CN103562214B9 - 人乳寡糖(hmo)或其前体的多样化 - Google Patents

人乳寡糖(hmo)或其前体的多样化 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种使人乳寡糖(HMO)或其前体多样化的方法、可以用该方法获得的化合物以及涉及此类化合物的应用和组合物。所述方法包括以下步骤：a)提供选自由以下物质组成的组的至少一种化合物或化合物混合物：通式2的可选地唾液酸化和/或岩藻糖基化的乳糖衍生物及其盐(2)，其中，R是能够氢解除去的基团，R1各自独立地为岩藻糖基或H，R4各自独立地为唾液酸基或H，前提是，如果仅提供一种化合物，通式2的化合物不是乳糖的R-糖苷；通式4的可选地唾液酸化和/或岩藻糖基化的乳糖衍生物及其盐(4)，其中，R1各自独立地为岩藻糖基或H，R4各自独立地为唾液酸基或H，前提是，如果仅提供一种化合物，通式4的化合物不是乳糖；乳-N-四糖(LNT)(I)；下式的乳-N-四糖(LNT)衍生物(II)，其中，R是能够氢解除去的基团；乳-N-新四糖(LNnT)(III)；下式的乳-N-新四糖(LNnT)衍生物(IV)，其中，R是能够氢解除去的基团；b)向按照步骤a)提供的所述至少一种化合物或化合物混合物中添加至少一种具有转糖苷酶活性的酶；和c)温育按照步骤b)得到的混合物。

Description

人乳寡糖(HMO)或其前体的多样化
技术领域
本发明涉及一种使人乳寡糖(HMO)或其前体多样化的方法，并涉及适合用于本发明的方法或可用本发明的方法获得的化合物。本发明还描述了用本发明的方法获得的化合物的应用以及包含这些化合物的产品。
背景技术
在过去几年，人乳寡糖(HMO)一直是一个备受关注的主题。特别而言，为合成这些复合碳水化合物(包括分泌的寡糖)而做出的商业化努力已显著增多，这归因于其在人体器官中所发生的多种生物学过程中的作用。此类复合寡糖的一种主要天然人体来源是哺乳动物的乳汁。哺乳动物乳汁包含至多10%的碳水化合物，其中的二糖，即乳糖(Gal(β1-4)Glc)，通常是主要成分。乳汁和初乳还包含较少量的被称作乳寡糖的其他糖类，几乎所有这些糖在其还原末端都具有半乳糖单元，而GlcNAc、Gal、Fuc和/或Neu5Ac或Neu5Gc残基可以与该半乳糖单元连接(Messer和Urashima,2002,TrendsGlycosci.Glycotech,14,153-176；Urashima等,Advanced Dairy Chemistry,第3卷:Lactose,Water,Salts and Minor Constituents,2009,第295-349页)。
迄今为止，已确定了至少115种人乳寡糖的结构，而质谱(MS)数据显示，在人乳或初乳中存在差不多130种寡糖(Newburg和Neubauer,1995,Carohydrates in milks:Analysis,quantities and significance.In:Handbook of Milk Composition(R.G.Jensen编),273-249页,Academic Press,San Diego,美国)。此外，基质辅助型激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)分析表明，人乳中还存在由超过50种单糖残基(如尺寸排阻色谱所示)构成的多糖。因此，认为在人乳中大概存在远多于130种不同的糖(另见Urashima等,Advanced Dairy Chemistry,第3卷:Lactose,Water,Salts and MinorConstituents,2009,295-349页；TADASU URASHIMA等,MILKOLIGOSACCHARIDES,Nova Biomedical Books,New York,2011,ISBN:978-1-61122-831-1)。
根据其核心结构，到现在为止结构已确定的115种人乳寡糖可以归为13个系列。
这13种核心结构例示于下表1中：
表1：人乳寡糖(HMO)的13种不同的核心结构
Urashima等发现(另见Urashima等,Advanced Dairy Chemistry,第3卷:Lactose,Water,Salts and Minor Constituents,2009,295-349页；TADASU URASHIMA等,MILKOLIGOSACCHARIDES,Nova Biomedical Books,New York,2011,ISBN:978-1-61122-831-1)，寡糖的多种变化形式是通过将Neu5Acβ2-3/2-6残基添加到Gal或GlcNAc以及将Fucα1-2/1-3/1-4添加到Gal、GlcNAc或核心单元的还原性Glc上来构建的。人乳寡糖的主要结构特征是存在含I型单元(Gal(β1-3)GlcNAc)的寡糖和含II型单元(Gal(β1-4)GlcNAc)的寡糖，并且含I型单元的寡糖相对于含II型单元的寡糖占据主导地位。到目前为止研究过的其他物种的乳寡糖几乎都展示出II型，但无I型单元。
但是，人乳和初乳中的寡糖的极大多样性及其与其他物种的差别使得难以制备食品中的适合的替换物，尤其是在显示出整个人乳寡糖谱的至少一部分的婴儿食品配方中。此外，其在免疫系统成熟化中的公认重要性及其作为免疫调节剂的预后用途凸显了其作为可能的免疫调节剂的重要性。
因此，在本领域中亟需制备尽可能地模仿甚至重现人乳中的复合寡糖多样性的复合寡糖及其混合物。
在此方面已进行了许多尝试来通过有机化学合成以及酶促手段(由于其立体选择性)产生单独的HMO。在过去20年间，对酶促手段的探索越来越多。
值得注意的是，在生物系统中，Leloir型糖基转移酶(GT,EC2.4.1.-)和糖苷酶(亦称为糖苷水解酶：GH,EC3.2.1.-)构成了碳水化合物加工酶的两个主要类别，它们可以用于产生HMO。这两类酶的作用都是将糖基从供体转移到受体，结果是产生寡糖。但是，糖基转移酶在工业规模的合成中的应用因所需的酶的表达和溶解性问题而受到所需的酶的可获得性的限制，并且还受到活化的供体糖的高成本的限制。这些核苷酸供体通常可以原位产生，但该过程需要额外的酶(参见S等，Trends Biochem Sci,2004.29(12):656-63页)。与糖基转移酶不同的是，糖苷酶的供体底物的范围较广，其通常采用单糖、寡糖和/或经改造的底物(即携带有多种官能团的底物)。其通常对多种碳水化合物和非碳水化合物受体显示出活性。与糖基转移酶相比，使用糖苷酶的另一优势是其稳健性和可及性。
在体内，糖苷酶通常催化糖苷键的水解，同时保留或反转产物中的立体化学构型。在体外，其能够通过转糖基作用或通过逆水解作用(即，缩合)来催化新糖苷键的形成。在受到动力学控制的反应中，这些酶(通常为保留型糖苷酶)可以用来形成糖苷键，其中利用了由良好的端基异构离去基团(例如，硝基苯基糖苷)活化的糖基供体。相比之下，受到热力学控制的逆水解作用则使用高浓度的游离糖。然而，即使糖苷酶在合成方向上的适当应用备受关注，其仍具有挑战性，这是因为必须发现最适条件和适合的底物来将反应驱向所需的方向并避免产物的水解。
最近开发出了解决这一瓶颈并使糖苷酶更适合用于寡糖合成的另一种方法：其使用经修饰的酶(变体)。因此，在过去的20年中已证明，以合理技术或组合技术为基础的蛋白质工程在产生具有提高的转糖基活性和效率的生物催化剂时极其强大。
然而，即使已公开了基础人乳寡糖结构或其前体的多种有机化学合成或酶法合成(例如，采用转唾液酸酶和3'-SL的一些个别的经唾液酸化的HMO或HMO苄基/具有取代基的苄基糖苷的合成，参见WO93/18787和WO2012/007588)，此类合成方法仍不能制备天然存在的寡糖极其衍生物的复合混合物。此外，基于为单个HMO单独设计的合成方法来制备此类混合物时成本较高，并且不会模仿天然存在的HMO的巨大多样性。
因此，本发明的一个目的是提供一种方法，该方法可以产生比现有技术的方法更大的人乳寡糖多样性，并且优选以具有成本效益的方式、更优选以工业规模来产生。
此外，希望的是，以立体选择性方式并以适于大规模生产寡糖的具有成本效益的方式来提供具有4～12个糖单元(例如6～10个糖单元)的寡糖和寡糖混合物。
附图说明
以下附图意在进一步阐明本发明。这些附图并不试图用来限制本发明的主题。
图1：绘出了人乳寡糖(HMO)的目前已知的13种核心结构。
图2：绘出了HMO的示例性合成，其中使用了乳糖、N-乙酰基氨基乳糖基供体和乳-N-二糖基供体，以及β-1,3-转乳-N-二糖苷酶、β-1,3-转N-乙酰基氨基乳糖苷酶和β-1,6-转N-乙酰基氨基乳糖苷酶等酶。
具体实施方式
根据第一方面，本发明提供了一种使人乳寡糖(HMO)或其前体多样化的方法，即，制备一种或多种人乳寡糖(HMO)或其衍生物或前体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供选自由以下物质组成的组的至少一种化合物或化合物混合物：
-通式2的可选地唾液酸化和/或岩藻糖基化的乳糖衍生物及其盐：
其中，
R是能够被氢解除去的基团，
R1各自独立地为岩藻糖基或H，
R4各自独立地为唾液酸基或H，
前提是，如果仅提供一种化合物，通式2的化合物不是乳糖的R-糖苷；
-通式4的可选地唾液酸化和/或岩藻糖基化的乳糖衍生物及其盐：
其中，
R1各自独立地为岩藻糖基或H，
R4各自独立地为唾液酸基或H，
前提是，如果仅提供一种化合物，通式4的化合物不是乳糖；
-乳-N-四糖(LNT)：
-下式的乳-N-四糖(LNT)衍生物：
其中，R是能够被氢解除去的基团；
-乳-N-新四糖(LNnT)：
-下式的乳-N-新四糖(LNnT)衍生物：
其中，R是能够被氢解除去的基团；
b)向按照步骤a)提供的所述至少一种化合物或化合物混合物中添加至少一种具有转糖苷酶活性的酶；
c)温育按照步骤b)得到的混合物；
d)可选地对按照步骤c)获得的混合物重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)；
e)可选地使在步骤c)或d)后得到的经温育的混合物进行氢解反应。
优选的是，在式2的化合物中，R1或R4中的至少一个不是H。
同样优选的是，在式4的化合物中，R1或R4中的至少一个不是H。
根据第一方面的优选实施方式，本发明提供了一种使人乳寡糖(HMO)或其前体多样化的方法，即，制备一种或多种人乳寡糖(HMO)或其衍生物或前体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供选自由以下物质组成的组的至少一种化合物或化合物混合物：
-通式2的可选地唾液酸化和/或岩藻糖基化的乳糖衍生物及其盐：
其中，
R是能够被氢解除去的基团，
R1各自独立地为岩藻糖基或H，
R4各自独立地为唾液酸基或H，
前提是，如果仅提供一种化合物，通式2的化合物不是乳糖的R-糖苷；
-通式4的可选地唾液酸化和/或岩藻糖基化的乳糖衍生物及其盐：
其中，
R1各自独立地为岩藻糖基或H，
R4各自独立地为唾液酸基或H，
前提是，如果仅提供一种化合物，通式4的化合物不是乳糖；
-乳-N-四糖(LNT)：
-下式的乳-N-四糖(LNT)衍生物：
其中，R是能够被氢解除去的基团；
-乳-N-新四糖(LNnT)：
-下式的乳-N-新四糖(LNnT)衍生物：
其中，R是能够氢解除去的基团；
b)向按照步骤a)提供的所述至少一种化合物或化合物混合物中添加至少一种具有转糖苷酶活性的酶；
c)温育按照步骤b)得到的混合物；
d)其中，在步骤a)仅提供了两种化合物且其中一种是3'-唾液酸基乳糖并且在步骤b)中添加的所述具有转糖苷酶活性的酶是具有转唾液酸酶活性的酶时，重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)；
e)可选地对按照步骤c)或d)获得的混合物重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)；
f)可选地使在步骤c)、d)或e)后得到的混合物进行氢解反应。
优选的是，在式2的化合物中，R1或R4中的至少一个不是H。
同样优选的是，在式4的化合物中，R1或R4中的至少一个不是H。
根据上述优选实施方式，在步骤a)仅提供了两种化合物且其中一种是3'-唾液酸基乳糖并且在步骤b)中提供的酶是具有转唾液酸酶活性的酶时，还需要至少一个额外温育循环。在重复进行步骤a)时，按照步骤a)所添加的至少一种化合物优选与在第一次循环中提供的化合物不同；在重复进行步骤b)时，按照步骤b)所添加的至少一种酶优选与在第一次循环中提供的酶不同。由此，在一种能够大规模实施的简单过程中，实现了寡糖混合物的制备。此外，可以简单地以大规模实现包含唾液酸基部分的更长链的寡糖或其混合物(例如包含4～12个糖单元或6～10个糖单元的寡糖)的制备。
在某些情况下，上述优选实施方式涉及一种使人乳寡糖(HMO)或其前体多样化的方法，即，制备一种或多种人乳寡糖(HMO)或其衍生物或前体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供选自由以下物质组成的组的至少一种化合物或化合物混合物：
-通式2的可选地唾液酸化和/或岩藻糖基化的乳糖衍生物及其盐：
其中，
R是能够被氢解除去的基团，
R1各自独立地为岩藻糖基或H，
R4各自独立地为唾液酸基或H，
前提是，如果仅提供一种化合物，通式2的化合物不是乳糖的R-糖苷；
-通式4的可选地唾液酸化和/或岩藻糖基化的乳糖衍生物及其盐：
其中，
R1各自独立地为岩藻糖基或H，
R4各自独立地为唾液酸基或H，
前提是，如果仅提供一种化合物，通式4的化合物不是乳糖；
-乳-N-四糖(LNT)：
-下式的乳-N-四糖(LNT)衍生物：
其中，R是能够被氢解除去的基团；
-乳-N-新四糖(LNnT)：
-下式的乳-N-新四糖(LNnT)衍生物：
其中，R是能够被氢解除去的基团；
b)向按照步骤a)提供的所述至少一种化合物或化合物混合物中添加至少一种具有转糖苷酶活性的酶；
c)温育按照步骤b)得到的混合物；
d)其中，在步骤a)仅提供了两种化合物且其中一种是通式2或4的唾液酸化的乳糖衍生物并且在步骤b)中添加的所述具有转糖苷酶活性的酶是具有转唾液酸酶活性的酶时，重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)；
e)可选地对按照步骤c)或d)获得的混合物重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)；
f)可选地使在步骤c)、d)或e)后得到的混合物进行氢解反应。
优选的是，在式2的化合物中，R1或R4中的至少一个不是H。
同样优选的是，在式4的化合物中，R1或R4中的至少一个不是H。
根据上述优选实施方式，在步骤a)仅提供了两种化合物且其中一种是通式2或4的唾液酸化的乳糖衍生物并且在步骤b)中提供的酶是具有转唾液酸酶活性的酶时，还需要至少一个额外的温育循环。在重复进行步骤a)时，按照步骤a)所添加的至少一种化合物优选与在第一次循环中提供的化合物不同；在重复进行步骤b)时，按照步骤b)所添加的至少一种酶优选与在第一次循环中提供的酶不同。由此，在一种能够大规模实施的简单过程中，实现了寡糖混合物的制备。此外，可以简单地以大规模实现包含唾液酸基部分的更长链的寡糖或其混合物(例如包含4～12个糖单元或6～10个糖单元的寡糖)的制备。
在某些情况下，上述优选实施方式涉及一种使岩藻糖基化的人乳寡糖(HMO)或其前体多样化的方法，即，制备一种或多种岩藻糖基化的人乳寡糖(HMO)或其衍生物或前体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供以通式5为特征的至少一种化合物或化合物混合物：
R'独立地为岩藻糖基或H，前提是至少一个R'是岩藻糖基；R*是能够被氢解除去的基团或H，并且
可选地提供选自由以下物质组成的组的至少一种化合物或化合物混合物：
-通式6的可选地唾液酸化的乳糖衍生物及其盐：
其中，
R*是能够被氢解除去的基团或H，
R''各自独立地为唾液酸基或H，
-乳-N-四糖(LNT)：
-下式的乳-N-四糖(LNT)衍生物：
其中，R是能够被氢解除去的基团；
-乳-N-新四糖(LNnT)：
-下式的乳-N-新四糖(LNnT)衍生物：
其中，R是能够被氢解除去的基团；
b)向按照步骤a)提供的所述至少一种化合物或化合物混合物中添加至少一种具有转岩藻糖苷酶活性的酶；
c)温育按照步骤b)得到的混合物；
f)可选地使在步骤d)后得到的混合物进行氢解反应。
根据上述优选实施方式，在一种能够大规模实施的简单过程中，实现了单一岩藻糖基化人乳寡糖(HMO)或其衍生物或前体的制备或者多种岩藻糖基化人乳寡糖(HMO)或其衍生物或前体的混合物的制备。特别优选的是，在步骤a)中提供2'-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖，并且还另外提供一种选自由2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、3'-唾液酸基乳糖、6'-唾液酸基乳糖、LNT和LNnT组成的组的化合物。
上述优选方法形成一种或多种岩藻糖基化的人乳寡糖(HMO)或其衍生物或前体，优选形成一种岩藻糖基化的人乳寡糖(HMO)或其衍生物或前体，更优选形成一种岩藻糖基化的人乳寡糖，特别是形成2',3-二岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基-3-唾液酸基乳糖、岩藻糖基化LNT或岩藻糖基化LNnT。
在某些情况下，上述优选实施方式涉及一种使人乳寡糖(HMO)或其前体多样化的方法，即，制备一种或多种人乳寡糖(HMO)或其衍生物或前体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供选自包含以下物质的组的至少一种化合物或化合物混合物：
-通式2的可选地唾液酸化和/或岩藻糖基化的乳糖衍生物及其盐：
其中，
R是能够被氢解除去的基团，
R1各自独立地为岩藻糖基或H，
R4各自独立地为唾液酸基或H，
前提是，如果仅提供一种化合物，通式2的化合物不是乳糖的R-糖苷；
-通式4的可选地唾液酸化和/或岩藻糖基化的乳糖衍生物及其盐：
其中，
R1各自独立地为岩藻糖基或H，
R4各自独立地为唾液酸基或H，
前提是，如果仅提供一种化合物，通式4的化合物不是乳糖；
-乳-N-四糖(LNT)：
-下式的乳-N-四糖(LNT)衍生物：
其中，R是能够被氢解除去的基团；
-乳-N-新四糖(LNnT)：
-下式的乳-N-新四糖(LNnT)衍生物：
其中，R是能够被氢解除去的基团；
b)向按照步骤a)提供的所述至少一种化合物或化合物混合物中添加至少一种具有转糖苷酶活性的酶；
c)温育按照步骤b)得到的混合物；
d)其中，在步骤a)仅提供了两种化合物且其中一种是通式2或4的岩藻糖基化的乳糖衍生物并且在步骤b)中添加的所述具有转糖苷酶活性的酶是具有转岩藻糖苷酶活性的酶时，重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)；
e)可选地对按照步骤c)或d)获得的混合物重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)；
f)可选地使在步骤c)、d)或e)后得到的混合物进行氢解反应。
优选的是，在式2的化合物中，R1或R4中的至少一个不是H。
同样优选的是，在式4的化合物中，R1或R4中的至少一个不是H。
根据上述优选实施方式，在步骤a)仅提供了两种化合物且其中一种是通式2或4的岩藻糖基化的乳糖衍生物并且在步骤b)中提供的酶是具有转岩藻糖苷酶活性的酶时，还需要至少一个额外的温育循环。在重复进行步骤a)时，按照步骤a)所添加的至少一种化合物优选与在第一次循环中提供的化合物不同；在重复进行步骤b)时，按照步骤b)所添加的至少一种酶优选与在第一次循环中提供的酶不同。由此，在一种能够大规模实施的简单过程中，实现了寡糖混合物的制备。此外，可以简单地以大规模实现包含岩藻糖基部分的更长链的寡糖或其混合物(例如包含4～12个糖单元或6～10个糖单元的寡糖)的制备。
根据第一方面的更优选的实施方式，本发明提供了一种使人乳寡糖(HMO)或其前体多样化的方法，即，制备多种人乳寡糖(HMO)或其衍生物或前体的混合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供选自包含以下物质的组的至少一种化合物或化合物混合物：
-通式2的可选地唾液酸化和/或岩藻糖基化的乳糖衍生物及其盐：
其中，
R是能够被氢解除去的基团，
R1各自独立地为岩藻糖基或H，
R4各自独立地为唾液酸基或H，
前提是，如果仅提供一种化合物，通式2的化合物不是乳糖的R-糖苷；
-通式4的可选地唾液酸化和/或岩藻糖基化的乳糖衍生物及其盐：
其中，
R1各自独立地为岩藻糖基或H，
R4各自独立地为唾液酸基或H，
前提是，如果仅提供一种化合物，通式4的化合物不是乳糖；
-乳-N-四糖(LNT)：
-下式的乳-N-四糖(LNT)衍生物：
其中，R是能够被氢解除去的基团；和
-乳-N-新四糖(LNnT)：
-下式的乳-N-新四糖(LNnT)衍生物：
其中，R是能够被氢解除去的基团；
b)向按照步骤a)提供的所述至少一种化合物或化合物混合物中添加至少一种具有转糖苷酶活性的酶；
c)温育按照步骤b)得到的混合物；
d)其中，
-如果步骤c)的结果是仅制得了一种HMO或其衍生物或前体，并且
-在步骤a)仅提供了两种化合物且其中一种是3'-唾液酸基乳糖或通式2或4的唾液酸化的乳糖衍生物并且在步骤b)中添加的所述具有转糖苷酶活性的酶是具有转唾液酸酶活性的酶时，
重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)；
e)可选地对按照步骤c)或d)获得的混合物重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)；
f)可选地使在步骤c)、d)或e)后得到的混合物进行氢解反应。
优选的是，在式2的化合物中，R1或R4中的至少一个不是H。
同样优选的是，在式4的化合物中，R1或R4中的至少一个不是H。
根据上述更优选的实施方式，当在第一个温育循环后仅形成了一种产物(HMO、HMO衍生物或HMO前体)时，还需要一个额外的温育循环。这种情况可以出现在步骤a)中提供的一些供体-受体对中。单一产物的形成使得步骤a)中提供的原料仍存在于步骤c)中获得的混合物中。在重复进行步骤a)和c)时，按照步骤a)所添加的至少一种化合物优选与在第一次循环中提供的化合物不同；在重复进行步骤b)和c)时，按照步骤b)所添加的至少一种酶优选与在第一次循环中提供的酶不同。在重复进行步骤a)～c)的所有步骤时，适合的是，步骤a)中提供的至少一种化合物或步骤b)中提供的至少一种酶与在第一次循环中提供的相应化合物或酶不同，且优选的是，二者均与第一次循环中提供的相应化合物和酶不同。
更优选的实施方式提供了一种方法，该方法在能够大规模实施的单一反应过程中能够简单地制造多种HMO或其前体的混合物。
在本发明的背景中，表述“能够被氢解除去的基团”是指氢使该基团旁边的碳-氧单键断裂或发生“裂解”的基团。氢解是保护基团化学中的一个例外，其中，水可以用作溶剂。氢解本身是一种强有力的脱保护过程，适合在防止副产物形成的极度温和的条件下以几乎全量的方式从寡糖骨架中除去O-苄基/具有取代基的O-苄基部分。作为复杂合成路径中的最终去封闭程序，氢解的优点还在于仅需要催化量的试剂来完成反应并且副产物仅为甲苯或具有取代基的甲苯衍生物。通过蒸发和/或萃取过程，即使数吨规模的甲苯或具有取代基的甲苯衍生物也都可以容易地从水溶性寡糖产物中除去。适合的用于氢解的基团可以包括苄基、二苯基甲基(二苯甲基)、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基(三苯甲基)，它们各自可以可选地取代有选自下述基团中的一个或多个基团：烷基、烷氧基、苯基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硝基、羧基、烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-烷基氨基甲酰基、N,N-二烷基氨基甲酰基、叠氮基、卤代烷基或卤素。优选的是，上述取代(如果存在的话)位于芳香环上。特别优选的保护基团是可选地取代有选自烷基或卤素中的一个或多个基团的苄基。更优选的是，保护基团选自不具有取代基的苄基、4-氯苄基和4-甲基苄基。这些特别优选和更优选的保护基团的优点在于氢解副产物仅为甲苯或具有取代基的甲苯。通过蒸发和/或萃取过程，即使数吨规模的这些副产物也可以容易地从水溶性寡糖产物中除去。氢解可以通过添加催化量的钯、Raney镍或已知用于氢解的其他适合的金属催化剂来进行，从而使OH基再生。此类基团是技术人员熟知的，并且已充分讨论过(参见例如P.G.M.Wuts和T.W.Greene:Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley&Sons(2007))。
此外，术语“乳糖的R-糖苷”应理解为用残基R修饰过从而通过糖苷键形成糖苷的乳糖。
此外，术语“HMO前体”是指HMO的R-糖苷，其已用残基R修饰过从而通过糖苷键形成了糖苷。
此外，术语“HMO衍生物”是指与HMO及其R-糖苷结构相似的寡糖，优选是符合通式1、2、3和4的衍生物。
此外，本发明背景下的术语“岩藻糖基”是指以α-糖苷间键连接到核心寡糖上的L-吡喃岩藻糖基：
本发明背景下的“N-乙酰基氨基乳糖基”是指以β键连接的N-乙酰基氨基乳糖的糖基残基(LacNAc,Galpβ1-4GlcNAcp)：
此外，本发明背景下的术语“乳-N-二糖基”是指以β键连接的乳-N-二糖的糖基残基(LNB,Galpβ1-3GlcNAcp)：
本发明背景下的术语“唾液酸基”是指以α键连接的唾液酸的糖基残基(N-乙酰基神经氨酸，Neu5Ac)：
此外，本发明背景下的术语“包含一个或多个N-乙酰基氨基乳糖基单元和/或一个或多个乳-N-二糖基单元的糖基残基”是指直链或支化的结构，其包含以糖苷间键相互连接的所述单元。
根据第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤a)，提供了至少一种化合物或化合物混合物。上述化合物混合物优选应理解为是至少两种、三种、四种、五种、一至五种、五至十种、一至十种、二至十种、二至二十种、三至二十种、四或五至二十种或者更多种不同的由步骤a)的任何化合物一般限定的化合物的混合物。因此，上述至少一种化合物或至少两种、三种、四种、五种、一至五种、五至十种、一至十种、二至十种、二至二十种、三至二十种、四或五至二十种、或更多种不同的由步骤a)的任何化合物一般限定的化合物的混合物可以不加限制地选自式2和/或式4中的任一式所限定的任何化合物或选自上述LNT、LNnT或者LNT衍生物或LNnT衍生物。
在本发明的使人乳寡糖(HMO)或其衍生物或前体多样化的方法中，第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤a)所限定的成分，特别是式2或式4中的任一式所限定的成分或者上述LNT、LNnT或LNT衍生物或LNnT衍生物中的任何化合物，可以充当供体或受体。在本发明的背景中，术语“供体”优选应理解为在化学反应(例如亲核取代反应或亲电取代反应)中向另一化合物(优选是受体)提供特定部分的化合物。同样地，术语“受体”优选应理解为在化学反应(例如亲核取代反应或亲电取代反应)中从另一化合物(优选是受体)接受特定部分的化合物。
特别优选的是，用于使人乳寡糖(HMO)多样化的第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤a)中所使用的上述式2的化合物
可以选自以下物质的组：2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、2',3-二岩藻糖基乳糖(DF-L)、3'-唾液酸基乳糖(3'-SL)、6'-唾液酸基乳糖(6'-SL)和3'-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖(FSL)的R-糖苷或其盐。这些R-糖苷可以是α或β端基异构体。优选的是，所述R-糖苷是β端基异构体。这些R-糖苷代表了具有乳糖核心的天然存在的HMO。本发明的使人乳寡糖(HMO)多样化的方法的步骤a)中所用的化合物可以优选选自上文定义的化合物，更优选选自其中R为苄基的通式2的化合物。
还特别优选的是，用于使人乳寡糖(HMO)多样化的第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤a)中所使用的化合物可以选自通式4的化合物及其盐：
使人乳寡糖(HMO)多样化的本发明的方法的步骤a)中所使用的特别优选的上文定义的式4化合物可以选自以下物质的组：2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、2',3-二岩藻糖基乳糖(DFL)、3'-唾液酸基乳糖(3'-SL)、6'-唾液酸基乳糖(6'-SL)、3'-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖(FSL)及其盐。
在用于使人乳寡糖(HMO)多样化的第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤b)中，将具有转糖苷酶活性的至少一种酶添加到按照步骤a)获得或提供的至少一种化合物或混合物中。此类温育有利地使按照步骤a)获得或提供的至少一种化合物或混合物多样化。按照步骤a)获得或提供的至少一种化合物或混合物的多样化基于步骤b)中添加的酶的不同活性，而且还基于按照步骤a)获得或提供的至少一种化合物或混合物，在多样化反应中，这些化合物每个都可以充当供体或受体。使用该途径，本发明的方法有利地使包含在混合物中的乳糖的数量和类型以简单且具有成本效益的方式发生变化并因此多样化。酶的使用进一步使多样化以立体选择性方式进行。多样化可以优选通过以下方法来进行：以精确的方式在分子等的所需位置形成新键以转移糖基部分(例如唾液酸基部分、岩藻糖基部分、N-乙酰基氨基乳糖基部分或乳-N-二糖基部分)，由此获得多样化的人乳寡糖或其衍生物的混合物。
在第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤b)中，添加至少一种具有转糖苷酶活性的酶，优选添加至少两种、三种、四种、五种、二至五种、二至十种、二至二十种、五至十种或更多种不同的具有转糖苷酶活性的酶。
在用于使人乳寡糖(HMO)多样化的第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤b)中，适合的酶通常包括至少一种具有转糖苷酶活性的酶，优选选自：具有例如岩藻糖苷酶或转岩藻糖苷酶活性、唾液酸酶(神经氨酸酶)或转唾液酸酶(转神经氨酸酶)活性、乳-N-二糖苷酶或转乳-N-二糖苷酶活性、和/或N-乙酰基氨基乳糖苷酶或转N-乙酰基氨基乳糖苷酶活性的酶，或具有此类活性的任何其他酶。进一步优选的是，在用于使人乳寡糖(HMO)多样化的第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤b)中，适合的酶可以选自包含以下酶的组：野生型或突变的糖苷酶或转糖苷酶，优选具有岩藻糖苷酶或转岩藻糖苷酶活性、唾液酸酶(神经氨酸酶)或转唾液酸酶(转神经氨酸酶)活性、乳-N-二糖苷酶或转乳-N-二糖苷酶活性、和/或N-乙酰基氨基乳糖苷酶或转N-乙酰基氨基乳糖苷酶活性的野生型或突变的糖苷酶或转糖苷酶，或优选具有α-转岩藻糖苷酶、α-转唾液酸酶、β-转乳-N-二糖苷酶和/或β-转N-乙酰基氨基乳糖苷酶活性的野生型或突变的糖苷酶或转糖苷酶。
在用于使人乳寡糖(HMO)多样化的第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤b)中，适合的酶还可以选自技术人员已知的用来表达或分泌至少一种上述酶(例如，具有转糖苷酶活性的酶，优选具有岩藻糖苷酶或转岩藻糖苷酶活性、唾液酸酶(神经氨酸酶)或转唾液酸酶(转神经氨酸酶)活性、乳-N-二糖苷酶或转乳-N-二糖苷酶活性、和/或N-乙酰基氨基乳糖苷酶或转N-乙酰基氨基乳糖苷酶活性的酶，或优选具有α-转岩藻糖苷酶、α-转唾液酸酶、β-转乳-N-二糖苷酶和/或β-转N-乙酰基氨基乳糖苷酶活性的酶，或具有此类活性的其他任何酶)的任何属。进一步优选的是，在用于使人乳寡糖(HMO)多样化的本发明的方法的步骤b)中，此类适合的酶可以选自细菌或锥虫，所述细菌选自芽孢杆菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、乳球菌属、链球菌属、链霉菌属、硫化叶菌属或栖热袍菌属。
进一步优选的是，在用于使人乳寡糖(HMO)多样化的第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤b)中，此类适合的酶选自包含以下的组：环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、链霉菌属物种、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)P2、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8等细菌；克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)；乳酸菌，例如两歧双岐杆菌JCM1254、两歧双岐杆菌NCIMB41171、两歧双岐杆菌NCIMB41171、两歧双岐杆菌JCM1254、两歧双岐杆菌JCM1254、两歧双岐杆菌PRL2010、两歧双岐杆菌PRL2010、两歧双岐杆菌S17、两歧双岐杆菌S17、齿双歧杆菌Bd1、长双岐杆菌婴儿亚种ATCC15697、长双岐杆菌长亚种JDM301、长双岐杆菌婴儿亚种JCM1222和干酪乳杆菌BL23。
在上述情形中特别优选的微生物(特别是针对目标糖苷酶/转糖苷酶的微生物)包括乳酸菌。乳酸菌，更具体而言，来自双歧杆菌属的细菌，包含一系列能够识别人乳寡糖的糖苷酶，包括α-2,3/6唾液酸酶(GH33)、α-1,2/3/4岩藻糖苷酶(GH29和GH95)、乳-N-二糖苷酶(GH20)、β-半乳糖苷酶(GH2)和β-N-乙酰基氨基己糖苷酶(GH20)。这些糖苷酶是细胞内酶或细胞外酶，视双歧杆菌菌株而定。
关于来自乳酸菌的糖苷酶的应用的另一方面考虑了此类细菌的工业重要性，因为它们具有GRAS(通常认为安全)状态。根据另一更优选的方面，展示出转岩藻糖酶活性、转唾液酸酶活性、转乳-N-二糖苷酶活性和/或转N-乙酰基氨基乳糖苷酶活性(优选α-转岩藻糖苷酶活性、α-转唾液酸酶活性、β-转乳-N-二糖苷酶活性和/或β-转N-乙酰基氨基乳糖苷酶活性)的糖苷酶是野生型或经改造的糖苷酶，最优选的是，野生型糖苷酶取自由乳酸菌组成的组，其中，利用合理改造和/或定向进化将糖苷酶转化为转糖苷酶。选自由乳酸菌组成的组的糖苷酶最优选是来自双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属或明串珠菌属的糖苷酶。选自双歧杆菌属的糖苷酶最优选是来自长双歧杆菌婴儿亚种、长双歧杆菌长亚种、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌和链状双歧杆菌的糖苷酶。
此外，最近已开发出经改造的来自噬热生物(例如硫磺矿硫化叶菌和海栖热袍菌)的岩藻糖苷酶，其可以用于本发明的方法中。这些热稳定的糖苷酶具有可观的工业应用潜力，因为它们可以用于高温生物技术过程中，并因此促进该过程、防止污染风险、提高反应中所用的化合物的溶解性。
根据另一更优选的方面，展示出转岩藻糖酶活性、转唾液酸酶活性、转乳-N-二糖苷酶活性和/或转N-乙酰基氨基乳糖苷酶活性(优选α-转岩藻糖苷酶活性、α-转唾液酸酶活性、β-转乳-N-二糖苷酶活性和/或β-转N-乙酰基氨基乳糖苷酶活性)的糖苷酶是野生型或经改造的糖苷酶，最优选的是，野生型糖苷酶取自由噬热生物组成的组，其中，利用合理改造和/或定向进化将糖苷酶转化为转糖苷酶。选自噬热生物的α-L-岩藻糖苷酶最优选是来自海栖热袍菌和硫磺矿硫化叶菌的α-L-岩藻糖苷酶。
优选的是，具有转糖苷酶活性的至少一种酶可以选自展示出岩藻糖苷酶或转岩藻糖苷酶活性的酶，优选如下所述。在此背景下，具有岩藻糖苷酶或转岩藻糖苷酶活性(更优选具有α-转岩藻糖苷酶活性)的酶优选选自常见的岩藻糖苷酶，更优选选自α-L-岩藻糖苷酶，例如根据EC3.2.1.38和3.2.1.51分类的α-L-岩藻糖苷酶。α-L-岩藻糖苷酶广泛地分布于例如哺乳动物、植物、真菌和细菌等活的生物体中。这些酶属于CAZY命名法(http://www.cazy.org)所定义的糖苷水解酶家族29和95(GH29和GH95)。来自GH29的岩藻糖苷酶是保留型酶(3D结构：(β/α)8)，而来自GH95的岩藻糖苷酶是反转型酶(3D结构：(α/α)6)。GH29家族的底物特异性较宽泛，而GH95家族的底物特异性严格限于α1,2连接的岩藻糖基残基。GH29家族大致分为两个亚家族。其中一个亚家族通常具有对α1,3-和α1,4-岩藻糖苷键的严格特异性。另一个亚家族的成员具有更宽泛的特异性，覆盖了所有的α岩藻糖基键。α-L-岩藻糖苷酶通常将末端岩藻糖残基从聚糖上水解除去。这些酶因其转岩藻糖基化活性还能够充当岩藻糖基化反应的催化剂，因此可以用于本发明的方法的背景中，优选在受动力学控制的条件下。
可以用于本发明的背景中的岩藻糖苷酶还可以包括经改造的岩藻糖苷酶。这种经改造的岩藻糖苷酶优选包括：经改造的α-L-岩藻糖苷酶，优选源自上述岩藻糖苷酶的经改造的岩藻糖苷酶，例如，经改造的来自两歧双歧杆菌的α-1,2-L-岩藻糖合酶、来自硫磺矿硫化叶菌和海栖热袍菌的α-L-岩藻糖合酶等。此类经改造的岩藻糖苷酶显示出受体依赖的区域选择性，并且缺乏产物水解活性。此外，经改造的岩藻糖苷酶优选包括来自海栖热袍菌的α-L-岩藻糖苷酶，近期已通过定向进化将其也转化成了高效的α-L-转岩藻糖苷酶(参见Osanjo,G.等，Directed evolution of the alpha-L-fucosidase fromThermotoga maritima into an alpha-L-trans-fucosidase.Biochemistry,2007,46(4):1022-33页)。
更优选的是，具有岩藻糖苷酶和/或转岩藻糖苷酶活性的至少一种酶可以选自源于以下物种的α-L-岩藻糖苷酶：海栖热袍菌MSB8、硫磺矿硫化叶菌P2、两歧双岐杆菌JCM1254、两歧双岐杆菌JCM1254、长双岐杆菌婴儿亚种ATCC15697、长双岐杆菌婴儿亚种ATCC15697、长双岐杆菌婴儿亚种JCM1222、两歧双岐杆菌PRL2010、两歧双岐杆菌S17、长双岐杆菌长亚种JDM301、齿双歧杆菌Bd1、或干酪乳杆菌BL23等等。
更优选的是，具有岩藻糖苷酶和/或转岩藻糖苷酶活性的至少一种酶可以选自用以下保藏号限定的以下α-L-岩藻糖苷酶：gi|4980806(海栖热袍菌MSB8，SEQ ID NO:1)、gi|13816464(硫磺矿硫化叶菌P2，SEQ ID NO:2)、gi|34451973(两歧双岐杆菌JCM1254，SEQ ID NO:3)、gi|242345155(两歧双岐杆菌JCM1254，SEQ ID NO:4)、gi|213524647(长双岐杆菌婴儿亚种ATCC15697，SEQ ID NO:5)、gi|213522629(长双岐杆菌婴儿亚种ATCC15697)、gi|213522799(长双岐杆菌婴儿亚种ATCC15697)、gi|213524646(长双岐杆菌婴儿亚种ATCC15697)、gi|320457227(长双岐杆菌婴儿亚种JCM1222)、gi|320457408(长双岐杆菌婴儿亚种JCM1222)、gi|320459369(长双岐杆菌婴儿亚种JCM1222)、gi|320459368(长双岐杆菌婴儿亚种JCM1222)、gi|310867039(两歧双岐杆菌PRL2010)、gi|310865953(两歧双岐杆菌PRL2010)、gi|309250672(两歧双岐杆菌S17)、gi|309251774(两歧双岐杆菌S17)、gi|296182927(长双岐杆菌长亚种JDM301)、gi|296182928(长双岐杆菌长亚种JDM301)、gi|283103603(齿双歧杆菌Bd1)、gi|190713109(干酪乳杆菌BL23，SEQ ID NO:6)、gi|190713871(干酪乳杆菌BL23，SEQ ID NO:7)、gi|190713978(干酪乳杆菌BL23，SEQ ID NO:8)等，或者可以是在氨基酸水平上与整个野生型序列相比时与一种上述的具有岩藻糖苷酶和/或转岩藻糖苷酶活性的酶序列的序列同一性为至少70%、更优选至少80%、同样更优选至少85%、进一步优选至少90%且最优选至少95%甚至97%、98%或99%的序列。
特别优选的具有岩藻糖苷酶/转岩藻糖苷酶活性的α-L-岩藻糖苷酶列于下表2中：
GenBank数据库中的GI号 生物体 SEQ ID NO:
gi|4980806 海栖热袍菌MSB8 1
gi|13816464 硫磺矿硫化叶菌P2 2
gi|34451973 两歧双歧杆菌JCM1254 3
gi|242345155 两歧双歧杆菌JCM1254 4
gi|213524647 长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697 5
gi|213522629 长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697 -
gi|213522799 长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697 -
gi|213524646 长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697 -
gi|320457227 长双歧杆菌婴儿亚种JCM1222 -
gi|320457408 长双歧杆菌婴儿亚种JCM1222 -
gi|320459369 长双歧杆菌婴儿亚种JCM1222 -
gi|320459368 长双歧杆菌婴儿亚种JCM1222 -
gi|310867039 两歧双歧杆菌PRL2010 -
gi|310865953 两歧双歧杆菌PRL2010 -
gi|309250672 两歧双歧杆菌S17 -
gi|309251774 两歧双歧杆菌S17 -
gi|296182927 长双歧杆菌长亚种JDM301 -
gi|296182928 长双歧杆菌长亚种JDM301 -
gi|283103603 齿双歧杆菌Bd1 -
gi|190713109 干酪乳杆菌BL23 6
gi|190713871 干酪乳杆菌BL23 7
gi|190713978 干酪乳杆菌BL23 8
表2：优选的α-L-岩藻糖苷酶。
同样优选的是，具有转糖苷酶活性的至少一种酶可以选自展示出唾液酸酶或转唾液酸酶活性的酶，优选如下所述。在此背景下，具有唾液酸酶或转唾液酸酶活性的酶优选选自下文描述的唾液酸酶或转唾液酸酶，例如，根据GH33家族分类的唾液酸酶(EC3.2.1.18)和转唾液酸酶(EC2.4.1.-)。这些酶是保留型酶。唾液酸酶和转唾液酸酶广泛分布在自然界中。它们具体存在于多种病毒家族和细菌中，还存在于原生动物、一些无脊椎动物和哺乳动物中。这些酶的生化性质(例如动力学、结合亲和力或底物偏好)有所差别。但是，它们具有保守的结构域和结构相似性。转唾液酸酶与唾液酸酶不同，因为转唾液酸酶能够将唾液酸(优选α-2,3键合的唾液酸)从供体分子转移到受体衍生物上，受体衍生物优选是具有β糖苷间键的末端半乳糖部分。该转移的结果是，在唾液酸和受体之间形成了α糖苷键。然而，如果没有适合的受体，转唾液酸酶会将唾液酸水解下来。
首次描述的转唾液酸酶存在于克氏锥虫中，克氏锥虫是引起Chagas病的一种原生动物。该转唾液酸酶(TcTS)已得到深入研究。从那时起，在数种其他锥虫(例如布氏锥虫冈比亚亚种(Trypanosoma brucei gambiense)、布氏锥虫罗得西亚亚种(Trypanosoma brucei rhodesiense)、布氏锥虫布氏亚种(Trypanosoma brucei brucei)和刚果锥虫(Trypanosoma congolense))中也检测到了转唾液酸酶。此外，在肠锥虫类型中、在白喉棒杆菌中、甚至在人类血浆中也发现存在转唾液酸酶。
唾液酸酶可以分类为不同的两个亚组：唾液酸内切酶和唾液酸外切酶。唾液酸内切酶水解大分子内部的唾液酸键；而第二种，即唾液酸外切酶，则攻击末端的唾液酸键，并使糖蛋白、糖肽、神经节糖苷、寡糖和多糖脱去唾液酸。最近，已鉴定、克隆并表征了来自两歧双歧杆菌和长双歧杆菌婴儿亚种的唾液酸酶。这些唾液酸酶能够切割并因此识别α-2,3-和α-2,6-连接的唾液酸苷。来自长双歧杆菌婴儿亚种的唾液酸酶一贯偏好α-2,6-键；而来自两歧双歧杆菌的唾液酸酶则一贯偏好α-2,3-键。这些酶因其转唾液酸酶活性还能够充当唾液酸化反应的催化剂，因此可以用于本发明的方法的背景中，优选在受动力学控制的条件下。
可以用于本发明的背景中的唾液酸酶还可以包括经改造的唾液酸酶。基于序列和结构比较，来自蓝氏锥虫(Trypanosoma rangeli)的唾液酸酶可以在6个位点突变，其中，所得的突变酶能够显示出高水平的转唾液酸酶活性(参见Paris,G.等，Asialidase mutant displaying trans-sialidase activity.J Mol Biol,2005.345(4):923-34页)。
更优选的是，具有唾液酸酶和/或转唾液酸酶活性的至少一种酶可以选自源于长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697、两歧双歧杆菌JCM1254、两歧双歧杆菌S17、两歧双歧杆菌PRL2010、两歧双歧杆菌NCIMB41171、克氏锥虫等的唾液酸酶或转唾液酸酶。
更优选的是，具有唾液酸酶和/或转唾液酸酶活性的至少一种酶可以选自用以下保藏号限定的唾液酸酶或转唾液酸酶：gi|213524659(长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697,SEQ ID NO:9)、gi|213523006长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697,SEQ ID NO:10)、siab2(两歧双歧杆菌JCM1254)、来自两歧双歧杆菌JCM1254的其他唾液酸酶或转唾液酸酶、gi|309252191(两歧双歧杆菌S17,SEQ ID NO:11)、gi|309252190(两歧双歧杆菌S17,SEQ ID NO:12)、gi|310867437(两歧双歧杆菌PRL2010,SEQ ID NO:13)、gi|310867438(两歧双歧杆菌PRL2010,SEQ ID NO:14)、gi|224283484(两歧双歧杆菌NCIMB41171)、gi|313140638(两歧双歧杆菌NCIMB41171)、gi|47252690(克氏锥虫,SEQ ID NO:15)、gi|432485(克氏锥虫,SEQ ID NO:16)、gi|343957998(刚果锥虫,SEQ ID NO:20)、gi|343958004(刚果锥虫,SEQ ID NO:21)等，或者可以是在氨基酸水平上与整个野生型序列相比时与一种上述的具有唾液酸酶和/或转唾液酸酶活性的酶序列的序列同一性为至少70%、更优选至少80%、同样更优选至少85%、进一步优选至少90%且最优选至少95%甚至97%、98%或99%的序列。
特别优选的具有唾液酸酶/转唾液酸酶活性的唾液酸酶列于下表3中：
GenBank数据库中的GI号 生物体 SEQ ID NO:
gi|213524659 长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697 9
gi|213523006 长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697 10
gi|309252191 两歧双歧杆菌S17 11
gi|309252190 两歧双歧杆菌S17 12
gi|310867437 两歧双歧杆菌PRL2010 13
gi|310867438 两歧双歧杆菌PRL2010 14
gi|224283484 两歧双歧杆菌NCIMB41171 -
gi|313140638 两歧双歧杆菌NCIMB41171 -
gi|47252690 克氏锥虫 15
gi|432485 克氏锥虫 16
gi|343957998 刚果锥虫 20
gi|343958004 刚果锥虫 21
表3：优选的唾液酸酶/转唾液酸酶。
此外，具有转糖苷酶活性的至少一种酶可以优选选自展示出乳-N-二糖苷酶或转乳-N-二糖苷酶活性的酶，优选如下所述。在此背景下，具有乳-N-二糖苷酶或转乳-N-二糖苷酶活性的酶优选选自下文描述的乳-N-二糖苷酶或转乳-N-二糖苷酶，例如，根据GH20家族分类的乳-N-二糖苷酶(EC3.2.1.140)。乳-N-二糖苷酶通常通过保留型机制发挥作用。到目前为止仅描述和表征了来自链霉菌属和两歧双歧杆菌的两种乳-N-二糖苷酶，它们可以作为乳-N-二糖苷酶或转乳-N-二糖苷酶用于本发明的方法中(参见Sano,M.,K.Hayakawa和I.Kato,Proc Natl Acad Sci U S A,1992.89(18):8512-6；Sano,M.,K.Hayakawa和I.Kato,J Biol Chem,1993.268(25):18560-6；Wada,J.等，ApplEnviron Microbiol,2008.74(13):3996-4004)。乳-N-二糖苷酶特异性地将末端乳-N-二糖残基(β-D-Gal-(1→3)-D-GlcNAc)从具有β-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→3)-β-D-Gal-(1→R)结构的寡糖的非还原性末端水解除去。通过将供体底物(例如乳-N-四糖和pNP-β-LNB)与受体(例如各种1-烷醇和乳糖)一起温育，Wada等(见上)和Murata等(Glycoconj.J.16,189(1999))还分别展示了来自两歧双歧杆菌和金杆菌属物种L-101的乳-N-二糖苷酶的催化转糖苷反应的能力。
更优选的是，具有乳-N-二糖苷酶和/或转乳-N-二糖苷酶活性的至少一种酶可以选自源于两歧双歧杆菌JCM1254、两歧双歧杆菌PRL2010、两歧双歧杆菌NCIMB41171、金杆菌属物种L-101或链霉菌属物种等的乳-N-二糖苷酶或转乳-N-二糖苷酶。
更优选的是，具有乳-N-二糖苷酶和/或转乳-N-二糖苷酶活性的至少一种酶可以选自用以下保藏号限定的乳-N-二糖苷酶或转乳-N-二糖苷酶：gi|167369738(两歧双歧杆菌JCM1254,SEQ ID NO:17),gi|4096812(链霉菌属物种,SEQ ID NO:18),gi|310867103(两歧双歧杆菌PRL2010),gi|313140985(两歧双歧杆菌NCIMB41171)等，或者可以是在氨基酸水平上与整个野生型序列相比时与一种上述的具有乳-N-二糖苷酶和/或转乳-N-二糖苷酶活性的酶序列的序列同一性为至少70%、更优选至少80%、同样更优选至少85%、进一步优选至少90%且最优选至少95%甚至97%、98%或99%的序列。
特别优选的具有乳-N-二糖苷酶或转乳-N-二糖苷酶活性的乳-N-二糖苷酶列于下表4中：
GenBank数据库中的GI号 生物体 SEQ ID NO:
gi|167369738 两歧双歧杆菌JCM1254 17
gi|4096812 链霉菌属物种 18
gi|310867103 两歧双歧杆菌PRL2010 -
gi|313140985 两歧双歧杆菌NCIMB41171 -
表4：优选的乳-N-二糖苷酶或转乳-N-二糖苷酶。
此外，具有转糖苷酶活性的至少一种酶可以优选选自展示出N-乙酰基氨基乳糖苷酶或转N-乙酰基氨基乳糖苷酶活性的酶，优选如下所述。在此背景下，具有N-乙酰基氨基乳糖苷酶或转N-乙酰基氨基乳糖苷酶活性的酶优选选自下文描述的N-乙酰基氨基乳糖苷酶或转N-乙酰基氨基乳糖苷酶，例如，根据GH20家族分类的乳-N-二糖苷酶(EC3.2.1.140)。特别优选的是，作为N-乙酰基氨基乳糖苷酶或转N-乙酰基氨基乳糖苷酶，可以使用来自环状芽孢杆菌的壳多糖酶、更优选来自以gi|142688保藏的环状芽孢杆菌WL-12的壳多糖酶A1(SEQ ID NO:19)，或者可以使用在氨基酸水平上与整个野生型序列相比时与一种上述的具有N-乙酰基氨基乳糖苷酶和/或转N-乙酰基氨基乳糖苷酶活性的酶序列的序列同一性为至少70%、更优选至少80%、同样更优选至少85%、进一步优选至少90%且最优选至少95%甚至97%、98%或99%的序列。值得注意的是，Shoda等展示了来自环状芽孢杆菌WL-12的壳多糖酶A1能够使用要转移的N-乙酰基氨基乳糖的1,2-恶唑啉衍生物来转移具有β-1,6糖苷键的N-乙酰基氨基乳糖(参见Shoda,S.-i.等，Cellulose,2006.13(4):477-484)。
特别优选的N-乙酰基氨基乳糖苷酶或转N-乙酰基氨基乳糖苷酶列于下表5中：
GenBank数据库中的GI号 生物体 SEQ ID NO:
gi|142688 环状芽胞杆菌 19
表5：优选的N-乙酰基氨基乳糖苷酶或转N-乙酰基氨基乳糖苷酶。
如上文所定义的，包括上述转糖苷酶的蛋白也可以包括具有转糖苷酶活性的经改造的蛋白。特别考虑的是，在本发明中可以使用显示出转岩藻糖苷酶活性、转唾液酸酶活性、转乳-N-二糖苷酶活性和/或转N-乙酰基氨基乳糖苷酶活性(优选α-转岩藻糖苷酶活性、α-转唾液酸酶活性、β-转乳-N-二糖苷酶活性和/或β-转N-乙酰基氨基乳糖苷酶活性)的野生型或突变的糖苷酶来产生此类寡糖。此类酶的制备优选通过定点诱变方法或定向进化来进行。
在合理改造中，通过定点诱变方法、优选通过引入点突变来产生新的变异酶(突变酶)。该技术通常需要依赖于静态3D蛋白结构。这些突变通常会影响酶的活性位点，从而使其丧失降解其转糖基产物的能力但仍能够进行合成。优选的方案是用非亲核残基替换催化性的亲核基团。由于缺乏用于形成转糖基反应性主体-客体复合物的适当环境，该修饰导致形成了无活性的突变酶或转糖基活性下降的变异酶。然而，如果存在与糖基酶中间体相似的更有活性的糖基供体(例如，氟化糖)，则该突变酶能够高效地将糖基部分转移到适合的受体上，从而产生具有反转的端基异构立体化学的糖苷。
第二种优选的技术称作定向进化。该方案包括施加到所选糖苷酶的基因上的随机诱变并由此产生具有遗传多样性的表达糖苷酶的基因文库。序列多样性的产生可以使用为人熟知的方法来进行，最优选的方法是易错聚合酶链式反应(epPCR)法。该基因文库可以插入适合的生物体中，例如大肠杆菌或酿酒酵母，从而产生具有略微变化的性质的重组变异酶。随后，用快速可靠的筛选方法鉴定出表达改进的酶的克隆，选择后进入下一轮突变过程。继续进行突变、重组和选择的递归循环，直至演化出具有所需活性和/或特异性的突变酶。迄今为止，已开发出了糖苷酶的不同的高通量筛选方法。通过实施这些方法，能够并且已经产生并分离出了高性能的经改造的转糖苷酶。最近，已用定向进化将来自海栖热袍菌的α-L-岩藻糖苷酶转变成了高效的α-L-转岩藻糖苷酶。该进化酶的转移酶/水解比率是天然酶的30倍(参见Osanjo,G.等，Biochemistry,2007.46(4):1022-33)。
上文定义的具有转糖苷酶活性的蛋白还可以包括那些蛋白序列的片段或变体。此类片段或变体通常可以包括在氨基酸水平上与整个野生型序列相比时与一种上述蛋白序列的序列同一性为至少70%、更优选至少80%、同样更优选至少85%、进一步优选至少90%且最优选至少95%甚至97%、98%或99%的序列。
在本发明的背景下，蛋白或肽的“片段”还可以包括就其氨基酸序列而言与原生(天然)蛋白的氨基酸序列相比在N端、C端和/或序列内被截短的本文所定义的蛋白或肽的序列。因此，此类截短可以出现在氨基酸水平或相应地出现在核酸水平。因此，与本文所定义的该片段之间的序列同一性可以优选针对本文所定义的整个蛋白或肽，或针对该蛋白或肽的整个(编码)核酸分子。同样，在本发明的背景下，核酸的“片段”可以包括就其核酸分子而言与原生(天然)核酸分子的核酸分子相比在5'-、3'-和/或序列内被截短的本文所定义的核酸序列。因此，与本文所定义的该片段之间的序列同一性可以优选针对本文所定义的整个核酸。
本发明的背景下所定义蛋白或肽(例如由本文所定义的核酸所编码)的“变体”可以由发明性的聚合物载体-携带物复合体的核酸分子编码。因此，可以产生氨基酸序列与原生序列在一个或多个突变(例如一个或多个替换、插入和/或缺失的氨基酸)上有所区别的蛋白或肽。优选的是，这些片段和/或变体的生物学功能或比活性(例如，其特异的抗原性)与全长天然蛋白的一样。
本发明的背景下所定义蛋白或肽(例如由本文所定义的核酸编码)的“变体”相对于其天然序列(即，未突变的生理学序列)还可以包含保守性氨基酸替换。特别是，这些氨基酸序列以及其编码核苷酸序列属于本文所定义的术语“变体”。将来自同一类别的氨基酸的相互替换称作保守性替换。具体而言，这些是指具有脂肪族侧链的氨基酸、具有带正电或负电的侧链的氨基酸、在侧链中具有芳香族基团的氨基酸或侧链能够参与形成氢键(例如，具有羟基官能团的侧链)的氨基酸。也就是说，例如，具有极性侧链的氨基酸被另一个同样具有极性侧链的氨基酸代替；或者，例如，具有疏水性侧链的氨基酸被另一个同样具有疏水性侧链的氨基酸代替(例如，丝氨酸(苏氨酸)被苏氨酸(丝氨酸)代替，或亮氨酸(异亮氨酸)被异亮氨酸(亮氨酸)代替)。可以进行插入和替换，特别是在那些不会改变三维结构或不影响结合区域的序列位置。因插入或缺失而引起的三维结构改变可以使用例如CD谱(圆二色谱)容易地确定(Urry,1985,Absorption,Circular Dichroism and ORD of Polypeptides,Modern Physical Methods in Biochemistry,Neuberger等(编),Elsevier,Amsterdam)。
此外，本文所定义的蛋白或肽的变体还可以包括那些按照遗传密码简并规则交换了核酸的核苷酸但不会使蛋白或肽的相应氨基酸序列发生变异的序列，即，氨基酸序列或其至少一部分不会与原始序列在上文所指的一个或多个突变上有所区别。
为了确定两条序列(例如，本文所定义的核酸序列或氨基酸序列，优选由本文定义的聚合物载体的核酸序列编码的氨基酸序列或氨基酸序列本身)的同一性百分比，可以对这些序列进行比对，从而能够随后对其进行相互比较。因此，例如，可以将第一条序列的某个位置与第二条序列的相应位置进行比较。如果第一条序列的某个位置上的成分与第二条序列的位置上的相同，则这两条序列在该位置上具有同一性。若非该情况，则这些序列在该位置上不同。如果第二条序列中相对于第一条序列出现插入，则可以在第一条序列中插入空位以使比对可以继续进行。如果第二条序列中相对于第一条序列出现缺失，则可以在第二条序列中插入空位以使比对可以继续进行。两条序列的同一性百分比是下述函数：相同位置的数量除以位置总数(包括仅在一条序列中为非空位的那些位置)。两条序列的同一性百分比可以使用数学算法来确定。可以使用的数学算法的优选但非限制性实例是Karlin等，(1993),PNAS USA,90:5873-5877的算法或Altschul等，(1997),Nucleic Acids Res.,25:3389-3402的算法。此类算法已整合在BLAST程序中。可以用该程序来鉴定与本发明的序列具有一定同一性的序列。
在第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤b)中所添加的蛋白可以以游离形式提供，或者可以使其结合或固定到表面上。在此特定情形下，优选将步骤a)和b)的顺序掉换。在表面上的结合或固定可以通过例如静电键、范德华连接、共价键等来实现。在表面上的结合或固定可以使用蛋白纯化领域中的技术人员已知的共价连接物或交联物或者标签来实现。此类标签包括例如亲和标签或色谱标签等。亲和标签可以包括例如壳多糖结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S转移酶(GST)或Strep标签。多组氨酸标签是广泛使用的蛋白标签，其结合金属基质。色谱标签用来改变蛋白的色谱性质，从而在特定的分离技术上提供不同的解析，其包括例如多阴离子氨基酸类标签，例如FLAG标签。所述表面可以是生物反应器或任何适合的反应室的表面。
在用于使人乳寡糖(HMO)多样化的第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的另一步骤c)中，优选对包含步骤a)所定义的至少一种化合物或其混合物和步骤b)中所添加的至少一种酶的混合物进行温育，从而可以使用至少一种本文所定义的具有转糖苷酶活性的酶通过酶促手段使人乳寡糖(HMO)或其衍生物多样化。
第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤c)中的温育优选在酶(各自)的浓度是1mU/l～1,000U/l、优选10mU/l～100U/l时进行，其中，将能够形成源自给定离析物的给定蛋白的1μmol特定产物的活性的定义为1单位(U)，例如，对于糖转移酶而言，为在37℃在1分钟内的含单糖的复合碳水化合物的产量。本文定义的各个酶的活性可以相应地利用其天然存在的底物或经改造的底物来获得。
第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤c)中的温育可以在反应介质、优选水性介质中进行，所述反应介质包含：按照步骤b)获得的混合物和可选的水；缓冲剂，例如磷酸盐缓冲剂、碳酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂和TRIS缓冲剂，或它们的组合；醇，例如甲醇和乙醇；酯，例如乙酸乙酯；酮，例如丙酮；酰胺，例如乙酰胺；等等。
此外，第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤c)中的温育可以在上文定义的反应介质中进行，其中，必要时可以可选地添加表面活性剂或有机溶剂。可以使用能够使作为本发明的可能产物的本发明所定义的复合碳水化合物更快地形成的任何表面活性剂来作为表面活性剂。实例包括：非离子表面活性剂，例如聚氧乙烯十八胺(例如，Nymeen S-215，由Nippon Oil&Fats制造)；阳离子表面活性剂，例如鲸蜡基三甲基溴化铵和烷基二甲基苄基氯化铵(例如，Cation F2-40E，由Nippon Oil&Fats制造)；阴离子表面活性剂，例如月桂酰肌氨酸盐；叔胺，例如烷基二甲基胺(例如Tertiary Amine FB，由Nippon Oil&Fats制造)；等等；这些为单独使用或两种以上混合使用。表面活性剂通常可以以0.1g/l～50g/l的浓度使用。有机溶剂可以包括二甲苯、甲苯、脂肪酸醇、丙酮和乙酸乙酯等，其通常可以以0.1ml/l～50ml/l的浓度使用。
此外，第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤c)中的温育可以在上文定义的反应介质中进行，所述反应介质的pH优选为3～10、5～10、优选6～8。
此外，第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤c)中的温育可以在约0℃～约100℃、优选在约10℃～约50℃(例如约20℃～约50℃)进行。在所述反应介质中，必要时可以添加如MnCl2和MgCl2等无机盐。
第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤c)中的温育可以在生物反应器中进行。所述生物反应器优选适合于连续模式或间断模式。
第一方面(包括优选和更优选的实施方式)的步骤c)中的温育可以以连续方式或间断方式来进行。如果以连续方式进行，该方法优选提供必要的化合物和/或酶的连续流，提供方式优选为：将反应离析物连续供给至反应混合物并从反应混合物中连续除去产物，同时将包括酶在内的所有化合物的浓度保持在预定水平。连续模式中所使用的酶可以以游离形式添加，或作为结合或固定在表面上的酶添加。
对于本发明的第一方面，按照可选的步骤d)，可以对按照步骤c)获得的混合物重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)。该混合物已经被温育过，因此已经用步骤a)所定义的至少一种化合物和步骤b)所定义的至少一种酶处理过。这种分步程序可以在数轮内以可控的方式使给定的一组离析物合理地多样化为有限的一组化合物。以预定的顺序添加步骤a)所定义的特定化合物和步骤b)所定义的不同的蛋白还可以合理地排除特定的组分。为了获得这种多样性，可以同时添加或依次添加化合物和/或酶，优选的是，可以在一个步骤中同时添加和/或在不同步骤中依次添加化合物和/或酶。
作为另一选择，可以在一个步骤中对步骤a)中定义的化合物或化合物混合物以及步骤b)中定义的至少一种酶进行温育，优选的是，其中所有化合物都同时提供。这种程序可以优选在某些环境下进行，因为其可以达到多样化的化合物的最大多样性。
对于第一方面的优选实施方式，在第一次循环的步骤a)仅提供了两种化合物且其中一种是3'-唾液酸基乳糖并且在第一次循环的步骤b)中提供的酶是具有转唾液酸酶活性的酶时，还需要至少一个额外的温育循环d)。特别优选的是，应当对按照步骤c)获得的混合物重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)。在重复进行步骤a)和c)时，按照步骤a)所添加的至少一种化合物优选与在第一次循环中提供的化合物不同；在重复进行步骤b)和c)时，按照步骤b)所添加的至少一种酶优选与在第一次循环中提供的酶不同。在重复进行步骤a)～c)的所有步骤时，适合的是，步骤a)中提供的至少一种化合物或步骤b)中提供的至少一种酶与在第一次循环中提供的相应化合物或酶不同，且优选的是，二者均与第一次循环中提供的相应化合物和酶不同。
对于第一方面的优选实施方式，在第一次循环的步骤a)仅提供了两种化合物且其中一种是通式2或4的唾液酸化乳糖衍生物并且在第一次循环的步骤b)中提供的酶是具有转唾液酸酶活性的酶时，还需要至少一个额外的温育循环d)。特别优选的是，应当对按照步骤c)获得的混合物重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)。在重复进行步骤a)和c)时，按照步骤a)所添加的至少一种化合物优选与在第一次循环中提供的化合物不同；在重复进行步骤b)和c)时，按照步骤b)所添加的至少一种酶优选与在第一次循环中提供的酶不同。在重复进行步骤a)～c)的所有步骤时，适合的是，步骤a)中提供的至少一种化合物或步骤b)中提供的至少一种酶与在第一次循环中提供的相应化合物或酶不同，且优选地，二者均与第一次循环中提供的相应化合物和酶不同。
对于第一方面的优选实施方式，在第一次循环的步骤a)仅提供了两种化合物且其中一种是通式2或4的岩藻糖基化乳糖衍生物并且在第一次循环的步骤b)中提供的酶是具有转岩藻糖苷酶活性的酶时，还需要至少一个额外的温育循环d)。特别优选的是，应当对按照步骤c)获得的混合物重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)。在重复进行步骤a)和c)时，按照步骤a)所添加的至少一种化合物优选与在第一次循环中提供的化合物不同；在重复进行步骤b)和c)时，按照步骤b)所添加的至少一种酶优选与在第一次循环中提供的酶不同。在重复进行步骤a)～c)的所有步骤时，适合的是，步骤a)中提供的至少一种化合物或步骤b)中提供的至少一种酶与在第一次循环中提供的相应化合物或酶不同，且优选的是，二者均与第一次循环中提供的相应化合物和酶不同。
此外，对于第一方面的优选实施方式，按照可选的步骤e)，可以对按照步骤c)获得的混合物重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)。优选的是，该混合物已经被温育过，因此已经用步骤a)所定义的至少一种化合物和步骤b)所定义的至少一种酶处理过。这种分步程序可以在数轮内以可控的方式使给定的一组离析物合理地多样化为有限的一组化合物。以预定的顺序添加步骤a)所定义的特定化合物和步骤b)所定义的不同的蛋白还可以合理地排除特定的组分。为了获得这种多样性，可以同时添加或依次添加化合物和/或酶，更优选的是，可以在一个步骤中同时添加和/或在不同步骤中依次添加化合物和/或酶。
作为另一选择，可以在一个步骤中对步骤a)中定义的化合物或化合物混合物以及步骤b)中定义的至少一种酶进行温育，优选的是，其中所有化合物都同时提供。这种程序可以优选在某些环境下进行，因为其可以实现多样化的化合物的最大多样性。
对于第一方面的更优选的实施方式，当在第一个温育循环后仅形成了一种产物(HMO或HMO衍生物或HMO前体)时，还需要一个额外的温育循环d)。这包括以下情况：在第一次温育步骤c)后获得的混合物包含来自第一次步骤a)的原料和作为所述原料在至少一种酶下的反应产物的一种HMO或HMO衍生物或HMO前体。特别优选的是，对按照步骤c)获得的混合物重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)。在重复进行步骤a)和c)时，按照步骤a)所添加的至少一种化合物优选与在第一次循环中提供的化合物不同；在重复进行步骤b)和c)时，按照步骤b)所添加的至少一种酶优选与在第一次循环中提供的酶不同。在重复进行步骤a)～c)的所有步骤时，适合的是，步骤a)中提供的至少一种化合物或步骤b)中提供的至少一种酶与在第一次循环中提供的相应化合物或酶不同，且优选的是，二者均与第一次循环中提供的相应化合物和酶不同。
本领域技术人员能够探究并决定在第一次温育步骤后是否仅产生了一种HMO或HMO衍生物或其前体，以及是否需要至少一个额外的温育循环来达到目标。在可能的情况下，对特定供体、特定受体和特定酶的选择导致仅有一种产物。当在一个温育循环中使用了多于一种供体和/或多于一种受体和/或多于一种酶来产生HMO、HMO衍生物或HMO前体时，通常预期会形成多于一种产物。类似地，当所使用糖苷酶和/或糖合酶具有较低的(区域)选择性时，可以预期更多的产物，即使在仅提供了一种受体时也是如此，这是因为该酶能够将糖基部分转移到受体的多个部位。另外，根据一般规则，供体与受体的比例可以对产物的多样性产生巨大影响：供体-受体比越高，在一种供体-一种受体的体系中获得多于一种产物的机会就越大。技术人员具有定性和定量的检测和监视方法的全部技能(例如，TLC、HPLC、GC、GC-MS和电泳等)来发现是否已形成了一种或多种产物。
此外，对于第一方面的更优选的实施方式，按照可选的步骤e)，可以对按照步骤c)获得的混合物重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)。优选的是，该混合物已经被温育过，因此已经用步骤a)所定义的至少一种化合物和步骤b)所定义的至少一种酶处理过。这种程序可以在数轮内以可控的方式使给定的一组离析物合理地多样化为有限的一组化合物。以预定的顺序添加步骤a)所定义的特定化合物和步骤b)所定义的不同的蛋白还可以合理地排除特定的组分。为了获得这种多样性，可以同时添加或依次添加化合物和/或酶，更优选的是，可以在一个步骤中同时添加和/或在不同步骤中依次添加化合物和/或酶。
作为另一选择，可以在一个步骤中对步骤a)中定义的化合物或化合物混合物以及步骤b)中定义的至少一种酶进行温育，优选的是，其中所有化合物都同时提供。这种程序可以优选在某些环境下进行，因为其可以实现多样化的化合物的最大多样性。
上文定义的本发明的方法使得步骤a)中提供的化合物在第一方面的任意实施方式的温育步骤c)之后或者优选在根据第一方面的任意实施方式的步骤d)或e)进行了强制的或可选的步骤重复之后得到多样化。优选的是，本文所描述的本发明的方法或者得到以下定义的单一人乳寡糖(HMO)或其衍生物、或者得到包含两种以上人乳寡糖(HMO)或其衍生物的多样化混合物，其中单一的化合物可以根据以下物质来定义：
-通式1的化合物及其盐：
其中，
R是能够被氢解除去的基团，
R1是岩藻糖基或H，
R2选自N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基，其中所述N-乙酰基氨基乳糖基可以带有包含一个或多个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个或多个乳-N-二糖基的糖基残基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基都可以取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基，
R3是H或N-乙酰基氨基乳糖基，所述N-乙酰基氨基乳糖基可选地取代有包含一个或多个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个或多个乳-N-二糖基的糖基残基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基都可以取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基；
-通式2的化合物及其盐：
其中，
R是能够被氢解除去的基团，
R1各自独立地为岩藻糖基或H，
R4各自独立地为唾液酸基或H，
前提是，R1或R4中的至少一个不是H，
-通式3的化合物及其盐：
其中，
R1是岩藻糖基或H，
R2选自N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基，其中所述N-乙酰基氨基乳糖基可以带有包含一个或多个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个或多个乳-N-二糖基的糖基残基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基都可以取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基，
R3是H或N-乙酰基氨基乳糖基，所述N-乙酰基氨基乳糖基可选地取代有包含一个或多个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个或多个乳-N-二糖基的糖基残基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基都可以取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基；和/或
-通式4的化合物及其盐：
其中，
R1各自独立地为岩藻糖基或H，
R4各自独立地为唾液酸基或H，
前提是，R1或R4中的至少一个不是H。
进一步优选的是，在第一方面的任意实施方式的温育步骤c)之后或者在根据第一方面的任意实施方式的步骤d)或e)进行了强制的或可选的步骤重复之后，用于使人乳寡糖(HMO)多样化的本发明的方法或者产生单一人乳寡糖衍生物、或者产生两种以上人乳寡糖(HMO)衍生物的多样化混合物，其中，式1和2的化合物进一步以通式1a、1b或2及其盐为特征：
其中，
R、R1和R4的定义同上，
R2a是可选地取代有包含一个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个乳-N-二糖基的糖基残基的N-乙酰基氨基乳糖基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基都可以取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基，
R3a是H或可选地取代有乳-N-二糖基的N-乙酰基氨基乳糖基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基都可以取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基，
R2b是可选地取代有唾液酸基和/或岩藻糖基残基的乳-N-二糖基，并且
R3b是H或可选地取代有一个或两个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个乳-N-二糖基的N-乙酰基氨基乳糖基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基都可以取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基。
特别优选的是，用上文定义的本发明的多样化方法获得的化合物的特征在于其连接键和修饰。优选的是，在第一方面的任意实施方式的温育步骤c)之后或者在根据第一方面的任意实施方式的步骤d)或e)进行了强制的或可选的步骤重复之后，用本发明的方法获得的化合物(优选如通式1a和1b定义的化合物)的特征在于：
-通式1a中的R2a的糖基残基中的N-乙酰基氨基乳糖基通过1-3糖苷间键与另一N-乙酰基氨基乳糖基连接，
-通式1a中的R2a的糖基残基中的乳-N-二糖基通过1-3糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基连接，
-通式1a中的R3a的糖基残基中的乳-N-二糖基通过1-3糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基连接，
-通式1b中的R3b的糖基残基中的N-乙酰基氨基乳糖基通过1-3或1-6糖苷间键与另一N-乙酰基氨基乳糖基连接，
-通式1b中的R3b的糖基残基中的乳-N-二糖基通过1-3糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基连接。
优选的是，在第一方面的任意实施方式的温育步骤c)之后或者在根据第一方面的任意实施方式的步骤d)或e)进行了强制的或可选的步骤重复之后，用本发明的方法获得的化合物的特征在于：通式1a表示可选地取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基的乳-N-新四糖、对乳-N-六糖、对乳-N-新六糖、乳-N-新六糖、对乳-N-八糖和乳-N-新八糖的R-糖苷，而通式1b表示可选地取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基的乳-N-四糖、乳-N-六糖、乳-N-八糖、异乳-N-八糖、乳-N-十糖和乳-N-新十糖的R-糖苷。
优选的是，在温育步骤c)之后和/或在根据步骤d)或e)进行了步骤重复之后，用本发明的方法获得的化合物的特征在于：
-连接在N-乙酰基氨基乳糖基和/或乳-N-二糖基上的岩藻糖基残基
·以1-2糖苷间键与乳-N-二糖基的半乳糖连接，和/或
·以1-4糖苷间键与乳-N-二糖基的N-乙酰基氨基葡萄糖连接，和/或
·以1-3糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基的N-乙酰基氨基葡萄糖连接，
-连接在N-乙酰基氨基乳糖基和/或乳-N-二糖基上的唾液酸基残基
·以2-3糖苷间键与乳-N-二糖基的半乳糖连接，和/或
·以2-6糖苷间键与乳-N-二糖基的N-乙酰基氨基葡萄糖连接，和/或
·以2-6糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基的半乳糖连接。
根据另一优选方面，用本发明的多样化方法获得的化合物(优选是符合式1或2的化合物或子通式1a、1b或2的化合物)可以选自以下物质的组：2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2',3-二岩藻糖基乳糖、3'-唾液酸基乳糖、6'-唾液酸基乳糖、3'-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、LNFP-I、LNFP-II、LNFP-III、LNFP-V、LST-a、LST-b、LST-c、FLST-a、FLST-b、FLST-c、LNDFH-I、LNDFH-II、LNDFH-III、DS-LNT、FDS-LNT I和FDS-LNT II的R-糖苷，或它们的盐。这些化合物的核心结构示于下表6中。这些R-糖苷可以是α或β端基异构体。优选的是，所述R-糖苷是β端基异构体。
表6：具有乳糖、LNT或LNnT核心的天然存在的HMO的R-糖苷的核心结构。
更优选的是，用本发明的多样化方法获得的化合物(优选是符合式1或2的化合物或子通式1a、1b或2的化合物)可以选自R为苄基时的化合物。
根据本发明的方法的另一具体方面，在根据步骤c)进行温育之后和/或在根据步骤d)或e)进行了进一步的重复之后，可选的是，使按照本发明的方法获得的化合物(优选是符合式1或2中任一式的化合物或子通式1a、1b或2的化合物)经历氢解反应，从而形成以上文所限定的通式3和4为特征的HMO。
同样优选的是，在温育步骤c)和可选的步骤d)或e)的步骤重复之后，本发明的人乳寡糖(HMO)多样化方法形成了上文定义的人乳寡糖，其中，式3和4的化合物进一步以通式3a、3b或4及其盐为特征：
其中，R1和R4的定义同上，
R2a是可选地取代有包含一个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个乳-N-二糖基的糖基残基的N-乙酰基氨基乳糖基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和/或乳-N-二糖基都可以取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基，
R3a是H或可选地取代有乳-N-二糖基的N-乙酰基氨基乳糖基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和/或乳-N-二糖基都可以取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基，
R2b是可选地取代有唾液酸基和/或岩藻糖基残基的乳-N-二糖基，
R3b是H或可选地取代有一个或两个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个乳-N-二糖基的N-乙酰基氨基乳糖基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和/或乳-N-二糖基都可以取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基。
特别优选的是，用上文定义的本发明的多样化方法获得的化合物的特征在于其连接键和修饰。优选的是，在温育步骤c)和可选的步骤d)或e)的步骤重复之后，用本发明的方法获得的化合物(优选是由通式3a或3b限定的化合物)的特征在于：
-通式3a中的R2a的糖基残基中的N-乙酰基氨基乳糖基通过1-3糖苷间键与另一N-乙酰基氨基乳糖基连接，
-通式3a中的R2a的糖基残基中的乳-N-二糖基通过1-3糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基连接，
-通式3a中的R3a的糖基残基中的乳-N-二糖基通过1-3糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基连接，
-通式3b中的R3b的糖基残基中的N-乙酰基氨基乳糖基通过1-3或1-6糖苷间键与另一N-乙酰基氨基乳糖基连接，
-通式3b中的R3b的糖基残基中的乳-N-二糖基通过1-3糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基连接。
优选的是，在温育步骤c)和可选的步骤d)或e)的步骤重复之后，用本发明的方法获得的化合物的特征在于：通式3a表示可选地取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基的乳-N-新四糖、对乳-N-六糖、对乳-N-新六糖、乳-N-新六糖、对乳-N-八糖和乳-N-新八糖，而通式3b表示可选地取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基的乳-N-四糖、乳-N-六糖、乳-N-八糖、异乳-N-八糖、乳-N-十糖和乳-N-新十糖。
优选的是，在温育步骤c)之后和/或在根据步骤d)或e)进行了步骤重复之后，用本发明的方法获得的化合物的特征在于：
-连接在N-乙酰基氨基乳糖基和/或乳-N-二糖基上的岩藻糖基残基
·以1-2糖苷间键与乳-N-二糖基的半乳糖连接，和/或
·以1-4糖苷间键与乳-N-二糖基的N-乙酰基氨基葡萄糖连接，和/或
·以1-3糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基的N-乙酰基氨基葡萄糖连接，
-连接在N-乙酰基氨基乳糖基和/或乳-N-二糖基上的唾液酸基残基
·以2-3糖苷间键与乳-N-二糖基的半乳糖连接，和/或
·以2-6糖苷间键与乳-N-二糖基的N-乙酰基氨基葡萄糖连接，和/或
·以2-6糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基的半乳糖连接。
根据另一优选方面，用本发明的多样化方法获得的化合物(优选是符合子通式3a、3b或4的化合物)可以选自以下物质的组：2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2',3-二岩藻糖基乳糖、3'-唾液酸基乳糖、6'-唾液酸基乳糖、3'-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、LNFP-I、LNFP-II、LNFP-III、LNFP-V、LST-a、LST-b、LST-c、FLST-a、FLST-b、FLST-c、LNDFH-I、LNDFH-II、LNDFH-III、DS-LNT、FDS-LNT I和FDS-LNT II，或它们的盐。这些化合物的核心结构示于上表6中。
在温育步骤c)和可选的步骤d)或e)的步骤重复之后，用本发明的方法获得的化合物是基于对上述具有转糖苷酶活性的至少一种酶的选择而得到的。可以根据在使用本发明的方法进行多样化时所需的连接键或所要进行的修饰来选择此类酶。
本文中可以采用上文定义的野生型或经改造的岩藻糖苷酶，其展现出转岩藻糖苷酶活性并显示出α,1-2、α,1-3和/或α,1-4区域选择性，这些连接是本发明中的靶标。此类野生型或经改造的岩藻糖苷酶优选展现出转岩藻糖苷酶活性，并且催化岩藻糖基残基：
-转移至乳-N-二糖基的半乳糖并以α,1-2糖苷间键与之连接，和/或
-转移至乳-N-二糖基的N-乙酰基氨基葡萄糖并以α,1-4糖苷间键与之连接，和/或
-转移至N-乙酰基氨基乳糖基的N-乙酰基氨基葡萄糖并以α,1-3糖苷间键与之连接；
当使用野生型或经改造的岩藻糖苷酶时，上述连接键在本发明的方法和本文所要求保护的化合物的背景下是高度优选的。
此外，本文中可以采用上文定义的野生型或经改造的唾液酸酶，其展现出转唾液酸酶活性并显示出α,2-3和/或α,2-6区域选择性。这些连接是本发明中的优选靶标。此类野生型或经改造的唾液酸酶优选展现出转唾液酸酶活性，并且催化唾液酸基残基：
-转移至乳-N-二糖基的半乳糖并以2-3糖苷间键与之连接，和/或
-转移至乳-N-二糖基的N-乙酰基氨基葡萄糖并以2-6糖苷间键与之连接，和/或
-转移至N-乙酰基氨基乳糖基的半乳糖并以2-6糖苷间键与之连接。
当使用野生型或经改造的唾液酸酶时，上述连接键在本发明的方法和本文所要求保护的化合物的背景下是高度优选的。此外，本文中可以采用上文定义的野生型或经改造的乳-N-二糖苷酶，其展现出转乳-N-二糖苷酶活性并显示出β,1-3区域选择性。这些连接是本发明中的优选靶标。此类野生型或经改造的乳-N-二糖苷酶优选展现出转乳-N-二糖苷酶活性，并且催化乳-N-二糖基残基转移至N-乙酰基氨基乳糖基并以1-3糖苷间键与之连接，这种连接是本发明中的靶标。当使用野生型或经改造的乳-N-二糖苷酶时，上述连接键在本发明的方法和本文所要求保护的化合物的背景下是高度优选的。
最后，本文中可以采用上文定义的野生型或经改造的糖苷酶，其展现出转N-乙酰基氨基乳糖苷酶活性并显示出β,1-3和/或β,1-6区域选择性，这些连接是本发明中的靶标。此类野生型或经改造的糖苷酶优选展现出转N-乙酰基氨基乳糖苷酶活性，并且催化N-乙酰基氨基乳糖基残基转移至另一N-乙酰基氨基乳糖基上并以1-3或1-6糖苷间键与之连接。当使用野生型或经改造的N-乙酰基氨基乳糖苷酶时，上述连接键在本发明的方法和本文所要求保护的化合物的背景下是高度优选的。
根据本发明的方法的另一具体方面，可选地使按照本发明的方法获得的化合物(优选是符合式1、2、3或4中任一式的化合物，或子通式1a、1b或2的化合物，或子通式3a、3b或4的化合物)经历纯化反应，所述纯化优选通过结晶或沉淀来进行。
根据本发明的方法的一个具体方面，可选地对按照本发明的方法获得的化合物(优选是符合式1、2、3或4中任一式的化合物，或子通式1a、1b或2的化合物，或子通式3a、3b或4的化合物)进行喷射干燥。
根据非常具体的一个方面，按照本发明的方法获得的化合物可以是一种或多种天然存在的HMO R-糖苷，优选是符合式1或2的化合物或子通式1a、1b或2的化合物，或者可以是一种或多种天然存在的HMO，优选是符合式3或4的化合物或子通式3a、3b或4的化合物。天然存在的HMO列举于以下文献中：TADASU URASHIMA等，MILK OLIGOSACCHARIDES,Nova Biomedical Books,New York,2011,ISBN:978-1-61122-831-1,第14-25页表4。
此外，根据非常具体的一个方面，按照本发明的方法获得的化合物可以是一种或多种HMO，其中的HMO是带苄基的衍生物。
根据本发明的方法的另一具体方面，在根据步骤c)进行温育之后和/或在根据步骤d)或e)进行了进一步的重复之后，使按照本发明的方法获得的化合物(优选是符合式1或2中任一式或子通式1a、1b或2的单一化合物或两种以上化合物的混合物)经历氢解反应，从而形成以通式3和4为特征的单一HMO或两种以上HMO的混合物。
在该氢解步骤中，使在温育步骤c)、d)或e)之后得到的符合式1或2中任一式或子通式1a、1b或2的单一化合物或两种以上化合物的混合物经历例如本文中所定义的氢解反应。在此背景下，优选进行该氢解步骤以获得天然存在的裸HMO(例如，上述各式中的任一式所定义的HMO)并优选除去可能的保护基团(例如苄基)。
催化氢解通常在质子溶剂或质子溶剂的混合物中进行。质子溶剂可以选自由水、乙酸或C1-C6醇组成的组。还可以使用一种或多种质子溶剂与一种或多种与该质子溶剂部分混溶或完全混溶的适合的非质子有机溶剂(例如THF、二氧六环、乙酸乙酯或丙酮)的混合物。优选使用水、一种或多种C1-C6醇或者水与一种或多种C1-C6醇的混合物作为溶剂体系。还可以使用的是包含任意浓度的碳水化合物衍生物的溶液或该碳水化合物衍生物在溶剂中的悬浮液。在10℃～100℃、优选在20℃～50℃，在1～50巴绝对值(100～5000kPa)的氢气氛围中，在催化剂(例如钯、Raney镍或任何其他合适的金属催化剂，优选炭载钯或钯黑)的存在下搅拌反应混合物，直至反应完成。当从环己烯、环己二烯、甲酸或甲酸铵原位生成氢时，也可以进行转移氢化。还可以利用加入有机或无机的碱或酸和/或碱性和/或酸性的离子交换树脂来改善氢解的动力学。当卤素取代基存在于前体的具有取代基的苄基部分上且/或希望形成甘露糖胺碱时，特别优选使用碱性物质。优选的有机碱包括但不限于三乙胺、二异丙基乙基胺、氨、氨基甲酸铵和二乙胺。在甘露糖胺盐为目标产物的情况下，有益的是将有机或无机酸用作助溶剂或添加剂。优选的酸包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、氯乙酸、二氯乙酸、三氟乙酸、HCl和HBr。以上提出的条件可以实现简单、方便且精巧地除去溶剂从而生成纯HMO的混合物或共混物。
因此，本发明的另一方面涉及提供单一的化合物或两种以上化合物的混合物，这些化合物的特征是：
-通式1及其盐：
其中，
R是能够被氢解除去的基团，
R1是岩藻糖基或H，
R2选自N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基，其中所述N-乙酰基氨基乳糖基可以带有包含一个或多个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个或多个乳-N-二糖基的糖基残基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基都可以取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基，
R3是H或N-乙酰基氨基乳糖基，所述N-乙酰基氨基乳糖基可选地取代有包含一个或多个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个或多个乳-N-二糖基的糖基残基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基都可以取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基，
前提是，如果仅提供一种化合物，则所述化合物不是LNnT R-糖苷或LNT苄基糖苷；或
-通式2及其盐：
其中，
R是能够被氢解除去的基团，
R1各自独立地为岩藻糖基或H，
R4各自独立地为唾液酸基或H，
前提是，如果R1或R4中至少一个不是H，并且，如果仅提供一种化合物，则所述化合物不是3'-唾液酸基乳糖苄基糖苷钠盐或6'-唾液酸基乳糖R-糖苷。
更优选的是，本发明涉及单一的人乳寡糖衍生物，或包含两种以上人乳寡糖(HMO)衍生物的多样化混合物，其中，上文定义的式1和2的化合物进一步以通式1a、1b或2以及其盐为特征：
其中，
R、R1和R4的定义同上，
R2a是可选地取代有包含一个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个乳-N-二糖基的糖基残基的N-乙酰基氨基乳糖基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基都可以取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基，
R3a是H或可选地取代有乳-N-二糖基的N-乙酰基氨基乳糖基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基都可以取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基，
R2b是可选地取代有唾液酸基和/或岩藻糖基残基的乳-N-二糖基，并且
R3b是H或可选地取代有一个或两个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个乳-N-二糖基的N-乙酰基氨基乳糖基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基都可以取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基。
特别优选的是，上文定义的化合物的特征在于其连接键和修饰。优选的是，通式1a和1b所定义的化合物的特征在于：
-通式1a中的R2a的糖基残基中的N-乙酰基氨基乳糖基通过1-3糖苷间键与另一N-乙酰基氨基乳糖基连接，
-通式1a中的R2a的糖基残基中的乳-N-二糖基通过1-3糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基连接，
-通式1a中的R3a的糖基残基中的乳-N-二糖基通过1-3糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基连接，
-通式1b中的R3b的糖基残基中的N-乙酰基氨基乳糖基通过1-3或1-6糖苷间键与另一N-乙酰基氨基乳糖基连接，
-通式1b中的R3b的糖基残基中的乳-N-二糖基通过1-3糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基连接。
优选的是，以通式1a为特征的化合物表示可选地取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基的乳-N-四糖、对乳-N-六糖、对乳-N-新六糖、乳-N-新六糖、对乳-N-八糖和乳-N-新八糖的R-糖苷，而通式1b表示可选地取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基的乳-N-四糖、乳-N-六糖、乳-N-八糖、异乳-N-八糖、乳-N-十糖和乳-N-新十糖的R-糖苷。
优选的是，以取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基的通式1a和1b为特征的化合物的特征进一步在于：
-连接在N-乙酰基氨基乳糖基和/或乳-N-二糖基上的岩藻糖基残基
·以1-2糖苷间键与乳-N-二糖基的半乳糖连接，和/或
·以1-4糖苷间键与乳-N-二糖基的N-乙酰基氨基葡萄糖连接，和/或
·以1-3糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基的N-乙酰基氨基葡萄糖连接，
-连接在N-乙酰基氨基乳糖基和/或乳-N-二糖基上的唾液酸基残基
·以2-3糖苷间键与乳-N-二糖基的半乳糖连接，和/或
·以2-6糖苷间键与乳-N-二糖基的N-乙酰基氨基葡萄糖连接，和/或
·以2-6糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基的半乳糖连接。
根据另一优选方面，上文定义的化合物可以选自以下物质的组：2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2',3-二岩藻糖基乳糖、3'-唾液酸基乳糖、6'-唾液酸基乳糖、3'-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、LNFP-I、LNFP-II、LNFP-III、LNFP-V、LST-a、LST-b、LST-c、FLST-a、FLST-b、FLST-c、LNDFH-I、LNDFH-II、LNDFH-III、DS-LNT、FDS-LNT I和FDS-LNT II的R-糖苷，或它们的盐。这些R-糖苷可以是α或β端基异构体。优选的是，所述R-糖苷是β端基异构体，更优选的是，R是苄基。
根据另一实施方式，本发明的方法还包括将在温育步骤中和/或在氢解步骤后获得的化合物添加到消耗品中，所述消耗品优选为本文中定义的消耗品。所述消耗品优选是药物制剂或营养制剂中的至少一种，且优选为液体或固体。根据另一实施方式，所述方法可以进一步包括将药物可接受的载剂和/或益菌素添加到在温育步骤中和/或在氢解步骤后获得的化合物中。
根据第二方面，本发明还提供用本文所述的本发明的方法所获得的或可以获得的化合物，特别是具有上文指出的特征的多样化的HMO混合物。根据第二方面的另一实施方式，本发明还提供用本文所述的本发明的方法所获得的或可以获得的化合物、优选化合物的混合物、更优选HMO混合物。在此背景下，用本文所述的方法所获得的或可以获得的上述化合物混合物优选应理解为是至少2～10种、2～10种、2～20种、2～20种、2～100种、2～200种或更多种不同的上文所一般定义的化合物的混合物。此类化合物可以优选地不受限制地选自上文定义的式1、2、3或4中任一式或者任何子式或选择所限定的化合物中的任一种。
根据第三方面，本发明还提供可以用于本发明中的化合物(例如供体或受体)以及可以在实施本发明的多样化方法时获得的化合物。
本发明还提供或使用本文所定义的化合物的盐。这些盐可以优选选自符合通式1～4或其子式的化合物的盐，其包含至少一个唾液酸基残基的盐形式：由符合式1～4或其子式的唾液酸化寡糖的带负电的酸残基和任何化学计量比例的一种或多种阳离子组成的缔合离子对。在此背景下使用的阳离子是具有正电荷的原子或分子。所述阳离子可以是无机阳离子或有机阳离子。优选的无机阳离子是铵离子、碱金属离子、碱土金属离子和过渡金属离子，更优选为Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+和Cu2+，最优选为K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Fe2+和Zn2+。相关的有机阳离子可以是带正电荷形式的碱性有机化合物。此类优选的带正电的反荷部分是均处于质子化形式的二乙胺、三乙胺、二异丙基乙基胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、咪唑、哌啶、哌嗪、吗啉、苄基胺、亚乙基二胺、甲基葡胺、吡咯烷、胆碱、三(羟甲基)甲基胺、N-(2-羟乙基)吡咯烷、N-(2-羟乙基)哌啶、N-(2-羟乙基)哌嗪、N-(2-羟乙基)吗啉、L-精氨酸、L-赖氨酸、具有L-精氨酸或L-赖氨酸单元的寡肽或在N端具有游离氨基的寡肽等。此类盐的形成可以用来修饰复合分子的整体特性，例如稳定性、与赋形剂的相容性、溶解性和形成晶体的能力。
根据第三方面的特定实施方式，可以对本文所定义的化合物进行氢解，优选在R不是H时进行，更优选在R是苄基时进行。所述氢解优选如上所述进行。R基团优选如本文中所定义能够在氢解反应中被切下。
在第三方面的另一实施方式中，用本文所述的本发明的方法所获得的或可以获得的化合物或化合物混合物(更优选为HMO混合物)或本文定义的任何其他化合物可以用于制备消耗品，优选用于制备药物组合物、营养制剂或食品补充剂。用本文所述的本发明的方法所获得的或可以获得的此类化合物或化合物混合物(更优选为HMO混合物)对新生儿免疫系统的增强和成熟而言特别有效，并且对病毒感染(例如流感)后的继发感染具有预防效果。使用按照本文所述的本发明的方法所获得的或可以获得的化合物或化合物混合物(更优选为HMO混合物)作为益菌素，会增强益生菌(例如乳杆菌属物种和双歧杆菌物种)的有益效果和效率，具体而言，促进婴儿的早期双歧杆菌产生性肠道微生物丛的发展、降低婴儿发展过敏和/或哮喘的风险、预防和治疗婴儿的病原性感染(例如腹泻)。
在第四方面中，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含用本文所述的本发明的方法所获得的或可以获得的化合物或化合物混合物(更优选为HMO混合物)，而且优选还包含药物可接受的载剂。“药物可接受的载剂”包括但不限于添加剂、佐剂、赋形剂和稀释剂(水、明胶、滑石、糖、淀粉、阿拉伯胶、植物胶、植物油、聚亚烷基二醇、调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、润滑剂、着色剂、填充剂和润湿剂等)。适合的载剂在最近一版的《Remington's Pharmaceutical Sciences》(本领域的标准参考书)中有所描述。用于施用的剂型包括例如片剂、粉末、颗粒剂、丸剂、悬浮液、乳液、输注剂、胶囊、注射剂、液体、酏剂、提取物和酊剂。
在第五方面，提供了营养制剂，例如食物或饮品，其优选包含用本文所述的本发明的方法所获得的或可以获得的化合物或化合物混合物、更优选HMO混合物。所述营养制剂可以包含可食用的微量营养素、维生素和矿物质。此类成分的量可以根据所述制剂是设计供正常的健康的婴儿、儿童、成年人使用还是供有特殊需求(例如，患有代谢紊乱)的受试对象使用而有所不同。微量营养素包括例如食用油、脂肪或脂肪酸(例如椰子油、大豆油、甘油单酯、甘油二酯、液态棕榈油、葵花子油、鱼油、亚油酸和亚麻酸等)、碳水化合物(例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖糊精、淀粉和水解玉米淀粉等)和来自酪蛋白、大豆、乳清或脱脂乳的蛋白或这些蛋白的水解产物，但是也可以使用来自其他来源的蛋白(完整的或经水解的)。维生素可以选自由维生素A、B1、B2、B5、B6、B12、C、D、E、H、K、叶酸、肌醇和烟酸组成的组。营养配方可以包含以下矿物质和微量元素：Ca、P、K、Na、Cl、Mg、Mn、Fe、Cu、Zn、Se、Cr或I。
根据第五方面的通常实施方式，上文定义的营养制剂还可以包含：一种或多种益生菌，例如乳酸菌、双岐杆菌物种；益菌素，例如寡聚果糖和寡聚半乳糖；来自酪蛋白、大豆、乳清或脱脂乳的蛋白；碳水化合物，例如乳糖、蔗糖、麦芽糖糊精、淀粉或其混合物；脂质(例如液态棕榈油、葵花子油、红花油)以及日常饮食中所必需的维生素和矿物质。益生菌还优选以足以在个体(优选婴儿、儿童和/或成年人)中获得所需效果的量包含在所述营养制剂中。
在优选实施方式中，上文定义的营养制剂是婴儿配方食品。在本发明的背景下，术语“婴儿配方食品”是指设计用来供婴儿在其生命的前4～6个月或前4～12个月期间使用的特殊营养食物，其本身即满足婴儿的营养需要。其可以包含：一种或多种益生双岐杆菌物种；益菌素，例如寡聚果糖和寡聚半乳糖；来自酪蛋白、大豆、乳清或脱脂乳的蛋白；碳水化合物，例如乳糖、蔗糖、麦芽糖糊精、淀粉或其混合物；脂质(例如液态棕榈油、葵花子油、红花油)以及日常饮食中所必需的维生素和矿物质。
在第六方面，可以提供一种食品补充剂。所述食品补充剂优选包含上文针对营养食品所定义的成分，例如，用本文所述的本发明的方法所获得的或可以获得的化合物或化合物混合物(更优选HMO混合物)、维生素、矿物质、微量元素和其他微量营养素等。所述食品补充剂可以是例如片剂、胶囊、软锭剂或液体形式。该补充剂可以包含选自但不限于粘合剂、涂布剂、乳化剂、增溶剂、包封剂、成膜剂、吸附剂、载剂、填充剂、分散剂、润湿剂、凝胶化剂和成凝胶剂等的常规添加剂。
根据优选实施方式，所述食品补充剂是消化性保健功能食品，在施用按照本文所述的本发明的方法所获得的或可以获得的化合物或化合物混合物(更优选为HMO混合物)时，其为消化健康带来有益效果。消化性保健功能食品优选是加工食品，其使用目的是利用按照本文所述的本发明的方法所获得的或可以获得的化合物或化合物混合物(更优选为HMO混合物)来增强并保持消化健康，其作为片剂、胶囊和粉末等形式的具有生理功能的成分或组分使用。诸如饮食补充剂、营养食品、设计食品或保健产品等不同的术语也可以用来指代消化性保健功能食品。
在另一方面，用本文所述的本发明的方法所获得的或可以获得的化合物或化合物混合物(更优选为HMO混合物)可以用来制备营养制剂(包括食品、饮品和饲料，优选是婴儿配方食品)、食品补充剂和消化性保健功能食品，优选是上述这些中的任一种。所述营养制剂可以用任何常用的方式来制备。
为了帮助理解本发明，下文描述和解释了本发明的方法在用于化合物和酶的某种组合时的结果。
适合的是，所述方法的步骤a)中提供的化合物可以是2'-岩藻糖基乳糖，步骤b)中提供的酶可以是转岩藻糖苷酶。由于2'-岩藻糖基乳糖可以在该体系中充当供体和受体，因此温育步骤c)的结果可能是产生了二岩藻糖基乳糖和乳糖。由于确切地讲乳糖并非人乳寡糖，因此认为，步骤c)的结果是产生了单一的HMO，因此根据本发明的更优选的实施方式，必须第二次重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)以实现HMO混合物。
适合的是，所述方法的步骤a)中提供的化合物可以是3'-唾液酸基乳糖(供体)和3-岩藻糖基乳糖(受体)，步骤b)中提供的酶可以是转唾液酸酶。温育步骤c)的结果可能是产生了唾液酸基-岩藻糖基乳糖和乳糖。由于确切地讲乳糖并非人乳寡糖，因此认为，步骤c)的结果是产生了单一的HMO，因此根据本发明的更优选的实施方式，必须第二次重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)以实现HMO混合物。
适合的是，所述方法的步骤a)中提供的化合物可以是3'-唾液酸基乳糖(供体)和乳糖(受体)，步骤b)中提供的酶可以是具有1-6选择性的转唾液酸酶。温育步骤c)的结果可能是产生了6-唾液酸基乳糖和乳糖。由于确切地讲乳糖并非人乳寡糖，因此认为，步骤c)的结果是产生了单一的HMO，因此根据本发明的更优选的实施方式，必须第二次重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)以实现HMO混合物。
适合的是，所述方法的步骤a)中提供的化合物可以是2'-岩藻糖基乳糖(供体)和乳糖(受体)，步骤b)中提供的酶可以是具有1-3选择性的转岩藻糖苷酶。温育步骤c)的结果可能是产生了3-岩藻糖基乳糖和乳糖。由于确切地讲乳糖并非人乳寡糖，因此认为，步骤c)的结果是产生了单一的HMO，因此根据本发明的更优选的实施方式，必须第二次重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)以实现HMO混合物。
适合的是，所述方法的步骤a)中提供的化合物可以是3'-唾液酸基乳糖(供体)和LNT(受体)，步骤b)中提供的酶可以是转唾液酸酶。温育步骤c)的结果可能是产生了唾液酸基-LNT和乳糖。由于确切地讲乳糖并非人乳寡糖，因此认为，步骤c)的结果是产生了单一的HMO，因此根据本发明的更优选的实施方式，必须第二次重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)以实现HMO混合物。
适合的是，所述方法的步骤a)中提供的化合物可以是LNnT(供体和受体)，步骤b)中提供的酶可以是转N-乙酰基氨基乳糖苷酶。温育步骤c)的结果可能是产生了对乳-N-新六糖(pLNnH)或乳-N-新六糖(LNnH)和乳糖。由于确切地讲乳糖并非人乳寡糖，因此认为，步骤c)的结果是产生了单一的HMO，因此根据本发明的更优选的实施方式，必须第二次重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)以实现HMO混合物。
适合的是，所述方法的步骤a)中提供的化合物可以是LNnT(供体)和LNT(受体)，步骤b)中提供的酶可以是转N-乙酰基氨基乳糖苷酶。温育步骤c)的结果可能是产生了乳-N-六糖(LNH)和乳糖。由于确切地讲乳糖并非人乳寡糖，因此认为，步骤c)的结果是产生了单一的HMO，因此根据本发明的更优选的实施方式，必须第二次重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)以实现HMO混合物。
适合的是，所述方法的步骤a)中提供的化合物可以是LNT(供体)和LNnT(受体)，步骤b)中提供的酶可以是转乳-N-二糖苷酶。温育步骤c)的结果可能是产生了对乳-N-六糖(pLNH)和乳糖。由于确切地讲乳糖并非人乳寡糖，因此认为，步骤c)的结果是产生了单一的HMO，因此根据本发明的更优选的实施方式，必须第二次重复进行至少步骤a)和c)或步骤b)和c)以实现HMO混合物。
可以使用采用了供体和/或受体的对应苄基糖苷的相似变化形式。
在本发明中，如果没有另外指明，则替代性方式和实施方式的不同的特征可以在适合的时候相互组合。
虽然特别参考了优选实施方式对本发明进行了描述，但应理解的是在本发明的范围内可以进行各种修改。
在本说明书中，除非另有明确说明，否则使用词语“或”时其意义相当于在满足两项陈述条件中的任一项或全部两项时会返回真值的运算符，这与要求只满足条件中的一项的运算符“异或”相反。使用词语“包含”时意指“包括”，而非“由……构成”。上文确认的所有现有技术教导都通过援引并入本文中。对于未在本文中予以确认的任何现有的出版文献，应理解为是承认或表示其教导在其日期时是澳大利亚或其他地方的公知常识。
实验部分
实施例1
转糖苷反应的一般程序：
在pH为5.0～9.0的温育缓冲液中，将适合的糖基供体和糖基受体(例如，通式2和4的化合物、LNT、LNT-OR、LNnT或LNnT-OR)的溶液(10mM～1M)与重组的糖苷酶、转糖苷酶或糖合酶(例如α-岩藻糖苷酶、α-转岩藻糖苷酶、α-岩藻糖合酶、α-唾液酸酶、α-转唾液酸酶、β-乳-N-二糖苷酶、β-转乳-N-二糖苷酶、β-N-乙酰基氨基乳糖苷酶或β-转N-乙酰基氨基乳糖苷酶)一起温育。在15℃～70℃的温度范围内搅拌反应混合物。在反应中的不同时刻取样，而后添加pH=10的1M NaHCO3溶液来使反应停止，用HPLC和/或LC-MS和/或LC/MS-MS来分析产物。完成后，使酶变性并离心除去。减压蒸发所得溶液。冻干后，将干的残留物溶解在水中，用biogel色谱(P-2Biogel,16×900mm)和水或者用反相色谱来纯化产物。
在转糖苷反应中使用和测试的重组酶如下：
来自海栖热袍菌的转岩藻糖苷酶P25(见Seq ID1)，其具有G226S Y237H T264AL322P突变
来自海栖热袍菌的转岩藻糖苷酶M3(见Seq ID1)，其具有Y237H Y267F L322P突变
来自海栖热袍菌的转岩藻糖苷酶C2(见Seq ID1)，其具有T264A Y267F L322P突变
来自克氏锥虫的转唾液酸酶(见Seq ID15、16)
来自长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697的岩藻糖苷酶Blon_2336(见Seq ID5)
按照以下文献的报导，在大肠杆菌中产生这些转糖苷酶：Osanjo等，Biochemistry46,1022(2007)；Sela等，Appl.Environ.Microbiol.78,795(2012)；Agustí等，Glycobiology14,659(2004)；和Neubacher等Org.Biomol.Chem.3,1551(2005)。将经纯化的转糖苷酶储存在-20℃～+4℃。
实施例2
使用3-SL作为供体的唾液酸化
一般程序：将3-SL和适合的唾液酸基受体在温育缓冲液(0.5ml,100mM Tris/HCl,pH7.0)中的溶液与来自克氏锥虫的重组转唾液酸酶(45μl,90μg/ml)一起在15℃温育。在3小时、6小时和24小时后取样(各50μl)并在TLC上监控反应的进程。
在以下唾液酸化反应中检测到了中等到高的转化率：
供体：3-SL(75mM)，受体：LNT(50mM)，产物：唾液酸化的LNT
供体：3-SL(75mM)，受体：LNnT(50mM)，产物：唾液酸化的LNnT
供体：3-SL(75mM)，受体：3-FL(25mM)，产物：唾液酸化的3-FL
实施例3
使用2'-FL作为供体的岩藻糖基化
一般程序：将2'-FL和LNT在脱气的温育缓冲液(0.5ml,50mM柠檬酸盐-磷酸盐,145mM NaCl，pH5.5)中的溶液与转岩藻糖苷酶(来自海栖热袍菌的P25、来自海栖热袍菌的M3)一起在60℃温育21小时后取样，用HPLC确定转化率。结果：
P25突变酶：
500mM2'-FL，500mM LNT，转化率：25%岩藻糖基化的LNT(未确定岩藻糖基化位置)；
1000mM2'-FL，500mM LNT，转化率：31%岩藻糖基化的LNT(未确定岩藻糖基化位置)+4%双岩藻糖基化的LNT(未确定岩藻糖基化位置)；
M3突变酶：
500mM2'-FL，500mM LNT，转化率：36%岩藻糖基化的LNT(未确定岩藻糖基化位置)。
实施例4
使用2'-FL作为供体的岩藻糖基化
一般程序：在pH=5.5的脱气的温育缓冲液(1ml,50mM柠檬酸/磷酸钠缓冲剂和150mM NaCl)中，将2'-FL和受体的溶液(10mM～500mM，供体-受体比为5:1～1:5)与转岩藻糖苷酶(来自海栖热袍菌的P25、来自海栖热袍菌的M3)一起在60℃下温育24小时。在反应中的不同时刻取样，而后添加pH=10的1M NaHCO3溶液来使反应停止，用TLC和/或HPLC来分析反应。完成后，使酶变性并离心除去。减压蒸发所得溶液。冻干后，将干的残留物溶解在水中，并且用biogel色谱(P-2Biogel,16×900mm)和水或者用反相色谱来进行纯化。用LC-MS来鉴定产物。
LC-MS条件：
仪器：AB Sciex API2000串联式质谱
离子化模式：正离子模式电喷射
扫描类型：Q1MS
样品插入模式：HPLC
柱：Phenomenex HILIC250×4.6mm
液流：等度(isocratic)(水-乙腈22:78)
流速：1ml/分钟
进样体积：5μl
结果：
受体：Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-O-Bn，产物：单岩藻糖基化的Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-O-Bn，正确的分子量经LC-MS确认(944[M+H]+,961[M+NH4]+,966[M+Na]+)，
受体：Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-O-Bn，产物：单岩藻糖基化的Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-O-Bn，正确的分子量经LC-MS确认(944[M+H]+,961[M+NH4]+,966[M+Na]+)。
实施例5
使用3-FL作为供体的岩藻糖基化
一般程序：在pH=7.0的温育缓冲液KHPO4(100mM)中，将作为供体的3-FL(200mM)和作为受体的2'-FL(200mM)的溶液与来自长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697的重组岩藻糖苷酶Blon_2336一起温育。在30℃搅拌反应混合物30分钟。添加pH=10的1M NaHCO3溶液来使反应停止。用HPLC分析产物。
所检测到的产物：2',3-二岩藻糖基乳糖(用HPLC与参照标准样品2',3-二岩藻糖基乳糖进行比较，从而得到鉴定)
实施例6
使用3-SL作为供体的多受体唾液酸化
操作规程：在pH=7.0的温育缓冲液Tris-HCl(100mM)中，将作为供体的3-SL(75mM)和作为受体的3-FL、乳-N-四糖及乳-N-新四糖(各为25mM)的溶液与来自克氏锥虫的重组转唾液酸酶一起温育。在30℃搅拌反应混合物24小时。添加pH=10的1M NaHCO3溶液来使反应停止。使用参照标准物(对于SFL、LSTa、LSTd)，用HPLC和LC-MS来分析产物。
所检测到的产物：3'-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖，LSTa：Neu5Acα2-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，唾液酸化的乳-N-新四糖(LSTd)：Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，双唾液酸化的乳-N-四糖和/或双唾液酸化的乳-N-新四糖，正确的分子量经LC-MS确认(1290[M+H]+,1307[M+NH4]+,1328[M+K]+)。
实施例7
使用3-SL作为供体的多受体岩藻糖基化
操作规程：在pH=7.0的温育缓冲液KHPO4(100mM)中，将作为供体的3-岩藻糖基乳糖(200mM)和作为受体的乳-N-四糖-β-OBn及乳-N-新四糖-β-OBn(各100mM)的溶液与来自长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697的重组岩藻糖苷酶Blon_2336一起温育。在30℃搅拌反应混合物30分钟。用HPLC和LC-MS分析产物。
所检测到的产物：岩藻糖基化的乳-N-四糖-(β)-OBn，岩藻糖基化的乳-N-新四糖-(β)-OBn(β)。
实施例8
使用多种供体和酶的LNT糖基化
操作规程：在第一次循环中，在pH=7.0的温育缓冲液KHPO4(100mM)中，将作为供体的3'-唾液酸基乳糖(100mM)和作为受体的乳-N-四糖(200mM)的溶液与来自克氏锥虫的重组转唾液酸酶一起温育。在30℃搅拌反应混合物24小时。
在第二次循环中，添加200mM2'-岩藻糖基乳糖和来自海栖热袍菌的重组转岩藻糖苷酶M3，之后在30℃将所得的反应混合物再温育24小时。
在第三次循环中，添加100mM3-岩藻糖基乳糖和来自长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697的重组岩藻糖苷酶Blon_2336，之后在30℃将所得的反应混合物再温育30分钟。添加pH=10的1M NaHCO3溶液来使反应停止，并用HPLC、LC-MS和LC-MS-MS来分析产物。
LC-MS条件：
仪器：AB Sciex API2000串联式质谱
离子化模式：正离子模式电喷射
扫描类型：Q1MS
样品插入模式：HPLC
柱：TSK Gel Amide80(Tosoh,3μm,150×4.6mm)
洗脱液：10mM甲酸铵缓冲液(pH=6)-乙腈：30%/70%
流速：1ml/分钟
进样体积：5μl
结果：
实施例9
使用多种供体和酶的LNnT糖基化
操作规程：在第一次循环中，在pH=7.0的温育缓冲液KHPO4(100mM)中，将作为供体的3'-唾液酸基乳糖(100mM)和作为受体的乳-N-新四糖(200mM)的溶液与来自克氏锥虫的重组转唾液酸酶一起温育。在30℃搅拌反应混合物24小时。
在第二次循环中，添加200mM2'-岩藻糖基乳糖和来自海栖热袍菌的重组转岩藻糖苷酶M3，之后将所得的反应混合物再温育24小时。
在第三次循环中，添加100mM3-岩藻糖基乳糖和来自长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697的重组岩藻糖苷酶Blon_2336，之后将所得的反应混合物再温育30分钟。添加pH=10的1M NaHCO3溶液来使反应停止，并用HPLC和LC-MS来分析产物。
结果(HPLC条件见实施例8)：
保留时间 分子量(道尔顿) MS/MS中的MH+的主要片段离子的质量
(分钟) (道尔顿)
6.4 633
7.0 342
11.5 998(唾液酸基LNnT) 657,546,454,366,292,274,204,197,138
17.0 707
19.8 853(岩藻糖基LNnT I)
25.7 853(岩藻糖基LNnT II) 512,366,204,186,138
实施例10
使用3-FL作为供体的岩藻糖基化
一般程序：在pH=7.0的温育缓冲液KHPO4(100mM)中，将作为供体的3-FL(200mM)和作为受体的LNT(200mM)的溶液与来自长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697的重组岩藻糖苷酶Blon_2336一起温育。在30℃搅拌反应混合物30分钟。添加pH=10的1M NaHCO3溶液来使反应停止。用HPLC分析产物。
所检测到的产物：岩藻糖基化的LNT(HPLC条件见实施例8)
实施例11
使用3-FL作为供体的岩藻糖基化
一般程序：在pH=7.0的温育缓冲液KHPO4(100mM)中，将作为供体的3-FL(200mM)和作为受体的LNnT(200mM)的溶液与来自长双歧杆菌婴儿亚种ATCC15697的重组岩藻糖苷酶Blon_2336一起温育。在30℃搅拌反应混合物30分钟。添加pH=10的1M NaHCO3溶液来使反应停止。用HPLC分析产物。
所检测到的产物：岩藻糖基化的LNnT(HPLC条件见实施例8)
实施例12
制造苄基/具有取代基的苄基糖苷
A)苄基/具有取代基的苄基乳糖苷
A1)一般程序：在室温下，将乳糖(5g，14.6mmol)和TsOH·H2O(0.2g，1.05mmol)作为一份添加到DMF(20ml)与苯甲醛二甲缩醛(5.5ml，35.4mmol，2.4当量)的混合物中。在排除湿气的情况下于70℃强烈搅拌反应混合物1小时。冷却后，添加三乙胺(0.15ml)，随后在真空下除去挥发性组分(MeOH、三乙胺、残留的苯甲醛二甲缩醛)。向反应混合物中添加苄溴衍生物(1.5当量)(如果该试剂为固体，则预先将其溶解在5～10ml DMF中)，历时20分钟使该混合物冷却到0℃。仍在冷却条件下，加入一份NaH(0.8g的在矿物油中的55%悬浮液，1.3当量)，在冷却条件下搅拌混合物直至氢停止形成为止，随后在室温下搅拌2～3小时。小心加入甲醇(2ml)，并将反应物再搅拌5分钟。使反应混合物在100ml DCM和100ml水之间分相，并进行萃取。用100mlDCM反萃取水层两次。将合并的有机相蒸干；将残留物溶解在100ml乙腈中，并用100ml己烷进行萃取。蒸馏除去乙腈，将残留物溶解在50℃的异丙醇(10ml)和异丙醚(50ml)中。用时2～12小时将澄清溶液冷却至-20℃。过滤出所获得的晶体，用TBME洗涤两次，并干燥。可以从TBME(约50ml)和乙醇(约20ml)的混合物中进行重结晶。
4-氯苄基4',6'-O-苯亚甲基-β-乳糖苷
产量：1.71g
4-甲基苄基4',6'-O-苯亚甲基-β-乳糖苷
产量：3.20g
3-苯基苄基4',6'-O-苯亚甲基-β-乳糖苷
产量：2.70g
2-萘基甲基4',6'-O-苯亚甲基-β-乳糖苷
产量：1.77g
B1)在室温下将TFA添加到在甲醇中的一种上述苯亚甲基缩醛(500mg)和水(0.5ml)的混合物中，在排除湿气的情况下搅拌反应混合物2～4小时，随后蒸干。将剩余的物质与乙醇共蒸发3～4次得到粗制固体，该固体在干燥后可以从甲醇(约10ml～35ml)和水(约0～2ml)的混合物中重结晶。
4-氯苄基β-乳糖苷
产量：333mg
13C-NMR(75.1MHz,D2O):δ=135.25,133.67,130.30,128.70,103.00,101.13,78.39,75.44,74.89,74.49,72.88,72.58,71.03,70.83,68.62,61.11,60.13。
4-甲基苄基β-乳糖苷
产量：439mg
13C-NMR(75.1MHz,D2O):δ=138.91,133.50,129.37,129.07,103.01,100.96,78.43,75.44,74.87,74.52,72.90,72.59,71.47,71.03,68.63,61.11,60.17,20.34。
3-苯基苄基β-乳糖苷
产量：438mg
13C-NMR(75.1MHz,d6-DMSO/d4-MeOH/D2O8:1:1):δ=140.29,140.24,138.88,129.13,129.02,127.66,126.88,126.83,126.03,125.90,103.95,102.03,80.76,75.65,75.07,75.00,73.34,73.28,70.66,69.81,68.27,60.56。
2-萘基甲基β-乳糖苷
产量：378mg
13C-NMR(75.1MHz,D2O/d6-DMSO):δ=134.96,133.24,133.12,128.59,128.31,128.08,127.46,126.98,126.90,126.79,103.26,101.59,78.89,75.62,75.09,74.81,73.14,72.81,71.33,71.14,68.75,61.22,60.39。
B)Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-O-Bn(1-O-苄基-β-LNT)可以按照A.Malleron等，Carbohydr.Res.341,29(2006)来制备。
C)Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-O-Bn(1-O-苄基-β-LNnT)可以按照WO2011/100980来制备。
D)唾液酸化和/或岩藻糖基化的乳糖的苄基/具有取代基的苄基糖苷、LNT或LNnT可以根据WO2012/007585通过端基异构烷基化来制备。

Claims (25)

1.一种制备一种或多种人乳寡糖或人乳寡糖的R-糖苷或者与人乳寡糖或人乳寡糖的R-糖苷结构相似的寡糖的方法，所述人乳寡糖或人乳寡糖的R-糖苷或者与人乳寡糖或人乳寡糖的R-糖苷结构相似的寡糖如下所定义：
—通式1：
其中，
R是能够被氢解除去的基团，该基团是苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基，所述苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基各自不具有取代基或取代有选自下述基团中的一个或多个基团：烷基、烷氧基、苯基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硝基、羧基、烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-烷基氨基甲酰基、N,N-二烷基氨基甲酰基、叠氮基、卤代烷基或卤素，
R1是岩藻糖基或H，
R2选自N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基，其中所述N-乙酰基氨基乳糖基带有包含一个或多个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个或多个乳-N-二糖基的糖基残基或不带有糖基残基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基不具有取代基或取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基，
R3是H或N-乙酰基氨基乳糖基，所述N-乙酰基氨基乳糖基不具有取代基或取代有包含一个或多个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个或多个乳-N-二糖基的糖基残基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基不具有取代基或取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基；
—通式2：
其中，
R是能够被氢解除去的基团，该基团是苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基，所述苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基各自不具有取代基或取代有选自下述基团中的一个或多个基团：烷基、烷氧基、苯基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硝基、羧基、烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-烷基氨基甲酰基、N,N-二烷基氨基甲酰基、叠氮基、卤代烷基或卤素，
R1各自独立地为岩藻糖基或H，
R4各自独立地为唾液酸基或H，
前提是，R1或R4中的至少一个不是H；
—通式3：
其中，
R1是岩藻糖基或H，
R2选自N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基，其中所述N-乙酰基氨基乳糖基带有包含一个或多个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个或多个乳-N-二糖基的糖基残基或不带有糖基残基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基不具有取代基或取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基，
R3是H或N-乙酰基氨基乳糖基，所述N-乙酰基氨基乳糖基不具有取代基或取代有包含一个或多个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个或多个乳-N-二糖基的糖基残基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基不具有取代基或取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基；和/或
—通式4：
其中，
R1各自独立地为岩藻糖基或H，
R4各自独立地为唾液酸基或H，
前提是，R1或R4中的至少一个不是H；
所述方法包括以下步骤：
a)提供选自由以下物质组成的组的至少一种化合物或化合物混合物：
—通式2的可选地唾液酸化和/或岩藻糖基化的乳糖衍生物及其盐：
其中，
R是能够被氢解除去的基团，该基团是苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基，所述苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基各自不具有取代基或取代有选自下述基团中的一个或多个基团：烷基、烷氧基、苯基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硝基、羧基、烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-烷基氨基甲酰基、N,N-二烷基氨基甲酰基、叠氮基、卤代烷基或卤素，
R1各自独立地为岩藻糖基或H，
R4各自独立地为唾液酸基或H，
前提是，如果仅提供一种化合物，通式2的化合物不是乳糖的R-糖苷；
—通式4的可选地唾液酸化和/或岩藻糖基化的乳糖衍生物及其盐：
其中，
R1各自独立地为岩藻糖基或H，
R4各自独立地为唾液酸基或H，
前提是，如果仅提供一种化合物，通式4的化合物不是乳糖；
—乳-N-四糖：
—下式的乳-N-四糖衍生物：
其中，R是能够被氢解除去的基团，该基团是苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基，所述苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基各自不具有取代基或取代有选自下述基团中的一个或多个基团：烷基、烷氧基、苯基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硝基、羧基、烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-烷基氨基甲酰基、N,N-二烷基氨基甲酰基、叠氮基、卤代烷基或卤素；
—乳-N-新四糖：
—下式的乳-N-新四糖衍生物：
其中，R是能够被氢解除去的基团，该基团是苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基，所述苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基各自不具有取代基或取代有选自下述基团中的一个或多个基团：烷基、烷氧基、苯基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硝基、羧基、烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-烷基氨基甲酰基、N,N-二烷基氨基甲酰基、叠氮基、卤代烷基或卤素；
b)向按照步骤a)提供的所述至少一种化合物或化合物混合物中添加至少一种酶，所述至少一种酶是转岩藻糖苷酶、转唾液酸酶、转乳-N-二糖苷酶和/或转N-乙酰基氨基乳糖苷酶；
c)温育按照步骤b)得到的混合物；
d)在步骤a)仅提供了两种化合物且其中一种是3'-唾液酸基乳糖并且在步骤b)中添加的所述酶是转唾液酸酶时，重复进行至少步骤a)和c)或者步骤b)和c)；
e)可选地对按照步骤c)或d)获得的混合物重复进行至少步骤a)和c)或者步骤b)和c)；
f)可选地使在步骤c)、d)或e)后得到的混合物进行氢解反应。
2.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤d)中，在步骤a)仅提供了两种化合物且其中一种是通式2或4的唾液酸化的乳糖衍生物并且在步骤b)中添加的所述酶是转唾液酸酶时，重复进行至少步骤a)和c)或者步骤b)和c)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述化合物混合物包含至少两种不同的如步骤a)所定义的化合物。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，提供了两种不同的具有转糖苷酶活性的酶。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述化合物或酶为同时加入或依次加入。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种酶是α-转岩藻糖苷酶、α-转唾液酸酶、β-转乳-N-二糖苷酶和/或β-转N-乙酰基氨基乳糖苷酶。
7.如权利要求1所述的方法，其中，式1和2的化合物进一步以通式1a、1b或2或其盐为特征：
并且式3和4的化合物进一步以通式3a、3b或4或其盐为特征：
其中，
R、R1和R4的定义同权利要求1，
R2a是可选地取代有包含一个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个乳-N-二糖基的糖基残基的N-乙酰基氨基乳糖基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基不具有取代基或取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基，
R3a是H或可选地取代有乳-N-二糖基的N-乙酰基氨基乳糖基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基不具有取代基或取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基，
R2b是可选地取代有唾液酸基和/或岩藻糖基残基的乳-N-二糖基，
R3b是H或N-乙酰基氨基乳糖基，该N-乙酰基氨基乳糖基可选地取代有一个或两个N-乙酰基氨基乳糖基和/或一个乳-N-二糖基；任何N-乙酰基氨基乳糖基和乳-N-二糖基不具有取代基或取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基。
8.如权利要求7所述的方法，其中，
—通式1a或3a中的R2a的糖基残基中的N-乙酰基氨基乳糖基通过1-3糖苷间键与另一N-乙酰基氨基乳糖基连接，
—通式1a或3a中的R2a的糖基残基中的乳-N-二糖基通过1-3糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基连接，
—通式1a或3a中的R3a的糖基残基中的乳-N-二糖基通过1-3糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基连接，
—通式1b或3b中的R3b的糖基残基中的N-乙酰基氨基乳糖基通过1-3或1-6糖苷间键与另一N-乙酰基氨基乳糖基连接，和/或
—通式1b或3b中的R3b的糖基残基中的乳-N-二糖基通过1-3糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基连接。
9.如权利要求7所述的方法，其中，通式1a表示乳-N-新四糖、对乳-N-六糖、对乳-N-新六糖、乳-N-新六糖、对乳-N-八糖和乳-N-新八糖的R-糖苷，其可选地取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基；通式1b表示乳-N-四糖、乳-N-六糖、乳-N-八糖、异乳-N-八糖、乳-N-十糖和乳-N-新十糖的R-糖苷，其可选地取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基；通式3a表示乳-N-新四糖、对乳-N-六糖、对乳-N-新六糖、乳-N-新六糖、对乳-N-八糖和乳-N-新八糖，其可选地取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基；通式3b表示乳-N-四糖、乳-N-六糖、乳-N-八糖、异乳-N-八糖、乳-N-十糖和乳-N-新十糖，其可选地取代有一个或多个唾液酸基和/或岩藻糖基残基。
10.如权利要求7所述的方法，其中，
—连接在N-乙酰基氨基乳糖基和/或乳-N-二糖基上的岩藻糖基残基
·以1-2糖苷间键与乳-N-二糖基的半乳糖连接，和/或
·以1-4糖苷间键与乳-N-二糖基的N-乙酰基氨基葡萄糖连接，和/或
·以1-3糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基的N-乙酰基氨基葡萄糖连接，
—连接在N-乙酰基氨基乳糖基和/或乳-N-二糖基上的唾液酸基残基
·以2-3糖苷间键与乳-N-二糖基的半乳糖连接，和/或
·以2-6糖苷间键与乳-N-二糖基的N-乙酰基氨基葡萄糖连接，和/或
·以2-6糖苷间键与N-乙酰基氨基乳糖基的半乳糖连接。
11.如权利要求7所述的方法，其中，所述化合物选自以下物质组成的组：2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2',3-二岩藻糖基乳糖、3'-唾液酸基乳糖、6'-唾液酸基乳糖、3'-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、LNFP-I、LNFP-II、LNFP-III、LNFP-V、LST-a、LST-b、LST-c、FLST-a、FLST-b、FLST-c、LNDFH-I、LNDFH-II、LNDFH-III、DS-LNT、FDS-LNT I和FDS-LNT II的R-糖苷，以及它们的盐。
12.如权利要求7所述的方法，其中，所述R-糖苷是β-端基异构体。
13.如权利要求12所述的方法，其中R是苄基。
14.如权利要求7所述的方法，其中，所述化合物选自以下物质组成的组：2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2',3-二岩藻糖基乳糖、3'-唾液酸基乳糖、6'-唾液酸基乳糖、3'-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、LNFP-I、LNFP-II、LNFP-III、LNFP-V、LST-a、LST-b、LST-c、FLST-a、FLST-b、FLST-c、LNDFH-I、LNDFH-II、LNDFH-III、DS-LNT、FDS-LNT I和FDS-LNT II，以及它们的盐。
15.如权利要求1或2所述的方法，其中，步骤a)包括：
提供以通式5为特征的至少一种化合物或化合物混合物：
R'独立地为岩藻糖基或H，前提是至少一个R'是岩藻糖基，
R*是能够被氢解除去的基团，所述能够被氢解除去的基团是苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基，所述苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基各自不具有取代基或取代有选自下述基团中的一个或多个基团：烷基、烷氧基、苯基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硝基、羧基、烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-烷基氨基甲酰基、N,N-二烷基氨基甲酰基、叠氮基、卤代烷基或卤素，或R*是H，并且
可选地提供选自由以下物质组成的组的至少一种化合物或化合物混合物：
—通式6的可选地唾液酸化的乳糖衍生物及其盐：
其中，
R*是能够被氢解除去的基团，所述能够被氢解除去的基团是苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基，所述苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基各自不具有取代基或取代有选自下述基团中的一个或多个基团：烷基、烷氧基、苯基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硝基、羧基、烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-烷基氨基甲酰基、N,N-二烷基氨基甲酰基、叠氮基、卤代烷基或卤素，或R*是H，
R”各自独立地为唾液酸基或H，
—乳-N-四糖：
—下式的乳-N-四糖衍生物：
其中，R是能够被氢解除去的基团，该基团是苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基，所述苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基各自不具有取代基或取代有选自下述基团中的一个或多个基团：烷基、烷氧基、苯基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硝基、羧基、烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-烷基氨基甲酰基、N,N-二烷基氨基甲酰基、叠氮基、卤代烷基或卤素；
—乳-N-新四糖：
—下式的乳-N-新四糖衍生物：
其中，R是能够被氢解除去的基团，该基团是苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基，所述苄基、二苯基甲基、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基各自不具有取代基或取代有选自下述基团中的一个或多个基团：烷基、烷氧基、苯基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硝基、羧基、烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-烷基氨基甲酰基、N,N-二烷基氨基甲酰基、叠氮基、卤代烷基或卤素；
且其中，在步骤b)中，向按照步骤a)提供的所述至少一种化合物或化合物混合物中添加至少一种转岩藻糖苷酶。
16.如权利要求15所述的方法，其中，步骤a)包括：提供2'-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖，并且还另外提供一种选自由2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、3'-唾液酸基乳糖、6'-唾液酸基乳糖、LNT和LNnT组成的组的化合物。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中，温育产生了岩藻糖基化的人乳寡糖或人乳寡糖混合物。
18.如权利要求17所述的方法，温育产生了2',3-二岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基-3-唾液酸基乳糖、岩藻糖基化的LNT或岩藻糖基化的LNnT或者它们的混合物。
19.如权利要求1或2所述的方法，其中，使在温育步骤中获得的化合物进行氢解反应。
20.如权利要求1或2所述的方法，其中，对在温育步骤或氢解步骤中获得的化合物随后进行纯化。
21.如权利要求20所述的方法，其中，通过结晶或沉淀来进行所述化合物的纯化。
22.如权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括对步骤c)、d)或e)中获得的化合物进行喷射干燥的步骤。
23.如权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括将在温育或氢解步骤中获得的化合物添加到消耗品中。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述消耗品是药物制剂或营养制剂中的至少一种。
25.如权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括将药物可接受的载剂和/或益菌素添加到在温育步骤或氢解步骤中获得的化合物中。
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