CN102803282A - 用于制备含n-乙酰乳糖胺的四糖乳糖-n-新四糖(lnnt)的方法 - Google Patents

用于制备含n-乙酰乳糖胺的四糖乳糖-n-新四糖(lnnt)的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102803282A
CN102803282A CN2011800097783A CN201180009778A CN102803282A CN 102803282 A CN102803282 A CN 102803282A CN 2011800097783 A CN2011800097783 A CN 2011800097783A CN 201180009778 A CN201180009778 A CN 201180009778A CN 102803282 A CN102803282 A CN 102803282A
Authority
CN
China
Prior art keywords
general formula
compound
optional substituted
benzyl
acyl group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011800097783A
Other languages
English (en)
Inventor
伊什特万·鲍伊佐
久洛·戴卡尼
卡罗伊·阿戈什顿
伊格纳西奥·费格罗拉·佩雷斯
朱莉安·布泰
马库斯·赫德罗斯
费伦茨·霍瓦特
皮罗什卡·科瓦奇-彭泽什
拉斯·克罗杰
克里斯托夫·勒里希
安德烈亚斯·施罗温
扬尼斯·弗拉斯达斯
彼得·特林卡
拉斯洛·卡尔马尔
伊姆雷·科瓦奇
尚多尔·德姆科
阿格尼斯·阿戈什顿
克里斯蒂安·里辛格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Glycom AS
Original Assignee
Glycom AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Glycom AS filed Critical Glycom AS
Priority to CN201510751641.5A priority Critical patent/CN105330705A/zh
Publication of CN102803282A publication Critical patent/CN102803282A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/30—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols, e.g. xylitol; containing starch hydrolysates, e.g. dextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及用于尤其是大规模制备四糖乳糖-N-新四糖(LNnt，式(I))、以及合成中的中间体、LNnt的新晶形(多晶型物)、以及它们在药物或营养组合物中的用途。

Description

用于制备含N-乙酰乳糖胺的四糖乳糖-N-新四糖(LNNT)的方法
技术领域
本发明涉及用于制备、尤其是大规模制备Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc(LNnT)的方法，以及LNnT的中间体和新晶形(多晶型物)。
背景技术
在过去数十年间，对人乳寡糖(人乳低聚糖，HMO)的制备和商业化的兴趣持续增加。HMO的重要性直接与其独特的生物学活性如抗菌、抗病毒、免疫系统和认知发育增强活性相关。
四糖Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc(乳糖-N-新四糖，LNnT，方案1)是存在于人乳中的寡糖之一(Kuhn等，Chem.Ber.1962，95，513和518，Kobata Methods Enzymol.1972，28，262]。LNnT充当肺炎双球菌(pneumococci)的细菌受体并且发现它可用于识别糖基转移酶的受体特异性、糖苷酶的底物特异性以及抗原决定簇的结构。此外，LNnT代表具有各种生理活性的糖脂和糖蛋白(拟红细胞糖苷酯(paragloboside)、6-唾液基-LNnT等)中的更复杂寡糖的核心结构元件。
方案1，乳糖-N-新四糖，LNnT
迄今，还不可能通过使用分离、生物技术和合成方法得到大量的LNnT。由于存在大量类似寡糖，所以即使以毫克量从人乳中分离LNnT也相当困难。
LNnT的酶合成包括在半乳糖基转移酶存在下将乳糖-N-丙糖II用UDP-半乳糖孵育[Sabesan等J.Am.Chem.Soc.1986，108，2068；EP-A-870841]或在β-D-半乳糖苷酶存在下用乳糖孵育[Murata等Glycoconj.J.1999，16，189；JP 10-234394A]。与固体载体结合的合适三糖的酶促半乳糖苷化也作了详细描述[Blixt等Carbohydr.Res.1999，319，80；Renaudie等ibid.2004，339，693]。这些复杂的酶促系统代表用于LNnT的大规模生产的非常昂贵的方法和困难的纯化方案。
公开的针对LNnT的总的合成程序[Zurabyan等Soviet J.Bioorg.Chem.1978，4，679；Paulsen等Carbohydr.Chem.1987，169，105；Aly等ibid.1999，316，121]包括多个反应步骤、保护基操作和色谱法纯化、低产率，并且仅提供毫克量的LNnT，因此它们对于大规模制备没有提供引人注意的技术。作为拟红细胞糖苷酯的苄基类似物的1-O-苯基-LNnT的合成也已公开[Ponpipom等Tetrahedron Lett.1978，20，1717]。
当从天然来源分离[Kuhn等Chem.Ber.1962，95，513]或通过酶方法[EP-A-1405856]制备时，LNnT被表征为晶体物质。
对于LNnT和用于它的中间体，仍然需要可以简化迄今为止想到的分离、纯化和制备问题的晶体产品。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种用于制备Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc(LNnT)的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使由通式5表征的供体
Figure BDA00002020133300021
通式5
其中R4是任选取代的酰基，
-NR5R6选自-NAc2、-NH-卤代酰基、苯邻二甲酰亚胺、四氯苯邻二甲酰亚胺、2，3-二苯基马来酰亚胺和2，3-二甲基马来酰亚胺，
X选自卤素、-OC(＝NH)CCl3、-OAc、-OBz和-SR7，其中R7选自烷基和任选取代的苯基，
与通式6的受体发生反应
通式6
其中R1是通过催化氢解可去除的基团，
R2是任选取代的酰基，而
R3选自任选取代的酰基或H，
从而产生通式4的化合物
Figure BDA00002020133300032
通式4
其中R1、R2、R3、R4和-NR5R6是如上所定义的，
b)将通式4的化合物转化为通式1的化合物
Figure BDA00002020133300033
通式1
其中R1是如上所定义的，
c)使所述通式1的化合物结晶，以及
d)随后使所述通式1的化合物经过催化还原。
本发明的第二方面提供Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc(LNnT)的一种多晶型物。
本发明的第三方面涉及Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc(LNnT)的多晶型物，其用作药物试剂。
本发明的第四方面提供Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc(LNnT)的多晶型物，其用作营养添加剂。
本发明的第五方面涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc的多晶型物。
本发明的第六方面提供一种营养组合物，所述营养组合物包含Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc的多晶型物。
本发明的第七方面涉及通式1’的化合物
Figure BDA00002020133300041
通式1’
其中R’1选自取代苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基。
本发明的第八方面提供通式2’的化合物
通式2’
其中R’1选自取代苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基。
本发明的第九方面涉及通式3的化合物
通式3
其中R1选自任选取代的苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基，而-NR5R6选自-NH-卤代酰基，苯邻二甲酰亚胺，四氯苯邻二甲酰亚胺，2，3-二苯基马来酰亚胺和2，3-二甲基马来酰亚胺。
本发明的第十方面提供通式4’的化合物
Figure BDA00002020133300044
通式4’
其中R1选自任选取代的苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基，并且R2和R4各自独立地是任选取代的酰基，R3选自任选取代的酰基和H，-NR5R6选自-NAc2，-NH-卤代酰基，四氯苯邻二甲酰亚胺，2，3-二苯基马来酰亚胺和2，3-二甲基马来酰亚胺。
本发明的第十一方面涉及通式4a的化合物
通式4a
其中R1选自任选取代的苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基。
本发明的第十二方面提供通式5’的化合物
Figure BDA00002020133300052
通式5’
其中R4是任选取代的酰基，优选乙酰基，-NR5R6是-NH-卤代酰基，优选-NH-三氯乙酰基或-NH-三氟乙酰基，并且R7是任选取代的苯基，优选苯基。
本发明的第十三方面涉及通式6’的化合物
Figure BDA00002020133300053
通式6’
其中R1选自任选取代的苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基，R2是任选取代的苯甲酰基，并且R3选自任选取代的酰基和H。
附图说明
下文中将参考附图进一步详细地描述本发明，其中：
图1显示根据实施例34制备的晶体LNnT的X射线粉末衍射图。
图2显示根据34和EP-A-1405856制备的晶体LNnT的X射线粉末衍射图的比较(连续曲线：根据实施例34制备的晶体LNnT的衍射图；垂直线：取自EP-A-1405856的数据)。
图3显示根据实施例34制备的晶体LNnT的固态13C-NMR谱图。
具体实施方式
在本说明书通篇中，术语“烷基”，单独地或与另一种原子或基团连接时，指具有1-6个碳原子的直链或支链烃基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等。
在本申请中，术语“芳基”指同芳香性基团如苯基或萘基。优选地，芳基指苯基。
在本说明书中，术语“酰基”表示R-C(＝O)-，其中R可以是H、烷基或芳基，如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、新戊酰基、苯甲酰基等。所述烷基和芳基残基都可以被取代。
对于本说明书及权利要求的目的，术语“任选取代的”指目标基团可以带有取代基或可以是未被取代的。
对于本说明书及权利要求的目的，术语“取代的”指目标基团被通常改变链或环的总体化学特性的基团取代。取代基可以被用于改变分子作为整体的性质，如稳定性、可溶性和形成晶体的能力。本领域技术人员将知道可以在给定情形下用作备选方案的具有相似大小和电荷特性的其他合适取代基。
更通常地，与术语“烷基”、“芳基”和“酰基”结合时，术语“任选取代的”意在表示目标基团可以被选自以下的基团取代一次或多次，优选1-5次，更优选1-3次：烷基(仅对芳基和芳族酰基)、羟基、烷氧基(即烷基-氧基)、羧基、氧代(形成酮或醛官能度)、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基氨基、芳基羰基、氨基、单和二烷基氨基、氨基甲酰基、单和二烷基-氨基羰基、烷基羰基氨基、氰基、烷酰氧基、硝基、烷硫基和卤素(F、Cl、Br、I)。
表述“通过催化氢化可去除的基团”指这样的基团，所述基团的C-O键在已知用于氢解的催化量钯、阮内镍或另一种适当金属催化剂存在下通过加入氢而裂解，导致产生OH基团。此类基团是技术人员熟知的并且被充分讨论的[例如P.G.M.Wuts和T.W Greene：Protective Groups in OrganicSynthesis(有机合成中的保护基团)，John Wiley&Sons(2007)]。合适的基团包括苄基、二苯基甲基(二苯甲基)、1-萘甲基、2-萘甲基或三苯基甲基(三苯甲基)，它们各自可以被选自以下的一个或多个基团任选取代：烷基、烷氧基、苯基、氨基、酰基氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硝基、羧基、烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-烷基氨基甲酰基、N，N-二烷基氨基甲酰基、叠氮基、卤代烷基或卤素。优选地，如果存在，这样的取代在芳环上。尤其优选的保护基是被选自烷基或卤素的一个或多个基团任选取代的苄基。更优选地，保护基选自未取代的苄基、4-氯苄基和4-甲基苄基。这些尤其优选的和更优选的保护基的优势在于：氢解的副产物只有甲苯或取代甲苯。即使在数吨规模中，这样的副产物也可以经由蒸发和/或萃取过程容易地从水溶性寡糖产物中除去。
结合基团-NR5R6中的-NH-卤代酰基，术语“卤代酰基”指式CnHxXy-C(＝O)-的卤代酰基，其中整数n是1、2或3，x+y＝2n+1，前提是x＜y，并且X是F、Cl和Br，如二氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、七氟丁酰基等。
本发明代表一种适用于LNnT的大规模制备的商业方法，即典型地用制备成批的至少1kg的LNnT，如至少5kg，或至少50kg，或甚至至少200kg，例如至少1吨的LNnT。成功的策略是基于引入相关的允许简单且可靠的纯化方法的晶体中间体。结晶或再结晶是从污染物分离产物并获得纯物质的最简单和廉价的方法之一。此外，在产品开发中，提供固体的一种或多种晶体变体(多晶型物)是一个重要的因素，因为不同的晶形不同地影响化合物的性质，例如热力学稳定性、可溶性、密度、吸湿性、电性质(如介电常数，电导率)、机械性质(如易碎性、硬度、抗断强度、弹性)、光学性质(如颜色、透明度、折射)等。它扩大了科学人员拥有的可用于改善产品特性的物质的技能。
本发明在第一方面提供了用于制备Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使由通式5表征的供体
Figure BDA00002020133300071
通式5
-NR5R6选自-NAc2，-NH-卤代酰基，苯邻二甲酰亚胺，四氯苯邻二甲酰亚胺，2，3-二苯基马来酰亚胺和2，3-二甲基马来酰亚胺，
X选自卤素，-OC(＝NH)CCl3，-OAc，-OBz和-SR7，其中R7选自烷基和任选取代的苯基，
与通式6的受体反应
Figure BDA00002020133300081
通式6
其中R1是通过催化氢解可去除的基团，
R2是任选取代的酰基并且
R3选自任选取代的酰基或H，
从而产生通式4的化合物
通式4
其中R1、R2、R3、R4和-NR5R6是如上所定义的，
b)将通式4的化合物转化为通式1的化合物
Figure BDA00002020133300083
通式1
其中R1是如上所定义的，
c)使通式1的化合物结晶，以及
d)随后使通式1的化合物经过催化还原。
关于步骤a)，根据通式4的经充分保护的LNnT衍生物在糖基化条件下在通式5的化合物(供体)与通式6的化合物(受体)的反应中合成。
通式6的乳糖受体与通式5的乳糖氨基供体的偶联可以在活化剂(促进剂或催化剂)的存在下在非质子溶剂或非质子溶剂的混合物中进行以导致所需的糖基化产物。新的糖苷间键合通过以下方式形成：用根据通式6的受体的3’-OH基团亲核取代根据通式5的供体的离去基团X。两个参与反应的反应物中的其他官能团需要用保护基屏蔽。此外，本发明的发明人意识到区域选择性糖基化可以在其中R3是H的通式6的受体上实现。在这样的二羟基受体中，平伏的3’-OH和轴向的4’-OH的反应性是不同的：平伏的OH基团在糖基化条件下可以充当更强的亲核体。因此，通过仔细地选择条件如供体反应性、溶剂、温度、促进剂性质、反应物/促进剂的添加方式等，可以推动反应以形成所需的1-3糖苷间键合而不是1-4偶联。对于立体选择性尤其需要注意。立体化学结果可能受到诸如以下的不同因素影响：供体C-2处是否存在参与基团，离去基团X的性质，溶剂效应，供体和受体两者上的保护基的性质，促进剂或催化剂的性质，温度，压力，供体和受体之间的空间相互作用等。在葡糖氨基或乳糖氨基衍生物的情况中，开发了一系列糖基化的异头活化并且其对于糖化学领域技术人员是可用的。这些方法通过综述和手册被广泛讨论，例如Demchenko(Ed.)：Handbook of Chemical Glycosylation(化学糖基化手册)，Wiley(2008)。为了实施例，取决于X基团，以下简要提及一些总的考虑。
糖基卤化物(X指F、Cl、Br、I)经常被用于糖基化反应，原因在于其容易的可及性和令人满意的反应性。典型地，对于亲核取代，异头卤化物遵循F＜Cl＜Br＜I的反应性次序。糖基化反应通常通过重金属离子，主要是汞或银，以及路易斯酸促进。
糖基三氯乙酰亚胺酯(X＝-OC(＝NH)CCl3)可以容易地通过在无机或有机碱催化下将游离的异头OH添加到三氯乙腈来制备。在典型的糖基化反应中，催化量的路易斯酸如三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸盐或BF3-醚合物促进偶联。
糖基化反应中的糖基乙酸酯或苯甲酸酯(X表示-OAc或-OBz)首先经历亲电子活化，提供反应性中间体，然后用亲核OH受体处理。选择的典型活化剂是布朗斯台德酸(如TsOH、HClO4、氨基磺酸)、路易斯酸(如ZnCl2、SnCl4、三氟甲磺酸盐、BF3-醚合物、三苯甲基高氯酸盐、AlCl3、三氟甲磺酸酐)和它们的混合物。
硫苷(X表示烷硫基或苯硫基)可以由以下活化：亲硫促进剂如汞(II)盐、Br2、I2、NBS、NIS、三氟甲磺酸、三氟甲磺酸盐、BF3-醚合物、三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸盐、三氟甲磺酸二甲基-甲硫基锍、苯基硒基三氟甲磺酸盐、高氯酸双可力丁碘、碘化四丁基铵或其混合物，在缩合反应中，优选由Br2、NBS、NIS和三氟甲磺酸盐活化。
在优选实施方案中，糖基供体是通式5的化合物，其中R4是任选取代的酰基，-NR5R6是-NH-卤代酰基并且X是-SR7，其中R7选自任选取代的烷基或任选取代的苯基；更优选R7是任选取代的苯基；甚至更优选R4是乙酰基，-NR5R6选自-NH-三氯乙酰基和-NH-三氟乙酰基，R7是苯基并且-SR7为β型。糖基化在非质子溶剂如氯仿、二氯甲烷、甲苯、二烷、THF、乙腈或其混合物(优选氯仿或二氯甲烷)中，在NIS、NBS、Br2、三氟甲磺酸、三氟甲磺酸银、BF3-醚合物或其混合物的活化下进行。
在进一步优选的实施方案中，糖基受体是通式6的化合物，其中R1是任选取代的苄基并且R3选自H和任选取代的苯甲酰基；更优选R1是苄基，R2是被氯任选取代的苯甲酰基并且R3选自H和任选被氯取代的苯甲酰基，并且OR1为β型。
由通式5表征的供体可以通过本领域已知的常规方法制备。一种方法可以隐含受保护的葡糖胺硫苷的半乳糖苷化[例如Sherman等Carbohydr.Res.2001，336，13]，或甲基氨基葡糖苷衍生物的半乳糖苷化[例如Kochetkov等Tetrahedron(四面体)1987，43，3109]。另一种途径是基于通过以下两种方法的对D-呋喃葡烯糖-5-半乳糖苷六乙酸酯的双键的衍生化：通过叠氮基硝化后对2-叠氮基的还原以及随后的对形成的胺的保护和在异头碳上的硝酸盐-卤化物交换[例如Lemieux等Can.J.Chem.1982，60，63]，或通过亚硝基氯化后对形成的肟的乙酰化和乙硼烷还原[例如Ponpipom等Tetrahedron Lett.1978，20，1717]，所述两种方法都导致产生受保护的乳糖氨基卤化物。乳糖胺的功能化也是可以想到的(O-乙酰化后，胺保护和异头乙酸酯-卤素互相转换)。通过从卤化物[例如Sherman等Carbohydr.Res.2001，336，13]或从乙酸酯[例如Sato等Tetrahedron Lett.1988，29，4759]形成硫苷，可以设想的其他异头活化。另一种经常使用的糖基供体是三氯乙酰亚胺酯[例如Sato等Tetrahedron Lett.1988，29，4759]，而乳糖氨基氟化物(从相应的糖基叠氮化物合成)作为供体的应用也被公开[例如
Figure BDA00002020133300102
等Carbohydr.Res.1993，249，221]。以上提及的文献实例仅是非限制性地举例说明某些可能的路径，并且本领域技术人员能够将它们结合从而获得由通式5表征的所需的实施方案。
通式6的化合物可以通过以下操作获得。由常用的八-O-乙酰乳糖或七-O-乙酰乳糖溴化物开始，在路易斯酸(例如汞盐，BF3-醚合物)活化下，利用R1OH可以形成相应的乳糖苷。通过去-O-乙酰化(例如Zemplén-去保护、氨解或碱性水解)后，在酸催化剂的存在下利用二甲氧基丙烷的区域选择性丙酮化，可以获得3’，4’-保护的乳糖苷，然后在通常条件下利用R2-卤化物或(R2)2O(酸酐)将其酰化。可以利用酸将所得的衍生物水解从而去除异亚丙基，产生二醇(通式6的化合物，其中R3是OH)，其利用衍生自R3OH的原酸酯处理。随后用酸催化剂将由此获得的环状原酸酯重排成通式6的另一个化合物，其中R3是酰基[见例如Paulsen等Carbohydr.Res.1985，137，39；Lubineau等ibid.1997，305，501；以及其中引用的参考文献](方案2)。
Figure BDA00002020133300111
通式6
方案2
在本发明的第一方面的步骤b)中，通式4的化合物
Figure BDA00002020133300112
通式4
其中R1是通过催化氢解可去除的基团，R2和R4各自独立地是任选取代的酰基，R3选自任选取代的酰基或H，-NR5R6选自-NAc2、-NH-卤代酰基、苯邻二甲酰亚胺、四氯苯邻二甲酰亚胺、2，3-二苯基马来酰亚胺和2，3-二甲基马来酰亚胺)被转化为通式1的化合物，包括以下步骤：
ba)通式4的化合物的碱催化酯交换去保护或碱性水解，其中-NR5R6是-NAc2，从而产生通式1的化合物，或者
bb)通式4的化合物的碱催化酯交换去保护，其中-NR5R6选自-NH-卤代酰基、苯邻二甲酰亚胺、四氯苯邻二甲酰亚胺、2，3-二苯基马来酰亚胺和2，3-二甲基马来酰亚胺，从而产生通式3的化合物
Figure BDA00002020133300121
通式3
其中R1和-NR5R6是如上所定义的，该通式3的化合物经过碱性水解或氨解，从而产生通式2的化合物
Figure BDA00002020133300122
通式2
其中R1是如上所定义的，该通式2的化合物被转化为通式1的化合物，或者
bc)通式4的化合物的碱性水解，其中-NR5R6选自-NH-卤代酰基、2，3-二苯基马来酰亚胺和2，3-二甲基马来酰亚胺，从而产生通式2的化合物
Figure BDA00002020133300123
通式2
其中R1是如上所定义的，该通式2的化合物被转化为通式1的化合物，或者
bd)通式4的化合物的碱性水解，其中-NR5R6选自苯邻二甲酰亚胺和四氯苯邻二甲酰亚胺，接着进行氨解，从而产生通式2的化合物
Figure BDA00002020133300131
通式2
其中R1是如上所定义的，该通式2的化合物被转化为通式1的化合物，或者
be)通式4的化合物的氨解，其中-NR5R6选自-NAc2、-NH-卤代酰基、苯邻二甲酰亚胺、四氯苯邻二甲酰亚胺、2，3-二苯基马来酰亚胺和2，3-二甲基马来酰亚胺，从而产生通式2的化合物
Figure BDA00002020133300132
通式2
其中R1是如上所定义的，该通式2的化合物被转化为通式1的化合物。
术语“碱催化酯交换去保护”指这样的反应，其中来自羟基的酰基保护基在醇溶剂如甲醇、乙醇、丙醇、叔丁醇等中，在醇化物如NaOMe、NaOEt、KOtBu等存在下，在20-100℃温度下被除去。醇和醇化物应当匹配。助溶剂如甲苯或二甲苯的使用可能是有益的以便控制产物的粒度，以及避免凝胶形成。在此条件下，仅O-酰基可以被去保护，或者当R5和R6都是乙酰基时，酰基中的一个也被去除从而产生具有-NHAc取代基的化合物。在碱催化酯交换去保护的条件下，-NH-卤代酰基和环状酰亚胺保护基保持完整。在一个优选实施方案中，使用在甲醇中的催化量的NaOMe(Zemplén去-O-酰基化).
术语“碱性水解”通常指在水、醇或水-有机溶剂混合物中，在均相或多相反应条件中，在0-100℃的温度的碱催化水解。所选的碱通常是强碱，例如LiOH、NaOH、KOH、Ba(OH)2、K2CO3、碱性离子交换树脂、四烷基氢氧化铵等。所述碱也可以以水溶液的形式使用。此条件影响O-酰基、N-卤代酰基、2，3-二苯基马来酰亚胺和2，3-二甲基马来酰亚胺。如果R5和R6都是乙酰基，则酰基之一也被去除。在一个优选实施方案中，所述碱是NaOH并且所述溶剂是甲醇。
术语“氨解”或基于N-酰基转移的去保护指，在20-120℃的温度的下在水、醇或水-有机溶剂混合物中利用氨水、肼、取代肼、乙二胺或伯胺处理。在此条件下，可以容易地除去所有的O-和N-保护酰基，包括环状酰亚胺。
根据另一个实施方案，获得的通式2的化合物被N-乙酰化。在一个或多个羟基存在下的选择性N-乙酰化是熟知的反应并且进行这样的反应也是本领域技术人员的部分常识。其涉及胺与稍过量的乙酸酐或乙酰氯(≈1.5-3当量)在约0-35℃(有或没有添加碱下)的反应。利用例如NaOH/MeOH或NaOMe/MeOH处理，最终形成的过乙酰化副产物可以容易地转化为所需的通式1的化合物。在另一种方法中，根据通式2的衍生物被过乙酰化，即游离氨基和所有游离羟基都被乙酰化。进行反应直至要被保护的所有基团被乙酰化属于本领域技术人员的能力。该化合物用乙酸酐或乙酰氯，优选乙酸酐，在碱，优选吡啶、三乙胺或Hünig碱存在下处理，从而产生通式4的充分保护的四糖的基团，其由通式4a表征
Figure BDA00002020133300141
通式4a
其中R1是如上所定义的。然后，过乙酰化衍生物4a经过碱催化酯交换去保护或碱性水解(参见上文)，优选经过Zemplén去-O-乙酰基化，从而产生通式1的化合物。
一旦通过不论采取上述哪种途径制得通式1的化合物，将它们以晶体形式分离。本发明的发明人认识到通式1的化合物是晶体物质。因为通式1的化合物是在产生LNnT的过程中最后中间体并且最后的去保护步骤在实际上不形成副产物下进行，所以它们的纯度与目标产物LNnT的纯度成比例。
在没有晶种的情况下，从包含一种或多种C1-C6醇的溶剂进行结晶。术语“C1-C6醇”指具有1至6个碳原子的醇，即甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丁醇、异戊醇等。优选选择甲醇或乙醇。更优选地，溶剂系统还可以包含水。在溶剂系统的总体积中的水含量范围优选可以多至30v/v％，更优选15-25v/v％。
在一个优选实施方案中，1-O-苯基LNnT从含水甲醇或含水乙醇中结晶。
在本发明第一方面的步骤d)中，通式1的化合物经过催化还原，产生LNnT。
R1基团的去除通常发生在质子溶剂或质子溶剂的混合物中。质子溶剂可以选自由以下组成的组：水、乙酸或C1-C6醇。也可以采用一种或多种质子溶剂与一种或多种可以部分或完全与该质子溶剂混溶的合适非质子有机溶剂(如THF、二
Figure BDA00002020133300151
烷、乙酸乙酯、丙酮等)的混合物。水、一种或多种C1-C6醇或水和一种或多种C1-C6醇的混合物优选用作溶剂系统。也可以使用含任何浓度的糖衍生物的溶液或糖衍生物与所用溶剂的悬浮液。反应混合物在10-100℃的温度范围，优选在20-70℃在1-50bar的氢气氛中在催化剂如钯、阮内镍或任何其他合适金属催化剂(优选碳负载钯或钯黑)存在下搅拌，直到达到反应完成。基于糖的重量，催化剂金属浓度范围通常为0.1％至10％。优选地，催化剂浓度范围为0.15％至5％，更优选0.25％至2.25％。当氢从环己烯、环己二烯、甲酸或甲酸铵原位产生时，也可以进行转移氢化。有机或无机碱/酸和/或碱性和/或酸性离子交换树脂的添加也可以用于改善氢解的动力学。当卤素取代基存在于前体的取代苄基部分上时，尤其优选使用碱性物质。优选的有机碱包括但不限于三乙胺、二异丙基乙胺、氨、氨基甲酸铵、二乙胺等。优选的有机/无机酸包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、氯乙酸、二氯乙酸、三氟乙酸、HCl、HBr等。上述条件允许简单、方便且准确去除溶剂，从而产生纯的LNnT。可以使用常规工作程序以晶体、非结晶固体、浆状体形式或浓水溶液从反应混合物中分离LNnT。
在一个优选实施方案中，使1-O-苯基LNnT经过催化氢解以产生LNnT。氢化可以在水或含水醇，优选在水/甲醇或水/乙醇混合物(醇含量：10-50v/v％)中在15-65℃，优选60-65℃下进行。原料的浓度可以在140-230g/l之间变化而催化剂浓度的范围可以为0.4％至1.2％(基于糖重量的金属内容物重量)。
由本发明提供的固体形式的LNnT如非结晶/冻干/喷雾干燥以及液体形式的LNnT如水溶液/浆状体都具有高的LNnT纯度，其适于婴儿营养用途，包括但不限于婴儿配方食品(formulas)、婴儿谷类食物、临床婴儿营养品等。通常，通过本发明的方法生产的固体和液体形式的LNnT都适于婴儿、幼童、儿童、成人和老年人的通常营养用途。由本发明提供的固体和液体形式的LNnT也都可以用作食品添加剂、营养保健品、酒精和非酒精饮料如软饮料、果汁、瓶装水、葡萄酒、啤酒等的组分。通过本发明提供的固体和液体形式的LNnT也都可以用作广泛治疗应用领域中的治疗剂，所述治疗应用领域包括但不限于预防细菌和病毒感染、避免腹泻、增强免疫系统和脑发育等。通过本发明提供的固体和液体形式的LNnT也都可以用于兽医应用，其包括但不限于对抗家畜的感染性疾病。通过本发明提供的LNnT也可以用作用于制备聚合物的/载有聚合物的产品的关键单体，所述聚合物的/载有聚合物的产品为细菌和病毒提供多价结合。通过应用化学和/或酶促方法，通过本发明提供的LNnT也可以用于制备其他人乳寡糖，所述化学和/或酶促方法包括但不限于经由N-乙酰乳糖氨基化/N-乙酰异乳糖氨基化等的进一步岩藻糖基化、进一步唾液酸基化、核心结构的进一步延展的简单结构修饰。
本发明的另一方面涉及LNnT的新型晶体多晶型物。该新型晶体LNnT包含基于使用CuKα辐射测量的X射线粉末衍射反射，在以下角度处：在20.32±0.20 2Θ角，优选20.32±0.20和19.10±0.20 2Θ角，更优选在20.32±0.20、19.10±0.20和7.98±0.20 2Θ角，甚至更优选20.32±0.20、19.10±0.20、7.98±0.20和21.03±0.20 2Θ角，最优选20.32±0.20、19.10±0.20、7.98±0.20、21.03±0.20和20.95±0.20 2Θ角，尤其是20.32±0.20、19.10±0.20、7.98±0.20、21.03±0.20、20.95±0.20和5.66±0.20 2Θ角。根据实施例34制备的晶体LNnT的XRPD图的峰的列表显示在表1中。
  2Θ   相对强度   2Θ   相对强度
  5.66   20   21.03   29
  6.78   7   21.88   14
  7.98   67   22.08   17
  9.10   2   22.32   16
  10.16   3   23.62   12
  11.58   9   25.22   14
  11.76   9   25.57   17
  14.00   5   25.64   17
  16.07   5   26.50   11
  17.20   11   27.25   8
  17.98   9   27.94   6
  19.10   77   29.99   5
  20.32   100   31.66   5
  20.95   27   33.94   7
表1.
所述LNnT的新晶形可以被认为是α-异头物和β-异头物的异头混合物或甚至所述异头物之一的纯形式。如果LNnT作为多晶物质被分离，则它形成α-和β-异头物的混合物，其中根据固态13C-NMR测量结果，α-异头物相对β-异头物占优势(比率：约为5∶2)(见图3)。
Kuhn等[Chem.Ber.1962，95，513]报道了晶体LNnT的熔点为214-218℃(dec.)。根据本发明的LNnT多晶型物的熔点是226-230℃(dec)。所述熔点之间的显著差异表明其涉及不同的多晶型物。
在欧洲申请EP-A-1405856中，LNnT的晶体获自丙酮水溶液，其测得的粉末X射线衍射数据显著不同于本申请的晶体的粉末X射线衍射数据。所述数据的比较显示在图2中。
优选地，根据本发明的晶体LNnT基本不含有机溶剂。短语“基本不含有机溶剂”意在指有机溶剂的含量最多为1000ppm，优选最多为800ppm，更优选最多为600ppm，最优选最多为400ppm并且尤其是最多为200ppm。
根据另一个优选的实施方案，本申请要求保护的晶体LNnT基本上是纯的。短语“基本上是纯的”意在指所述晶体LNnT(新的多晶型物)含有少于10w/w％的杂质，优选少于5w/w％的杂质，更优选少于1w/w％的杂质，最优选少于0.5w/w％的杂质，尤其是少于0.1w/w％的杂质，其中“杂质”指不同于本申请描述的晶体LNnT的任何物理个体，如非晶体LNnT、不同的LNnT多晶型物、来自LNnT的合成留下的未反应中间体、副产物、降解产物、无机盐和/或不同于有机溶剂的其他污染物。
本发明还提供通过从包含一种或多种C1-C6醇的溶剂系统结晶来制备晶体LNnT的方法。更优选地，该溶剂系统还可以含有水。溶剂系统的总体积中的水含量的范围可以优选多至40v/v％。优选可以使用3-15体积的该溶剂混合物来进行结晶。
在典型的结晶中，将取自在除去催化剂后的氢化的反应混合物或新鲜制备的LNnT在水/甲醇或在水/乙醇，优选在水/甲醇(≈1∶1)混合物中的溶液(浓度：140-180g/l)温热到50-60℃，在搅拌和逐渐冷却至35-45℃下向其中分2-4部分加入热甲醇(多至起始体积的115-250％)。结晶可以通过加入种晶来引发。然后将所得的温热悬浮液小心地冷却至0-8℃并且任选地持续搅拌2-5小时。通过过滤分离形成的晶体物质。
在进一步的实施方案中，根据本发明的晶体LNnT适用于药物和营养用途。单独的LNnT或与含人乳寡糖的其他N-乙酰乳糖胺和/或岩藻糖和/或唾液酸组合的LNnT在新生儿免疫系统的教化和/或成熟方面尤其有效，并且针对病毒感染(如流感)后的继发感染具有预防效果。使用LNnT作为益生素(prebiotic)增强了益生元(如乳酸菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)物种)在促进婴儿的早期双歧肠内微生物群的形成方面，在减小婴儿过敏和/或哮喘的形成风险方面，在预防和治疗婴儿的在如腹泻中的病原感染方面的有益效果和效力。
在另一方面，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的本发明的晶体LNnT和一种或多种药用载体，包括但不限于添加剂、佐剂、赋形剂和稀释剂(水、明胶、滑石、糖类、淀粉、阿拉伯胶、植物胶、植物油、聚亚烷基二醇、调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、润滑剂、着色剂、填充剂、湿润剂等)。合适的载体描述于最新版的Remington′sPharmaceutical Sciences(本领域中的一个标准参考文献)中。用于给药的剂型包括例如，片剂、粉剂、粒剂、丸剂、混悬剂、乳化剂、浸剂、胶囊剂、糖浆、注射剂、液体、酏剂、浸膏剂和酊剂。
在进一步的实施方案中，根据本发明的晶体LNnT被用于制备药物组合物。药物组合物可以借助于本领域中已知的任何通常方式生产，例如描述于最新版的Remington′s Pharmaceutical Sciences(本领域中的一个标准参考文献)中的方式。
在进一步的实施方案中，提供了包含根据本发明的晶体LNnT的营养制剂如食品、饮料或饲料。该营养制剂也可以包含可食用的微量营养物、维生素和矿物质。这样的成分的量可以根据该制剂是否意在用于正常健康的婴儿、儿童、成人或具有专门需要的对象(例如患有代谢紊乱)而变化。微量营养物包括例如食用油、脂肪或脂肪酸(如椰油、豆油、甘油一酯、甘油二酯、棕榈油精、葵花油、鱼油、亚油酸、亚麻酸等)、糖类(如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糊精、淀粉、水解玉米淀粉等)和来自酪蛋白、大豆、乳清或脱脂乳的蛋白，或这些蛋白的水解产物，并且也可以使用来自其他来源的蛋白(完整的或水解的)。维生素可以选自由以下组成的组：维生素A、B1、B2、B5、B6、B12、C、D、E、H、K、叶酸、肌醇和烟酸。营养配方可以包含以下矿物质和痕量元素：Ca、P、K、Na、Cl、Mg、Mn、Fe、Cu、Zn、Se、Cr或I。
在一个优选实施方案中，所述营养制剂是婴儿配方食品。婴儿配方食品是指这样的食物，其计划用于处于生命的头4-6个月期间的婴儿的特殊营养用途并且本身满足婴儿的营养要求。它可以包含一种或多种益生双歧杆菌物种、益生元如果寡糖和半乳寡糖、来自酪蛋白、大豆、乳清或脱脂乳的蛋白、糖如乳糖、蔗糖、麦芽糊精、淀粉或其混合物、脂类(例如棕榈油精、葵花油、红花油)以及日常饮食中必需的维生素和矿物质。婴儿配方食品包含的根据本发明的晶体LNnT的总量为0.1-3.0g/100g配方食品。
在另一个优选的实施方案中，所述营养制剂可以是包含根据本发明的晶体LNnT的食物补充剂。该食物补充剂可以包含一种或多种益生元，其量为足以在个体中(优选在儿童和成人中)实现所需的效果。该食物补充剂还可以包含维生素、矿物质、痕量元素和其他微量营养物。该食物补充剂可以是例如片剂、胶囊剂、锭剂或液体的形式。所述增补剂可以包含选自但不限于以下的常规添加剂：粘合剂、包衣、乳化剂、增溶剂、包封剂、成膜剂、吸附剂、载体、填充剂、分散剂、湿润剂、胶冻剂(jellifying agent)、胶凝剂等。LNnT的日剂量为0.1至3.0g。
根据一个更优选的实施方案，该食物补充剂是消化健康功能食品，因为LNnT的给予对消化健康产生有益作用。消化健康功能食品是一种加工食品，使用的目的是通过以片剂、胶囊、粉剂等形式的作为生理功能成分或组分的根据本发明的晶体LNnT来增强并保持消化健康。不同的术语如膳食补充剂、营养食品、设计食品、健康产品也可以用于指代功能食品。
在进一步的实施方案中，根据本发明的晶体LNnT被用于制备营养制剂，所述营养制剂包括食物、饮料和饲料，优选婴儿配方食品、食物补充剂和消化健康功能食品。该营养制剂可以以任何常规方式制备。
认为通式1、2、3、4、5和6的化合物对于LNnT是有价值的合成中间体。本发明的发明人惊人地发现通式1、2、3、4、5和6的化合物中的一部分可以以晶体形式获得。结晶或再结晶是从反应混合物分离产物、从污染物分离产物并获得纯物质的最简单和最廉价的方法之一。利用结晶的分离或纯化使得整个技术过程可靠且成本有效，因此与其他程序相比，它具有优势且吸引人。本发明在LNnT的大规模生产中具有极大商业价值，提供高纯度的中间体，这是通过任何其他已知纯化方法所不能实现的。虽然一部分其他中间体没有显示出结晶的能力，但是它们可以在清洁、高产率且较少副产物形成的反应中制备，其中常规操作(萃取、蒸发、沉淀等)程序已经足以获得高纯度产品，其在没有进一步纯化下被用于下一个步骤中。
因此，提供了有价值的通式1’的LNnT中间体
通式1’
其中R’1选自取代的苄基、任选取代的二苯甲基、任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基。
着重强调的是，由通式1’表征的新型衍生物可以被视作单独的化学个体如α异头物或β异头物或甚至是α异头物和β异头物的异头混合物，优选β异头物。通式1’的新型LNnT中间体可以表征为结晶固体、油状物、浆状体、沉淀非晶体物质或喷雾干燥产物。如果是晶体，通式1’的化合物可以以无水晶形存在或通过在其晶体结构中结合一个或若干个水分子而以水合晶形存在。类似地，由通式1’表征的新型化合物可以作为在其晶体结构中结合有配体如有机分子和/或离子的晶体物质存在。
在一个优选实施方案中，R1是取代的苄基，优选4-氯苄基或4-甲基苄基。
由本发明提供的通式1’的新型化合物可以通过使用本领域中已知的化学/酶促方法而用于制备LNnT自身以及其他LNnT衍生物。通式1’的新型化合物也可以用作用于生产/制备大量人乳寡糖的高级前体/中间体。通式1’的新型化合物也可以被认为是用于合成适于治疗/营养用途的复杂寡糖/糖缀合物的有价值中间体。
提供了有价值的通式2’的LNnT中间体
Figure BDA00002020133300211
通式2’
其中R’1选自取代的苄基、任选取代的二苯甲基、任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基。
着重强调的是，由通式2’表征的新型衍生物可以被视作单独的化学个体如α异头物或β异头物或甚至是α异头物和β异头物的异头混合物，优选β异头物。通式2’的新型LNnT中间体可以表征为结晶固体、油状物、浆状体、沉淀的非晶体物质或喷雾干燥产物。如果是晶体，通式2’的化合物可以以无水晶形存在或通过在其晶体结构中结合一个或若干个水分子而以水合晶形存在。类似地，由通式2’表征的新型化合物可以作为在其晶体结构中结合有配体如有机分子和/或离子的晶体物质存在。
在一个优选实施方案中，R1是取代的苄基，优选4-氯苄基或4-甲基苄基。
由本发明提供的通式2’的新化合物可以通过使用本领域中已知的化学/酶促方法而用于制备LNnT自身以及其他LNnT衍生物。通式2’的新型化合物也可以用作用于生产/制备大量人乳寡糖的高级前体/中间体。通式2’的新化合物也可以被认为是用于合成适于治疗/营养用途的复杂寡糖/糖缀合物的有价值中间体。
此外，提供了通式3的化合物
Figure BDA00002020133300221
通式3
其中R1选自任选取代的苄基、任选取代的二苯甲基、任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基，并且-NR5R6选自-NH-卤代酰基、苯邻二甲酰亚胺、四氯苯邻二甲酰亚胺、2，3-二苯基马来酰亚胺和2，3-二甲基马来酰亚胺。
着重强调的是，由通式3表征的新型衍生物可以被视作单独的化学个体如α异头物或β异头物或甚至是α异头物和β异头物的异头混合物，优选β异头物。通式3的新的LNnT中间体可以表征为结晶固体、油状物、浆状体、沉淀的非晶体物质或喷雾干燥产物。如果是晶体，通式3的化合物可以以无水晶形存在或通过在其晶体结构中结合一个或若干个水分子而以水合晶形存在。类似地，由通式3表征的新型化合物可以作为在其晶体结构中结合有配体如有机分子和/或离子的晶体物质存在。
在一个优选实施方案中，R1选自苄基、4-甲基苄基和4-氯苄基，优选苄基，并且-NR5R6是-NH-卤代酰基，优选-NH-三氯乙酰基。
由本发明提供的通式3的新型化合物可以通过使用本领域中已知的化学/酶促方法而用于制备LNnT自身以及其他LNnT衍生物。通式3的新型化合物也可以用作用于生产/制备大量人乳寡糖的高级前体/中间体。通式3的新型化合物也可以被认为是用于合成适于治疗/营养用途的复杂寡糖/糖缀合物的有价值中间体。
此外，提供了通式4’的化合物
Figure BDA00002020133300222
通式4’
其中R1选自任选取代的苄基、任选取代的二苯甲基、任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基，并且R2和R4各自独立地是任选取代的酰基，R3选自任选取代的酰基和H，-NR5R6选自-NAc2、-NH-卤代酰基、四氯苯邻二甲酰亚胺、2，3-二苯基马来酰亚胺和2，3-二甲基马来酰亚胺。
着重强调的是，由通式4’表征的新型衍生物可以被视作单独的化学个体如α异头物或β异头物或甚至是α异头物和β异头物的异头混合物，优选β异头物。通式4’的新型LNnT中间体可以表征为结晶固体、油状物、浆状体、沉淀的非晶体物质或喷雾干燥产物。如果是晶体，通式4’的化合物可以以无水晶形存在或通过在其晶体结构中结合一个或若干个水分子而以水合晶形存在。类似地，由通式4’表征的新化合物可以作为在其晶体结构中结合有配体如有机分子和/或离子的晶体物质存在。
在一个优选实施方案中，R1选自苄基、4-甲基苄基和4-氯苄基，优选苄基，R2是任选被氯取代的苯甲酰基，R3是任选取代的苯甲酰基，优选苯甲酰基，R4是乙酰基而-NR5R6是-NH-卤代酰基，优选-NH-三氯乙酰基。
由本发明提供的通式4’的新型化合物可以通过使用本领域中已知的化学/酶促方法而用于制备LNnT自身以及其他LNnT衍生物。通式4’的新型化合物也可以用作用于生产/制备大量人乳寡糖的高级前体/中间体。通式4’的新型化合物也可以被认为是用于合成适于治疗/营养用途的复杂寡糖/糖缀合物的有价值中间体。
此外，提供了通式4a的化合物
Figure BDA00002020133300231
通式4a
其中R1选自任选取代的苄基、任选取代的二苯甲基、任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基。
着重强调的是，由通式4a表征的新型衍生物可以被视作单独的化学个体如α异头物或β异头物或甚至是α异头物和β异头物的异头混合物，优选β异头物。通式4a的新型LNnT中间体可以表征为结晶固体、油状物、浆状体、沉淀的非晶体物质或喷雾干燥产物。如果是晶体，通式4a的化合物可以以无水晶形存在或通过在其晶体结构中结合一个或若干个水分子而以水合晶形存在。类似地，由通式4a表征的新化合物可以作为在其晶体结构中结合有配体如有机分子和/或离子的晶体物质存在。
在一个优选实施方案中，R1选自苄基、4-甲基苄基和4-氯苄基，优选苄基。
本发明提供的通式4a的新型化合物可以通过使用本领域中已知的化学/酶方法而用于制备LNnT自身(尤其当通式2的化合物的选择性N-乙酰化不是有效时)以及其他LNnT衍生物。通式4a的新型化合物也可以用作用于生产/制备大量人乳寡糖的高级前体/中间体。通式4a的新型化合物也可以被认为是用于合成适于治疗/营养用途的复杂寡糖/糖缀合物的有价值中间体。
本发明的另一个方面涉及由通式5’表征的新型晶体乳糖氨基供体
通式5’
其中R4是任选取代的酰基，-NR5R6是-NH-卤代酰基，而R7是任选取代的苯基。
着重强调的是，由通式5’表征的新型衍生物可以被视作单独的化学个体如α异头物或β异头物或甚至是α异头物和β异头物的异头混合物，优选β异头物。通式5’的新的LNnT中间体可以表征为结晶固体、油、浆液、沉淀的无定形物质或喷雾干燥的产物。如果是晶体，通式5’的化合物可以以无水晶形存在或通过在其晶体结构中结合一个或若干个水分子而以水合晶形存在。类似地，由通式5’表征的新型化合物可以作为在其晶体结构中结合有配体如有机分子和/或离子的晶体物质存在。
在一个优选实施方案中，R4是乙酰基，-NR5R6是-NH-三氯乙酰基或-NH-三氟乙酰基，R7是苯基并且-SR7为β型。
通式5’的化合物是稳定的，可以长期储存而不发生显著分解，可以在糖基化反应中容易地被活化并且显示出优异的β选择性。因为已知其他β选择性乳糖氨基供体不是固体和/或稳定的，所以根据本申请的通式5’的化合物在乳糖氨基化反应中具有显著有利的应用性并且因此代表在其中含乳糖胺的寡糖作为目标的合成(尤其是大规模或工业规模的)中的有价值供体工具。
通式5’的化合物可以制备如下：乳糖胺盐酸盐在Ac2O/HBr/AcOH中被乙酰化，从而产生1，3，6，2’，3’，4’6’-七-O-乙酰基-乳糖胺盐酸盐，其用卤化卤代酰基或酸酐N-酰基化为-NH-卤代酰基衍生物。利用HBr/AcOH形成溴代糖，接着利用R7SH硫代苯酚衍生物进行硫解，而容易地得到通式5’的化合物。通过碱催化的酯交换反应，接着后续的酰基化，可以将乙酰基变为其他适当的酰基。
因此，本发明提供有价值的通式6’的化合物
Figure BDA00002020133300251
通式6’
其中R1选自任选取代的苄基、任选取代的二苯甲基、任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基，R2是任选取代的苯甲酰基，并且R3选自任选取代的苯甲酰基和H。
优选的实施方案涵盖这样的通式6’的化合物，其中R1是任选取代的苄基，优选苄基、4-甲基苄基或4-氯苄基，R2是任选取代的苯甲酰基，优选苯甲酰基或4-氯苯甲酰基，而R3是苯甲酰基或H。
本发明的发明人认识到，当通式6的化合物在苷化反应中充当糖基受体时，作为R3的乙酰基是不方便的保护基。在偶联条件下，总是发生乙酰基迁移从而产生包含具有相似物理特性的物质的复杂的混合物，这些化合物仅可能通过冗长和/或复杂和/或费力的技术例如色谱法进行分离。选择不趋于或较不趋于迁移的更大体积的酰基保护基导致产生以下受体，其在苷化中几乎排他地形成偶联产物，使得所需化合物的工艺程序和分离过程更简单、快速、有效且成本有效，例如通过结晶，这是在大规模生产或工业过程中最为关注之一。
在以下对示例性实施方案进行描述的过程中，本发明的其他特征将变得明显，这些示例性实施方案用于举例说明本发明而不用于限制本发明。
实施例
实施例1
将10g苄基β-D-乳糖苷在丙酮(50ml)、二甲氧基丙烷(3.5ml)和TMSCl(7ml)中的悬浮液在室温搅拌5h。混合物用乙酸乙酯(50ml)稀释，过滤，并且滤饼用乙酸乙酯(2x30ml)洗涤。将湿的滤饼溶解在吡啶(36ml)和干燥DCM(50ml)中，并缓慢加入4-氯苯甲酰氯(22ml)以维持温度在40-45℃。在过夜搅拌后，加入甲醇(10ml)和DCM(10ml)并进行萃取操作(2x1M HCl，1x水，1x饱和NaHCO3)。将合并的有机相浓缩并且作为稠的浆状体在剧烈搅拌下倒入50ml异丙醇中。过滤固体，用异丙醇洗涤并干燥，从而产生20.0g苄基2，3，6，2’，6’-五-O-(4-氯苯甲酰基)-3’，4’-二-O-异亚丙基-β-D-乳糖苷(72％)。[α]D＝+58.4°(c＝1DCM)，Mp：184℃。
实施例2
将10g苄基2，3，6，2’，6’-五-O-(4-氯苯甲酰基)-3’，4’-二-O-异亚丙基-β-D-乳糖苷溶解在DCM(20ml)、乙腈(2ml)和50％HClO4(1ml)中，并将该混合物在室温搅拌30min。用饱和NaHCO3(2x10ml)萃取该溶液，干燥，过滤并浓缩。将所得的物质再次溶解在乙酸乙酯(10ml)中并用己烷(50ml)稀释。将该悬浮液在室温搅拌30min，并过滤，从而产生5.4g作为白色晶体的苄基2，3，6，2’，6’-五-O-(4-氯苯甲酰)-β-D-乳糖苷。[α]D＝+58.65°(c＝1DCM)，Mp：200-201℃。
实施例3
根据实施例1和2利用丙酰氯类似地制备：苄基2，3，6，2’，6’-五-O-丙酰基-β-D-乳糖苷。
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.346-7.227(5H，Ph)，5.140(1H，dd，J＝9.1，9.7，H-3)，4.980(1H，dd，J＝7.9，9.7，H-2)，4.881(1H，dd，J＝7.9 9.7，H-2′)，4.838(1H，d，J＝12.3，1/2CH 2Ph)，4.570(1H，d，J＝12.3，1/2CH 2Ph)，4.495(1H，dd，J＝1.8，11.7，H-6a or H-6a′)，4.343-4.282(2H，未分辨的，H-6a或H-6a′，H-1)，4.217-4.155(2H，未分辨的，H-6b，H-6b′)，3.821(1H，d，J＝3.4，H-4′)，3.743(1H，dd，J＝9.8，9.8，H-4)，3.606-3.537(3H，未分辨的，H-3′，H-5，H-5′)，2.438-2.194(10H，m，5×CH 2CH3)，1.263-1.036(15H，m，5×CH2CH 3)。
13C NMR(CDCl3，75.4MHz)δ：174.7，174.3，173.9，173.8，172.9，171.2(6×CO)，136.6-127.9(Ph)，100.6(C-1′)，99.1(C-1)，75.9(C-4)，73.3，72.9，72.7，72.3，72.2(C-2′，C-3，C-3′，C-5，C-5′)，71.2(C-2)，70.6(CH2Ph)，68.4(C-4′)，62.2，62.0(C-6，C-6′)。
实施例4
根据实施例1和2利用苯甲酰氯类似地制备：苄基2，3，6，2’，6’-五-O-苯甲酰基-β-D-乳糖苷。
1H NMR。(CDCl3)δ：8.20-7.10(m，30H，芳族)，5.55(dd，1H，J2，39.82Hz，J3，49.82Hz，H-3)，5.49(dd，1H，J1，29.78Hz，H-2)，5.35(dd，1H，J1′，2′7.85Hz，J2′，3′9.64Hz，H-2′)，4.81和4.57(ABq，2H，Jgem 12.59Hz，-CH 2Ph)，4.62(d，1H，H-1)，4.57(d，1H，H-1′)，4.52(m，2H，H-6)，4.12(m，1H，H-4)，3.80(m，1H，H-4′)，3.75(m，1H，H-5)，3.70(m，1H，H-3′)。
13C NMR(CDCl3)δ：166.51，166.31，166.18，166.16和165.45(5×CO)，101.23(C-1′)，99.09(C-1)，76.49(C-4)，73.81(C-2′)，73.26，73.22，73.19和72.87(C-3，C-5，C-3′和C-5′)，72.80(C-2)，71.77(-CH2Ph)，68.81(C-4′)，62.85和61.99(C-6和C-6′)。
实施例5
根据实施例1和2从4-甲基苄基β-D-乳糖苷类似地制备：4-甲基苄基2，3，6，2’，6’-五-O-(4-氯苯甲酰基)-β-D-乳糖苷。
1H NMR(CDCl3)：7.8，7.4，7.2，7.0(m)，5.4(m，3H)，4.76(d，1H)，4.5(m，5H)，4.1(dd，1H)，4.0(m，2H)，3.84(m，1H)，3.72(m，2H)，3.6(m，2H)，3.48(m，1H)，3.3(d，1H)。
13C NMR(CDCl3)：165.3，165.2，165.1，164.3，139.9，139.8，137.9，133.2，131.3，131.1，130.9，130.9，129.1，129.0，128.9，128.8，128.7，128.1，127.9，127.8，127.7，127.5，127.4，101.1，98.3，76.4，73.6，73.4，72.9，72.6，72.3，71.7，70.4，68.6，62.9，62.0，60.4，21.1，14.2。
实施例6
向116.6g根据实施例2的化合物在甲苯(600ml)中的混合物中，加入原苯甲酸三甲酯(120ml)和莰烯磺酸(4g)。将混合物在室温剧烈搅拌3h，然后加入80％乙酸(160ml)。在又一个小时的搅拌后，将获得的两相混合物分离，用甲苯(600ml)稀释有机相，用水(800ml)和饱和NaHCO3(2x600ml)洗涤，干燥，过滤并蒸发。将所得的油状物滴入到600ml庚烷中并加入晶种。将白色晶体化合物过滤，洗涤并干燥，从而产生110.3g受体(通式6的化合物，其中R1＝Bn，R2＝4-氯苯甲酰基，R3＝苯甲酰基，OR1为β型)。[α]D＝+17.13°(c＝1DCM)，Mp 156-157℃。
实施例7
从实施例4的化合物类似地制备：通式6的化合物，其中R1＝Bn，R2＝R3＝苯甲酰基，OR1为β型。
1H NMR。(CDCl3)δ：8.20-7.00(m，35H，芳族)，5.67(dd，1H，J2，39.77Hz，J3，49.11Hz，H-3)，5.55(dd，1H，J1，27.81Hz，H-2)，5.47(dd，1H，J3′，4′3.45Hz，J4′，5′＜1Hz，H-4′)，5.30(dd，1H，J1′，2′7.82Hz，J2′，3′9.97Hz，H-2′)，4.85和4.60(ABq，2H，Jgem12.59Hz，-CH 2Ph)，4.72(d，1H，H-1)，4.70(d，1H，H-1′)，4.60(m，2H，H-6)，4.21(m，1H，H-4)，3.93(m，1H，H-3′)，3.82(m，1H，H-5)，3.75-3.45(m，3H，H-5′和H-6′)2.70(d，1H，J3′，OH6.68Hz，3′-OH)。
13C NMR(CDCl3)δ：166.67，166.26，166.03，165.90，165.68和165.41(6×CO)，100.79(C-1′)，99.35(C-1)，76.16(C-4)，73.89(C-2′)，73.26(C-5)，72.96(C-3)，72.11(C-3′)，71.79(C-2)，71.76(C-5′)，70.73(-CH2Ph)，70.22(C-4′)，62.87和61.68(C-6和C-6′)。
实施例8
从实施例5的化合物类似地制备：通式6的化合物，其中R1＝4-甲基苄基，R2＝4-氯苯甲酰基，R3＝苯甲酰基，OR1为β型。
1H NMR(CDCl3)：7.92-7.0(m，芳族H)，5.6(dd，1H)，5.5(d，1H)，5.41(dd，1H)，5.3(dd，1H)，4.8(d，1H)，4.68(m，2H)，4.52(m，2H)，4.08(m)，4.0(m，2H)，3.78(m，3H)，3.6(m，1H)。
13C NMR(CDCl3)：165.7，165.2，165.1，164.7，164.5，164.3(Bz和ClBz羰基)，140.1，140.02，139.9，139.7，139.6，137.8，133.7，133.1，131.2-127.2芳族碳，100.6，98.6(异头碳)，75.9，73.6，73.1，72.9，71.7，71.4，71.3，70.5，69.9，62.9，61.7，45.9，42.7，42.4，14.1。
实施例9
根据实施例1、2和6，从4-氯苄基β-D-乳糖苷类似地制备：通式6的化合物，其中R1＝4-氯苄基，R2＝4-氯苯甲酰基，R3＝苯甲酰基，OR1为β型。
1H NMR(CDCl3)：7.89-7.0(m，芳族H)，5.63(dd，1H)，5.5(d，1H)，5.42(dd，1H)，5.28(dd，1H)，4.78(d，1H)，4.68(dd，1H)，4.54(m，3H)，4.1(m，2H)，3.98(m，1H)，3.8(m，2H)，3.6(m，2H)。
13C NMR(CDCl3)：165.8，165.2，164.8，164.5，164。3，140.2，140.0，139.8，134.9，133.9，133.8。131.2，131.1，130.9，130.9，130.8，129.9，129.0，128.9，128.8，128.7，128.6，128.5，127.7，127.4，127.3，100.6，99.2，75.8，73.6，73.0，71.8，71.5，71.4，70.0，69.9，62.8，61.6，57.9，56.1，48.1，46.0，42.7，42.5。
实施例10
在0℃，将10g乳糖胺盐酸盐溶解在Ac2O(50ml)中并加入10ml的30％HBr/AcOH。允许反应混合物升温至室温，搅拌10h并倒入200ml叔丁基甲基醚(MTBE)中。过滤沉淀，用MTBE洗涤并干燥，从而得到12.4g作为浅棕色粉末的1，3，6，2’，3’，4’6’-七-O-乙酰基-乳糖胺盐酸盐。1H NMR(CDCl3)δ：5.57和5.22(2m，1H，H-1α和β)，5.57，5.29，4.98和4.89(4m，各1H，H-3，H-2′，H-3′和H-4′)，4.41(m，1H，H-1′)，4.37和4.06(2m，1H和3H，H-6和H-6′)，3.83，3.82和3.73(3m，各1H，H-4，H-5和H-5′)，3.40(m，1H，H-2)，2.10，2.10，2.06，2.04，1.98，1.90和1.89(7s，各3H，7×-OAc)。13C NMR(CDCl3)δ：100.87(C-1′)，92.91和88.93(C-1α和β)，75.64，73.03和71.01(C-4，C-5和C-5′)，61.72和60.72(C-6和C-6′)，54.08(C-2)。
实施例11
将16.4g 1，3，6，2’，3’，4’6’-七-O-乙酰基-乳糖胺盐酸盐溶解在DCM(30ml)中并冷却至0℃。首先加入2.95ml三氯乙酰氯，然后缓慢加入7.6ml三乙胺并且在0℃继续搅拌30min。用DCM(10ml)稀释该反应混合物，用水(2x20ml)和盐水(20ml)洗涤，在Na2SO4上干燥并过滤。在0℃，将此溶液与Ac2O(100μl)的混合物滴入DCM(15ml)、HBr/AcOH(15ml)和Ac2O(1ml)的溶液中并在相同温度保持30min。用DCM(10ml)稀释该反应混合物，用冷水(3x20ml)和冷的饱和NaHCO3(20ml)洗涤。向有机相中加入100ml半饱和Na2CO3溶液、4.3ml硫代苯酚和100mg四丁基硫酸氢铵并将该两相混合物在室温搅拌30min。在分离后，用盐水(2x20ml)洗涤有机相，并且在加入乙酸乙酯(50ml)后，过滤形成的晶体(6.3g)。通过添加MTBE(50ml)，从浓母液中进一步沉淀出3.2g晶体。合并收率：9.5g产物(通式5的化合物，其中R4＝乙酰基，-NR5R6＝-NH-三氯乙酰基，X＝β-SPh)。1H NMR。(CDCl3)δ：7.50和7.30(2m，5H，芳族)，7.08(d，1H，JNH，29.37Hz，NH)，5.33(dd，1H，J3′，4′3.19Hz，J4′，5′0.65Hz，H-4′)，5.21(dd，1H，J2，38.34Hz，J3，410.12Hz，H-3)，5.08(dd，1H，J1′，2′7.83Hz，J2′，3′10.47Hz，H-2′)，4.94(dd，1H，H-3′)，4.75(d，1H，J1，210.34Hz，H-1)，4.55和4.09(2m，4H，H-6和H-6′)，4.47(d，1H，H-1′)，4.00(m，1H，H-2)，3.87，3.78和3.67(3m，各1H，H-4，H-5和H-5′)，2.16，2.11，2.10，2.04，2.03和1.96(6s，各3H，6×-OAc)。13C NMR(CDCl3)δ：100.47(C-1′)，85.1(C-1)，75.99，75.41和69.97(C-4，C-5和C-5′)，72.50(C-3)，70.17(C-3′)，68.42(C-2′)，65.87(C-4′)，61.43和60.26(C-6和C-6′)，53.66(C-2)，21.35，21.11，21.11，20.98，20.87和20.75(6×OAc)。Mp.：247-249℃，[α]D＝-13,9°(c＝0,58CHCl3)。
实施例12
根据实施例11类似地制备：通式5的化合物，其中R4＝乙酰基，-NR5R6＝-NH-二氯乙酰基，X＝β-SPh。
1H NMR(CDCl3)δ：7.50和7.30(2m，5H，芳族)，7.08(d，1H，JNH，29.37Hz，NH)，5.33(dd，1H，J3′，4′3.19Hz，J4′，5′0.65Hz，H-4′)，5.21(dd，1H，J2，38.34Hz，J3，410.12Hz，H-3)，5.08(dd，1H，J1′，2′7.83Hz，J2′，3′10.47Hz，H-2′)，4.94(dd，1H，H-3′)，4.75(d，1H，J1，210.34Hz，H-1)，4.55和4.09(2m，4H，H-6和H-6′)，4.47(d，1H，H-1′)，4.00(m，1H，H-2)，3.87，3.78和3.67(3m，各1H，H-4，H-5和H-5′)，2.16，2.11，2.10，2.04，2.03和1.96(6s，各3H，6×-OAc)。
13C NMR(CDCl3)δ：100.47(C-1′)，85.1(C-1)，75.99，75.41和69.97(C-4，C-5和C-5′)，72.50(C-3)，70.17(C-3′)，68.42(C-2′)，65.87(C-4′)，61.43和60.26(C-6和C-6′)，53.66(C-2)，21.35，21.11，21.11，20.98，20.87和20.75(6×OAc)。
实施例13
根据实施例11类似地制备：通式5的化合物，其中R4＝乙酰基，-NR5R6＝-NH-三氟乙酰基，X＝β-SPh。
1H NMR(CDCl3)δ：7.79(d，1H，JNH，29.74Hz，NH)，7.45和7.29(2m，5H，芳族)，5.35(dd，1H，J3′，4′3.10Hz，J4′，5′＜1Hz，H-4′)，5.24(m，1H，H-3)，5.05(dd，1H，J1′，2′7.59Hz，J2′，3′10.44Hz，H-2′)，4.96(dd，1H，H-3′)，4.82(d，1H，J1，210.35Hz，H-1)，4.46(d，1H，H-1′)，4.65和4.10-3.88(m，7H，H-2，H-5，H-6，H-5′和H-6′)，3.76(m，1H，H-4)，2.11，2.06，2.05，2.04，2.03和1.99(6s，各3H，6×-OAc)。
13C NMR(CDCl3)δ：171.67，170.63，170.56，170.41，170.41和169.48(6×OAc)，101.64(C-1′)，84.44(C-1)，76.78(C-4)，76.25(C-5)，71.41(C-3)，71.09和70.84(C-3′和C-5′)，69.22(C-2′)，66.70(C-4′)，62.06和60.87(C-6和C-6′)，52.72(C-2)。
实施例14
根据实施例11类似地制备：通式5的化合物，其中R4＝4-氯苯甲酰基，-NR5R6＝-NH-二氯乙酰基，X＝β-SPh。
1H NMR(CDCl3)δ：7.92-7.05(m，29H，芳族)，6.65(d，1H，JNH，29.45Hz，NH)，5.74(s，1H，-CHCl2)，5.65(dd，1H，J3′，4′3.39Hz，J4′，5′＜1Hz，H-4′)，5.55(dd，1H，J1′，2′7.89Hz，J2′，3′10.34Hz，H-2′)，5.53(dd，1H，J2，39.01Hz，J3，410.24Hz，H-3)，5.32(dd，1H，H-3′)，4.80(d，1H，J1，210.31Hz，H-1)，4.78(d，1H，H-1′)，4.52和4.35(m，2H，H-6)，4.01(m，1H，H-2)，3.91(m，1H，H-4)，3.90(m，3H，H-5′和H-6′)，3.67(m，1H，H-5)。
13C NMR(CDCl3)δ：165.42，165.16，164.89，164.74，164.37，164.37和164.25(7×CO)，100.87(C-1′)，86.27(C-1)，76.98(C-5)，75.99(C-4)，73.99(C-3)，71.67(C-3′)，71.01(C-5′)，70.12(C-2′)，67.69(C-4′)，66.36(-CHCl2)，62.71和61.05(C-6和C-6′)，53.42(C-2)。
实施例15
根据实施例11类似地制备：通式5的化合物，其中R4＝苯甲酰基，-NR5R6＝-NH-二氯乙酰基，X＝β-SPh。
1H NMR(CDCl3)δ：8.18-7.08(m，35H，芳族)，6.84(d，1H，JNH，29.50Hz，NH)，5.82(s，1H，-CHCl2)，5.77(dd，1H，J3′，4′3.40Hz，J4′，5′＜1Hz，H-4′)，5.69(dd，1H，J1′，2′7.88Hz，J2′，3′10.36Hz，H-2′)，5.53(dd，1H，J2，39.05Hz，J3，410.27Hz，H-3)，5.42(dd，1H，H-3′)，4.91(d，1H，J1，210.21Hz，H-1)，4.91(d，1H，H-1′)，4.65和4.44(m，2H，H-6)，4.14(m，1H，H-2)，4.05(m，1H，H-4)，3.83(m，3H，H-5′和H-6′)，3.73(m，1H，H-5)。
13C NMR(CDCl3)δ：166.51，165.97，165.84，165.67，165.45，165.05和164.39(7×CO)，101.30(C-1′)，86.63(C-1)，76.86(C-5)，75.85(C-4)，73.91(C-3)，71.90(C-3′)，71.65(C-5′)，70.11(C-2′)，67.64(C-4′)，66.25(-CHCl2)，62.79和61.28(C-6和C-6′)，53.72(C-2)。
实施例16
将3.0g甲基硫代氨基乳糖苷溶解在10ml DMF中并向此溶液中加入100μl三乙胺和6.0ml三氯乙酸甲酯。将该反应混合物室温搅拌过夜，然后浓缩至干，将浓缩物溶解在甲醇(10ml)中，冷却并加入NaOMe直到pH达到9。将此混合物搅拌过夜，蒸发，然后加入吡啶(20ml)和Ac2O(10ml)。在6h后，将该混合物浓缩并用己烷-丙酮6∶4来进行色谱分离，从而得到灰白色泡沫(通式5的化合物，其中R4＝乙酰基，-NR5R6＝-NH-三氯乙酰基，X＝SMe)。为表征该异头物，对分析样品进行色谱分析。α异头物：1H NMR(CDCl3)δ：7.05(d，1H，JNH，27.05Hz，NH)，5.30(m，2H，J1，25.38Hz，H-1和H-4′)，5.13(dd，1H，J2，310.99Hz，J3，48.81Hz，H-3)，5.07(dd，1H，J1′，2′7.83Hz，J2′，3′10.42Hz，H-2′)，4.92(dd，1H，J3′，4′3.37Hz，H-3′)，4.49(d，1H，H-1′)，4.38-4.13(m，2H，H-6′)，4.26(m，1H，H-2)，4.21(m，1H，H-5)，4.03(m，2H，H-6)，3.85(m，1H，H-5′)，3.76(m，1H，H-4)，2.09，2.09，2.07，2.02，2.02，2.01和1.99(7×s，各3H，6×OAc和SMe)。13C NMR(CDCl3)δ：171.14，170.28，170.28，170.01，169.91，169.03和161.75(7×CO)，100.96(C-1′)，91.67(TCA)，83.98(C-1)，75.89(C-4)，70.76(C-3′)，70.75(C-3)，70.43(C-5′)，68.98(C-5)，68.91(C-2′)66.46(C-4′)，61.79和60.69(C-6和C-6′)，54.31(C-2)，20.69，20.59，20.55，20.47，20.47和20.34(6×OAc)，13.51(SMe)。β异头物：1H NMR。(CDCl3)δ：7.48(d，1H，JNH，29.68Hz，NH)，5.33(m，1H，H-4′)，5.28(dd，1H，J2，310.19Hz，J3，49.12Hz，H-3)，5.02(dd，1H，J1′，2′7.64Hz，J2′，3′10.40Hz，H-2′)，4.92(dd，1H，J3′，4′3.27Hz，H-3′)，4.48(m，2H，H-1和H-1′)，4.15(m，1H，H-2)，4.04(m，4H，H-6和H-6′)，3.86(m，1H，H-5′)，3.80(m，1H，H-4)，3.64(m，1H，H-5)，2.15，2.12，2.10，2.04，2.03，2.01和1.92(7×s，各3H，6×OAc和SMe)。13C NMR(CDCl3)δ：170.97，170.36，170.25，170.06，169.94，169.08和162.23(7×CO)，101.51(C-1′)，92.23(TCA)，83.03(C-1)，76.66和76.66(C-4和C-5)，73.61(C-3)，70.81(C-3′)，70.55(C-5′)，70.52(C-2′)，66.41(C-4′)62.09和60.60(C-6和C-6′)，53.62(C-2)，20.85，20.80，20.57，20.56，20.52和20.40(6×OAc)，11.25(SMe)。
实施例17
在氩气下，将10g(8.13mmol)的根据实施例6的受体(通式6的化合物，其中R1＝Bn，R2＝4-氯苯甲酰基，R3＝苯甲酰基，OR1为β型)和10g(1.6当量)的根据实施例16的供体(通式5的化合物，其中R4＝乙酰基，-NR5R6＝三氯乙酰基，X＝SMe)溶解在35ml干燥CHCl3中。在室温向此溶液中加入3.7g NIS和490mg AgOTf，并继续搅拌约20min。将三乙胺(5ml)加入到该浆料中，用CH2Cl2(500ml)稀释然后用硫代硫酸钠溶液(10％)萃取2x，分离有机相，用MgSO4干燥，过滤，浓缩，然后该浆状体在硅胶柱上进行色谱分离，使用CH2Cl2∶丙酮梯度：98∶2→95∶5。收率：12.7g，80％(通式4的化合物，其中R1＝Bn，R2＝4-氯苯甲酰基，R3＝苯甲酰基，R4＝乙酰基，-NR5R6＝-NH-三氯乙酰基，OR1为β型中)。MS(ESP)：1972.1[M+Na]+，1988.1[M+K]+，1948.2[M-H]-，1984.0[M+Cl]-。13C NMR(CDCl3)δ：101.2，100.7，100.0，98.8(异头碳)。Mp.：139-142℃。
实施例18
在氩气下，将100g(120.4mmol)的根据实施例11的供体(通式5的化合物，其中R4＝乙酰基，-NR5R6＝-NH-三氯乙酰基，X＝β-SPh)和118g(96.2mmol)的根据实施例6的受体(通式6的化合物，其中R1＝Bn，R2＝4-氯苯甲酰基，R3＝苯甲酰基，OR1为β型)溶解在250ml干燥CHCl3中。在室温，向此溶液中加入38g NIS和6g AgOTf，并且继续搅拌约1h。该浆料用CH2Cl2(500ml)稀释并经过萃取操作。有机相的最终体积为1.5L，使用450ml 10％Na2S2O3溶液和150ml饱和NaHCO3溶液。在浓缩后，分离出280g棕色浆状体，其经过柱色谱，从而得到通式4的化合物，其中R1＝Bn，R2＝4-氯苯甲酰基，R3＝苯甲酰基，R4＝乙酰基，-NR5R6＝-NH-三氯乙酰基，OR1为β型(物理数据与实施例17的化合物的物理数据相同)。
实施例19
根据实施例18，从实施例11的供体和实施例8的受体类似地制备：通式4的化合物，其中R1＝4-甲基苯基，R2＝4-氯苯甲酰基，R3＝苯甲酰基，R4＝乙酰基，-NR5R6＝-NH-三氯乙酰基，OR1为β型。
来自MeOH的白色晶体
1H数据(CDCl3)：8.0-7.25(m，芳族)，6.8-7.0(m，芳族)，6.4(d，1H，NH)，5.54(m，2H)，5.42(dd，1H)，5.38(dd，1H)，5.3(d，1H)，5.04(m，2H)，4.92(dd，1H)，4.74(d，1H)，4.6(m，4H)，4.4(m，4H)，4.0(m，6H)，3.7(m，5H)，3.4(m，2H)。
13C数据(CDCl3)：177.4(NHTCA羰基)，170.3，170.2，170.1，170.0，169.9，169.0(OAc，羰基)，165.3，165.1，164.9，164.4，164.2，163.5，161.3(OBz羰基)，140.2，140.0，139.9，139.7，139.4，137.9，133.4，133.1，131.2，131.1，130.9，130.8，130.7，129.9，129.1，129.0，128.9，128.6，128.5，128.3，127.9，127.8，127.7，127.6，127.5，127.1(芳族碳)，101.2，100.7，99.9，98.6(异头碳)，91.7(NHTCA CCl3)，76.2，75.4，72.9，72.8，71.7，71.6，70.8，70.7，70.5，69.5，68.9，66.5，62.8，62.1，60.9，60.7，55.7，29.5，21.1，20.6，20.5，20.4，20.3。
实施例20
根据实施例18，从实施例11的供体和实施例9的受体类似地制备：通式4的化合物，其中R1＝4-氯苯基，R2＝4-氯苯甲酰基，R3＝苯甲酰基，R4＝乙酰基，-NR5R6＝-NH-三氯乙酰基，OR1为β型。
1H NMR(CDCl3)：7.95-6.85(m，芳族H)，6.42(d，1H)，5.55(m)，5.4(m，4H)，5.0(m，3H)，4.75(d，1H)，4.55(m，4H)，4.4(m，2H)，4.0(m)，3.7(m，5H)，3.45(m，3H)。
13C NMR(CDCl3)：170.32，170.0，169.0，165.1，164.4，163.6，161.4，140.3，139.9，139.5，134.9，133.9，133.4，131.0，130.0，128.9，128.6，127.9，127.6，127.4，127.1，101.2，100.7，99.9，99.2，91.7，76.2，75.4，73.0，71.6，70.8，70.0，69.6，68.9，68.7，66.6，65.4，63.2，62.7，62.1，60.8，55.7，53.5，30.9。
实施例21
将实施例11的糖基供体(1.0当量)和实施例2的二醇受体(1.0当量)溶解在25mL CH2Cl2中。将该溶液冷却至0℃并加入NBS(1.2当量)。在搅拌10min后，缓慢加入25μL三氟甲磺酸。在反应达到完成后，对其进行通常操作。通过快速色谱纯化粗产物，从而产生通式4的化合物，其中R1＝苄基，R2＝4-氯苯甲酰基，R3＝H，R4＝乙酰基，-NR5R6＝-NH-三氯乙酰基，OR1为β型(56％)。
13C NMR(500MHz)：170.3，170.1，170.0，169.9，169.0，165.0，164.9，164.5，164.3，163.6，162.0，140.0，139.9，139.8，139.7，139.5，137.7，136.3，131.2，131.1，131.0，130.8，130.7，129.0，128.9(2个信号)，128.8，128.6，128.5，128.3，128.1，128.0(2个信号)，127.9，127.6(2个信号)，127.5，127.2，125.2，101.1，100.6，99.4，98.7，91.6，79.8，75.9，75.4，73.2，73.1，72.8，72.1，71.9，71.0，70.7，70.6，70.5(2个信号)，69.0，67.4，66.5，62.8，62.7，61.7，60.8，55.8，22.6，21.3，20.5(2个信号)，20.4。
实施例22
将10g(5.1mmol)经保护的四糖(实施例17)溶解在MeOH(110ml)中并加入NaOMe的溶液(1M，在MeOH中)直到pH 10。将该溶液在40℃搅拌5h，然后通过添加Amberlite IR 120H+树脂进行中和，将该树脂滤除，将滤液蒸发至干。将残余物溶解在温热的DMF(10ml)中并逐滴加入到iPr2O(150ml)中，并且将该悬浮液另外搅拌3h。将沉淀滤除，用iPr2O洗涤(2x20ml)并干燥，从而产生4.2g作为灰白色粉末的产物(91％)(通式3的化合物，其中R1＝Bn，-NR5R6＝-NH-三氯乙酰基，OR1为β型)。MS(ESP)：900.1[M-H]-。13C NMR(D2O)δ：105.6，105.5，104.2，103.7(异头碳)。Mp.：134,5-135℃。
可以类似地从实施例21的化合物制备相同的产物。
实施例23
根据实施例22，从实施例19的化合物类似地制备：通式3的化合物，其中R1＝4-甲基苄基，-NR5R6＝-NH-三氯乙酰基，OR1为β型。
1H NMR(D2O)：7.25(dd，4H，芳族)，4.98(d，1H)，4.88(d，1H)，4.8(s)，4.7(d，1H)，4.5(dd，1H)，4.44(d，1H)，4.18d(1H)，3.9(m)，3.78(m)，3.6(m)，3.36(s)。
13C NMR(D2O)：167.7，141.5，136.2，132.0，131.7，105.7，105.6，104.2，103.7，94.3，84.2，81.1，80.9，78.1，77.6，77.5，77.4，77.1，75.5，75.3，74.5，74.1，73.7，72.9，71.3，71.0，63.8，63.7，62.9，62.6，60.0，51.6，23.0。
实施例24
根据实施例22，从实施例20的化合物类似地制备：通式3的化合物，其中R1＝4-氯苄基，-NR5R6＝-NH-三氯乙酰基，OR1为β型。
1H NMR(D2O)：7.2(m，4H，芳族)，4.96(d，1H)，4.88(d，1H)，4.72(d，1H)，4.62(d，1H)，4.52(m，2H)，4.42(m，1H)，4.16(d，1H)，3.9(m)，3.7(m)，3.65(m)，3.58(m)。
13C NMR(D2O)：167.7(NHTCA羰基)，137.9，136.2，132.9，131.3，105.7，105.6，104.3，103.8(4x异头碳)，94.3(NHTCA CCl3)，84.2，81.4，81.1，80.9，78.1，77.6，77.5，77.4，77.1，75.5，75.3，74.6，74.5，73.7，73.4，72.9，71.3，71.0，63.8，63.7，62.8，62.6，60.2，60.0，59.8。
实施例25
将35g的实施例22的化合物溶解在110ml MeOH和110ml KOH(7.5g)水溶液中并将该混合物在室温搅拌1天。然后利用冰浴冷却该混合物，通过HCl气体中和并浓缩至干。然后在室温用吡啶(150ml)和乙酸酐(150ml)将粗褐色玻璃状物(通式2的化合物，其中R1＝Bn，OR1为β型，13C NMR(D2O)δ：107.1，105.7，105.4，103.7(异头碳))乙酰化1天。将溶液浓缩，将该浆料溶解在CH2Cl2中，用1M HCl溶液萃取有机相，然后用饱和NaHCO3溶液萃取有机相，用MgSO4干燥，过滤并浓缩，从而产生43g褐色泡沫。使其经过柱色谱，从而得到通式4a的化合物，其中R1＝Bn，OR1为β型)。13C NMR(CDCl3)δ：101.2，100.8，100.4，99.2(异头碳)。
实施例26
根据实施例25的去-N-酰基化步骤，从实施例23的化合物类似地制备：通式2的化合物，其中R1＝4-甲基苄基，OR1为β型。
1H NMR(D2O)：7.3(dd，4H，芳族)，4.9(d，1H)，4.72(dd，1H)，4.5(m)，4.18(d，1H)，3.95(m)，3.8-3.55(m)，3.34(dd)。
13C NMR(D2O)：184.1，141.4，136.6，136.1，131.9，131.6，131.4，105.7，105.3，105.2，100.0，84.8，81.0，80.9，78.0，77.7，77.5，77.4，77.1，75.9，75.5，75.2，74.4，74.0，73.6，73.2，72.7，72.4，71.2，70.9，63.7，63.6，62.5，58.9，25.9。
实施例27
根据实施例25的去-N-酰基化步骤，从实施例24的化合物类似地制备：通式2的化合物，其中R1＝4-氯苄基，OR1为β型。
1H NMR(D2O)：7.4(s，4H，芳族)，4.9(m，2H)，4.75(m)，4.52(dd，1H)，4.46(dd，1H)，4.18(d，1H)，3.96(m)，3.86(m)，3.7(m)，3.62(m)。
13C NMR(D2O)：184.1，137.9，136.2，132.9，132.6，131.3，105.7，105.2，104.0，103.8，84.6，80.9，80.7，78.1，77.6，77.4，77.1，75.5，75.2，74.4，73.6，73.4，72.7，71.2，70.9，63.8，63.6，62.8，62.4，58.6，51.6，25.9。
实施例28
将140g(107.5mmol)过乙酰化的四糖(实施例25)溶解在1.5L MeOH中，加入NaOMe溶液(1M)直到pH 10，并将该混合物在50℃搅拌过夜。产物从该反应混合物中结晶。允许该混合物冷却至室温，然后将其冷却，过滤，用冷的EtOH洗涤滤液，然后干燥，从而产生69g白色粉末(通式1的化合物，其中R1＝Bn，OR1为β型；80％)。13C NMR(D2O)δ：105.6，105.5，105.4，103.6(异头碳)。Mp.：284-286℃。
实施例29
在室温，将150g纯化的胺(通式2的化合物，R1＝苄基，OR1为β型)加入到水(150mL)和MeOH(200mL)的混合物中。加入一个部分的乙酸酐(20mL)。1h的搅拌后，加入额外的10mL乙酸酐并将混合物在室温搅拌。在1h的搅拌后，加入额外的10mL乙酸酐并将混合物在室温再搅拌2h。最后，混合物是结晶物质。加入MeOH(250mL)并将混合物放入冰箱过夜。过滤固体，用冷的MeOH(200mL)洗涤滤饼，从而产生260g浅褐色固体。此固体在50℃在大气压下干燥(3天)，产生118g产物(通式1的化合物，R1＝Bn，OR1为β型)。80g在MeOH/水中的再结晶产生具有99.7％纯度(根据HPLC)的72.6g产物。
实施例30
根据实施例29，从实施例26的化合物类似地制备：通式1的化合物，R1＝4-甲基苄基，OR1为β型。
1H NMR(D2O)：7.3(dd，4H)，4.88(d，1H)，4.7(m)，4.54(d，1H)，4.48(d，1H)，4.42(d，1H)，4.34(d)，4.0-3.5(m)，3.34(dd，1H)。
13C NMR(D2O)：184.2，177.6，173.7，141.5，136.1，131.9，131.4，105.6，105.5，105.4，103.6，93.2，84.7，81.5，81.0，80.8，78.0，77.6，77.4，77.1，75.5，75.2，74.8，74.0，73.6，72.9，63.7，62.8，58.9，56.4，25.9，22.9。
实施例31
根据实施例29，从实施例27的化合物类似地制备：通式1的化合物，R1＝4-氯苄基，OR1为β型。
1H NMR(D2O)：7.4(s，4H)，4.9(d，1H)，4.72(m)，4.52(d，1H)，4.8(d，1H)，4.42(d，1H)，4.16(d，1H)，4.0-3.52(m)。
13C NMR(D2O)：138.9，177.6，138.3，137.9，136.2，131.3，105.6，105.5，105.4，103.7，93.2，86.1，84.7，81.5，81.0，80.8，78.0，77.5，77.4，77.2，77.1，75.5，75.2，74.9，63.7，58.9，57.8，56.4，24.8。
实施例32
将40g(50.1mmol)苄基糖苷(实施例28或29)溶解在200ml水、1.6gPd-C中并加入400μl乙酸，并将该混合物在室温在H2气氛(约40bar)下搅拌2天。滤除催化剂，用水洗涤滤饼，并将滤液逐滴加入到1.6l丙酮中，然后冷却，过滤并将收集的固体在真空下干燥，从而产生31.5g LNnT的白色粉末(44.5mmol，89％)。
实施例33
将苄基糖苷(实施例28或29，100g)溶解在300ml水、2ml乙酸中并加入30ml MeOH，然后加入10g Pd-C(5％)。在室温，将该混合物在5bar的氢气下氢化2天。将活性炭(5g)加入到该混合物中，滤除催化剂和碳，用水(200ml)稀释滤液，将该水溶液加热至50℃。通过加入EtOH(4L)如上所述地进行结晶。分离得到65g LNnT的白色固体。
实施例34
将50g苄基糖苷(实施例28或29)溶解在110mL水中并用MeOH(120mL)稀释该溶液。加入Pd-C(2g，10％Pd)催化剂，并在60℃在H2气氛下(5bar)氢化该混合物。在7h后，滤除催化剂，用约20mL水∶MeOH混合物(1∶1)洗涤滤饼。
结晶：将以上获得的溶液温热(50-55℃)，在逐渐冷却至40℃的过程中向其中分3-5个部分加入热的MeOH(600mL)。结晶立即开始。在加入甲醇后，将结晶混合物缓慢(3h)冷却至室温，然后放入冰箱过夜。在玻璃滤器上过滤，用冷的MeOH洗涤固体，并在60℃在真空干燥烘箱中干燥2天，从而产生37.4g白色固体。HPLC纯度：100％，mp.：226-230℃。13C-NMR(600MHz，D2O∶CD3OD＝3∶2)δ：Glc(α)C-193.2 C-2 72.5 C-3 72.7 C-4 79.5 C-5 71.3 C-6 61.2，Glc(β)C-1 97.2 C-275.2 C-3 75.7 C-4 79.5 C-5 76.1 C-6 61.3，Gal C-1 104.3 C-2 71.4 C-3 83.1C-4 69.7 C-5*76.2 C-6 62.3，GlcNAc C-1 104.1 C-2 56.4 C-3 73.4 C-4 79.2C-5 75.8 C-6 61.0 NCOCH3 23.3 174.8，Gal C-1 104.2 C-2 72.3 C-3 73.9C-4 69.9 C-5*76.6 C-6 62.3(*可互换的分配)。

Claims (22)

1.一种用于制备Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc(LNnT)的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通式5表征的供体
Figure FDA00002020133200011
通式5
其中R4是任选取代的酰基，
-NR5R6选自-NAc2、-NH-卤代酰基、苯邻二甲酰亚胺、四氯苯邻二甲酰亚胺、2，3-二苯基马来酰亚胺和2，3-二甲基马来酰亚胺，
X选自卤素、-OC(＝NH)CCl3、-OAc、-OBz和-SR7，其中R7选自烷基和任选取代的苯基，
与通式6的受体发生反应
Figure FDA00002020133200012
通式6
其中R1是通过催化氢解可去除的基团，
R2是任选取代的酰基，并且
R3选自任选取代的酰基或H，
从而生成通式4的化合物
Figure FDA00002020133200013
通式4
其中R1、R2、R3、R4和-NR5R6是如上所定义的，
b)将所述通式4的化合物转化为通式1的化合物
Figure FDA00002020133200021
通式1
其中R1是如上所定义的，
c)使所述通式1的化合物结晶，以及
d)随后使所述通式1的化合物经过催化还原。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中，在所述通式5的供体中，-NR5R6是-NH-卤代酰基并且X是-SR7，其中R7选自任选取代的烷基或任选取代的苯基；以及在通式6的化合物受体中，R1是任选取代的苄基并且R3选自H和任选取代的苯甲酰基。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中在步骤b)中，所述通式4的化合物向所述通式1的化合物的转化包括以下步骤：
ba)所述通式4的化合物的碱催化酯交换去保护或碱性水解，其中-NR5R6是-NAc2，从而获得通式1的化合物，或者
bb)所述通式4的化合物的碱催化酯交换去保护，其中-NR5R6选自-NH-卤代酰基、苯邻二甲酰亚胺、四氯苯邻二甲酰亚胺、2，3-二苯基马来酰亚胺和2，3-二甲基马来酰亚胺，从而获得通式3的化合物
通式3
其中R1和-NR5R6是如上所定义的，所述通式3的化合物经过碱性水解或氨解，从而产生通式2的化合物
Figure FDA00002020133200023
通式2
其中R1是如上所定义的，所述通式2的化合物被转化为所述通式1的化合物，或者
bc)所述通式4的化合物的碱性水解，其中-NR5R6选自-NH-卤代酰基、2，3-二苯基马来酰亚胺和2，3-二甲基马来酰亚胺，从而获得通式2的化合物
Figure FDA00002020133200031
通式2
其中R1是如上所定义的，所述通式2的化合物被转化为所述通式1的化合物，或者
bd)所述通式4的化合物的碱性水解，其中-NR5R6选自苯邻二甲酰亚胺和四氯苯邻二甲酰亚胺，接着进行氨解，从而获得通式2的化合物
通式2
其中R1是如上所定义的，所述通式2的化合物被转化为所述通式1的化合物，或者
be)所述通式4的化合物的氨解，其中-NR5R6选自-NAc2、-NH-卤代酰基、苯邻二甲酰亚胺、四氯苯邻二甲酰亚胺、2，3-二苯基马来酰亚胺和2，3-二甲基马来酰亚胺，从而获得通式2的化合物
Figure FDA00002020133200033
通式2
其中R1是如上所定义的，所述通式2的化合物被转化为所述通式1的化合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述通式2的化合物被
a)N-乙酰化，从而获得通式1的化合物，
或者
b)过乙酰化，从而得到通式4a的化合物
Figure FDA00002020133200041
通式4a
其中R1是如上所定义的，
接着进行碱催化酯交换反应或碱性水解，从而获得通式1的化合物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤c)中的所述结晶在包含一种或多种C1-C6醇的溶剂中进行，优选在含水甲醇或含水乙醇中进行，并且R1是苄基。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中使其中R1是苄基的所述通式1的化合物经过催化氢化。
7.一种Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc(LNnT)的多晶型物，其特征在于，基于使用CuKα辐射的测量，所述多晶型物显示在20.32±0.20 2Θ角的X射线粉末衍射反射，优选在20.32±0.20和19.10±0.20 2Θ角，更优选在20.32±0.20、19.10±0.20和7.98±0.20 2Θ角，甚至更优选在20.32±0.20、19.10±0.20、7.98±0.20和21.03±0.20 2Θ角，最优选20.32±0.20、19.10±0.20、7.98±0.20、21.03±0.20和20.95±0.20 2Θ角，尤其是20.32±0.20、19.10±0.20、7.98±0.20、21.03±0.20、20.95±0.20和5.66±0.20 2Θ角。
8.根据权利要求7所述的Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc的多晶型物，所述多晶型物显示在226-230℃之间的熔点。
9.根据权利要求7和8中任一项所述的Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc的多晶型物，其用作药物。
10.根据权利要求7和8中任一项所述的Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc的多晶型物，其用作营养添加剂。
11.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求7和8中任一项定义的Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc的多晶型物。
12.一种营养组合物，所述营养组合物包含根据权利要求7和8中任一项定义的Galpβ1-4GlcNAcpβ1-3Galpβ1-4Glc的多晶型物。
13.一种通式1’的化合物
Figure FDA00002020133200051
通式1’
其中R’1选自取代的苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基。
14.一种通式2’的化合物
通式2’
其中R’1选自取代的苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基.
15.一种通式3的化合物
Figure FDA00002020133200053
通式3
其中R1选自任选取代的苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基，而-NR5R6选自-NH-卤代酰基，苯邻二甲酰亚胺，四氯苯邻二甲酰亚胺，2，3-二苯基马来酰亚胺和2，3-二甲基马来酰亚胺。
16.根据权利要求15所述的化合物，其中R1选自苄基，4-甲基苄基和4-氯苄基，优选苄基，而-NR5R6是-NH-卤代酰基，优选-NH-三氯乙酰基。
17.一种通式4’的化合物
Figure FDA00002020133200054
通式4’
其中R1选自任选取代的苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基，而R2和R4各自独立地是任选取代的酰基，R3选自任选取代的酰基和H，-NR5R6选自-NAc2，-NH-卤代酰基，四氯苯邻二甲酰亚胺，2，3-二苯基马来酰亚胺和2，3-二甲基马来酰亚胺。
18.根据权利要求17所述的化合物，其中R1选自苄基，4-甲基苄基和4-氯苄基，优选苄基，R2是任选地被氯取代的苯甲酰基，R3是任选取代的苯甲酰基，优选苯甲酰基，R4是乙酰基，而-NR5R6是-NH-卤代酰基，优选-NH-三氯乙酰基。
19.一种通式4a的化合物
通式4a
其中R1选自任选取代的苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基。
20.一种通式5’的化合物
Figure FDA00002020133200062
通式5’
其中R4是任选取代的酰基，优选乙酰基，-NR5R6是-NH-卤代酰基，优选-NH-三氯乙酰基或-NH-三氟乙酰基，而R7是任选取代的苯基，优选苯基。
21.一种通式6’的化合物
Figure FDA00002020133200063
通式6’
其中R1选自任选取代的苄基，任选取代的二苯甲基，任选取代的三苯甲基和任选取代的萘甲基，R2是任选取代的苯甲酰基，而R3选自任选取代的酰基和H。
22.根据权利要求21所述的化合物，其中R2是任选取代的苯甲酰基，优选苯甲酰基或4-氯苯甲酰基，而R3是苯甲酰基或H。
CN2011800097783A 2010-02-19 2011-02-21 用于制备含n-乙酰乳糖胺的四糖乳糖-n-新四糖(lnnt)的方法 Pending CN102803282A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510751641.5A CN105330705A (zh) 2010-02-19 2011-02-21 用于制备含n-乙酰乳糖胺的四糖乳糖-n-新四糖(lnnt)的方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA201070060 2010-02-19
DKPA201070060 2010-02-19
PCT/DK2011/050053 WO2011100980A1 (en) 2010-02-19 2011-02-21 A method for preparation of the tetrasaccharide lacto-n-neotetraose (lnnt) containing n-acetyllactosamine

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510751641.5A Division CN105330705A (zh) 2010-02-19 2011-02-21 用于制备含n-乙酰乳糖胺的四糖乳糖-n-新四糖(lnnt)的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102803282A true CN102803282A (zh) 2012-11-28

Family

ID=44482456

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011800097783A Pending CN102803282A (zh) 2010-02-19 2011-02-21 用于制备含n-乙酰乳糖胺的四糖乳糖-n-新四糖(lnnt)的方法
CN201510751641.5A Pending CN105330705A (zh) 2010-02-19 2011-02-21 用于制备含n-乙酰乳糖胺的四糖乳糖-n-新四糖(lnnt)的方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510751641.5A Pending CN105330705A (zh) 2010-02-19 2011-02-21 用于制备含n-乙酰乳糖胺的四糖乳糖-n-新四糖(lnnt)的方法

Country Status (6)

Country Link
US (2) US8993740B2 (zh)
EP (2) EP3241836A1 (zh)
CN (2) CN102803282A (zh)
DE (1) DE202011111124U1 (zh)
HK (1) HK1246302A1 (zh)
WO (1) WO2011100980A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103562214A (zh) * 2011-05-13 2014-02-05 格力康公司 人乳寡糖(hmo)或其前体的多样化
CN104231009A (zh) * 2013-06-08 2014-12-24 上海医药工业研究院 一种果聚糖、其中间体、制备方法及用途

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2805501A1 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Glycom A/S Synthesis of new sialooligosaccharide derivatives
KR20140036227A (ko) 2011-05-13 2014-03-25 글리콤 에이/에스 모유 올리고사카라이드(hmo) 또는 그의 전구체의 생성 방법
EP2760875A4 (en) * 2011-09-30 2015-08-26 Glycom As SYNTHESIS OF HMO NUCLEAR STRUCTURES
PT2775852T (pt) * 2011-10-18 2016-11-08 Nestec Sa Composição para utilização no crescimento cerebral e/ou desenvolvimento cognitivo e/ou psicomotor
WO2013182206A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Glycom A/S Method for producing oligosaccharides and oligosaccharide glycosides by fermentation
US9896470B2 (en) 2012-06-14 2018-02-20 Glycom A/S Enhancing the stability and purity and increasing the bioavailability of human milk oligosaccharides or precursors or blends thereof
WO2013190531A1 (en) * 2012-06-22 2013-12-27 Glycom A/S Glycosylated galactosyl disaccharides, methods for their production and their use in consumable products
CN102942598B (zh) * 2012-11-28 2015-07-01 济南圣泉唐和唐生物科技有限公司 一种乙酰糖卤代反应的后处理方法
WO2014086373A1 (en) * 2012-12-07 2014-06-12 Glycom A/S Crystallisation of human milk oligosaccharides (hmo)
DE202013012839U1 (de) 2012-12-18 2020-05-15 Glycom A/S Neue Polymorphe von LNnT
PL2999358T3 (pl) 2013-05-22 2021-12-20 Glycom A/S Syntetyczna mieszanina oligosacharydów do leczenia mikrobioty ssaka
WO2015032413A1 (en) 2013-09-06 2015-03-12 Glycom A/S Fermentative production of oligosaccharides
US10314852B2 (en) 2014-10-24 2019-06-11 Glycom A/S Mixtures of HMOs
US11040050B2 (en) 2014-10-29 2021-06-22 Glycom A/S Composition comprising HMSs/HMOs and use thereof
PL3212198T3 (pl) 2014-10-29 2021-08-23 Glycom A/S Syntetyczna kompozycja i sposób promowania gojenia się błony śluzowej
CN115364113A (zh) 2014-10-29 2022-11-22 格礼卡姆股份公司 合成组合物以及用于治疗肠易激综合症的方法
US11040049B2 (en) 2014-10-29 2021-06-22 Glycom A/S Composition comprising HMSs/HMOs and use thereof
WO2016086947A1 (en) * 2014-12-05 2016-06-09 Glycom A/S Crystalline difucosyllactose
CN107106584A (zh) 2014-12-08 2017-08-29 格礼卡姆股份公司 用于治疗代谢障碍的合成组合物
US10881674B2 (en) 2014-12-08 2021-01-05 Glycom A/S Synthetic composition for treating metabolic disorders
US10987368B2 (en) 2014-12-08 2021-04-27 Glycom A/S Synthetic composition for preventing or treating CVD
US10835544B2 (en) 2014-12-08 2020-11-17 Glycom A/S Synthetic composition for regulating satiety
US10709721B2 (en) 2015-03-05 2020-07-14 Societe Des Produits Nestle S.A. Compositions for use in the prevention or treatment of gastrointestinal infections/inflammations in infants or young children
EP3265099B1 (en) 2015-03-05 2023-08-09 Glycom A/S Human milk oligosaccharides for treating acute respiratory tract infections
ES2971093T3 (es) 2015-03-31 2024-06-03 Glycom As Mezclas de oligosacáridos de la leche humana que comprenden 3'-O-sialilactosa
ES2870973T3 (es) 2015-06-09 2021-10-28 Glycom As Mezclas ternarias de 6'-SL, LNnT y LST c
EP3349763B1 (en) 2015-09-14 2021-08-11 Glycom A/S Composition for use in microbiota modulation
ES2927009T3 (es) 2015-10-28 2022-10-31 Glycom As Composición sintética y método para modular la función cerebral y la conducta
ES2950489T3 (es) 2015-10-28 2023-10-10 Glycom As Composición sintética y método para modular los trastornos de la emoción y del ánimo
CN108348536B (zh) 2015-11-17 2021-09-24 格礼卡姆股份公司 治疗抗生素相关性并发症的合成组合物
CN108289492A (zh) 2015-12-15 2018-07-17 雀巢产品技术援助有限公司 Hmo的混合物
WO2017144062A1 (en) 2016-02-24 2017-08-31 Glycom A/S Synthetic composition for microbiota modulation
EP3452050B1 (en) 2016-05-05 2022-11-23 Glycom A/S Composition comprising hmos for the treatment of non-infectious diarrhoea
PL3452051T3 (pl) 2016-05-05 2022-11-14 Glycom A/S Kompozycja zawierająca hmos do zastosowania w leczeniu nadwrażliwości trzewnej i/lub bólu trzewnego mediowanych komórkami tucznymi
EP3458073B1 (en) 2016-05-19 2023-10-25 Glycom A/S Use of human milk oligosaccharides for treating migraine in patients with inflammatory bowel syndrome
WO2017215722A1 (en) * 2016-06-15 2017-12-21 Glycom A/S Synthetic composition comprising hmo and method for modulating emotion and mood disorders
EP3474861A4 (en) 2016-06-24 2020-04-15 Glycom A/S COMPOUNDS COMPRISING HMOS FOR THE PREVENTION AND / OR TREATMENT OF VIRAL AND / OR BACTERIAL INFECTIONS.
WO2018077368A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Glycom A/S Method for removing residual organic solvent from a crystalline oligosaccharide
US11278558B2 (en) 2017-03-01 2022-03-22 Glycom A/S Synthetic composition for microbiota modulation
WO2018207110A1 (en) 2017-05-09 2018-11-15 Glycom A/S Synthetic composition for microbiota modulation
US11541068B2 (en) 2017-05-24 2023-01-03 Glycom A/S HMO compositions and methods for reducing autism spectrum disorder symptoms
US11541067B2 (en) 2017-05-24 2023-01-03 Glycom A/S HMO compositions and methods for reducing detrimental proteolytic metabolites
CN110914284A (zh) 2017-07-12 2020-03-24 格礼卡姆股份公司 包含中性单糖或寡糖和酸性非碳水化合物组分的无定形混合物
EP3672600A4 (en) 2017-08-21 2021-05-19 Glycom A/S SYNTHETIC COMPOSITION TO REDUCE ALLERGY SYMPTOMS
EP3691658A4 (en) 2017-10-04 2021-06-23 The Regents of The University of California IMMUNOMODULATOR OLIGOSACCHARIDES
WO2019087140A1 (en) 2017-11-02 2019-05-09 Glycom A/S One or more hmos for reducing or preventing fatigue and/or improving focus or concentration
BR112020010863A2 (pt) 2017-11-30 2020-11-10 Glycom A/S mistura de hmos para tratamento da sensibilidade ao trigo
CN111556755A (zh) 2017-12-05 2020-08-18 格礼卡姆股份公司 用于治疗偏头痛的人乳寡糖
WO2019123316A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Glycom A/S Composition comprising hmos for preventing or reducing nociception
US11554131B2 (en) 2018-05-31 2023-01-17 Glycom A/S Mixture of HMOs for treating autoimmune diseases
KR20210104773A (ko) 2018-12-19 2021-08-25 글리콤 에이/에스 저-포드맵 식단을 사용한 인간 치료를 위한 조성물 및 방법
CN111925403A (zh) * 2019-05-13 2020-11-13 山东大学 一类氨基葡萄糖给体及其应用
EP3750902A1 (en) * 2019-06-14 2020-12-16 Jennewein Biotechnologie GmbH Process for the purification of lacto-n-neotetraose
US20230381211A1 (en) 2020-10-16 2023-11-30 Societe Des Produits Nestle S.A. Nutritional composition comprising human milk oligosaccharides
US20240009216A1 (en) 2020-11-10 2024-01-11 Societe Des Produits Nestle S.A. Nutritional composition
WO2022223430A1 (en) 2021-04-19 2022-10-27 Dsm Ip Assets B.V. A composition of enzymes and human milk oligosaccharides
DK181566B1 (en) 2021-12-21 2024-05-24 Dsm Ip Assets Bv Crystallization of LNnT
WO2023141513A2 (en) * 2022-01-19 2023-07-27 The Regents Of The University Of California Functionalized human milk oligosaccharides and methods for producing them

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1297892A (zh) * 1999-11-25 2001-06-06 中国科学院生态环境研究中心 一种制备1→6连接的、具有1,2反式糖苷键吡喃寡糖的新方法
CN1303857A (zh) * 1999-12-16 2001-07-18 中国科学院生态环境研究中心 香菇多糖核心片段三糖,四糖,六糖,七糖的合成
US20040019198A1 (en) * 2002-06-11 2004-01-29 Crich David C. Method of forming glycosidic bonds from thioglycosides using an N,N-dialkylsulfinamide
CN101168550A (zh) * 2006-10-25 2008-04-30 中国科学院大连化学物理研究所 一种氨基葡萄糖四糖的合成方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6821756B2 (en) 1996-09-17 2004-11-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Processes for reproducing sugar nucleotides and complex carbohydrates
JP3100559B2 (ja) 1997-02-26 2000-10-16 ヤマサ醤油株式会社 ラクト−ｎ−ネオテトラオースの製造法
EP1405856B1 (en) 2001-06-11 2018-09-26 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Crystals of oligosaccharides and processes for preparation thereof
FI115919B (fi) * 2002-06-27 2005-08-15 Danisco Sweeteners Oy Menetelmä kiteytysinhibiittoreiden poistamiseksi monosakkaridisokeriliuoksista
US8197872B2 (en) * 2007-05-17 2012-06-12 The Regents Of The University Of California Human milk oligosaccharides to promote growth of beneficial gut bacteria

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1297892A (zh) * 1999-11-25 2001-06-06 中国科学院生态环境研究中心 一种制备1→6连接的、具有1,2反式糖苷键吡喃寡糖的新方法
CN1303857A (zh) * 1999-12-16 2001-07-18 中国科学院生态环境研究中心 香菇多糖核心片段三糖,四糖,六糖,七糖的合成
US20040019198A1 (en) * 2002-06-11 2004-01-29 Crich David C. Method of forming glycosidic bonds from thioglycosides using an N,N-dialkylsulfinamide
CN101168550A (zh) * 2006-10-25 2008-04-30 中国科学院大连化学物理研究所 一种氨基葡萄糖四糖的合成方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MITREE M. PONPIPOM等: "Synthesis of paragloboside analogs", 《TETRAHEDRON LETTERS》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103562214A (zh) * 2011-05-13 2014-02-05 格力康公司 人乳寡糖(hmo)或其前体的多样化
US9382564B2 (en) 2011-05-13 2016-07-05 Glycom A/S Diversification of human milk oligosaccharides (HMOs) or precursors thereof
CN103562214B (zh) * 2011-05-13 2016-10-19 格力康公司 人乳寡糖(hmo)或其前体的多样化
CN103562214B9 (zh) * 2011-05-13 2016-12-14 格力康公司 人乳寡糖(hmo)或其前体的多样化
US9963729B2 (en) 2011-05-13 2018-05-08 Glycom A/S Diversification of human milk oligosaccharides (HMOs) or precursors thereof
CN104231009A (zh) * 2013-06-08 2014-12-24 上海医药工业研究院 一种果聚糖、其中间体、制备方法及用途
CN104231009B (zh) * 2013-06-08 2017-07-04 上海医药工业研究院 一种果聚糖、其中间体、制备方法及用途

Also Published As

Publication number Publication date
DE202011111124U1 (de) 2020-05-22
US8993740B2 (en) 2015-03-31
US20150239923A1 (en) 2015-08-27
WO2011100980A1 (en) 2011-08-25
EP2536737A4 (en) 2013-10-02
CN105330705A (zh) 2016-02-17
US20120309949A1 (en) 2012-12-06
HK1246302A1 (zh) 2018-09-07
EP2536737A1 (en) 2012-12-26
EP2536737B1 (en) 2017-05-31
EP3241836A1 (en) 2017-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102803282A (zh) 用于制备含n-乙酰乳糖胺的四糖乳糖-n-新四糖(lnnt)的方法
US9237764B2 (en) Production of 6′-O-sialyllactose and intermediates
EP2417143B1 (en) Synthesis of 2'-o-fucosyllactose
WO2012113405A1 (en) Catalytic hydrogenolysis of a composition of a mixture of oligosaccharide precursors and uses thereof
WO2013091660A1 (en) A method for obtaining crystalline lacto-n-tetraose and lacto-n-neotetraose precursors and mixtures thereof
US10500221B2 (en) Crystalline difucosyllactose
CN103703012A (zh) 乳糖-n-四糖的制造
CN103958537A (zh) Hmo核心结构的合成
CN103443113A (zh) 新型含岩藻糖的糖类衍生物的合成
EP2828275A1 (en) Synthesis of the trisaccharide 3-o-fucosyllactose and intermediates thereof
CN104812768B (zh) 晶体3-o-岩藻糖基乳糖
CN110818750B (zh) 一种甜菊苷r的合成方法
TW201629077A (zh) 抗壞血酸衍生物及使用該衍生物的配醣體之製造方法
Verma et al. International Journal of Carbohydrate Research

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20121128