CN115003681B

CN115003681B - 用于回收和纯化人乳寡糖的方法

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Publication number: CN115003681B
Application number: CN202180011267.9A
Authority: CN
Inventors: A·M·C·詹斯; P·沙赛涅
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2020-01-29
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2024-07-05
Anticipated expiration: 2041-01-29

Abstract

一种用于回收和纯化HMO的方法，其包括：(a)提供包含生物质的含HMO的发酵液；(b)分离发酵液以形成分离的含HMO的流和生物质废物流；(c)纯化分离的含HMO的流；(d)浓缩分离的含HMO的流；和(e)通过间接干燥方法干燥步骤(a)‑(d)的产物，从而形成纯化的HMO，其中步骤(c)‑(d)能够以任何顺序执行。

Description

用于回收和纯化人乳寡糖的方法

技术领域

本发明涉及分离方法。更具体地，本发明涉及用于从发酵液中回收和纯化人乳寡糖(HMO)的方法。

相关申请的交叉引用

本申请为要求2020年1月29日提交的美国临时申请第62/967,357号的优先权的国际申请，其全部内容并入本文以供参考。

背景技术

人乳含有一系列独特的寡糖HMO，它们是结构多样的非共轭聚糖。尽管是人乳中第三最丰富的固体组分(仅次于乳糖和脂肪)，但是人类婴儿实际上不可消化HMO。相反，它们充当益生元以帮助建立共生细菌。HMO还充当抗粘连剂，帮助防止微生物病原体附着到粘膜表面。支持婴儿健康消化道的发育有助于他们免疫系统的发育，因为大部分婴儿免疫系统处于消化道内。这些复杂寡糖的存在和浓度是人类特有的，并且在其它哺乳动物比如家养乳畜的乳汁中没有大量发现。因此，需要含HMO的补充剂，与喂养婴儿的配方奶粉一起使用，以提供这些有益效果。开发用于产生HMO的改进系统的工作一直在进行中，如EP14827224.8、WO2019/003133、WO2019/003135、US 2017/0304375和WO2019/003136中。特别地，这些方法通常在回收过程中使用喷雾干燥步骤，例如，如WO2019/110801、WO2019/110806、WO2015/106943、WO2019/110804和WO2019/110800中所示。然而，相对于常规方法，仍然需要提供用于产生和回收HMO的改进方法。

发明内容

本公开的主题包括用于从发酵液中回收和纯化HMO的方法。出乎意料地发现，通过以特定方式回收、纯化和干燥HMO，可以改进操作安全性并且减少产物损失。

在一个实施方式中，本公开提供用于回收和纯化HMO的方法，其包括：(a)提供包含生物质的含HMO的发酵液；(b)分离发酵液以形成分离的含HMO的流和生物质废物流；(c)纯化分离的含HMO的流；(d)浓缩分离的含HMO的流；和(e)通过间接干燥方法干燥步骤(a)-(d)的产物，从而形成纯化的HMO，其中步骤(c)-(d)能够以任何顺序执行。纯化步骤(c)可选自以下中的至少一种：(i)超滤；(ii)纳滤；(iii)去离子处理；和(iv)脱色，其中子步骤i-iv能够以任何顺序执行。去离子处理步骤(iii)可选自离子吸附或离子交换。

在另一个实施方式中，本公开提供用于回收和纯化HMO的方法，其包括：(a)提供包含生物质的含HMO的发酵液；(b)分离发酵液以形成分离的含HMO的流和生物质废物流；(c)在选自以任何顺序执行的超滤、纳滤、离子吸附和脱色的至少一种的步骤中纯化分离的含HMO的流；(d)浓缩分离的含HMO的流；和(e)通过间接干燥方法干燥步骤(a)-(d)的产物，从而形成纯化的HMO，其中步骤(c)-(d)能够以任何顺序执行。

在另一个实施方式中，本公开提供用于回收和纯化HMO的方法，其包括：(a)提供包含生物质的含HMO的发酵液；(b)分离发酵液以形成分离的含HMO的流和生物质废物流；(c)在选自以任何顺序执行的超滤、纳滤、离子交换处理和脱色的至少一种的步骤中纯化分离的含HMO的流；(d)浓缩分离的含HMO的流；和(e)通过间接干燥方法干燥步骤(a)-(d)的产物，从而形成纯化的HMO，其中步骤(c)-(d)能够以任何顺序执行。

在另一个实施方式中，本公开另外提供一种方法，其包括用间接干燥方法干燥干物质含量为20至80wt％的纯化的HMO流，从而形成水分水平不大于9wt％的干燥的HMO产物。

在又另一个替代实施方式中，本公开另外提供通过上述方法生产的干燥的HMO产物，其经由与脉冲安培检测耦合的高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)进行测量，单糖含量小于9％。

在另一个实施方式中，本公开另外提供通过上述方法生产的干燥的HMO，其根据下述方法进行测量，在溶液中的颜色吸收小于0.3。

在另一个实施方式中，本公开提供一种方法，其包括：提供包含生物质的含HMO的发酵液；去除生物质，从而形成生物质贫化流；纯化生物质贫化流，从而形成含有20-80wt％固体和20-80wt％液体的纯化的HMO流；和通过间接干燥方法干燥纯化的HMO流以形成含有至少90wt％固体的HMO固体流。

在一个实施方式中，本公开提供一种方法，其包括：(a)提供包含生物质的含HMO的发酵液；(b)离心发酵液以形成生物质富集流和生物质贫化产物流；(c)通过微滤过滤生物质贫化产物流以形成低悬浮物质产物流；(d)通过超滤过滤低悬浮物质产物流以形成超滤产物流；(e)通过纳滤过滤超滤产物流以形成纳滤产物流；(f)对纳滤产物流进行阳离子交换，从而形成阳离子贫化产物流；(g)将阳离子贫化产物流脱色，从而形成脱色的产物流；(h)对脱色的产物流进行阴离子交换，从而形成阴离子贫化产物流；(i)浓缩阴离子贫化产物流，从而形成浓缩的产物流；和(j)用间接干燥方法干燥浓缩的产物流以形成HMO富集产物，其中步骤(i)的产物任选地在步骤(i)和(j)之间进行热处理步骤。

在替代实施方式中，本公开提供一种方法，其包括：(a)提供包含生物质的含HMO的发酵液；(b)离心发酵液以形成生物质富集流和生物质贫化产物流；(c)通过超滤过滤生物质贫化产物流以形成超滤产物流；(d)通过纳滤过滤超滤产物流，从而形成纳滤产物流；(e)对纳滤产物流进行阳离子交换，从而形成阳离子贫化产物流；(f)将阳离子贫化产物流脱色，从而形成脱色的产物流；(g)对脱色的产物流进行阴离子交换，从而形成阴离子贫化产物流；(h)浓缩阴离子贫化产物流，从而形成浓缩的产物流；和(i)用间接干燥方法干燥浓缩的产物流以形成HMO富集产物，其中步骤(h)的产物任选地在步骤(h)和(i)之间进行热处理步骤。

在另一个实施方式中，本公开提供一种用于产生HMO的方法，其包含呈任何顺序的纳滤、离子交换或离子吸附以及通过蒸发浓缩，然后是间接干燥。

在又另一个实施方式中，本公开提供一种通过间接干燥生产的HMO，其包含以下中的至少一种：(i)<2％的乳果糖；(ii)<3％的岩藻糖；(iii)<1％的半乳糖；或(iv)<3％的葡萄糖。

在另一个实施方式中，本公开提供一种用于产生HMO的方法，其包含在滚筒干燥器中干燥含HMO的流，干燥器包含接触含HMO的流的镀铬表面。

在又另一个实施方式中，本公开提供通过间接干燥生产的HMO，其包含<5wt％的水。

在又另一个实施方式中，本公开提供通过间接干燥生产的HMO，其包含小于10％，优选小于5％，更优选小于1％，最优选小于0.1％的细粒分数。

具体实施方式

本公开的特征在于用于回收和纯化人乳寡糖(HMO)的方法包括以下方法步骤中的一个或多个：遗传修饰的微生物有机体的发酵；离心或过滤，以及微滤以去除生物质(例如细胞、高分子量分子)；超滤以去除蛋白质和/或其它更高分子量分子，比如DNA；纳滤步骤以去除小于期望HMO的分子；脱色以去除有色材料；离子交换以去除带电分子，和浓缩以去除液体。在所有情况下，间接干燥都用于产生HMO产物。

HMO

从作为发酵产物的发酵液中纯化期望HMO，比如2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)。在发酵后，将含有期望HMO的发酵液应用于如下概述的分离过程。

如本说明书中使用的术语“发酵液”是指从微生物有机体的发酵中获得的产物。因此，发酵产物包含细胞(生物质)、发酵培养基、残余底物材料和在发酵期间生产的任何分子/副产物，比如期望HMO。在纯化方法的每个步骤后，去除发酵产物的组分中的一种或多种，产生更纯的HMO。

优选地，根据本公开的方法纯化的期望HMO选自：2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2',3-二岩藻糖基乳糖、乳-N-三糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-新岩藻五糖、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-新岩藻五糖V、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖和乳-N-新六糖、唾液酸-乳-N-四糖a、唾液酸乳-N-四糖b、唾液酸乳-N-四糖c、二唾液酸乳-N-四糖、3'和6'唾液酸乳糖或它们的混合物。更优选地，期望HMO为2’-岩藻糖基乳糖。

期望HMO，比如2'-FL，为通过遗传修饰的微生物有机体的发酵产生。发酵可在任何合适的发酵培养基中执行，例如化学成分限定的发酵培养基。发酵培养基可基于使用的微生物有机体而变化。

优选地，微生物有机体为遗传修饰的酵母，比如酵母属(Saccharomyces)菌株、假丝酵母属(Candida)菌株、汉逊酵母属(Hansenula)菌株、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)菌株、毕赤酵母属(Pichia)菌株、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)菌株、许旺酵母属(Schwanniomyces)菌株、孢圆酵母属(Torulaspora)菌株、耶氏酵母属(Yarrowia)菌株或接合酵母属(Zygosaccharomyces)菌株。更优选地，酵母为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、树干毕赤酵母(Pichia stipites)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)或拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)。

优选地，微生物有机体还可选自大肠杆菌(E.coli)或酿酒酵母属(S.cerevisiae)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Strepto coccus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、梭菌属(Clostridium)、真杆菌属(Eubacterium)、韦荣氏球菌属(Veilonella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、厌氧杆菌属(Bacterioides)、普氏菌属(Prevotella)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)和酵母属(Saccharomyces)、青春双歧杆菌属(Bifidobacteriumadolescentis)、动物双歧杆菌属(B.animalis)、双歧双歧杆菌属(B.bifidum)、短双歧杆菌属(B.breve)、婴儿双歧杆菌属(B.infantis)、乳酸双歧杆菌属(B.lactis)、长双歧杆菌属(B.longum)；屎肠球菌(Enterococcus faecium)；大肠杆菌(Escherichia coll)、马克斯克鲁维酵母(Klyveromyces marxianus)；嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、干酪乳杆菌(L.casei)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、加氏乳杆菌(L.gasseri)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、副干酪乳杆菌(L.paracasei)、植物乳杆菌(L.plantarum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、沙克乳杆菌(L.sakel)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(包括但不限于乳酸亚种、乳脂亚种和二乙酰乳酸亚种)；肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)(包括但不限于肠系膜亚种)；乳酸片球菌(Pedicoccus acidilactici)、戊糖片球菌(P.pentosaceus)；产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)、费氏丙酸杆菌费氏亚种(P.freudenreichiissp.shermanii)；肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)；和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)。

下文描述在本公开中描述的方法中利用的各种单元操作。根据目标HMO的性质和期望产物纯度，可利用这些单元操作的组合。然而，在每种情况下，在回收/纯化步骤之后，利用间接干燥将水分水平降低至其目标水平。

常规过滤

出于本说明书的目的，术语常规过滤是指使用板框过滤、凹室过滤、带式过滤、真空过滤、水平金属叶过滤、竖直金属叶过滤、叠盘式过滤、旋转真空过滤以及它们的组合的方法。

离心

离心可用于去除悬浮物质，比如生物质。期望HMO产物包含在离心机不保留的液体中。优选地，离心机连续操作。

微滤

交叉流过滤过程可用于用作保护过滤器，以去除在离心步骤中未去除的残余生物质。通常，微滤具有10微米的截留，优选2微米的截留；甚至更优选地，微滤具有0.2至2.0微米的截留，并且最优选地，微滤具有0.2至0.5微米的截留。产物流为液体渗透物。

超滤

交叉流超滤可用于从发酵产物中去除蛋白质和其它高分子量化合物，比如DNA和大多糖。超滤膜的孔径范围为约300kD分子量截留(“MWCO”)或更小至约1kD MWCO。产物流为渗透物。

优选地，在超滤步骤后，渗透物中期望HMO的产率大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％。

纳滤

交叉流纳滤可用于去除小于期望HMO的低分子量分子，比如单糖和二糖、肽、小有机酸、水和盐。纳滤膜的孔径为约1000道尔顿(Da)或更小的分子量截留至200Da MWCO或更小。优选地，分子量截留为500道尔顿(Da)或更小、450Da MWCO、400Da MWCO、350Da MWCO、300Da MWCO、250Da MWCO或200Da MWCO或更小。产物流为渗余物。

优选地，在纳滤步骤后，渗余物中期望HMO的产率大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％。

去离子处理

去离子处理可用于从含HMO的流中分离带电分子。去离子处理可包括使用合成树脂的离子交换处理、离子吸附或两者。这种合成树脂可包括阳离子交换剂、阴离子交换剂、两性交换剂或它们的组合，其中阳离子交换剂可为强酸性或弱酸性的，并且阴离子交换剂可为强碱性或弱碱性的。在离子交换处理中，含HMO的流中的目标离子在流中被最初由树脂结合的离子取代。离子传输为双向的，其中目标离子流动到树脂上，并且平衡离子从树脂中移出到含HMO的流中，从而实现电中性。在离子吸附中，含HMO的流中的目标离子从流中去除并且富集在树脂表面上。离子传输为单向的，其中过程类似于活性炭床对分子的吸附。除了去除目标分子之外，液体本身没有改变。离子吸附的实例为通过呈游离碱形式的弱碱性阴离子树脂捕获酸，其中胺官能团为中性的(未离子化的)，并且不带有比如Cl^-的抗衡离子。这种树脂的实例包括Resindion Relite系列RAM2和Diaion WA系列WA20。然而，如果树脂的官能团带有或负载有抗衡离子，那么它们可用于离子交换处理。

阳离子交换

在利用阳离子交换的离子交换处理中，固定相(树脂)通常含有磺酸盐基团。此阳离子交换步骤去除带正电荷的组分，例如残余氨、金属阳离子和肽。所用树脂的结合容量通常为1.2至2.2eq/L。用于阳离子交换的典型树脂包括Dow Dowex 88、Resindion JC系列JC603和Resindion PK216。

阴离子交换

在利用阴离子交换的离子交换中，固定相(树脂)带正电荷，因此通过库仑相互作用保留带负电荷的分子。此步骤去除带负电荷的组分，例如硫酸盐、磷酸盐、有机酸和带负电荷的颗粒。所用树脂的结合容量通常为0.8至2.0eq/L。用于阴离子交换的典型树脂包括Resindion Relite系列，比如D182和JA100。

脱色

可执行脱色步骤以去除含颜色的组分。此步骤可使用活性炭比如Norit CA1活性炭、疏水相互作用色谱(HIC)或另一种可官能化的吸附树脂比如Resindion Relite RAD/F来进行。脱色可在阴离子交换步骤之前或之后执行。

浓缩

使用蒸发、反渗透过滤和纳滤，浓缩步骤可用于从含HMO的流中经济地去除大量液体。蒸发过程可包括例如降膜蒸发、升膜蒸发和旋转蒸发。进入该过程的固体浓度为约5-30wt％。这种过程的出口固体浓度通常大于30wt％。优选大于50wt％。更优选地，离开脱水操作的固体浓度为60-80wt％。回收材料的固体部分大于80wt％HMO，其余杂质主要为糖醇或二糖或三糖。

热处理

热处理步骤可用于杀死可以任何显著程度存在的细菌或其它不期望的微生物，并且基本上为巴氏灭菌过程。任何可接受的巴氏灭菌条件都是可以的，例如从62.8℃持续30分钟到72℃持续20秒到100℃持续1-3秒。

间接干燥

执行间接干燥过程以将HMO的固体浓度增加到90wt％+，同时使所得固体流中的细粒生成降至最低。优选地，离开干燥器的HMO的固体浓度为95wt％+，更优选96wt％+。出于本说明书的目的，间接干燥器包括不利用待干燥的材料与加热的过程气体的直接接触进行干燥，而是依赖于通过干燥器的壁(例如，在滚筒干燥器的情况下，通过壳体壁)或替代地通过桨叶干燥器的中空桨叶的壁的热传递的那些装置，因为它们旋转通过固体，同时传热介质在桨叶的中空内部循环。间接干燥器的其它实例包括接触干燥器和真空滚筒干燥器。

传热介质优选为蒸汽或传热油。更优选地，传热介质为蒸汽。间接干燥与直接干燥器比如喷雾干燥器形成鲜明对比，喷雾干燥器的热过程气体流经容器，直接接触循环固体。快速干燥器或流化床干燥器为这种直接干燥方法的额外实例。

滚筒干燥

优选地，间接干燥方法为滚筒干燥。在滚筒干燥中，加热的表面为旋转的水平金属圆筒的外壳。优选地，圆筒通过内部冷凝的蒸汽加热，使圆筒壁的温度达到110-155℃。蒸汽压力维持在约2至5巴以实现这些温度。优选地，接触待干燥的材料的滚筒干燥器的圆筒壁为镀铬的。这防止从常规滚筒比如铸铁滚筒的未受保护的壁中浸出的金属组分；或由于剥落而在滚筒上存在的腐蚀产物对干燥产物的污染。此外，不建议在操作pH小于5下使用铸铁滚筒，因此镀铬滚筒提供更大的操作灵活性。最后，出乎意料地发现铸铁赋予HMO产物灰色，而镀铬滚筒则没有。

滚筒干燥包括利用常压双滚筒干燥器、常压单滚筒干燥器、常压双滚筒干燥机和任选地在真空下操作的封闭滚筒干燥器的过程。优选地，滚筒干燥在常压双滚筒干燥器中进行。液体进料可通过辊隙进料、辊式进料、浸涂进料或喷雾和飞溅进料施加到转筒的表面。优选地，液体进料使用辊隙进料引入双滚筒干燥器。在辊隙进料中，液体进料被引导至相邻的反向转筒之间的空间。在滚筒之间建立液体的贮液器或池，因此“辊隙宽度”为在池的顶部表面处相邻滚筒之间的水平直线距离。此顶部表面相对于滚筒的中心线越高，池中的液体量越大。此液体量也称为“持液量”，因为它代表液体在干燥前的额外停留时间。金属滚筒表面之间最近点处的水平直线距离称为滚筒间隙。

当暴露于滚筒壁的较高温度时，在辊隙中形成的液体池可开始沸腾。滚筒的反向旋转有助于将液体吸入辊隙中的液体池中，并且将其展开成在两个转筒之间分开的相对较薄的膜。影响滚筒干燥器操作的变量包括旋转速度、滚筒间隙大小、辊隙宽度、滚筒温度、蒸汽压力、进料温度和进料固体浓度。滚筒旋转速度优选为1至10rpm。滚筒间隙大小优选为0.1mm至2.0mm，更优选为0.1mm至0.3mm。辊隙宽度优选为0至50mm，更优选为0至10mm。用于减小辊隙宽度的这些范围避免辊隙中的结晶/固化形成结块，这妨碍实现稳定操作。进料温度优选为4℃至110℃，更优选为4℃至95℃或50℃至110℃。进料固体浓度优选为30wt％至70wt％。优选地，在整个滚筒上维持均匀进料。更优选地，利用具有多个管道分支的进料集管管道来维持均匀进料，该管道分支充当滚筒长度上的进料点。进料点可包含喷嘴或引导进料液体的其它装置。进料pH维持在3至7.5之间。

辊式进料包括在滚筒外侧旋转的涂布辊，液体进料在此处被输送到涂布器和滚筒之间形成的二级辊隙。

浸涂包括滚筒旋转通过贮液器，从而将液体粘附到滚筒的壁上的那些过程。

在喷雾和飞溅进料中，液体进料从滚筒下部向上引导至滚筒表面。

滚筒表面上的液体进料随着滚筒旋转而干燥，直到干燥固体最终从滚筒表面去除，例如在刮刀或细绳的帮助下。干燥固体的特性，例如水分含量、形态和孔隙率主要通过变化蒸汽压力、辊隙的宽度、进料特性和滚筒旋转速度来调节，这影响干燥器的停留时间。优选地，HMO材料在干燥器上的停留时间小于3分钟。随后，可在干燥之后使用研磨和/或筛分步骤，以获得期望的粒度范围。

研磨

如果需要研磨步骤，那么通常适用于所针对的固体类型和粒度的任何研磨方法。这种研磨设备可包括例如球磨机、锤磨机、SAG磨机、棒磨机、雷蒙(Raymond)磨机和立式磨机。

出于本说明书的目的，除非另有说明，否则当提及利用说明书中描述的方法回收和纯化的HMO时，对于单一HMO，基于干物质，“纯”、“纯化”或“产物”HMO流的纯度大于80％，或者对于组合，基于干物质，HMO混合物的纯度大于70％；根据表1和2的程序测量，乳糖含量小于或等于10％，并且水分含量小于或等于10wt％。2'-FL的优选特性总结在表1中。当HMO流已被处理以去除杂质但还没有完全干燥时，术语“纯”、“纯化”或“产物”是指以干基计的材料。

表1

HPAEC-PAD方法利用脉冲安培检测技术。表2-4中说明示例性的HPAEC-PAD。

表2

表3

表4

根据本说明书中描述的方法回收和纯化的HMO可为无定形的或结晶的。优选地，对于单一HMO，基于干物质，以干基计的HMO的纯度大于80wt％；或者对于组合，基于干物质，HMO混合物的纯度大于70％。更优选地，单一HMO纯度大于90wt％。

优选地，HMO具有以下特征中的至少一种：<2％的乳果糖、<3％的岩藻糖、<1％的半乳糖或<3％的葡萄糖。

相对于直接干燥过程，比如喷雾干燥或快速干燥，要求保护的方法的间接干燥导致HMO固体的更苛刻的热处理。出乎意料地，由间接干燥过程产生的HMO表现出优异的耐化学降解性。由间接干燥过程产生的固体可呈颗粒、片状材料、薄片或粉末的形式。研磨为任选的步骤，随后可在此材料上执行，以比喷雾干燥更灵活和有效的方式诱导期望的粒度分布，而喷雾干燥的粒度分布通过喷雾干燥操作固定。相对于喷雾干燥或快速干燥，间接干燥的这些优点是除了其改进的能量利用和降低的排放和操作者暴露于细粒的风险之外的优点。此外，为了避免产物产量水平降低，喷雾干燥和快速干燥通常需要额外的细粒再循环进料操作，这对于所述的间接干燥过程为不需要的。

除非另有说明，否则根据本发明的固体颗粒的所有粒度都是使用英国马尔文仪器有限公司(Malvern Instruments Ltd.,UK)的“Mastersizer 3000”通过激光衍射技术确定的。关于此粒度表征方法的另外的信息可例如发现于“《粒度分析的基本原理(Basicprinciples of particle size analytics)》”，Alan Rawle博士，英国伍斯特郡马尔文市格罗夫伍德路英格玛商业区WR14 1XZ的马尔文仪器有限公司(Malvern InstrumentsLimited,Enigma Business Part,Grovewood Road,Malvern,Worcestershire,WR14 1XZ,UK)和“《马尔文粒度分析仪手册(Manual of Malvern particle size analyzer)》”中。特别参考编号为MAN 0096的用户手册，1.0版，1994年11月。粒度可以以干燥形式，即粉末或悬浮液的形式确定。优选地，根据本发明的固体颗粒的粒度被确定为粉末。术语d₅₀(平均粒度)意指对应于50体积％的累积筛下大小分布的粒径。

优选地，HMO具有小于10％，优选小于5％，更优选小于1％，最优选小于0.1％的细粒分数(小于或等于10μm)。HMO还优选具有大于100μm，更优选大于150μm，甚至更优选大于200μm的平均粒度(d₅₀)。

根据要求保护的方法产生的HMO表现出良好的流动性。优选地，HMO具有小于30的Carr指数，其中Carr指数(C)由公式C＝100(1-ρ_B/ρ_T)确定，其中ρ_B为粉末的自由沉降堆积密度，并且ρ_T为“压实”后粉末的振实堆积密度。对于自由流动的固体，堆积密度和振实密度的值是相似的，所以该值很小。对于流动性较差的固体，这些值之间的差异将更大，因此Carr指数将更大。

优选地，HMO在溶液中的颜色通过使用400nm波长的吸光度测量小于0.3，更优选小于0.2，最优选小于0.1。除非另有说明，否则出于本说明书的目的，颜色测量经由以下程序获得：

样品溶液

制备10％的HMO水溶液，小心地将溶液均化。如果溶解后溶液仍然浑浊，那么应在测量前进行离心或过滤。将澄清溶液转移到1cm的分光光度比色皿中，并且确保消除所有气泡。

评估

根据以下公式对获得的吸光度值进行归一化：

⁴⁰⁰A＝100×⁴⁰⁰A_测量的/m

⁴⁰⁰A-在400nm处的归一化吸光度值

⁴⁰⁰A_测量的-在400nm处获得的吸光度值

m-以mg为单位的样品重量

优选地，HMO的水含量小于5wt％。为了优化产物回收，优选地，HMO具有大于3.0的pH，更优选地，HMO具有大于4.0的pH。通常，这是通过在间接干燥步骤之前将含HMO的流的pH调节至大于3.0来实现的。

在一个实施方式中，本公开提供用于回收和纯化HMO的方法，其包括：(a)提供包含生物质的含HMO的发酵液；(b)分离发酵液以形成分离的含HMO的流和生物质废物流；(c)纯化分离的含HMO的流；(d)浓缩分离的含HMO的流；和(e)通过间接干燥方法干燥步骤(a)-(d)的产物，从而形成纯化的HMO固体，其中步骤(c)-(d)能够以任何顺序执行。优选地，步骤(b)使用离心、微滤、板框过滤、凹室过滤、带式过滤、真空过滤、水平金属叶过滤、竖直金属叶过滤、叠盘式过滤、旋转真空过滤以及它们的组合来执行。

纯化步骤(c)可选自以下中的至少一种：(i)超滤；(ii)纳滤；(iii)去离子处理；和(iv)脱色，其中子步骤i-iv能够以任何顺序执行。去离子处理步骤(iii)可选自离子吸附或离子交换。当执行脱色步骤时，优选用活性炭、疏水相互作用色谱(HIC)和可官能化的吸附树脂中的至少一种执行，其中这些步骤能够以任何顺序执行。优选地，步骤(d)选自蒸发、反渗透分离和纳滤中的至少一种，其中子步骤能够以任何顺序执行。

以下实施例另外详述和解释本发明HMO分离方法的性能。本领域技术人员将认识到在本发明的精神和权利要求的范围内的许多变化。

实施例1和2证明HMO高温降解的影响。

实施例1

将可商购自菲仕兰坎皮纳(Friesland Campina)的Aequival 2'-FL作为粉末状2'-岩藻糖基乳糖(“2'-FL”)与水混合以形成50wt％混合物。将混合物铺在三个铝托盘上。铝托盘中的一个在80℃下加热129分钟，第二个在95℃下加热110分钟，并且第三个在120℃下加热51分钟。加热后，通过HPAEC-PAD测量干燥样品中的每一个中的2'-FL浓度。此外，对于干燥样品中的每一个，通过分光光度测量方法在438nm处测量10％溶液的颜色。类似地，在原始Aequival 2'-FL粉末的三个样品上确定2'-FL浓度和颜色。测试结果在表5中示出。

表5

	2'-FL浓度(mg/g)	在438nm下10％溶液的颜色
			开始粉末#1	792	0.012
开始粉末#2	803	0.010
			开始粉末#3	811	n.d
在80℃下129分钟	759	0.017
			在95℃下110分钟	729	0.043
在120℃下51分钟	710	0.065

表5中的数据指示，在更高的干燥温度下，发生2'-FL降解。此外，在更高的干燥温度下，颜色对应增加。

实施例2

使用高效阴离子交换色谱分析实施例1中干燥和测试的2'-FL粉末，以确定由于加热引起的固体组分的改变。这些结果在表6中示出。

表6

表6的数据指示，随着伴随更高加热温度的2'-FL水平的降低，糖岩藻糖、葡萄糖-半乳糖和乳果糖增加。乳糖稍微有下降的趋势。

实施例3

为了评估增加pH对使用滚筒干燥器干燥的2'-FL样品的影响，如实施例1制备两种1升的2'-FL样品，固体浓度为50wt％。用苛性碱将样品中的一种的pH调节至4.4。用苛性碱将另一个样品的pH调节至6.6。然后在0.6rpm的旋转速度下操作的滚筒温度为110℃的滚筒干燥器中执行滚筒干燥器测试。通过HPLC测试干燥样品的2'-FL浓度。结果在表7中示出。pH为4.4的样品为无定形的，pH为6.6的样品为结晶的，其中结晶度通过X射线粉末衍射(XRPD)测量。

表7

表7中的数据说明，增加pH改进干燥材料中的2'-FL浓度。

实施例4

在50℃和pH 4.5下，以大约13L/h的进料速率，在配备有铸铁滚筒(滚筒直径500mm/滚筒长度500mm)的滚筒干燥器上沉积2'-FL的Brix 58溶液。术语“Brix”定义水溶液中的糖含量。一度Brix为100克溶液中的1克蔗糖并且以质量百分比表示溶液的强度。虽然是基于蔗糖，但对其它糖的应用也以相同的方式执行。蒸汽压力为3.2巴(表压)，滚筒之间的间隙设置为0.17mm，滚筒的旋转速度为4.5rpm，并且辊隙宽度为50mm。产物在刀处收集为白色薄片和粉尘，其中残余水分为2.13％。XRPD指示材料为结晶的(II型)。

实施例5

将Brix 50 2'-FL溶液在储存罐中预热至大约50℃，随后使用单孔进料管通过泵输送到镀铬双滚筒干燥器(滚筒直径500mm，长度500mm)。蒸汽压力为3.3巴(表压)，滚筒的旋转速度设置为1.2rpm，并且间隙设置为0.2mm，如使用铅丝以滚筒上的产物所测量。滚筒之间的平均辊隙宽度为30mm。在30分钟的容量测试期间，过程为稳定的，并且在刀处实现主要为薄片的部分片材。残余水分含量平均为1.13％。使用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)分析2'FL进料的金属含量。在第二次测试中，旋转速度增加到2.5rpm。另外，在以下条件下测试更浓的2'FL溶液(Brix 58)。蒸汽压力为3.0巴(表压)，并且旋转速度为2.5rpm(随后在后续实验中增加到3.5rpm)，池宽度为50mm，并且间隙设置为0.15mm，如以滚筒上的产物所测量。同样，在这些设置下，分析产物的金属含量。表8总结铁和铬泄漏到干燥的2'FL产物中，其中干物质含量在1.1和2.4％之间变化。

表8

测试	Fe(ppm)	Cr(ppm)
			进料(Brix 58)	0.366	0.033
Brix 50，1.2rpm	0.994	0.0995
			Brix 50，2.5rpm	0.83	0.092
Brix 58 2.5rpm	0.781	0.067
			Brix 58 3.5rpm	0.79	0.053

还通过HPAEC-PAD(具有PAD检测器的Dionex ICS5000，具有2×30保护柱的CarboPac PA210 4×150柱，洗脱液A：500mM NaOH，洗脱液B：水，洗脱液C 100mM NaOH)分析滚筒干燥的固体和冻干的进料溶液。表9中呈现选择的峰。没有观察到滚筒干燥后的降解。

表9

实施例6

制备六种5kg 2'-FL Brix 58的样品，并且使用4M苛性碱溶液或4M硫酸将pH从4.66调整至不同值。当进料溶液处于环境条件下(18-20℃)时，测试的pH范围在5.85和4.03之间变化。使用泵将溶液从储存罐输送到由铸铁制成的双滚筒干燥器中，并且使用单孔分配管分配到滚筒之间的空间中。实验以下列设置开始：3.0巴(表压)蒸汽压力、1.5rpm旋转速度、0.15mm间隙和30-35mm池宽度。使用收集篮从每个测试中收集产物，并且用ICP-MS进行分析。样品的铁含量从66.9ppm下降到10.5ppm，因此可观察到明显的时间效应。使用相同的brix 58 2'FL溶液执行第二系列测试，其中旋转速度不同。进料溶液的pH(4.66)没有改变。蒸汽压力为3.2巴(表压)，滚筒速度在1.5rpm和9.5rpm之间变化，并且辊隙宽度为30-35mm。使用正排量泵将液体进料溶液在滚筒之间进料。表10说明在每个rpm设置下在产物中测量的铁和铬含量，其中干燥固体的干物质含量在1.3％和2.4％之间变化。

表10

旋转速度(rpm)	Fe(ppm)	Cr(ppm)
			进料分析	0.34(基于干物质)	0.09(基于干物质)
1.5	6.43	0.07
			3.2	3.07	0.04
4.7	3.65	0.09
			5.7	2.58	0.05
9.5	3.75	0.06

表9和10的结果证明，镀铬滚筒比铸铁滚筒更能防止金属泄漏到产物中。

实施例7和8证明间接干燥器构造(铸铁对镀铬)对产物颜色的影响。

实施例7

通过添加去离子水稀释含有2'-FL和二岩藻糖基乳糖(DFL)(14.5％DFL，基于总固体含量)两者的混合物产物的brix 58溶液，使浓度达到brix 45。在pH 4.3下测量溶液pH，然后在环境条件下通过泵输送到双滚筒干燥器(铸铁，直径500m，宽度500mm)。产物为轻微粘稠和透明的。在此测试期间，蒸汽压力设置为2.8巴(表压)，滚筒速度为5.1转/分钟，滚筒之间的间隙设置为0.15mm，池宽度最大为10mm。恒定的最小进料在刀处产生片材。滚筒有些变色。产物从滚筒上刮下并且收集在收集篮中。使用相同的操作条件执行第二个实验，但是液体进料的pH从4.3调节到5.2。所产生材料的颜色结果在表11中示出。还通过HPAEC-PAD(具有PAD检测器的Dionex ICS5000，具有2×30保护柱的CarboPac PA210 4×150柱，洗脱液A：500mM NaOH，洗脱液B：水，洗脱液C 100mM NaOH)分析来自处理pH 5.2进料溶液和冻干的进料溶液的干燥固体。表12中呈现选择的峰。没有观察到滚筒干燥后的降解。

实施例8

如实施例7制备2'-FL和DFL的溶液，不同之处在于使用镀铬滚筒。执行两次测试。第一次使用在pH 4.3下Brix 58的进料，第二次测试使用在相同的pH 4.3下Brix 45的稀释进料执行。将(冷的，大约8℃)产物沉积在储存罐中，之后如果需要，那么将液体稀释至期望值。随后，使用Waukesha正排量泵和具有8mm孔的进料管将产物沉积在池中。间隙设置为0.15mm(用产物测量为0.21mm)，并且蒸汽压力为2.8巴(表压)，并且滚筒的旋转速度为5.1rpm。将产物收集在收集篮中，并且测量颜色。所产生材料的颜色结果在表11中示出。

表11

	⁴⁰⁰A
		2'FL-DFL滚筒干燥铸铁pH 4.3Brix 45	0.102
2'FL-DFL滚筒干燥铸铁pH 5.2Brix 45	0.291
		2'FL-DFL滚筒干燥镀铬pH 4.3Brix 45	0.009
2'FL-DFL滚筒干燥镀铬pH 4.3Brix 57	0.015

表12

实施例9

将Brix 33的乳-N-四糖(LNT)进料溶液加热至50℃并且使用排量泵泵入双滚筒干燥器(铸铁，尺寸直径500mm，长度50mm)。旋转速度为1.5rpm，蒸汽压力为3.2巴表压并且滚筒之间的间隙设置为0.10mm。辊隙宽度为大约50mm。在这些设置下，进行短暂的测试，其中产物在刀处形成部分封闭的片材。产物的残余水分含量为4.57％。经测量，产物大部分为结晶的，由90％的LNT D型和10％的LNT B型组成。

实施例10

通过添加硫酸将Brix 40的乳-N-新四糖(LNnT)溶液调节至4.0。由于产物的轻微酸性，测试在带有镀铬滚筒(直径500mm，长度500mm)的双滚筒干燥器上进行。将产物从加热的储存罐中进料到滚筒之间。此测试的设置为：3.0巴(表压)；旋转速度为3.5rpm；辊隙宽度为40mm。过程为稳定的，在刀处有部分片材和薄片。测量残余水分为6.1％。用相同的装置和设置执行第二次测试，不同之处在于旋转速度降低至2.5rpm以增加产物的干物质含量。较低的旋转速度导致在刀处有更多的薄片和粉末。残余水分为大约5.5％。

表10的数据证明，相对于铸铁滚筒，镀铬滚筒产生的产物显色要少得多。

本文公开的本发明的其它特征、优点和实施方式在阅读上述公开内容后，对普通技术人员来说将是显而易见的。在这方面，尽管已经相当详细地描述本发明的具体实施方式，但是在不脱离所描述和要求保护的本发明的精神和范围的情况下，可对这些实施方式进行变化和修改。

Claims

1.一种用于回收和纯化HMO的方法，其包括：

(a)提供包含生物质的含HMO的发酵液；

(b)分离所述发酵液以形成分离的含HMO的流和生物质废物流；

(c)纯化所述分离的含HMO的流；

(d)浓缩所述分离的含HMO的流；和

(e)通过间接干燥方法干燥步骤(a)-(d)的产物，从而形成纯化的HMO，

其中步骤(c)-(d)能够以任何顺序执行，

其中所述间接干燥方法为滚筒干燥，

所述滚筒干燥的干燥器具有接触所述含HMO的流的镀铬表面。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)通过离心、微滤、板框过滤、凹室过滤、带式过滤、真空过滤、水平金属叶过滤、竖直金属叶过滤、叠盘式过滤、旋转真空过滤、或它们的组合执行。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)选自以下中的至少一种：

(i)超滤；

(ii)纳滤；

(iii)去离子处理；和

(iv)脱色，

其中子步骤i-iv能够以任何顺序执行。

4.根据权利要求3所述的方法，其中子步骤(iv)用活性炭、疏水相互作用色谱HIC和能够官能化的吸附树脂中的至少一种方法执行，所述方法以任何顺序执行。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)选自蒸发、反渗透过滤和纳滤中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述蒸发选自降膜蒸发、升膜蒸发、旋转蒸发、或它们的组合。

7.根据权利要求1所述的方法，还包括步骤(d)和(e)之间的热处理步骤。

8.根据权利要求2所述的方法，其中所述微滤具有在0.2至2.0微米范围内的截留。

9.根据权利要求3-4中任一项所述的方法，其中所述超滤利用MWCO为300kD或更小至1kD的膜。

10.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述纳滤利用MWCO为1000道尔顿或更小至200道尔顿或更小的膜。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述滚筒干燥的干燥器停留时间小于3分钟。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述HMO选自2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2',3-二岩藻糖基乳糖、乳-N-三糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-新岩藻五糖、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-新岩藻五糖V、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖和乳-N-新六糖、唾液酸-乳-N-四糖a、唾液酸乳-N-四糖b、唾液酸乳-N-四糖c、二唾液酸乳-N-四糖、3'和6'唾液酸乳糖或它们的混合物。

13.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述间接干燥步骤之后的研磨步骤。

14.根据权利要求1所述的方法，其中在所述间接干燥之前，将所述HMO的pH调节至≥4.0。

15.一种用于产生HMO的方法，其包括在滚筒干燥器中干燥含HMO的流，所述干燥器具有接触所述含HMO的流的镀铬表面。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述HMO的d₅₀大于100μm。

17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述HMO具有小于30的Carr指数。

18.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述HMO具有小于10％的细粒分数。

19.一种用于回收和纯化HMO的方法，其包括：

(a)提供包含生物质的含HMO的发酵液；

(b)分离所述发酵液以形成分离的含HMO的流和生物质废物流；

(c)在选自以任何顺序执行的超滤、纳滤、离子交换处理和脱色的至少一种的步骤中纯化所述分离的含HMO的流；

(d)浓缩所述分离的含HMO的流；和

其中步骤(c)-(d)能够以任何顺序执行，

其中所述间接干燥方法为滚筒干燥，

所述滚筒干燥的干燥器具有接触所述含HMO的流的镀铬表面。

20.一种用于回收和纯化HMO的方法，其包括：

(a)提供包含生物质的含HMO的发酵液；

(b)分离所述发酵液以形成分离的含HMO的流和生物质废物流；

(c)在选自以任何顺序执行的超滤、纳滤、离子吸附和脱色的至少一种的步骤中纯化所述分离的含HMO的流；

(d)浓缩所述分离的含HMO的流；和

其中步骤(c)-(d)能够以任何顺序执行，

其中所述间接干燥方法为滚筒干燥，

所述滚筒干燥的干燥器具有接触所述含HMO的流的镀铬表面。