ジフラク トース ジアンヒドリ ド III結晶の製造方法
技術分野
本発明は、 ジフラク トース ジアンヒドリ ド III (D i f r u c t o s e d i a nhy d r i d e III)明 (以下、 DF A III ともいう) 結晶を効率的に製 造する方法に関する。 本発明は、 循環式による DF A III の製造においても、 その結晶化率を低下させることがなく、 DFA III の工業的製造方法としても 非常にすぐれている。 書
背景技術
DFA III は、 カルシウムを始めとしてミネラル吸収促進や利尿効果、 便通 改善効果を有する機能性オリゴ糖で、 2個のフラクトースの還元末端が、 互いに —方の還元末端以外の水酸基に結合した環状二糖類であって (d i— D— f r u c t o f u r a n o s e— 2 , 1 : 2, 3 — d i a n h y d r i d e)、 水 への溶解度が高く蔗糖の 90〜 95 %を示すが、 その甘味度は蔗糖の 52 %程度 である。 また、 熱や酸に強い物質である。
DFA III の製造法としては、 ィヌリン及び Z又はィヌリン含有植物抽出液 にアースロバクタ一■ ウレァファシエンスに属する細菌またはその産生する酵素 を作用させて DFA III の含有液を作成して、 その DF A III 含有液を活性 炭カラムに通液して DFA III を吸着させた後、 エタノールで溶離して DFA III の多い画分を回収し、 蒸発乾固する DF A III の製造方法が提案されてい る (例えば、 特許文献 1参照)。
また、 ィヌリン及び Z又はィヌリン含有植物抽出液を、 固定化素材に固定化し たィヌリンフラク トトランスフェラーゼを充填したカラムに通液して、 DFA III 含有液を産生し、 その含有液を、 イオン交換樹脂、 活性炭等の精製工程を経 て、 DFA III含有シラップ又は蒸発乾固物を生成する DF A III の製造方 法が提案されている (例えば、 特許文献 2参照)。
また、 ィヌリンにィヌラ一ゼ II を作用させることにより、 高純度の DFA III を工業的に生産することが可能である旨が記載されている (例えば、 特許文 献 3参照)。
しかしながら、 これらの文献には、 いずれも結晶化 DF A III を得ることに ついては全く記載されておらず、 ましてや DFA III 結晶を効率的に工業生産 することなど報告例はなく全く未知である。 特許文献 1
特公昭 56— 26400号公報
特許文献 2
特開平 1— 285 1 95号公報
特許文献 3
特開平 1 1— 43438号公報 発明が解決しようとする課題
近年、 DFA III について有用な用途が開発されるに伴い、 DFA III の 需要が高まってきている。 そして医薬用途に使用する場合はもちろんのこと飲食 品用途に使用する場合においても、 DFA III 以外の糖及び各種不純物を除去 した高純度 DF A III 結晶が要望されており、 特に、 DFA III を含有する 液からより効率的に DF A III の結晶を得る方法、 及び結晶化 DF A III の 工業的製造方法の確立が要望されている。 課題を解決するための手段
本発明は、 上記した技術の現状に鑑み、 DFA III 結晶を製造する方法、 特 に工業的に効率よく製造する方法を開発する目的でなされたものである。
そこで本発明者らは、 DFA III を含有する溶液を清浄 '濾過した後、 これ を濃縮し、 粗結晶化して粗結晶シラップを分離し、 得られた粗結晶を溶解し、 こ れを清浄 '濾過した後、 濃縮し、 結晶化して結晶シラップを分離して製品結晶を 製造する方法を開発し、 そして更に、 効率化、 工業化のために、 上記において分
離した粗結晶シラップ及びノ又は結晶シラップを結晶化工程に再度戻してやり、 循環系を構築して連続的に DF A III の結晶の製造を実施したところ、 DFA III の結晶化率が時間の経過とともに低下していき、 DFA III 結晶の製造が 困難になること、 特にその工業生産は実質的にできなくなるという極めて重大な 欠点にはじめて遭遇した。 本発明者らは、この新しく発見された重大な欠点を解決するために DF A III の結晶化率低下の原因について各方面から徹底的に検討を行った。
DFA III を含有する溶液には、 DFA III 以外の物質が含まれている。 それらは、 チコリ等の植物からィヌリンを抽出する際、 チコリ由来の物質であつ たり、 砂糖から酵素合成でィヌリンを生成する際に合成される物質由来であった り、 ィヌリンから DF A III を酵素反応する際ィヌリンの酵素分解物質等が考 えられる。 また、 DFA III 含有溶液が結晶 DF A III を製造する過程で溶 液の滞留が長くなり、 また、 溶液の濃縮過程で高温等の過酷な条件に長時間曝さ れるので、 これらの条件で、 DFA III 含有溶液の組成が変質することにより 新たな他の物質が生ずることも考えられる。 以上のような種々の物質が、 DFA III の結晶化に影響を与えることが考えられる。 また、 DFA III の精製 '結 晶化工程で DF A III 含有液の循環があるため、 上記で生成した DF A III 以外の新たな物質が蓄積する。
DFA III の原料の 1つとなるィヌリンは、 グノレコース一個にフラクトース が多数連なった多糖類であり、 このィヌリンに分解転移酵素を作用させた場合、 DFA III を主成分として生成し、 その他の副産物質として、 4糖類 (G-F -F-F) や 5糖類 (G-F-F-F-F) のフラク トオリゴ糖を生成する。 こ れらの 4糖類、 5糖類は、 熱等に弱く、 濃縮等の高温下での工程で変化して更に 分子量の小さい糖や、 最終的には有機酸等に分解する。 そして結果的に DF A III 含有液の pHが下がり、 特に製造工程を循環系としたときでは、 その分解が DFA III清浄 ·結晶化工程でさらに加速されることを突きとめた。
また、 ィヌリンから DF A III を生成する酵素反応工程は、 60°C前後の比
較的温和な温度条件下で行われるが、 酵素反応初期の pHは中性域 (6〜7) で あるものの、 反応終了時点の pHは4台まで低下することが分かった。 したがつ て、 酵素反応法によって得られる DF A III 酵素合成液の pHは、 通常 5以下 となっており、 その後の DFA III 結晶化に至る工程で、 4糖類、 5糖類が分 解する原因の一つとなることが分った。
すなわち、 DFA III の結晶化工程へと進むときには、 DFA III 以外の 物質としては、 糖類由来のものが多く、 単糖であるグルコース、 フラク トース、 二糖類である蔗糖、 3糖類、 4糖類以上 (フラタトオリゴ糖) の物質、 有機酸等 が混在することになる。 また、 DFA III は、 前述した通り熱や酸分解を起こ しづらい物質である。
これらのことに鑑み、 本発明者等は、 DFA II I含有溶液中の種々の物質が、 DFA III 結晶を製造する際に影響する事項について、 鋭意調査検討した。 そ の結果、 驚くべきことに、 DF A III を含有する溶液の pH、 加えて混在する 糖類、 特にフラク トースゃ蔗糖が DFA III の結晶化に特に影響することをは じめて見出した。 ·
そこで、 本発明者らは、 本発明者らがはじめて見出した上記 DF A III の結 晶化に特に影響するフ了クタ一について、 各方面から鋭意研究を行った。
すなわち、 本発明者等は、 DFA III 以外の上記物質に着目し、 種々検討の 結果、 DFA III 清浄 ·濃縮 '結晶化工程に於ける DF A III を含有する総 ての溶液の pH (ガラス電極法) が 5以上、 好ましくは pH5〜8、 更に好まし くは p H 6〜 8に維持及び 又は調整することにより、 D F A III 結晶化の一 連の工程で分解し易い物質の分解を抑制し、 他の物質への変化を最小限に食い止 めることが判った。 また、 (粗) 結晶母液の pHが 5以上、 好ましくは pH6〜 8で DFA III を結晶化することにより、 結晶化率が低下せず維持上昇するこ とを新たに見出した。
結晶化母液の pHによって、 糖の結晶化率が変化することは、 DFA III の みならず他の糖類でも知られておらず、 全く新規の知見である。
DFA III製造における各工程液の pHを上記範囲で維持、 調節する方法と しては、 可能な限り 70 °C以下で工程液を管理することが効果的であり、 また
アルカリ剤を添加して積極的に pH調節することが可能である。 用いられるァノレ カリ剤としては、例として水酸化ナトリウム(苛性ソーダ)や水酸化力リゥム(苛 性カリ)、 炭酸ナトリウム (ソーダ灰) 等がある。 また、 クロマトグラフィーに より、 工程液中の有機酸等の酸性物質および D F A III以外の糖類を同時に除 去することで、 工程液の DFA IIIの純度アップと pH低下防止を同時に達成 することが可能である。
また、 上記以外の方法として、 酸性物質を含む DFA III含有液をァニオン 交換樹脂に通液することで、 酸性物質がイオン交換により吸着し、 酸性物質を除 去することが可能である。
また、 DFA IIIを含有する結晶化母液中に含まれるフラク トース、 蔗糖が 特に DFA IIIの結晶化の阻害要因となることを新たに見出した。 フラクトー スの含有量が、 結晶化母液の固形分当たり 5%以下、 好ましくは 1%以下である ことが D F A IIIの結晶化をするにあたり結晶化率を高めることが判明した。 更に、 結晶化母液 pH5〜7の時、 結晶化終点温度の溶解度に対する過飽和度 (本発明では過飽和度 Sと称する) が 4. 4以上の条件では、 いずれの純度の D FA III含有結晶化母液においても、 マスキットの流動性が著しく低下し、 分 蜜作業が困難と判断された。 一方、 過飽和度 Sが 4. 1以下の条件では、 マスキ ットは適度に流動性があり、 分蜜作業は支障なく実施可能であった。 従って、 結 晶化母液 pHが 5以上である DF A III の工業的な結晶製造条件は、 結晶化終 点温度を基準とする過飽和度 Sが 4. 1以下であることが分かった。 過飽和度 S が 1. 3未満では結晶化率が 20 %以下となることから、 好ましくは、 結晶化率 の観点から過飽和度 Sは 1. 3以上 4. 1以下、 さらに好ましくは 1. 5以上 4. 1以下、 またさらに好ましくは、 2. 3以上 4. 1以下が良いことが分かった。 なお、 本発明で用いる 「固形分濃度」 とは、 乾燥法により溶液中の水分を除去 した後に残存する固形分の重量より算出される溶液中の固形分比率 (w/w%) であり、 実際の製造工程管理では、 簡便法として R_Bx (R e f r a c t om e t r i c B r i x De g r e e) のィ直も代用できる。
本発明は、 これらの有用新知見に基づき、 更に研究、 検討の結果、 遂に完成さ れたものである。
図面の簡単な説明
図 1
DFA III を含有する溶液の精製 ·結晶化工程を包含する DF A III 結晶 の製造フ口一の一例を示す。
図 2
クロマト処理による精製フローの一例を示す。
図 3
粗結晶化工程の母液組成および結晶化率を示す。 なお、 図中、 ー騸一は DF A III 固形分純度 (%)、 一 ·一は DFA III 結晶化率 (%)、 一口一フラク ト オリゴ糖の固形分純度 (%)、 一◊一は蔗糖の固形分純度 (%) —△一はフラク トースの固形分純度 (%) をそれぞれ示し、 —〇一は pHを示す。 以下、 図 4、 5、 6についても、 上記記号は同様な意味を表す。
図 4
結晶化工程の母液組成および結晶化率を示す。
図 5
苛性ソーダの添加により精製 ·結晶化工程の p Hを 5以上に維持したときの粗 結晶化母液組成および結晶化率を示す。
図 6
苛性ソーダの添加により精製 ·結晶化工程の pHを 5以上に維持したときの結 晶化母液組成および結晶化率を示す。
図 7
DFA III 溶液にスクロース、 フラクトース溶液を添カ卩した場合における D F A III結晶化率の変化を示す。
図 8
DFA III を含有する溶液中に内在するフラク トオリゴ糖、 スクロース、 フ ラク トースが DFA III 結晶化率に与える影響 (1) を示す。 なお、 図中、 F OSはフラタ トオリゴ糖、 S u eはスクロース、 F r uはフラク トース、 B l a n kは対照をそれぞれ示す。
DFA III を含有する溶液中に存在するスクロース (S u e;)、 フラク トー ス (F r u)、 スクロースとフラク トースの合量(S u c + F r u) が DFA III 結晶化率に与える影響 (2) を示す。
図 1 0
DFA III を含有する溶液中に存在する有機酸塩 (酢酸 Na +蟻酸 Na) が DFA III結晶化率に与える影響を示す。
図 1 1
DFA IIIを含有する溶液の pHが DF A III結晶化率に与える影響 (1) を示す。
図 1 2
DFA IIIを含有する溶液の pHが DF A III結晶化率に与える影響 ( 2 ) を示す。
図 1 3
粗結晶化母液の P Hが D F A III結晶化率に与える影響を示す。
図 14
DFA III の溶解度および溶解度の近似曲線を示す。 なお、 図中、 〇は DF A IIIの溶解度 (実測値)、 —は DFA III溶解度の近似曲線を示す。 以下、 本発明について詳述する。
本発明は、 DFA III を含有する液体を精製して、 高純度の DFA III 結 晶を、 結晶化率を低下させることなく、 効率的に工業生産するものであって、 そ の際、 DFA III を含有する液体の pHの重要性にはじめて着目し、 そして更 に研究の結果、 pH 5以上とすることが必要であることをはじめてつきとめ、 こ の有用新知見に基づき更に研究、 検討を加え、 遂に本宪明の完成に至ったもので ある。
すなわち、 本発明は、 DFA III を含有する液体を精製して DF A III 結 晶を製造するに際して、 DFA IIIを含有する液体の pHが 5以上であること、 を重要な特徴とするものである。
従来、 DFA III については、 工業的結晶化は行われておらず、 したがって pHの検討はもとより pHについては全く着目されていなかったのであるが、 D FA III の結晶化に及ぼす pHの影響は、 本発明者らによる DF A III のェ 業的結晶化に係る研究の過程においてはじめて着目されたものであって、 全く新 規な知見である。 換言すれば、 本発明は、 DFA III 結晶化に係る工業的研究 においてはじめて問題点がクローズアップされたものであって、 技術課題自体が 新規であるということができ、 してみれば、 当然にその解決手段も新規である。 すなわち、 本発明は、 次のものを包含するものである。
1. ジフラタ トース ジアンヒドリ ド III (DFA III) を含有する溶液の pHが 5以上であることを特徴とする、ジフラクトース ジアンヒドリ ド III (D FA III) 結晶の製造方法。
2. DFA III を含有する溶液の pHをアルカリ剤の添加法、 クロマトダラ フィ一法、 ァニオン交換樹脂法の少なくともひとつで調整 ·維持すること、 を特 徴とする上記第 1項記載の DF A III結晶の製造方法。
3. DFA III を含有する溶液が、 ィヌリンにフラクトシルトランスフェラ ーゼを作用させ、 得られた液を清浄 ·濾過した溶液である::とを特徴とする、 上 記第 1及び 2項記載の DF A III結晶の製造方法。
4. ィヌリンのフラクトース重合度が 1 0から 60であってポリサッカライド の固形分純度が 70%以上であることを特徴とする、 上記第 3項記載の DF A III結晶の製造方法。
5. DFA III 粗液から粗結晶化を経て製品結晶化に至る、 DF A III を 含有する溶液を清浄 *濾過した後、 濃縮して結晶化するまでの工程 (精製 ·結晶 化工程) において、 少なくともひとつの DFA III を含有する溶液の pHが 5 以上であること、 を特徴とする上記第 1〜4項のいずれか 1 項に記載の DF A III結晶の製造方法。
6. 精製 ·結晶化工程を循環系で行うこと、 を特徴とする上記第 5項に記載の DFA III結晶の製造方法。
7. 結晶化母液又は粗結晶化母液の冷却結晶化における終点温度での溶解度に
対する過飽和度が 1. 3〜4. 1であることを特徴とする、 上記第 1〜6項のい ずれか 1項に記載の D F A III結晶の製造方法。
8. DFA III 含有の結晶化母液又は粗結晶化母液のフラク トース含量が固 形分重量当たり 5%以下であること、 を特徴とする DF A III結晶の製造方法。
9. フラクトース含量が固形分重量当たり 5%以下にする方法として、 フラク トオリゴ糖及び/又はフラクトースをクロマトグラフィ一法、 イースト処理法の いずれかひとつ以上を用いて除去すること、 を特徴とする上記第 8項記載の DF A III結晶の製造方法。
10. 上記第 1〜 9項のいずれか 1 項に記載の方法で製造された DF A III の; taS曰 o 本発明は、 DFA III を含有する溶液を精製して高純度の DFA III 結晶 を効率的に工業生産するものであって、 特にその際、 DFA III を含有する溶 液について、 少なぐともひとつ、 好ましくはすべての該溶液の pHが 5以上であ ること、 を重要な特徴のひとつとするものである。
本発明を実施するには、 DFA ΙΠ結晶の製造工程 (その 1例を図 1に示す) において、 DFA III を含有する溶液の少なくともひとつあるいはすべての溶 液について、 p Hが 5以上となるようにして結晶化を実施すればよい。
DFA III 結晶の製造法について、 その 1例を図示した図 1を参照しながら 以下に説明する。
DFA III を含有する溶液の原料としては、 ィヌリン又はィヌリン含有液に フラクトシルトランスフェラーゼを作用させて得た DF A III 合成液のほか、 DFA III化学合成液がすべて包含される。
原料の 1つであるィヌリンは、 グルコース 1個にフラクトースが多数連なった フラクトース重合体である。 このィヌリンを原料として、 DFA III を生成す る酵素、 広義でフラク トシルトランスフェラーゼ、 好ましくはィヌリンフラタト トランスフェラーゼ (I FT) を作用させる。
I FT生成微生物としては、 次のものが例示される。
その非限定例を以下に示す; Ar t h r o b a c t e r s p. ; A r t h
r o b a c t e r u r e a f a c i e n s I F O 12140 ; A r t h r o b a c t e r g l o b i f o rm i s I FO 12137 ; A r t h r o b a c t e r p a s c e n s I F O 12139 ; B a c i l l u s s p . ; K l u y v e r omy c e s ma r x i a nu s v a r . ma r x i a n u s : S t r e p t omy c e s s p . ; En t e r o b a c t e r s .
これら微生物由来の酵素を使用する場合、 分離精製した酵素のほか、 粗精製酵 素、 微生物培養物、 同処理物 (培養上清、 分離菌体、 菌体破砕物等) も使用可能 である。 なお、 DFA III 結晶を食品用途に使用する場合には、 酵素としてフ ラク トシルトランスフェラーゼ、 特に I FTを使用するのが好適であって、 上記 微生物由来の酵素のほか、 今回、 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物 寄託センターに FERM BP— 8296として国際寄託されたアースロバクタ 一 エスピー AHU 1 753 (Ar t h r o b a c t e r s p. AHU 1753) 株は、 I FT生産能にすぐれているので、 本菌株の酵素は好適に使用 可能である。
例えば、 上記したアースロバクタ一 エスピー AHU 1 753株 (FERM BP— 8296) 由来のィヌリンフラク ト トランスフェラーゼ (デポリメライジ ング) (I FT) の粗酵素、 精製酵素、 酵素含有物等を酵素 5000 u n i t s Zk gィヌリンで、 60°Cで 24時間攪拌しながら作用させて、 加水 '転移さ せて、 DFA III を含有する酵素反応溶液を生成する。 酵素を失活させて、 D FA III 合成液を得る。 また、 化学合成によって DF A III 化学合成液を得 ることもできる。
このようにして得た DFA III 酵素合成又は化学合成液は、 それ単独かある いはそれに DFA III を含有する他の溶液等を混合して DF A III 粗液とす る。 DFA III 粗液は、 次に清浄濾過する。 清浄濾過は、 DFA III 粗液の 活性炭処理及び固液分離処理を指すものである。 活性炭処理は、 DFA III 粗 液に粉末活性炭を少量添加して、 必要あれば加熱及び 又は攪拌して、 DFA III以外の不純物を活性炭に吸着せしめる処理である。
粉末活性炭としては、 平均粒径が 1 5〜 50ミクロン、 好ましくは 25〜 45
ミクロン、 更に好ましくは約 35ミクロン;最大粒径が 200ミクロン以下、 好 ましくは 170ミクロン以下、 更に好ましくは 150ミクロン以下、 例えば 14 7ミクロン以下のものが使用される。 その添加量は、 固形分に対して、 5%以下、 好ましくは 0. 1〜3%、 更に好ましくは 0. 5〜1. 5%とするのが良く、 D FA III粗液の組成に応じて適宜規定する。
固液分離処理としては、 ハイフロスーパーセル (和光純薬製) ゃケイソゥ士濾 過等の濾過助剤を使用する濾過 (例えば、 セラミック濾過機による濾過: 日本ポ ール (株) 製 PR— 12型が使用可能)、 メンブランフィルター (MF) 濾過、 連続遠心分離法、 分子篩法、 逆浸透膜法、 場合によっては限外濾過 (UF) 膜の 少くともひとつが適宜利用される。 固液分離は、 常圧、 加圧、 又は減圧の少くと もいずれかで実施される。
具体的には、 例えば、 I FT酵素失活液に固形分当たり 1%の割合で太閤活性 炭 S (二村化学工業製:平均粒径約 35ミクロン、 147ミクロン以下) を添カロ し 60°C、 10分間攪拌する。 この完了液を珪藻土 (昭和化学工業製ラジオラ イト 700) 濾過を行う。 すなわちセラミック製の筒 (日本ポール (株) 製 PR 一 12型セラミックチューブ) の外面に上記珪藻土をプレコートしておき、 筒外 に活性炭含有反応液を加圧通過させて、 加圧濾過し、 筒内から濾液を回収する。
DFA III含有液 (粗液) の清浄濾過処理によつて得た濾液は、 常法によつ て濃縮する。 例えば、 砂糖等の製造で用いられるカランドリア型濃縮効用缶によ り濃縮 (例えば、 60〜80°C、 1 20mmHg以下) し、 濃縮液を得る。 濃 縮液は、 固形分濃度 60〜85%、 例えば 77%程度に濃縮すればよい。
本発明においては、 上記した DFA III 酵素合成液又は化学合成液から得た DFA III 粗液は清浄'濾過さらに濃縮までの工程の間で、 pHを 5以上に保 持することが好ましい。 例えば、 水酸化ナトリウムを添加して、 pH5以上に調 整すればよい。
上記で得た濃縮液である母液、 つまり粗結晶化母液 (約 60°C) を結晶機に 移し、 DFA III の結晶を冷却又は煎糖方式で生成させ粗結晶を得る。 この場 合、 DFA III 結晶を乳鉢等で粉砕したものをアルコール等に分散させたシー ド (種結晶) を適当量、 適切なタイミングで母液に添加して育晶する。 シード法
には、 フルシーディング法とショックシ一ディング法がある。 フルシーディング 法では、 結晶化母液中又は粗結晶化母液中 DF A III 量に対してシード量が 1%以上にすることで、 DFA III 結晶の粒度分布を小さい方へシフトするこ とができる。 また、 冷却結晶化方法では、 前記両用法のシード温度が低い程、 D FA III 結晶粒度は、 小さくなる。 冷却結晶時の温度勾配は、 最初は小さく、 その後は大きくする方が結晶粒度のバラツキが少ない。 結晶機は、 循環方式及び 又は撹拌方式が付加されたものを用いるのが好ましレ、。
結晶を析出した粗結晶化母液は分離機 (3000 r pm、 1200 G) で DF A III粗結晶と粗結晶シラップに分離する。
DFA III 粗結晶は、 お湯で再溶解して DF A III 精製液とし、 清浄、 濾 過工程を経て、 濃縮し、 粗結晶と同様の方法で結晶化して、 製品結晶を得る。 得 られた結晶は、 無臭であり、 中性域にある無色透明の八面体結晶であり、 融点: 163. 7°C、 旋光度 〔c〕 D : 134. 5であった。
本発明のように、 各工程液の pHを 5以上に維持、 調節した場合では、 上記フ ローにおいて分離された粗結晶シラップ及び 又は結晶シラップを、 所望に応じ て結晶製造系に戻してやり、 循環系とすることで、 さらに DFA III の回収率 の向上を達成することが可能となる。 一方、 各工程液の pHの維持、 調節を行わ ず循環系とすると、 工程液中に単糖 (特にフラクト一ス) や蔗糖といった DFA III 結晶化阻害物質が著しく増加 ·蓄積し、 また結晶化母液の pHが著しく低下 するため、 DF A結晶化工程で結晶化率の低下、 さらに最悪の場合、 結晶化不能 といった状況に陥る。
本発明では、各工程液の p Hを 5以上に維持、調節することにより、 DFA III 結晶化阻害要因である単糖や蔗糖、 あるいは酸性物質 (有機酸など) の生成を抑 制できることを見いだした。 さらに、 アルカリ性剤を添加する方法に加えて、 上 記阻害物質を含む工程液を、 クロマトグラフィー (以下、 クロマトとレ、うことも ある) 分離法やィースト処理をすることで、 上記阻害物質を除去し、 DFA III を精製して結晶化することも可能である。 すなわち、 DFA III 精製結晶化の 全工程 (図 1 ) で生成する各種生成物をクロマト処理原液 (固形分濃度 40〜 75%) として、 これをクロマト処理し、 DFA III を含有する溶液を精製し
て結晶化することが可能である。 そのクロマト処理による精製フローの一例を図 2に示す。
クロマト処理原液 (固形分濃度 40〜7 5%) は、 クロマト処理して、 DF A III 画分を分離する。 既述した再溶解液 (DFA III 液) と同様の精製度 を有する DFA III リッチ画分は、 DFA III 精製液として、 これを清浄濾 過、 濃縮、 結晶化することにより製品結晶を製造することができ (ルート A)、 あるいは、これをそのまま結晶化することもできる(ノレート B)。また、 DFA III リッチ画分とは異なり DFA III含量が低い DFA III 非リッチ画分につい ては、 製造フロー (図 1に示すような DFA III 含有液から DF A III 製品 に至る全精製工程) の適宜個所に戻してやればよい (ルート C)。 さらに、 フラ タトオリゴ糖、 フラクトースなどの単糖、 および酸性物質などを含み、 ごく少量 しか DFA III を含まない非 DFA III 画分は、 飼料用原料として使用する か、 又は廃棄する。
クロマト分離法としては、 その分離は固定床方式 (ワンパス方式)、 連続方式 (疑似移動床方式)、 半連続方式 (固定床方式と連続方式の組み合わせ) が適用 できる。 その装置の充填イオン交換樹脂としては、 クロマト用の Na形、 K形、 C a形等の強酸性イオン交換樹脂が使用される。 その樹脂は均一粒径のスチレン ジビュルベンゼン系樹脂等が用いられている。 イオン交換樹脂のメーカーから 種々のクロマト用樹脂が販売されているが、 糖液に適用できるものであればいず れも使用できる。 クロマト処理は結晶母液の DF A III 純度が低い場合、 その 純度を上げるのにも適宜使用される。 イースト処理は、 DFA III 含有液とイーストを接触させればよく、 両者を 混合し、 必要あれば攪拌してインキュベートしてもよいし、 通気しながら培養し てもよい。 イーストとしては、 パン酵母、 清酒酵母、 ビール酵母、 プドウ酒酵母 その他各種の酵母が適宜使用可能であって、 ドライイースト、 圧搾酵母その他各 種の市販品も充分に使用可能である。 イーストによって、 フラタトオリゴ糖、 シ ョ糖、 単糖類が分解されたり菌体内に取り込まれるので、 イースト処理は、 主に フラクトオリゴ糖、 ショ糖及び/又は単糖類を系外に除去するのに有用である。
本発明は、 更に、 DFA III 純度が 60%未満の DFA III 含有液 (結晶 化母液) についても、 工業的に結晶させることができる。
本発明においては、 DF A III 純度が 60%未満の DFA ΠΙ 含有液の精 製度を高めるため、 DFA III 含有液を、 イースト処理、 清浄濾過処理又はク ロマトグラフィー処理の少なくとも一つで処理することにより DFA含有液の D FA III純度を大幅に上昇させることができる。 本発明における主要な用語について、 図 1に示した DFA III 結晶の製造フ ローを参照しながら、 以下に定義する。
(ィヌリン)
ィヌリンとは、 植物由来もしくは酵素合成物由来のィヌリン及びィヌリン含有 液のことをいい、 例えば、 キクイモ、 ゴボウ、 チコリ等の植物抽出液、 及び蔗糖 にィヌリン合成酵素を作用させた合成ィヌリンを含む液、 又はそれらの液を、 清 浄 ·濾過した液を指し、 更に各液を乾固もしくは結晶化させたィヌリン含有粉末 を指す。
DFA III を含有する溶液の原料の 1つとなるィヌリンは、 フラク ト一ス重 合度が 10から 60であってポリサッカライドの固形分当たりの純度が 70%以 上、 好ましくは 80%以上のものを使用することにより、 DFA III が効率的 に生成する。 そして、 その DFA III 含有液を使用し、 DFA III 結晶を製 造すると効率的に製造ができる。
(DFA III酵素合成又は化学合成液)
DFA III 酵素合成又は化学合成液とは、 上記ィヌリンに酵素を反応させて DFA III を含有する溶液を生成し必要に応じて酵素を失活させた溶液又は D FA IIIの化学合成液をいう。
(DFA ΙΠ粗液)
DFA III 粗液とは、 上記 DFA III 酵素合成又は化学合成液それ自体、 結晶化工程 (粗結晶化、 結晶化) で結晶化した母液を固液分離した粗結晶シラッ プ、 結晶シラップ、 クロマト分離処理液 D F A III 画分の少なくとも 1つ以上
からなる液をいうが、 DFA III 酵素合成又は化学合成液に粗結晶シラップ、 結晶シラップ、 クロマト分離処理液、 クロマト分離で得られた D F A I II 画分 の少なくともひとつを混合してなる液も指すものである。
(粗結晶化母液)
粗結晶化母液とは、 上記 DFA III 粗液を必要があれば活性炭、 イオン交換 樹脂、 クロマトグラフィー、 イースト等の清浄処理を行い、 その後濾過等の固液 分離(即ち、清浄 '濾過)により希薄液を得る。この希薄液あるいは上記 D F A III 粗液を効用缶等の濃縮装置で適宜濃度に濃縮したものをいう。
(DFA III精製液)
DFA III 精製液とは、 粗結晶化で得た粗結晶を適切な濃度に水 (湯) で溶 解した溶解液もしくはクロマト分離で得られた D F A III 画分の少なくとも 1 つからなる溶液のことをいう。
(結晶化母液)
結晶化母液とは、 上記 DFA III 精製液を必要があれば活性炭、 イオン交換 樹脂、 イースト等の清浄処理を行い、 その後濾過等の固液分離 (即ち、 清浄'濾 過) により希薄液を得る。 この希薄液、 あるいは上記 DF A III 精製液、 結晶 シラップ、 D F A III 画分の少なくとも 1つを効用缶等の濃縮装置で適宜濃度 に濃縮したものをいう。
このように、 DFA III を含有する粗結晶化母液、 結晶化母液とは、 DFA III の結晶化のために、 冷却方式及び Z又は蒸発方式等の結晶機等に専ら供給さ れる DFA IIIを含有する溶液である。
(DFA IIIの精製 ·結晶化工程)
DFA ΠΙ の精製.結晶化工程とは、 DFA III 粗液から粗結晶化を経て 製品結晶化に至る、 すべての DFA III を含有する溶液を清浄'濾過の後、 濃 縮して結晶化するまでの工程をいう。
(DFA IIIを含有する溶液)
DFA III を含有する溶液とは、 DFA III 結晶製造フローにおいて生成 し、 DFA III を含有する溶液のすべてをいい、 例えば、 DFA III 粗液、 粗結晶化母液、 結晶化母液、 粗結晶シラップ、 結晶シラップ、 DFA III 精製
液、クロマト分離処理液、クロマト分離で得られた D FA III画分(DFA III クロマト画分) の少なくともひとつを包含するものである。 本発明を実施するには、 DFA III を含有する溶液の PHを 5以上としなけ ればならない。 DFA III の結晶化を行っていくと、 pHが低下して結晶化率 が低下することを本発明者らがはじめて見出したものである。 p Hは 5以上であ ればよレ、が、 好適域は 5〜8、 更に好ましくは 6〜 8である。 これ以上高い pH ももちろん可能であるが、 pHの調整に使用する苛性ソーダ、 苛性カリといった アルカリの量が多くなり、 無駄となってコストも高くなるし、 作業安全性の面で も問題がでてくる。
DFA III を含有する溶液としては、 上記に定義したものの少なくともひと つ、好適にはそのすべてについて、 pHが 5以上であることが必要である。 また、 DFA II I の精製 ·結晶化工程を包含する DF A III 結晶の製造工程におけ る移送パイプ内における pHも 5以上であると更に好適である。
以上述べたように、 本発明においては、 DFA III 結晶化率を高めるには、 DFA III を含有する溶液の pHが 5以上であることが必須であるが、 更に研 究の結果、 全く予期せざることに、 蔗糖及びフラクトースの存在が DFA III の結晶化率を低下させることをはじめて見出し、 結晶化母液のフラクトースが固 形分当たり 5%以下、 好ましくは 1%以下含有することにより、 DFA III の 結晶化率が高まることを見出した。 そして、 更に、 このような糖の抑制も pHを 5以上にすることで達成されることもはじめて確認した。 DFA III を含有す る液の pHが 5以上であり、 かつ、 粗結晶化母液、 結晶化母液のフラク トースの 固形分当りの含量が 5 %以下の条件を同時に満す場合に、 最大の D F A III 結 晶化が相乗的に高まることが判明する。 発明の効果
DFA III を含有する溶液の pHが 5以上であること、 粗結晶化母液、 結晶 化母液のフラク トースが 5重量0 /0以下に含有することにより、 DFA III をェ 業的に、 効率良く結晶化させて製造することができる。
以下、 本発明を実施例により更に詳しく説明するが、 本発明は実施例のみに限 定されるものではない。 実施例 1
テストプラントを使い、 図 1に示したフローの一部にしたがって、 循環方式に より DFA III結晶製造試験を行った。
尚、 本試験で使用する DF A III を含有する液の糖類の値は、 高速液体クロ マトグラフィ一による組成分析値を使用したものである。
(1) 酵素反応工程
1日処理量として市販ィヌリン (オラフティー社、 商品名ラフィテリン HP) 100 k gの溶解液に A r t h r o b a c t e r s p. AHU 1753株培養 酵素液 (酵素力価約 50万 U) を添加し、 60°C12時間反応させ、 DFA III 酵素合成液を得た。
(2) 脱色、 清浄工程
DFA III 酵素合成液に脱色処理として固形分あたり 0. 5%の活性炭 (二 村化学、 商品名 太閤活性炭 KW50) を添加し、 80°Cで 30分インキュべ ートした後、 珪藻土濾過した。
(3) 粗結晶化工程
DFA III 酵素合成液の脱色液を固形分濃度 76%に濃縮したものを粗結晶 化母液として、 それに 50 °Cで種結晶 (シード) を添加し、 1 2時間かけて 1 0°Cまで冷却し DFA III 粗結晶を生成させた。 この粗結晶母液 (粗結晶マス キットともいう) を遠心分離し、 粗結晶と粗結晶シラップに分離した。
(4) 精製結晶化工程
粗結晶を再溶解し、 固形分濃度 75%まで濃縮したものを結晶化母液として、 それに 50°Cで種結晶を添加し、 1 2時間かけて 10°Cまで冷却し結晶を生成
させた。 この結晶マスキットを遠心分離し、 結晶と結晶シラップに分離した。
(5) 循環工程
DFA III 回収率を高めるために、 粗結晶シラップの 5割を酵素反応終了液 に混合し、 残りは飼料用原料に供した。 また結晶シラップの 5割は、 粗結晶化工 程の濃縮缶に戻し、 残りの 5割は結晶化工程の濃縮缶に戻した。
(6) 結晶化率の算出
本実施例の粗結晶及び結晶の結晶化率の算出は、 下記の式によつた。
結晶化率 (%) = (P/Q) 100
式中、 各記号は以下のことを表す。
P : M-N
Q: (100— N) M/100
M: (粗) 結晶化母液の D F A ΙΠ純度
N: (粗) 結晶シラップの DF A III純度
(7) 製造試験
上記 (1) 〜 (5) の工程に従い製造作業を行レ、、 試験開始 4日目より粗結晶 化工程を、 試験 7日目より結晶化工程を開始した。 粗結晶化工程の概要 (母液組 成および結晶化率) を図 3に示した。 粗結晶化率は試験 10 S目より低下しはじ め、 13 S目には 30%以下となったため、 粗結晶シラップの戻しを 5割から 3 割に減じた。 しかしながら、結晶化率はその後も低下し続け、 17日目には 10% を下回るようになった。 粗結晶化母液の D F A III 純度は、 試験期間中 80 % 弱で推移し、 大きな変動はなかった。 一方、 不純物組成は、 試験の経過とともに フラタトオリゴ糖が減少し、その分解物と思われるフラク トースが増加していた。 また粗結晶化母液の pHは、 開始時の 5. 1から徐々に低下し、 4前後まで低下 していた。 次に精製結晶工程の概要を図 4に示した。 期間中の糖組成に大きな変 化は認められなかったが、 結晶化率は試験期間中、 漸減した。 また結晶化母液の pHも開始時 4. 8であったが、 4前後まで徐々に低下していった。
実施例 2
実施例 1から、 循環方式で DFA III を製造すると結晶化率が徐々に低下す ることが明らかとなった。 この時、 結晶化母液 pHが低下し、 フラク トオリゴ糖 の分解も進んで 、たことから、 結晶化率の低下と何らかの関係があることが示唆 された。 そこで本実施例の製造試験では、 酵素反応終了液、 粗結晶化母液 (濃縮 前の液) および粗結晶再溶解液に苛性ソーダを添カ卩し、 各工程汁の pH低下の防 止を図った。 それ以外は実施例 1と同様の方法で行った。
粗結晶化工程、 結晶化工程の概要を図 5、 6に示した。 苛性ソーダの添加によ り各結晶化母液の pHは、 各々 5. 1〜5. 6、 5. 4〜5. 7の範囲で推移し、 フラクトオリゴ糖の分解も抑制されていた。 また各結晶化率も高水準で維持する ことができた。 実施例 3
DFA III 自体は、 他の糖類に比べて熱、 酸に強い物質である。 図 1に示す ような DFA III の工業的な製造法において、 製造工程液の p Hが低いと、 D FA III 以外の不純物が分解して、 他の物質が生じ、 また、 結晶化に使用され る DFA III 含有液は、 循環して使用されるため pHが益々低下するのみなら ず、 DFA III 以外の他の物質が蓄積すると考えられる。 実際に実施例 1の試 験製造では、 工程液の pHが徐々に低下し、 フラクトオリゴ糖の割合が低下しフ ラク トースが蓄積することが確認された。
そこで、 本発明者らは、 pH (3〜7) と熱 (70、 80°C) によって、 実 施例 1で調製した酵素反応終了液の糖組成がどのように変化するか、 テーブル試 験を実施した。 その結果、 70°C、 pH5以上の条件下では、 24時間経過迄 含有糖類の組成変化はほとんど認められなかったが、 p H 4にすると 8時間経過 時点で 4糖類以上の糖類の分解とフラク トースの増加が見られ、 pH3でさらに その傾向が強まった。 また、 70°Cで観察された各 pH条件における上記の糖 組成の変化は、 80°Cにするとさらに加速された。 80°Cでは、 pH5以上の 条件でも、 1 2時間経過迄は 70°Cと同様にほとんど変化がなかったが、 24
時間経過時点では、 4糖類以上の糖類の分解とフラク トースの増加傾向が見られ た。
さらに、 本発明者らは、 実施例 1で P H 4にまで低下した粗結晶化母液の酸性 物質を調べたところ、 有機酸 (乳酸や酢酸、 蟻酸等) が 30〜40mgZl 00 g試料の濃度で含有していることが分かった。 さらにテーブル試験で、 フラク ト ース水溶液を 80°C環境下で長時間放置すると、 徐々に有機酸が増加し、 pH が低下することが分かった。
そこで実施例 1〜 3の分析値の結果から、変動の大きかったフラクトオリゴ糖、 有機酸、 フラク トース、 蔗糖、 pHが結晶化率にどのように影響するか、 さらに 実施例 4〜 7にてテーブル試験を行った。 なお、 実施例 4〜 7で使用する結晶化 率の算出は下記の式によつた。 結晶化率 (%) =A/BX 100
式中の各記号は以下のことを表す。
A:結晶化によって得られた DF A ΙΠ結晶重量 (g)
B :結晶化母液中の D FA III含量 (g)
実施例 4
(純度 99. 9%DFA III の水溶液にスクロース、 フラクトース溶液を添加 したときの結晶化率)
固形分濃度 71%に調製した13 八 III 溶液 300 gに固形分濃度 71 %の スクロース溶液又は固形分濃度 71 %のフラク トース溶液をそれぞれ 3 g、 15 g、 30 g (固形分当たりのスクロース (フラタ トース) 量として、 1. 0、 4. 8、 9. 1%) 添加し、 無添加のものと併せて結晶化を行った。 尚、 この時の育 晶温度は 10°Cまでとした。 また、 スクロース (フラク トース) 溶液を 30 g 添加した試験では 50 °Cでシード時にシードした結晶が溶解したため、 45 °C で再びシードを行なった。 その試験結果を図 7に示した。 結晶化に用いる母液の 固形分濃度及び DF A III の量を統一し、 スクロース、 フラク トースの添加量 を増加させて生成する結晶の量を測定した結果、 両者とも添加量の増加に伴い D FA . IIIの結晶生成量は減少した。
実施例 5
(DFA III含有液に混在する不純物が結晶生成に与える影響)
(1) 母液の固形分濃度及び DF A III の量を統一して試験を行なった結果、 スクロース、 フラクトースの添加量の増加に伴い DFA III の結晶生成量は減 少したが、 この結果は単に DFA III の純度が低下したため起こったこととも 考えられたため、 次に混在する不純物の違いが結晶生成に与える影響について試 験を行なった。
固形分濃度 7 1。/。に調製した D F A III 溶液 300 gに固形分濃度 71 %の フラクトオリゴ糖 (明治製菓製メイオリゴ P : 4糖類、 3糖類、 2糖類、 フラク トース含量がそれぞれ固形分当たり 65. 2%、 32. 8%、 1. 2%、 0. 8% の混合物) 溶液、 スクロース溶液、 フラク トース溶液をそれぞれ 30 g (固形分 あたり 9. 1%) 添加し、 無添加のものと併せて結晶化を行った。 尚この時の育 晶温度は 10°Cまでとし、 シード温度は 45°Cとした。 その試験結果を図 8に 示した。
図 8より、 不純物としてフラクトオリゴ糖のみが存在する場合に比べ、 フラク トオリゴ糖をスクロース、フラクトースに置き換えた場合は生成する DF A III 結晶の量が少なく、 同じ D F A III 純度でもフラクトオリゴ糖が分解してスク ロース、 フラク トースが生成すると DFA III の結晶化が抑制されるという結 果が確認された。
(2) DFA III溶液に混在する不純物組成が結晶生成に与える影響
次に、 スクロース、 フラクトースが単独で存在する場合と両者が混在する場合 の影響につ!/、て調査を行なつた。
固形分濃度 7 1 %に調製した D F A III 溶液 300 gに固形分濃度 71 %の スクロ—ス溶液、 フラタトース溶液をそれぞれ 30 g (固形分あたり 9. 1 %) 添加したもの及びスクロース溶液 15 gとフラク トース溶液 15 g (スクロース とフラクトースの合計で固形分当たり 9. 1%) を同時に添加したものを無添カロ のものと併せて結晶化を行った。 尚、 この時の育晶温度は 10°Cまでとし、 シ
一ド温度は 45°Cとした。 その試験結果を図 9に示した。
図 9より、 DFA III 純度は同じでも、 スクロースとフラク トースを半量ず つ添カ卩したときょり、 単独で添加した時の方が阻害の度合いが高いという結果と なった。 そのため、 DFA III の結晶化は不純物として存在するスクロース、 フラクトースの内、 どちら力含量が多い方に影響されると考えられた。 伹し、 実 際の製造現場では生成するスクロースの量がブラクトースの量を上回ることはな いため、 結晶生成量はフラクトースの量に影響されると思われる。
以上より、 不純物としてフラクトオリゴ糖のみが存在する場合に比べ、 スクロ ース、 フラクトースが存在する場合は生成する DF A III 結晶の量が少なく、 その度合いは存在するスクロース、 フラクトースの内、 どちら力含量が多い方に 影響されると考えられた。 しかし、 同じ不純物純度でも DF A III 溶液にスク ロース、 フラクトースを固形物で添加したときは結晶の生成量が無添加のものよ りも多いことから、 スクロース、 フラクトースが存在しても、 その分、 母液の濃 度を上げると、 両者が存在しない時並に結晶の回収ができると考えられた。
(3) DFA ΙΠ溶液に混在する不純物組成が結晶生成に与える影響
次に、 工程汁分析でその存在が確認された有機酸の影響について調査を行なつ た。 工程汁中に存在の確認された有機酸は、 乳酸、 酢酸、 蟻酸、 その他 (複数の 未知ピーク) であったが、 ここではフラクトースの熱分解で生成する酢酸、 蟻酸 について試験を行なった。 工程汁の分析結果より D F A III 粗液の清浄 ·濾過 した液の濃縮液中に検出された各有機酸含量は 30〜4 OmgZl O O gサンプ ル程度であるため、 有機酸塩の添力卩量はそれぞれ 0〜1 O OmgZl O O g D
FA III溶液とした。
固形分濃度 71%に調製した13?八 III 溶液 300 gに酢酸ナトリゥムと蟻 酸ナトリゥムの溶液をそれぞれの含量が 10mg+ 10mg、 50 m g + 50 m g、 10 Omg + 10 OmgZl 00 g DFA III溶液となるように添加し、 無添加のものも含め濃度が同じとなるように純水で固形分濃度を調整後 (最終固 形分濃度 70. 3%)、 結晶化を行った。 尚、 この時の育晶温度は 10°Cまでと し、 シード温度は 50 °Cとした。 その試験結果を図 10に示した。
図 10より、 結晶生成量に多少の変動はあるものの、 有機酸塩は DFA III の結晶化を阻害していないと考えられた。 伹しこの時、 無添加のものと酢酸ナト リゥムと蟻酸ナトリゥムをそれぞれ 1 Omgノ 100 gとなるように添加したも のでは固形分濃度が 70. 3%とこれまでの試験より多少薄かったせいもあり、 シード直後の結晶生成が遅かったのに比べ、 それぞれを 50mg l O O gとな るように添カ卩したものと 10 Omg/100 gになるように添カ卩したものではシ 一ド直後の結晶生成が速レ、という現象が見られた。 この差は何に起因するのか考 察したところ、 試験に用いた酢酸ナトリゥムと蟻酸ナトリゥム混液の pHが 8. 6と高く、 そのため、 後者ではそれを添加後の母液の pHが 7前後になっていた とレ、うことが原因ではないかと考えられた。そこで、製造工程で有機酸が生成し、 工程汁の pHが変わると DFA III の結晶生成に何らかの影響を与えるのでは ないかと考えた。 実施例 6
(DFA IIIの結晶化に与える pHの影響について)
(1) 結晶化に用いる母液の pHが DF A III の結晶生成に与える影響を確認 するため、 有機酸塩 (酢酸ナトリウムと蟻酸ナトリウム) が存在する状態で pH を変動させた時の結晶生成量の変化を調査した。
固形分濃度 73%に調製した13?八 III 溶液 300 gに酢酸ナトリゥムと蟻 酸ナトリウムの溶液を 100mg+ 10 OmgZl 00 g DFA III 溶液と なるように添カ卩し、 5 N塩酸で pHをそれぞれ 7、 5、 4、 3に調整後、 純水で 固形分濃度を 71%に調製し、 結晶化を行った。 尚、 この時の育晶温度は 25°C までとし、 シード温度は 50°Cとした。 その試験結果を図 1 1に示した。
図 1 1より、 生成する結晶量は pHにより影響を受け、 pH7が一番結晶の生 成量が多く、 pH4で極小値となり、 pH3と pH5が同程度の結晶生成量であ るという結果が得られた。
(2) 次に、 この現象が pHのみに依存するもので、 有機酸塩の存在なしでも起 こるものかを検証するため、 DFA III溶液を塩酸と苛性ソーダで pH調製し、
生成する結晶の量が変化する力試験を行なった。 固形分濃度を 71. 5%に調製 した D F A III溶液 300 gを 1 N塩酸及び 1 N奇性ソーダで p H 7、 5、 4、 3に調製後純水を加えて固形分濃度を 71%に調製し、 結晶化を行った。 尚、 こ の時の育晶温度は 25°Cまでとし、 シード温度は 50°Cとした。 その試験結果 を図 12に示した。
試験結果は有機酸塩の存在時と多少異なり、 p H 5での結晶生成量が少ないが、 pH7が一番結晶の生成量が多く、 P H 4に極小値があることは同じであった。 更にこの結果が無機塩の濃度の違いによるものではないことを確認するため、 1%の食塩存在下で同様に pH調整をし、 結晶化を行ったが、 結果は有機酸塩の 存在下で pH調整をして結晶化したときと同じ傾向であった。 このことから、 塩 類の存在により p H 5での結晶化阻害作用は緩和されると考えられた。
(3) そこで、 実工程の粗結晶母液を用い、 以上のことを検証した。
採取した粗結晶母液 (DFA III 固形分純度 75. 9%) に析出していた結 晶を完全に溶解後、 固形分濃度 76 %程度まで濃縮し、 5 N塩酸又は 5 N苛性ソ ーダを用いて PHを 7、 5、 4、 3に調製後、純水を加えて固形分濃度を 75 (又 は 73) %に調製し、 結晶化を行った。 尚、 この時の育晶温度は固形分濃度を 7 5%とした時は 25°Cまで、 固形分濃度を 73%とした時は 10°Cまでとし、 シード温度は 50 °C (固形分濃度 75%).又は 45 °C (固形分濃度 73%) と した。 その試験結果を図 1 3に示した。 いずれの固形分濃度においても、 pH4 で D F A III結晶化率が最も低下することが分かった。 実施例 7
((粗) 結晶化母液 pHと過飽和度が DF A IIIに与える影響)
DFA III 結晶化阻害要因である pH変化に対して、 DFA III 結晶化母 液の最適な濃縮度を決定するための検討を行つた。
これに先立ち、図 14に示すように、各温度における DF A IIIの溶解度(飽 和固形分濃度%)を調査し、その実測値より次式で表される溶解度曲線近似式(相 関係数 R 2= 0. 999) を新たに算出した。
溶解度 (飽和固形分濃度%) Ζ = _0· 00058 Χ2+ 0. 39 Χ+48.
8
ただし X :温度 (°C)
次に、 DFA III 結晶化母液の結晶化に必要な濃縮度を表す数値として、 冷 却結晶化終点温度 X°Cの DFA III 溶解度に対する純度 P%の DFA III 結 晶化母液の過飽和度 Sを次式のように定義した。 過飽和度 S= [YX P/ (1 00-Y)] / [Z/ (1 00-Z) X 1 00] ただし Y: D F A III結晶化母液の固形分濃度 (%)
P : DFAIII結晶化母液の D FAIII固形分純度 (%)
Z :溶解度 (X:冷却結晶化終点温度。 C) 次に、 ここで定義した過飽和度 Sが DF A III結晶化に与える影響について、 実際の DFA III 工程汁を使い、 結晶化阻害要因である結晶母液 pHを変えて テーブル試験を行った。 pH調整は、 DF A III工程汁に 5N HC 1または、 5N N a OHを添カ卩して行った。 これらを様々な濃度に濃縮した後、 得らえた 各濃縮液を結晶化母液として 50°Cでシードし、 1 0°Cまで冷却して育晶した。 過飽和度 Sは上記式に従い、 冷却結晶化終点温度 10°Cとして算出した。
結晶母液 pHと過飽和度 Sの関係について、 結果を表 1に示す。 結晶化母液 p H5〜7の時、 過飽和度 Sが 4. 4以上条件では、 いずれの純度の DF A III 含有結晶化母液においても、 マスキッ トの流動性が著しく低下し、 分蜜作業が困 難と判断された。 一方、 過飽和度 Sが 4. 1以下の条件では、 マスキットは適度 に流動性があり、 分蜜作業は支障なく実施可能であった。 従って、 結晶化母液 Hが 5以上である DFA III の工業的な結晶製造条件は、 結晶化終点温度を基 準とする過飽和度 Sが 4. 1以下であることが分かった。 過飽和度 Sが 1. 3未 満では結晶化率が 20 %以下となることから、 好ましくは、 結晶化率の観点から 過飽和度 Sは 1. 3以上 4. 1以下、 さらに好ましくは 1. 5以上 4. 1以下、 またさらに好ましくは、 2. 3以上 4. 1以下が良いことが分かった。
(表 1)
各種 D FA III含有液の p Hと過飽和度 Sが結晶化率に及ぼす影響 DFA III含有液 Aの冷却結晶化率 (%) 結晶化母液 pH 過飽和度 S 5 6 7
1. 3 21. 0 21. 6 21. 9
1. 5 29. 4 31. 0 31. 4
1. 6 36. 0 36. 8 37. 0
2. 3 53. 1 55. 3 56. 1
4. 1 67. 1 68. 5 68. 8
4. 7 X X X
DFA III含有液 Bの冷却結晶化率 (%) 結晶化母液 pH 過飽和度 S 5 6 7
1. 3 20. 6 21. 1 21. 3
1 · 5 31. 2 32. 4 32. 6
1. 6 36. 1 36. 8 38. 1
2. 3 53. 3 54. 2 54. 7
4. 1 65. 0 65. 1 65. 4
4. 7 X X X
A液の固形分組成: D F A III 99. 5 %、 灰分 0. 1 %、 フラク トオリゴ 糖 0. 4%
B液の固形分組成: DFA III79. 7%、 灰分 0. 3%、 フラク トオリゴ 糖 18. 3%、 蔗糖 0. 2%、 フラク トース 1. 0%
表中 Xは、 マスキッ トの流動性低下により、 分蜜作業が困難であることを示 す。 寄託番号: FERM BP— 8296
寄託の表示: Ar t h r o b a c t e r s p. AHU 1753
寄託機関の名称:独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 寄託機関のあて名 : 〒 305— 8566 日本国茨城県つくば巿
東 1丁目 1番地 1 中央第 6 寄託のョ付:平成 15年 (2003) 2月 18日