CN103709215B - 一种从甜菊糖结晶母液糖中提取莱鲍迪甙d的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从甜菊糖结晶母液糖中提取莱鲍迪甙D的方法，属于生物工程和新型甜味剂领域。主要步骤为：将提取RA后的一次转晶母液糖溶于水：甲醇=1:7-10的混合有机溶剂中，50-70℃，搅拌速度20-100rpm/min，保持1-10小时进行结晶；经固液分离，固体物质洗涤后除去母液杂质，烘干获得高纯RD产品。本发明通过一次结晶可将原料样品中RD的比例从20%-30%提升至50%以上，以此为基础，重复数次，可获得更高纯度的RD产品，为高纯RD产品的生产奠定了基础。工艺简单，能耗较低，易实现，生产时搅拌与控温的。母液可浓缩后回收，溶剂可蒸馏后循环利用，实现了较好的经济效益和较低的环境污染。

Description

一种从甜菊糖结晶母液糖中提取莱鲍迪甙D的方法

技术领域：

本发明属于生物工程和新型甜味剂领域，特别涉及从甜菊糖结晶母液糖中提取莱鲍迪甙D的方法。

背景技术：

甜菊糖是从菊科草本植物甜叶菊中精提的新型天然甜味剂。它具有高甜度、低热能的特点，其甜度是蔗糖的200—350倍，热值仅为蔗糖的1／300。甜菊糖的9种甜味成分中，甜菊甙（ST）、莱鲍迪甙A(RA)和莱鲍迪甙C(RC)的相对含量较高，共占90%以上，是决定甜菊糖味质的主要成分。RA甜度最高，相当于蔗糖的450倍，甜味特性也与蔗糖相接近；甜菊甙的甜度相当于蔗糖的300倍，具有一定不愉快的后苦味，影响了甜菊糖的味质，限制了其更为广泛的应用。

莱鲍迪甙D（简称RD）是甜菊糖9种组分中的一种，其含量占甜菊糖的0.3%-0.8%，除了具有甜菊糖的低热量、有保健作用的优点外，其口感也较好，同时甜度也很高，是蔗糖甜度的200-300倍。

甜菊糖一次提取物中RD的含量受甜菊叶品质及提取方法的影响，其含量在20%-30%不等。目前，国际上重点关注甜菊糖中各种单一组分的提纯方法的研究。因为单一组分的口感比较单一，可以直接添加在食品或者药品当中，并且以单组份纯品作为研究对象可以进行一系列的性质等方面的研究。而RD就是甜菊糖混合物中其中一种单组份。同时，由于RA单体的提纯研究比较广泛，因此，存在着大量的甜菊糖结晶母液糖（提取RA后的一次转晶母液糖）需要处理。如果能够利用甜菊糖结晶母液糖为原料，继续提纯单一组分RD，将能够很好的利用原料，同时能够为甜菊糖的生产企业及研究机构提高收入、节约成本。但因为甜菊糖结晶母液糖中各组分结构相似，现有技术中并无一种简单有效的将RD从甜菊糖结晶母液糖中分离出来的方法。

发明内容：

本发明解决的技术问题是提供一种从甜菊糖结晶母液糖中提取莱鲍迪甙D（RD）的方法。工艺流程为：

将甜菊糖结晶母液糖（提取RA后的一次转晶母液糖）溶于水：甲醇=1:7-10的混合有机溶剂中；

保持温度为50-70℃，保持1-10小时进行结晶；

结晶过程中保持搅拌，转速为20-100rpm/min；

上述结晶溶液进行固液分离，固体物质用溶剂进行洗涤，即洗晶除去母液杂质，烘干获得转晶甜菊糖，即高纯RD产品；

所述原料为甜菊糖结晶母液糖（提取RA后的一次转晶母液糖），所得转晶甜菊糖干燥后含水量不得高于5%。

所述甲醇纯度为95-99.9%；

所述甲醇纯度优选为98-99.9%；

所述结晶温度优选60℃，结晶时间优选3-6小时，搅拌速度优选30-80rpm/min；

所述结晶分离后的固体洗晶时固体湿重与溶剂的体积比为1:3-8，时间为10-40min；

所述结晶样品的烘干温度为50-100℃。

所述水为蒸馏水或去离子水；

所述原料与溶剂的比例为1:1-6，

所述原料与溶剂的优选比例为1:1-3。

有益效果：

本发明可通过一次结晶将甜菊糖结晶母液糖样品中RD的比例从20%-30%提升至50%以上，以此为基础，重复数次，可获得更高纯度的RD产品，为高纯RD产品的生产奠定了基础；

本发明工艺简单，易实现，生产时搅拌与控温的能耗较低，操作简单；

转速、温度会影响结晶的时间、晶型以及晶体中的RD的含量，本发明通过控制转速在20-100rpm/min、温度在50-70℃范围内得到了较好的晶型，同时结晶时间1-10小时也保证了产品中RD的含量。

本发明中母液可浓缩后回收，溶剂可蒸馏后循环利用，实现了较好的经济效益和较低的环境污染。

具体实施方式：下面通过具体的实施方案叙述本发明中提取甜菊糖中莱鲍迪甙D的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的结晶条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明中甜菊糖总甙的测定法法如下：

HPLC定量测定方法（JECFA2010会议标准）

检测步骤：按照以下液相色谱条件检测每种糖甙的含量。

试剂：乙腈，在210nm下检测透光度>95%.

标准品规格：

甜菊甙标准品：干重纯度>99%

莱鲍迪甙A标准品：干重纯度>99%

含有9种甜菊糖甙的基准溶液：鲍含甜菊甙、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙F、杜尔克甙A、悬钩子甙和甜菊双糖甙。用7:3的水乙腈溶液将含有9种甜菊糖甙的标准溶液进行稀释，以便用来确定各个糖甙的出峰时间。标准品可在日本Wako公司和美国ChromaDex公司买到。

标准品溶液的配制：精确称取50毫克甜菊甙标准品和50毫克莱鲍迪甙A标准品，分别放入50毫升的容量瓶中，然后加入7:3的水乙腈溶液进行溶解至50毫升刻度。

样品溶液的配制：精确称取50－100毫克本发明结晶出来的晶体，放入50毫升的容量瓶中，然后加入7:3的水乙腈溶液进行溶解至50毫升刻度。

检测步骤：

在以下条件下注入5μl的样品溶液。

色谱柱：Shiseido公司的CapcellpakC18MGII型色谱柱或者Phenomenex公司的Luna5μC18(2)100A型色谱柱或者相当规格的色谱柱(长度：250毫米;内径：4.6毫米,填料粒度：5μm)。；

流动相：比例为32:68的乙腈和磷酸钠缓冲液（规格：10mmol/L,pH值2.6）的混合液。

磷酸钠缓冲液的配置方法：将2.76克磷酸二氢钠溶解到2升水中，加入磷酸将pH值调整到2.6

流速：1毫升/每分钟。

检测器：210nm紫外检测。

色谱柱温度：40℃

记录大约30分钟的检测图谱。

峰值识别和计算

将样品溶液的出峰与含有9种甜菊糖甙的基准溶液的出峰时间对比，确定样品溶液中各个出峰对应的糖甙。算出样品溶液中各种糖甙对应的峰面积，算出甜菊甙标准品溶液和莱鲍迪甙A标准品溶液的峰面积。

按照以下公式，计算样品中莱鲍迪甙A之外的8种糖甙中每一种糖甙的百分比：

%X=［Ws/W］x［fxAx/As］x100

按照以下公式，计算样品中莱鲍迪甙A的百分比：

%莱鲍迪甙A=［WR/W］x［Ax/AR］x100

公式中：

X代表每种糖甙

Ws是甜菊甙标准品溶液中甜菊甙的干重(mg)

WR是莱鲍迪甙A标准品溶液中莱鲍迪甙A的干重(mg)

W是样品溶液中样品的干重(mg)

As是甜菊甙标准品溶液的峰面积

AR是莱鲍迪甙A标准品溶液的峰面积

Ax是样品溶液每种糖甙的峰面积

fx是每种糖甙的分子量与甜菊甙分子量的比值：1.00(甜菊甙),1.20(莱鲍迪甙A),1.00(莱鲍迪甙B)，1.18(莱鲍迪甙C),1.40(莱鲍迪甙D)，1.16(莱鲍迪甙F)，0.98(杜尔克甙A，简称DA),0.80(悬钩子甙，简称DB),0.80(甜菊双糖甙,简称STV)。

按照如上方法可以将RD、总甙的含量计算出来。

实施例1

取甜菊糖结晶母液糖100g，加入300ml溶剂，水:甲醇=1:7，甲醇纯度为99.9%，充分混匀后置于三口烧瓶中，水浴控制温度50摄氏度，搅拌速度为20rpm/min，时间为1小时，将结晶混合液用布氏漏斗进行抽滤，所得晶体用溶剂洗涤，固液比为1:4，60℃过夜烘干，得干样43g。液相测定结果为：

采用实施例1方法可将产品中RD含量提升至40%以上。

实施例2

取甜菊糖结晶母液糖200g，加入400ml溶剂，水:甲醇=1:9，甲醇纯度为99.9%，充分混匀后置于三口烧瓶中，水浴控制温度65摄氏度，搅拌速度为60rpm/min，时间为4小时，将结晶混合液用布氏漏斗进行抽滤，所得晶体用溶剂洗涤，固液比为1:2，60℃过夜烘干，得干样101g。液相测定结果为：

采用实施例2方法可将产品中RD含量提升至50%。

实施例3

取甜菊糖结晶母液糖300g，加入300ml溶剂，水:甲醇=1:10，甲醇纯度为99.9%，充分混匀后置于三口烧瓶中，水浴控制温度70摄氏度，搅拌速度为40rpm/min，时间为8小时，将结晶混合液用布氏漏斗进行抽滤，所得晶体用溶剂洗涤，固液比为1:1，60℃过夜烘干，得干样132g。液相测定结果为：

采用实施例3方法可将产品中RD含量提升至50%以上。

实施例4

取甜菊糖结晶母液糖200g，加入300ml溶剂，水:甲醇=1:8，甲醇纯度为99.9%，充分混匀后置于三口烧瓶中，水浴控制温度55摄氏度，搅拌速度为100rpm/min，时间为6小时，将结晶混合液用布氏漏斗进行抽滤，所得晶体用溶剂洗涤，固液比为1:5，60℃过夜烘干，得干样88g。液相测定结果为：

采用实施例4方法可将产品中RD含量提升至40%以上。

实施例5

取甜菊糖结晶母液糖500g，加入600ml溶剂，水:甲醇=1:8.5，甲醇纯度为99.9%，充分混匀后置于三口烧瓶中，水浴控制温度60摄氏度，搅拌速度为70rpm/min，时间为5小时，将结晶混合液用布氏漏斗进行抽滤，所得晶体用溶剂洗涤，固液比为5:6，60℃过夜烘干，得干样211g。液相测定结果为：

采用实施例5方法可将产品中RD含量提升至55%。

Claims (9)

1.一种从甜菊糖结晶母液糖中提取莱鲍迪甙D的方法,包括如下步骤：

将甜菊糖结晶母液糖溶于甲醇水溶液中；

保持温度为50-70℃，搅拌速度为20-100rpm，保持1-10小时进行结晶；

结晶溶液进行固液分离，固体物质用甲醇水溶液洗涤，即洗晶除去母液杂质，烘干至含水量不高于5％，获得转晶甜菊糖，即莱鲍迪甙D产品；

所述甜菊糖结晶母液糖为提取莱鲍迪甙A后的一次转晶母液糖；

所述甲醇水溶液为水：甲醇＝1:7-10的混合溶液；

所述甲醇纯度为95-99.9％；所述水为蒸馏水或去离子水；

所述甜菊糖结晶母液糖与甲醇水溶液的比例为1:1-6。

2.根据权利要求1所述从甜菊糖结晶母液糖中提取莱鲍迪甙D的方法,其特征在于，所述甲醇纯度为98-99.9％。

3.根据权利要求1所述从甜菊糖结晶母液糖中提取莱鲍迪甙D的方法,其特征在于，所述结晶温度为60℃。

4.根据权利要求1所述从甜菊糖结晶母液糖中提取莱鲍迪甙D的方法,其特征在于，所述结晶时间为3-6小时。

5.根据权利要求1所述从甜菊糖结晶母液糖中提取莱鲍迪甙D的方法,其特征在于，所述搅拌速度为30-80rpm。

6.根据权利要求1所述从甜菊糖结晶母液糖中提取莱鲍迪甙D的方法,其特征在于，所述结晶分离后的固体洗晶时，固体湿重与甲醇水溶液的体积比为1:3-8，时间为10-40min。

7.根据权利要求1所述从甜菊糖结晶母液糖中提取莱鲍迪甙D的方法,其特征在于，所述结晶样品的烘干温度为50-100℃。

8.根据权利要求1所述从甜菊糖结晶母液糖中提取莱鲍迪甙D的方法,其特征在于，甜菊糖结晶母液糖与甲醇水溶液的比例为1:1-3。

9.根据权利要求1所述从甜菊糖结晶母液糖中提取莱鲍迪甙D的方法,包括如下步骤：取甜菊糖结晶母液糖500g，加入600ml甲醇水溶液，水:甲醇＝1:8.5，甲醇纯度为99.9％，充分混匀后置于三口烧瓶中，水浴控制温度60摄氏度，搅拌速度为70rpm，时间为5小时，将结晶混合液用布氏漏斗进行抽滤，所得晶体用甲醇水溶液洗涤，固液比为5:6，60℃过夜烘干，得干样。