ES2868249T3 - Proceso de purificación de un oligosacárido de leche humana neutro mediante cromatografía de lecho móvil simulado - Google Patents

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Abstract

Proceso para purificación de un oligosacárido de leche humana neutro en una cromatografía continua a partir de una solución cruda que comprende el oligosacárido de la leche humana neutro y contaminantes, en el que el oligosacárido de la leche humana neutro se selecciona del grupo que consiste en 2'-fucosillactosa, 3-fucosillactosa, 2',3-difucosillactosa, lacto-N-triosa II, lacto-N-tetraosa, lacto-N-neotetraosa, lacto-N-fucopentaosa I, lacto-N- neofucopentaosa I, lacto-N-fucopentaosa II, lacto-N-fucopentaosa III, lacto-N-fucopentaosa V, lacto-N- neofucopentaosa V, lacto-N-difucohexaosa I, lacto-N-difucohexaosa II, 6'-galactosillactosa, 3'-galactosillactosa, lacto- N-hexaosa, lacto-N-neohexaosa, para-lacto-N-hexaosa, para-lacto-N-neohexaosa y difucosil-lacto-N-neohexaosa, en el que la solución cruda que comprende el oligosacárido de leche humana neutro y los contaminantes comprende o consiste en una solución que se selecciona del grupo que consiste en extracto de fermentación microbiana, solución de reacción de biocatálisis, solución de síntesis química y combinaciones de los mismos, en el que la pureza del oligosacárido de leche humana neutro en la solución es <80%, caracterizado porque la solución cruda se aplica a al menos una etapa de purificación usando cromatografía de lecho móvil simulado, en la que se proporciona una solución purificada que comprende el oligosacárido de leche humana neutro con una pureza de >=80%, en la que la solución purificada se seca por aspersión.

Description

DESCRIPCIÓN
Proceso de purificación de un oligosacárido de leche humana neutro mediante cromatografía de lecho móvil simulado
La presente solicitud divulga un proceso para la purificación de un oligosacárido de leche humana neutro (HMO neutro). El proceso utiliza cromatografía de lecho móvil simulado (SMB) que permite la purificación continua de grandes cantidades de HMO con alta pureza. A diferencia de las rutas de síntesis química de los HMO neutros, y su posterior purificación, el proceso presentado permite el suministro de HMO libre de productos químicos nocivos, tales como por ejemplo, trazas de metales pesados o disolventes orgánicos. El producto HMO neutro individual se obtiene en forma sólida mediante secado por aspersión. El HMO neutro proporcionado es muy adecuado para su uso en aplicaciones alimentarias.
La leche humana representa una mezcla compleja de carbohidratos, grasas, proteínas, vitaminas, minerales y oligoelementos. Con mucho, la fracción más predominante está representada por carbohidratos, que se pueden dividir en lactosa y oligosacáridos más complejos. Mientras que la lactosa se utiliza como fuente de energía, el bebé no metaboliza los oligosacáridos complejos. La fracción de oligosacáridos complejos representa hasta 1/10 de la fracción total de carbohidratos y consiste probablemente en más de 150 oligosacáridos diferentes. La aparición y concentración de estos oligosacáridos complejos son específicas de los seres humanos y, por lo tanto, no se pueden encontrar en grandes cantidades en la leche de otros mamíferos, tales como por ejemplo los animales lecheros domesticados.
La existencia de estos oligosacáridos complejos en leche humana se conoce desde hace mucho tiempo y las funciones fisiológicas de estos oligosacáridos han sido objeto de investigación médica durante muchas décadas. Para algunos de los oligosacáridos de la leche humana más abundantes, ya se han identificado funciones específicas.
El suministro limitado y las dificultades para obtener fracciones puras de HMO individuales llevaron al desarrollo de rutas químicas para algunas de estas moléculas complejas. Sin embargo, la síntesis de HMO mediante síntesis química, síntesis enzimática o fermentación ha demostrado ser un desafío. Hasta la fecha no se han podido proporcionar al menos cantidades a gran escala ni calidades adecuadas para aplicaciones alimentarias. En este sentido, en particular las rutas de síntesis química de HMO específicas (por ejemplo, e1HMO 2'-fucosillactosa; véanse los documentos WO 2010/115935 A1 y W o 2010/115934 A1) involucran varias sustancias químicas nocivas, que implican el riesgo de contaminación del producto final.
Debido a los desafíos involucrados en la síntesis química de oligosacáridos de la leche humana, se han desarrollado varios métodos enzimáticos y enfoques fermentativos. Sin embargo, estos métodos producen mezclas complejas de oligosacáridos, es decir, el producto deseado está contaminado con material de partida tales como lactosa, compuestos intermedios biosintéticos y sustratos tales como monosacáridos y polipéptidos individuales, etc.
Los procesos en el estado de la técnica para purificar productos de oligosacáridos individuales a partir de estas mezclas complejas son técnicamente complejos y también antieconómicos para aplicaciones alimentarias. Para la purificación de los disacáridos lactosa o sacarosa a partir de mezclas complejas tales como suero o melaza, se han desarrollado procesos a escala industrial que implican múltiples cristalizaciones. La desventaja de dichos métodos es que son elaborados y solo conducen a bajos rendimientos.
Para la purificación de oligosacáridos complejos, tales como ciertos HMO, la cromatografía de filtración en gel ha sido el método de elección hasta ahora. La desventaja de la cromatografía de filtración en gel es que no se puede escalar de manera eficiente y no es adecuada para un funcionamiento continuo. Por lo tanto, la cromatografía de filtración en gel no es económica y hace que sea imposible proporcionar ciertos HMO, tal como e1HMO 2'-fucosillactosa, en cantidades y calidad razonables para usarlos en la alimentación humana.
El documento WO 2012/158517 A1 divulga composiciones y métodos para utilizar oligosacáridos de leche humana sintéticos como prebióticos. Kuhn, R. et al., (Chemische Berichte, vol. 89, No. 11, página 2513) divulgan fucosillactosa amorfa y cristalina. El documento CN 102676 604 A divulga un método para producir una mezcla heterogénea que comprende galactooligosacáridos de alta pureza.
La cromatografía de lecho móvil simulado (SMB) tiene sus raíces en las industrias petroquímica y minera. En la actualidad, la industria farmacéutica utiliza la cromatografía de SMB para la separación de enantiómeros de mezclas racémicas. La cromatografía de SMB ya se ha utilizado para la separación del monosacárido fructosa de las soluciones de fructosa-glucosa y para la separación del disacárido sacarosa de los jarabes de remolacha azucarera o de caña de azúcar a gran escala. La cromatografía de SMB también se ha utilizado para la purificación de lactosa a partir de una fracción de carbohidratos combinada purificada previamente de la leche humana (véase Geisser A. et al., Journal of Chromatography A, vol. 1092, No. 1, páginas 17-23). Sin embargo, la cromatografía de SMB aún no se ha utilizado para la purificación de HMO, ni de ningún otro oligosacárido complejo, procedente de fermentaciones.
La cromatografía de lecho móvil simulado (SMB) se desarrolló como un proceso de separación continuo análogo a los procesos de separación química continua tales como la rectificación. En la rectificación se establece una contracorriente entre la fase líquida y la gaseosa, que permite luego la aplicación continua de alimentación y retirada de producto o productos. Además, las operaciones cromatografías en contracorriente en teoría deberían lograr separaciones superiores a las operaciones convencionales de contracorriente. Sin embargo, las operaciones cromatografías en contracorriente requerirían que las fases móvil y estacionaria se movieran en direcciones opuestas. Así, la cromatografía de SMB se desarrolló como una solución práctica a las dificultades relacionadas con el concepto de mover material cromatográfico sólido en un proceso de separación cromatografía continua.
El concepto estándar de SMB implica cuatro zonas diferentes con cuatro corrientes aplicadas externamente: una corriente de alimentación que comprende los componentes a separar, una corriente de fase móvil o desorbente, un extracto y una corriente de refinado (con la corriente de refinado representando el componente o componentes menos retenidos). Estas corrientes líquidas dividen el sistema de SMB en cuatro zonas diferentes (cada zona o sección puede comprender una o más columnas) con las siguientes tareas: la zona I es necesaria para la regeneración de la fase sólida, el propósito de la zona II es la desorción del material menos fuertemente desorbido, la tarea de la zona III es la adsorción del material fuertemente adsorbido y finalmente la tarea de la zona IV es la adsorción del material menos adsorbente. Por lo tanto, los componentes que adsorben más fuertemente establecen una onda de concentración en la zona II y son transportados al puerto de extracción, mientras que los componentes que adsorben menos fuertemente migran hacia el puerto de refinado.
En principio, las zonas I y IV sirven para la regeneración de la fase sólida (zonas de regeneración) mientras que las zonas II y III pueden considerarse como las zonas de separación reales del sistema (zonas de separación). Además de las cuatro corrientes líquidas y zonas resultantes, el sistema contiene (para la operación en circuito cerrado) una bomba de reciclaje para la fase móvil (desorbente), pasando la fase móvil a través de las zonas fijas en una dirección. Luego, el flujo en contracorriente se logra mediante el cambio periódico y el suministro continuo o la extracción de alimentación, desorbente y productos secuencialmente de una columna a la siguiente en el sistema.
Además del circuito cerrado estándar, también se pueden utilizar sistemas SMB de 4 zonas, circuito abierto y sistemas de 3 zonas. Los sistemas de circuito abierto de 3 zonas son económicos en el caso de que el disolvente fresco sea bastante económico, por ejemplo, cuando se utiliza agua o agua/etanol como fase móvil. Al utilizar una configuración de circuito abierto de 3 zonas, la regeneración de la fase líquida ya no es necesaria, lo que hace que la zona IV sea obsoleta.
Además de los sistemas SMB estándar para la separación de una mezcla de dos componentes, también se han desarrollado sistemas SMB de bucle cerrado de ocho zonas o de bucle abierto de cinco zonas para la separación de más de 2 componentes.
Debido al modo de funcionamiento continuo y también a la posibilidad de utilizar tamaños de columna bastante más grandes y reciclar la fase móvil, el sistema de SMB se puede escalar en principio a volúmenes de producción de cientos de toneladas.
A partir de esta técnica anterior, el problema técnico es la provisión de un proceso novedoso para proporcionar un HMO neutro en grandes cantidades, con alta pureza y libre de productos químicos nocivos.
El problema técnico se resuelve mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1. Las reivindicaciones dependientes presentan formas de realización ventajosas.
La presente invención proporciona un proceso para la purificación de un HMO neutro (por ejemplo, 2'-fucosillactosa) en una cromatografía continua (o de manera continua) a partir de una solución cruda que comprende e1HMO neutro (por ejemplo, 2'-fucosillactosa) y contaminantes, en el que el oligosacárido de la leche humana neutro se selecciona del grupo que consiste en 2'-fucosil-lactosa, 3-fucosil-lactosa, 2',3-difucosil-lactosa, lacto-N-triosa II, lacto-N-tetraosa, lacto-N-neotetraosa, lacto-N-fucopentaosa I, lacto-N-neofucopentaosa I, lacto-N-fucopentaosa II, lacto-N-fuco pentaosa III, lacto-N-fucopentaosa V, lacto-N-neofucopentaosa V, lacto-N-difucohexaosa I, lacto-N-difucohexaosa II, 6'-galactosillactosa, 3'-galactosillactosa, lacto-N-hexaosa, lacto-N-neohexaosa, para-lacto-N-hexaosa, para-lacto-N-neohexaosa y difucosil-lacto-N-neohexaosa, en el que la solución cruda que comprende e1HMO neutro (por ejemplo, 2'-fucosil-lactosa) y contaminantes comprende o consiste en una solución que se selecciona del grupo que consiste en extracto de fermentación microbiana, solución de reacción de biocatálisis, solución de síntesis química y combinaciones de los mismos y en el que la pureza del HMO neutro (por ejemplo, 2'-fucosillactosa) en la solución es <80%. El proceso se caracteriza porque la solución cruda se aplica a al menos una etapa de purificación usando cromatografía de lecho móvil simulado. De esta manera, se proporciona una solución purificada que comprende el HMO neutro deseado (por ejemplo, 2'-fucosillactosa) con una pureza de >80%. La solución purificada se seca por aspersión.
El proceso de purificación de un HMO neutro en una cromatografía continua puede ser un proceso de purificación de un HMO neutro de manera continua. A este respecto, el HMO neutro puede ser 2'-fucosillactosa o lacto-N-tetraosa.
El solicitante ha descubierto que con el proceso desarrollado que implica una etapa de purificación usando cromatografía de lecho móvil simulado, los HMO pueden proporcionarse con alta pureza, sin contaminantes de metales pesados y de manera continua. Por lo tanto, se pueden proporcionar grandes cantidades de HMO de alta calidad de una manera muy conveniente y económica, por ejemplo, a partir de una solución cruda de fermentación microbiana. El proceso inventivo también resultó ser muy estable incluso sin una etapa de regeneración del material de columna (por ejemplo, material de columna catiónico) usado en la etapa de cromatografía de lecho móvil simulado. De hecho, todo el proceso se puede operar de manera estable y continua durante varios meses.
En una realización preferida, la pureza del HMO neutro en la solución cruda es <70%, <60%, <50%, <40%, <30%, <20%, <10% o <5% y/o la solución purificada contiene el HMO con una pureza de >80%, preferiblemente >90%. El término "solución cruda" se refiere a una solución que contiene HMO neutro antes de la etapa de purificación de cromatografía de lecho móvil único, mientras que la solución purificada se refiere a una solución después de la etapa de cromatografía de lecho móvil único.
Al menos una etapa de cromatografía de lecho móvil simulado puede tener
i) al menos 4 columnas, preferiblemente al menos 8 columnas, más preferiblemente al menos 12 columnas, en la que al menos una columna comprende una resina de intercambio catiónico débil o fuerte, preferiblemente una resina de intercambio catiónico en la forma H+ o en forma Ca2+; y/o
ii) cuatro zonas I, II, III y IV con diferentes caudales; y/o
iii) un eluyente que comprende o consiste en agua, preferiblemente etanol y agua, más preferiblemente 5-15% en volumen de etanol y 85-95% en volumen de agua, lo más preferiblemente 9-1l% en volumen de etanol y 89-91% en volumen de agua, en el que el eluyente comprende opcionalmente además ácido sulfúrico, preferiblemente ácido sulfúrico <10 mM; más preferiblemente ácido sulfúrico <2-5 mM; y/o
iv) una temperatura de operación de 15 °C a 60 °C, preferiblemente de 20 °C a 55 °C, más preferiblemente de 25 °C a 50 °C.
Si el HMO a purificar es 2'-fucosillactosa, al menos una etapa de cromatografía de lecho móvil simulado puede tener
i) cuatro zonas I, II, III y IV con diferentes caudales, en las que los caudales son preferiblemente: 28-32 ml/min en la zona I, 19-23 ml/min en la zona II, 21-25 ml/min en la zona III y/o 16-20 ml/min en la zona IV; y/o
ii) una velocidad de alimentación de 2-4 ml/min, preferiblemente 3 ml/min; y/o
iii) un caudal de eluyente de 10-13 ml/min, preferiblemente 11,5 ml/min; y/o
iv) un tiempo de cambio de 16-20 min, preferiblemente 17-19 min, más preferiblemente 18 min.
Preferiblemente, al menos una de las columnas comprende de 0,1 a 5.000 kg de resina de intercambio catiónico, preferiblemente de 0,2 a 500 kg de resina de intercambio catiónico, más preferiblemente de 0,5 a 50 kg de resina de intercambio catiónico, lo más preferiblemente de 1,0 a 20 kg de resina de intercambio catiónico.
Es importante destacar que es posible aumentar la cantidad de material de intercambio catiónico, el caudal en las diferentes zonas, el caudal de alimentación, el caudal de eluyente y/o el tiempo de conmutación. El aumento puede ser por un factor de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1.000 o todos los posibles factores de escalamiento entre dichos valores.
En las columnas, se puede utilizar una resina de intercambio catiónico fuerte como fase estacionaria. Preferiblemente, la resina de intercambio catiónico es una resina de ácido sulfónico, más preferiblemente una resina Purolite® PCR833H (Purolite, Ratingen, Alemania), Lewatit MDS 2368 y/o Lewatit MDS 1368. Si se emplea una resina de intercambio catiónico en las columnas, se puede regenerar con ácido sulfúrico. Puede emplearse ácido sulfúrico en el eluyente, preferiblemente a una concentración de ácido sulfúrico 10 mM o menos. La resina de intercambio catiónico (fuerte) puede estar presente en forma H+ o en forma Ca2+.
No se prefieren temperaturas de funcionamiento superiores a 60 °C durante la cromatografía de lecho móvil simulado. Se encontró que especialmente en presencia de una resina de intercambio iónico catiónico fuerte (en forma H+o forma Ca2+) como fase estacionaria, los oligosacáridos neutros aplicados se desestabilizaron significativamente, es decir, se despolimerizaron, lo que fue perjudicial para el rendimiento final del HMO neutro.
En una realización ventajosa de la invención, la invención se caracteriza porque la solución purificada se aplica a al menos una etapa de purificación adicional mediante cromatografía de lecho móvil simulado, en la que una solución purificada que comprende el oligosacárido de la leche humana neutro con una pureza > 90%, preferiblemente >92%; más preferiblemente se proporciona > 93%. En particular, la invención produce un producto HMO libre de ADN recombinante y libre de proteínas de la cepa del huésped.
La cromatografía de lecho móvil simulado adicional puede tener
i) al menos 4 columnas, preferiblemente al menos 8 columnas, más preferiblemente al menos 12 columnas, en la que al menos una columna comprende una resina de intercambio catiónico débil o fuerte, preferiblemente una resina de intercambio catiónico en la forma H+ o en la forma Ca2+; y/o
ii) cuatro zonas I, II, III y IV con diferentes caudales, y/o
iii) un eluyente que comprende o consiste en agua, preferiblemente etanol y agua, más preferiblemente 5-15% en volumen de etanol y 85-95% en volumen de agua, lo más preferiblemente 9-11% en volumen de etanol y 89-91% en volumen de agua, en la que el eluyente opcionalmente comprende además ácido sulfúrico, preferiblemente ácido sulfúrico <10 mM; más preferiblemente ácido sulfúrico <2-5 mM, y/o
iv) una temperatura de operación de 15 °C a 60 °C, preferiblemente de 20 °C a 55 °C, más preferiblemente de 25 °C a 50 °C.
Si el HMO a purificar es 2'-fucosil-lactosa, la etapa adicional de cromatografía de lecho móvil simulado puede tener
i) cuatro zonas I, II, III y IV con diferentes caudales, en las que los caudales son preferiblemente: 28-32 ml/min en la zona I, 19-23 ml/min en la zona II, 21-25 ml/min en la zona III y/o 16-20 ml/min en la zona IV; y/o
ii) un caudal de alimentación de 2-4 ml/min, preferiblemente 3 ml/min; y/o
iii) un caudal de eluyente de 10-13 ml/min, preferiblemente 11,5 ml/min; y/o
iv) un tiempo de cambio de 16-20 min, preferiblemente 17-19 min, más preferiblemente 18 min.
En particular, al menos una de las columnas contiene de 0,1 a 5.000 kg de resina de intercambio catiónico, preferiblemente de 0,2 a 500 kg de resina de intercambio catiónico, más preferiblemente de 0,5 a 50 kg de resina de intercambio catiónico, lo más preferiblemente de 1,0 a 20 kg de resina de intercambio catiónico.
Es importante destacar que es posible aumentar la cantidad de material de intercambio catiónico, el caudal en las diferentes zonas, el caudal de alimentación, el caudal de eluyente y/o el tiempo de conmutación. El aumento puede ser por un factor de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1.000 o todos los posibles factores de escalamiento entre dichos valores.
Después de una etapa de purificación usando cromatografía de lecho móvil simulado, el pH de la solución purificada se puede ajustar a pH 7, preferiblemente agregando una base, más preferiblemente agregando NaOH (por ejemplo, NaOH 0,2 M).
De acuerdo con la invención, la solución cruda que contiene el HMO neutro y los contaminantes comprende o consiste en una solución que se selecciona del grupo que consiste en fermentación microbiana, extracto de fermentación microbiana, solución de reacción de biocatálisis, solución de síntesis química y combinaciones de las mismas. La fermentación como fuente de HMO neutro tiene la ventaja de que es más rentable que la síntesis química o la biocatálisis, es decir, la síntesis enzimática. Por lo tanto, se prefiere un extracto de fermentación microbiana.
Preferiblemente, antes de aplicar la solución a al menos una etapa de cromatografía de lecho móvil simulado, la solución (preferiblemente una solución de fermentación microbiana) que comprende e1HMO neutro es
i) filtrado o centrifugado para eliminar la biomasa y/o cualquier material insoluble, preferiblemente filtrado con carbón activado, carbón vegetal, Celite y/o mediante filtración de flujo cruzado para eliminar cualquier material insoluble y contaminantes orgánicos, más preferiblemente filtrado por filtración de flujo cruzado, lo más preferiblemente filtrado por filtración de flujo cruzado usando una membrana de microfiltración; y/o
ii) aplicado a al menos una etapa de purificación usando cromatografía de intercambio catiónico y/o aniónico, preferiblemente primero al menos una etapa de cromatografía de intercambio catiónico y luego al menos una etapa de cromatografía de intercambio aniónico.
En una realización preferida adicional, antes de aplicar la solución a al menos una etapa de purificación usando cromatografía de lecho móvil simulado o después de una etapa de purificación usando cromatografía de lecho móvil simulado, la solución que contiene el HMO neutro es electrodializada y/o diafiltrada, preferiblemente diafiltrada con una membrana de nanofiltración, más preferiblemente diafiltrada con una membrana de nanofiltración que tiene un límite de exclusión de tamaño de <20 A. Lo más preferiblemente, la solución se dializa a una conductividad de <15 mS/cm, preferiblemente <10 mS/cm, más preferiblemente <5 mS/cm.
Si la solución cruda se dializa antes de aplicar la solución a al menos una etapa de purificación utilizando cromatografía de lecho móvil simulado, los principales contaminantes dependen del origen de las fracciones de HMO neutras (es decir, síntesis química, biocatálisis o fermentación). Los contaminantes típicos son monosacáridos (por ejemplo, glucosa, galactosa, fucosa, etc.), disacáridos (por ejemplo, lactosa) y subproductos (por ejemplo, lactulosa). En caso de que la fermentación se haya utilizado como fuente de HMO neutro, la solución cruda normalmente comprende la fuente de carbono empleada (por ejemplo, glicerol, sacarosa y/o glucosa) así como subproductos de los microbios empleados (por ejemplo, oligosacáridos de masa molecular más alta) como contaminantes. Como contaminantes adicionales, también pueden estar presentes oligosacáridos que se generan debido a la promiscuidad de las glicosiltransferasas usadas (por ejemplo, glicosiltransferasas en la célula sintetizadora que convierten el producto deseado, el sustrato o un producto intermedio en un oligosacárido contaminante). Dichos contaminantes pueden eliminarse eficazmente mediante una etapa de purificación utilizando cromatografía de lecho móvil simulado (SMB).
Después de la diálisis, preferiblemente después de la electrodiálisis y/o diafiltración (opcionalmente antes de aplicar la solución al proceso cromatográfico SMB), la solución que comprende el HMO puede concentrarse, en particular
i) a una concentración de > 50 g/l, > 100 g/l, preferiblemente > 200 g/l, más preferiblemente > 300 g/l; y/o
ii) emplear un concentrador de vacío; y/o
iii) por nanofiltración; y/o
iv) a una temperatura de 4 °C a 50 °C, preferiblemente de 10 °C a 45 °C, opcionalmente de 20 °C a 40 °C o de 30 °C a 35 °C.
Más preferiblemente, la fracción que comprende HMO se concentra empleando nanofiltración. La etapa de nanofiltración se puede utilizar además para dializar las sales contaminantes. En el presente documento, la fracción de HMO se puede concentrar primero por nanofiltración y la fracción de HMO concentrada resultante se diluye posteriormente con agua, preferiblemente H2 O bidestilada (ddH2 O) o agua desionizada, y luego la fracción de HMO diluida se puede volver a concentrar usando una membrana de nanofiltración .
Se prefiere particularmente la concentración por nanofiltración porque se puede prescindir de una exposición de los HMO neutros a altas temperaturas. Por lo tanto, dicho método de concentración es menos destructivo para la estructura de los HMO que un tratamiento térmico, es decir, no induce daño térmico a los HMO neutros durante la concentración. Una ventaja adicional de la nanofiltración es que se puede utilizar tanto para concentrar como para dializar (diafiltrar) los HMO neutros. En otras palabras, una membrana utilizada en la nanofiltración no tiene que cambiarse si la etapa de concentración y la etapa de diálisis se implementan sucesivamente en el proceso inventivo. Además, la concentración de sal de la solución que contiene HMO neutros se puede reducir significativamente. Esto ahorra material y tiempo y hace que todo el proceso sea más económico. Preferiblemente, la nanofiltración se combina con electrodiálisis. Esta combinación resultó dar excelentes resultados en la concentración y desalación.
En una realización preferida de la invención, la solución purificada se filtra de forma estéril y/o se somete a eliminación de endotoxinas, preferiblemente mediante filtración de la solución purificada a través de un filtro de 3 kDa.
De acuerdo con la invención, la solución purificada se seca por aspersión, particularmente se seca por aspersión a una concentración de HMO neutro de 20-60% (p/v), preferiblemente 30-50% (p/v), más preferiblemente 35-45% (p/v), una temperatura de entrada de 110 °C -150 °C, preferiblemente 120 °C -140 °C, más preferiblemente 125 °C -135 °C y/o una temperatura de salida de 60 °C - 80 °C, preferiblemente 65 °C - 70 °C.
De acuerdo con la invención, el HMO neutro que se va a purificar se selecciona del grupo formado por 2'-fucosillactosa, 3-fucosillactosa, 2',3-difucosillactosa, lacto-N-triosa II, lacto-N-tetraosa, lacto-N-neotetraosa, lacto-N-fucopentaosa I, lacto-N-neofucopentaosa I, lacto-N-fucopentaosa II, lacto-N-fucopentaosa III, lacto-N-fucopentaosa V, lacto-N-neofucopentaosa V , lacto-N-difucohexaosa I, lacto-N-difucohexaosa II, 6'-galactosillactosa, 3'-galactosillactosa, lacto-N-hexaosa, lacto-N-neohexaosa, para-lacto-N-hexaosa, para-lacto-N-neohexaosa y difucosil-lacto-N-neohexaosa. Lo más preferiblemente, el HMO neutro es 2'-fucosil-lactosa o lacto-N-neotetraosa.
Opcionalmente, también es posible que el HMO neutro no sea 2'-fucosillactosa.
En una forma de realización ventajosa de la invención, el proceso inventivo se caracteriza porque la solución cruda que comprende el oligosacárido de leche humana neutro y los contaminantes comprenden o consisten en un extracto de fermentación microbiana, en el que el extracto de fermentación microbiana se obtiene en al menos una etapa de fermentación microbiana que es preferiblemente seguida por al menos una etapa de
a) filtración de una solución, preferiblemente la solución cruda, para separar el material soluble del insoluble después de la fermentación microbiana; y/o
b) cromatografía de intercambio iónico, preferiblemente cromatografía de intercambio catiónico, más preferiblemente cromatografía de intercambio catiónico seguida de cromatografía de intercambio aniónico, de una solución, preferiblemente de una solución obtenida en la etapa a); y/o
c) concentración de una solución, preferiblemente una solución obtenida en la etapa b), más preferiblemente por evaporación de agua y/o por nanofiltración, opcionalmente concentrando más de una vez; y/o
d) diálisis de una solución, preferiblemente de una solución obtenida en la etapa c), más preferiblemente por electrodiálisis y/o diafiltración, lo más preferiblemente diafiltración con una membrana de nanofiltración, opcionalmente dializando más de una vez; y/o
e) cromatografía de una solución usando cromatografía de lecho móvil simulado, preferiblemente una solución obtenida en la etapa D); y/o
f) filtración de una solución, preferiblemente una solución obtenida en la etapa e), para separar el oligosacárido de leche humana neutro de los contaminantes coloreados, más preferiblemente por filtración a través de carbón activado; y/o
g) secar por aspersión una solución purificada que comprende el oligosacárido de leche humana neutro, preferiblemente una solución purificada obtenido en la etapa f).
Lo más preferiblemente, todos las etapas a) a g) se implementan en sucesión. La implementación de todos las etapas a) a g) en sucesión se ha encontrado que es la realización más ventajosa del proceso inventivo. Dicho proceso es rentable y corto y permite la provisión de grandes cantidades de HMO neutros altamente puros, secados por aspersión (es decir, amorfos) a partir de fermentación microbiana (extractos). En particular, las etapas de concentración y desalación de la solución de HMO utilizando nanofiltración representa etapas operativas extremadamente rentables y suaves que evitan la formación de subproductos no deseados.
Por lo tanto, la divulgación proporciona un HMO neutro que se puede producir con el proceso de la invención. E1HMO neutral (por ejemplo, 2'-fucosillactosa o lacto-N-tetraosa) preferiblemente se seca por aspersión. E1 HMO neutro purificado tiene la ventaja de ser altamente puro y estar libre de contaminantes de metales pesados y/o disolventes orgánicos.
El HMO neutro de acuerdo con la divulgación puede tener
i) una forma de gránulos sólidos; y/o
ii) una temperatura de transición vítrea de 60 °C a 90 °C, preferiblemente de 62 °C a 88 ° C, más preferiblemente de 64 °C a 86 ° C, determinada por calorimetría diferencial de barrido; y/o
iii) un tamaño de partícula de 5 a 500 pm, preferiblemente de 10 a 300 pm, determinado por difracción láser; y/o iv) un tamaño medio de partícula de 10 a 100 pm, preferiblemente de 20 a 90 pm, más preferiblemente de 30 a 80 pm, lo más preferiblemente 40 a 70 pm, determinado por difracción láser; y/o
v) un estado amorfo, preferiblemente un estado amorfo sin picos característicos de materia cristalina en difracción de rayos X en polvo, y/o
vi) un contenido de humedad de < 10%, preferiblemente < 8%, más preferiblemente <5%.
El HMO neutro se puede usar en medicina, preferiblemente en la profilaxis o terapia de trastornos gastrointestinales. También se puede utilizar en nutrición, preferiblemente nutrición medicinal o nutrición láctea (por ejemplo, productos de cereales).
En una realización preferida de la divulgación, el oligosacárido de leche humana neutro es un HMO neutro que tiene más de 3 unidades de monosacárido, preferiblemente un trisacárido, tetrasacárido, pentasacárido o hexasacárido de leche humana neutro hexasacáridos. Más preferiblemente, el HMO neutro se selecciona del grupo que consiste en 2'-fucosil-lactosa, 3-fucosil-lactosa, 2',3-difucosillactosa, lacto-N-triosa II, lacto-N-tetraosa, lacto-N-neotetraosa, lacto-N-fucopentaosa I, lacto-N-neofucopentaosa I, lacto-N-fucopentaosa II, lacto-N-fucopentaosa III, lacto-N-fucopentaosa V, lacto-N-neofucopentaosa V, lacto-N-difucohexaosa I, lacto-N-difucohexaosa II, 6'-galactosillactosa, 3'-galactosillactosa, lacto-N-hexaosa, lacto-N-neohexaosa, para-lacto-N-hexaosa, para-lacto-N-neohexaosa y difucosillacto-N-neohexaosa. Lo más preferiblemente el HMO neutro es 2'-fucosil-lactosa o lacto-N-neotetraosa.
Opcionalmente, también es posible que el HMO neutro no sea 2'-fucosil-lactosa.
Además, se propone utilizar el HMO neutro de acuerdo con la divulgación como aditivo en alimentos, preferiblemente como aditivo en alimentos para humanos y/o alimentos para mascotas, más preferiblemente como aditivo en alimentos para bebés humanos.
Con referencia a las siguientes figuras y ejemplos, el objetivo de acuerdo con la invención está destinado a ser explicado con más detalle sin desear restringir dicho objetivo a las realizaciones especiales mostradas en el presente documento.
La Figura 1 ilustra esquemáticamente una etapa de purificación usando cromatografía de lecho móvil simulado. La cromatografía de lecho móvil simulado puede tener, por ejemplo 12 columnas en una disposición 1 en serie, en la que la disposición se divide en cuatro zonas diferentes I, II, III y IV. La solución cruda que contiene e1HMO 2'-fucosillactosa neutro y los contaminantes se aplica entre las zonas II y III a la entrada de alimentación 2. El extracto se retira de la salida 4 entre la zona I y la zona II, mientras que el refinado se retira en la salida 3 entre la zona III y la zona IV. El refinado en la salida 3 contiene el HMO 2'-fucosillactosa purificado, mientras que el extracto en la salida 4 contiene contaminantes de bajo peso molecular (por ejemplo, monosacáridos y disacáridos).
La Figura 2 ilustra esquemáticamente dos etapas de purificación posteriores usando cromatografía de lecho móvil simulado. Cada cromatografía de lecho móvil simulado puede tener por ejemplo, 12 columnas en una disposición en serie 1,1', en la que cada disposición se divide en cuatro zonas diferentes Ia, IIa, IIIa y IVa o zonas Ib, IIb, IIIb y IVb, respectivamente. La solución cruda que comprende el HMO neutro 2'-fucosillactosa y los contaminantes se aplica entre las zonas IIa y IIIa de la primera disposición 1 a la entrada de alimentación 2. El extracto se retira en la salida 4 entre la zona Ia y la zona IIa, mientras que el refinado sale de la primera disposición en serie 1 en la salida 3 entre la zona IIIa y la zona IVa y se aplica a la segunda disposición en serie 1' entre la zona IIb y IIIb. En la segunda disposición en serie 1', el extracto se elimina en la salida 6 mientras que el refinado se elimina en la salida 5 entre la zona IIIb y la zona IVb. El refinado en la salida 5 contiene 2'-fucosillactosa altamente purificada, mientras que el extracto en la salida 6 contiene contaminantes de alto peso molecular (por ejemplo, oligosacáridos superiores).
La Figura 3 ilustra esquemáticamente un esquema de purificación preferido de acuerdo con la presente invención. En primer lugar, se aplica una solución 7 que contiene HMO neutro 2'-fucosillactosa y contaminantes a una etapa de electrodiálisis 8 hasta que se obtiene una conductividad < 0,5 mS/cm. Dicha solución se concentra hasta que la solución alcanza una concentración de 2'-fucosil-lactosa de aprox. 40% (p/v). Posteriormente, dicha solución se aplica a al menos una etapa de purificación mediante cromatografía de lecho móvil simulado 9. Después de la cromatografía de lecho móvil simulado, se obtiene una solución purificada que comprende 2'-fucosillactosa de alta pureza. Dicha solución pura se somete a filtración 11 estéril (preferiblemente también eliminación de endotoxinas). Antes de la filtración 11 estéril, se puede realizar opcionalmente una etapa adicional de electrodiálisis 10 con concentración posterior. Después de la filtración 11 estéril, la solución purificada que comprende 2'-fucosil-lactosa se somete a secado por aspersión 12 y se obtiene 2'-fucosil-lactosa 13 pura, secada por aspersión, en forma de gránulos sólidos.
La Figura 4 muestra el resultado de un análisis de difracción de rayos X en polvo de dos muestras de 2'-fucosillactosa secada por aspersión de acuerdo con la presente invención (muestra # 1 y muestra # 2). Los dos difractogramas obtenidos revelan que tanto la muestra No. 1 como la muestra No. 2 están en estado completamente amorfo (sin picos característicos de materia cristalina).
La Figura 5 muestra la distribución del tamaño de partícula de 2'-fucosillactosa secada por aspersión de acuerdo con la presente invención (muestra No. 1 y muestra No. 2) determinada por difracción láser. Se determinó un tamaño medio de partícula de aprox. 68 pm para la muestra No. 1. La muestra No. 2 tenía un tamaño de partícula medio de aprox. 44 pm. Ambos valores se consideran altos para un producto secado por aspersión.
La Figura 6 muestra la biosíntesis del tetrasacárido de leche humana neutro lacto-N-neotetraosa 17. La biosíntesis comienza con el disacárido lactosa 14 que es convertido por p-1,3-N-acetil-glucosamintransferasa 15 en el trisacárido lacto-N-triosa 16. El trisacárido lacto-N-triosa 16 se convierte posteriormente en el tetrasacárido lacto-N-neotetraosa 18 por la enzima 1,4-galactosiltransferasa 17. In vivo, un cierto porcentaje de lacto-N-neotetraosa 18 se convierte posteriormente en oligosacáridos más grandes 19, 20, 21 por las enzimas p-1,3-N-acetil-glucosamintransferasa 15 y 1,4-galactosiltransferasa 17. Si el objetivo del proceso inventivo es la purificación de lacto-N-neotetraosa 17, los oligonucleótidos más grandes así como los oligonucleótidos más pequeños (eductos) lactosa 14 y lacto-N-triosa 16 pueden estar presentes como contaminantes 22 en una solución cruda que contiene lacto-N-neotetraosa 17. El proceso inventivo permite la eliminación eficiente de dichos contaminantes 22.
La Figura 7 muestra una comparación de dos membranas de nanofiltración diferentes para la concentración de una solución que contiene 2'-fucosillactosa por nanofiltración (VCF: factor de concentración volumétrica, Flujo: expresa la velocidad a la que el agua penetra en la membrana de nanofiltración). La membrana de nanofiltración Alfa Laval tipo NF99 (NF) y la membrana de nanofiltración Alfa Laval tipo NF99HF se utilizaron como membrana de nanofiltración. Se puede ver que a VCF < 6, la membrana de nanofiltración NF99HF permite un flujo más alto, es decir, una concentración más rápida de la solución.
La Figura 8 muestra el análisis por HPLC de la alimentación (Figura 8A) y el refinado (Figura 8B) de la cromatografía de SMB del Ejemplo 6 (se usó sacarosa como patrón interno; véase Figura 8A). Como columna analítica, se empleó una columna de carbohidratos ReproSil (columna de sílice con la función amino; 5 pm; 250 x 4,6 mm; Dr. Maisch GmbH; Ammerbuch) con un caudal de 1,4 ml/min. Como eluyente se utilizó una mezcla de acetonitrilo y agua (68% en volumen: 32% en volumen). La elución fue isocrática. El volumen de inyección fue de 20 pl. La temperatura del horno fue de 35 °C. En la cromatografía de SMB, se utilizó una resina de intercambio catiónico fuerte que estaba presente en la forma H+.
La Figura 9 muestra el análisis por HPLC del extracto de la cromatografía de SMB del Ejemplo 6. Como columna analítica, se empleó una columna de carbohidratos ReproSil (columna de sílice con la función amino; 5 pm; 250 x 4,6 mm; Dr. Maisch GmbH; Ammerbuch) con un caudal de 1,4 ml/min. Como eluyente se utilizó una mezcla de acetonitrilo y agua (68% en volumen: 32% en volumen). La elución fue isocrática. El volumen de inyección fue de 20 pl. La temperatura del horno fue de 35 °C. En la cromatografía de SMB, se utilizó una resina de intercambio catiónico fuerte que estaba presente en la forma H+.
La Figura 10 muestra el análisis por HPLC del extracto de la segunda cromatografía de SMB (= cromatografía de SMB adicional de acuerdo con la invención) del Ejemplo 6. Como columna analítica, se empleó una columna de carbohidratos ReproSil (columna de sílice con la función amino; 5 pm; 250 x 4,6 mm; Dr. Maisch GmbH; Ammerbuch) con un caudal de 1,4 ml/min. Como eluyente se utilizó una mezcla de acetonitrilo y agua (68% en volumen: 32% en volumen). La elución fue isocrática. El volumen de inyección fue de 20 pl. La temperatura del horno fue de 35 °C. En la cromatografía de SMB, se utilizó una resina de intercambio catiónico fuerte que estaba presente en la forma H+.
La Figura 11 muestra el análisis por HPLC de la alimentación (Figura 11A) y el refinado (Figura 11B) de la cromatografía de SMB del Ejemplo 7. Como columna analítica, se empleó una columna de carbohidratos ReproSil (columna de sílice con la función amino; 5 pm; 250 x 4,6 mm; Dr. Maisch GmbH; Ammerbuch) con un caudal de 1,4 ml/min. Como eluyente se utilizó una mezcla de acetonitrilo y agua (68% en volumen: 32% en volumen). La elución fue isocrática. El volumen de inyección fue de 20 pl. La temperatura del horno fue de 35 °C. En esta cromatografía de SMB, se utilizó una resina de intercambio catiónico fuerte que estaba presente en la forma Ca2+.
La Figura 12 muestra el análisis HPLC del extracto de la cromatografía de SMB del Ejemplo 7. Como columna analítica, se empleó una columna de carbohidratos ReproSil (columna de sílice con la función amino; 5 pm; 250 x 4,6 mm; Dr. Maisch GmbH; Ammerbuch) con un caudal de 1,4 ml/min. Como eluyente se utilizó una mezcla de acetonitrilo y agua (68% en volumen: 32% en volumen). La elución fue isocrática. El volumen de inyección fue de 20 pl. La temperatura del horno fue de 35 °C. En esta cromatografía de SMB, se utilizó una resina de intercambio catiónico fuerte que estaba presente en la forma Ca2+.
Ejemplo 1: Purificación de 2'-fucosil-lactosa usando cromatografía de lecho móvil simulado (cromatografía de SMB)
Se electrodializó una solución transparente sin partículas que contenía 2'-fucosillactosa a una concentración de 250 g/l a 0,5 mS/cm utilizando un aparato de electrodiálisis PC-Cell BED 1-3 (PC-Cell, Heusweiler, Alemania) equipado con un apilamiento de membranas PC-Cell E200. Dicho apilamiento comprendía las siguientes membranas: membrana de intercambio catiónico CEM: PC SK y la membrana de intercambio aniónico AEM: PcAcid60 con un límite de exclusión de tamaño de 60 Da.
Para purificación por SMB, la solución de 2'-fucosillactosa se concentró a 300 g/l empleando un concentrador de vacío a 40 °C. Para la cromatografía de SMB se utilizó un sistema de SMB de circuito cerrado equipado con 12 columnas (columnas Prosep® con las dimensiones: 40 mm x 740 mm (Latek, Eppelheim, Alemania)) dispuestas en 4 zonas. Cada columna contenía 760 g de resina de intercambio de cationes fuerte Purolite® PCR833H+ (Purolite, Ratingen, Alemania).
El sistema se hizo funcionar a una temperatura de 25 °C con los siguientes parámetros de flujo establecidos: el c audal de la zona la fue de 30,00 ml/min, el caudal de la zona IIa se fijó en 21,00 ml/min, el caudal de la zona Illa fue de 21,48 ml/min, el caudal de la zona IVa se ajustó a 18,44 ml/min, la alimentación se ajustó a 3,00 ml/min, el flujo de eluyente se ajustó a 11,56 ml/min y el tiempo de conmutación se ajustó a 17,92 min. Como eluyente, se utilizó agua con etanol de calidad alimentaria al 10% (v/v).
Se fraccionaron en el extracto los contaminantes principales tales como tales como fucosa, glucosa, galactosa y glicerol. La 2'-fucosillactosa y los contaminantes oligosacáridos más grandes (por ejemplo, difucosil-lactosa) se fraccionaron en el refinado
La 2'-fucosillactosa se diluyó marginalmente a través de la etapa de purificación de SMB, la concentración de 2'-fucosillactosa en el refinado se determinó en 200 g/l. El pH del refinado se ajustó a pH 7 utilizando NaOH 0,2 N. En las configuraciones descritas, los sistemas de SMB podrían funcionar de forma continua durante al menos 3 meses.
A continuación, la solución obtenida se sometió de nuevo a electrodiálisis hasta obtener una conductividad inferior a 0,5 mS/cm y se concentró para obtener una solución de 2'-fucosillactosa al 40% (p/v).
Después, la solución se sometió a filtración estéril y eliminación de endotoxinas pasando la solución a través de un filtro de 3 kDa (módulo de fibra hueca de ultrafiltración Pall Microza SEP-2013, Pall Corporation, Dreieich).
Usando este protocolo se pudo obtener 2'-fucosil-lactosa con una pureza del 90,4%. Los principales contaminantes fueron 3'-fucosillactosa (2,6%), difucosillactosa (1,5%) y lactosa (1,4%). El rendimiento de la purificación fue aproximadamente del 80%.
Ejemplo 2: Purificación de 2'-fucosil-lactosa usando separación cromatográfica de SMB de múltiples componentes.
Se electrodializó una solución transparente libre de partículas que comprendía 2'-fucosillactosa a una concentración de 250 g/l a 0,5 mS/cm utilizando un aparato de electrodiálisis PC-Cell BED 1-3 (PC-Cell, Heusweiler, Alemania) equipado con apilamiento de membranas PC-Cell E200. Dicho apilamiento comprendía las siguientes membranas: membrana de intercambio catiónico CEM: Pc SK y membrana de intercambio aniónico AEM: Pc Acid 60 que poseen un límite de exclusión de tamaño de 60 Da.
Para la purificación de SMB, la solución de 2'-fucosillactosa se concentró a 300 g/l empleando un concentrador de vacío a 40 °C. Para la cromatografía de SMB, se utilizó un sistema de SMB de múltiples componentes de circuito cerrado equipado con 24 columnas (columnas Prosep® con las dimensiones: 40 mm x 740 mm (Latek, Eppelheim, Alemania)) dispuestas en 2 x 4 zonas. Cada columna contenía 760 g de resina intercambiadora de cationes fuertes Purolite® PCR833H+ (Purolite, Ratingen, Alemania).
El sistema se hizo funcionar a 25 °C con los siguientes parámetros de flujo establecidos: el caudal de la zona la fue de 30,00 ml/min, el caudal de la zona Ila se fijó en 21,00 ml/min, el caudal de la zona Illa se fijó en 21,48 ml/min, el caudal de la zona IVa se fijó a 18,44 ml/min, la alimentación se fijó a 3,00 ml/min, el flujo de eluyente se fijó a 11,56 ml/min y el tiempo de conmutación se fijó en 17,92 min.
El refinado de la primera separación se pasó a un caudal de 3,04 ml/min a una segunda etapa de separación. El caudal de la zona Ib se mantuvo a 30 ml/min, el caudal de la zona llb se fijó en 19,61 ml/min, el caudal de la zona lllb se fijó en 21,63 ml/min, el caudal de la zona IVb se fijó en 18,46 ml/min, el flujo de eluyente se fijó de manera similar en 11,56 ml/min y el tiempo de cambio de las zonas Ib a IVb fue 10,46 min.
Como eluyente se utilizó agua con etanol de calidad alimentaria al 10% (v/v).
En la separación de múltiples componentes, se encontraron contaminantes tales como lactosa, monosacáridos tales como fucosa, glucosa, galactosa y glicerol en el extracto de la primera etapa de separación y los contaminantes de oligosacáridos más grandes (por ejemplo, difucosillactosa) se fraccionaron en el refinado de la segunda etapa de separación.
Se fraccionó 2'-fucosillactosa en el refinado de la primera etapa de separación y el extracto de la segunda etapa de separación y, por lo tanto, estaba libre de contaminantes de bajo y alto peso molecular. La 2'-fucosillactosa solo se diluyó marginalmente a través de la etapa de purificación de SMB; la concentración de 2'-fucosillactosa en el extracto de la segunda etapa de purificación se determinó en 200 g/l.
El pH del refinado después de la primera etapa de separación se ajustó a pH 7 usando NaOH 0,2 N.
Usando este protocolo, se pudo obtener 2'-fucosil-lactosa con una pureza del 93,0%. Los principales contaminantes fueron 3'-fucosillactosa (1,1%), difucosillactosa (0,9%) y lactosa (1,0%).
Ejemplo 3: Obtención de 2'-fucosillactosa en forma sólida mediante secado por aspersión
Las fracciones de 2'-fucosillactosa obtenidas por cromatografía de SMB se sometieron de nuevo a tratamiento de electrodiálisis hasta que se obtuvo una conductividad inferior a 0,5 mS/cm. Después, las fracciones se concentraron al vacío para obtener fracciones de 2'-fucosillactosa que contenían 2'-fucosillactosa al 40% (p/v). Posteriormente, las soluciones se sometieron a filtración estéril y eliminación de endotoxinas pasando la solución a través de un filtro de 3 kDa (módulo de fibra hueca de ultrafiltración Pall Microza SEP-2013, Pall Corporation, Dreieich, Alemania).
Las soluciones estériles de 2'-fucosillactosa así obtenidas se secaron luego por aspersión usando un secador por aspersión NUBILOSA LTC-GMP (NUBILOSA, Constanza, Alemania). Para el secado por aspersión de la 2'-fucosillactosa, se pasó una solución al 40% (p/v) a presión a través de las boquillas del secador por aspersión con una temperatura de entrada ajustada a 130 °C. El flujo se ajustó para mantener una temperatura de salida entre 66 °C y 67 °C.
Usando estos ajustes, se podría obtener un polvo secado por aspersión con menos del 5% de humedad. Los contenidos de humedad se determinaron mediante valoración Karl-Fischer.
Ejemplo 4: Caracterización de la 2'-fucosillactosa secada por aspersión
1. Calorimetría diferencial de barrido (DSC)
Se usó un Mettler Toledo 821e (Mettler Toledo, Giessen, Alemania) para determinar los eventos térmicos de dos muestras (muestra No. 1 y muestra No. 2) de 2'-fucosillactosa secada por aspersión.
Se analizaron aproximadamente 25 mg de una muestra secada por aspersión en crisoles de aluminio prensados (Mettler Toledo, Giessen, Alemania). Las muestras se enfriaron a 0 °C a 10 K/min y se recalentaron a 100 °C a una velocidad de barrido de 10 K/min. Después de enfriar las muestras a 0 °C en un segundo ciclo de calentamiento, las muestras se calentaron a 150 °C. El punto medio del desplazamiento endotérmico de la línea base durante el barrido de calentamiento se tomó como Tg. Los picos exotérmicos y endotérmicos se informan mediante la temperatura máxima y la energía normalizada del evento. Los resultados del análisis de DSC de las muestras se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1
Figure imgf000011_0001
El análisis por DSC de la muestra No. 1 reveló una transición vitrea principal (Tg) a 67,4 °C en el segundo barrido de calentamiento. También se detectó una pequeña segunda Tg a 122,6 °C en el segundo barrido de calentamiento. La transición vitrea principal se detectó en el primer barrido de calentamiento seguido de un evento exotérmico y endotérmico a temperaturas por encima de la Tg. Estos eventos se atribuyen a efectos de relajación en la muestra. El análisis por DSC de la muestra No. 2 mostró una transición vitrea (Tg) sustancialmente más alta a 84,6 °C en el segundo barrido de calentamiento que también se detectó en el primer barrido de calentamiento. Esto puede indicar un contenido de agua residual más bajo de la muestra # 2 en comparación con la muestra # 1. Dado que la transición vitrea se detectó cerca de la temperatura final del primer barrido de calentamiento, no se pudieron detectar fenómenos de relajación potenciales. En esta muestra, no se pudo detectar una segunda transición vitrea, aunque fue visible un pequeño pico exotérmico a 125,9 °C en el segundo barrido de calentamiento.
2. Difracción de rayos X en polvo
Se utilizó difracción de rayos X en polvo (XRD) de gran angular para estudiar la morfologia de las muestras No. 1 y No. 2. Se utilizó el difractómetro de rayos X Empyrean (Panalytical, Almelo, Paises Bajos) equipado con un ánodo de cobre (45 kV, 40 mA, emisión de Ka1 a una longitud de onda de 0,154 nm) y un detector PIXcel3D. Aproximadamente 100 mg de las muestras secadas por aspersión se analizaron en modo de reflexión en el intervalo angular de 5-45 ° 20, con un tamaño de paso de 0,04 ° 20 y un tiempo de recuento de 100 segundos por paso.
El análisis de XRD de las muestras No. 1 y No. 2 reveló el estado completamente amorfo de ambas muestras y no mostró picos característicos de materia cristalina (véase la Figura 4 para una superposición de ambos difractogramas).
3. Difracción láser
Las mediciones de difracción láser se realizaron utilizando un analizador de distribución de tamaño de particulas por difracción láser Partica LA-950 (Horiba, Kyoto, Japón) equipado con un diodo láser de 605 nm para detectar particulas> 500 nm y un diodo emisor de luz azul de 405 nm (LED) para detectar particulas <500 nm. Se utilizó isooctano como medio de dispersión (indice de refracción de 1,391). Dado que se desconocia el indice de refracción de las muestras, se utilizó el indice de refracción de las particulas de azúcar (disacárido) (1,530). Las muestras se dispersaron en isooctano mediante ultrasonicación durante hasta 5 minutos. Antes de la medición, el sistema se puso en blanco con isooctano. La dispersión de cada muestra se midió 3 veces y se informan los valores medios y la desviación estándar. Se registraron el tamaño de particula medio (promedio ponderado de tamaños de particula por volumen) y el tamaño de particula de modo (pico de la distribución). Además de la distribución de particulas por volumen (q%), el resultado se registró como:
d (v, 10): diámetro de particula correspondiente al 10% de la distribución acumulada por tamaño en volumen d (v, 50): diámetro de particula correspondiente al 50% de la distribución acumulada por tamaño en volumen d (v, 90): diámetro de particula correspondiente al 90% de la distribución acumulada por tamaño en volumen. La distribución del tamaño de particula para las muestras No. 1 y No. 2 se muestra en la Figura 5. El tamaño de modo, que representa el tamaño de particula de mayor intensidad, es comparable para ambas muestras. En general, el tamaño medio de particula de 67,85 pm (muestra No. 1) y 43,65 pm (muestra No. 2), respectivamente, se considera inusualmente alto para las particulas secadas por aspersión. La fracción detectada en diámetros de particulas más altos probablemente sea causada por particulas de polvo aglomeradas.
La Tabla 2 resume las características de tamaño de particulas de la muestra # 1 y # 2.
Tabla 2
Figure imgf000012_0001
Ejemplo 5: Reducción de volumen y desalación del sobrenadante que comprende 2'-fucosillactosa mediante nanofiltración
Para la concentración y desalación del sobrenadante de cultivo que contiene 2'-fucosillactosa, se empleó un módulo de filtración por membrana Alfa Laval M-20 equipado con una membrana de nanofiltración NF99 (Alfa Laval NF99) o NF99HF (Alfa Laval NF99HF). El sobrenadante de cultivo que contenía 2'-fucosillactosa usado (que contenía 25 g/l de 2'-fucosillactosa) se separó de la biomasa microbiana de fermentación usando filtración de flujo cruzado. El corte molecular de la membrana de filtración de flujo cruzado fue de 150 kDa (Filtro StrassBurger Micro Cross Module® FS10LFC-FUS1582).
El filtrado libre de células se trató luego con un intercambiador de iones catiónico (Lewatit S2568 en forma de protón (Lanxess)) y un intercambiador aniónico (Lewatit S6368 en forma de carbonato (Lanxess)) antes de someterse a nanofiltración. La solución se neutralizó después de cada etapa del intercambiador iónico usando una solución de hidróxido de sodio o ácido clorhídrico, respectivamente. La presión de entrada del módulo de membrana fue de 42 bar y la presión de salida fue de 40 bar, el caudal de alimentación dentro del módulo de membrana fue de 8 litros/min. El permeado se eliminó del proceso, mientras que el retenido se retroalimentó al depósito y al módulo de membrana. El volumen del depósito conectado a la pila de membranas fue de 6 litros. Durante la concentración de la solución que comprende 2'-fucosillatosa, el depósito se llenó continuamente con una solución sobrenadante de cultivo de 2'-fucosillactosa hasta que se obtuvo una solución concentrada 8 veces.
La Figura 7 muestra el flujo obtenido (L/m2/h) graficado frente al factor de concentración de volumen (VCF) de las dos membranas empleadas. Habiendo concentrado la concentración de 2'-fucosillactosa 8 veces hasta aproximadamente 200 g/l de 2'-fucosillactosa, la solución concentrada se diafiltró para desalar añadiendo agua desionizada a la misma velocidad que se obtuvo el permeado del módulo de membrana. Usando la etapa de diafiltración, la conductividad del concentrado de 2'-fucosillactosa podría disminuir de 25 mS a menos de 7 mS usando la membrana HF99HF.
Mediante el uso de este enfoque de nanofiltración, la solución de 2'-fucosillactosa podría concentrarse 8 veces hasta una concentración de 2'-fucosillactosa de >200 g/l de 2'-fucosillactosa en condiciones suaves (evitando la exposición térmica), con la etapa de diafiltración podría eliminarse una gran fracción del contenido de sal. El concentrado de 2'-fucosillactosa se sometió a electrodiálisis para reducir aún más el contenido de sal.
Ejemplo 6: Purificación de lacto-N-tetraosa usando dos etapas de cromatografía de lecho móvil simulado y una resina intercambiadora de iones en forma H+.
Una solución transparente de lacto-N-tetraosa libre de partículas (30 g/l) obtenida de la fermentación bacteriana se electrodializó hasta una conductividad de 0,5 mS/cm usando un aparato de electrodiálisis PC-Cell (véase más arriba). Para la cromatografía de SMB, la solución de lacto-N-tetraosa se concentró a 50 g/l al vacío a 40 °C. Alternativamente, la solución que contenía lacto-N-tetraosa se puede desalar y concentrar usando una membrana de nanofiltración (por ejemplo, membrana de nanofiltración HF99HF de Alfa Laval).
Para la cromatografía de SMB se utilizó un sistema de SMB de circuito cerrado equipado con 12 columnas (columnas de vidrio Prosep® con las dimensiones: 40 mm x 740 mm (Lartek, Eppelheim, Alemania) dispuestas en 4 zonas. Cada columna de vidrio contenía 760 g de resina de intercambio catiónico fuerte Purolite® PCR833H+. La resina intercambiadora catiónica fuerte estaba presente en la forma H+.
El sistema se hizo funcionar a 25 °C con los siguientes ajustes de parámetros: el caudal de la zona I se fijó en 30,00 ml/min, el caudal de la zona II se fijó en 19,07 ml/min, el caudal de la zona IV se fijó a 18,44 ml/min. La alimentación se mantuvo a 1 ml/min y el flujo de eluyente se fijó a 11,56 ml/min con un tiempo de conmutación de 17,92 min. Como eluyente se utilizó agua con etanol de calidad alimentaria al 10% (v/v).
Bajo estos parámetros, la lacto-N-tetraosa y los oligosacáridos neutros más grandes se fraccionaron en el refinado. La pureza de lacto-N-tetraosa fue del 86,3% en lugar del 33,4% en la alimentación de SMB (véase la Fig. 7A para el análisis por HPLC de la alimentación de SMB y la Fig. 7B para el análisis por HPLC del refinado de SMB). Se encontraron contaminantes tales como lactosa, monosacáridos y glicerol en la fracción de extracto de SMB (véase la Fig. 8 para el análisis por HPLC de la fracción de extracto de SMB). El refinado que contenía lacto-N-tetraosa se ajustó a pH neutro usando una solución de NaOH 0,2 N.
El pH del extracto obtenido que contenía lacto-N-tetraosa se ajustó a pH 7 usando NaOH 0,2 N. Luego, la solución obtenida se sometió a electrodiálisis hasta obtener nuevamente una conductividad menor de 0,5 mS. Después, la solución se concentró al vacío hasta aprox. 50 g/l de lacto-N-tetraosa y luego esterilizada por filtración pasando a través de un filtro de flujo cruzado de 3 kDa (módulo de fibra hueca de ultrafiltración Pall Microza SEP-2013, Pall Corporation, Dreieich).
Para separar los contaminantes oligosacáridos más grandes de la lacto-N-tetraosa, se realizó una segunda separación por cromatografía de SMB. Utilizando el mismo sistema de SMB, los parámetros se cambiaron de la siguiente manera: zona de caudal I 30 ml/min, zona de caudal II 19,27 ml/min, zona de caudal IV 17,30 ml/min. La alimentación se fijó en 2,08 ml/min y el flujo de eluyente en 12,70 ml/min. El flujo de refinado fue de 4,04 ml/min y el flujo de extracto fue de 10,73 ml/min. El tiempo de conmutación de la separación de SMB se fijó en 10,46 min. Como eluyente se empleó de nuevo una mezcla de agua/etanol 9:1 (v/v). El análisis por HPLC del extracto de la segunda separación de lacto-N-tetraosa por cromatografía de SMB se muestra en la Fig. 10.
En estas condiciones, la lacto-N-tetraosa se fraccionó en el extracto y se encontró del 5 al 10% de la cantidad total de oligosacáridos neutros más grandes en el refinado. Usando este protocolo (columna de sílice con la función amino después de la segundo etapa de SMB), se pudo obtener lacto-N-tetraosa con una pureza del 93,1%.
Ejemplo 7: Purificación de lacto-N-tetraosa usando cromatografía de lecho móvil simulado con una resina intercambiadora de iones en forma Ca2+
Una solución transparente de lacto-N-tetraosa libre de partículas (30 g/l) obtenida de la fermentación bacteriana se electrodializó hasta una conductividad de 0,5 mS/cm usando un aparato de electrodiálisis PC-Cell (véase más arriba).
Para la cromatografía de SMB con calcio como contraión, la solución de lacto-N-tetraosa se concentró a 50 g/l al vacío a 40 °C. Para la cromatografía de SMB se utilizó un sistema de SMB de circuito cerrado equipado con 12 columnas (columnas de vidrio Prosep® con las dimensiones: 40 mm x 740 mm (Lartek, Eppelheim, Alemania)) dispuestas en 4 zonas.
Cada columna contenía 760 g de resina intercambiadora catiónica fuerte Purolite® PCR833H+. La resina intercambiadora de cationes se lavó con 50 litros de CaCh 200 mM para intercambiar los iones H+ por iones Ca2+. Por lo tanto, la resina intercambiadora catiónica fuerte estaba presente en la forma Ca2+.
El sistema se hizo funcionar a 25 °C con los siguientes ajustes de parámetros: el caudal de la zona I se fijó en 30,00 ml/min, el caudal de la zona II se fijó en 20,07 ml/min, el caudal de la zona IV se fijó hasta 17,04 ml/min. La alimentación se mantuvo a 2,5 ml/min y caudal del eluyente se fijó en 11,56 ml/min con un tiempo de conmutación de 17,92 min. Como eluyente se utilizó agua con etanol de calidad alimentaria al 10% (v/v).
Ejemplo 8: Obtención de lacto-N-tetraosa en forma sólida mediante secado por aspersión.
Las fracciones que contenían lacto-N-tetraosa se concentraron al vacío para obtener una concentración de lacto-N-tetraosa del 25% (p/v). A continuación, las soluciones se sometieron a filtración estéril y las endotoxinas removidas pasaron a través de un filtro de 3 kDa (módulo de fibra hueca de ultrafiltración Pall Microza SEP-1013, Pall Corporation, Dreieich, Alemania).
La solución de lacto-N-tetraosa estéril así obtenida se secó luego por aspersión usando un Mini secador por aspersión B-290 (Büchi Labortechnik GmbH, Essen, Alemania). Para el secado por aspersión de lacto-N-tetraosa, la solución se pasó a presión a través de las boquillas del secador por aspersión con una temperatura de salida entre 120 °C y 130 °C y el flujo se ajustó para mantener una temperatura de escape entre 66 °C y 67 °C. Usando estos ajustes, se pudo obtener un polvo secado por aspersión con 7-9% de humedad y un rendimiento de lacto-N-tetraosa secado por aspersión del 72%. Los contenidos de humedad se determinaron mediante valoración Karl-Fischer.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Proceso para purificación de un oligosacárido de leche humana neutro en una cromatografía continua a partir de una solución cruda que comprende el oligosacárido de la leche humana neutro y contaminantes, en el que el oligosacárido de la leche humana neutro se selecciona del grupo que consiste en 2'-fucosillactosa, 3-fucosillactosa, 2',3-difucosillactosa, lacto-N-triosa II, lacto-N-tetraosa, lacto-N-neotetraosa, lacto-N-fucopentaosa I, lacto-N-neofucopentaosa I, lacto-N-fucopentaosa II, lacto-N-fucopentaosa III, lacto-N-fucopentaosa V, lacto-N-neofucopentaosa V, lacto-N-difucohexaosa I, lacto-N-difucohexaosa II, 6'-galactosillactosa, 3'-galactosillactosa, lacto-N-hexaosa, lacto-N-neohexaosa, para-lacto-N-hexaosa, para-lacto-N-neohexaosa y difucosil-lacto-N-neohexaosa, en el que la solución cruda que comprende el oligosacárido de leche humana neutro y los contaminantes comprende o consiste en una solución que se selecciona del grupo que consiste en extracto de fermentación microbiana, solución de reacción de biocatálisis, solución de síntesis química y combinaciones de los mismos, en el que la pureza del oligosacárido de leche humana neutro en la solución es <80%,
caracterizado porque la solución cruda se aplica a al menos una etapa de purificación usando cromatografía de lecho móvil simulado, en la que se proporciona una solución purificada que comprende el oligosacárido de leche humana neutro con una pureza de >80%, en la que la solución purificada se seca por aspersión.
2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la pureza del oligosacárido de leche humana neutro en la solución cruda es <70%, <60%, <50%, <40%, <30%, <20%, <10% o <5%.
3. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque al menos una cromatografía de lecho móvil simulado tiene
i) al menos 4 columnas, preferiblemente al menos 8 columnas, más preferiblemente al menos 12 columnas, en el que al menos una columna contiene una resina de intercambio catiónico débil o fuerte, preferiblemente una resina de intercambio catiónico en la forma H+ o en la forma Ca2+; y/o
ii) cuatro zonas I, II, III, IV con diferentes caudales;
iii) un eluyente que comprende o consiste en agua, preferiblemente etanol y agua, más preferiblemente 5-15% en volumen de etanol y 85-95% en volumen de agua, lo más preferiblemente 9-11% en volumen de etanol y 89-91% en volumen de agua, en el que el eluyente contiene opcionalmente además ácido sulfúrico, preferiblemente ácido sulfúrico <10 mM o menos; y/o
iv) una temperatura de funcionamiento de 15 °C a 60 °C, preferiblemente de 20 °C a 55 °C, más preferiblemente de 25 °C a 50 °C.
4. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la solución purificada se aplica a al menos una etapa de purificación adicional utilizando cromatografía de lecho móvil simulado, en el que se proporciona una solución purificada que comprende el oligosacárido de leche humana neutro con una pureza >92%.
5. Proceso de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque la cromatografía de lecho móvil simulado adicional tiene
i) al menos 4 columnas, preferiblemente al menos 8 columnas, más preferiblemente al menos 12 columnas, en el que al menos una columna contiene una resina de intercambio catiónico débil o fuerte, preferiblemente una resina de intercambio catiónico en la forma H+ o en la forma Ca2+; y/o
ii) cuatro zonas I, II, III y IV con diferentes caudales;
iii) un eluyente que comprende o consiste en agua, preferiblemente etanol y agua, más preferiblemente 5-15% en volumen de etanol y 85-95% en volumen de agua, lo más preferiblemente 9-11% en volumen de etanol y 89-91% en volumen de agua, en el que el eluyente contiene opcionalmente además ácido sulfúrico, preferiblemente ácido sulfúrico <10 mM o menos; y/o
iv) una temperatura de funcionamiento de 15 °C a 60 °C, preferiblemente de 20 °C a 55 °C, más preferiblemente de 25 °C a 50 °C.
6. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la solución cruda que comprende el oligosacárido de leche humana neutro y los contaminantes comprende o consiste en un extracto de fermentación microbiana, en el que el extracto de fermentación microbiana se obtiene en al menos una etapa de fermentación microbiana que es preferiblemente seguido por al menos una etapa de
a) filtración de una solución, preferiblemente la solución cruda, para separar el material soluble del material insoluble después de la fermentación microbiana;
b) cromatografía de intercambio iónico, preferiblemente cromatografía de intercambio catiónico, más preferiblemente cromatografía de intercambio catiónico seguida de cromatografía de intercambio aniónico, de una solución, preferiblemente de una solución obtenida en la etapa a);
c) concentración de una solución, preferiblemente una solución obtenida en la etapa b), más preferiblemente por evaporación de agua y/o por nanofiltración, opcionalmente concentrando más de una vez;
d) diálisis de una solución, preferiblemente de una solución obtenida en la etapa c), más preferiblemente por electrodiálisis y/o diafiltración, lo más preferiblemente diafiltración con una membrana de nanofiltración, opcionalmente dializando más de una vez;
e) cromatografía de una solución usando cromatografía de lecho móvil simulado, preferiblemente una solución obtenida en la etapa d);
f) filtración de una solución, preferiblemente una solución obtenida en la etapa e), para separar el oligosacárido de leche humana neutro de los contaminantes coloreados, más preferiblemente mediante filtración a través de carbón activado; y
g) secar por aspersión una solución purificada que comprende el oligosacárido de leche humana neutro, preferiblemente una solución purificada obtenida en la etapa f);
en el que lo más preferiblemente, todas las etapas a) a g) se implementan en sucesión.
7. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque antes de aplicar la solución a al menos una etapa de cromatografía de lecho móvil simulado, la solución que comprende el oligosacárido de leche humana neutro se
i) filtra para eliminar cualquier material insoluble, preferiblemente filtrado con carbón activado, carbón vegetal y/o Celite para eliminar cualquier material insoluble y contaminantes orgánicos, más preferiblemente filtrado por filtración de flujo cruzado, lo más preferiblemente filtrado por filtración de flujo cruzado usando una membrana de microfiltración; y/o ii) aplica a al menos una etapa de purificación usando cromatografía de intercambio catiónico y/o aniónico, preferiblemente primero al menos una etapa de cromatografía de intercambio catiónico y luego al menos una etapa de cromatografía de intercambio aniónico.
8. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque antes de aplicar la solución a al menos una etapa de purificación mediante cromatografía de lecho móvil simulado o después de una etapa de purificación mediante cromatografía de lecho móvil simulado, la solución que comprende el oligosacárido de leche humana neutro es electrodializado y/o diafiltrado, preferiblemente diafiltrado con una membrana de nanofiltración, más preferiblemente diafiltrado con una membrana de nanofiltración que tiene un límite de exclusión de tamaño de <20 A, en el que lo más preferiblemente la solución se dializa a una conductividad de <15 mS/cm, preferiblemente <10 mS/cm, más preferiblemente <5 mS/cm.
9. Proceso de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque después de la diálisis se concentra la solución que comprende el oligosacárido de leche humana neutro
i) hasta una concentración de > 100 g/l, preferiblemente > 200 g/l, más preferiblemente > 300 g/l; y/o
ii) empleando un concentrador de vacío; y/o
iii) por nanofiltración; y/o
iv) a una temperatura de 4 °C a 50 °C, preferiblemente de 10 °C a 45 °C, opcionalmente de 20 °C a 40 °C o de 30 °C a 35 °C.
10. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la solución purificada se filtra de forma estéril y/o se somete a eliminación de endotoxinas, preferiblemente mediante filtración de la solución purificada a través de un filtro de 3 kDa.
11. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la solución purificada se seca por aspersión a una concentración de oligosacárido de leche humana neutro de 20-60% (p/v), preferiblemente 30-50% (p/v), más preferiblemente 35-45% (p/v), una temperatura de boquilla de 110 °C -150 °C, preferiblemente 120 °C -140 °C, más preferiblemente 125 °C -135 °C y/o una temperatura de salida de 60 °C - 80 °C , preferiblemente 65 °C - 70 °C.
12. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el proceso de purificación de un oligosacárido de leche humana neutro en una cromatografía continua es un proceso de purificación de un oligosacárido de leche humana neutro de forma continua, en el que el oligosacárido de leche humana neutro es preferiblemente 2'-fucosil-lactosa o lacto-N-tetraosa.
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