CN107722070A - 一种制备高纯度甜菊糖苷rd的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备高纯度甜菊糖苷RD的方法。本发明方法中，通过采用溶剂结晶的方法将提取结晶RA和ST后的甜菊糖苷母液糖中的RD组分进行提取，从而能够实现对于甜菊糖苷中各组分的提取和利用，同时也能够实现甜叶菊资源的充分利用。进一步的，本发明方法还能够对于结晶所用溶剂进行回收利用，因而更加绿色环保；同时，本发明方法操作简便，适于规模化、工业化的将加工后的母液甜菊糖苷干粉中的RD进行分离提纯。

Description

一种制备高纯度甜菊糖苷RD的方法

技术领域

本发明涉及甜味剂领域，具体而言，涉及一种制备高纯度甜菊糖苷RD的方法。

背景技术

甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)又称甜草、甜菊等，是一种原产于巴拉圭、巴西等国家的多年生草本植物。甜叶菊叶中所含有的甜菊糖苷是一种高甜度、低热量的新型天然甜味剂，主要由Stevioside(St)甜菊苷和Rebaudioside A(RA)瑞鲍迪苷A两种成分组成。

相较于蔗糖而言，甜菊糖苷的甜度能够达到其200～350倍，而热量却仅为蔗糖的1/300，且甜味比较纯正，是蔗糖的理想替代品，目前用量最大的甜菊糖苷RA具有清凉的口感，甜味最接近蔗糖，然而也存在口感不足、略带后涩味等缺陷。

甜菊作为第三糖源，具有甘蔗糖和甜菜糖不可替代的十大优点：纯天然安全、热稳定性、零卡路里、对血糖无影响、非可发酵性、酸碱性稳定、比普通蔗糖甜150～300倍、无褐变反应、无脂肪和碳水化合物，以及防龋齿。同时还有特殊的药用与保健功效，因此受到国内外尤其肥胖症、糖尿病、代谢综合症等群体的青睐，因消费需求和应用逐年增加而得到长足的发展。随着研究的深入，新的功能、新的方法被相继开发问世，尤其国外对甜菊的研究更为活跃，因此有必要了解和掌握国外甜菊的研究现况，以期对我国甜菊及其相关产品的研发提供参考与借鉴。

莱鲍迪苷D(简称RD)是甜菊糖苷9种组分中的一种，其含量占甜菊糖苷的0.3％～0.8％，除具有甜菊糖苷的低热量、高甜度外，还具有口感纯正的优点，是甜菊糖苷中口感最接近蔗糖的组分。

甜菊糖苷提取结晶后母液中RD的含量受甜菊叶品质及提取方法的影响，其含量一般在10％～15％不等。目前，国际上重点关注甜菊糖苷中各种单一组分的提纯方法的研究。因为单一组分的口感比较单一，可以直接添加在食品或者药品当中，并且以单组份纯品作为研究对象可以进行一系列的性质等方面的研究。而RD就是甜菊糖苷混合物中其中一种单组份。同时，由于RA、ST单体的提纯研究比较广泛，因此，存在着大量的甜菊糖苷结晶母液糖(提取RA、ST后的转晶母液糖)需要处理。如果能够利用甜菊糖苷结晶母液糖为原料，继续提纯单一组分RD，将能够很好的利用原料，同时能够为甜菊糖苷的生产企业及研究机构提高收入、节约成本。但由于甜菊糖苷结晶母液糖中各组分结构相似，现有技术中并无一种简单有效的将RD从甜菊糖苷结晶母液糖中分离出来的方法。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种制备高纯度甜菊糖苷RD的方法，所述的方法中，采用溶剂结晶的方法将提取结晶RA和ST后的甜菊糖苷母液糖中的RD组分进行提取，能够实现对于甜菊糖苷中各组分的提取和利用，而这也能够实现甜叶菊资源的充分利用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种制备高纯度甜菊糖苷RD的方法，所述制备高纯度甜菊糖苷RD的方法包括如下步骤：

(a)加工后的母液甜菊糖苷干粉中加入乙醇溶液，然后加热搅拌回流，接着保温搅拌后过滤，滤液冷却析晶，过滤收集晶体；

(b)步骤(a)所得晶体中加入甲醇溶液，然后加热搅拌回流，接着保温搅拌后过滤，滤液冷却析晶，过滤收集晶体；

(c)步骤(b)所得晶体中加入甲醇溶液，然后加热搅拌保温，接着回流搅拌后过滤，滤液冷却析晶，过滤收集晶体；

所得晶体干燥粉碎后过筛，即得到高纯度甜菊糖苷RD；

其中，所述加工后的母液甜菊糖苷干粉为提取RA和ST后的甜菊糖苷母液糖。

优选的，本发明所述的制备高纯度甜菊糖苷RD的方法步骤(a)中，乙醇溶液的浓度为80～90％；更优选的，步骤(a)中，乙醇的浓度为85～90％。

优选的，本发明所述的制备高纯度甜菊糖苷RD的方法步骤(a)中，加工后的母液甜菊糖苷干粉的质量克数与乙醇溶液的体积毫升数之比为1:5～1:10。

优选的，本发明所述的制备高纯度甜菊糖苷RD的方法步骤(a)中，冷却结晶的时间为12～36h，温度为4～8℃；更优选的，步骤(a)中，冷却结晶的时间为24～36h，温度为4℃。

优选的，本发明所述的制备高纯度甜菊糖苷RD的方法步骤(b)中，甲醇溶液的浓度为75～85％；更优选的，甲醇溶液的浓度为80～85％；

优选的，本发明所述的制备高纯度甜菊糖苷RD的方法步骤(b)中，晶体的质量克数与甲醇溶液的体积毫升数之比为1:5～1:10。

优选的，本发明所述的制备高纯度甜菊糖苷RD的方法步骤步骤(b)中，冷却结晶的时间为12～36h，温度为：4～8℃；更优选的，步骤(b)中，冷却结晶的时间为24～36h，温度为4℃。

优选的，本发明所述的制备高纯度甜菊糖苷RD的方法步骤步骤(c)中，甲醇溶液的浓度为50～70％；更优选的，步骤(c)中，甲醇溶液的浓度为60～70％；和/或，步骤(c)中，晶体的质量克数与甲醇溶液的体积毫升数之比为1:10～1:20。

优选的，本发明所述的制备高纯度甜菊糖苷RD的方法步骤(c)中，冷却结晶的时间为12～36h，温度为；更优选的，步骤(a)中，冷却结晶的时间为24～36h，温度为4～8℃。

优选的，本发明所述的制备高纯度甜菊糖苷RD的方法步骤(a)中，还进一步包括将晶体过滤后所得滤液蒸发回收乙醇的步骤；和/或，步骤(b)中，还进一步包括将晶体过滤后所得滤液蒸发回收甲醇的步骤；和/或，步骤(c)中，还进一步包括将晶体过滤后所得滤液蒸发回收甲醇的步骤。与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明中，通过采用多次溶剂结晶的方法将甜菊糖苷结晶母液糖中的RD成分进行高效提取，不仅能够获得高纯度的RD产品，同时还能够使得原料甜叶菊能够获得最大程度上的充分利用；

同时，本发明各步骤中所用溶剂均能够回收利用，而这不仅实现了资源的充分利用，同时也能够实现产品的环保、绿色生产；

进一步的，本发明方法步骤操作简便，且效率高，适于推广并工业化规模的生产。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

有鉴于目前对于甜叶菊自然资源的利用并不充分，同时并无有效的甜菊糖苷提取结晶后母液中RD等成分的提取方法手段，本发明特提供了一种新的提取方法，并通过采用操作简便的溶剂结晶的方法，实现对于甜菊糖苷结晶母液糖中有效成分的充分提取和利用。

本发明所提供的方法可具体参考如下：

(a)加工后的母液甜菊糖苷干粉中加入乙醇溶液；

此步骤中，所用加工后的母液甜菊糖苷干粉为提取RA和ST后的甜菊糖苷母液糖，其可由母液糖提取RA、ST后的转晶母液浓缩干燥制得；而该原料中，RD的含量一般在10～15％左右；

同时，此步骤中，可以将加工后的母液甜菊糖苷干粉置于结晶罐中，然后，加入乙醇溶液；

优选的，加工后的母液甜菊糖苷干粉与乙醇溶液的比例为1:5～1:10(mg/ml)，具体的，二者的比例可以为，但不限于1:6、1:7、1:8，或者1:9等；

同时，优选的，所用乙醇溶液的浓度为80～90％(v/v)；更优选的，所用乙醇的浓度为85～90％；进一步优选的，所用乙醇的浓度为85％；

在将乙醇溶液加入盛装有加工后的母液甜菊糖苷干粉的结晶罐中后，对结晶罐进行加热，同时搅拌，优选的，加热的预设温度为80℃；

由于在加热过程中，乙醇会随着加热而蒸发，因而，加热过程在回流条件下进行；

在到达加热的预设温度后，继续保温回流搅拌，此阶段的时间优选的控制在30min左右；

然后，停止加热搅拌，趁热过滤除去杂质，然后将滤液冷却结晶，冷却结晶的时间优选的为12～36h；更优选的，冷却结晶的时间为24～36h；

冷却结晶的温度优选的为4～8℃，更优选的，冷却的温度为4℃；

然后，将结晶液过滤，然后分别收集晶体和滤液；

而所收集的晶体则用于下一步结晶纯化中，所收集的滤液则通过加热蒸发冷凝，而将其中的乙醇溶液进行回收，从而实现对于有机溶剂的重复利用；

(b)步骤(a)所得晶体中加入甲醇溶液；

此步骤中，可以直接以步骤(a)中所得到的湿固体作为进一步纯化的原料，或者也可以将步骤(a)中所得湿固体烘干后作为进一步纯化的原料；

优选的，此步骤中，同样的可以将由步骤(a)所得到的原料晶体加入结晶罐中，然后再向结晶罐中加入甲醇；

优选的，晶体的质量克数与甲醇溶液的体积毫升数之比为1:5～1:10，例如可以为，但不限于1:6、1:7、1:8，或者1:9等；

同时，优选的，所用甲醇溶液的浓度为75～85％(v/v),更优选的，所用甲醇溶液的浓度为80～85％；进一步优选的，所用甲醇溶液的浓度为80％；

在将甲醇醇溶液加入盛装晶体的结晶罐中后，对结晶罐进行加热，同时搅拌，优选的，加热的预设温度为80℃；

由于在加热过程中，甲醇会随着加热而蒸发，因而，加热过程在回流条件下进行；

在到达加热的预设温度后，继续保温回流搅拌，此阶段的时间优选的控制在30min左右；

然后，停止加热搅拌，趁热过滤除去杂质，然后将滤液冷却结晶，冷却结晶的时间优选的为12～36h；更优选的，冷却结晶的时间为24～36h；

冷却结晶的温度优选的为4～8℃，更优选的，冷却的温度为4℃；

然后，将结晶液过滤，然后分别收集晶体和滤液；

而所收集的晶体则用于下一步结晶纯化中，所收集的滤液则通过加热蒸发冷凝，而将其中的甲醇溶液进行回收，从而实现对于有机溶剂的重复利用；

(c)步骤(b)所得晶体中加入甲醇溶液；

此步骤中，同样的，可以直接以步骤(b)中所得到的湿固体作为进一步纯化的原料，或者也可以将步骤(b)中所得湿固体烘干后作为进一步纯化的原料；

优选的，此步骤中，同样的可以将由步骤(b)所得到的原料晶体加入结晶罐中，然后再向结晶罐中加入甲醇；

优选的，晶体的质量克数与甲醇溶液的体积毫升数之比为1:10～1:20；更优选的，晶体的质量克数与甲醇溶液的体积毫升数之比为1:15～1:20，例如可以为，但不限于1:16、1:17、1:18，或者1:19等

同时，优选的，所用甲醇溶液的浓度为50～70％；更优选的，所用甲醇溶液的浓度为60～70％；进一步优选的，所用甲醇溶液的浓度为65％；

在将甲醇醇溶液加入盛装晶体的结晶罐中后，对结晶罐进行加热，同时搅拌，优选的，加热的预设温度为80℃；

由于在加热过程中，甲醇会随着加热而蒸发，因而，加热过程在回流条件下进行；

在到达加热的预设温度后，继续保温回流搅拌，此阶段的时间优选的控制在30min左右；

然后，停止加热搅拌，趁热过滤除去杂质，然后将滤液冷却结晶，冷却结晶的时间优选的为12～36h；更优选的，冷却结晶的时间为24～36h；

冷却结晶的温度优选的为4～8℃，更优选的，冷却的温度为4℃；

然后，将结晶液过滤，然后分别收集晶体和滤液；

而所收集的晶体则优选的在经过低温减压干燥粉碎过筛后，得到具有高RD含量的结晶提纯产物，产物中RD的含量能够达到≥95％；

同时，所收集的滤液则通过加热蒸发冷凝，将其中的甲醇溶液进行回收，而这同样有利于有机溶剂的重复利用。

而由如上方法可知，本发明中通过操作简便的溶液结晶的提纯方法，能够得到具有高RD含量的产物，由此可见，本发明方法也是适于规模化、工业化的对加工后的母液甜菊糖苷进行RD等有效物质的提纯，以及进一步将其作为代糖食品而有效利用的。

实施例1

(1)称取100g提取结晶RA和ST后的甜菊糖苷母液糖，加入到圆底烧瓶中，加入85％的乙醇溶液1L，加热温度设置为80℃，搅拌转速50rpm，热搅拌回流保温半小时，然后趁热过滤去除滤渣，滤液4℃冷却结晶24h，过滤收集晶体，得到200g湿晶体，滤液蒸发冷凝回收乙醇；

(2)将晶体加入到圆底烧瓶中，然后加入80％甲醇2L，加热温度设置为80℃，转速50rpm，热搅拌回流保温半小时，然后趁热过滤去除滤渣，滤液4℃冷却结晶24h，过滤收集晶体，得到200g湿固体，滤液蒸发冷凝回收甲醇；

(3)将湿固体加入圆底烧瓶中，然后加入65％甲醇4L，温度设置为80℃、转速20-50rpm/min，热搅拌回流保温半小时，然后趁热过滤去除滤渣，滤液4℃冷却结晶24h，过滤收集晶体；

所得晶体低温减压干燥后粉碎过滤即得26.9g高RD含量的产物晶体，滤液蒸发冷凝回收甲醇。

然后，对所得产物进行成分分析，分析按照GB-8270中所记载的方法进行；

具体步骤可参考如下：

色谱条件：C18柱反相色谱柱(250mm×4.6mm)，粒径5μm；柱温：室温40℃；紫外检测器：210nm检测波长；流动相：乙腈：磷酸钠缓冲液＝32:68；流速：1.0mL/min；进样量：2μL～10μL。

混合标准品溶液的制备：分别称取适量甜菊苷、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷F、杜克苷A、甜茶苷，以及甜菊双糖苷标准品，置于同一个容量瓶中，用乙腈水溶液完全溶解后定容，得到混合标准品溶液。混合标准品溶液用于确定9种糖苷的相对保留时间。

标准溶液的制备：分别称取0.05g甜菊苷标准品和瑞鲍迪苷A标准品，精确至0.001g，分别置于50mL的容量瓶中，用乙腈水溶液溶解后稀释至刻度，得到甜菊糖苷标准溶液和瑞鲍迪苷A标准溶液。

试样溶液的制备：称取0.05g～0.1g试样，精确至0.001g，置于50mL的容量瓶中，用乙腈水溶液溶解后稀释至刻度，得到试样溶液。

测定：在参考色谱条件下，分别对混合标准品溶液、标准溶液和试样溶液进行色谱分析。将试样溶液的色谱图与混合标准品溶液的色谱图比较，以确定试样溶液色谱图中各组分对应的峰。

记录试样溶液色谱图中甜菊苷、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷F、杜克苷A、甜茶苷、甜菊双糖苷的峰面积及标准溶液色谱图中甜菊苷和瑞鲍迪苷A的峰面积，然后根据峰面积对比得出各组分的含量。

实施例1产物中各成分和含量的液相分析结果如下：

实施例2

称取提取结晶RA和ST后的甜菊糖苷母液糖125kg，投入到结晶罐中，加入85％的乙醇溶液1250L，80℃，转速50rpm，热搅拌回流保温半小时，然后趁热板框过滤去除滤渣，滤液4℃冷却结晶24h，过滤收集晶体，得到250kg湿固体，滤液蒸发冷凝回收乙醇；

向所得湿固体中加入2500L、浓度为80％的甲醇，调节温度为80℃，转速50rpm，热搅拌回流保温半小时，然后趁热板框过滤去除滤渣，滤液4℃冷却结晶24h，过滤收集晶体，得到250kg湿固体，滤液蒸发冷凝回收甲醇；

向前一步骤中所得湿固体中加入5000L、浓度为65％的甲醇，调节温度为80℃，转速50rpm，热搅拌回流保温半小时，然后趁热板框过滤去除滤渣，滤液4℃冷却结晶24h，过滤收集晶体；

所得晶体低温减压干燥后粉碎过滤即得31.2Kg高RD含量的晶体产物，滤液蒸发冷凝液，回收甲醇。

然后，按照实施例1中相同的方法，对实施例2所得产物进行成分和含量分析，结果如下所示：

对比例1

参照实施例1的方法，对100g实施例1中同一批次的提取结晶RA和ST后的甜菊糖苷母液糖进行RD提纯处理；

其中，对比例1步骤(1)中，是向圆底烧瓶中，加入1L、浓度为85％的甲醇溶液；

按照对比例1的方法，能够得到21.1g高RD含量的产物晶体；

然后，按照实施例1中相同的方法，对对比例1所得产物进行成分和含量分析，结果如下：

对比例2

参照实施例1的方法，对100g实施例1中同一批次的提取结晶RA和ST后的甜菊糖苷母液糖进行RD提纯处理；

其中，对比例1步骤(2)中，是向圆底烧瓶中，加入1L、浓度为80％的乙醇溶液；

步骤(3)中，是向圆底烧瓶中加入4L、浓度为65％的乙醇溶液；

按照对比例2的方法，能够得到19.1g高RD含量的产物晶体；

然后，按照实施例1中相同的方法，对对比例2所得产物进行成分和含量分析，结果如下：

对比例3

参照实施例1的方法，对100g实施例1中同一批次的提取结晶RA和ST后的甜菊糖苷母液糖进行RD提纯处理；

其中，对比例3步骤(1)中，是向圆底烧瓶中加入1L、浓度为95％的乙醇溶液；

步骤(2)中，是向圆底烧瓶中加入2L、浓度为90％的甲醇溶液；

步骤(3)中，是向圆底烧瓶中加入4L、浓度为90％的甲醇溶液；

按照对比例3的方法，能够得到23.7g高RD含量的产物晶体；

然后，按照实施例1中相同的方法，对对比例3所得产物进行成分和含量分析，结果如下：

对比例4

参照实施例1的方法，对100g实施例1中同一批次的提取结晶RA和ST后的甜菊糖苷母液糖进行RD提纯处理；

其中，对比例3步骤(1)中，是向圆底烧瓶中加入1L、浓度为75％的乙醇溶液；

步骤(2)中，是向圆底烧瓶中加入2L、浓度为65％的甲醇溶液；

步骤(3)中，是向圆底烧瓶中加入4L、浓度为60％的甲醇溶液；

按照对比例4的方法，能够得到24.1g高RD含量的产物晶体；

然后，按照实施例1中相同的方法，对对比例4所得产物进行成分和含量分析，结果如下：

对比例5

参照实施例1的方法，对100g实施例1中同一批次的提取结晶RA和ST后的甜菊糖苷母液糖进行RD提纯处理；

其中，对比例5中，步骤(1)、(2)、(3)中，冷却结晶的温度为0℃。

按照对比例4的方法，能够得到23.1g高RD含量的产物晶体；

然后，按照实施例1中相同的方法，对对比例4所得产物进行成分和含量分析，结果如下：

对比例6

参照实施例1的方法，对100g实施例1中同一批次的提取结晶RA和ST后的甜菊糖苷母液糖进行RD提纯处理；

其中，对比例5中，步骤(1)、(2)、(3)中，结晶的温度为30℃。

按照对比例4的方法，能够得到18.5g高RD含量的产物晶体；

然后，按照实施例1中相同的方法，对对比例4所得产物进行成分和含量分析，结果如下：

由实施例1、2的实验结果可知，本发明工艺方法不仅适用于甜菊糖苷母液糖的小规模提纯，同时也能够应用于产业化规模的甜菊糖苷母液糖中RD的有效提取；

同时，由本发明实施例和对比例的实验效果对比可知，无论是所用醇溶液，还是在不同步骤中所用醇溶液的浓度，或者是结晶的温度，都对于产物中RD的含量以及产物纯度有着较大的影响，而按照实施例中的条件进行结晶提纯，明显是能够提高产品得率以及产物中RD的含量的。

对比例7

100g实施例1中同一批次的提取结晶RA和ST后的甜菊糖苷母液糖进行RD提纯处理；

对比例7的精制方法按照CN103709215A(一种从甜菊糖结晶母液糖中提取莱鲍迪甙D的方法)实施例5中所公开的方法进行；

然后，按照实施例1中相同的方法，对所得产物进行成分和含量分析；

接着，以对比例7一次提纯所得产物为原料，按照CN103709215A实施例5中所公开的方法进行二次提纯；同样按照实施例1中相同的方法，对所得二次提纯产物进行成分和含量分析；

最后，以二次提纯产物晶体为原料，按照CN103709215A实施例5中所公开的方法进行二次提纯；同样按照实施例1中相同的方法，对所得三次提纯产物进行成分和含量分析；

其中，对比例7一次提纯所得晶体的质量为43.2g；二次提纯所得晶体的质量为29.5g；三次提纯所得晶体的质量为17.8g。

对比例7三次提纯产物成分和含量分析结果如下：

由如上分析结果可知，虽然采用对比例7中所述提纯方法在多次提纯后也能够得到较高RD纯度的结晶产物。然而，相较于实施例方法而言，对比例7方法在产物收率上明显不及实施例方法，虽然所用原料批次相同，但产品的收率仅能够达到实施例1的70％左右。同时，由对比例7方法步骤流程可知，其结晶过程中需要持续搅拌加热，而且需要加热至50～70℃，对于能源的消耗较大，对于大规模的生产而言，很大程度上提高了对于设备的要求和生产的成本。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种制备高纯度甜菊糖苷RD的方法，其特征在于，所述制备高纯度甜菊糖苷RD的方法包括如下步骤：

(a)加工后的母液甜菊糖苷干粉中加入乙醇溶液，然后加热搅拌回流，接着保温搅拌后过滤，滤液冷却析晶，过滤收集晶体；

(b)步骤(a)所得晶体中加入甲醇溶液，然后加热搅拌回流，接着保温搅拌后过滤，滤液冷却析晶，过滤收集晶体；

(c)步骤(b)所得晶体中加入甲醇溶液，然后加热搅拌回流，接着保温搅拌后过滤，滤液冷却析晶，过滤收集晶体；

所得晶体干燥粉碎后过筛，即得到高纯度甜菊糖苷RD；

其中，所述加工后的母液甜菊糖苷干粉为提取RA和ST后的甜菊糖苷母液糖。

2.根据权利要求1所述的制备高纯度甜菊糖苷RD的方法，其特征在于，步骤(a)中，乙醇溶液的浓度为80～90％；

优选的，步骤(a)中，乙醇的浓度为85～90％。

3.根据权利要求1所述的制备高纯度甜菊糖苷RD的方法，其特征在于，步骤(a)中，加工后的母液甜菊糖苷干粉的质量克数与乙醇溶液的体积毫升数之比为1:5～1:10。

4.根据权利要求1所述的制备高纯度甜菊糖苷RD的方法，其特征在于，步骤(a)中，冷却结晶的时间为12～36h，温度为4～8℃；

优选的，步骤(a)中，冷却结晶的时间为24～36h，温度为4℃。

5.根据权利要求1所述的制备高纯度甜菊糖苷RD的方法，其特征在于，步骤(b)中，甲醇溶液的浓度为75～85％

优选的，甲醇溶液的浓度为80～85％。

6.根据权利要求1所述的制备高纯度甜菊糖苷RD的方法，其特征在于，步骤(b)中，晶体的质量克数与甲醇溶液的体积毫升数之比为1:5～1:10。

7.根据权利要求1所述的制备高纯度甜菊糖苷RD的方法，其特征在于，步骤(b)中，冷却结晶的时间为12～36h，温度为：4～8℃；

优选的，步骤(b)中，冷却结晶的时间为24～36h，温度为4℃。

8.根据权利要求1所述的制备高纯度甜菊糖苷RD的方法，其特征在于，步骤(c)中，甲醇溶液的浓度为50～70％；

优选的，步骤(c)中，甲醇溶液的浓度为60～70％；

和/或，步骤(c)中，晶体的质量克数与甲醇溶液的体积毫升数之比为1:10～1:20。

9.根据权利要求1所述的制备高纯度甜菊糖苷RD的方法，其特征在于，步骤(c)中，冷却结晶的时间为12～36h，温度为：4～8℃；

优选的，步骤(a)中，冷却结晶的时间为24～36h，温度为4℃。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤

(a)中，还进一步包括将晶体过滤后所得滤液蒸发回收乙醇的步骤；

和/或，步骤(b)中，还进一步包括将晶体过滤后所得滤液蒸发回收甲醇的步骤；

和/或，步骤(c)中，还进一步包括将晶体过滤后所得滤液蒸发回收甲醇的步骤。