KR20050026384A - ＲＮＡｉ효과를 가지는 스템 루프 형 ＲＮＡ 분자 발현 시스템 - Google Patents

ＲＮＡｉ효과를 가지는 스템 루프 형 ＲＮＡ 분자 발현 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명자 등은 스템 루프 형 RNA 분자를 코드하는 DNA로부터 tRNA 프로모터를 이용하여 당해 RNA 분자를 생성시킴으로써 당해 RNA 분자를 효율적으로 세포질로 이행시켜 RNAi 효과를 발휘시키는 것이 가능함을 발견하였다. 또한, 스템 루프 형 RNA 분자를 코드하는 DNA에 세포질 이행 시그널 서열을 도입함에 의해서도 RNAi 효과를 효율적으로 발휘시키는 것이 가능하다. 또한, polII계의 프로모터를 이용해서도 전사 산물을 세포질로 이행시켜 RNAi 효과를 효율적으로 발휘시키는 것이 가능하다. 이 경우, Dicer 유전자를 동시 발현시킴으로써 세포독성을 경감할 수 있다. 나아가, dsRNA 또는 스템 루프 형 RNA 분자를 Dicer 단백질로 처리함으로써 효과적인 dsRNA를 제작할 수 있다. 이들 스템 루프 형 RNA 분자 발현 시스템을 이용함으로써 간단하게 희망하는 유전자가 넉아웃된 세포를 제작할 수 있다.

Description

ＲＮＡｉ효과를 가지는 스템 루프 형 ＲＮＡ 분자 발현 시스템{Expression systems for stem loop RNA molecule having RNAi effect}
본 발명은 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 RNA 분자 발현 시스템 및, 이것을 이용한 넉다운 세포의 생산 방법 등에 관한 것이다.
RNA 간섭(RNA interference, 이하 「RNAi」라고 약칭한다)은 표적 유전자의 mRNA와 상동 서열인 센스 RNA와 이것과 상보적인 서열인 안티센스 RNA로 구성되는 이중 사슬 RNA(이하, 「dsRNA」라고 약칭한다)를 세포 등에 도입하는 것으로써, 표적 유전자 mRNA의 파괴를 유도하여 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상이다.
이와 같이 RNAi는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에, 종래의 번잡하고 효율 낮은 상동 재조합에 의한 유전자 파괴 방법을 대신하는, 간단하고 쉬운 유전자 넉아웃 방법으로서 또는, 유전자 치료(gene therapy)에의 응용 가능한 방법으로서 주목을 끌고 있다. 상기 RNAi는 당초 선충(nematode)에서 발견되었지만(Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811, (1998)) 현재는 선충 뿐만 아니라, 식물, 선형 동물, 초파리(Drosophila), 원생동물 등 여러 생물에서 관찰되고 있다(Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363 (1999); Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001); Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001); Hammond, S. M., Caudy, A. A. & Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2, 110-119 (2001); Zamore, P. D. RNA interference: listening to the sound of silence. Nat Struct Biol. 8, 746-750 (2001)). 이들 생물에서는 실제로 외래에서 dsRNA를 도입함으로써 표적 유전자의 발현이 억제되는 것이 확인되고 나아가 넉아웃 개체를 생산하는 방법으로서도 이용되고 있다.
인비트로에서 dsRNA는 초파리의 초기 배의 용해물 또는 배양 초파리 S2 세포의 추출물에서 절단을 위하여 mRNA를 표적으로 하는 것이 알려져 있다(Tuschl T., et al., Genes Dev. 13: 3191-3197, 1999; Hammond S. M., et al., Nature 404: 293-296, 2000; Zamore P. et al., Cell 101: 25-33, 2000). 인비트로에서의 RNAi의 반응은 ATP(Hammond S. M. et al., Nature 404: 293-296, 2000; Zamore P., et al., Cell 101: 25-33, 2000)를 필요로 한다.
합성 RNA 이중 사슬에 의한 최근의 연구에 의하여 각각의 siRNA 이중 사슬이 표적 RNA를 절단하는 것이 증명되었다(Elbashir S. M. et al., Genes Dev. 15: 188-200, 2001). siRNA 이중 사슬 내의 2 뉴클레오티드 또는 3 뉴클레오티드의 돌출 3' 말단이 효율적인 표적 절단에 있어 필요하다는 것이 밝혀졌다(Elbashir S. M. et al., Genes Dev. 15: 188-200, 2001). 그러한 3' 돌출 말단은, RNase III 절단 반응의 산물에 특징적이고, 배양 초파리 S2 세포에 있어서, dsRNA의 siRNA로의 절단은, 다이서(dicer)로서 알려진 멀티도메인 RNase III 효소를 필요로 한다(Bernstein E. et al., Nature 409: 363-366, 2001). siRNA는 초파리에서 동정되어 RISC로 불리는 다성분 뉴클레아제와 회합하여 mRNA의 서열 특이적 분해에 대해서 이 효소를 유도하는 것이라고 생각된다(Hammond S. M. et al., Nature 404: 293-296, 2000; Bernstein E. et al., Nature 409: 363-366, 2001; Hammond S. M. et al., Science 293: 1146-1150, 2001).
RNAi는 표적 유전자를 비활성화 하는 방법을 제공하여 이와 같이 C. elegance, 초파리 및 식물에 있어서의 유전자 기능을 연구하기 위한 강력한 툴을 제공한다. 유전자 발현의 특이적 저해는 또한, 동물 및 식물에 있어서의 dsRNA의 안정적인 발현 및 유도형 발현에 의하여 일어날 수 있다(Hammond, S. M., Caudy, A. A. & Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2, 110-119 (2001); Kennerdell and Carthew Nature Biotechnol. 18: 896-898, 2000; Tavernarakis N. et al., Nature Genetics 24: 180-183, (2000)). 마우스배 암 EC 세포 및 배간(ES) 세포에서는 dsRNA에 의한 유전자의 비활성화는 성공했지만(Billy E. et al., PNAS 98: 14428-14433 (2001); Paddison P. J. et al., PNAS 99: 1443-1448 (2002)), 배양 포유류 세포에서의 긴 dsRNA에 의한 RNAi의 유도는 그다지 성공하지 못했다. 이러한 실패는 긴 dsRNA(＞30 염기쌍)(Stark G. R. et al., Annu. Rev. Biochem. 67: 227-264 (1998))에 의해 활성화되는 인터페론(IFN) 방어 경로의 일부를 형성하는 2 개의 잠재형 효소의 작용에 의하여 용이하게 설명된다. 그 하나는 2'-5'-올리고아데닐레이트(2-5 A) 신타제이며, 이것은 dsRNA에 의해 활성화되어 RNase L로 불리는 서열 비특이적 RNase의 활성화에 있어 필요한 2-5 A의 합성을 증가시킨다(Silverman R. H. in Ribonucleases: Structures and Functions, eds. D'Alessio, G. and Riordan J. F. (Academic, New York) pp. 515-551). 다른 하나는 단백질 키나제 PKR이며 그 활성형은 번역 인자 진핵세포 개시 인자(eIF2)를 인산화하여 단백질 합성의 전반적인 저해와 세포사에 이르게 한다(Clemens M. J. and Elia A., J. Interferon Cytokine Res. 17: 503-524 (1997)).
최근 21 뉴클레오티드의 siRNA 이중 사슬이 몇몇 포유류 세포에 있어 내인성 유전자의 발현을 특이적으로 억제하는 것이 보고되었다(Elbashir S. M. et al., Nature 411: 494-498 (2001)). 이 경우 21 뉴클레오티드 siRNA 이중 사슬은 IFN 방어 시스템으로부터 회피할 수 있다. 이 지견은 RNAi 또는 RNAi 관련 시스템이 포유류에 존재하는 것을 시사하였다. 실제로 rde-1, mut-7 및 다이서(dicer)와 같은 RNAi 관련 단백질의 포유류 상동체 몇 가지가 동정되어 있다(Bernstein E. et al., Nature 409: 363-366, 2001; Tabara H. et al., Cell 99: 123-132 (1999); Ketting R. F. et al., Cell 99: 133-141 (1999)). 그러나, 포유류 체세포에 있어서 RNAi의 특징 및 메카니즘은 그다지 자세하게는 알려져 있지 않다.
또한, RNAi를 이용하여 유전자 발현 억제에 의한 기능 해석이나 유전자 치료를 수행하는 것이 기대되고 있다. 유전자의 일차 서열이 거의 밝혀진 현재, 유전자의 기능을 신속히 해명하기 위해서, 계통적이고 효율적인 기능 유전자 탐색 방법의 개발이 진행되고 있다. RNAi를 이용하여 임의의 유전자의 발현을 억제하고 그 세포 혹은 개체의 표현형의 변화로부터 계통적으로 기능 유전자의 탐색이 가능하다면 신규한 기능 유전자의 해명을 보다 한층 가속화 시킬 수 있다.
도 1은 dsRNA 발현 플라스미드의 구축을 나타내는 그림이다.
(A) tRNA-dsRNA 발현용 플라스미드는 사람 tRNAVal 프로모터 서열 및 터미네이터 서열을 가진다. 마우스 U6-dsRNA 또는 사람 U6-dsRNA 발현용 플라스미드는 각각, 마우스 U6프로모터 또는 사람 U6프로모터를 가진다. 루프 1 서열(5'-GAAAA-3') 또는 루프 2 서열(mir23 루프 서열(Lagos-Quintana, M. et al. Science, 294, 853-858 (2001)):5'-CUUCCUGUCA-3'/서열 번호：30)을 k-ras 센스 사슬 서열(29bp)과 안티센스 사슬 서열(29bp)과의 사이에 삽입하였다. U6-dsRNA에 있어서의 dsRNA 및 루프 서열은 tRNA-dsRNA와 같다.
(B) dsRNA에 의해 타겟팅 되는 변이체 및 정상 k-ras mRNA의 서열. 변이체 k-ras 유전자는 점 돌연변이를 가진다(코돈 12GGT-＞GTT).
도 2는, 전구체 dsRNA 및 siRNA의 검출을 나타내는 사진이다. 전구체 dsRNA 및 siRNA의 검출은 노던블롯 분석에 의해 분석하였다. tRNA-dsRNA를 코드하는 플라스미드 혹은 U6-dsRNA를 코드하는 플라스미드를, SW480 세포에 도입하였다. 48시간 후 이러한 세포를 회수하여 세포질(C)과 핵분획(N)으로 분리하였다. 각 분획의 total RNA를 단리하여 15% 폴리아크릴 아미드겔을 이용하여 분획화 하였다.
노던블롯 분석은 본문에 기재된 바와 같이 수행하였다(레인 1, tRNA-dsRNA를 발현하는 세포의 핵 분획; 레인 2, tRNA-dsRNA를 발현하는 세포의 세포질 분획; 레인 3, mU6-dsRNA(루프 1)를 발현하는 세포의 핵분획; 레인 4, mU6-dsRNA(루프 1)를 발현하는 세포의 세포질 분획; 레인 5, hU6-dsRNA(루프 1)를 발현하는 세포의 핵 분획; 레인 6, hU6-dsRNA(루프 1) 발현하는 세포의 세포질 분획; 레인 7, mU6-dsRNA(루프 2)를 발현하는 세포의 핵 분획; 레인 8, mU6-dsRNA(루프 2)를 발현하는 세포의 세포질 분획; 레인 9, hU6-dsRNA(루프 2)를 발현하는 세포의 핵 분획; 레인 10, hU6-dsRNA(루프 2)를 발현하는 세포의 세포질 분획).
도 3은 dsRNA 처리에 미치는 Dicer 리보자임의 영향을 나타내는 사진이다.
(A) 폴리(A) 연결 Dicer 리보자임(Dicer-RzA100) 발현 세포에 있어서의 dicer 유전자의 발현 레벨을 나타낸다. dicer mRNA는 dicer 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 RT-PCR에 의해 검출하였다(실시예 3 참조). GADPH는 내인성 대조군이다.
(B)　Dicer-RzA100 발현 세포에 있어서의 전구체 dsRNA 및 siRNA의 검출. (레인 1, tRNA-dsRNA 및 Dicer-RzA100를 발현하는 세포의 핵 분획; 레인 2, tRNA-dsRNA 및 Dicer-RzA100를 발현하는 세포의 세포질 분획; 레인 3, U6-dsRNA 및 Dicer-RzA100를 발현하는 세포의 핵 분획; 레인 4, U6-dsRNA 및 Dicer-RzA100를 발현하는 세포의 세포질 분획).
도 4는 dsRNA 및 siRNA-매개 분해에 의한 변이체 k-ras mRNA의 절단을 나타내는 사진이다.
(A) tRNA-dsRNA를 포함하는 세포 추출물에 의한 변이체 k-ras mRNA의 절단. 인비트로 RNAi 에세이를 실험 기법으로서 기술하였다. (레인 1：tRNA-dsRNA와 정상 k-ras RNA를 발현하는 세포의 핵 분획(N), 레인 2：tRNA-dsRNA와 정상 k-ras mRNA를 발현하는 세포의 세포질 분획(C), 레인 3：tRNA-dsRNA와 변이체 k-ras mRNA를 발현하는 세포의 핵 분획, 레인 4：tRNA-dsRNA와 변이체 k-ras mRNA를 발현하는 세포의 세포질 분획).
(B) k-ras 지향 siRNA 및 SW480 세포 추출물에 의한 변이체 k-ras mRNA의 절단(레인 1：SW480 세포의 핵 분획과 정상 k-ras mRNA, 레인 2：SW480 세포의 세포질 분획과 정상 k-ras mRNA, 레인 3：SW480 세포의 핵 분획과 변이체 k-ras mRNA, 레인 4：SW480 세포의 세포질 분획과 변이체 k-ras mRNA).
도 5는, 인비보에서 tRNA-dsRNA에 의한 RNAi의 효율과 특이성을 나타내는 그림이다. tRNA-dsRNA 또는 U6-dsRNA를 발현하는 세포에 있어서의 K-ras 단백질 레벨을, 특이적 k-Ras 항체를 이용해 웨스턴블롯 분석에 의해 분석하였다. 변이체 k-ras 유전자는 SW480 세포에서 발현시켰다. 대조적으로, 정상 k-ras 유전자는 HeLa 세포에서 발현시켰다. 정량을 위해서 밴드의 강도를 NIH Image Analysis를 이용하여 덴시토메트리(densitometry)에 의해 분석하였다.
도 6은, tRNA-dsRNA에 의한 세포 증식의 영향을 나타내는 그림이다. 실시예의 기재와 같이 증식 속도를 측정하였다. 나타난 값은 각각의 경우에서의 3회 반복 실험결과의 평균±S.D.이다. tRNA-dsRNA 발현 SW480 세포는 야생형 SW480 세포보다 꽤 완만하게 증식하였다. 대조적으로, tRNA-dsRNA 발현 HeLa 세포에 있어서의 증식 속도는 야생형 SW480 세포의 증식 속도와 같았다.
도 7은, (A) hDicer에 의해 생성된 diced-siRNA의 검출을 나타내는 사진이다. 실시예 중에 기재한 대로, 재조합 hDicer를 대장균 내에서 합성하여 웨스턴블롯 해석에 의해 검출하였다. re-hDicer(0.5㎍)의 조제물은 SDS-PAGE(10% 폴리아크릴아미드)에 의해 분획화하여 일렉트로블롯팅에 의해 PVDF 막에 전사하였다. 다음으로 ECL 킷과 스트렙트아비딘 결합 알칼라인포스파타제에 의하여 re-hDicer를 가시화하였다. Mock：공(空) 플라스미드로 형질전환한 세포로부터의 조제물；phDicer：hDicer를 코드하는 발현 플라스미드를 감염시킨 세포로부터의 조제물.
(B) re-Dicer에 의한 siRNA의 생성을 나타내는 사진이다. 200 ㎕의 반응용 완충액 내 5 mM MgCl2를 첨가 혹은 첨가하지 않고 장쇄 dsRNA(10 ㎍)와 1 ㎍의 re-hDicer를 혼합하였다. 반응 혼합액을 37℃에서 30분간 인큐베이트 하였다. 그리고, 20 ㎕의 각 반응 혼합액을 12% 비변성 폴리아크릴 아미드겔로 전기 영동하여 분획화 하였다. 20~25 염기 길이의 siRNA를 Syber(등록상표) 그린 II로 검출하였다.
도 8은, 외래성 퓨로마이신 내성 유전자의 발현 억제를 나타내는 그림이다.
(A) 실시예에서 설명했던 대로 합성 siRNA의 표적으로서 10 개의 부위(부위 1~10)를 선택하였다. diced-siRNA를 조제하기 위해 퓨로마이신 내성 유전자의 5'말단측 영역(1-300 위치의 염기)에 대응하는 장쇄 dsRNA를 제작하여 재조합 hDicer로 처리하였다.
(B) mfold 프로그램(Provost, P.et al., Ribonuclease activity and RNA binding of recombinant human Dicer., EMBO J., 21, 5864-5874 (2002))에 의해 추정된 퓨로마이신 내성 mRNA의 2차 구조를 나타내는 그림이다.
(C) diced-siRNA가 외래성 퓨로마이신 내성 유전자의 발현에 대한 가장 유효한 서프레서(suppressor)였다(막대 그래프의 제일 우측의 바). 레닐라 유래의 루시퍼라제 리포터 유전자에 의하여 siRNA에 의한 형질전환 효율을 관찰하였다.
도 9는, 내인성 H-ras 유전자의 발현 억제를 나타내는 그림이다.
(A) 실시예에서 설명한 대로, 합성 siRNA의 표적으로서 10개의 부위(부위 1~10)를 선택하였다. diced-siRNA를 조제하기 위해 관련 ras 유전자의 서열과 상동성이 낮은 H-ras 유전자(370~570 nt)의 3' 영역에 대응하는 장쇄 dsRNA를 제작하여 재조합 hDicer로 처리하였다.
(B) mfold 프로그램에 의해 추정된 H-ras mRNA의 2차 구조를 나타내는 그림이다.
(C) diced-siRNA가 내인성 H-ras 유전자의 발현에 대한 가장 유효한 서프레서였다(막대 그래프의 제일 우측의 바). 액틴 레벨(대조군)을 참조로서 결과를 표준화 하였다.
(D) H-ras 유전자를 표적으로 하는 diced-siRNA의 관련 유전자 K-ras 및 N-ras의 발현에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. K-Ras 및 N-Ras는, 특이적 항체를 이용하여 웨스턴블롯에 의해 검출하였다. 발현 레벨은 덴시토메트리 및 NIH Image Analysis에 의해 정량하였다.
도 10은, diced-siRNA에 의한 내인성 유전자 c-jun 및 c-fos의 발현의 억제를 나타내는 사진이다. diced-siRNA의 조제를 위해서 c-jun 유전자(1~200 nt) 및 c-fos 유전자(1~200 nt)의 5' 영역에 관련하는 장쇄 dsRNA를 제조하여 재조합 hDicer로 처리하였다. c-Jun 및 c-Fos 양쪽 모두에 특이적 항체를 이용한 웨스턴블롯에 의해 검출하였다. 액틴을 내인성 대조군으로서 이용하였다. WT-Hela；야생형 HeLa 세포, c-Jun(c-Fos) diced-siRNA； c-jun 특이적(c-fos 특이적) dsRNA 로부터 생성되는 siRNA.
도 11은, shRNA 및 그 표적 erbB2 mRNA의 polIII 의존 발현용 플라스미드의 구축을 나타내는 그림이다.
(A)　polIII 프로모터의 제어 하에서 shRNA를 발현하는 shRNA 발현 플라스미드의 구축도이다. tRNA-shRNA, hU6-shRNA, 및 mU6-shRNA 발현용 플라스미드는, 각각 사람 tRNAVal 유전자로부터의 프로모터 서열, 사람 U6프로모터 서열, 마우스 U6프로모터 서열과 함께 터미네이터 서열을 포함한다. 루프 서열(5＇-GAAAA-3＇)을 erbB2 타겟의 센스 사슬 서열(29 nt)과 안티센스 사슬 서열(29 nt)과의 사이에 삽입하였다.
(B)　erbB2 mRNA에 있어서의 RNAi의 타겟팅 부위를 나타내는 그림이다. 본 발명자 등은 erbB2 mRNA 내에 tRNA-shRNA의 5개의 타겟팅 부위를 선택하였다.
(C) 전구체 dsRNA 및 siRNA의 검출을 나타내는 사진이다. 전구체 dsRNA(프레 dsRNA) 및 siRNA의 존재를 노던블롯팅에 의해 분석하였다. tRNA-shRNA, mU6-shRNA, 및 hU6-shRNA를 코드하는 플라스미드를 MCF-7 세포에 도입하였다. 48 시간 후, 세포를 수집하여 세포질(C) 분획 및 핵(N) 분획을 조제하였다. 각 분획의 총RNA를 단리하여 12% 폴리아크릴 아미드겔로 분획화 하였다. 노던블롯팅 분석은 그 밖의 기재와 같이 행하였다. 레인 1은 tRNA-shRNA를 발현하는 세포의 핵 분획, 레인 2는 tRNA-shRNA를 발현하는 세포의 세포질 분획, 레인 3은 hU6-shRNA를 발현하는 세포의 핵 분획, 레인 4는 hU6-shRNA를 발현하는 세포의 세포질 분획, 레인 5는 mU6-shRNA를 발현하는 세포의 핵 분획, 레인 6은 mU6-shRNA를 발현하는 세포의 세포질분획이다.
(D)　MCF-7 세포에 있어서의 tRNA-shRNA(tRNAi), mU6-shRNA(mU6i), 및 hU6-shRNA(hU6i)에 의한 RNAi의 효과에 대하여 나타낸 그림이다. ErbB2 단백질 레벨은, 웨스턴블롯팅 분석 및 덴시토메트리에 의한 정량에 의하여 조사하였다. ErbB2 단백질 레벨은 액틴 레벨을 이용해 표준화 하였다.
도 12는, 마우스에 있어서의 tRNA-shRNA, mU6-shRNA, 및 hU6-shRNA에 의한 RNAi의 효과를 나타내는 그림이다.
(A)　GFP mRNA 내의 E126 서열에 타겟팅 된 tRNA-shRNA, mU6-shRNA, 및 hU6-shRNA 발현 플라스미드의 구축을 나타내는 그림이다.
(B)　8 세포 다세포 동물의 초기 폐에 있어서의 tRNA-shRNA, mU6-shRNA, 및 hU6-shRNA에 의한 RNAi의 효과를 나타내는 사진이다. 세포에 자외선을 조사하였다. GFP 발광은 형광 현미경에 의해 검출되었다(오른쪽 패널). 왼쪽 패널은 위상차 현미경 사진을 나타낸다.
도 13은, 마우스에 있어서의 tRNA-shRNA, mU6-shRNA, 및 hU6-shRNA에 의한 RNAi의 효과를 나타내는 그림이다.
(A) 배반포에 있어서의 tRNA-shRNA, mU6-shRNA, 및 hU6-shRNA에 의한 RNAi의 효과를 나타내는 사진이다. 상세한 것에 대하여는 (B)를 참조.
(B) 마우스 신생자에 있어서의 tRNA-shRNA에 의한 RNAi의 효과를 나타내는 사진이다. tRNA-shRNA 트랜스제닉(transgenic) 마우스에 자외선을 조사하였다. 녹색 형광 GFP 발광은 디지털 카드 카메라(필터 없음)를 이용하여 촬영하였다.
도 14는, tRNA-shRNA의 테트라사이클린 유도(Tet 유도) 발현을 나타내는 그림이다.
(A)　tRNA-shRNA의 Tet 의존 발현의 모식도이다. Dox는 독시사이클린(doxycyclin), Tet-tTS는 테트라사이클린 리프렛서, TetO7는 7 카피의 테트라사이클린 오퍼레이터시스템.
(B)　Tet 의존 shRNA 발현계에 있어서의 전구체 dsRNA(pre dsRNA) 및 siRNA의 검출 결과를 나타내는 사진이다. 100ng/ml Dox의 존재 하 또는 비존재 하에서의 전구체 dsRNA 및 siRNA의 존재를, 노던블롯팅에 의해 분석하였다.
도 15는, tRNA-shRNA의 테트라사이클린 유도(Tet 유도) 발현을 나타내는 그림이다.
(A)　TetO7-tRNA-shRNA 발현의 독시사이클린(Dox) 용량 의존성에 대하여 나타내는 그림이다. Dox 농도를 올리는 것에 따라, 전사물 레벨이 급속히 증가하여 최대 활성화는 100 ng/ml였다.
(B)　erbB2 유전자 발현에 미치는 TetO7-tRNA-shRNA의 영향을 나타내는 그림이다. 100ng/ml Dox의 존재 하 또는 비존재 하에서의 ErbB2 단백질 레벨은, 웨스턴블롯팅 및 덴시토메트리로 정량하여 분석하였다. ErbB2 단백질 레벨은 액틴 레벨을 이용하여 표준화 하였다.
도 16 A는, 효모에 있어서의 dsRNA 발현 벡터의 구축을 모식적으로 나타낸 그림이다.
B는, dsRNA의 발현 및 siRNA의 작성을 나타내는 사진이다. dsRNA 및 siRNA의 레벨은 노던블롯 분석에 의해 검출한(레인 1은 야생형(WT) S. 폼베 주(株)에 있어서의 목크(Mock) 벡터, 레인 2는 WT S. 폼베 주에 있어서의 pSPi-LEU2, 레인 3은 ydcr1-S. 폼베 주에 있어서의 pSPi-LEU2, 레인 4는 WT S. 세레비지에 주에 있어서의 목크 벡터, 레인 5는 WT S. 세레비지에 주에 있어서의 pSCi-LacZ, 레인 6은 WT S. 폼베 주에 있어서의 목크 벡터, 레인 7은 WT S. 폼베 주에 있어서의 pSCi-LacZ). siRNA는 pSPi-LEU2 및 pSPi-LacZ를 발현하는 WT S. 폼베 주에서 검출되었다. 그러나, siRNA는 pSPi-LEU2를 발현하는 yDcrl-S. 폼베 주 및 pSCi-LacZ를 발현하는 WT S. 세레비지에 주에서 거의 검출되지 않았다.
도 17은, S. 폼베 및 S. 세레비지에에 있어서의 외인성 LacZ 유전자의 발현에 미치는 dsRNA 유도성 RNAi의 영향을 나타내는 그림이다.
　
도 18은 S. 폼베에 있어서 dsRNA 유도성 RNAi의 영향을 나타내는 사진이다.
A는, S. 폼베에 있어서의 외인성 LEU2 유전자의 발현에 미치는 dsRNA 유도성 RNAi의 영향을 나타내는 사진이다. dsRNA-LEU2를 발현하는 S. 폼베 세포의 증식을 류신 결손 배지(Leu-)에 있어 조사하였다.
B는, S. 폼베에 있어서의 내인성 PCNA 유전자의 발현에 미치는 dsRNA 유도성 RNAi의 영향을 나타내는 사진이다. PCNA 단백질 레벨은 웨스턴블롯 분석에 의해 검출되었다. Rad17는 내인성 대조군이다.
도 19는, S. 폼베에 있어서의 siRNA 유도성 RNAi의 영향 및 RdRP 활성의 검출을 나타내는 사진이다.
A는, S. 폼베에 있어서의 외인성 Zeor 유전자의 발현에 미치는 siRNA 유도성 RNAi의 영향을 나타내는 사진이다.
B는, 비오틴 풀다운 RT-PCR 분석을 이용한 S. 폼베에 있어서의 yRdp1 복합체에 의해 신장(伸長)된 안티센스 사슬 siRNA의 검출을 나타내는 그림 및 사진이다. (레인 1은 Zeor 유전자를 발현하는 WT 주, 레인 2는 20mM siRNA-Zeor로 처리된 WT 주, 레인 3은 Zeor 유전자를 발현하는 yrdp- 주에 있어서의 20mM siRNA-Zeor, 레인 4는 20mM siRNA-Zeor로 처리된 Zeor 발현 S. 폼베 주). 신장된 안티센스 사슬 siRNA는 20mM siRNA-Zeor로 처리된 Zeor 발현 S. 폼베 주에서 밖에 검출되지 않았다. Rad17는 내인성 대조군이다.
본 발명은 이러한 상황에 조응하여 그 목적은, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 신규 RNA 분자 발현 시스템, 및 당해 시스템을 이용한 넉다운 세포의 제작 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자 등은 상기 과제를 해결하기 위해서 열심히 연구를 수행하였다. 본 발명자 등은 포유류 세포에 있어서 RNAi 효과가 생기는 세포 내 부위를 검토하였다. 우선, tRNAVal 또는 U6프로모터에 의해 제어되는 2 종류의 dsRNA 발현 벡터를 구축하였다(각각「tRNA-dsRNA」, 「U6-dsRNA」). tRNAVal 프로모터로부터의 전사 산물은 핵으로부터 세포질로 효율적으로 이행하는데 대하여 U6프로모터로부터의 전사 산물은 핵내에 머무르는 것이 알려져 있다.
실험 결과, tRNA-dsRNA의 전사물은 세포질에 존재하여 리보뉴클레아제 III 복합체에 의해 효율적으로 처리되었다. 게다가 변이체 k-ras 지향(指向, directed against) tRNA-dsRNA는 타겟팅 된 mRNA를 인비트로 및 인비보에서 효율적으로 절단하였다. 즉, RNAi 효과가 발생하였음이 나타났다. 대조적으로, U6-dsRNA는 HeLa 세포에 있어서 정상적인 k-ras의 발현에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 이러한 결과는 포유류 세포에서 RNAi가 세포질에서 일어나는 것을 나타내는 것이다. 나아가 본 발명자 등은 효모에서도 RNAi 효과에 의해 효율적으로 유전자의 발현을 억제할 수 있는 것을 발견하였다.
또, 상기 실험에 사용한 dsRNA는 세포에서 스템 루프 구조를 형성하는 것이라고 생각되었다. 따라서, 상기 실험 결과는 스템 루프 구조를 가지는 RNA 분자(스템 루프 형 RNA 분자)가 세포질로 이행함에 의하여 RNAi 효과를 가져오는 것을 나타내는 것이기도 하다.
또, 스템 루프 구조를 형성하는 RNA 분자는 1 개의 산물로서 DNA로부터 전사 시키는 것이 가능하다는 특징을 가진다.
나아가 U6프로모터에서 발현된 스템 루프 형 RNA 분자는, 통상 핵에 존재하지만, 본 발명자 등에 의한 마이크로 RNA의 루프 서열을 포함한 스템 루프 형 분자는, 세포질로 수송되어 높은 효율의 RNAi 효과를 나타냈다. 그러나, 마이크로 RNA의 세포질로의 수송은 세포의 유지에 필수적이며, 마이크로 RNA의 루프 서열을 포함한 U6-스템 루프 형 RNA 분자는 도미넌트 네가티브로 작용하여 세포 독성을 나타낼 가능성도 있다. 그 점에서 본 발명자 등이 개발한 tRNA 프로모터에서 발현된 스템 루프 형 RNA 분자는 마이크로 RNA의 수송 시스템을 사용하지 않고 세포질로 수송되기 때문에 세포 독성이 없다고 생각된다.
상기와 같이 본 발명자 등은 스템 루프 형 RNA 분자를 코드하는 DNA로부터 tRNA 프로모터를 이용하여 당해 RNA 분자를 생산시킴으로써 당해 RNA 분자를 효율적으로 세포질로 이행시켜, RNAi 효과를 발휘시키는 것에 성공하여 본 발명을 완성시켰다.
또한, 본 발명자 등은 상기 RNA 분자가 세포질로 이행함으로써 RNAi 효과를 가져온다고 하는 본 발명자 등이 금번 찾아낸 지견에 근거하여 이하의 실험을 수행하였다.
즉, 재조합 사람 Dicer(hDicer)를 제작하고 이 재조합 hDicer를 이용하여 장쇄 dsRNA를 프로세싱하여 20~25 nt의 siRNA를 생성시키고, 이 siRNA를 직접 세포질에 도입하여 RNAi 효과를 검토하였다. 그 결과, 장쇄 dsRNA를 기질로서 상기 hDicer로 처리된 siRNA(diced-siRNA)는 세포질에 직접 도입하는 것에 의하여 효율적인 표적 유전자의 억제 효과를 볼 수 있었다. 재조합 hDicer로 처리된 RNA를 직접 세포에 도입하는 것으로 RNAi 효과를 발휘시키는 것은 본 발명자 등에 의하여 처음으로 달성된 것이다. 또, siRNA를 생성할 수 있는 활성을 가지는 hDicer에 대한 재조합 단백질의 제조도 본 발명자 등에 의하여 처음으로 완수할 수 있던 것이다.
본 발명자 등에 의해 개발된 스템 루프 형 RNA 분자 발현 시스템을 이용하는 것으로써 간편하게 희망하는 유전자가 넉아웃된 세포를 제작하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명은 포유류 세포에 있어서의 RNAi의 메카니즘 및 다른 유전자 기능을 연구하기 위한 강력한 툴이 되고 또한, 치료 용도로서 잠재적 유용성을 가지는 것으로 크게 기대된다.
본 발명은 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 신규 RNA 분자 발현 시스템, 및 당해 시스템을 이용한 넉다운 세포의 제작 방법에 관련된 것으로 보다 구체적으로는,
　　〔1〕　세포내에서 RNAi 효과를 가지는 스템 루프 형 RNA 분자를 코드하는 DNA와 세포질 이행 시그널 서열을 가지는 DNA로서, 표적 유전자 mRNA의 어느 영역의 센스 RNA를 코드하는 센스 코드 DNA와 당해 DNA와 상보적인 서열을 스페이서 영역을 사이에 두어 대향(對向)하도록 연결시키고 이것을 프로모터와 기능적으로 접속시킨 구조를 특징으로 하는 DNA,
　　〔2〕　상기 스페이서 영역 내에 세포질 이행 시그널 서열을 가지는,〔1〕기재의 DNA,
　　〔3〕　프로모터가, tRNA 프로모터, polII계 프로모터, polIII계 프로모터, 또는 테트라사이클린 유도형 프로모터인,〔1〕또는〔2〕기재의 DNA,
　　〔4〕　테트라사이클린 유도형 프로모터가 테트라사이클린 유도형 tRNA 프로모터인〔3〕기재의 DNA,
　　〔5〕　프로모터가, NMT1 프로모터 또는 GAL1 프로모터인〔1〕또는〔2〕기재의 DNA,
　　〔6〕　세포내에서 RNAi 효과를 가지는 스템 루프 형 RNA 분자를 코드하는 DNA로서, 표적 유전자 mRNA의 어느 영역의 센스 RNA를 코드하는 센스 코드 DNA와 당해DNA와 상보적인 서열과 스페이서 영역을 사이에 두어 대향하도록 연결시키고 이것을 tRNA 프로모터와 기능적으로 접속시킨 구조를 특징으로 하는 DNA,
　　〔7〕　tRNA 프로모터가 tRNAVAL프로모터인,〔3〕,〔4〕또는〔6〕기재의 DNA,
　　〔8〕　센스 코드 DNA의 길이가 10~35 bp인,〔1〕~〔4〕,〔6〕또는〔7〕의 어 느 하나에 기재된 DNA,
　　〔9〕　센스 코드 DNA의 길이가 26~30 bp인,〔1〕~〔4〕,〔6〕또는〔7〕의 어느 하나에 기재된 DNA,
　　〔10〕　센스 코드 DNA의 길이가 31~35 bp인,〔1〕~〔4〕,〔6〕또는〔7〕의 어느 하나에 기재된 DNA,
　　〔11〕　센스 코드 DNA의 길이가 10~5000 bp인,〔5〕기재의 DNA,
　　〔12〕　스페이서 영역의 길이가 1~10000 염기인〔1〕~〔11〕의 어느 하나에 기재된 DNA,
　　〔13〕　스페이서 영역의 길이가 1~100 염기인〔1〕~〔11〕의 어느 하나에 기재된 DNA,
　　〔14〕　발현되는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역의 길이가 10~35 bp인,〔1〕~〔4〕,〔6〕~〔10〕,〔12〕또는〔13〕의 어느 하나에 기재된 DNA,
　　〔15〕　발현되는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역의 길이가 26~30 bp인,〔1〕~〔4〕,〔6〕~〔10〕,〔12〕또는〔13〕의 어느 하나에 기재된 DNA,
　　〔16〕　발현되는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역의 길이가 31~35 bp인,〔1〕~〔4〕,〔6〕~〔10〕,〔12〕또는〔13〕의 어느 하나에 기재된 DNA,
　　〔17〕　발현되는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역 내에 미스매치 또는 벌지(bulge)를 포함하도록 구축된 〔1〕~〔16〕의 어느 하나에 기재된 DNA,
　　〔18〕　센스 사슬에 20 염기쌍 당 1~6 염기의 G·U 짝을 두는 것 같은 미스매치를 포함하도록 구축된 〔17〕기재의 DNA,
　　〔19〕　발현되는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역 내에 20 염기쌍 당 1~10 염기의 미스매치 또는 벌지를 포함하도록 구축된〔1〕~〔18〕의 어느 하나에 기재된 DNA,
　　〔20〕　미스매치가 센스 사슬에 20 염기쌍 당 1~6 염기의 G·U 짝을 두는 것 같은 미스매치인,〔19〕기재의 DNA,
　　〔21〕　발현되는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역 내에 300 염기쌍 당 1~100 염기의 미스매치 또는 벌지를 포함하도록 구축된〔5〕또는〔11〕기재의 DNA,
　　〔22〕　세포가 포유동물 세포 혹은 효모 세포인,〔1〕~〔21〕의 어느 하나에 기재된 DNA,
　　〔23〕　〔1〕~〔22〕의 어느 하나에 기재된 DNA의 전사 산물인, 세포내에서 RNAi 효과를 가지는 스템 루프 형 RNA 분자,
　　〔24〕　〔1〕~〔22〕의 어느 하나에 기재된 DNA를 포함하는 벡터,
　　〔25〕　〔1〕~〔22〕의 어느 하나에 기재된 DNA, 또는〔24〕에 기재된 벡터를 보유하는 세포,
　　〔26〕　세포가 포유동물 세포 혹은 효모 세포인,〔25〕기재의 세포,
　　〔27〕　〔1〕~〔22〕의 어느 하나에 기재된 DNA, 또는〔24〕에 기재된 벡터를 포함하는 조성물,
　　〔28〕　표적 유전자의 발현이 억제된 세포를 생산하는 방법으로서,〔1〕~〔22〕의 어느 하나에 기재된 DNA, 또는〔24〕에 기재된 벡터를 세포에 도입하는 공정, 및 상기 DNA 혹은 벡터가 도입된 세포를 선별하는 공정을 포함하는 생산 방법,
　　〔29〕　세포내에서 스템 루프 형 랜덤 RNA 분자를 코드하는 DNA로서, 랜덤인 서열로 구성되는 RNA를 코드하는 DNA와 당해 DNA와 상보적인 서열을, 스페이서-영역을 사이에 두어 대향하도록 연결시키고 이것을 tRNA 프로모터와 기능적으로 접속시킨 구조를 가지는 DNA를 포함한 벡터,
〔30〕 〔1〕~〔22〕의 어느 하나에 기재된 DNA, 또는〔24〕혹은〔29〕에 기재된 벡터를 보유한 생물 개체,
　　〔31〕　표적 유전자 넉아웃 비사람 동물인,〔30〕기재의 생물 개체,
　　〔32〕　생물이 마우스, 래트, 토끼, 소, 말, 돼지, 양, 원숭이 및 침팬지로구성되는 군으로부터 선택되는,〔30〕또는〔31〕기재의 생물 개체,
　　〔33〕　발현되는 스템 루프 형 랜덤 RNA 분자의 스템 영역의 길이가 10~35 bp인〔29〕기재의 벡터,
　　〔34〕　이하의 공정 (a)~(c)를 포함하는, 기능 유전자의 탐색 방법,
(a)〔29〕또는〔33〕에 기재된 벡터를 세포에 도입하는 공정;
(b) 전기 벡터가 도입된 세포를 선택하는 공정; 및
(c) 선택된 세포의 표현형을 해석하는 공정
　　〔35〕　표현형 해석에 의해 표현형이 변화한 세포 내 벡터 서열 중 랜덤 서열에 기초하여 기능 유전자를 스크리닝 하는 공정을 추가로 포함하는〔34〕기재의 기능 유전자 탐색 방법,
　　〔36〕　(a) 세포내에서 RNAi 효과를 가지는 스템 루프 형 RNA 분자를 코드하는 DNA로서, 표적 유전자 mRNA의 어느 영역의 센스 RNA를 코드하는 센스 코드 DNA와 당해 DNA와 상보적인 서열을, 스페이서-영역을 사이에 두어 대향하도록 연결시키고 이것을 프로모터와 기능적으로 접속시킨 구조를 특징으로 하는 DNA와
(b) Dicer 단백질에 있어서의 Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드 영역을 코드 하는 DNA와 프로모터를 기능적으로 접속시킨 구조를 특징으로 하는 DNA,
를 포함하는 siRNA 발현 시스템,
　　〔37〕　(a) 기재의 프로모터가 tRNA 프로모터 또는 Pol III계 프로모터인,〔36〕에 기재의 siRNA 발현 시스템,
　　〔38〕　(a) 기재의 프로모터가 NMT1 프로모터, GAL1 프로모터 또는 PolII계 프로모터인,〔36〕기재의 siRNA 발현 시스템,
　　〔39〕　발현하는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역 내에 300 염기쌍 당 1~100 염기의 미스매치 또는 벌지를 포함하는〔38〕기재의 siRNA 발현 시스템,
　　〔40〕　(b) 기재의 프로모터가 PolII계 프로모터인,〔36〕기재의 siRNA 발현 시스템,
　　〔41〕　세포가 포유동물 세포 혹은 효모 세포인,〔36〕~〔40〕의 어느 하나에 기재된 siRNA 발현 시스템,
　　〔42〕　표적 유전자 mRNA의 어느 영역에 있어서의 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 결합한 dsRNA, 또는 당해 dsRNA를 스템으로 하는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역의 길이가, 적어도 30 염기쌍 이상인,〔36〕~〔41〕의 어느 하나에 기재된 siRNA 발현 시스템,
　　〔43〕　표적 유전자 mRNA의 어느 영역에 있어서의 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 결합한 dsRNA 중, 또는 당해 dsRNA를 스템으로 하는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역 내의 센스 사슬에 300 염기쌍 당 1~100 염기의 미스매치 또는 벌지를 포함하는〔36〕~〔41〕의 어느 하나에 기재된 siRNA 발현 시스템,
　　〔44〕　〔36〕의 (a) 및 (b)의 양쪽 모두의 DNA를 포함하는 siRNA 발현 벡터,
　　〔45〕　〔36〕~〔43〕의 어느 하나에 기재된 siRNA 발현 시스템, 또는〔44〕에 기재된 발현 벡터를 이용하여 스템 루프 형 RNA 분자와 Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드의 양쪽 모두를 발현시키는 것을 특징으로 하는, 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법,
　　〔46〕　이하의 공정 (a) 및 (b)를 포함하는 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법,
(a) 표적 유전자 mRNA의 어느 영역에 있어서의 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 결합한 dsRNA, 또는 당해 dsRNA를 스템으로 하는 스템 루프 형 RNA 분자를, Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드로 처리하는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 생성된 dsRNA를, 표적 유전자를 포함하는 세포에 도입하는 공정,
　　〔47〕　Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드가, Dicer 단백질의 1066~1924 위치의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드인〔46〕기재의 방법,
　　〔48〕　Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드가, Dicer 단백질의 1268~1924 위치의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드인〔46〕기재의 방법,
　　〔49〕　Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드가, Dicer 단백질의 1296~1924 위치의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드인〔46〕기재의 방법,
　　〔50〕　Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드가 전체 길이 Dicer 단백질인〔46〕 기재의 방법,
　　〔51〕　세포가 포유동물 세포 혹은 효모 세포인〔45〕~〔50〕의 어느 하나에 기재된 방법,
　　〔52〕　Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드가 대장균에서 발현시킨〔47〕~〔50〕의 어느 하나에 기재된 폴리펩티드인〔46〕기재의 방법,
　　〔53〕　Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드가 곤충 세포에서 발현시킨〔44〕~〔47〕의 어느 하나에 기재의 폴리펩티드인〔46〕기재의 방법,
　　〔54〕　표적 유전자 mRNA의 어느 영역에 있어서의 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 결합한 dsRNA, 또는 당해 dsRNA를 스템으로 하는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역의 길이가 적어도 30 염기쌍 이상인,〔45〕~〔53〕의 어느 하나에 기재된 방법,
　　〔55〕　표적 유전자 mRNA의 어느 영역에 있어서의 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 결합한 dsRNA 내, 또는 당해 dsRNA를 스템으로 하는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역 내의 센스 사슬에 300 염기쌍 당 1~100 염기의 미스매치 또는 벌지를 포함하는 청구항〔45〕~〔53〕의 어느 하나에 기재된 방법을 제공하는 것이다.
한편, 본 명세서에 첨부된 서열목록 내의 염기 n 은 명세서 내의 서열에 기재된 바와 같이 우라실 염기 u 를 나타내는 것이다.
본 발명자 등은 스템 루프 형 RNA 분자가 세포질로 이행하면 RNAi 효과를 나타내는 것을 찾아냈다. 그리고 본 발명자 등은 스템 루프 형 RNA를 코드하는 DNA를 tRNA 프로모터와 연결시키는 것으로 당해 프로모터에 의한 전사 산물은 핵으로부터 세포질로 효율적으로 이행하여 당해 전사 산물은 RNAi 효과를 나타내는 것을 밝혔다.
「스템 루프」란, 단일 사슬 RNA 상에 존재하는 역방향 반복 서열간 수소결합에 의해 생기는 이중 사슬의 부분(스템; stem)과 그 사이의 루프 부분으로 구성되는 구조를 말하며, 헤어핀 루프라고도 불린다. 스템 루프 형 RNA 분자는 스템 영역이 이중 사슬 RNA 구조를 하고 있고 세포질에서 다이서(Dicer)를 포함하는 리보뉴클레아제(RISC)에 의해 처리되어 RNAi 효과를 가지는 si(짧은 사슬 간섭; short interfering) RNA가 생성되는 것이라고 생각된다. siRNA는 통상 20 bp 정도의 이중 사슬 RNA 분자이며 RNAi 효과를 가지는 것이 알려져 있다. 다이서 및 RISC는 세포질에 존재한다고 생각되고 있으며 따라서, 스템 루프 형 RNA 분자를 세포질로 이행시키는 것은, RNAi 효과를 발휘시키기 위해서 중요하다.
본 발명은 세포내에서 RNAi 효과를 가지는 스템 루프 형 RNA 분자를 코드하는 DNA를 제공한다. 즉, 본 발명은 발현 산물이 효율적으로 세포질로 이행하는 것을 특징으로 하는, 세포내에서 RNAi 효과를 가지는 스템 루프 형 RNA 분자를 코드 하는 DNA에 관한 것이다.
본 발명의 상기 DNA의 바람직한 태양에 대해서는 표적 유전자 mRNA의 어느 영역의 센스(혹은 안티센스) RNA를 코드하는 센스(혹은 안티센스) 코드 DNA와 당해DNA와 상보적인 서열을, 스페이서-영역을 사이에 두어 대향하도록 연결시키고 이것을 프로모터와 기능적으로 접속시킨 구조를 특징으로 하는 DNA이다.
본 발명에 있어서 표적 유전자란, 그 유전자의 발현이 본 발명의 스템 루프 형 RNA 분자의 RNAi 효과에 의해 억제되는 유전자이며, 임의로 선택할 수 있다. 이 표적 유전자로서 예를 들면, 서열은 판명되어 있지만 어떠한 기능을 가지는지를 해명하고 싶은 유전자나, 그 발현이 질환의 원인이라고 생각되는 유전자 등을 바람직하게 선택할 수 있다. 표적 유전자는 그 mRNA 서열의 일부, 적어도 15 염기 이상이 판명된 것이면, 게놈 서열까지 판명되지 않은 유전자이어도 선택할 수 있다. 따라서, EST(Expressed Sequence Tag) 등의 mRNA의 일부는 판명되어 있지만, 전체 길이가 판명되어 있지 않는 유전자 등도 본 발명에 있어서의 표적 유전자로서 선택할 수 있다.
상기 「대향한다」란, 2개의 서열이 서로 역방향이 되도록 배치하는 것을 가리킨다. 본 발명의 상기 DNA는 센스 RNA를 코드하는 DNA 서열이, 스페이서-영역을 사이에 두어 역방향 반복 서열을 형성한 구조를 가진다, 라고 환언할 수 있다.
구체적으로 설명하면, 예를 들어 센스 RNA를 코드하는 DNA 서열(이중 사슬)이,
AGTC (센스 사슬)
::::
TCAG (안티센스 사슬)
인 경우에는, 상기의 센스 RNA를 코드하는 DNA 서열이 스페이서-영역을 사이에 두고 역방향 반복 서열을 형성한 구조는,
AGTC-SSS-GACT
:::: ::::
TCAG-SSS-CTGA
와 같이 나타낼 수 있다. (상기의 「S」는 스페이서-영역의 임의의 염기이며, 「:」은 수소결합을 나타낸다.)
본 발명의 DNA는 상기와 같이 표적 유전자 mRNA의 어느 영역의 센스 RNA를 코드하는 센스 코드 DNA와 당해 DNA와 상보적인 서열을, 스페이서-영역을 사이에 두어 대향하도록 연결시킨 구조를 가지지만, 이 「상보적인 서열」은 즉, 상기의 「표적 유전자 mRNA의 어느 영역」에 대한 안티센스 RNA를 코드하는 DNA이다, 라고 나타낼 수도 있다. 따라서 본 발명의 DNA는 환언하면, 표적 유전자 mRNA의 어느 영역에 대한 안티센스 RNA를 코드하는 안티센스 코드 DNA와 당해 DNA와 상보적인 서열을, 스페이서-영역을 사이에 두어 대향하도록 연결시킨 구조를 가진다, 라고 표현할 수도 있다.
본 발명의 상기 DNA를 세포질에 효율적으로 이행시키기 위해서는, 예를 들면, 상기 DNA 상에 세포질 이행 시그널 서열을 포함하게 하는 것에 의해 달성시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 DNA의 바람직한 태양에 있어서는, 세포질 이행 시그널 서열을 가지는 상기 DNA이다. 세포질 이행 시그널 서열은, 반드시 한정되지 않지만, 스페이서-영역 안에 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 세포질 이행 시그널 서열로서는, 공지의 세포질 이행 시그널 외에, 예를 들면, 세포질 이행 단백질이 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 서열을 바람직하게 이용할 수 있다. 세포질 이행 시그널 서열의 일례로서 miR23의 루프 모티프(서열：5'-CUUCCUGUCA-3')를 들 수 있다(Kawasaki, H., Taira, K. Short hairpin type of dsRNAs that are controlled by tRNA(Val) promoter significantly induce RNAi-mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells. Nucleic Acids Res., 31, 700-707 (2003)).
　
또한, 본 발명의 상기 DNA에 있어서의 「프로모터」로서는, 후술하는 tRNA 프로모터, 혹은, polII계, polIII계 프로모터를 사용할 수 있다. 또, 테트라사이클린 유도형 프로모터를 바람직하게 사용할 수 있다.
이러한 유도 가능한 프로모터를 이용하는 것으로, 희망하는 타이밍에 본 발명의 DNA를 발현시키는 것도 가능해진다. 테트라사이클린 유도형 프로모터로서는, 예를 들면, 테트라사이클린으로 유도 가능한 U6프로모터(Ohkawa, J. & Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Hum Gene Ther. 11, 577-585 (2000)) 등을 들 수 있다. 예를 들면, 테트라사이클린 유도형 프로모터의 예로서 TetO7를 포함한 프로모터를 들 수 있다. 또, 테트라사이클린 유도형 프로모터를 이용했을 경우의 일례로서 후술하는 실시예를 참조할 수 있다. 또, 본 발명의 프로모터로서 테트라사이클린 유도형 tRNA 프로모터를 바람직하게 사용할 수가 있다. 나아가 본 발명의 매우 적합하게 사용 가능한 프로모터로서 예를 들면, NMT1 프로모터, GAL1 프로모터를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 바람직한 태양에 있어서는, 상기의 표적 유전자 mRNA의 어느 영역의 센스(혹은 안티센스) RNA를 코드하는 센스(혹은 안티센스) 코드 DNA와 당해 DNA와 상보적인 서열을, 스페이서-영역을 사이에 두어 대향하도록 연결시킨 DNA를 tRNA 프로모터와 기능적으로 접속시킨 구조를 특징으로 하는 DNA이다.
tRNA 프로모터는 원핵생물의 경우는 유전자의 상류에 존재하는데 대하여 진핵생물의 경우는 tRNA의 D루프, T루프에 대응하는 DNA 영역이 tRNA 프로모터로서 기능하는 것이 알려져 있다. 따라서 본 발명의 tRNA 프로모터란 통상, tRNA의 D루프 또는 T루프에 대응하는 DNA 영역을 말한다. tRNA는 각 아미노산에 대하여 통상 복수 개의 tRNA가 존재한다. 본 발명의 tRNA 프로모터로서는 발린(Val)에 대응한 tRNA (tRNAVal)의 프로모터를 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명에 사용할 수 있는 tRNA 프로모터로서는, 구체적으로는, 이하의 염기 서열을 코드 하는 프로모터를 들 수 있다.
5'- ACCGUUGGUUUCCGUAGUGUAGUGGUUAUCACGUUCGCCUAACACGCGAAAGGUCCCCGGUUCGAAACCGGGCACUACAAAAACCAAC -3'(서열번호：1)
본 발명에 있어서 상기 「기능적으로 연결하였다」라 함은, tRNA 프로모터로부터 전사를 받아, 상기의 「표적 유전자 mRNA의 어느 영역의 센스 RNA를 코드하는 센스 코드 DNA와 당해 DNA와 상보적인 서열을, 스페이서-영역을 사이에 두어 대향하도록 연결시킨 DNA」의 전사 산물이 생성되도록 당해 DNA와 tRNA 프로모터가 결합하고 있는 것을 말한다. 따라서, 당해 DNA에 대한 tRNA 프로모터의 위치는 그 상류, 하류를 묻지 않지만, 통상 상류에 위치한다. 또, 당해 DNA와 tRNA 프로모터 사이에는 당해 DNA의 전사가 일어날 수 있는 한, 임의의 DNA 서열을 가지고 있어도 좋다.
본 발명에 있어서는, 상기와 같이 tRNA 프로모터로부터 전사를 받는 것에 의하여 세포질로의 이행 시그널로서 그 tRNA 자체도 상기 스템 루프 형 RNA 분자와 결합하고 있다.
나아가 본 발명에 있어서는, 상기 DNA에 터미네이터를 적절히 구비할 수 있다. 상기 터미네이터는 프로모터의 전사를 종결할 수 있는 서열이면, 특히 제한되지 않고 예를 들면, A(아데닌) 염기가 4개 이상 연속된 서열, 팰린드롬 구조를 형성할 수 있는 서열 등 공지의 터미네이터를 이용할 수 있다. 덧붙여 본 발명의 DNA에는 단일 사슬 DNA 및 이중 사슬 DNA가 포함된다.
본 발명의 상기 DNA가 tRNA 프로모터로부터 전사를 받는 것으로, 일련의 전사 산물(RNA 분자)이 생성된다. 본 발명의 DNA에는 스페이서-영역을 사이에 두고 역방향 반복 서열을 가지므로 본 발명의 DNA의 전사 산물도 또한, 스페이서-영역을 사이에 둔 역방향 반복 서열을 포함한 구조를 하고 있다. 이러한 구조를 가지는 RNA 분자는 통상, 당해 반복 서열 간에 수소결합을 형성하여 당해 반복 서열을 스템으로 하여 스페이서 영역을 루프로 하는 스템 루프를 형성한다.
본 명세서에 있어서는, 이 스템 루프를 형성하는 RNA 분자를 「스템 루프 형 RNA 분자」라고 기재한다. 본 발명은 본 발명의 상기 DNA로부터 전사되는 스템 루프 형 RNA 분자도 포함한다.
본 발명에 있어서 「RNAi 효과를 가진다」란, 본 발명의 스템 루프 형 RNA 분자의 대사 산물 등 (예를 들면, RNA 사슬에 절단 등의 대사를 받아 생성되는 산물)이 RNAi 효과를 가지는 경우도 포함된다.
본 발명의 스페이서 영역을 구성하는 DNA는 이에 인접하는 반복 서열이 수소결합을 할 수 있는 한, 그 길이는 특히 제한되지 않지만, 통상 1~10000 염기이며, 바람직하게는 1~100 염기, 보다 바람직하게는, 3~30 염기이며, 한층 더 바람직하게는 5~20 염기이다. 스페이서 영역을 구성하는 DNA의 염기 서열은, 특별히 규정하지 않고 임의의 서열로 할 수 있다.
또, 상기와 같이 역방향 반복 서열 간에 수소결합을 형성할 수 있는 것이면, 특히 스페이서 영역은 필요로 하지 않고, 스페이서 영역을 가지지 않는 경우여도 본 발명의 DNA에 포함된다.
본 발명의 DNA는 예를 들면, 도 1 A의 상단과 같은 구조를 모식적으로 나타낼 수 있다.
포유동물 세포에 통상 약 30 bp 이상의 길이의 이중 사슬 RNA를 도입하면, 인터페론(IFN) 방어 경로에 의하여 당해 이중 사슬 RNA가 소화되는 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 스템 루프 형 RNA 분자는, 스템 영역의 이중 사슬 RNA의 길이가 통상, 35 bp이내이며, 바람직하게는 10~35 bp이며, 보다 바람직하게는 15~30 bp이며, 한층 더 바람직하게는 18~30 bp이며, 가장 바람직하게는 26~30 bp 혹은 31~35 bp이다.
또한, 본 발명의 DNA에 있어서의 「센스 코드 DNA」혹은, 상기 2개의 역방향 반복 서열의 각각의 길이도 또한, 통상 35 bp이내이며, 바람직하게는 10~35 bp이며, 보다 바람직하게는 15~30 bp이며, 한층 더 바람직하게는 18~30 bp이며, 가장 바람직하게는 26~30 bp 혹은 31~35 bp이다. 다만, 본 발명의 프로모터로서 NMT1 프로모터 또는 GAL1 프로모터를 이용하는 경우에는, 특히 제한되는 것은 아니지만, 센스 코드 DNA의 길이는 10~5000 bp인 것이 바람직하다.
또한 본 발명에 있어서, siRNA에 있어서의 RNA끼리 결합한 이중 사슬 RNA의 부분(스템 루프 형 RNA 분자의 스템 부분)은 완전에 결합하고 있는 것에 한정하지 않고, 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않다), 벌지(한편의 사슬에 대응하는 염기가 없다) 등에 의해 결합하지 않은 부분이 포함되어 있어도 좋다. 결합하지 않은 부분은 siRNA 형성에 지장이 없는 범위에서 구비할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 DNA로부터 발현하는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역 안에 존재하는 미스매치 또는 벌지의 수는 특히 제한되지 않지만, 통상 20 염기쌍 당 1~10 염기이다.
또한, 본 발명의 DNA가 가지는 프로모터가 NMT1 프로모터 혹은 GAL1 프로모터인 경우에는 본 발명의 DNA로부터 발현되는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역안에 특히 제한되지 않지만, 300 염기쌍 당 1~100 염기의 미스매치 또는 벌지를 포함하고 있어도 좋다. 또, 상기 미스매치로서는 예를 들면, 센스 사슬에 20 염기쌍 당 1~6 염기의 G·U 짝을 두는 것 같은 미스매치를 들 수 있다.
본 발명의 상기 DNA는 당업자에 있어서는, 일반적인 유전자 공학 기술에 의하여 제작할 수 있다. tRNA 프로모터를 포함하는 본 발명의 DNA는, 예를 들면, 주지의 올리고 뉴클레오티드 합성법에 따라 임의의 서열을 합성하여 제작할 수 있다. 본 발명의 이중 사슬 DNA는, 센스 사슬과 안티센스 사슬을 각각 개별적으로 합성하여 각각의 사슬을 어닐링 시키는 것으로 얻을 수 있다.
본 발명의 DNA는, 그대로 세포내 염색체에 도입하여 세포내에서 발현시킬 수도 있지만, 효율적인 세포 도입 등을 실시하기 위해서 상기 DNA를 벡터에 유지시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 DNA를 포함한 벡터도 또한, 본 발명에 포함된다.
여기서 이용할 수 있는 「벡터」는, 도입하고 싶은 세포 등에 대응하여 선택할 수 있다. 예를 들면, 포유동물 세포에서는 레트로바이러스 벡터(retrovirus vector), 아데노바이러스 벡터(adenovirus vector), 아데노 관련 바이러스 벡터(adeno-associated vector), 백시니아 바이러스 벡터(vaccinia virus vector), 렌티바이러스 벡터(lentivirus vector), 히피스 바이러스 벡터(herpes virus vector), 알파바이러스 벡터(alphavirus vector), EB 바이러스 벡터(EB virus vector), 파필로마 바이러스 벡터(papilloma virus vector), 포미바이러스 벡터(foamyvirus vector)등의 바이러스 벡터와 양이온 리포좀(cationic liposome), 리간드 DNA 복합체(ligand DNA complex), 유전자 총(gene gun) 등의 비 바이러스 벡터(non-viral vector)등을 들 수 있지만(Y. Niitsu 등, Molecular Medicine 35: 1385-1395, 1998), 이들에 한정되는 것은 아니다.
벡터에는 필요에 따라서 벡터가 도입된 세포를 선택할 수 있는 선택 마커 등을 추가로 보유시킬 수 있다. 선택 마커로서는, 네오마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자와 같은 약제 내성 마커, 갈락토시다아제 등의 효소 활성을 지표로 선택할 수 있는 마커, 혹은, GFP 등의 형광 발광등을 지표로 선택할 수 있는 마커 등을 들 수 있다. 또, EGF 리셉터, B7-2 등의 표면 항원을 지표로 선택할 수 있는 선택 마커 등을 이용하여도 좋다.
이와 같이 선택 마커를 이용하는 것에 의하여 당해 벡터가 도입된 세포, 즉, 본 발명의 벡터가 도입된 세포만을 선택하는 것이 가능해진다. 또, 벡터를 이용하는 것으로 세포내에서의 보유 시간을 높이고 또 벡터에 따라서는 레트로바이러스 벡터 등과 같이 염색체로의 인테그레이션을 유도하기 때문에 본 발명의 DNA로부터 세포내에서의 안정적인 스템 루프 형 RNA 분자의 공급을 행하는 것이 가능해진다.
본 발명의 바람직한 태양에 있어서는, 본 발명의 DNA 또는 당해 DNA를 포함한 벡터를 세포에 도입하는 것으로써, 당해 세포에 있어서의 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 따라서 본 발명은 표적 유전자의 발현이 억제된 세포를 생산하는 방법으로서, 본 발명의 DNA 또는 당해 DNA를 포함한 벡터를 세포에 도입하는 공정, 및 상기 벡터가 도입된 세포를 선택하는 공정을 포함하는 생산 방법을 제공한다.
나아가 본 발명은, 본 발명의 DNA 또는 당해 DNA를 포함한 벡터를 보유하는 세포를 제공한다. 본 발명의 상기 세포는 특히 한정되지 않고, 유전자의 발현을 억제하고 싶은 희망하는 세포를 사용할 수 있다. 종래 RNAi의 유도가 곤란한 포유동물 세포에 있어서도, 본 발명의 DNA 또는 당해 DNA를 포함하는 벡터에 의하여 RNAi를 유도하는 것이 가능하기 때문에 본 발명의 세포로서는 특히 제한되지 않고, 예를 들면, 포유동물 세포(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 소, 말, 돼지, 양, 원숭이, 또는 침팬지 등의 세포), 효모 등을 들 수가 있다. 또, 식물세포 등과 같이 장쇄 dsRNA의 장기의 안정적인 발현 유지가 어려운 세포도 본 발명의 DNA 또는 당해 DNA를 포함한 벡터가 도입되는 세포로서 매우 적합하다.
또, 본 발명의 DNA 또는 당해 DNA를 포함한 벡터의 상기 세포로의 도입 방법은 당업자에 있어서는, 세포의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면, 포유동물 세포로의 도입에 있어서는 인산 칼슘법(Virology, Vol. 52, p. 456 (1973)), 일렉트로포레이션법(Nucleic Acids Res., Vol. 15, p. 1311 (1987)) , 리포펙션법(J. Clin. Biochem. Nutr., Vol. 7, p. 175 (1989)), 바이러스에 의해 감염 도입 방법(Sci.Am., p. 34, March (1994)) , 유전자 총 등에서 선택할 수 있으며, 식물세포로의 도입에서는, 일렉트로포레이션법(Nature, Vol. 319, p. 791 (1986)) , 폴리에틸렌 글리콜법(EMBO J., Vol. 3, p. 2717 (1984)) , 파티클 건법(Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, Vol. 85, p. 8502 (1988)) , 아그로박테리움을 개입시킨 방법(Nucleic. Acids Res., Vol. 12, p. 8711 (1984)) 등에 의해 실시할 수가 있다.
본 발명의 DNA 또는 당해 DNA를 포함한 벡터가 도입된 세포를 선택하는 방법으로서는, 본 발명의 DNA 또는 당해 DNA를 포함한 벡터에 특이적인 DNA 서열을 프로브 혹은 프라이머로서 하이브리다이제이션, PCR 법 등 공지의 수단에 의해 선택할 수도 있지만, 선택 마커를 갖춘 벡터에 본 발명의 DNA가 보유되고 있는 경우에는, 그 선택 마커에 의한 표현형을 지표로 선택할 수 있다.
상기와 같이 본 발명의 DNA 또는 당해 DNA를 포함한 벡터가 도입된 세포는, 표적 유전자의 발현이 억제된 넉다운 세포가 된다. 여기서 「넉다운 세포」에는 표적 유전자의 발현이 완전하게 억제된 세포와 표적 유전자의 발현이 완전하게는 억제되어 있지 않지만 저감되고 있는 세포가 포함된다. 종래, 이러한 세포는 표적 유전자를 혹은 그 제어 영역을 결손, 변형시켜 제조되고 있었지만, 본 발명을 이용함으로써 염색체 상의 표적 유전자를 변형시키는 일 없이, 단지 본 발명의 DNA 또는 당해 DNA를 포함한 벡터를 도입하여 도입된 세포를 선별한다고 하는 간단하고 쉬운 방법에 의해 표적 유전자의 발현이 억제된 세포를 제조할 수 있다.
이와 같이 제조된 넉다운 세포는 표적 유전자의 기능 해석을 위한 연구 재료로서 또 질환 원인 유전자를 표적 유전자로서 발현이 억제되어 있는 세포에서는 질환 모델 세포 등으로 이용하는 것이 가능해진다.
또, 생식 세포에 본 발명의 DNA 또는 당해 DNA를 포함한 벡터를 도입하여 본 시스템을 보유한 생식 세포로부터 생물 개체를 발생시키는 것으로, 표적 유전자 넉다운 동물, 질환 모델 동물 등을 제조하는 일도 가능해진다.
본 발명에는 본 발명에 의해 생산되는 상기 넉다운 세포도 포함되고 나아가 상기 본 발명의 DNA 혹은 벡터를 보유하는 생물 개체(예를 들면, 표적 유전자 넉아웃 비사람 동물 등)도 본 발명에 포함된다. 본 발명에 있어서의 상기 생물로서는, 예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 소, 말, 돼지, 양, 원숭이, 또는 침팬지 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 DNA 또는 당해 DNA를 포함한 벡터를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의해 희망하는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에, 본 발명에 의해 질환의 원인이 되는 유전자 발현을 억제함으로써, 당해 질환의 치료 또는 예방 효과를 기대할 수 있다. 나아가 상기 조성물은, 희망 하는 유전자의 기능을 검토하기 위한 시약으로서도 유용하다. 본 발명의 DNA 또는 당해 DNA를 포함한 벡터를 의약품으로서 이용하는 경우에는, 적절한 부형제 등을 첨가한 조성물로 할 수도 있다.
본 발명의 다른 태양에 대해서는, 스템 루프 형 랜덤 RNA 분자를 발현하는 벡터에 관한 것이다.
당해 벡터는 랜덤인 서열로 구성되는 RNA를 코드하는 DNA와 당해 DNA와 상보적인 서열을 스페이서 영역을 사이에 두어 대향하도록 연결시키고 이것을 tRNA 프로모터와 기능적으로 접속시킨 구조를 가지는 DNA를 포함한다. 당해 DNA로부터 발현하는 랜덤인 서열을 가지는 전사 산물을, 본 발명에서는 「스템 루프 형 랜덤 RNA 분자」라고 부른다. 이 스템 루프 형 랜덤 RNA 분자를 세포에 도입하는 것으로써, 기능 유전자의 탐색이 가능하다.
결국, 상기까지의 본 발명의 DNA 또는 당해 DNA를 포함한 벡터는 특정의 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 것이지만, 상기 태양에 있어서는, 스템 루프 형 랜덤 RNA를 발현하여 임의의 유전자, 예를 들면 기능 미지의 유전자, 서열 미지의 유전자를 억제하여 신규 기능 유전자를 탐색하기 위해서 이용할 수 있다. 상기 스템 루프 형 랜덤 RNA 분자도 또한, 바람직하게는, 스템 영역의 길이가 통상 30 bp이내이며, 바람직하게는 15~30 bp이며, 보다 바람직하게는 18~30 bp이다.
본 발명은, 상기 스템 루프 형 랜덤 RNA 분자 발현 벡터를 세포에 도입하는 공정, 상기 벡터가 도입된 세포를 선택하는 공정, 및, 선택된 세포의 표현형을 해석하는 공정을 포함하는 기능 유전자의 탐색 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서는, 다른 랜덤 서열을 가지는 스템 루프 형 랜덤 RNA 분자를 발현할 수 있는 벡터를 모아 라이브러리로서 구축할 수도 있다. 당해 라이브러리를 이용함으로써, 기능 유전자의 탐색을 한층 효율적으로 실시하는 것이 가능해진다.
상기 방법에 있어서, 스템 루프 형 랜덤 RNA 분자 발현 벡터의 세포로의 도입은 전술과 바와 같이 실시할 수 있다.
상기 방법에서는 그 후 스템 루프 형 랜덤 RNA 분자 발현 벡터 또는 라이브러리가 도입된 세포가 선택된 후에 그 세포의 표현형을 해석한다. 이 표현형의 해석은, 예를 들면, 컨트롤로서 스템 루프 형 랜덤 RNA 분자 발현 벡터가 도입되어 있지 않은 세포의 표현형과 비교하는 것으로 실시할 수가 있다. 이 표현형은, 세포 표면에 생기는 것 만이 아니라 예를 들면, 세포내의 변화 등도 포함된다.
상기 해석의 결과, 표현형이 변화한 세포에는, 어떠한 기능 유전자의 발현을 억제할 수 있는 스템 루프 형 랜덤 RNA 분자가 포함되어 있을 가능성이 높다. 그 때문에, 기능 유전자를 스크리닝 하기 위해서, 예를 들면, 이 세포에 포함되는 스템 루프 형 랜덤 RNA 분자 발현 벡터의 스템 루프 형 랜덤 RNA를 코드하는 DNA의 서열에 근거하여 프로브, 프라이머를 구축한다. 그리고, 이 프로브, 프라이머를 이용하여 하이브리다이제이션 또는 PCR를 실시하는 것으로, 기능 유전자의 클로닝을 실시할 수 있다. 또, 스템 루프 형 랜덤 RNA를 코드하는 DNA의 서열에 근거하여 데이타베이스로부터 기능 유전자를 검색할 수도 있다.
또한, 본 발명은 세포내에서 RNAi 효과를 가지는 RNA 분자가 발현 가능한 구조를 가지는 DNA, 및 Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드(예를 들면, Dicer 단백질)의 발현이 가능한 구조를 가지는 DNA를 포함하는 siRNA 발현 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 siRNA 발현 시스템의 바람직한 태양에 있어서는, 이하의 (a) 및(b)의 DNA를 포함하는 siRNA 발현 시스템이 있다. Dicer 활성에 의해 장쇄 dsRNA에 의한 세포 독성을 경감시키는 것이 가능하다.
(a) 세포내에서 RNAi 효과를 가지는 스템 루프 형 RNA 분자를 코드하는 DNA로서, 표적 유전자 mRNA의 어느 영역의 센스 RNA를 코드하는 센스 코드 DNA와 당해 DNA와 상보적인 서열을, 스페이서 영역을 사이에 두어 대향하도록 연결시키고 이것을 프로모터와 기능적으로 접속시킨 구조를 특징으로 하는 DNA
(b) Dicer 단백질에 있어서의 Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드 영역을 코드하는 DNA와 프로모터를 기능적으로 접속시킨 구조를 특징으로 하는 DNA
본 발명에 있어서 「Dicer 단백질에 있어서의 Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드」란, Dicer 단백질에 있어서 적어도 Dicer 활성을 가지는 부분 폴리펩티드 단편, 혹은 당해 폴리펩티드를 포함하는 단백질(예를 들면, 전장 Dicer 단백질)을 말한다. 이 Dicer 활성이란, 통상 긴 이중 사슬 RNA를 21~25 염기의 이중 사슬 RNA로 절단하는 활성을 말한다. 일반적으로 Dicer 활성은 RNaseIII 활성을 측정하는 것으로써 평가할 수 있다. 당업자에 있어 공지의 방법, 예를 들면, 인비트로 프로세싱 에세이 등에 의해 당해 활성을 평가할 수 있다. 인비트로프로세싱 에세이는, 후술하는 실시예에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.
또, 본 발명에 있어서 사용되는 Dicer 단백질은 특별히 그 유래가 제한되지 않고 예를 들면, 사람 Dicer 단백질을 바람직하게 이용할 수가 있다. 예를 들면, Dicer 단백질을 코드하는 유전자의 염기 서열을 서열번호：55에, Dicer 단백질의 아미노산 서열을 서열번호：56에 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서의 상기 Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드의 구체적인 예로서는, 통상 Dicer 단백질에 있어서 바람직하게는 1066~1924 위치, 보다 바람직하게는 1268~1924 위치, 한층 더 바람직하게는 1296~1924 위치의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드(예를 들면, 서열번호：56에 기재된 아미노산 서열에 있어서 바람직하게는 1066~1924 위치, 보다 바람직하게는 1268~1924 위치, 한층 더 바람직하게는 1296~1924 위치의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드) 이다.
상기(a) 및 (b)의 DNA를 가지는 siRNA 발현 벡터도 또한 본 발명에 포함된다. 상기(a) 또는 (b)의 DNA는, 당업자에 있어서는, 공지의 유전자 공학 기술을 이용하여 용이하게 제작할 수 있다.
나아가 본 발명은 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 표적 유전자 억제 방법의 바람직한 태양에 있어서는, 본 발명의 siRNA 발현 시스템, 또는 본 발명의 발현 벡터를 이용하여 스템 루프 형 RNA 분자와 Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드(예를 들면, Dicer 단백질)의 양쪽 모두를 세포에서 발현시키는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 발현 억제 방법이다. 당해 방법에 있어서의 Dicer로서는, 재조합 단백질이 바람직하게 사용된다.
또한, 본 발명의 표적 유전자 억제 방법의 다른 바람직한 태양에 있어서는, 우선, 표적 유전자 mRNA의 어느 영역에 있어서의 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 결합한 dsRNA를 Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드(예를 들면, 재조합 hDicer 단백질)로 처리하고 그 다음으로 생성된 dsRNA를 표적 유전자를 포함하는 세포에 도입한다.
상기 방법에 있어서의 재조합 hDicer의 제조 방법은, 예를 들면, 후술하는 실시예에서 가리키는 방법에 의하여 실시할 수 있지만, 반드시 이 방법에만 제한되는 것은 아니다. 당업자에 있어서는 실시예에 나타나는 방법을 적절히 변형시켜 재조합 hDicer를 제조할 수 있다.
또, 상기 방법에 있어서의 「Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드」로서는, 예를 들면, 전체 길이 Dicer 단백질, 또는 Dicer 단백질에 있어서의 상술한 부분 폴리펩티드 영역을 포함하는 단백질을 바람직하게 사용할 수 있다. 또, 「Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드」는 예를 들면, 대장균 혹은 곤충 세포 등에서 발현시킨 것을 바람직하게 이용할 수 있다. 당업자에 있어 일반적인 유전자 공학 기술을 이용하여 대장균 혹은 곤충 세포에서 희망하는 단백질을 발현시키고 나아가 당해 단백질을 회수, 정제하는 것이 가능하다.
또한, 상기 방법에 있어서 dsRNA의 세포로의 도입은, 당업자에 있어 공지의 방법, 예를 들면, 일렉트로포레이션법, 또는 리포펙션법 등에 의하여 용이하게 실시할 수 있다.
상기 방법에 있어서의 「표적 유전자 mRNA의 어느 영역에 있어서의 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 결합한 dsRNA」의 길이는, 특히 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는, 표적 유전자 mRNA의 어느 영역에 있어서의 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 결합한 dsRNA, 또는 당해 dsRNA를 스템으로 하는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역은 적어도 30 염기쌍 이상이다. 또, 표적 유전자 mRNA의 어느 영역에 있어서의 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 결합한 dsRNA 내에, 또는 당해 dsRNA를 스템으로 하는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역 안의 센스 사슬에 300 염기쌍 당 1~100 염기의 미스매치 또는 벌지를 포함하고 있어도 좋다.
또, 생식 세포에 본 발명의 DNA 혹은 벡터를 도입하여 당해 DNA 혹은 벡터를 보유한 생식 세포로부터 생물 개체를 발생시키는 것에 의하여 표적 유전자 넉다운비사람 동물(예를 들면, 마우스 등), 질환 모델 비사람 동물 등을 제조하는 일도 가능해진다.
본 발명의 DNA 혹은 벡터를 이용한 표적 유전자 넉다운 동물은, 당업자에 있어서는, 일반적인 넉아웃 동물 제작 기술에 의해 제작할 수 있다.
일례를 나타내면, siRNA 발현 벡터를 F1의 암컷과 수컷을 교배하여 얻어진 수정란에 주입한다. 수정란으로부터 발생시킨 마우스의 꼬리 부분으로부터 말초혈DNA를 얻어 발현 벡터의 일부를 프로브로 이용한 게노믹 서던블롯팅을 실시하여 염색체에 siRNA 발현 벡터가 삽입된 양성의 창시 동물을 동정한다. F1 하이브리드(hybrid) 마우스의 어느 쪽과의 역교배를 반복하여 후대 마우스를 얻는다. 그리고, 게노믹 서던블롯팅 해석 및 PCR 해석에 의하여 유전자 재조합 양성의 자손을 동정한다.
또, 상기에서는 주로 포유동물에 siRNA 발현 시스템을 이용하는 경우를 설명했지만, 본 발명의 siRNA 발현 시스템은 식물에 이용하여도 좋다. 특히, 종래 이중 사슬 RNA를 직접 식물세포에 도입하여 RNAi를 유도하고 있었지만, 세포를 계대하는 과정에서 dsRNA가 소실되어 RNAi의 효과를 유지하는 것이 곤란하였다. 그 때문에, 본 발명의 DNA 혹은 벡터를 식물세포 내의 염색체에 인테그레이션 시키는 것으로, RNAi의 효과를 유지하는 것이 가능해진다. 또, 이러한 세포로부터 트랜스제닉(transgenic) 식물을 제조함으로써, RNAi 효과를 안정적으로 보유한 식물을 제조할 수도 있다. 덧붙여 식물의 제조는 당업자에 있어서는 주지의 방법에 의해 실시할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 명세서에 첨부된 서열목록 내의 염기 n 은 명세서 내의 서열에 기재된 바와 같이 우라실 염기 u 를 나타내는 것이다.
본 실시예에 있어서의 실험 재료 및 실험 방법은 아래와 같다.
(1) 세포 배양과 트랜스펙션
SW480 사람 결장 암 세포주를, 10% FBS를 첨가한 L-15 배지(ICN 바이오메디카르즈인크, 오하이오, 미국)에서 배양하였다. HeLa 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 중에서 배양하였다. 트랜스펙션은 EffectinTM시약(QUIAGEN, Hilden, 독일)에 의해 제조원의 프로토콜에 따라 실시하였다. dsRNA 발현 SW480 및 dsRNA 발현 HeLa 세포는 퓨로마이신과 함께 2주간 인큐베이트 하는 것에 의하여 선별하였다.
(2) dsRNA 발현 플라스미드의 구축
tRNA-dsRNA를 발현하는 벡터를 구축하기 위해서 본 발명자 등은 pPUR(Clontech, CA주, 미국)의 EcoRI와 BamHI 부위와의 사이에, tRNAVal(Koseki, S. et al. (1999) J.Virol., 73, 1868-1877)에 관계된 사람 유전자의 화학 합성된 프로모터를 포함하는 pPUR-tRNA 플라스미드를 이용하였다. 루프 1(5'-GAG CTC GGT AGT TGG AGC TGT TGG CGT AGG CAA GAG AAA ATC TTG CCT ACG CCA ACA GCT CCA ACT ACC GGT ACC-3'/서열번호：2)을 포함하는 변이체 k-ras 지향 dsRNA를 코드하는 화학 합성된 올리고 뉴클레오티드를 PCR에 의하여 이중 사슬 서열로 증폭하였다. SacI 및 KpnI에 의한 소화 후, 단편을 pPUR-tRNA의 tRNA 프로모터의 하류에 클로닝 하였다. 마우스 U6프로모터로부터 dsRNA를 발현시키기 위한 벡터의 구축에 대하여 dsRNA 서열의 삽입 공정 이외는 다른 문헌에서 기술되어 있다(Plehn-Dujowich, D. & Altman, S. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 95, 7327-7332., Kato, Y, et al. (2001) J.Biol.Chem., 276, 15378-15385).
루프 1(5'-GAA TTC GGT AGT TGG AGC TGT TGG CGT AGG CAA GAG AAA ATC TTG CCT ACG CCA ACA GCT CCA ACT ACC TCT AGA-3'/서열번호：3) 또는 루프 2(5'-GAA TTC GGT AGT TGG AGC TGT TGG CGT AGG CAA GAC UUC CUG UCA TCT TGC CTA CGC CAA CAG CTC CAA CTA CCC TCG AG-3'/서열번호：4)를 포함하는 k-ras 지향 dsRNA를 코드하는 화학 합성 올리고 뉴클레오티드를 특이적 업 프라이머 및 다운 프라이머(각각, EcoRI 및 XhoI 링커 서열을 포함한다)를 이용하여 이중 사슬 서열로서 PCR로 증폭하였다. EcoRI 및 XhoI로 소화 후 단편을 마우스 U6유전자 프로모터의 하류에 클로닝 하였다. 사람 U6프로모터의 경우 본 발명자 등은 pTZ U6+1(Bertrand, E. et al. (1997) RNA, 3, 75-88)를 사용하였다. 루프 1(5'-GTC GAC GGT AGT TGG AGC TGT TGG CGT AGG CAA GAG AAA ATC TTG CCT ACG CCA ACA GCT CCA ACT ACC TCT AGA-3'/서열번호：5) 또는 루프 2(5'-GTC GAC GGT AGT TGG AGC TGT TGG CGT AGG CAA GAC UUC CUG UCA TCT TGC CTA CGC CAA CAG CTC CAA CTA CCT CTA GA-3'/서열번호：6)를 포함하는 k-ras 지향성 dsRNA를 코드하는 화학 합성 올리고 뉴클레오티드를 특이적 업 프라이머 및 다운 프라이머(각각 SalI 및 XbaI 링커 서열을 포함한다)를 이용하여 이중 사슬 서열로서 PCR로 증폭하였다. SalI 및 XbaI로 소화한 후, 단편을 pTZ U6+1의 사람 U6유전자 프로모터의 하류에 클로닝 하였다.
(3) Dicer 지향 리보자임 발현 플라스미드 및 Dicer cDNA 발현 플라스미드의 구축
polIII 종결 서열(TTTTTT)을 가지는 Dicer 지향성 리보자임 서열을 코드하는 화학 합성 올리고 뉴클레오티드(5'-TCC CCG GTT CGA AAC CGG GCA CTA CAA AAA CCA ACT TTC AAA GAA AGC TGA TGA GGC CGA AAG GCC GAA ACC CAT TGG GGT ACC CCG GAT ATC TTT TTT-3'/서열번호：7)를 PCR에 의해 이중 사슬 DNA로 변환하였다. Csp45I 및 PstI로 소화 후 단편을 pUC-dt(Koseki, S.et al., J. Virol., 73, 1868-1877 (1999), Kawasaki H., et al. Nature, 393, 284-289 (1998), Kawasaki, H., & Taira, K., EMBO rep., 3, 443-450 (2002))의 tRNA 프로모터의 하류에 클로닝 하였다. 폴리(A) 연결 리보자임을 작성하기 위해서 본 발명자 등은 리보자임과 polIII 종결 서열과의 사이에 100 뉴클레오티드의 폴리(A) 서열을 삽입하였다(Kawasaki, H., & Taira, K. EMBO rep., 3, 443-450 (2002), Kawasaki, H. et al., Nature Biotechnol., 20, 376-380 (2002), Kawasaki, H., & Taira, K. Nucleic Acids Res., 30, 3609-3614 (2002), Warashina, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 98, 5572-5577 (2001)).
(4) 세포의 핵 분획과 세포질 분획의 조제
SW480 세포 또는 HeLa 세포를 세포 약 5×105 개로 증식시켜 EffectinTM 시약(QUIAGEN, Hilden, 독일)에 의해 tRNA-dsRNA 또는 U6-dsRNA 발현 벡터를 트랜스펙트 하였다. 트란스펙션 36시간 후, 세포를 회수하였다. 세포질 분획을 조제하기 위하여 회수한 세포를 PBS로 2회 세정하고 digitonin 용해 완충액(50 mM HEPES/KOH, pH 7.5, 50 mM 초산 칼륨, 8 mM MgCl2, 2 mM EGTA, 및 50 ㎍/ml digitonin으로 얼음상에서 10분간 재부유 시켰다. 용해물을 1,000 ×ｇ로 원심분리 하여 상청을 세포질 분획으로서 회수하였다. pellet를 NP-40 용해 완충액(20 mM 트리스 염산, pH 7.5, 50 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 및 0.5% NP-40)으로 재부유 시키고 얼음 상에서 10 분간 유지하여 얻어진 용해물을 핵 분획으로서 이용하였다.
(5) 노던블롯 분석
세포질 RNA 및 핵 RNA를 추출하여 ISOGEN 시약(Wako, Osaka, 일본)으로 세포질 분획 및 핵 분획으로부터 각각 정제하였다. 1 레인 당 total RNA 30 ㎍를 15% 폴리아크릴 아미드겔에 로딩하였다. 전기영동 후 RNA의 밴드를 하이 본드-N(등록상표) 나일론 멤브레인(Amersham Co., Buckinghamshire, 영국)에 전사하였다. k-ras 유전자의 서열과 상보적인 합성 올리고 뉴클레오티드로 멤브레인을 프로빙 하였다. 합성 프로브를 T4 폴리누클레오티드키나제(Takara Shuzo Co., Kyoto, 일본)에 의해 32 P표지하였다.
(6) RT-PCR 분석
RT-PCR은 RNA PCR Kit ver. 2(Takara, Kyoto, 일본)로 dicer 상류(nt. 1-24) 프라이머 및 하류(nt. 435-459) 프라이머, 또는 대조군으로서 GADPH 상류(nt. 230-254) 프라이머 및 하류(nt. 442-446) 프라이머를 이용하여 수행하였다. PCR 산물을 2% 아가로스 겔에서의 전기영동에 의해 분석하였다.
(7) 웨스턴블롯 분석
개개의 dsRNA-발현 벡터를 트랜스펙트한 SW480 세포 또는 HeLa 세포를 회수하였다. 단백질을 SDS-PAGE(10% 폴리아크릴아미드)에 의해 분해하여 일렉트로블롯팅에 의해 PVDF 멤브레인(Funakoshi, Tokyo, 일본)에 전사하였다. 면역 복합체는, K-Ras(UBI, CA, 미국) 및 액틴(Santa Cruz, CA, 미국)을 이용하여 특이적 폴리클로날 항체 ECL 킷(Amersham Co., Buckinghamshire, 영국)에 의해 가시화 하였다.
(8) 인비트로 RNAi 에세이
표적 RNA 절단에 관해서 본 발명자 등은 변이체 k-ras 주형 DNA(70 nt) 및 정상 k-ras 주형 DNA(70 nt)를 DNA 신디사이저에 의해 합성하였다. k-ras mRNA 기질을 조제하기 위해 주형 DNA를 T7 프로모터 서열을 포함하는 k-ras 특이적 업 프라이머 및 k-ras 특이적 다운 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다. 이러한 증폭된 k-ras DNA 주형을 T7 폴리머라제에 의해 전사하였다. 전사된 정상 및 변이체 k-ras mRNA 기질을 PAGE를 이용하여 추출하였다. 이들 mRNA는, T4 폴리누크레오티드키나제에 의해 32 P표지하였다. 표적 RNA 절단을 검출하기 위해서, 5~10 nM 표적 RNA를 tRNA-dsRNA 또는 U6-dsRNA를 발현하는 각 SW480 세포 용해물과 함께 표준적인 조건 하에서(Zamore, P. et al. Cell, 101, 25-33 (2000)) 25℃로 2시간 인큐베이트 하였다. k-ras mRNA에 타겟팅되는 siRNA의 경우, 100 nM siRNA를 SW480 세포 용해물에 있어 5~10 nM 표적 RNA와 함께 표준적인 조건 하에서(Zamore, P. et al. Cell, 101, 25-33 (2000)) 25℃로 2시간 인큐베이트 하였다.
(9) 세포 증식 속도의 검출
각 세포계의 증식 속도는 세포 증식 킷 II(Roche Ltd.,스위스)를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 측정하였다.
<실시예 1>　pol III 프로모터에 의해 제어되는 2 종류의 dsRNA 발현 플라스미드의 구축
긴 dsRNA가 핵 또는 세포질에서 Dicer에 의하여 어떻게 작용할지는 불명하기 때문에 본 발명자 등은 포유류 세포에 있어서의 dsRNA의 발현을 위해서 2 종류의 pol III 프로모터(사람 tRNAVal에 관한 유전자의 프로모터 및 마우스 U6프로모터 혹은 사람 U6프로모터)를 이용하였다. 적절히 디자인되면 tRNAVal에 관한 사람 유전자의 프로모터에서 생성되는 전사물을 세포질로부터 효율적으로 수송할 수 있다고 생각된다. 대조적으로, U6프로모터의 제어 하에서 전사된 작은 RNAs는 핵에 존재한다(Koseki, S.et al. J.Virol., 73, 1868-1877 (1999)).
다음으로 본 발명자 등은 신장된 스템 루프 RNA(도 1 A)로서 dsRNA를 tRNAVal 프로모터(tRNA-dsRNA), 마우스 U6프로모터(mU6-dsRNA) 또는 사람 U6프로모터(hU6-dsRNA)의 3' 말단에 결합시켰다. 본 발명자 등은 k-ras 유전자의 코돈 12에 있어 점 돌연변이를 가지는 K-Ras 변이체의 mRNA를 표적으로 한 dsRNA 발현 플라스미드를 구축하였다(도 1 B). 긴 dsRNA(＞30mer)는 mRNA의 비특이적 축소를 유도하기 때문에(Manche, L. et al., Mol. Cell. Biol. 12, 5238-5248 (1992), Minks, M. A. et al., J. Biol. Chem. 254, 10180-10183 (1979)), dsRNA 내의 이중 사슬 영역의 길이는 29 bp로 하였다.
U6에 근거하는 구축물의 경우, 본 발명자 등은 스템 루프 RNA의 2 종류의 루프 모티프를 사용하였다. 한편은 5 뉴클레오티드(5'-GAAAA-3')로 구성되는 루프 모티프, 즉 루프 1이다(도 1 A). 다른 한편은 마이크로 RNA(사람 mir-23;48) 루프 모티프, 즉 루프 2이다(도 1 A). 전구체 마이크로 RNA는 수송되고 처리된 마이크로 RNA는 전사 후 유전자 사이렌싱을 담당한다고 생각된다(Lagos-Quintana, M. et al., Science, 294, 853-858 (2001), Lee, Y. et al., EMBO J, 21, 4663-4670 (2002), Grishok, A. et al., Cell, 106, 23-24 (2001), Reinhart, B.J. et al., Nature, 403, 901-906 (2000), Lau, N.C. et al., Science, 294, 858-862 (2001), Lee, R.C. & Ambros, V., Science, 294, 862-864 (2001), Mourelatos, Z. et al., Genes Dev., 16, 720-728 (2002)).
<실시예 2>　tRNA Val 프로모터 제어 하 dsRNA의 세포질에 있어서의 Dicer 복합체에 의한 처리
RNAi에 있어서 긴 dsRNA는 길이가 약 21 및 22 뉴클레오티드로, RNase III 유사 반응(RNase III-like reaction)에 의해 점착(staggered) 3' 말단을 가지는 짧은 RNA 이중 사슬로 처리된다(Bernstein, E. et al. (2001) Nature, 409, 363-366). tRNA-dsRNA 및 U6-dsRNA가 포유류 세포에 있어서 RNase III 복합체에 의해 처리되는지 여부를 조사하기 위해 본 발명자 등은 k-ras mRNA 특이적 프로브를 이용하여 노던블롯 분석을 실시하였다.
tRNAVal 또는 U6프로모터의 제어 하에서 SW480 세포에 dsRNA 발현 플라스미드를 트랜스펙트 시켰다. 트랜스펙션 48시간 후, 세포를 회수하고 세포질과 핵 분획으로 분리하였다. 각 분획의 total RNA를 단리하여 15% 폴리아크릴아미드겔로 분획화 하였다. 도 2에 나타나듯이 tRNA-dsRNA를 발현하는 세포에 있어서 처리된 siRNA가 세포질 분획에서 검출되었지만, 핵 분획에서는 검출되지 않았다. 더욱이 처리된 siRNAs의 서열은 siRNA 클로닝 및 시퀀싱에 의해 확인되었다(데이터는 나타내지 않았다).
대조적으로, mU6-dsRNA 또는 hU6-dsRNA(루프 1)를 발현하는 세포에서는 대부분이 처리되어 있지 않은(unprocessed) 전구체 dsRNA가 핵에서 검출되었다. mU6-dsRNA 또는 hU6-dsRNA(루프 1)를 발현하는 세포의 핵 분획은 siRNA를 거의 포함하지 않았다. 그러나, mU6-dsRNA(루프 2) 및 hU6-dsRNA(루프 2)는 세포질에 수송되어 효율적으로 처리(processed)되었다(그림 2).
포유동물의 Dicer의 대부분이 in situ에 있어서의 면역 염색에 의해 세포질에서 검출되고 있다(Billy, E.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 98, 14428-14433 (2001)). 그 때문에 세포질에 수송된 tRNA-dsRNA, mU6-dsRNA(루프 2), 및 hU6-dsRNA(루프 2)는 Dicer 유사(Dicer-like) RNaseIII 복합체에 의해 처리되었다고 생각된다.
tRNA-dsRNA가 Dicer에 의해 처리될지 여부를 확인하기 위해서 본 발명자 등은 폴리(A) 연결 Dicer 지향 리보자임(Dicer-RzA100) 발현 플라스미드를 구축하였다. 그 다음에 이 플라스미드를 HeLa 세포에 안정하게 도입하였다. 안정적인 세포계는 네오마이신에 의한 선발에 의해 얻을 수 있었다. 그 후 Dicer-RzA100에 의한 dicer 유전자의 발현 억제를 조사하기 위해서 dicer mRNA 특이적 프라이머를 이용하여 RT-PCR 분석을 실시하였다.
도 3 A에 나타나듯이 Dicer-RzA100 발현 세포에 있어서의 dicer mRNA 레벨은 WT-HeLa 세포에 있어서의 dicer mRNA 레벨과 비교해 감소하였다. 대조군인 GADPH mRNA 레벨은 양 세포계에 있어 변화가 없었다. 이러한 결과로부터, Dicer-RzA100는 dicer mRNA를 특이적으로 절단하는 것을 알 수 있었다.
Dicer의 감소가 tRNA-dsRNA의 처리에 영향을 주고 있는지 여부를 조사하기 위해서, 본 발명자 등은 tRNA-dsRNA 발현 세포의 total RNA를 이용하여 노던블롯 분석을 실시하였다. 도 3 B에 나타나듯이 Dicer-RzA100 발현 세포의 total RNA의 경우, tRNA-dsRNA로부터 생긴 siRNA는 핵 및 세포질의 양쪽 모두에서 관찰되지 않았다. 따라서 이러한 결과로부터 tRNA-dsRNA가 세포질에서 Dicer에 의해 처리되는 것이 시사된다. 대조적으로 Dicer의 감소는 mU6-dsRNA(루프 1)의 처리에 영향을 주지 않았다. 따라서, mU6-dsRNA(루프 1)의 처리(processing)는 다른 RNaseIII 유사 효소에 의해 행해지고 있을 가능성이 있다.
<실시예 3>　tRNA-dsRNA, U6-dsRNA 혹은 합성 siRNA를 포함하는 세포 추출물을 이용한 in vitro 표적 mRNA 분해
dsRNA-매개 유전자 사이렌싱에 의한 표적 mRNA 분해가 어느 구획에 대해 일어날지 조사하기 위해서, 본 발명자 등은 tRNA-dsRNA의 전사물을 포함하는 세포 추출물을 이용하여 in vitro RNAi 에세이를 실시하였다. 이들 에세이에 있어 본 발명자 등은 in vitro로 T7 폴리머라제에 의해 기질로서 전사되는 변이체 및 정상 k-ras 부분적 mRNA를 이용하였다.
표적 mRNA를 절단하기 위해서, 각 기질을 tRNA-dsRNA 발현 벡터를 트랜스펙트한 SW480 세포 추출물과 함께 25℃로 2시간 인큐베이트 하였다. 5' 절단 산물을 시퀀싱겔 상에서 분해하였다. 도 4 A에 나타나듯이 변이체 k-ras mRNA 기질은 tRNA-dsRNA를 포함하는 세포 추출물의 세포질 분획에서 절단되었다(레인 4). 대조적으로 세포 추출물의 핵 분획에서는 기질은 절단되지 않았다(레인 3). RNAi 유도 사이렌싱 복합체(RNAi-induced silencing complex; RISC)는 리보솜 분획에 포함되는 것이 이전에 보고되어 있음(Zamore, P. et al. Cell, 101, 25-33 (2000), Bernstein, E. et al., Nature, 409, 363-366 (2001), Hammond, S.M. et al., Science, 293, 1146-1150 (2001))이 이러한 결과를 지지하는 것이다.
이러한 결과와는 대조적으로, 정상 k-ras mRNA 기질의 경우 기질의 5' 절단 산물은, 의미 있게 보다 적은 양이 검출되어 tRNA-dsRNA의 전사물을 포함하는 세포 추출물의 세포질 분획에서만 볼 수 있었다(도 4 A, 레인 2). 이러한 결과는 siRNA의 중심부에 미스매치 염기쌍 1개를 가지는 합성 siRNA에서는 드로소필라 멜라노가스타(Drosophila melanogaster)의 용해물과 in vitro RNAi 에세이를 이용하는 표적 RNA의 억제 효율이 감소하였다고 하는 보고와 일치하였다(Elbashir, S.M. et al., EMBO J., 20, 6877-6888 (2001)).
본 발명자 등은, tRNA-dsRNA로부터 생성된 siRNA가 시퀀싱 분석에 의해 siRNA 중앙의 위치에 있어 정상적인 k-ras mRNA에 대한 미스매치 염기쌍을 가지는 것을 확인하였고(데이터 없음), 변이체 k-ras mRNA에 타겟팅되는 합성 siRNAs를 이용하여 유사한 결과를 얻었다(도 4 B；Hutvagner, G. & Zamore, P.D., Science, 297, 2056-2060 (2002)). 이와 같이, 본 발명자 등의 결과에 의하여 dsRNA 매개 유전자 사이렌싱에 의한 표적 mRNA 분해도 마찬가지로 세포질에서 일어나 siRNA가 중앙 위치에 있어서 하나의 미스매치 염기쌍을 구별할 수 있음이 시사되었다.
<실시예 4>　결장 암 세포에 있어서의 tRNA-dsRNA에 의한 RNAi의 유효성과 특이성
사람 결장암 SW480 세포에 있어서의 tRNA-dsRNA에 의한 RNAi의 특이성과 유효성을 조사하기 위해서 본 발명자 등은 tRNA-dsRNA 및 4 종류의 U6-dsRNA 발현 플라스미드를 SW480 세포 및 HeLa 세포에 도입하였다. 변이체 k-ras 유전자는 SW480 세포에 한정하여 발현하였다(Mitchell, C.E. et al., Anal Biochem., 224, 148-153 (1995)). 본 발명자 등은, 대조군으로서 정상적인 k-ras 유전자를 발현하는 HeLa 세포를 이용하였다. 다음으로 본 발명자 등은 퓨로마이신 선발에 의해 tRNA-dsRNA 또는 각 U6-dsRNA를 발현하는 안정적인 세포주를 얻었다. 그 후 본 발명자 등은 K-Ras 특이적 항체를 이용한 웨스턴블롯 분석에 의해 tRNA-또는 각 U6-dsRNA를 발현하는 세포에 있어서의 K-Ras 단백질 레벨을 체크하였다. 정량을 위하여 밴드 강도를 NIH Image Analysys를 이용하여 덴시토메트리에 의해 분석하였다.
도 5에 나타나듯이 tRNA-dsRNA, mU6-dsRNA(루프 2) 혹은 hU6-dsRNA(루프 2)를 발현하는 SW480 세포의 K-Ras 단백질 레벨은 야생형(WT) SW480 세포와 비교하여 의미있게 감소했지만, mU6-dsRNA(루프 1) 혹은 hU6-dsRNA(루프 1)를 발현하는 SW480 세포에 있어서의 K-Ras 단백질 레벨은, 야생형 SW480 세포와 비교하여 거의 변화하지 않았다. 내부 대조군으로서의 액틴 단백질 레벨은 이러한 세포주에서 일정하였다. 또한, tRNA-dsRNA를 발현하는 HeLa 세포에 있어서 K-Ras 단백질 레벨은 야생형 세포 및 각 U6-dsRNA를 발현하는 세포와 비교하여 변화하지 않았다. 이러한 결과는 tRNA-dsRNA의 사람 암 세포에 있어서의 효율성 및 특이성을 명확하게 나타낸다.
다음으로, tRNA-dsRNA를 발현하는 세포의 표현형을 조사하기 위해서, 본 발명자 등은 이들 세포주의 증식속도를 분석하였다. 도 6에 나타나듯이, tRNA-dsRNA를 발현하는 SW480 세포의 증식 속도는, 야생형 SW480 세포보다 의미 있게 늦었다. 대조적으로, tRNA-dsRNA를 발현하는 HeLa 세포의 증식 속도는 야생형 SW480 세포와 비교하여 변함이 없었다. 이러한 결과는 tRNA-dsRNA를 발현하는 SW480 세포에 있어서의 증식 속도의 감소가 세포에 있어서의 K-Ras 단백질 레벨의 감소와 상관 이 있음을 나타낸다. 본 발명자 등의 tRNA-dsRNA를 변이체 k-ras에 타겟팅하는 것은, 치료 물질로서의 잠재적 유용성을 가질 것이다.
<실시예 5>　사람 Dicer 유전자의 클로닝 및 재조합 사람 Dicer(re-hDicer)의 정제
특정의 표적 mRNA 내의 다양한 부위를 타겟팅 할 수 있는 불균일 siRNA를 조제하기 위해서, 사람 세포에 있어서의 RNAi에 관여하는 사람 Dicer를 이용하였다. 우선, 본 발명자 등은 세균 발현계를 사용하여 재조합 사람 Dicer/HERNA(hDicer)를 제작하였다.
pBluescript 벡터(Stratagene, CA, 미국)에 삽입된 부분길이 사람 dicer/HERNA 유전자(nt 379~1657 및 nt 1390~7037)를 Dr.Matsuda(나고야 대학; Matsuda, S., Ichigotani, Y., Okuda, T., Irimura, T., Nakatsugawa, S. and Hamaguchi, M., Molecular cloning and characterization of a novel human gene (HERNA) which encodes a putative RNA-helicase. Biochim.Biophys. Acta., 1490, 163-169 (2000))로부터 분양받았다. 본 발명자 등은 특이적 프라이머(포워드 프라이머：5'-ATG AAA AGC CCT GCT TTG CAA CCC CT-3'/서열번호：8；리버스 프라이머：5'-AGT TGC AGT TTC AGC ATT ACT CTT-3'/서열번호：9)를 이용하여 HeLa cDNA 라이브러리로부터 dicer의 5' 말단측 코드 영역(183~902 위치의 염기)을 PCR에 의해 증폭하여 증폭된 DNA를 TA 클로닝 벡터(Invitrogen, CA, 미국)에 클로닝 하였다. 그리고, 상기 부분길이 사람 dicer(hDicer) cDNA로부터 전체 길이 사람 dicer 유전자를 클로닝 하였다. 그 다음에 hDicer의 전체 길이 cDNA를 절단하고 그러한 평활 말단 단편을 재조합 단백질의 정제를 위한 비오틴 태그를 포함하고 있는 PinPoint(등록상표)-Xa벡터(Promega, WI, 미국)에 EcoRV 부위를 이용하여 서브클로닝 하였다. 다음으로 hDicer 발현 플라스미드(phDicer)를 의 비오틴과 함께 대장균에 도입하고 100 uM IPTG에 의해 발현을 유도하였다. 그 후 세포를 회수하고 5,000 rpm로 10분간 원심분리하여 침전시켜 세포 용해용 완충액［100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1mM DTT, 2 mM PMSF, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)］에 재현탁 하였다.
그 뒤 제조업자의 프로토콜에 따라, 스트렙트아비딘을 결합시킨 SoftLink TM 수지(Promega)를 이용한 「풀다운(pull-down)」법에 따라 re-hDicer의 조제액(0.5㎍)의 등량액을 정제하고 Xa 인자 프로테아제를 사용하여 비오틴 태그로부터 단 리하였다. 이 hDicer를 SDS-PAGE(10% 폴리아크릴아미드)로 분획화하여 일렉트로블롯팅에 의해 PVDF막(Funakoshi Co., Tyokyo, 일본)에 전사하였다. 그리고 ECL킷(Amarsham, Buckinghamshire, 영국)과 스트렙트아비딘, 알칼라인 포스포타제를 사용하여 가시화하는 웨스턴블롯팅에 의해 검출하였다.
그 결과, 도 7 A에 나타낸 것처럼, 비오틴 태그를 가지는 재조합 hDicer가 웨스턴블롯팅에 의해 검출되었다. re-hDicer의 추정 분자량은 대략 220 kDa이다. 대조적으로 hDicer 유전자를 코드하고 있지 않는 목크(Mock) 벡터에서는 동 단백질을 얻을 수 없었다. 따라서, 재조합 hDicer는 이 발현계를 사용하여 제작될 수 있는 것이 밝혀졌다.
<실시예 6>　인비트로 프로세싱 에세이
다음으로, 재조합 hDicer가 RNaseIII 활성을 가지는 것을 확인하기 위하여 인비트로 전사에 의해 제작한 장쇄 dsRNA를 사용하여 인비트로 프로세싱 에세이를 수행하였다.
우선, 기질로서 이용하는 장쇄 dsRNA를 제작하기 위하여 퓨로마이신 내성 유전자(nt 1~300), H-ras 유전자(nt 370~570), c-jun 유전자(nt 1~200), 및 c-fos 유전자(nt 1~200)를, T7 프로모터를 포함하는 특이적 포워드 프라이머와 SP6 프로모터를 포함하는 특이적 리버스 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다. 그 뒤 T7 RNA 폴리머라제에 의해 센스 사슬 RNA를 생성시키고 SP6 RNA 폴리머라제에 의해 안티센스 사슬 RNA를 생성시켰다. 퓨로마이신 내성 mRNA 및 H-ras mRNA에 대한 siRNA는 모두 일본 Bio Service(JBioS) Co Ltd. (Saitama, 일본)에 의해 합성하였다. 그 다음에 이러한 RNA를 표준적인 방법을 사용하여 어닐링 시켰다(Elbashir, S.M., Lendeckel, W. and Tuschl, T., RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev., 15, 188-200 (2001)).
hDicer의 활성을 조사하기 위하여, 10 ㎍의 dsRNA와 1 ㎍의 re-hDicer를 200㎕의 반응용 완충액［100 mM NaCl, 20 mM HEPES, 1 mM ATP, 5 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl (pH 7.0) 내에서 혼합하였다. 상기 MgCl2는 첨가 혹은 첨가하지 않고 사용하였다. 이 혼합액을 37℃로 30 분간 인큐베이트 한 후, 20 ㎕의 반응 혼합액을 비변성 12% 폴리아크릴아미드겔로 전기영동하여 분획화 하였다. Syber TM green II시약(Nippon Gene, Toyama, 일본)을 이용하여 RNA 밴드를 검출하였다.
QIAquick TM 뉴클레오티드 제거용 킷(QIAGEN, Hilden, 독일)을 이용하여 이 반응혼합액으로부터 21~23 염기 길이의 siRNA를 회수하였다. siRNA는 에탄올로 침전시키고 나서 TE 완충액에 용해하였다. 260 nm에 있어서의 흡광도를 측정하여 diced-siRNA의 농도를 산정하였다.
결과, 도 7 B에 나타낸 것처럼 재조합 hDicer 의 존재 하에서는 20~25 nt의 siRNA가 생성하였다. 대조적으로 재조합 hDicer 또는 Mg2+이온의 비존재 하에서는 이러한 siRNA는 검출되지 않았다(레인 1 및 3). 따라서, 재조합 hDicer는 dsRNA 프로세싱 활성을 의미있게 나타내고 또 re-hDicer는 Mg2+에 의존한 dsRNA 프로세싱 활성을 나타냈다. 곤충 세포에 있어서도 재조합 hDicer가 리보뉴클라아제 III 활성을 나타내는 것이 최근 보고되었다(Harborth, J.et al., Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs. J.Cell Sci., 114, 4557-4565 (2001), Provost, P. et al., Ribonuclease activity and RNA binding of recombinant human Dicer. EMBO J., 21, 5864-5874, (2002)).
<실시예 7>　퓨로마이신 내성 유전자를 표적으로 한 diced-siRNA의 효과
포유동물 세포에 있어서, 합성 21nt siRNA가 리포터 유전자 및 내인성 유전자 양쪽 모두의 발현을 의미있게 억제하는 것이 알려져 있다(Elbashir, S.M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K. and Tuschl, T., Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in mammalian cell culture. Nature, 411, 494-498 (2001) ; Harborth, J., Elbashir, S.M., Bechert, K., Tuschl, T. and Weber, K.,. Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs. J. Cell Sci., 114, 4557-4565 (2001) ; Holen, T., Amarzguioui, M., Wiiger, M.T., Babaie, E. and Prydz, H., Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor. Nucleic Acids Res., 30, 1757-1766 (2002)).
장쇄 dsRNA(＞30 nt)는 IFN에 의해 매개되는 방어 경로에 관여하고 있는 PKR 및 2', 5'-올리고아데닐산합성 효소를 활성화 하지만, 이러한 비교적 짧은 siRNA는 이러한 효소의 활성화를 회피함과 함께 RNAi 경로를 활성화 할 수 있다. 따라서 이러한 siRNA는 유전자 발현에 있어서의 서열 특이적 유전자 사이렌싱에 유용하다.
그러나, siRNA는 표적 부위 의존성을 가지는 것이 보고되고 있고(Holen, T., Amarzguioui, M., Wiiger, M.T., Babaie, E. and Prydz, H., Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor. Nucleic Acids Res., 30, 1757-1766 (2002)), 최고의(효율적인) 표적 부위를 예측하는 것은 매우 곤란하다.
siRNA의 표적 부위 의존성은 사람 조직 인자(hTF) 유전자에서 밖에 조사되어 있지 않기 때문에(Holen, T., Amarzguioui, M., Wiiger, M.T., Babaie, E. and Prydz, H., Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor. Nucleic Acids Res., 30, 1757-1766 (2002)), 본 발명자 등은 나아가 퓨로마이신 내성 유전자를 표적으로 하는 siRNA의 표적 부위 의존성을 이 유전자 내 이하에 나타내는 10개의 표적 부위(부위 1~10)를 선택함으로써 검토하였다(도 8 A 및 8 B).
부위 1：5'- ATG ACC GAG TAC AAG CCC A -3'/서열번호：10；
부위 2：5'- CTC GCC ACC CGC GAC GAC G -3'/서열번호：11；
부위 3：5'- CAC CGT CGA CCC GGA CCG C -3'/서열번호：12；
부위 4：5'- GAA CTC TTC CTC ACG CGC G -3'/서열번호：13；
부위 5：5'- GGT GTG GGT CGC GGA CGA C -3'/서열번호：14；
부위 6：5'- CAG ATG GAA GGC CTC CTG G -3'/서열번호：15；
부위 7：5'- GGA GCC CGC GTG GTT CCT G -3'/서열번호：16；
부위 8：5'- GGG TCT GGG CAG CGC CGT C -3'/서열번호：17；
부위 9：5'- CCT CCC CTT CTA CGA GCG G -3'/서열번호：18；
부위 10：5'- GCC CGG TGC CTG ACG CCC G -3'/서열번호：19
GL3-루시퍼라제를 표적으로 하는 siRNA를 대조군으로서 사용하였다. diced-siRNA 구축을 위하여 퓨로마이신 내성 유전자의 부분 길이 mRNA의 센스 사슬 및 안티센스 사슬(1~300 nt)의 양쪽 모두를 T7 RNA 폴리머라제 및 SP6 RNA 폴리머라제에 의해 인비트로에서 전사하고 재조합 hDicer에 의해 처리하였다. dsRNA를 인비트로에서 단편화하고 나서, QIAquick TM 뉴클레오티드 제거용 킷을 이용해 겔 추출법에 의해 diced-siRNA를 정제하였다. 그 뒤, 각 siRNA(20 nM) 및 퓨로마이신 내성 유전자 발현 플라스미드를 OligofectaminTM(Invitrogen) 시약을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 HeLa 세포에 도입하였다. HeLa 세포는 10% FBS를 첨가한 DMEM 으로 배양하였다. 36시간 후, HeLa 세포를 퓨로마이신으로 처리하고 세포 생존률을 trypan blue 염색을 이용하여 측정하였다. 각 siRNA의 형질전환 효율은 Renilla 루시퍼라제 리포터 유전자를 이용하여 측정하였다.
도 8 B에 나타나듯이, GL3 루시페라제를 표적으로 하는 siRNA의 존재 하에서는 세포 생존률은 야생형 HeLa 세포와 비교하여 변화가 없었다. 부위 2, 부위 3, 부위 4, 부위 5, 및 부위 10에 대하여 특이적인 siRNA로 처리한 세포의 생존률은, 야생형 세포와 비교하여 의미 있게 감소하고 있다. 대조적으로 부위 1, 부위 6, 부위 7, 부위 8, 및 부위 9에 대한 siRNA는 비교적 낮은 저해 활성을 나타냈다.
이러한 결과는 퓨로마이신 내성 유전자에 특이적인 siRNA의 효율은 표적 mRNA 내의 표적 부위에 의존하고 있는 것을 나타낸다. 예상대로 특정의 mRNA에 대해 제한을 두지 않는 타겟팅 부위로 구성되는 diced-siRNA는 어떠한 특이적인 siRNA 보다도 또는 부위 1, 부위 2, 부위 3, 부위 4, 및 부위 5의 siRNA를 혼합한 것보다도 효율적이었다.
나아가 표적 부위의 GC 함량 및 표적 유전자의 2차 구조를 해석했는데, mfold 프로그램의 예상에 의하면(도 8 B;Z영국er, M.et al., Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide. RNA Biochemistry and Biotechnology, Barciszewski, J., & Clark, B.F.C. (eds), Kluwer Academic Publishers, Hingham, MA, 미국. (1999)) 2차 구조 또는 GC 함량(표 1)의 어느 것도 표적 부위의 유효성과 명확하게 상관관계가 있다고는 인식되지 않았다.
퓨로마이신 내성 mRNA H-ras mRNA
GC(%) 저해(%) GC(%) 저해(%)
표적부위 1 52.6 37.2 36.0 63.2
표적부위 2 78.9 88.6 78.9 81.7
표적부위 3 78.9 86.9 52.6 78.6
표적부위 4 63.1 79.5 57.8 87.8
표적부위 5 73.6 84.6 42.0 70.5
표적부위 6 73.6 24.8 68.4 45.3
표적부위 7 73.6 45.1 68.4 23.6
표적부위 8 78.9 40.5 73.6 36.8
표적부위 9 68.4 36.8 63.1 74.2
표적부위 10 84.0 78.2 57.8 82.1
표적 유전자의 경우에는 표적 유전자의 20~280 nt 영역 및 3' 말단 근방 영역을 표적으로 하는 siRNA가 시험한 한도에서는 다른 것과 비교해서도 상당히 효율적이었다.
<실시예 8>　H-ras 유전자를 표적으로 한 diced-siRNA의 효과
또한, 내인성 유전자 발현에 대한 diced-siRNA의 효과를 확인하기 위하여 표적으로서 H-ras 유전자를 선택하였다. H-ras 유전자는 K-ras 및 N-ras도 포함하는 ras 유전자 패밀리의 멤버이다(Adjei, A.A., Blocking oncogenic Ras signaling for cancer therapy. J.Natl. Cancer Inst., 93, 1062-1074 (2001)). 또, siRNA의 표적 부위 의존성을 확인하기 위하여 H-ras 유전자 내 이하에 나타내는 10개의 표적 부위(부위 1~10)를 선택하였다(도 9 A 및 9 B).
부위 1：5'- ATG ACG GAA TAT AAG CTT G -3'/서열번호：20；
부위 2：5'- GTT GGC GCC GGC GGT GTG G -3'/서열번호：21；
부위 3：5'- TAC GAC CCC ACT ATA GAG G -3'/서열번호：22；
부위 4：5'- AGG AGG AGT ACA GCG CCA T -3'/서열번호：23；
부위 5：5'- CAA CAC CAA GTC TTT TGA G -3'/서열번호：24；
부위 6：5'- GGA CTC GGA TGA CGT GCC C -3'/서열번호：25；
부위 7：5'- TCT CGG CAG GCT CAG GAC C -3'/서열번호：26；
부위 8：5'- GAC CCG GCA GGG AGT GGA G -3'/서열번호：27；
부위 9：5'- GCT GCG GAA GCT GAA CCC T -3'/서열번호：28；
부위 10：5'- GTG TGT GCT CTC CTG AGG A -3'/서열번호：29
diced-siRNA를 구축하기 위하여 우선 H-ras 유전자에 있어서의 다른 ras 패밀리 멤버와 상동성이 낮은 영역을 탐색하였다. H-ras 유전자의 3' 영역에 상당하는 영역(300~500 nt)을 장쇄 dsRNA 기질로서 선택하여 재조합 hDicer에 의해 처리하였다. H-ras 유전자를 표적으로 하는 diced-siRNA를 <실시예 6>과 같은 방법에 의해 제작하였다. 각 siRNA(20 nM)를, OligofectaminTM 시약(인비트로젠사)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 HeLa 세포에 도입하였다. 36시간 후, 각 siRNA로 트랜스펙트 된 HeLa 세포를 수집하여 각 세포로부터 전(全) 단백질을 추출하였다. H-Ras 단백질의 레벨을 H-ras 특이적 항체를 이용하여 웨스턴블롯팅에 의해 검출하였다. 내부 대조군으로서 액틴을 사용하였다.
자세하게는, H-Ras 단백질을 SDS-PAGE(10% 폴리아크릴아미드)에 의해 분획화하고 나서, 일렉트로블롯팅에 의해 PVDF막(Funakoshi, Tokyo, 일본)에 전사하였다. H-Ras, N-Ras, K-Ras, c-Jun, c-Fos 및 내부 대조군으로서의 액틴에 대한 특이적 폴리클로날 항체(항H-Ras 폴리클로날 항체：Oncogene Research Products 사제, CA, 미국；항N-Ras 폴리클로날 항체：Oncogene Research Products 사제；항K-Ras 폴리클로날 항체：Oncogene Research Products 사제, 항c-Jun 폴리클로날 항체：Santa Cruz Biotechnology 사제, 산타 클로스, CA, 미국；항c-Fos 폴리클로날 항체(Santa Cruz Biotechnology 사제)；및 항액틴 폴리클로날 항체：Oncogene Research Products 사제)를 이용하여 ECLTM 킷에 의해 면역 복합체를 가시화하였다. 덴시토메트리 및 NIH Image Analysis에 의해 정량화 하였다.
그 결과, 도 9 C에 나타낸 것처럼 부위 2, 부위 3, 부위 4, 부위 5 및 부위 9에 대한 siRNA로 처리된 세포에 있어서는 H-Ras의 레벨이 야생형 HeLa 세포와 비교하여 의미 있게 감소하고 있다. 대조적으로, 부위 1, 부위 6, 부위 7, 및 부위 8에 대한 siRNA는 비교적 낮은 저해 활성을 나타내었다.
액틴의 레벨을 참조하여 결과를 표준화 했는데, siRNA의 효율은 내인성 H-ras 유전자에 있어서의 표적 부위에 의존하는 것을 나타내고 있다. 퓨로마이신 내성 유전자의 경우도, H-ras 유전자의 경우에도, 이러한 유전자의 중앙의 영역을 표적으로 한 합성 siRNA의 효율은 낮았다. diced-siRNA에 대해서는 조사한 한도에서는 다른 siRNA의 어느것보다도 유효하고 또, H-ras 유전자를 표적으로 하는 siRNA를 혼합한 것(부위 7, 부위 8, 부위 9 및 부위 10의 siRNA)보다도 유효하였다.
나아가 diced-siRNA 처리 세포에 있어서 관련 단백질 K-Ras 및 N-Ras의 레벨은 야생형 HeLa 세포와 비교하여 변화가 없었다(도 9 D). 따라서, diced-siRNA는 K-ras 유전자의 발현에도 N-ras 유전자의 발현에도 영향을 주지 않았다.
또한, 도 8 B에 나타낸 것과 같은 구조 해석을 수행하였지만(도 9 B), GC 함량(표 1)과 siRNA에 의한 저해 정도가 상관함을 나타낼 수 없었다. 이전의 연구에서 얻을 수 있던 결과는 siRNA, 올리고 뉴클레오티드, 및 리보자임의 효과에는 공통의 특징이 있는 것을 시사하고 있었기 때문에(Miyagishi, M. et al., Comparison of the suppressive effects of antisense oligonucleotides and siRNAs directed against the same targets in mammalian cells. Antisense Nucleic Acid Drug Develop., in press. (2003)), 이러한 추정상의 관계를 보다 정확하게 조사하기 위해서는 (예를 들면, 도 9 B에 나타낸 컴퓨터 예측에 의한 2차 구조 보다도) 인비트로 및 인비보에 있어서의 표적 mRNA와의 접촉 가능성에 관한 실험 데이터가 한층 더 필요하게 될 가능성이 높다고 생각된다.
여기에서도, H-ras의 경우에는, 표적 유전자의 일정한 영역(20~280 nt, 및 3' 말단 근방)을 표적으로 하는 siRNA가, 다른 영역을 표적으로 하는 siRNA보다 유효하고, 또, 여기에서도, 단편화한 siRNA가 각 siRNA나 혼합 siRNA보다 훨씬 유효하였다 (도 9 C). 이러한 결과는 퓨로마이신 내성 유전자에서 얻어진 결과와 같았다. diced-siRNA가 각 siRNA보다 활성이 높은 것은 단지, 메신저 RNA 상의 다수의 부위를 표적으로 하는 것의 상가(相加) 효과에 의한 것이라고도 생각된다.
그러나, siRNA를 혼합한 것(부위 7, 부위 8, 부위 9 및 부위 10의 siRNA)에 의한 결과에 의해서는 이 해석이 뒷받침되지 않았다. 그보다도 siRNA의 효과는 표적 부위의 얼마 안되는 차이에 의해서도(단지 수 염기 차이 만으로도) 변화한다고 할 가능성이 높고, 그 때문에 diced-siRNA는 각 siRNA의 편성보다도, 더욱 유효성이 높은 siRNA 집단을 몇개나 포함하고 있다고 생각된다. 이러한 결과는 diced-siRNA가 개개의 합성 siRNA보다도 분명하게 유익하다는 것을 시사하는 것이다.
<실시예 9>　c-jun mRNA 또는 c-fos mRNA를 표적으로 한 diced-siRNA의 효과
나아가 diced-siRNA의 효과를 확인하기 위하여, 본 발명자 등은 c-jun mRNA 또는 c-fos mRNA 각각에 대한 diced-siRNA를 구축하였다. 우선, c-jun 유전자(1~200 nt), 또는 c-fos 유전자(1~200 nt)의 5' 영역에 상당하는 장쇄 dsRNA를 제작하고, 재조합 hDicer에 의해 처리하였다. diced-siRNA는 <실시예 6>과 같은 방법으로 제작하였다. 그 다음에 이러한 diced-siRNA를 HeLa 세포에 도입하였다. 36시간 후, 이들 세포를 수집하여 각 세포로부터 전 단백질을 추출하였다. c-Jun 단백질 또는 c-Fos 단백질의 레벨을 각 특이적 항체를 이용한 웨스턴블롯팅을 이용하여 검출하였다.
그 결과, 도 10에 나타나듯이, diced-siRNA로 형질전환된 세포에 있어서는 c-Jun의 레벨이 야생형 HeLa 세포와 비교하여 의미 있게 감소하고 있다. 형질전환 세포에서도 야생형 세포에서도, 액틴의 발현 레벨은 변화하지 않았다. 같은 결과를 c-fos mRNA에 대한 diced-siRNA의 경우에도 얻을 수 있었다.
이들 결과로부터 diced-siRNA가 사람 세포에 있어서 특정 유전자를 사이렌싱 상태로 하는데 지극히 유용하다는 가능성이 제시되었다.
<실시예 10>　여러 가지 shRNA를 코드하는 플라스미드의 구축
본 발명자 등은 shRNA, 즉, tRNAVal 프로모터에 기초하는 shRNA(tRNAi), 사람 U6프로모터에 기초하는 shRNA(hU6i), 및 마우스 U6프로모터에 기초하는 shRNA(mU6i)의 3 종류의 tRNA-shRNA 발현용 벡터를 구축하였다. pPUR(Clontech, CA, 미국)의 EcoRI 부위와 BamHI 부위와의 사이에, 사람 tRNAVal 유전자의 화학 합성 프로모터를 포함하는 pPUR-tRNA 플라스미드를 사용하였다. 이들 구축물은 각각 사람 erbB2 유전자의 전사물을 표적으로 한 것이다(도 11 A).
본 발명자 등은 erbB2 mRNA 내에 5개의 표적 부위(부위1:5＇-AAG UGU GCA CCG GCA CAG ACA UGA AGC UG-3＇/서열번호：31, 부위2:5＇-ACC CAC CUG GAC AUG CUC CGC CAC CUC UA-3＇ /서열번호：32, 부위3:5＇-UGC UCA UCG CUC ACA ACC AAG UGA GGC AG-3＇ /서열번호：33, 부위4:5＇-AAG AUC CGG AAG UAC ACG AUG CGG AGA CU-3＇ /서열번호：34, 부위5:5＇-GAC ACA GCU UAU GCC CUA UGG CUG CCU CU-3＇ /서열번호：35), 및 GFP mRNA 내에 1개의 부위(5＇-GGC AAG CUG ACC CUG AAG UUC ATC TGC AC-3＇ /서열번호：36)를 선택하였다(도 11 B). 루프 서열(5＇-GAAAA-3＇)로 연결된 센스 사슬(29nt) 및 안티센스 사슬(29nt) erbB2 유전자를 코드하는 화학 합성 올리고 뉴클레오티드를, 특이적 업 프라이머 및 다운 프라이머를 이용하여 이중 사슬 서열로서 PCR로 증폭하였다. SacI 및 KpnI로 소화한 후 단편을 pPUR-tRNA의 tRNA 유전자 프로모터 하류에 클로닝 하였다. mU6 및 hU6 프로모터로부터 dsRNA 발현용 벡터의 구축은 문헌(Tuschl, T. Expanding small RNA interference., Nature Biotechnol., 20, 446-448 (2002)., Kato, Y., Kuwabara, T., Warashina, M., Toda, H., & Taira, K. Relationships between the activities in vitro and in vivo of various kinds of ribozyme and their intracellular localization in mammalian cells. J. Biol. Chem., 276, 15378-15385 (2001)., Ohkawa, J., & Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Human Gene Therapy 11, 577-585 (2000))에 기재되어 있다.
<실시예 11>　세포의 배양 및 트랜스펙션
MCF-7 사람 유방암 세포는 10% FBS, 1% 비필수 아미노산 용액, 및 1 mM 피루빈산나트륨을 첨가한 MEM(ICN Biomedicals, Inc., 미국) 으로 배양하였다.
MCF-7 세포를 약 5×106 세포/10 cm 디쉬까지 증식시켜, EffectinTM 시약(QUIAGEN)을 이용하여 tRNA-dsRNA, hU6-dsRNA 또는 mU6-dsRNA 발현 벡터로 트랜스펙트 하였다.퓨로마이신과 2 주간 인큐베이션 하여 안정화된 tRNA-shRNA 또는 U6-shRNA를 발현하는 형질전환 MCF-7 세포를 선별하였다.
<실시예 12>　세포의 핵 분획 및 세포질 분획의 조제
트랜스펙션 36시간 후에 세포를 수집하였다. 세포질 분획을 조제하기 위하여, 수집한 세포를 PBS로 2회 세정하고 digitonin 용해 완충액(50mM HEPES/KOH(pH7. 5), 50 mM 초산 칼륨, 8mM MgCl2, 2mM EGTA, 및 50 uM/ml digitonin)으로 얼음 상에서 10분간 재현탁 하였다. 용해 산물을 1,000 ×g에서 원심분리하고 상청을 세포질 분획으로서 수집하였다.
또, pellet를 NP-40 용해 완충액(20mM Tris-HCl(pH7. 5), 50mM KCl, 10mM NaCl, 1mM EDTA, 및 0.5% NP-40)에 재현탁하고 얼음 상에서 10 분간 유지시켰다. 그 결과 얻어진 용해 산물을 핵 분획으로서 사용하였다.
<실시예 13>　MCF-7 세포에 있어서의 shRNA 발현 확인
나아가 <실시예 11>에서 얻어진 형질전환 MCF-7 세포에 있어서 여러 shRNA의 발현을 확인하였다. 세포질 RNA 및 핵 RNA를 추출하고 ISOGENTM시약(Wako, Osaka, 일본)을 이용하여 각각 세포질 분획 및 핵 분획을 정제하였다. 레인 1개에 대하여 30 ㎍의 총 RNA를 전기 영동을 하기 위하여 12% 폴리아크릴아미드겔에 로드하고 이 후, RNA의 밴드를 Hybond-NTM 나일론막(Amersham Co., Buckinghamshire, 영국)에 전사하였다. 상기 막을 erbB2 유전자 내의 서열에 상보적인 합성 올리고 뉴클레오티드(5＇-AAG TGT GCA CCG GCA CAG ACA TGA AGC TG-3＇ /서열번호：37)로 프로브 하였다. 각각의 합성 프로브는 AlkPhos Direct Labelling and Detection 시스템(Amersham Co.)을 이용해 표지하였다.
그 결과, 도 11 C에 나타나듯이, tRNA-shRNA 발현 세포의 세포질에서 전구체 shRNA 및 프로세싱된 siRNA를 검출하였다(레인 2). 대조적으로, hU6-shRNA 또는 mU6-shRNA 발현 세포의 핵에서 전구체 shRNA 및 소량의 siRNA를 검출했지만(레인 3 및 5), 세포질에서는 검출하지 못했다(레인 4 및 6).
이러한 결과로부터, tRNA-shRNA가 세포질로 효율적으로 수송된 것을 알 수 있었고 siRNA가 Dicer에 의해 전구체 shRNA로부터 생성된 가능성이 시사되었다.
<실시예 14>　tRNA-shRNA의 발현 조절을 위한 테트라사이클린 의존성 유도 시스템의 구축
테트라사이클린 의존 유도시스템을 구축하기 위해서, 7 카피의 테트라사이클린 오퍼레이터 서열(5＇-TTT ACC ACT CCC TAT CAG TGA TAG AGA AAA GTG AAA GTC GAG-3＇ /서열번호：38)을 pPUR-tRNA-shRNA의 tRNA 프로모터 하류에 삽입하였다. MCF-7-TR세포계를 구축하기 위해서 테트라사이클린 리프렛서 유전자를 코드하는 pTet-Tts(Clontech)를 네오마이신 내성 유전자를 코드하는 pcDNA3. 1-neo(Invitrogen), CA, 미국)과 함께 MCF-7 세포에 도입하였다. MCF-7-TR 세포계는 네오마이신에 의한 선별에 의해 얻었다. tRNA-shRNA의 발현 조절을 위해서 본 발명자 등은 shRNA 전사의 유도 물질로서 여러 가지 농도의 독시사이클린(클론텍)를 사용하였다.
<실시예 15>　erbB2 유전자 발현에 대한 shRNA의 영향
MCF-7 세포에서 erbB2 유전자 발현에 대한 shRNA의 영향, 즉, tRNAi-ErB2, hU6i-ErB2, 및 mU6i-ErB2의 영향을 조사하기 위해서 ErB2 특이적 항체를 이용하여 웨스턴블롯팅 분석을 실시하였다.
개개의 shRNA를 코드하는 벡터로 트랜스펙트된 MCF-7 세포를 수집하였다. 단백질을 SDS-PAGE(10% 폴리아크릴아미드)에 의해 분리하고 일렉트로블롯팅에 의해 PVDF 막(Funakoshi Co., Tokyo, 일본)에 전사하였다. ECL 검출 킷(Amersham Co.) 및 ErbB2에 대한 폴리클로날 항체(Oncogene, CA, 미국) 및 내인성 대조군으로서 액틴에 대한 폴리클로날 항체(Oncogene)를 이용하여 면역 복합체를 시각화 하였다. 정량을 위해서 밴드의 강도를 NIH Image Analysis 프로그램을 이용하여 덴시토메트리에 의해 분석하였다. ErbB2 단백질 레벨은 액틴 레벨을 이용하여 표준화 하였다.
그 결과, 도 11 D에 나타나듯이, tRNAi-ErB2(부위 2 및 3 지향), hU6i-ErB2(부위 2), 및 mU6i-ErB2(부위 2)를 발현하는 MCF-7 세포에 있어서의 ErB2 단백질 레벨은 야생형 MCF-7 세포 보다 의미 있게 적었다. 게다가 그 효과는 표적 부위의 선택에 의해 좌우되었지만, tRNAi-ErB2의 영향은 적어도 hU6i-ErB2의 영향과 동일한 정도, 혹은 그 이상이었다. 내인성 대조군으로서 선택된 액틴의 레벨은 모든 세포계에서 일정하였다. 이들 결과로부터 erbB2 전사물에 대한 RNAi에 있어서 세포질 tRNA-shRNA의 유용성이 분명히 증명되었다.
<실시예 16>　tRNA-shRNA 발현 트랜스제닉(transgenic) 마우스
나아가 본 발명자 등은 본 발명의 tRNA-shRNA가 마우스에서 기능할 수 있을지 여부를 tRNA-shRNA를 발현하는 트랜스제닉(transgenic) 마우스를 제작하여 조사하였다.
녹색 형광 단백질(GFP)(Okabe M, , Ikawa M. Kominami K. Nakanishi T., & Nishimune Y. 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett., 407, 313-319 (1997)) 유전자를 가지는 트랜스제닉(transgenic) 마우스를 사용하여 이 유전자를 tRNA-shRNA(tRNAi-E126), hU6-shRNA(hU6-E126), 및 mU6-shRNA(mU6-E126)의 표적으로서 사용하였다(도 12 A; E126는 GFP 유전자 서열의 일부이다). tRNAi-E126, mU6-E126, 및 mU6-E126를 각각 코드하는 발현 플라스미드의 정제 SalI 단편을, GFP 발현 수컷 마우스(Baer, M., Nilsen, T.W., Costigan, C., & Altman, S. Structure and transcription of a human gene for H1 RNA, the RNA component of human RNase P. Nucleic Acids Res. 18, 97-103 (1990))의 정자와 수정시킨 야생형 란(卵)에 주입하였다. 그 후 100개의 DNA 주입란을 가임신 마우스에 이식하였다. 트랜스 유전자의 삽입은 서던블롯팅 분석으로 조사하였다.
주입난으로부터, tRNAi-E126, mU6-E126, 및 mU6-E126를 각각 발현하는 트랜스제닉(transgenic) 8 세포 상실배 및 배반포를 발생시켰다. 이들 세포에 있어서의 GFP 발현을 조사하기 위해서 녹색 형광의 검출을 자외선(254 nm) 조사에 의해 수행하였다. 또한, 생후 3일된 tRNA-shRNA 트랜스제닉(transgenic) 마우스에 자외선(254nm)을 조사하였다. 자외선 하에서 디지털 카드 카메라(DS-505;Fujix, 일본)(필터 없음)를 이용하여 사진을 촬영하였다.
그 결과, 도 12 B에 나타나듯이, tRNAi-E126를 발현하는 상실배에 자외선을 조사했을 때, 상실배는 녹색 형광을 발하였다. 대조적으로, mU6-E126 또는 mU6-E126를 발현하는 상실배는 녹색 형광을 발하였다. 같은 결과가 배반포기에서 얻어진 것으로부터(도 13 A) tRNAi-E126의 효력이 유지되고 있는 것을 알 수 있었다. 나아가, tRNAi-E126 트랜스제닉(transgenic) 마우스 신생자가 발하는 녹색 형광은 WT(GFP 발현) 마우스보다 의미있게 적었다(도 13 B). 이들 결과로부터, tRNAi-E126는 8 세포 상실배 및 배반포 뿐만이 아니라 마우스 신생자에 있어서도 서열 특이적 유전자 사이렌싱을 유도하는 것을 알 수 있었다.
<실시예 17>　RNAi 유도 발현계의 개발
다음으로 본 발명자 등은 tRNAi의 잠재적인 유용성을 고려하여 장래 하우스키핑 유전자의 기능 분석을 목표로 하고 RNAi의 유도발현계의 개발을 시도하였다. 상세하게 설명하자면, 본 발명자 등은 tRNAVal 프로모터에 장착한 TetO7를 이용하여 tRNAi 발현의 제어를 시도하였다(도 14 및 15). TetO7계는, 유전자 발현의 「On/off」스위치로서 기능한다.
우선, 본 발명자 등은 TetO7를 tRNAVal 프로모터에 장착한 벡터, 및 테트라 사이클린 응답 리프렛서(tTS;Clontech)를 발현하는 안정한 MCF-7 세포계(MCF-7-TR)를 구축하였다. 그 후 테트라사이클린에 관련된 시약인 독시사이클린(Dox)의 존재 하 및 비존재 하에서 tRNAi-ErbB2의 발현을 조사하였다. 도 14 B에 나타나듯이, Dox 비존재 하의 MCF-7-TR세포에서는 tRNAi-ErbB2의 발현은 매우 적었다(레인 3). 대조적으로, Dox 존재 하의 세포에서는 상당한 레벨의 전구체 shRNA 및 siRNA가 검출되었다(레인 4). 이러한 결과로부터 본 발명의 테트라사이클린 유도계는 tRNAi-ErbB2의 발현 조절이 가능하다는 것을 알 수 있었다.
본 발명자 등은 또, Dox에 대한 용량 반응을 조사하였다(도 15 A). tRNAi-ErbB2를 발현하는 세포를, 여러가지 농도의 Dox와 함께 72시간 배양하고 전사물의 레벨을 RT-PCR에 의해 분석하였다. tRNAi-ErbB2는 배양 중에 1 ng/ml라고 하는 소량의 Dox에 의하여 유도가 검출되었다. Dox 농도가 증가하는 것에 따라, 전사물의 레벨은 급속히 증가하여 100 ng/ml에서 완전하게 활성화 하였다. 이 용량은 TetO7 비존재계에 있어서의 Dox 활성화 레벨의 80%과 동일하였다. 게다가 이 포화 농도의 Dox에서는 배양 세포의 증식 양상 및 형태에 분명한 변화는 없었다.
TetO7-tRNAi-ErbB2의 영향을 확인하기 위해서, 본 발명자 등은 웨스턴블롯팅 분석을 실시하였다. 도 15 B에 나타나듯이, Dox 비존재 하에서는 TetO7-tRNAi-ErbB2 구축물을 포함하는 세포에 있어서 ErbB2 단백질 레벨은 WT MCF-7-TR세포와 같았다. 대조적으로, Dox 존재 하에서는 ErbB2 단백질 레벨은 WT MCF-7-TR세포보다 의미 있게 적었다. 이들 결과로부터, 본 발명자 등의 테트라사이클린 유도계는 tRNAi-ErbB2의 기능 조절을 가능하게 하는 것을 알 수 있었다. tRNAi-ErbB2의 영향은 예상되듯이 Dox와 무관하다.
본 발명에 있어서 본 발명자 등은 tRNA-shRNA가 세포질에 존재하는 tRNA에 기초하는 RNAi 발현계를 구축하였다.
<실시예 18>　효모주(株) 및 배양
본 발명에서는 S. 폼베 TCP1주(Invitrogen, CA, 미국) 및 S. 세레비지에 EGY48주(Invitrogen, CA, 미국)를 사용하였다.
ydcr1- 및 yrdp1-결실주는 ura4 유전자의 상동재조합에 의해 제조하였다. 이들 결실주를 각각 ydcr1, yrdp1, 및 ura4 유전자의 특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR 분석에 의해 확인하였다.
LacZ 유전자를 발현하는 S. 폼베는 LacZ 유전자 및 nmt 프로모터를 포함하는 pNMT-LacZ 벡터를 이용하여 제조하였다.
LacZ 유전자를 발현하는 S. 세레비지에는 pYes2-LacZ 플라스미드(Invitrogen)를 세포에 도입하였다. 이들 효모 주는, 효모 엑기스/펩톤/덱스트로스(YPD) 배지에서 증식시켰다. 여러가지 dsRNA 또는 외인성 유전자를 발현하는 주의 선택에는 -Leu, -Trp, 또는 -Ura Do Supplement(Clontech, CA, 미국)를 포함하는 합성 덱스트로스(SD) 배지를 사용하였다. 제오신 내성 유전자를 발현하는 주는 50 ㎍/ml 제오신(Invitrogen)을 포함하는 YPD 배지에서 선별하였다.
<실시예 19>　dsRNA 발현 플라스미드의 구축
외인적으로 발현된 긴 dsRNA가 S. 폼베 및 S. 세레비지에에 있어서 RNAi를 개입시키는 유전자 사이렌싱을 유도할지 여부를 확인하기 위해서, 본 발명자 등은 S. 폼베 및 S. 세레비지에에 있어서의 dsRNA 발현 벡터를 각각 구축하였다. (도 16 A). 본 발명자 등은 이러한 dsRNA의 표적으로서 외인성 LEU2 유전자, LacZ 유전자, 및 내인성 PCNA 유전자를 선택하였다. S. 폼베(pSPi)에 있어서 LEU2-dsRNA, PCNA-dsRNA, 및 LacZ-dsRNA(300 nt)의 발현은 nmt1 프로모터에 의해 제어된다. S. 세레비지에(pSCi)에서 LacZ-dsRNA(300nt)의 발현은 GAL1 프로모터에 의해 제어된다.
S. 폼베에 있어서 dsRNA 발현용 벡터 구축에는 nmt 프로모터를 포함하는 pNMT-TOPO 클로닝 킷(Invitrogen)을 사용하였다. LEU2(nt. 1-300), PCNA(nt. 1050-1350), 또는 LacZ(부위 A(nt. 1-300);부위 B[nt. 1000-1300);부위 C(nt. 2000-2300)]를 코드하는 센스 사슬 DNA를, 특이적 업 프라이머[LEU2(5＇-ATG TCT GCC CCT ATG TCT GCC CCT-3＇ /서열번호：39) ;PCNA(5＇-ACA ACG GTA TCT CTC TGC AGG CTA-3＇ /서열번호：40);LacZ-부위 A(5＇-ATG ATA GAT CCC GTC GTT TTA CAA-3＇ /서열번호：41);LacZ-부위 B(5＇-GAA AAT GGT CTG CTG CTG CTG AAC-3＇ /서열번호：42);LacZ-부위 C(5＇-ATG TCG CTC CAC AAG GTA AAC AGT-3＇ /서열번호：43)], 및 XhoI 부위를 가지는 다운 프라이머[LEU2(5＇-GAT TTT TAG TAA ACC TTG TTC AGG-3＇ /서열번호：44) ;PCNA(5＇-TCG ATA TCT GGT ATA CCC AAG TGT-3＇ /서열번호：45);LacZ-부위 A(5＇-GGT TAC GTT GGT GTA GAT GGG CGC-3＇ /서열번호：46);LacZ-부위 B(5＇-CGC TCA TCG CCG GTA GCC AGC GCG-3＇ /서열번호：47);LacZ-부위 C(5＇-CCA ATC CAC ATC TGT GAA AGA AAG-3＇ /서열번호：48)]에 의해 증폭하였다. PCR 산물을 pNMT-TOPO에 클로닝 하였다. 그 후, 안티센스 사슬 DNA를 XhoI 부위를 가지는 업 프라이머[LEU2(5＇-GAT TTT TAG TAA ACC TTG TTC AGG-3＇ /서열번호：44) ;PCNA(5＇-TCG ATA TCT GGT ATA CCC AAG TGT-3＇ /서열번호：45);LacZ-부위 A(5＇-GGT TAC GTT GGT GTA GAT GGG CGC-3＇ /서열번호：46);LacZ-부위 B(5＇-CGC TCA TCG CCG GTA GCC AGC GCG-3＇ /서열번호：47);LacZ-부위 C(5＇-CCA ATC CAC ATC TGT GAA AGA AAG-3＇ /서열번호：48)], 및 SalI 부위를 가지는 다운 프라이머[LEU2(5＇-ATG TCT GCC CCT ATG TCT GCC CCT-3＇ /서열번호：39) ;PCNA(5＇-ACA ACG GTA TCT CTC TGC AGG CTA-3＇ /서열번호：40);LacZ-부위 A(5＇-ATG ATA GAT CCC GTC GTT TTA CAA-3＇ /서열번호：41);LacZ-부위 B(5＇-GAA AAT GGT CTG CTG CTG CTG AAC-3＇ /서열번호：42);LacZ-부위 C(5＇-ATG TCG CTC CAC AAG GTA AAC AGT-3＇ /서열번호：43)]를 이용해 PCR로 증폭하였다. PCR 산물을 SalI 및 XhoI로 소화하였다. 단편을 센스 사슬 유전자를 포함하는 pNMT-TOPO의 XhoI-SalI 부위에 삽입하였다.
S. 세레비지에 용의 LacZ[부위 A(nt. 1-300);부위 B[nt. 1000-1300);부위 C(nt. 2000-2300)]-dsRNA 발현 플라스미드를 구축하는 경우, 본 발명자 등은 pYes3CT 플라스미드(Invitrogen)를 사용하였다. LacZ[부위 A(nt. 1-300);부위 B[nt. 1000-1300);부위 C(nt. 2000-2300)]를 코드하는 센스 사슬 DNA를, HindIII 부위를 가지는 특이적 업 프라이머[LacZ-부위 A(5＇-ATG ATA GAT CCC GTC GTT TTA CAA-3＇ /서열번호：41);LacZ-부위 B(5＇-GAA AAT GGT CTG CTG CTG CTG AAC-3＇ /서열번호：42);LacZ-부위 C(5＇-ATG TCG CTC CAC AAG GTA AAC AGT-3＇ /서열번호：43]및 KpnI 부위를 가지는 다운 프라이머[LacZ-부위 A(5＇-GG TTA CGT TGG TGT AGA TGG GCG C/서열번호：49);LacZ-부위 B(5＇-CG CTC ATC GCC GGT AGC CAG CGC G-3＇ /서열번호：50);LacZ-부위 C(5＇-CC AAT CCA CAT CTG TGA AAG AAA G-3＇ /서열번호：51)]를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후 이들 증폭 DNA를 HindIII 및 KpnI으로 소화하고, 단편을 pYes3CT의 HindIII-KpnI 부위에 클로닝 하였다. LacZ(부위 A, 부위 B, 및 부위 C)의 안티센스 사슬 DNA를, NotI 부위를 가지는 업 프라이머[LacZ-부위 A(5＇-GG TTA CGT TGG TGT AGA TGG GCG C-3＇ /서열번호：46);LacZ-부위 B(5＇-CG CTC ATC GCC GGT AGC CAG CGC G-3＇ /서열번호：47);LacZ-부위 C(5＇-CC AAT CCA CAT CTG TGA AAG AAA G/서열번호：48)] 및 XhoI 부위를 가지는 다운 프라이머[LacZ-부위 A(5＇-ATG ATA GAT CCC GTC GTT TTA CAA-3＇ /서열번호：41);LacZ-부위 B(5＇-GAA AAT GGT CTG CTG CTG CTG AAC-3＇ /서열번호：42);LacZ-부위 C(5＇-ATG TCG CTC CAC AAG GTA AAC AGT-3＇ /서열번호：43)]를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후 이들 증폭 DNA를 NotI 및 XhoI로 소화하고 단편을 센스 사슬 유전자를 포함하는 pYes3CT의 NotI-XhoI 부위에 클로닝 하였다.
<실시예 20>　dsRNA의 발현 및 siRNA의 작성
본 발명자 등은 S. 폼베 세포 및 S. 세레비지에 세포에서의 전구체 dsRNA의 발현 및 이러한 dsRNA의 프로세싱에 대하여 각 dsRNA 특이적 프로브를 이용하여 노던블롯 분석을 수행하여 확인하였다.
총 RNA는 YeaStar RNA 킷(Zymo Research, CA, 미국)을 이용하여 얻었다. 레인 1개에 대하여 30 ㎍의 총 RNA를 2.5% 아가로스 겔에 로드하였다. 전기영동 후 RNA의 밴드를 Hybond-NTM 나일론 막(Amersham Co., Buckinghamshire, 영국)에 전사하였다. 상기 막을 dsRNA-LEU2(nt. 1-300) 및 dsRNA-LacZ(nt. 1-300) 유전자의 서열에 상보적인 특이적 올리고 뉴클레오티드로 프로브 하였다. 이러한 프로브는 ECL 표지 킷(Amersham Co., Buckinghamshire, 영국)을 이용하여 표지하였다.
그 결과, 도 16 B에 나타나듯이, dsRNA를 발현하는 S. 세레비지에 세포에 있어서는 LacZ mRNA에 타겟팅 된 프로세싱을 받고 있지 않은 전구체 dsRNA가 검출되었지만, siRNA는 거의 검출되지 않았다(도 16 B, 레인 5). 대조적으로, dsRNA 발현 S. 폼베 세포에서는 전구체 dsRNA 및 siRNA의 양쪽 모두 검출되었다(레인 2). 또, dsRNA-LacZ 발현 S. 폼베 세포에서는 전구체 dsRNA 및 siRNA의 양쪽 모두가 검출되었다(도 16 B, 레인 7). 상기 결과를 뒷받침하도록 S. 세레비지에의 게놈 서열 중에 RNaseIII Dicer 유사 단백질은 발견되지 않았다. 이러한 결과로부터, siRNA는 S. 폼베에서 전구체 dsRNA로부터 생성되지만, S. 세레비지에에서는 생성되지 않는 것이 시사되었다.
또한, S. 폼베 세포에서의 dsRNA 프로세싱에 있어서의 yDcr1의 역할을 조사하기 위해서 본 발명자 등은 ydcr1 결실주를 구축하였다. ydcr1 결실주 구축은 <실시예 18>에 기재된 바와 같이 수행하였다.
본 발명자 등이 예상한 것처럼, dsRNA 발현 ydcr1 결실주에서는 siRNA는 전구체 dsRNA로부터 생성되지 않았다(도 16 B, 레인 3). 따라서, S. 폼베 Dicer 호몰로그 yDcr1는 S. 폼베 세포에서 siRNA의 생성에 필요함을 알 수 있었다.
<실시예 21>　S. 폼베 및 S. 세레비지에에 있어서의 외인성 LacZ 유전자의 발현에 미치는 dsRNA 유도성 RNAi의 영향
dsRNA가 S. 세레비지에에서 서열 특이적인 유전자 사이렌싱을 유도할 수 있을지 여부를 조사하기 위해서 본 발명자 등은 LacZ에 타겟팅 된 dsRNA 발현 벡터(pSCi-LacZ)를 구축하였다.
본 발명자 등은, LacZ mRNA 내에 dsRNA의 3개의 표적 부위를 선택하였다. 그 다음으로 이러한 dsRNA 발현 플라스미드를 LacZ 유전자를 발현하는 S. 세레비지에 세포에 도입하였다. 각 세포 추출물의 β갈락토시다제 활성은 Yeast β-Galactosidase Reporter Assay 킷(PIERCE, Rockford, IL, 미국)을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 측정하였다. 나타난 값은 각각의 경우로 3회의 반복 실험을 실시하여 그 결과의 평균과 S.D. 이다.
그 결과, 도 17에 나타나듯이, dsRNA-LacZ를 발현하는 S. 폼베 세포의 LacZ 활성 레벨은 야생형 S. 폼베 세포와 비교하여 감소하였다. 대조적으로, dsRNA-LacZ를 발현하는 S. 세레비지에 세포에 있어서의 LacZ 활성 레벨은 야생형 S. 세레비지에 세포와 비교하여 충분하게 감소하지 않았다. 이러한 결과로부터 외인성 dsRNA는 S. 세레비지에에서는 서열 특이적인 유전자 사이렌싱을 유도하지 않을 가능성이 시사되었다. S. 세레비지에 세포에서는 내인성 유전자에 타겟팅 된 dsRNA에 대해서도 같은 결과를 얻을 수 있었다(데이터는 제시하지 않음).
<실시예 22>　S. 폼베에 있어서 외인성 LEU2 유전자의 발현에 미치는 dsRNA 유도성 RNAi의 영향
siRNA가 dsRNA-LEU2를 발현하는 S. 폼베 세포에서 검출되었으므로, 본 발명자 등은, 류신 결손 배지(Leu-)에서 S. 폼베 세포의 증식을 조사하였다. LEU2 mRNA에 타겟팅 된 dsRNA 발현 플라스미드(pSPi-LEU2), LacZ mRNA에 타겟팅 된 dsRNA 발현 플라스미드(pSPi-LacZ) 각각을 S. 폼베 세포에 도입하였다.
그 결과, 도 18 A에 나타나듯이 LEU2 유전자를 발현하는 야생형(WT) 세포는, Leu- 배지에 있어 정상적으로 증식하였다. 그러나 dsRNA-LEU2 발현 세포는 이 배지에서는 증식하지 않았다.
ydcr1 결실주의 경우, dsRNA-LEU2는 유전자 사이렌싱을 유도하지 않고 그 결과 이러한 세포는 Leu- 배지에서도 증식하였다. 나아가 dsRNA-LEU2 발현 세포에서의 LEU2 mRNA 레벨은 WT 세포와 비교하여 의미 있게 감소하였다(데이터는 가리키지 않음). 따라서, 외인성 dsRNA는 S. 폼베 세포에서는 RNAi를 개입시키는 유전자 사이렌싱을 유도할 수 있어 yDcr1가 dsRNA를 개입시키는 유전자 사이렌싱에 필요하다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 23>　S. 폼베에 있어서의 내인성 PCNA 유전자의 발현에 미치는 dsRNA 유도성 RNAi의 영향
외인성 dsRNA가 S. 폼베 세포에 있어서의 내인성 유전자의 발현을 억제할지 여부를 조사하기 위해서 PCNA mRNA에 타겟팅 된 dsRNA 발현 플라스미드(pSPi-PCNA)를 S. 폼베 세포에 도입하였다. 그 후 본 발명자 등은 PCNA 단백질 레벨 및 내인성 대조로서 Rad17 단백질 레벨을 각각 마우스 PCNA 단일 클론 항체(Waseem, N.H., & Lane, D.P., Monoclonal antibody analysis of the proliferating cell nuclear antigen (PCNA): Structural conservation and the detection of a nucleolar form. J. Cell Sci. 96 121-129 (1990)) 및 마우스 Rad17 단일 클론 항체(Li, L., Peterson, C.A., Kanter-Smoler, G., Wei, Y.F., Ramagli, L.S., Sunnerhagen, P., Siciliano, M.J., & Legerski, R.J. hRAD17, a structural homolog of the Schizosaccharomyces pombe RAD17 cell cycle checkpoint gene, stimulates p53 accumulation. Oncogene 18, 1689- 1699 (1999))를 이용한 웨스턴블롯 분석에 의해 조사하였다.
웨스턴블롯 분석은 Y-PER 효모 단백질 추출 시약(PIERCE)을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 세포 추출물을 각 형질전환체로부터 제조하여 수행하였다. 단백질을 SDS-PAGE(10% 폴리아크릴아미드)에 의해 분리하고 그 밖의 기재(Kawasaki, H., Eckner, R., Yao, T. P., Taira, , K., Chiu, R., Livingston, D.M., & K. K. Yokoyama., Distinct roles of the co-activators p3OO and CBP in retinoic-acid-induced F9-cell differentiation., Nature, 393, 284-289 (1998).,Kawasaki H, Schiltz L, Chiu R, Itakura K, Taira K, Nakatani Y, Yokoyama KK, ATF-2 has intrinsic histone acetyltransferase activity which is modulated by phosphorylation, Nature, 405, 195-200 (2000))와 같이 일렉트로블롯팅에 의해 PVDF 막(Funakoshi Co., Tokyo, 일본)에 전사하였다. 마우스 PCNA에 대한 특이적 폴리클로날 항체(ZYMED Lab. Inc., CA, 미국) 및 마우스 Rad17에 대한 특이적 폴리클로날 항체(ZYMED Lab. Inc.)를 이용한 ECL 킷(Amersham Co)에 의해 면역 복합체를 시각화 하였다. 이러한 항체는 각각 S. 폼베의 PCNA 및 Rad17와 반응한다(Waseem, N.H., & Lane, D.P., Monoclonal antibody analysis of the proliferating cell nuclear antigen (PCNA): Structural conservation and the detection of a nucleolar form. J. Cell Sci. 96 121-129 (1990), Li, L., Peterson, C.A., Kanter-Smoler, G., Wei, Y.F., Ramagli, L.S., Sunnerhagen, P., Siciliano, M.J., & Legerski, R.J. hRAD17, a structural homolog of the Schizosaccharomyces pombe RAD17 cell cycle checkpoint gene, stimulates p53 accumulation. Oncogene 18, 1689- 1699 (1999)).
그 결과, 도 18 B에 나타나듯이 dsRNA-PCNA 발현 세포에 있어서의 PCNA 단백질 레벨은 야생형(WT) 세포와 비교하여 의미 있게 감소하였다. 대조군으로서 사용한 Rad17 단백질 레벨은 양세포 모두 변화하지 않았다. 이러한 결과로부터, 외인성 dsRNA는 S. 폼베 세포에 있어서의 RNAi 시스템을 개입시켜 외인성 LEU2 유전자의 발현 뿐만이 아니라 내인성 PCNA 유전자의 발현도 억제하는 것을 알 수 있었다.
<실시예 24>　S. 폼베에 있어서의 siRNA 유도성 RNAi의 영향 및 RdRP 활성
다음으로 합성 siRNA도 S. 폼베 세포에서는 서열 특이적인 유전자 사이렌싱을 유도할 수 있을지 여부를 시험하기 위해서 본 발명자 등은, zeocinTM 내성(Zeor) 유전자에 타겟팅 된 siRNA(siRNA-Zeor)를 합성하였다.
제오신 지향성 siRNA(센스 사슬:5＇-CUG CGU GCA CUU CGU GGC CGA-3＇ /서열번호：49;안티센스 사슬:5＇-GGC CAC GAA GUG CAC GCA GUU-3＇ /서열번호：50)는, 일본 바이오 서비스(일본 Bio Service(JBioS) Co Ltd)에 의해 합성되었다. 이러한 RNA를 표준적인 방법(Elbashir, S.M., Lendeckel, W., & Tuschl, T., RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes&Dev., 15, 188-200 (2001))을 이용하여 어닐링(annealing) 시켰다. 그 후, Frozen-EZ Yeast Transformation II킷(Zymo Research, Inc., CA, 미국)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 5~20 nM의 제오신 지향성 siRNA를 제오신을 포함하는 S. 폼베 세포에 트랜스펙트 하였다.
다음으로, 본 발명자 등은 50 ㎍/ml 제오신(Invitrogen)을 포함하는 YPD 배지에서 제오신 내성 유전자를 발현하는 주를 선별하고 siRNA-Zeor 처리 세포의 증식을 조사하였다. 도 19 A에 나타나듯이, Zeor 유전자를 발현하는 WT 세포가 제오신 함유 배지에서 증식하였다. 그러나 siRNA-Zeor(20nM)로 처리한 세포의 증식 레벨은, Zeor 유전자를 발현하는 WT세포와 비교하여 의미 있게 감소하였다.
나아가 S. 폼베의 RdRP 호몰로그(yrdp1)가 DNA 데이타베이스 검색에 의해 동정되었으므로, 본 발명자 등은, RNAi를 개입시키는 유전자 사이렌싱에 있어서의 yRdp1의 역할에 대하여 조사하기 위하여 yrdp1 결실주를 구축하였다. yrdp1 결실주의 구축은, <실시예 18>에 기재된 바와 같이 수행하였다.
그 결과, yrdp1 결실주에서는 siRNA-Zeor는 유전자 사이렌싱을 효율적으로 유도하지 않았다(도 19 A:우측 하단 4분의 1의 증식 레벨과 좌측 하단 4분의 1의 증식 레벨을 비교). 따라서, 이러한 결과로부터 합성 siRNA도 S. 폼베에서 RNAi를 개입시키는 유전자 사이렌싱을 유도할 수 있어 yRdp1가 RNAi를 개입시키는 유전자 사이렌싱에 적어도 부분적으로 관여하는 것을 알 수 있었다.
<실시예 25>　5＇비오틴 표지 안티센스 사슬 siRNA 「풀다운」 및 역전사(RT)-PCR 분석
신장된 안티센스 사슬 RNA가 siRNA-RdRP 복합체에 의해 생성될지 여부를 확인하기 위해서 본 발명자 등은 비오틴 풀다운 RT-PCR 분석을 실시하였다.
최초로, 본 발명자 등은 Zeor 유전자에 타겟팅 된 5＇비오틴 결합 siRNA를 합성하였다. 5＇비오틴 표지 제오신 내성 유전자(Zeor)-siRNA는 일본 바이오 서비스에 의해 합성되었다. 이들 RNA를 표준적인 방법(Fire A., Xu S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E., & Mello, C.C., Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans., Nature, 391, 806-811 (1998))을 이용하여 어닐링 시켰다. Frozen-EZ Yeast Transformation II킷(Zymo Researh)을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 5＇비오틴 표지 Zeor-siRNA를 S. 폼베 세포 또는 yrdp1 결실주에 트랜스펙트 하였다. 48시간 후, 세포를 수집하고 총 RNA를 각 세포로부터 YeaStar RNA 킷(Zymo Researh)을 이용하여 얻었다. 스트렙트아비딘 수지를 포함하는 SoftLinkTM 수지(Promega, 미국)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라, 비오틴 표지 안티센스 사슬 siRNA를 정제 하였다.
RT-PCR 분석을 RNA PCR Kit ver. 2(TaKaRa, Kyoto, 일본)와 Zeor 상류 프라이머(5＇-GGC CAC GAA GTG CAC GCA GTT-3＇ /서열번호：51) 및 하류 프라이머(5＇-CAC CCT GGC CTG GGT GTG GGT-3＇ /서열번호：52) 또는 대조군으로서 Rad17 상류 프라이머(5＇-TCT GGT TGT GGA AAG AGT ACC GCA-3＇ /서열번호：53) 및 하류 프라이머(5＇-CCT CTT TAC GTA GAA TAG AGC CAA G-3＇ /서열번호：54)를 이용하여 신장된 안티센스 사슬 RNA를 증폭하였다. PCR 산물을 2% 아가로스 겔에서의 전기영동에 의하여 분석하였다.
그 결과, 도 19 B에 나타나듯이, siRNA로부터 생긴 신장된 안티센스 사슬 RNA는 siRNA를 포함하는 세포(Zeor)에서 밖에 검출되지 않았다(레인 4). 대조적으로, siRNA-Zeor를 포함한 WT세포는 신장된 안티센스 사슬 RNA를 포함하지 않았다(레인 2). 이러한 결과로부터, siRNA는 타겟팅 mRNA의 비존재 하에서는 증폭되지 않음이 시사되었다.
나아가 이들 신장된 RNA는 siRNA-Zeor를 포함하는 yrdp1s 결실주에서는 생성되지 않았다(레인 3). 이러한 결과로부터, siRNA가 S. 폼베 세포에서 RNAi 유도성 사이렌싱 복합체(RISC)의 가이드로서 뿐만이 아니라 siRNA 증폭을 위한 프라이머로서도 작용하는 것이 시사되었다.
본 발명에 의하여 RNAi 효과를 가지는 스템 루프 형 RNA를 코드하는 DNA, 및 당해 DNA를 포함하는 벡터가 제공되었다. 이들을 이용함으로써 간편하게 희망하는 유전자가 넉아웃된 세포를 제작하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명은 포유류 세포에 있어서의 RNAi의 메카니즘 및 다른 유전자의 기능을 연구하기 위한 강력한 툴이 되고 또한, 치료 용도로서 잠재적 유용성을 가지는 것으로 크게 기대된다.
<110> NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Expression systems for stem loop RNA molecule having RNAi effect <130> 4fpi-10-05 <150> JP 2002-127089 <151> 2002-04-26 <150> JP 2003-4706 <151> 2003-01-10 <150> US 60/449,860 <151> 2003-02-27 <160> 56 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 88 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 accguugguu uccguagugu agugguuauc acguucgccu aacacgcgaa agguccccgg 60 uucgaaaccg ggcacuacaa aaaccaac 88 <210> 2 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 2 gagctcggta gttggagctg ttggcgtagg caagagaaaa tcttgcctac gccaacagct 60 ccaactaccg gtacc 75 <210> 3 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 3 gaattcggta gttggagctg ttggcgtagg caagagaaaa tcttgcctac gccaacagct 60 ccaactacct ctaga 75 <210> 4 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 4 gaattcggta gttggagctg ttggcgtagg caagacnncc ngncatcttg cctacgccaa 60 cagctccaac taccctcgag 80 <210> 5 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 5 gtcgacggta gttggagctg ttggcgtagg caagagaaaa tcttgcctac gccaacagct 60 ccaactacct ctaga 75 <210> 6 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 6 gtcgacggta gttggagctg ttggcgtagg caagacnncc ngncatcttg cctacgccaa 60 cagctccaac tacctctaga 80 <210> 7 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 7 tccccggttc gaaaccgggc actacaaaaa ccaactttca aagaaagctg atgaggccga 60 aaggccgaaa cccattgggg taccccggat atctttttt 99 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 8 atgaaaagcc ctgctttgca acccct 26 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 9 agttgcagtt tcagcattac tctt 24 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> puromycin resistance gene <400> 10 atgaccgagt acaagccca 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> puromycin resistance gene <400> 11 ctcgccaccc gcgacgacg 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> puromycin resistance gene <400> 12 caccgtcgac ccggaccgc 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> puromycin resistance gene <400> 13 gaactcttcc tcacgcgcg 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> puromycin resistance gene <400> 14 ggtgtgggtc gcggacgac 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> puromycin resistance gene <400> 15 cagatggaag gcctcctgg 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> puromycin resistance gene <400> 16 ggagcccgcg tggttcctg 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> puromycin resistance gene <400> 17 gggtctgggc agcgccgtc 19 <210> 18 <211> 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<221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog <400> 24 caacaccaag tcttttgag 19 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog <400> 25 ggactcggat gacgtgccc 19 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog <400> 26 tctcggcagg ctcaggacc 19 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog <400> 27 gacccggcag ggagtggag 19 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog <400> 28 gctgcggaag ctgaaccct 19 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog <400> 29 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primer sequence <400> 45 tcgatatctg gtatacccaa gtgt 24 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 46 ggttacgttg gtgtagatgg gcgc 24 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 47 cgctcatcgc cggtagccag cgcg 24 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 48 ccaatccaca tctgtgaaag aaag 24 <210> 49 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized siRNA sequence <400> 49 cugcgugcac uucguggccg a 21 <210> 50 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized siRNA sequence <400> 50 ggccacgaag ugcacgcagu u 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 51 ggccacgaag tgcacgcagt t 21 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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480 ttgaaaaatg gttacttatc actgtcagac attaaccttt tggtgtttga tgagtgtcat 540 cttgcaatcc tagaccaccc ctatcgagaa tttatgaagc tctgtgaaat ttgtccatca 600 tgtcctcgca ttttgggact aactgcttcc attttaaatg ggaaatggga tccagaggat 660 ttggaagaaa agtttcagaa actagagaaa attcttaaga gtaatgctga aactgcaact 720 gacctggtgg tcttagacag gtatacttct cagccatgtg agattgtggt ggattgtgga 780 ccatttactg acagaagtgg gctttatgaa agactgctga tggaattaga agaagcactt 840 aattttatca atgattgtaa tatatctgta cattcaaaag aaagagattc tactttaatt 900 tcgaaacaga tactatcaga ctgtcgtgcc gtattggtag ttctgggacc ctggtgtgca 960 gataaagtag ctggaatgat ggtaagagaa ctacagaaat acatcaaaca tgagcaagag 1020 gagctgcaca ggaaattttt attgtttaca gacactttcc taaggaaaat acatgcacta 1080 tgtgaagagc acttctcacc tgcctcactt gacctgaaat ttgtaactcc taaagtaatc 1140 aaactgctcg aaatcttacg caaatataaa ccatatgagc gacacagttt tgaaagcgtt 1200 gagtggtata ataatagaaa tcaggataat tatgtgtcat ggagtgattc tgaggatgat 1260 gatgaggatg aagaaattga agaaaaagag aagccagaga caaattttcc ttctcctttt 1320 accaacattt tgtgcggaat tatttttgtg gaaagaagat acacagcagt tgtcttaaac 1380 agattgataa aggaagctgg caaacaagat ccagagctgg cttatatcag tagcaatttc 1440 ataactggac atggcattgg gaagaatcag cctcgcaaca acacgatgga agcagaattc 1500 agaaaacagg aagaggtact taggaaattt cgagcacatg agaccaacct gcttattgca 1560 acaagtattg tagaagaggg tgttgatata ccaaaatgca acttggtggt tcgttttgat 1620 ttgcccacag aatatcgatc ctatgttcaa tctaaaggaa gagcaagggc acccatctct 1680 aattatataa tgttagcgga tacagacaaa ataaaaagtt ttgaagaaga ccttaaaacc 1740 tacaaagcta ttgaaaagat cttgagaaac aagtgttcca agtcggttga tactggtgag 1800 actgacattg atcctgtcat ggatgatgat cacgttttcc caccatatgt gttgaggcct 1860 gacgatggtg gtccacgagt cacaatcaac acggccattg gacacatcaa tagatactgt 1920 gctagattac caagtgatcc gtttactcat ctagctccta aatgcagaac ccgagagttg 1980 cctgatggta cattttattc aactctttat ctgccaatta actcacctct tcgagcctcc 2040 attgttggtc caccaatgag ctgtgtacga ttggctgaaa gagttgtcgc tctcatttgc 2100 tgtgagaaac tgcacaaaat tggcgaactg gatgaccatt tgatgccagt tgggaaagag 2160 actgttaaat atgaagagga gcttgatttg catgatgaag aagagaccag tgttccagga 2220 agaccaggtt ccacgaaacg aaggcagtgc tacccaaaag caattccaga gtgtttgagg 2280 gatagttatc ccagacctga tcagccctgt tacctgtatg tgataggaat ggttttaact 2340 acacctttac ctgatgaact caactttaga aggcggaagc tctatcctcc tgaagatacc 2400 acaagatgct ttggaatact gacggccaaa cccatacctc agattccaca ctttcctgtg 2460 tacacacgct ctggagaggt taccatatcc attgagttga agaagtctgg tttcatgttg 2520 tctctacaaa tgcttgagtt gattacaaga cttcaccagt atatattctc acatattctt 2580 cggcttgaaa aacctgcact agaatttaaa cctacagacg ctgattcagc atactgtgtt 2640 ctacctctta atgttgttaa tgactccagc actttggata ttgactttaa attcatggaa 2700 gatattgaga agtctgaagc tcgcataggc attcccagta caaagtatac aaaagaaaca 2760 ccctttgttt ttaaattaga agattaccaa gatgccgtta tcattccaag atatcgcaat 2820 tttgatcagc ctcatcgatt ttatgtagct gatgtgtaca ctgatcttac cccactcagt 2880 aaatttcctt cccctgagta tgaaactttt gcagaatatt ataaaacaaa gtacaacctt 2940 gacctaacca atctcaacca gccactgctg gatgtggacc acacatcttc aagacttaat 3000 cttttgacac ctcgacattt gaatcagaag gggaaagcgc ttcctttaag cagtgctgag 3060 aagaggaaag ccaaatggga aagtctgcag aataaacaga tactggttcc agaactctgt 3120 gctatacatc caattccagc atcactgtgg agaaaagctg tttgtctccc cagcatactt 3180 tatcgccttc actgcctttt gactgcagag gagctaagag cccagactgc cagcgatgct 3240 ggcgtgggag tcagatcact tcctgcggat tttagatacc ctaacttaga cttcgggtgg 3300 aaaaaatcta ttgacagcaa atctttcatc tcaatttcta actcctcttc agctgaaaat 3360 gataattact gtaagcacag cacaattgtc cctgaaaatg ctgcacatca aggtgctaat 3420 agaacctcct ctctagaaaa tcatgaccaa atgtctgtga actgcagaac gttgctcagc 3480 gagtcccctg gtaagctcca cgttgaagtt tcagcagatc ttacagcaat taatggtctt 3540 tcttacaatc aaaatctcgc caatggcagt tatgatttag ctaacagaga cttttgccaa 3600 ggaaatcagc taaattacta caagcaggaa atacccgtgc aaccaactac ctcatattcc 3660 attcagaatt tatacagtta cgagaaccag ccccagccca gcgatgaatg tactctcctg 3720 agtaataaat accttgatgg aaatgctaac aaatctacct cagatggaag tcctgtgatg 3780 gccgtaatgc ctggtacgac agacactatt caagtgctca agggcaggat ggattctgag 3840 cagagccctt ctattgggta ctcctcaagg actcttggcc ccaatcctgg acttattctt 3900 caggctttga ctctgtcaaa cgctagtgat ggatttaacc tggagcggct tgaaatgctt 3960 ggcgactcct ttttaaagca tgccatcacc acatatctat tttgcactta ccctgatgcg 4020 catgagggcc gcctttcata tatgagaagc aaaaaggtca gcaactgtaa tctgtatcgc 4080 cttggaaaaa agaagggact acccagccgc atggtggtgt caatatttga tccccctgtg 4140 aattggcttc ctcctggtta tgtagtaaat caagacaaaa gcaacacaga taaatgggaa 4200 aaagatgaaa tgacaaaaga ctgcatgctg gcgaatggca aactggatga ggattacgag 4260 gaggaggatg aggaggagga gagcctgatg tggagggctc cgaaggaaga ggctgactat 4320 gaagatgatt tcctggagta tgatcaggaa catatcagat ttatagataa tatgttaatg 4380 gggtcaggag cttttgtaaa gaaaatctct ctttctcctt tttcaaccac tgattctgca 4440 tatgaatgga aaatgcccaa aaaatcctcc ttaggtagta tgccattttc atcagatttt 4500 gaggattttg actacagctc ttgggatgca atgtgctatc tggatcctag caaagctgtt 4560 gaagaagatg actttgtggt ggggttctgg aatccatcag aagaaaactg tggtgttgac 4620 acgggaaagc agtccatttc ttacgacttg cacactgagc agtgtattgc tgacaaaagc 4680 atagcggact 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Thr Asp Thr 340 345 350 Phe Leu Arg Lys Ile His Ala Leu Cys Glu Glu His Phe Ser Pro Ala 355 360 365 Ser Leu Asp Leu Lys Phe Val Thr Pro Lys Val Ile Lys Leu Leu Glu 370 375 380 Ile Leu Arg Lys Tyr Lys Pro Tyr Glu Arg His Ser Phe Glu Ser Val 385 390 395 400 Glu Trp Tyr Asn Asn Arg Asn Gln Asp Asn Tyr Val Ser Trp Ser Asp 405 410 415 Ser Glu Asp Asp Asp Glu Asp Glu Glu Ile Glu Glu Lys Glu Lys Pro 420 425 430 Glu Thr Asn Phe Pro Ser Pro Phe Thr Asn Ile Leu Cys Gly Ile Ile 435 440 445 Phe Val Glu Arg Arg Tyr Thr Ala Val Val Leu Asn Arg Leu Ile Lys 450 455 460 Glu Ala Gly Lys Gln Asp Pro Glu Leu Ala Tyr Ile Ser Ser Asn Phe 465 470 475 480 Ile Thr Gly His Gly Ile Gly Lys Asn Gln Pro Arg Asn Asn Thr Met 485 490 495 Glu Ala Glu Phe Arg Lys Gln Glu Glu Val Leu Arg Lys Phe Arg Ala 500 505 510 His Glu Thr Asn Leu Leu Ile Ala Thr Ser Ile Val Glu Glu Gly Val 515 520 525 Asp Ile Pro Lys Cys Asn Leu Val Val Arg Phe Asp Leu Pro Thr Glu 530 535 540 Tyr Arg Ser Tyr Val Gln Ser Lys Gly Arg Ala Arg Ala Pro Ile Ser 545 550 555 560 Asn Tyr Ile Met Leu Ala Asp Thr Asp Lys Ile Lys Ser Phe Glu Glu 565 570 575 Asp Leu Lys Thr Tyr Lys Ala Ile Glu Lys Ile Leu Arg Asn Lys Cys 580 585 590 Ser Lys Ser Val Asp Thr Gly Glu Thr Asp Ile Asp Pro Val Met Asp 595 600 605 Asp Asp His Val Phe Pro Pro Tyr Val Leu Arg Pro Asp Asp Gly Gly 610 615 620 Pro Arg Val Thr Ile Asn Thr Ala Ile Gly His Ile Asn Arg Tyr Cys 625 630 635 640 Ala Arg Leu Pro Ser Asp Pro Phe Thr His Leu Ala Pro Lys Cys Arg 645 650 655 Thr Arg Glu Leu Pro Asp Gly Thr Phe Tyr Ser Thr Leu Tyr Leu Pro 660 665 670 Ile Asn Ser Pro Leu Arg Ala Ser Ile Val Gly Pro Pro Met Ser Cys 675 680 685 Val Arg Leu Ala Glu Arg Val Val Ala Leu Ile Cys Cys Glu Lys Leu 690 695 700 His Lys Ile Gly Glu Leu Asp Asp His Leu Met Pro Val Gly Lys Glu 705 710 715 720 Thr Val Lys Tyr Glu Glu Glu Leu Asp Leu His Asp Glu Glu Glu Thr 725 730 735 Ser Val Pro Gly Arg Pro Gly Ser Thr Lys Arg Arg Gln Cys Tyr Pro 740 745 750 Lys Ala Ile Pro Glu Cys Leu Arg Asp Ser Tyr Pro Arg Pro Asp Gln 755 760 765 Pro Cys Tyr Leu Tyr Val Ile Gly Met Val Leu Thr Thr Pro Leu Pro 770 775 780 Asp Glu Leu Asn Phe Arg Arg Arg Lys Leu Tyr Pro Pro Glu Asp Thr 785 790 795 800 Thr Arg Cys Phe Gly Ile Leu Thr Ala Lys Pro Ile Pro Gln Ile Pro 805 810 815 His Phe Pro Val Tyr Thr Arg Ser Gly Glu Val Thr Ile Ser Ile Glu 820 825 830 Leu Lys Lys Ser Gly Phe Met Leu Ser Leu Gln Met Leu Glu Leu Ile 835 840 845 Thr Arg Leu His Gln Tyr Ile Phe Ser His Ile Leu Arg Leu Glu Lys 850 855 860 Pro Ala Leu Glu Phe Lys Pro Thr Asp Ala Asp Ser Ala Tyr Cys Val 865 870 875 880 Leu Pro Leu Asn Val Val Asn Asp Ser Ser Thr Leu Asp Ile Asp Phe 885 890 895 Lys Phe Met Glu Asp Ile Glu Lys Ser Glu Ala Arg Ile Gly Ile Pro 900 905 910 Ser Thr Lys Tyr Thr Lys Glu Thr Pro Phe Val Phe Lys Leu Glu Asp 915 920 925 Tyr Gln Asp Ala Val Ile Ile Pro Arg Tyr Arg Asn Phe Asp Gln Pro 930 935 940 His Arg Phe Tyr Val Ala Asp Val Tyr Thr Asp Leu Thr Pro Leu Ser 945 950 955 960 Lys Phe Pro Ser Pro Glu Tyr Glu Thr Phe Ala Glu Tyr Tyr Lys Thr 965 970 975 Lys Tyr Asn Leu Asp Leu Thr Asn Leu Asn Gln Pro Leu Leu Asp Val 980 985 990 Asp His Thr Ser Ser Arg Leu Asn Leu Leu Thr Pro Arg His Leu Asn 995 1000 1005 Gln Lys Gly Lys Ala Leu Pro Leu Ser Ser Ala Glu Lys Arg Lys Ala 1010 1015 1020 Lys Trp Glu Ser Leu Gln Asn Lys Gln Ile Leu Val Pro Glu Leu Cys 1025 1030 1035 1040 Ala Ile His Pro Ile Pro Ala Ser Leu Trp Arg Lys Ala Val Cys Leu 1045 1050 1055 Pro Ser Ile Leu Tyr Arg Leu His Cys Leu Leu Thr Ala Glu Glu Leu 1060 1065 1070 Arg Ala Gln Thr Ala Ser Asp Ala Gly Val Gly Val Arg Ser Leu Pro 1075 1080 1085 Ala Asp Phe Arg Tyr Pro Asn Leu Asp Phe Gly Trp Lys Lys Ser Ile 1090 1095 1100 Asp Ser Lys Ser Phe Ile Ser Ile Ser Asn Ser Ser Ser Ala Glu Asn 1105 1110 1115 1120 Asp Asn Tyr Cys Lys His Ser Thr Ile Val Pro Glu Asn Ala Ala His 1125 1130 1135 Gln Gly Ala Asn Arg Thr Ser Ser Leu Glu Asn His Asp Gln Met Ser 1140 1145 1150 Val Asn Cys Arg Thr Leu Leu Ser Glu Ser Pro Gly Lys Leu His Val 1155 1160 1165 Glu Val Ser Ala Asp Leu Thr Ala Ile Asn Gly Leu Ser Tyr Asn Gln 1170 1175 1180 Asn Leu Ala Asn Gly Ser Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Asp Phe Cys Gln 1185 1190 1195 1200 Gly Asn Gln Leu Asn Tyr Tyr Lys Gln Glu Ile Pro Val Gln Pro Thr 1205 1210 1215 Thr Ser Tyr Ser Ile Gln Asn Leu Tyr Ser Tyr Glu Asn Gln Pro Gln 1220 1225 1230 Pro Ser Asp Glu Cys Thr Leu Leu Ser Asn Lys Tyr Leu Asp Gly Asn 1235 1240 1245 Ala Asn Lys Ser Thr Ser Asp Gly Ser Pro Val Met Ala Val Met Pro 1250 1255 1260 Gly Thr Thr Asp Thr Ile Gln Val Leu Lys Gly Arg Met Asp Ser Glu 1265 1270 1275 1280 Gln Ser Pro Ser Ile Gly Tyr Ser Ser Arg Thr Leu Gly Pro Asn Pro 1285 1290 1295 Gly Leu Ile Leu Gln Ala Leu Thr Leu Ser Asn Ala Ser Asp Gly Phe 1300 1305 1310 Asn Leu Glu Arg Leu Glu Met Leu Gly Asp Ser Phe Leu Lys His Ala 1315 1320 1325 Ile Thr Thr Tyr Leu Phe Cys Thr Tyr Pro Asp Ala His Glu Gly Arg 1330 1335 1340 Leu Ser Tyr Met Arg Ser Lys Lys Val Ser Asn Cys Asn Leu Tyr Arg 1345 1350 1355 1360 Leu Gly Lys Lys Lys Gly Leu Pro Ser Arg Met Val Val Ser Ile Phe 1365 1370 1375 Asp Pro Pro Val Asn Trp Leu Pro Pro Gly Tyr Val Val Asn Gln Asp 1380 1385 1390 Lys Ser Asn Thr Asp Lys Trp Glu Lys Asp Glu Met Thr Lys Asp Cys 1395 1400 1405 Met Leu Ala Asn Gly Lys Leu Asp Glu Asp Tyr Glu Glu Glu Asp Glu 1410 1415 1420 Glu Glu Glu Ser Leu Met Trp Arg Ala Pro Lys Glu Glu Ala Asp Tyr 1425 1430 1435 1440 Glu Asp Asp Phe Leu Glu Tyr Asp Gln Glu His Ile Arg Phe Ile Asp 1445 1450 1455 Asn Met Leu Met Gly Ser Gly Ala Phe Val Lys Lys Ile Ser Leu Ser 1460 1465 1470 Pro Phe Ser Thr Thr Asp Ser Ala Tyr Glu Trp Lys Met Pro Lys Lys 1475 1480 1485 Ser Ser Leu Gly Ser Met Pro Phe Ser Ser Asp Phe Glu Asp Phe Asp 1490 1495 1500 Tyr Ser Ser Trp Asp Ala Met Cys Tyr Leu Asp Pro Ser Lys Ala Val 1505 1510 1515 1520 Glu Glu Asp Asp Phe Val Val Gly Phe Trp Asn Pro Ser Glu Glu Asn 1525 1530 1535 Cys Gly Val Asp Thr Gly Lys Gln Ser Ile Ser Tyr Asp Leu His Thr 1540 1545 1550 Glu Gln Cys Ile Ala Asp Lys Ser Ile Ala Asp Cys Val Glu Ala Leu 1555 1560 1565 Leu Gly Cys Tyr Leu Thr Ser Cys Gly Glu Arg Ala Ala Gln Leu Phe 1570 1575 1580 Leu Cys Ser Leu Gly Leu Lys Val Leu Pro Val Ile Lys Arg Thr Asp 1585 1590 1595 1600 Arg Glu Lys Ala Leu Cys Pro Thr Arg Glu Asn Phe Asn Ser Gln Gln 1605 1610 1615 Lys Asn Leu Ser Val Ser Cys Ala Ala Ala Ser Val Ala Ser Ser Arg 1620 1625 1630 Ser Ser Val Leu Lys Asp Ser Glu Tyr Gly Cys Leu Lys Ile Pro Pro 1635 1640 1645 Arg Cys Met Phe Asp His Pro Asp Ala Asp Lys Thr Leu Asn His Leu 1650 1655 1660 Ile Ser Gly Phe Glu Asn Phe Glu Lys Lys Ile Asn Tyr Arg Phe Lys 1665 1670 1675 1680 Asn Lys Ala Tyr Leu Leu Gln Ala Phe Thr His Ala Ser Tyr His Tyr 1685 1690 1695 Asn Thr Ile Thr Asp Cys Tyr Gln Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ala 1700 1705 1710 Ile Leu Asp Tyr Leu Ile Thr Lys His Leu Tyr Glu Asp Pro Arg Gln 1715 1720 1725 His Ser Pro Gly Val Leu Thr Asp Leu Arg Ser Ala Leu Val Asn Asn 1730 1735 1740 Thr Ile Phe Ala Ser Leu Ala Val Lys Tyr Asp Tyr His Lys Tyr Phe 1745 1750 1755 1760 Lys Ala Val Ser Pro Glu Leu Phe His Val Ile Asp Asp Phe Val Gln 1765 1770 1775 Phe Gln Leu Glu Lys Asn Glu Met Gln Gly Met Asp Ser Glu Leu Arg 1780 1785 1790 Arg Ser Glu Glu Asp Glu Glu Lys Glu Glu Asp Ile Glu Val Pro Lys 1795 1800 1805 Ala Met Gly Asp Ile Phe Glu Ser Leu Ala Gly Ala Ile Tyr Met Asp 1810 1815 1820 Ser Gly Met Ser Leu Glu Thr Val Trp Gln Val Tyr Tyr Pro Met Met 1825 1830 1835 1840 Arg Pro Leu Ile Glu Lys Phe Ser Ala Asn Val Pro Arg Ser Pro Val 1845 1850 1855 Arg Glu Leu Leu Glu Met Glu Pro Glu Thr Ala Lys Phe Ser Pro Ala 1860 1865 1870 Glu Arg Thr Tyr Asp Gly Lys Val Arg Val Thr Val Glu Val Val Gly 1875 1880 1885 Lys Gly Lys Phe Lys Gly Val Gly Arg Ser Tyr Arg Ile Ala Lys Ser 1890 1895 1900 Ala Ala Ala Arg Arg Ala Leu Arg Ser Leu Lys Ala Asn Gln Pro Gln 1905 1910 1915 1920 Val Pro Asn Ser

Claims (55)

  1. 세포내에서 RNAi 효과를 가지는 스템 루프 형 RNA 분자를 코드하는 DNA와 세포질 이행 시그널 서열을 가지는 DNA로서, 표적 유전자 mRNA의 어느 영역의 센스 RNA를 코드하는 센스 코드 DNA와 당해 DNA와 상보적인 서열을 스페이서 영역을 사이에 두어 대향하도록(마주하도록) 연결시키고 이것을 프로모터와 기능적으로 접속시킨 구조를 특징으로 하는 DNA.
  2. 제1항에 있어서, 상기 스페이서 영역 내에 세포질 이행 시그널 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 DNA.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프로모터가 tRNA 프로모터, polII계 프로모터, polIII계 프로모터, 또는 테트라사이클린 유도형 프로모터인 것을 특징으로 하는 DNA.
  4. 제3항에 있어서, 상기 테트라사이클린 유도형 프로모터가 테트라사이클린 유도형 tRNA 프로모터인 것을 특징으로 하는 DNA.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프로모터가 NMT1 프로모터 또는 GAL1 프로모터인 것을 특징으로 하는 DNA.
  6. 세포내에서 RNAi 효과를 가지는 스템 루프 형 RNA 분자를 코드하는 DNA로서, 표적 유전자 mRNA의 어느 영역의 센스 RNA를 코드하는 센스 코드 DNA와 당해 DNA와 상보적인 서열과 스페이서 영역을 사이에 두어 대향하도록 연결시키고 이것을 tRNA 프로모터와 기능적으로 접속시킨 구조를 특징으로 하는 DNA.
  7. 제3항, 제4항 또는 제6항 중 어느 하나에 있어서, 상기 tRNA 프로모터가 tRNAVAL프로모터인 것을 특징으로 하는 DNA.
  8. 제1항 내지 제4항, 제6항 또는 제7항 중 어느 하나에 있어서, 상기 센스 코드 DNA의 길이가 10~35 bp인 것을 특징으로 하는 DNA.
  9. 제1항 내지 제4항, 제6항 또는 제7항 중 어느 하나에 있어서, 상기 센스 코드 DNA의 길이가 26~30 bp인 것을 특징으로 하는 DNA.
  10. 제1항 내지 제4항, 제6항 또는 제7항 중 어느 하나에 있어서, 상기 센스 코드 DNA의 길이가 31~35 bp인 것을 특징으로 하는 DNA.
  11. 제5항에 있어서, 상기 센스 코드 DNA의 길이가 10~5000 bp인 것을 특징으로 하는 DNA.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나에 있어서, 상기 스페이서 영역의 길이가 1~10000 염기인 것을 특징으로 하는 DNA.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나에 있어서, 상기 스페이서 영역의 길이가 1~100 염기인 것을 특징으로 하는 DNA.
  14. 제1항 내지 제4항, 제6항 내지 제10항, 제12항 또는 제13항 중 어느 하나에 있어서, 발현되는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역의 길이가 10~35 bp인 것을 특징으로 하는 DNA.
  15. 제1항 내지 제4항, 제6항 내지 제10항, 제12항 또는 제13항 중 어느 하나에 있어서, 발현되는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역의 길이가 26~30 bp인 것을 특징으로 하는 DNA.
  16. 제1항 내지 제4항, 제6항 내지 제10항, 제12항 또는 제13항 중 어느 하나에 있어서, 발현되는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역의 길이가 31~35 bp인 것을 특징으로 하는 DNA.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나에 있어서, 발현되는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역 내에 미스매치 또는 벌지(bulge)를 포함하도록 구축된 것을 특징으로 하는 DNA.
  18. 제17항에 있어서, 센스 사슬에 20 염기쌍 당 1~6 염기의 G·U 짝을 두는 것 같은 미스매치를 포함하도록 구축된 것을 특징으로 하는 DNA.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나에 있어서, 발현되는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역 내에 20 염기쌍 당 1~10 염기의 미스매치 또는 벌지를 포함하도록 구축된 것을 특징으로 하는 DNA.
  20. 제19항에 있어서, 상기 미스매치가 센스 사슬에 20 염기쌍 당 1~6 염기의 G·U 짝을 두는 것 같은 미스매치인 것을 특징으로 하는 DNA.
  21. 제5항 또는 제11항에 있어서, 발현되는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역 내에 300 염기쌍 당 1~100 염기의 미스매치 또는 벌지를 포함하도록 구축된 것을 특징으로 하는 DNA.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포 혹은 효모 세포인 것을 특징으로 하는 DNA.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나에 기재된 DNA의 전사 산물로서 세포내에서 RNAi 효과를 가지는 스템 루프 형 RNA 분자.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나에 기재된 DNA를 포함하는 벡터.
  25. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나에 기재된 DNA 또는 제24항에 기재된 벡터를 보유하는 세포.
  26. 제25항에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포 혹은 효모 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  27. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나에 기재된 DNA 또는 제24항에 기재된 벡터를 포함하는 조성물.
  28. (a) 제1항 내지 제22항 중 어느 하나에 기재된 DNA 또는 제24항에 기재된 벡터를 세포에 도입하는 공정 및,
    (b) 상기 DNA 혹은 벡터가 도입된 세포를 선별하는 공정을 포함하는,
    표적 유전자의 발현이 억제된 세포를 생산하는 방법.
  29. 세포내에서 스템 루프 형 랜덤 RNA 분자를 코드하는 DNA로서, 랜덤인 서열로 구성되는 RNA를 코드하는 DNA와 당해 DNA와 상보적인 서열을 스페이서-영역을 사이에 두어 대향하도록 연결시키고 이것을 tRNA 프로모터와 기능적으로 접속시킨 구조를 가지는 DNA를 포함하는 벡터.
  30. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나에 기재된 DNA 또는 제24항 또는 제29항에 기재된 벡터를 보유한 생물 개체.
  31. 제30항에 있어서, 상기 생물 개체는 표적 유전자가 넉아웃된 비사람 동물인 것을 특징으로 하는 생물 개체.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 생물 개체가 마우스, 래트, 토끼, 소, 말, 돼지, 양, 원숭이 및 침팬지로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생물 개체.
  33. 제29항에 있어서, 상기 발현되는 스템 루프 형 랜덤 RNA 분자의 스템 영역의 길이가 10~35 bp인 것을 특징으로 하는 벡터.
  34. (a) 제29항 또는 제33항에 기재된 벡터를 세포에 도입하는 공정;
    (b) 전기 벡터가 도입된 세포를 선택하는 공정; 및
    (c) 선택된 세포의 표현형을 해석하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 기능 유전자의 탐색 방법.
  35. 제34항에 있어서, 표현형 해석에 의해 표현형이 변화한 세포 내 벡터 서열 중의 랜덤 서열에 기초하여 기능 유전자를 스크리닝 하는 공정을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 기능 유전자의 탐색 방법.
  36. (a) 세포내에서 RNAi 효과를 가지는 스템 루프 형 RNA 분자를 코드하는 DNA로서, 표적 유전자 mRNA의 어느 영역의 센스 RNA를 코드하는 센스 코드 DNA와 당해 DNA와 상보적인 서열을 스페이서-영역을 사이에 두어 대향하도록 연결시키고 이것을 프로모터와 기능적으로 접속시킨 구조를 특징으로 하는 DNA와
    (b) Dicer 단백질에 있어서의 Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드 영역을 코드 하는 DNA와 프로모터를 기능적으로 접속시킨 구조를 특징으로 하는 DNA
    를 포함하는 siRNA 발현 시스템.
  37. 제36항에 있어서, (a) 기재의 프로모터가 tRNA 프로모터 또는 Pol III계 프로모터인 것을 특징으로 하는 siRNA 발현 시스템.
  38. 제36항에 있어서, (a) 기재의 프로모터가 NMT1 프로모터, GAL1 프로모터 또는 PolII계 프로모터인 것을 특징으로 하는 siRNA 발현 시스템.
  39. 제38항에 있어서, 발현되는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역 내에 300 염기쌍 당 1~100 염기의 미스매치 또는 벌지를 포함하는 것을 특징으로 하는 siRNA 발현 시스템.
  40. 제36항에 있어서, (b) 기재의 프로모터가 PolII계 프로모터인 것을 특징으로 하는 siRNA 발현 시스템.
  41. 제36항 내지 제40항 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포 혹은 효모 세포인 것을 특징으로 하는 siRNA 발현 시스템.
  42. 제36항 내지 제41항 중 어느 하나에 있어서, 표적 유전자 mRNA의 어느 영역에 있어서의 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 결합한 dsRNA, 또는 당해 dsRNA를 스템으로 하는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역의 길이가 적어도 30 염기쌍 이상인 것을 특징으로 하는 siRNA 발현 시스템.
  43. 제36항 내지 제41항 중 어느 하나에 있어서, 표적 유전자 mRNA의 어느 영역에 있어서의 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 결합한 dsRNA 내, 또는 당해 dsRNA를 스템으로 하는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역 내의 센스 사슬에 300 염기쌍 당처 1~100 염기의 미스매치 또는 벌지를 포함하는 것을 특징으로 하는 siRNA 발현 시스템.
  44. 제36항의 (a) 및 (b)의 양방의 DNA를 포함하는 siRNA 발현 벡터.
  45. 제36항 내지 제43항 중 어느 하나에 기재된 siRNA 발현 시스템 또는 제44항에 기재된 발현 벡터를 이용하여 스템 루프 형 RNA 분자와 Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드의 양방을 발현시키는 것을 특징으로 하는, 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법.
  46. (a) 표적 유전자 mRNA의 어느 영역에 있어서의 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 결합한 dsRNA 또는 당해 dsRNA를 스템으로 하는 스템 루프 형 RNA 분자를 Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드로 처리하는 공정, 및
    (b) 상기 공정 (a)에서 생성된 dsRNA를 표적 유전자를 포함하는 세포에 도입하는 공정,
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드가 Dicer 단백질의 1066~1924 위치의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제46항에 있어서, 상기 Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드가 Dicer 단백질의 1268~1924 위치의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제46항에 있어서, 상기 Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드가 Dicer 단백질의 1296~1924 위치의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제46항에 있어서, 상기 Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드가 전체 길이 Dicer 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제45항 내지 제50항 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 포유동물 세포 혹은 효모 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제46항에 있어서, 상기 Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드가 대장균에서 발현시킨 제47항 내지 제50항의 어느 하나에 기재된 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제46항에 있어서, 상기 Dicer 활성을 가지는 폴리펩티드가 곤충 세포에서 발현시킨 제44항 내지 제47항의 어느 하나에 기재된 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제45항 내지 제53항 중 어느 하나에 있어서, 표적 유전자 mRNA의 어느 영역에 있어서의 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 결합한 dsRNA 또는 당해 dsRNA를 스템으로 하는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역의 길이가 적어도 30 염기쌍 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제45항 내지 제53항 중 어느 하나에 있어서, 표적 유전자 mRNA의 어느 영역에 있어서의 센스 RNA 및 안티센스 RNA가 결합한 dsRNA 내, 또는 당해 dsRNA를 스템으로 하는 스템 루프 형 RNA 분자의 스템 영역 내의 센스 사슬에 300 염기쌍 당 1~100 염기의 미스매치 또는 벌지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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