JP2023503711A - 臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離することに用いられるレクチン-高分子担体カップリング複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
本願発明では、中国国家知識産権局に提出された、出願番号が202010060063.1で、発明の名称が「臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離することに用いられるレクチン-高分子担体カップリング複合体」である中国特許出願の優先権が主張され、当該出願が援用により全体として本明細書に組み込まれる。
レクチンは、パラミツ由来レクチン、ピーナッツ由来レクチン、エンドウ由来レクチン(VVA及び/又はVVL)、ナタマメ由来レクチン、レンズマメ由来レクチン、小麦胚芽レクチン、ダイズ由来レクチン、インゲンマメ由来レクチン、カタツムリ由来レクチン(HAA及び/又はHPA)の任意の1つ、2つ又はそれ以上を含み、
高分子担体は、デキストランミクロスフェア、アガロースミクロスフェア、樹脂又はエポキシ樹脂ミクロスフェア、ポリスチレンミクロスフェアの任意の1つ、2つ又はそれ以上を含む。
臨床サンプルを前処理するステップと、
前処理後のサンプルを得、任意選択で、洗浄液と均一に混合して希釈したものを、被検出サンプルとするステップと、
レクチン-高分子担体カップリング複合体保存液から保存液の部分を完全に除去して、レクチン-高分子担体カップリング複合体を残すステップと、
被検出サンプルを、保存液を除去したレクチン-高分子担体カップリング複合体に加え、室温下で静置しながらインキュベートして、サンプルを除去するステップと、
洗浄液を使用してグリコシル化エクソソームが結合してあるレクチン-高分子担体カップリング複合体を洗浄し、分離過程で非特異的にカップリングしたグリコシル化していないエクソソーム及び他の不純物を洗浄し除去するために、洗浄液を除去するステップと、
溶離液を使用して、洗浄後のレクチン-高分子担体カップリング複合体を溶離し、室温下で静置して、溶離上清を収集し、これが分離後のグリコシル化エクソソーム溶液であるステップと、を含む。
且つ/又は、1回で加える洗浄液の体積とグリコシル化エクソソームが結合してあるレクチン-高分子担体カップリング複合体の体積の比は1~3:1であり、
且つ/又は、洗浄液での洗浄ステップを1~3回繰り返し、
且つ/又は、加える溶離液の体積と洗浄後のレクチン-高分子担体カップリング複合体の体積の比は0.5~2:1であり、好ましくは0.5~1:1である。
血清、血漿、唾液、脳脊髄液又はリンパ液サンプルの場合は、サンプルを3000g以下の速度で10~15分遠心分離して、サンプルから細胞破片、沈殿した不純物を除去し、遠心分離後の上清を得、使用に備えるステップと、
組織又は細胞培養上清、尿サンプルの場合は、サンプルを3000g以下の速度で10~15分遠心分離して、サンプルから細胞破片、沈殿した不純物を除去し、次に、上清を限外濾過遠心管で10~1000倍濃縮し、使用に備えるステップと、を含む。
臨床サンプルを前処理するステップと、
前処理後のサンプルを得、任意選択で、洗浄液と均一に混合して希釈したものを、被検出サンプルとするステップと、
レクチン-高分子担体カップリング複合体を入れた親和性吸着遠心分離管でレクチン-高分子担体カップリング複合体保存液から保存液の部分を完全に除去して、レクチン-高分子担体カップリング複合体を残し、新しい外側のスリーブ管と交換するステップと、
被検出サンプルを、保存液を除去した上部の遠心分離管に加え、室温下で静置しながらインキュベートして、サンプルを除去するステップと、
分離過程で非特異的にカップリングしたグリコシル化していないエクソソーム及び他の不純物を洗浄し除去するために、上部の遠心分離管に洗浄液を加え、親和性吸着遠心分離管を遠心分離した後に上部の遠心分離管を取り出して、新しい外側のスリーブ管に入れ、元の外側のスリーブ管及びその中の液体を全部捨てるステップであって、当該ステップを1~3回行うステップと、
上部の遠心分離管に溶離液を加えて、洗浄後のレクチン-高分子担体カップリング複合体を溶離し、室温下で静置して、外側のスリーブ管から溶離上清を収集し、これが分離後のグリコシル化エクソソーム溶液であり、溶離分離後のグリコシル化エクソソームは形態が完全で、破裂したもの又は断片化したものはないステップと、を含む。
レクチン-高分子担体カップリング複合体は、高分子担体と、高分子担体の外側にカップリングしたレクチンとを含み、レクチンと高分子担体が特定の条件下で結合して得られるものであり、主に、サンプルからグリコシル化エクソソームを分離するために用いられ、分離したグリコシル化エクソソームは形態が完全である。
レクチンは、主に、パラミツ由来レクチン(Jacalin)、ピーナッツ由来レクチン(PNA)、エンドウ由来レクチン(VVA及び/又はVVL)、ナタマメ由来レクチン(ConA)、レンズマメ由来レクチン(LCA)、小麦胚芽レクチン(WGA)、ダイズ由来レクチン(SBA)、インゲンマメ由来レクチン(PVL)、カタツムリ由来レクチン(HAA及び/又はHPA)の任意の1つを選択し、又は2つ若しくはそれ以上のレクチンを組み合わせて使用し、主な理由は、異なるレクチンの組み合わせでさまざまなタイプのグリコシル化エクソソームの分離を実現できることであり、例えば、LCA、AALでフコシル化エクソソームを分離し、ConA、PVL、SBA、WGA、AALなどのレクチンでN-グリコシル化エクソソームを分離し、HAA、HPA、VVA、PNA、JacalinなどのレクチンでO-グリコシル化エクソソームを分離する。単一のレクチンは、主に、レクチンに対応する特定のグリコシル化エクソソームを分離するために用いられ、2つ又はそれ以上のレクチンを組み合わせて使用するのはさまざまな異なる形態のグリコシル化エクソソームを分離するために利用でき、又は2つ若しくはそれ以上のレクチンを組み合わせて使用するのは特定のグリコシル化エクソソームを相乗的に分離することができる。
(1)活性化アガロース4Bを1g秤量し、pH2~3の1mM HCl溶液を200mL以上加え、均一に混合して完全に膨潤したまで浸漬し、pH2~3の1mM HCl溶液でホウケイ酸ガラス漏斗において15分以上洗浄し、洗浄が終了した後、使用に備え、完全に膨潤したアガロース4Bを収集し、完全に膨潤したアガロース4Bは約3~5mLであった。
本願発明では、実施例1のLCA-アガロースミクロスフェア保存液が分注された親和性吸着遠心分離管、即ちグリコシル化エクソソーム分離装置と、洗浄液、溶離液とを含むグリコシル化エクソソーム分離組成物が提供され、それぞれが個別に包装され、同時に1つの薬物キット又は試薬キットに存在する。
本願発明では、さらに、前記グリコシル化エクソソーム分離組成物を用いる実験ステップを含むグリコシル化エクソソーム分離方法が提供され、以下を含む。
1.事前の準備
用具又は装置を用意する。遠心分離機であり、グリコシル化エクソソームの分離プロセスの遠心分離ステップに用いる。又は、当社若しくは子会社による自動アガロースミクロスフェア分離装置を使用し、主に、人力節約の目的のために、グリコシル化エクソソームの自動分離に用いられる。アガロースミクロスフェアによるグリコシル化エクソソームの自動分離は手動方式の自動化を実現するもので、手動分離と同等な又はより優れた効果を得られ、本実施例では、遠心分離機による手動分離で一層の説明を行う。
(1)サンプルの前処理である。臨床サンプルの特性に応じてサンプルを前処理するための方法を調整した。
前記組織又は細胞培養上清、尿サンプルの場合は、サンプルを3000gで10~15分遠心分離してサンプルから細胞破片、沈殿物などの不純物を除去し、次に、上清を限外濾過遠心管で10~1000倍濃縮し、濃縮後の上清を得、使用に備えた。一層の明瞭な説明のために、本実施例では10分の遠心分離とした。
本実施例では、主に、グリコシル化エクソソーム分離サンプルを一層説明し、本願発明で利用可能な被分離サンプルは、主に、血清、血漿、唾液、組織又は細胞培養上清、尿、脳脊髄液、リンパ液の任意の1つである。通常の1.5~2mLの上部の遠心分離管の場合は、1mL/管でレクチン-高分子担体カップリング複合体保存液が分注されてもよく(0.1~0.6mL/管で、例えば、0.5mLのレクチン-高分子担体カップリング複合体が含まれる)、600μLのレクチン-高分子担体カップリング複合体に対しては、前記血清、血漿、唾液、脳脊髄液、リンパ液、組織又は細胞培養上清、尿の前処理済みのサンプルの体積は50~600μLであり、好ましくは100~300μLで、より好ましくは200~300μLであり、当該サンプルはそのままで加えてもよいし洗浄液で希釈してから加えてもよい。サンプルを前処理する過程で、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、リンパ液サンプルは遠心分離するだけで、サンプルの遠心分離前とその後の体積は実質的に変わらないため、50~600μL、好ましくは100~300μL、より好ましくは200~300μLのサンプルを前処理するだけで所定の体積の前処理済みのサンプルを得られる。前記組織又は細胞培養上清、尿サンプルはサンプルを前処理する過程で、遠心分離ステップの他に、10~1000倍の濃縮が必要であり、十分な前処理済みのサンプルを得るためには、1~50mL、好ましくは10~50mL、より好ましくは30~50mLの前記組織又は細胞培養上清、尿サンプルに対し遠心と濃縮を含む前処理を行う必要があり、こうして50~600μL、好ましくは100~300μL、より好ましくは200~300μLの所定の体積の前処理済みのサンプルを得た。
本実施例は、主に、グリコシル化エクソソームの形態及び粒径サイズを観察するために、実施例4で分離したグリコシル化エクソソームを透過型電子顕微鏡で検出するもので、主なステップは次のとおりである。
実施例4で分離したグリコシル化エクソソームサンプルを約5μL吸引して、銅メッシュに滴下し、4~5分静置して、濾紙で銅メッシュの縁部から余分な液体を吸い取り、ネガティブ染色液(0.5%酢酸ウラニル水溶液、pH4.5)を滴加して、銅メッシュにおいて1分間反応させ、濾紙で乾燥させて、2回洗浄し、自然乾燥させた後、Tecnai Spirit(120kV TEM)透過型電子顕微鏡で観察した。透過型電子顕微鏡で実施例4の4つの異なるサンプルから分離したグリコシル化エクソソームを観察したところ、エクソソームの形態が完全で、破裂したものはなく、粒径はいずれも30~150nmで、詳しくは図2の4つの異なるタイプのサンプルから分離したグリコシル化エクソソームの電子顕微鏡下観察画像を参照する。
本実施例は、主に、実施例4で分離したグリコシル化エクソソームに対しNanoSight NS300システムを用いてエクソソームの粒度及び粒径についてナノ粒子トラッキング解析(NTA)を行うもので、NTA解析は主に溶液状態下の測定(インサイチュ測定)で、高精度の粒度数分布測定により、約1:1.5倍の相対的粒径差の粒子を見分けることができ、エクソソーム粒子を本来に近い状態で測定することができ、測定データの信憑性と有効性が保証され、信頼性のあるエクソソーム濃度データを提供することで、エクソソームを電子顕微鏡で直接的に観察し測定する際は、一度に観察できる範囲が限られているため、得られた粒径分布データが代表的でないことが多いという従来の欠点を効果的に解消し、電子顕微鏡観察のための乾燥、固定、凍結などのさまざまな前処理でエクソソームが損傷したことを効果的に軽減することができる。
本実施例は、主に、実施例4で分離したグリコシル化エクソソームに対してエクソソーム特異的膜タンパク質CD9/CD63/CD81、エクソソーム特異的非膜タンパク質ALIX及びTSG101、エクソソームカルネキシン(Calnexin)抗体のウエスタンブロット(Western Blot)検出及び同定を行うもので、主な検出ステップは次のとおりである。
(1)サンプル調製である。30μLのグリコシル化エクソソーム溶離液に等体積の5×SDS-PAGEロード緩衝液を加えて、100℃下で10分処理し、使用に備えた。
(2)SDS電気泳動である。ゲル(15%分離ゲル、5%濃縮ゲル)を調製し、1×電気泳動緩衝液を加え、10μL/ウェルでサンプルを加え、電気泳動条件は60V、120分と設定した。
(3)転写である。適切なサイズのPVDF膜を転写緩衝液に入れて、10分浸漬し、ゲルとPVDF膜及びスポンジパッドを、気泡が出ないようにぴったりと貼り合わせ、セミドライ式転写装置でタンパク質をPVDF膜に転写した(定電圧40V、定電流200mA、転写20分)。
(4)ブロッキングである。5%脱脂粉乳ブロッキング溶液で1時間ブロッキングし、TBSTで3回洗浄し、毎回5分とした。
(5)インキュベートである。それぞれ一次抗体(抗CD9、抗CD81、抗CD63、抗TSG101、抗Alix、抗カルネキシン(Calnexin)モノクローナル抗体、濃度1mg/mL、1:400希釈)を加えて1時間インキュベートし、TBSTで3回洗浄し、毎回5分とした。二次抗体(ヤギ抗マウスHRP 1mg/mL、1:5000希釈)を加えて1時間インキュベートし、TBSTで3回洗浄し、毎回5分とした。
(6)表示である。BeyoECL Moon(高感度ECL化学発光試薬キット)で発色させた後、検出した。
実施例4で分離した4つのグリコシル化エクソソームのウエスタンブロット(Western Blot)検出結果はそれぞれ次のとおりである。
(1)エクソソーム特異的膜タンパク質CD9、CD63、CD81抗体のウエスタンブロット(Western Blot)検出が全て陽性であることから、エクソソーム特異的膜タンパク質CD9、CD63、CD81があることが示される。詳しくは、エクソソーム特異的膜タンパク質CD9、CD63、CD81抗体のウエスタンブロット(Western Blot)検出結果図である図4を参照する。
(2)エクソソーム特異的非膜タンパク質ALIX及びTSG101抗体のウエスタンブロット(Western Blot)検出が全て陽性であることから、エクソソーム特異的非膜タンパク質ALIX及びTSG101があることが示される。詳しくは、エクソソーム特異的非膜タンパク質ALIX及びTSG101抗体のウエスタンブロット(Western Blot)検出結果図である図5を参照する。
(3)エクソソームサンプルのカルネキシン(Calnexin)抗体のウエスタンブロット(Western Blot)検出が全て陰性であった。詳しくは、エクソソームカルネキシン(Calnexin)抗体のウエスタンブロット(Western Blot)検出結果図である図6を参照する。カルネキシン(Calnexin)が細胞の小胞体に存在し、エクソソームになく、本実施例でサンプルから分離したグリコシル化エクソソームのカルネキシン(Calnexin)抗体のウエスタンブロット(Western Blot)検出が全て陰性であることから、分離後のグリコシル化エクソソームサンプルに細胞破片がないことが示される。
本実施例は、主に、異なる洗浄液に対し、特に、金属塩イオンを含む一般的な洗浄液、金属塩イオンを含まない一般的な洗浄液、精製水に対して、グリコシル化エクソソーム分離プロセスの洗浄効果及び分離効果を一層比較及び検証することにより、本願発明で選択した洗浄液の適合性を決定するものである。
本実施例は、主に、グリコシル化エクソソームに対する異なる一般的なタンパク質溶離液及び本願発明のホウ酸塩-マンノース緩衝液の分離効果について一層比較及び検証することにより、本願発明で選択した溶離液の適合性を決定するものである。
Claims (15)
- 高分子担体と、高分子担体の外側にカップリングしたレクチンとを含み、
前記レクチンは、パラミツ由来レクチン、ピーナッツ由来レクチン、エンドウ由来レクチン(VVA及び/又はVVL)、ナタマメ由来レクチン、レンズマメ由来レクチン、小麦胚芽レクチン、ダイズ由来レクチン、インゲンマメ由来レクチン、カタツムリ由来レクチン(HAA及び/又はHPA)の任意の1つ、2つ又はそれ以上を含み、
前記高分子担体は、デキストランミクロスフェア、アガロースミクロスフェア、樹脂又はエポキシ樹脂ミクロスフェア、ポリスチレンミクロスフェアの任意の1つ、2つ又はそれ以上を含むことを特徴とする臨床サンプルからグリコシル化エクソソームを分離することに用いられるレクチン-高分子担体カップリング複合体。 - 前記高分子担体の粒径分布範囲は1~200μmであり、好ましくは10~200μmであり、より好ましくは30~150μmであることを特徴とする請求項1に記載のレクチン-高分子担体カップリング複合体。
- 前記レクチン-高分子担体カップリング複合体において、1mLの高分子担体当たり1~20mg、好ましくは5~15mg、より好ましくは10~15mgのレクチンがカップリングされていることを特徴とする請求項1に記載のレクチン-高分子担体カップリング複合体。
- 前記臨床サンプルは、血清、血漿、唾液、組織又は細胞培養上清、尿、脳脊髄液、リンパ液の任意の1つを含むことを特徴とする請求項1に記載のレクチン-高分子担体カップリング複合体。
- 前記レクチンは、パラミツ由来レクチン、ピーナッツ由来レクチン、エンドウ由来レクチン(VVA及び/又はVVL)、ナタマメ由来レクチン、レンズマメ由来レクチン、小麦胚芽レクチン、ダイズ由来レクチン、インゲンマメ由来レクチンの任意の1つ、2つ又はそれ以上を含むことを特徴とする請求項1に記載のレクチン-高分子担体カップリング複合体。
- 前記グリコシル化エクソソームは、N-グリコシル化エクソソーム、O-グリコシル化エクソソーム、フコシル化エクソソームの任意の1つ、2つ又はそれ以上を含むことを特徴とする請求項1に記載のレクチン-高分子担体カップリング複合体。
- 前記レクチン-高分子担体カップリング複合体保存液が親和性吸着遠心分離管を含む分離装置に分注されており、前記親和性吸着遠心分離管は、上部の遠心分離管及び外側の保護スリーブ管の2つの部分を含み、前記上部の遠心分離管の直径は外側の保護スリーブ管の直径より小さく、前記上部の遠心分離管は外側の保護スリーブ管内に套設され且つその上部の外側には、上部の遠心分離管の開口部が外側の保護スリーブ管を超えるよう支持するための隆起した環状の縁部又は支柱があり、前記上部の遠心分離管は、遠心分離管蓋と、遠心分離管壁と、遠心分離管壁に固定して接続される濾過膜底部と、を含み、濾過膜底部で使用される濾過膜の孔径はレクチン-高分子担体カップリング複合体の粒径より小さく、且つエクソソームの粒径より大きく、前記レクチン-高分子担体カップリング複合体保存液が上部の遠心分離管に保存され、場合によって濾過膜の孔径は150~1000nmであることを特徴とする請求項1に記載のレクチン-高分子担体カップリング複合体。
- 請求項1~7のいずれか1項に記載のレクチン-高分子担体カップリング複合体を含み、分離過程で非特異的に結合した、グリコシル化していないエクソソーム及び他の不純物を洗浄し除去するための洗浄液及び/又はレクチン-高分子担体カップリング複合体に特異的に結合したグリコシル化エクソソームを溶離するための溶離液をさらに含むことを特徴とするグリコシル化エクソソーム分離組成物。
- 前記洗浄液は金属塩イオン不含の洗浄緩衝液又は精製水であり、場合によって金属塩イオン不含の洗浄緩衝液であり、
且つ/又は、前記溶離液は糖類を溶解したホウ酸塩緩衝液であり、さらに、場合によって、マンノースを溶解したホウ酸塩緩衝液であることを特徴とする請求項8に記載のグリコシル化エクソソーム分離組成物。 - 請求項1~7のいずれか1項に記載のレクチン-高分子担体カップリング複合体を用いてグリコシル化エクソソームを分離する分離ステップを含み、前記分離ステップは、
臨床サンプルを前処理するステップと、
前処理後のサンプルを得、場合によって、洗浄液と均一に混合して希釈したものを、被検出サンプルとするステップと、
レクチン-高分子担体カップリング複合体保存液から保存液の部分を完全に除去して、レクチン-高分子担体カップリング複合体を残すステップと、
被検出サンプルを、保存液を除去したレクチン-高分子担体カップリング複合体に加え、室温下で静置しながらインキュベートして、サンプルを除去するステップと、
洗浄液を使用してグリコシル化エクソソームが結合してあるレクチン-高分子担体カップリング複合体を洗浄し、分離過程で非特異的に結合したグリコシル化していないエクソソーム及び他の不純物を洗浄し除去するために、洗浄液を除去するステップと、
溶離液を使用して、洗浄後のレクチン-高分子担体カップリング複合体を溶離し、室温下で静置して、溶離上清を収集し、これが分離後のグリコシル化エクソソーム溶液であるステップと、を含むことを特徴とするグリコシル化エクソソーム分離方法。 - 被検出サンプルとレクチン-高分子担体カップリング複合体の比は1:1~3であり、
且つ/又は、1回で加える洗浄液の体積とグリコシル化エクソソームが結合してあるレクチン-高分子担体カップリング複合体の体積の比は1~3:1であり、
且つ/又は、洗浄液での洗浄ステップを1~3回繰り返し、
且つ/又は、加える溶離液の体積と洗浄後のレクチン-高分子担体カップリング複合体の体積の比は0.5~2:1であり、好ましくは0.5~1:1であることを特徴とする請求項10に記載のグリコシル化エクソソーム分離方法。 - レクチン-高分子担体カップリング複合体保存液から保存液の部分の完全除去、サンプルの除去、洗浄液の除去、及び/又は、溶離上清の収集は、3000rpm以下の速度で、室温下で20秒遠心分離することにより行い、
且つ/又は、室温下で静置しながら10~30分、好ましくは10~15分インキュベートし、
且つ/又は、前記洗浄液は金属塩イオン不含の洗浄緩衝液又は精製水であり、場合によって金属塩イオン不含の洗浄緩衝液であり、
且つ/又は、前記溶離液は糖類を溶解したホウ酸塩緩衝液であり、場合によって、マンノース含有ホウ酸塩緩衝液であることを特徴とする請求項10に記載のグリコシル化エクソソーム分離方法。 - サンプルを前処理するための方法は、
血清、血漿、唾液、脳脊髄液又はリンパ液サンプルの場合は、サンプルを3000g以下の速度で10~15分遠心分離して、サンプルから細胞破片、沈殿した不純物を除去し、遠心分離後の上清を得、使用に備えるステップと、
組織又は細胞培養上清、尿サンプルの場合は、サンプルを3000g以下の速度で10~15分遠心分離して、サンプルから細胞破片、沈殿した不純物を除去し、次に、上清を限外濾過遠心管で10~1000倍濃縮し、使用に備えるステップと、を含むことを特徴とする請求項10に記載のグリコシル化エクソソーム分離方法。 - 請求項7に記載のレクチン-高分子担体カップリング複合体を用いてグリコシル化エクソソームを分離する分離ステップは、
臨床サンプルを前処理するステップと、
前処理後のサンプルを得、場合によって、洗浄液と均一に混合して希釈したものを、被検出サンプルとするステップと、
レクチン-高分子担体カップリング複合体を入れた親和性吸着遠心分離管でレクチン-高分子担体カップリング複合体保存液から保存液の部分を完全に除去して、レクチン-高分子担体カップリング複合体を残し、新しい外側のスリーブ管と交換するステップと、
被検出サンプルを、保存液を除去した上部の遠心分離管に加え、室温下で静置しながらインキュベートして、サンプルを除去するステップと、
分離過程で非特異的に結合したグリコシル化していないエクソソーム及び他の不純物を洗浄し除去するために、上部の遠心分離管に洗浄液を加え、親和性吸着遠心分離管を遠心分離した後に上部の遠心分離管を取り出して、新しい外側のスリーブ管に入れ、元の外側のスリーブ管及びその中の液体を全部捨てるステップであって、当該ステップを1~3回行うステップと、
上部の遠心分離管に溶離液を加えて、洗浄後のレクチン-高分子担体カップリング複合体を溶離し、室温下で静置して、外側のスリーブ管から溶離上清を収集し、これが分離後のグリコシル化エクソソーム溶液であるステップと、を含むことを特徴とする請求項10に記載のグリコシル化エクソソーム分離方法。 - グリコシル化エクソソームの液体の検出、エクソソームの免疫学的検出、エクソソームからの核酸抽出後のヌクレオチド断片の測定分析を含むことを特徴とする請求項10~14のいずれか1項に記載のグリコシル化エクソソーム分離方法で分離したエクソソームの使用。
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