JP2022166190A - レバウディオサイドｄ含有晶析物の製造方法およびレバウディオサイドｄ含有晶析物 - Google Patents

Abstract

【課題】レバウディオサイドＤの収率が高く、また、レバウディオサイドＤを高純度で含むレバウディオサイドＤ含有晶析物を得ることができる、レバウディオサイドＤ含有晶析物の製造方法、並びにレバウディオサイドＤ含有晶析物を提供する。【解決手段】ステビア植物由来の粗精製物における総ステビオール配糖体含有量が５０～９５質量％であり、且つ、前記粗精製物が少なくともＲｅｂＡとＲｅｂＤとを含有しており、前記粗精製物を、ＲｅｂＤの１０℃での過飽和度が１０以上であり且つＲｅｂＡの１０℃での過飽和度が１８以下になるように、メタノールまたはエタノールを含む溶媒中に混合して、晶析用溶液を調製する工程、並びに、前記晶析用溶液を、攪拌しながら冷却し、ＲｅｂＤを析出させる工程を含む、ＲｅｂＤ含有晶析物の製造方法とする。【選択図】なし

Description

本発明は、レバウディオサイドＤの収率が高く、また、レバウディオサイドＤを高純度で含むレバウディオサイドＤ含有晶析物を得ることができる、レバウディオサイドＤ含有晶析物の製造方法、並びに、レバウディオサイドＤ含有晶析物に関する。

キク科ステビア(Stevia rebaudiana)の葉にはジテルペノイドの一種であるステビオール(Steviol)とよばれる二次代謝産物が含まれている。ステビオール配糖体は砂糖の約300倍もの甘味を呈することからカロリーレスの甘味料として食品産業に利用されている。肥満は国際的に深刻な社会問題となっており、健康増進および医療費削減の観点からもカロリーレスの甘味料の要望は日々大きくなっている。現在では人工的に合成されたアミノ酸誘導体のアスパルテーム(Aspartame)やアセスルファムカリウム(Acesulfame Potassium)が人工甘味料として利用されている。しかし、ステビオール配糖体のように天然に存在するカロリーレス甘味料はより安全で消費者理解（Public Acceptance）が得られやすいと期待される。

これまでステビオール配糖体の精製に関してはいくつかの報告がなされている。例えば特許文献１は、ステビア・レバウディアナ・ベルトーニ植物の抽出物を有機溶媒の水溶液に溶かして３回以上晶析することで、レバウジオシドＤを精製する方法を開示している。また、特許文献２は、ステビア・レバウディアナ植物の少なくとも１つのステビオール配糖体を含む出発材料とアルコール水溶液とを用意し、出発材料をアルコール水溶液に溶解し、約１分～約２４０時間の間、約２４～８０℃で溶液を保持し、固液分離し、乾燥して、ステビオール配糖体組成物を得る方法であって、ステビオール配糖体組成物が、２０℃の水中で少なくとも０．０１％の溶解度を有する、方法を開示している。

特開２０１３－５０７９１４号公報 特開２０１９－５１８０６５号公報

上記のような状況から、現在、ＲｅｂＤ晶析物の新規な製造方法が求められている。

本発明の一態様は、以下を提供する。
［１］ステビア植物からの抽出物を粗精製して得られた粗精製物を用いる、レバウディオサイドＤ含有晶析物の製造方法であって、
前記粗精製物における総ステビオール配糖体含有量が５０～９５質量％であり、且つ、前記粗精製物が少なくともレバウディオサイドＡとレバウディオサイドＤとを含有しており、
前記粗精製物を、レバウディオサイドＤの１０℃での過飽和度が１０以上であり且つレバウディオサイドＡの１０℃での過飽和度が１８以下になるように、メタノールまたはエタノールを含む溶媒中に混合して、晶析用溶液を調整する工程、並びに、
前記晶析用溶液を、攪拌しながら冷却し、レバウディオサイドＤを析出させる工程を含むことを特徴とする、レバウディオサイドＤ含有晶析物の製造方法。
[２]前記総ステビオール配糖体が、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、ステビオシド、レバウディオサイドＦおよびレバウディオサイドＭである、上記[１]に記載の製造方法。
[３]前記粗精製物におけるレバウディオサイドＡの含有量が５～７０質量％であり、かつ、レバウディオサイドＤの含有量が２～７０質量％である、上記[１]または[２]に記載の製造方法。
[４]前記溶媒における前記メタノールまたはエタノールの濃度が９９．９質量％以下である、上記[１]～[３]のいずれかに記載の製造方法。
[５]前記粗精製物を混合する際に、前記溶媒が４０～８０℃の温度に維持されている、上記[１]～[４]のいずれかに記載の製造方法。
[６]種晶として、レバウディオサイドＤを使用する、上記[１]～[５]のいずれかに記載の製造方法。
[７]前記晶析用溶液を、攪拌しながら３５℃以下の温度となるまで冷却し、レバウディオサイドＤを析出させる、上記[１]～[６]のいずれかに記載の製造方法。
[８]前記晶析用溶液を、攪拌しながら０．００２～１．３７℃／分の速度で冷却し、レバウディオサイドＤを析出させる、上記[１]～[７]のいずれかに記載の製造方法。
[９]前記晶析用溶液を、１～４８時間の間攪拌しながら冷却し、レバウディオサイドＤを析出させる、上記[１]～[８]のいずれかに記載の製造方法。
[１０]前記粗精製物が、
ステビア植物の乾燥葉を溶媒を用いて抽出して抽出物を得る、抽出工程、
前記抽出物を固液分離処理することで清澄液を得る、固液分離工程、
前記清澄液に凝集剤を添加して凝集させ、処理液を得る、凝集工程、
前記処理液を疎水性多孔質樹脂で処理する、樹脂精製工程、および
樹脂精製後の溶液を濃縮する、濃縮工程
を含む方法により得られたものである、上記[１]～[９]のいずれかに記載の製造方法。
[１１]さらに、析出したレバウディオサイドＤと液相とを分離し、分離後のレバウディオサイドＤを乾燥する工程を含む、上記[１]～[１０]のいずれかに記載の製造方法。
[１２]さらに、
析出したレバウディオサイドＤを分離し、乾燥して、一次晶析物を得る工程、
該一次晶析物を、レバウディオサイドＤの１０℃での過飽和度が１０以上であり且つレバウディオサイドＡの１０℃での過飽和度が１８以下になるように、メタノールまたはエタノールを含む溶媒中に混合して、一次晶析物溶解液を調整する工程、
前記一次晶析物溶解液を、攪拌しながら冷却し、レバウディオサイドＤを析出させる工程、並びに、
析出したレバウディオサイドＤを分離し、乾燥する工程
を含む、上記[１]～[１０]のいずれかに記載の製造方法。
[１３]レバウディオサイドＤ含有晶析物における総ステビオール配糖体に対するレバウディオサイドＤの割合が３５～９５質量％である、上記[１]～[１２]のいずれかに記載の製造方法。
[１４]レバウディオサイドＤ含有晶析物における総ステビオール配糖体に対するレバウディオサイドＡの割合が１０～５０質量％である、上記[１３]に記載の製造方法。
[１５]晶析回数を一回とした場合の、粗精製物中に含まれていたレバウディオサイドＤに対する晶析したレバウディオサイドＤの割合が、７０～９９質量％である、上記[１]～[１４]のいずれかに記載の製造方法。
[１６]上記[１]～[１５]のいずれかに記載の製造方法により製造された、レバウディオサイドＤ含有晶析物。
[１７]上記[１６]に記載のレバウディオサイドＤ含有晶析物を含む飲食品。
[１８]飲料である、上記[１７]に記載の飲食品。

本発明においては、高純度、高収率でＲｅｂＤ含有晶析物を得ることができる。

実験例１における、様々な濃度のエタノール溶媒における溶解度曲線を示す。 実験例２における、ＲｅｂＤ添加率と収率の関係を示す。 実験例３における、エタノール溶媒の濃度がＲｅｂＤ晶析物の組成に与える影響を示す。 実験例３における、エタノール溶媒の濃度が収量（結晶量）に与える影響を示す。 実験例４における温度プロファイルを示す。 実験例４における、冷却速度がＲｅｂＤ晶析物の組成に与える影響を示す。 実験例４における、冷却速度が収量（結晶量）に与える影響を示す。 実験例５における温度プロファイルを示す。 実験例５における、晶析時間がＲｅｂＤ晶析物の組成に与える影響を示す。 実験例５における、晶析時間が収量（結晶量）に与える影響を示す。 実験例６における、二次晶析を行う場合のエタノール溶媒の濃度がＲｅｂＤ晶析物の組成に与える影響を示す。 実験例６における、二次晶析を行う場合のエタノール溶媒の濃度が収量（結晶量）に与える影響を示す。 実験例１４における、二次晶析の際の温度プロファイルを示す。

以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。

本明細書において、「レバウディオサイド」、「レバウジオシド」、「Ｒｅｂ」および「Ｒｅｂ．」は同じ意味を表すものであり、いずれも「ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ」を意味するものである。同様に、本明細書において、「ズルコサイド」は「ｄｕｌｃｏｓｉｄｅ」を意味するものである。

本発明は、ステビア植物からの抽出物を粗精製して得られた粗精製物（以下、単に粗精製物と呼ぶことがある。）を、メタノールまたはエタノールの溶媒に溶解してＲｅｂＤを結晶として析出させることで、レバウディオサイドＤ（ＲｅｂＤ）含有晶析物を製造する方法に関する。

従来広く行われてきた方法では、まずステビア植物の抽出物からＲｅｂＡを精製し、残った母液からＲｅｂＤを精製してきた。入手可能なほとんどのステビア植物の葉に、ＲｅｂＤよりもＲｅｂＡのほうが多く含まれているからである。しかし、本発明では、一次晶析の段階からＲｅｂＤを晶析する。ステビア植物からの抽出物の粗精製物において、ＲｅｂＤよりもＲｅｂＡのほうが高濃度で含まれていることを考慮すると、そのような粗精製物を原料として用いるにも関わらず、純度の高いＲｅｂＤ含有晶析物が得られるということは驚くべきことである。

ステビア植物の葉ではＲｅｂＤよりもＲｅｂＡの含有量が圧倒的に多いため、従来の方法では、ＲｅｂＡ晶析時にＲｅｂＤが巻き込まれてしまうと考えられる。そのため、従来の方法において、ＲｅｂＡ晶析後の母液からＲｅｂＤ精製を行ってＲｅｂＤ高純度製剤を得ようとする場合、ＲｅｂＡ晶析時にＲｅｂＤが巻き込まれてしまうことで、必然的に収率が低くなっていた。本発明では、ＲｅｂＤを目的とする精製を実施することで、上記した問題をどちらも解決し、ＲｅｂＤの高純度と高収率の両立を実現した。

＜粗精製＞
本発明の製造方法には、ステビア植物の粗精製物を用いる。ステビア植物の粗精製物は市販品を用いてもよく、ステビア植物、特にステビア植物の葉からの抽出物を精製して得てもよい。また、粗精製物として、市販品や抽出物を粗精製して得たものに対し、さらにＲｅｂＤを添加したものを用いてもよい。
ステビア植物からの抽出物を粗精製して粗精製物を得る場合、ステビア植物からの抽出物は、市販品を用いてもよく、ステビア植物、特にステビア植物の葉を抽出処理して得てもよい。粗精製物を得る好適な方法としては、
（Ａ）ステビア植物の乾燥葉を溶媒を用いて抽出して抽出物を得る、抽出工程、
（Ｂ）抽出物を固液分離処理することで清澄液を得る、固液分離工程、
（Ｃ）清澄液に凝集剤を添加して凝集させ、処理液を得る、凝集工程、
（Ｄ）処理液を疎水性多孔質樹脂で処理する、樹脂精製工程、および
（Ｅ）樹脂精製処理後の溶液を濃縮する、濃縮工程、
を含む方法が挙げられる。以下、この方法を、本発明の粗精製方法と呼ぶことがある。各工程について以下に説明する。

本発明の粗精製方法の一態様において、ステビア植物の乾燥葉の含水率は１～１１重量％である。

（Ａ）ステビア植物の乾燥葉からの抽出
本発明の粗精製方法の一態様には、ステビア植物の乾燥葉を水性溶媒を用いて抽出して抽出物（抽出液）を得ることが含まれる。本明細書において、ステビア植物の乾燥葉とは、ステビア植物の新鮮葉を乾燥させることにより含水量を減らしたものをいう。ステビア植物の乾燥葉の含水率は、好ましくは１～１０重量％、より好ましくは、２～８重量％、特に好ましくは３～４重量％である。ステビア植物の乾燥葉はステビオール配糖体が含まれていれば特に限定されないが、好ましくはＲｅｂＤまたはレバウディオサイドＭ（ＲｅｂＭ）の含有量が天然のステビア植物の乾燥葉よりも多いものが好ましい。そのようなステビア植物の乾燥葉は、例えば、国際公開第２０１９／０７４０８９号公報等に記載の方法で得ることができる。

本発明の製造方法に用いるのに好ましいステビア植物の乾燥葉は、含水率が３～４重量％の場合に乾燥葉１００ｇ中に５.０～２５ｇのステビオール配糖体を含む。他の態様における乾燥葉は、含水率が３～４重量％の場合に乾燥葉１００ｇ中に６．０～２４ｇ、７．０～２３ｇ、８．０～２２ｇ、９．０～２１ｇ、１０～２０ｇまたは１１～１９ｇのステビオール配糖体を含んでいてもよい。

別の好ましい態様において、本発明の製造方法に用いるステビア植物の乾燥葉は、含水率が３～４重量％の場合に乾燥葉１００ｇ中に８～１７ｇのステビオール配糖体を含む。

本態様において好ましい乾燥葉は、含水率が３～４重量％の場合に乾燥葉１００ｇ中に０．５ｇ以上のＲｅｂＤを含む。また、他の態様に用いる好ましい乾燥葉は、含水率が３～４重量％の場合に乾燥葉１００ｇ中に０．１９ｇ以上のＲｅｂＭを含む。また、他の態様に用いる好ましい乾燥葉は、含水率が３～４重量％の場合に乾燥葉１００ｇ中に３.０ｇ以上のレバウディオサイドＡ（ＲｅｂＡ）を含む。他の好ましい態様において、乾燥葉は、含水率が３～４重量％の場合に乾燥葉１００ｇ中にＲｅｂＤが０．６ｇ以上、０．７ｇ以上、０．８ｇ以上、１．０ｇ以上、１．１ｇ以上、１．２ｇ以上、１．３ｇ以上、１．４ｇ以上、１．５ｇ以上、１．６ｇ以上、１．７ｇ以上、１．８ｇ以上、１．９ｇ以上、２．０ｇ以上、２．１ｇ以上、２．２ｇ以上、２．３ｇ以上、２．４ｇ以上、２．５ｇ以上、２．６ｇ以上、２．７ｇ以上、２．８ｇ以上、２．９ｇ以上、３．０ｇ以上、３．１ｇ以上、３．２ｇ以上、３．３ｇ以上、３．４ｇ以上、３．５ｇ以上、３．６ｇ以上、３．７ｇ以上、３．８ｇ以上、３．９ｇ以上、４.０ｇ以上、４．１ｇ以上または４．２ｇ以上の量で存在し、例えば、６．０ｇ以下、５．５ｇ以下または５．０ｇ以下の量で存在していてもよい。あるいは、２．７～８．０ｇ、３．２～８．０ｇ、３．７～８．０ｇ、４．２～８．０ｇ、４．７～８．０ｇ、５．２～８．０ｇ、５．７～８．０ｇ、６．２～８．０ｇ、６．７～８．０ｇ、２．７～７．５ｇ、３．２～７．５ｇ、３．７～７．５ｇ、４．２～７．５ｇ、４．７～７．５ｇ、５．２～７．５ｇ、５．７～７．５ｇ、６．２～７．５ｇ、６．７～７．５ｇ、２．７～７．０ｇ、３．２～７．０ｇ、３．７～７．０ｇ、４．２～７．０ｇ、４．７～７．０ｇ、５．２～７．０ｇ、５．７～７．０ｇ、６．２～７．０ｇまたは６．７～７．０ｇの量で存在していてもよい。他の好ましい態様において、乾燥葉には、乾燥葉１００ｇ当たりＲｅｂＭが０．２０ｇ以上、０．２５ｇ以上、０．３０ｇ以上、０．３５ｇ以上、０．４０ｇ以上、０．４５ｇ以上、０．５０ｇ以上、０．５５ｇ以上、０．６０ｇ以上、０．６５ｇ以上、０．７０ｇ以上、０．７５ｇ以上、０．８０ｇ以上、０．８５ｇ以上、０．９０ｇ以上、０．９５ｇ以上、１．００ｇ以上、１．０５ｇ以上、１．１０ｇ以上、１．１５ｇ以上、１．２０ｇ以上、１．２５ｇ以上、１．３０ｇ以上、１．３５ｇ以上、１．４０ｇ以上または１．４５ｇ以上の量で存在し、例えば、１．５０ｇ以下、１．３０ｇ以下または１．２０ｇ以下の量で存在していてもよい。他の好ましい態様において、乾燥葉には、含水率が３～４重量％の場合に乾燥葉１００ｇ中にＲｅｂＡが３．０ｇ以上、３.５ｇ以上、４．０ｇ以上、４．５ｇ以上、５．０ｇ以上、５．５ｇ以上、６．０ｇ以上、６．５ｇ以上、７．０ｇ以上、７．５ｇ以上、８．０ｇ以上、８．５ｇ以上、９．０ｇ以上、９．５ｇ以上、１０ｇ以上、１１ｇ以上、１２ｇ以上、１３ｇ以上、または１４ｇ以上の量で存在し、例えば、１７ｇ以下、１６ｇ以下または１５ｇ以下の量で存在していてもよい。

別の好ましい態様において、乾燥葉は、含水率が３～４重量％の場合に乾燥葉１００ｇ中にＲｅｂＤが０．５～０．９ｇまたは０．６～０．８５ｇ含まれてもよい。ＲｅｂＭは、含水率が３～４重量％の乾燥葉１００ｇ中に０．２～１．５ｇ、０．２～１．３ｇ、０．２～１．２ｇ、０．２～１ｇ、０．２～０．８ｇ、０．２～０．７ｇ、０．３～１．５ｇ、０．３～１．３ｇ、０．３～１．１ｇ、０．３～０．９ｇ、０．３～０．７ｇのいずれかの量で含まれてもよい。ＲｅｂＡは、含水率が３～４重量％の乾燥葉１００ｇ中に３～１７ｇ、３～１６ｇ、３～１５ｇ、３～１４ｇ、３～１３ｇ、３～１２ｇ、５～１７ｇ、５～１６ｇ、５～１５ｇ、５～１４ｇ、５～１３ｇ、５～１２ｇ、６～１７ｇ、６～１６ｇ、６～１５ｇ、６～１４ｇ、６～１３ｇ、６～１２ｇ、６～１１ｇのいずれかの量で含まれていてもよい。

乾燥葉からのステビオール配糖体の抽出は、水やアルコール、あるいはそれらの混合溶液等の溶媒を用いて行うことができる。好ましい抽出溶媒としては、イオン交換水、純水（例えば、ミリＱ水）およびエタノール水溶液などが挙げられる。抽出する際には、乾燥葉を破砕してもよく、破砕しなくてもよい。破砕する場合はボールミルなどを用いて破砕してもよい。あるいは、ニーダー抽出器（例えば、ＳＫＮ－Ｒ１００、三友機器株式会社製）等を用いて、抽出処理をしてもよい。

抽出時には水性溶媒を加熱することで、より効率的にステビオール配糖体を抽出することができる。抽出する際の温度は、例えば、０～１００℃、２０～９０℃、４０～８０℃、２５～８０℃、３０～７５℃、３５～７０℃、４０～６５℃または４５～７０℃であってもよく、好ましくは４５～７０℃である。

抽出は１回だけでなく、複数回行ってもよい。複数回抽出を行うことで、葉に含まれているステビオール配糖体がより多く抽出される。効率の観点から、抽出は２回程度が好ましい。

（Ｂ）固液分離処理
本発明の粗精製方法の一態様においては、得られた抽出液を固液分離処理することで清澄液を得ることができる。固液分離処理としては、固体と液体が十分に分離されれば特に限定されないが、例えば、遠心分離器による処理や、メッシュによる処理、フィルタープレスによる処理が挙げられる。
固液分離処理は、複数の手段を用いてもよく、例えば、第１の固液分離処理の後に第２の固液分離処理を行って清澄液を得てもよい。

固液分離処理としては、上記した処理以外に、精密濾過膜による処理を挙げることもできる。

（Ｃ）凝集処理
本発明の粗精製方法の一態様においては、固液分離処理によって得られた清澄液に凝集剤を添加させることで処理液を得ることができる。凝集剤としては、特に限定されず、公知の無機凝集剤や有機高分子凝集剤を用いることができる。本発明の他の態様において、凝集剤は、硫酸アルミニウム、ポリ塩化アルミニウム、塩化鉄（III)またはその水和物、合成高分子凝集剤（ポリアクリルアミド高重合体やポリアクリルアミドの部分加水分解物など）、アルギン酸、キチン、キトサン、水酸化カルシウムから選択される１つ以上である。凝集剤としてこれらの凝集剤の１つ以上が含まれていればよく、他の凝集剤がさらに含まれていてもよい。凝集剤は２種以上のものを組み合わせて使用してもよく、例えば、水酸化カルシウムと塩化鉄の組合せ、または水酸化カルシウムと塩化鉄とキトサンとの組み合わせなどで使用してもよい。

凝集剤の添加量は、各凝集剤について凝集が起こる量であれば特に限定されないが、例えば、清澄液に含まれる可溶性固形分に対して、３．０～５０重量％の量で添加することができる。例えば、水酸化カルシウムについては清澄液中の固形分の１０～３０重量％に相当する量で添加することができ、好ましくは１２～２８重量％、より好ましくは１４～２５重量％の量で添加することができる。塩化鉄（III)六水和物の場合は、清澄液中の固形分の１５～４０重量％に相当する量で添加することができ、好ましくは１８～３８重量％、より好ましくは２０～３５重量％の量で添加することができる。０．５％（ｗ／ｖ）キトサン溶液の場合は、清澄液中の固形分の３．０～１０重量％に相当する量で添加することができ、好ましくは４.０～８．０重量％、より好ましくは４．５～７．０重量％の量で添加することができる。

凝集処理の際のｐＨは特に限定されず、凝集剤の種類によって凝集が最適化されるように適宜選択することができる。本発明の一態様において、凝集処理時の清澄液のｐＨは、２．０～１３、３．０～１３、４．０～１３、５．０～１３または６．０～１３であってもよい。

凝集処理の温度は特に限定されず、室温（約２５℃）で加熱や冷却を行わずに実施してもよい。

凝集処理の後、後述の樹脂精製処理の前に処理液に含まれる凝集物を除去してもよい。凝集物の除去は、ろ過等の任意の方法で行うことができる。

凝集物の除去方法としては、上記した方法以外に遠心分離も挙げることができる。

（Ｄ）樹脂精製処理
本発明の粗精製方法の一態様においては、凝集処理によって得られた処理液を疎水性多孔質樹脂で処理する。ステビオール配糖体は分子構造中に親水基と疎水基を持つ両親媒性であり、分子量は１，０００前後である。また、ｐＨ２．５～９．０において安定であり、酸性・塩基性でもイオン化はしないことが知られている。一方、凝集処理を経た処理液にはステビオール配糖体以外の成分も大量に含まれている。理論に拘束されるものではないが、そのような成分には、鉄イオンのように分子量がステビオール配糖体と異なる成分やアミノ酸のようにイオン化する成分があり、これらの成分を、疎水性多孔質樹脂の処理によって除去することができると考えられる。

疎水性のステビオール骨格を有するステビオール配糖体は合成樹脂に疎水結合し、捕捉される。他方、親水性の高い不純物は樹脂と結合せずスルー画分に移行し除去されるため、上記の樹脂を充填させたカラムに凝集処理を経た処理液を投入し、その後水で洗浄することでステビオール配糖体の純度は向上すると考えられる。また、低極性の溶媒によってステビオール配糖体と合成樹脂の官能基の結合は解離するから、最終的にステビオール配糖体を高収率で回収することができるという利点がある。

本発明の粗精製方法の一態様に用いる多孔質樹脂としては、水への親和性が低い多孔質樹脂であれば特に限定されないが、例えば、スチレンとジビニルベンゼンとの共重合体、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリロニトリル、ポリアミドおよびポリカーボネートから選択される１種以上の疎水性樹脂の多孔質樹脂が好ましい。本発明の好ましい態様において、スチレンとジビニルベンゼンとの共重合体にイオン交換基の導入処理がなされていないこと(すなわちイオン交換基を持たないこと)が好ましい。一般的に、イオン交換樹脂を製造する際にはスチレンとジビニルベンゼンとを共重合させて立体的網目構造を形成した後、樹脂にイオン交換基を導入するが、「イオン交換基の導入処理がなされていない」とはこのような処理がなされていないことを意味する。

本発明の粗精製方法の一態様において、疎水性多孔質樹脂は疎水性基を有し、疎水性基には、アリール基、アルキル基、アルキルシリル基、エステル基およびエポキシ基から選択される１つ以上が含まれる。これらから選択される１つ以上の疎水性基が含まれていれば、他の疎水性基がさらに含まれていてもよい。アリール基としては、例えば、フェニル基、ベンジル基、トリル基、キシリル基等が挙げられ、アルキル基としては、Ｃ１～２０のアルキル基、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、オクタデシル基などが挙げられる。

本発明の粗精製方法における好ましい態様において、疎水性多孔質樹脂の最頻度細孔半径は、１０～２００Åである。好ましい態様において、最頻度細孔半径は、１０～１５０Å、１５～１００Å、または２０～８０Åである。このような細孔特性を有することで、ステビオール配糖体が細孔に効率的に吸着されて、他の成分と効率的に分離されると考えられる。

なお、疎水性多孔質樹脂で処理を行う前に、陰イオン交換樹脂を用いて処理液を処理してもよい。陰イオン交換樹脂で事前に処理を行うことで、色素やカテキンなどの疎水性樹脂に結合する成分を効果的に除去することができる。そのような陰イオン交換樹脂としては、特に限定されないが、例えば、塩基性陰イオン交換樹脂が挙げられ、そのような塩基性陰イオン交換樹脂としては、官能基として１～２級アミノ基を導入した弱塩基性陰イオン交換樹脂や四級アンモニウム基（例えば、トリメチルアンモニウム基やジメチルエタノールアンモニウム基など）を有する強塩基性陰イオン交換樹脂などを用いることができる。

（Ｅ）濃縮処理
樹脂精製処理を得た溶液は、更に濃縮処理を行って水性溶媒を除去してもよい。そのような処理は特に限定されないが、加熱によって水性溶媒を蒸発させることや、減圧乾燥によって水性溶媒を除去する方法などが挙げられる。

濃縮処理後にはスプレードライを行ってもよい。スプレードライの温度条件は、通常、入口温度が１２０～２００℃程度であり、出口温度が８０～１２０℃程度である。

（粗精製物）
本発明の製造方法に用いられる粗精製物は、粗精製物の総重量に対して５０～９５質量％の量の総ステビオール配糖体を含み、好適には、５５～９５、６０～９５、７０～９５、８０～９５、９０～９５、５０～９０、５０～８０、５０～７０、５０～６５、５０～６０、５５～９０、５５～８０、５５～７０、５５～６０、６０～７０、６０～８０、５０～９４、５５～９４、６０～９４のいずれかの量（質量％）の総ステビオール配糖体を含む。

本願明細書において、好適には、総ステビオール配糖体は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ステビオシド、ＲｅｂＦおよびＲｅｂＭの７種のステビオール配糖体からなる。本願明細書においては総ステビオール配糖体のことをＴＳＧと略称することがある。

粗精製物は、少なくともＲｅｂＡおよびＲｅｂＤを含む。好適には、粗精製物におけるＲｅｂＡの含有量（質量％）が、５～７０、１５～７０、２０～７０、２５～７０、３５～７０、４５～７０、５５～７０、６５～７０、５～６５、５～４５、５～２５、１５～６５、２５～４５、４０～７５、４５～６５のいずれかであり、かつ、ＲｅｂＤの含有量（質量％）が１～７０、２～７０、５～７０、１５～７０、２５～７０、３５～７０、４５～７０、５５～７０、６５～７０、１～６５、１～４５、１～２５、２～６５、２～４５、２～２５、５～６５、５～４５、５～２５、１５～６５、２５～４５、４０～７５、４５～６５、１～２０、１～１５、１～１０、１～８、２～２０、２～１５、２～１０、２～８のいずれかである。

別の好ましい態様において、粗精製物におけるＲｅｂＡの含有量は１～３０質量％であり、且つ、ＲｅｂＤの含有量は上述のいずれかである。

＜晶析用溶液の調製＞
続いて、任意の容器、例えば、攪拌翼を備えた結晶缶に溶媒を入れ、粗精製物を溶媒中に混合し、晶析用溶液を調製する。このとき、ＲｅｂＡが結晶化しないように、ＲｅｂＡの過飽和度（１０℃）を特定の範囲に設定しながら、ＲｅｂＤの過飽和度（１０℃）を特定の範囲に設定する。そして、そのような過飽和度が達成されるような量で粗精製物を溶媒中に混合する。
なお、過飽和度（１０℃）とは、１０℃を基準温度とした場合の過飽和度を意味する。１０℃の冷却を必須とする意図はない。

過飽和度は、以下の式で表される。
σ＝（Ｃ－Ｃ^＊）／Ｃ^＊
式中、σは過飽和度を、Ｃは、溶媒に対する物質の添加量の占める割合（ｐｐｍ）を、Ｃ^＊は飽和溶解濃度（ｐｐｍ）を示す。
なお、本明細書において、Ｃを単に「物質の濃度」ではなく「溶媒に対する物質の添加量の占める割合」としたのは、添加した物質が完全溶解せず懸濁状態となる場合を想定してのことである。本明細書では、添加した物質の溶解の有無及びその程度によらず、添加量の溶媒に対する割合を過飽和度の基準とする。
また、本発明においては、種晶を使用する場合があるが、過飽和度の計算に、この種晶の添加量は含めないものとする。

本明細書において、飽和溶解度は、以下の方法で測定されるものである。すなわち、所定のメタノールまたはエタノール濃度（ｗ/ｗ）の溶媒１００ｍｌを容器（容量１００ｍｌまたは２００ｍｌ、好適には２００ｍｌ）に入れ、ウォーターバスであらかじめ液温を１０℃にした後、２００ｒｐｍで攪拌し、対象物質を過剰量（懸濁するまでの量）投入する。２４時間後、０．４５ｕｍメンブレンフィルターでろ液を獲得し、ろ液中に含まれる対象物質（ＲｅｂＡまたはＲｅｂＤ）量をＬＣＭＳにて測定する。ＬＣＭＳとしては、好適には、島津社製、ＬＣＭＳ８０５０を使用する。

ＲｅｂＤの過飽和度（１０℃）は、１０以上であり、好適には、１０～２００、１０～１８０、１０～１６０、１０～１４０、１０～１２０、１０～１００、１０～８０、１０～６０、１０～４０、１０～２０、１５～２００、３５～２００、５５～２００、７５～２００、９５～２００、１１５～２００、１３５～２００、１５５～２００、１７５～２００、１５～１８０、１５～１６０、１５～１４０、１５～１２０、１５～１００、１５～８０、１５～６０、１５～４０、１５～２０、２０～１８０、２０～１６０、２０～１４０、２０～１２０、２０～１００、２０～８０、２０～６０、２０～４０、８０～１８０、８０～１６０、８０～１４０、８０～１２０、８０～１００、１００～１８０、１００～１６０、１００～１４０、１００～１２０のいずれかである。

別の好ましい態様において、ＲｅｂＤの過飽和度（１０℃）は、１０～３５０、２０～３５０、５０～３５０、１０～３００、２０～３００、５０～３００、１０～２０５または２０～２０５である。

ＲｅｂＡの過飽和度（１０℃）は、１８以下であり、０以下も含む。本発明の一態様において、ＲｅｂＡの過飽和度（１０℃）は、０より大きく１８以下である。より好適には、３～１８、３～１３、３～８、５～１８、７～１８、９～１８、１１～１８、１３～１８、１５～１８、１７～１８、５～１３、７～１１、５～１５、７～１５、９～１５、１１～１５、１３～１５のいずれかである。

別の好ましい態様において、ＲｅｂＡの過飽和度（１０℃）は、１６以下、マイナス１～１６、０～１６のいずれかである。

ＲｅｂＡの過飽和度が小さく且つＲｅｂＤの過飽和度が大きいという条件では、ＲｅｂＡが析出しにくくＲｅｂＤが析出しやすい。ＲｅｂＡとＲｅｂＤの過飽和度（１０℃）がどちらも上記範囲内にあり、且つ、ＲｅｂＡの過飽和度が０より大きい場合、ＲｅｂＡの過飽和度σＡに対するＲｅｂＤの過飽和度σＤの割合、σＤ／σＡが、４以上、５以上、４～４０、５～４０、７～４０、１２～４０、１７～４０、２２～４０、２７～４０、３２～４０、３７～４０、４～３０、５～３０、７～３０、１２～３０、１７～３０、２２～３０、２７～３０、４～３５、５～３５、８～３５、１３～３５、１８～３５、２３～３５、２８～３５、３３～３５、８～２５、１３～２５、１８～２５、２３～２５、１０～４０、１５～４０、２０～４０、２５～４０、３０～４０、３５～４０、１０～３０、１５～３０、２０～３０、２５～３０のいずれかであることが好ましい。

別の好ましい態様において、σＤ／σＡは、４～１００万、５～１００万、４～７５万、５～７５万のいずれかである。

晶析用溶液の調整に用いる溶媒は、メタノールまたはエタノールの溶媒である。好適には、メタノール水溶液またはエタノール水溶液である。より好適には、エタノールの水溶液である。特に好適には、メタノール溶媒を使用せずエタノール溶媒を使用する。「メタノール溶媒を使用せずエタノール溶媒を使用する」とは、好適には、溶媒におけるメタノール濃度が１ｍｇ／Ｌ以下、より好適には０．５ｍｇ／Ｌ以下、特に好適には０．１ｍｇ／Ｌ以下であることを意味する。なお、メタノール濃度の下限は０ｍｇ／Ｌである。エタノールは、メタノールよりも環境負荷が低く、加えて、人体への影響も低い。メタノールを使用する場合、製造現場において、法令に基づく換気設備及び換気能力や従業員の特殊健康診断実施が義務化されているが、エタノールにはそうした義務がないという点で工業利用上大きなメリットがある。

粗精製物の添加量は、過飽和度が上述した範囲となるように適宜設定されるが、好適には、溶媒あたり１～３０質量％、より好適には、１～２５、１～２０、１～１５，１～１０、５～３０、５～２５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～３０、１５～３０、２０～３０、２５～２９、１０～２５、１５～２０のいずれかの量（質量％）となるような量を混合する。

別の好ましい態様において、粗精製物の添加量は、溶媒あたり１～２８質量％、１～６質量％、６～２５質量％または６～２８質量％である。

粗精製物の添加量は、過飽和度が上述した範囲となるように適宜設定されるが、好適には、粗精製物を、溶媒あたりのＲｅｂＤが０．１５～３．５０、０．３０～３．５０、０．４５～３．５０、０．６０～３．５０、０．７５～３．５０、０．９０～３．５０、１．０５～３．５０、１．２０～３．５０、１．５０～３．５０、１．８０～３．５０、２．１０～３．５０、２．４０～３．５０、２．７０～３．５０、３．００～３．５０、０．１５～３．００、０．３０～３．００、０．４５～３．００、０．６０～３．００、０．７５～３．００、０．９０～３．００、１．０５～３．００、１．２０～３．００、１．５０～３．００、１．８０～３．００、２．１０～３．００、２．４０～３．００、２．７０～３．００、０．１５～２．５０、０．１５～２．００、０．１５～１．５０、０．１５～１．００、０．１５～０．７０、０．１５～０．４０、０．３０～２．５０、０．４５～２．００、０．６０～１．５０、０．７５～１．００のいずれかの量（質量％）となるような量で添加する。

別の好ましい態様において、粗精製物を、溶媒あたりのＲｅｂＤが０．２０～３．５０、０．２５～３．５０のいずれかの量（質量％）となるような量で添加する。

メタノールまたはエタノールを含む溶媒の濃度（質量％）は、好適には、９９．９質量％以下、より好適には、９２質量％以下である。本発明の一態様において、５０～９９、６０～９９、７０～９９、８０～９９、９０～９９、５０～８９、６０～７９、５０～９２、６０～９２、７０～９２、８０～９２、９０～９２、５０～８２、６０～７２、７０～９０、８０～９０、７０～８０質量％のいずれかである。

別の好ましい態様において、メタノールまたはエタノールを含む溶媒の濃度（質量％）は、７３質量％以上９５質量％未満、７３～９２質量％のいずれかである。

粗精製物を溶媒に混合する際の溶媒の液温（℃）を４０～８０、４２～８０、４４～８０、４６～８０、４８～８０、５０～８０、５２～８０、５７～８０、６２～８０、６７～８０、７２～８０、４０～７５、４０～７０、４０～６５、４０～６０、４０～５５、４０～５０、４２～７５、４４～７０、４６～６５、４８～６０、５０～５５のいずれかに維持されていることが好ましい。

好適には、粗精製物を溶媒に混合するに際し、あわせて種晶を混合することが好ましい。種晶としては、ＲｅｂＤを使用することが好ましい。種晶の粒径に特に制限はない。

種晶を添加する場合には、種晶の溶解を回避する観点から、過飽和となっているような溶液温度であることが好ましい。

種晶の添加量は、他の条件等に応じて適宜決定すればよいが、添加量が多いほうが収率が向上する傾向にある。好適には、下記式で表される種晶添加率Ｃｓが０．０５０～１０．０００、０．０７５～１０．０００、０．１００～１０．０００、０．２００～１０．０００、０．３００～１０．０００、０．４００～１０．０００、０．５００～１０．０００、０．６００～１０．０００、０．７００～１０．０００、０．８００～１０．０００、０．９００～１０．０００、１．０００～１０．０００、２．０００～１０．０００、３．０００～１０．０００、４．０００～１０．０００、５．０００～１０．０００、６．０００～１０．０００、７．０００～１０．０００、８．０００～１０．０００、０．０５０～９．０００、０．０５０～８．０００、０．０５０～７．０００、０．０５０～６．０００、０．０５０～５．０００、０．０５０～４．０００、０．０５０～３．０００、０．０５０～２．０００、０．０５０～１．０００、０．０５０～０．７００、０．０５０～０．４００、０．０５０～０．１００、０．０７５～９．０００、０．１００～８．０００、０．２００～７．０００、０．３００～６．０００、０．４００～５．０００、０．５００～４．０００、０．６００～３．０００、０．７００～２．０００、０．８００～１．０００、５．５００～９．５００、６．５００～９．５００、７．５００～９．５００、８．５００～９．５００、５．５００～８．５００、６．５００～７．５００のいずれかの値であることが好ましい。
Ｃｓ＝Ｗｓ／Ｗ_ｔｈ
式中、Ｗｓは種晶量（単位：ｇ）を、Ｗ_ｔｈは想定収量（単位：ｇ）を示す。
Ｗ_ｔｈ＝（Ｃ－Ｃ^＊）／1,000,000×溶媒量
式中、Ｃは溶媒に対するＲｅｂＤの添加量の占める割合（ｐｐｍ）を、
Ｃ^＊は飽和溶解度（単位：ｐｐｍ）を示す。
溶媒量の単位はｍｌである。
Ｃには種晶の量は含めない。

＜析出＞
任意の結晶装置、例えば円筒回転式助晶機等の助晶機にて、晶析用溶液を攪拌しながら冷却し、ＲｅｂＤを析出させる。

冷却を急激に行うとＲｅｂＤ純度の低い晶析物が得られる可能性や、収率が向上しない虞があることから、冷却は漸次行うことが好ましい。好適な冷却速度（℃／分）は、０．００２℃／分以上であり、より好適には、０．００２～１．３７℃／分であり、特に、０．００２～１．３７、０．００２～０．８７、０．００２～０．３７、０．００２～０．２７、０．００２～０．１７、０．００２～０．０７、０．００２～０．０４、０．００２～０．０１、０．００２～０．００７、０．００７～１．３７、０．０１７～１．３７、０．０２７～１．３７、０．０５７～１．３７、０．０８７～１．３７、０．３８７～１．３７、０．６８７～１．３７、０．９８７～１．３７、０．００７～０．８７、０．０１７～０．３７、０．０２７～０．２７、０．０５７～０．１７のいずれかである。

別の好ましい態様において、冷却速度（℃／分）は、０．０２～０．２である。

攪拌冷却時間（単位：時間）は、種晶使用の有無等他の条件に応じて適宜設定すればよいが、収率を向上させる観点から、１～４８、６～４８、１１～４８、１６～４８、２１～４８、２６～４８、３１～４８、３６～４８、４１～４８、４６～４８、１～４３、１～３８、１～３３、１～２８、１～２３、１～１８、１～１３、１～８、１～３、６～４３、１１～３８、１６～３３、２１～２８のいずれかが好ましい。

別の好ましい態様において、攪拌冷却時間（単位：時間）は、６～２４時間、１２時間以上または１２～２４時間である。

析出工程における冷却温度（℃）は、種晶使用の有無等の他の条件により適宜決定されるが、３～４０、６～４０、９～４０、１２～４０、１５～４０、１８～４０、２１～４０、２４～４０、２７～４０、３０～４０、３３～４０、２０～４０、３５℃以下、３～３５、６～３５、９～３５、１２～３５、１５～３５、１８～３５、２１～３５、２４～３５、２７～３５、３０～３５、２５～３５のいずれかまで冷却することが好ましい。

別の好ましい態様において、冷却温度（℃）は、９～２０℃、９～１７℃、４～２０℃または４～１７℃まで冷却する。

さらに、冷却開始時の温度（℃）は、３０～８５，４０～８５，５０～８５，６０～８５，７０～８５，３０～８０，３０～７０，３０～６０，３０～５０，３０～４０，４０～８０，４０～７０，４０～６０のいずれかが好ましい。

攪拌速度（ｒｐｍ）は、５～６００，５～５００，５～４００，５～３００，５～２００，５～１００，５～５０，５～２０，５５～６００，１０５～６００，１５５～６００，２０５～６００，２５５～６００，３０５～６００，３５５～６００，４０５～６００，４５５～６００，５０５～６００，５５５～６００，５０～６００，２００～６００，３５０～６００，５００～６００，１００～４５０，１００～３００，１００～１５０，２００～５００，３００～４００のいずれかが好ましい。

＜後工程＞
析出したＲｅｂＤを含む固体組成物と液相とを遠心分離や濾別等により分離し、分離後のＲｅｂＤを乾燥する。分離手段は、固体と液体が十分に分離されれば特に限定されないが、例えば、遠心分離器による処理や、メンブレンフィルターによる処理、メッシュによる処理が挙げられる。分離後乾燥前に、必要に応じて、晶析に用いたのと同じ溶媒等でＲｅｂＤ結晶に少量噴霧して表面を洗浄してもよい。

＜その他＞
固液分離処理後の母液は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＭ等の他の成分の晶析に利用してもよい。

本発明の製造方法の一態様においては、純度よりも収率をより重要視する観点から、上述の粗精製工程、晶析用溶液調製工程、析出工程および後工程を一回ずつ行い、製造完了としてもよい（一回晶析）。また、他の態様においては、ＲｅｂＤ含有晶析物の純度をより高めるために、晶析用溶液調製工程～後工程までを複数回くりかえしてもよい（複数回晶析）。収率と純度のバランスの観点から、二回晶析が好ましい。

＜二回晶析＞
二回晶析を行う場合、上述の粗精製工程～析出工程までを実施し、析出したレバウディオサイドＤを分離し、乾燥して、一次晶析物を得た後、上述した粗精製物に代えて一次晶析物をレバウディオサイドＤの１０℃での過飽和度が１０以上であり且つレバウディオサイドＡの１０℃での過飽和度が１８以下になるように、メタノールまたはエタノールを含む溶媒中に混合して、一次晶析物溶解液を調製し、上述した晶析用溶液に代えて一次晶析物溶解液を攪拌しながら冷却し、ＲｅｂＤを析出させ、析出したＲｅｂＤを分離し、乾燥することで、ＲｅｂＤ含有晶析物を得ることができる。二回晶析における手順や条件は、前述した晶析手順や晶析条件と同様にしてよい。その場合、上述の説明における「粗精製物」を「一次晶析物」に読み替えるものとする。

二回晶析では、晶析用溶液の調製に用いるメタノールまたはエタノールを含む溶媒の濃度を、一回晶析の場合に比べて低くすることで、より純度を高めることができる。また、２回目の晶析では、ＲｅｂＡの過飽和度を１回目よりも低く設定してもよい。

本発明においては、晶析を何回も行っても構わないが、２回以下の少ない晶析回数でも十分に高純度の精製が可能である。そのため、欠減の減少やサイクルタイム短縮、省エネ等の様々な利点がある。

＜ＲｅｂＤ含有晶析物＞
本発明の方法により得られるＲｅｂＤ含有晶析物（以下、本発明のＲｅｂＤ含有晶析物と呼ぶことがある。）は、ＲｅｂＤを多く含有している。好適には、本発明のＲｅｂＤ含有晶析物におけるＴＳＧに対するＲｅｂＤの割合（質量％）は、３５～９９、４５～９９、５５～９９、６５～９９、７５～９９、８５～９９、３５～８９、３５～７９、３５～６９、３５～５９、３５～９５、４５～９５、５５～９５、６５～９５、７５～９５、８５～９５、４０～９９、５０～９９、６０～９９、７０～９９、８０～９９、９０～９９、４０～９９、４０～８９、４０～７９、４０～６９、４０～５９、５０～８９、６０～７９、４０～９５、５０～９５、６０～９５、７０～９５、８０～９５、９０～９５、４０～８５、４０～７５、４０～６５、４０～５５、５０～８５、６０～７５のいずれかである。

本発明のＲｅｂＤ含有晶析物では、ＲｅｂＡの含有量が少ない。好適には、ＲｅｂＤの割合が上述した何れかの数値範囲であるという条件の下、ＴＳＧに対するＲｅｂＡの割合（質量％）が、５～８０、５～５０、１０～５０、２０～５０、３０～５０、４０～５０、１０～４０、２０～４０、２０～３０、３０～４０、１０～３０、１０～２０、１２～１８、５～３０、５～２０、５～１０のいずれかである。

別の好ましい態様において、ＴＳＧに対するＲｅｂＡの割合（質量％）は、３．５～８０、３．５～３５、３．５～３０または３．５～１２である。

本発明の方法では、高収率でＲｅｂＤを晶析できる。好適には、晶析回数を一回とした場合の、粗精製物中に含まれていたＲｅｂＤに対する晶析したＲｅｂＤの割合（質量％）が７０～９９、７５～９９、８０～９９、８５～９９、９０～９９、７０～９４、７０～８９、７０～８４、７０～７９、７０～７４、７５～９４、８０～８９、５０～９９、５５～９９、６０～９９、６５～９９、５０～９４、５０～８９、５０～８４、５０～７９、５０～７４、５０～６９、５５～９４、６０～８９、６５～８４のいずれかである。

別の好ましい態様において、晶析回数を一回とした場合の、粗精製物中に含まれていたＲｅｂＤに対する晶析したＲｅｂＤの割合（質量％）は、３９～８５、より好適には３９～８２である。

また、葉の抽出から晶析後までのＲｅｂＤの回収率（総収率と呼ぶことがある。）も高く、好適には、３５～９０、４５～９０、５５～９０、６５～９０、または７５～９０質量％である。

本発明のＲｅｂＤ含有晶析物におけるＴＳＧの割合（質量％）は、好適には、５０～９９、６０～９９、７０～９９、８０～９９、９０～９９、５０～９０、５０～７０、５０～６０、６０～８０、６０～９０、６０～７０または７０～８０である。
別の態様において、本発明のＲｅｂＤ含有晶析物におけるＴＳＧの割合（質量％）は、好適には、５０以上、６０以上、７０以上または７５以上である。

本発明の一態様において、製造時にエタノール溶媒を使用し、メタノール溶媒を使用しなかった場合、ＲｅｂＤ含有晶析物に含まれるメタノール量は少なく、好適には１０ｐｐｍ未満であり、特に好適には５ｐｐｍ未満であり、最も好適には２ｐｐｍ以下である。メタノール含有量は、ヘッドスペースＧＣＭＳで測定することができる。その下限値は、好ましくは１ｐｐｍである。

別の好ましい態様において、製造時にエタノール溶媒を使用し、メタノール溶媒を使用しなかった場合、ＲｅｂＤ含有晶析物に含まれるメタノール量の下限値は０ｐｐｍである。

本発明の一態様において、製造時にエタノール溶媒を使用し、メタノール溶媒を使用しなかった場合、さらに、ＲｅｂＤ含有晶析物における、エタノールに対するメタノール含有割合ＭｅＯＨ／ＥｔＯＨもまた小さな値である。好適には、０．０００１０～０．０００８０であり、より好適には、０．０００１０～０．０００７０であり、特に好適には、０．０００１０～０．０００５０であり、最も好適には、０．０００１０～０．０００３０である。

本発明の一態様によれば、本発明のＲｅｂＤ含有晶析物を甘味料組成物として用いてもよい。そのような甘味料組成物は、本発明のＲｅｂＤ含有晶析物に加え、ステビオール配糖体以外の他の甘味料を含んでいてもよい。他の甘味料としては、果糖、砂糖、果糖ぶどう糖液糖、ぶどう糖、麦芽糖、高果糖液糖、糖アルコール、オリゴ糖、はちみつ、サトウキビ搾汁液（黒糖蜜）、水飴、羅漢果末、羅漢果抽出物、甘草末、甘草抽出物、ソーマトコッカスダニエリ種子末、ソーマトコッカスダニエリ種子抽出物、ショ糖などの天然甘味料や、アセスルファムカリウム、スクラロース、ネオテーム、アスパルテーム、サッカリンなどの人工甘味料などが挙げられる。中でもすっきりさ、飲みやすさ、自然な味わい、適度なコク味の付与の観点から、天然甘味料を用いることが好ましく、特に、果糖、ぶどう糖、麦芽糖、ショ糖、砂糖が好適に用いられる。これら甘味成分は一種類のみ用いてもよく、また複数種類を用いてもよい。

また、本発明の一態様によれば、本発明のＲｅｂＤ含有晶析物を含む飲食品、香料および医薬品（本明細書中それぞれ「本発明の飲食品」、「本発明の香料」および「本発明の医薬品」ともいう）が提供される。本発明の飲食品、香料及び医薬品は、本発明のＲｅｂＤ含有晶析物を含んでいれば特に限定されない。ここで飲食品とは、飲料および食品を意味し、好ましい対応において飲食品は飲料である。したがって、ある実施態様では、本発明は新規な飲料又は食品を提供する。

本発明の飲食品、香料及び医薬品に含まれる総ステビオール配糖体の量（質量ｐｐｍ）は、具体的な飲食品によって異なるが、飲料の場合、おおむね１～８００質量ｐｐｍであるのが好ましく、例えば、２０～７５０、２０～７００、２０～６５０、２０～６００、２０～５５０、２５～５５０、３０～５５０、３５～５５０、４０～５５０、４５～５５０、５０～５５０、５５～５５０、２０～５４０、２５～５４０、３０～５４０、３５～５４０、４０～５４０、４５～５４０、５０～５４０、５５～５４０、２０～５３０、２５～５３０、３０～５３０、３５～５３０、４０～５３０、４５～５３０、５０～５３０、５５～５３０、２０～５２０、２５～５２０、３０～５２０、３５～５２０、４０～５２０、４５～５２０、５０～５２０、５５～５２０、２０～５１０、２５～５１０、３０～５１０、３５～５１０、４０～５１０、４５～５１０、５０～５１０、５５～５１０、２０～５０５、２５～５０５、３０～５０５、３５～５０５、４０～５０５、４５～５０５、５０～５０５、５５～５０５、２０～５００、２５～５００、３０～５００、３５～５００、４０～５００、４５～５００、５０～５００、５５～５００、２０～４９５、２５～４９５、３０～４９５、３５～４９５、４０～４９５、４５～４９５、５０～４９５、５５～４９５、２０～４９０、２５～４９０、３０～４９０、３５～４９０、４０～４９０、４５～４９０、５０～４９０、５５～４９０、１００～４００、１５０～４００、２００～４００、２５０～４００、３００～４００、１００～１５０、１００～２００、１００～２５０または１００～３００であってもよい。含有量をこの範囲とすることで適度な甘みを付与することができるという利点がある。本明細書において「ｐｐｍ」とは、特に明記しない限り、「質量ｐｐｍ」を意味する。

本発明の飲食品、香料および医薬品は、さらにステビオール配糖体以外の甘味料を含んでいてもよい。そのような甘味料としては、果糖、砂糖、果糖ぶどう糖液糖、ぶどう糖、麦芽糖、ショ糖、高果糖液糖、糖アルコール、オリゴ糖、はちみつ、サトウキビ搾汁液（黒糖蜜）、水飴、羅漢果末、羅漢果抽出物、甘草末、甘草抽出物、ソーマトコッカスダニエリ種子末、ソーマトコッカスダニエリ種子抽出物などの天然甘味料や、アセスルファムカリウム、スクラロース、ネオテーム、アスパルテーム、サッカリンなどの人工甘味料などが挙げられる。中でもすっきりさ、飲みやすさ、自然な味わい、適度なコク味の付与の観点から、天然甘味料を用いることが好ましく、特に、果糖、ぶどう糖、麦芽糖、ショ糖、砂糖が好適に用いられる。これら甘味成分は一種類のみ用いてもよく、また複数種類を用いてもよい。

本発明の食品の例としては、特に限定されるものではないが、製菓、製パン類、穀粉、麺類、飯類、農産・林産加工食品、畜産加工品、水産加工品、乳・乳製品、油脂・油脂加工品、調味料またはその他の食品素材等が挙げられる。

本発明の飲料の例としては、特に限定されるものではないが、例えば炭酸飲料、非炭酸飲料、アルコール飲料、非アルコール飲料、ビールやノンアルコールビール等のビールテイスト飲料、コーヒー飲料、茶飲料、ココア飲料、栄養飲料、機能性飲料などが挙げられる。

以下に実験例により本発明を更に具体的に説明する。

以下の実験例において、特記しない限り、ＴＳＧは、ＲｅｂＡ，ＲｅｂＢ，ＲｅｂＣ，ＲｅｂＤ，Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ，ＲｅｂＦ，ＲｅｂＭの７種類を意味する。

最適なＲｅｂＤ晶析条件を探るべく、まずは研究室において小規模なスケールの実験を行い、各種実験条件と結果の関係を検討した。小規模な実験は、条件と結果の大まかな関係を知るためのものである。

＜実験例１＞
核発生および結晶成長の現象において、過飽和度は非常に大きな影響を与える。そこで、ステビア葉の主成分であるＲｅｂＡおよびターゲット成分であるＲｅｂＤの各溶媒における溶解度を測定した。
具体的には、所定のエタノール濃度（ｗ/ｗ）の溶媒１００ｍｌを５０ｍｌまたは１００ｍｌガラス容器（セパラブル丸底フラスコ,東京理化器械株式会社）に入れ、ウォーターバス（ＰＣＣ－７０００、東京理化器械株式会社）であらかじめ所定の温度にした後、２００ｒｐｍで攪拌（ＳＰＺ－１００、東京理化器械株式会社）し、ＲｅｂＡ（Ｊ－１００、守田化学株式会社）またはＲｅｂＤ（Ｊｉｎｉｎｇ Ｒｅｎｅｗａｌ＆Ｊｏｉｎｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃｈｉｎａ）を過剰量（懸濁するまでの量）投入した。２４時間後、０．４５ｕｍメンブレンフィルターでろ液を獲得し、ろ液中に含まれるＲｅｂＡまたはＲｅｂＤ量をＬＣＭＳ（島津社製、ＬＣＭＳ８０５０）にて測定し、溶解度曲線を作成した。結果を図１に示す。図１によれば、１０℃、９０％エタノール溶媒におけるＲｅｂＡ及びＲｅｂＤの飽和溶解濃度はそれぞれ、８，２５０ｐｐｍと９９．３ｐｐｍであった。

＜実験例２＞
本実験では、溶媒に対するＲｅｂＤの割合がＲｅｂＤの回収率に与える影響を確認した。

ＲｅｂＤ一成分系での実験を行った。具体的には、未変性アルコール９９．９質量％グレードを用い、これに適宜水を添加してエタノール濃度を調整し、５０質量％エタノール溶媒を調製した。セパラブル丸底フラスコ（東京理化器械株式会社製）を用い、下記表の条件で、ＲｅｂＤを５０質量％エタノール溶媒に溶解した。このとき、想定される収量に対する種晶添加率が０．０５となるような量のＲｅｂＤを種晶として添加した。次いで、下記条件で冷却した。
（晶析条件）
Ｉｎｉｔｉａｌ Ｔｅｍｐ ４５℃
Ｅｎｄ Ｔｅｍｐ １０℃
ＲｅｂＤ Ｊｉｎｉｎｇ Ｒｅｎｅｗａｌ＆
Ｊｏｉｎｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ製
Ａｇｉｔａｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄ １００ｒｐｍ

種晶添加率は、下記式により算出される。
Ｃ_ｓ＝Ｗ_ｓ／Ｗ_ｔｈ
式中、Ｗ_ｓは種晶量（ｇ）を、Ｗ_ｔｈは想定収量（ｇ）を、Ｃ_ｓは種晶添加率（単位無し）を示す。
Ｗ_ｔｈ＝（Ｃ－Ｃ^＊）／1,000,000×溶媒量
式中、Ｃは溶媒に対するＲｅｂＤの添加量(種晶の量は除く)の占める割合（ｐｐｍ）を、Ｃ^＊は飽和溶解度（ｐｐｍ）を示す。溶媒量の単位はｍｌである。
次いで、固液分離を行って結晶を得た。固液分離に用いたフィルターは、アドバンテック製０．４５ｕｍメンブレンフィルターであった。
その後、ＲｅｂＤ結晶を９９質量％エタノールにて洗浄した。洗浄後の結晶を５０℃にて乾燥した。

結果を図２に示す。いずれの割合においても７５％程度の回収率（使用したＲｅｂＤ量（種晶を含む）に対する回収したＲｅｂＤ量）を示すことがわかった。

＜実験例３＞
本実験では、溶媒として用いるエタノールの濃度が、ＲｅｂＤ晶析物のＴＳＧ（総ステビオール配糖体）組成および収量に与える影響を検討した。

下記組成（単位：質量％）の粗精製物を用意した。この粗精製物における、ＴＳＧあたりのＲｅｂＤ純度は、１．８質量％であった。粗精製物におけるＴＳＧ含有量は５９．７質量％であった。

下記量の粗精製物を、下記濃度および量のエタノール溶媒（７８℃）に溶解した。
次いで、下記温度プロファイルおよび攪拌条件にて冷却し、ＲｅｂＤ結晶を晶析した。晶析には、セパラブル丸底フラスコ（東京理化器械株式会社製）を用いた。また、エタノールとしては、未変性アルコール９９．９質量％グレードを用い、これに適宜水を添加してエタノール濃度を調整した。なお、溶媒に対するＲｅｂＤの比率は０．２５質量％、溶媒に対するＴＳＧの比率は１３．８質量％、ＲｅｂＡの過飽和度（１０℃）σＡは５.１０（９０．５０質量％エタノール溶媒使用時）、ＲｅｂＤの過飽和度（１０℃）σＤは２４．３７（９０．５０質量％エタノール溶媒使用時）、σＤ／σＡは４．７８（９０．５０質量％エタノール溶媒使用時）であった。
なお、過飽和度の算出式は以下のとおりである。初期濃度（溶媒に対する物質の添加量の占める割合）に種晶量は含まない。
σ＝（初期濃度－１０℃での飽和溶解度）／（１０℃での飽和溶解度）

次いで、固液分離を行ってＲｅｂＤ結晶を得た。固液分離に用いたフィルターは、アドバンテック製０．４５ｕｍメンブレンフィルターであった。
その後、ＲｅｂＤ結晶を９９質量％エタノールにて洗浄した。洗浄後のＲｅｂＤ結晶を５０℃にて乾燥し、ＲｅｂＤ晶析物が得られた。
得られたＲｅｂＤ晶析物とろ液の配糖体比率をＬＣＭＳ（島津社製、ＬＣＭＳ８０５０）にて分析した。結果を図３および図４に示す。

本実験の条件下においては、濃度９５質量％のエタノールを使用した場合、スラリーの粘度が高くなり、固液分離ができなかった。一方、エタノール濃度が７０質量％程度である場合、結晶が析出することはなかった。
図４より、エタノール濃度が低い場合、結晶の析出が悪い傾向であったが、図３は、ＲｅｂＤ純度はエタノール濃度にあまり影響を受けないことを示唆した。本実験で採用した溶媒に対するＴＳＧの比率（１３．８％）においては最適なエタノール溶媒濃度が存在することがわかった。

＜実験例４＞
冷却速度は結晶核の出現および結晶成長に大きく影響を与える。例えば、冷却速度が速い場合に、初期の少ない核の状態から結晶成長する際、過飽和が消費しきれず、核発生が優位となることが多い。一方、温度降下が遅い場合、結晶成長が優位となる。しかし、その場合、過飽和の消費速度にもよるが晶析時間は長くなる傾向にある。
本実験では冷却速度のＴＳＧ組成および収量への影響を検討した。

具体的には、表３の条件に代えて下記表の条件を採用した点以外は、実験例３と同様にして一次晶析を行い、ＲｅｂＤ晶析物を得た。

結果を図６および図７に示す。図６および図７より、温度降下速度が速い方で、ＴＳＧに対するＲｅｂＤ純度の低い沈殿物が得られた。また、収量も低下した。沈殿物の性状については、温度降下が速い方では粘性がある沈殿物が得られた。一方、遅いほうでは粘性は確認されなかった。

＜実験例５＞
晶析時間は結晶成長に大きな影響を与えると同時に精製工程全体のタイムサイクルに影響を与える。結果として、晶析時間はコストや製品特性（収量、純度等）にも影響を与える。そのため、本実験では、晶析時間のＴＳＧ組成および収量への影響を検討した。

具体的には、表３の条件に代えて下記表の条件を採用した点以外は、実験例３と同様にして一次晶析を行い、ＲｅｂＤ晶析物を得た。

結果を図９および図１０に示す。晶析時間は配糖体組成に影響を与えない一方、収量には影響を与えることがわかった。６Ｈ晶析では、晶析後のろ液からさらに結晶が析出した。このことから少なくとも１２Ｈ以上の晶析時間が必要と考えた。但し、種晶使用の有無により更なる時間短縮の可能性はあると考える。

＜実験例６＞
本実験では、ＲｅｂＤの更なる高純度化を目指すべく、一次晶析物を用いて二次晶析の実施の是非を検討した。具体的には、実験例２～５の結果を参考に、一次晶析条件を下記表のとおりに決定した。そして、表３の条件に代えて下記表の条件を採用した点以外は、実験例３と同様にして一次晶析を行い、ＲｅｂＤ一次晶析物を得た。

その後、表３の条件に代えて下記表の条件を採用した点以外は、実験例３と同様にして二次晶析を行い、ＲｅｂＤ二次晶析物を得た。なお、溶媒に対するＲｅｂＤの比率は、０．５６質量％であった。ＲｅｂＡの過飽和度（１０℃）は－０．６６、ＲｅｂＤの過飽和度（１０℃）は５３．６であった。

結果を図１１および図１２に示した。実験例３において一次晶析の溶媒を検討した場合と同様に、二次晶析においてもエタノール濃度が低下すると収量が減少することがわかった。

本実験例における、最終的な結晶組成および収率情報としては、約９０％の純度を達成する条件下（つまり二次晶析でのエタノール濃度７０質量％）で、二次晶析まで行った場合の収率が約４３質量％であった。

＜実験例７＞
本実験例では、一次晶析でＲｅｂＤではなくＲｅｂＡを晶析させる場合について検討した。

ステビア植物の乾燥葉を用いて抽出操作を行い、得られた抽出物を固液分離操作に供した。乾燥葉中の各ステビオール配糖体の含有率は、下記のとおりであった（単位：質量％）。本実験例で用いた乾燥葉中のＴＳＧの含有量は、１００ｇ当たり１６．６ｇであった。

固液分離後の清澄液を凝集、樹脂精製、蒸発濃縮工程に供した。その結果、下記表に示す組成（単位：質量％）を有する粗精製物が得られた。粗精製物における、ＴＳＧあたりのＲｅｂＤ割合は３．８質量％であった。

下記量の粗精製物を、下記濃度および量のエタノール溶媒（４０℃）に溶解させた。なお、溶媒に対するＲｅｂＤの添加率は、０．２２質量％であった。
次いで、下記温度プロファイルおよび攪拌条件にて冷却し、ＲｅｂＡ結晶を晶析した。晶析には、セパラブル丸底フラスコ（東京理化器械株式会社製）を用いた。また、エタノールとしては、未変性アルコール９９．９質量％グレードを用いた。
次いで、固液分離を行ってＲｅｂＡ結晶を得た。固液分離に用いたフィルターは、アドバンテック製０．４５ｕｍメンブレンフィルターであった。
その後、ＲｅｂＡ結晶を９９質量％エタノールにて洗浄した。洗浄後のＲｅｂＡ結晶を５０℃にて乾燥した。

一次晶析物について、島津製ＬＣＭＳ８０５０を用いて分析を行った。下記表１１に、一次晶析物のＴＳＧに対する各ステビオール配糖体の比率（単位：質量％）を示す。また、表１２に収率情報（単位：質量％）を記載する。ＴＳＧに対するＲｅｂＡ純度は９８．６％、ＲｅｂＡ収率は４１．８％であった。ＲｅｂＡ結晶には、ＲｅｂＤ収量の１１．５質量％程度が混入する結果となった。

次に、一次晶析の母液より、ＲｅｂＤ種晶を用いてＲｅｂＤ晶析を試みた。以下の表に示すように、ＴＳＧに対するＲｅｂＤ純度は９４質量％以上であった。

＜実験例８＞
本実験では、研究室で行った小規模実験の結果得られた最適条件を採用してＲｅｂＤ晶析を行った。

ステビア植物の乾燥葉を用いて抽出操作を行い、得られた抽出物を固液分離操作に供した。乾燥葉中の各ステビオール配糖体の含有率は、下記のとおりであった。本実験例で用いた乾燥葉中のＴＳＧの含有量は、１００ｇ当たり８．７ｇであった。

固液分離後の清澄液を凝集、樹脂精製、蒸発濃縮工程に供した。その結果、下記表に示す組成（単位：質量％）を有する粗精製物が得られた。粗精製物における、ＴＳＧあたりのＲｅｂＤ割合は４．６質量％であった。粗精製物におけるＴＳＧの割合は５４．０質量％であった。

下記量の粗精製物(表中ではsampleと表示)を、下記濃度および量のエタノール溶媒（４０℃）に溶解させた。なお、溶媒に対するＴＳＧの比率は１２．５質量％、溶媒に対するＲｅｂＤの比率は０．５８質量％、ＲｅｂＡの過飽和度（10℃）は９．９８、ＲｅｂＤの過飽和度（10℃）は５７．６４であった。
次いで、下記温度プロファイルおよび攪拌条件にて冷却し、晶析した。晶析には、セパラブル丸底フラスコ（東京理化器械株式会社製）を用いた。また、エタノールとしては、未変性アルコール９９．９質量％グレードを用い、これに適宜水を添加してエタノール濃度を調整した。
次いで、固液分離を行って結晶を得た。固液分離に用いたフィルターは、アドバンテック製０．４５ｕｍメンブレンフィルターであった。
その後、結晶を９９質量％エタノールにて洗浄した。洗浄後の結晶を５０℃にて乾燥した。

一次晶析の結果、ＴＳＧ純度（晶析物あたりのＴＳＧの割合）７６．２％、ＲｅｂＤ純度（ＴＳＧあたりのＲｅｂＤの割合）７０．５％の結晶３４３ｍｇを得ることができた。収率（単位工程収率）は３９．５％であった。

＜実験例９＞
ステビア植物の乾燥葉を用いて抽出操作を行い、得られた抽出物を固液分離操作に供した。乾燥葉において、ＴＳＧあたりの各ステビオール配糖体の割合（質量％）は、下記のとおりであった。本実験例で用いた乾燥葉中のＴＳＧの含有量は、１００ｇ当たり１１．８ｇであった。

固液分離後の清澄液を凝集、樹脂精製、蒸発濃縮工程に供した。得られたステビオール配糖体組成物をスプレードライして、粗精製物を得た。スプレードライ後の粗精製物の組成は以下のとおりである。

未変性アルコール９９．９質量％グレードを用い、これに適宜水を添加して下記濃度および量のエタノールを調整した。
攪拌機付き晶析用容器（容量１リットル）に、エタノール溶媒を投入し、加熱した。
エタノール溶媒の温度が約５５℃になったところで、容器に粗精製物を投入した。
約３５０ｒｐｍで攪拌しながら、温度を下げた。このとき、冷却時間（すなわち11時間）－１時間（すなわち、10時間）で均等に冷却した。
晶析終了後、固液分離を行った。固液分離に用いたフィルターは、アドバンテック製０．４５ｕｍメンブレンフィルターであった。
得られた結晶を６０－７０℃で乾燥した。

単位工程収率（晶析前の粗精製物に含まれていたＲｅｂＤに対する晶析したＲｅｂＤの割合）は８０．０質量％であった。ＴＳＧ純度（晶析物に対するＴＳＧの割合）は６３．２質量％、ＲｅｂＤ純度（ＴＳＧに対するＲｅｂＤの割合）は３５．８質量％であった。

＜実験例１０＞
本実験は、エタノール溶媒中に多くのＲｅｂＡが存在する場合、すなわち、ＲｅｂＡの過飽和度を高く設定した場合のＲｅｂＤ晶析について検討したものである。

１．抽出・固液分離
ステビア乾燥葉（含水率：３～４重量％）の１５倍量（質量）のイオン交換水を６０℃±５℃に加熱し、その水にステビア乾燥葉を浸した。その後、ニーダー抽出器（ＳＫＮ－Ｒ１００、三友機器株式会社製）で８ｒｐｍの撹拌棒で撹拌しながら６０分間抽出を行った。次に、１８メッシュと１４０メッシュのメッシュを通して濾過し、冷水を用いて熱交換器で冷却し、ろ液をディスク型遠心分離機（９１５０ｒｐｍ（１１６０１Ｇ）、２４Ｌ／ｍｉｎ）で固液分離して一次抽出液を得た。その間に、濾過後の葉を再び同じ条件下で抽出し、固液分離して透明な二次抽出液を得、一次抽出液に加えて、清澄液を得た。

乾燥葉中のＴＳＧあたりの各ステビオール配糖体の割合を、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）（島津社製、ＬＣＭＳ８０５０）によって測定した。結果を下記表に示す（単位：質量％）。

２．凝集
清澄液中の可溶性固形分の１６．１６質量％に相当する量のＣａ（ＯＨ）_２（Ｂｒｉｘ（可溶性固形分濃度）から計算）を清澄液に添加し、得られた混合液を１５分間撹拌した。その後、清澄液中の可溶性固形分の２８．２８質量％に相当する量のＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏを添加し、混合液を３０分間撹拌し、クエン酸でｐＨを７に調整した後、清澄液中の可溶性固形分（ｇ）の５．６３倍に相当する体積（ｍＬ）の０．５％（ｗ／ｖ）キトサン溶液を添加した。この混合液を３分間強く撹拌し、２分間弱く撹拌し、そして１０分間放置した。その後、電気的に中性の凝固沈殿物を遠心分離によって除去した。その結果、清澄な処理液が得られた。

３．樹脂精製
樹脂精製としては、（ｉ）陰イオン交換樹脂を用いた精製と（ｉｉ）疎水性多孔質樹脂（イオン交換基の導入がなされていないもの）を用いた精製とを行った。
（ｉ）陰イオン交換樹脂を用いた精製
カラムに高多孔質の塩基性陰イオン交換樹脂（三菱ケミカル社製）を充填し、そのカラムに凝集分離後の処理液を投入して精製を行った。凝集分離後の処理液をカラムに投入したのに次いでカラムの容積の２倍量のイオン交換水で押し出し、精製されたステビオール配糖体組成物を含む溶液を回収した。この精製により、処理液中の黒色不純物や着色成分が除去された。

（ｉｉ）疎水性多孔質樹脂を用いた精製
カラムに疎水性多孔質樹脂（三菱ケミカル社製）を充填し、そのカラムに（ｉ）陰イオン交換樹脂を用いた精製後の試料を投入して精製を行った。疎水性多孔質樹脂としては、スチレンとジビニルベンゼンとの共重合体であって、イオン交換基を持たないものであり、最頻度細孔半径が４５Åのものを用いた。上記（ｉ）の精製後の溶液をカラムに投入後、カラムの容積の３倍量の０．０１Ｍクエン酸水溶液、カラムの容積の３倍量の０．０１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いてカラムを洗浄した。その後、カラムの容積の４倍量の６０％エタノール水溶液でステビオール配糖体組成物を溶出し、回収した。

４．蒸発濃縮
遠心式薄膜真空蒸発装置エバポール（大川原製作所製）を用いて、溶液を蒸発濃縮しながらエタノールを除去した。蒸発濃縮処理後も水が残存しており、組成物は液状であった。

得られたステビオール配糖体組成物をスプレードライして、粗精製物を得た。スプレードライ後の粗精製物の組成（単位：質量％）は以下のとおりである。

下記表の条件を採用した点以外は、実験例９と同様にして晶析を行った。結果を後述の表３１に示す。

＜実験例１１＞
実験例１０と同様にして、抽出・固液分離を行った。乾燥葉中のＴＳＧあたりの各ステビオール配糖体の割合（質量％）を、実験例１０と同様にして測定したところ、下記表のとおりであった。

実験例１０と同様にして、凝集、樹脂精製、蒸発濃縮工程を行った。得られたステビオール配糖体組成物をスプレードライして、粗精製物を得た。スプレードライ後の粗精製物の組成（質量％）は以下のとおりである。

下記表の条件を採用した点以外は、実験例９と同様にして一次晶析を行った。

下記表の条件を採用した点以外は、一次晶析と同様にして二次晶析を行った。結果を後述の表３１～３３に示した。

＜実験例１２＞
実験例１０と同様にして、抽出・固液分離を行った。乾燥葉中のＴＳＧあたりの各ステビオール配糖体の割合（質量％）を、実験例１０と同様にして測定したところ、下記表のとおりであった。

実験例１０と同様にして、凝集、樹脂精製、蒸発濃縮工程を行った。得られたステビオール配糖体組成物をスプレードライして、粗精製物を得た。スプレードライ後の粗精製物の組成（質量％）は以下のとおりである。

下記表の条件を採用した点以外は、実験例９と同様にして晶析を行った。ＲｅｂＡの過飽和度（１０℃）は８．２、ＲｅｂＤの過飽和度（１０℃）は１６０．１であった。

下記表の条件を採用した点以外は、一次晶析と同様にして二次晶析を行った。結果を表３２と表３３に示す。

実験例１０～１２で使用した粗精製物中の各種成分の純度、過飽和度、および、ＲｅｂＡ単位工程収率・ＲｅｂＤ単位工程収率を下記表に示す。
ＲｅｂＡ純度、ＲｅｂＤ純度は、島津社製、ＬＣＭＳ８０５０により測定し、ＴＳＧに対する割合（ｗ／ｗ）で表す。
過飽和度の計算式は前述のとおりである。過飽和度の算出にあたり、ＲｅｂＡとＲｅｂＤの飽和溶解度（９０質量％ＥｔＯＨ、１０℃）は、それぞれ以下のとおりであった。
ＲｅｂＡ＝８２７０．５ｐｐｍ
ＲｅｂＤ＝９９．３３ｐｐｍ
ＲｅｂＡ単位工程収率は、晶析に用いた原料中のＲｅｂＡ量に対する、晶析物中に含まれるＲｅｂＡ量の割合を示す。ＲｅｂＤ単位工程収率も同様である。

ＲｅｂＤの過飽和度にもよるが、ＲｅｂＡ過飽和度１５～１８を境に、ＲｅｂＡの析出が激しくなると推測された。また、上記表において、いくつかの純度が１００％を超えているのは、残留溶媒による重量アップか、分析誤差が原因と考えられた。

＜実験例１３＞
本実験は、晶析用の溶媒としてエタノール溶媒を使用したときに、メタノール溶媒使用時に比べてＲｅｂＤ晶析物の組成に変化が起こるかを検討したものである。

ＲｅｂＤ晶析物を２種類入手した。いずれもメタノール溶媒を用いて晶析されたものと考えられる。サンプルＮｏ．１は、ＧＬＧ社製ＲｅｂＤ晶析物、サンプルＮｏ．２は、ＪＮＲＪ製ＲｅｂＤ晶析物であった。

また、実験例１１で得られたＲｅｂＤ二次晶析物をサンプルＮｏ．３とした。

実験例１０と同様にして、抽出・固液分離を行った。乾燥葉中のＴＳＧあたりの各ステビオール配糖体の割合（質量％）を、実験例１０と同様にして測定したところ、下記表のとおりであった。

実験例１０と同様にして、凝集、樹脂精製、蒸発濃縮工程を行った。得られたステビオール配糖体組成物をスプレードライして、粗精製物を得た。スプレードライ後の粗精製物の組成（質量％）は以下のとおりである。

下記表の条件を採用した点以外は、実験例９と同様にして一次晶析を行った。ＲｅｂＡの過飽和度（１０℃）は、１６．１、ＲｅｂＤの過飽和度（１０℃）は１６０．２であった。

下記表の条件を採用した点以外は、一次晶析と同様にして二次晶析を行った。

得られたＲｅｂＤ二次晶析物をサンプルＮｏ．４とした。

実験例１２で得られたＲｅｂＤ二次晶析物をサンプルＮｏ．５とした。

サンプルＮｏ．４をさらに６０～７０℃で３日間乾燥したものをサンプルＮｏ．６とした。

サンプルＮｏ．５をさらに６０～７０℃で３日間乾燥したものをサンプルＮｏ．７とした。

各サンプルを、１種ずつジメチルホルムアミドに溶解し、ＨＳ（ヘッドスペース）－ＧＣ／ＭＳでメタノール含有量とエタノール含有量を測定した。結果を下記表に示す。

＜実験例１４＞
１．抽出・固液分離
ステビア乾燥葉（含水率：９～１１重量％）の１５倍量（質量）の水を６０～６５℃に加熱し、その水にステビア乾燥葉を浸した。その後、攪拌槽（容積：４００Ｌ）において攪拌羽（半径２７ｃｍ×２枚×２段）を用いて７５ｒｐｍで撹拌しながら６０分間抽出を行った。次に、ステビア乾燥葉と水の混合物を、直径９５ｃｍのブフナー漏斗にセットした１００メッシュのナイロン製メッシュに通して濾過し、珪藻土（セライト５０３）を加え、フィルタープレスでろ過し、精密濾過膜（孔径：１０μｍ）でろ過することで固液分離して一次抽出液を得た。その間に、濾過後の葉を再び同じ条件下で抽出し、固液分離して透明な二次抽出液を得、一次抽出液に加えて、清澄液を得た。

２．凝集
清澄液中の可溶性固形分の１６．１６質量％に相当する量のＣａ（ＯＨ）_２（Ｂｒｉｘ（可溶性固形分濃度）から計算）を清澄液に添加し、得られた混合液を１５分間撹拌した。その後、清澄液中の可溶性固形分の２８．２８質量％に相当する量のＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏを添加し、混合液を３０分間撹拌し、クエン酸でｐＨを７に調整した後、清澄液中の可溶性固形分（ｇ）の５．６３倍に相当する体積（ｍＬ）の０．５％（ｗ／ｖ）キトサン溶液を添加した。この混合液を３分間強く撹拌し、２分間弱く撹拌し、そして１０分間放置した。その後、電気的に中性の凝固沈殿物を遠心分離によって除去した。その結果、清澄な処理液が得られた。

３．樹脂精製
樹脂精製としては、（ｉ）陰イオン交換樹脂を用いた精製と（ｉｉ）疎水性多孔質樹脂（イオン交換基の導入がなされていないもの）を用いた精製とを行った。
（ｉ）陰イオン交換樹脂を用いた精製
カラムに高多孔質の塩基性陰イオン交換樹脂（三菱ケミカル社製）を充填し、そのカラムに凝集分離後の処理液を投入して精製を行った。凝集分離後の処理液をカラムに投入したのに次いでカラムの容積の２倍量のイオン交換水で押し出し、精製されたステビオール配糖体組成物を含む溶液を回収した。この精製により、処理液中の黒色不純物や着色成分が除去された。

（ｉｉ）疎水性多孔質樹脂を用いた精製
カラムに疎水性多孔質樹脂（三菱ケミカル社製）を充填し、そのカラムに（ｉ）陰イオン交換樹脂を用いた精製後の試料を投入して精製を行った。疎水性多孔質樹脂としては、スチレンとジビニルベンゼンとの共重合体であって、イオン交換基を持たないものであり、最頻度細孔半径が４５Åのものを用いた。上記（ｉ）の精製後の溶液をカラムに投入後、カラムの容積の３倍量の０．０１Ｍクエン酸水溶液、カラムの容積の３倍量の０．０１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いてカラムを洗浄した。その後、カラムの容積の６倍量の６０％エタノール水溶液でステビオール配糖体組成物を溶出し、回収した。

４．蒸発濃縮
遠心式薄膜真空蒸発装置エバポール（大川原製作所製）を用いて、溶液を蒸発濃縮しながらエタノールを除去した。次いで、エバポレーターを用い、2段階に分けて濃縮を実施しエタノールを除去した。蒸発濃縮処理後も水が残存しており、組成物は液状であった。

得られたステビオール配糖体組成物をスプレードライして、粗精製物を得た。スプレードライ後の粗精製物の組成（単位：質量％）は以下のとおりである。

未変性アルコール９９．９質量％グレードを用い、これに適宜水を添加して下記濃度および量のエタノールを調整した。
セパラブルフラスコに、エタノール溶媒を投入し、加熱した。
エタノール溶媒の温度が約７１℃になったところで、容器に粗精製物と種晶を投入した。なお、ＲｅｂＤの過飽和度（１０℃）は１６２．８５４、ＲｅｂＡの過飽和度（１０℃）は０．７９３であった。
攪拌しながら、温度を下げた。
晶析終了後、固液分離を行った。固液分離に用いたフィルターは、アドバンテック製０．４５ｕｍメンブレンフィルターであった。
得られた結晶を６０－７０℃で乾燥した。
なお、種晶添加率（Cs）は０．０８であった。

一次晶析物におけるＴＳＧ（ここでは、ReｂA、RebB、RebC、RebD、ステビオシド、RebF、RebM、RebN、ズルコシドA、RebI、RebG、ルブソシド、ステビオビオシド、RebE）あたりの各ステビオール配糖体の割合（質量％）は、下記表のとおりであった。また、一次晶析までのＲｅｂＤの単位工程収率は８６．３９質量％であった。一次晶析物におけるＴＳＧの割合は９７．４質量％であった。

下記表の条件を採用した点以外は、一次晶析と同様にして二次晶析を行った。温度プロファイルの詳細を図１３に示す。なお、ＲｅｂＤの過飽和度（１０℃）は３４２．２５４、ＲｅｂＡの過飽和度（１０℃）は－０．４７であった。

二次晶析物におけるＴＳＧあたりの各ステビオール配糖体の割合は、下記表のとおりであった。また、二次晶析までのＲｅｂＤの単位工程収率は９８．９質量％であった。二次晶析物におけるＴＳＧの割合は９５．９質量％であった。

＜実験例１５＞
実験例１０と同様にして、抽出・固液分離を行った。乾燥葉中のＴＳＧあたりの各ステビオール配糖体の割合（質量％）を、実験例１０と同様にして測定したところ、下記表のとおりであった。

実験例１０と同様にして、凝集、樹脂精製、蒸発濃縮工程を行った。得られたステビオール配糖体組成物をスプレードライして、粗精製物を得た。スプレードライ後の粗精製物のTSG(ここではＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ステビオシド、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮの８種類)あたりの各ステビオール配糖体の割合（質量％）は以下のとおりである。粗精製物あたりのＴＳＧの割合は９５．７５％であった。

下記表の条件を採用した点以外は、実験例９と同様にして晶析を行った。ＲｅｂＡの過飽和度（１０℃）は５．７、ＲｅｂＤの過飽和度（１０℃）は１６０．１であった。

下記表の条件を採用した点以外は、一次晶析と同様にして二次晶析を行った。

実験例１０～１２と同様にして、各種成分の純度、過飽和度、および、ＲｅｂＡ単位工程収率・ＲｅｂＤ単位工程収率を算出した。下記表に結果を示す。尚、下記表において純度が１００％を超えているものがあるが、これは、残留溶媒による重量アップか、分析誤差が原因と考えられた。

＜実験例１６＞
実験例１０と同様にして、抽出・固液分離を行った。乾燥葉中のＴＳＧあたりの各ステビオール配糖体の割合（質量％）を、実験例１０と同様にして測定したところ、下記表のとおりであった。

実験例１０と同様にして、凝集、樹脂精製、蒸発濃縮工程を行った。得られたステビオール配糖体組成物をスプレードライして、粗精製物を得た。スプレードライ後の粗精製物の組成（質量％）は以下のとおりである。

下記表の条件を採用した点以外は、実験例９と同様にして一次晶析を行った。

下記表の条件を採用した点以外は、一次晶析と同様にして二次晶析を行った。

実験例１０～１２と同様にして、各種成分の純度、過飽和度、および、ＲｅｂＡ単位工程収率・ＲｅｂＤ単位工程収率を算出した。結果を下記表に示す。なお、下記表において、一部の純度が１００％を超えているのは、残留溶媒による重量アップか、分析誤差が原因と考えられた。

Claims (17)

1. ステビア植物からの抽出物を粗精製して得られた粗精製物を用いて、１次晶析の段階からレバウディオサイドＤを晶析する、レバウディオサイドＤ含有晶析物の製造方法であって、
   前記粗精製物における総ステビオール配糖体含有量が５０～９５質量％であり、且つ、前記粗精製物が少なくともレバウディオサイドＡとレバウディオサイドＤとを含有しており、前記粗精製物におけるレバウディオサイドＡの含有量が１５～７０質量％であり、
   前記粗精製物を、レバウディオサイドＤの１０℃での過飽和度が１０以上であり且つレバウディオサイドＡの１０℃での過飽和度が１８以下になるように、メタノールまたはエタノールを含む溶媒中に混合して、晶析用溶液を調整する工程、並びに、
   前記晶析用溶液を、攪拌しながら冷却し、レバウディオサイドＤを析出させる工程を含むことを特徴とする、レバウディオサイドＤ含有晶析物の製造方法。
2. 前記総ステビオール配糖体が、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、ステビオシド、レバウディオサイドＦおよびレバウディオサイドＭである、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記粗精製物におけるレバウディオサイドＤの含有量が２～７０質量％である、請求項１または２に記載の製造方法。
4. 前記溶媒における前記メタノールまたはエタノールの濃度が９９．９質量％以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
5. 前記粗精製物を混合する際に、前記溶媒が４０～８０℃の温度に維持されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
6. 種晶として、レバウディオサイドＤを使用する、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
7. 前記晶析用溶液を、攪拌しながら３５℃以下の温度となるまで冷却し、レバウディオサイドＤを析出させる、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
8. 前記晶析用溶液を、攪拌しながら０．００２～１．３７℃／分の速度で冷却し、レバウディオサイドＤを析出させる、請求項１～７のいずれか一項に記載の製造方法。
9. 前記晶析用溶液を、１～４８時間の間攪拌しながら冷却し、レバウディオサイドＤを析出させる、請求項１～８のいずれか一項に記載の製造方法。
10. 前記粗精製物が、
    ステビア植物の乾燥葉を溶媒を用いて抽出して抽出物を得る、抽出工程、
    前記抽出物を固液分離処理することで清澄液を得る、固液分離工程、
    前記清澄液に凝集剤を添加して凝集させ、処理液を得る、凝集工程、
    前記処理液を疎水性多孔質樹脂で処理する、樹脂精製工程、および
    樹脂精製後の溶液を濃縮する、濃縮工程
    を含む方法により得られたものである、請求項１～９のいずれか一項に記載の製造方法。
11. さらに、析出したレバウディオサイドＤと液相とを分離し、分離後のレバウディオサイドＤを乾燥する工程を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の製造方法。
12. さらに、
    析出したレバウディオサイドＤを分離し、乾燥して、一次晶析物を得る工程、
    該一次晶析物を、レバウディオサイドＤの１０℃での過飽和度が１０以上であり且つレバウディオサイドＡの１０℃での過飽和度が１８以下になるように、メタノールまたはエタノールを含む溶媒中に混合して、一次晶析物溶解液を調整する工程、
    前記一次晶析物溶解液を、攪拌しながら冷却し、レバウディオサイドＤを析出させる工程、並びに、
    析出したレバウディオサイドＤを分離し、乾燥する工程
    を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の製造方法。
13. レバウディオサイドＤ含有晶析物における総ステビオール配糖体に対するレバウディオサイドＤの割合が３５～９５質量％である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の製造方法。
14. レバウディオサイドＤ含有晶析物における総ステビオール配糖体に対するレバウディオサイドＡの割合が１０～５０質量％である、請求項１３に記載の製造方法。
15. 晶析回数を一回とした場合の、粗精製物中に含まれていたレバウディオサイドＤに対する晶析したレバウディオサイドＤの割合が、７０～９９質量％である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の製造方法。
16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の製造方法により製造されたレバウディオサイドＤ含有晶析物を添加することを含む、飲食品の製造方法。
17. 前記飲食品が飲料である、請求項１６に記載の製造方法。

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