JP2008292478A - マイクロウェル・アレイ内の物質のスクリーリングの方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】液体や懸濁液内に存在する細胞を含む材料を大量の微小サンプルとして操作し、解析するための装置を生産し使用する方法に係わる。平行な貫通穴がプラテン内に形成され、これに液体が充填される。貫通穴の位置に関係して、特定の物質の濃度あるいはその他の物理量の傾きが生じるような方法で充填が行われる。既に充填されたマイクロ・ウェル・アレイを個々の貫通穴が一致するように互いに接触させることによって、貫通穴の内容物の混合が行われる。
【選択図】図10
Description
本発明の好適な実施例においては、複数の異なったサンプル・コンテナにサンプルを充填する方法であって、サンプル・コンテナが全体の構造を構成し、各コンテナ内の特定の物質の濃度が構造内におけるコンテナの位置に関係した傾きによって特徴付けられる。この方法は第一の液体を異なったコンテナの中に充填するステップとコンテナを第二の液体に接触させるステップを有し、第二の液体が特定の物質を含み、この特定の物質が異なったコンテナの中へ拡散する程度を制御して、コンテナの間で異なるようにしている。
本発明は、貫通穴のあいたアレイ(array)内において異なった化学反応を発生させるための方法を提供する。本発明は、例えばスクリーニング処理を行うときに、異なる反応条件をアレイの種々の貫通穴に適切に提供できることから、都合よく使用することができる。本発明を利用する形態は多くあるが、その中の一つの例として、アレイに設けられた異なった貫通穴に、異なる化学種を入れることができ、また、種々の化学種の濃度を、種々の貫通穴間で異なるようにすることもできる。従って、本発明は、例えば、患者に吸収される各化合物の機能を予測するために、化合物のライブラリーをスクリーニングする方法を提供することができる。
体積が一定でない貫通穴を有するアレイの一つの応用として、後述するような、希釈シーケンスのように異なった体積の液体を混合する場合が考えられる。この方法の利点は、これも後述することであるが、幅広い範囲の希釈が可能となる一方、数多くのアレイを重ねる必要がないことである。
図7について説明する。プラテン10に使用される材料に合った適切な手段によって、プラテン10内に貫通穴を形成することができる。例えば、貫通穴を形成する方法としては、ガラスまたはポリマーに100μmの貫通穴を形成することができる紫外線(UV)エキシマ・レーザーを使用したレーザー・アブレーションによる方法がある。貫通穴を形成することができる更に別の技術的手段として、機械的なドリリング、微小放電加工(EDM)、導電性材料のイオン化除去のための高周波パルスによる技術、あるいは、本発明の別の実施例であるが、選択的化学エッチングまたは荷電粒子エッチング技術がある。また、種々の組成を持ったガラスファイバーからできた微小毛細管の束をプリフォームとして引き揃え、これをスライスすることによってプラテンを形成し、その後に貫通穴を形成するためにエッチング処理して製作する方法もある。
沈浸による充填方法
図9a-9cについて説明する。貫通穴12を有するアレイ10は、次のいずれかの手法を使って充填される。一つは特定の貫通穴に直接処理する方法であり、もう一つは物質の組成や濃度、その他の特性に基づいて特定のパターンに従ってアレイの全体に充填する手法である。
アレイ表面上に液滴を流すことにより充填する方法は、アレイ全体または一つのアレイ中の一つのグループを構成するチャンネルに、同じ流体を充填するために使用される。これは、コストとロスを少なくしなければならないサンプルを充填するのに適している。液滴を流すことにより充填するために、充填する溶液の液滴は注射針の先端、マイクロ・ピペット、あるいはその他の液体注入毛細管が利用される。液滴は充填すべき貫通穴の上のアレイ面上に置かれる。液滴をアレイの表面に沿って、充填すべきチャンネルの上に流すために毛細管を移動させる。毛細管の先端と液滴の間は、表面張力によって接触し続ける。液滴が使い尽くされると、充填すべき全ての貫通穴が充填されるまで更に別の液滴が置かれる。その後毛細管と残った液滴はアレイの表面から取り除かれる。
本発明の更に別の実施例においては、標準的なマイクロ・タイター・プレート(microtiter plate: 滴定量に使用するプレート)(例えば、96, 384, あるいは1536個のウェルを有するもの)から貫通穴を有する単一のアレイまたは多数のアレイに液体を移送するための方法が提供されている。ここで、多数のアレイの場合には、一つのアレイと、次に配置する別のアレイの穴が同じ空間的関係を持って配置され、この穴が互いに一致するように垂直に積み重ねられる(スタックされる)。ここで使用されている、「一致する」という用語は、貫通穴を有する一枚のプレートと貫通穴を有する他の少なくとも一枚のプレートのアライメントが調整されており、そのため、複数のプレートのうちの一枚のプレートに設けられた複数の貫通穴の上部と、複数のプレートのうちの他の一枚のプレートまたは複数のプレートに設けられた貫通穴の底部とが一致していることを言い、それによって連結された複数のチャンネルを形成するものである。
図10と11について説明する。本発明の更に別の実施例として、標準的なマイクロ・タイター・プレート(96-, 384-, あるいは1536-のウェルの構成のもの)から貫通穴を有する一枚のアレイまたは多数のアレイに液体を移送するために特に適した装置および方法が提供されている。ここで、多数のアレイの場合には、一つのアレイと、次に配置する別のアレイの穴が同じ空間的関係を持って配置され、この穴が互いに一致するように垂直に積み重ねられる(スタックされる)。分子または細胞のライブラリの複製を作るために上述した積み重ねられたアレイが使用される。
断面とって見ると、毛細管チューブの束100は、貫通穴マイクロ・ウェルのアレイ10に設けた貫通穴の中に精度よく適合する外径を持った毛細管チューブ102から構成されている。チューブ102の端部104ではチューブの中心間距離106が貫通穴アレイ10の穴間距離(あるいは、必要であれば複数の穴間距離)に等しくなっており、チューブの反対側端部108ではチューブの中心間距離はマイクロ・タイター・プレート114のウェル112の穴間距離110に等しくなるように設計されている。プレート116,118,および120は貫通穴を備え、中間に分離して配置され、規則正しくチューブを保持する治具として機能する。チューブの中心間距離は長手方向で変化するので、両端の間に配置された追加的な貫通穴プレート116,118,および120は、チューブの束を支持するスペーサー治具としての役割も果たす。
本発明の別の実施例として、図11に断面図として示すものがある。これは、チューブの束130の端部をアレイ・スタック122(アレイを積み重ねたもの)の積み重ねた貫通穴のごく近くに近接させることによって、アレイ・スタックに液体を充填するための方法を提供するものである。液体を入れる貫通穴と同じ中心間距離を有する貫通穴を備えたアライメント・プレート128を使用することにより、チューブの束をアレイ・スタックに対応して整列させることができる。スタック122における各アレイは、貫通穴の穴間隔と同じ寸法(これに限定するものではないが)の小さい間隔sを持たせて配置されている。加圧された容器132の中に配置されているチューブの束の端部に圧力をかけることによって、各毛細管チューブ102から反対側の貫通穴に液体を強制移送できる。貫通穴が充填された後、液滴は二つのプレートの間のスペースの中で成長をし始める。液滴のサイズが液滴がプレートの貫通穴に接触するようになったときに、表面張力によって液体の一部が貫通穴の中に入り込む。いったん、液路が作られると、液体は貫通穴の中に容易に流れ込み、チューブの束の反対側に負荷される圧力によって流入しつづける。圧力負荷を中止すると、貫通穴に入った液滴は後退してプレート間の液路は破断される。その結果、充填後のアレイ・プレートの分離を容易に行うことができるようになる。(即ち、表面張力による抵抗が存在しなくなるからである。) 充填されたプレート10はそこから取り出され、チューブの束も図中に示す128の方向に引き下げられる。従って、垂直方向に穴位置を一致させた貫通穴のセットは、液体の流路となるチャンネルとして機能する。アレイの外部表面には、疎水性のコーティング処理が行われているので、液体が隣の穴に流れ込むのを阻止することができる。この技術は、細胞の懸濁液をアレイ・スタックに充填して、細胞ライブラリの複製プレートを作る場合にも都合よく使用される。
本発明の他の実施例によってアレイ・スタックの貫通穴に液体を充填する方法が図12に示されている。この方法は、マイクロ・タイター・プレート114と同じ横方向寸法を有し、マイクロ・タイター・プレート114に配置されたウェルの内、使用する部分の穴間隔と同じ穴間隔を有する貫通穴アレイ10を使用する。アレイ10がマイクロ・タイター・プレートの上面に置かれたとき、一つまたは二つ以上の貫通穴12がマイクロ・タイター・プレート114内の各ウェル112に一致して整列する。従って、中心間距離をウェルの中心間距離と等しくした注射器132のアレイ130を、マイクロ・タイター・プレートと穴位置を一致させた貫通穴スタックの上に配置することができる。注射器のアレイは貫通穴プレート134の中へ挿入され、注射器がアレイ・スタックに沿って動くことができるように、アレイ・プレートは注射器のチューブの機械的なガイドとなる。注射器のプランジャは機械的に固定されており、機械的または電気-機械的ドライバー・モジュール136によって駆動され、並行的に液体は吸い込まれ、あるいは各注射器から液体が押し出される。注射器のチューブの外径は、好適には、それがスライドしてフィットできるように貫通穴の横方向寸法によって決められる。そして注射器のチューブは、アレイ・スタック122の中を通り、マイクロ・タイター・プレート内の各ウェル112に収容されている液体の中へ挿入できるようにその長さが決められている。
図12b, 12cに示すように、フレキシブルな要素142の束140、例えば形状記憶合金製のファイバー、を用いてマイクロ・タイター・プレート114の個々のウェル112から液体を移送することができる。そのファイバーの外径は、液体を移送するアレイ10の貫通穴12の内径より小さいか等しい。束の中のファイバーの本数は、マイクロ・タイター・プレート114の中のウェルの数と等しくすることができる。ファイバーの束の一方の端部における中心間距離は、貫通穴アレイの穴の中心間距離と等しくし、一方、反対側の端部におけるファイバーの束の中心間距離は、マイクロ・タイター・プレートのウェルの中心間距離と等しくする。このファイバーは、ファイバーの束の一方の端部から他方の端部の間において中心間距離が徐々に大きくなるように設計された一連の貫通穴治具を使用して、一定の位置で保持する。特定の位置でいったん固定されると、形状記憶合金ファイバーを変形させた後の形状が永続するようにするために、変態温度以上にまで加熱する。加熱後室温まで冷却することにより、ファイバーの中心間距離は変化することなく、形状記憶合金ファイバーを保持治具から取り外すことができる。ファイバーの束の一方の端部は、マイクロ・タイター・プレートの各ウェルからの液体を充填する貫通穴アレイの中に挿入することができる。他方の端部は、各ファイバーがマイクロ・タイター・プレートのウェル上に並べて配置できるようになっており、そのファイバーの端部は各ウェル内に収納された液体の中へ浸すことができる。ファイバーの束をマイクロ・タイター・プレートから引上げると、図12cに示すように、小さい体積の液滴144が(例えば表面張力によって)各ファイバー142の端部に付着して残る。貫通穴アレイ10の穴12を通って引っ張るようにしてそのファイバーの束の反対側端部に力を作用させると、その液体は対応する貫通穴と接触しその中へ入り込む。ファイバー142を穴12を通って引っ張られると、ファイバーが取り出されるときに、表面張力が作用し、液体を貫通穴の中に保持することができる。
アドレスを特定できる注入方法を使用することにより、同じ溶質で異なった特定の濃度を有する液体を一連の貫通穴に充填することができる。貫通穴を溶媒の中に浸すか、微小な注射器232によって溶媒を分配するか(図21に示す)、あるいはその他の液体移送装置を使用した充填によって、選択された一連の貫通穴に、Z ナノリッター(nL)と表示された量の溶媒を充填する。これは図13のフロー・チャートに第一のステップ120として示されている。ステップ121では、微小な注射器232、またはその他の液体移送装置が、Xモル/リッターの溶質の入った溶液で充填され、それから第一の貫通穴の上に配置される。この溶液Y nLを注射器の先端から押し出し、注射器のチップの端部において小滴をつくる。ここで(Y+Z) nLは凸状のメニスカスができるようにするのに十分な体積である。注射器の先端にできた溶媒の小滴が第一の貫通穴に入っている溶液の表面に接触するまで注射器のチップを下げていき、二つの液体を混合122することによって、濃度YX/(Y+Z)モル/リッターの溶液を作り出す。注射器のチップの外側表面およびアレイの表面は、分配される溶液によって濡れてはならない。更に、ステップ123で注射器のプランジャは、稀釈化された溶液Y nLを吸い上げ、引出される。注射器のチップは次の(N+1)の貫通穴124の上に配置され、Y nLの稀釈された溶液を、別の係数Y/(Y+Z)で稀釈125すべき溶媒の中へ分配される。このプロセスは、一連の個々の貫通穴に溶液を分配しながら繰り返され、いずれの場合も係数Y/(Y+Z)で稀釈される。
本発明の好適な実施例によれば、特定の化学物質の種がアレイの全ての穴に均一に注入されず、むしろ、二次元的な貫通穴アレイにおいて少なくとも一次元的な方向で化学物質の種の傾きが生じるように注入することができる。この明細書および添付する特許請求の範囲のいずれかに使われているように、用語「傾き」は、通常の数学的な意味として使用されている。即ち、一方向またはそれ以上の方向に沿い、明示された量が変化していることを意味する。ここで、方向は貫通穴アレイの表面に沿ってとられる。従って、貫通穴内に充填された特定の化学物質の種の濃度の傾きは、特定の方向に対応して存在するか、あるいはいくつかの方向に対応して存在すると言うことができる。従って、特定の傾きは、単調なものであっても良く(必ずしも単調である必要はないが)、特定の方向において化学物質の種の濃度は上がったり、下がったりする。
次のセクションで詳細に述べるように、混合や希釈する目的のために、マイクロ・ウェル・プレートを都合よく積み重ねる(スタックする)ことができる。一つの例として、貫通穴に細胞のサンプルを割り当てる場合がある。例示のために、一辺が250μmの正方形断面をした500μmの深さを有する一枚のプレート上の貫通穴を考える。このようなマイクロ・チャンネルを有する3枚のプレートを積み重ねる(2ステップ検定の例となるものであるが)と、チャンネルの合計の体積(即ち、三つの貫通穴を結合した体積である)は、ほぼ100 nLとなる。もし、全体のチャンネルが濃度の濃いイースト菌の培養細胞(〜107 /mL)で充填されると、各チャンネルは約103のイースト菌の細胞を含むことになる。70μm3のイースト菌細胞の体積によれば、100 nLのチャンネル当りの細胞の最大数は106のオーダーである。そして、生物試験に反応するイースト菌細胞として必要となるマイクロ・チャンネル当りの最小細胞数は100であり、これらの値と対応するものである。
本発明の実施例における方法および装置は、種々の操作中、貫通穴の周辺環境は高い相対湿度(典型的には95%以上)が維持された状態に置かれる。高湿度状態を維持することによって、貫通穴アレイ中に保持される溶液の蒸発を生じないようにすることはできないまでも、最小に押さえることができる。体積の減少量は、雰囲気温度や各貫通穴の中に保持される液体の体積、並びに必要な操作を行うのに必要となる時間の長さにも依存する。高い相対湿度環境は、体積減少を許容できるレベルに維持するために必要となる。温度が21℃のときに、水の小滴からの蒸発ロスは、図20に示すようにフィックの法則(Fick’s law)によって予測することができる。50μLの小滴の場合(曲線200)と50 nLの小滴の場合(曲線202)に10%の蒸発ロスが生じる時間(秒単位で)を、相対湿度の関数としてプロットしてある。もし湿度レベルが100%近くでなければ、小さい小滴の場合、非常に早く蒸発してしまい、相対湿度65%の時には、11秒で10%の質量ロスが生じる。
図21に示す装置は、湿度制御の対象となる閉環境の容積を小さくするために提供されたものである。本発明の実施例によれば、貫通穴アレイ10は水のリザーバー210の上に固定される。96-ウェル、384-ウェル、あるいは更に高い密度のマイクロ・タイター・プレート212は貫通穴アレイに隣接して、同じリザーバーの上に固定される。リザーバー210にはリザーバーが動いた時に、液体が揺れないようにするために、スポンジ214のような水を吸収する材料が入っている。光学的に透明なプレート216が、例えば、シリコン・グリースのような粘性流体の薄い層218の分だけリザーバーの側壁から離されて、リザーバーの上に配置される。一つまたは二つ以上の小さな穴220が透明なプレート216に明けられている。各穴を通して、微小注射器の針222、微小毛細管、ピン、カニューレ(排管)、あるいはその他の液体移送用の要素が挿入される。
沈浸による充填と混合中に貫通穴アレイからの液体の蒸発を防止するため、図21に示すような閉環境である密閉チャンバー236が使用される。密閉チャンバー236は、例えば、混合操作のためのアライメント治具156(図15に示す)、モーターや移送ステージ228、種々の操作を行うために必要となる装置、およびアレイを収納するのに十分な大きさを有する。冷水蒸気が外部の加湿器によって生成され、ポートを通ってチャンバー内へ放出される。超音波加湿器は、0.13立方メートルのチャンバーを95%以上のレベルの湿度を維持するために十分な蒸気を発生させることができる。チヤンバー全体に水の蒸気を均一に分配するために、ファンと隔壁からなる循環システムが備えられている。種々のドアー、ハッチ、および目視ポートがチャンバーの中へアクセスするために準備されている。ボックス内の温度は、抵抗加熱器と温度制御器によって制御される。このようなチャンバーは、商業生産されている乳幼児の保育器に別途加湿器を取り付けることによって組み立てることができる。
図22aについて説明する。この図は、番号250を付したコンパクトな移動用カセットの分解斜視図を示したものである。このカセットは、加湿充填チャンバー236(図21参照)から、例えば光学的解析を行うために、アレイを取り出したときに、相対的湿度を95%以上に維持するためのものである。図22bは図22aに示す加湿カセット250の側方断面を示したものである。貫通穴アレイ10と水のマイクロ・レンズ・アレイ252が密閉空間内にコンパクトに固定されている。貫通穴アレイは、アライメント・ピン256またはその他の手段によって配置されかつ保持される。アレイ・マウント258とカバー・ホルダ260は、接着剤またはその他の機械的な手段によってマウントに固定された光学的に透明なプレート262によってカバーされる。光学的解析装置の内部にアレイを容易に配置するために、マウントには、マグネット、ピン、溝、あるいはその他の物理的な手段を備えることもできる。透明なガラス製の微小な毛細管の束252(あるいは、マイクロ・チャンネル・アレイという) (ガラス製の微小な毛細管の束は、マサチューセッツ州サウスブリッジにあるスコット・ファイバー・オプティクスによって製造されたものである。) が,貫通穴アレイの下に取り付けられ、固定ネジまたはその他の機械的な手段によって固定されている。この毛細管の束252の中に保持された水が蒸発することによって湿度は上昇する。各毛細管264の代表的な寸法は、直径が200μmで長さが1mmである。マイクロ・チャンネル・アレイ252の上面266と下面268とは、上述した手順に従って疎水性の表面に仕上げられている。毛細管264のアレイ内における配列は規則的である必要はない。毛細管内の水270は、光源272からの光をアレイを通過して散光するのに役立つマイクロ・レンズのセットを形成し、それによって光学的解析のための均一な照明環境を提供することができる。この液体のマイクロ・レンズ・アレイを使用することも、本発明の範囲内に含まれる。
適切に組み立てられたチャンバー内にアレイを閉じ込め、従来から用いられている方法によってチャンバー内の環境を制御することにより圧力、光、および温度を制御することができる。蒸散を防止するため、そのチャンバーは高い相対湿度を維持するための装置を備えていなくてはならない。
Claims (9)
- プラテンの複数の貫通穴の中に液体サンプルを充填する方法であって、
a. 分配のための端部を有する複数の毛細管チューブであって、当該毛細管チューブがアレイを構成し、当該毛細管チューブを充填するステップと、
b. 異なった貫通穴の近くに分配のための各端部を配置するステップと、
c. 前記毛細管チューブを通して前記プラテンの貫通穴へ液体を移送するステップと、
から構成されることを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法において、前記プラテンが疎水性材料からできた二つの外層を有し、前記各貫通穴は親水性の内面を有することを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記親水性の内面は液体サンプルを貫通穴の中へ引き込むように作用し、前記疎水性の外層は液体サンプルが貫通穴の外へ移動することを防止するように作用することを特徴とする方法。
- プラテンの複数の貫通穴の中へ液体を充填する方法であって、各プラテンが複数の貫通穴を有し、
a. 少なくとも一つの連続したチャンネルを形成するように、各プラテンの複数の貫通穴の少なくとも一つが、互いに隣接するプラテンの貫通穴と一致するようにして少なくとも二つのプラテンを一緒にスタックするステップと、
b. 各連続したチャンネルに液体を移送するステップと、
から構成されることを特徴とする方法。 - 請求項4に記載の方法において、各プラテンが空隙によって各隣り合うプラテンから離れていることを特徴とする方法。
- 請求項4に記載の方法において、前記液体を移送するステップが、毛細管チューブを通じて液体を移送するステップを含むことを特徴とする方法。
- 請求項4に記載の方法において、前記液体を移送するステップが、少なくとも一つのカニューレを通じて液体を移送するステップを含むことを特徴とする方法。
- 少なくとも二つのプラテン内の液体を混合する方法であって、各プラテンが複数の貫通穴を有し、結合された貫通穴の間で液体が拡散できるように、各プラテンの複数の貫通穴の内の少なくとも一つが他のプラテンの対応する貫通穴と結合されるような方法で、特定の時間の間、少なくとも二つのプラテンを一緒にスタックするステップから成ることを特徴とする方法。
- 請求項8に記載の方法において、結合された貫通穴の間での液体の混合の後、少なくとも二つのプラテンを分離するステップを更に含むことを特徴とする方法。
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