DE10362194B4 - Verfahren zum Testen der Aktivität einer möglichen wirksamen Substanz, die die enzymatische Aktivität der Phospholipase A2 hemmen kann

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DE10362194B4

Publication number: DE10362194B4
Application number: DE2003162194
Authority: DE
Inventors: Delphine Rival; Sébastien Bonnet; Eric Perrier
Original assignee: Engelhard Lyon SA
Current assignee: BASF Beauty Care Solutions France SAS
Priority date: 2002-11-19
Filing date: 2003-05-08
Publication date: 2008-11-13
Anticipated expiration: 2023-05-09
Also published as: DE10362194C5; KR20040044076A; US20150110907A1; JP2012224637A; JP2004166684A; JP5425489B2; CH694107A5; FR2847267B1; KR101172700B1; DE10320603A1; FR2847267A1; US20040096925A1; JP2009108104A

Verwendung von mindestens einem Wirkstoff, der die enzymatische Aktivität von Phospholipase A2 vom Typ I oder II signifikant hemmt, zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung zur Reduktion von Reizungen und/oder Entzündungen von Hautgewebe, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff ausgewählt ist aus einem Extrakt von Traubensamen, einem Extrakt von Pueraria lobata, einem Limonenextrakt, einem Sonnenblumenextrakt, einem Guaranaextrakt, oder einer Kombination von mindestens zwei der oben aufgeführten wirksamen Bestandteile.

Im wesentlichen betrifft die Erfindung einen Wirkstoff, der in der Lage ist, Hautentzündungen zu reduzieren, und dessen Verwendung im Bereich der Kosmetika oder Pharmazeutika.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Testen einer Substanz, die möglicherweise im inflammatorischen Bereich wirksam ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein neues Testverfahren, dessen Verwendung in Untersuchungen und zur Identifikation einer Substanz, die möglicherweise wirksam im Bereich einer Entzündung ist aufgrund der Fähigkeit, das Enzym Phospholipase A2 (PLA2) zu hemmen.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin neue Substanzen, die im Bereich von Entzündungen wirksam sind und die so nachgewiesen wurden, und deren Verwendung im kosmetischen oder dermo-pharmazeutischen oder pharmazeutischen Bereich, insbesondere zur Pflege, um Anzeichen einer Hautreizung zu reduzieren.
Stand der Technik
Die anti-inflammatorischen Produkte, die bisher in den Laboratorien entwickelt wurden und die vorgesehen sind, Hautentzündungen zu bekämpfen, wurden aufgrund von Modellstudien ausgewählt, die nicht Bedingungen angepaßt sind, ein Aufzeigen der Wirksamkeiten gegenüber Entzündungen der Haut zu erlauben (Ausschlag, Schuppen, Xerose, Flecken).
Die verwendeten Modelle wurden in der Tat meistens mit Tieren entwickelt, wobei die angelegte Reizung häufig sehr stark war; diese Reizung kann sein:

– eine UV-Bestrahlung auf einem bestimmten Punkt, die zur Bildung von Hautausschlag führt, und, nach Verabreichen eines möglicherweise wirksamen Produkts, Untersuchen des Verschwindens dieses Hautausschlags;
– eine subkutane Injektion von Lipopolysacchariden (LPS) und/oder Guanidin und/oder sogar Carrageen, um ein Ödem in Meerschweinchen zu bilden und dann, nach Verabreichen des möglicherweise wirksamen Produkts, Untersuchen ob das Ödem wieder verschwindet.

In vitro Tests, die die Hemmung der Phospholipase A2 betreffen, ein Enzym, das in der Synthese der inflammatorischen Mediatoren involviert ist, wurden ebenfalls entwickelt; diese Tests sind aber weit von den in vivo Bedingungen entfernt und daher nicht anwendbar.
Bekannte in vitro Tests
Die bisher beschriebenen Tests betreffen meist Sensitivitätsprobleme und sind aufgrund der Objekte der verwendeten Modelle weit von der in vivo Situation entfernt. So beschreibt zum Beispiel das Patent FR 2,757,395 A1 die Hemmung der Phospholipase A2 mit einem Substrat, das nichts mit den natürlichen Substraten des Enzyms, wie sie bei entzündlichen Reaktionen vorkommen, zu tun hat; dieses Substrat, Dimyristoyl-L-phosphatidylcholin, ist in der Tat ein Phospholipid mit zwei C14-Fettsäuren (gesättigte Kohlenwasserstoff-Fettsäuren mit 14 Kohlenstoffatomen). Dieses Substrat und diese Fettsäuren sind nicht in dem Weg zur Bildung der entzündlichen Mediatoren involviert; hierbei handelt es sich um ein Phospholipid, das eine ungesättigte C20-Fettsäure (Arachidonsäure) trägt; dieses wird dann durch Phospholipase A2 hydrolysiert.
Gemäß diesem Dokument wird die Fettsäure durch das Enzym hydrolysiert, und die Freisetzung der Fettsäure führt zum Auftreten einer Trübung der Lösung aufgrund der Unlöslichkeit der Fettsäure in dem Medium, gemessen mittels Spektrophotometrie bei 360 nm. Diese Technik ist nicht sehr sensitiv und erlaubt einerseits keine sichere Klassifizierung der Hemmstoffe; auf der anderen Seite erlaubt die Technik nicht das Testen von lipophilen oder emulgierenden Molekülen, da sie die Lösung trüb machen und somit keine richtige Messung der Phospholipase A2 Hemmung ermöglichen.
Die A2 Phospholipasen (PLA2s)
Phospholipase A2 ist ein Enzym, das in Membranen von Zellen vorkommt. Es kommt hauptsächlich in Zellen vor, die mit entzündlichen Phänomenen verbunden sind, wie Mastozyten. Dieses Enzym hydrolysiert die Membranphospholipide, um eine Fettsäure freizusetzen.
Es können drei Funktionsarten den Phospholipasen zugeschrieben werden: spaltende Funktionen, Funktionen der Restrukturierung von Membranphospholipiden, die zur Aufrechterhaltung der Zellarchitektur verantwortlich sind, wobei sie Deacylierungs-/Reacylierungszyklen durchführen kann, und schließlich Funktionen bei der Signaltransduktion durch die Produktion von biologisch wirksamen Produkten aus Membranphospholipiden. Die Regulation der Aktivierung der Phospholipasen stellt daher ein vorherrschendes Element in den Signalkaskaden dar und somit auch der Signalamplifikatiuon während der entzündlichen Reaktionen.

PLA2s wurden zuerst im extrazellulären Medium von verschiedenen Arten identifiziert: Säugetieren (Pankreas PLA2), Schlangen, Insekten (Gift PLA2). Später wurden fünf Gruppen von PLA2s definiert, gekennzeichnet durch sowohl enzymatische und strukturelle als auch funktionelle Eigenschaften (Tabelle 1). Tabelle 1 Eigenschaften der verschiedenen PLA2s

	Ursprung		Vorkommen	Größe (kDa)	Ca2+
SPLA2	Gruppe I Kobra; Pankreas	Säugetier	sekretiert	13–15	mM
	Gruppe II Vipern; synovial	Säugetier	sekretiert	16–18	mM
	Gruppe III Biene		sekretiert	16–18	mM
	Gruppe IV ubiquitär	Säugetier	zytosolisch	85	µM
CPLA2	Gruppe IV ubiquitär	Säugetier	zytosolisch	85	µM
CPLA2	Gruppe V Myokardium	Säugetier	zytosolisch	40	nein

Diese Enzyme teilen das gleiche Substrat: Phospholipide, die sie hydrolysieren; sie sind 2-Acylhydrolasen und setzen Fettsäuren, die sich in dieser Position befinden, sowie ein Lysophospholipid frei.
Allerdings unterscheiden sich diese Gruppen von Enzymen in ihrer Funktion, ihrem Vorkommen, ihrer Regulation, ihrem Wirkungsmechanismus, ihrer Sequenz, ihrer Struktur und ihrer Abhängigkeit von zweiwertigen Ionen.
Die ersten drei Gruppen, die als extrazelluläre Enzyme oder als sekretierte PLA2s (sPLA2s) isoliert wurden, haben eine hohe Zahl von Disulfidbrücken, ein Molekulargewicht von ca. 15 kDa und benötigen für ihre Aktivität eine hohe Konzentration an Calcium.
Die Klassifikation der PLA2s in eine dieser drei Gruppen wurde im wesentlichen aufgrund der strukturellen Homologien durchgeführt. Obwohl die Mehrzahl der PLA2s nicht-humane Enzyme sind, gibt es humane sekretierte PLA2s in der Synovialflüssigkeit (Gruppe II) oder im humanen Pankreas (Gruppe I).
Die am besten charakterisierte PLA2 ist die sekretierte PLA2 der Gruppe II, die aus der menschlichen Synovialflüssigkeit stammt. Die Gruppe IV der PLA2s enthält nur ein intrazelluläres Enzym, die sogenannte zytoplasmatische PLA2 (cPLA2), mit großem Molekulargewicht (85 kDa); diese ist spezifisch für Phospholipide mit Arachidonsäure; diese cPLA2 benötigt Calciumkonzentrationen, die vergleichbar mit einer intra-zytoplasmatischen Aktivierung sind.
Das Enzym kommt zytosolisch vor und geht während der zellulären Aktivierung in die Membran über.
Dieses Enzym besitzt keine Disulfidbrücke und wird durch Kinasen der PKC- und der MAP-Familie aktiviert.
Schließlich gibt es eine fünfte Gruppe von PLA2, intra-zytoplasmatische PLA2. Dieses Enzym hat ein Molekulargewicht von 40 kDa und ist ebenfalls spezifisch für Phospholipide mit Arachidonsäure und benötigt kein Calcium für seine Aktivierung.
Sehr vereinfacht scheint es so zu sein, daß die PLA2 der Gruppe IV das Enzym ist, das bevorzugt unter physiologischen Bedingungen verwendet wird, und daß die sPLA2s in Antwort auf entzündliche Stimuli synthetisiert und sekretiert werden, um Mediatoren der Entzündung herzustellen.
Allerdings ist diese Unterscheidung zu schematisch:
Tatsächlich werden die beiden PLA2s, sPLA2 und cPLA2, während der zellulären Aktivierung bei einer inflammatorischen Reaktion induziert und aktiviert.
Verschiedene Arbeiten behandeln die Modifikationen der Aktivierung von PLA2s sekretiert bei Psoriasis (Forster et al., Br. J. Dermatol., 1985, II2, 135–147). Diese Studien identifizieren aber nicht die spezifischen Formen der PLA2.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines im Bereich der Entzündung wirksamen Bestandteils (Wirkstoff); dieser kann insbesondere eine Hautentzündung reduzieren.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines im Bereich der Entzündung wirksamen Bestandteils, der die enzymatische Aktivität der Phospholipase A2 hemmen kann.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung der Verwendung dieser wirksamen Bestandteile im kosmetischen, dermo-pharmazeutischen oder pharmazeutischen Bereich, insbesondere zur Herstellung von kosmetischen Zusammensetzungen oder dermo-pharmazeutischen Zusammensetzungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen.
Die Erfindung betrifft im wesentlichen Phospholipasen A2 vom Typ I und/oder vom Typ II.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines wirksamen Bestandteils, einer kosmetischen Zusammensetzung, einer haut-pharmazeutischen Zusammensetzung oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltend diesen wirksamen Bestandteil, identifiziert durch dieses Testverfahren, insbesondere zur Pflege und zur Reduktion der Anzeichen von Hautreizungen, wie Hautausschlägen oder Rötungen der Haut, mehr oder weniger verbunden mit externen physikalischen Mitteln oder durch eine Entzündung, Xerose oder Hauttrockenheit, des Verringerns oder des Verlusts der Spannkraft der Haut und des Auftretens von Flecken oder des Auftretens von kleinen geplatzten Äderchen, wie man es bei sehr trockener Haut beobachten kann.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung erlaubt die Lösung der oben ausgeführten Ziele.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von mindestens einem Wirkstoff, der die enzymatische Aktivität von Phospholipase A2 vom Typ I oder II signifikant hemmt, zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung zur Reduktion von Reizungen und/oder Entzündungen von Hautgewebe bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung von mindestens einem Wirkstoff, der die enzymatische Aktivität von Phospholipase A2 vom Typ I oder II signifikant hemmt, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Reduktion von Entzündungen der Haut bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von mindestens einem wirksamen Bestandteil zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung zur signifikanten Reduktion der enzymatischen Aktivität von Phospholipase A2 vom Typ I und/oder II bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur kosmetischen Pflege durch Reduktion von Reizungen und/oder Entzündungen von Hautgewebe bereit.
Ein Verfahren zum Testen der Aktivität einer möglicherweise wirksamen Substanz, die enzymatische Aktivität der Phospholipase A2 signifikant zu hemmen, bevorzugt der Phospholipase A2 vom Typ I oder II, umfasst:

a) Zusammenbringen der möglicherweise wirksamen Substanz mit – Phospholipase A2; – einem Phospholipidsubstrat, umfassend mindestens eine Fettsäure in Form eines Esters; die Fettsäure ist bevorzugt eine Fettsäure mit einer langen Kette umfassend zwischen 15 und 22 Kohlenstoffatome; das Substrat ist bevorzugter ungesättigt oder mehrfach ungesättigt; das Substrat ist in der Lage, mindestens eine Fettsäure während der Hydrolyse freizusetzen;
b) Messen der enzymatischen Aktivität der Phospholipase A2, insbesondere umfassend den Nachweis des Vorhandenseins dieser freigesetzten Fettsäuren und gegebenenfalls deren quantitative Bestimmung.

Die Messung der enzymatischen Aktivität wird bevorzugt durchgeführt durch Bestimmung von nicht-veresterten Fettsäuren.
Der Begriff "Phospholipase A2" wird hier verwendet in Verbindung mit der Phospholipase A2 vom Typ I und/oder II.
Der Ausdruck "hemmen" bedeutet hier, daß der wirksame Bestandteil (Wirkstoff) die Phospholipase A2 hemmen kann, so daß eine enzymatische Aktivität induziert wird, die geringer ist als die enzymatische Aktivität, die induziert wird wenn die Phospholipase A2 nicht in Kontakt mit der möglicherweise wirksamen Substanz gebracht wird; alle Bedingungen, wie Temperatur, Kontaktzeit und Arbeitsbedingungen, sind dabei identisch oder unter anderen Gesichtspunkten vergleichbar (d. h. unter gleichen Bedingungen).
Vorteilhaft erfolgt die Auswahl der möglicherweise wirksamen Moleküle während des Screenens zur Hemmung der PLA2 Aktivität; diese kann als stark angesehen werden, wenn die Hemmung größer oder gleich 50% einer Referenzaktivität ist; diese Referenzaktivität wird gemessen, indem die PLA2 nicht in Kontakt mit der möglicherweise wirksamen Substanz gebracht wird; alle anderen Bedingungen, wie Temperatur, Kontaktzeit und Arbeitsbedingungen, sind identisch oder unter anderen Gesichtspunkten vergleichbar.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform wird der Test mit einer Phospholipase A2 vom Typ I durchgeführt, insbesondere zur Vorauswahl der möglicherweise wirksamen Substanzen; diese sind zumindest signifikant wirksam, die Aktivität der Phospholipase A2 zu hemmen. Das Verfahren wird dann noch einmal mit Phospholipase A2 vom Typ II durchgeführt, genauer um die Wirksamkeit der möglicherweise wirksamen Substanzen zu bestätigen, signifikant die enzymatische Aktivität der Phospholipase A2 vom Typ I und/oder vom Typ II zu hemmen. Dies erlaubt das Minimieren der Verwendung der Phospholipase A2 vom Typ II, die nicht so einfach erhältlich ist und die sehr teuer ist.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform stammt das Enzym Phospholipase A2 vom Typ I und/oder vom Typ II aus dem Bienengift (Apis mellifera) oder aus dem Ochsenpankreas oder aus Streptomyces violaceoruber Hefe oder aus dem Schlangengift (Crotalus adamanteus oder Crotalus atrox oder Crotalus durissus oder Naja mossambica mossambica) oder aus einem menschlichen oder tierischen Zelllysat oder aus einer menschlichen oder tierischen biologischen Flüssigkeit (Synovialflüssigkeit), oder stammt von irgendeiner möglichen Mischung dieser so erhaltenen Enzyme.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform stammt das Enzym Phospholipase A2 vom Typ I aus dem Schweinepankreas.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform stammt das Enzym Phospholipase A2 vom Typ II aus der menschlichen Synovialflüssigkeit oder aus dem Schlangengift von Crotalus adamanteus.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist das Substrat ein natürliches Phospholipid, umfassend in der Typ 2 nukleophilen Substitutionsposition (SN2) mindestens eine Fettsäure mit einer langen Kette, bevorzugt einer langen Kette von C15 bis C22 Kohlenstoffatomen; diese Fettsäure ist insbesondere ungesättigt oder mehrfach ungesättigt.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist das Substrat ausgewählt aus mindestens einem Esterderivat der Arachidonsäure, bevorzugt dem Substrat β-Arachidonoyl-γ-palmitoyl-L-α-phosphatidylcholin.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform umfaßt das Verfahren das Inkontaktbringen mit einem Ko-Faktor der Phospholipase A2.
Die Konzentrationen an Ko-Faktor sind bevorzugt zwischen 0,0001% und 10% Vorteilhafterweise ist der Ko-Faktor ein zweiwertiges Ion, noch bevorzugter ist der Ko-Faktor der spezifische Ko-Faktor Calcium.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform umfaßt das Verfahren das Inkontaktbringen mit einem Auflösungsmittel. Die Konzentrationen an Auflösungsmittel sind bevorzugt zwischen 0,001% und 10%. Vorteilhafterweise ist das Auflösungsmittel Natriumdeoxycholat.
Vorteilhafterweise ist die enzymatische Aktivität der Phospholipase A2 von dem Moment an gehemmt, wenn die Phospholipase A2 Aktivität, gemessen in Anwesenheit des wirksamen Bestandteils, weniger als die gemessene Aktivität ohne das Inkontaktbringen dieser möglicherweise wirksamen Substanz mit Phospholipase A2 ist, während alle anderen Bedingungen, wie Temperatur, Kontaktzeit und Arbeitsbedingungen, identisch oder unter anderen Gesichtspunkten vergleichbar sind.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen wirksamen Bestandteil, der in der Lage ist, die enzymatische Aktivität der Phospholipase A2, insbesondere der Phospholipase A2 vom Typ I und/oder II, zu hemmen; die Aktivität der Phospholipase A2 wird gemessen durch Inkontaktbringen der Phospholipase A2 mit:

– dem wirksamen Bestandteil;
– einem Phospholipidsubstrat, umfassend mindestens eine Fettsäure in Form eines Esters; die Fettsäure ist bevorzugt eine Fettsäure mit einer langen Kette umfassend zwischen 15 und 22 Kohlenstoffatome; die Fettsäure ist bevorzugter ungesättigt oder mehrfach ungesättigt; das Substrat ist in der Lage, mindestens eine Fettsäure während der Hydrolyse freizusetzen.

Die verschiedenen Ausführungsformen des Testverfahrens, wie es oben beschrieben ist, können entsprechend angepaßt sein zur Identifikation und/oder zur Auswahl eines wirksamen Bestandteils, wie oben beschrieben. Das heißt insbesondere, daß gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform das Enzym Phospholipase A2 vom Typ I und/oder vom Typ II aus Bienengift (Apis mellifera) stammt oder aus Ochsenpankreas oder aus Stremptomyces violaceoruber Hefe oder aus Schlangengift (Crotalus adamanteus oder Crotalus atrox oder Crotalus durissus oder Naja mossambica mossambica) oder aus menschlichem oder tierischem Zelllysat oder aus menschlicher oder tierischer biologischer Flüssigkeit (Synovialflüssigkeit), oder von einer dieser möglichen Mischungen der erhaltenen Enzyme stammt.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform stammt das Enzym Phospholipase A2 vom Typ I aus Schweinepankreas.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform stammt das Enzym Phospholipase A2 vom Typ II aus menschlicher Synovialflüssigkeit oder aus Crotalus adamanteus Schlangengift.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist das Substrat ein natürliches Phospholipid, umfassend in der Typ 2 nukleophilen Substitutionsposition (SN2) mindestens eine Fettsäure mit einer langen Kette, bevorzugt einer langen Kette von C15 bis C22 Kohlenstoffatomen; diese Fettsäure ist noch bevorzugter ungesättigt oder mehrfach ungesättigt.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist das Substrat ausgewählt aus mindestens einem Esterderivat der Arachidonsäure, bevorzugt ist das Substrat β-Arachidonoyl-γ-palmitoyl-L-α-phosphatidylcholin.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform umfaßt das Verfahren das Inkontaktbringen mit einem Ko-Faktor der Phospholipase A2.
Die Konzentrationen an Ko-Faktor sind bevorzugt zwischen 0,0001% und 10%. Vorteilhafterweise ist der Ko-Faktor ein zweiwertiges Ion, noch bevorzugter ist der Ko-Faktor der spezifische Ko-Faktor Calcium.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform umfaßt das Verfahren das Inkontaktbringen mit einem Auflösungsmittel. Die Konzentrationen an Auflösungsmittel sind bevorzugt zwischen 0,001% und 10% Vorteilhafterweise ist das Auflösungsmittel Natriumdeoxycholat.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen wirksamen Bestandteil, der in der Lage ist, die enzymatische Aktivität der Phospholipase A2, insbesondere Phospholipase A2 vom Typ I und/oder II, zu hemmen; dieser wirksame Bestandteil wird durch ein oben beschriebenes Testverfahren identifiziert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen wirksamen Bestandteil mit einer anti-inflammatorischen und/oder anti-Schmerz- und/oder anti-Reizung- und/oder anti-Kribbel- und/oder anti-Brenn- und/oder anti-Juck- und/oder anti-Hautausschlag- und/oder anti-Xerose- und/oder anti-Flecken- und/oder anti-hautspannungverlierender Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß er ausgewählt ist aus einem Extrakt von Traubensamen, einem Extrakt von Pueraria lobata, einem Extrakt von Pneumus boldus (boldo), einem Arnikaextrakt, einem Limonenextrakt, einem Sonnenblumenextrakt, einem Kamilleextrakt, Zinkgluconat, einem Guaranaextrakt und einem Lianenextrakt (Uncaria tomentosa), oder einer Kombination dieser erhalten durch Kombination von mindestens zwei wirksamen Bestandteilen, wie sie oben aufgeführt sind; die Pflanzenextrakte werden bevorzugt in einer Konzentration von zwischen 0,1 und 30% (G/G), bezogen auf das Endprodukt, verwendet.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen wirksamen Bestandteil, der in der Lage ist, signifikant die enzymatische Aktivität von Phospholipase A2, insbesondere Phospholipase A2 vom Typ I und/oder II, zu hemmen, dadurch gekennzeichnet, daß er ausgewählt ist aus einem Extrakt von Traubensamen, einem Extrakt von Pueraria lobata, einem Extrakt von Pneumus boldus (boldo), einem Arnikaextrakt, einem Limonenextrakt, einem Sonnenblumenextrakt, einem Kamilleextrakt, Zinkgluconat, einem Guaranaextrakt und einem Lianenextrakt (Uncaria tomentosa), oder einer Kombination dieser erhalten durch Kombination von mindestens zwei wirksamen Bestandteilen, wie sie oben aufgeführt sind; die Pflanzenextrakte werden bevorzugt in einer Konzentration von zwischen 0,1 und 30% (G/G), bezogen auf das Endprodukt, verwendet.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Pflanzenextrakt von Pueraria lobata Wurzel, bevorzugt extrahiert in einer Konzentration von 0,1 bis 20 Gew.%, bevorzugt mit einer Konzentration von ca. 5% (d. h. 5 g auf 100 g Lösungsmittel), in einem wäßrigen Lösungsmittel enthaltend Alkohol/Glycol, z. B. Butylenglycol und/oder Ethanol, d. h. mit einer Konzentration von zwischen 0 und 80%, bevorzugt mit einer Konzentration von ca. 25% Butylenglycol, und gegebenenfalls einem Konservierungsmittel, wie Methylparaben, mit einer Konzentration von zwischen 0,01 und 0,5%, bevorzugt in einer Konzentration von ca. 0,1% (G/G). Der als "Extrakt 1" bezeichnete Extrakt wurde nur durch eine einzige wäßrige Extraktion hergestellt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Pflanzenextrakt aus Traubensamen, hergestellt aus Traubensamen, bevorzugt Extrakte mit einer Konzentration von zwischen 0,1 und 20 Gew.%, bevorzugter mit einer Konzentration von ca. 2% (d. h. ca. 2 g auf 100 g Lösungsmittel), in einem wäßrigen Lösungsmittel enthaltend Alkohol/Glycol, z. B. Butylenglycol und/oder Ethanol, d. h. mit einer Konzentration zwischen 0 und 80%, bevorzugt mit einer Konzentration von ca. 25% Butylenglycol, und gegebenenfalls einem Konservierungsmittel, wie Methylparaben, in einer Konzentration zwischen 0,01 bis 0,5%, bevorzugt mit einer Konzentration von ca. 0,1% (G/G). Der als "Extrakt 2" bezeichnete Extrakt wird durch eine einzige wäßrige Extraktion hergestellt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem wirksamen Bestandteil, wie er oben oder in der folgenden Beschreibung definiert ist und/oder von einem oben definierten oder in der folgenden Beschreibung definierten Extrakt, zur Herstellung einer Zusammensetzung, insbesondere einer kosmetischen Zusammensetzung, zur Reduktion von Reizungen und/oder Kribbeln und/oder Jucken und/oder von Fleckenbildung und/oder von kleinen geplatzten Gefäßen und/oder von Abschlaffen des Hautgewebes und/oder von Verlust der Hautspannung und/oder vom Austrocknen der Haut.
Ein weiterer Aspekt vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem wirksamen Bestandteil, wie oben definiert, und/oder von einem Extrakt, wie oben oder in der folgenden Beschreibung definiert, zur Herstellung einer Zusammensetzung, insbesondere einer pharmazeutischen Zusammensetzung, zur Reduktion von Entzündung und/oder Schmerzen und/oder Verbrennungen und/oder Hautausschlag und/oder Rötung der Haut, mehr oder weniger verbunden mit einem externen physikalischen Mittel oder mit einem Entzündungssyndrom und/oder mit Xerosen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem wirksamen Bestandteil, wie er oben oder in der folgenden Beschreibung definiert ist, und/oder von einem Extrakt, wie er oben oder in der folgenden Beschreibung definiert ist, zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung zur Hemmung der enzymatischen Aktivität der Phospholipase A2, insbesondere Phospholipase A2 vom Typ I und/oder II.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einem wirksamen Bestandteil, wie er oben oder in der folgenden Beschreibung definiert ist, und/oder von einem Extrakt, wie er oben oder in der folgenden Beschreibung definiert ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung der enzymatischen Aktivität der Phospholipase A2, insbesondere Phospholipase A2 vom Typ I und/oder II.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine kosmetische Zusammensetzung umfassend mindestens einen wirksamen Bestandteil, wie er oben oder in der folgenden Beschreibung definiert ist, und/oder einen Extrakt, wie er oben oder in der folgenden Beschreibung definiert ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend mindestens einen wirksamen Bestandteil, wie er oben oder in der folgenden Beschreibung definiert ist, und/oder einen Extrakt, wie er oben oder in der folgenden Beschreibung definiert ist.
Bevorzugt ist die Konzentration an wirksamem Bestandteil gemäß der vorliegenden Erfindung zwischen 0,01 und 30 Gew.% der Gesamtzusammensetzung.
Die wirksamen Bestandteile können zur Behandlung von verschiedenen Symptomen oder zur wirksamen Behandlung des gleichen Symptoms vorteilhaft miteinander kombiniert werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur kosmetischen Pflege umfassend das topische Auftragen einer oben definierten kosmetischen Zusammensetzung auf Hautbereiche einer Person, die dies benötigt.
Das kosmetische Behandlungsverfahren betrifft die Pflege von Reizungen und/oder Kribbeln und/oder Jucken und/oder die Pflege um oberflächliche Flecken zu begrenzen oder zu entfernen und/oder das Auftreten von kleinen geplatzten Gefäßen und/oder das Abschlaffen von Hautgewebe und/oder den Verlust der Spannung des Hautgewebes und/oder das Austrocknen des Hautgewebes zu begrenzen oder zu verhindern.
Vorteilhaft umfaßt das Hautgewebe Haut.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Untersuchung zur Hemmung der Phospholipase A2 (PLA2) wird in einem nicht-zellulären in vitro Modell durchgeführt, das versucht, so gut wie möglich die Situation in vivo widerzuspiegeln.
Die PLA2s vom Typ I und vom Typ II werden in vitro verwendet in einem Modell umfassend:

1) ein Substrat ausgewählt aus Esterderivaten der Arachidonsäure (wie β-Arachidonoyl-γ-palmitoyl-L-α-phosphatidylcholin, dies ist ein Phospholipid enthaltend Arachidonsäure in der SN2-Position, der hydrolytischen Stelle der Phospholipase A2), das spezifisch die Fettsäure ist, die in der Synthese von entzündlichen Mediatoren involviert ist,
2) ein zweiwertiges Ion, das die Rolle eines Katalysators spielt (wie Calcium),
3) einen Aktivator, der unentbehrlich für die Aktivität des Enzyms ist, der die Rolle eines Solubilisators für das Substrat im Reaktionsmedium ist und der die Enzym-Substrat-Interaktion erlaubt (bevorzugt Natriumdeoxycholat).

Die Reaktionsmischung wird in Kontakt gebracht mit einer Vielzahl von Substanzen, die möglicherweise aktiv sind; die Aktivität dieser, PLA2 zu hemmen, wird getestet und der Gehalt an freien Fettsäuren nach dem Test wird in verschiedener Art und Weise untersucht (Gasphasen-Chromatographie, HPLC, kolorimetrische Bestimmung usw.); dies erlaubt die Auswahl der besten Hemmer.
Die PLA2, die in dem Untersuchungsmodell bevorzugt verwendet wird, stammt aus Schweinepankreas (Enzym vom Typ I) aufgrund der Zugänglichkeit und der Kosten, mit dem Hintergrund, daß:

– die Homologie der Sequenz zwischen PLA2 vom Typ I und dem humanen Äquivalent PLA2 vom Typ II (Tatina A. et al., Blast 2 sequences – a new tool for comparing Protein und nucleotide sequences, FEMS Microbil. Lett., 174, 247–250 (1999)) größer als 54% ist,
– parallele Studien es den Erfindern erlaubten zu zeigen, daß diese beiden Enzyme sehr ähnliche Spektren bezüglich der Hemmer, denen sie ausgesetzt sind, aufzeigen.

Die PLA2 wird in Kontakt mit einem Substrat gebracht, z. B. β-Arachidonoyl-γ-palmitoyl-L-α-phosphatidylcholin; dies ist ein Phospholipid, das Arachidonsäure an der SN2-Position aufweist, der Stelle der Hydrolyse durch die Phospholipase A2; dies ist die Fettsäure, die spezifisch in der Synthese von entzündlichen Mediatoren involviert ist.
Parallel dazu finden Kontrollen für die Hemmung der Phospholipase A2 statt; diese können zum Beispiel sein:

– Aristolochiasäure (8-Methoxy-6-nitrophenanthro(3,4-d)-1,3-dioxol-5-carbonsäure); dies ist ein Hauptbestandteil von verschiedenen Aristolochia-Pflanzenarten und wird in der traditionellen Medizin zur Neutralisierung von Schlangengiften, insbesondere von Naja naja atra und Bungarus multicinctus, verwendet.

Es wurde gezeigt, daß Aristolochiasäure insbesondere in vitro die enzymatische Aktivität und die Ödem induzierende Aktivität von PLA2 aus Schlangengiften hemmt (Vishwanath B.S., Endema-Inducing activity of Phospholipase A2 purified from human synovial fluid and inhibition by aristolochic acid, Inflammation, Bd. 12, Nr. 6, 549–561, 1988; Sannanaik Vishwanath B., Interaction of aristolochic acid with vipera Russelli Phospholipase A2; its effect an enzymatic und pathological activities, Toxicom., 25, 929–937, 1987; Moreno J.J., Effect of aristolochic acid an arachidonic acid cascade and in vivo models of inflammation, Immunmopharmagolocy, 26, 1–9, 1993).

– p-Bromphenacylbromid, welches ein spezifischer Hemmer der sekretierten PLA2s ist (Mao-Qiang M. et al., Secretory phospholipase A2 activity is required for permeability barrier homeostasis, J. Invest. Derm., 106, 1996, 57–63).

Zu dem Reaktionsmedium wird weiterhin zugegeben:

– ein Katalysator, der bevorzugt Calcium ist.
– Ein Aktivator, der für die Aktivität des Enzyms notwendig ist, wie z. B. Natriumdeoxycholat. Dieser Aktivator erlaubt, daß die Löslichkeit des Substrats im Reaktionsmedium erhöht wird und fördert somit die Enzym-Substrat-Interaktion.

Die Studie zur Hemmung der PLA2 wird bevorzugt in zwei Phasen durchgeführt.
Das Enzym wird in Anwesenheit seines Ko-Faktors für einen bestimmten Zeitraum mit dem Hemmer inkubiert (z. B. ca. 15 Minuten) und dann in einer zweiten Inkubation (für z. B. ca. 20 Minuten) in Anwesenheit eines Substrats, das bevorzugt β-Arachidonoyl-γ-palmitoyl-L-α-phosphatidylcholin ist, und dem Aktivator, der bevorzugt Natriumdeoxycholat ist.
Am Ende der Inkubation wird eine Bestimmung der nicht-veresterten Fettsäuren im Reaktionsmedium durch ein enzymatisches Verfahren gemacht; das ist zum Beispiel mittels Kolorimetrie bei einer bestimmten Wellenlänge möglich.
Parallel dazu wird eine Kontrolle durchgeführt entsprechend der Aktivität der Phospholipase A2 in Abwesenheit des Hemmers. Die Verwendung eines wirksamen Bestandteils, der in der Lage ist, signifikant die enzymatische Aktivität zu hemmen, gibt sich durch Abnahme der optischen Dichte bei einer definierten Wellenlänge zu erkennen, d. h. durch Erniedrigen der Menge an Fettsäuren freigesetzt in das Medium im Vergleich zu der Kontrolle.
So ist es möglich, ein Screenen von möglichen aktiven Substanzen, die in der Lage sind, das Enzym PLA2 zu hemmen, durchzuführen.
Durch dieses Verfahren wurde ein Screenen von über 100 Molekülen durchgeführt, um aus einer Vielzahl von Familien von möglichen wirksamen Bestandteilen, nämlich Pflanzenextrakten, Algen, Polysacchariden oder Proteinen, solche mit einer höchsten hemmenden Wirkung auf PLA2 auszuwählen.
Die aus dem Screenen hervorgehenden Produkte, die somit eine hemmende Wirkung auf die PLA2 Typ I aufzeigen, werden dann mit einem ähnlichen Testverfahren untersucht, welches es erlaubt, die mögliche wirksame Substanz in Kontakt mit einer PLA2 vom Typ II aus Crotalus adamanteus (Schlangengift) zu bringen, einem Enzym, das sich in Hautgeweben bei entzündlichen Prozessen befindet.
Der Test mit der PLA2 vom Typ II wird im allgemeinen nach dem Test mit der PLA2 vom Typ I aufgrund der Verfügbarkeit und der Kosten gemacht, wie oben dargestellt. Es ist daher ausreichend, eine Vorauswahl von möglichen aktiven Substanzen mit dem Testverfahren unter Verwendung von PLA2 vom Typ I zu machen und dann gegebenenfalls die Aktivität der vorausgewählten Substanzen mit dem Testverfahren mit der PLA2 vom Typ II zu bestätigen.
Somit wurden spezifische Extrakte aufgrund ihrer Wirksamkeit ausgewählt. Extrakte von Traubensamen, Extrakte von Pueraria lobata, Extrakte von Boldo Pneumus boldus, Extrakte von Limonen, Extrakte von Sonnenblumen, Extrakte von Kamille, Zinkgluconat, Extrakte von Guarana, Extrakte von Lianen (Uncaria tomentosa) und Extrakte von Arnika.
Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Ergebnisse des anti-PLA2 Aktivitätstests für verschiedene Konzentrationen von Extrakt 1; die Konzentration von Extrakt 1 ist auf der Abszisse in Prozent ausgedrückt; und der Grad an PLA2 Hemmung ist als Prozent auf der Ordinate ausgedrückt, für Beispiel 2 für den Extrakt Pueraria lobata bzw. Extrakt 1;
2 zeigt in ähnlicher Weise wie 1 einen Vergleich der anti-PLA2 Aktivität von PLA2 vom Typ I aus Extrakt 1 von Pueraria lobata und einer PLA2 vom Typ II aus Crotalus adamenteus, s. a. Tabelle 4;
3 zeigt die Ergebnisse erhalten für die anti-PLA2 Aktivität für verschiedene Konzentrationen von Extrakt 2, dem Traubensamenextrakt gemäß Beispiel 3, mit der Konzentration von Extrakt 2 in Prozent auf der Abszisse und der PLA2 Hemmung in Prozent auf der Ordinate;
4 ist eine ähnliche Kurve wie 2 für Extrakt 2, vergleichend PLA2 vom Typ I mit PLA2 vom Typ II;
5 stellt die Verteilung der Zahl der Freiwilligen dar, deren Anzeichen einer Hautreizung zugenommen haben, die sich nicht verändert hat oder die nach 28 Tagen Verwendung einer Placeboformulierung oder einer Formulierung enthaltend 3% Extrakt 1 von Pueraria gemäß der in vivo Studie von Beispiel 6 eine Reduktion aufzeigen;
6 stellt die Verbesserung der Anzeichen von Hautreizung nach 28 Tagen Verwendung einer Placeboformulierung oder einer Formulierung enthaltend 3% Extrakt 1 von Pueraria gemäß der in vivo Studie von Beispiel 6 dar;
7 stellt die Ergebnisse der Reduktion der Intensität von Anzeichen von Hautreizungen in Prozent dar im Vergleich zu einer Placeboformulierung mit einer Formulierung enthaltend 3% Extrakt 1 gemäß in vivo Studie von Beispiel 6;
8 stellt die Zahl der Freiwilligen mit einer weicheren oder geschmeidigeren Haut in Prozent dar im Vergleich zu einer Placeboformulierung und einer Formulierung enthaltend 3% Extrakt 1 gemäß in vivo Studie bei menschlichen Freiwilligen gemäß Beispiel 6;
9 stellt in ähnlicher Weise wie 8 die Zahl an Freiwilligen dar in Prozent der Zahlen, die wünschten eine Behandlung durchführen zu lassen oder das Bedürfnis hatten, diese Formulierung zu kaufen, im Vergleich zu einer Placeboformulierung und einer Formulierung enthaltend 3% Extrakt 1.
In den Beispielen und in den Ansprüchen sind alle Prozentangaben in Gewichtsprozent angegeben, die Temperatur in Grad Celsius und der Druck im atmosphärischen Druck, solange nicht anders genannt.
Beispiel 1: Screenen von wirksamen Bestandteilen
Eine wäßrige Lösung von PLA2 (35 Units/ml) wird in Kontakt gebracht mit 3 mM β-Arachidonoyl-γ-palmitoyl-L-α-phosphatidylcholin, einem Phospholipid enthaltend in der SN2-Position, der Stelle, die durch die Phospholipase A2 hydrolysiert wird, eine Arachidonsäure, die eine wichtige in der Synthese von Entzündungsmediatoren involvierte Fettsäure darstellt.
Zu dem Reaktionsmedium wird folgendes hinzugegeben: Calcium (Ko-Faktor): 0,9 mM, Natriumdeoxycholat (Aktivator): 1,6 mM.
Die Untersuchung zur Hemmung der PLA2 wird in zwei Schritte unterteilt:

a) Das Enzym wird in Anwesenheit des Ko-Faktors (Calcium) für 15 Minuten bei Umgebungstemperatur (20°C) mit dem Hemmer inkubiert;
b) anschließend wird eine zweite Inkubation für 20 Minuten in Anwesenheit des β-Arachidonoyl-γ-palmitoyl-L-α-phosphatidylcholins (3 mM) und Natriumdeoxycholat (1,6 mM) durchgeführt.

Am Ende der Inkubation wird eine Bestimmung der freien Fettsäuren im Reaktionsmedium durchgeführt, d. h. der nicht-veresterten freien Fettsäuren, durch ein klassisches enzymatisches Verfahren, das dem Fachmann wohl bekannt ist, zum Beispiel durch Kolorimetrie, z. B. hier bei 550 nm.
Die verwendeten Kontrollen sind hier:

– Aristolochiasäure (8-Methoxy-6-nitrophenanthro(3,4-d)-1,3-dioxol-5-carbonsäure),
– p-Bromphenacylbromid; diese sind spezifische Hemmer der sekretierten PLA2s.

Die Verwendung dieser Moleküle ergab die folgenden Ergebnisse:

	Hemmung%
Hemmer (Anfangskonzentrationen)	nicht-verdünntes Produkt (verwendet in den Konzentrationen gemäß Spalte 1)	Produkt verdünnt 1/100 in demineralisiertem Wasser	Produkt verdünnt 1/1000 in demineralisiertem Wasser
Aristolochiasäure (2 mM)	96,2% ± 1,04	10,00% ± 3,4	0,25% ± 0,5
p-Bromphenacylbromid (10 mM)	29,9% ± 8,3	4,5% ± 2,3	-
Nordihydroguaiarinsäure (5 mM)	97,3% ± 13,2	8,8% ± 0,8	-

Die getesteten möglicherweise wirksamen Substanzen sind in Tabelle 2 aufgeführt: Tabelle 2 Ergebnisse der Screeningtests für Produkte hergestellt und vertrieben von Coletica: die Ergebnisse sind ausgedrückt als Prozent Hemmung in Bezug auf die Kontrolle

Mögliche aktive getestete Substanz	Hemmung der reinen getesteten Substanz (%)	Hemmung der auf 1% in demineralisiertem Wasser verdünnten Substanz (%)
Kürbisextrakt	1,3	1,5
Lianenextrakt	55,3	0
Luzernextrakt	19,4	1,7
Kresseextrakt	0	0
Limonenextrakt	23,5	1,4
Blaubeerenextrakt	9,2	2,2
Maulbeerenextrakt	0	0
Puerariaextrakt	90,2	23,9
Sonnenblumenextrakt	25,5	0
Traubensamenextrakt	79,82	29,7
Johanniskrautextrakt	35,7	0
Shiitakeextrakt	0	0
Algenextrakt	1,7	0
Zinkgluconat (5% wäßrige Lösung G/G)	50	12,6
Magnesiumgluconat (5% wäßrige Lösung G/G)	3,4	0
Pilzextrakt	0	0
Lakritzenextrakt	5,8	0
Lupinenmehl (Extraktion von 5 g in 95 g Wasser)	2,6	0
Kamillenextrakt	41,3	0
Vanilleextrakt	0	0
Guaranaextrakt	59,1	1,1
Steinbrechextrakt	2,6	0
Extrakt von Lentinus edodes	0,9	0
Extrakt von Pneumus boldus	80,2	72,4
Arnikaextrakt	79,8	69,2
Coletica Exopolysaccharid, hergestellt durch Fermentation (1% G/G in demineralisiertem Wasser)	24,2	0

Die Extrakte von Kürbis, Luzerne, Kresse, Limone, Maulbeere, Sonnenblume, Johanniskraut, Lakritze, Kamille, Vanille, Guarana, Steinbrech, Lentinus edodes und Pneumus boldus wurden in folgender Art und Weise gemacht: Einweichen der Blätter mit 5% (G/G) in Wasser oder der gesamten Pflanze mit 5% (G/G) in Wasser oder der Früchte mit 5% (G/G) in Wasser über Nacht bei 4°C. Dann Filtrieren der Suspension mit einer Maschendichte von 0,45 µm. Die Bestimmung der hemmenden Wirkung auf PLA2 wurde direkt mit dem erhaltenen Filtrat durchgeführt.
Die Extrakte von Liane, Blaubeere, Pueraria lobata und von Traubensamen wurden hergestellt durch Vermahlen der Wurzeln oder der gesamten Pflanze oder der Frucht und anschließend durch alkoholische Extraktion von 5% (G/G) in 70% Ethanol.
Ein Dekokt wurde durch Erwärmen der Mischung auf 60°C für 1 Stunde erhalten. Der Überstand wurde dann filtriert. Ein zweiter Dekokt wurde vom erhaltenen Rest in der gleichen Menge mit 5% (G/G) in 70% Ethanol durchgeführt. Der Alkohol der beiden Überstände wurde mit einem Rotationsverdampfer abgedampft und der Rest wurde dann durch Lyophilisierung getrocknet.
Das erhaltene trockene Produkt wurde dann mit 5% (G/G) in einer Mischung aus 69,6% Wasser (G/G), Butylenglycol (25%), Methylparaben (0,1%) wieder gelöst.
Die Lösung des "Lupinenmehls" wurde erhalten durch Lösen einer Mischung von Lupinenprotein und Polysaccharid mit 5% (G/G) in Wasser.
Am Ende der Untersuchung auf wirksame Substanzen wurden die folgenden Extrakte aufgrund ihrer Wirksamkeit ausgewählt:
Traubensamenextrakt, Extrakte von Pueraria lobata, Extrakte von Boldo (Pneumus boldus), Limonenextrakte, Akazienextrakte, Sonnenblumenextrakte, Kamilleextrakte, Zinkgluconat, Guaranaextrakte und Lianenextrakte (Uncaria tomentosa).
Beispiel 2: Extrakt von Pueraria lobata bzw. Extrakt 1
A. Allgemeines
Pueraria lobata (Kudzu, Ge-gen) ist eine ursprüngliche Pflanze, die voluminöse Stengel besitzt, wie Weinranken beim Wein; diese erlauben es ihnen, sich selbst an Netze oder an Bäume anzuhaften.
Diese Pflanze, die ursprünglich aus China und Japan stammt, wo ihre Wurzeln beim Kochen als Stärke verwendet werden, ist in der chinesischen Medizin seit dem 6. Jahrhundert v.Chr. für verschiedene Eigenschaften bekannt. Eine davon war vor kurzem Thema von amerikanischen Untersuchungen, nämlich als Hilfe beim Überwinden von Drogenabhängigkeit. Die Wurzel von Pueraria lobata enthält drei Flavonoide: Puerarin, Dadzein und Dadzin. Die Wurzel wird üblicherweise als Heilmittel verwendet, da sie zu einer Senkung des Alkoholverbrauchs führt und sehr stark die Abhängigkeit von Zigaretten verringert (Shebek, J. et al., Journal of alternative and complementary medicine, 45–48, 2000).
B. Zusammensetzung von Extrakt 1
Extrakt 1 wurde hergestellt durch Vermahlen der Wurzeln und dann 5% (G/G) Alkoholextraktion in 70% Ethanol.
Ein Dekokt wurde durchgeführt durch Erwärmen der Mischung auf 60°C für 1 Stunde und anschließend wurde der Überstand filtriert. Ein zweiter Dekokt wurde von dem Rest durchgeführt in gleichem Verhältnis wie vorher, 5% (G/G) in 70% Ethanol. Der Alkohol der beiden Überstände wurde mit einem Rotationsverdampfer abgedampft und der Rest wurde durch Lyophilisierung getrocknet.
Das erhaltene trockene Produkt wurde mit 5% (G/G) in einer Mischung aus 69,6% Wasser (G/G), Butylenglycol (25%) und Methylparaben (0,1%) wieder gelöst.
C. Anti-PLA2 Aktivität
C1. Bestimmung der freien (nicht-veresterten) Fettsäuren
Eine Studie der Dosisabhängigkeit der Wirkungen des wäßrigen Pflanzenextrakts (als "Extrakt 1" bezeichnet) wurde so durchgeführt, daß die Spezifität der Wirkung des ausgewählten Produkts auf die PLA2 vom Typ I aus Schweinepankreas untersucht wurde.
Die anti-PLA2 Aktivität bei zunehmenden Konzentrationen des ausgewählten Produkts wurde mit drei verschiedenen Ausgangsmaterialien gemessen. Jede Bestimmung wurde dreifach durchgeführt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3

Verwendete Konzentrationen von Extrakt 1 (%) 10 5 3 2 1 0,1

Hemmung (%) 88,62 77,31 58,73 44,2 21,66 0,38

Standardabweichung (%) 0,36 0,80 2,33 1,78 1,4 0,36
Die Ergebnisse sind dargestellt in Prozent Hemmung in Bezug auf die Kontrolle und sind auch in 1 gezeigt.
1 zeigt die Ergebnisse zur hemmenden Wirkung des ausgewählten Produkts gegenüber PLA2 und dessen Dosisabhängigkeit. Das Ergebnis zeigt die Spezifität der Wirkung der Verbindung für den untersuchten Parameter.
C2. Aktivität gemessen für PLA2 vom Typ II

Eine Dosiswirkungskurve wurde für eine PLA2 vom Typ II aus Crotalus adamanteus durchgeführt, um die für die PLA2 vom Typ I erhaltenen Ergebnisse mit unserem Screeningmodell zu validieren. Tabelle 4

Verwendete Konzentration (%)	10	5	3	2	1
Durchschnitt sPLA2 Typ I	91,3	77,5	56,6	40,7	21,6
Standardabweichung	0,36	0,79	3,44	2,19	2,65
Durchschnitt sPLA2 Typ II	87,3	72,3	51,6	40,1	16,9
Standardabweichung	1,49	0,52	0,99	1,52	1,85

Die Ergebnisse sind dargestellt als Prozent Hemmung in Bezug auf die Kontrolle und sind auch in 2 gezeigt.
Die in 2 dargestellten Ergebnisse zeigen die hemmende Wirkung des ausgewählten Produkts auf die PLA2 vom Typ I oder vom Typ II und daß diese gleich ist. Das ausgewählte Produkt ist daher tatsächlich in der Lage, die PLA2 Formen zu hemmen, die im Hautgewebe während einer Entzündung vorkommen, und stellen somit ein Werkzeug dar, sensibler Haut zu helfen.
Beispiel 3: Traubensamenextrakt (Extrakt 2)
Extrakt 2 wurde hergestellt durch alkoholische Extraktion von 5% (G/G) von geernteten Samen in 70% Ethanol.
Ein Dekokt wurde durch Erwärmen der Mischung auf 60°C für 1 Stunde hergestellt, anschließend wurde der Überstand filtriert. Ein zweiter Dekokt wurde mit dem Rest durchgeführt in gleichem Verhältnis von 5% (G/G) in 70% Ethanol. Der Alkohol der beiden Überstände wurde mit einem Rotationsverdampfer abgedampft und der Rest wurde durch Lyophilisierung getrocknet.
Das erhaltene trockene Produkt wurde mit 2% (G/G) in einer Mischung aus 72,6% Wasser (G/G), Butylenglycol (25%) und Methylparaben (0,1%) wieder gelöst.
Anti-PLA2 Aktivität
Eine Untersuchung der Dosisabhängigkeit der Wirkungen dieser Substanz wurde gemacht, um die Spezifität der Wirkung der ausgewählten Produkte auf die PLA2 zu bestimmen.
Die anti-PLA2 Aktivität mit zunehmenden Konzentrationen des ausgewählten Produkts wurde mit drei verschiedenen Ansätzen des Ausgangsmaterials durchgeführt. Jede Bestimmung erfolgte dreifach.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5

Verwendete Konzentration (%) 5 3 2 1 0,1

Hemmung (%) 71,75 59,41 47,80 32,78 3,40

Standardabweichung (%) 3,95 2,62 1,98 3,42 1,52
Die Ergebnisse sind dargestellt in Prozent Hemmung in Bezug auf die Kontrolle und sind auch in 3 gezeigt.
Die in 3 dargestellten Ergebnisse zeigen die hemmende Wirkung des ausgewählten Produkts gegenüber PLA2 in dosisabhängiger Art und Weise. Dieses Ergebnis zeigt die Spezifität der Wirkung der Verbindung für den untersuchten Parameter.
Aktivitätsmessung auf PLA2 vom Typ II

Eine Dosiswirkungskurve wurde mit einer PLA2 vom Typ II durchgeführt, um die Ergebnisse erhalten mit der PLA2 vom Typ I in unserem Screeningmodell zu validieren. Tabelle 6

	10%	5%	3%	2%	1%	0,1%
sPLA2 Typ I	84,1	69,5	60,1	46,2	31,9	66
Standardabweichung	0,89	1,06	1,21	2,49	0,77	3,98
sPLA2 Typ II	82,3	74,1	57,1	43,7	25,6	5,6
Standardabweichung	0,99	0,49	0,47	1,58	3,2	2,98

Die Ergebnisse sind dargestellt in Prozent Hemmung in Bezug auf die Kontrolle und sind auch in 4 gezeigt.
Die in 4 dargestellten Ergebnisse zeigen die hemmende Wirkung des ausgewählten Produkts gegenüber PLA2 vom Typ I oder vom Typ II; sie sind gleich. Das ausgewählte Produkt ist daher in der Lage, die Form von PLA2 zu hemmen, die in Hautgeweben während einer Entzündung vorkommen und stellen somit eine Möglichkeit dar, einer sensiblen Haut zu helfen.
Beispiel 4: Anti-inflammatorische Wirkung
Die steroid und nicht-steroid anti-entzündlichen Mittel, wie sie üblicherweise in der Pharmazie verwendet werden, wurden in unserem Untersuchungsmodell getestet, um ihre Wirkung in Bezug auf die Wirksamkeit unserer Produkte zu vergleichen.

Die Ergebnisse sind dargestellt als Prozent Hemmung in Bezug auf die Kontrolle. Tabelle 7

nicht-steroid anti-entzündliche Mittel	10 mM	1 mM
Diclofenac	29,8	8
Indomethacin	25,7	0
Ibuprofen	40,3	6,9
Aspirin	7	3,5
steroid anti-entzündliche Mittel	10 mM
Cortison	0
Hydrocortison	4,5
Prednisolon	6,3

Die in unserem Untersuchungsmodell erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die klassischen anti-inflammatorischen Mittel eine anti-PLA2 Aktivität aufweisen, die geringer ist als die der oben ausgewählten wirksamen Substanzen, wenn sie mit 3 in einer Formulierung verwendet werden.
Beispiel 5: Identifizierung von Isoflavonen in Extrakten von Pueraria
Pueraria lobata ist eine Pflanze, die für ihren Gehalt an Isoflavonen, wie Puerarin, Dadzein, Dadzin und Genistein bekannt ist (Kaufman P. et al., 1997). Diese Moleküle wurden in dem ausgewählten Produkt mittels HPLC identifiziert.
Der Gehalt an Puerarin, Dadzin und Dadzein sind in Tabelle 8 aufgeführt. Tabelle 8

Isoflavone Gehalt (%)

Puerarin 1,5

Dadzin 0,45

Dadzein 0,06

Genistein < 0,005
Es war nicht möglich, eine Bestimmung von Genistein in dem ausgewählten Produkt durchzuführen, da dessen Konzentration sehr niedrig ist mit kleiner 0,005%.
Es wurde daher eine kommerzielle 1% Genisteinlösung in unserem Modell zur Hemmung der PLA2 untersucht, und das Ergebnis war 28,79%; dieses zeigt, daß dieses Isoflavon nicht verantwortlich für die Aktivität des ausgewählten Extrakts ist, da der Gehalt an Genistein im Produkt kleiner als 0,005% ist.
Die anti-PLA2 Aktivität der Mischung der drei Isoflavone in Konzentrationen, wie sie im Extrakt gefunden werden, wurde in dem entwickelten Modell zur Hemmung untersucht.
Die Ergebnisse zeigen, daß Isoflavone, wie sie im Extrakt von Pueraria identifiziert wurden, nicht für die hemmende Aktivität von PLA2 verantwortlich sind.
Beispiel 6: In vivo Untersuchung an Freiwilligen
Eine Studie an Freiwilligen wurde gemacht, um die Wirksamkeit einer Formulierung enthaltend 3% Extrakt 1 in Bezug auf Anzeichen von Hautreizung, beobachtet während der Entzündung der Haut, zu untersuchen.
1. Protokoll der Untersuchung
50 Freiwillige nahmen eine Placeboformulierung für 28 Tage. 50 andere Freiwillige nahmen eine Formulierung enthaltend 3% Extrakt 1 über den gleichen Zeitraum.
Jede Gruppe der 50 Freiwilligen wurde in zwei Untergruppen von 25 Freiwilligen unterteilt. Eine Untergruppe wurde aus Freiwilligen gemacht mit einer reaktiven Haut ("sensitive skin", Untergruppe SS), die andere wurde aus Freiwilligen gemacht, von denen angenommen wurde, daß sie eine reaktive Haut haben ("estimated sensitive skin", Untergruppe ESS). Die Einteilung der Freiwilligen in die entsprechende Untergruppe wurde mit Hilfe eines klinischen Fragebogens gemacht, der über zwei Jahre durch das Labor, das die Studie gemacht hat, validiert wurde.
Es wird angemerkt, daß die Freiwilligen der beiden Untergruppen (SS + ESS) Zeichen von Hautreizung aufzeigen können.
Vor und nach 28-tägiger Behandlung mit einer der Formulierungen (Placeboformulierung oder Formulierung enthaltend Extrakt 1) wurden die Anzeichen einer Hautreizung bei den Freiwilligen von einem Arzt eingestuft.

Die verschiedenen beobachteten Anzeichen waren die folgenden:

Am Ende der Studie füllten die Freiwilligen einen Fragebogen zur Evaluierung der Produkte aus.
Ergebnisse
Allgemeine Analyse:
Wenn keine Unterscheidung zwischen den SS und ESS Untergruppen gemacht wurde und die Verteilung der Freiwilligen oder die Zahl der Freiwilligen, deren Anzeichen von Hautreizung zunahmen, nicht während der Studie verändert wurde, konnte beobachtet werden, daß:
für die Freiwilligen, die eine Placeboformulierung verwendet haben:
4 sahen ihre Anzeichen von Hautreizung als erhöht an 23 sahen keine Anzeichen von einer veränderten Hautreizung
23 sahen ihre Anzeichen von Hautreizung als verringert an.
Für die Freiwilligen, die die Formulierung enthaltend 3% Extrakt 1 genommen haben:
keiner sah die Anzeichen von Hautreizung als erhöht an 19 sahen ihre Anzeichen von Hautreizung als unverändert an
31 sahen ihre Anzeichen von Hautreizung als reduziert an.
Diese Ergebnisse, die auch in 5 dargestellt sind, zeigen deutlich, daß die Formulierung enthaltend Extrakt 1 eine Verbesserung der klinischen Anzeichen von Hautreizung aufzeigt, die größer ist als die durch eine Placeboformulierung (p < 0,07, Chi-2 Test).
Zu 5 wird angemerkt, daß die Verteilung der Zahl der Freiwilligen, deren Zeichen an Hautreizung zunahm, sich nicht veränderte oder reduziert war nach 28 Tagen Verwendung der Placeboformulierung oder nach Formulierung enthaltend 3% Puerariaextrakt.
Punkt-für-Punkt Analyse:
Wenn keine Unterscheidung zwischen den SS und ESS Untergruppen gemacht wird, sind die beiden Formulierungen (Placeboformulierung und Formulierung enthaltend Extrakt 1) in der Lage, signifikant die meisten klinischen Anzeichen von Hautreizung, die in der Liste aufgeführt waren, zu verbessern:
Prozentsatz an Intensitätsabnahme der klinischen Anzeichen von Hautreizung: Placeboformulierung:

Hautausschlag –21,28 +/– 48,06%

Xerose –27,03 +/– 72,23%

Schlaffheit –27,12 +/– 43,45%

Flecken –26,32 +/– 79,75%

Formulierung enthaltend 3 Extrakt 1:

Hautausschlag –15,69 +/– 45,86%

Xerose –38,64 +/– 63,33%

Schlaffheit –31,01 +/– 51,94%

Flecken –41,94 +/– 85,04%
In 6 wird eine Verbesserung der Anzeichen von Hautreizung nach 28 Tagen unter Verwendung einer Placeboformulierung oder einer Formulierung enthaltend 3% Extrakt 1 aufgezeigt: Gesamtanalyse unter Unterscheidung zwischen SS und ESS Untergruppen.
Das Folgende wird in Bezug auf 6 angemerkt:

ns: nicht signifikanter Unterschied zwischen D0 und D28
*: signifikanter Unterschied zwischen D0 und D28 (p < 0,05; Wilcoxon Test für gepaarte Stichproben)
**: signifikanter Unterschied zwischen D0 und D28 (p < 0,01; Wilcoxon Test für gepaarte Stichproben)
***: signifikanter Unterschied zwischen D0 und D28 (p < 0,001; Wilcoxon Test für gepaarte Stichproben)

Diese Ergebnisse zeigen, daß die einfache Anwendung einer kosmetischen Formulierung, wie auch immer sie ist, in der Lage ist, den allgemeinen Zustand des Hautgewebes zu verbessern. Diese Verbesserung kann möglicherweise der verbesserten Feuchtigkeitszufuhr nach Verabreichung der Creme zugeschrieben werden. Dieses Gesamtergebnis zieht allerdings nicht den Parameter der "reaktiven Haut", wie er hier untersucht wurde, in Betracht und es ist daher notwendig, die SS und ESS Gruppen für eine genauere Analyse der Ergebnisse zu trennen.
Wenn nur die sensitive Haut berücksichtigt wird, ist nur eine Formulierung enthaltend 3% Extrakt 1 in der Lage, signifikant 3 oder 4 klinische Anzeichen der untersuchten Hautreizung zu verbessern (6). Für die Placeboformulierung verbessert diese nur den Punkt der Schlaffheit (6), der in Verbindung mit dem Feuchtigkeitseffekt erhalten nach Anwendung einer Creme steht.
In 7 wird eine Verbesserung der Anzeichen der Hautreizung nach 28 Tagen unter Verwendung einer Placeboformulierung oder einer Formulierung enthaltend 3% Extrakt 1 unter Analyse der "sensitiven Haut" Untergruppen dargestellt.
Die folgenden Kommentare können in Bezug auf 7 gemacht werden:

ns: nicht signifikanter Unterschied zwischen D0 und D28
*: signifikanter Unterschied zwischen D0 und D28 (p < 0,05; Wilcoxon Test für gepaarte Stichproben)
**: signifikanter Unterschied zwischen D0 und D28 (p < 0,01; Wilcoxon Test für gepaarte Stichproben)

Prozentsatz an Intensitätsabnahme der klinischen Anzeichen von Hautreizung: Placeboformulierung:

Hautausschlag –13,54 +/– 48,58%

Xerose –25,48 +/– 97,40%

Schlaffheit –32,11 +/– 54,40%

Flecken –9,02 +/– 60,61%

Formulierung enthaltend 3% INHIPASE^®:

Hautausschlag –13,00 +/– 47,64%

Xerose –55,05 +/– 74,91%

Schlaffheit –34,68 +/– 54,78%

Flecken –60,61 +/– 117,23%
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß Extrakt 1 in der Lage ist, spezifisch die klinischen Anzeichen einer Hautreizung in einer Population, deren Haut besonders reaktiv ist, zu reduzieren. Diese Wirkung ist besonders auf diesen Populationstyp fokussiert; Extrakt 1 kann somit eine Möglichkeit darstellen, diese sensitive Haut zu schützen.
Fragebogen zur Evaluierung der Produkte
Der Fragebogen, der den Freiwilligen gegeben wurde, die die Placeboformulierung oder die Formulierung enthaltend 3% Extrakt 1 über 28 Tage anwendeten, erlaubt auch, die signifikanten Unterschiede zwischen den getesteten Produkten aufzuzeigen (8 und 9).
Die Formulierung enthaltend 3% Extrakt 1 erlaubt ein Weichmachen der Haut (p < 0,05) und führt zu einer größeren Geschmeidigkeit der Haut (p < 0,06), signifikant stärker als die erhalten für die Placeboformulierung (8).
In 8 ist ein Weicherwerden der Haut und eine größere Geschmeidigkeit der Haut nach 28-tägiger Anwendung einer Placeboformulierung oder einer Formulierung enthaltend 3% Extrakt 1 dargestellt.
Das Folgende gilt für 8:

*: signifikanter Unterschied zu der Placebogruppe (p < 0,05; Chi-2 Test)
+: signifikanter Unterschied zu der Placebogruppe (p < 0,06; Chi-2 Test).

Weiterhin bevorzugten die Freiwilligen deutlich die Formulierung enthaltend 3% Extrakt 1 (9):
60% der Freiwilligen wünschen eine Fortsetzung damit (gegenüber 29% für die Placeboformulierung, p < 0,05) und
52 der Freiwilligen drückten deutlich ihren Wunsch aus, diese zu kaufen (gegenüber 26% für die Placeboformulierung, p < 0,06).
In 9 sind die Ergebnisse der Verkaufsabsicht und der Fortsetzung der Behandlung dargestellt.
Folgendes gilt für 9:

Es wird angemerkt, daß der Chi-2 Test die Verteilung der Population vergleicht. Die Daten in diesem Graph drücken die Zahl der Freiwilligen ohne Angabe der Standardabweichung aus.
Extrakt 1 scheint eine Wirkung auf die Reduktion der Anzeichen von Hautreizungen bei Personen, die eine sensitive Haut haben, aufzuzeigen. Dies stellt eine gute Möglichkeit dar, reaktive Haut zu lindern und durch kosmetische Verabreichung ungewünschte Rötung und ein kribbelndes Gefühl beim Verbraucher zu verringern.
Beispiel 7
Formulierungen für kosmetische Zusammensetzungen oder für pharmazeutische Zusammensetzungen

Verwendung der erfindungsgemäßen Produkte in Formulierungen für kosmetische Zusammensetzungen oder pharmazeutische Zusammensetzungen vom Öl-in-Wasser Emulsionstyp Formulierung 7a

A	Wasser	auf 100
	Butylenglycol	2
	Glycerol	3
	Natriumdihydroxycetylphosphat,	2
	Isopropylhydroxycetylether
B	Glycolstearat SE	14
	Triisononaoin	5
	Octylcocoat	6
C	Butylenglycol,	2
	Methylparaben,
	Ethylparaben, Propylparaben,
	pH auf 5,5 eingestellt
D	erfindungsgemäße Produkte	0,01–30%

Die Phasen A und B wurden getrennt auf 75°C erhitzt und dann wurde B zu A unter kräftigem Rühren gegeben; C und D wurden anschließend unter Abkühlung der sich bildenden Creme hinzugefügt. Formulierung 7b

A	Wasser	auf 100
	Butylenglycol	2
	Glycerol	3
	Polyacrylamid, Isoparaffin,	2,8
	Laureth-7
B	Butylenglycol	2
	Methylparaben,	2
	Ethylparaben, Propylparaben
	Phenoxyethanol,
	Methylparaben,
	Propylparaben, Butylparaben,
	Ethylparaben	0,5
	Butylenglycol
C	erfindungsgemäße Produkte	0,01–30%

Phase A wurde auf 75°C erwärmt; B und C wurden dann unter Rühren und Abkühlung der so hergestellten Formulierung hinzugegeben. Formulierung 7c

A	Carbomer	0,50
	Propylenglycol	3
	Glycerol	5
	Wasser	auf 100
B	Octylcocoat	5
	Bisabolol	0,30
	Dimethicon	0,30
C	Natriumhydroxid	1,60
D	Phenoxyethanol,	0,50
	Methylparaben,
	Propylparaben, Butylparaben,
	Ethylparaben
E	Parfüm	0,30
F	erfindungsgemäße Produkte	0,01–30%

Phasen A und B wurden getrennt auf 75°C erwärmt und B wurde dann unter kräftigem Rühren zu A gegeben; C und dann D und dann E und dann F wurden unter Kühlen der so gebildeten Creme hinzugegeben.
Beispiel 8

Verwendung der entzündungshemmenden Produkte in einer Wasser- in-Öl Typ Formulierung

A	PEG 30	–3
	Dipolyhydroxystearat
	Caprintriglyceride	3
	Cetearyloctanoat	4
	Dibutyladipat	3
	Traubensamenöl	1,5
	Jojobaöl	1,5
	Phenoxyethanol,	0,5
	Methylparaben,
	Propylparaben, Butylparaben,
	Ethylparaben
B	Glycerin	3
	Butylenglycol	3
	Magnesiumsulfat	0,5
	EDTA	0,05
	Wasser	auf 100
C	Cyclomethicon	1
C	Dimethicon	1
D	Parfüm	0,3
E	erfindungsgemäße Produkte	0,01–30%

Phasen A und B wurden getrennt auf 75°C erwärmt und dann wurde B zu A unter kräftigem Rühren gegeben; C und dann D und dann E wurden unter Abkühlen der so gebildeten Creme hinzugegeben.
Beispiel 9

Verwendung der entzündungshemmenden Produkte in einer Formulierung zur Gesichtsreinigung vom Geltyp

A	Xanthangummi	0,8
A	Wasser	auf 100
B	Butylenglycol	0,5
	Methylparaben,
	Ethylparaben, Propylparaben
	Phenoxyethanol,	0,5
	Methylparaben,
	Propylparaben, Butylparaben,
	Ethylparaben
C	Zitronensaure	0,8
D	Natriumlaurethsulfat	40,0
E	erfindungsgemäße Produkte	0,01–30%

Phasen A und B wurden getrennt bei Raumtemperatur hergestellt und anschließend wurde B zu A unter Rühren hinzugegeben; C und dann D und dann E wurden unter moderatem Rühren hinzugefügt.
Beispiel 10

Verwendung der erfindungsgemäßen Produkte in einer wasserfreien Formulierung

A	Mineralwachs	17,0
	Isostearylisostearat	31,5
	Propylenglycoldipelargonat	2,6
	Propylenglycolisostearat	1,7
	Bienenwachs/PEG 8	3,0
	hydriertes Palmkernöl	3,4
	hydriertes Palmglyceridöl
	Lanolinöl	3,4
	Sesamöl	1,7
	Cetyllactat	1,7
	Mineralöl, Lanolinalkohol	3,0
B	Castoröl auf	100
	erfindungsgemäße Produkte in trockener	0,001–5%
	Form

Phasen A und B wurden getrennt auf 80°C erwärmt und dann wurde B zu A unter Rühren hinzugegeben.
Beispiel 11

Verwendung der erfindungsgemäßen Produkte in einer Formulierung für wäßrige Gele (Gesichtsgele, Körpergele usw.)

A	Wasser auf	100
	Carboxyvinylpolymer	0,5
	(auch genannt Carbomer)
	Butylenglycol	15
	Phenoxyethanol, Methylparaben,	0,5
	Propylparaben, Butylparaben,
	Ethylparaben
B	erfindungsgemäße Produkte	0,01–30%

Phase A wurde durch Zugabe aller Inhaltsstoffe und durch Erwärmen des ganzen auf 80°C, bis eine homogene Mischung erhalten wurde, hergestellt. B wurde dann zu A unter kräftigem Rühren und Abkühlen des so gebildeten Gels hinzugegeben.
Beispiel 12: Toxizitätstest
Untersuchung der kosmetischen Akzeptanz des Präparats enthaltend die erfindungsgemäßen Produkte
Die Toxizitätstests wurden mit Extrakt 1 in reiner Form durch eine Augenuntersuchung bei Kaninchen durchgeführt, durch Untersuchung der Abwesenheit von unnormaler Toxizität durch orale Einzelgabe bei der Ratte und durch Untersuchung der Sensibilisierungsfähigkeit bei Meerschweinchen.
1. Untersuchung der primären Hautreizung beim Kaninchen
Das oben beschriebene Präparat wurde unverdünnt mit einer Dosis von 0,5 ml auf die Haut von drei Kaninchen gegeben, gemäß dem Verfahren empfohlen durch die OECD-Direktive in Bezug auf Untersuchungen "der akut reizenden/ätzenden Wirkung auf die Haut".
Die Produkte wurde den Kriterien definiert in der Verordnung vom 1.2.1982, veröffentlicht im Blatt der Französischen Republik vom 21.2.1982 , klassifiziert. Die Ergebnisse dieser Tests erlauben den Rückschluß, daß das Präparat als nicht reizend für die Haut klassifiziert werden kann.
2. Untersuchung der Augenreizung beim Kaninchen
Das oben beschriebene Präparat wurde pur auf einmal mit einer Menge von 0,1 ml in das Auge von drei Kaninchen getropft gemäß dem Verfahren empfohlen durch die OECD Direktive Nr. 405 vom 24. Februar 1987 in Verbindung mit der Untersuchung "der akuten reizenden/ätzenden Wirkung auf die Augen".
Die Ergebnisse dieses Tests erlauben den Rückschluß, daß das Präparat im Sinn der Direktive 91/326 EEC als nicht reizend für die Augen angesehen werden kann, wenn in reiner Form verwendet.
3. Test auf die Abwesenheit einer abnormalen Toxizität durch orale Einzelgabe bei der Ratte
Das beschriebene Präparat wurde auf einmal oral mit einer Dosis von 5 g/kg Körpergewicht 5 männlichen Ratten und 5 weiblichen Ratten verabreicht, gemäß dem Protokoll der Direktive der OECD Nr. 401 vom 24. Februar 1987 und angepaßt an kosmetische Produkte.
Die LD0 und LD50 stellten sich als größer als 5.000 mg/kg heraus. Das getestete Präparat kann daher als Produkt, das als nicht schädlich bei Verzehr ist, angesehen werden.
4. Untersuchung des Hautsensibilierungspotentials bei Meerschweinchen
Das beschriebene Präparat wurde einem Maximierungstest beschrieben von Magnusson und Kligmann, gemäß einem Protokoll der Direktive Nr. 406 der OECD, untersucht.
Die Präparate konnten als nicht-sensibilisierend bei Hautkontakt klassifiziert werden.
5. Untersuchung des phototoxischen und photoallergischen Potentials durch topische Auftragung bei Meerschweinchen
10 Tiere erhielten das Produkt als einzelne topische Verabreichung, sie wurden dann UV-Strahlen ausgesetzt, um das phototoxische Potential zu untersuchen.
Dann erhielten sie das Produkt durch wiederholte topische Verabreichung, gefolgt vom Aussetzen gegenüber UV-Strahlen (Induktionsaussetzung). Nach einem Zeitraum von 10 Tagen erhielten die Tiere eine einzelne Verabreichung des zu testenden Produkts, gefolgt von einem/keinem Aussetzen gegenüber UV (Ausgangsstrahlung).
Parallel dazu erhielten 5 Tiere das zu testende Produkt unter den gleichen Bedingungen; diese wurden nicht UV-Strahlen ausgesetzt und dienten somit als Bestrahlungskontrollen.
Die Untersuchung des phototoxischen und photoallergischen Potentials wurde gemacht durch Vergleich der Intensität von Hautrötungen und Ödemen auf den mit dem Produkt behandelten Flächen, die dann UV ausgesetzt wurden, und den Flächen von Kontrolltieren, die nicht behandelt wurden und UV ausgesetzt wurden, und den Flächen von Kontrolltieren, die behandelt wurden aber nicht UV ausgesetzt wurden.
Unter den angewandten experimentellen Bedingungen konnte das Produkt als nicht potentiell phototoxisch und photoallergisch angesehen werden.

Hautausschlag:

Mehr oder weniger lokalisierte Flecken in der Haut verbunden mit einem externen physischen Mittel oder mit einem entzündlichen Syndrom.

Medizinischer Begriff, verwendet, um die Trockenheit der Haut zu definieren verbunden mit der Intensität. Der Ausdruck "Xerose" wird verwendet, wenn eine Trockenheit definiert werden soll, die über die durchschnittliche hinausgeht.

Schlaffheit:

Spannkraft der Haut klinisch analysiert mittels der Kapazität der Erholung der Haut, die Zwängen unterworfen wurde.

Kleine geplatzte Gefäße (Telangiektasie) in Form von Sternchen, mit kupferrosa Färbung auf trockener Haut im Gesicht.

Verwendung von mindestens einem Wirkstoff, der die enzymatische Aktivität von Phospholipase A2 vom Typ I oder II signifikant hemmt, zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung zur Reduktion von Reizungen und/oder Entzündungen von Hautgewebe, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff ausgewählt ist aus einem Extrakt von Traubensamen, einem Extrakt von Pueraria lobata, einem Limonenextrakt, einem Sonnenblumenextrakt, einem Guaranaextrakt, oder einer Kombination von mindestens zwei der oben aufgeführten wirksamen Bestandteile.
Verwendung von mindestens einem Wirkstoff, der die enzymatische Aktivität von Phospholipase A2 vom Typ I oder II signifikant hemmt, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Reduktion von Entzündungen der Haut, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff ausgewählt ist aus einem Extrakt von Traubensamen, einem Extrakt von Pueraria lobata, einem Limonenextrakt, einem Sonnenblumenextrakt, einem Guaranaextrakt, oder einer Kombination von mindestens zwei der oben aufgeführten wirksamen Bestandteile.
Verwendung gemäß Anspruch 2, worin die Entzündungen verursacht sind durch Verbrennungen und/oder Ausschläge und/oder Rötungen der Haut mehr oder weniger in Verbindung mit externen physikalischen Mittel oder mit einem Entzündungssyndrom und/oder mit Xerosen.
Verwendung von mindestens einem wirksamen Bestandteil ausgewählt aus einem Extrakt von Traubensamen, einem Extrakt von Pueraria lobata, einem Limonenextrakt, einem Sonnenblumenextrakt, einem Guaranaextrakt, oder einer Kombination von mindestens zwei der oben aufgeführten wirksamen Bestandteile zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung zur signifikanten Reduktion der enzymatischen Aktivität von Phospholipase A2 vom Typ I und/oder II.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Wirkstoffes vorzugsweise zwischen 0.01 Gew.% und 30 Gew.% der Gesamtzusammensetzung ist.
Verfahren zur kosmetischen Pflege durch Reduktion von Reizungen und/oder Entzündungen von Hautgewebe, dadurch gekennzeichnet, dass es die topische Anwendung einer kosmetischen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 auf Hautbereiche einer Personumfasst.
Verfahren zur kosmetischen Pflege gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass Reizungen und/oder Kribbeln und/oder Jucken behandelt und/oder oberflächlich auftretende Flecken und/oder das Auftreten von kleinen geplatzten Gefäßen und/oder das Abschlaffen von Hautgeweben und/oder den Verlust der Hautspannung und/oder die Trockenheit von Hautgewebe eingegrenzt oder entfernt werden.