DE10360269A1

DE10360269A1 - Verfahren zur schnellen Mischung von kleinvolumigen Flüssigkeiten und Kit zu dessen Anwendung

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Publication number: DE10360269A1
Application number: DE10360269A
Authority: DE
Inventors: Heidrun Dr.med.habil. Rhode; Anton Prof. Dr.med.habil. Horn; Margarete Dr.rer.nat. Schulze
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 2003-12-17
Filing date: 2003-12-17
Publication date: 2005-07-28

Abstract

Es soll ein einfaches, universell anwendbares Verfahren zur Durchmischung kleinvolumiger wässriger Flüssigkeiten im Endvolumenbereich bis maximal 500 mul angegeben werden, wobei die Flüssigkeiten vorzugsweise in Mikrotiterplatten insbesondere ohne mechanische Bewegung sowie damit verbundene Nachteile, wie Oberflächenfilm- bzw. Schaumbildung, schnell, zuverlässig und vollständig zu vermischen sind. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird ein Reagenz zugegeben, welches auf Grund seiner inhärenten physikochemischen Eigenschaften DOLLAR A - eine wesentlich niedrigere Oberflächenspannung als die zu mischenden Flüssigkeiten aufweist oder hervorruft, DOLLAR A - einen hohen Konzentrationsgradienten bewirkt bzw. DOLLAR A - eine hohe Lösungswärme erzeugt. DOLLAR A Die Erfindung findet beispielsweise in der Analytik Verwendung.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen und sicheren Durchmischung wässriger Flüssigkeiten vorzugsweise mit End-Volumina bis maximal 500 μl in Gefäßen, die als Mikrogefäße, wie Eppendorf-Tubes oder Gefäße vergleichbarer Größe, als Kapillaren oder vorzugsweise als Multiküvetten, Mikroplatten bzw. Mikrotiterplatten ausgebildet sind, sowie einen Kit zur Anwendung des Verfahrens.
Die meisten Reaktionen werden durch Zusammenpipettieren und Mischen von Flüssigkeiten, die jeweils verschiedene Reaktanten enthalten, gestartet. In der Regel handelt es sich um eine Probe und mindestens eine Testlösung, die alle notwendigen Hilfskomponenten enthält. Dabei ist die Vollständigkeit und die Gleichzeitigkeit der Mischung entscheidend für die Präzision und Reproduzierbarkeit der Untersuchung. In der Regel ist das Probenvolumen sehr viel kleiner als das Volumen der Testlösung. In der Praxis sind die Bedingungen für eine hinlängliche Durchmischung allerdings häufig nicht gegeben oder die Durchmischung dauert zu lange, so dass die Festlegung des Zeitpunktes eines besagten Reaktionsstarts sowie Routine-Arbeitsabläufe verzögert werden.
Um eine chemische Reaktion starten zu können, sind entsprechende Reaktionsbedingungen, wie eine geeignete Temperatur, ein geeigneter Druck, ein geeignetes chemisches Medium und eine enge räumliche Nachbarschaft der Reaktanten, die eine hohe Wahrscheinlichkeit von Molekülzusammenstößen garantiert, erforderlich.
Die räumliche Nachbarschaft wird durch die Molekularbewegung der Reaktanten sowie durch die daraus resultierende Diffusion im Medium erreicht und kann z. B. durch von außen herbeigeführte Turbulenz-Bildung infolge mechanischer Bewegungen, zu einem homogenen Reaktionsmedium mit einer maximalen Gleichverteilung der Reaktanten beschleunigt werden.
Eine solche von außen herbeigeführte mechanische Bewegung wässriger Lösungen, kann durch Rühren mit in der Flüssigkeit eintauchenden Rührwerken, welche dem Volumen bereich in Größe und Rührgeschwindigkeit angepasst sind, durch Ultraschall, oder auch durch Schüttelbewegungen des gesamten Gefäßes bewirkt werden.
Speziell in kleinen Gefäßen mit Fassungsvolumina im Bereich bis 500 μl wird die Geschwindigkeit der Durchmischung von wässrigen Lösungen durch die Bindungskräfte der Reaktanten zu Wasser-Molekülen, durch die Bindungskräfte der Wasser-Moleküle untereinander und durch die Bindungskräfte zum Gefäß-Mantel, wie die bekannten Kohäsions- und Adhäsionskräfte, welche unter diesen Bedingungen eine große Bedeutung erlangen, stark behindert. In Abhängigkeit von Größe und Form des Gefäßes kann dadurch eine Durchmischung durch von außen herbeigeführte mechanische Bewegungen sogar vollständig verhindert werden.
Die Durchmischung eines Stoffes mittels Diffusion ist ein relativ langsamer Vorgang und entsprechend dem bekannten Fick'schen Gesetz (Formel 1) J = –D·(Δc2/Δs) (1)mit
J = Diffusionsstrom (= n/A·t, bewegte Stoffmenge (n) pro Flächen- (A) und Zeiteinheit (t)),
D = Diffusionskonstante (Stoffkonstante),
Δc₂ = Konzentrationsdifferenz,
Δs = Diffusions-Weglänge
von der Weglänge und dem Konzentrationsgradienten abhängig.
Da sich in einem abgeschlossenen System (d. h. in einem Gefäß mit Δs = constant), in dem alle zu mischenden Komponenten zu einem Zeitpunkt eingebracht wurden, die Konzentrationsgradienten Δc₂ während der Diffusion bis zur Herstellung der vollständigen Homogenität ständig verringern, wird die ideale homogene Durchmischung mit J = 0 streng genommen erst nach unendlich langer Zeit erreicht. In Zellen und kleinen Gewebeverbänden, ist die Diffusion allein als Transport- bzw. Misch-Mittel effizient genug. Abgeleitet aus der Größe dieser biologischer Einheiten, handelt es sich um sehr kleine Weglängen im Nanometer-Bereich bis hin zu wenigen Mikrometern.
Tatsächlich lassen sich für kleine Moleküle mit mittleren Diffusionskonstanten von 10^–5 cm/sec durchschnittliche Diffusionszeiten von 0,1 sec für 10 μm bzw. 0,001 sec für 1 μm errechnen (http://members.aol.com/Cappuccinno21/Biochem/diffusion.html).
In Reaktionsvolumina bis 500 μl betragen die Diffusionswege in Abhängigkeit der Gefäßform 1 mm bis 1 cm. Damit ist die Diffusion allein kein geeigneter Wirkmechanismus, der eine vollständige Durchmischung von eingebrachten Reaktionskomponenten in kurzen Zeiten (Sekunden bis Minuten) garantiert. Die Diffusion ist zudem von meist nicht näher bekannten Stoffeigenschaften (Größe, Form, Hydratisierungshülle etc.) abhängig, welche sich in der Konstante D (siehe Formel 1) widerspiegeln.
Auf Diffusionsbasis wird eine für die meisten Fragestellungen ausreichende Durchmischung erfahrungsgemäß erst nach mehreren Stunden erreicht. Dies deckt sich mit den in (http://members.aol.com/Cappuccinno21/Biochem/diffusion.html) angegeben Zeiten.
Deshalb wurden zahlreiche Verfahren und Geräte entwickelt, die durch mechanische Bewegungen in der Flüssigkeit mit dem besagten Volumenbereich eine zur Durchmischung ausreichende Turbulenz erzeugen sollen. Dazu zählen Mikro-Rührwerke (z. B. US 6,582,116 ), Ultraschall-Sonden (z. B. Ultraschallsonde Sonifier der Firma BRANSON) oder -Bäder (z. B. Ultraschallbad UTR 200 der Firma Hielscher) sowie Schüttelgeräte (z. B. VortexGenie der Firma Scientific Industries) mit unterschiedlichster Bewegungsart und -frequenz.
Für Mikro- bzw. Mikrotiterplatten wurden eine Vielzahl horizontal bewegter Plattformen, sogenannte Mikrotiterplattenschüttler entwickelt (z. B. US 6,508,582 ). Hierbei ist auch das Einbringen von Mikro-Kügelchen als Turbulenz-verstärkende Elemente vorteilhaft erprobt worden ( EP 0349591 ). Diese sind allerdings nicht mit allen analytischen Messprinzipien kompatibel.
Selbst für sehr kleine Volumina, die im Rahmen der Nanotechnologie, Microfluidic oder für micro-HPLC-Verfahren verdunstungsgeschützt in Kapillaren transportiert und gehandhabt werden, sind mikromechanische Mischer bzw. Flüssigkeitsstrom-abhängige statische Mischkammern ( EP 0377202 ) und andere statische Mikrostrukturen für einen sog. lateralen Flüssigkeitstransport (beispielsweise B. He et al.: A Picoliter-Volume Mixer for Microfluidic Analytical Systems, Anal. Chem. 73, 2001, 1942–1947) bekannt.
Für Microarray-Verfahren wurde ein akustisches Mischverfahren entwickelt, welches die Durchmischung von Nukleinsäuren auf wenige Minuten verkürzt (Scriba et al.: Optimierung biochemischer Reaktionen durch akustisches Mischen, GIT Labor-Fachzeitschrift 9/2003, 930–932).
Ein erhebliches Problem dieser genannten Techniken ist, dass der Einfluss der mechanischen Bewegung bzw. der statischen Maßnahmen auf die Durchmischung in kleinen Volumina nur selten exakt messbar ist, oder aber die Stärke, Frequenz und Bewegungsart der Turbulenz-erzeugenden mechanischen Bewegung zumeist aus dem Verhalten von Flüssigkeiten im Makromaßstab abgeleitet und empirisch festgelegt wurden. Hinzu kommt, dass bei zu großen mechanischen Bewegungen (z. B. durch Vortexer) Flüssigkeitsfilme und -schäume entstehen können, wobei die chemische Zusammensetzung der Flüssigkeiten durch den intensiven Kontakt mit dem Gefäßwand-Material oder/und mit Luft Veränderungen erfahren können.
Seit Langem ist auch bekannt, dass es zu gut sichtbaren Turbulenzen in der sog. Bulk-Flüssigkeit kommt, wenn z. B. ein Tropfen Äthanol auf eine Wasseroberfläche fällt. Dieses Phänomen wird als "Marangoni-Effekt", "Marangoni-Konvektion" oder auch "Marangoni-instability" bezeichnet sowie physikalisch als "surface tension driven hydrodynamic flow" beschrieben und ist bis heute Gegenstand theoretisch-physikalischer Untersuchungen (beispielsweise Walters: A Stable Transitional Flow Pattern in the Surface Tension Driven Spreading of Ethanol-Water Solutions, Langmuir 6, 1990, 991 oder http://flux.aps.org/meetings/YR9596/BAPSDFD96/abs/S650.html oder Tokaruk et al.: Benard-Marangoni Convection in Two Layered Liquids, Physical Review Lett. 84, 2000, 3590). Dieses Phänomen ist nicht auf Äthanol und Wasser beschränkt, sondern wird bei einer Vielzahl verschiedener Flüssigkeiten und Schmelzen immer dann beobachtet, wenn sich die Oberflächenspannungen der beiden beteiligten Flüssigkeiten stark unterscheiden. Die Turbulenz ist durch unterschiedliche Stoffeigenschaften auszulösen und theoretisch auf mehrere physikalische Prozesse, die sich weit entfernt vom thermodynamischen Gleichgewicht befinden, gleichermaßen mitunter synchron zurückführbar. Dazu zählen die Doppeldiffusion hochkonzentrierter mischbarer Substanzen (z. B. Volpert et al.: Convection induced by composition gradients in miscible systems, Comptes Rendus Mecanique 330, 2002, 353), Temperatur-Unterschiede in Lösungen, die zu Dichte-, Viskositäts- und Oberflächenspannungs-Unterschieden führen können, und, wie oben genannt, auch inhärente Oberflächenspannungs-Unterschiede von Lösungen, die Kontakt bekommen. Deshalb kann diese Turbulenz beispielsweise auch durch lokale Erwärmung durch fokussierten Energieeintrag (z. B. Gugliotti et al.: Laser-Induced Marangoni Convection in the Presence of Surface Monolayers, Langmuir 18, 2002, 9792; Akopyan et al.: Instability of light-driven convenction motions, Proceedings of SPIE – The Int. Soc. For Optical Engineering 4748, 2002, 120) oder durch die Lösungswärme eines Stoffes in der "bulk-Flüssigkeit" (z. B. Sha et al.: Optical study on concentration-driven Rayleigh-Bernard-Marangoni convection, Transactions of Tijanjin University 8, 2002, 22) ausgelöst werden.
Der Marangoni-Effekt ist in zahlreichen Patentschriften als nutzbarer oder als störender und deshalb zu umgehender Effekt beschrieben. Er wird für viele technische Anwendungen genutzt, wie beispielsweise überwiegend für das Verteilen und Trocknen von flüssig aufgebrachten dünnen Schichten (z. B. DE 696 24 830 , DE 199 26 462 ), für definierte Oberflächen-Strukturierungen (z. B. EP 1 332 119 , US 6,555,017 ) und zur Verbesserung der Wärmeleitung (z. B. JP 20011336890 ). Dabei handelt es sich überwiegend um die technische Beeinflussung von Vorgängen in sehr dünnen flüssigen Schichten. Über eine Ausnutzung des Marangoni-Effektes im Zusammenhang mit Mikrotiterplatten- bzw. Mikroarray-Technologie ist nichts bekannt geworden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein möglichst einfach und universell anwendbares Verfahren zur Durchmischung kleinvolumiger wässriger Flüssigkeiten, insbesondere im Endvolumenbereich bis 500 μl, anzugeben, wobei die Flüssigkeiten ohne zusätzlichen Aufwand, wie erforderliche mechanische Bewegung und damit verbundene Oberflächenfilm- bzw. Schaumbildung, schnell, zuverlässig und vollständig durchmischt werden sollen.
Erfindungsgemäß wird auf der Oberfläche der zu mischenden Flüssigkeiten ein Reagenz abgesetzt, welches zum Zweck einer hohen Marangoni-Konvektion der eingebrachten Flüssigkeiten für eine schnelle und vollständige Durchmischung auf Grund seiner inhärenten physikochemischen Eigenschaften

– eine wesentlich niedrigere Oberflächenspannung aufweist als die zu mischenden Flüssigkeiten oder durch das Zusammenbringen mit den zu mischenden Flüssigkeiten lokal eine solche niedrigere Oberflächenspannung hervorruft,
– einen hohen Konzentrationsgradienten zu den zu mischenden Flüssigkeiten bewirkt bzw.
– eine hohe Lösungswärme in den zusammengebrachten und zu mischenden Flüssigkeiten erzeugt.

Das Reagenz kann mit an sich bekannten und in der Praxis etablierten Dosiergeräten auf die Oberfläche der in einem Gefäß befindlichen zu mischenden Lösungen aufgebracht werden oder es ist beispielsweise zumindest in einer der zu mischenden Flüssigkeiten enthalten. Durch die Zugabe eines solchen mit den Flüssigkeitskomponenten mischbaren Reagenz wird auf Grund dessen besagter physikochemischer Eigenschaften in dem zu vermischenden Flüssigkeitsreservoir eine Turbulenz erzeugt, welche überraschender Weise für eine sofortige und vollständige Durchmischung der Mischungskomponenten innerhalb von Sekunden sorgt.
In den angegebenen kleinen Volumina von zu mischenden Flüssigkeiten (bis 500 μl) wurde dabei eine unerwartete Konvektion beobachtet, welche selbst bei Schichtdicken (Füllstandshöhen) von mehreren Millimetern diese schnelle und zuverlässige Durchmischung bewirkt.
Vorteilhafterweise werden als Reagenz flüchtige Lösungsmittel eingesetzt. Von der Vielzahl möglicher Reagenzien aus der Gruppe organischer Lösungsmittel und Detergenzien kann dabei dasjenige Reagenz ausgewählt werden, welches die zu untersuchende Reaktion in der Mischung nicht beeinflusst bzw. nicht stört.
Die untersuchten Lösungsmittelvolumina, die für eine erfindungsgemäße Durchmischung ausreichend sind, führen zu keiner für analytische Fragestellungen relevanten Temperaturerhöhung in der Mischung.
Zur universellen Anwendung des Verfahrens wird ein Kit vorgeschlagen, der als Reagenz

– organische, mit Wasser mischbare, Lösungsmittel bzw. wässrige Lösungen derselben, beispielsweise Äthanol, Methanol, Propanol, Acetonitril, Aceton und Dimethylsulfoxid, Isopropanol, Dimethylformamid, Glycerol, Äthylenglycol bzw. Diäthylenglycol,
– Detergenzien bzw. detergenzhaltigen Lösungen, wie Triton X-100, Tween 20, Tween 80, Brij 35, SDS, Cholsäure, Desoxycholsäure, Taurocholsäure, Taurodeoxycholsäure, Octanoyl-N-methylglucamid, 6-O(N-heptyl-carbamoyl)-methyl-α-D-glucopyranosid, n-Octylglucosid, Sulfobetain SB 12, Sulfobetain SB 14, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat bzw. 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propansulfonat,
– Mischungen von diesen

Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Es zeigen:
1 Durchmischung von Flüssigkeiten gleicher Dichte in einer 96-well-Mikrotiterplatte im Endvolumen von jeweils 150 μl mit und ohne Verwendung eines Mikrotiterplattenschüttlers
2 Durchmischung von Flüssigkeiten gleicher Dichte in einer 384-well-Mikrotiterplatte im Endvolumen von jeweils 55 μl mit und ohne Verwendung eines Mikrotiterplattenschüttlers
3 Durchmischung von Flüssigkeiten unterschiedlicher Dichte in einer 384-well-Mikrotiterplatte im Endvolumen von jeweils 55 μl mit und ohne Verwendung eines Mikrotiterplattenschüttlers

a) Schichtung der Lösungen im Well vor (A) und nach (B) Durchmischung
b) Mittelwerte und VK-Werte für Absorbanz-Quotienten

4 Durchmischung von Flüssigkeiten unterschiedlicher Dichte in 384-well-Mikrotiterplatten mit kreisrundem Querschnitt im Endvolumen von jeweils 55 μl mit und ohne Verwendung eines Mikrotiterplattenschüttlers
5 Mittel- und VK-Werte der Absorbanzquotienten nach Zugabe von 3 μl Reagenzlösung
6 VK-Werte nach Zugabe von 5 μl 0.1%igen Detergenzlösungen bzw. Äthanol (EOH)
7 Temperaturmessung in einem Well von einer 96- und 384-well-Mikrotiterplatte nach Zugabe verschiedener Reagenzien

a) Temperaturverlauf
b) und c) Maximal-Werte der Temperaturerhöhung für drei verschiedene Lösungsmittel in Abhängigkeit vom zupipettierten Volumen

8 Kleinstmögliche Mischungsvolumina und -endkonzentrationen, die zu einer sofortigen Mischung in Mikrotiterplatten führen
9 Abhängigkeit der Mischgeschwindigkeit von der Oberflächenspannung der zugegebenen Reagenzien
Ausführungsbeispiel 1:
Charakterisierung einer Durchmischung in 96-well-Mikrotiterplatten (150 μl Endvolumen) mittels Mikrotiterplattenschüttler
Es soll untersucht werden, wie lange es dauert, bis Lösungen, die in den Wells an sich bekannter 96-well-Mikrotiterplatten zusammengebracht wurden, vollständig, d. h. homogen, durchmischt sind und wie dieser Vorgang durch die Anwendung von mechanischen Schüttelbewegungen beschleunigt werden kann. Dazu wird in alle Wells zweier 96-well-Mikrotiterplatten (Greiner bio-one, no. 655101) 145 μl einer Lösung mit 26 μM Fluoreszein in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 11,0 mit einer 96-Kanal-Pipette (CyBi-Well^TM) pipettiert. Anschließend werden 5 μl einer Lösung mit 1,8 mM p-Nitrophenylphosphat und 26 μM Fluoreszein in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 11,0 dazu pipettiert und die Absorbanzen jedes Wells bei 405 nm (Absorbanzmaximum von p-Nitrophenol) und 492 nm (Absorbanzmaximum von Fluoreszein) in einem Mikrotiterplattenreader (SpektraMAX Plus³⁸⁴) sofort und fortlaufen im Abstand von ca. 10 min gemessen. Die erste Mikrotiterplatte wurde dabei zwischenzeitlich ohne Bewegung gelagert, die zweite Mikrotiterplatte wurde auf einem Mikrotiterplattenschüttler (Titramax 100) in der höchstmöglichen Stufe geschüttelt.
Zur Beurteilung der Durchmischung werden Mittelwert und Variationskoeffizient (VK) für die Absorbanzquotienten aller Wells für jede Messung mittels Excel^® errechnet. Der minimal mögliche VK, der durch die Pipettierung determiniert wird, ist nach 60 min Schütteln auf höchster Stufe für beide Mikrotiterplatten bestimmt. Als der Zeitpunkt homogener Durchmischung wird der erste Zeitpunkt definiert, der einen VK_akt (aktueller VK) liefert, der dem minimal möglichen VK (VK_end, endgültiger VK) äquivalent ist, d. h. nicht mehr als 5% von diesem abweicht.
In 1 lässt sich anhand der resultierenden VK-Werte- erkennen, dass eine homogene Durchmischung ohne Schütteln nach ca. 60 min und mit Schütteln bereits nach etwa 10 min erreicht wird. Das bedeutet, unter Volumen- und Geometriebedingungen von 96-Well-Mikrotiterplatten wird die Durchmischung durch die Verwendung des Mikrotiterplattenschüttlers deutlich beschleunigt. Es werden jedoch auch mit Schütteln noch wenigstens 10 min für eine homogene Durchmischung benötigt.
Ausführunsgbeispiel 2:
Charakterisierung der Durchmischung in 384-well-Mikrotiterplatten mit „rounded square"-Querschnitt (55 μl Endvolumen) mittels Mikrotiterplattenschüttler unter Verwendung von Lösungen gleicher Dichte
Es soll wie im Anwendungsbeispiel 1 untersucht werden, wieviel Zeit für die homogene Durchmischung in den Wells einer an sich bekannten 384-well-Mikrotiterplatte ohne und mit Mikrotiterplattenschüttler benötigt wird. Dazu wird in alle Wells zweier 384-well-Mikrotiterplatten (Greiner bio-one, no. 781101) 45 μl einer Lösung mit 26 μM Fluoreszein in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 11,0 mit einer 96-Kanal-Pipette (CyBi-Well^TM) pipettiert. Anschließend werden 5 μl einer Lösung mit 0,6 mM p-Nitrophenylphosphat und 26 μM Fluoreszein in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 11,0 dazu pipettiert und die Absorbanzen jedes Wells bei 405 nm (Absorbanzmaximum von p-Nitrophenol) und 492 nm (Absorbanzmaximum von Fluoreszein) in einem Mikrotiterplattenreader (SpektraMAX Plus³⁸⁴) sofort und fortlaufen im Abstand von ca. 10 min gemessen. Die erste Mikrotiterplatte wurde dabei zwischenzeitlich ohne Bewegung gelagert, die zweite Mikrotiterplatte wurde auf einem Mikrotiterplattenschüttler in der höchstmöglichen Stufe geschüttelt.
Es ist in 2 zu sehen, dass die Absorbanzmittelwerte bald einen stabilen Maximalwert erreichen. Dies ist bei Vertikalphotometrie von Kapillar-ähnlichen Wells zu erwarten, da hier auch inhomogen verteilte absorbierende Stoffe im Strahlengang zur Gesamtabsorbanz beitragen. Der VK-Wert zeigt empfindlicher an, dass eine gute und zuverlässige Durchmischung in allen Wells erst nach 50 bis 60 min erreicht wird, und dies ist unabhängig davon, ob geschüttelt wurde oder nicht. Damit wird auch bei maximalen mechanischen Bewegungen mit einem kommerziell etablierten Gerät eine Durchmischung in einer 384-Well-Mikrotiterplatte nicht beschleunigt.
Ausführunsgbeispiel 3:
Charakterisierung der Durchmischung in 384-well-Mikrotiterplatten mit „rounded square"-Querschnitt (55 μl Endvolumen) mittels Mikrotiterplattenschüttler unter Verwendung von Lösungen unterschiedlicher Dichte
Um nicht nur den VK-Wert, sondern auch die mittels Vertikalphotometrie erreichte Farbintensität der Mischungen als Kriterium für eine gute Durchmischung heranzuziehen, wurde eine neue Methode eingesetzt.
Dazu wurden mit einem programmierbaren 384-Kanal-Pipettierer (CyBi-Well^TM) die aufgeführten Lösungen wie folgt nacheinander in die Wells der Mikrotiterplatte eingebracht. 3a zeigt dabei die Schichtung der in ein Well 1 eingebrachten Lösungen vor (A) und nach (B) vollständiger Durchmischung.

1. Als erste Mischflüssigkeit 2 werden zunächst 25 μl deionisiertes Wasser mit 26 μM Fluoreszein in das Well 1 gegeben.
2. Danach werden als zweite Mischflüssigkeit 3 sehr langsam 5 μl 0,5 M Phosphatpuffer, pH 11,0 mit 10% Rohrzucker und 26 μM Fluoreszein, Dichte: 1.114 g/cm³ zugegeben. Dabei bewegen sich Kolben und Pipettenspitzen des 384-Kanal-Pipettierers mit 0,33 bzw. 0,66 mm/sec. Die Mischflüssigkeit 3 unterschichtet am Boden des Wells 1 das zuvor pipettierte Wasser (Mischflüssigkeit 2).
3. Als dritte Mischflüssigkeit 4 werden 20 μl 10 mM Acetatpuffer, pH 4,0 mit 26 μM Fluoreszein langsam auf die Oberfläche des bisherigen Wellinhaltes bei schrittweisem Absenken des Mikrotiterplatten-Tisches zugegeben, so dass die jeweils dazukommende Flüssigkeit immer auf der Oberfläche placiert wird,
4. Danach werden 5 μl einer Pipettierlösung 5 (0,66 μM pNitrophenol und 26 μM Fluoreszein in 10 mM Acetatpuffer, pH 4,0) zugegeben.

p-Nitrophenol hat bei pH 4,0 nahezu keine, bei pH > 10.0 die volle Absorbanz bei 400 nm, d. h. gelbe Färbung. Damit kann die Flüssigkeit im Well 1 erst Licht bei 400 nm absorbieren, wenn der am Boden befindliche hochkonzentrierte alkalische Puffer und die oben auf pipettierte p-Nitrophenollösung ausreichend durchmischt sind (vgl. rechte B in 3c mit der im Well 1 vollständig durchmischten Flüssigkeit 7).
Es ist in 3b zu erkennen, dass es mit diesem Messsystem ebenfalls ca. 60 min dauert, bis die völlige Durchmischung sicher erreicht ist und auch hier durch Schütteln keine Beschleunigung erfolgt. Der maximal mögliche Absorbanzwert und der minimal mögliche VK-Wert werden synchron erreicht.
Ausführunsgbeispiel 4:
Charakterisierung der Durchmischung in 384-well-Mikrotiterplatten mit kreisrundem Querschnitt (55 μl Endvolumen) mittels Mikrotiterplattenschüttler unter Verwendung von Lösungen unterschiedlicher Dichte
Es wurde das gleiche Messsystem, wie unter Anwendungsbeispiel 3 beschrieben, für kreisrunde Mikrotiterplatten (Cliniplate³⁸⁴, Labsystems) untersucht. Hier wäre zu vermuten, dass auf Grund der kleineren benetzten Oberfläche bei gleichem Gesamtvolumen, der daraus resultierenden geringeren Adhäsionskräfte und der möglicherweise kleineren Reibung der Flüssigkeit mit den Wellwänden, eine schnellere Durchmischung mittels Diffusion und möglicherweise auch eine Beschleunigung durch Schütteln gegeben wäre.
4 zeigt jedoch, dass entgegen dieser Überlegungen, ebenfalls mindestens 60 min für die Durchmischung erforderlich sind und durch rotierendes Schütteln ebenfalls keine Beschleunigung erreicht wird.
Ausführungsbeispiel 5:
Beschleunigung der Durchmischung in 384-well-Mikrotiterplatten durch unterschiedliche Lösungsmittel
Mit dem Messsystem in Ausführungsbeispiel 3 wurde der Effekt verschiedener Reagenzien auf das Zeitverhalten der Durchmischung geprüft. Dazu wurden die Wells von 384-well-Mikrotiterplatten, wie unter Ausführungsbeispiel 3 beschrieben, gefüllt und sofort anschließend 3 μl einer Reagenzlösung (vgl. Reagenzlösung 6 in 3a) auf die Oberfläche der Flüssigkeit pipettiert. Danach wurden die Mikrotiterplatten in unterschiedlichen Zeitabständen im Mikrotiterplattenreader gemessen. Die Mikrotiterplatten wurden nicht geschüttelt. Weil die erreichten VK-Werte nach 55 min sehr unterschiedlich waren, wurden alle VK-Werte (VK_akt) anhand dieser letzten Werte (VK_end) durch Quotientenbildung VK_akt/VK_end normiert.
5 zeigt, dass mit dem Reagenz Acetatpuffer, welches dem Medium der zuvor pipettierten Lösung entspricht, keine Verkürzung der Durchmischungszeit, und mit DMSO nur eine geringfügige Verkürzung erreicht wird. Alle anderen organischen Lösungsmittel führen zu einer drastischen Verkürzung, ablesbar an den Mittelwerten und VK-Werten, die bereits bei der ersten Messzeit den Endwerten nach 55 min entsprechen. Die Durchmischung ist praktisch bereits vor der ersten erfassten bzw. technisch erfassbaren Messzeit vollständig.
Ausführunsgbeispiel 6:
Beschleunigung der Durchmischung in 384-well-Mikrotiterplatten durch unterschiedliche Detergenz-haltige Lösungen
Mit den in Ausführungsbeispiel 3 beschriebenen Messungen wurde der Effekt verschiedener Detergenz-Lösungen auf das Zeitverhalten einer Durchmischung geprüft.
Dazu wurden die Wells von 384-well-Mikrotiterplatten, wie unter Anwendungsbeispiel 3 beschrieben, gefüllt und sofort anschließend 5 μl einer Detergenz-Lösung (0.1% w/v) auf die Oberfläche der Flüssigkeit pipettiert. Danach wurden die Platten in unterschiedlichen Zeitabständen im Mikrotiterplattenreader gemessen.
In 6 ist anhand der zeitlichen Entwicklung des VK aller Wells zu erkennen, dass auch Detergenzien in der Lage sind, die Durchmischung im Vergleich zu einer Lösung, die der "bulk-Flüssigkeit" entspricht (Acetatpuffer) zu beschleunigen, wenngleich nicht so schlagartig, wie das hier verwendete Lösungsmittel Äthanol (EOH).
Ausführungsbeispiel 7:
Temperaturverlauf in einem Well von einer 96- und 384-well-Mikrotiterplatte nach Zugabe verschiedener Reagenzien
Da das Einbringen und Lösen von organischen Lösungsmitteln in wässrigen Lösungen mit der beschriebenen Konvektion und ursächlich bzw. als dessen Folge, wie bekannt, zusätzlich mit exothermen Lösungsreaktionen verknüpft ist, wurde geprüft, ob die Lösungsmittel-Volumina, die eine ausreichende Durchmischung gewährleisten, zu einer gleichzeitigen und unakzeptablen, weil biologische Moleküle schädigenden, Temperaturerhöhung in den Wells von Mikrotiterplatten führen. Dazu wurden alle Wells von 96- und 384-well-Mikrotiterplatten mit 150 μl bzw. 50 μl deionisiertem Wassers gefüllt. In ausgewählten Wells befinden sich Thermistoren, welche der Temperaturerfassung dienen. Der Temperaturverlauf in einem Well einer 96-well-Platte ist in 7a dargestellt. Es ist zu erkennen, dass sofort mit dem durch den Pfeil markierten Einbringen des Lösungsmittels ein deutlicher Temperaturanstieg bis zu einer maximalen Temperaturdifferenz (Delta-T) erfolgt, dem sich eine langsame Abkühlphase anschließt.
Die ermittelten Maximal-Werte der Temperaturerhöhung (Delta-T) sind in 7b und 7c für drei verschiedene Lösungsmittel in Abhängigkeit vom zupipettierten Volumen dargestellt. In der 96-well-Platte werden für alle untersuchten Lösungsmittel etwa vergleichbare Temperaturänderungen gemessen.
Lösungsmittelvolumina, die für eine Durchmischung ausreichen (Ausführungsbeispiel 8), führen jedoch zu keiner für analytische Fragestellungen relevanten Temperaturerhöhung.
Ausführunsgbeispiel 8:
Ermittlung des minimal notwendigen Lösungsmittelvolumens für 96- und 384-well-Mikrotiterplatten
Die Mikrotiterplatten wurden, wie in Ausführungsbeispiel 3 beschrieben, schichtweise befüllt und Lösungsmittel als Mischmittel 6 mit unterschiedlichen Volumina zugegeben. Die Platten wurden sofort (d. h. 10 bis 20 sec nach Zugabe des Lösungsmittels) sowie nach 60 min photometrisch gemessen.
In 8 sind die kleinsten Lösungsmittelvolumina tabellarisch dargestellt, die bei sofortiger Messung zu VK_end führen, der nach 60 min Mischzeit erreicht wird
(VK_rel < 1,05 = VK_akt/VK_end).
Ausführungsbeispiel 9:
Abhängigkeit der Mischgeschwindigkeit von der Oberflächenspannung der zugegebenen Reagenzien
Die Oberflächenspannungen der als Reagenz eingesetzten Lösungsmittel, wässrigen Lösungsmittel-Verdünnungen und wässrigen Detergenzlösungen wurden mit einem drop-shape Analysengerät DSA 10 MK2 (Fa. Krüss) nach der Methode der Randwinkelanalyse am hängenden Tropfen gemessen. In 9 sind die mit jeweils 5 μl Reagenzvolumen erreichten Mischzeiten (Zeitpunkt, zu dem jeweils das ≤ 1,1-Fache des End-VK erstmals erreicht wird) in Abhängigkeit von der gemessenen Oberflächenspannung (IFT, interfacial tension) des Reagenzes dargestellt.
Es ist zu erkennen, dass für die Lösungsmittel Äthanol und Propanol eine Schwellen-Oberflächenspannung existiert (bei ca. 45 dyn/cm), unterhalb deren eine sofortige Durchmischung erfolgt. Lösungsmittel (z. B. reines DMSO) bzw. Lösungsmittel-Verdünnungen unterschiedlicher Oberflächenspannung oberhalb dieser Schwellenkonzentration führen zu einer linearen Abhängigkeit der Mischzeiten von der Oberflächenspannung. Die verwendeten Detergenzlösungen Triton X-100, Tween 20, Brij 35 (0,1%ig ≥ 10X CMC, critcal micellar concentration) beschleunigen zu Beginn (vgl. 6), zeigen jedoch bei vergleichbaren Oberflächenspannungen wesentlich längere Mischzeiten als die organischen Lösungsmittel, wenn man das oben genannte Kriterium verwendet.

1: Well
2: erste Mischflüssigkeit (deionisiertes Wasser mit Fluoreszein)
3: zweite Mischflüssigkeit (Phosphatpuffer mit Rohrzucker und Fluoreszein)
4: dritte Mischflüssigkeit (Acetatpuffer mit Fluoreszein)
5: Pipettierlösung (Acetatpuffer mit p-Nitrophenol und Fluoreszein)
6: Reagenzlösung
7: durchmischte Flüssigkeit

Claims

Verfahren zur schnellen Mischung von kleinvolumigen Flüssigkeiten, bei dem insbesondere wässrige Flüssigkeiten im Endvolumenbereich bis maximal 500 μl vorzugsweise in Mikrotiterplatten zusammengebracht werden, dadurch gekennzeichnet, dass ein Reagenz auf der Oberfläche der zu mischenden Flüssigkeiten zum Zweck der Erzeugung einer hohen Marangoni-Konvektion innerhalb der zusammengebrachten Flüssigkeiten abgesetzt wird, welches zu einer örtlich begrenzten thermodynamischen Instabilität auf Grund starker Gradienten führt, die auf mindestens einer der folgenden Eigenschaften des Reagenzes beruhen: – das Reagenz besitzt eine inhärente wesentlich niedrigere Oberflächenspannung als die zu mischenden Flüssigkeiten, – das Reagenz erzeugt durch Reaktionen mit den zu mischenden Flüssigkeiten eine lokal stark erniedrigte Oberflächenspannung, – das Reagenz enthält Lösungsbestandteile, die sich mit den eingebrachten Flüssigkeiten komplett mischen in einer wesentlich höheren Konzentration als die zu mischenden Flüssigkeiten – das Reagenz besitzt eine hohe Lösungswärme in den zusammengebrachten und zu mischenden Flüssigkeiten.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Reagenz ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Reagenz eine Detergenz bzw. eine detergenzhaltige Lösung zum Einsatz kommt.
Verfahren nach mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Reagenz eine Mischung von Substanzen der bezeichneten Substanzklassen verwendet wird.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz in zumindest einer der zu mischenden Flüssigkeiten enthalten ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz zusätzlich zu den zu mischenden Flüssigkeiten zugegeben wird.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz einmalig zugesetzt wird.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz mehrmalig zugesetzt wird.
Verfahren nach einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz in Art und Menge so ausgewählt wird, dass es die jeweils zu untersuchende Reaktion der Mischung nicht beeinflusst.
Kit zur Anwendung des Verfahrens nach einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Reagenz – organische Lösungsmittel bzw. Lösungen derselben – Detergenzien bzw. detergenzhaltigen Lösungen, – Mischungen von diesen zusammen mit einer Arbeitsvorschrift vorliegen.
Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass dieser als organische Lösungsmittel Äthanol, Methanol, Propanol, Acetonitril, Aceton. Dimethylsulfoxid, Isopropanol, Dimethylformamid, Glycerol, Äthylenglycol bzw. Diäthylenglycol enthält.
Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, das dieser als Detergenzien bzw. detergenzhaltige Lösungen Triton X-100, Tween 20, Tween 80, Brij 35, SDS, Cholsäure, Desoxycholsäure, Taurocholsäure, Taurodeoxycholsäure, Octanoyl-N-methylglucamid, 6-O(N-heptyl-carbamoyl)-methyl-α-D-glucopyranosid, n-Octylglucosid, Sulfobetain SB 12, Sulfobetain SB 14, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat bzw. 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propansulfonat enthält.