在下に第２のインキュベーションを行う（例えば、約２０分間）。

このインキュベーションの終わりにおいて、例えば所定の波長における比色測定を引き続き行うことができる酵素的技法により反応媒質の非エステル化脂肪酸を測定する。

並行して、阻害剤の存在下におけるホスホリパーゼＡ２の活性に対応するコントロール試験を行った。酵素活性を有意に阻害することが可能な有効物質を使用していることは所定波長の光学濃度の低下により、すなわちコントロールに対して反応媒質中に放出された脂肪酸が減少することによりはっきりと示される。

このようにして、酵素ＰＬＡ２を阻害することが可能な、有効である可能性がある物質のスクリーニングを行うことが可能となった。

この技法により、約１００個の分子についてスクリーニングを行って、種々のファミリーの有効である可能性がある成分、すなわち、植物抽出物、藻類、多糖類およびタンパク質からＰＬＡ２の強力な阻害活性を有するものを選別した。

このスクリーニングにより出現し、それゆえＩ型ＰＬＡ２の阻害活性を有する生成物は、炎症過程中の皮膚に見出される精選された酵素である、トウブダイヤガラガラヘビ（ヘビ毒）由来のＩＩ型ＰＬＡ２と有効である可能性がある物質を接触させることを使用する同様の試験方法により評価する。

このＩＩ型ＰＬＡ２を用いる試験は、上述のように入手可能性とコストの理由で、一般にＩ型ＰＬＡ２を使用する試験の後に行われる。したがって、Ｉ型ＰＬＡ２を使用する試験方法により有効である可能性のある物質を予備選択し、次いでこの予備選択した物質の活性をＩＩ型ＰＬＡ２を使用する試験方法で確認または反証すればよい。

このように、特定の抽出物、すなわちブドウ種子抽出物、クズ抽出物、プネウムス・ボルドゥス（ボルド）抽出物、レモン抽出物、ヒマワリ抽出物、カモミール抽出物、グルコン酸亜鉛、ガラナ抽出物、蔓植物（ウンカリア・トメントーサ）抽出物、ウサギギク抽出物をそれらの有効性に基づいて選択した。

抽出物１の種々の濃度に対する抗ＰＬＡ２活性の結果を示すグラフである。抽出物１の濃度は横軸にパーセンテージ（％）で表した。ＰＬＡ２阻害のレベルは縦軸にパーセンテージ（％）で表した。本図はクズ抽出物、すなわち抽出物１に関する実施例２用である。 図１と同様に、クズの抽出物１由来のＩ型ＰＬＡ２と表ＩＶの対象であるトウブダイヤガラガラヘビ由来のＩＩ型ＰＬＡ２との間で抗ＰＬＡ２活性を比較したグラフである。 実施例３による種々の濃度の抽出物２、ブドウ種子抽出物の抗ＰＬＡ２活性の得られた結果を示すグラフである。抽出物２の濃度は横軸にパーセンテージ（％）で、ＰＬＡ２阻害は縦軸にパーセンテージ（％）で表した。 抽出物２用の図２と同様のグラフであり、Ｉ型ＰＬＡ２をＩＩ型ＰＬＡ２と比較している。 実施例６のインビボ検討により、プラセボ配合剤、またはクズの抽出物１を３％含有する配合剤を２８日間使用した後に皮膚刺激の徴候が増した、変化しなかった、または減少したボランティアの人数の分布を示すグラフである。 実施例６のインビボ検討により、プラセボ配合剤、またはクズの抽出物１を３％含有する配合剤を２８日間使用した後の皮膚刺激の徴候の改善を示すグラフである。 皮膚刺激の徴候の強さの減少の結果をパーセンテージで表すグラフであり、実施例６のインビボ検討により、プラセボ配合剤と抽出物１を３％含有する配合剤とを比較している。 実施例６のヒトボランティアに関するインビボ検討の状況における、プラセボ配合剤と抽出物１を３％含有する配合剤との間で、軟化した皮膚またはしなやかになった皮膚を有するボランティアの数の比較をパーセンテージ（％）で示すグラフである。 図８と同様に、プラセボ配合剤と抽出物１を３％含有する配合剤との間で、処置を行うことを希望するか、または購買に対する強い要求を持つボランティアの数をパーセンテージ（％）で比較するグラフである。

実施例においていかなる技術水準に関しても新規であると考えられるいかなる特徴も本発明の重要な部分を成し、その機能および一般性についての保護が求められる。

さらに、説明および請求項において、特に指示しない限り％はすべて重量により、温度はすべて℃であり、圧力は気圧である。

（活性のスクリーニングを用いる本発明の実施例１）
水溶液中のＰＬＡ２（３５単位／ｍｌ）を、ホスホリパーゼＡ２により加水分解されるＳＮ２位に、とりわけ炎症のメディエーターの合成に関与する重要な脂肪酸であるアラキドン酸を含有するリン脂質であるβ−アラキドノイル−γ−パルミトイル・Ｌ−α−ホスファチジルコリン３ｍＭの存在下に置く。

この反応媒質には、
−カルシウム（補因子）：０．９ｍＭ
−デオキシコール酸ナトリウム（アクチベーター）：１．６ｍＭ
も添加する。

ＰＬＡ２の阻害の検討を２段階で行う、すなわち、
ａ）酵素を阻害剤とともに補因子（カルシウム）の存在下で１５分間外気温度（２０℃）においてインキュベートする；
ｂ）次いで、第２のインキュベーションを２０分間、β−アラキドノイル−γ−パルミトイル・Ｌ−α−ホスファチジルコリン（３ｍＭ）およびデオキシコール酸ナトリウム（１．６ｍＭ）の存在下で行う。

このインキュベーションの終点で、反応媒質の遊離脂肪酸、従って非エステル化遊離脂肪酸の測定を当業者に周知の伝統的酵素技法により行い、次いで比色測定を、例えばここでは５５０ｎｍにおいて行うことが可能である。

本発明に従って使用するコントロールは：
−アリストロキン酸（８−メトキシ−６−ニトロフェナントロ（３，４−ｄ）−１，３−ジオキソール−５−カルボン酸）、
−臭化ｐ−ブロモフェナシル、これは分泌されたＰＬＡ２の特異的阻害剤である。

これらの分子により下記の結果が得られるようになった。

有効である可能性がある被験物質および得られた結果を下表ＩＩに示す：

カボチャ、アルファルファ、カラシナ、レモン、クワの実、ヒマワリ、オトギリソウ、カンゾウ、カモミール、バニラ、ガラナ、ユキノシタ、レチヌス・エドデス、およびボルドの抽出物は下記の方法により調製する。すなわち、葉を水中に５％（ｗ／ｗ）、全植物体を水中に５％（ｗ／ｗ）、または果実を水中５％（ｗ／ｗ）になるように１晩４℃で浸漬を行う。次いで、得られた懸濁液の０．４５μｍ超部分を濾過する。ＰＬＡ２の阻害活性の測定は得られた濾液について直接行う。

蔓植物、コケモモ、クズおよびブドウ種子の抽出物は根、全植物体または果実の粉砕後、７０％エタノール中５％（ｗ／ｗ）でアルコール抽出することにより調製される。この混合物を６０℃で１時間加熱することにより煎出物を調製する。次いで、上澄みを濾過した。第２の煎出物を７０％エタノール中で同じ５％（ｗ／ｗ）の割合で得られた充填物から調製する。得られた２種の上澄みのアルコールをロータリー・エバポレータを用いて蒸発させ、次いで充填物を凍結乾燥により乾燥させる。

得られた乾燥製品を水６９．６％（ｗ／ｗ）、ブチレングリコール（２５％）およびメチルパラベン（０．１％）からなる混合物中に５％に再溶解させる。

「ウチワマメ粉」の溶液はウチワマメ・タンパク質と多糖類の混合物の水中５％（ｗ／ｗ）溶解物から得られる。

有効物質の探索を可能にする本検討の終了時点において、特定の抽出物、すなわちブドウ種子抽出物、クズ抽出物、ボルド抽出物、レモン抽出物、アカシア抽出物、ヒマワリ抽出物、カモミール抽出物、グルコン酸亜鉛、ガラナ抽出物、および蔓植物（ウンカリア・トメントーサ）抽出物がそれらの有効性に基づいて選別される。

（本発明の実施例２）
（１−クズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）の抽出物すなわち抽出物１）
（Ａ−一般性）
プエラリア・ロバータ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）（クズ、中国名Ｇｅ−ｇｅｎ）は風変わりな植物であり、蔓植物の蔓シュートのような巻きつく茎を有し、網や樹木に取り付くことができる。

中国および日本原産であり、これらの国々ではその根が澱粉として調理に用いられているこの植物は、紀元前６世紀以降中国医学において多くの性質が知られており、その性質のうちの１つ、すなわち、薬剤中毒の克服を促進する性質はアメリカ人による最近の研究の主題であった。クズの根（葛根）は３種類のフラボノイド：プエラリン（ｐｕｅｒａｒｉｎ）、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）およびダイジン（ｄａｉｄｚｉｎｅ）を含有している。この根は治療薬として定期的に消費されているが、その理由はアルコールの消費を減少させ、たばこ依存症を顕著に減少させるからである（シェーベック、ジェイ（Ｓｈｅｂｅｋ， Ｊ）他、ジャーナル・オブ・オールタナティブ・アンド・コンプリメンタリ・メディスン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ），４５−４８，２０００）。

（Ｂ−抽出物１の組成）
（根を粉砕し、次いで７０％エタノール中で５％（ｗ／ｗ）アルコール抽出して抽出物１を調製）
混合物を６０℃で１時間加熱することにより煎出物を調製し、次いで上澄みを濾過する。第２の煎出物を７０％エタノール中で同じ５％（ｗ／ｗ）の割合で得られた充填物から調製する。得られた２種の上澄みのアルコールをロータリー・エバポレータを用いて蒸発させ、次いで充填物を凍結乾燥により乾燥させる。

得られた乾燥製品を水６９．６％（ｗ／ｗ）、ブチレングリコール（２５％）およびメチルパラベン（０．１％）からなる混合物中に５％に再溶解させる。

（Ｃ−抗ＰＬＡ２活性）
（Ｃ１−遊離脂肪酸（非エステル化）の測定）
植物の水性抽出物（「抽出物１」と呼ぶ）の効果の用量依存性の検討を行って、選別された製品の、ブタ膵臓に由来するＩ型ＰＬＡ２に対する作用の特異性を評価した。

選別された製品の濃度を増加した際の抗ＰＬＡ２活性を出発材料の３つの異なるバッチについて測定した。各測定は３回行った。

得られた結果を下表ＩＩＩにまとめた。

結果をコントロールに対する阻害（％）で表し、図１の対象とした。

図１において、これらの結果から、選別された製品のＰＬＡ２に対する阻害効果は用量に関連していることが示されている。この結果はこの化合物の作用が検討したパラメータについて特異的であることを支持している。

（Ｃ２−ＩＩ型ＰＬＡ２について測定した活性）
トウブダイヤガラガラヘビ（Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）由来のＩＩ型ＰＬＡ２について用量効果曲線を作成して本発明者のスクリーニングモデルに使用したＩ型ＰＬＡ２について得られた結果を確認した。

結果をコントロールに対する阻害（％）で表し、図２の対象とした。

図２において、ここに示されている結果から、選別された製品のＩ型ＰＬＡ２またはＩＩ型ＰＬＡ２に対する阻害活性は均等であることが示されている。このように、選別された製品は実際に炎症中に皮膚組織において遭遇するＰＬＡ２の形態を阻害することができ、このことから敏感肌を助けるための精選された道具となる。

（本発明の実施例３）
（ブドウ種子からの抽出物（抽出物２））
種子を収穫し、７０％アルコール中５％（ｗ／ｗ）でアルコール抽出して抽出物２を調製した。

混合物を６０℃で１時間加熱することにより煎出物を調製し、次いで上澄みを濾過する。第２の煎出物を７０％エタノール中で同じ５％（ｗ／ｗ）の割合で得られた充填物から調製する。得られた２種の上澄みのアルコールをロータリー・エバポレータを用いて蒸発させ、次いで充填物を凍結乾燥により乾燥させる。

得られた乾燥製品を水７２．６％（ｗ／ｗ）、ブチレングリコール（２５％）およびメチルパラベン（０．１％）からなる混合物中に２％に再溶解させる。

（抗ＰＬＡ２活性）
この物質の効果の用量依存性の検討を行い、選別された製品のＰＬＡ２に対する作用の特異性を評価した。

選別された製品の濃度を増加した際の抗ＰＬＡ２活性を出発材料の３つの異なるバッチについて測定した。各測定は３回行った。

得られた結果を下表Ｖにまとめた。

結果をコントロールに対する阻害（％）で表し、図３の対象とした。

図３において、これらの結果から、選別された製品のＰＬＡ２に対する阻害効果は用量に関連していることが示されている。この結果はこの化合物の作用が検討したパラメータについて特異的であることを支持している。

（ＩＩ型ＰＬＡ２について測定した活性）
ＩＩ型ＰＬＡ２について用量効果曲線を作成して、本発明者のスクリーニングモデルに使用したＩ型ＰＬＡ２について得られた結果を確認した。

結果をコントロールに対する阻害（％）で表し、図４の対象とした。

図４において、ここに示されている結果から、選別された製品のＩ型ＰＬＡ２またはＩＩ型ＰＬＡ２に対する阻害活性は均等であることが示されている。このように、選別された製品は実際に炎症中に皮膚において遭遇するＰＬＡ２の形態を阻害することができ、このことから敏感肌を助けるための精選された道具となる。

（本発明の実施例４）
（−抗炎症剤の活性）
調剤において古典的に使用されているステロイド系および非ステロイド系抗炎症剤を本発明者の検討モデルで試験して上記選別された製品で実証された有効性に関する活性を比較した。

結果をコントロールに対する阻害（％）で表した。

本発明者の検討モデルにおいて得られた結果により、古典的に検討されている抗炎症剤は、配合剤中に３％で使用すると、選別された上記有効物質よりも抗ＰＬＡ２活性が低いことが示された。

（本発明の実施例５）
（−クズの抽出物中に存在するフラボン類の同定）
クズはプエラリン（ｐｕｅｒａｒｉｎ）、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、ダイジン（ｄａｉｄｚｉｎｅ）およびゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）のようなイソフラボン類の含有量について知られている植物である。これらの分子は上記選別された製品中でＨＰＬＣ技法により測定される。

プエラリン、ダイジンおよびダイゼインの含有量が下表ＶＩＩＩに記載されている。

上記選別された製品中でゲニステインは非常に低濃度（計算値にして０．００５％未満）であるため測定不能であった（カウフマン・ピー、他、１９９７）。

しかしながら、市販の１％ゲニステイン溶液を本発明者のＰＬＡ２阻害モデルで評価して、結果（２８．７９％）を得た。これにより、この製品のゲニステイン含有量が０．００５％未満である限り、このイソフラボンは選別された抽出物の活性には関与していないことが示されている。

抽出物中に見出される濃度における３種類のイソフラボンの混合物の抗ＰＬＡ２活性を開発された阻害モデルで評価する。

これらの結果により、クズの抽出物中で同定されたイソフラボン類はＰＬＡ２の阻害活性には関与していないことが示された。

（本発明の実施例６）
（−ヒトのボランティアについてのインビボ検討）
ヒトのボランティアについての検討を行って、抽出物１を３％含有する配合剤の、皮膚の炎症の間に観察される皮膚刺激の徴候に対する有効性を検査する。

（１−検討のプロトコル）
５０名のボランティアが２８日間プラセボ配合剤を使用した。他の５０名のボランティアが同じ期間、抽出物１を３％含有する配合剤を使用した。

５０名からなるグループをそれぞれ２５名のボランティアからなる２つのサブグループに分割した。１つのサブグループは反応性皮膚を有するボランティア（「敏感肌」サブグループ、ＳＳ）からなり、もう１つのサブグループは反応性皮膚を持つと推定されるボランティア（「推定敏感肌」サブグループ、ＥＳＳ）からなっていた。各サブグループへのボランティアの編入は本検討を行った研究室が２年間にわたって実証した臨床質問表を用いて行った。

注：２つのサブグループ（ＳＳ＋ＥＳＳ）は皮膚刺激の徴候を示してもよい。

配合剤（プラセボ配合剤または抽出物１を含有する配合剤）の一方または他方により２８日間処置する前および後：
１）：ボランティアの示す皮膚刺激の徴候を医師が「等級付け」した。

観察された種々の徴候は下記の通りであった。
発疹：外部物理的作用因子または炎症症候群に結びついている外皮の多少とも局在したしみ
乾燥症：皮膚の乾燥を定義する医学用語であるが、強度を内包している。「乾燥症」という用語は中等度を超える乾燥を定義することが望まれるときに使用される。
弛緩：圧迫された皮膚の回復能力により臨床的に分析された皮膚の色調
しみ：顔面の乾燥皮膚上に現れる銅色〜バラ色の星状の小さな破裂した脈管（末梢血管拡張症）。

本検討の終了時にボランティアは製品評価の質問表に回答した。

（結果）
（全体的分析）
ＳＳサブグループおよびＥＳＳサブグループ間で差異がなく、そして検討中に皮膚刺激の徴候が増大した、変化しない、または減少したボランティアの分布を検査すれば、次のことを観察することができる。
プラセボ配合剤を用いたボランティアについて：
４名は皮膚刺激の徴候の増大が見られた。
２３名は皮膚刺激の徴候の変化が見られなかった。
２３名は皮膚刺激の徴候の減少が見られた。
抽出物１を３％含有する配合剤を用いたボランティアについて：
０名は皮膚刺激の徴候の増大が見られた。
１９名は皮膚刺激の徴候の変化が見られなかった。
３１名は皮膚刺激の徴候の減少が見られた。

図５に示すこれらの結果により、抽出物１を含有する配合剤は、プラセボ配合剤により提供されるよりも大きな皮膚刺激の臨床的徴候の改善を提供することが明らかに示されている（ｐ＜０．０７、χ−２検定）。

図５において、注意すべきことは、皮膚刺激の徴候が増大した、変化しない、または減少したボランティアの人数の分布はプラセボ配合剤またはクズの抽出物を３％含有する配合剤を２８日間使用した後に検査したことである。

（項目別分析）
ＳＳサブグループおよびＥＳＳサブグループ間に差異がなければ、これら２種の配合剤（プラセボ配合剤および抽出物１を含有する配合剤）はパネリストが遭遇する皮膚刺激の臨床的徴候の大部分を有意に改善することができる（下図）。

図６において、プラセボ配合剤または抽出物１を３％含有する配合剤を２８日間使用した後の皮膚刺激徴候の改善が観察される：ＳＳサブグループとＥＳＳサブグループを区別しない全体的分析

図６に関して下記のコメントをすることができる。
ｎｓ：Ｄ０およびＤ２８の間で有意の差がない。
＊：Ｄ０およびＤ２８の間で有意の差がある（ｐ＜０．０５；ウィルコクソン一対符号付き順位検定）。
＊＊：Ｄ０およびＤ２８の間で有意の差がある（ｐ＜０．０１；ウィルコクソン一対符号付き順位検定）。
＊＊＊：Ｄ０およびＤ２８の間で有意の差がある（ｐ＜０．００１；ウィルコクソン一対符号付き順位検定）。

皮膚刺激の臨床徴候の強度の減少パーセンテージ（％）
プラセボ配合剤：
発疹： −２１．２８±４８．０６％
乾燥症： −２７．０３±７２．２３％
弛緩： −２７．１２±４３．４５％
しみ： −２６．３２±７９．７５％
抽出物１を３％含有する配合剤：
発疹： −１５．６９±４５．８６％
乾燥症： −３８．６４±６３．３３％
弛緩： −３１．０１±５１．９４％
しみ： −４１．９４±８５．０４％

これらの結果から示されることは、化粧用配合剤は、それがどのようなものであれ、単に塗布するだけで皮膚組織の一般的状態を改善することができるということである。この改善は多分クリームの塗布後に得られる水和によるものであると考えられる。しかしながら、この全体的結果はここで検討した「反応性皮膚」パラメータを考慮に入れておらず、結果の詳しい分析にはＳＳパネルとＥＳＳパネルとを分離するのが好適である。

敏感肌のみを考慮するときは、抽出物１を３％含有する配合剤のみが検討した皮膚刺激の臨床徴候４例のうち３例を有意に改善することが可能である（図６）。プラセボ配合剤に関しては、この配合剤は「弛緩」項目のみを改善し（図６）、この項目はクリームの塗布後に得られる水和効果と関連している蓋然性が非常に高い。

図７において、プラセボ配合剤または抽出物１を３％含有する配合剤を２８日間使用した後の皮膚刺激徴候の改善が観察される：「敏感肌」サブグループの分析

図７に関して下記のコメントをすることができる。
ｎｓ：Ｄ０およびＤ２８の間で有意の差がない。
＊：Ｄ０およびＤ２８の間で有意の差がある（ｐ＜０．０５；ウィルコクソン一対符号付き順位検定）。
＊＊：Ｄ０およびＤ２８の間で有意の差がある（ｐ＜０．０１；ウィルコクソン一対符号付き順位検定）。

皮膚刺激の臨床徴候の強度の減少パーセンテージ（％）
プラセボ配合剤：
発疹： −１３．５４±４８．５８％
乾燥症： −２５．４８±９７．４０％
弛緩： −３２．１１±５４．４０％
しみ： −９．０２±６０．６１％
インヒパーゼ（ＩＮＨＩＰＡＳＥ（登録商標））を３％含有する配合剤：
発疹： −１３．００±４７．６４％
乾燥症： −５５．０５±７４．９１％
弛緩： −３４．６８±５４．７８％
しみ： −６０．６１±１１７．２３％

結論として、抽出物１は皮膚が特に反応性である集団において皮膚刺激の臨床的徴候を特異的に低減することができる。この作用はこのタイプの人々に特に集中しているので、抽出物１は敏感肌に対抗する精選されたツールとなると考えられる。

（製品評価の質問表）
２８日間プラセボ配合剤または抽出物１を３％含有する配合剤を用いたボランティアに配られた質問表によっても、試験した製品間の有意の差を実証することができた（図８および図９）。

抽出物１を３％含有する配合剤は皮膚の軟化を可能にし（ｐ＜０．０５）、プラセボ配合剤を用いて得たものよりも有意に強く皮膚をしなやかにした（ｐ＜０．０６）（図８）。

図８において、皮膚の軟化および皮膚をよりしなやかにすることがプラセボ配合剤または抽出物１を３％含有する配合剤の２８日間の塗布に応答して観察された。

図８に関して下記のコメントをすることができる。
＊：プラセボグループに対して有意に異なる（ｐ＜０．０５；χ−２検定）
＋：プラセボグループに対して有意に異なる（ｐ＜０．０６；χ−２検定）

さらに、ボランティアは抽出物１を３％含有する配合剤の方を明らかに好んだ（図９）。
→ボランティアの６０％がその使用を継続することを希望した（対２９％プラセボ配合剤希望、ｐ＜０．０５）、および
→ボランティアの５２％が明確に購入の意思を表明した（対２６％プラセボ配合剤希望、ｐ＜０．０６）

図９に、購入の意思および処置継続の結果を示した。

図９に関して下記のコメントをすることができる。
＊：プラセボグループに対して有意に異なる（ｐ＜０．０５；χ−２検定）
＋：プラセボグループに対して有意に異なる（ｐ＜０．０６；χ−２検定）
注：χ−２検定は集団の分布を比較している。
このグラフのデータはボランティアの人数で表されており、この場合は標準偏差を求める必要がない。

抽出物１は、敏感肌を有する被験者が遭遇する皮膚刺激の徴候の低減に特異的に集中された作用を提供する。このことから、この有効物質は反応性皮膚の軽快および消費者が感じる化粧的塗布による不快な発赤およびチクチク感を直すための特に適したツールである。

（本発明の実施例７）
（化粧用組成物または製薬用組成物の配合）
水中油エマルション型の化粧用組成物または製薬用組成物の配合における本発明の製品の使用
（配合剤７ａ）

Ａ相およびＢ相を別々に７５℃に加熱し、次いで激しく撹拌しながらＢをＡに添加し、このようにして形成されたクリームが冷却する間に、Ｃ次いでＤを添加する。

（配合剤７ｂ）

Ａ相を７５℃に加熱し、このようにして調製された配合剤が冷却する間、撹拌しながらＢ次いでＣを添加する。

（配合剤７ｃ）

Ａ相とＢ相を別々に７５℃に加熱し、次いで激しく撹拌しながらＢをＡに添加し、このようにして形成されたクリームが冷却する間に、Ｃ次いでＤ、次いでＥ、次いでＦを添加する。

（本発明の実施例８）
油中水型配合剤における「抗炎症性」製品の使用

Ａ相とＢ相を別々に７５℃に加熱し、次いで激しく撹拌しながらＢをＡに添加し、このようにして形成されたクリームが冷却する間に、Ｃ次いでＤ、次いでＥを添加する。

（本発明の実施例９）
洗顔ジェル型配合剤における「抗炎症性」製品の使用

Ａ相およびＢ相を外気温度で別々に調製し、次いで、撹拌しながらＢをＡに添加し、適度に撹拌しながら、Ｃ次いでＤ次いでＥを添加する。

（本発明の実施例１０）
無水型配合剤における本発明の製品の使用

Ａ相およびＢ相を別々に８０℃に加熱し、次いで、撹拌しながらＢをＡに添加する。

（本発明の実施例１１）
水性ジェル（顔用ジェル、ボディジェルなど）の配合剤における本発明の製品の使用

すべての成分を添加し、均質な混合物が得られるまで全体を８０℃に加熱することによりＡ相が調製される。次いで、このようにして形成されたジェルが冷却する間、激しく撹拌しながらＢをＡに添加する。

（実施例１２）
（無害性試験）
（本発明の製品を含有する標品の化粧用合格判定）
純粋状態で使用した保持化合物、すなわち抽出物１についてウサギにおける眼球評価、ラットにおける単独経口投与による異常な毒性の不在の検討、およびモルモットにおける感作能力の検討により毒性試験を行った。

（１．ウサギの皮膚における一次刺激の評価）
「皮膚に対する急性刺激／腐食効果」の検討に関するＯＥＣＤ推奨の方法により、上記の標品を希釈せずに３匹のウサギの皮膚に０．５ｍｌの薬用量で塗布した。

製品は２１／０２／８２付けのフランス共和国官報に公表された１／２／１９８２付けの指令に定義されている基準に従って分類する。これらの試験の結果、保有されている標品は皮膚に対して非刺激性であると分類されることを結論することができた。

（２．ウサギにおける眼球刺激の評価）
「皮膚に対する急性刺激／腐食効果」の検討に関する１９８７年２月２４日付けＯＥＣＤ第４０５号指令の推奨する方法に従って、３匹のウサギの眼に０．１ｍｌの割合で１回上記の標品を純粋状態で点眼した。

この試験の結果から、純粋状態で使用した場合、上記標品は９１／３２６ＥＥＣ指令の意味で眼に対して非刺激性であると考えることができると結論することができる。

（３．ラットにおける単独経口投与による異常毒性の不在試験）
１９８７年２月２４日付けＯＥＣＤ第４０１号指令により啓発され化粧品に適合されたプロトコルにより上記の標品を雄ラット５匹と雌ラット５匹とに５ｇ／体重Ｋｇの薬用量で１回経口投与した。

ＬＤ_０およびＬＤ_５０は５，０００ｍｇ／Ｋｇよりも大きいことが見出された。試験した標品は従って摂取すると危険である標品には分類されない。

（４．モルモットにおける皮膚感作能力の評価）
上記の標品をＯＥＣＤの第４０６号指令に従ったプロトコルであるマグヌッソン（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ）およびクリーグマン（Ｋｌｉｇｍａｎｎ）により記載された最大化試験にかけた。

上記標品は皮膚と接触しても非感作性であると分類された。

（５．モルモットにおける局所塗布による光毒性および光アレルギーの可能性の評価）
１０匹のモルモットに上記製品をそのまま１回局所塗布し、次いでＵＶ光に曝露してその光毒性の可能性を評価した。

次いで、試験すべき製品をそのまま繰り返し局所塗布することによって投与した後、ＵＶ光に曝露した（誘導曝露）。１０日間の安息期間経過後、モルモットに試験すべき製品をそのまま一回未露光皮膚上に塗布し、次いでＵＶ光に曝露した（開始曝露）。

並行して、５匹のモルモットに同じ条件下で試験すべき製品を投与し、ＵＶ光には曝露せず、照射コントロールとした。

試験すべき製品で処置し、次いでＵＶ光に曝露した領域、並びにコントロールモルモットの未処置かつ曝露領域および処置かつ未曝露領域における発疹および浮腫の強度を比較することにより光毒性および光アレルギーの可能性の評価を行う。

採用した実験条件下で、そのまま試験した製品は光毒性および光アレルギーの可能性がないと考えられる。

Claims (6)

1. ７０％エタノール中で抽出された、植物クズ根抽出物を少なくとも含む、Ｉ型および／またはＩＩ型ホスホリパーゼＡ２の酵素活性を有意に阻害する局所塗布用組成物であって、
   前記植物クズ根抽出物は、０．０６％の量のダイゼイン、１．５％の量のプエラリン、０．４５％の量のダイジン、０．００５％未満のゲニステインを含み、
   前記植物クズ根抽出物が、組成物の０．０１重量〜３０重量%の濃度で組成物において使用される、
   組成物。
2. 前記組成物が、化粧用組成物または医薬組成物であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. 前記植物クズ根抽出物が、７０％エタノール中で０．１重量％〜２０重量％の濃度で抽出されることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記植物クズ根抽出物が、７０％エタノール中で約５重量％の濃度で抽出されることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
5. 前記植物クズ根抽出物が、皮膚抗炎症および／または抗刺激活性を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記植物クズ根抽出物が、組成物の０．１重量〜３０重量％の濃度で組成物において使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。

Images