JP2016535724A5

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Publication number: JP2016535724A5
Application number: JP2016520025A
Authority: JP
Filing date: 2014-10-02
Publication date: 2019-12-19
Anticipated expiration: 2034-10-02

Description

好ましくは、溶液に少なくとも１つの擬似移動床クロマトグラフィー工程を適用する前に、中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液（好ましくは、微生物発酵溶液）を
ｉ）濾過または遠心してバイオマスおよび／または不溶性物質をすべて除去し、好ましくは活性炭、チャコール、セライトで濾過し、および／またはクロスフロー濾過により、不溶性物質および有機夾雑物をすべて除去し、より好ましくはクロスフロー濾過により濾過し、最も好ましくは精密濾過膜を用いるクロスフロー濾過により濾過する；および／または
ｉｉ）カチオンおよび／またはアニオン交換クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つの精製工程、好ましくは最初に少なくとも１つのカチオン交換クロマトグラフィー工程、次いで少なくとも１つのアニオン交換クロマトグラフィー工程を適用する。

こうして得られた無菌ラクト−Ｎ−テトラオース溶液を、次いでミニ噴霧乾燥器Ｂ−２９０（ＢｕｅｃｈｉＬａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋＧｍｂＨ，ドイツ、エッセン）を用いて噴霧乾燥した。ラクト−Ｎ−テトラオースの噴霧乾燥のために、溶液を加圧下で出口温度１２０℃〜１３０℃の噴霧乾燥器ノズルに通し、排出温度６６℃〜６７℃を維持するように流速を調整した。これらのセッティングを用いて、含水率７〜９％および収率７２％の噴霧乾燥ラクト−Ｎ−テトラオースを含む噴霧乾燥粉末を得ることができた。含水率をカールフィッシャー滴定法により測定した。
本発明には、以下の態様もある。
態様１
中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液から中性ヒトミルクオリゴ糖を連続クロマトグラフィーで精製する方法であって、
中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液が、微生物発酵抽出液、生体触媒反応溶液、化学合成溶液、およびその組合わせからなる群から選択される溶液を含むかまたはそれからなり、その際、溶液中の中性ヒトミルクオリゴ糖の純度は＜８０％であり、
粗製溶液に、擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つの精製工程を適用し、その際、純度≧８０％の中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液が得られることを特徴とする方法。
態様２
粗製溶液中の中性ヒトミルクオリゴ糖の純度が≦７０％、≦６０％、≦５０％、≦４０％、≦３０％、≦２０％、≦１０％もしくは≦５％であり、および／または精製溶液が純度≧８５％、好ましくは≧９０％の中性ヒトミルクオリゴ糖を含むことを特徴とする、態様１に記載の方法。
態様３
少なくとも１つの擬似移動床クロマトグラフィーが、
ｉ）少なくとも４つのカラム、好ましくは少なくとも８つのカラム、より好ましくは少なくとも１２のカラムを有し、その際、少なくとも１つのカラムが弱または強カチオン交換樹脂、好ましくはＨ^＋−形またはＣａ^２＋−形のカチオン交換樹脂を含む；および／または
ｉｉ）流速の異なる４つのゾーンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶを有する；
ｉｉｉ）水、好ましくはエタノールおよび水、より好ましくは５〜１５体積％のエタノールおよび８５〜９５体積％の水、最も好ましくは９〜１１体積％のエタノールおよび８９〜９１体積％の水を含むかまたはそれからなる溶離剤を有し、その際、溶離剤は場合によりさらに硫酸、好ましくは≦１０ｍＭまたはそれより少ない硫酸を含む；および／または
ｉｖ）１５℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５５℃、より好ましくは２５℃〜５０℃の操作温度を有する；
ことを特徴とする、態様１または２に記載の方法。
態様４
精製溶液に、擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つのさらなる精製工程を適用し、その際、純度≧９２％の中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液が得られることを特徴とする、態様１〜３のいずれか１項に記載の方法。
態様５
さらなる擬似移動床クロマトグラフィーが、
ｉ）少なくとも４つのカラム、好ましくは少なくとも８つのカラム、より好ましくは少なくとも１２のカラムを有し、その際、少なくとも１つのカラムが弱または強カチオン交換樹脂、好ましくはＨ^＋−形またはＣａ^２＋−形のカチオン交換樹脂を含む；および／または
ｉｉ）流速の異なる４つのゾーンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶを有する；
ｉｉｉ）水、好ましくはエタノールおよび水、より好ましくは５〜１５体積％のエタノールおよび８５〜９５体積％の水、最も好ましくは９〜１１体積％のエタノールおよび８９〜９１体積％の水を含むかまたはそれからなる溶離剤を有し、その際、溶離剤は場合によりさらに硫酸、好ましくは≦１０ｍＭまたはそれより少ない硫酸を含む；および／または
ｉｖ）１５℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜５５℃、より好ましくは２５℃〜５０℃の操作温度を有する；
ことを特徴とする、態様４に記載の方法。
態様６
中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液が微生物発酵抽出液を含むかまたはそれからなり、その際、微生物発酵抽出液が少なくとも１つの微生物発酵工程、好ましくはそれに続く少なくとも１つの下記の工程で得られ：
ａ）微生物発酵後に可溶性物質を不溶性物質から分離するための、溶液、好ましくは粗製溶液の濾過；
ｂ）溶液、好ましくは工程ａ）で得られた溶液の、イオン交換クロマトグラフィー、好ましくはカチオン交換クロマトグラフィー、より好ましくはカチオン交換クロマトグラフィーに続くアニオン交換クロマトグラフィー；
ｃ）溶液、好ましくは工程ｂ）で得られた溶液の濃縮、より好ましくは水の蒸発による濃縮、および／またはナノ濾過による濃縮、場合により１回より多い濃縮；
ｄ）溶液、好ましくは工程ｃ）で得られた溶液の透析、より好ましくは電気透析および／または透析濾過による透析、最も好ましくはナノ濾過膜を用いる透析濾過による透析、場合により１回より多い透析；
ｅ）溶液、好ましくは工程ｄ）で得られた溶液の、擬似移動床クロマトグラフィーを用いるクロマトグラフィー；
ｆ）中性ヒトミルクオリゴ糖を有色夾雑物から分離するための、溶液、好ましくは工程ｅ）で得られた溶液の濾過、より好ましくは活性炭による濾過；ならびに
ｇ）中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液、好ましくは工程ｆ）で得られた精製溶液の、噴霧乾燥；
その際、最も好ましくはすべての工程ａ）〜ｇ）を連続的に実施する
ことを特徴とする、態様１〜５のいずれか１項に記載の方法。
態様７
溶液に少なくとも１つの擬似移動床クロマトグラフィー工程を適用する前に、中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液を
ｉ）濾過して不溶性物質をすべて除去し、好ましくは活性炭、チャコールおよび／またはセライトで濾過して不溶性物質および有機夾雑物をすべて除去し、より好ましくはクロスフロー濾過により濾過し、最も好ましくは精密濾過膜を用いるクロスフロー濾過により濾過する；および／または
ｉｉ）カチオンおよび／またはアニオン交換クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つの精製工程、好ましくは最初に少なくとも１つのカチオン交換クロマトグラフィー工程、次いで少なくとも１つのアニオン交換クロマトグラフィー工程を適用する；
ことを特徴とする、態様１〜６のいずれか１項に記載の方法。
態様８
溶液に擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つの精製工程を適用する前に、または擬似移動床クロマトグラフィーを用いる精製工程の後に、中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液を電気透析および／または透析濾過し、好ましくはナノ濾過膜で透析濾過し、より好ましくはサイズ排除限界≦２０Åを有するナノ濾過膜で透析濾過し、その際、最も好ましくは溶液を≦１５ｍＳ／ｃｍ、好ましくは≦１０ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは≦５ｍＳ／ｃｍの導電率にまで透析することを特徴とする、態様１〜７のいずれか１項に記載の方法。
態様９
透析後に、中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液を、
ｉ）≧１００ｇ／Ｌ、好ましくは≧２００ｇ／Ｌ、より好ましくは≧３００ｇ／Ｌの濃度にまで；および／または
ｉｉ）真空濃縮機を用いて；および／または
ｉｉｉ）ナノ濾過により；および／または
ｉｖ）４℃〜５０℃、好ましくは１０℃〜４５℃、場合により２０℃〜４０℃または３０℃〜３５℃の温度で
濃縮することを特徴とする、態様８に記載の方法。
態様１０
精製溶液を、好ましくは３ｋＤａフィルターによる精製溶液の濾過により、無菌濾過および／またはエンドトキシン除去することを特徴とする、態様１〜９のいずれか１項に記載の方法。
態様１１
精製溶液を噴霧乾燥すること、特に、２０〜６０％（ｗ／ｖ）、好ましくは３０〜５０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは３５〜４５％（ｗ／ｖ）の中性ヒトミルクオリゴ糖濃度、１１０〜１５０℃、好ましくは１２０〜１４０℃、より好ましくは１２５〜１３５℃のノズル温度、および／または６０〜８０℃、好ましくは６５〜７０℃の出口温度で噴霧乾燥することを特徴とする、態様１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
態様１２
中性ヒトミルクオリゴ糖が３以上の単糖単位を有する中性ヒトミルクオリゴ糖、好ましくは中性ヒトミルク三糖、四糖、五糖または六糖であり、より好ましくは中性ヒトミルクオリゴ糖が２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩＩ、６’−ガラクトシルラクトース、３’−ガラクトシルラクトース、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオースおよびジフコシル−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオースからなる群から選択され、最も好ましくは中性ヒトミルクオリゴ糖が２’−フコシルラクトースまたはラクト−Ｎ−テトラオースであることを特徴とする、態様１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
態様１３
中性ヒトミルクオリゴ糖を連続クロマトグラフィーで精製する方法が中性ヒトミルクオリゴ糖を連続的に精製する方法であり、その際、中性ヒトミルクオリゴ糖は好ましくは２’−フコシルラクトースまたはラクト−Ｎ−テトラオースであることを特徴とする、態様１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
態様１４
態様１〜１３のいずれか１項に記載の方法で製造できる中性ヒトミルクオリゴ糖、好ましくは噴霧乾燥された中性ヒトミルクオリゴ糖。
態様１５
態様１４に記載の中性ヒトミルクオリゴ糖であって、
ｉ）固体顆粒形態；および／または
ｉｉ）示差走査熱量測定により測定して、６０〜９０℃、好ましくは６２〜８８℃、より好ましくは６４〜８６℃のガラス転移温度；および／または
ｉｉｉ）レーザー回折により測定して、５〜５００μｍ、好ましくは１０〜３００μｍの粒径；および／または
ｉｖ）レーザー回折により測定して、１０〜１００μｍ、好ましくは２０〜９０μｍ、より好ましくは３０〜８０μｍ、最も好ましくは４０〜７０μｍの平均粒径；および／または
ｖ）非晶質状態、好ましくはＸ線粉末回折で結晶性物質の特徴的なピークをもたない非晶質状態；および／または
ｖｉ）≦１０％、好ましくは≦８％、より好ましくは＜５％の含水率
を有する中性ヒトミルクオリゴ糖。
態様１６
医薬に使用するための、好ましくは胃腸障害の予防または治療に使用するための、態様１４または１５に記載の中性ヒトミルクオリゴ糖。
態様１７
中性ヒトミルクオリゴ糖が３以上の単糖単位を有する中性ヒトミルクオリゴ糖、好ましくは中性ヒトミルク三糖、四糖、五糖または六糖であり、より好ましくは中性ヒトミルクオリゴ糖が２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩＩ、６’−ガラクトシルラクトース、３’−ガラクトシルラクトース、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオース、パラ−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオースおよびジフコシル−ラクト−Ｎ−ネオヘキサオースからなる群から選択され、最も好ましくは中性ヒトミルクオリゴ糖が２’−フコシルラクトースまたはラクト−Ｎ−テトラオースであることを特徴とする、態様１４〜１６のいずれか１項に記載の中性ヒトミルクオリゴ糖。
態様１８
食品における添加剤としての、好ましくはヒトの食品および／またはペットフードにおける添加剤としての、より好ましくはヒトのベビーフードにおける添加剤としての、態様１４〜１７のいずれか１項に記載の中性ヒトミルクオリゴ糖の使用。

Claims

中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液から中性ヒトミルクオリゴ糖を連続クロマトグラフィーで精製する方法であって、
中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液が、微生物発酵抽出液、生体触媒反応溶液、化学合成溶液、およびその組合わせからなる群から選択される溶液を含むかまたはそれからなり、その際、溶液中の中性ヒトミルクオリゴ糖の純度は＜８０％であり、
粗製溶液に、擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つの精製工程を適用し、その際、純度≧８０％の中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液が得られることを特徴とする方法。
粗製溶液中の中性ヒトミルクオリゴ糖の純度が≦７０％、≦６０％、≦５０％、≦４０％、≦３０％、≦２０％、≦１０％もしくは≦５％であり、および／または精製溶液が純度≧８５％の中性ヒトミルクオリゴ糖を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
少なくとも１つの擬似移動床クロマトグラフィーが、
ｉ）少なくとも４つのカラムを有し、その際、少なくとも１つのカラムが弱または強カチオン交換樹脂を含む；および／または
ｉｉ）流速の異なる４つのゾーンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶを有する；
ｉｉｉ）水を含むかまたは水からなる溶離剤を有する；および／または
ｉｖ）１５℃〜６０℃の操作温度を有する；
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
精製溶液に、擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つのさらなる精製工程を適用し、その際、純度≧９２％の中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液が得られることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
さらなる擬似移動床クロマトグラフィーが、
ｉ）少なくとも４つのカラムを有し、その際、少なくとも１つのカラムが弱または強カチオン交換樹脂を含む；および／または
ｉｉ）流速の異なる４つのゾーンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶを有する；
ｉｉｉ）水を含むかまたは水からなる溶離剤を有する；および／または
ｉｖ）１５℃〜６０℃の操作温度を有する；
ことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液が微生物発酵抽出液を含むかまたはそれからなり、その際、微生物発酵抽出液が少なくとも１つの微生物発酵工程、それに続く少なくとも１つの下記の工程で得られることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法：
ａ）微生物発酵後に可溶性物質を不溶性物質から分離するための、溶液の濾過；
ｂ）溶液のイオン交換クロマトグラフィー、それに続くアニオン交換クロマトグラフィー；
ｃ）溶液の濃縮；
ｄ）溶液の透析；
ｅ）溶液の擬似移動床クロマトグラフィーを用いるクロマトグラフィー；
ｆ）中性ヒトミルクオリゴ糖を有色夾雑物から分離するための溶液の濾過；ならびに
ｇ）中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液の噴霧乾燥。
溶液に少なくとも１つの擬似移動床クロマトグラフィー工程を適用する前に、中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液を
ｉ）濾過して不溶性物質をすべて除去する；および／または
ｉｉ）カチオンおよび／またはアニオン交換クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つの精製工程を適用する；
ことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
溶液に擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも１つの精製工程を適用する前に、または擬似移動床クロマトグラフィーを用いる精製工程の後に、中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液を電気透析および／または透析濾過することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
透析後に、中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液を、
ｉ）≧１００ｇ／Ｌの濃度にまで；および／または
ｉｉ）真空濃縮機を用いて；および／または
ｉｉｉ）ナノ濾過により；および／または
ｉｖ）４℃〜５０℃の温度で
濃縮することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
精製溶液を、無菌濾過および／またはエンドトキシン除去することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
精製溶液を噴霧乾燥することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
中性ヒトミルクオリゴ糖が中性ヒトミルク三糖、四糖、五糖または六糖であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
中性ヒトミルクオリゴ糖を連続クロマトグラフィーで精製する方法が中性ヒトミルクオリゴ糖を連続的に精製する方法であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。