KR20070089212A - 디프룩토스 ２무수물 ⅲ 결정 제조 방법 - Google Patents

디프룩토스 ２무수물 ⅲ 결정 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 디프룩토스 2무수물 III: DFA III, 즉, 1,2';2,3' 에서 서로 결합된 2 개의 프룩토스 분자 (디-D-프룩토푸라노스-1,2';2,3' 2무수물) 를 포함하는 거의 분해되지 않는 디사카리드를 함유하는 용액이 5 이상, 바람직하게는 5 내지 8, 더욱 바람직하게는 6 내지 8 의 pH 값을 갖는 것을 특징으로하는 DFA III 결정의 제조 방법을 제공한다. 제조 방법에 따르면, DFA III 는 결정화가 순환 시스템에서 수행되는 경우에서 조차도 결정화율의 감소 없이 상업 규모에서 제조될 수 있다. 이러한 경우, (조-)결정화 모액의 총 프룩토스 함량이 고체 기준으로 5% 이하이고 프룩토스 함량이 5% 이하인 경우, 효과는 더욱 향상된다.
Figure 112007047336172-PCT00007

Description

디프룩토스 ２무수물 Ⅲ 결정 제조 방법 {PROCESS FOR PRODUCING DIFRUCTOSE DIANHYDRIDE III CRYSTAL}
본 발명은 디프룩토스 2무수물 III (이하, 간혹 DFA III 로 칭함) 의 결정을 효과적으로 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 DFA III 제조용 재순환 시스템에서 결정은 절대 감소되지 않는다. 따라서, 본 발명의 방법은 DFA III 제조를 위한 공업적 방법으로서 매우 우수하다.
DFA III 은 주로 칼슘을 포함하는 미네랄의 흡수, 이뇨 효과, 및 변비 개선의 효과를 촉진하는 효과를 갖는 관능성 올리고사카리드이다. DFA III 은 시클릭 디사카리드 (디-D-프룩토푸라노스-2',1:2,3'-2무수물) 이며, 여기서 2 개의 프룩토스 분자 각각의 환원성 말단이 다른 프룩토스 분자의 환원성 말단 이외의 위치에서 히드록실기에 결합된다. DFA III 는 수크로스의 수용해도의 90 내지 95% 의 용해도에서 고도로 수용성인 한편, 당도는 수크로스의 약 52% 이다. 추가적으로, DFA III 은 열 및 산에 대해 매우 내성이 있는 물질이다.
DFA III 의 하나의 제조 방법으로서, 아트로박터 우레아파시엔스 (Arthrobacter ureafaciens) 종의 박테리아 또는 상기 종에 의해 생성되는 효소와 이눌린 및/또는 이눌린-함유 식물 추출물을 상호작용시켜 DFA III 함유 용액을 제 조하고, DFA III 함유 용액을 활성탄으로 채워진 컬럼에 통과시켜 DFA III 가 활성탄에 흡착되도록 한 후, 컬럼을 에탄올로 용리시켜 높은 DFA III 함량에서 분획을 회수하고 분획을 증발 및 건조하는 것을 포함하는 DFA III 제조 방법이 제안되었다 (예를 들어 특허 문헌 1 참조).
이눌린 및/또는 이눌린-함유 식물 추출물을, 고정화된 물질 상에 고정화된 이눌린 프룩토트랜스퍼라제 (fructotransferase) 로 채워진 컬럼에 통과시켜 DFA III-함유 용액을 생성하고, DFA III-함유 용액을, 예를 들어, 이온 교환 수지 또는 활성탄으로의 정제 단계에 처리하여 DFA III-함유 시럽 또는 증발 및 건조 생성물을 생성하는 것을 포함하는, 또 다른 DFA III 제조 방법이 제안되었다 (예를 들어, 특허 문헌 2 참조).
추가적으로, 이눌린과 이눌라제 II 의 반응은 높은 순도의 DFA III 의 공업적 제조를 가능하게 한다 (예를 들어, 특허 문헌 3 참조).
그러나, 상기 어느 참조문도 결정화 DFA III 의 수율에 대해 언급하지 않는다. DFA III 의 결정의 효과적인 공업적 제조에 대한 보고가 없었다. 따라서, 상기 제조는 전혀 공지되어 있지 않다.
특허 문헌 1
JP-B-56-26400
특허 문헌 2
JP-A-1-285195
특허 문헌 3
JP-A-11-43438
본 발명이 해결해야할 문제
DFA III 의 유용한 적용의 최근의 진전에 따라, DFA III 에 대한 요구가 증가하고 있다. 의학적 용도 및 식용 용도를 위해, 이로부터 DFA III 를 제외한 당 및 기타 여러 불순물이 제거된 높은 순도의 DFA III 의 결정이 요망된다. 바람직하게는, DFA III 를 함유하는 용액으로부터 DFA III 의 결정을 더욱 효과적으로 제조하는 방법 및 결정화 DFA III 의 공업적 제조 방법이 확립될 수 있다.
문제 해결 방법
상기 기술적 상황에서, 본 발명은 DFA III 의 결정 제조 방법, 특히 DFA III 의 결정의 효과적 제조를 위한 공업적 방법 개발의 목적을 위해 달성되었다.
따라서, 본 발명자들은, DFA III-함유 용액의 정화 및 여과 후, 조(租)-결정 시럽을 분리하는, 조-결정화를 위한, 수득된 여액의 농축, 조-결정의 용해, 및 수득된 용액의 정화 및 여과, 여액의 농축, 농축물의 결정화, 및 결정 시럽 분리를 포함하는, 생성물로서의 DFA III 의 결정 제조를 위한 방법을 개발하였다. 효과적인 제조 및 공업화를 위해, 본 발명자들은 추가적으로 상술된 바와 같이 분리된 조-결정 시럽 및/또는 결정 시럽을 결정화 단계로 재순환시키기 위한 재순환 시스템을 구축하여 DFA III 의 결정을 지속적으로 제조하였다. 본 발명자는 처음에 어떠한 DFA III 의 결정도 제조하지 못하는 어려움을 포함하여, DFA III 의 결정 수율이 시간에 걸쳐 감소되는 심각한 문제에 부딪쳤으며, 이의 공업적 제조는 실질적으로 전혀 달성되지 못했다.
처음 발견된 심각한 결점을 극복하기 위해, 본 발명자는 여러 측면에서 DFA III 의 결정 수율 감소의 원인을 철저히 조사하였다.
DFA III-함유 용액은 DFA III 이외의 특정 물질을 포함한다. 상기는, 예를 들어, 치커리와 같은 식물로부터의 이눌린 추출에서의 치커리로부터 유래되는 물질, 또는 효소적 합성 제조를 통한 당으로부터의 이눌린 생성에서 합성되는 물질, 또는 이눌린으로부터의 DFA III 제조를 위한 효소 반응을 통해 효소 분해된 이눌린-유래 물질일 수 있다. DFA III 의 결정 제조 방법에서, DFA III-함유 용액은 매우 긴 시간 동안 유지되고, 용액은, 용액의 농축 과정 동안 고온을 포함하는 매우 가혹한 조건에 긴 시간 동안 노출되어, DFA III-함유 용액의 조성은 상기 조건 하에서 개질되어 다른 새로운 물질을 생성할 수 있다. 상술된 여러 물질이 DFA III 의 결정화에 영향을 미칠 수 있다. DFA III-함유 용액이 DFA III 의 정제 및 결정화 단계에서 재순환되기 때문에, 상술된 바와 같이 생성된 DFA III 이외의 새로운 물질이 간혹 축적될 수 있다.
DFA III 에 대한 원료 중 하나로서 이눌린은 다수의 프룩토스 분자가 하나의 글루코스 분자에 연속으로 연결된 폴리사카리드이다. 가수분해 및 전이 활성을 갖는 효소가 이눌린과 반응할 경우, DFA III 는 주성분으로 생성되며, 기타 부산물로서, 프룩토올리고사카리드 예컨대 테트라사카리드 (G-F-F-F) 및 펜타사카리드 (G-F-F-F-F) 가 생성된다. 상기 테트라사카리드 및 펜타사카리드는 열에 대한 약한 내성이 있으며, 이에 따라 농축 단계에서와 같이 높은 온도에서의 단계에서 개질되어, 보다 적은 분자량의 당으로, 최종적으로 유기산 등으로 분해된다. 이에 따라, DFA III-함유 용액은 감소된 pH 를 갖는다. 본 발명자들은 그의 분해가 DFA III 의 정화 및 결정화 단계, 특히 재순환 시스템에서의 제조 과정에서 추가적으로 촉진되는 것을 발견하였다.
이눌린으로부터 DFA III 를 생성하는 효소 반응 단계에서, 반응은 약 60℃ 와 같은 온화한 온도 조건 하에서 진행된다. 초기 효소 반응이 중성 pH 범위 (pH 6-7) 에서 수행되었지만, 반응의 종결시 반응 용액은 pH 4 또는 그 근처로 감소되었다. 따라서, 효소 반응 과정에 의해 효소적으로 합성된 DFA III 용액은 일반적으로 pH 5 이하인 것으로 나타났으며, 이는 DFA III 결정화에 이르는 이후 단계에서 테트라사카리드 및 펜타사카리드의 분해를 초래하는 요인 중 하나가 되었다.
DFA III 의 결정화 단계로의 과정에서, DFA III 이외의 물질은 주로 당으로부터 유도되었고, 여기서 모노사카리드 글루코스 및 프룩토스, 디사카리드 수크로스, 트리사카리드, 테트라사카리드 및 (프룩토올리고사카리드) 보다 큰 물질, 유기산 등이 혼합물 중 존재할 수 있다. 추가적으로, DFA III 은 상술된 바와 같이, 산에 의해, 또는 열적으로 거의 분해되지 않는 물질이다.
상술된 점을 고려하여, 본 발명자들은 DFA III 의 결정 제조에 영향을 미치는 DFA III-함유 용액 중 다양한 물질에 대한 여러 측면을 조사하였다. 그 결과, 놀랍게도, 본 발명자들은 DFA III 및 혼합으로 존재하는 당, 특히 프룩토스 및 수크로스를 함유하는 용액의 pH 는 DFA III 의 결정화에 특이적 영향을 미치는 것을 처음으로 발견하였다.
따라서, 본 발명자들은 DFA III 의 결정화에 특이적으로 영향을 미치는 요인을 여러 측면에서 조사하였고, 상기 요인은 본 발명자들에 의해 처음 발견되었다.
DFA III 를 제외한 물질에 중점을 두어, 본 발명자들은 다양한 조사를 실시하였다. 그에 따라, 본 발명자들은 DFA III 결정화 단계의 일련에서 쉽게 분해가능한 물질의 분해가 억제될 수 있으며, 상기 물질의 기타 물질로의 전환은 DFA III 의 정화, 농축 및 결정화 단계에서 DFA III 를 함유하는 용액 모두를 pH 5 이상, 바람직하게는 pH 5 내지 8, 더욱 바람직하게는 pH 6 내지 8 (유리 전극 방법에 의해) 로 조절 및/또는 유지시켜 차단된 수 있다. 추가적으로, 본 발명자들은 pH 5 이상, 바람직하게는 pH 6 내지 8 에서 (조-)결정화를 위한 모액으로부터 DFA III 의 결정화에 의해, 결정 수율은 결코 감소하지 않았으며, 유지되거나 증가하였다는 것을 새롭게 발견하였다.
DFA III 과 같은 당 및 기타 당의 결정 수율이 결정화를 위한 모액의 pH 에 의해 개질되는 것은 공지되어 있지 않다. 따라서, 상기 발견은 완전히 새로운 발견이다.
DFA III 제조의 개별적 단계에서 상기 용액의 pH 를 상술된 범위 내로 조절하거나 유지하는 방법으로서, 개별적 단계에서의 용액은 가능한 70℃ 또는 그 이하로 효과적으로 조절되어야 한다. 부가적으로, 알칼리성 제제는 pH 를 적극적으로 조절하기 위해 첨가되어야 한다. 사용될 알칼리성 제제는 예를 들어 소듐 히드록시드 (가성 소다), 포타슘 히드록시드 (가성 포타슘) 및 소듐 카르보네이트 (라임 소다) 를 포함한다. 추가적으로, 크로마토그래피 방법을 사용하여 상기 단계에서 용액 중 DFA III 외의 당 및 유기산과 같은 산성 물질을 동시에 제거하여, 상기 단계에서 용액의 DFA III 의 순도는 증가될 수 있으며 동시에 pH 감소는 방지될 수 있다.
상술된 방법 이외의 방법으로서, 또한 산성 물질을 함유하는 DFA III-함유 용액은 음이온 교환 수지에 통과되어 이온 교환을 통해 산성 물질이 흡착되어 산성 물질이 제거된다.
본 발명자들은 결정화를 위한 DFA III 함유 모액에 함유된 프룩토스 및 수크로스가 DFA III 의 결정화의 억제를 초래하는 원인임을 새롭게 발견하였다. 결정화를 위한 모액 중 고체 함량에 대해 5% 이하, 바람직하게는 1% 이하의 프룩토스 함량은 그의 결정화 동안 DFA III 의 결정 수율을 개선시키는 것이 발견되었다.
DFA III 의 결정화를 위한 모액의 pH 값이 5 내지 7 이고, 결정화의 종결시 온도에서 DFA III 의 용해도에 대한 모액 중 DFA III 농도의 과포화도 (본 발명에 따라 과포화도 "S" 로 칭함) 가 4.4 이상인 조건 하에서, 마세큐트 (massecuite) 의 유동성은 결정화를 위한 임의의 순도에서 DFA III 를 함유하는 모액 중 현저히 감소되어, 퍼징 (purging) 에 많은 어려움이 수반되는 것을 나타났다. 대안적으로, 과포화도 "S" 가 4.1 이하인 조건 하에서, 마세큐트는 매우 적합성 유동성을 가져, 퍼징이 아무런 어려움 없이 수행될 수 있었다. 따라서, pH 5 이상에서 결정화를 위한 모액으로부터의 DFA III 의 공업적 결정 제조를 위한 조건 하에서, 결정화의 종결시 온도에 기초한 과포화도 "S" 는 4.1 이하임을 발견하였다. 과포화도 "S" 가 1.3 미만일 경우, 결정 수율은 20% 이하였다. 따라서, 과포화도 "S" 는 결정 수율의 관점에서, 바람직하게 1.3 이상 내지 4.1 이하, 더욱 바람직하게 1.5 이상 내지 4.1 이하 및 더 더욱 바람직하게 2.3 이상 내지 4.1 이하임을 발견하였다.
본 발명에 따라 "고체 농도" 라 칭하는 용어는 용액 중 물이 건조법에 의해 제거된 후, 남아 있는 고체의 중량에 기초하여 측정된 용액 중 고체의 비율 (w/w%) 이다. 제조 공정의 실제 제어를 위해, R-Bx (Refractometric Brix Degree) 의 값도 단순한 방식으로 사용될 수 있다.
상기 유용한 새로운 발견에 기초하여, 본 발명은 결국 추가의 연구 및 조사의 결과로서 달성되었다.
도 1 은 DFA III 를 함유하는 용액의 정제 및 결정화 단계를 포함하는, DFA III 결정 제조의 흐름도의 예를 나타낸다.
도 2 는 크로마토그래피에 의한 정제의 흐름도의 예를 나타낸다.
도 3 은 조-결정화를 위한 단계에서 모액의 조성 및 그의 결정 수율을 나타내며, 여기서 개별적으로, -
Figure 112007047336172-PCT00001
- 는 건조 물질 중 DFA III 의 순도 (%) 를 나타내고; -
Figure 112007047336172-PCT00002
- 는 DFA III 의 결정 수율 (%) 을 나타내고; -
Figure 112007047336172-PCT00003
- 는 건조 물질 중 프룩토올리고사카리드의 순도 (%) 를 나타내고; -
Figure 112007047336172-PCT00004
- 는 건조 물질 중 수크로스의 순도 (%) 를 나타내고; -
Figure 112007047336172-PCT00005
- 는 건조 물질 중 프룩토스의 순도 (%) 를 나타내고; -
Figure 112007047336172-PCT00006
- 는 pH 를 나타낸다. 이하, 도 4, 5 및 6 에서의 기호는 상술된 바와 동일한 의미를 나타낸다.
도 4 는 결정화 단계에서 모액의 조성 및 결정 수율을 나타낸다.
도 5 는 정제 및 결정화 단계 동안 pH 가 가성 소다의 첨가를 통해 5 이상으로 유지될 경우, 조-결정화 단계에서 모액의 조성 및 결정 수율을 나타낸다.
도 6 은 정제 및 결정화 단계 동안 pH 가 가성 소다의 첨가를 통해 5 이상으로 유지될 경우, 결정화 단계에서 모액의 조성 및 결정 수율을 나타낸다.
도 7 은 수크로스- 및 프룩토스 용액이 DFA III 용액에 첨가되는 경우 DFA III 결정 수율의 변화를 나타낸다.
도 8 은 DFA III-함유 용액에 함유된 프룩토올리고사카리드, 수크로스 및 프룩토스의, DFA III 결정 수율에 대한 영향 (1) 을 나타낸다. 도에서, 개별적으로, FOS 는 프룩토올리고사카리드를 나타내며; Suc 은 수크로스를 나타내며; Fru 는 프룩토스를 나타내며; Blank 는 대조군을 나타낸다.
도 9 는 DFA III-함유 용액 중 수크로스 (Suc), 프룩토스 (Fru), 및 프룩토스와 조합된 수크로스 (Suc + Fru) 의, DFA III 결정 수율에 대한 영향 (2) 을 나타낸다.
도 10 은 DFA III-함유 용액에 함유된 유기산 염 (Na 아세테이트 + Na 포르메이트) 의, DFA III 결정 수율에 대한 영향을 나타낸다 .
도 11 은 DFA III-함유 용액의 pH 의, DFA III 결정 수율에 대한 영향 (1) 을 나타낸다.
도 12 는 DFA III-함유 용액의 pH 의, DFA III 결정 수율에 대한 영향 (2) 을 나타낸다.
도 13 은 조-결정을 위한 모액의 pH 의, DFA III 결정 수율에 대한 영향 (1) 을 나타낸다.
도 14 는 DFA III 의 용해도 및 용해도의 대략적인 곡선을 나타낸다. 도에서 기호 "O" 은 DFA III 의 용해도 (관찰 값) 를 나타내며, 기호 "-" 는 DFA III 용해도의 대략적인 곡선을 나타낸다.
본 발명은 이하 상세하게 기술된다.
본 발명은 DFA III 를 함유하는 액체의 정제에 의한, 결정 수율을 감소시키지 않는, 높은 순도에서의 DFA III 의 결정의 효과적인 공업적 제조에 관한 것이다. DFA III 함유 액체의 pH 의 중요성에 초점을 두고, 본 발명자는 액체가 본질적으로 pH 5 이상으로 조절되어야 한다는 것을 발견하였다. 새로운 유용한 발견에 기초하여, 본 발명자들은 연구 및 조사를 실행하였다. 본 발명은 결국 달성되었다.
본 발명에 따라, DFA III 함유 액체는 정제되어 DFA III 의 결정이 제조되며, DFA III 함유 액체는 pH 5 이상이었다.
DFA III 의 공업적 결정화는 당업계에서 한번도 실행되지 않았다. 따라서, 그의 pH 에 대한 조사가 실행되지 않았거나, 그의 pH 가 주목되지 않았다. DFA III 결정화에 대한 pH 의 영향은 본 발명자들에 의한 공업적 DFA III 결정화에 대한 연구 과정 중 본 발명자들에 의해 처음으로 주목되었다. 따라서, 이는 완 전히 새로운 발견이다. 본 발명에 따라, DFA III 결정화에 관한 공업적 연구 동안 문제점이 처음으로 주의를 끌었다. 따라서, 상기 기술적 문제점 자체를 새로운 것으로 인식할 수 있다. 따라서, 문제 해결 방법 또한 당연히 신규하다.
본 발명은 하기 기술되는 것을 포함한다.
1. 디프룩토스 2무수물 III (DFA III) 를 함유하는 용액이 pH 5 이상인, 디프룩토스 2무수물 III (DFA III) 의 결정의 제조 방법.
2. 상기 1 에 있어서, 알칼리 첨가 방법, 크로마토그래피 방법, 및 음이온 교환 수지 방법 중 하나 이상에 의해, DFA III 함유 용액의 pH 를 조절하고 유지하는, DFA III 의 결정의 제조 방법.
3. 상기 1 및 2 에 있어서, DFA III 함유 용액이 이눌린과 프룩토실트랜스퍼라제를 반응시키고, 수득되는 용액을 정화 및 여과시켜 제조되는 용액인, DFA III 의 결정의 제조 방법.
4. 상기 3 에 있어서, 이눌린이 건조 물질 중 70% 이상의 폴리사카리드 순도및 10 내지 60 의 프룩토스 중합도를 갖는, DFA III 의 결정의 제조 방법.
5. 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, DFA III 함유 용액의 정화 및 여과, 및 결정화를 위한 수득된 여액의 농축 단계 (정제 및 결정화 단계) 를 포함하며, 상기 단계가 조(粗)-DFA III 용액에서 조-결정화를 거쳐, 생성물로서 결정화에 미치고, DFA III 함유 용액 중 하나 이상이 pH 5 이상을 갖는, DFA III 의 결정의 제조 방법.
6. 상기 5 에 있어서, 정제 및 결정화 단계가 재순환 시스템 내에서 수행되는, DFA III 의 결정의 제조 방법.
7. 상기 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 결정화를 위한 모액 또는 조-결정화를 위한 모액의, 냉각 결정화의 종결시 온도에서의 용해도에 기초한 과포화도가 1.3 내지 4.1 인, DFA III 의 결정의 제조 방법.
8. 결정화를 위한 DFA III-함유 모액 또는 조-결정화를 위한 DFA III-함유 모액에서 건조 물질 중 프룩토스 함량이 5% 이하인, DFA III 의 결정의 제조 방법.
9. 상기 8 에 있어서, 건조 물질 중 프룩토스 함량을 5% 이하로 조절하는 방법으로서 크로마토그래피 처리 방법 및 효모 처리 방법 중 어느 하나 이상에 의해 프룩토올리고사카리드 및/또는 프룩토스를 제거하는, DFA III 의 결정의 제조 방법.
10. 상기 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조되는 DFA III 의 결정.
본 발명에 따라, 높은 순도의 DFA III 의 결정은 DFA III 함유 용액을 정제하여 효과적으로 공업적으로 제조될 수 있으며, 여기서 DFA III 를 함유하는 용액의 하나 이상, 바람직하게는 모두가 pH 5 이상이다.
본 발명을 실행하기 위해, DFA III 를 함유하는 용액의 하나 이상 또는 모두가 DFA III 결정의 제조 단계 동안 결정화를 위해 pH 5 이상으로 조절된다 (그의 하나의 실시예가 도 1 에 나타나 있다).
DFA III 의 결정 제조 방법이 이의 하나의 실시예를 예시하는 도 1 과 관련 하여 하기에 기술되어 있다.
DFA III 함유 용액을 위한 원료는 이눌린 또는 이눌린-함유 용액을 프룩토실트랜스퍼라제와 반응시켜 합성적으로 제조된 DFA III 의 용액을 포함하며, 추가적으로 화학적 합성에 의해 제조된 DFA III 의 용액을 포함한다.
원료 중 하나로서의 이눌린은 다수의 프룩토스 분자가 하나의 글루코스 분자에 연속적으로 연결된, 프룩토스 중합체이다. 폭넓게 프룩토실트랜스퍼라제, 바람직하게는 이눌린 프룩토실트랜스퍼라제 (IFT) 를 포함하는 DFA III 생성을 위해 작용하는 효소는 원료 이눌린과 반응한다.
IFT 를 생성하는 미생물은 하기에 기술되는 것을 포함한다.
그에 비제한적인 예가 하기에 열거된다.
아트로박터 종; 아트로박터 우레아파시엔스 IFO 12140; 아트로박터 글로비포미스 (Arthrobacter globiformis) IFO 12137; 아트로박터 파센스 (Arthrobacter pascens) IFO 12139; 바실러스 (Bacillus) 종; 클루이베로마이세스 막시아누스 (Kluyveromyces marxianus) 변형 막시아누스; 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 종; 엔테로박터 (Enterobacter) 종.
상기 미생물로부터 유래되는 효소를 사용하는 경우, 분리 및 정제된 효소 및 조(粗)-정제된 효소, 미생물 배양, 및 미생물 배양의 처리된 생성물 (배양 상청액, 분리된 박테리아 세포, 붕괴는 박테리아 세포 등) 또한 사용될 수 있다. DFA III 의 결정이 식품에 사용되는 경우, 프룩토실트랜스퍼라제, 특히 IFT 가 상기 효소로 바람직하게 사용된다. 상기 미생물로부터 유도되는 효소 이외에, [International Patent Organism Depositary, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology] 에 FERM BP-8296 으로 최근에 국제 기탁된 아트로박터 종 AHU1753 균주는 IFT 를 생성할 큰 가능성을 갖는다. 따라서, 상기 균주로부터 유래되는 효소가 바람직하게 사용될 수 있다.
예를 들어, 60℃ 에서 24 시간 동안 교반 하, 500 단위의 효소/kg·이눌린에서의, 조(粗)-효소, 정제 효소, 또는 상술된 아트로박터 종 균주 AHU 1753 (FERM BP-8296) 으로부터 유래된 이눌린 프룩토트랜스퍼라제 (탈중합화) (IFT) 의 효소-함유 물질과의 반응은 수화 및 이동을 가능하게 하여 DFA III 함유 효소 반응 용액을 생성한다. 효소를 불활성화시켜, 효소적으로 제조된 DFA III 의 용액을 수득할 수 있다. 화학적 합성에 의해 제조된 DFA III 의 용액 또한 수득될 수 있다.
상기 수득된 화학적 합성에 의한, 또는 효소적으로 제조된 DFA III 의 용액은, 단독으로서 또는 DFA III 를 함유하는 기타 용액과 함께, 조-DFA III 용액으로 정의된다. 조-DFA III 용액은 이후 정화 및 여과된다. 정화 및 여과 단계는 조- DFA III 용액의 활성탄으로의 처리 및 고체를 액체로부터 분리하기 위한 처리 단계를 의미한다. 활성탄으로의 처리는 소량의 분말성 활성탄을 조-DFA III 용액에 첨가하여 DFA III 를 제외한 불순물을 활성탄에 흡착시키고, 필요에 따라, 수득된 혼합물을 가열 및/또는 교반하는 것을 포함하는 처리이다.
분말성 활성탄으로서, 15 내지 50 마이크론, 바람직하게는 25 내지 45 마이크론, 더욱 바람직하게는 약 35 마이트론의 평균 입자 크기의 분말성 활성탄이 사 용되며, 이는 200 마이크론 이하, 바람직하게는 170 마이크론 이하, 더욱 바람직하게는 150 마이크론 이하, 예를 들어 147 마이크론 이하의 최대 입자 크기를 갖는다. 첨가될 분말성 활성탄의 양은 5% 이하, 바람직하게는 0.1 내지 3%, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 1.5% 의 고체 함량이며, 조-DFA III 용액의 조성에 따라 적절하게 조절될 수 있다.
고체를 액체로부터 분리하기 위한 처리를 위해, Hi-Flo Supercell (Wako Pure Chemical Ind.) 및 규조토 (예를 들어, 세라믹 여과 기계로의 여과; Japan Pall K.K. 사 제조 Type PR-12 가 사용될 수 있다) 와 같은 보조 여과제로의 여과, 막 여과 (MF), 지속적 원심분리 방법, 분자체 (molecular sieve) 방법, 역삼투압 방법, 및 일부 경우, 한외여과 (UF) 막으로의 여과 중 하나 이상이 적절하게 사용된다. 고체로부터 액체의 분리는 대기압, 가압 하, 또는 감압 하에서 수행될 수 있다.
구체적으로, 예를 들어, Taiko Active Charcoal S (Futamura Kagaku Kogyo K.K. 사 제조; 약 35 마이크론, 그러나 147 마이크론 이하의 평균 입자 크기) 를, 고체 함량에 대해 1% 의 비율로 불활성화 IFT 효소 용액에 첨가하고, 60℃ 에서 10 분 동안 교반하였다. 종결 후, 용액은 규조토 (Radiolite 700, Showa Chemical Ind. 사 제조) 를 통해 여과하였다. 구체적으로, 규조토는 세라믹 실린더 (Japan Pall K.K. 사 제조 Type PR-12 의 세라믹 튜브) 의 외부 표면에 사전-코팅되며, 활성탄을 함유하는 반응 용액은 가압 하 실린더의 외부를 통해 통과된 후, 가압 하 여과되어, 실린더의 내부로부터 여액을 회수하였다.
DFA III 함유 용액 (조(粗)-용액) 의 정화 및 여과 처리를 통해 회수된 여액은 일반적인 방법에 의해 농축되었다. 예를 들어, 여액은 당 등의 제조 용도를 위한 칼란드리아 (calandria) 증발기에서 농축되어 (예를 들어 60 내지 80℃ 및 120 mmHg 이하에서) 농축 용액이 수득되었다. 농축 용액은 60 내지 85%, 예를 들어 약 77% 의 고체 농도로 만족스럽게 농축될 수 있다.
본 발명에 따라, 효소적으로 제조된 DFA III 의 용액 또는 화학적 합성에 의해 제조된 DFA III 의 용액으로부터 수득된 조-DFA III 용액은 바람직하게 정와 및 여과 단계와 농축 단계 사이에서 pH 5 이상으로 유지된다. 조-용액에, 예를 들어 소듐 히드록시드를 첨가함으로써, 조-용액은 pH 5 이상으로 조절될 수 있다.
상기 수득된 농축 용액으로서의 모액, 즉, 조-결정화를 위한 모액 (약 60℃) 은 결정화기에 이동되어 냉각 모드 또는 비등 시스템에서 DFA III 의 결정을 생성하여 조-결정이 수득된다. 이러한 경우, 막자사발 등에서 분쇄된 DFA III 의 결정은 알코올 등에서 분산되며, 이는 시드 (seed) 로 정의한다. 시드 (시드 결정) 는 적절한 시간에 모액에 적절한 양으로 첨가되어 결정이 수득된다. 시딩 방법은 풀 시딩 (full seeding) 방법 또는 쇼크 시딩 (shock seeding) 방법을 포함한다. 풀 시딩 방법에 따라, 시드의 양은 결정화를 위한 모액 또는 조-결정화를 위한 모액 중 DFA III 의 양의 1% 이상으로 조절되어, DFA III 의 결정의 입자 분포를 보다 작은 크기로 변화시킨다. 냉각 결정화 방법에 의해, DFA III 입자의 결정은 상기 모두의 시딩 방법에 의해, 보다 낮은 시딩 온도에서 보다 작다. 냉각 및 결정화 동안 온도 구배는 처음에 보다 적은 수준, 및 이후, 보다 큰 수준으로 조절되며, 이는 결정 입자 크기의 보다 적은 변동을 초래한다. 결정화기로서, 순환 시스템 및/또는 교반 시스템이 장착된 결정화기가 바람직하게 사용된다.
결정을 침전시키기 위한 조-결정화를 위한 모액은 원심분리기 (3000 rpm, 1200 G) 에 의해 DFA III 의 조-결정 및 조-결정 시럽으로 분리된다.
DFA III 의 조-결정은 다시 미온수에 용해되어, 정제된 DFA III 용액이 제조되고, 이는 정화 및 여과 단계에 통과된 후, 조-결정과 동일한 방법에 의해 농축 및 결정화되어, 생성물 결정이 수득된다. 수득된 결정은 중성 영역에서 8면체의 무취, 무색이고 투명하며, 이의 용융점은 163.7℃ 이며, 광회전 [α]D 는 134.5 이다.
개별 단계에서의 용액의 pH 가 본 발명에 따라 5 이상으로 조절 및 유지되는 경우, 상술된 흐름에서 분리된 조-결정 시럽 및/또는 결정 시럽은 필요에 따라 결정 제조 시스템으로 재순환된다. 이러한 재순환 시스템을 사용하여, 추가적으로, DFA III 의 회수 비율이 개선될 수 있다. 개별 단계로부터의 용액의 pH 가 결코 유지되거나 조절되지 않는 재순환 시스템이 확립된 경우, DFA III 의 결정화를 억제하는 물질, 예컨대 모노사카리드 (특히 프룩토스) 및 수크로스는 상기 단계에서의 용액에서 현저히 증가 및 축적되며, 결정화를 위한 모액의 pH 는 크게 감소되어, DFA 결정화 단계 동안 결정 수율의 감소를 초래하고, 추가적으로, 가장 바람직하지 않게는, 결정화의 달성이 이루어지지 않는 상태가 된다.
본 발명에 따라, 개별 단계로부터의 용액은 pH 5 이상으로 조절되거나 유지되어, DFA III 의 결정화 억제 요인으로서 모노사카리드, 수크로스 또는 산성 물질 (예컨대 유기산) 의 생성을 억제하는 것이 밝혀졌다. 알칼리성 제제 첨가를 포함하는 방법 이외에, 크로마토그래피 분리 방법 및 단계로부터 억제성 물질을 함유하는 용액의 효모 처리는 억제성 물질의 제거 및 DFA III 의 정화 및 결정화를 가능하게 한다. 즉, DFA III 의 정제 및 결정화를 위한 모든 단계 (도 1) 동안 생성되는 다양한 생성물이 크로마토그래피 (고체 농도의 40 내지 75%) 를 위한 스탁 용액 (stock solution) 에서 사용되어, DFA III 함유 용액을 위한 정제 및 결정화를 허용한다. 크로마토그래피 처리에 의한 정제 흐름도의 하나의 예는 도 2 에 나타나 있다.
크로마토그래피를 위한 스탁 용액 (40 내지 75% 의 고체 농도) 는 크로마토그래피로 처리되어, DFA III 의 분획을 분리한다. 상술된 재용해 용액 (DFA III 용액) 과 유사한 순도에서의 DFA III 로 보강된 분획이 DFA III 정제, 정화 및 여과, 또는 농축 및 결정화를 위한 용액으로 사용되어, 생성물 결정을 제조한다 (루트 A). 달리는, 보강된 분획이 그 자체로서 결정화에 사용된다 (루트 B). DFA III 로 보강된 분획과 달리, DFA III 로 보강되지 않은, DFA III 의 함량이 낮은 분획은, 제조 흐름도에서 적절한 위치로 만족스럽게 재순환될 수 있다 (도 1 에 나타난 바와 같이, DFA III-함유 용액으로부터 생성물 DFA III 에 걸친 전체 정제 단계 중) (루트 C). 추가적으로, 프룩토올리고사카리드, 모노사카리드 예컨대 프룩토스 및 산성 물질을 포함하나, 오로지 소량의 DFA III 를 포함하는, DFA III 로 보강되지 않은 분획은 공급물을 위한 원료로 사용되거나 처분될 수 있다.
크로마토그래피 분리 방법을 위해, 고정층 모드 (1-경로 모드), 연속 모드 (모사 이동층 모드) 및 반-연속 모드 (고정층 모드 및 연속 모드의 조합) 이 사용될 수 있다. 상기 장치에 충전될 이온 교환 수지로서, 예를 들어, Na 형태, K 형태 및 Ca 형태의, 크로마토그래피에서의 용도를 위한 극산성 이온 교환 수지가 사용될 수 있다. 수지는 예를 들어, 일정한 입자 크기의 스티렌-디비닐벤젠-시리즈이다. 다양한 크로마토그래피 수지가 이온 교환 수지의 제조원으로부터 시판된다. 당 용액에 적용가능한 임의의 상기 크로마토그래피 수지가 만족스럽게 사용될 수 있다. 결정화를 위한 모액 중 DFA III 의 순도가 낮은 경우, 순도를 증가시키기 위해 크로마토그래피 처리가 적절하게 사용될 수 있다.
효모 처리는 DFA III-함유 용액을 효모와 접촉하도록 하여 만족스럽게 수행될 수 있다. 용액 및 효모 모두는 함께 혼합되고 필요에 따라, 교반 하 배양되거나 공기 퍼징에서 배양될 수 있다. 효모로서, 제빵 효모 (baker's yeast), 일본 사케 효모, 맥주 효모, 와인 효모 및 기타 다양한 유형의 효모가 적절하게 사용될 수 있다. 추가적으로, 건조 효모, 압착 효모 및 기타 여러 시판되는 효소 생성물 또한 사용될 수 있다. 효모는 프룩토올리고사카리드, 수크로스 및 모노사카리드의 박테리아 세포로의 혼입을 허용하기 때문에, 효모 처리가 프룩토올리고사카리드, 수크로스 및/또는 모노사카리드를 시스템 외부로 제거하는데 주로 유용하다.
본 발명에 따라, DFA III 의 순도의 60% 미만의 DFA III-함유 용액 (결정화 를 위한 모액) 은 공업적으로 결정화될 수 있다.
본 발명에 따라, DFA III 의 순도의 60% 미만의 DFA III-함유 용액의 정제 수준을 증가시키기 위해, DFA III-함유 용액은 효모 처리, 정화 및 여과 처리 및 크로마토그래피 처리 중 하나 이상에 의해 처리되어, DFA III-함유 용액 중 DFA III 의 순도를 크게 증가시킨다.
본 발명에 따른 주요 용어는 도 1 에 나타난 바와 같은 DFA III 의 결정의 흐름도의 제조와 관련하여 이제 하기에 기술될 것이다.
(이눌린)
"이눌린" 이란 용어는 식물-유래 또는 효소적으로 합성된 생성물-유래 이눌린 또는 이눌린-함유 액체를 의미하며, 이는 예를 들어 예루살렘 아티초크, 우엉 또는 치커리로부터의 식물 추출물, 이눌린 신타아제와 수크로스의 반응에 의해 제조되는 합성 이눌린을 함유하는 용액, 또는 상기 용액의 정화 및 여과로부터 수득되는 용액을 포함하며, DFA III 을 건조시키거나 그 안의 DFA III 를 결정화시켜 수득되는 이눌린-함유 분말을 포함한다.
10 내지 60 의 프룩토스 중합도 및 고체 함량에 대해 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상의 폴리사카리드 순도를 갖는, DFA III 함유 용액을 위한 원료 중 하나로서 이눌린을 사용하여 DFA III 가 효과적으로 생성된다. 이후, DFA III-함유 용액을 사용하여, DFA III 의 결정이 효과적으로 제조된다.
(화학적 합성에 의해 또는 효소적으로 제조되는 DFA III 의 용액)
화학적 합성에 의해 또는 효소적으로 제조되는 DFA III 의 용액은 이눌린을 효소와 반응시켜 DFA III 함유 용액을 생성하고, 필요에 따라 효소를 불활성화시켜 제조된 용액, 및 화학적 합성에 의해 제조된 DFA III 의 용액을 포함한다.
(조-DFA III 용액)
"조-DFA III 용액" 이란 용어는 화학적 합성의 의해 또는 효소적으로 제조된 DFA III 의 용액 그 자체, 및 (조-결정화, 및 결정화를 위한) 결정화 단계에서 결정화 후, 모액을 고체 및 액체로 분리하여 제조된, 조-결정 시럽, 결정 시럽, 크로마토그래피로 분리된 용액, DFA III 의 분획 중 하나 이상을 포함하는 용액을 의미한다. 추가적으로, 상기 용액은 또한 화학적 합성에 의해, 또는 효소적으로 제조된 DFA III 의 용액을, 상기와 같은 조-시럽, 결정 시럽, 크로마토그래피 분리 용액 및 크로마토그래피 분리에 의해 수득된 DFA III 의 분획 중 하나 이상과 혼합하여 제조된 용액을 의미한다.
(조-결정화를 위한 모액)
"조-결정화를 위한 모액" 이란 용어는 조-DFA III 용액을 필요에 따라 활성탄 또는 이온 교환 수지 또는 크로마토그래피 또는 효모로 정화 처리하고, 수득된 생성물을 고체/액체 분리, 예컨대 여과 (즉, 정화 및 여과) 처리하여 제조되는 희석 용액이다. 추가적으로, 상기 용어는 효과적인 캔 (can) 과 같은 농축 장치에서 적절히 농축된 조-DFA III 용액의 농축물을 의미한다.
(정제된 DFA III 용액)
"정제된 DFA III 용액" 이란 용어는 조-결정화로부터의 조-결정을, 적절한 농도로 물 (미온수) 에 용해시켜 제조되는 용액 또는 크로마토그래피 분리에 의해 수득되는 DFA III 의 분획 중 하나 이상을 포함하는 용액을 의미한다.
(결정화를 위한 모액)
"결정화를 위한 모액" 이란 용어는 정제된 DFA III 용액을, 필요에 따라 활성탄 또는 이온 교환 수지, 또는 효모로 정화 처리한 후, 수득된 생성물을 여과와 같은 고체/액체 분리 (즉, 정화 및 여과) 처리하여 제조되는 희석 용액을 의미한다. 추가적으로, 상기 용어는 정제된 DFA III 용액, 결정 시럽, 및 효용 증발기와 같은 농축 장치에서 적절하게 농축된 DFA III 를 갖는 분획 중 하나 이상을 농축시켜 제조되는 농축물을 의미한다.
상술된 바와 같이, 조-결정화를 위한 DFA III 함유 모액 및결정화를 위해 상기를 함유하는 모액은 DFA III 를 함유하는 용액이며, 이는 DFA III 를 결정화시키기 위해 냉각 모드 및/또는 비등 모도의 결정화기에 독점적으로 공급된다.
(DFA III 의 정제 및 결정화 단계)
"DFA III 의 정제 및 결정화 단계" 란 용어는 DFA III 를 함유하는 모드 용액을 정화 및 여과한 후, 결정화를 위해 여액을 농축하는 단계를 의미하며, 상기 단계는 조-DFA III 용액에서 조-결정화를 거쳐 생성물로서의 결정화에 미친다.
(DFA III 함유 용액)
"DFA III 함유 용액" 이란 용어는, 예를 들어, 조-DFA III 용액, 조-결정화를 위한 모액, 결정화를 위한 모액, 조-결정 시럽, 결정 시럽, 정제된 DFA III 용액, 크로마토그래피 분리된 용액, 크로마토그래피 분리에 의해 수득된 DFA III 의 분획 (DFA III 의 크로마토그래피성 분획) 중 하나 이상을 포함하는, DFA III 의 결정의 제조 흐름에서 생성되는 모든 DFA III 함유 용액을 의미한다.
본 발명을 실행하기 위해, DFA III 함유 용액은 pH 5 이상으로 조절되어야 한다. DFA III 의 결정이 진행 중인 경우, 본 발명자들에 의해 처음 발견된 바와 같이, pH 가 감소하여 결정 수율을 감소시킨다. pH 는 만족스럽게 5 이상, 바람직하게는 5 내지 8, 더욱 바람직하게는 6 내지 8 이다. 보다 높은 pH 수준도 가능하기만, pH 의 조절은, 보다 많은 양의 가성 소다 및 가성 포타슘과 같은 알칼리를 필요로하며, 이는 무익하고 고가이며, 추가로 노동 중 안전성 문제를 야기시킨다.
DFA III 함유 용액에 대해, 상기 정의된 것 중 하나 이상 및 바람직하게는 모두가 본질적으로 pH 5 이상에 있다. DFA III 의 정제 및 결정화 단계를 포함하는, DFA III 의 결정의 제조 과정 중 이동 파이프 내에서 그의 pH 는 바람직하게 5 이상이다.
상술된 바와 같이, DFA III 함유 용액은, 본 발명에 따라, DFA III 의 결정 수율을 증가시키기 위해 본질적으로 pH 5 이상이다. 추가적인 연구 결과로서, 뜻밖에 본 발명자들은 수크로스 및 프룩토스의 존재는 DFA III 의 결정 수율을 감소시켰으며, DFA III 의 결정 수율은, 결정화를 위한 모액이 고체 함량에 대해 5% 이하, 바람직하게는 1% 이하의 프룩토스를 함유할 경우 증가될 수 있음을 처음 발견하였다. 이후, 본 발명자들은 이러한 당 억제가 용액을 pH 5 이상으로 조절하여 달성될 수 있음을 처음으로 증명하였다. DFA III 함유 용액이 pH 5 이상인 경우, 조-결정화를 위한 모액 및 결정화를 위한 모액은 고체 함량에 대해 5% 이하 의 프룩토스 함량을 가졌고, 추가적으로, 상기 조건이 동시에 충족되는 경우, DFA III 의 최대 결정화가 상승적으로 증가될 수 있음이 발견되었다.
본 발명의 장점
DFA III 함유 용액이 pH 5 이상이며, 조-결정화를 위한 모액 및 결정화를 위한 모액 중 프룩토스 함량이 고체 함량에 대해 5% 이하인 경우, DFA III 는 결정화 및 공업적으로 효과적으로 제조될 수 있다.
본 발명은 이제 하기 실시예에서 상세하게 기술될 것이나, 본 발명은 이들 실시예에 제한되지는 않는다.
실시예 1
시험 설비를 사용하고, 도 1 에 나타난 흐름도의 일부에 따라, 재순환 모드 중 DFA III 의 결정 제조를 시험하였다.
시험에서 사용된 DFA III 함유 용액 중 당의 수준으로서, 추가적으로 HPLC 에 의한 조성 분석으로부터의 값을 사용하였다.
(1) 효소 반응 단계
아트로박터 종 균주 AHU 1753 의 배양으로부터의 효소 용액 (약 500,000 U 의 효소 타이터) 를, 60℃ 에서 12 시간 동안의 반응을 위해, 일일 처리가능한 양으로서 시판되는 이눌린 (ORAFTI: RAFTILINE HP 의 제품명) 100 kg 의 용액에 첨가하여, 효소적으로 제조된 DFA III 의 용액을 수득하였다.
(2) 착색 및 정화 단계
착색 처리를 위해, 활성탄 (Futamura Kagaku Kogyo K.K.; Taiko Active Charcoal KW50) 을, 합성적으로 효소적 제조된 DFA III 의 용액에 고체 함량 기준 0.5% 의 비율로 첨가하고, 80℃ 에서 30 분간 배양한 후, 규조토를 통해 여과하였다.
(3) 조-결정화 단계
효소적으로 제조된 DFA III 의 착색된 용액을 고체 농도로서 76% 로 농축시키고, 이를 조-결정화를 위한 모액으로 사용하였다. 이후, 시드 결정 (시드) 을, 50℃ 에서 모액에 첨가한 후, 수득된 모액을 12 시간에 걸쳐 10℃ 로 냉각시켜 DFA III 의 조-결정을 생성하였다. 조-결정의 모액 (조-결정 마세큐트로도 칭함) 을 원심분리하고, 조-결정 및 조-결정 시럽으로 분리하였다.
(4) 정제 및 결정화 단계
조-결정을 다시 용해시킨 후, 상기-수득된 용액을 고체 농도로서 75% 로 농축시킨 후, 이를 결정화를 위한 모액으로 사용하였다. 이후, 시드 결정을 50℃ 에서 모액에 첨가하고, 수득된 모액을 12 시간에 걸쳐 10℃ 로 냉각시켜 결정을 생성하였다. 결정 마세큐트를 원심분리하고 결정 및 결정 시럽으로 분리하였다.
(5) 재순환 단계
DFA III 의 회수 비율을 증가시키기 위해, 조-결정 시럽의 50% 를, 효소 반응의 종결 후 용액과 혼합하는 한편, 잔류 조-결정 시럽은 공급물을 위한 원료로 사용하였다. 추가적으로, 결정 시럽의 50% 는 조-결정화 단계에서 증발기로 돌아간 한편, 나머지 50% 는 결정화 단계에서 증발기로 돌아갔다.
(6) 결정 수율의 계산
조-결정 및 결정의 결정 수율을 본 실시예에서 하기 식에 의해 계산하였다.
결정 수율 (%) = (P/Q) x 100
하기 식에서, 개개의 기호 또는 알파벳은 하기 의미를 나타낸다.
P: M-N
Q: (100-N)M/100
M: (조-)결정화를 위한 모액 중 DFA III 순도
N: (조-)결정 시럽 중 DFA III 순도
(7) 생성물 시험
(1) 내지 (5) 에서 상기 기술된 단계에 따라, 제조를 시작하였다. 시험 개시 제 4 일에, 조-결정화를 위한 단계를 개시하고, 결정화를 위한 단계는 시험 개시 제 7 일에 시작하였다. 조-결정화를 위한 단계 (모액의 조성 및 결정 수율) 가 도 3 에 계략적으로 나타나 있다. 조-결정 수율은 시험 개시 제 10 일에 감소하기 시작했고, 제 13 일에 30% 이하로 감소하였다. 따라서, 재순환될 조-결정 시럽의 비율은 50% 에서 30% 로 감소하였다. 그럼에도 불구하고, 결정 수율은 이후 지속적으로 감소하였다. 제 17 일에, 결정 수율은 10% 미만이었다. 조-결정화를 위한 모액에서의 DFA III 순도는 시험 기간 내내 80% 보다 조금 낮았으며, 보다 큰 변화는 없었다. 한편, 불순물의 조성에 대해, 프룩토올리고사카리드는 시험 동안 시간에 걸쳐 감소되었으며, 이의 분해 생성물로 여겨지는 프룩토스는 증가하였다. 조-결정화를 위한 모액은 시험 개시에 pH 5.1 이었 고, 점차 4 정도로 감소하였다. 정제 및 결정화 단계는 도 4 에 계략적으로 나타나 있다. 상기 기간 동안 당 조성의 큰 변화는 관찰되지 않았으며, 결정 수율은 시험 기간 동안 점차 감소하였다. 결정화를 위한 모액은 개시에 pH 4.8 에 있었고, 점차 4 정도로 감소하였다.
실시예 2
실시예 1 은, DFA III 가 재순환 모드에서 제조되는 경우, DFA III 의 결정 수율이 점차 감소하는 것을 명백히 나타내었다. 결정화의 모액은 감소된 pH 와 함께 프룩토올리고사카리드의 분해의 진행이 있었으므로, 결정 수율 감소와 분해 진행 사이에 임의의 관계가 있음이 제시되었다. 본 실시예에서의 제조 시험에서, 효소 반응의 종결 후, 조-결정화를 위한 모액 (농축 전의 용액) 및 재용해된 조-결정의 용액에 가성 소다를 첨가하여, 개별 단계에서 용액의 pH 감소를 방지하였다. 상기 과정을 제외하고, 제조는 실시예 1 과 동일한 방법으로 수행하였다.
조-결정화를 위한 단계 및 결정화를 위한 단계는 도 5 및 6 에 계략적으로 나타나 있다. 가성 소다의 첨가에 의해, 상기 결정화를 위한 개별적인 모액은 각각 5.1 내지 5.6 의 범위 및 5.4 내지 5.7 의 범위 내에서 변화하였고, 프룩토올리고사카리드의 분해는 억제되었다. 추가적으로, 개별적인 결정 수율이 높은 수준으로 유지될 수 있었다.
실시예 3
기타 당과 비교하여, DFA III 자체는 열 및 산에 대해 고도의 내성을 갖는 물질이다. 제조 단계에서의 용액이 도 1 에 나타난 바와 같이, DFA III 제조를 위한 공업적 단계에서, 보다 낮은 pH 를 갖는 경우, 불순물이 분해되어 DFA III 를 제어한 기타 물질을 생성한다. 추가적으로, 결정화에서의 용도를 위한 DFA III 함유 용액이 재순환되고 사용되기 때문에, 이의 pH 는 점차 감소되며, DFA III 이외의 기타 물질도 축적되는 것으로 나타난다. 실시예 1 에서의 시험 제조에서, 단계에서의 용액의 pH 는 실제로 점차 감소하여, 프룩토올리고사카리드의 비율의 감소를 초래하여, 프룩토스가 축적된다.
따라서, 본 발명자들은 실시예 1 에 제조된 바와 같은 효소 반응의 종결 후, 용액의 당 조성이 pH (3 내지 7) 및 온도 (70℃, 80℃) 의 조건 하에서 어떻게 개질되었는지 결정하기 위해 테이블 시험 (table test) 을 수행하였다. 이에 따라, 70℃ 및 pH 5 이상의 조건 하에서 24 시간 내에 포함된 당의 조성의 변화는 거의 관찰되지 않았다. pH 4 에서, 테트라사카리드 및 보다 큰 사카리드와 같은 당의 분해 및 프룩토스의 증가가 8 시간 내에 관찰되었다. pH 3 에서, 이러한 경향은 추가적으로 향상되었다. 70℃ 에서의 개별적 pH 조건 하에서 관찰된 바와 같은 당 분해의 변화는 온도가 80℃ 인 경우 추가로 촉진되었다. 80℃ 에서, 70℃ 에서 관찰된 것과 동일한 식으로, pH 5 이상에서 조차도 12 시간 내에 그의 변화가 관찰되지 않았다. 그러나, 24 시간 후의 시점에서, 테트라사카리드 및 보다 큰 사카리드와 같은 당의 분해 및 프룩토스의 증가는 마찬가지로 관찰되었다.
본 발명자들은 감소된 pH 4 를 갖는, 실시예 1 에서의 조-결정을 위한 모액 중 산성 물질을 추가로 조사하였다. 모액이 유기산 (락트산, 아세트산, 포름산 등) 을 30 내지 40 mg/100g·시료의 농도로 함유하는 것을 발견하였다. 테이블 실험에서, 수득된 프룩토스 수용액이 80℃ 의 환경에 긴 시간 동안 단독으로 방치되는 경우, 유기산이 점차 증가하였고, pH 의 감소를 수반하는 것을 발견하였다.
실시예 1 내지 3 에서의 분석 값의 결과에 기초하여, 본 발명자들은 실시예 4 내지 7 에서의 테이블 시험을 수행하여, 가변의 프룩토올리고사카리드, 유기산, 프룩토스, 수크로스 및 pH 가 결정 수율에 어떤 영향을 미치는지 조사하였다. 여기서, 결정 수율은 하기 식에 따라 계산하였고, 이는 실시예 4 내지 7 에서 사용하였다.
결정 수율 (%) = A/B x 100
상기 식에서, 개개의 기호 및 알파벳은 하기에 기술된 것을 나타낸다.
A: 결정화를 통해 수득된 DFA III 의 결정의 중량 (그램)
B: 결정화를 위한 모액 중 DFA III 의 함량 (그램)
실시예 4
(수크로스 용액 또는 프룩토스 용액이 99.9% 의 순도에서 DFA III 의 수용액에 첨가된 경우의 결정 수율)
결정화를 위해, 71% 의 고체 농도의 수크로스 용액 또는 71% 의 고체 농도의 프룩토스 용액 3 g, 15 g, 및 30 g (고체 함량 기준 수크로스 (프룩토스) 의 양으로서 각각 1.0, 4.8 및 9.1%) 을, 71% 의 고체 농도로 조절된 DFA III 용액 300 g 에 첨가하였다. 상기 수크로스 용액 또는 프룩토스 용액이 첨가되지 않은 대조 군도 결정화를 위해 사용하였다. 수크로스 (프룩토스) 용액이 30 g 첨가된 시험에서, 시드 결정은 50℃ 에서의 시딩 동안 완전히 용해되었다. 따라서, 시딩을 다시 45℃ 에서 수행하였다. 이후, 용액을 10℃ 로 냉각시켜 결정을 수득하였다. 시험 결과는 도 7 에 나타나 있다. 결정화를 위한 모액을 일정한 고체 농도 및 일정한 DFA III 양에서 사용하며, 첨가될 수크로스 및 프룩토스의 양을 증가시켜, 생성된 결정의 양을 측정하였다. 첨가된 양의 증가에 따라, 생성된 DFA III 의 결정의 양은 양쪽 모두의 경우 감소하였다.
실시예 5
(DFA III-함유 용액 중 오염된 불순물의, 결정 생성에 대한 영향)
(1) 시험은 일정한 고체 농도 및 일정한 DFA III 양에서 모액을 사용하여 수행하였다. 이에 따라, 생성된 DFA III 의 결정의 양은, 첨가된 수크로스 및 프룩토스의 양의 증가에 따라 감소하였다. 상기 결과가 DFA III 의 순도의 감소에 기인한 것일 수 있다는 제시 때문에, 오염된 불순물의 차이의, 결정 생성에 대한 영향을 조사하였다.
결정화를 위해, 71% 의 고체 농도의 프룩토올리고사카리드 (Meiji Seika Kaisha, Ltd. 제조 MEIOLIGO P: 테트라사카리드, 트리사카리드, 디사카리드, 및 프룩토스의 혼합물, 고체 함량 기준, 각각 65.2 %, 32.8 %, 1.2 %, 및 0.8 %) 용액, 71% 의 고체 농도의 수크로스 용액 및 71% 의 고체 농도의 프룩토스 용액 30 g (고체 함량 기준 9.1%) 을 개별적으로, 71% 의 고체 농도로 조절된 300 g 의 DFA III 용액에 첨가하였다. 상기 용액이 첨가되지 않은 대조군도 결정화를 위해 사용 하였다. 시딩 온도는 45℃ 였다. 용액을 10℃ 로 냉각시켜 결정을 수득하였다. 시험 결과는 도 8 에 나타나 있다.
도 8 은 불순물로서, 프룩토올리고사카리드 단독의 존재와 비교하여, 프룩토올리고사카리드를 수크로스 또는 프룩토스로 대체하는 경우, 생성된 DFA III 의 결정의 양은 더 적었으며, 프룩토올리고사카리드가 수크로스 및 프룩토스로 분해되는 경우, 동일한 DFA III 순도에서 조차도 DFA III 의 결정화가 억제되는 결과를 나타낸다. 상기 결과는 입증되었다.
(2) DFA III 중 오염된 불순물 조성의, 결정 생성에 대한 영향
이어서, 수크로스 또는 프룩토스 단독의 존재의 영향 또는 수크로스 및 프룩토스 모두의 존재의 영향을 조사하였다.
결정화를 위해, 71% 의 고체 농도에서의 수크로스 용액, 및 71% 고체 농도에서의 프룩토스 용액을, 개별적으로 30 g (고체 함량 기준 9.1%) 에서, 71% 의 고체 농도로 조절된 DFA III 용액 300 g 에 첨가하였다. 15 g 에서의 수크로스 용액 및 15 g 에서의 프룩토스 용액의 조합 또한 DFA III 용액 300 g (수크로스 및 프룩토스의 합은 고체 함량 기준 9.1% 에 상응한다) 에 첨가하였다. 상기 수크로스 용액 또는 프룩토스 용액이 첨가되지 않은 대조군도 결정화를 위해 사용하였다. 시딩 온도는 45℃ 였다. 용액을 10℃ 로 냉각시켜 결정을 수득하였다. 시험 결과는 도 9 에 나타내었다.
도 9 는 수크로스 또는 프룩토스의 단일 첨가는, DFA III 의 동일한 순도에서 조차도, 상술된 그의 양의 절반에서의 수크로스 및 프룩토스의 개별적인 첨가보 다 더 고도로 억제성임을 나타낸다. 따라서, DFA III 결정화는 불순물로 존재하는 수크로스 또는 프룩토스의, 보다 높은 함량에 영향을 받을 수 있다. 그러나, 결정 제조에서의 현장에서 생성된 수크로스의 양은 생성된 프룩토스의 양을 절대 초과하지 않는다. 따라서, 생성된 결정의 양은 프룩토스의 양에 영향을 받을 수 있음이 제시된다.
불순물로서 프룩토올리고사카리드 단독의 존재와 비교하여, 생성된 수크로스 및 프룩토스의 존재는 보다 적은 양의 DFA III 결정을 생성하였고, 생성 수준은 보다 높은 함량의 수크로스 및 프룩토스 중 어느 하나에 영향을 받는 것이 제시되었다. 그러나, 동일한 불순물의 수준에서, 고체 중 수크로스 결정 또는 프룩토스 결정이 DFA III 용액에 첨가되는 경우, 생성된 결정의 양이 대조군 보다 컸다. 따라서, DFA III 결정은, 모액의 농도를 적절하게 증가시켜, 수크로스 및 프룩토스의 존재 하에서도 수크로스 및 프룩토스 모두의 부재 하에서의 경우와 유사한 수율로 회수될 수 있음이 나타났다.
(3) DFA III 중 오염된 불순물 조성의, 결정 생성에 대한 영향
이어서, 유기산의 영향을 조사하였고, 이의 존재는 단계에서 용액의 분석에 의해 확인하였다. 단계에서 용액 중 그 존재가 확인된 유기산은 락트산, 아세트산, 포름산 및 기타 산 (및 미확인된 다중 피크) 이었다. 여기서, 프룩토스의 열적 분해 동안 생성된 아세트산 및 포름산을 시험하였다. 단계에서의 용액의 분석 결과는, 조-DFA III 용액의 정화 및 여과된 용액으로부터의 농축 용액에서 검출된 개별적 유기산 함량이 약 30 내지 40 mg/100 g·시료임을 나타내기 때문에, 첨가될 유기산의 개별적 염의 양을 0 내지 100 mg/100 g·DFA III 용액으로 조절하였다.
결정화를 위해, 소듐 아세테이트 및 소듐 포르메이트의 혼합 용액을, 100 g·DFA III 용액 당 10 mg 소듐 아세테이트 및 10 mg 소듐 포르메이트, 50 mg 소듐 아세테이트 및 50 mg 소듐 포르메이트, 및 100 mg 소듐 아세테이트 및 100 mg 소듐 포르메이트의 각 함량이 제공되도록, 71% 의 고체 농도로 조절된 DFA III 용액 300 g 에 첨가하고, 여기에 고체 농도를 (70.3% 의 최종 고체 농도로) 조절하기 위해 순수 (pure water) 를 첨가하였다. 순수를 첨가하여, 상기 혼합 용액이 첨가되지 않은 대조군도 동일한 고체 농도로 조절하였다. 시딩 온도는 50℃ 였다. 용액을 10℃ 로 냉각시켜 결정을 수득하였다. 시험 결과는 도 10 에 나타나 있다.
도 10 은 유기산 염이, 생성된 결정 양의 다소의 변화에도 불구하고 DFA III 의 결정화를 결코 억제시키지 못하는 것을 나타낸다. 추가적으로, 소듐 아세테이트 및 소듐 포르메이트가 10 mg/100 g 으로 개별적으로 첨가된, 대조군에서 및 DFA III 용액에서의 결정 생성은, 시딩 직후 천천히 진행되었으며, 이는 상기 용액이 이전의 시험 조건 보다 다소 낮은 농도인, 보다 낮은 고체 농도, 즉, 70.3% 를 가졌기 때문이다. 상기 결과와 비교하여, 소듐 아세테이트 및 소듐 포르메이트가 50 mg/100 g 및 100 mg/100 g 으로 개별적으로 첨가된 DFA III 용액에서의 결정 생성은 시딩 직후, 보다 빠르게 진행되었다. 상기 모순의 원인을 조사하였다. 소듐 아세테이트 및 소듐 포르메이트의 혼합 용액이 높은 pH 인 8.6 을 가졌기 때문에, 후자의 경우, 혼합 용액이 첨가된 후 모액은 약 pH 7 이었음을 나타낸다. 따라서, 본 발명자는 제조 단계에서 유기산의 생성에 기인한 단계에서 용액의 pH 의 변화가 DFA III 결정의 생성에 다소 영향을 미칠 수 있음을 고려하였다.
실시예 6
(pH 의, DFA III 결정화에 대한 영향)
(1) 결정화에서의 용도를 위한 모액의 pH 의, DFA III 결정 생성에 대한 영향을 확인하기 위해, 생성된 결정의 양의 변화를, 유기산 염 (소듐 아세테이트 및 소듐 포르메이트) 의 존재 하에서 가변성 pH 로 조사하였다.
73% 의 고체 농도로 조절된 DFA III 용액 300 g 에 소듐 아세테이트 및 소듐 포르메이트를, 100 g·DFA III 용액 당 100 mg 소듐아세테이트 및 100 mg 소듐 포르메이트로 첨가하였다. 결정화를 위해, 5 N 염산으로, 수득된 용액을 pH 7, 5, 4 및 3 으로 조절하고, 순수로 71% 의 고체 농도로 조절하였다. 시딩 온도는 50℃ 였다. 용액을 25℃ 로 냉각시켜 결정을 수득하였다. 시험 결과는 도 11 에 나타나 있다.
도 11 은 생성된 결정의 양이 pH 에 영향을 받고, 그의 양은 pH 7 에서 가장 컸고, pH 4 에서 가장 작았고, pH 3 에서 pH 5 에서의 양과 동일한 수준이었음을 나타낸다.
(2) 상기 현상이 pH 에 단독으로 의존하는지의 여부 및 유기산 염의 부재 하에서도 일어나는지 조사하기 위해, DFA III 용액을 염산 및 가성 소다로 조절하여, 생성된 결정의 양의 변화를 검사하였다. 결정화를 위해, 71.5% 의 고체 농도로 조절된 DFA III 용액 300 g 을, 1 N 염산 및 1 N 가성 소다로 pH 7, 5, 4 및 3 으로 조절하고, 이후 순수를 첨가하여 71% 의 고체 농도로 조절하였다. 시딩 온도는 50℃ 이었다. 용액을 25℃ 로 냉각시켜 결정을 수득하였다. 시험 결과는 도 12 에 나타나 있다.
시험 결과는, pH 5 이하에서 생성된 결정의 양이 보다 적다는 점에서, 유기산 염의 존재에서의 결과와 다소 상이하다. 그러나, pH 7 에서, 생성된 결정의 양이 가장 많았고, pH 4 에서 양이 최소였다는 점에서, 동일한 결과가 수득되었다. 상기 결과가 결코 무기산의 농도 차이에 기인하지 않음을 확인하기 위해, 결정화를 위해, 1% 소듐 클로리드의 존재 하에서 동일한 방식으로 pH 조절을 수행하였다. 결과는 결정화가 유기산 염의 존재 하에서 pH 조절 후 수행된 경우와 유사하였다. 이는 염이 존재가 pH 5 에서 결정화 억제 작용을 감소시키는 것을 나타낸다.
(3) 하기에 기술된 것은 실질적 단계에서 조-결정 모액을 사용하여 확인하였다.
(75.9% 의 DFA III 순도에서) 수집된 조-결정 모액 중 침전된 결정을 완전히 용해시킨 후, 수득된 용액을 고체 농도로서 약 76% 로 농축시키고, 이를 5N 염산 또는 5N 가성 소다로 pH 7, 5, 4 및 3 으로 조절하였다. 결정화를 위해, 순수를 첨가하여 고체 농도를 75 (또는 73)% 로 조절하였다. 용액을 25℃ 로 냉각시켜 결정을 수득하였으며, 이는 75% 의 고체 농도를 가졌고, 한편 용액을 10℃ 로 냉각시켰으며, 이는 73% 의 고체 농도를 가졌다. 시딩 온도는 (75% 의 고체 농도에서) 50℃ 또는 (73% 의 고체 농도에서) 45℃ 였다. 시험 결과는 도 13 에 나타나 있다. 임의의 고체 농도에서, DFA III 의 결정 수율은 pH 4 에서 가장 적었다.
실시예 7
(과포화도 및 (조-)결정화를 위한 모액의 pH 의, DFA III 에 대한 영향)
DFA III 결정화를 위한 모액의 최적의 농도 수준 대 DFA III 결정화 억제 요인으로서 pH 변화를 측정하기 위해, 조사를 수행하였다.
이전 도 14 에서 나타난 바와 같이, 각 온도에서 DFA III 의 용해도 (포화 고체 농도%) 를 조사하였다. 측정된 수준에 기초하여, 처음 용해도의 대략적인 곡선을 나타내고 하기 식에 의해 나타난 바와 같이 계산하였다:
(상관 계수 R2 = 0.999).
용해도 (포화 고체 농도 %) "Z" = -0.00058X2 + 0.39X + 48.8
여기서, X 는 온도 (℃) 를 나타낸다.
이어서, 냉각 결정화의 종결시 온도 "X"℃ 에서의 DFA III 용해도에 대한 순도 "P" 에서의 DFA III 결정화를 위한 모액의 과포화도 "S" 는 하기 식으로 정의하였다. 과포화도 "S" 는 수치로 표현되는, DFA III 결정화를 위한 모액의 결정화에 필요한 농도 수준이다.
과포화도 "S" = [Y x P/ (100-Y)]/[Z/(100-Z) x 100]
여기서, Y: DFA III 결정화를 위한 모액의 고체 농도 (%);
P: DFA III 결정화를 위한 모액 중 DFA III 의 순도 (%); 및
Z: 용해도 (X: 냉각 결정화의 종결시 온도 (℃)).
이후, 실제 단계에서의 DFA III 용액을 사용하여, 상기 정의된 과포화도 "S" 의, DFA III 결정화에 대한 영향은 결정화 억제 요인으로서, 결정화를 위한 모액의 가변성 pH 하에서 테이블 시험으로 조사하였다. pH 조절은 단계로부터의 DFA III 용액에 5N HCl 또는 5N NaOH 를 첨가하여 수행하였다. 용액을 다양한 농도로 농축시킨 후, 수득되는 개별 용액을 결정화를 위한 모액으로 사용하여, 50℃ 에서 시딩하고 10℃ 로 냉각시켜 결정을 수득하였다. 식에 따라, 과포화도 "S" 는 냉각 결정화의 종결시 10℃ 의 온도에서 계산하였다.
결정화를 위한 모액의 pH 및 과포화도 "S" 의 관계의 조사에 대한 결과는 표 1 에 나타나 있다. 결정화를 위한 모액이 pH 5 내지7 인 경우, 마세큐트 유동성은 과포호도 "S" 가 4.4 이상인 조건 하에서, 결정화에 대한 임의의 순도에서 DFA III 함유 모액 중 현저하게 감소하였다. 따라서, 명백하게, 퍼징은 어려웠다. 과포화도 "S" 가 4.1 이하인 경우, 한편, 마세큐트는 퍼징이 아무 어려움 없이 수행될 수 있는 적절한 유동성을 가졌다. 결정화를 위한 모액이 pH 5 이상인 경우 DFA III 의 결정 제조를 위한 공업적 조건 하에서, 결정화의 완결시 온도 기준의 과포화도 "S" 는 4.1 이하인 것으로 나타났다. 과포화도 "S" 가 1.3 미만인 경우, 결정 수율은 20% 이하였다. 결정 수율의 관점에서, 과포화도 "S" 는 바람직하게 1.3 이상 내지 4.1 이하, 더욱 바람직하게 1.5 이상 내지 4.1 이하, 더욱 더 바람직하게 2.3 이상 내지 4.1 이하인 것으로 나타났다.
(표 1)
과포화도 "S" 및 여러 DFA III-함유 용액의 pH 의, 결정 수율에 대한 영향
냉각 결정화에 의한 DFA III-함유 용액 "A" 의 결정 수율 (%)
결정화를 위한 모액의 pH
과포화도 "S" 5 6 7
1.3 21.0 21.6 21.9
1.5 29.4 31.0 31.4
1.6 36.0 36.8 37.0
2.3 53.1 55.3 56.1
4.1 67.1 68.5 68.8
4.7 X X X
냉각 결정화에 의한 DFA III-함유 용액 "B" 의 결정 수율 (%)
결정화를 위한 모액의 pH
과포화도 "s" 5 6 7
1.3 20.6 21.1 21.3
1.5 31.2 32.4 32.6
1.6 36.1 36.8 38.1
2.3 53.3 54.2 54.7
4.1 65.0 65.1 65.4
4.7 X X X
용액 "A" 내의 고체 함량의 조성: DFA III 99.5%, 회분 0.1% 및 프룩토올리고사카리드 0.4%
용액 "B" 내의 고체 함량의 조성: DFA III 79.7%, 회분 0.3% 및 프룩토올리고사카리드 18.3%, 수크로스 0.2% 및 프룩토스 1.0%.
표에서, 기호 "X" 는 마세큐트 유동성의 감소에 기인하여, 퍼징이 어려웠던 것을 나타낸다.
기탁 번호: FERM BP-8296
기탁된 박테리아 균주: 아트로박터 종 AHU 1753
기탁 기관 명칭: The International Patent Organism Depositary, The National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)
기탁 기관 주소: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan (zip code: 305-8566)
기탁일: 2003년 2월 18일

Claims (10)

  1. 디프룩토스 2무수물 III (DFA III) 를 함유하는 용액이 pH 5 이상인, 디프룩토스 2무수물 III (DFA III) 의 결정의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 알칼리 첨가 방법, 크로마토그래피 방법, 및 음이온 교환 수지 방법 중 하나 이상에 의해, DFA III 함유 용액의 pH 를 조절하고 유지하는 것을 포함하는, DFA III 의 결정의 제조 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, DFA III 함유 용액이 이눌린과 프룩토실트랜스퍼라제를 반응시키고, 수득되는 용액을 정화 및 여과시켜 제조되는 용액인, DFA III 의 결정의 제조 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 이눌린이 건조 물질 중 70% 이상의 폴리사카리드 순도 및 10 내지 60 의 프룩토스 중합도를 갖는, DFA III 의 결정의 제조 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, DFA III 함유 용액의 정화 및 여과, 및 결정화를 위한 수득된 여액의 농축 단계 (정제 및 결정화 단계) 를 포함하며, 상기 단계가 조(粗)-DFA III 용액에서 조(粗)-결정화를 거쳐 생성물로서의결정화에 미치고, DFA III 함유 용액 중 하나 이상이 pH 5 이상을 갖는, DFA III 의 결정의 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 정제 및 결정화 단계가 재순환 시스템 내에서 수행되는, DFA III 의 결정의 제조 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 결정화를 위한 모액 또는 조-결정화를 위한 모액의 냉각 결정화의 종결시 온도에서의 용해도에 대한 과포화도가 1.3 내지 4.1 인, DFA III 의 결정의 제조 방법.
  8. DFA III 의 결정화를 위한 모액 또는 DFA III 의 조-결정화를 위한 모액 중 프룩토스 함량이 고체 함량 중량에 대해 5% 이하인, DFA III 의 결정의 제조 방법.
  9. 크로마토그래피 방법 및 효모 처리 방법 중 어느 하나 이상에 의해 프룩토올리고사카리드 및/또는 프룩토스를 제거하여, 프룩토스 함량을 고체 함량 중량에 대해 5% 이하로 조절하는 단계를 포함하는, DFA III 의 결정의 제조 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 DFA III 의 결정.
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