WO2006070483A1 - ジフラクトース ジアンヒドリドｉｉｉ結晶の製造方法 - Google Patents

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WO2006070483A1
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crystallization
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dfa
solution
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Taizo Nagura
Katsuya Honjyo
Hiroto Kikuchi
Norimitsu Takagi
Tsutomu Aritsuka
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Nippon Beet Sugar Manufacturing Co., Ltd.
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    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently producing a difractose dianhydride III (hereinafter also referred to as DF A III) crystal.
  • the present invention does not decrease the crystallization rate even in the production of DF A III by circulation, and is very excellent as an industrial production method of DFA III. book
  • DFA III is a functional oligosaccharide that promotes mineral absorption, diuretics, and improves bowel movements, including calcium. Cyclic disaccharides in which the reducing ends of two fructose are bound to hydroxyl groups other than the other reducing end. (Di-D-fructofuranose-2, 1: 2, 3-dianhydride), which is highly soluble in water, showing 90-95% of sucrose, but its sweetness is about 52% of sucrose. It is also a substance resistant to heat and acid.
  • the production method of DFA III is to prepare a DFA III-containing solution by reacting a bacterial extract belonging to Arthrobacter monourea or an enzyme produced by inulin and Z or an inulin-containing plant extract.
  • a method for producing DF A III is proposed in which a solution containing III is passed through an activated charcoal column to adsorb DFA III and then eluted with ethanol to collect fractions rich in DFA III and evaporate to dryness. (For example, see Patent Document 1).
  • inulin and Z or inulin-containing plant extract are passed through a column filled with inulin fruct transferase immobilized on an immobilization material to produce a DFA III-containing solution, and the containing solution is used as an ion exchange resin,
  • a method for producing DF A III that produces a DFA III-containing syrup or evaporated to dry matter through a purification process such as activated carbon see, for example, Patent Document 2.
  • high purity DFA III can be produced industrially by causing Inuralase II to act on inulin (see, for example, Patent Document 3).
  • Patent Literature 1
  • Patent Document 2
  • the present invention has been made for the purpose of developing a method for producing a DFA III crystal, in particular, an industrially efficient production method, in view of the current state of the technology described above.
  • the present inventors cleaned and filtered the solution containing DFA III, and then concentrated the solution, coarsely crystallized to separate the crude crystal syrup, dissolved the obtained crude crystal, and cleaned it. After filtration, concentration, crystallization, separation of crystal syrup and production of product crystals were developed, and for further efficiency and industrialization, The separated crude crystal syrup and slag or crystal syrup were returned to the crystallization process again, and a circulatory system was constructed to produce DF A III crystals continuously. For the first time, we encountered the very serious drawback that the production of DFA III crystals became difficult, especially that industrial production was virtually impossible. In order to solve this newly discovered serious defect, the present inventors have thoroughly investigated the cause of the decrease in the crystallization rate of DF A III from various directions.
  • the solution containing DFA III contains substances other than DFA III. They are derived from chicory when extracting inulin from plants such as chicory, from substances synthesized when enzymatically synthesizing inulin from sugar, or DF A III from enzyme. When reacting, an enzyme-degrading substance of inulin may be considered.
  • the DFA III-containing solution becomes longer in the process of producing crystalline DF A III, and the solution is exposed to harsh conditions such as high temperatures for a long time in the process of concentration of the solution. It is also possible that other new substances are generated by altering the composition of the III-containing solution.
  • Various substances as described above may affect the crystallization of DFA III.
  • since there is a circulation of DF A III-containing liquid in the purification and crystallization process of DFA III new substances other than DF A III produced above accumulate.
  • Inulin which is one of the raw materials of DFA III, is a polysaccharide in which a number of fructose is linked to a single gnolecose.
  • this transferase When this transferase is treated with a degradative transfer enzyme, it produces DFA III as the main component and other by-products.
  • This produces fructooligosaccharides such as tetrasaccharide (GF-FF) and pentasaccharide (GFFFF).
  • GF-FF tetrasaccharide
  • GFFFFFF pentasaccharide
  • These tetrasaccharides and pentasaccharides are weak to heat, etc., and change in a process under high temperature such as concentration, and are further decomposed into sugars having a lower molecular weight or finally organic acids.
  • the pH of the DF A III-containing liquid dropped, and that the decomposition was further accelerated by the DFA III cleaning and crystallization process, especially when
  • the enzymatic reaction process to produce DF A III from inulin has a ratio of around 60 ° C. Although it was carried out under relatively mild temperature conditions, the pH at the beginning of the enzyme reaction was in the neutral range (6-7), but the pH at the end of the reaction was found to drop to four . Therefore, the pH of the DF A III enzyme synthesis solution obtained by the enzyme reaction method is usually 5 or less, and the cause of the decomposition of tetrasaccharides and pentasaccharides in the subsequent process leading to DFA III crystallization. I found out that it would be one of
  • DFA III when proceeding to the crystallization process of DFA III, many substances other than DFA III are derived from saccharides, such as monosaccharide glucose, fructose, disaccharide sucrose, trisaccharide, tetrasaccharide or more ( Frata oligosaccharides), organic acids, etc.
  • DFA III is a substance that is difficult to cause heat and acid decomposition as described above.
  • the present inventors have intensively investigated and examined the matters that various substances in the DFA II I-containing solution affect when producing DFA III crystals.
  • the pH of the solution containing DF A III in addition to the mixed sugars, especially fructose sucrose, particularly affects the crystallization of DFA III.
  • the present inventors have conducted extensive research from various directions on the feature that particularly affects the crystallization of the above-mentioned DF A III, which the present inventors have found for the first time.
  • the present inventors paid attention to the above substances other than DFA III, and as a result of various studies, the pH of all solutions containing DF A III in the DFA III cleaning and concentration 'crystallization process (glass electrode Method) is maintained at 5 or more, preferably pH 5-8, more preferably pH 6-8, to suppress decomposition of substances that are easily decomposed in a series of DFA III crystallization steps. It has been found that changes to other substances can be minimized. Further, it has been newly found that the crystallization rate is maintained and increased without crystallization by crystallizing DFA III at a pH of the (crude) crystal mother liquor of 5 or more, preferably pH 6-8.
  • fructose and sucrose contained in the crystallization mother liquor containing DFA III inhibits crystallization of DFA III. It has been found that when the content of fructose is 5% or less, preferably 1% or less, based on the solid content of the crystallization mother liquor, the crystallization rate is increased in crystallization of D F A III. Furthermore, when the crystallization mother liquor has a pH of 5 to 7, the DFA III-containing crystallization mother liquor of any purity is used under the condition that the supersaturation degree relative to the solubility at the crystallization end point temperature (referred to as supersaturation degree S in the present invention) is 4.4 or more.
  • the fluidity of the maskits decreased significantly, and it was judged that honey work was difficult.
  • the supersaturation S was 4.1 or less
  • the mascot was moderately fluid and the honey work could be carried out without any problems. Therefore, the industrial crystal production conditions of DFA III with a crystallization mother liquor pH of 5 or more were found to have a supersaturation degree S of 4.1 or less based on the crystallization end temperature.
  • the supersaturation degree S is less than 1.3, the crystallization rate is 20% or less.
  • the supersaturation degree S is preferably 1.3 or more and 4.1 or less, more preferably 1.5 or more.
  • the “solid content concentration” used in the present invention is the solid content ratio (w / w%) in the solution calculated from the weight of the solid content remaining after removing water in the solution by the drying method.
  • R_Bx Refractory Brick Degree
  • ⁇ 1 is DF A III solids purity (%)
  • 1 ⁇ 1 is DFA III crystallization rate (%)
  • bite-fractor oligosaccharide solids purity %
  • Solid content purity of sucrose (%)- ⁇ 1 indicates the solid content purity (%) of fructose
  • - ⁇ 1 indicates pH.
  • the above symbols also have the same meaning in FIGS.
  • the mother liquor composition and the crystallization rate in the crystallization step are shown.
  • composition of the crude crystallization mother liquor and the crystallization rate are shown when the pH of the purification and crystallization process is maintained at 5 or more by adding caustic soda.
  • composition of the crystallization mother liquor and the crystallization rate when the pH of the purification and crystallization process is maintained at 5 or higher by adding caustic soda are shown.
  • FOS fructooligosaccharide
  • sucrose sucrose
  • Fru fructose
  • Blank is a control. Effects of sucrose (S ue;), fructose (F ru), and the total amount of sucrose and fructose (S uc + F ru) present in the solution containing DFA III on the DFA III crystallization rate (2 ).
  • solubility curve and solubility curve of DFA III are shown.
  • ⁇ indicates the solubility of DF A III (measured value), and-indicates an approximate curve of DFA III solubility.
  • the present invention purifies a DFA III-containing liquid to efficiently produce a high-purity DFA III crystal without reducing the crystallization rate. Focusing on the importance of the pH of liquids containing sucrose for the first time, and as a result of further research, we found out that it was necessary to adjust the pH to 5 or more, and based on this useful new knowledge, It was finally the completion of Akira Honjo.
  • the present invention has an important feature in that when a DFA III-containing liquid is purified to produce a DF A III crystal, the pH of the DFA III-containing liquid is 5 or more. .
  • DFA III has not been industrially crystallized. Therefore, the pH has not been paid attention at all as well as the investigation of pH, but the effect of pH on the crystallization of DFA III is This is the first time that the inventors have paid attention in the course of research related to the industrial crystallization of DF A III, and it is completely new knowledge.
  • the present invention is the first issue in industrial research related to DFA III crystallization, and the technical problem itself is novel.
  • the solution is also novel. That is, the present invention includes the following.
  • DFA III difructose dianhydride III
  • DF A III characterized in that the pH of the solution containing DFA III is adjusted and maintained by at least one of the alkali addition method, the chromatographic method, and the anion exchange resin method. Crystal production method.
  • the solution containing DFA III is a solution obtained by allowing fructosyl transferase to act on inulin and purifying and filtering the obtained solution.
  • DF A III crystal production method.
  • the present invention purifies a solution containing DFA III to produce high-purity DFA III crystals. It is an industrially efficient product, especially at that time, with respect to a solution containing DFA III, at least one, preferably the pH of all the solutions is preferably 5 or more. One thing.
  • the pH is 5 or more in at least one or all of the solutions containing DFA III.
  • crystallization may be performed.
  • the raw material for the solution containing DFA III includes all of DFA III chemical synthesis solution in addition to DF A III synthesis solution obtained by allowing fructosyltransferase to act on inulin or an inulin-containing solution.
  • Inulin one of the raw materials, is a fructose polymer in which a large number of fructose is linked to one glucose.
  • an enzyme that produces DFA III in a broad sense, a fructosyltransferase, preferably inulin furatotransferase (IFT) is allowed to act.
  • IFT inulin furatotransferase
  • I FT-producing microorganisms examples include the following.
  • Non-limiting examples are shown below; Ar throbacters p. robacterureafaciens IFO 12140; A rthrobacterglobifo rm is I FO 12137; A rthrobacterpascens IFO 12139; B acillussp.; K luyver omy ces ma rxia nu svar.
  • microorganism-derived enzymes in addition to the separated and purified enzymes, crudely purified enzymes, microbial cultures, and processed products (culture supernatants, separated cells, broken cells, etc.) can also be used.
  • fructosyltransferase especially IFT
  • this time Since the Arthrobacter ISP AHU 1 753 (Ar throbacters p. AHU 1753) strain, which was deposited internationally as FERM BP-8296 at the Research Institute for Biological Biology, has excellent IFT-producing ability, the enzyme of this strain is suitable. Can be used for
  • the mixture is allowed to act at 60 ° C with stirring for 24 hours, and then transferred to form an enzyme reaction solution containing DFA III. Inactivate the enzyme to obtain a DFA III synthesis solution.
  • DF A III chemical synthesis solution can be obtained by chemical synthesis.
  • the DFA III enzyme synthesis or chemical synthesis solution thus obtained is used alone or mixed with other solutions containing DFA III to make a crude DFA III solution.
  • the DFA III crude liquid is then clean filtered. Clean filtration refers to activated carbon treatment and solid-liquid separation treatment of DFA III crude liquid.
  • Activated carbon treatment is a treatment in which a small amount of powdered activated carbon is added to the DFA III crude liquid and, if necessary, heated and / or stirred to adsorb impurities other than DFA III onto the activated carbon.
  • the average particle size is 15-50 microns, preferably 25-45. Micron, more preferably about 35 microns; a maximum particle size of 200 microns or less, preferably 170 microns or less, more preferably 150 microns or less, for example 147 microns or less is used.
  • the addition amount is 5% or less, preferably 0.1 to 3%, more preferably 0.5 to 1.5%, based on the solid content, depending on the composition of the DFA III crude liquid. As appropriate.
  • filtration using a filter aid such as Hyflo Supercell (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) diatomite filter (for example, filtration using a ceramic filter: PR—manufactured by Nippon Pol Co., Ltd.) Molds can be used), membrane filter (MF) filtration, continuous centrifugation, molecular sieve method, reverse osmosis membrane method, and in some cases, at least one of ultrafiltration (UF) membranes is used as appropriate.
  • MF membrane filter
  • UF ultrafiltration
  • IFT enzyme deactivation solution is supplemented with Dazai activated charcoal S (made by Futamura Chemical Co., Ltd .: average particle size of about 35 microns, 147 microns or less) at a rate of 1% per solid. Stir for 10 minutes.
  • This completed solution is filtered through diatomaceous earth (Radiolite 700, Showa Chemical Industry). That is, the diatomaceous earth is precoated on the outer surface of a ceramic tube (PR-1 12 type ceramic tube manufactured by Nippon Pole Co., Ltd.), and the reaction solution containing activated carbon is pressurized and filtered outside the tube. Collect the filtrate from the inside.
  • the filtrate obtained by clean filtration of the DFA III-containing liquid (crude liquid) is concentrated by a conventional method.
  • it is concentrated (for example, 60 to 80 ° C., 120 mmHg or less) with a calandria-type concentration effect can used in the production of sugar and the like to obtain a concentrated solution.
  • the concentrated solution may be concentrated to a solid content concentration of 60 to 85%, for example, about 77%.
  • the DFA III crude liquid obtained from the above-mentioned DFA III enzyme synthesis solution or chemical synthesis solution is maintained at a pH of 5 or more during the steps from cleaning to filtration and concentration.
  • sodium hydroxide may be added to adjust the pH to 5 or higher.
  • the mother liquor that is, the crude crystallization mother liquor (about 60 ° C) obtained above is transferred to a crystallizer, and DFA III crystals are produced by cooling or sucrose method to obtain crude crystals.
  • a seed (seed crystal) obtained by dispersing DFA III crystals in a mortar or the like in alcohol or the like is added to the mother liquor in an appropriate amount and grown.
  • Seed method There are a full seeding method and a shock seeding method. In the full seeding method, the particle size distribution of DFA III crystals can be shifted to a smaller one by setting the seed amount to 1% or more of the DF A III amount in the crystallization mother liquor or the crude crystallization mother liquor. .
  • the lower the seed temperature of the both methods the smaller the D FA III crystal grain size.
  • the temperature gradient during cooling crystallization is small at first, and then increases as the temperature gradient decreases. It is preferable to use a crystallizer with a circulation system and / or a stirring system.
  • the crude crystallization mother liquor from which crystals have been separated is separated into DF A III crude crystals and crude crystal syrup with a separator (3000 rpm, 1200 G).
  • DFA III crude crystals are redissolved in hot water to obtain a DF A III purified solution, and after purification, filtration, concentration, and crystallization in the same manner as the crude crystals to obtain product crystals.
  • the obtained crystal was odorless, colorless and transparent octahedral crystal in the neutral range, melting point: 163.7 ° C., optical rotation [c] D : 134.5.
  • the crude crystal syrup and / or crystal syrup separated in the above flow is returned to the crystal production system as desired, and circulated.
  • the circulatory system is used without maintaining or adjusting the pH of each process liquid, DFA III crystallization inhibitors such as monosaccharides (especially fructose) and sucrose increase and accumulate significantly in the process liquid, and crystallization occurs. Since the pH of the mother liquor drops significantly, the crystallization rate decreases during the DFA crystallization process, and in the worst case, the crystallization is impossible.
  • the above-mentioned inhibitory substance can be obtained by subjecting the process liquid containing the inhibitory substance to chromatography (hereinafter, sometimes referred to as “chromatography”) or a east treatment. It is possible to remove and purify and crystallize DFA III. That is, the various products produced in the entire DFA III purification crystallization process (Fig. 1) were used as a chromatographic stock solution (solids concentration 40-75%) and chromatographed to purify the solution containing DFA III. And can be crystallized.
  • Figure 2 shows an example of the purification flow by the chromatographic process.
  • the chromatographic stock solution (solid concentration 40-75%) is chromatographed to separate the DF A III fraction.
  • the DFA III-rich fraction which has the same degree of purification as the previously-dissolved solution (DFA III solution), is used as the DFA III purified solution to produce product crystals by clean filtration, concentration, and crystallization. (Route A), or it can be crystallized as it is (Norate B).
  • DFA III non-rich fractions with low DFA III content are used in the manufacturing flow (total purification process from DFA III-containing solution to DF A III product as shown in Fig. 1). Return to the appropriate place (Route C).
  • non-DFA III fractions containing flat oligosaccharides, monosaccharides such as fructose, and acidic substances, and containing only a small amount of DFA III should be used as feed ingredients or discarded.
  • chromatographic separation methods fixed bed method (one-pass method), continuous method (pseudo moving bed method), and semi-continuous method (combination of fixed bed method and continuous method) can be applied.
  • the filler ion exchange resins of the device Na type for chromatographic, K type, the strongly acidic ion exchange resins such as C a form is used.
  • the resin a styrene dibutene benzene resin having a uniform particle diameter is used.
  • a variety of chromatographic resins are sold by ion exchange resin manufacturers, but any resin that can be applied to a sugar solution can be used. Chromatographic treatment is also used to increase the purity of the crystal mother liquor when the purity of DF A III is low.
  • the DFA III-containing solution and yeast may be brought into contact with each other, and both may be mixed and, if necessary, incubated with stirring or cultured with aeration.
  • yeast baker's yeast, sake yeast, brewer's yeast, pudou liquor yeast and other various yeasts can be used as appropriate, and dry yeast, pressed yeast and other various commercial products can also be used sufficiently.
  • Yeast treatment is mainly useful for removing fructooligosaccharides, sucrose and / or monosaccharides out of the system because furato-oligosaccharides, sucrose, and monosaccharides are degraded or taken into the cells. .
  • a DFA III-containing liquid (crystallization mother liquor) having a DFA III purity of less than 60% can be industrially crystallized.
  • the DFA III-containing solution having a purity of less than 60% of DF A III is treated with at least one of yeast treatment, clean filtration treatment, or chromatographic treatment in order to increase the purity of the solution.
  • the DFA III purity of the DFA-containing liquid can be significantly increased.
  • the main terms in the present invention are defined below with reference to the DFA III crystal production flow shown in FIG.
  • Inulin refers to inulin and inulin-containing liquids derived from plants or enzyme products, for example, plant extracts such as Jerusalem artichoke, burdock, chicory, etc., and liquids containing synthetic inulin obtained by reacting sucrose with inulin synthase. Or a liquid obtained by purifying and filtering these liquids, and an inulin-containing powder obtained by drying or crystallizing each liquid.
  • Inulin which is one of the raw materials of the solution containing DFA III, has a fructose polymerization degree of 10 to 60 and a polysaccharide content of 70% or more, preferably 80% or more. By using it, DFA III is generated efficiently.
  • the DFA III-containing liquid can be used to produce DFA III crystals efficiently.
  • the DFA III enzyme synthesis or chemical synthesis solution refers to a solution or a DFA III chemical synthesis solution in which the enzyme is reacted with the above-described inulin to produce a solution containing DFA III and the enzyme is deactivated as necessary.
  • the DFA III crude liquid is a crude crystal syrup, crystal syrup, or chromatographic separation obtained by solid-liquid separation of the DFA III enzyme synthesis or chemical synthesis liquid itself, or the mother liquor crystallized in the crystallization process (crude crystallization, crystallization).
  • Treatment solution At least one of the DFA III fractions A liquid consisting of DFA III enzyme synthesis or chemical synthesis liquid mixed with at least one of crude crystal syrup, crystal syrup, chromatographic separation solution, and DFAI II fraction obtained by chromatographic separation. It is.
  • the crude crystallization mother liquor means that if the above DFA III crude liquid is necessary, the activated carbon, ion-exchange resin, chromatography, yeast, etc. are cleaned and then diluted by solid-liquid separation such as filtration (that is, clean 'filtration). Obtain a liquid.
  • This dilute liquid or the above-mentioned D F A III crude liquid is concentrated to an appropriate concentration with a concentrator such as a utility can.
  • DFA III purified solution is a solution consisting of at least one of the DFA III fraction obtained by chromatographic separation or a solution obtained by dissolving crude crystals obtained by coarse crystallization with water (hot water) to an appropriate concentration.
  • the crystallization mother liquor means that if the above DFA III purified liquid is necessary, clean up activated carbon, ion exchange resin, yeast, etc., and then obtain a dilute liquid by solid-liquid separation such as filtration (ie, cleaning and filtration). .
  • the crude crystallization mother liquor containing DFA III and the crystallization mother liquor contain DFA III that is supplied exclusively to the crystallizer of the cooling method, Z or evaporation method, etc. for crystallization of DFA III. Solution.
  • a solution containing DFA III refers to all of the solutions produced in the DFA III crystal production flow and containing DFA III.
  • the P H of solutions containing DFA III is 5 or more.
  • the present inventors have found for the first time that the crystallization rate decreases as pH decreases as DFA III is crystallized.
  • the pH should be 5 or more, but the preferred range is 5-8, more preferably 6-8. Of course, higher pH is possible, but the amount of alkalis such as caustic soda and caustic potash used to adjust the pH increases, resulting in waste and high costs, and problems in terms of work safety. .
  • the solution containing DFA III should have a pH of at least 5 for at least one, preferably all of those defined above. Further, it is more preferable that the pH in the transfer pipe in the production process of DF A III crystal including the purification and crystallization process of DFA II I is 5 or more.
  • the pH of the solution containing DFA III is 5 or more.
  • the presence of sucrose and fructose decreases the crystallization rate of DFA III, and the fact that the crystallization mother liquor contains 5% or less, preferably 1% or less of the fructose in the solid fraction. It has been found that the crystallization rate of increases. It was also confirmed for the first time that such sugar suppression was achieved by setting the pH to 5 or higher.
  • the pH of the solution containing DFA III is 5 or more, coarse crystallization mother liquor, by fracture toast the crystallization mother liquor contains 5 wt 0/0 or less, the DFA III in E industrially efficiently crystals Can be manufactured.
  • the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to the examples.
  • Example 1
  • the DFA III crystal production test was conducted by the circulation method according to a part of the flow shown in Fig. 1.
  • the saccharide value of the liquid containing DF A III used in this test is the value obtained from the composition analysis by high-speed liquid chromatography.
  • AHU 1753 strain enzyme solution (enzyme titer of about 500,000 U) was added to 100 kg of the commercially available inulin (Orafti, trade name Lafitelin HP) at a daily treatment amount of 60 ° C for 12 hours.
  • a DFA III enzyme synthesis solution was obtained by reaction.
  • activated carbon Naimura Chemical Co., Ltd., Dazai activated carbon KW50
  • 0.5% activated carbon Naimura Chemical Co., Ltd., Dazai activated carbon KW50
  • DFA III enzyme synthesis solution decolorization solution Concentrate the DFA III enzyme synthesis solution decolorization solution to a solid concentration of 76% as a crude crystallization mother liquor, add seed crystals (seed) at 50 ° C, and cool to 10 ° C over 12 hours DFA III crude crystals were produced.
  • This crude crystal mother liquor also called a crude crystal mass kit
  • 50% of the crude crystal syrup was mixed with the enzyme reaction finished solution, and the rest was used as feed material.
  • 50% of the crystal syrup was returned to the concentrate in the coarse crystallization process, and the remaining 50% was returned to the concentrate in the crystallization process.
  • the coarse crystallization process was started from the fourth day of the test, and the crystallization process was started from the seventh day of the test.
  • the outline of the coarse crystallization process (mother liquor composition and crystallization rate) is shown in Fig. 3.
  • the coarse crystallization rate started to decrease from the 10th S of the test and became less than 30% at the 13th S, so the return of the coarse crystal syrup was reduced from 50% to 30%.
  • the crystallization rate continued to decline thereafter, reaching below 10% on the 17th day.
  • the DFA III purity of the crude crystallization mother liquor remained at less than 80% during the test period and did not change significantly.
  • the furato-oligosaccharide decreased with the progress of the test, and the fructose, which is considered to be a degradation product, increased.
  • the pH of the crude crystallization mother liquor gradually decreased from 5.1 at the beginning and decreased to around 4.
  • the outline of the purification crystallization process is shown in Fig. 4. There was no significant change in the sugar composition during the period, but the crystallization rate gradually decreased during the test period.
  • the pH of the crystallization mother liquor was 4.8 at the start, but gradually decreased to around 4.
  • Example 1 From Example 1, it is clear that the crystallization rate gradually decreases when DFA III is produced in a circulating manner. At this time, the pH of the crystallization mother liquor was lowered, and the degradation of the fructo-oligosaccharide was also advanced, suggesting that it had some relationship with the decrease in the crystallization rate. Therefore, in the production test of this example, caustic soda was added to the enzyme reaction finished solution, the crude crystallization mother liquor (the solution before concentration) and the crude crystal redissolved solution to prevent the pH drop of each process juice. . Other than that was carried out in the same manner as in Example 1.
  • DFA III itself is a substance that is more resistant to heat and acid than other sugars.
  • the pH of the production process liquid is low, impurities other than DFA III are decomposed to produce other substances, which are also used for crystallization. Since the DFA III-containing liquid is used in a circulating manner, not only will the pH decrease, but other substances other than DFA III may accumulate. In fact, in the test production of Example 1, it was confirmed that the pH of the process liquid gradually decreased, the proportion of fructooligosaccharides decreased, and fructose accumulated.
  • the present inventors conducted a table test to determine how the sugar composition of the enzyme reaction completed solution prepared in Example 1 changes depending on pH (3 to 7) and heat (70, 80 ° C). Carried out.
  • As a result under the conditions of 70 ° C and pH 5 or higher, there was almost no change in the composition of the saccharides contained until 24 hours. An increase in toose was observed, and the tendency was further enhanced at pH3.
  • the change in the sugar composition observed under each pH condition observed at 70 ° C was further accelerated at 80 ° C. At 80 ° C, even under the condition of pH 5 or higher, there was almost no change until 70 hours as in the case of 70 ° C. Over time, there was a tendency for the decomposition of saccharides of 4 or more saccharides and an increase in fructose.
  • the present inventors examined the acidic substance of the crude crystallization mother liquor that had been reduced to PH 4 in Example 1.
  • organic acids lactic acid, acetic acid, formic acid, etc.
  • a concentration of 30 to 40 mgZl 00 g sample It was found that it contained.
  • sucrose solution with a solid content of 71% or a fructose solution with a solid content of 71% were added to 300 g of the 13 8 III solution prepared to a solid content of 71% (sucrose per solid content ( (Flatatoose) was added as 1.0, 4.8, 9. 1%), and crystallization was performed together with the additive-free.
  • the growth temperature at this time was up to 10 ° C.
  • sucrose (fructose) solution was added, the seeded crystals were dissolved at 50 ° C, so seeding was performed again at 45 ° C. The test results are shown in FIG.
  • Figure 8 shows that the amount of DF A III crystals produced is smaller when fructooligosaccharides are replaced with sucrose and fructose than when only fructooligosaccharides are present as impurities, and fructooligosaccharides are degraded even with the same DFA III purity. It was confirmed that the formation of sucrose and fructose suppresses crystallization of DFA III.
  • the crystal growth temperature at this time is limited to 10 ° C.
  • the oven temperature was 45 ° C.
  • the test results are shown in FIG.
  • Fig. 9 shows that even when the DFA III purity is the same, when sucrose and fructose are added in half, the degree of inhibition is higher when added alone. Therefore, the crystallization of DFA III was considered to be affected by the higher content of sucrose and fructose that existed as impurities. On the other hand, since the amount of sucrose produced does not exceed the amount of fructose at the actual manufacturing site, the amount of crystals produced seems to be affected by the amount of fructose.
  • the amount of DF A III crystals produced is smaller when sucrose and fructose are present, and the degree of either sucrose or fructose is present. It was thought that it was influenced by those who have a lot. However, even when sucrose and fructose are present in the DF A III solution even when the sucrose and fructose are present in the DF A III solution, sucrose and fructose are present in a solid form. It was thought that when the concentration of the mother liquor was increased, the crystals could be recovered as if both were not present.
  • the solution of sodium acetate and sodium formate in 300 g of 13-8 H solution prepared to a solid content of 71% is 10 mg + 10 mg, 50 mg + 50 mg, 10 Omg + 10 Omg Zl 00 g DFA III solution. Crystallization was carried out after adjusting the solid content concentration with pure water so that the concentration was the same including those with no addition (final solid content concentration 70.3%). The crystal growth temperature at this time was 10 ° C, and the seed temperature was 50 ° C. The test results are shown in FIG. From Fig. 10, it was considered that the organic acid salt did not inhibit the crystallization of DFA III, although there was some variation in the amount of crystal formation.
  • Figure 11 shows that the amount of crystals produced is affected by pH, pH 7 has the largest amount of crystals produced, pH 4 has a minimum value, and pH 3 and pH 5 have the same amount of crystals produced. Obtained.
  • test results were slightly different from those in the presence of the organic acid salt, and the amount of crystals produced at pH 5 was small, but pH 7 had the largest amount of crystals produced, and P H 4 had the minimum value. Furthermore, in order to confirm that this result was not due to the difference in the concentration of inorganic salt, the pH was adjusted in the same manner in the presence of 1% sodium chloride, and crystallization was performed, but the result was obtained in the presence of organic acid salt. The tendency was the same as when crystallizing with pH adjustment. From this, it was considered that the crystallization inhibition action at pH 5 was alleviated by the presence of salts.
  • Table 1 shows the relationship between the pH of the crystal mother liquor and the degree of supersaturation S.
  • the crystallization mother liquor has a pH of 5 to 7, under the condition of supersaturation S of 4.4 or higher, the flowability of the mascot is remarkably reduced in any purity of the crystallization mother liquor containing DF A III, and the honey work is difficult. It was judged difficult.
  • the supersaturation degree S was 4.1 or less, the maskit was moderately fluid and the honey work could be carried out without any problem. Therefore, it was found that the industrial crystal production conditions of DFA III with a crystallization mother liquor H of 5 or more had a supersaturation degree S of 4.1 or less based on the crystallization end point temperature.
  • the degree of supersaturation S is 1.3 or more and 4.1 or less, more preferably 1.5. It was found that the above is 4.1 or less, and more preferably 2.3 or more and 4.1 or less. (table 1)
  • Solid content of liquid B DFA III 79. 7%, ash 0.3%, fructooligosaccharide 18.3%, sucrose 0.2%, fructose 1.0%

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Abstract

本発明は、ジフラクトース　ジアンヒドリドIII(difructose　dianhydride　III:DFA　III)、すなわち、フラクトース2分子が1,2';2,3'で結合している難消化性二糖類(di-D-fructofuranose-1,2';2,3'dianhydride)を含有する溶液のpHが5以上、好ましくは5～8、更に好ましくは6～8であることを特徴とするDFA　III結晶の製造方法である。本発明方法によれば、たとえ循環系で結晶化を行っても、結晶化率を低下させることなくDFA　IIIを工業生産でき、その際、更に、(粗)結晶化母液のフラクトースの含量合計が固形分当たり5%以下であり、そしてフラクトース含量が5%以下とすることにより更に効果が高まる。

Description

ジフラク トース ジアンヒドリ ド III結晶の製造方法
技術分野
本発明は、 ジフラク トース ジアンヒドリ ド III (D i f r u c t o s e d i a nhy d r i d e III)明 (以下、 DF A III ともいう） 結晶を効率的に製 造する方法に関する。 本発明は、 循環式による DF A III の製造においても、 その結晶化率を低下させることがなく、 DFA III の工業的製造方法としても 非常にすぐれている。 書
背景技術
DFA III は、 カルシウムを始めとしてミネラル吸収促進や利尿効果、 便通 改善効果を有する機能性オリゴ糖で、 2個のフラクトースの還元末端が、 互いに —方の還元末端以外の水酸基に結合した環状二糖類であって （d i— D— f r u c t o f u r a n o s e— 2 , 1 : 2, 3 — d i a n h y d r i d e)、 水 への溶解度が高く蔗糖の 90〜 95 %を示すが、 その甘味度は蔗糖の 52 %程度 である。 また、 熱や酸に強い物質である。
DFA III の製造法としては、 ィヌリン及び Z又はィヌリン含有植物抽出液 にアースロバクタ一■ ウレァファシエンスに属する細菌またはその産生する酵素 を作用させて DFA III の含有液を作成して、 その DF A III 含有液を活性 炭カラムに通液して DFA III を吸着させた後、 エタノールで溶離して DFA III の多い画分を回収し、 蒸発乾固する DF A III の製造方法が提案されてい る （例えば、 特許文献 1参照)。
また、 ィヌリン及び Z又はィヌリン含有植物抽出液を、 固定化素材に固定化し たィヌリンフラク トトランスフェラーゼを充填したカラムに通液して、 DFA III 含有液を産生し、 その含有液を、 イオン交換樹脂、 活性炭等の精製工程を経 て、 DFA III含有シラップ又は蒸発乾固物を生成する DF A III の製造方 法が提案されている （例えば、 特許文献 2参照)。 また、 ィヌリンにィヌラ一ゼ II を作用させることにより、 高純度の DFA III を工業的に生産することが可能である旨が記載されている （例えば、 特許文 献 3参照)。
しかしながら、 これらの文献には、 いずれも結晶化 DF A III を得ることに ついては全く記載されておらず、 ましてや DFA III 結晶を効率的に工業生産 することなど報告例はなく全く未知である。 特許文献 1
特公昭 56— 26400号公報
特許文献 2
特開平 1— 285 1 95号公報
特許文献 3
特開平 1 1— 43438号公報 発明が解決しようとする課題
近年、 DFA III について有用な用途が開発されるに伴い、 DFA III の 需要が高まってきている。 そして医薬用途に使用する場合はもちろんのこと飲食 品用途に使用する場合においても、 DFA III 以外の糖及び各種不純物を除去 した高純度 DF A III 結晶が要望されており、 特に、 DFA III を含有する 液からより効率的に DF A III の結晶を得る方法、 及び結晶化 DF A III の 工業的製造方法の確立が要望されている。 課題を解決するための手段
本発明は、 上記した技術の現状に鑑み、 DFA III 結晶を製造する方法、 特 に工業的に効率よく製造する方法を開発する目的でなされたものである。
そこで本発明者らは、 DFA III を含有する溶液を清浄 '濾過した後、 これ を濃縮し、 粗結晶化して粗結晶シラップを分離し、 得られた粗結晶を溶解し、 こ れを清浄 '濾過した後、 濃縮し、 結晶化して結晶シラップを分離して製品結晶を 製造する方法を開発し、 そして更に、 効率化、 工業化のために、 上記において分 離した粗結晶シラップ及びノ又は結晶シラップを結晶化工程に再度戻してやり、 循環系を構築して連続的に DF A III の結晶の製造を実施したところ、 DFA III の結晶化率が時間の経過とともに低下していき、 DFA III 結晶の製造が 困難になること、 特にその工業生産は実質的にできなくなるという極めて重大な 欠点にはじめて遭遇した。 本発明者らは、この新しく発見された重大な欠点を解決するために DF A III の結晶化率低下の原因について各方面から徹底的に検討を行った。
DFA III を含有する溶液には、 DFA III 以外の物質が含まれている。 それらは、 チコリ等の植物からィヌリンを抽出する際、 チコリ由来の物質であつ たり、 砂糖から酵素合成でィヌリンを生成する際に合成される物質由来であった り、 ィヌリンから DF A III を酵素反応する際ィヌリンの酵素分解物質等が考 えられる。 また、 DFA III 含有溶液が結晶 DF A III を製造する過程で溶 液の滞留が長くなり、 また、 溶液の濃縮過程で高温等の過酷な条件に長時間曝さ れるので、 これらの条件で、 DFA III 含有溶液の組成が変質することにより 新たな他の物質が生ずることも考えられる。 以上のような種々の物質が、 DFA III の結晶化に影響を与えることが考えられる。 また、 DFA III の精製 '結 晶化工程で DF A III 含有液の循環があるため、 上記で生成した DF A III 以外の新たな物質が蓄積する。
DFA III の原料の 1つとなるィヌリンは、 グノレコース一個にフラクトース が多数連なった多糖類であり、 このィヌリンに分解転移酵素を作用させた場合、 DFA III を主成分として生成し、 その他の副産物質として、 4糖類 (G-F -F-F) や 5糖類 (G-F-F-F-F) のフラク トオリゴ糖を生成する。 こ れらの 4糖類、 5糖類は、 熱等に弱く、 濃縮等の高温下での工程で変化して更に 分子量の小さい糖や、 最終的には有機酸等に分解する。 そして結果的に DF A III 含有液の pHが下がり、 特に製造工程を循環系としたときでは、 その分解が DFA III清浄 ·結晶化工程でさらに加速されることを突きとめた。
また、 ィヌリンから DF A III を生成する酵素反応工程は、 60°C前後の比 較的温和な温度条件下で行われるが、 酵素反応初期の pHは中性域 （6〜7) で あるものの、 反応終了時点の pHは4台まで低下することが分かった。 したがつ て、 酵素反応法によって得られる DF A III 酵素合成液の pHは、 通常 5以下 となっており、 その後の DFA III 結晶化に至る工程で、 4糖類、 5糖類が分 解する原因の一つとなることが分った。
すなわち、 DFA III の結晶化工程へと進むときには、 DFA III 以外の 物質としては、 糖類由来のものが多く、 単糖であるグルコース、 フラク トース、 二糖類である蔗糖、 3糖類、 4糖類以上 （フラタトオリゴ糖） の物質、 有機酸等 が混在することになる。 また、 DFA III は、 前述した通り熱や酸分解を起こ しづらい物質である。
これらのことに鑑み、 本発明者等は、 DFA II I含有溶液中の種々の物質が、 DFA III 結晶を製造する際に影響する事項について、 鋭意調査検討した。 そ の結果、 驚くべきことに、 DF A III を含有する溶液の pH、 加えて混在する 糖類、 特にフラク トースゃ蔗糖が DFA III の結晶化に特に影響することをは じめて見出した。 ·
そこで、 本発明者らは、 本発明者らがはじめて見出した上記 DF A III の結 晶化に特に影響するフ了クタ一について、 各方面から鋭意研究を行った。
すなわち、 本発明者等は、 DFA III 以外の上記物質に着目し、 種々検討の 結果、 DFA III 清浄 ·濃縮 '結晶化工程に於ける DF A III を含有する総 ての溶液の pH (ガラス電極法） が 5以上、 好ましくは pH5〜8、 更に好まし くは p H 6〜 8に維持及び 又は調整することにより、 D F A III 結晶化の一 連の工程で分解し易い物質の分解を抑制し、 他の物質への変化を最小限に食い止 めることが判った。 また、 （粗） 結晶母液の pHが 5以上、 好ましくは pH6〜 8で DFA III を結晶化することにより、 結晶化率が低下せず維持上昇するこ とを新たに見出した。
結晶化母液の pHによって、 糖の結晶化率が変化することは、 DFA III の みならず他の糖類でも知られておらず、 全く新規の知見である。
DFA III製造における各工程液の pHを上記範囲で維持、 調節する方法と しては、 可能な限り 70 °C以下で工程液を管理することが効果的であり、 また アルカリ剤を添加して積極的に pH調節することが可能である。 用いられるァノレ カリ剤としては、例として水酸化ナトリウム（苛性ソーダ）や水酸化力リゥム（苛 性カリ）、 炭酸ナトリウム （ソーダ灰） 等がある。 また、 クロマトグラフィーに より、 工程液中の有機酸等の酸性物質および D F A III以外の糖類を同時に除 去することで、 工程液の DFA IIIの純度アップと pH低下防止を同時に達成 することが可能である。
また、 上記以外の方法として、 酸性物質を含む DFA III含有液をァニオン 交換樹脂に通液することで、 酸性物質がイオン交換により吸着し、 酸性物質を除 去することが可能である。
また、 DFA IIIを含有する結晶化母液中に含まれるフラク トース、 蔗糖が 特に DFA IIIの結晶化の阻害要因となることを新たに見出した。 フラクトー スの含有量が、 結晶化母液の固形分当たり 5%以下、 好ましくは 1%以下である ことが D F A IIIの結晶化をするにあたり結晶化率を高めることが判明した。 更に、 結晶化母液 pH5〜7の時、 結晶化終点温度の溶解度に対する過飽和度 (本発明では過飽和度 Sと称する） が 4. 4以上の条件では、 いずれの純度の D FA III含有結晶化母液においても、 マスキットの流動性が著しく低下し、 分 蜜作業が困難と判断された。 一方、 過飽和度 Sが 4. 1以下の条件では、 マスキ ットは適度に流動性があり、 分蜜作業は支障なく実施可能であった。 従って、 結 晶化母液 pHが 5以上である DF A III の工業的な結晶製造条件は、 結晶化終 点温度を基準とする過飽和度 Sが 4. 1以下であることが分かった。 過飽和度 S が 1. 3未満では結晶化率が 20 %以下となることから、 好ましくは、 結晶化率 の観点から過飽和度 Sは 1. 3以上 4. 1以下、 さらに好ましくは 1. 5以上 4. 1以下、 またさらに好ましくは、 2. 3以上 4. 1以下が良いことが分かった。 なお、 本発明で用いる 「固形分濃度」 とは、 乾燥法により溶液中の水分を除去 した後に残存する固形分の重量より算出される溶液中の固形分比率 （w/w%) であり、 実際の製造工程管理では、 簡便法として R_Bx (R e f r a c t om e t r i c B r i x De g r e e) のィ直も代用できる。
本発明は、 これらの有用新知見に基づき、 更に研究、 検討の結果、 遂に完成さ れたものである。 図面の簡単な説明
図 1
DFA III を含有する溶液の精製 ·結晶化工程を包含する DF A III 結晶 の製造フ口一の一例を示す。
図 2
クロマト処理による精製フローの一例を示す。
図 3
粗結晶化工程の母液組成および結晶化率を示す。 なお、 図中、 ー騸一は DF A III 固形分純度 （％)、 一 ·一は DFA III 結晶化率 （％)、 一口一フラク ト オリゴ糖の固形分純度 （％)、 一◊一は蔗糖の固形分純度 （％) —△一はフラク トースの固形分純度 （％) をそれぞれ示し、 —〇一は pHを示す。 以下、 図 4、 5、 6についても、 上記記号は同様な意味を表す。
図 4
結晶化工程の母液組成および結晶化率を示す。
図 5
苛性ソーダの添加により精製 ·結晶化工程の p Hを 5以上に維持したときの粗 結晶化母液組成および結晶化率を示す。
図 6
苛性ソーダの添加により精製 ·結晶化工程の pHを 5以上に維持したときの結 晶化母液組成および結晶化率を示す。
図 7
DFA III 溶液にスクロース、 フラクトース溶液を添カ卩した場合における D F A III結晶化率の変化を示す。
図 8
DFA III を含有する溶液中に内在するフラク トオリゴ糖、 スクロース、 フ ラク トースが DFA III 結晶化率に与える影響 （1) を示す。 なお、 図中、 F OSはフラタ トオリゴ糖、 S u eはスクロース、 F r uはフラク トース、 B l a n kは対照をそれぞれ示す。 DFA III を含有する溶液中に存在するスクロース （S u e；)、 フラク トー ス （F r u)、 スクロースとフラク トースの合量（S u c + F r u) が DFA III 結晶化率に与える影響 （2) を示す。
図 1 0
DFA III を含有する溶液中に存在する有機酸塩 （酢酸 Na +蟻酸 Na) が DFA III結晶化率に与える影響を示す。
図 1 1
DFA IIIを含有する溶液の pHが DF A III結晶化率に与える影響 （1) を示す。
図 1 2
DFA IIIを含有する溶液の pHが DF A III結晶化率に与える影響 （ 2 ) を示す。
図 1 3
粗結晶化母液の P Hが D F A III結晶化率に与える影響を示す。
図 14
DFA III の溶解度および溶解度の近似曲線を示す。 なお、 図中、 〇は DF A IIIの溶解度 （実測値)、 —は DFA III溶解度の近似曲線を示す。 以下、 本発明について詳述する。
本発明は、 DFA III を含有する液体を精製して、 高純度の DFA III 結 晶を、 結晶化率を低下させることなく、 効率的に工業生産するものであって、 そ の際、 DFA III を含有する液体の pHの重要性にはじめて着目し、 そして更 に研究の結果、 pH 5以上とすることが必要であることをはじめてつきとめ、 こ の有用新知見に基づき更に研究、 検討を加え、 遂に本宪明の完成に至ったもので ある。
すなわち、 本発明は、 DFA III を含有する液体を精製して DF A III 結 晶を製造するに際して、 DFA IIIを含有する液体の pHが 5以上であること、 を重要な特徴とするものである。 従来、 DFA III については、 工業的結晶化は行われておらず、 したがって pHの検討はもとより pHについては全く着目されていなかったのであるが、 D FA III の結晶化に及ぼす pHの影響は、 本発明者らによる DF A III のェ 業的結晶化に係る研究の過程においてはじめて着目されたものであって、 全く新 規な知見である。 換言すれば、 本発明は、 DFA III 結晶化に係る工業的研究 においてはじめて問題点がクローズアップされたものであって、 技術課題自体が 新規であるということができ、 してみれば、 当然にその解決手段も新規である。 すなわち、 本発明は、 次のものを包含するものである。
1. ジフラタ トース ジアンヒドリ ド III (DFA III) を含有する溶液の pHが 5以上であることを特徴とする、ジフラクトース ジアンヒドリ ド III (D FA III) 結晶の製造方法。
2. DFA III を含有する溶液の pHをアルカリ剤の添加法、 クロマトダラ フィ一法、 ァニオン交換樹脂法の少なくともひとつで調整 ·維持すること、 を特 徴とする上記第 1項記載の DF A III結晶の製造方法。
3. DFA III を含有する溶液が、 ィヌリンにフラクトシルトランスフェラ ーゼを作用させ、 得られた液を清浄 ·濾過した溶液である：：とを特徴とする、 上 記第 1及び 2項記載の DF A III結晶の製造方法。
4. ィヌリンのフラクトース重合度が 1 0から 60であってポリサッカライド の固形分純度が 70%以上であることを特徴とする、 上記第 3項記載の DF A III結晶の製造方法。
5. DFA III 粗液から粗結晶化を経て製品結晶化に至る、 DF A III を 含有する溶液を清浄 *濾過した後、 濃縮して結晶化するまでの工程 （精製 ·結晶 化工程） において、 少なくともひとつの DFA III を含有する溶液の pHが 5 以上であること、 を特徴とする上記第 1〜4項のいずれか 1 項に記載の DF A III結晶の製造方法。
6. 精製 ·結晶化工程を循環系で行うこと、 を特徴とする上記第 5項に記載の DFA III結晶の製造方法。
7. 結晶化母液又は粗結晶化母液の冷却結晶化における終点温度での溶解度に 対する過飽和度が 1. 3〜4. 1であることを特徴とする、 上記第 1〜6項のい ずれか 1項に記載の D F A III結晶の製造方法。
8. DFA III 含有の結晶化母液又は粗結晶化母液のフラク トース含量が固 形分重量当たり 5%以下であること、 を特徴とする DF A III結晶の製造方法。
9. フラクトース含量が固形分重量当たり 5%以下にする方法として、 フラク トオリゴ糖及び/又はフラクトースをクロマトグラフィ一法、 イースト処理法の いずれかひとつ以上を用いて除去すること、 を特徴とする上記第 8項記載の DF A III結晶の製造方法。
10. 上記第 1〜 9項のいずれか 1 項に記載の方法で製造された DF A III の; taS曰 o 本発明は、 DFA III を含有する溶液を精製して高純度の DFA III 結晶 を効率的に工業生産するものであって、 特にその際、 DFA III を含有する溶 液について、 少なぐともひとつ、 好ましくはすべての該溶液の pHが 5以上であ ること、 を重要な特徴のひとつとするものである。
本発明を実施するには、 DFA ΙΠ結晶の製造工程 （その 1例を図 1に示す） において、 DFA III を含有する溶液の少なくともひとつあるいはすべての溶 液について、 p Hが 5以上となるようにして結晶化を実施すればよい。
DFA III 結晶の製造法について、 その 1例を図示した図 1を参照しながら 以下に説明する。
DFA III を含有する溶液の原料としては、 ィヌリン又はィヌリン含有液に フラクトシルトランスフェラーゼを作用させて得た DF A III 合成液のほか、 DFA III化学合成液がすべて包含される。
原料の 1つであるィヌリンは、 グルコース 1個にフラクトースが多数連なった フラクトース重合体である。 このィヌリンを原料として、 DFA III を生成す る酵素、 広義でフラク トシルトランスフェラーゼ、 好ましくはィヌリンフラタト トランスフェラーゼ （I FT) を作用させる。
I FT生成微生物としては、 次のものが例示される。
その非限定例を以下に示す； Ar t h r o b a c t e r s p. ； A r t h r o b a c t e r u r e a f a c i e n s I F O 12140 ； A r t h r o b a c t e r g l o b i f o rm i s I FO 12137 ; A r t h r o b a c t e r p a s c e n s I F O 12139 ； B a c i l l u s s p . ; K l u y v e r omy c e s ma r x i a nu s v a r . ma r x i a n u s : S t r e p t omy c e s s p . ; En t e r o b a c t e r s .
これら微生物由来の酵素を使用する場合、 分離精製した酵素のほか、 粗精製酵 素、 微生物培養物、 同処理物 （培養上清、 分離菌体、 菌体破砕物等） も使用可能 である。 なお、 DFA III 結晶を食品用途に使用する場合には、 酵素としてフ ラク トシルトランスフェラーゼ、 特に I FTを使用するのが好適であって、 上記 微生物由来の酵素のほか、 今回、 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物 寄託センターに FERM BP— 8296として国際寄託されたアースロバクタ 一 エスピー AHU 1 753 (Ar t h r o b a c t e r s p. AHU 1753) 株は、 I FT生産能にすぐれているので、 本菌株の酵素は好適に使用 可能である。
例えば、 上記したアースロバクタ一 エスピー AHU 1 753株 （FERM BP— 8296) 由来のィヌリンフラク ト トランスフェラーゼ （デポリメライジ ング） （I FT) の粗酵素、 精製酵素、 酵素含有物等を酵素 5000 u n i t s Zk gィヌリンで、 60°Cで 24時間攪拌しながら作用させて、 加水 '転移さ せて、 DFA III を含有する酵素反応溶液を生成する。 酵素を失活させて、 D FA III 合成液を得る。 また、 化学合成によって DF A III 化学合成液を得 ることもできる。
このようにして得た DFA III 酵素合成又は化学合成液は、 それ単独かある いはそれに DFA III を含有する他の溶液等を混合して DF A III 粗液とす る。 DFA III 粗液は、 次に清浄濾過する。 清浄濾過は、 DFA III 粗液の 活性炭処理及び固液分離処理を指すものである。 活性炭処理は、 DFA III 粗 液に粉末活性炭を少量添加して、 必要あれば加熱及び 又は攪拌して、 DFA III以外の不純物を活性炭に吸着せしめる処理である。
粉末活性炭としては、 平均粒径が 1 5〜 50ミクロン、 好ましくは 25〜 45 ミクロン、 更に好ましくは約 35ミクロン；最大粒径が 200ミクロン以下、 好 ましくは 170ミクロン以下、 更に好ましくは 150ミクロン以下、 例えば 14 7ミクロン以下のものが使用される。 その添加量は、 固形分に対して、 5%以下、 好ましくは 0. 1〜3%、 更に好ましくは 0. 5〜1. 5%とするのが良く、 D FA III粗液の組成に応じて適宜規定する。
固液分離処理としては、 ハイフロスーパーセル （和光純薬製） ゃケイソゥ士濾 過等の濾過助剤を使用する濾過 （例えば、 セラミック濾過機による濾過： 日本ポ ール （株） 製 PR— 12型が使用可能）、 メンブランフィルター （MF) 濾過、 連続遠心分離法、 分子篩法、 逆浸透膜法、 場合によっては限外濾過 （UF) 膜の 少くともひとつが適宜利用される。 固液分離は、 常圧、 加圧、 又は減圧の少くと もいずれかで実施される。
具体的には、 例えば、 I FT酵素失活液に固形分当たり 1%の割合で太閤活性 炭 S (二村化学工業製：平均粒径約 35ミクロン、 147ミクロン以下） を添カロ し 60°C、 10分間攪拌する。 この完了液を珪藻土 （昭和化学工業製ラジオラ イト 700) 濾過を行う。 すなわちセラミック製の筒 （日本ポール （株） 製 PR 一 12型セラミックチューブ） の外面に上記珪藻土をプレコートしておき、 筒外 に活性炭含有反応液を加圧通過させて、 加圧濾過し、 筒内から濾液を回収する。
DFA III含有液 （粗液） の清浄濾過処理によつて得た濾液は、 常法によつ て濃縮する。 例えば、 砂糖等の製造で用いられるカランドリア型濃縮効用缶によ り濃縮 （例えば、 60〜80°C、 1 20mmHg以下） し、 濃縮液を得る。 濃 縮液は、 固形分濃度 60〜85%、 例えば 77%程度に濃縮すればよい。
本発明においては、 上記した DFA III 酵素合成液又は化学合成液から得た DFA III 粗液は清浄'濾過さらに濃縮までの工程の間で、 pHを 5以上に保 持することが好ましい。 例えば、 水酸化ナトリウムを添加して、 pH5以上に調 整すればよい。
上記で得た濃縮液である母液、 つまり粗結晶化母液 （約 60°C) を結晶機に 移し、 DFA III の結晶を冷却又は煎糖方式で生成させ粗結晶を得る。 この場 合、 DFA III 結晶を乳鉢等で粉砕したものをアルコール等に分散させたシー ド （種結晶） を適当量、 適切なタイミングで母液に添加して育晶する。 シード法 には、 フルシーディング法とショックシ一ディング法がある。 フルシーディング 法では、 結晶化母液中又は粗結晶化母液中 DF A III 量に対してシード量が 1%以上にすることで、 DFA III 結晶の粒度分布を小さい方へシフトするこ とができる。 また、 冷却結晶化方法では、 前記両用法のシード温度が低い程、 D FA III 結晶粒度は、 小さくなる。 冷却結晶時の温度勾配は、 最初は小さく、 その後は大きくする方が結晶粒度のバラツキが少ない。 結晶機は、 循環方式及び 又は撹拌方式が付加されたものを用いるのが好ましレ、。
結晶を析出した粗結晶化母液は分離機 （3000 r pm、 1200 G) で DF A III粗結晶と粗結晶シラップに分離する。
DFA III 粗結晶は、 お湯で再溶解して DF A III 精製液とし、 清浄、 濾 過工程を経て、 濃縮し、 粗結晶と同様の方法で結晶化して、 製品結晶を得る。 得 られた結晶は、 無臭であり、 中性域にある無色透明の八面体結晶であり、 融点： 163. 7°C、 旋光度 〔c〕 D : 134. 5であった。
本発明のように、 各工程液の pHを 5以上に維持、 調節した場合では、 上記フ ローにおいて分離された粗結晶シラップ及び 又は結晶シラップを、 所望に応じ て結晶製造系に戻してやり、 循環系とすることで、 さらに DFA III の回収率 の向上を達成することが可能となる。 一方、 各工程液の pHの維持、 調節を行わ ず循環系とすると、 工程液中に単糖 （特にフラクト一ス） や蔗糖といった DFA III 結晶化阻害物質が著しく増加 ·蓄積し、 また結晶化母液の pHが著しく低下 するため、 DF A結晶化工程で結晶化率の低下、 さらに最悪の場合、 結晶化不能 といった状況に陥る。
本発明では、各工程液の p Hを 5以上に維持、調節することにより、 DFA III 結晶化阻害要因である単糖や蔗糖、 あるいは酸性物質 （有機酸など） の生成を抑 制できることを見いだした。 さらに、 アルカリ性剤を添加する方法に加えて、 上 記阻害物質を含む工程液を、 クロマトグラフィー （以下、 クロマトとレ、うことも ある） 分離法やィースト処理をすることで、 上記阻害物質を除去し、 DFA III を精製して結晶化することも可能である。 すなわち、 DFA III 精製結晶化の 全工程 （図 1 ) で生成する各種生成物をクロマト処理原液 （固形分濃度 40〜 75%) として、 これをクロマト処理し、 DFA III を含有する溶液を精製し て結晶化することが可能である。 そのクロマト処理による精製フローの一例を図 2に示す。
クロマト処理原液 （固形分濃度 40〜7 5%) は、 クロマト処理して、 DF A III 画分を分離する。 既述した再溶解液 （DFA III 液） と同様の精製度 を有する DFA III リッチ画分は、 DFA III 精製液として、 これを清浄濾 過、 濃縮、 結晶化することにより製品結晶を製造することができ （ルート A)、 あるいは、これをそのまま結晶化することもできる（ノレート B)。また、 DFA III リッチ画分とは異なり DFA III含量が低い DFA III 非リッチ画分につい ては、 製造フロー （図 1に示すような DFA III 含有液から DF A III 製品 に至る全精製工程） の適宜個所に戻してやればよい （ルート C)。 さらに、 フラ タトオリゴ糖、 フラクトースなどの単糖、 および酸性物質などを含み、 ごく少量 しか DFA III を含まない非 DFA III 画分は、 飼料用原料として使用する か、 又は廃棄する。
クロマト分離法としては、 その分離は固定床方式 （ワンパス方式）、 連続方式 (疑似移動床方式)、 半連続方式 （固定床方式と連続方式の組み合わせ） が適用 できる。 その装置の充填イオン交換樹脂としては、 クロマト用の Na形、 K形、 C a形等の強酸性イオン交換樹脂が使用される。 その樹脂は均一粒径のスチレン ジビュルベンゼン系樹脂等が用いられている。 イオン交換樹脂のメーカーから 種々のクロマト用樹脂が販売されているが、 糖液に適用できるものであればいず れも使用できる。 クロマト処理は結晶母液の DF A III 純度が低い場合、 その 純度を上げるのにも適宜使用される。 イースト処理は、 DFA III 含有液とイーストを接触させればよく、 両者を 混合し、 必要あれば攪拌してインキュベートしてもよいし、 通気しながら培養し てもよい。 イーストとしては、 パン酵母、 清酒酵母、 ビール酵母、 プドウ酒酵母 その他各種の酵母が適宜使用可能であって、 ドライイースト、 圧搾酵母その他各 種の市販品も充分に使用可能である。 イーストによって、 フラタトオリゴ糖、 シ ョ糖、 単糖類が分解されたり菌体内に取り込まれるので、 イースト処理は、 主に フラクトオリゴ糖、 ショ糖及び/又は単糖類を系外に除去するのに有用である。 本発明は、 更に、 DFA III 純度が 60%未満の DFA III 含有液 （結晶 化母液） についても、 工業的に結晶させることができる。
本発明においては、 DF A III 純度が 60%未満の DFA ΠΙ 含有液の精 製度を高めるため、 DFA III 含有液を、 イースト処理、 清浄濾過処理又はク ロマトグラフィー処理の少なくとも一つで処理することにより DFA含有液の D FA III純度を大幅に上昇させることができる。 本発明における主要な用語について、 図 1に示した DFA III 結晶の製造フ ローを参照しながら、 以下に定義する。
(ィヌリン）
ィヌリンとは、 植物由来もしくは酵素合成物由来のィヌリン及びィヌリン含有 液のことをいい、 例えば、 キクイモ、 ゴボウ、 チコリ等の植物抽出液、 及び蔗糖 にィヌリン合成酵素を作用させた合成ィヌリンを含む液、 又はそれらの液を、 清 浄 ·濾過した液を指し、 更に各液を乾固もしくは結晶化させたィヌリン含有粉末 を指す。
DFA III を含有する溶液の原料の 1つとなるィヌリンは、 フラク ト一ス重 合度が 10から 60であってポリサッカライドの固形分当たりの純度が 70%以 上、 好ましくは 80%以上のものを使用することにより、 DFA III が効率的 に生成する。 そして、 その DFA III 含有液を使用し、 DFA III 結晶を製 造すると効率的に製造ができる。
(DFA III酵素合成又は化学合成液）
DFA III 酵素合成又は化学合成液とは、 上記ィヌリンに酵素を反応させて DFA III を含有する溶液を生成し必要に応じて酵素を失活させた溶液又は D FA IIIの化学合成液をいう。
(DFA ΙΠ粗液）
DFA III 粗液とは、 上記 DFA III 酵素合成又は化学合成液それ自体、 結晶化工程 （粗結晶化、 結晶化） で結晶化した母液を固液分離した粗結晶シラッ プ、 結晶シラップ、 クロマト分離処理液 D F A III 画分の少なくとも 1つ以上 からなる液をいうが、 DFA III 酵素合成又は化学合成液に粗結晶シラップ、 結晶シラップ、 クロマト分離処理液、 クロマト分離で得られた D F A I II 画分 の少なくともひとつを混合してなる液も指すものである。
(粗結晶化母液）
粗結晶化母液とは、 上記 DFA III 粗液を必要があれば活性炭、 イオン交換 樹脂、 クロマトグラフィー、 イースト等の清浄処理を行い、 その後濾過等の固液 分離（即ち、清浄 '濾過）により希薄液を得る。この希薄液あるいは上記 D F A III 粗液を効用缶等の濃縮装置で適宜濃度に濃縮したものをいう。
(DFA III精製液）
DFA III 精製液とは、 粗結晶化で得た粗結晶を適切な濃度に水 （湯） で溶 解した溶解液もしくはクロマト分離で得られた D F A III 画分の少なくとも 1 つからなる溶液のことをいう。
(結晶化母液）
結晶化母液とは、 上記 DFA III 精製液を必要があれば活性炭、 イオン交換 樹脂、 イースト等の清浄処理を行い、 その後濾過等の固液分離 （即ち、 清浄'濾 過） により希薄液を得る。 この希薄液、 あるいは上記 DF A III 精製液、 結晶 シラップ、 D F A III 画分の少なくとも 1つを効用缶等の濃縮装置で適宜濃度 に濃縮したものをいう。
このように、 DFA III を含有する粗結晶化母液、 結晶化母液とは、 DFA III の結晶化のために、 冷却方式及び Z又は蒸発方式等の結晶機等に専ら供給さ れる DFA IIIを含有する溶液である。
(DFA IIIの精製 ·結晶化工程）
DFA ΠΙ の精製.結晶化工程とは、 DFA III 粗液から粗結晶化を経て 製品結晶化に至る、 すべての DFA III を含有する溶液を清浄'濾過の後、 濃 縮して結晶化するまでの工程をいう。
(DFA IIIを含有する溶液）
DFA III を含有する溶液とは、 DFA III 結晶製造フローにおいて生成 し、 DFA III を含有する溶液のすべてをいい、 例えば、 DFA III 粗液、 粗結晶化母液、 結晶化母液、 粗結晶シラップ、 結晶シラップ、 DFA III 精製 液、クロマト分離処理液、クロマト分離で得られた D FA III画分（DFA III クロマト画分） の少なくともひとつを包含するものである。 本発明を実施するには、 DFA III を含有する溶液の PHを 5以上としなけ ればならない。 DFA III の結晶化を行っていくと、 pHが低下して結晶化率 が低下することを本発明者らがはじめて見出したものである。 p Hは 5以上であ ればよレ、が、 好適域は 5〜8、 更に好ましくは 6〜 8である。 これ以上高い pH ももちろん可能であるが、 pHの調整に使用する苛性ソーダ、 苛性カリといった アルカリの量が多くなり、 無駄となってコストも高くなるし、 作業安全性の面で も問題がでてくる。
DFA III を含有する溶液としては、 上記に定義したものの少なくともひと つ、好適にはそのすべてについて、 pHが 5以上であることが必要である。 また、 DFA II I の精製 ·結晶化工程を包含する DF A III 結晶の製造工程におけ る移送パイプ内における pHも 5以上であると更に好適である。
以上述べたように、 本発明においては、 DFA III 結晶化率を高めるには、 DFA III を含有する溶液の pHが 5以上であることが必須であるが、 更に研 究の結果、 全く予期せざることに、 蔗糖及びフラクトースの存在が DFA III の結晶化率を低下させることをはじめて見出し、 結晶化母液のフラクトースが固 形分当たり 5%以下、 好ましくは 1%以下含有することにより、 DFA III の 結晶化率が高まることを見出した。 そして、 更に、 このような糖の抑制も pHを 5以上にすることで達成されることもはじめて確認した。 DFA III を含有す る液の pHが 5以上であり、 かつ、 粗結晶化母液、 結晶化母液のフラク トースの 固形分当りの含量が 5 %以下の条件を同時に満す場合に、 最大の D F A III 結 晶化が相乗的に高まることが判明する。 発明の効果
DFA III を含有する溶液の pHが 5以上であること、 粗結晶化母液、 結晶 化母液のフラク トースが 5重量0 /0以下に含有することにより、 DFA III をェ 業的に、 効率良く結晶化させて製造することができる。 以下、 本発明を実施例により更に詳しく説明するが、 本発明は実施例のみに限 定されるものではない。 実施例 1
テストプラントを使い、 図 1に示したフローの一部にしたがって、 循環方式に より DFA III結晶製造試験を行った。
尚、 本試験で使用する DF A III を含有する液の糖類の値は、 高速液体クロ マトグラフィ一による組成分析値を使用したものである。
(1) 酵素反応工程
1日処理量として市販ィヌリン （オラフティー社、 商品名ラフィテリン HP) 100 k gの溶解液に A r t h r o b a c t e r s p. AHU 1753株培養 酵素液 （酵素力価約 50万 U) を添加し、 60°C12時間反応させ、 DFA III 酵素合成液を得た。
(2) 脱色、 清浄工程
DFA III 酵素合成液に脱色処理として固形分あたり 0. 5%の活性炭 （二 村化学、 商品名 太閤活性炭 KW50) を添加し、 80°Cで 30分インキュべ ートした後、 珪藻土濾過した。
(3) 粗結晶化工程
DFA III 酵素合成液の脱色液を固形分濃度 76%に濃縮したものを粗結晶 化母液として、 それに 50 °Cで種結晶 （シード） を添加し、 1 2時間かけて 1 0°Cまで冷却し DFA III 粗結晶を生成させた。 この粗結晶母液 （粗結晶マス キットともいう） を遠心分離し、 粗結晶と粗結晶シラップに分離した。
(4) 精製結晶化工程
粗結晶を再溶解し、 固形分濃度 75%まで濃縮したものを結晶化母液として、 それに 50°Cで種結晶を添加し、 1 2時間かけて 10°Cまで冷却し結晶を生成 させた。 この結晶マスキットを遠心分離し、 結晶と結晶シラップに分離した。
(5) 循環工程
DFA III 回収率を高めるために、 粗結晶シラップの 5割を酵素反応終了液 に混合し、 残りは飼料用原料に供した。 また結晶シラップの 5割は、 粗結晶化工 程の濃縮缶に戻し、 残りの 5割は結晶化工程の濃縮缶に戻した。
(6) 結晶化率の算出
本実施例の粗結晶及び結晶の結晶化率の算出は、 下記の式によつた。
結晶化率 （％) = (P/Q) 100
式中、 各記号は以下のことを表す。
P ： M-N
Q： (100— N) M/100
M： (粗） 結晶化母液の D F A ΙΠ純度
N： (粗） 結晶シラップの DF A III純度
(7) 製造試験
上記 （1) 〜 （5) の工程に従い製造作業を行レ、、 試験開始 4日目より粗結晶 化工程を、 試験 7日目より結晶化工程を開始した。 粗結晶化工程の概要 （母液組 成および結晶化率） を図 3に示した。 粗結晶化率は試験 10 S目より低下しはじ め、 13 S目には 30%以下となったため、 粗結晶シラップの戻しを 5割から 3 割に減じた。 しかしながら、結晶化率はその後も低下し続け、 17日目には 10% を下回るようになった。 粗結晶化母液の D F A III 純度は、 試験期間中 80 % 弱で推移し、 大きな変動はなかった。 一方、 不純物組成は、 試験の経過とともに フラタトオリゴ糖が減少し、その分解物と思われるフラク トースが増加していた。 また粗結晶化母液の pHは、 開始時の 5. 1から徐々に低下し、 4前後まで低下 していた。 次に精製結晶工程の概要を図 4に示した。 期間中の糖組成に大きな変 化は認められなかったが、 結晶化率は試験期間中、 漸減した。 また結晶化母液の pHも開始時 4. 8であったが、 4前後まで徐々に低下していった。 実施例 2
実施例 1から、 循環方式で DFA III を製造すると結晶化率が徐々に低下す ることが明らかとなった。 この時、 結晶化母液 pHが低下し、 フラク トオリゴ糖 の分解も進んで 、たことから、 結晶化率の低下と何らかの関係があることが示唆 された。 そこで本実施例の製造試験では、 酵素反応終了液、 粗結晶化母液 （濃縮 前の液） および粗結晶再溶解液に苛性ソーダを添カ卩し、 各工程汁の pH低下の防 止を図った。 それ以外は実施例 1と同様の方法で行った。
粗結晶化工程、 結晶化工程の概要を図 5、 6に示した。 苛性ソーダの添加によ り各結晶化母液の pHは、 各々 5. 1〜5. 6、 5. 4〜5. 7の範囲で推移し、 フラクトオリゴ糖の分解も抑制されていた。 また各結晶化率も高水準で維持する ことができた。 実施例 3
DFA III 自体は、 他の糖類に比べて熱、 酸に強い物質である。 図 1に示す ような DFA III の工業的な製造法において、 製造工程液の p Hが低いと、 D FA III 以外の不純物が分解して、 他の物質が生じ、 また、 結晶化に使用され る DFA III 含有液は、 循環して使用されるため pHが益々低下するのみなら ず、 DFA III 以外の他の物質が蓄積すると考えられる。 実際に実施例 1の試 験製造では、 工程液の pHが徐々に低下し、 フラクトオリゴ糖の割合が低下しフ ラク トースが蓄積することが確認された。
そこで、 本発明者らは、 pH (3〜7) と熱 （70、 80°C) によって、 実 施例 1で調製した酵素反応終了液の糖組成がどのように変化するか、 テーブル試 験を実施した。 その結果、 70°C、 pH5以上の条件下では、 24時間経過迄 含有糖類の組成変化はほとんど認められなかったが、 p H 4にすると 8時間経過 時点で 4糖類以上の糖類の分解とフラク トースの増加が見られ、 pH3でさらに その傾向が強まった。 また、 70°Cで観察された各 pH条件における上記の糖 組成の変化は、 80°Cにするとさらに加速された。 80°Cでは、 pH5以上の 条件でも、 1 2時間経過迄は 70°Cと同様にほとんど変化がなかったが、 24 時間経過時点では、 4糖類以上の糖類の分解とフラク トースの増加傾向が見られ た。
さらに、 本発明者らは、 実施例 1で P H 4にまで低下した粗結晶化母液の酸性 物質を調べたところ、 有機酸 （乳酸や酢酸、 蟻酸等） が 30〜40mgZl 00 g試料の濃度で含有していることが分かった。 さらにテーブル試験で、 フラク ト ース水溶液を 80°C環境下で長時間放置すると、 徐々に有機酸が増加し、 pH が低下することが分かった。
そこで実施例 1〜 3の分析値の結果から、変動の大きかったフラクトオリゴ糖、 有機酸、 フラク トース、 蔗糖、 pHが結晶化率にどのように影響するか、 さらに 実施例 4〜 7にてテーブル試験を行った。 なお、 実施例 4〜 7で使用する結晶化 率の算出は下記の式によつた。 結晶化率 （％) =A/BX 100
式中の各記号は以下のことを表す。
A：結晶化によって得られた DF A ΙΠ結晶重量 （g)
B ：結晶化母液中の D FA III含量 （g)
実施例 4
(純度 99. 9%DFA III の水溶液にスクロース、 フラクトース溶液を添加 したときの結晶化率）
固形分濃度 71%に調製した13 八 III 溶液 300 gに固形分濃度 71 %の スクロース溶液又は固形分濃度 71 %のフラク トース溶液をそれぞれ 3 g、 15 g、 30 g (固形分当たりのスクロース （フラタ トース） 量として、 1. 0、 4. 8、 9. 1%) 添加し、 無添加のものと併せて結晶化を行った。 尚、 この時の育 晶温度は 10°Cまでとした。 また、 スクロース （フラク トース） 溶液を 30 g 添加した試験では 50 °Cでシード時にシードした結晶が溶解したため、 45 °C で再びシードを行なった。 その試験結果を図 7に示した。 結晶化に用いる母液の 固形分濃度及び DF A III の量を統一し、 スクロース、 フラク トースの添加量 を増加させて生成する結晶の量を測定した結果、 両者とも添加量の増加に伴い D FA . IIIの結晶生成量は減少した。 実施例 5
(DFA III含有液に混在する不純物が結晶生成に与える影響）
(1) 母液の固形分濃度及び DF A III の量を統一して試験を行なった結果、 スクロース、 フラクトースの添加量の増加に伴い DFA III の結晶生成量は減 少したが、 この結果は単に DFA III の純度が低下したため起こったこととも 考えられたため、 次に混在する不純物の違いが結晶生成に与える影響について試 験を行なった。
固形分濃度 7 1。/。に調製した D F A III 溶液 300 gに固形分濃度 71 %の フラクトオリゴ糖 （明治製菓製メイオリゴ P ： 4糖類、 3糖類、 2糖類、 フラク トース含量がそれぞれ固形分当たり 65. 2%、 32. 8%、 1. 2%、 0. 8% の混合物） 溶液、 スクロース溶液、 フラク トース溶液をそれぞれ 30 g (固形分 あたり 9. 1%) 添加し、 無添加のものと併せて結晶化を行った。 尚この時の育 晶温度は 10°Cまでとし、 シード温度は 45°Cとした。 その試験結果を図 8に 示した。
図 8より、 不純物としてフラクトオリゴ糖のみが存在する場合に比べ、 フラク トオリゴ糖をスクロース、フラクトースに置き換えた場合は生成する DF A III 結晶の量が少なく、 同じ D F A III 純度でもフラクトオリゴ糖が分解してスク ロース、 フラク トースが生成すると DFA III の結晶化が抑制されるという結 果が確認された。
(2) DFA III溶液に混在する不純物組成が結晶生成に与える影響
次に、 スクロース、 フラクトースが単独で存在する場合と両者が混在する場合 の影響につ!/、て調査を行なつた。
固形分濃度 7 1 %に調製した D F A III 溶液 300 gに固形分濃度 71 %の スクロ—ス溶液、 フラタトース溶液をそれぞれ 30 g (固形分あたり 9. 1 %) 添加したもの及びスクロース溶液 15 gとフラク トース溶液 15 g (スクロース とフラクトースの合計で固形分当たり 9. 1%) を同時に添加したものを無添カロ のものと併せて結晶化を行った。 尚、 この時の育晶温度は 10°Cまでとし、 シ 一ド温度は 45°Cとした。 その試験結果を図 9に示した。
図 9より、 DFA III 純度は同じでも、 スクロースとフラク トースを半量ず つ添カ卩したときょり、 単独で添加した時の方が阻害の度合いが高いという結果と なった。 そのため、 DFA III の結晶化は不純物として存在するスクロース、 フラクトースの内、 どちら力含量が多い方に影響されると考えられた。 伹し、 実 際の製造現場では生成するスクロースの量がブラクトースの量を上回ることはな いため、 結晶生成量はフラクトースの量に影響されると思われる。
以上より、 不純物としてフラクトオリゴ糖のみが存在する場合に比べ、 スクロ ース、 フラクトースが存在する場合は生成する DF A III 結晶の量が少なく、 その度合いは存在するスクロース、 フラクトースの内、 どちら力含量が多い方に 影響されると考えられた。 しかし、 同じ不純物純度でも DF A III 溶液にスク ロース、 フラクトースを固形物で添加したときは結晶の生成量が無添加のものよ りも多いことから、 スクロース、 フラクトースが存在しても、 その分、 母液の濃 度を上げると、 両者が存在しない時並に結晶の回収ができると考えられた。
(3) DFA ΙΠ溶液に混在する不純物組成が結晶生成に与える影響
次に、 工程汁分析でその存在が確認された有機酸の影響について調査を行なつ た。 工程汁中に存在の確認された有機酸は、 乳酸、 酢酸、 蟻酸、 その他 （複数の 未知ピーク） であったが、 ここではフラクトースの熱分解で生成する酢酸、 蟻酸 について試験を行なった。 工程汁の分析結果より D F A III 粗液の清浄 ·濾過 した液の濃縮液中に検出された各有機酸含量は 30〜4 OmgZl O O gサンプ ル程度であるため、 有機酸塩の添力卩量はそれぞれ 0〜1 O OmgZl O O g D
FA III溶液とした。
固形分濃度 71%に調製した13?八 III 溶液 300 gに酢酸ナトリゥムと蟻 酸ナトリゥムの溶液をそれぞれの含量が 10mg+ 10mg、 50 m g + 50 m g、 10 Omg + 10 OmgZl 00 g DFA III溶液となるように添加し、 無添加のものも含め濃度が同じとなるように純水で固形分濃度を調整後 （最終固 形分濃度 70. 3%)、 結晶化を行った。 尚、 この時の育晶温度は 10°Cまでと し、 シード温度は 50 °Cとした。 その試験結果を図 10に示した。 図 10より、 結晶生成量に多少の変動はあるものの、 有機酸塩は DFA III の結晶化を阻害していないと考えられた。 伹しこの時、 無添加のものと酢酸ナト リゥムと蟻酸ナトリゥムをそれぞれ 1 Omgノ 100 gとなるように添加したも のでは固形分濃度が 70. 3%とこれまでの試験より多少薄かったせいもあり、 シード直後の結晶生成が遅かったのに比べ、 それぞれを 50mg l O O gとな るように添カ卩したものと 10 Omg/100 gになるように添カ卩したものではシ 一ド直後の結晶生成が速レ、という現象が見られた。 この差は何に起因するのか考 察したところ、 試験に用いた酢酸ナトリゥムと蟻酸ナトリゥム混液の pHが 8. 6と高く、 そのため、 後者ではそれを添加後の母液の pHが 7前後になっていた とレ、うことが原因ではないかと考えられた。そこで、製造工程で有機酸が生成し、 工程汁の pHが変わると DFA III の結晶生成に何らかの影響を与えるのでは ないかと考えた。 実施例 6
(DFA IIIの結晶化に与える pHの影響について）
(1) 結晶化に用いる母液の pHが DF A III の結晶生成に与える影響を確認 するため、 有機酸塩 （酢酸ナトリウムと蟻酸ナトリウム） が存在する状態で pH を変動させた時の結晶生成量の変化を調査した。
固形分濃度 73%に調製した13?八 III 溶液 300 gに酢酸ナトリゥムと蟻 酸ナトリウムの溶液を 100mg+ 10 OmgZl 00 g DFA III 溶液と なるように添カ卩し、 5 N塩酸で pHをそれぞれ 7、 5、 4、 3に調整後、 純水で 固形分濃度を 71%に調製し、 結晶化を行った。 尚、 この時の育晶温度は 25°C までとし、 シード温度は 50°Cとした。 その試験結果を図 1 1に示した。
図 1 1より、 生成する結晶量は pHにより影響を受け、 pH7が一番結晶の生 成量が多く、 pH4で極小値となり、 pH3と pH5が同程度の結晶生成量であ るという結果が得られた。
(2) 次に、 この現象が pHのみに依存するもので、 有機酸塩の存在なしでも起 こるものかを検証するため、 DFA III溶液を塩酸と苛性ソーダで pH調製し、 生成する結晶の量が変化する力試験を行なった。 固形分濃度を 71. 5%に調製 した D F A III溶液 300 gを 1 N塩酸及び 1 N奇性ソーダで p H 7、 5、 4、 3に調製後純水を加えて固形分濃度を 71%に調製し、 結晶化を行った。 尚、 こ の時の育晶温度は 25°Cまでとし、 シード温度は 50°Cとした。 その試験結果 を図 12に示した。
試験結果は有機酸塩の存在時と多少異なり、 p H 5での結晶生成量が少ないが、 pH7が一番結晶の生成量が多く、 P H 4に極小値があることは同じであった。 更にこの結果が無機塩の濃度の違いによるものではないことを確認するため、 1%の食塩存在下で同様に pH調整をし、 結晶化を行ったが、 結果は有機酸塩の 存在下で pH調整をして結晶化したときと同じ傾向であった。 このことから、 塩 類の存在により p H 5での結晶化阻害作用は緩和されると考えられた。
(3) そこで、 実工程の粗結晶母液を用い、 以上のことを検証した。
採取した粗結晶母液 （DFA III 固形分純度 75. 9%) に析出していた結 晶を完全に溶解後、 固形分濃度 76 %程度まで濃縮し、 5 N塩酸又は 5 N苛性ソ ーダを用いて PHを 7、 5、 4、 3に調製後、純水を加えて固形分濃度を 75 (又 は 73) %に調製し、 結晶化を行った。 尚、 この時の育晶温度は固形分濃度を 7 5%とした時は 25°Cまで、 固形分濃度を 73%とした時は 10°Cまでとし、 シード温度は 50 °C (固形分濃度 75%).又は 45 °C (固形分濃度 73%) と した。 その試験結果を図 1 3に示した。 いずれの固形分濃度においても、 pH4 で D F A III結晶化率が最も低下することが分かった。 実施例 7
((粗） 結晶化母液 pHと過飽和度が DF A IIIに与える影響）
DFA III 結晶化阻害要因である pH変化に対して、 DFA III 結晶化母 液の最適な濃縮度を決定するための検討を行つた。
これに先立ち、図 14に示すように、各温度における DF A IIIの溶解度（飽 和固形分濃度％)を調査し、その実測値より次式で表される溶解度曲線近似式（相 関係数 R 2= 0. 999) を新たに算出した。 溶解度 （飽和固形分濃度％) Ζ = _0· 00058 Χ2+ 0. 39 Χ+48.
8
ただし X ：温度 (°C)
次に、 DFA III 結晶化母液の結晶化に必要な濃縮度を表す数値として、 冷 却結晶化終点温度 X°Cの DFA III 溶解度に対する純度 P%の DFA III 結 晶化母液の過飽和度 Sを次式のように定義した。 過飽和度 S= [YX P/ (1 00-Y)] / [Z/ (1 00-Z) X 1 00] ただし Y： D F A III結晶化母液の固形分濃度 （％)
P ： DFAIII結晶化母液の D FAIII固形分純度 （％)
Z ：溶解度 （X：冷却結晶化終点温度。 C) 次に、 ここで定義した過飽和度 Sが DF A III結晶化に与える影響について、 実際の DFA III 工程汁を使い、 結晶化阻害要因である結晶母液 pHを変えて テーブル試験を行った。 pH調整は、 DF A III工程汁に 5N HC 1または、 5N N a OHを添カ卩して行った。 これらを様々な濃度に濃縮した後、 得らえた 各濃縮液を結晶化母液として 50°Cでシードし、 1 0°Cまで冷却して育晶した。 過飽和度 Sは上記式に従い、 冷却結晶化終点温度 10°Cとして算出した。
結晶母液 pHと過飽和度 Sの関係について、 結果を表 1に示す。 結晶化母液 p H5〜7の時、 過飽和度 Sが 4. 4以上条件では、 いずれの純度の DF A III 含有結晶化母液においても、 マスキッ トの流動性が著しく低下し、 分蜜作業が困 難と判断された。 一方、 過飽和度 Sが 4. 1以下の条件では、 マスキットは適度 に流動性があり、 分蜜作業は支障なく実施可能であった。 従って、 結晶化母液 Hが 5以上である DFA III の工業的な結晶製造条件は、 結晶化終点温度を基 準とする過飽和度 Sが 4. 1以下であることが分かった。 過飽和度 Sが 1. 3未 満では結晶化率が 20 %以下となることから、 好ましくは、 結晶化率の観点から 過飽和度 Sは 1. 3以上 4. 1以下、 さらに好ましくは 1. 5以上 4. 1以下、 またさらに好ましくは、 2. 3以上 4. 1以下が良いことが分かった。 (表 1)
各種 D FA III含有液の p Hと過飽和度 Sが結晶化率に及ぼす影響 DFA III含有液 Aの冷却結晶化率 （％) 結晶化母液 pH 過飽和度 S 5 6 7
1. 3 21. 0 21. 6 21. 9
1. 5 29. 4 31. 0 31. 4
1. 6 36. 0 36. 8 37. 0
2. 3 53. 1 55. 3 56. 1
4. 1 67. 1 68. 5 68. 8
4. 7 X X X
DFA III含有液 Bの冷却結晶化率 （％) 結晶化母液 pH 過飽和度 S 5 6 7
1. 3 20. 6 21. 1 21. 3
1 · 5 31. 2 32. 4 32. 6
1. 6 36. 1 36. 8 38. 1
2. 3 53. 3 54. 2 54. 7
4. 1 65. 0 65. 1 65. 4
4. 7 X X X A液の固形分組成： D F A III 99. 5 %、 灰分 0. 1 %、 フラク トオリゴ 糖 0. 4%
B液の固形分組成： DFA III79. 7%、 灰分 0. 3%、 フラク トオリゴ 糖 18. 3%、 蔗糖 0. 2%、 フラク トース 1. 0%
表中 Xは、 マスキッ トの流動性低下により、 分蜜作業が困難であることを示 す。 寄託番号： FERM BP— 8296
寄託の表示： Ar t h r o b a c t e r s p. AHU 1753
寄託機関の名称：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 寄託機関のあて名 ： 〒 305— 8566 日本国茨城県つくば巿
東 1丁目 1番地 1 中央第 6 寄託のョ付：平成 15年 （2003) 2月 18日

Claims

請 求 の 範 囲
1. ジフラクトース ジアンヒ ドリ ド III (DF A ΙΠ) を含有する溶液 の pHが 5以上であることを特徴とする、 ジフラク トース ジアンヒドリ ド III
(DFA III) 結晶の製造方法。
2. DFA III を含有する溶液の p Hをアルカリ剤の添加法、 クロマトグ ラフィ一法、 ァ-オン交換樹脂法の少なくともひとつで調整 '維持すること、 を 特徴とする請求項 1記載の DF A III結晶の製造方法。
3. DFA III を含有する溶液が、 ィヌリンにフラクトシルトランスフエ ラーゼを作用させ、 得られた液を清浄 ·濾過した溶液であることを特徴とする、 請求項 1及び 2記載の DF A III結晶の製造方法。
4. ィヌリンのフラク トース重合度が 10から 60であってポリサッカライ ドの固形分純度が 7◦%以上であることを特徴とする、 請求項 3記載の DF A III結晶の製造方法。
5. DFA III 粗液から粗結晶化を経て製品結晶化に至る、 DFA III を含有する溶液を清浄 '濾過した後、 濃縮して結晶化するまでの工程 （精製 ·結 晶化工程） において、 少なくともひとつの DFA III を含有する溶液の pHが 5以上であること、 を特徴とする請求項 1〜4のいずれか 1 項に記載の DFA III結晶の製造方法。
6. 精製 ·結晶化工程を循環系で行うこと、 を特徴とする請求項 5に記載の DFA I II結晶の製造方法。
7. 結晶化母液又は粗結晶化母液の冷却結晶化における終点温度での溶解度 に対する過飽和度が 1. 3〜4. 1であることを特徴とする、 請求項 1〜6のい ずれか 1項に記載の DF A III結晶の製造方法。
8. DFA III 含有の結晶化母液又は粗結晶化母液のフラクトース含量が 固形分重量当たり 5%以下であること、 を特徴とする DFA III 結晶の製造方 法。
9. フラク ト一ス含量が固形分重量当たり 5%以下にする方法として、 フラ クトオリゴ糖及び/又はフラク トースをクロマトグラフィ一法、 ィ一スト処理法 のいずれかひとつ以上を用レ、て除去すること、 を特徴とする請求項 8記載の D F A III結晶の製造方法。
10. 請求項 1〜 9のいずれか 1 項に記載の方法で製造された DF A III の! ¾日曰 0
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