ES2820429T3

ES2820429T3 - Diversificación de los oligosacáridos de la leche humana (HMO) o sus precursores

Info

Publication number: ES2820429T3
Application number: ES12785572T
Authority: ES
Inventors: Gyula Dekany; Elise Champion; Andreas Schroven; Hederos Markus Jondelius
Original assignee: Glycom AS
Current assignee: Glycom AS
Priority date: 2011-05-13
Filing date: 2012-05-14
Publication date: 2021-04-21
Anticipated expiration: 2032-05-14
Also published as: US9382564B2; EP3744725A1; CN103562214A; US9963729B2; JP6106160B2; WO2012156898A1; MX2013013027A; KR20140036226A; BR112013029203A2; US20140212930A1; CN103562214B9; EP2707380A4; PL2707380T3; EP2707380B1; JP2014513986A; RU2013155453A; DK2707380T3; EP2707380A1; CA2835989A1; US20160289721A1

Abstract

Un metodo de preparacion de una mezcla diversificada que comprende dos o mas oligosacaridos de la leche humana (HMO), el metodo comprende las etapas de a) proporcionar al menos un compuesto o una mezcla de los compuestos seleccionados del grupo que consiste en: - derivados de lactosa opcionalmente sialilados y/o fucosilados de formula general 4 y sus sales: **(Ver fórmula)** en donde R1 independientemente entre si es fucosilo o H R4 independientemente entre si es sialilo o H, siempre y cuando el compuesto de formula general 4 no sea lactosa, si se proporciona sola; - lacto-N-tetraosa (LNT): **(Ver fórmula)** - lacto-N-neotetraosa (LNnT): **(Ver fórmula)** b) anadir al menos una enzima que comprende una actividad transglicosidasa a al menos un compuesto o una mezcla de compuestos proporcionados de acuerdo con la etapa a); c) incubar la mezcla obtenida de acuerdo con la etapa b); d) en donde: i. donde ambos: solo se proporcionan dos compuestos en la etapa a) de los cuales uno es 3'-sialil lactosa o un derivado de lactosa sialilado de formula general 4, y la enzima que comprende una actividad transglicosidasa anadida en la etapa b) es una enzima que comprende una actividad trans-sialidasa, se repiten al menos las etapas a) y c) o las etapas b) y c); ii. cuando solo se elabora un HMO como resultado de la etapa c), se repiten al menos las etapas a) y c) o las etapas b) y c); e) opcionalmente repetir al menos las etapas a) y c) o las etapas b) y c) con la mezcla obtenida de acuerdo con la etapa c) o d); en donde la al menos una enzima que comprende actividad transglicosidasa es una enzima que comprende una actividad trans-fucosidasa, trans-sialidasa, trans-lacto-N-biosidasa y/o trans-N-acetil-lactosaminidasa.

Description

DESCRIPCIÓN

Diversificación de los oligosacáridos de la leche humana (HMO) o sus precursores

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método de diversificación de los oligosacáridos de la leche humana (HMO).

Antecedentes de la invención

Los oligosacáridos de la leche humana (HMO) han sido objeto de gran interés en los últimos años. En particular, los esfuerzos de comercialización para la síntesis de estos carbohidratos complejos, que incluyen los oligosacáridos secretados, han aumentado significativamente debido a su papel en numerosos procesos biológicos que ocurren en el organismo humano. Una fuente natural humana importante de tales oligosacáridos complejos es la leche de mamíferos. La leche de mamíferos contiene hasta un 10 % de carbohidratos, de los que el disacárido, lactosa (Gal(p1-4)Glc), es generalmente un componente importante. La leche y el calostro también contienen cantidades menores de otros sacáridos, denominados oligosacáridos de la leche, casi todos los que tienen una unidad de lactosa en su extremo reductor a la que pueden unirse residuos de GlcNAc, Gal, Fuc y/o Neu5Ac o Neu5Gc (Messer y Urashima, 2002, Trends Glycosci. Glycotech, 14, 153-176; y Urashima y otros, Advanced Dairy Chemistry, Volumen 3: Lactose, Water, Salts and Minor Constituents, 2009, págs. 295-349).

Hasta la fecha, se han determinado las estructuras de al menos 115 oligosacáridos de la leche humana, mientras que los datos de espectros de masas (MS) sugieren la presencia de casi 130 oligosacáridos en la leche humana o el calostro (Newburg y Neubauer, 1995, Carbohydrates in milks: Analysis, quantities and significance. En: Handbook of Milk Composition (RGJensen, ed.), Págs.273-249, Academic Press, San Diego, Estados Unidos). Además, los análisis de espectrometría de masas de ionización/desorción láser asistida por matriz y detección por tiempo de vuelo (MALDI-TOFMS) sugieren que los polisacáridos, que consisten de más de 50 residuos de monosacáridos, como lo indica la cromatografía de exclusión por tamaño, también están presentes en la leche humana. Por lo tanto, es probable que en la leche humana estén presentes considerablemente más de 130 sacáridos diferentes (ver también Urashima y otros, Advanced Dairy Chemistry, Volumen 3: Lactose, Water, Salts and Minor Constituents, 2009, págs. 295-349; y TADASU URASHIMA y otros, MILK OLIGOSACCHARIDES, Nova Biomedical Books, Nueva York, 2011, ISBN: 978 1-61122-831-1).

Los 115 oligosacáridos de la leche humana, cuyas estructuras se han determinado hasta la fecha, pueden agruparse en 13 series en función de sus estructuras principales. Estas 13 estructuras principales se muestran de manera ilustrativa en la Tabla 1 más abajo:

Tabla 1: 13 estructuras principales diferentes de oligosacáridos de la leche humana (HMO)

De acuerdo con lo encontrado por Urashima y otros (ver también Urashima y otros, Advanced Dairy Chemistry, Volumen 3: Lactose, Water, Salts and Minor Constituents, 2009, págs. 295-349; y TADASU URASHIMA y otros, MILK OLIGOSACCHARIDES, Nova Biomedical Books, Nueva York, 2011, ISBN: 978-1-61122-831-1) las muchas variaciones de los oligosacáridos se construyen mediante la adición de un residuo Neu5Acp2-3/2-6 a Gal o GlcNAc, y de Fuca1-2/1-3/1-4 a Gal, GlcNAc o una Glc reductora de la unidades principales. Las principales características estructurales de los oligosacáridos de la leche humana son la presencia de oligosacáridos que contienen la unidad de tipo I (Gal(/31-3)GlcNAc), así como también los que contienen la unidad tipo II (Gal(/31-4)GlcNAc), y los oligosacáridos que contienen el tipo I predominan sobre los que contienen la unidad del tipo II. Los oligosacáridos de la leche de otras especies investigadas hasta la fecha muestran principalmente la unidad de tipo II pero no la de tipo I.

Sin embargo, la gran variedad de oligosacáridos en la leche humana y el calostro y la diferencia con otras especies, dificulta la preparación de sustitutos adecuados en los alimentos, particularmente en las fórmulas alimenticias para bebés, que presentan al menos parte del espectro completo de los oligosacáridos de la leche humana. Además, su reconocida importancia en la maduración del sistema inmunológico y su uso pronóstico como inmunomoduladores subraya su importancia como un posible inmunomodulador.

En consecuencia, existe una necesidad urgente en la técnica de la preparación de oligosacáridos complejos y mezclas de los mismos, que se asemejen tanto como sea posible o incluso reproduzcan la variedad de los oligosacáridos complejos en la leche humana.

A este respecto, se han realizado muchos intentos de producir los HMO individuales mediante la síntesis organoquímica y, debido a su estereoselectividad, mediante medios enzimáticos. Los medios enzimáticos se han explorado cada vez más en las dos últimas décadas.

En particular, en los sistemas biológicos, las glicosiltransferasas de tipo Leloir (GT, EC 2.4.1.-) y las glicosidasas (también llamadas glucósido hidrolasas: GH, EC 3.2.1.-) constituyen las dos clases principales de enzimas procesadoras de carbohidratos, que pueden usarse en la producción de HMO. Ambas clases de enzimas actúan para transferir un grupo glicosilo de un donante a un aceptor dando como resultado de la producción de oligosacáridos. Sin embargo, el uso de las glicosiltransferasas para la síntesis en los procesos industriales se limita tanto por la disponibilidad de las enzimas deseadas debido a los problemas de expresión y solubilidad como por los altos costos de los azúcares donantes activados. Estos donantes de nucleótidos pueden generarse típicamente in situ, pero el proceso requiere enzimas adicionales (ver Hanson, S. y otros, Trends Biochem Sci, 2004. 29(12): pág. 656-63). Por el contrario de las glicosiltransferasas, las glicosidasas tienen una amplia gama de sustratos donantes que emplean habitualmente monosacáridos, oligosacáridos o/y sustratos modificados (es decir, sustratos que portan varios grupos funcionales). Frecuentemente muestran actividad hacia una gran variedad de aceptores de carbohidratos y no carbohidratos. Otra ventaja del uso de las glicosidasas en comparación con las glicosiltransferasas es su robustez y accesibilidad.

In vivo, las glicosidasas normalmente catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos con retención o inversión de la configuración estereoquímica en el producto. In vitro, pueden catalizar la formación de un nuevo enlace glicosídico por transglicosilación o por hidrólisis inversa (es decir, la condensación). En reacciones controladas cinéticamente, estas enzimas (típicamente, que retienen glicosidasas) pueden usarse para formar enlaces glicosídicos mediante el uso de un donador de glicosilo activado por un buen grupo saliente anomérico (por ejemplo, nitrofenil glicósido). Por el contrario, la hidrólisis inversa controlada termodinámicamente usa altas concentraciones de azúcares libres. Sin embargo, aunque la aplicación apropiada de glicosidasas en la dirección sintética es de considerable interés, es un desafío ya que deben encontrarse las condiciones óptimas y los sustratos adecuados para impulsar la reacción en la dirección deseada y evitar la hidrólisis de los productos.

Recientemente se ha desarrollado otro enfoque para superar este cuello de botella y hacer que las glicosidasas sean más adecuadas para la síntesis de oligosacáridos, al proporcionar las enzimas modificadas (variantes). Así, durante estas dos últimas décadas, la ingeniería de proteínas basada en técnicas racionales o combinatorias ha demostrado ser extremadamente poderosa para generar biocatalizadores con actividad y eficiencia de transglicosilación mejoradas.

Sin embargo, aunque se han publicado muchas síntesis organoquímicas o síntesis basadas en enzimas para las estructuras de los oligosacáridos básicos de la leche humana o sus precursores mientras tanto (por ejemplo, para la síntesis de algunos HMO sialilados individuales o bencil HMO/glucósidos sustituidos con bencilo mediante el uso de una trans-sialidasa y 3'-SL ver los documentos WO 93/18787 y WO 2012/007588), tales métodos de síntesis todavía no permiten la preparación de mezclas complejas de oligosacáridos de origen natural o sus derivados. La preparación de tales mezclas sobre la base de síntesis diseñadas individualmente de HMO individuales es además costoso y puede no parecerse a la gran variedad de HMO de origen natural.

En consecuencia, es un objeto subyacente de la presente invención para proporcionar un método que permita la provisión de una mayor variedad de oligosacáridos de la leche humana que los métodos de la técnica anterior, preferentemente de una manera eficiente y preferentemente a escala industrial.

Además, es conveniente la provisión de oligosacáridos y mezclas de oligosacáridos que tienen entre 4 y 12 unidades de sacáridos, tales como entre 6 y 10 unidades de sacáridos, de una manera estereoselectiva y de una manera rentable adecuada para la producción a gran escala de oligosacáridos.

El documento WO2005/055944 describe la producción in vitro de 2'-FL que comprende proporcionar una levadura modificada genéticamente que produce fucosa-GDP a partir de manosa-GDP, mediante la obtención de una fracción de la levadura que contiene fucosa-GDP y exponer la fracción a la fucosiltransferasa y el sustrato apropiados para producir la 2'-FL.

Chen y otros (Curr. Opin. Drug Discovery Develop. 3, 756 (2000) revisan la síntesis enzimática de oligosacáridos a gran escala.

El documento WO99/08511 describe el enriquecimiento de 3'-SL en fuentes lácteas y corrientes residuales de procesamiento de queso que se han puesto en contacto con una a-2,3-transialidasa.

El documento WO2010/100980 se relaciona con la síntesis química total de LNnT.

El documento WO03/016469 describe el uso de un sistema de múltiples enzimas para la preparación de sialooligosacáridos protegidos de forma anomérica mediante la adición secuencial de unidades de sacáridos.

El documento WO94/25615 describe un sistema mixto de sialiltransferasa/trans-sialidasa para la producción de a-2,3-sialil galactósidos.

El documento WO96/32492 describe el uso de un ciclo de sialil transferasa para la producción de sialil galactósidos. La Ferla y otros (Carbohydrate Res. 337, 1333 (2002)) describen la fucosilación química de los derivados de N-acetil lactosamina o lacto-N-biosa.

Malleron y otros (Carbohydrate Res. 341, 29 (2006)) describen la síntesis quimioenzimática de Lewis 3-sulfatadoun pentasacárido.

Breve descripción de las figuras

Las siguientes figuras se destinan a ilustrar más la invención. No pretenden limitar el objeto de la invención a ello. Figura 1: representa las 13 estructuras principales actualmente conocidas de los oligosacáridos de la leche humana (HMO).

Figura 2: representa una síntesis de HMO ilustrativa mediante el uso de la lactosa, el donante de N-acetilactosaminilo y el donante de lacto-N-biosilo con las enzimas P-1,3-trans-lacto-N-biosidasa, P-1,3-trans-N-acetilactosaminidasa, y P-1,6-trans-N-acetil-lactosaminidasa.

Descripción de la invención

De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para la diversificación de los oligosacáridos de la leche humana (HMO) o sus precursores, específicamente un método para la preparación de una mezcla diversificada que comprende dos o más oligosacáridos de la leche humana (HMO), el método que comprende las etapas de

a) proporcionar al menos un compuesto o una mezcla de compuestos seleccionados del grupo que consiste en: - derivados de lactosa opcionalmente sialilados y/o fucosilados de fórmula general 4 y sus sales:

- en donde

Ri independientemente entre sí es fucosilo o H

R4 independientemente entre sí es sialilo o H,

siempre y cuando el compuesto de fórmula general 4 no sea lactosa, si se proporciona sola;

- lacto-N-tetraosa (LNT):

b) añadir al menos una enzima que comprende una actividad transglicosidasa al menos a un compuesto o mezcla de compuestos proporcionados de acuerdo con la etapa a);

c) incubar la mezcla obtenida de acuerdo con la etapa b);

d) en donde:

i) donde ambos: solo se proporcionan dos compuestos en la etapa a) de los que uno es 3'-sialil lactosa o un derivado de lactosa sialilado de fórmula general 4, y la enzima que comprende una actividad trans-sialidasa, al menos las etapas a) y c) o se repiten las etapas b) y c);

ii) cuando solo se elabora un HMO como resultado de la etapa c), al menos las etapas a) y c) o se repiten las etapas b) y c);

e) opcionalmente repetir al menos las etapas a) y c) o las etapas b) y c) con la mezcla obtenida de acuerdo con la etapa c); en donde la al menos una enzima que comprende la actividad transglicosidasa es una enzima que comprende una actividad trans-fucosidasa, trans-sialidasa, trans-lacto-N-biosidasa y/o trans-N-acetil-lactosaminidasa.

f) opcionalmente someter la mezcla incubada obtenida después de la etapa c) o d) a una reacción de hidrogenólisis. Preferentemente, en el compuesto de fórmula 4 al menos uno de R1 o R4 no es H.

De acuerdo con la invención, se necesita al menos un ciclo de incubación adicional cuando ambos: solo se proporcionan dos compuestos en la etapa a), de los cuales uno es 3'-sialil lactosa, y la enzima que se proporciona en la etapa b) es una enzima que comprende una actividad trans-sialidasa. Cuando se repite la etapa a), el al menos un compuesto añadido de acuerdo con la etapa a) es preferentemente diferente de los proporcionados en el primer ciclo; cuando se repite la etapa b), la al menos una enzima añadida de acuerdo con la etapa b) es preferentemente diferente de la que se proporciona en el primer ciclo. Por tanto, la producción de mezclas de oligosacáridos se logra en un proceso sencillo que puede realizarse a gran escala. Además, la producción de oligosacáridos de cadena más larga que comprenden restos/restos de sialilo y mezclas de los mismos, tales como oligosacáridos que contienen de 4-12 unidades de sacáridos, o de 6-10 unidades de sacáridos, puede lograrse de forma sencilla y a gran escala.

De acuerdo con la invención, se necesita al menos un ciclo de incubación adicional cuando ambos: solo se proporcionan dos compuestos en la etapa a), de los que uno es un derivado de lactosa sialilado de fórmula general 4, y la enzima que se proporciona en la etapa b) es una enzima que comprende una actividad trans-sialidasa. Cuando se repite la etapa a), el al menos un compuesto añadido de acuerdo con la etapa a) es preferentemente diferente de los proporcionados en el primer ciclo; cuando se repite la etapa b), la al menos una enzima añadida de acuerdo con la etapa b) es preferentemente diferente de la que se proporciona en el primer ciclo. Por tanto, la producción de mezclas de oligosacáridos se logra en un proceso sencillo que puede realizarse a gran escala. Además, la producción de oligosacáridos de cadena más larga que comprenden restos/restos de sialilo y mezclas de los mismos, tales como oligosacáridos que contienen de 4-12 unidades de sacáridos, o de 6-10 unidades de sacáridos, puede lograrse de forma sencilla y a gran escala.

En ciertos casos, la invención se refiere a un método para la diversificación de los oligosacáridos de la leche humana (HMO) fucosilados o sus precursores, específicamente un método para la preparación de una mezcla de diversificación que comprende dos o más oligosacáridos de la leche humana (HMO) fucosilados en donde la etapa a) comprende: proporcionar al menos un compuesto o una mezcla de los compuestos caracterizados por la fórmula general 5

R' es independientemente fucosilo o H, con la condición de que al menos un R' sea fucosilo y R* sea H, y opcionalmente proporcionar al menos un compuesto o una mezcla de los compuestos, seleccionados del grupo que consiste en:

opcionalmente derivados de lactosa sialilados de fórmula general 6 y sus sales:

en donde

R* es H,

R" independientemente entre sí es sialilo o H,

- lacto-N-tetraosa (LNT):

lacto-N-neotetraosa (LNnT):

y en donde la etapa b) comprende:

añadir al menos una enzima que comprende una actividad transfucosidasa al menos a un compuesto o mezcla de compuestos proporcionados de acuerdo con la etapa a).

De acuerdo con la modalidad preferida anterior, la producción de mezclas de oligosacáridos de la leche humana (HMO) fucosilados se logra en un proceso simple que puede realizarse a gran escala. Particularmente preferentemente, se proporciona la 2'-fucosil lactosa o la 3-fucosil lactosa en la etapa a) y también se proporciona un compuesto adicional que se selecciona del grupo que consiste en 2'-fucosil lactosa, 3-fucosil lactosa, 3'-sialil lactosa, 6'- sialil lactosa, LNT y LNnT.

El método preferido anterior conduce a la formación de una mezcla que comprende dos o más oligosacáridos de la leche humana (HMO) fucosilados, particularmente a la formación de una mezcla de 2',3-difucosil lactosa, 3-fucosil-3-sialil lactosa, LNT fucosilado o fucosilado LNnT.

En ciertos casos, la invención se refiere a un método para la diversificación de los oligosacáridos de la leche humana (HMO), específicamente, un método para la preparación de una mezcla diversificada que comprende dos o más oligosacáridos de la leche humana (HMO):

en donde, donde ambos: solo se proporcionan dos compuestos en la etapa a) de los que uno es un derivado de lactosa fucosilado de fórmula general 2 o 4, y la enzima añadida que comprende una actividad transglicosidasa en la etapa b) es una enzima que comprende una actividad trans-fucosidasa; al menos las etapas a) y c) o se repiten las etapas b) y c);

De acuerdo con la modalidad preferida anterior, se necesita al menos un ciclo de incubación adicional cuando ambos: solo se proporcionan dos compuestos en la etapa a), de los que uno es un derivado de lactosa fucosilado de fórmula general 4, y la enzima que se proporciona en la etapa b) es una enzima que comprende una actividad trans-fucosidasa. Cuando se repite la etapa a), el al menos un compuesto añadido de acuerdo con la etapa a) es preferentemente diferente de los proporcionados en el primer ciclo; cuando se repite la etapa b), la al menos una enzima añadida de acuerdo con la etapa b) es preferentemente diferente de la que se proporciona en el primer ciclo. Por tanto, la producción de mezclas de oligosacáridos se logra en un proceso sencillo que puede realizarse a gran escala. Además, la producción de oligosacáridos de cadena más larga que comprenden restos/restos de fucosilo y mezclas de los mismos, tales como oligosacáridos que contienen de 4-12 unidades de sacáridos, o de 6-10 unidades de sacáridos, puede lograrse de forma sencilla y a gran escala.

De acuerdo con la invención, se necesita al menos un ciclo de incubación adicional cuando solo se forma un producto (HMO) después del primer ciclo de incubación. Este caso puede ocurrir en algunos pares de donante-aceptor proporcionados en la etapa a). La formación de un solo producto permite la presencia de material(es) de partida proporcionado(s) en la etapa a) que permanecen en la mezcla obtenida en la etapa c). Cuando se repiten las etapas a) y c), el al menos un compuesto añadido de acuerdo con la etapa a) es preferentemente diferente de los proporcionados en el primer ciclo; cuando se repiten las etapas b) y c), la al menos una enzima añadida de acuerdo con la etapa b) es preferentemente diferente de la proporcionada en el primer ciclo. Cuando se repiten todas las etapas a) a c), adecuadamente el al menos un compuesto que se proporciona en la etapa a) o la al menos una enzima proporcionada en la etapa b) son diferentes de los proporcionados en el primer ciclo, y preferentemente ambos son diferentes de los proporcionados en el primer ciclo.

La invención proporciona un proceso en el que pueden producirse mezclas de HMO o precursores de los mismos simplemente en un solo proceso de reacción que puede llevarse a cabo a gran escala.

En el contexto de la presente invención, la expresión "grupo que puede eliminarse mediante hidrogenólisis" se refiere a los grupos de manera que un enlace sencillo carbono-oxígeno se escinde o sufre "lisis" por hidrógeno. La hidrogenólisis representa una excepción entre las químicas de los grupos protectores, en las que puede usarse el agua como solvente. La propia hidrogenólisis es un poderoso proceso de desprotección adecuado para eliminar O-bencilo/restos de O-bencilo sustituido de un armazón de oligosacáridos de manera casi cuantitativa en condiciones extremadamente suaves que evitan la formación de subproductos. También es una ventaja de la hidrogenólisis como procedimiento de desbloqueo final dentro de una ruta sintética compleja que solo se requiere una cantidad catalítica de reactivos para la terminación de la reacción que proporciona exclusivamente tolueno o derivados de tolueno sustituidos como subproductos. Tanto el tolueno como los derivados del tolueno sustituido pueden eliminarse fácilmente incluso en escalas de varias toneladas de los productos de oligosacáridos solubles en agua mediante procesos de evaporación y/o extracción. Los grupos adecuados para la hidrogenólisis pueden incluir grupos bencilo, difenilmetilo (bencihidrilo), 1-naftilmetilo, 2-naftilmetilo o trifenilmetilo (tritilo), cada uno de los que puede estar sustituido opcionalmente con uno o más grupos seleccionados de: alquilo, alcoxi, fenilo, amino, acilamino, alquilamino, dialquilamino, nitro, carboxilo, alcoxicarbonilo, carbamoilo, W-alquilcarbamoilo, W,W-dialquilcarbamoilo, azido, halogenoalquilo o halógeno. Preferentemente, tal sustitución, si está presente, está en el anillo o anillos aromáticos. Un grupo protector particularmente preferido es el bencilo sustituido opcionalmente con uno o más grupos seleccionados entre alquilo o halógeno. Con mayor preferencia, el grupo protector se selecciona entre bencilo no sustituido, 4-clorobencilo y 4-metilbencilo. Estos grupos protectores particularmente preferidos y más preferidos tienen la ventaja de que los subproductos de la hidrogenólisis son exclusivamente tolueno o tolueno sustituido. Dichos subproductos pueden eliminarse fácilmente incluso en escalas de varias toneladas de los productos oligosacáridos solubles en agua mediante procesos de evaporación y/o extracción. La hidrogenólisis puede llevarse a cabo al añadir cantidades catalíticas de paladio, níquel Raney u otro catalizador metálico apropiado conocido para usar en la hidrogenólisis, dando como resultado la regeneración del grupo OH. Los grupos de este tipo se conocen bien por el experto y se discuten a fondo (ver, por ejemplo, PGM Wuts y TW Greene: Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons (2007)).

Además, el término "R-glucósido de lactosa" debe entenderse como lactosa que se ha modificado con un residuo R para formar un glucósido mediante un enlace glucosídico.

Además, el término "precursor de HMO" significa un R-glucósido de un HMO, que se ha modificado con un residuo R para formar un glucósido mediante un enlace glucosídico.

Además, el término "derivado de HMO" significa un oligosacárido estructuralmente similar a un HMO y R-glucósidos del mismo, preferentemente derivados de acuerdo con la fórmula general 1, 2, 3 y 4.

Adicionalmente, el término "fucosilo" dentro del contexto de la presente invención significa un grupo L-fucopiranosilo unido al oligosacárido principal con enlace a-interglucosídico:

El grupo "N-acetil-lactosaminilo" dentro del contexto de la presente invención significa el residuo glicosilo de N-acetillactosamina (LacNAc, Galpp1-4GlcNAcp) unido con enlace p:

Además, el término grupo "lacto-N-biosilo" dentro del contexto de la presente invención significa el residuo glicosilo de lacto-N-biosa (LNB, Galpp1-3GlcNAcp) unido con enlace p:

El término "sialilo" dentro del contexto de la presente invención significa el residuo glicosilo del ácido siálico (ácido N-acetil-neuramínico, Neu5Ac) unido con un enlace a:

Adicionalmente, el término "residuo glicosilo que comprende una o más unidades de N-acetil-lactosaminilo y/o una o más lacto-N-biosilo" dentro del contexto de la presente invención significa una estructura lineal o ramificada que comprende dichas unidades que están unidas a entre sí mediante enlaces interglucosídicos.

De acuerdo con la etapa a) de la invención, se proporciona al menos un compuesto o una mezcla de compuestos. Tal mezcla de compuestos debe entenderse preferentemente como una mezcla de al menos dos, tres, cuatro, cinco, uno a cinco, cinco a diez, uno a diez, dos a diez, dos a veinte, tres a veinte, cuatro o incluso cinco a veinte, o incluso más compuestos diferentes como se define generalmente de acuerdo con cualquiera de los compuestos de la etapa a). En consecuencia, al menos un compuesto de este tipo o una mezcla de al menos dos, tres, cuatro, cinco, uno a cinco, cinco a diez, uno a diez, dos a diez, dos a veinte, tres a veinte, cuatro o incluso cinco a veinte, o incluso más compuestos diferentes como se define generalmente de acuerdo con cualquiera de los compuestos de la etapa a) pueden seleccionarse sin restricción de cualquiera de los compuestos como se define de acuerdo con la fórmula general 4 o de LNT o LNnT como se definió anteriormente.

Los componentes según se definen de acuerdo con la etapa a) de la invención, en particularmente componentes según se definen de acuerdo con la fórmula general 4 o LNT o LNnT como se define anteriormente, puede servir como donante o aceptor en el método de la presente invención para la diversificación de los oligosacáridos de la leche humana (HMO). En el contexto de la presente invención, el término "donante" se entiende preferentemente como un compuesto, que proporciona un resto específico en una reacción química, por ejemplo, una reacción de sustitución nucleofílica o electrofílica, a un compuesto adicional, preferentemente un aceptor. Igualmente, el término "aceptor" se entiende preferentemente como un compuesto, que recibe un resto específico en una reacción química, por ejemplo, la reacción de sustitución nucleofílica o electrofílica, a un compuesto adicional, preferentemente un donante.

Los compuestos empleados en la etapa a) de la invención, para la diversificación de los oligosacáridos de la leche humana (HMO), pueden seleccionarse de un compuesto de acuerdo con la fórmula general 4 y sus sales.

Los compuestos particularmente preferidos de acuerdo con la fórmula 4 como se define anteriormente para su uso en la etapa a) del método de la presente invención para la diversificación de los oligosacáridos de la leche humana (HMO) pueden seleccionarse del grupo de: 2'-fucosil lactosa (2'-FL), 3-fucosil lactosa (3-FL), 2',3-difucosil lactosa (DFL), 3'-sialil lactosa (3'-SL), 6'-sialil lactosa (6'-SL), 3'-sialil-3-fucosil lactosa (FSL) y sus sales.

En la etapa b) de la invención, para la diversificación de los oligosacáridos de la leche humana (HMO) se añade al menos una enzima que comprende una actividad transglicosidasa al menos un compuesto o la mezcla obtenida o proporcionada de acuerdo con la etapa a). Una incubación de este tipo permite ventajosamente la diversificación del al menos un compuesto o la mezcla obtenida o proporcionada de acuerdo con la etapa a). La diversificación de dicho al menos un compuesto o la mezcla obtenida o proporcionada de acuerdo con la etapa a) se basa en las diferentes actividades de las enzimas añadidas durante la etapa b) pero también en el al menos un compuesto o la mezcla obtenida o proporcionada de acuerdo con la etapa a), cada uno de los compuestos puede servir como donante o aceptor en la reacción de diversificación. Mediante el uso de este enfoque, el método de la presente invención permite ventajosamente la variación y por tanto la diversificación del número y tipo de oligosacáridos contenidos en la mezcla de una manera sencilla y eficiente. Además, el uso de las enzimas permite llevar a cabo la diversificación de forma estereoselectiva. La diversificación puede ocurrir preferentemente al transferir los restos de glicosilo (por ejemplo, un resto de sialilo, un resto de fucosilo, un resto de N-acetilactosaminilo o un resto de lacto-N-biosilo) al formar nuevos enlaces en las posiciones deseadas de la molécula, etc. una manera bien definida de obtener una mezcla de oligosacáridos de la leche humana diversificados o derivados de los mismos.

En la etapa b) de la invención, se agrega al menos una enzima que comprende la actividad transglicosidasa, preferentemente al menos dos, tres, cuatro, cinco, dos a cinco, dos a diez, dos a veinte, cinco a diez o incluso más enzimas diferentes que comprenden la actividad transglicosidasa.

Las enzimas adecuadas en la etapa b) de la invención, para la diversificación de los oligosacáridos de la leche humana (HMO) comprenden al menos una enzima que comprende una actividad transglicosidasa, seleccionada entre enzimas que tienen una trans-fucosidasa, una trans-sialidasa (transneuraminidasa), una trans-lacto-N-biosidasa y/o una actividad trans-N-acetilactoaminidasa, o cualquier otra enzima que tenga dicha actividad. Preferentemente, las enzimas adecuadas en la etapa b) de la invención para la diversificación de oligosacáridos de la leche humana (HMO) pueden seleccionarse del grupo que comprende transglicosidasas de tipo salvaje o mutadas que tienen una transfucosidasa, una trans-sialidasa (transneuraminidasa), una trans-lacto-N-biosidasa y/o actividad a o trans-N-acetilactoaminidasa, preferentemente con actividad a-trans-fucosidasa, a-trans-sialidasa, P-trans-lacto-N-biosidasa y/o P-trans-N-acetil-lactosaminidasa.

Las enzimas adecuadas en la etapa b) de la invención para la diversificación de oligosacáridos de la leche humana (HMO) pueden seleccionarse además de cualquier género conocido por un experto en la técnica, para expresar o secretar al menos una enzima como se define anteriormente, por ejemplo, una enzima que tiene una trans-fucosidasa, una trans-sialidasa (transneuraminidasa), actividad a o trans-lacto-N-biosidasa y/o una actividad trans-N-acetilactoaminidasa, que tiene preferentemente actividad a-trans-fucosidasa, a-trans-sialidasa, P-trans-lacto-N-biosidasa y/o P-trans-N-acetil-lactosaminidasa, o cualquier otra enzima que tenga dicha actividad. Aún con mayor preferencia, dichas enzimas adecuadas en la etapa b) del método de la presente invención para la diversificación de oligosacáridos de la leche humana (HMO) pueden seleccionarse de bacterias seleccionadas de Bacillus, Bifidobacterium, Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Streptococcus, Streptomyces, Sulfolobus, Thermotoga o Trypanosoma.

Aún con mayor preferencia, dichas enzimas adecuadas en la etapa b) de la invención para la diversificación de oligosacáridos de la leche humana (HMO) se seleccionan del grupo que comprende las bacterias Bacillus circulans, Streptomyces sp., Sulfolobus solfataricus P2, Thermotoga maritima MSB8, Trypanosoma cruzi, bacterias del ácido láctico, como Bifidobacterium bifidum JCM 1254, Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171, Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171, Bifidobacterium bifidum JCM1254, Bifidobacterium bifidum JCM1254, Bifidobacterium bifidum PRL2010, Bifidobacterium bifidum PRL2010, Bifidobacterium bifidum S17, Bifidobacterium bifidum S17, Bifidobacterium dentium Bd1, Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697, Bifidobacterium longum subsp longum JDM 301, Bifidobacterium longum subsp. infantis JCM 1222, y Lactobacillus casei BL23.

Los microorganismos particularmente preferidos en el contexto anterior, particularmente para las glicosidasas/transglicosidasas dirigidas, comprenden bacterias del ácido láctico. Las bacterias del ácido láctico, y más particularmente las bacterias del género Bifidobacteria contienen una serie de glicosidasas que incluyen a-2,3/6 sialidasas (GH33), a-1,2/3/4 fucosidasas (GH29 y GH95), lacto-N-biosidasas (GH20), P-galactosidasas (Gh 2) y P-N-acetilhexosaminidasas (GH20) que son capaces de reconocer los oligosacáridos de la leche humana. En dependencia de las cepas de bifidobacterias, estas glicosidasas son enzimas intra o extracelulares.

Un aspecto adicional con respecto al uso de las glicosidasas de bacterias del ácido láctico se refiere a la importancia industrial de dichas bacterias, ya que tienen el estado GRAS (generalmente reconocido como seguro). De acuerdo con otro aspecto más preferido, la glicosidasa que presenta una actividad trans-fucosidasa, trans-sialidasa, translacto-N-biosidasa y/o trans-N-acetil-lactosaminidasa, preferentemente una actividad a-trans-fucosidasa, a-transsialidasa, P-trans-lacto-N-biosidasa y/o P-trans-N-acetil-lactosaminidasa, es una glicosidasa de tipo salvaje o modificada, con la máxima preferencia la glicosidasa de tipo salvaje se toma del grupo que consiste en bacterias del ácido láctico, en donde la glicosidasa se convierte en una transglicosidasa mediante la ingeniería racional o/y la evolución dirigida. Una glicosidasa seleccionada del grupo que consiste en bacterias del ácido láctico es con la máxima preferencia una glicosidasa de Bifidobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus o Leuconostoc. Una glicosidasa seleccionada del género Bifidobacteria es con la con la máxima preferencia una glicosidasa de Bifidobacterium longum subsp. Infantis, Bifidobacterium longum subsp. Longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum y Bifidobacterium catenulatum.

Además, las fucosidasas modificadas a partir de organismos termofílicos tales como Sulfolobus solfataricus y Thermotoga maritima se han desarrollado recientemente, que pueden usarse en el método de la presente invención. Estas glicosidasas termoestables tienen un potencial considerable para aplicaciones industriales ya que pueden usarse en procesos biotecnológicos a temperaturas elevadas, y facilitar así el proceso, mediante la prevención del riesgo de contaminación, aumentar la solubilidad de los compuestos usados en la reacción.

De acuerdo con otro aspecto más preferido, la glicosidasa que presenta una actividad trans-fucosidasa, transsialidasa, trans-lacto-N-biosidasa y/o trans-N-acetil-lactosaminidasa, preferentemente una actividad a-transfucosidasa, a-trans-sialidasa, P-trans-lacto-N-biosidasa y/o P-trans-N-acetil-lactosaminidasa, es una glicosidasa de tipo salvaje o modificada, con la máxima preferencia la glicosidasa de tipo salvaje se toma del grupo que consiste en organismos termofílicos, en los que se convierte la glicosidasa a una transglicosidasa genéticamente racional o/y evolución dirigida. Una a-L-fucosidasa seleccionada de organismos termofílicos es con la máxima preferencia una a-L-fucosidasa de Thermotoga maritima y Sulfolobus solfataricus.

Preferentemente, la al menos una enzima que comprende una actividad transglicosidasa puede seleccionarse de una enzima que muestra una actividad trans-fucosidasa, preferentemente como se describe a continuación. En este contexto, las enzimas que tienen una actividad trans-fucosidasa, con mayor preferencia una actividad a-transfucosidasa, se seleccionan preferentemente de fucosidasas en general, aún con mayor preferencia de a-L-fucosidasas, por ejemplo, a-L-fucosidasas según se clasifican de acuerdo con EC 3.2.1.38 y 3.2.1.51. Las a-L-fucosidasas se distribuyen ampliamente en organismos vivos tales como mamíferos, plantas, hongos y bacterias. Estas enzimas pertenecen a las familias 29 y 95 de las glucósido hidrolasas (GH29 y GH95) según se define por la nomenclatura CAZY (http://www.cazy.org). Las fucosidasas de GH 29 son enzimas de retención (estructura 3D: (p/a)8) mientras que las fucosidasas de GH 95 son enzimas inversoras (estructura 3D: (a /a)6). La especificidad de sustrato de la familia GH29 es amplia, mientras que la de la familia GH95 es estricta para los residuos fucosilo unidos a a1,2. La familia GH29 parece estar dividida en dos subfamilias. Una subfamilia tiene típicamente una especificidad estricta hacia los enlaces fucosídicos a1,3 y a1,4. Los miembros de otra subfamilia tienen una especificidad más amplia, que cubre todos los enlaces a-fucosilo. Las a-L-fucosidasas generalmente hidrolizan el residuo de fucosilo terminal de los glicanos. Estas enzimas también son capaces de actuar como catalizador para la reacción de fucosilación debido a su actividad de transfucosilación y, por tanto, pueden usarse en el contexto del método de la presente invención, preferentemente en condiciones controladas cinéticamente.

Las fucosidasas, que pueden emplearse en el contexto de la presente invención, también pueden comprender fucosidasas modificadas. Dichas fucosidasas modificadas comprenden preferentemente a-L-fucosidasas modificadas por ingeniería, preferentemente fucosidasas modificadas por ingeniería derivadas de fucosidasas como se describió anteriormente, por ejemplo, una a-1,2-L-fucosintasa modificada por ingeniería a partir de Bifidobacterium bifidum, las a-L-fucosintasas de Sulfolobus sofataricus y Thermotoga marítima, etc. Dichas fucosidasas modificadas por ingeniería muestran una regioselectividad dependiente del aceptor y están desprovistas de la actividad de hidrólisis del producto. Además, las fucosidasas modificadas por ingeniería comprenden preferentemente a-L-fucosidasa de Thermotoga marítima, que también se ha convertido recientemente en una a-L-trans-fucosidasa eficiente por evolución dirigida (ver Osanjo, G., y otros, Directed evolution of the alpha-L-fucosidase from Thermotoga maritima into an alpha-L-transfucosidase. Biochemistry, 2007, 46(4): pág. 1022-33).

Aún con mayor preferencia, la al menos una enzima que tiene una actividad trans-fucosidasa puede seleccionarse de a-L-fucosidasas derivadas de Thermotoga maritima MSB8, Sulfolobus solfataricus P2, Bifidobacterium bifidum JCM 1254, Bifidobacterium bifidum JCM 1254, Bifidobacterium longum subsp. Infantis ATCC 15697, Bifidobacterium longum subsp. Infantis ATCC 15697, Bifidobacterium longum subsp. Infantis JCM 1222, Bifidobacterium bifidum PRL2010, Bifidobacterium bifidum S17, Bifidobacterium longum subsp longum JDM 301, Bifidobacterium dentium Bd1, o Lactobacillus casei BL23, etc.

Aún con mayor preferencia, la al menos una enzima que tiene una actividad trans-fucosidasa puede seleccionarse de las siguientes a-L-fucosidasas según se define de acuerdo con los siguientes números de depósito gi|4980806 (Thermotoga marítima MSB8, SEQ ID NO: 1), gi|13816464 (Sulfolobus solfataricus P2, SEQ ID NO: 2), gi|34451973 (Bifidobacterium bifidum JCM 1254, SEQ ID NO: 3), gi|242345155 (Bifidobacterium bifidum, JCM 1254, SEQ ID NO: 4), gi|213524647 (Bifidobacterium longum subsp. infantis, ATCC 15697, SEQ ID NO: 5), gi|213522629 (Bifidobacterium longum subsp. Infantis ATCC 15697), gi|213522799 (Bifidobacterium longum subsp. Infantis ATCC 15697), gi|213524646 (Bifidobacterium longum subsp. Infantis ATCC 15697), gi|320457227 (Bifidobacterium longum subsp. Infantis JCM 1222), gi|320457408 (Bifidobacterium longum subsp. Infantis JCM 1222), gi|320459369 (Bifidobacterium, longum subsp. Infantis JCM 1222), gi|320459368 (Bifidobacterium longum subsp. Infantis JCM 1222), gi|310867039 (Bifidobacterium bifidum PRL2010), gi|310865953 (Bifidobacterium bifidum PRL2010), gi|309250672 (Bifidobacterium bifidum S17), gi|309251774 (Bifidobacterium bifidum S17), gi|296182927 (Bifidobacterium longum subsp longum JDM 301), gi|296182928 (Bifidobacterium longum subsp longum Jd M 301), gi|283103603 (Bifidobacterium dentium Bd1), gi|190713109 (Lactobacillus casei BL23, SEQ ID NO: 6), gi|190713871 (Lactobacillus casei BL23, SEQ ID NO: 7), gi|190713978 (Lactobacillus casei BL23, SEQ ID NO: 8), etc., o una secuencia que muestra una identidad de secuencia con una de las secuencias de enzimas mencionadas anteriormente que tiene una actividad fucosidasa y/o transfucosidasa de al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, igualmente con mayor preferencia al menos 85 %, aún con mayor preferencia al menos 90 % y con la máxima preferencia al menos 95 % o incluso 97 %, 98 % o 99 % en comparación con la secuencia de tipo salvaje completa a nivel de aminoácidos.

Las a-L-fucosidasas particularmente preferidas con actividad trans-fucosidasa se enumeran en la siguiente Tabla 2:

Tabla 2: A-L-fucosidasas preferidas

Igualmente, preferentemente, la al menos una enzima que comprende una actividad transglicosidasa puede seleccionarse de una enzima que muestra una actividad trans-sialidasa, preferentemente como se describe a continuación. En este contexto, las enzimas que tienen una actividad trans-sialidasa se seleccionan preferentemente de una sialidasa o trans-sialidasa como se describe a continuación, por ejemplo, trans-sialidasas (EC 2.4.1.-) como se clasifican de acuerdo con la familia GH33. Se retienen las enzimas. Las sialidasas y trans-sialidasas se distribuyen ampliamente en la naturaleza. Se encuentran particularmente en diversas familias de virus y bacterias, y también en protozoos, algunos invertebrados y mamíferos. Estas enzimas difieren en sus propiedades bioquímicas, por ejemplo, cinética, afinidad de unión o preferencia de sustrato. Sin embargo, poseen dominios conservados y similitudes estructurales. Las trans-sialidasas se diferencian de las sialidasas porque pueden transferir ácidos siálicos, preferentemente ácidos siálicos con enlaces a-2,3, desde una molécula donante a un derivado aceptor, que es preferentemente un resto de galactosa terminal con enlace P-interglucosídico. Como resultado de esta transferencia, se forma un enlace a-glicosídico entre el ácido siálico y el aceptor. Sin embargo, si no hay un aceptor adecuado, la trans-sialidasa hidroliza el ácido siálico.

La primera enzima trans-sialidasa descrita se encontró en el Trypanosoma cruzi, un protozoo que causa la enfermedad de Chagas. Esta trans-sialidasa (TcTS) se ha estudiado ampliamente. Desde entonces, se han detectado transsialidasas en varios otros tipos de tripanosomas, tales como el Trypanosoma brucei gambiense, el Trypanosoma brucei rhodesiense, el Trypanosoma brucei brucei y el Trypanosoma congolense. Además, la existencia de las transsialidasas se ha demostrado en tipos de Endotrypanum, en las Corynebacterium diphtheriae e incluso en el plasma humano.

Las sialidasas pueden clasificarse en dos subgrupos diferentes, endo y exosialidasas. Las endo-sialidasas hidrolizan los enlaces del ácido siálico internos a las macromoléculas, mientras que las segundas, las exosialidasas, atacan los enlaces terminales del ácido siálico y desialilan las glicoproteínas, los glicopéptidos, los gangliósidos, los oligosacáridos y los polisacáridos. Recientemente, las sialidasas de Bifidobacterium bifidum y Bifidobacterium longum subsp. Infantis se han identificado, clonado y caracterizado. Estas sialidasas pueden escindirse y, por tanto, reconocer sialósidos con enlaces a-2,3 y a-2,6. Sialidasas de Bifidobacterium longum subsp. Infantis tienen una preferencia constante por el enlace a-2,6, mientras que las sialidasas de Bifidobacterium bifidum tienen una preferencia constante por el enlace a-2,3. Estas enzimas también son capaces de actuar como catalizadores para reacciones de sialilación debido a su actividad trans-sialidasa y, por tanto, pueden usarse en el contexto del método de la presente invención, preferentemente en condiciones controladas cinéticamente.

Las sialidasas, que pueden emplearse en el contexto de la presente invención, también pueden comprender sialidasas modificadas por ingeniería. Basado en comparaciones de secuencia y estructura, la sialidasa de Trypanosoma rangeli puede estar mutada en seis posiciones, en donde el mutante resultante es capaz de mostrar un nivel significativo de actividad trans-sialidasa (ver Paris, G., y otros, A sialidase mutant displaying trans-sialidase activity. J Mol Biol, 2005.

345(4): pág. 923-34).

Aún con mayor preferencia, la al menos una enzima que tiene actividad trans-sialidasa puede seleccionarse entre sialidasas o trans-sialidasas derivadas de Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697, Bifidobacterium bifidum JCM1254, Bifidobacterium bifidum S17, Bifidobacterium bifidum PRL2010, Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171, Trypanosoma cruzi, etc.

Aún con mayor preferencia, la al menos una enzima que tiene actividad trans-sialidasa puede seleccionarse de sialidasas o trans-sialidasas como se define de acuerdo con los siguientes números de depósito: gi|213524659 (Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697, SEQ ID NO: 9), gi|213523006 Bifidobacterium longum subsp. infantis ATCC 15697, SEQ ID NO: 10), siab2 (Bifidobacterium bifidum JCM1254), otras sialidasas o trans-sialidasas de Bifidobacterium bifidum JCM1254), gi|309252191 (Bifidobacterium bifidum S17, SEQ ID NO: 11), gi|309252190 (Bifidobacterium bifidum S17, SEQ ID NO: 12), gi|310867437 (Bifidobacterium bifidum PRL2010, SEQ ID NO 13), gi|310867438 (Bifidobacterium bifidum PRL2010, SEQ ID NO 14), gi|224283484 (Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171), gi|313140638 (Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171), gi|47252690 (Trypanosoma cruzi, SEQ ID NO: 15), gi|432485 (Trypanosoma cruzi, SEQ ID NO: 16), gi|343957998 (Trypanosoma congolense, SEQ ID NO: 20), gi|343958004 (Trypanosoma congolense, SEQ ID NO: 21) etc., o una secuencia que muestra una identidad de secuencia con una de las secuencias de enzimas mencionadas anteriormente que tiene una actividad trans-sialidasa de al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, igualmente con mayor preferencia al menos 85 %, aún con mayor preferencia al menos 90 % y con la máxima preferencia al menos 95 % o incluso 97 %, 98 % o 99 % en comparación con la secuencia de tipo salvaje completa a nivel de aminoácidos.

Las sialidasas particularmente preferidas con actividad trans-sialidasa se enumeran en la siguiente Tabla 3:

Tabla 3: Sialidasas/trans-sialidasas preferidas

Adicionalmente, la al menos una enzima que comprende una actividad transglicosidasa puede seleccionarse preferentemente de una enzima que muestra una actividad trans-lacto-N-biosidasa, preferentemente como se describe a continuación. En este contexto, las enzimas que tienen una actividad trans-lacto-N-biosidasa se seleccionan preferentemente de una lacto-N-biosidasa o trans-lacto-N-biosidasa como se describe a continuación, por ejemplo, lacto-N-biosidasas (EC 3.2.1.140) según se clasifica de acuerdo con la familia GH20. Las lacto-N-biosidasas proceden típicamente a través de un mecanismo de retención. Solo dos lacto-N-biosidasas de Streptomyces y Bifidobacterium bifidum se han descrito y caracterizado hasta ahora, que pueden utilizarse en la presente invención como una translacto-N-biosidasa (ver Sano, M., K. Hayakawa e I. Kato, Proc Natl Acad Sci de Estados Unidos, 1992. 89(18): pág.

8512-6; Sano, M., K. Hayakawa e I. Kato, J Biol Chem, 1993. 268(25): pág. 18560-6; Wada, J. y otros, Appl Environ Microbiol, 2008. 74(13): pág. 3996-4004.). Las lacto-N-biosidasas hidrolizan específicamente el residuo de lacto-N-biosilo terminal (P-D-Gal-(1^3)-D-GlcNAc) del extremo no reductor de los oligosacáridos con la estructura P-D-Gal-(1^3)-P-D-GlcNAc-(1^3)-P-D-Gal-(1^R). Wada y otros (supra) y Murata y otros (Glycoconj. J. 16, 189 (1999))) también demostró la capacidad de la lacto-N-biosidasa de Bifidobacterium bifidum y de Aureobacterium sp. L-101, respectivamente, para catalizar la transglicosilación mediante la incubación de sustratos donantes (como la lacto-N-tetraosa y la pNP-P-LNB) con aceptores (como varios 1-alcanoles y lactosa).

Aún con mayor preferencia, la al menos una enzima que tiene una actividad trans-lacto-N-biosidasa puede seleccionarse entre las lacto-N-biosidasas o trans-lacto-N-biosidasas derivadas de Bifidobacterium bifidum JCM1254, Bifidobacterium bifidum PRL2010, Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171, Aureobacterium sp. L-101 o Streptomyces sp., etc.

Aún con mayor preferencia, la al menos una enzima que tiene una actividad trans-lacto-N-biosidasa puede seleccionarse de las lacto-N-biosidasas o trans-lacto-N-biosidasas como se define de acuerdo con los siguientes números de depósito: gi|167369738 (Bifidobacterium bifidum JCM1254, SEQ ID NO: 17), gi|4096812 (Streptomyces sp., SEQ ID NO: 18), gi|310867103 (Bifidobacterium bifidum PRL2010), gi|313140985 (Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171), etc., o una secuencia que muestra una identidad de secuencia con una de las secuencias de enzimas mencionadas anteriormente que tiene una actividad lacto-N-biosidasa o trans-lacto-N-biosidasa de al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, igualmente con mayor preferencia al menos 85 %, aún con mayor preferencia al menos 90 % y con la máxima preferencia al menos 95 % o incluso 97 %, 98 % o 99 % en comparación con la secuencia de tipo salvaje completa a nivel de aminoácidos.

Las lacto-N-biosidasas particularmente preferidas con actividad trans-lacto-N-biosidasa se enumeran en la siguiente Tabla 4:

Tabla 4: Lacto-N-biosidasas o trans-lacto-N-biosidasas preferidas

Además, la al menos una enzima que comprende una actividad transglicosidasa puede seleccionarse preferentemente de una enzima que muestra una actividad trans-N-acetil-lactosaminidasa, preferentemente como se describe a continuación. En este contexto, las enzimas que tienen una actividad trans-N-acetil-lactosaminidasa se seleccionan preferentemente de una N-acetil-lactosaminidasa o trans-N-acetil-lactosaminidasa como se describe a continuación, por ejemplo, las lacto-N-biosidasas (EC 3.2.1.140) según se clasifican de acuerdo con la familia GH20. Particularmente preferentemente, la quitinasa de bacillus circulans, con mayor preferencia quitinasa A1 de Bacillus circulans WL-12 tal como se deposita bajo gi|142688 (SEQ ID NO: 19), puede usarse como una trans-N-acetil-lactosaminidasa, o una secuencia que muestra una identidad de secuencia con una de las secuencias de enzimas mencionadas anteriormente que tiene una actividad trans-N-acetil-lactosaminidasa de al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, igualmente con mayor preferencia al menos 85 %, aún con mayor preferencia al menos 90 % y con la máxima preferencia al menos 95 % o incluso 97 %, 98 % o 99 % en comparación con el secuencia completa de tipo salvaje a nivel de aminoácidos. En particular, Shoda y otros mostró que la quitinasa A1 de B. Circulans WL-12 es capaz de transferir N-acetil-lactosamina con un enlace glucosídico P-1,6 mediante el uso de un derivado de 1,2-oxazolina de transferencia N-acetil-lactosamina (ver Shoda, S.-i., y otros, Cellulose, 2006. 13(4): pág. 477-484.).

Las trans-N-acetil-lactosaminidasas particularmente preferidas se enumeran en la siguiente Tabla 5:

Tabla 5: Trans-N-acetil-lactosaminidasas preferidas

Como se definió anteriormente, las proteínas que comprenden una transglicosidasa como se definió anteriormente también pueden comprender proteínas modificadas que comprenden una actividad transglicosidasa. Se prevé particularmente que las glicosidasas de tipo salvaje o mutadas que presentan una actividad transfucosidasa, transsialidasa, trans-lacto-N-biosidasa y/o trans-N-acetil-lactosaminidasa, preferentemente una actividad atransfucosidasa, a-trans-sialidasa, P-trans-lacto-N-biosidasa y/o P-trans-N-acetil-lactosaminidasa, pueden usarse en la presente invención para producir dichos oligosacáridos. La preparación de dichas enzimas se lleva a cabo preferentemente mediante los enfoques de mutagénesis dirigida al sitio o evolución dirigido.

En la ingeniería racional, se crean nuevas enzimas alteradas (mutantes) mediante los enfoques de mutagénesis dirigida al sitio, preferentemente mediante la introducción de mutaciones puntuales. Esta técnica generalmente requiere depender de la estructura de la proteína 3D estática. Las mutaciones generalmente afectan el sitio activo de las enzimas de manera que pierden su capacidad para degradar sus productos de transglicosilación pero siguen siendo capaces de la síntesis. Una estrategia preferida consiste en la sustitución del nucleófilo catalítico por un residuo no nucleofílico. Esta modificación da como resultado la formación de un mutante inactivo o una enzima alterada con actividad de transglicosilación reducida debido a la falta de un entorno apropiado para la formación del complejo reactivo portador-hospedado para la transglicosilación. Sin embargo, en presencia de un donante de glicosilo más activo (por ejemplo, el fluoruro de glicosilo) que imita el intermediario enzimático glicosilo, la enzima mutada es capaz de transferir eficientemente el resto glicosilo a un aceptor adecuado que genera un glicósido con estereoquímica anomérica invertida.

La segunda técnica preferida se llama evolución dirigida. Esta estrategia comprende la mutagénesis aleatoria aplicada sobre el gen de la glicosidasa seleccionada y genera así una biblioteca de genes genéticamente diversos que expresan la glicosidasa. La generación de diversidad de secuencias puede realizarse mediante el uso de metodologías bien conocidas, la de mayor preferencia es el método de reacción en cadena de la polimerasa propensa a errores (epCR). Esta biblioteca de genes puede insertarse en microorganismos adecuados tales como la E. coli o la S. cerevisiae para producir variantes recombinantes con propiedades ligeramente alteradas. Los clones que expresan las enzimas mejoradas se identifican luego con un método de selección rápido y confiable, se seleccionan y se llevan a una siguiente ronda de proceso de mutación. Los ciclos recursivos de mutación, recombinación y selección continúan en la medida en que se desarrollen mutantes con la actividad y/o especificidad deseadas. Hasta la fecha, se han desarrollado diferentes metodologías de selección de alto rendimiento para las glucosidasas. Aplicar estos enfoques, hace que las transglucosidasas modificadas por ingeniería puedan y sean creadas y aisladas. Una a-L-fucosidasa de Thermotoga maritima se convirtió recientemente en una a-L-transfucosidasa eficiente mediante la evolución dirigida. La relación de la transferasa/hidrólisis de la enzima desarrollada fue 30 veces mayor que la de la enzima nativa (ver Osanjo, G. y otros, Biochemistry, 2007. 46(4): pág. 1022-33).

Las proteínas que comprenden una actividad transglicosidasa como se definió anteriormente también pueden comprender fragmentos o variantes de esas secuencias de proteínas. Dichos fragmentos o variantes pueden comprender típicamente una secuencia que tiene una identidad de secuencia con una de las secuencias de proteínas mencionadas anteriormente de al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, igualmente con mayor preferencia al menos 85 %, aún con mayor preferencia al menos 90 % y con la máxima preferencia al menos 95 % o incluso 97 %, 98 % o 99 % en comparación con la secuencia de tipo salvaje completa a nivel de aminoácidos.

Los "fragmentos" de proteínas o péptidos en el contexto de la presente invención también pueden comprender una secuencia de una proteína o péptido como se define en la presente descripción, que es, con respecto a su secuencia de aminoácidos N-terminal, C-terminal y/o truncada intrasecuencialmente en comparación con la secuencia de aminoácidos de la proteína original (nativa). Por tanto, dicho truncado puede ocurrir a nivel de aminoácidos o de forma correspondiente a nivel de ácido nucleico. Por lo tanto, una identidad de secuencia con respecto a dicho fragmento como se define en la presente descripción puede referirse preferentemente a la proteína o péptido completo como se define en la presente descripción o a la molécula de ácido nucleico completa (codificante) de dicha proteína o péptido. Igualmente, los "fragmentos" de ácidos nucleicos en el contexto de la presente invención pueden comprender una secuencia de un ácido nucleico como se define en la presente descripción, que es, con respecto a su molécula de ácido nucleico 5'-, 3'- y/o intrasecuencialmente truncada en comparación a la molécula de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico original (nativa). Por lo tanto, una identidad de secuencia con respecto a dicho fragmento como se define en la presente descripción puede referirse preferentemente al ácido nucleico completo como se define en la presente descripción.

Las "variantes" de proteínas o péptidos como se definen en el contexto de la presente invención (por ejemplo, como codificadas por un ácido nucleico como se define en la presente descripción) pueden codificarse por la molécula de ácido nucleico del complejo de carga portador de polímero de la invención. De esta manera, puede generarse una proteína o péptido, que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia original en una o más mutaciones, tales como uno o más aminoácidos sustituidos, insertados y/o eliminados. Preferentemente, estos fragmentos y/o variantes tienen la misma función biológica o actividad específica en comparación con la proteína nativa de longitud completa, por ejemplo, su propiedad antigénica específica.

Las "variantes" de proteínas o péptidos como se definen en el contexto de la presente invención (por ejemplo, como codificadas por un ácido nucleico como se define en la presente descripción) también pueden comprender sustituciones de aminoácidos conservativas en comparación con su secuencia fisiológica nativa, es decir, no mutada. Esas secuencias de aminoácidos, así como también sus secuencias de nucleótidos codificantes, en particular, caen bajo el término variantes como se define en la presente descripción. Las sustituciones en las que los aminoácidos, que se originan en la misma clase, se intercambian entre sí se denominan sustituciones conservativas. En particular, se trata de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas, cadenas laterales cargadas positiva o negativamente, grupos aromáticos en las cadenas laterales o aminoácidos, cuyas cadenas laterales pueden entrar en puentes de hidrógeno, por ejemplo cadenas laterales que tienen una función hidroxilo. Esto significa que, por ejemplo, un aminoácido que tiene una cadena lateral polar se reemplaza por otro aminoácido que tiene una cadena lateral igualmente polar o, por ejemplo, un aminoácido caracterizado por una cadena lateral hidrofóbica se sustituye por otro aminoácido que tiene igualmente una cadena lateral hidrofóbica (por ejemplo, serina (treonina) por treonina (serina) o leucina (isoleucina) por isoleucina (leucina)). Son posibles inserciones y sustituciones, en particular, en aquellas posiciones de secuencia que no provocan modificación de la estructura tridimensional o no afectan a la región de unión. Las modificaciones a una estructura tridimensional por inserción(es) o deleción(es) pueden determinarse fácilmente, por ejemplo, mediante el uso de espectros de CD (espectros de dicroísmo circular) (Urry, 1985, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger y otros (ed.), Elsevier, Amsterdam).

Además, las variantes de proteínas o péptidos tal como se definen en la presente descripción también pueden comprender aquellas secuencias, en donde los nucleótidos del ácido nucleico se intercambian de acuerdo con la degeneración del código genético, sin conducir a una alteración de la secuencia de aminoácidos respectiva de la proteína o péptido, es decir, la secuencia de aminoácidos o al menos parte de la misma puede no diferir de la secuencia original en una o más mutaciones dentro del significado anterior.

Para determinar el por ciento en el que dos secuencias son idénticas, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos como se definen en la presente descripción, preferentemente las secuencias de aminoácidos codificadas por una secuencia de ácidos nucleicos del portador de polímero como se define en la presente descripción o las secuencias de aminoácidos en sí mismas, las secuencias pueden alinearse para compararlas entre sí subsecuentemente. Por tanto, por ejemplo, una posición de una primera secuencia puede compararse con la posición correspondiente de la segunda secuencia. Si una posición en la primera secuencia se ocupa por el mismo componente que en el caso de una posición en la segunda secuencia, las dos secuencias son idénticas en esta posición. Si este no es el caso, las secuencias difieren en esta posición. Si se producen inserciones en la segunda secuencia en comparación con la primera secuencia, pueden insertarse espacios en la primera secuencia para permitir una alineación adicional. Si se producen deleciones en la segunda secuencia en comparación con la primera secuencia, pueden insertarse espacios en la segunda secuencia para permitir una alineación adicional. El por ciento en el que dos secuencias son idénticas es entonces una función del número de posiciones idénticas dividido por el número total de posiciones, que incluyen aquellas posiciones que sólo se ocupan en una secuencia. El por ciento en el que dos secuencias son idénticas puede determinarse mediante el uso de un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido, pero no limitante, de un algoritmo matemático que puede usarse es el algoritmo de Karlin y otros (1993), PnAs de Estados Unidos, 90:5873-5877 o Altschul y otros (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-3402. Dicho algoritmo está integrado en el programa BLAST. Las secuencias que son idénticas a las secuencias de la presente invención hasta cierto punto pueden identificarse mediante este programa.

Las proteínas añadidas en la etapa b) de la invención pueden proporcionarse en forma libre o, alternativamente, estar unidas o inmovilizadas sobre una superficie. En este caso específico, el orden de las etapas a) y b) se invierte preferentemente. La unión o inmovilización sobre una superficie puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante enlaces electrostáticos, enlaces de van der Waals, enlaces covalentes, etc. La unión o inmovilización sobre una superficie puede llevarse a cabo además, mediante el uso de un enlazador covalente o un reticulante, o una etiqueta, como se conoce por un experto para la purificación de proteínas. Dichas etiquetas comprenden, entre otras cosas, por ejemplo, etiquetas de afinidad o etiquetas de cromatografía. Las etiquetas de afinidad pueden incluir, por ejemplo, la proteína de unión a quitina (CBP), la proteína de unión a maltosa (MBP), la glutatión-S-transferasa (GST) o la Strep-Tag. La etiqueta poli(His) es una etiqueta de proteína ampliamente usada que se une a matrices metálicas. Las etiquetas de cromatografía se usan para alterar las propiedades cromatográficas de la proteína para proporcionar una resolución diferente a través de una técnica de separación particular, e incluyen, por ejemplo, etiquetas basadas en aminoácidos polianiónicos, tal como la etiqueta FLAG. La superficie puede ser la superficie de un biorreactor o cualquier cámara de reacción adecuada.

En una etapa adicional c) de la invención, para la diversificación de los oligosacáridos de la leche humana (HMO), la mezcla que contiene al menos un compuesto como se define de acuerdo con la etapa a) o una mezcla de los mismos y al menos una enzima añadida de acuerdo con la etapa b) se incuban para permitir la diversificación de los oligosacáridos de la leche humana (HMO) o sus derivados a través de medios enzimáticos mediante el uso de al menos una enzima que comprende una actividad transglicosidasa como se define en la presente descripción.

La incubación de acuerdo con la etapa c) de la invención, preferentemente se produce con una concentración de (cada una de las) enzimas en una concentración de 1 mU/l a 1000 U/l, preferentemente 10 mU/l a 100 U/l, cuando la actividad capaz de formar 1 pmol de producto específico para una proteína definida a partir de un educto definido se define como 1 unidad (U), por ejemplo, para una glucotransferasa la producción de un carbohidrato complejo que contiene glucosa a 37 °C en 1 minuto. La actividad de cada enzima como se define en la presente descripción puede evaluarse con respecto a su sustrato de origen natural o en consecuencia modificado por ingeniería.

La incubación de acuerdo con la etapa c) de la invención, puede llevarse a cabo en un medio de reacción, preferentemente un medio acuoso, que comprende la mezcla obtenida de acuerdo con la etapa b) y agua opcionalmente; un tampón tal como un tampón de fosfato, un tampón de carbonato, un tampón de acetato, un tampón de borato, un tampón de citrato y un tampón TRIS, o sus combinaciones; alcohol, tal como metanol y etanol; éster tal como acetato de etilo; cetona tal como acetona; amida tal como acetamida; y similares.

Además, la incubación de acuerdo con la etapa c) de la invención, puede llevarse a cabo en un medio de reacción como se definió anteriormente, en donde opcionalmente puede añadirse un tensioactivo o un solvente orgánico, si es necesario. Cualquier tensioactivo capaz de acelerar la formación de un carbohidrato complejo como se define de acuerdo con la presente invención como posible producto de la invención puede usarse como tensioactivo. Los ejemplos incluyen tensioactivos no iónicos tales como la octadecilamina de polioxietileno (por ejemplo, Nymeen S-215, fabricado por Nippon Oil & Fats); los tensioactivos catiónicos, tales como el bromuro de cetiltrimetilamonio y el cloruro de alquildimetil bencilamonio (por ejemplo, el Cation F2-40E, fabricado por Nippon Oil & Fats); los tensioactivos aniónicos tales como el lauroil sarcosinato; las aminas terciarias tales como la alquildimetilamina (por ejemplo, Amina Terciaria FB, fabricada por Nippon Oil & Fats); y similares, que se usan solos o como una mezcla de dos o más. El tensioactivo puede usarse generalmente en una concentración de 0,1 a 50 g/l. El solvente orgánico puede incluir xileno, tolueno, alcohol de ácido graso, acetona, acetato de etilo y similares, que pueden usarse en una concentración generalmente de 0,1 a 50 ml/l.

La incubación de acuerdo con la etapa c) de la invención puede llevarse a cabo además en un medio de reacción como el definido anteriormente, preferentemente de pH 3 a 10, pH 5 a 10, preferentemente pH 6 a 8.

La incubación de acuerdo con la etapa c) de la invención, puede llevarse a cabo además a una temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 100 °C, preferentemente a una temperatura de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 °C, por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 50 °C. En el medio de reacción, sales inorgánicas, tales como MnCl2 y MgCl2, pueden añadirse, si es necesario.

La incubación de acuerdo con la etapa c) de la invención, puede llevarse a cabo en un biorreactor. El biorreactor es adecuado preferentemente para un modo continuo o un modo discontinuo.

La incubación de acuerdo con la etapa c) de la invención, puede realizarse de forma continua o discontinua. Si se lleva a cabo de manera continua, el método preferentemente proporciona un flujo continuo de compuestos y/o enzimas según sea necesario, preferentemente al proporcionar continuamente los eductos de la reacción a la mezcla de reacción y eliminar continuamente los productos de la mezcla de reacción, mientras se mantiene la concentración de todos los componentes, que incluyen las enzimas a un nivel predeterminado. Las enzimas usadas en un modo continuo pueden añadirse en forma libre o unidas o inmovilizadas a una superficie.

Con respecto a la presente invención, al menos las etapas a) y c) o las etapas b) y c) pueden repetirse con la mezcla obtenida de acuerdo con la etapa c) de acuerdo con una etapa opcional e). Esta mezcla ya se incubó y, por tanto, se procesó con al menos un compuesto como se define en la presente descripción para la etapa a) y al menos una enzima como se define en la presente descripción de acuerdo con la etapa b). Dicho procedimiento por etapas puede permitir dentro de múltiples rondas la diversificación racional de un conjunto definido de eductos a un conjunto limitado de compuestos de una manera controlable. La adición de compuestos específicos como se define de acuerdo con la etapa a) y diferentes proteínas como se define de acuerdo con la etapa b) en un orden predeterminado también puede proporcionar una exclusión racional de componentes específicos. Para obtener tal variedad, los compuestos y/o enzimas pueden añadirse de forma simultánea o secuencial, y preferentemente los compuestos y/o enzimas pueden añadirse simultáneamente en una etapa y/o secuencialmente en diferentes etapas.

Alternativamente, un compuesto o una mezcla de compuestos como se define en la presente descripción para la etapa a) y al menos una enzima como se define en la presente descripción de acuerdo con la etapa b) pueden incubarse en una etapa, preferentemente en donde todos los compuestos se proporcionan simultáneamente. Dicho procedimiento puede preferirse en determinadas circunstancias, ya que puede conducir a la mayor variedad de compuestos diversificados.

Con respecto a la invención, se necesita al menos un ciclo de incubación adicional c) cuando ambos: solo se proporcionan dos compuestos en la etapa a) del primer ciclo, de los que uno es 3'-sialil lactosa, y la enzima que se proporciona en la etapa b ) del primer ciclo es una enzima que comprende una actividad trans-sialidasa. Se repetirán al menos las etapas a) y c) o b) y c), con la mezcla obtenida de acuerdo con la etapa c). Cuando se repiten las etapas a) y c), el al menos un compuesto que se añade de acuerdo con la etapa a) es preferentemente diferente de los que se proporcionan en el primer ciclo; y, cuando se repiten las etapas b) y c), la al menos una enzima que se añade de acuerdo con la etapa b) es preferentemente diferente de la que se proporciona en el primer ciclo. Cuando se repiten todas las etapas a) a c), adecuadamente el al menos un compuesto que se proporciona en la etapa a) o la al menos una enzima proporcionada en la etapa b) son diferentes de los proporcionados en el primer ciclo, y preferentemente ambos son diferentes de los proporcionados en el primer ciclo.

Con respecto a la invención, se necesita al menos un ciclo de incubación adicional c) cuando ambos: solo se proporcionan dos compuestos en la etapa a) del primer ciclo, de los que uno es un derivado de lactosa sialilado de fórmula general 4, y la enzima que se proporciona en la etapa b) del primer ciclo es una enzima que comprende una actividad trans-sialidasa. Se repetirán al menos las etapas a) y c) o b) y c), con la mezcla obtenida de acuerdo con la etapa c). Cuando se repiten las etapas a) y c), el al menos un compuesto que se añade de acuerdo con la etapa a) es preferentemente diferente de los que se proporcionan en el primer ciclo; cuando se repite la etapa b) y c), la al menos una enzima que se añade de acuerdo con la etapa b) es preferentemente diferente de la que se proporciona en el primer ciclo. Cuando se repiten todas las etapas a) a c), adecuadamente el al menos un compuesto que se proporciona en la etapa a) o la al menos una enzima proporcionada en la etapa b) son diferentes de los proporcionados en el primer ciclo, y preferentemente ambos son diferentes de los proporcionados en el primer ciclo.

Con respecto a la invención, preferentemente, se lleva a cabo al menos un ciclo de incubación adicional c) cuando ambos: solo se proporcionan dos compuestos en la etapa a) del primer ciclo, de los que uno es un derivado de lactosa fucosilado de fórmula general 4, y la enzima que se proporciona en la etapa b) del primer ciclo es una enzima que comprende una actividad trans-fucosidasa. Particularmente preferentemente, se repetirán al menos las etapas a) y c) o las etapas b) y c), con la mezcla obtenida de acuerdo con la etapa c). Cuando se repiten las etapas a) y c), el al menos un compuesto que se añade de acuerdo con la etapa a) es preferentemente diferente de los que se proporcionan en el primer ciclo; cuando se repite la etapa b) y c), la al menos una enzima que se añade de acuerdo con la etapa b) es preferentemente diferente de la que se proporciona en el primer ciclo. Cuando se repiten todas las etapas a) a c), adecuadamente el al menos un compuesto que se proporciona en la etapa a) o la al menos una enzima proporcionada en la etapa b) son diferentes de los proporcionados en el primer ciclo, y preferentemente ambos son diferentes de los proporcionados en el primer ciclo.

Además, con respecto a la invención pueden repetirse al menos las etapas a) y c) o las etapas b) y c) con la mezcla obtenida de acuerdo con la etapa c) de acuerdo con una etapa opcional e). Preferentemente, esta mezcla se incuba y, por tanto, se procesa con al menos un compuesto como se define en la presente descripción para la etapa a) y al menos una enzima como se define en la presente descripción de acuerdo con la etapa b). Dicho procedimiento por etapas puede permitir dentro de múltiples rondas la diversificación racional de un conjunto definido de eductos a un conjunto limitado de compuestos de una manera controlable. La adición de compuestos específicos como se define de acuerdo con la etapa a) y diferentes proteínas como se define de acuerdo con la etapa b) en un orden predeterminado también puede proporcionar una exclusión racional de componentes específicos. Para obtener tal variedad, los compuestos y/o enzimas pueden añadirse de forma simultánea o secuencial, con mayor preferencia los compuestos y/o enzimas pueden añadirse simultáneamente en una etapa y/o secuencialmente en diferentes etapas.

Con respecto a la invención, se necesita al menos un ciclo de incubación adicional c) cuando solo se forma un producto (HMO o derivado de HMO o precursor de HMO) después del primer ciclo de incubación. Esto incluye la situación en donde la mezcla obtenida después de la primera etapa de incubación c) comprendía materiales de partida de la primera etapa a) así como también un HMO como producto de la reacción de los materiales de partida con la al menos una enzima. Se repiten al menos las etapas a) y c) o las etapas b) y c) con la mezcla obtenida de acuerdo con la etapa c).

Cuando se repiten las etapas a) y c), el al menos un compuesto añadido de acuerdo con la etapa a) es preferentemente diferente de los proporcionados en el primer ciclo; y cuando se repiten las etapas b) y c), la al menos una enzima añadida de acuerdo con la etapa b) es preferentemente diferente de la proporcionada en el primer ciclo. Cuando se repiten todas las etapas a) a c), adecuadamente el al menos un compuesto que se proporciona en la etapa a) o la al menos una enzima proporcionada en la etapa b) son diferentes de los proporcionados en el primer ciclo, y preferentemente ambos son diferentes de los proporcionados en el primer ciclo.

Una persona experta en la técnica puede explorar y decidir si solo se fabrica un HMO después de la primera etapa de incubación y si se necesita al menos un ciclo de incubación más para lograr el objetivo. En un posible caso, la selección de un donante particular, un aceptor particular y una enzima particular conduce a un solo producto. Cuando se usa más de un donante y/o más de un aceptor y/o más de una enzima para generar los HMO en un ciclo de incubación, generalmente se espera que se forme más de un producto. De manera similar, cuando la enzima transglicosidasa usada tiene menor (regio)selectividad, puede esperarse más producto, incluso si solo se proporciona un aceptor, ya que la enzima es capaz de transferir el resto glicosilo a varias partes del aceptor. Además, de acuerdo con una regla general, la proporción de donante y aceptor puede tener un gran impacto en la diversidad del producto: cuanto mayor sea la proporción donante-aceptor, mayor será la posibilidad de obtener más de un producto en un sistema de un donante-un aceptor. La persona experta tiene el repertorio de métodos de detección y control, tanto cualitativos como cuantitativos (por ejemplo, TLC, HPLC, GC, GC-MS, electroforesis, etc.) para averiguar si se han formado uno o más productos.

Además, con respecto a la invención pueden repetirse al menos las etapas a) y c) o las etapas b) y c) con la mezcla obtenida de acuerdo con la etapa c) de acuerdo con una etapa opcional e). Preferentemente, esta mezcla se incuba y, por tanto, se procesa con al menos un compuesto como se define en la presente descripción para la etapa a) y al menos una enzima como se define en la presente descripción de acuerdo con la etapa b). Dicho procedimiento puede permitir dentro de múltiples rondas la diversificación racional de un conjunto definido de eductos a un conjunto limitado de compuestos de una manera controlable. La adición de compuestos específicos como se define de acuerdo con la etapa a) y diferentes proteínas como se define de acuerdo con la etapa b) en un orden predeterminado también puede proporcionar una exclusión racional de componentes específicos. Para obtener tal variedad, los compuestos y/o enzimas pueden añadirse de forma simultánea o secuencial, con mayor preferencia los compuestos y/o enzimas pueden añadirse simultáneamente en una etapa y/o secuencialmente en diferentes etapas.

El método de la presente invención como se define anteriormente conduce a la diversificación de los compuestos como se proporciona en la etapa a) después de la etapa de incubación c) de cualquier modalidad del primer aspecto, o preferentemente la repetición obligatoria u opcional de las etapas de acuerdo con la etapa d) o e) de cualquier modalidad del primer aspecto. Preferentemente, el método de la presente invención como se describe en la presente descripción da como resultado una mezcla diversificada que comprende dos o más oligosacáridos de la leche humana (HMO), cuyos compuestos individuales pueden definirse de acuerdo con

- los compuestos de fórmula general 3 y sus sales

en donde

R1 es fucosilo o H,

R2 se selecciona de los grupos N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo, en donde el grupo N-acetil-lactosaminilo puede llevar un residuo glicosilo que comprende uno o más grupos N-acetil-lactosaminilo y/o uno o más grupos lacto-N-biosilo; cualquier grupo N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede sustituirse con uno o más residuos sialilo y/o fucosilo,

R3 es H o un grupo N-acetil-lactosaminilo sustituido opcionalmente con un residuo glicosilo que comprende uno o más grupos N-acetil-lactosaminilo y/o uno o más grupos lacto-N-biosilo; cualquier grupo N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede sustituirse con uno o más residuos sialilo y/o fucosilo; y/o

los compuestos de fórmula general 4 y sus sales

en donde

R1 independientemente entre sí es fucosilo o H

R4 independientemente entre sí es sialilo o H,

con la condición de que al menos un R1 o R4 no sea H.

Preferentemente, el método para la diversificación de los oligosacáridos de la leche humana (HMO) de la presente invención da como resultado oligosacáridos de la leche humana como se definió anteriormente, después de la etapa de incubación c) y opcionalmente una repetición de las etapas de acuerdo con la etapa d) o e), en donde los compuestos de fórmulas 3 y 4 se caracterizan además por fórmulas generales 3a, 3b o 4 y sus sales

Fórmula general 3a Fórmula general;3b Fórmula general 4

en donde R1 y R4 son según se definió anteriormente,

R2a es un grupo N-acetil-lactosaminilo sustituido opcionalmente con un residuo glicosilo que comprende un grupo N-acetil-lactosaminilo y/o lacto-N-biosilo; cualquier grupo N-acetil-lactosaminilo y/o lacto-N-biosilo puede sustituirse con uno o más residuos sialilo y/o fucosilo,

R3a es H o un grupo N-acetil-lactosaminilo sustituido opcionalmente con un grupo lacto-N-biosilo; cualquier grupo N-acetil-lactosaminilo y/o lacto-N-biosilo puede sustituirse con uno o más residuos sialilo y/o fucosilo,

R2b es un grupo lacto-N-biosilo sustituido opcionalmente con residuo(s) de sialilo y/o fucosilo,

R3b es H o un grupo N-acetil-lactosaminilo sustituido opcionalmente con uno o dos grupos N-acetil-lactosaminilo y/o un grupo lacto-N-biosilo; cualquier grupo N-acetil-lactosaminilo y/o lacto-N-biosilo puede sustituirse con uno o más residuos sialilo y/o fucosilo.

Particularmente preferentemente, los compuestos obtenidos de acuerdo con el método de la presente invención para la diversificación como se definió anteriormente se caracterizan por sus enlaces y modificaciones. Preferentemente, los compuestos obtenidos por el método de la presente invención, después de la etapa de incubación c) y opcionalmente una repetición de las etapas de acuerdo con la etapa d) o e), y según se definan preferentemente de acuerdo con las fórmulas generales 3a o 3b, se caracterizan porque:

- el grupo N-acetil-lactosaminilo en el residuo glicosilo de R2a en la fórmula general 3a se une a otro grupo N-acetil-lactosaminilo por un enlace interglucosídico 1-3,

- el grupo lacto-N-biosilo en el residuo glicosilo de R2a en la fórmula general 3a se une al grupo N-acetillactosaminilo por un enlace interglucosídico 1-3,

- el grupo lacto-N-biosilo en el residuo glicosilo de R3a en la fórmula general 3a se une al grupo N-acetillactosaminilo por un enlace interglucosídico 1-3,

- el grupo N-acetil-lactosaminilo en el residuo glicosilo de R3b en la fórmula general 3b se une a otro grupo N-acetil-lactosaminilo por un enlace interglucosídico 1-3 o 1-6,

- el grupo lacto-N-biosilo en el residuo glicosilo de R3b en la fórmula general 3b se une al grupo N-acetillactosaminilo mediante un enlace interglucosídico 1-3.

Preferentemente, los compuestos obtenidos por el método de la presente invención, después de la etapa de incubación c) y opcionalmente una repetición de las etapas de acuerdo con la etapa d) o e), caracterizado porque la fórmula general 3a representa lacto-N-neotetraosa, para-lacto-N-hexaosa, para-lacto-N-neohexaosa, lacto-N-neohexaosa, para-lacto-N-octaosa y lacto-N-neooctaosa sustituida opcionalmente con uno o más residuos sialilo y/o fucosilo y la fórmula general 3b representa lacto-N-tetraosa, lacto-N-hexaosa, lacto-N-octaosa, iso-lacto-N-octaosa, lacto-N-decaosa y lacto-N-neodecaosa sustituida opcionalmente con uno o más residuos sialilo y/o fucosilo.

Preferentemente, los compuestos obtenidos por el método de la presente invención, después de la etapa de incubación c) y/o una repetición de las etapas de acuerdo con la etapa d) o e), se caracterizan porque:

- el residuo fucosilo unido al grupo N-acetil-lactosaminilo y/o el grupo lacto-N-biosilo se une a

■ la galactosa del grupo lacto-N-biosilo con un enlace interglucosídico 1-2 y/o

■ la N-acetil-glucosamina del grupo lacto-N-biosilo con un enlace interglucosídico 1-4 y/o

■ la N-acetil-glucosamina del grupo N-acetil-lactosaminilo con un enlace interglucosídico 1-3,

- el residuo sialilo unido al grupo N-acetil-lactosaminilo y/o el grupo lacto-N-biosilo se une a

■ la galactosa del grupo lacto-N-biosilo con un enlace interglucosídico 2-3 y/o

■ la N-acetil-glucosamina del grupo lacto-N-biosilo con un enlace interglucosídico 2-6 y/o

■ la galactosa del grupo N-acetil-lactosaminilo con un enlace interglucosídico 2-6.

De acuerdo con otro aspecto preferido, los compuestos obtenidos de acuerdo con el método de diversificación de la presente invención, preferentemente los compuestos de acuerdo con las subfórmulas generales 3a, 3b o 4 pueden seleccionarse del grupo de: 2'-fucosil lactosa, 3-fucosil lactosa, 2',3-difucosil lactosa, 3'-sialil lactosa, 6'-sialil lactosa, 3'-sialil-3-fucosil lactosa, lacto-N-tetraosa, lacto-N-neotetraosa, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LST-a, LST-b, LST-c, FLST-a, FLST-b, FLST-c, LNDFH-I, LNDFH-II, LNDFH-III, DS-LNT, FDS-LNT I y FDS-LNT II, o sus sales. Las estructuras centrales de estos compuestos se muestran en la Tabla 6 anterior.

Los compuestos obtenidos por el método de la presente invención, después de la etapa de incubación c) y opcionalmente una repetición de las etapas de acuerdo con la etapa d) o e), se obtienen en dependencia de la selección de la al menos una enzima que comprende una actividad transglicosidasa como se describió anteriormente. Dicha enzima puede seleccionarse en dependencia del enlace o modificación deseada que se llevará a cabo durante la diversificación mediante el uso del método de la presente invención.

En la presente descripción pueden usarse fucosidasas de tipo salvaje o modificadas por ingeniería como se define anteriormente son el objetivo de la presente invención, que presentan actividad transfucosidasa y muestran una regioselectividad a,1-2, a,1-3 y/o a,1-4. Dichas fucosidasas de tipo salvaje o modificadas por ingeniería presentan preferentemente actividad transfucosidasa y catalizan la transferencia del residuo de fucosilo a:

- la galactosa del grupo lacto-N-biosilo con enlace interglucosídico a,1-2 y/o

- la N-acetil-glucosamina del grupo lacto-N-biosilo con enlace interglucosídico a,1-4 y/o

- la N-acetil-glucosamina del grupo N-acetil-lactosaminilo con enlace interglucosídico a,1-3;

Dichos enlaces son altamente preferidos en el contexto del método de la presente invención y los compuestos reivindicados en la presente descripción, cuando se usan las fucosidasas de tipo salvaje o modificadas por ingeniería.

Adicionalmente, pueden usarse en la presente descripción sialidasas de tipo salvaje o modificadas por ingeniería como se definió anteriormente, que muestran actividad trans-sialidasa y muestran una regioselectividad a,2-3 y/o a,2-6. Dichos enlaces son preferentemente el objetivo en la presente invención. Dichas sialidasas de tipo salvaje o modificadas por ingeniería presentan preferentemente actividad trans-sialidasa y catalizan la transferencia del residuo sialilo a:

- la galactosa del grupo lacto-N-biosilo con 2-3 enlaces interglucosídicos y/o

- la N-acetil-glucosamina del grupo lacto-N-biosilo con enlace interglucosídico 2-6 y/o

- la galactosa del grupo N-acetil-lactosaminilo con enlace interglucosídico 2-6.

Dichos enlaces son altamente preferidos en el contexto del método de la presente invención y los compuestos reivindicados en la presente descripción, cuando se usan sialidasas de tipo salvaje o modificadas por ingeniería. Además, en la presente descripción pueden usarse las lacto-N-biosidasas de tipo salvaje o modificadas por ingeniería como se definió anteriormente, que muestran actividad trans-lacto-N-biosidasa y muestran una regioselectividad p,1-3. Dichos enlaces son preferentemente el objetivo en la presente invención. Dichas lacto-N-biosidasas de tipo salvaje o modificadas por ingeniería presentan preferentemente actividad trans-lacto-N-biosidasa y catalizan la transferencia del residuo lacto-N-biosilo al grupo N-acetil-lactosaminilo con enlaces interglucosídicos 1-3 que son el objetivo en la presente invención. Dichos enlaces son altamente preferidos en el contexto del método de la presente invención y los compuestos reivindicados en la presente descripción, cuando se usan lacto-N-biosidasas de tipo salvaje o modificadas por ingeniería.

Finalmente, en la presente descripción pueden usarse glicosidasas de tipo salvaje o modificadas por ingeniería como se definió anteriormente son el objetivo de la presente invención, que muestran actividad trans-N-acetillactosaminidasa y una regioselectividad p,1-3 y/o p,1-6. Dichas glicosidasas de tipo salvaje o modificadas por ingeniería presentan preferentemente actividad trans-N-acetil-lactosaminidasa y catalizan la transferencia del residuo N-acetil-lactosaminilo a otro grupo N-acetil-lactosaminilo con enlace interglucosídico 1-3 o 1-6. Dichos enlaces son altamente preferidos en el contexto del método de la presente invención y los compuestos reivindicados en la presente descripción, cuando se usan las N-acetil-lactosaminidasas de tipo salvaje o modificadas por ingeniería.

De acuerdo con otro aspecto específico del método de la presente invención los compuestos obtenidos de acuerdo con el método de la presente invención, preferentemente los compuestos de acuerdo con cualquiera de las fórmulas 1, 2, 3 o 4 o de las subfórmulas generales 1a, 1b o 2 o de las subfórmulas generales 3a, 3b o 4 opcionalmente se someten a una reacción de purificación, preferentemente mediante la cristalización o la precipitación.

De acuerdo con un aspecto específico del método de la presente invención los compuestos obtenidos de acuerdo con el método de la presente invención, preferentemente los compuestos de acuerdo con cualquiera de las fórmulas 1, 2, 3 o 4 o de las subfórmulas generales 1a, 1b o 2 o de las subfórmulas generales 3a, 3b o 4 opcionalmente se secan por pulverización.

De acuerdo con un aspecto muy particular, los compuestos obtenidos de acuerdo con el método de la presente invención pueden ser dos o más HMO de origen natural, preferentemente los compuestos de acuerdo con las fórmulas 3 o 4 o de las subfórmulas generales 3a, 3b o 4. Los HMO de origen natural se enumeran en TADASU URASHIMA y otros, MILK OLIGOSACCHARIDES, Nova Biomedical Books, Nueva York, 2011, ISBN: 978-1-61122-831-1, Tabla 4 en págs. 14-25.

De acuerdo con una modalidad adicional, el método de la presente invención comprende además la adición de los compuestos obtenidos en la etapa de incubación a un producto consumible, preferentemente como se define en la presente descripción. El producto consumible es preferentemente al menos uno de una formulación farmacéutica o nutricional y preferentemente un líquido o un sólido. De acuerdo con otra modalidad, el método puede comprender además la adición de portadores farmacéuticamente aceptables y/o la adición de prebióticos a los compuestos obtenidos en la etapa de incubación.

La presente invención también usa sales de compuestos definidos en la presente descripción. Estas sales pueden seleccionarse preferentemente de las sales de los compuestos de acuerdo con la fórmula general 4 o sus subfórmulas, que contienen al menos un residuo sialilo, en forma de sal: un par iónico asociado que consiste en el residuo de ácido cargado negativamente de oligosacáridos sialilados comprendidos en la fórmula general 4 o sus subfórmulas y uno o más cationes en cualquier proporción estequiométrica. Los cationes, como se usan en el presente contexto, son átomos o moléculas con carga positiva. Los cationes pueden ser inorgánicos u orgánicos. Los cationes inorgánicos preferidos son iones de amonio, de iones de metales alcalinos, metales alcalinotérreos y metales de transición, con mayor preferencia Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Ba2+, Fe2+, Zn2+, Mn2+ y Cu2+, con la máxima preferencia K+, Ca2+, Mg2+, Ba2+, Fe2+ y Zn2+. Los compuestos orgánicos básicos en forma cargada positivamente pueden ser cationes orgánicos relevantes. Dichas contrapartes preferidas cargadas positivamente son dietilamina, trietilamina, diisopropiletilamina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, imidazol, piperidina, piperazina, morfolina, bencilamina, etilendiamina, meglumina, pirrolidina, colina, tris-(hidroximetil)metilamina, N-(2-hidroxietil)-pirrolidina, N-(2-hidroxietil)-piperidina, N-(2-hidroxietil)-piperazina, N-(2-hidroxietil)-morfolina, L-arginina, L-lisina, oligopéptidos que tienen la unidad de L-arginina o L-lisina u oligopéptidos que tienen un grupo amino libre en el W-terminal, etc., todo en la forma protonada. Dichas formaciones de sal pueden usarse para modificar las características de la molécula compleja en su conjunto, tales como la estabilidad, la compatibilidad con excipientes, la solubilidad y la capacidad para formar cristales.

En una modalidad adicional de la invención, una mezcla de HMO, obtenida por el método de la presente invención como se describe en la presente descripción, puede usarse para la preparación de un producto de consumo, preferentemente para la preparación de una composición farmacéutica, una formulación nutricional o un suplemento alimenticio. Tal mezcla de HMO, obtenida mediante el método de la presente invención como se describe en la presente descripción, es particularmente eficaz en la mejora y maduración del sistema inmunológico de los recién nacidos y tiene un efecto preventivo contra las infecciones secundarias que siguen a infecciones virales como la gripe. El uso de una mezcla de HMO, obtenida por el método de la presente invención como se describe en la presente descripción como un prebiótico mejora los efectos beneficiosos y la eficiencia de los probióticos, tales como el Lactobacillus y la Bifidobacteria especies, en la promoción del desarrollo de una microbiota intestinal bifidogénica temprana en los bebés, en la reducción del riesgo de desarrollo o alergia y/o asma en los bebés, en la prevención y el tratamiento de infecciones patógenas como la diarrea en los bebés.

Puede prepararse una composición farmacéutica que comprende una mezcla de HMO, obtenida mediante el método de la presente invención como se describe en la presente descripción, preferentemente que comprenda además un portador farmacéuticamente aceptable. Los "portadores farmacéuticamente aceptables" incluyen, entre otros, aditivos, adyuvantes, excipientes y diluyentes (agua, gelatina, talco, azúcares, almidón, goma arábiga, gomas vegetales, aceites vegetales, polialquilenglicoles, agentes aromatizantes, conservantes, estabilizantes, agentes emulsionantes, lubricantes, colorantes, masillas, agentes humectantes, etc.). Los portadores adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia estándar en el campo. La forma de dosificación para administración incluye, por ejemplo, comprimidos, polvos, gránulos, píldoras, suspensiones, emulsiones, infusiones, cápsulas, inyecciones, líquidos, elixires, extractos y tinturas.

Pueden prepararse formulaciones nutricionales tales como alimentos o bebidas, que comprenden una mezcla de HMO, obtenidas mediante el método de la presente invención como se describe en la presente descripción. La formulación nutricional también puede contener micronutrientes comestibles, vitaminas y minerales. Las cantidades de dicho ingrediente pueden variar en dependencia de si la formulación está destinada a usar con bebés, niños, adultos normales y sanos o sujetos que tienen necesidades especializadas (por ejemplo, que padecen trastornos metabólicos). Los micronutrientes incluyen, por ejemplo, aceites comestibles, grasas o ácidos grasos (como aceite de coco, aceite de soja, monoglicéridos, diglicéridos, oleína de palma, aceite de girasol, aceite de pescado, ácido linoleico, ácido linolénico, etc.), carbohidratos (como glucosa, fructosa, sacarosa, maltodextrina, almidón, almidón de maíz hidrolizado, etc.) y proteínas de caseína, soja, suero de leche o leche descremada, o hidrolizados de estas proteínas, pero también pueden usarse proteínas de otras fuentes (intactas o hidrolizadas). Las vitaminas pueden elegirse del grupo que consiste en vitamina A, B1, B2, B5, B6, B12, C, D, E, H, K, ácido fólico, inositol y ácido nicotínico. La fórmula nutricional puede contener los siguientes minerales y oligoelementos: Ca, P, K, Na, Cl, Mg, Mn, Fe, Cu, Zn, Se, Cr o I.

Una formulación nutricional como se define anteriormente puede contener además uno o más probióticos, por ejemplo, lacto bacterias, especies de Bifidobacteria, prebióticos como fructooligosacáridos y galactooligosacáridos, proteínas de caseína, soja, suero o leche desnatada, carbohidratos como lactosa, sacarosa, maltodextrina, almidón o sus mezclas, lípidos (por ejemplo, oleína de palma, aceite de girasol, aceite de cártamo) y vitaminas y minerales esenciales en la dieta diaria. Los probióticos también se encuentran preferentemente en la formulación nutricional en una cantidad suficiente para lograr el efecto deseado en un individuo, preferentemente en bebés, niños y/o adultos.

La formulación nutricional definida anteriormente es preferentemente una fórmula infantil. En el contexto de la presente invención, el término "fórmula infantil" significa preferentemente un alimento destinado a un uso nutricional particular por parte de los bebés durante los primeros 4-6 meses o incluso de 4 a 12 meses de vida y que satisface por sí mismo los requisitos nutricionales de los bebés. Puede contener uno o más probióticos de especies de Bifidobacteria, prebióticos como fructooligosacáridos y galactooligosacáridos, proteínas de caseína, soja, suero o leche desnatada, carbohidratos como lactosa, sacarosa, maltodextrina, almidón o sus mezclas, lípidos (por ejemplo, oleína de palma, aceite de girasol, aceite de cártamo) y vitaminas y minerales esenciales en la dieta diaria.

Puede prepararse un complemento alimenticio, que contiene preferentemente los ingredientes como se definieron anteriormente para alimentos nutricionales, por ejemplo, una mezcla de HMO, obtenida mediante el método de la presente invención como se describe en la presente descripción, vitaminas, minerales, oligoelementos y otros micronutrientes, etc. El suplemento alimenticio puede estar, por ejemplo, en forma de comprimidos, cápsulas, pastillas o líquido. El suplemento puede contener aditivos convencionales seleccionados entre, pero no se limita a, aglutinantes, recubrimientos, emulsionantes, agentes solubilizantes, agentes encapsulantes, agentes formadores de películas, adsorbentes, portadores, cargas, agentes dispersantes, agentes humectantes, agentes gelificantes, agentes formadores de gel, etc.

El complemento alimenticio es preferentemente un alimento funcional para la salud digestiva, ya que la administración de una mezcla de HMO, obtenida mediante el método de la presente invención como se describe en la presente descripción, proporciona un efecto beneficioso sobre la salud digestiva. Un alimento funcional para la salud digestiva es preferentemente un alimento procesado usado con la intención de mejorar y preservar la salud digestiva mediante el uso de una mezcla de HMO, obtenida mediante el método de la presente invención como se describe en la presente descripción, como ingredientes o componentes fisiológicamente funcionales en forma de tabletas, cápsulas, polvos, etc. También pueden usarse diferentes términos como suplemento dietético, nutracéutico, alimento diseñado o producto para la salud para referirse a un alimento funcional para la salud digestiva.

Una mezcla de HMO, obtenida por el método de la presente invención como se describe en la presente descripción, puede usarse para la preparación de formulaciones nutricionales que incluyen alimentos, bebidas y piensos, preferentemente fórmulas para lactantes, complementos alimenticios y alimentos funcionales para la salud digestiva, preferentemente cualquiera de estos como se describió anteriormente. La formulación nutricional puede prepararse de cualquier forma habitual.

Para ayudar en la comprensión de la presente invención, se describe más abajo la explicación del resultado de los métodos de la invención cuando se aplican a ciertas combinaciones de compuestos y enzimas.

De forma adecuada, el compuesto proporcionado en la etapa a) del método puede ser 2'-fucosil lactosa, y la enzima proporcionada en la etapa b) puede ser una transfucosidasa. Como la 2'-fucosil lactosa puede actuar como donante y aceptor en este sistema, el resultado de la etapa de incubación c) puede ser la producción de difucosil lactosa y lactosa. Como la lactosa no es específicamente un oligosacárido de la leche humana, se considera que el resultado de la etapa c) es la producción de un solo HMO y, por lo tanto, de acuerdo con la invención, una segunda iteración de al menos la etapa a) y la etapa c) o la etapa b) y la etapa c) deben realizarse para llegar a una mezcla de HMO.

De forma adecuada, los compuestos proporcionados en la etapa a) del método pueden ser 3'-sialil lactosa (donante) y 3-fucosil lactosa (aceptor), y la enzima proporcionada en la etapa b) puede ser una trans-sialidasa. El resultado de la etapa de incubación c) puede ser la producción de sialil-fucosil-lactosa y lactosa. Como la lactosa no es específicamente un oligosacárido de la leche humana, se considera que el resultado de la etapa c) es la producción de un solo HMO y, por lo tanto, de acuerdo con la invención, una segunda iteración de al menos la etapa a) y la etapa c) o la etapa b) y la etapa c) deben realizarse para llegar a una mezcla de HMO.

De forma adecuada, los compuestos proporcionados en la etapa a) del método pueden ser 3'-sialil lactosa (donante) y lactosa (aceptor), y la enzima proporcionada en la etapa b) puede ser una trans-sialidasa selectiva 1-6. El resultado de la etapa de incubación c) puede ser la producción de 6-sialil-lactosa y lactosa. Como la lactosa no es específicamente un oligosacárido de la leche humana, se considera que el resultado de la etapa c) es la producción de un solo HMO y, por lo tanto, de acuerdo con la invención, una segunda iteración de al menos la etapa a) y la etapa c) o la etapa b) y la etapa c) deben realizarse para llegar a una mezcla de HMO.

De forma adecuada, los compuestos proporcionados en la etapa a) del método pueden ser 2'-fucosil lactosa (donante) y lactosa (aceptor), y la enzima proporcionada en la etapa b) puede ser una transfucosidasa selectiva 1-3. El resultado de la etapa de incubación c) puede ser la producción de 3-fucosil lactosa y lactosa. Como la lactosa no es específicamente un oligosacárido de la leche humana, se considera que el resultado de la etapa c) es la producción de un solo HMO y, por lo tanto, de acuerdo con la invención, una segunda iteración de al menos la etapa a) y la etapa c) o la etapa b) y la etapa c) deben realizarse para llegar a una mezcla de HMO.

De forma adecuada, los compuestos proporcionados en la etapa a) del método pueden ser 3'-sialil lactosa (donante) y LNT (aceptor), y la enzima proporcionada en la etapa b) puede ser una trans-sialidasa. El resultado de la etapa de incubación c) puede ser la producción de sialil-LNT y lactosa. Como la lactosa no es específicamente un oligosacárido de la leche humana, se considera que el resultado de la etapa c) es la producción de un solo HMO y, por lo tanto, de acuerdo con la invención, una segunda iteración de al menos la etapa a) y la etapa c) o la etapa b) y la etapa c) deben realizarse para llegar a una mezcla de HMO.

De manera adecuada, los compuestos proporcionados en la etapa a) del método pueden ser LNnT (donante y aceptor), y la enzima proporcionada en la etapa b) puede ser una trans-N-acetil-lactosaminidasa. El resultado de la etapa de incubación c) puede ser la producción de para-lacto-N-neohexaosa (pLNnH) o lacto-N-neohexaosa (LNnH) y lactosa. Como la lactosa no es específicamente un oligosacárido de la leche humana, se considera que el resultado de la etapa c) es la producción de un solo HMO y, por lo tanto, de acuerdo con la invención, una segunda iteración de al menos la etapa a) y la etapa c) o la etapa b) y la etapa c) deben realizarse para llegar a una mezcla de HMO.

De forma adecuada, los compuestos proporcionados en la etapa a) del método pueden ser LNnT (donante) y LNT (aceptor), y la enzima proporcionada en la etapa b) puede ser una trans-N-acetil-lactosaminidasa. El resultado de la etapa de incubación c) puede ser la producción de lacto-N-hexaosa (LNH) y lactosa. Como la lactosa no es específicamente un oligosacárido de la leche humana, se considera que el resultado de la etapa c) es la producción de un solo HMO y, por lo tanto, de acuerdo con la invención, una segunda iteración de al menos la etapa a) y la etapa c) o la etapa b) y la etapa c) deben realizarse para llegar a una mezcla de HMO.

De manera adecuada, los compuestos proporcionados en la etapa a) del método pueden ser LNT (donante) y LNnT (aceptor), y la enzima proporcionada en la etapa b) puede ser una trans-lacto-N-biosidasa. El resultado de la etapa de incubación c) puede ser la producción de para-lacto-N-hexaosa (pLNH) y lactosa. Como la lactosa no es específicamente un oligosacárido de la leche humana, se considera que el resultado de la etapa c) es la producción de un solo HMO y, por lo tanto, de acuerdo con la invención, una segunda iteración de al menos la etapa a) y la etapa c) o la etapa b) y la etapa c) deben realizarse para llegar a una mezcla de HMO.

En la presente invención, si no se indica de cualquier otra manera, diferentes características de alternativas y modalidades pueden combinarse entre sí, cuando sea adecuado.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a una modalidad preferida, se apreciará que son posibles diversas modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones.

En esta descripción, a menos que expresamente se indique de cualquier otra manera, la palabra "o" se usa en el sentido de un operador que devuelve un valor verdadero cuando una o ambas de las condiciones indicadas se cumple, opuesto al operador "exclusivo o" que requiere que solo una de las condiciones se cumpla. La palabra "comprende" se usa en el sentido de "que incluye" y no en el sentido de "que consiste de". El no reconocimiento de cualquier documento que se publicó antes en la presente invención debe tomarse como una admisión o una representación de que la enseñanza de la misma era de conocimiento general común en Australia o en cualquier otro lugar en la fecha de la misma.

EXPERIMENTAL

Procedimiento general 1

Procedimiento general para las reacciones de transglicosilación:

Una solución de donante(s) de glicosilo y aceptor(es) de glicosilo (10 mM -1M) apropiados, tales como compuestos de acuerdo con la fórmula general 4, LNT, LNnT se incubaron en tampón de incubación en un intervalo de pH de 5,0 a 9,0 con transglicosidasa recombinante, como a-transfucosidasa, a-trans-sialidasa, P-trans-lacto-N-biosidasa o P-trans-N-acetil-lactosaminidasa. La mezcla de reacción se agitó a una temperatura comprendida entre 15 y 70 °C. Se tomaron muestras en diferentes momentos de la reacción, la reacción se detuvo mediante la adición de solución de NaHCÜ31 M a pH=10 y los productos se analizaron por HPLC, o/y LC-MS, o/y LC/MS-MS. Después de la terminación, la enzima se desnaturalizó y centrifugó. La solución resultante se evaporó bajo presión reducida. Después de la liofilización, el residuo seco se disolvió en agua y los productos se purificaron mediante la cromatografía de biogel (P-2 Biogel, 16x900 mm) con agua o mediante la cromatografía de fase inversa.

Las siguientes enzimas recombinantes usadas y probadas en la reacción de transglicosilación:

La transfucosidasa P25 de Thermotoga marítima (ver la sec. de ident. 1) que contienen las mutaciones G226S Y237H T264AL322P

La transfucosidasa M3 de Thermotoga marítima (ver la sec. de ident. 1) que contienen las mutaciones Y237H Y267F L322P.

La transfucosidasa C2 de Thermotoga marítima (ver la sec. de ident. 1) que contienen las mutaciones T264A Y267F L322P.

La trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi (ver las sec. de ident. 15, 16)

La fucosidasa Blon_2336 de Bifidobacterium longum subsp. Infantis ATCC 15697 (ver la seq. ID 5)

Estas transglicosidasas se produjeron en E. coli como se informa en Üsanjo y otros Biochemistry 46, 1022 (2007), Sela y otros Appl. Environ. Microbiol. 78, 795 (2012), Agustí y otros Glycobiology 14, 659 (2004) y Neubacher y otros Ürg. Biomol. Chem. 3, 1551 (2005). Las transglicosidasas purificadas se almacenaron entre -20 °C y 4 °C.

Procedimiento general 2

Sialilación mediante el uso de 3-SL como donante

Procedimiento general: se incubó una solución de 3-SL y el aceptor de sialilo apropiado en tampón de incubación (0,5 ml, Tris/HCl 100 mM, pH 7,0) con trans-sialidasa recombinante de T. cruzi (45 pl, 90 pg/ml) a 15 °C. Se tomaron muestras después de 3, 6 y 24 horas (50 pl cada una) y se controló la progresión de la reacción en TLC.

Se detectó una conversión media a alta en las siguientes reacciones de sialilación:

donante: 3-SL (75 mM), aceptor: LNT (50 mM), producto: LNT sialilado

donante: 3-SL (75 mM), aceptor: LNnT (50 mM), producto: LNnT sialilado

donante: 3-SL (75 mM), aceptor: 3-FL (25 mM), producto: 3-FL sialilado

Procedimiento general 3

Fucosilación con 2'-FL como donante

Procedimiento general: se incubó una solución de 2'-FL y LNT en tampón de incubación desgasificado (0,5 ml, citratofosfato 50 mM, NaCl 145 mM, pH 5,5) con transfucosidasa (P25 de Thermotoga Maritima, M3 de Thermotoga Maritima) a 60 °C. Se tomó una muestra después de 21 horas y se determinó la conversión mediante HPLC. Resultados: Mutante P25:

2'-FL 500 mM, LNT 500 mM, conversión: LNT fucosilado al 25 % (posición de fucosilación no determinada);

2'-FL 1000 mM, LNT 500 mM, conversión: LNT fucosilado al 31 % (posición de fucosilación no determinada) LNT difucosilado al 4 % (posición de fucosilación no determinada);

Mutante M3:

2'-FL 500 mM, LNT 500 mM, conversión: LNT fucosilado al 36 % (posición de fucosilación no determinada).

Procedimiento general 4

Fucosilación con 2'-FL como donante

Procedimiento general: Se incubó una solución de 2'-FL y el aceptor (10-500 mM, la proporción de donante aceptor es de 5:1 a 1:5) en tampón de incubación desgasificado (1 ml, tampón de citrato/fosfato de sodio 50 mM y NaCl 150 mM) a pH=5,5 con transfucosidasa (P25 de Thermotoga Marítima, M3 de Thermotoga Marítima) a 60 °C durante 24 horas. Se tomaron muestras en diferentes momentos de la reacción, la reacción se detuvo mediante la adición de solución de NaHCO3 1 M a pH = 10 y analizada por TLC y/o HPLC. Después de la terminación, la enzima se desnaturalizó y centrifugó. La solución resultante se evaporó bajo presión reducida. Después de la liofilización, el residuo seco se disolvió en agua y se purificó mediante la cromatografía de biogel (P-2 Biogel, 16x900 mm) con agua o mediante la cromatografía de fase inversa. El producto se identificó mediante el uso de la LC-MS.

Condiciones de LC-MS:

Instrumento: MS en tándem AB Sciex API 2000

Modo de ionización: electropulverización en modo positivo

Tipo de analizador: Q1MS

Modo de inserción de la muestra: HPLC

Columna: Phenomenex HILIC 250 x 4,6 mm

Flujo: isocrático (agua-acetonitrilo 22:78)

Velocidad de flujo: 1 ml/min

Volumen de inyección: 5 pl

Resultados:

aceptor: Galp1-3GlcNAcp1-3Galp1-4Glcp1-0-Bn, producto: Galp1-3GlcNAcp1-3Galp1-4Glcp1-0-Bn monofucosilada, la masa molecular correcta fue confirmada por LC-MS (944 [M+H]+, 961 [M+NH4]+, 966 [M+Na]+),

aceptor: Galp1-4GlcNAcp1-3Galp1-4Glcp1-0-Bn, producto: Galp1-4GlcNAcp1-3Galp1-4Glcp1-0-Bn monofucosilada, la masa molecular correcta fue confirmada por LC-MS (944 [M+H]+, 961 [M+NH4]+, 966 [M+Na]+).

Procedimiento general 5

Fucosilación con 3-FL como donante

Procedimiento general: Se incubó una solución de 3-FL como donante (200 mM) con 2'-FL como aceptor (200 mM) en el tampón de incubación KHPO4 (100 mM) a pH 7,0 con la fucosidasa recombinante Blon_2336 de Bifidobacterium longum subsp. Infantis ATCC 15697. La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante 30 min. La reacción se detuvo mediante la adición de solución de NaHCO31 M a pH=10. Los productos se analizaron por HPLC.

Producto detectado: 2',3-difucosil lactosa (identificado por HPLC en comparación con la muestra estándar de referencia de 2',3-difucosil lactosa)

Ejemplo 1

Sialilación de múltiples aceptores mediante el uso del 3-SL como donante

Protocolo: Se incubó una solución de 3-SL como donante (75 mM) con 3-FL, lacto-N-tetraosa y lacto-N-neotetraosa como aceptores (25 mM cada uno) en el tampón de incubación Tris-HCl (100 mM) a pH 7,0 con trans-sialidasa recombinante de Trypanosoma cruzi. La mezcla de reacción se agitó a una temperatura de 30 °C durante 24 horas. La reacción se detuvo mediante la adición de solución de NaHCO3 1 M a pH=10. Los productos se analizaron por HPLC y LC-MS mediante el uso de estándares de referencia (para SFL, LSTa, LSTd).

Productos detectados: 3'-sialil-3-fucosil lactosa, LSTa: Neu5Aca2-3GalP1-3GlcNAcP1-3GalP1-4Glc, lacto-N-neotetraosa sialilada (LSTd): Neu5Aca2-3Galp1-4GlcNAcp1-3Galp1-4Glc, lacto-N-tetraosa disialilada y/o lacto-N-neotetraosa disialilada, la masa molecular correcta fue confirmada por LC-MS (1290 [M+H]+, 1307 [M+NH4]+, 1328 [M+K]+).

Ejemplo 2

Fucosilación de múltiples aceptores mediante el uso del 3-FL como donante

Protocolo: Se incubó una solución de 3-fucosil lactosa como donante (200 mM) con lacto-N-tetraosa-P-OBn y lacto-N-neotetraosa-P-OBn como aceptores (100 mM cada uno) en tampón de incubación KHPO4 (100 mM) a pH 7,0 con la fucosidasa recombinante Blon_2336 de Bifidobacterium longum subsp. Infantis ATCC 15697. La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante 30 min. Los productos se analizaron por HPLC y LC-MS.

Productos detectados: lacto-N-tetraosa-(P)-OBn fucosilada, lacto-N-neotetraosa-(P)-OBn (P) fucosilada.

Ejemplo 3

Glucosilación de LNT mediante el uso de múltiples donantes y enzimas

Protocolo: En un primer ciclo, se incubó una solución de 3'-sialil lactosa como donante (100 mM) con lacto-N-tetraosa como aceptor (200 mM) en el tampón de incubación KHPO4 (100 mM) a pH 7,0 con la trans-sialidasa recombinante de Trypanosoma cruzi. La mezcla de reacción se agitó a una temperatura de 30 °C durante 24 horas.

En un segundo ciclo, la mezcla de reacción resultante se incubó durante 24 horas adicionales a 30 °C después de añadir 200 mM de 2'-fucosil lactosa y la transfucosidasa M3 recombinante de Thermotoga maritima.

En un tercer ciclo, la mezcla de reacción resultante se incubó durante 30 minutos adicionales a 30 °C después de añadir 100 mM de 3-fucosil lactosa y la fucosidasa recombinante Blon_2336 de Bifidobacterium longum subsp. Infantis ATCC 15697. La reacción se detuvo mediante la adición de solución de NaHCO3 1 M a pH=10 y los productos se analizaron por HPLC, LC-MS y LC-MS-MS.

Condiciones de LC-MS:

Instrumento: MS en tándem AB Sciex API 2000

Modo de ionización: electropulverización en modo positivo

Tipo de analizador: Q1MS

Modo de inserción de la muestra: HPLC

Columna: TSK Gel amida 80 (Tosoh, 3 |jm, 150x4,6 mm)

Eluyente: Tampón de formiato de amonio 10 mM pH=6 - acetonitrilo: 30 %/70 %

Velocidad de flujo: 1 ml/min

Volumen de inyección: 5 j l

Resultados:

Ejemplo 4

Glucosilación de LNnT mediante el uso de múltiples donantes y enzimas

Protocolo: En un primer ciclo, se incubó una solución de 3'-sialil lactosa como donante (100 mM) y lacto-N-neotetraosa como aceptor (200 mM) en tampón de incubación KHPO4 (100 mM) a pH 7,0 con la trans-sialidasa recombinante de Trypanosoma cruzi. La mezcla de reacción se agitó a una temperatura de 30 °C durante 24 horas.

En un segundo ciclo, la mezcla de reacción resultante se incubó durante 24 horas adicionales después de añadir 200 mM de 2'-fucosil lactosa y la transfucosidasa recombinante M3 de Thermotoga maritima.

En un tercer ciclo, la mezcla de reacción resultante se incubó durante 30 minutos adicionales después de añadir 100 mM de 3-fucosil lactosa y la fucosidasa recombinante Blon_2336 de Bifidobacterium, longum subsp. Infantis ATCC 15697. La reacción se detuvo mediante la adición de solución de NaHCO31 M a pH=10 y los productos se analizaron por HPLC y LC-MS.

Resultados (condición de HPLC: ver el Ejemplo 8):

Procedimiento general 6

Fucosilación con 3-FL como donante

Procedimiento general: Se incubó una solución de 3-FL como donante (200 mM) con LNT como aceptor (200 mM) en el tampón de incubación KHPO4 (100 mM) a pH 7,0 con la fucosidasa recombinante Blon_2336 de Bifidobacterium longum subsp. Infantis ATCC 15697. La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante 30 min. La reacción se detuvo mediante la adición de solución de NaHCO31 M a pH=10. Los productos se analizaron por HPLC.

Producto detectado: LNT fucosilado (condición de HPLC: ver el Ejemplo 8)

Procedimiento general 7

Fucosilación con 3-FL como donante

Procedimiento general: Se incubó una solución de 3-FL como donante (200 mM) con LNnT como aceptor (200 mM) en tampón de incubación KHPO4 (100 mM) a pH 7,0 con la fucosidasa recombinante Blon_2336 de Bifidobacterium longum subsp. Infantis ATCC 15697. La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante 30 min. La reacción se detuvo mediante la adición de solución de NaHCO31 M a pH=10. Los productos se analizaron por HPLC.

Producto detectado: LNnT fucosilado (condición de HPLC: ver Ejemplo 8)

Claims

REIVINDICACIONES

Un método de preparación de una mezcla diversificada que comprende dos o más oligosacáridos de la leche humana (HMO), el método comprende las etapas de

a) proporcionar al menos un compuesto o una mezcla de los compuestos seleccionados del grupo que consiste en:

- derivados de lactosa opcionalmente sialilados y/o fucosilados de fórmula general 4 y sus sales:

en donde

R1 independientemente entre sí es fucosilo o H

R4 independientemente entre sí es sialilo o H,

siempre y cuando el compuesto de fórmula general 4 no sea lactosa, si se proporciona sola;

- lacto-N-tetraosa (LNT):

- lacto-N-neotetraosa (LNnT):

b) añadir al menos una enzima que comprende una actividad transglicosidasa a al menos un compuesto o una mezcla de compuestos proporcionados de acuerdo con la etapa a);

c) incubar la mezcla obtenida de acuerdo con la etapa b);

d) en donde:

i. donde ambos: solo se proporcionan dos compuestos en la etapa a) de los cuales uno es 3'-sialil lactosa o un derivado de lactosa sialilado de fórmula general 4, y la enzima que comprende una actividad transglicosidasa añadida en la etapa b) es una enzima que comprende una actividad trans-sialidasa, se repiten al menos las etapas a) y c) o las etapas b) y c);

ii. cuando solo se elabora un HMO como resultado de la etapa c), se repiten al menos las etapas a) y c) o las etapas b) y c);

e) opcionalmente repetir al menos las etapas a) y c) o las etapas b) y c) con la mezcla obtenida de acuerdo con la etapa c) o d);

en donde la al menos una enzima que comprende actividad transglicosidasa es una enzima que comprende una actividad trans-fucosidasa, trans-sialidasa, trans-lacto-N-biosidasa y/o trans-N-acetil-lactosaminidasa.

El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la mezcla de compuestos comprende al menos dos, tres, cuatro, cinco, uno a cinco, tres a diez, cinco a diez o incluso más compuestos diferentes como se define de acuerdo con la etapa a), y/o donde la al menos una enzima que comprende actividad transglicosidasa se selecciona de dos, tres, cuatro, cinco, dos a cinco, dos a diez, cinco a diez o incluso más enzimas diferentes que comprenden actividad transglicosidasa, y/o en donde los compuestos o enzimas se añaden simultánea o secuencialmente.

El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la al menos una enzima que comprende actividad transglicosidasa es una enzima que comprende una actividad a-trans-fucosidasa, a-transsialidasa, p-trans-lacto-N-biosidasa y/o p-trans-N-acetil-lactosaminidasa.

El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la incubación conduce a una mezcla de oligosacáridos de la leche humana como se define de acuerdo con

- compuestos de fórmula general 3 y sus sales

en donde

Ri es fucosilo o H,

R2 se selecciona de los grupos N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo, en donde el grupo N-acetil-lactosaminilo puede llevar un residuo glicosilo que comprende uno o más grupos N-acetil-lactosaminilo y/o uno o más grupos lacto-N-biosilo; cualquier grupo N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede sustituirse con uno o más residuos sialilo y/o fucosilo,

R3 es H o un grupo N-acetil-lactosaminilo sustituido opcionalmente con un residuo glicosilo que comprende uno o más grupos N-acetil-lactosaminilo y/o uno o más grupos lacto-N-biosilo; cualquier grupo N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede sustituirse con uno o más residuos sialilo y/o fucosilo; y/o

- compuestos de fórmula general 4 y sus sales

en donde

R1 independientemente entre sí es fucosilo o H

R4 independientemente entre sí es sialilo o H

con la condición de que al menos un R1 o R4 no sea H.

El método de acuerdo con la reivindicación 4,

en donde los compuestos de fórmulas 3 y 4 se caracterizan además por las fórmulas generales 3a, 3b o 4 o sus sales

en donde

R1 y R4 son como se definieron en la reivindicación 4,

R2a es el grupo N-acetil-lactosaminilo sustituido opcionalmente con un residuo glicosilo que comprende un grupo N-acetil-lactosaminilo y/o lacto-N-biosilo; cualquier grupo N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede sustituirse con uno o más residuos sialilo y/o fucosilo,

R3a es H o un grupo N-acetil-lactosaminilo sustituido opcionalmente con un grupo lacto-N-biosilo; cualquier grupo N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede sustituirse con uno o más residuos sialilo y/o fucosilo, R2b es un grupo lacto-N-biosilo sustituido opcionalmente con un residuo sialilo y/o fucosilo,

R3b es H o un grupo N-acetil-lactosaminilo sustituido opcionalmente con uno o dos N-acetil-lactosaminilo y/o un grupo lacto-N-biosilo; cualquier grupo N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede sustituirse con uno o más residuos sialilo y/o fucosilo,

preferentemente en donde

- el grupo N-acetil-lactosaminilo en el residuo glicosilo de R2a en la fórmula general 3a se une a otro grupo N-acetil-lactosaminilo con enlace interglucosídico 1-3,

- el grupo lacto-N-biosilo en el residuo glicosilo de R2a en la fórmula general 3a se une al grupo N-acetillactosaminilo con enlace interglucosídico 1-3,

- el grupo lacto-N-biosilo en el residuo glicosilo de R3a en la fórmula general 3a se une al grupo N-acetillactosaminilo con enlace interglucosídico 1-3,

- el grupo N-acetil-lactosaminilo en el residuo glicosilo de R3b en la fórmula general 3b se une a otro grupo N-acetil-lactosaminilo con enlace interglucosídico 1-3 o 1-6,

- el grupo lacto-N-biosilo en el residuo glicosilo de R3b en la fórmula general 3b se une al grupo N-acetillactosaminilo con enlace interglucosídico 1-3,

con mayor preferencia en donde la fórmula general 3a representa lacto-N-neotetraosa, para-lacto-N-hexaosa, para-lacto-N-neohexaosa, lacto-N-neohexaosa, para-lacto-N-octaosa y lacto-N-neooctaosa sustituida opcionalmente con uno o más residuos sialilo y/o fucosilo y la fórmula general 3b representa lacto-N-tetraosa, lacto-N-hexaosa, lacto-N-octaosa, iso-lacto-N-octaosa, lacto-N-decaosa y lacto-N-neodecaosa sustituida opcionalmente con uno o más residuos sialilo y/o fucosilo.

El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, en donde

- el residuo fucosilo unido al grupo N-acetil-lactosaminilo y/o al grupo lacto-N-biosilo se une a

■ la galactosa del grupo lacto-N-biosilo con enlace interglucosídico 1-2 y/o

■ la N-acetil-glucosamina del grupo lacto-N-biosilo con enlace interglucosídico 1-4 y/o

■ la N-acetil-glucosamina del grupo N-acetil-lactosaminilo con enlace interglucosídico 1-3,

- el residuo sialilo unido al grupo N-acetil-lactosaminilo y/o el grupo lacto-N-biosilo se une a

■ la galactosa del grupo lacto-N-biosilo con enlace interglucosídico 2-3 y/o

■ la N-acetil-glucosamina del grupo lacto-N-biosilo con enlace interglucosídico 2-6 y/o

■ la galactosa del grupo N-acetil-lactosaminilo con enlace interglucosídico 2-6.

El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde los compuestos se seleccionan del grupo que consiste en: 2'-fucosil lactosa, 3-fucosil lactosa, 2',3-difucosil lactosa, 3'-sialil lactosa, 6'-sialil lactosa, 3'-sialil-3-fucosil lactosa, lacto-N-tetraosa, lacto-N-neotetraosa, LNFP-I, LNFP-II, LNFP-III, LNFP-V, LST-a, LST-b, LST-c, FLST-a, FLST-b, FLST-c, LNDFH-I, LNDFH-II, LNDFH-III, DS-LNT, FDS-LNT I y FDS-LNT II, y sus sales.

El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa a) comprende

proporcionar al menos un compuesto o una mezcla de los compuestos caracterizados por la formula general 5

R' es independientemente fucosilo o H, con la condición de que al menos un R' sea fucosilo

R* es H; y

proporcionar opcionalmente al menos un compuesto o una mezcla de los compuestos, seleccionados del grupo que consiste en:

- opcionalmente derivados de lactosa sialilados de fórmula general 6 y sus sales:

en donde

R* es H,

R" independientemente entre sí es sialilo o H,

- lacto-N-tetraosa (LNT):

- lacto-N-neotetraosa (LNnT):

preferentemente en donde la etapa a) comprende proporcionar 2'-fucosil lactosa o 3-fucosil lactosa, y un compuesto adicional seleccionado del grupo que consiste en 2'-fucosil lactosa, 3-fucosil lactosa, 3'-sialil lactosa, 6'-sialil lactosa, LNT y LNnT;

y en donde en la etapa b) se añade al menos una enzima que comprende una actividad transfucosidasa a al menos un compuesto o mezcla de compuestos proporcionados de acuerdo con la etapa a).

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la incubación conduce a una mezcla fucosilada de oligosacáridos de la leche humana, particularmente a una mezcla de 2',3-difucosil lactosa, 3-fucosil-3-sialil lactosa, LNT fucosilada o LNnT fucosilada.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde los compuestos obtenidos en la etapa de incubación se purifican subsecuentemente, preferentemente mediante la cristalización o la precipitación.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además la etapa de secar por pulverización los compuestos obtenidos en la etapa c), d) o e).

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además la adición de los compuestos obtenidos en la etapa de incubación a un producto consumible, en donde el producto consumible es preferentemente al menos uno de una formulación farmacéutica o nutricional.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende además la adición de portadores farmacéuticamente aceptables y/o la adición de prebióticos a los compuestos obtenidos en la etapa de incubación.