JP2018082706A - 5’リン酸オリゴヌクレオチドの構造および使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、免疫治療および薬物発見の分野に関する。本発明は、抗ウイルスまたは抗細菌応答、特に、I型IFN、IL-18、および/またはIL-1βの産生を誘導することができるオリゴヌクレオチド、ならびにそれらのインビトロ使用だけでなく治療的使用も提供する。
脊椎動物免疫系は、侵入する病原体をそれらの微生物核酸のある種の特徴に基づいて検出する異なる方法を確立した。微生物核酸の検出は、免疫系を変化させ、検出されたそれぞれの種類の病原体に対する防御に必要とされる適当な種類の免疫応答を開始する。ウイルス核酸の検出は、抗ウイルス防御のための重要なサイトカインである、IFN-αおよびIFN-βを含む、I型インターフェロン(IFN)の産生をもたらす。
[発明1001]
脊椎動物におけるウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、腫瘍、多発性硬化症、アレルギー、自己免疫疾患、免疫抑制、および免疫不全からなる群より選択される疾患および/または障害を予防および/または処置するためのオリゴヌクレオチドまたはその前駆体であって、
オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも6つのリボヌクレオチドを5'末端に含み、
オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、およびより好ましくは少なくとも3つのリン酸基を5'末端に含み、かつリン酸基がキャップまたは修飾をいずれも含まず、
オリゴヌクレオチドが、少なくとも12、好ましくは少なくとも18、およびより好ましくは少なくとも20、さらにより好ましくは少なくとも21ヌクレオチド長である、
オリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
[発明1002]
オリゴヌクレオチドが二本鎖構造を形成することができる配列をいずれも含まない一本鎖であり、かつオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が疾患または障害関連のRNAと相補的である、発明1001記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
[発明1003]
5'のキャッピングされていないリン酸基のうちの少なくとも1つが三リン酸に含まれない、発明1001または1002記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
[発明1004]
少なくとも1つのイノシン(I)を含む、発明1001〜1003のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
[発明1005]
オリゴヌクレオチドの5'末端の最初のリボヌクレオチドが、A、C、Uより選択されるリボヌクレオチド、好ましくはAおよびCより選択されるリボヌクレオチド、および最も好ましくはAを含む、発明1001〜1004のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
[発明1006]
オリゴヌクレオチドの5'末端の最初の4ヌクレオチドの配列が、
より選択され、配列が5'→3'方向にある、発明1001〜1005のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
[発明1007]
オリゴヌクレオチドが、シュードウリジン、2-チオウリジン、2'-フルオリン-dNTP、2'-O-メチル化NTP、特に2'-フルオリン-dCTP、2'-フルオリン-dUTP、2'-O-メチル化CTP、2'-O-メチル化UTPなどの修飾を含まない、発明1001〜1006のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
[発明1008]
オリゴヌクレオチドまたはその前駆体が、
からなる群より選択される4ヌクレオチド(4 mer)モチーフのうちの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、さらにより好ましくは少なくとも4つ、さらにより好ましくは少なくとも5つ、および最も好ましくは少なくとも6つを含み、
モチーフのヌクレオチド配列が5'→3'であり、かつ
オリゴヌクレオチドが、12〜64、好ましくは12〜50、より好ましくは14〜40、さらにより好ましくは16〜36、および最も好ましくは18〜25ヌクレオチド長である、
発明1001〜1007のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
[発明1009]
オリゴヌクレオチドまたはその前駆体が、
からなる群より選択される4ヌクレオチド(4 mer)モチーフのうちの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、さらにより好ましくは少なくとも4つ、さらにより好ましくは少なくとも5つ、および最も好ましくは少なくとも6つを含み、
モチーフのヌクレオチド配列が5'→3'であり、かつ
オリゴヌクレオチドまたはその前駆体が、12〜64、好ましくは12〜50、より好ましくは14〜40、さらにより好ましくは16〜36、および最も好ましくは18〜30ヌクレオチド長である、
発明1001〜1008のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
[発明1010]
複合体形成剤をさらに含む、発明1001〜1009のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
[発明1011]
ウイルスベクターに含まれる、発明1001〜1009のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
[発明1012]
免疫賦活剤、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗腫瘍剤、および遺伝子サイレンシング剤より選択される少なくとも1つの薬剤、ならびに/または抗腫瘍治療と組み合わせて使用するための、発明1001〜1011のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
[発明1013]
レチノイン酸および/またはI型IFNと組み合わせて使用するための、発明1012記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
[発明1014]
脊椎動物において腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、抗ウイルス応答を誘導し、抗細菌応答を誘導し、かつ/または抗腫瘍応答を誘導するための、発明1001〜1013のいずれか一項で定義した通りのオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
[発明1015]
抗ウイルス応答、抗細菌応答、および/または抗腫瘍応答が、I型IFN産生、IL-18産生、および/またはIL-1β産生を含む、発明1014記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
[発明1016]
脊椎動物において少なくとも1つの抗原に対する免疫応答を誘導するための、発明1001〜1013のいずれか一項で定義した通りのオリゴヌクレオチドまたはその前駆体および少なくとも1つの抗原。
[発明1017]
オリゴヌクレオチドまたはその前駆体が、少なくとも1つの抗原と共有結合によって連結している、発明1016記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体および少なくとも1つの抗原。
[発明1018]
脊椎動物におけるウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、腫瘍、多発性硬化症、アレルギー、自己免疫疾患、免疫抑制、および免疫不全からなる群より選択される疾患および/または障害を予防および/または処置するための医薬の調製用の、発明1001〜1013のいずれか一項で定義した通りのオリゴヌクレオチドまたはその前駆体の使用。
[発明1019]
脊椎動物において腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、抗ウイルス応答を誘導し、抗細菌応答を誘導し、かつ/または抗腫瘍応答を誘導するための医薬の調製用の、発明1001〜1013のいずれか一項で定義した通りのオリゴヌクレオチドまたはその前駆体の使用。
[発明1020]
抗ウイルス応答、抗細菌応答、および/または抗腫瘍応答が、I型IFN産生、IL-18産生、および/またはIL-1β産生を含む、発明1019記載の使用。
[発明1021]
発明1001〜1013のいずれか一項で定義した通りのオリゴヌクレオチドまたはその前駆体を含む、薬学的組成物。
[発明1022]
発明1001〜1013のいずれか一項で定義した通りのオリゴヌクレオチドまたはその前駆体と、免疫賦活剤、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗腫瘍剤、および遺伝子サイレンシング剤より選択される少なくとも1つの薬剤とを含む複合調製物であって、オリゴヌクレオチドまたはその前駆体および少なくとも1つの薬剤が同時投与、分離投与、または連続投与用である、複合調製物。
[発明1023]
薬剤がレチノイン酸およびI型IFNの少なくとも1つである、発明1022記載の複合調製物。
[発明1024]
発明1021記載の薬学的組成物または発明1022もしくは1023記載の複合調製物と、使用のための取扱説明書とを含む、薬学的パッケージ。
[発明1025]
(a)発明1001〜1009のいずれか一項で定義した通りのオリゴヌクレオチドまたはその前駆体を複合体形成剤と混合する工程;ならびに
(b)RIG-Iおよび/またはインフラマソーム(inflammasome)の構成成分を発現する細胞を(a)の混合物と接触させる工程
を含む、細胞における抗ウイルス応答および/または抗細菌応答および/または抗腫瘍応答を刺激するためのインビトロ法。
[発明1026]
オリゴヌクレオチドが一本鎖であり、かつ細胞が該オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むmRNAを含む、発明1025記載の方法。
[発明1027]
(a)少なくとも1つのキャッピングされていない5'一リン酸、二リン酸、および/または三リン酸をオリゴヌクレオチドに導入する工程;ならびに
(b)細胞内で二本鎖構造を形成することができるヌクレオチド配列をオリゴヌクレオチドに導入する工程
を含む、抗ウイルス応答および/または抗細菌応答および/または抗腫瘍応答を誘導することができるオリゴヌクレオチドを調製するための方法。
[発明1028]
(c)5'末端にアデノシン(A)を持つオリゴヌクレオチドを調製する工程;および/または
(d)5'末端にAAGU、AAAG、AUGG、AUUA、AACG、AUGA、AGUU、AUUG、AACA、AGAA、AGCA、AACU、AUCG、AGGA、AUCA、AUGC、AGUA、AAGC、AACC、AGGU、AAAC、AUGU、ACUG、ACGA、ACAG、AAGG、ACAU、ACGC、AAAU、ACGG、AUUC、AGUG、ACAA、AUCC及びAGUCより選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを調製する工程;および/または
(e)オリゴヌクレオチドにイノシン(I)を導入する工程
をさらに含む、発明1027記載の方法。
[発明1029]
(a)オリゴヌクレオチドから全ての5'リン酸基を排除する工程;ならびに/または
(b)オリゴヌクレオチドの全ての5'一リン酸、二リン酸、および三リン酸をキャッピングする工程;ならびに/または
(c)細胞内で二本鎖構造を形成することができる任意のヌクレオチド配列をオリゴヌクレオチドから排除する工程;ならびに/または
(d)シュードウリジン、2-チオウリジン、2'-フルオリン-dNTP、2'-O-メチル化NTP、好ましくは2'-フルオリン-dCTP、2'-フルオリン-dUTP、2'-O-メチル化CTP、2'-O-メチル化UTPなどの修飾されたヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに組み入れる工程
を含む、抗ウイルス応答誘導活性および抗細菌応答誘導活性を持たないオリゴヌクレオチドを調製するための方法。
[発明1030]
抗ウイルス応答、抗細菌応答、および/または抗腫瘍応答が、I型IFN産生、IL-18産生、および/またはIL-1β産生を含む、発明1025〜1029のいずれか記載の方法。
[発明1031]
脊椎動物におけるウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、腫瘍、多発性硬化症、アレルギー、自己免疫疾患、免疫抑制、および免疫不全からなる群より選択される疾患および/または障害を予防および/または処置するための細菌RNA。
ウイルス感染の検出は、高等生物がそれらのゲノムの完全性を守るために必須である。TLRはウイルス核酸の認識に寄与するが、それらの適切な機能は、有効な抗ウイルス防御に大部分が必須ではないように思われる(A. Krug et al., Immunity 21, 107 (Jul, 2004); K. Tabeta et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101, 3516 (Mar 9, 2004); T. Delale et al., J Immunol 175, 6723 (Nov 15, 2005); K. Yang et al., Immunity 23, 465 (Nov, 2005))。最近になって初めて、2つの細胞質ヘリカーゼ、MDA-5およびRIG-I(M. Yoneyama et al., Nat Immunol 5, 730 (Jul, 2004))が、ウイルス感染を制御するのに不可欠であることが明確になった。
本明細書で用いる場合、「1つの(a)」および「1つの(an)」は、単数形の個体だけでなく、実在物の群または種も指す。
本明細書で用いる場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、複数の連結されたヌクレオシド単位から形成されたポリヌクレオチドを指し、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は同義的に用いられる。そのようなオリゴヌクレオチドは、ゲノムDNAまたはcDNAを含む既存の核酸源から得ることができるが、好ましくは化学合成、インビトロおよびインビボの転写を含む合成法によって産生される。好ましい態様において、各々のヌクレオシド単位には、複素環塩基およびペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、2'-デオキシ-2'-置換アラビノース、2'-0-置換アラビノース、またはヘキソース糖基が含まれる。ヌクレオシド残基は、数々の公知のヌクレオシド間連結のいずれかによって互いに共役することができる。そのようなヌクレオシド間連結には、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ピロホスフェート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルフォリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋されたホスホロアミデート、架橋されたメチレンホスホネート、架橋されたホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間連結が含まれるが、これらに限定されない。「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、1つまたは複数の立体特異的なヌクレオシド間連結(例えば、(Rp)-もしくは(Sp)-ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル連結)を包含する。
ヌクレアーゼ抵抗性および/または標的に対する結合親和性の増加のために、オリゴヌクレオチドは、例えば、2'-修飾リボース単位および/またはホスホロチオエート連結および/またはピロホスフェート連結を含むことができる。例えば、2'ヒドロキシル基(OH)を、多数の異なる「オキシ」もしくは「デオキシ」置換基で修飾するかまたはこの置換基と交換することができる。
本発明のRNAオリゴヌクレオチドには、テザーリガンドを含むオリゴヌクレオチドも含まれる。その薬理学的特性を含むRNAオリゴヌクレオチドの特性は、リガンド、例えばテザーリガンドの導入によって影響を与えられ、その特性を好みに合わせることができる。
本明細書で用いる場合、「免疫刺激活性」とは、分子または組成物などの薬剤が、免疫応答を誘導する能力を指す。ある態様において、免疫刺激活性は、I型IFN誘導活性、特にIFN-α誘導活性を指す。
本明細書で用いる場合、「抗ウイルス応答」とは、ウイルスを排除するかまたは無力にすることを目的とした、ウイルスによる感染時の細胞、組織、または生物による応答を指す。典型的な抗ウイルス応答には、I型IFN、MIP1-a、MCP、RANTES、IL-8、IL-6、IP-10、およびIFN-γの産生が含まれるが、これらに限定されない。
抗細菌応答とは、細菌を排除するかまたは無力にすることを目的とした、細菌による感染時の細胞、組織、または生物による応答である。典型的な抗細菌応答には、受容体を介するアポトーシスかまたはTNFもしくはTRAILによるサイトカインを介するアポトーシスのいずれかによるT細胞またはNK細胞を介する感染細胞の排除、マクロファージまたは単球による食作用が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で用いる場合、「障害/疾患関連遺伝子」とは、障害/疾患で発現するかまたは過剰発現し、かつ正常な健常細胞では発現しないかまたは低下した量で発現する遺伝子を指す。例えば、突然変異体CF遺伝子は、嚢胞性線維症患者で発現するが、嚢胞性線維症のない個人では発現せず;ErbB2(またはHer2)は、正常な乳房細胞と比較して乳癌細胞で過剰発現し;ウイルス遺伝子またはウイルスによって誘導された宿主遺伝子は、感染細胞で発現するが、非感染細胞では発現しない。障害/疾患関連遺伝子の遺伝子産物は、本明細書において「障害/疾患関連抗原」と称する。「障害/疾患関連RNA」とは、罹患細胞に存在するかまたは上昇したレベルで存在し、かつ正常な健常細胞では存在しないかまたは低下したレベルで存在するRNA分子を指す。障害/疾患関連RNAは、mRNA、miRNA、またはrRNAもしくはtRNAなどのその他の非コードRNAであってもよい。
本明細書で用いる場合、「哺乳類」という用語には、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ヒツジ、ウシ(cattle)、ウシ(cow)、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒトが含まれるが、これらに限定されない。
本発明は、抗ウイルス応答、特に、I型IFN産生を誘導することができるオリゴヌクレオチドを提供し、オリゴヌクレオチドは、5'末端に少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、およびより好ましくは少なくとも3つのリン酸基を含み、リン酸基は任意のキャップ構造または修飾を含まず、オリゴヌクレオチドは、5'末端に少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、より好ましくは少なくとも6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、さらにより好ましくは少なくとも12、13、14、15、16、17、最も好ましくは少なくとも18、19、20、21のリボヌクレオチドを含み、かつオリゴヌクレオチドは、少なくとも12、好ましくは少なくとも18、より好ましくは少なくとも19、さらにより好ましくは少なくとも20、および最も好ましくは少なくとも21ヌクレオチド長である。
からなる群より選択される4ヌクレオチド(4mer)モチーフのうちの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、さらにより好ましくは少なくとも4つ、さらにより好ましくは少なくとも5つ、および最も好ましくは少なくとも6つを含み、
モチーフのヌクレオチド配列は5'→3'であり、
オリゴヌクレオチドまたはその前駆体は、12〜64、好ましくは12〜50、より好ましくは14〜40、さらにより好ましくは16〜36、および最も好ましくは18〜25ヌクレオチド長である。
からなる群より選択される4ヌクレオチド(4mer)モチーフのうちの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、さらにより好ましくは少なくとも4つ、さらにより好ましくは少なくとも5つ、および最も好ましくは少なくとも6つを含み、
モチーフのヌクレオチド配列は5'→3'であり、
オリゴヌクレオチドまたはその前駆体は、12〜64、好ましくは12〜50、より好ましくは14〜40、さらにより好ましくは16〜36、および最も好ましくは18〜30ヌクレオチド長である。
本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドおよび本オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた抗原を含む、抗ウイルス応答、特に、I型IFN産生を誘導することができるオリゴヌクレオチドコンジュゲートを提供する。好ましい態様において、抗原を、5'三リン酸を持つその5'末端以外の位置でオリゴヌクレオチドにコンジュゲートする。幾つかの態様において、抗原はワクチン効果を生み出す。
本発明は、上記のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体の1つまたは複数および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
本発明は、同時、別々、または連続的な投与用である、本発明で記載したオリゴヌクレオチドもしくはその前駆体または細菌RNAおよび薬学的活性薬剤を含む複合調製物を提供する。
本発明は、本発明の薬学的組成物または複合調製物および使用のための取扱説明書を含む薬学的パッケージを提供する。
本出願は、脊椎動物、特に、哺乳類で、抗ウイルス応答、特に、I型IFN産生、IL-18産生、および/またはIL-1β産生を誘導するための薬学的組成物の調製のための本発明で記載したオリゴヌクレオチドもしくはその前駆体または細菌RNAの使用を提供する。
本出願は、脊椎動物、特に哺乳類で、抗細菌応答、特に細胞内細菌に対する応答を誘導するための薬学的組成物の調製のための本発明で記載したオリゴヌクレオチドもしくはその前駆体または細菌RNAの使用を提供する。
本出願は、脊椎動物、特に哺乳類で、インビトロおよびインビボにおけるアポトーシスを誘導するための薬学的組成物の調製のための本発明で記載したオリゴヌクレオチドもしくはその前駆体または細菌RNAの使用を提供する。
本出願は、脊椎動物、特に哺乳類で、抗腫瘍応答を誘導するための薬学的組成物の調製のための本発明で記載したオリゴヌクレオチドもしくはその前駆体または細菌RNAの使用を提供する。
本発明は、医学および/または獣医学の診療において、脊椎動物、特に哺乳類で、疾患/障害を予防および/または処置するための薬学的組成物の調製のための本発明で記載したオリゴヌクレオチドもしくはその前駆体または細菌RNAの使用を提供する。
本発明は、脊椎動物、特に哺乳類で、少なくとも1つの抗原に対する免疫応答を誘導するためのワクチンの調製のための少なくとも1つの抗原と組み合わせた本発明に記載のオリゴヌクレオチドもしくはその前駆体または細菌RNAの使用を提供する。
本発明は、以下の工程を含む、細胞における抗ウイルス応答および/または抗細菌応答を刺激するためのインビトロ法を提供する:
(a)本発明で記載したオリゴヌクレオチドもしくはその前駆体または細菌RNAを複合体形成剤と混合する工程;ならびに
(b)RIG-Iおよび/またはインフラマソームの構成成分を発現する細胞を、(a)の混合物と接触させる工程。
本発明は、以下の工程を含む、細胞におけるTh1サイトカインの産生を刺激するためのインビトロ法を提供する:
(a)本発明で記載したオリゴヌクレオチドもしくはその前駆体または細菌RNAを複合体形成剤と混合する工程;ならびに
(b)Th1サイトカインを産生することができる細胞を、(a)の混合物と接触させる工程。
本発明は、以下の工程を含む、抗ウイルスおよび/または抗細菌応答を誘導することができるオリゴヌクレオチドを調製するための方法を提供する:
(a)少なくとも1つのキャッピングされていない5'リン酸基をオリゴヌクレオチドに導入する工程;および
(b)細胞内で二本鎖構造を形成することができるヌクレオチド配列をオリゴヌクレオチドに導入する工程。
(c)5'末端にアデノシン(A)を有するオリゴヌクレオチドを調製する工程;
(d)5'末端に
より選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを調製する工程;および
(e)イノシン(I)をオリゴヌクレオチドに組み入れる工程。
本発明はまた、以下の工程の1つまたは複数を含む、任意の抗ウイルス応答誘導活性および抗細菌応答誘導活性がないオリゴヌクレオチドを調製するための方法を提供する:
(a)全ての5'リン酸基をオリゴヌクレオチドから排除する工程;
(b)オリゴヌクレオチドの全ての5'一リン酸、二リン酸、または三リン酸をキャッピングする工程;
(c)細胞内で二本鎖構造を形成することができる任意のヌクレオチド配列をオリゴヌクレオチドから排除する工程;および
(d)シュードウリジン、2-チオウリジン、2'-フルオリン-dNTP、2'-O-メチル化NTP、好ましくは2'-フルオリン-dCTP、2'-フルオリン-dUTP、2'-O-メチル化CTP、2'-O-メチル化UTPなどの修飾ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに組み入れる工程。
本発明は、遺伝子治療で使用するためのRNAを調製するための方法を提供し、本方法は、RNAから5'一リン酸、二リン酸、もしくは三リン酸を排除する工程、および/またはシュードウリジン、2-チオウリジン、2'-フルオリン-dNTP、2'-O-メチル化NTP、好ましくは2'-フルオリン-dCTP、2'-フルオリン-dUTP、2'-O-メチル化CTP、2'-O-メチル化UTPなどの修飾ヌクレオチドをRNAに組み入れる工程を含む。本発明の方法によって調製されるRNAは、免疫刺激活性および/または抗ウイルス応答を誘導する能力を欠いており、したがって脊椎動物細胞における遺伝子移入に好適である。
材料および方法
実施例1〜10
細胞培養
若い健康ドナーによって供与された全血からFicoll-Hypaque密度勾配遠心分離(Biochrom, Berlin, Germany)でヒトPBMCを調製した。Miltenyi Biotec(Bergisch-Gladbach, Germany)からの血液樹状細胞Ag(BCDA)-4 樹状細胞単離キットを用いてMACSでPDCを単離した。簡潔には、コロイド状の常磁性マイクロビーズに共役した抗BDCA-4 AbでPDCを標識し、磁気分離カラムに2回(LSカラム、次にMSカラム;Miltenyi Biotec)通した。単離されたPDC(系統陰性、MHC-II陽性、およびCD123陽性細胞)の純度は、95%を越えていた。単球の単離の前に、MACS(LDカラム;Miltenyi Biotec)でPDCを枯渇させ、その後単球単離キットII(Miltenyi Biotec)を用いて単球を単離した。プールした骨髄細胞をマウスGM-CSF(10 ng/ml;R&D Systems, Minneapolis, MN)の存在下でインキュベートすることによって、マウス骨髄由来の従来型の樹状細胞を発生させた。7日後、これらの培養は典型的には、90%よりも多くのcDC(CD11c+、CD11b+、B220-)を含んでいた。トリパンブルー排出で決定した場合、生存率は95%を越えていた。PDC(2.5*106細胞/ml)を除く、全ての細胞を、10%(v/v) FCS(Biochrom)、1.5 mM L-グルタミン、100 U/ml ペニシリン、および100 μg/ml ストレプトマイシン(全てSigma- Aldrich, Munich, Germanyから)を補充したRPMI 1640培養培地(Biochrom, Berlin, Germany)中で2*106細胞/mlの密度で培養した。PDC培養に追加で10 ng/ml IL-3(R&D Systems)を補充した。HEK 293細胞(ヒト胎児腎臓)を、10%(v/v) FCS(Biochrom)、1.5 mM L-グルタミン、100 U/ml ペニシリン、および100 μg/ml ストレプトマイシン(全てSigma- Aldrichから)を補充したRPMI 1640培養培地(Biochrom)中で維持した。Vero(アフリカミドリザル腎臓)およびHEK 293T(ヒト胎児腎臓)細胞を、抗生物質およびそれぞれ5%または10% 胎仔ウシ血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で維持した。BSR細胞を、10% 新生仔ウシ血清、リン酸ブロス、アミノ酸、および抗生物質を添加したグラスゴー最小必須培地中で繁殖させた。
TLR7、RIG-I、およびMDA5欠損マウスは、以前に記載されている(Hemmi H et al. Nat. Immunol. 3:196, Feb, 2002; Kato H et al., Immunity 23:19, Jul, 2005; Kato H et al. Nature 441 (7089):101-105, Apr 9, 2006)。雌の野生型C57BL/6マウスは、Harlan-Winkelmann(Borchen, Germany)から購入した。マウスは、実験の開始時に6〜12週齢であった。動物研究は、地域の規制当局(Regierung von Oberbayern, Munich, Germany)によって承認された。
IFN-αモジュールセット(Bender MedSystems, Graz, Austria)を用いて細胞培養上清中でヒトIFN-αを評価した。マウス IP-10 ELISAはBiosource(Solingen, Germany)から、マウスIFN-α ELISAはPBL Biomedical Laboratories(Piscataway, USA)から得た。全てのELISA手順を製造元の勧めに従って行なった。マウスIFN-αを以下のプロトコルに従って測定した:モノクローナルラット抗マウスIFN-α(クローンRMMA-1)を捕捉Abとして、検出用のポリクローナルウサギ抗マウスIFN-α血清(両方ともPBL Biomedical Laboratories)をHRPコンジュゲートされたロバ抗ウサギIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)と共に二次試薬として用いた。マウスrIFN-A(PBL Biomedical Laboratories)を標準品(1 U/mlのIFN-α濃度)として用いた。
化学合成したRNAオリゴヌクレオチドは、Eurogentec(Leiden, Belgium)から購入した。インビトロ転写されたRNAは、Silencer siRNA構築キット(Ambion, Huntingdon, UK)を用いるかまたは以下のプロトコルに従って合成した:部分的に重複する一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを用いて、二本鎖DNA鋳型をExo- Klenow(Fermentas)を用いて構築した。Opti mRNAキット(Curevac, Tubingen, Germany)の対照鋳型を用いて2500ヌクレオチドの転写物(図1)を生成した。40 bpより大きい鋳型は、pBluescript KSを鋳型として用いるPCRによって構築した(全てのインビトロ転写鋳型の詳細なリストについては、表1を参照されたい)。得られた鋳型は、T7 RNAポリメラーゼコンセンサスプロモーター、その後に転写されるべき関心対象の配列を含んだ。20 pmolのDNA鋳型を、40 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM DTT、2 mM スペルミジン-HCl(Sigma)および20 mM MgCl2を含む緩衝剤中で30 U T7 RNAポリメラーゼ、40 U RNアーゼ阻害剤、0.3 U 酵母無機ピロホスファターゼとインキュベートした。キャッピングされたRNAを、Opti mRNAキット(Curevac)を用いて転写した。ヌクレオシド修飾したRNAを転写するために、インビトロ転写反応の間、ウリジン-5'-三リン酸を、シュードウリジン-5'-三リン酸かまたは2-チオウリジン-5'-三リン酸(両方ともTriLink, San Diego, USA)のいずれかに交換した。2'-O-メチル化UTP(Trilink)の取込みのために、T7 R&DNA(商標)ポリメラーゼ(Eipcentre, Madison, USA)を用いた。このポリメラーゼは、2'-O-メチルなどの2'-置換基を持つNTPの取込みを可能にする1塩基の活性部位突然変異を有する。インビトロ転写を終夜37℃で実行した。DNA鋳型をDNアーゼI(Fermentas)を用いて消化し、その後Roche高純度RNA単離キット(Roche Applied Science, Mannheim, Germany)を用いて以下の修正を行なってRNAを精製した:結合緩衝剤は、70% エタノール中の2.0 M グアニジンチオシアネートであり、洗浄緩衝剤は、70% エタノール中の100 mM NaCl、4.5 mM EDTA、10 mM Tris HClで置換した。溶出後、Mini Quick Spin(商標)Oligo Column(Roche)にRNAを通すことによって、余分な塩およびNTPを除去した。RNAのサイズおよび完全性をゲル電気泳動でチェックした。
対応する鎖
(表1B)pBKSをPCR鋳型として用いるインビトロ転写鋳型の生成用のPCRプライマー
フォワードプライマー
バックワードプライマー
大腸菌株DH10BおよびヒトPBMC由来のRNAを、Trizol(登録商標)試薬(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)を用いて製造元のプロトコルに従って単離した。CIAP処理を以下のように行なった:10 μgのインビトロ転写されたRNA、15 μgの細胞RNA、または1.5 μgのウイルスRNAを、30 Uのウシ小腸アルカリホスファターゼ(CIAP)(Stratagene, La Jolla, USA)を用いて、3時間37℃で50 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTAを含む緩衝剤中で、10 UのRNアーゼ阻害剤(RNAguard(商標);Amersham-Biosciences)の存在下で処理した。CIAP処理後、RNeasy Miniキットを用いてRNAを浄化した。
細胞ライセートを、Meisterら(G. Meister et al., Mol Cell 15, 185 (Jul 23, 2004))に従って少し修正をして調製した。高分子量(25 kDa)ポリエチレンイミン(PEI; Sigma, 40.872-7)を用いて、HEK293細胞にトランスフェクトした。80〜90%のコンフルエンシーで、1.5:1のPEI:DNA比で細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの24〜36時間後、細胞を採取し、5ペレット用量の10 mM KCl、1.5 mM MgCl2、0.5 mM ジチオスレイトール、10 mM HEPES-NaOH(pH 7.9)、0.5 mM PMSFに細胞ペレットを再懸濁し、10分間氷上でインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、細胞ペレットを2ペレット用量の上記の緩衝剤に再懸濁し、ダウンシング(douncing)によってホモジェナイズした。2.000 gで10分間の遠心分離によって、細胞ライセートから細胞核を除去した。上清を微量遠心分離チューブに移し、2.000 gで10分間の遠心分離および30分間20.000 gでのさらなる遠心分離によってさらに浄化し、細胞質抽出物を得た。その後、抽出物のKClの濃度を2 M KClの添加によって100 mMまで上げ、グリセロールを10%のパーセンテージまで添加した。FLAGタグ付きRIG-IC複合体の精製のために、細胞質抽出物をFLAG M2アガロースビーズ(Sigma)中でインキュベートした。FLAG M2アガロースビーズを 0.1 M グリシン(pH 3.5)で1回洗浄し、1 M Tris-HCl(pH 8.0)で洗浄することによって平衡化した。その後、ビーズを緩衝剤C(0.1 M KCl、5 mM MgCl2、10% グリセロール、10% Tween20、10 mM β-メルカプトエタノール、0.2 mM PMSF、および20 mM Tris-HCl [pH 8.0])に再懸濁し、細胞質抽出物と4時間4℃で回転させながらインキュベートした。ビーズを回収し、0.1% NP40を補充した洗浄緩衝剤(300 mM NaCl、5 mM MgCl2、50 mM Tris-HCl [pH 7.5])中で2回洗浄した。その後、0.2 μg/ml 3xFLAGペプチド(Sigma)を含む洗浄緩衝剤中で2時間10℃でビーズを振盪することによって親和性結合した複合体を溶出し、遠心分離後に溶出物を回収した。
4O U RNアーゼ阻害剤(Fermentas)、0.5 mM PMSFの存在下で洗浄緩衝剤中に100 μlの最終容量で2時間4℃で回転させながら、全細胞ライセートまたは25 μl RIG-IC溶出物を0.375 μg ビオチン化RNAとインキュベートした。50 μl ストレプトアビジンコーティングされたビーズ(Pierce, Rockford, USA; 20347)をさらに1時間室温で回転させながら添加した。その後、ビーズを0.1% NP40を補充した洗浄緩衝剤中で4回洗浄した。さらなる免疫ブロット解析用に、上清およびビーズをLaemli緩衝剤中で溶解した。
ウェスタンブロッティング用に、試料をSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜(Amersham-Biosciences, UK)にセミドライ式電気ブロッティングで移した。一次抗体として、モノクローナル抗Flag抗体(Sigma)を用いた。二次抗体として、ペルオキシダーゼがコンジュゲートされた抗マウス抗体(Amersham-Biosciences)を用いた。結合した抗体は、増強された化学発光システム(ECL)によって製造元のプロトコル(Amersham-Biosciences)に従って可視化した。
トランスフェクションの12〜16時間前に、HEK 293細胞を48ウェルプレート中に播種した。80%のコンフルエンシーで、300 ngのレポータープラスミド(pIFNβ-luc)、500 ngの(ラウス肉腫ウイルスβ-ガラクトシダーゼを発現する)標準化プラスミド、および示された発現プラスミドが合計で1.5 μg DNA/ウェルになるように、PEIを用いてHEK 293細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、培養培地を吸引し、10 mM EDTAを含む0.5ml PBS中で細胞を1回洗浄した。その後、50 μl ルシフェラーゼ溶解緩衝剤(10% グリセロール、1% Triton-X、2 mM EDTA、25 mM TrisHCl [pH 7.8]、2 mM DTT)中で細胞を溶解した。20 μlの各試料を20 μlのLuciferase Detection Reagent(Promega)と混合し、マイクロプレートルミノメーター(LUMIstar, BMGLabtechnologies)でルシフェラーゼ活性について解析した。ベータ-ガラクトシダーゼ活性を測定するために、10 μl ライセートを100 μlの溶液1(1% Galacton-Plus [TROPIX]、0.1% 0.1 M MgCl2、20% 0.5 M リン酸 [pH 8]、78.9% H2O)と20分間インキュベートし、その後50 μlの溶液2を添加した(20% 1 M NaOH、10% Emerald [TROPIX] 70% H2O)。ルシフェラーゼ活性値を同じ抽出物のベータ-ガラクトシダーゼ活性に対して標準化した。ウイルス感染を伴う実験についてのレポーターアッセイ(図5)は、以下のように行なった:トランスフェクションの12〜18時間前に、HEK 293TまたはVero細胞を24ウェルプレート中に播種した。80%のコンフルエンシーで、ホタルルシフェラーゼをコードする400 ngのレポータープラスミド(p125-Luc)および標準化用のCMV制御されたウミシイタケルシフェラーゼをコードする2 ngのプラスミド(pRL-CMV、Promega)を、表示されている場合には400 ngのRIG発現プラスミドの空ベクターと一緒にLipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて細胞にトランスフェクトした。DNAトランスフェクションの6時間後、細胞にPEIを用いて表示された量のRNAを感染させるかまたはトランスフェクトするかのいずれかにした。DNAトランスフェクションの48時間後、細胞抽出物を調製し、Dual Luciferase Reporter System(Promega)でアッセイした。ルシフェラーゼ活性は、供給元の取扱説明書に従ってLuminometer(Berthold)で測定した。
pIFN-ベータ-Lucは、T. Maniatisにより親切に提供された。RIG-I CARD2は、S. Rothenfusserにより親切に提供された。p125-Luc、RIG-I全長、RIG-IC、RIG-I K270A、および空の対照ベクターは、T. Fujita(M. Yoneyama et al., Nat Immunol 5, 730 (Jul, 2004))により親切に提供された。RIG-I Δヘリカーゼ_C(AS 655-734)は、以下のPCRプライマー対を用いたループアウトPCRによってRIG-I全長から構築した:
pSC6-T7-NEOは、M. Billeter F.(Radecke et al., Embo J 14, 5773 (Dec 1, 1995))により親切に提供された。T7 D812Nは、以下のPCRプライマー対を用いた部位特異的突然変異によってpSC6-T7-NEOから構築した:
RIG-I Δヘリカーゼ_CおよびT7 RNA D812Nは、シークエンシングによって確認した。
組換えRV SAD L16(Schnell MJ et al., 1994, EMBO J. 13(18):4195-4203)をwt RVとして用いた。cDNAのクローニング、プロモーターから最も遠位の遺伝子位置由来のPをコードする、組換え SAD ΔPLPウイルスの回収、およびウイルス繁殖は、以前に記載された(K. Brzozka, et al. Journal of virology 79, 7673 (Jun, 2005))。
培地および試薬
10%(v/v)熱不活化FCS(Invitrogen Life Technologies)、3 mM L-グルタミン、0.01 M HEPES、100 U/ml ペニシリン、および100 μg/ml ストレプトマイシン(全てSigma-Aldrichから)を補充したRPMI 1640(Biochrom)および10% ウシ胎仔血清(FCS)、3 mM L-グルタミン、100 U/ml ペニシリン、および100 μg/ml ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(PAN, Aidenbach, Germany)を用いた。CpG ODN(Coley Pharmaceutical Group)は、小文字がホスホロチオエート(PT)連結、大文字が塩基の3'のホオスホジエステル(PD)連結を示す;
ポリイノシン:ポリシチジン酸(ポリ(I:C))は、Sigma-Aldrichから購入した。NK細胞およびCD8 T細胞の枯渇のために、IL-2受容体β鎖特異的mAb TMβ1およびmAb RmCD8-2を記載された通りに用いた(Ralph Mocikat, GSF-lnstitut fur Molekulare Immunologie, Munich, Germanyの親切な贈与品)。組換えマウスIFNβは、Europa Bioproducts社で購入した。In vivo-jetPEI(商標)(#201-50)は、Biomol GmbH(Hamburg, Germany)で購入した。
化学合成したRNAオリゴヌクレオチドは、Eurogentec(Leiden, Belgium)またはMWG-BIOTECH AG(Ebersberg, Germany)から購入した(全ての化学合成RNAオリゴヌクレオチドの詳細なリストについては、表3を参照されたい)。インビトロ転写されたRNAは、製造元の取扱説明書に従ってmegashort scriptキット(Ambion, Huntingdon, UK)を用いて合成された(全てのインビトロ転写鋳型の詳細なリストについては、表4を参照されたい)。得られた鋳型は、T7 RNAポリメラーゼコンセンサスプロモーター、その後に転写されるべき関心対象の配列を含んだ。インビトロ転写された二本鎖RNAの生成のために、センスおよびアンチセンス鎖のDNA鋳型を、6時間別々の反応で転写させた。T7 RNAポリメラーゼで転写するために、過剰なGを センスおよびアンチセンス鎖の両方に添加した。その後、反応物を混合し、組み合わせた反応物を終夜37℃でインキュベートした。DNA鋳型を、DNアーゼ1(Ambion)を用いて消化し、その後フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿を用いてRNAを精製した。溶出後、Mini Quick Spin(商標)Oligo Column(Roche)にRNAを通すことによって、余分な塩およびNTPを除去した。RNAの完全性をゲル電気泳動でチェックした。
マウス骨髄樹状細胞および形質細胞様樹状細胞のFlt3-リガンド(Flt3-L)で誘導した混合培養を記載された通りに成長させた(3)。FLT-3リガンドで誘導した骨髄培養由来の形質細胞様DC をB220マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)で分取した。プールした骨髄細胞をマウスGM-CSF(10 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, MN)の存在下でインキュベートすることによって従来型の樹状細胞(cDC)を発生させた。7日後、これらの培養は、典型的には80%よりも多くのcDC(CD11c+、CD11b+、B220-)を含んでいた。幾つかの実験については、野生型マウスの脾臓からB細胞を、マウスB細胞単離キットおよびCD19マイクロビーズ(Milteny Biotec)を用いたMACS で単離した。手を付けていないNK細胞およびCD 8 T細胞を、NK細胞単離およびCD8 T細胞単離キット(Mileny Biotec)を用いて脾臓から分取した。トリパンブルー排出で決定した場合、全ての細胞の生存率は95%を越えており、FACSで解析した場合、純度は>90%であった。10% 胎仔ウシ血清(FCS)、4 mM L-グルタミン、および10-5 M メルカプトエタノールを補充したRPMI(PAN, Aidenbach, Germany)中でマウス初代細胞を養殖した。マウスB16細胞(H-2b)は、Thomas Tutingの親切な贈与品であり、10% 胎仔ウシ血清(FCS)、2 mM L-グルタミン、100 U/ml ペニシリン、および100 μg/ml ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(PAN, Aidenbach, Germany)中で養殖した。
全ての細胞を2*106細胞/mlの密度で培養し、それぞれ、24ウェルの平底プレート中に播種した。そうでないように示さない限り、細胞を、3 μg/ml CpG-B-DN 1826および/またはCpG-ODN 2216、1 μM R848と24時間インキュベートした。RNAをLipofectamine 2000と共に製造元のプロトコル(Invitrogen)に従ってトランスフェクトした。そうでないように示さない限り、本発明者らは、200 ngの核酸を0.5μlのLipofectamineと共にトランスフェクトした。24時間後、上清を酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)によるサイトカイン分泌の解析用に回収し、細胞をフローサイトメトリー解析用に採取した。
培養上清および血清中の マウスIFN-γおよびIL-12p40の濃度を、ELISAで製造元の取扱説明書(BD PharMingen, San Diego, CA)に従って決定した。マウスIFN-αは、マウスIFN-α ELISAキット(PBL Biomedical Laboratories, PBL #42100-2, New Brunswick, NJ)を用いて解析した。幾つかの実験については、マウスIFN-αを以下のプロトコルに従って測定した:モノクローナルラット抗マウスIFN-α(クローンRMMA-1)を捕捉抗体として、検出用のポリクローナルウサギ抗マウスIFN-α血清(両方ともPBL Biomedical Laboratories)をHRPコンジュゲートされたロバ抗ウサギIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)と共に二次試薬として用いた。マウスrIFN-α(PBL Biomedical Laboratories)を標準品(1 U/mlのIFN-α濃度)として用いた。
5'三リン酸siRNAによる一過性のIFN-β活性化をモニタリングするために、マウスB16細胞を24ウェルプレート中に播種した。70%のコンフルエンシーで、200 ngのレポータープラスミド(pIFNβ-luc DAM/DCM)、200 ngの(ウミシイタケルシフェラーゼを発現する)標準化プラスミド、および表示された発現プラスミドが合計で1.5 μg DNA/ウェルになるように、PEIを用いてB16細胞にトランスフェクトした。高分子量(25 kDa)ポリエチレンイミン(PEI; Sigma, 40.872-7)を1.5:1のPEI:DNA比で用いて、B16細胞にトランスフェクトした。幾つかの実験について、本発明者らは、表示された発現プラスミドと共に合成siRNAを共トランスフェクションするためにLipofectamine 2000(Invitrogen)を製造元のプロトコルに従って用いた。トランスフェクションの16時間後、培養培地を吸引し、細胞を0.5 ml PBSで1回洗浄し、次に異なるリガンドで表示された時点で刺激した。上清を回収し、1OmM EDTAを含む0.5ml PBSで細胞をもう一度洗浄した。その後、細胞を100μlのPromega溶解緩衝剤(Promega, #1531)で溶解した。20 μlの各試料を20 μlのLuciferase Detection Reagent(Luciferase Assay Kit, Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany)と混合し、マイクロプレートルミノメーター(LUMIstar, BMGLabtechnologies)でルシフェラーゼ活性について解析した。ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定するために、20 μlライセートを20 μlのウミシイタケ基質(コエレンテラジン (Promega, #2001))とインキュベートした。ルシフェラーゼ活性値を同じ抽出物のウミシイタケ活性に対して標準化した。
IFN-β-Lucレポータープラスミド、野生型pPME-myc NS3-4A(NS3-4A)、pPME-myc MutNS3- 4A(NS3-4A*;不活性化するセリン139からAlaへの突然変異を含む)は、T. ManiatisおよびJ. Chenにより親切に提供された。RIG-I全長、RIG-IC、RIG-I K270A、および空の対照ベクターは、T. Fujita(Yoneyama M et al. (2004) Nat. Immunol. 5(7):730-737)により親切に提供された。ウミシイタケルシフェラーゼトランスフェクション効率化ベクター(phRLTK)は、Promegaから購入した。
ウェスタンブロッティング用に、試料をSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜(Amersham-Biosciences, UK)にセミドライ式電気ブロッティングで移した。一次抗体として、ポリクローナルラット抗RIG-1抗体(Kremer博士の親切な贈与品)、ポリクローナルウサギ抗Bcl-2(Santa Cruz, sc-7382)およびウサギ抗カスパーゼ-1(Santa Cruz, sc-7148)抗体を用いた。二次抗体として、ペルオキシダーゼがコンジュゲートされた抗マウスまたは抗ウサギ抗体(Amersham-Biosciences)を用いた。結合した抗体は、増強された化学発光システム(ECL)によって製造元のプロトコル(Amersham-Biosciences)に従って可視化した。
表示した時点で、表面抗原染色を先に記載したように行なった。B220、CD11c、NK1.1、CD4、CD8、CD69、CD86に対する蛍光標識モノクローナル抗体(mAb)および適当なアイソタイプ対照抗体をBD Pharmingen(Heidelberg, Germany)から購入した。フローサイトメトリーのデータは、2つのレーザー(488-および635-nmの波長で励起)を搭載したBecton Dickinson FACSCaliburで取得した。データは、Cellquestソフトウェア(Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)を用いて解析した。転移性の肺におけるB16メラノーマ細胞のBcl-2発現を明らかにするために、IFNAR-欠損マウスの肺転移から1細胞懸濁を調製した。2% PFAおよびサポニンを用いて細胞を固定および透過処理し、コンジュゲートされていない特異的なウサギTRP-1 Ab(Thomas Tutingの親切な寄贈品)と20分間氷上でインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ヤギ抗ウサギFITC Ab(Santa Cruz; sc-2012)と20分間インキュベートした。再度、細胞を洗浄し、PEコンジュゲートされたBcl-2-Ab(Santa Cruz, sc-7382-PE)を細胞に添加した。インキュベーションの20分後、細胞をフローサイトメトリーで解析した。
FITC標識アネキシン-V(Roche)およびヨウ化プロピジウム(BD Biosciences)で染色することにより、付着細胞および上清細胞を解析した。アネキシン-V染色は、製造元の取扱説明書に従って行なった。ヨウ化プロピジウムを0.5 mg/mlの最終濃度まで添加し、フローサイトメトリーおよびCellQuestソフトウェア(Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)によって細胞を解析した。
jetPEI(Biomol)と複合体化したFITC標識RNA(100 μg)をC57BL/6マウスに静注した。6時間後、マウスを屠殺し、RNA複合体の取込みについて所望の臓器を解析した。簡潔には、転移性の肺または罹患していない肺の切片を顕微鏡スライドに移し、アセトン中で10分間固定した。TOPRO-3(Molecular Probes)を用いて、核の対比染色を行なった。洗浄工程をTris緩衝化生理食塩水中で行ない、細胞をVectarshield Mounting Medium(Vector Laboratories)中で標本にした。その後、488nm-アルゴンおよび633nm-ヘリウム-ネオンレーザーを搭載したZeiss LSM510共焦点顕微鏡(Carl Zeiss, Germany)を用いて、細胞を解析した。
RIG-I、MDA-5、TLR7の欠損マウスを記載された通りに樹立した(Kato et al. (2006) Nature 441 :101 ; Akira S et al. (2004) C R Biol. 327(6):581-9)。IFNAR欠損マウスは、Ulrich Kalinkeの親切な寄贈品であった。メスのC57BL/6マウスをHarlan-Winkelmann(Borchen, Germany)から購入した。マウスは、実験の開始時に6〜12週齢であった。動物研究は、地域の規制当局(Regierung von Oberbayern, Munich, Germany)によって承認された。
インビボ実験のために、本発明者らは、製造元のプロトコルに従って事前にjetPEIと複合体化した核酸を含む200 μlをC57BL/6マウスに注射した。簡潔には、10 μlのin vivo jetPEIを50 μgの核酸と10/1のN:P比で5% ブドウ糖溶液中で混合し、15分間インキュベートした。その後、複合体を眼窩後静脈中に注射した。そうでないように示さない限り、血清は6時間後に採集した。表示された時点での尾の切り落としによって全血を得た。30分間37℃での凝固およびその後の遠心分離によって全血から血清を調製し、-20℃で保存した。サイトカインレベルはELISAで決定した。
肺転移の誘導のために、本発明者らは、4x105 B16メラノーマ細胞を表示されたマウスの尾静脈に注射した。3日目、6日目、および9日目に、本発明者らは、記載したような事前にjetPEIと複合体化した核酸(各々50 μg)を含む200 μlをマウスに注射した。その後、複合体を眼窩後静脈中に注射した。刺激の14日後、肺の表面上の肉眼で見えるメラノーマ転移の数を、解剖用の顕微鏡を援用して数えるか、または大きい腫瘍量の場合には、肺の重さを決定した。NK細胞およびCD8 T細胞の枯渇を、記載された通りに行なった{Adam, 2005 #49; Mocikat, 2003 #50}。簡潔には、腫瘍刺激の4日前(1 mg)、ならびに2日後(0.2 mg)および14日後(0.1 mg)に、TMβ1 mAbを腹腔内に与えた。CD8 T細胞を中和するために、腫瘍播種の1日前(0.5 mg)および4日前(0.1 mg)、ならびに4日後(0.1 mg)および14日後(0.1 mg)に、mAb RmCD8-2を腹腔内注射した。実験は、4〜5匹のマウスの群で行ない、2〜4回繰り返した。
マウスを屠殺する時に、肺の試料を得た。組織標本を完全エタノール中で固定し、パラフィンに包埋した。アポトーシスは、トランスフェラーゼを介するdUTPニックエンド標識(TUNEL)法によって製造元の取扱説明書(Boehringer Roche, Mannheim, Germany)に従って検出した。簡潔には、脱パラフィン化しかつ再水和した切片を、1xテーリング緩衝剤、1 mM CoCl_2、1 μlの10x DIG DNA標識混合液、および200単位のターミナルトランスフェラーゼを含むテーリング混合液(50 μlの総容量まで再蒸留水を添加)と1時間37℃でインキュベートした。tris緩衝化生理食塩水中で洗浄した後、切片をアルカリホスファターゼがコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体(10% 胎仔ウシ血清中で1:250に希釈)と1時間室温でインキュベートした。ニトロブルーテトラゾリウム/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸で反応を可視化した。
ヒト免疫系におけるIFN-α産生は、大部分はPDCに限定されていると考えられている。ヒト初代単球におけるIFN-α産生は、これまで報告されていない。以前の研究で示されたように(V. Hornung et al., J Immunol 168, 4531 (May 1, 2002); I. B. Bekeredjian-Ding et al., J Immunol 174, 4043 (Apr 1, 2005))、単球はTLR2、TLR4、TLR6、およびTLR8を発現するが、TLR3、TLR7、またはTLR9を発現せず、かつTLR2/6、TLR4、TLR8リガンドに応答してIL-6を産生するが、TLR3、TLR7、またはTLR9リガンドに応答してIL-6を産生しない(I. B. Bekeredjian-Ding et al., J Immunol 174, 4043 (Apr 1, 2005))。単球は、その両方ともPDCでIFN-αを誘導する、CpG-A ODN 2216(A. Krug et al., Eur J Immunol 31, 2154 (Jul, 2001))およびR848を含む検討した全てのTLRリガンドでの刺激によってIFN-αを産生しなかった(図1およびデータは示さない)。本発明者らは、RNA中のモチーフパターンまたは配列が、単球でIFN-αを誘導する長いRNA分子中に存在する可能性があるという仮説を立てた。
一般に、RNAのインビトロ転写には、バクテリオファージT7 DNA依存性RNAポリメラーゼが用いられる。合成RNAまたは真核生物mRNAとは異なり、T7 RNAポリメラーゼによって生成されるRNAは、RNA分子の5'末端にキャッピングされていない三リン酸基を含む。5'三リン酸の配列非依存的な寄与を検討するために、合成およびインビトロ転写されたバージョンの免疫刺激性ssRNAオリゴヌクレオチド9.2s(isRNA9.2s、19ヌクレオチド)によるIFN-α誘導を比較した。isRNA9.2sは、以前の研究でPDCにおけるIFN-α産生の強力な刺激であると同定された(V. Hornung et al., Nat Med 11, 263 (Mar, 2005))。
真核細胞では、7'メチルグアノシンが、キャッピングと呼ばれる過程によって新生mRNA転写物の5'三リン酸に付着する。キャッピングは、ヌクレアーゼに対する真核生物RNAの安定性を向上させかつリボソームタンパク質のmRNAへの結合を増強する。
TLRのファミリーの中で、TLR3、TLR7、TLR8、およびTLR9は、核酸を検出することが知られている。多くの研究によって、一本鎖RNAが、両方ともエンドソーム膜にある、TLR7およびTLR8によって認識されることが示唆されている。CpG-DNAと同様に、TLR7/8による一本鎖RNAの認識は、エンドソームの成熟を阻害する、クロロキンによって遮断することができる。本発明者らは、PBMCにおいて、増加濃度のクロロキンはCpG-AによるIFN-α誘導を阻害するが、5'三リン酸RNAによるIFN-α誘導を阻害せず(図12A);さらに、クロロキンが、単離された単球における5'三リン酸RNA誘導性のIFN-α産生に影響を及ぼさない(図12B)ことを見出した。CpG-Aは、TLR9を欠くためにクロロキンがあってもなくても単球において不活性である(図12B)。
以前の研究で、本発明者らは、TLR7を介する合成の免疫刺激性RNAの認識は、エンドソーム送達を可能にしかつヌクレアーゼ分解に対する保護を付与するカチオン性ポリマーとの複合体化を必要とするが、細胞質へのRNAのトランスフェクションを必要としないことを見出した。合成isRNAとは対照的に、5'三リン酸RNAは、カチオン性脂質によって細胞質中にトランスフェクトされた場合にのみ単球におけるIFN-αを誘導したのに対し、カチオン性ペプチドとの複合体化は十分ではなかった(データは示さない)。これらの観察と一致して、5'三リン酸RNAを介するIFN-α誘導は、エンドソームの成熟もTLR7(図11)もTLR3(データは示さない)も必要としなかった。これらの結果により、5'三リン酸RNAの受容体は、細胞質にあり、エンドソーム区画にはないことが示された。
特徴として、全てのNSVは、プライマー非依存的な様式でのウイルスRNA複製を開始し、ウイルスゲノム(vRNA)またはアンチゲノム(cRNA)の5'末端の三リン酸部分の存在を結果的にもたらす。その上、例えばパラミクソウイルスおよびラブドウイルスを含む、セグメント化されていないゲノムを持つNSV(モノネガウイルス目)の場合、RNA転写によって、vRNAの3'末端が鋳型となる、リーダーRNAとして知られる、大量の短い(およそ60 nt)5'三リン酸RNAが生み出される(S. P. Whelan, et al. Current topics in microbiology and immunology 283, 61 (2004))。RIG-Iによるウイルス感染の認識におけるNSV 5'三リン酸RNAの重要性を評価するために、プロトタイプラブドウイルスである、狂犬病ウイルス(RV)を用いた。
RIG-Iが5'三リン酸RNAの認識に必要とされるという事実は、RIG-Iが5'三リン酸RNAの受容体であるという何の証拠ももたらさない。5'三リン酸RNAの受容体を同定するために、インビトロ結合アッセイを実行し、5'三リン酸RNAがRIG-I、またはRIG-IのRNA結合ドメインであるRIG-ICをプルダウンする能力を検討した。
古典的なインビトロ転写系は、T7 RNAポリメラーゼコンセンサスプロモーターを利用している(J. J. Dunn, F. W. Studier, J Mol Biol 166, 477 (Jun 5, 1983))。このプロモーターの下での転写は、GTPによって開始されかつ効率的な転写のためにRNAの5'末端に2つまたはそれより多くの連続するグアノシンを通常必要とする。それにもかかわらず、5' ATPで始まるT7 RNAポリメラーゼ用のプロモーター系を用いることが可能である(F. Huang et al. Biochemistry 39, 15548 (Dec 19, 2000))。この系を用いて、5'三リン酸RNAオリゴヌクレオチドのI型IFN誘導活性における最初の5'グアノシンの役割を評価した。それが5'アデノシンで始まるので、RNA9.2s(RNA9.2s-0A)を参照オリゴヌクレオチドとして用いた。
配列(5'→3')の2番目、3番目、および4番目の位置の全てのあり得る塩基順列(A、C、G、およびU)を持つアデノシンで始まる三リン酸RNAオリゴヌクレオチド(表2)をインビトロ転写によって生成した。その後、3人の独立のドナー由来の単球を単離し、それぞれのRNAオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。トランスフェクション36時間後、上清をIFN-α産生について解析した。全てのオリゴヌクレオチドの得られたIFN-α誘導レベルを、全てのオリゴヌクレオチドの平均の誘導レベル(= 100%)に対して標準化した。3人全てのドナーの得られた標準化された誘導レベルを平均値 ± SEMとしてまとめた(図13)。
が含まれる。
図9で示した通り、トータルの細菌RNAは単球からIFN-α誘導活性を誘導することができる。
本発明者らは、マウスBcl-2を標的化する幾つかの配列を同定し、その後マウスBcl-2 mRNAの異なる部分を標的化する3つの合成siRNA(抗Bcl-2.1、抗Bcl-2.2、抗Bcl-2.3)を生成した(全ての化学合成RNAオリゴヌクレオチドの詳細なリストについては表3を参照されたい)。
3p-RNAへの長時間にわたる曝露の後、B16細胞の顕微鏡による評価により、対照siRNAまたはOH-2.2をトランスフェクトしたB16細胞と比較して細胞数の低下が明らかにされた。本発明者らは、3p-2.2のトランスフェクションによる細胞死の増加が、生存しているB16細胞の低下に寄与しているという仮説を立てた。
最近の研究によって、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、センダイウイルス(SeV)、および水疱性口内炎ウイルス(VSV)を含む、幾つかのRNAウイルスへの曝露による従来型のDC(cDC)におけるIFN-αおよびIFN-β両方の誘導は、RIG-Iによって調節されていることが示された(Kato H et al. (2005) Immunity 23(1): 19-28)。対照的に、形質細胞様DC(pDC)は、NDVなどのウイルスの認識にTLR7を優先的に用いるが、RIG-Iを用いることなく、I型IFNの誘導を引き起こす。
インビボでの3p-2.2を介する応答の生物学的関連性についての洞察を得るために、本発明者らは、jetPEI(商標)と複合体化した3p-2.2でマウスを刺激し、IFN-α、IL-12p40、およびIFN-γを含む血清サイトカインを測定した(図18a、b、c)。6時間後、3p-2.2は、CpG 1826またはOH-2.2よりも著しく高いレベルのIFN-αを誘導した(図18a;3p-2.2とOH-2.2、CpG 1826、jetPEI(商標)、およびPBSの間でP**<0.01)。3p-2.2およびOH-2.2の両方とも、著しいIL-12p40産生を誘導した(図18b;3p-2.2とjetPEI(商標)およびPBSの間でP**<0.01)。さらに、3p-2.2は、高レベルのIFN-γ産生をインビボで誘導した(図18c;3p-2.2とOH-2.2の間でP**<0.01;3p-2.2とjetPEI(商標)およびPBSの間でP*<0.05)。
本発明者らは、B16メラノーマ肺転移に対する3p-2.2の抗腫瘍活性をインビボで評価した。5匹のマウスの群にまずB16メラノーマ細胞を静脈内に投与し、その後図21aに図示したスケジュールに従ってポリA、OH-2.2、3p-GC、または3p-2.2で処理した。jetPEI(商標)と複合体化したポリA(非刺激性の19-mer RNA分子;表3)は、陰性対照の役割を果たした。jetPEI(商標)と複合体化したCpG 1826は、陽性対照の役割を果たした。14日目に、マウスを屠殺し、肺を摘出した。その後、解剖用の顕微鏡を用いて肺転移を数えるか、または大きい腫瘍量の場合には、重さを量って腫瘍質量を決定した。
B16メラノーマ転移の縮小の原因となるメカニズムをインビボでさらに調べるために、本発明者らは、野生型、TLR7、およびIFNAR(I型IFN受容体)欠損マウスにB16細胞を静脈内に投与し、これらのマウスをポリA、3p-2.2、またはポリ(I:C)で処理した。3p-2.2によるB16メラノーマ転移の縮小が、対照の野生型マウスと匹敵する程度にTLR7欠損マウスで観察された(図22a、b)。対照的に、3p-2.2の抗腫瘍活性は、IFNAR欠損マウスで減少しており(図22c)、3p-2.2を介する抗腫瘍応答におけるI型IFNの著しい関与が示唆された。
ここで本発明者らは、24ヌクレオチド長の3p-siRNA(表5)が、HBV特異的な複製マーカーの低下をインビトロおよびインビボでもたらす、RIG-Iによる認識を介した抗ウイルスIFN-α応答を誘導したことを示している。
イノシンは、ヒポキサンチンおよびリボースから構成されている、ヌクレオシドである。ある種の状況下で、イノシンは、アデノシンの代わりにRNA中に存在する。ADAR(RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ)は、アデノシンを脱アミノ化してイノシンにする(Palladino MJ et al. (2000) Cell 102(4): 437-49)。ADARの重要な機能は、mRNAの転写後修飾である(Gerber AP and Keller W (2001) Trends Biochem Sci 26(6): 376-84)。さらに細胞質で、dsRNA中のアデノシンは、ADARによって脱アミノ化されて、イノシンになる(Bass BL and Weintraub H (1988) Cell 55(6): 1089-98)。ウイルスdsRNAの場合、アデニンはイノシンに交換され、I:UおよびI:C塩基対形成を結果的に生じる可能性がある。
インビトロ転写で生成されたRNAにおいて、3'末端の長さおよび塩基組成は化学的に規定されていない。特に、3'末端は折り返され、ポリメラーゼが部分的に二本鎖のRNAを生成するのを可能にする場合がある。5'三リン酸RNAのIFN-α誘導活性に対する3'末端の寄与を解析しかつ二本鎖RNAの寄与を正確に規定するために、合成5'三リン酸RNA(表6)を記載された通りに調製した(Ludwig J (1981) Acta Biochim Biophys Acad Sci Hung. 16:131-3)。そのような合成5'三リン酸RNAを用いることによって、二本鎖形成を結果的に生じる3'末端の制御されない伸張を排除する。
HepG2-H1.3細胞および初代ヒト肝細胞にHBVを100のMOIで感染させるかまたはモックを感染させる。感染の3日後に、5'三リン酸を持ちかつHBV1.1、1.2、1.3、およびHCV対照のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列(表5)を有する化学合成された一本鎖RNAを、HBV感染細胞およびモック感染細胞にトランスフェクトする。IFN-αの誘導をELISAで決定しかつHBV感染の程度を、トランスフェクション6日後のHBV感染細胞の数、HBeAgレベル、およびHBsAgレベルによって決定する。
Claims (31)
- 脊椎動物におけるウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、腫瘍、多発性硬化症、アレルギー、自己免疫疾患、免疫抑制、および免疫不全からなる群より選択される疾患および/または障害を予防および/または処置するためのオリゴヌクレオチドまたはその前駆体であって、
オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも6つのリボヌクレオチドを5'末端に含み、
オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、およびより好ましくは少なくとも3つのリン酸基を5'末端に含み、かつリン酸基がキャップまたは修飾をいずれも含まず、
オリゴヌクレオチドが、少なくとも12、好ましくは少なくとも18、およびより好ましくは少なくとも20、さらにより好ましくは少なくとも21ヌクレオチド長である、
オリゴヌクレオチドまたはその前駆体。 - オリゴヌクレオチドが二本鎖構造を形成することができる配列をいずれも含まない一本鎖であり、かつオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が疾患または障害関連のRNAと相補的である、請求項1記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
- 5'のキャッピングされていないリン酸基のうちの少なくとも1つが三リン酸に含まれない、請求項1または2記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
- 少なくとも1つのイノシン(I)を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
- オリゴヌクレオチドの5'末端の最初のリボヌクレオチドが、A、C、Uより選択されるリボヌクレオチド、好ましくはAおよびCより選択されるリボヌクレオチド、および最も好ましくはAを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
- オリゴヌクレオチドが、シュードウリジン、2-チオウリジン、2'-フルオリン-dNTP、2'-O-メチル化NTP、特に2'-フルオリン-dCTP、2'-フルオリン-dUTP、2'-O-メチル化CTP、2'-O-メチル化UTPなどの修飾を含まない、請求項1〜6のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
- オリゴヌクレオチドまたはその前駆体が、
からなる群より選択される4ヌクレオチド(4 mer)モチーフのうちの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、さらにより好ましくは少なくとも4つ、さらにより好ましくは少なくとも5つ、および最も好ましくは少なくとも6つを含み、
モチーフのヌクレオチド配列が5'→3'であり、かつ
オリゴヌクレオチドまたはその前駆体が、12〜64、好ましくは12〜50、より好ましくは14〜40、さらにより好ましくは16〜36、および最も好ましくは18〜30ヌクレオチド長である、
請求項1〜8のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。 - 複合体形成剤をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
- ウイルスベクターに含まれる、請求項1〜9のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
- 免疫賦活剤、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗腫瘍剤、および遺伝子サイレンシング剤より選択される少なくとも1つの薬剤、ならびに/または抗腫瘍治療と組み合わせて使用するための、請求項1〜11のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
- レチノイン酸および/またはI型IFNと組み合わせて使用するための、請求項12記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
- 脊椎動物において腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、抗ウイルス応答を誘導し、抗細菌応答を誘導し、かつ/または抗腫瘍応答を誘導するための、請求項1〜13のいずれか一項で定義した通りのオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
- 抗ウイルス応答、抗細菌応答、および/または抗腫瘍応答が、I型IFN産生、IL-18産生、および/またはIL-1β産生を含む、請求項14記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体。
- 脊椎動物において少なくとも1つの抗原に対する免疫応答を誘導するための、請求項1〜13のいずれか一項で定義した通りのオリゴヌクレオチドまたはその前駆体および少なくとも1つの抗原。
- オリゴヌクレオチドまたはその前駆体が、少なくとも1つの抗原と共有結合によって連結している、請求項16記載のオリゴヌクレオチドまたはその前駆体および少なくとも1つの抗原。
- 脊椎動物におけるウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、腫瘍、多発性硬化症、アレルギー、自己免疫疾患、免疫抑制、および免疫不全からなる群より選択される疾患および/または障害を予防および/または処置するための医薬の調製用の、請求項1〜13のいずれか一項で定義した通りのオリゴヌクレオチドまたはその前駆体の使用。
- 脊椎動物において腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、抗ウイルス応答を誘導し、抗細菌応答を誘導し、かつ/または抗腫瘍応答を誘導するための医薬の調製用の、請求項1〜13のいずれか一項で定義した通りのオリゴヌクレオチドまたはその前駆体の使用。
- 抗ウイルス応答、抗細菌応答、および/または抗腫瘍応答が、I型IFN産生、IL-18産生、および/またはIL-1β産生を含む、請求項19記載の使用。
- 請求項1〜13のいずれか一項で定義した通りのオリゴヌクレオチドまたはその前駆体を含む、薬学的組成物。
- 請求項1〜13のいずれか一項で定義した通りのオリゴヌクレオチドまたはその前駆体と、免疫賦活剤、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗腫瘍剤、および遺伝子サイレンシング剤より選択される少なくとも1つの薬剤とを含む複合調製物であって、オリゴヌクレオチドまたはその前駆体および少なくとも1つの薬剤が同時投与、分離投与、または連続投与用である、複合調製物。
- 薬剤がレチノイン酸およびI型IFNの少なくとも1つである、請求項22記載の複合調製物。
- 請求項21記載の薬学的組成物または請求項22もしくは23記載の複合調製物と、使用のための取扱説明書とを含む、薬学的パッケージ。
- (a)請求項1〜9のいずれか一項で定義した通りのオリゴヌクレオチドまたはその前駆体を複合体形成剤と混合する工程;ならびに
(b)RIG-Iおよび/またはインフラマソーム(inflammasome)の構成成分を発現する細胞を(a)の混合物と接触させる工程
を含む、細胞における抗ウイルス応答および/または抗細菌応答および/または抗腫瘍応答を刺激するためのインビトロ法。 - オリゴヌクレオチドが一本鎖であり、かつ細胞が該オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むmRNAを含む、請求項25記載の方法。
- (a)少なくとも1つのキャッピングされていない5'一リン酸、二リン酸、および/または三リン酸をオリゴヌクレオチドに導入する工程;ならびに
(b)細胞内で二本鎖構造を形成することができるヌクレオチド配列をオリゴヌクレオチドに導入する工程
を含む、抗ウイルス応答および/または抗細菌応答および/または抗腫瘍応答を誘導することができるオリゴヌクレオチドを調製するための方法。 - (a)オリゴヌクレオチドから全ての5'リン酸基を排除する工程;ならびに/または
(b)オリゴヌクレオチドの全ての5'一リン酸、二リン酸、および三リン酸をキャッピングする工程;ならびに/または
(c)細胞内で二本鎖構造を形成することができる任意のヌクレオチド配列をオリゴヌクレオチドから排除する工程;ならびに/または
(d)シュードウリジン、2-チオウリジン、2'-フルオリン-dNTP、2'-O-メチル化NTP、好ましくは2'-フルオリン-dCTP、2'-フルオリン-dUTP、2'-O-メチル化CTP、2'-O-メチル化UTPなどの修飾されたヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに組み入れる工程
を含む、抗ウイルス応答誘導活性および抗細菌応答誘導活性を持たないオリゴヌクレオチドを調製するための方法。 - 抗ウイルス応答、抗細菌応答、および/または抗腫瘍応答が、I型IFN産生、IL-18産生、および/またはIL-1β産生を含む、請求項25〜29のいずれか記載の方法。
- 脊椎動物におけるウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、腫瘍、多発性硬化症、アレルギー、自己免疫疾患、免疫抑制、および免疫不全からなる群より選択される疾患および/または障害を予防および/または処置するための細菌RNA。
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