JP6666243B2 - 擬似移動床クロマトグラフィーを用いる中性ヒトミルクオリゴ糖の精製方法 - Google Patents
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Description
本発明は、中性HMO(たとえば、2’−フコシルラクトース)および夾雑物を含む粗製溶液から中性ヒトミルクオリゴ糖を連続クロマトグラフィーで(または連続的に)精製する方法を提供し、その際、中性HMO(たとえば、2’−フコシルラクトース)および夾雑物を含む粗製溶液が、微生物発酵抽出液、生体触媒反応溶液、化学合成溶液、およびその組合わせからなる群から選択される溶液を含むかまたはそれからなり、その際、溶液中の中性HMO(たとえば、2’−フコシルラクトース)の純度は<80%である。本方法は、粗製溶液に、擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも1つの精製工程を適用することを特徴とする。この方法で、純度≧80%の所望の中性HMO(たとえば、2’−フコシルラクトース)を含む精製溶液が得られる。
i)少なくとも4つのカラム、好ましくは少なくとも8つのカラム、より好ましくは少なくとも12のカラムを有し、その際、少なくとも1つのカラムが弱または強カチオン交換樹脂、好ましくはH+−形またはCa2+−形のカチオン交換樹脂を含む;および/または
ii)流速の異なる4つのゾーンI、II、III、IVを有する;および/または
iii)水、好ましくはエタノールおよび水、より好ましくは5〜15体積%(vol %)のエタノールおよび85〜95体積%の水、最も好ましくは9〜11体積%のエタノールおよび89〜91体積%の水を含むかまたはそれからなる溶離剤を有し、その際、溶離剤は場合によりさらに硫酸、好ましくは≦10mMの硫酸;より好ましくは≦2〜5mMの硫酸を含む;および/または
iv)15℃〜60℃、好ましくは20℃〜55℃、より好ましくは25℃〜50℃の操作温度を有する
ことができる。
i)流速の異なる4つのゾーンI、II、IIIおよびIVを有し、その際、流速は好ましくは:ゾーンIにおいて28〜32ml/分、ゾーンIIにおいて19〜23ml/分、ゾーンIIIにおいて21〜25ml/分、および/またはゾーンIVにおいて16〜20ml/分である;および/または
ii)2〜4ml/分、好ましくは3ml/分の供給速度を有する;および/または
iii)10〜13ml/分、好ましくは11.5ml/分の溶離剤流速を有する;および/または
iv)16〜20分、好ましくは17〜19分、より好ましくは18分のスイッチング時間を有する
ことができる。
i)少なくとも4つのカラム、好ましくは少なくとも8つのカラム、最も好ましくは少なくとも12のカラムを有し、その際、少なくとも1つのカラムが弱または強カチオン交換樹脂、好ましくはH+−形またはCa2+−形のカチオン交換樹脂を含む;および/または
ii)流速の異なる4つのゾーンI、II、III、IVを有する;および/または
iii)水、好ましくはエタノールおよび水、より好ましくは5〜15体積%のエタノールおよび85〜95体積%の水、最も好ましくは9〜11体積%のエタノールおよび89〜91体積%の水を含むかまたはそれからなる溶離剤を有し、その際、溶離剤は場合によりさらに硫酸、好ましくは≦10mMの硫酸;より好ましくは≦2〜5mMの硫酸を含む;および/または
iv)15℃〜60℃、好ましくは20℃〜55℃、より好ましくは25℃〜50℃の操作温度を有する
ことができる。
i)流速の異なる4つのゾーンI、II、IIIおよびIVを有し、その際、流速は好ましくは:ゾーンIにおいて28〜32ml/分、ゾーンIIにおいて19〜23ml/分、ゾーンIIIにおいて21〜25ml/分、および/またはゾーンIVにおいて16〜20ml/分である;および/または
ii)2〜4ml/分、好ましくは3ml/分の供給速度を有する;および/または
iii)10〜13ml/分、好ましくは11.5ml/分の溶離剤流速を有する;および/または
iv)16〜20分、好ましくは17〜19分、より好ましくは18分のスイッチング時間を有する
ことができる。
i)濾過または遠心してバイオマスおよび/または不溶性物質をすべて除去し、好ましくは活性炭、チャコール、セライトで濾過し、および/またはクロスフロー濾過により、不溶性物質および有機夾雑物をすべて除去し、より好ましくはクロスフロー濾過により濾過し、最も好ましくは精密濾過膜を用いるクロスフロー濾過により濾過する;および/または
ii)カチオンおよび/またはアニオン交換クロマトグラフィーを用いる少なくとも1つの精製工程、好ましくは最初に少なくとも1つのカチオン交換クロマトグラフィー工程、次いで少なくとも1つのアニオン交換クロマトグラフィー工程を適用する。
i)≧50g/l、≧100g/l、好ましくは≧200g/l、より好ましくは≧300g/lの濃度にまで;および/または
ii)真空濃縮を用いて;および/または
iii)ナノ濾過により;および/または
iv)4℃〜50℃、好ましくは10℃〜45℃、場合により20℃〜40℃または30℃〜35℃の温度で
濃縮することができる。
精製溶液を噴霧乾燥すること、特に、20〜60%(w/v)、好ましくは30〜50%(w/v)、より好ましくは35〜45%(w/v)の中性HMO濃度、110〜150℃、好ましくは120〜140℃、より好ましくは125〜135℃の入口温度、および/または60〜80℃、好ましくは65〜70℃の出口温度で噴霧乾燥することができる。
本発明の有利な態様において、本発明の方法は、中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液が微生物発酵抽出液を含むかまたはそれからなり、その際、微生物発酵抽出液が少なくとも1つの微生物発酵工程、好ましくはそれに続く少なくとも1つの下記の工程で得られることを特徴とする:
a)微生物発酵後に可溶性物質を不溶性物質から分離するための、溶液、好ましくは粗製溶液の濾過;および/または
b)溶液、好ましくは工程a)で得られた溶液の、イオン交換クロマトグラフィー、好ましくはカチオン交換クロマトグラフィー、より好ましくはカチオン交換クロマトグラフィーに続くアニオン交換クロマトグラフィー;および/または
c)溶液、好ましくは工程b)で得られた溶液の濃縮、より好ましくは水の蒸発による濃縮、および/またはナノ濾過による濃縮、場合により1回より多い濃縮;および/または
d)溶液、好ましくは工程c)で得られた溶液の透析、より好ましくは電気透析および/または透析濾過による透析、最も好ましくはナノ濾過膜を用いる透析濾過による透析、場合により1回より多い透析;および/または
e)溶液、好ましくは工程d)で得られた溶液の、擬似移動床クロマトグラフィーを用いるクロマトグラフィー;および/または
f)中性ヒトミルクオリゴ糖を有色夾雑物から分離するための、溶液、好ましくは工程e)で得られた溶液の濾過、より好ましくは活性炭による濾過;および/または
g)中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液、好ましくは工程f)で得られた精製溶液の、噴霧乾燥。
i)固体顆粒形態;および/または
ii)示差走査熱量測定により測定して、60〜90℃、好ましくは62〜88℃、より好ましくは64〜86℃のガラス転移温度;および/または
iii)レーザー回折により測定して、5〜500μm、好ましくは10〜300μmの粒径;および/または
iv)レーザー回折により測定して、10〜100μm、好ましくは20〜90μm、より好ましくは30〜80μm、最も好ましくは40〜70μmの平均粒径;および/または
v)非晶質状態、好ましくはX線粉末回折で結晶性物質の特徴的なピークをもたない非晶質状態;および/または
vi)≦10%、好ましくは≦8%、より好ましくは<5%の含水率
をもつことができる。
さらに、本発明による中性HMOを食品における添加剤として、好ましくはヒトの食品および/またはペットフードにおける添加剤として、より好ましくはヒトのベビーフードにおける添加剤として使用することを提唱する。
濃度250g/Lの2’−フコシルラクトースを含有する透明な、粒子を含まない溶液を、0.5mS/cmになるまで、PC−Cell E200膜積層体を備えたPC−Cell BED 1−3 電気透析装置(PC−Cell,ドイツ、ホイスヴァイラー)を用いて電気透析した。その積層体はサイズ排除限界60Daをもつ下記の膜から構成されていた:カチオン交換膜(cation exchange membrane)CEM:PC SK、およびアニオン交換膜(anion exchange membrane)AEM:PcAcid60。
溶液を3kDaフィルター(Pall Microza限外濾過中空繊維モジュールSEP−2013,Pall Corporation,ドライアイヒ)に通すことにより、この溶液に次いで無菌濾過およびエンドトキシン除去を施した。
濃度250g/Lの2’−フコシルラクトースを含有する透明な、粒子を含まない溶液を、0.5mS/cmになるまで、PC−Cell E200膜積層体を備えたPC−Cell BED 1−3 電気透析装置(PC−Cell,ドイツ、ホイスヴァイラー)を用いて電気透析した。その積層体はサイズ排除限界60Daをもつ下記の膜から構成されていた:カチオン交換膜CEM:Pc SK、およびアニオン交換膜AEM:PcAcid60。
マルチコンポーネント分離において、夾雑物、たとえばラクトース、単糖類、たとえばフコース、グルコース、ガラクトースおよびグリセロールは第1分離工程のエクストラクト中にみられ、より大きなオリゴ糖夾雑物(たとえば、ジフコシルラクトース)は第2分離工程のラフィネート中に分画された。
このプロトコルを用いて、純度93.0%の2’−フコシルラクトースを得ることができた。主な夾雑物は、3’−フコシルラクトース(1.1%)、ジフコシルラクトース(0.9%)およびラクトース(1.0%)であった。
SMBクロマトグラフィーにより得られた2’−フコシルラクトース画分に、0.5mS/cm未満の導電率が得られるまで再び電気透析処理を施した。これらの画分を次いで真空下で濃縮して、40%(w/v)の2’−フコシルラクトースを含有する2’−フコシルラクトース画分を得た。その後、溶液を3kDaフィルター(Pall Microza限外濾過中空繊維モジュールSEP−2013,Pall Corporation,ドイツ、ドライアイヒ)に通すことにより、これらの溶液に無菌濾過およびエンドトキシン除去を施した。
実施例4:噴霧乾燥した2’−フコシルラクトースの特性分析
1.示差走査熱量測定(DSC)
Mettler Toledo 821e(Mettler Toledo,ドイツ、ギーセン)を用いて、噴霧乾燥した2’−フコシルラクトースの2つの試料(試料#1および試料#2)の熱事象を測定した。
広角X線粉末回折(XRD)を用いて試料#1および#2の形態を調べた。銅アノード(45kV,40mA,波長0.154nmにおけるKα1発光)およびPIXcel3D検出器を備えた、X線回折計Empyrean(Panalytical,オランダ、アルメロ)を用いた。おおよそ100mgの噴霧乾燥試料を、反射モードで、角度範囲5〜45° 2θ、ステップサイズ0.04° 2θ、およびステップ当たりのカウンティング時間100秒で分析した。
3.レーザー回折
>500nmの粒子を検出するための605nmレーザーダイオードおよび<500nmの粒子を検出するための405nm青色発光ダイオード(LED)を備えた、Partica LA−950レーザー回折粒度分布分析計(堀場,日本、京都)を用いて、レーザー回折測定を実施した。イソオクタン(1.391の屈折率)を分散媒として用いた。試料の屈折率は未知であったので、ショ糖(二糖)粒子の屈折率(1.530)を用いた。最大5分間の超音波処理によりイソオクタン中に試料を分散させた。測定前に、システムをイソオクタンでブランキングした。各試料の分散液を3回測定し、平均値および標準偏差を報告する。
d(v,10):10体積%の累積ふるい下分布(cumulative undersize distribution)に対応する粒径
d(v,50):50体積%の累積ふるい下分布に対応する粒径
d(v,90):90体積%の累積ふるい下分布に対応する粒径
試料#1および#2の粒度分布を図5に示す。最高強度の粒径を表わすモード径は両試料について同等である。全体として、それぞれ67.85μm(試料#1)および43.65μm(試料#2)の平均粒度を噴霧乾燥粒子について異例に高いとみなす。より高い粒径で検出された画分はおそらく凝集粉末粒子により生じたものであろう。
2’−フコシルラクトースを含む培養上清の濃縮および脱塩のために、NF99(Alfa Laval NF99)またはNF99HF(Alfa Laval NF99HF)ナノ濾過膜のいずれかを備えた、Alfa Laval M−20膜濾過モジュールを用いた。用いた2’−フコシルラクトース含有培養上清(25g/lの2’−フコシルラクトースを含有)は、発酵微生物バイオマスからクロスフロー濾過を用いて分離された。クロスフロー濾過膜の分子カットオフは150kDaであった(StrassBurger Filter Micro Cross Module(登録商標) FS10LFC−FUS1582)。
細菌発酵から得られた透明な、粒子を含まないラクト−N−テトラオース溶液(30g/l)を、PC−Cell電気透析装置を用いて0.5mS/cmの導電率にまで電気透析した(前記を参照)。SMBクロマトグラフィーのために、ラクト−N−テトラオース溶液を真空下に40℃で50g/lにまで濃縮した。あるいは、ラクト−N−テトラオース含有溶液をナノ濾過膜(たとえば、ナノ濾過膜HF99HF,Alfa Lavalから)により脱塩および濃縮することができる。
細菌発酵から得られた透明な、粒子を含まないラクト−N−テトラオース溶液(30g/l)を、PC−Cell電気透析装置を用いて0.5mS/cmの導電率にまで電気透析した(前記を参照)。
ラクト−N−テトラオースを含有する画分を真空下で濃縮して、ラクト−N−テトラオース濃度25%(w/v)を得た。この溶液を次いで無菌濾過およびエンドトキシン除去のために3kDaフィルター(Pall Microza限外濾過中空繊維モジュールSEP−1013,Pall Corporation,ドイツ、ドライアイヒ)に通した。
本発明には、以下の態様もある。
態様1
中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液から中性ヒトミルクオリゴ糖を連続クロマトグラフィーで精製する方法であって、
中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液が、微生物発酵抽出液、生体触媒反応溶液、化学合成溶液、およびその組合わせからなる群から選択される溶液を含むかまたはそれからなり、その際、溶液中の中性ヒトミルクオリゴ糖の純度は<80%であり、
粗製溶液に、擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも1つの精製工程を適用し、その際、純度≧80%の中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液が得られることを特徴とする方法。
態様2
粗製溶液中の中性ヒトミルクオリゴ糖の純度が≦70%、≦60%、≦50%、≦40%、≦30%、≦20%、≦10%もしくは≦5%であり、および/または精製溶液が純度≧85%、好ましくは≧90%の中性ヒトミルクオリゴ糖を含むことを特徴とする、態様1に記載の方法。
態様3
少なくとも1つの擬似移動床クロマトグラフィーが、
i)少なくとも4つのカラム、好ましくは少なくとも8つのカラム、より好ましくは少なくとも12のカラムを有し、その際、少なくとも1つのカラムが弱または強カチオン交換樹脂、好ましくはH+−形またはCa2+−形のカチオン交換樹脂を含む;および/または
ii)流速の異なる4つのゾーンI、II、III、IVを有する;
iii)水、好ましくはエタノールおよび水、より好ましくは5〜15体積%のエタノールおよび85〜95体積%の水、最も好ましくは9〜11体積%のエタノールおよび89〜91体積%の水を含むかまたはそれからなる溶離剤を有し、その際、溶離剤は場合によりさらに硫酸、好ましくは≦10mMまたはそれより少ない硫酸を含む;および/または
iv)15℃〜60℃、好ましくは20℃〜55℃、より好ましくは25℃〜50℃の操作温度を有する;
ことを特徴とする、態様1または2に記載の方法。
態様4
精製溶液に、擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも1つのさらなる精製工程を適用し、その際、純度≧92%の中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液が得られることを特徴とする、態様1〜3のいずれか1項に記載の方法。
態様5
さらなる擬似移動床クロマトグラフィーが、
i)少なくとも4つのカラム、好ましくは少なくとも8つのカラム、より好ましくは少なくとも12のカラムを有し、その際、少なくとも1つのカラムが弱または強カチオン交換樹脂、好ましくはH+−形またはCa2+−形のカチオン交換樹脂を含む;および/または
ii)流速の異なる4つのゾーンI、II、III、IVを有する;
iii)水、好ましくはエタノールおよび水、より好ましくは5〜15体積%のエタノールおよび85〜95体積%の水、最も好ましくは9〜11体積%のエタノールおよび89〜91体積%の水を含むかまたはそれからなる溶離剤を有し、その際、溶離剤は場合によりさらに硫酸、好ましくは≦10mMまたはそれより少ない硫酸を含む;および/または
iv)15℃〜60℃、好ましくは20℃〜55℃、より好ましくは25℃〜50℃の操作温度を有する;
ことを特徴とする、態様4に記載の方法。
態様6
中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液が微生物発酵抽出液を含むかまたはそれからなり、その際、微生物発酵抽出液が少なくとも1つの微生物発酵工程、好ましくはそれに続く少なくとも1つの下記の工程で得られ:
a)微生物発酵後に可溶性物質を不溶性物質から分離するための、溶液、好ましくは粗製溶液の濾過;
b)溶液、好ましくは工程a)で得られた溶液の、イオン交換クロマトグラフィー、好ましくはカチオン交換クロマトグラフィー、より好ましくはカチオン交換クロマトグラフィーに続くアニオン交換クロマトグラフィー;
c)溶液、好ましくは工程b)で得られた溶液の濃縮、より好ましくは水の蒸発による濃縮、および/またはナノ濾過による濃縮、場合により1回より多い濃縮;
d)溶液、好ましくは工程c)で得られた溶液の透析、より好ましくは電気透析および/または透析濾過による透析、最も好ましくはナノ濾過膜を用いる透析濾過による透析、場合により1回より多い透析;
e)溶液、好ましくは工程d)で得られた溶液の、擬似移動床クロマトグラフィーを用いるクロマトグラフィー;
f)中性ヒトミルクオリゴ糖を有色夾雑物から分離するための、溶液、好ましくは工程e)で得られた溶液の濾過、より好ましくは活性炭による濾過;ならびに
g)中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液、好ましくは工程f)で得られた精製溶液の、噴霧乾燥;
その際、最も好ましくはすべての工程a)〜g)を連続的に実施する
ことを特徴とする、態様1〜5のいずれか1項に記載の方法。
態様7
溶液に少なくとも1つの擬似移動床クロマトグラフィー工程を適用する前に、中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液を
i)濾過して不溶性物質をすべて除去し、好ましくは活性炭、チャコールおよび/またはセライトで濾過して不溶性物質および有機夾雑物をすべて除去し、より好ましくはクロスフロー濾過により濾過し、最も好ましくは精密濾過膜を用いるクロスフロー濾過により濾過する;および/または
ii)カチオンおよび/またはアニオン交換クロマトグラフィーを用いる少なくとも1つの精製工程、好ましくは最初に少なくとも1つのカチオン交換クロマトグラフィー工程、次いで少なくとも1つのアニオン交換クロマトグラフィー工程を適用する;
ことを特徴とする、態様1〜6のいずれか1項に記載の方法。
態様8
溶液に擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも1つの精製工程を適用する前に、または擬似移動床クロマトグラフィーを用いる精製工程の後に、中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液を電気透析および/または透析濾過し、好ましくはナノ濾過膜で透析濾過し、より好ましくはサイズ排除限界≦20Åを有するナノ濾過膜で透析濾過し、その際、最も好ましくは溶液を≦15mS/cm、好ましくは≦10mS/cm、より好ましくは≦5mS/cmの導電率にまで透析することを特徴とする、態様1〜7のいずれか1項に記載の方法。
態様9
透析後に、中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液を、
i)≧100g/L、好ましくは≧200g/L、より好ましくは≧300g/Lの濃度にまで;および/または
ii)真空濃縮機を用いて;および/または
iii)ナノ濾過により;および/または
iv)4℃〜50℃、好ましくは10℃〜45℃、場合により20℃〜40℃または30℃〜35℃の温度で
濃縮することを特徴とする、態様8に記載の方法。
態様10
精製溶液を、好ましくは3kDaフィルターによる精製溶液の濾過により、無菌濾過および/またはエンドトキシン除去することを特徴とする、態様1〜9のいずれか1項に記載の方法。
態様11
精製溶液を噴霧乾燥すること、特に、20〜60%(w/v)、好ましくは30〜50%(w/v)、より好ましくは35〜45%(w/v)の中性ヒトミルクオリゴ糖濃度、110〜150℃、好ましくは120〜140℃、より好ましくは125〜135℃のノズル温度、および/または60〜80℃、好ましくは65〜70℃の出口温度で噴霧乾燥することを特徴とする、態様1〜10のいずれか1項に記載の方法。
態様12
中性ヒトミルクオリゴ糖が3以上の単糖単位を有する中性ヒトミルクオリゴ糖、好ましくは中性ヒトミルク三糖、四糖、五糖または六糖であり、より好ましくは中性ヒトミルクオリゴ糖が2’−フコシルラクトース、3−フコシルラクトース、2’,3−ジフコシルラクトース、ラクト−N−トリオースII、ラクト−N−テトラオース、ラクト−N−ネオテトラオース、ラクト−N−フコペンタオースI、ラクト−N−ネオフコペンタオースI、ラクト−N−フコペンタオースII、ラクト−N−フコペンタオースIII、ラクト−N−フコペンタオースV、ラクト−N−ネオフコペンタオースV、ラクト−N−ジフコヘキサオースI、ラクト−N−ジフコヘキサオースII、6’−ガラクトシルラクトース、3’−ガラクトシルラクトース、ラクト−N−ヘキサオース、ラクト−N−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−N−ヘキサオース、パラ−ラクト−N−ネオヘキサオースおよびジフコシル−ラクト−N−ネオヘキサオースからなる群から選択され、最も好ましくは中性ヒトミルクオリゴ糖が2’−フコシルラクトースまたはラクト−N−テトラオースであることを特徴とする、態様1〜11のいずれか1項に記載の方法。
態様13
中性ヒトミルクオリゴ糖を連続クロマトグラフィーで精製する方法が中性ヒトミルクオリゴ糖を連続的に精製する方法であり、その際、中性ヒトミルクオリゴ糖は好ましくは2’−フコシルラクトースまたはラクト−N−テトラオースであることを特徴とする、態様1〜12のいずれか1項に記載の方法。
態様14
態様1〜13のいずれか1項に記載の方法で製造できる中性ヒトミルクオリゴ糖、好ましくは噴霧乾燥された中性ヒトミルクオリゴ糖。
態様15
態様14に記載の中性ヒトミルクオリゴ糖であって、
i)固体顆粒形態;および/または
ii)示差走査熱量測定により測定して、60〜90℃、好ましくは62〜88℃、より好ましくは64〜86℃のガラス転移温度;および/または
iii)レーザー回折により測定して、5〜500μm、好ましくは10〜300μmの粒径;および/または
iv)レーザー回折により測定して、10〜100μm、好ましくは20〜90μm、より好ましくは30〜80μm、最も好ましくは40〜70μmの平均粒径;および/または
v)非晶質状態、好ましくはX線粉末回折で結晶性物質の特徴的なピークをもたない非晶質状態;および/または
vi)≦10%、好ましくは≦8%、より好ましくは<5%の含水率
を有する中性ヒトミルクオリゴ糖。
態様16
医薬に使用するための、好ましくは胃腸障害の予防または治療に使用するための、態様14または15に記載の中性ヒトミルクオリゴ糖。
態様17
中性ヒトミルクオリゴ糖が3以上の単糖単位を有する中性ヒトミルクオリゴ糖、好ましくは中性ヒトミルク三糖、四糖、五糖または六糖であり、より好ましくは中性ヒトミルクオリゴ糖が2’−フコシルラクトース、3−フコシルラクトース、2’,3−ジフコシルラクトース、ラクト−N−トリオースII、ラクト−N−テトラオース、ラクト−N−ネオテトラオース、ラクト−N−フコペンタオースI、ラクト−N−ネオフコペンタオースI、ラクト−N−フコペンタオースII、ラクト−N−フコペンタオースIII、ラクト−N−フコペンタオースV、ラクト−N−ネオフコペンタオースV、ラクト−N−ジフコヘキサオースI、ラクト−N−ジフコヘキサオースII、6’−ガラクトシルラクトース、3’−ガラクトシルラクトース、ラクト−N−ヘキサオース、ラクト−N−ネオヘキサオース、パラ−ラクト−N−ヘキサオース、パラ−ラクト−N−ネオヘキサオースおよびジフコシル−ラクト−N−ネオヘキサオースからなる群から選択され、最も好ましくは中性ヒトミルクオリゴ糖が2’−フコシルラクトースまたはラクト−N−テトラオースであることを特徴とする、態様14〜16のいずれか1項に記載の中性ヒトミルクオリゴ糖。
態様18
食品における添加剤としての、好ましくはヒトの食品および/またはペットフードにおける添加剤としての、より好ましくはヒトのベビーフードにおける添加剤としての、態様14〜17のいずれか1項に記載の中性ヒトミルクオリゴ糖の使用。
Claims (13)
- 中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液から中性ヒトミルクオリゴ糖を連続クロマトグラフィーで精製する方法であって、
中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液が、微生物発酵抽出液、生体触媒反応溶液、化学合成溶液、およびその組合わせからなる群から選択される溶液を含むかまたはそれからなり、その際、溶液中の中性ヒトミルクオリゴ糖の純度は<80%であり、
粗製溶液に、擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも1つの精製工程を適用し、その際、純度≧80%の中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液が得られることを特徴とする方法。 - 粗製溶液中の中性ヒトミルクオリゴ糖の純度が≦70%、≦60%、≦50%、≦40%、≦30%、≦20%、≦10%もしくは≦5%であり、および/または精製溶液が純度≧85%の中性ヒトミルクオリゴ糖を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの擬似移動床クロマトグラフィーが、
i)少なくとも4つのカラムを有し、その際、少なくとも1つのカラムが弱または強カチオン交換樹脂を含む;および/または
ii)流速の異なる4つのゾーンI、II、III、IVを有する;
iii)水を含むかまたは水からなる溶離剤を有する;および/または
iv)15℃〜60℃の操作温度を有する;
ことを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。 - 精製溶液に、擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも1つのさらなる精製工程を適用し、その際、純度≧92%の中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液が得られることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- さらなる擬似移動床クロマトグラフィーが、
i)少なくとも4つのカラムを有し、その際、少なくとも1つのカラムが弱または強カチオン交換樹脂を含む;および/または
ii)流速の異なる4つのゾーンI、II、III、IVを有する;
iii)水を含むかまたは水からなる溶離剤を有する;および/または
iv)15℃〜60℃の操作温度を有する;
ことを特徴とする、請求項4に記載の方法。 - 中性ヒトミルクオリゴ糖および夾雑物を含む粗製溶液が微生物発酵抽出液を含むかまたはそれからなり、その際、微生物発酵抽出液が少なくとも1つの微生物発酵工程、それに続く少なくとも1つの下記の工程で得られることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法:
a)微生物発酵後に可溶性物質を不溶性物質から分離するための、溶液の濾過;
b)溶液のイオン交換クロマトグラフィー、それに続くアニオン交換クロマトグラフィー;
c)溶液の濃縮;
d)溶液の透析;
e)溶液の擬似移動床クロマトグラフィーを用いるクロマトグラフィー;
f)中性ヒトミルクオリゴ糖を有色夾雑物から分離するための溶液の濾過;ならびに
g)中性ヒトミルクオリゴ糖を含む精製溶液の噴霧乾燥。 - 溶液に少なくとも1つの擬似移動床クロマトグラフィー工程を適用する前に、中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液を
i)濾過して不溶性物質をすべて除去する;および/または
ii)カチオンおよび/またはアニオン交換クロマトグラフィーを用いる少なくとも1つの精製工程を適用する;
ことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。 - 溶液に擬似移動床クロマトグラフィーを用いる少なくとも1つの精製工程を適用する前に、または擬似移動床クロマトグラフィーを用いる精製工程の後に、中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液を電気透析および/または透析濾過することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 透析後に、中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液を、
i)≧100g/Lの濃度にまで;および/または
ii)真空濃縮機を用いて;および/または
iii)ナノ濾過により;および/または
iv)4℃〜50℃の温度で
濃縮することを特徴とする、請求項8に記載の方法。 - 精製溶液を、無菌濾過および/またはエンドトキシン除去することを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 精製溶液を噴霧乾燥することを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 中性ヒトミルクオリゴ糖が中性ヒトミルク三糖、四糖、五糖または六糖であることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 中性ヒトミルクオリゴ糖を連続クロマトグラフィーで精製する方法が中性ヒトミルクオリゴ糖を連続的に精製する方法であることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
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