EP2783747B1 - Verfahren und Vorrichtung zur berührungslosen Durchmischung von Flüssigkeiten - Google Patents

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EP2783747B1
EP2783747B1 EP14162100.3A EP14162100A EP2783747B1 EP 2783747 B1 EP2783747 B1 EP 2783747B1 EP 14162100 A EP14162100 A EP 14162100A EP 2783747 B1 EP2783747 B1 EP 2783747B1
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EP
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liquid
particles
radiation
interaction
layer
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Stefan Duhr
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Nano Temper Tech GmbH
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Nano Temper Technologies GmbH
Nano Temper Tech GmbH
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    • B01F2215/0436—Operational information
    • B01F2215/0472—Numerical temperature values

Definitions

  • the invention generally relates to a method and a device for non-contact mixing of liquids or for mixing particles in a liquid and in particular for mixing aqueous solutions.
  • directed liquid radiation is generated by targeted irradiation of electromagnetic radiation into the liquid in order, for example, to transport particles, preferably particles dissolved in the liquid, to a surface or boundary surface of a sample chamber or a surface of a liquid volume in order to mix the particles the liquid, in particular at the surface / interface to provide.
  • the invention is advantageous in that a "depletion layer" or an "enhancement layer” with a reduced or increased particle concentration at the surface / interface is avoided, so that surface-based measurement methods can be improved.
  • the invention is also advantageous in that it allows small volumes (micro-volumes), which are difficult to mix, for example, due to mechanical effects such as shaking or shaking, to be mixed.
  • the invention also relates to a method and a device for investigating specific and nonspecific interactions or interactions of particles, which are preferably dissolved in a liquid, with surfaces or interfaces.
  • fluorescence measurements are fluorescence measurements, fluorescence anisotropy measurements, Förster resonance energy transfer measurements (FRET), total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), backscattering interferometry measurements (BSI), absorption measurements, spectroscopic measurements, AlphaScreen® assays , MicroScale Thermophoresis Measurements (MST), Patch Clamp Measurements.
  • FRET Förster resonance energy transfer measurements
  • TRFM total internal reflection fluorescence microscopy
  • BSI backscattering interferometry measurements
  • absorption measurements spectroscopic measurements
  • AlphaScreen® assays are MicroScale Thermophoresis Measurements (MST), Patch Clamp Measurements.
  • Another method of avoiding the depletion layer moves or "shakes" the sample chamber macroscopically with respect to a surface sensor.
  • a problem with this method is that the sample chamber must be open to the outside and so can evaporate the aqueous solution and / or can be contaminated by external influences.
  • the mechanical "shaking" of the open sample chamber is also problematic, since the shaking overflow liquids / "spill" and so can penetrate into adjacent open sample chambers.
  • the invention generally relates to a method for mixing fluids, preferably liquids or for mixing particles in a fluid or a liquid.
  • the invention relates to a method for mixing of dissolved and / or undissolved particles in the liquid.
  • the present invention relates to the mixing of any kind of particles or particles such as (bio) molecules, (nano) particles, (micro) beads, (bio) polymers, paints, emulsifiers, cells (biological cells), viruses, bacteria, Lipids, vesicles, liposomes, nanodiscs, pigments, dispersing additives, pastes.
  • the liquid is provided as a liquid volume in at least one sample chamber, wherein the sample chamber may be open or closed.
  • the liquid can also be provided in the form of a drop, wherein according to the invention a thermal convection flow is generated within the droplet.
  • the liquid drop may be provided on a suitable slide (see discussion below) and, for example, surrounded by an oil layer to prevent evaporation. According to a preferred embodiment, the provision of very small volumes of liquid in glass capillaries already suffices.
  • a convection flow is achieved in the liquid volume by irradiation of electromagnetic radiation in the liquid volume and in particular a mixing of Liquid with the particles present therein at a surface of the liquid volume or at an interface or boundary layer between the liquid volume and a material layer of the sample chamber achieved.
  • the inventive method and the associated apparatus is thus applicable to measuring methods in which preferably measured at the surface or interface of a liquid, since according to the invention a depletion zone, depletion layer, enrichment zone, enrichment layer or a concentration shift at the surface or interface is avoided.
  • a good mixing in contact surfaces between solids for example inner surface of a sample chamber or of glass capillaries
  • a surface or contact surface according to the invention is not limited to a flat surface, but may also be three-dimensional or fractal, e.g. when dextran or dendrimer coated glass substrates are used and the interaction between e.g. Antibody and antigen takes place on / in the dextran layer.
  • the thermal convection flow is generated by means of at least one electromagnetic radiation source, preferably a light source.
  • the thermal convection flow is generated by means of an infrared (IR) radiation source.
  • IR radiation can be generated with known IR radiation sources and preferably positioned locally by an optical means (eg, lens and / or mirror / reflector) in the liquid also be focused.
  • an optical means eg, lens and / or mirror / reflector
  • IR LEDs are used as the radiation source.
  • the liquid is preferably heated locally at the location of the radiated beam and thus generates the thermal convection flow.
  • the present invention preferably produces liquid streams directly, and preferably purely optically and in particular completely contactless, directly in the liquid / solution with the particles. Since liquids to be examined are often aqueous solutions, it is particularly advantageous in these cases to select the electromagnetic radiation in the infrared wavelength range, due to the advantageous absorption behavior.
  • an aqueous solution not only absorbs the energy of the IR laser radiation, but also the pulse of the photons of the IR laser radiation (light pressure) has an influence on the convection behavior (see FIGS. 2A, 2B ).
  • the energy absorption heats the aqueous solution locally at the location where the IR laser radiation is radiated into the aqueous solution, which leads to thermal convection.
  • the momentum of the photons of the IR laser radiation is transferred to the aqueous solution.
  • the flow velocity of the thermal convection can be amplified (antiparallel to gravitation) or attenuated (parallel to gravitation).
  • the laser radiation can also be aligned vertically or obliquely to the gravitation.
  • the wavelength of the preferred IR radiation is preferably in the range 1200 nm to 2000 nm. More preferred are the specific IR laser wavelengths: 980 nm (+/- 10 nm); 1450 nm (+/- 20 nm); 1480 nm (+/- 20 nm); 1550 nm (+/- 20 nm) and 1920 nm (+/- 20 nm).
  • the invention also relates to a device for carrying out the method according to the invention.
  • the method according to the invention is preferably used in combination with surface / interface-based measuring methods / measuring devices.
  • This allows, for example, specific chemical, biochemical Interactions at interfaces are safely and reliably investigated, preferably in extremely small volumes.
  • non-specific effects such as "sticking", physisorption, chemisorption, sorption, adsorption, absorption, electrochemical processes, catalytic processes, etc. can also be investigated
  • the mixing method according to the invention can be used, for example, in combination with measuring device for determining optical properties on a thin layer, whereby, for example, chemical, biochemical, medical and / or physical reactions, binding and / or addition processes as well as other interactions on the thin layer are detected can.
  • measuring methods for example, light, preferably light of a specific wavelength, is irradiated onto a sample to be examined, the sample being bound to a thin layer. Changes in the optical layer thickness are detected or measured, for example, by means of interference phenomena, which results in conclusions on reactions of the examined sample with a suitably pretreated thin layer.
  • volume consumption can be reduced from a few 100 microliters to a few milliliters to a few nanoliters to a few microliters. Volumes of from 1 microliter to 10 microliters are preferably used as the volume according to the invention.
  • Elaborate flow cells, microfluidics, pumps, valves and hoses are preferably eliminated, whereby a device according to the invention is very robust and preferably can not be contaminated by any residues in hoses and / or valves and it also prevents loss of sample / particles in the sample Adherence (adsorption / chemsorption / physorption) of the particles to the surfaces of the hoses and valves (more generally: to the surfaces of the dead volumes).
  • both open and closed sample chambers can be used, whereby vaporization / evaporation of the (aqueous) solution can also be avoided by closed sample chambers. This is advantageous, for example, in that significantly longer measurement times are possible.
  • convection is caused by a flow that can carry particles.
  • Cause of the transporting flow can basically be different forces, such. As weight or forces resulting from pressure, density, temperature or concentration differences.
  • the method of the invention preferably produces a free or natural convention, i.e., convection caused by a temperature gradient.
  • the temperature increase is preferably so low that the particles or the sample are not damaged and / or negatively affected.
  • free convection due to thermal density differences may be described as follows: When heated, fabrics tend to expand (except, for example, the density anomaly of the water). Under the influence of the gravitational force, areas of lower density rise within the fluid against the gravitational field (buoyancy), while areas of higher density sink therein. For example, if heat is applied to the bottom of a sample chamber and the top of the sample is allowed to cool, a continuous flow is created: the liquid heats up, expands, and rises. Once there, the liquid cools down, contracts again and sinks to be heated again below.
  • the velocity of the liquid streams of the thermal convection according to the invention can preferably be determined by varying the optical energy or power, the focusing or defocusing, the intensity, the direction, the parallelism (or also the convergence and divergence) and / or the position of the focus relative to surface / thin film, the number of beams (laser beam can be split to heat several places at the same time), the duration of irradiation, pulse width modulation (pulse height, pulse duration, repetition rate), wavelength, moving beam velocity, irradiated radiation and / or be changed or controlled relative to the direction of gravity relative to gravity.
  • the position of the irradiated radiation can vary, for example the focus can be positioned in all three spatial directions by means of mirror systems (see laser scanner) and be moved at different speeds. Since the present invention can also generate liquid streams perpendicular to the surfaces of sample chambers by means of optically generated thermal convection (as opposed to liquid streams generated by external pumps), mixing the liquid and reducing a depletion layer is very efficient.
  • the rate of thermal convection depends, among other things, on the chamber thickness (height in the direction of gravity) of the sample chamber and, in particular, on the chamber geometry.
  • edge surfaces of a sample chamber can significantly influence the speed of thermal convection.
  • Preference is given to sample chambers that are thick enough (for example> 0.05 mm) to achieve a desired rapid flow velocity of the thermal convection in order to avoid the " depletion layer" or an enrichment layer.
  • a thermal convection such that preferably a laminar flow is generated, preferably at low Reynolds numbers (Reynolds number Re ⁇ 1000).
  • sample chambers also liquid drops or water drops
  • a layer thickness of at least 0.05 mm is preferred because at lower layer thicknesses or smaller thicknesses of the sample chamber, the convection effect is too weak to achieve a desired mixing.
  • layer thicknesses of the liquid or thicknesses of the sample chamber not greater than 11.5 mm (well depth in the case of multiwell plates).
  • An exemplary convection velocity for a sample chamber that is 1 mm in height and 5 mm in diameter, 20 ⁇ l in volume, 52 ° C chamber temperature, 1480 nm IR laser with 75 mW light output is at medium speed of about 0.4 mm / s.
  • a typical or average extent of the convection flow lines in this example is about 2 mm in diameter.
  • exemplary diffusion constants D of biomolecules are between 1 ⁇ m 2 / s and 400 ⁇ m 2 / s.
  • the movement / displacement / mixing of the particles due to the convection flow is adapted to the movement of the particles (Brownian motion) due to their diffusion (diffusion constant D).
  • diffusion constant D diffusion constant of the particles to be examined
  • there is a preferred average flow velocity of the thermal convection to be used and thus, for example, preferably also radiation intensities or configurations for the irradiation of the radiation to be used. Due to the very flexible and easily variable and preferably purely optical construction according to the invention, the convection flow and thus the mixing can preferably be adjusted to the particles to be examined, without a new structure having to be built specifically for each particle.
  • rate constants can be exemplified as follows. Assume a chemical reaction of molecule A of concentration [A] with molecule B of concentration / surface density [B] to complex D of concentration [D].
  • mixing according to the invention are “diagnostics” (mixing also important in ELISA), the field of electrochemistry, the range of catalysts, or the area of quality control ("sticking" to surfaces to avoid it).
  • rates of “sticking” of particles or measuring the strength of "sticking"("sticking", physorption, chemsorption, adsorption, absorption) can be measured.
  • thermal convection is to be generated for mixing by means of IR LEDs.
  • IR LEDs are cheap; one can e.g. Insert 384 LEDs or 96, or 24 or 16 to mix many wells simultaneously.
  • IR LEDs typically have less light output than IR lasers, but since the layer thickness of the aqueous solution in the wells is very large (typically> 1 mm), the IR radiation is very well absorbed (Beer-Lambert's Law) and so are IR LEDs powerful enough.
  • the method according to the invention is advantageous for reaction kinetics measurements or biomolecule analysis.
  • the method can be used with NanoTemper® capillaries (for example, glass capillaries with inner diameter of 0.05 mm to 0.8 mm), preferably with inner diameters of 0.2 mm, 0.35 mm, 0.5 mm and 0.8 mm and outer diameters less than or equal to 1.0 mm.
  • no flow cells are necessary and filling of the capillaries can be carried out purely passively by capillary forces.
  • the inner surface of the glass capillary may be untreated or at least partially specifically coated / modified (e.g., with antibody, antigen, DNA, RNA, PNA, TNA, proteins, peptides, cells, polymers, etc.) or not.
  • the disclosed method can generally be carried out with sample compartments having at least one region which is transparent.
  • Transparency in physics is the ability of matter to transmit electromagnetic waves (transmission). In everyday life, the term is usually related to light, that is, to the spectral range of electromagnetic radiation visible to humans.
  • the transparent material is preferably in a wavelength range between 200 nm to 2000 nm permeable, ie preferably also for infrared light and / or UV light.
  • the transparent material is transparent to light in the range of 200 nm to 900 nm, preferably 250 nm to 900 nm, preferably 275 nm to 850 nm.
  • the transparent material is also transparent to light of the following wavelength: 940 nm to 1040 nm (preferably 980 nm +/- 10 nm), 1150 nm to 1210 nm, 1380 nm to 1600 nm (preferably 1450 nm +/- 10 nm and / or 1480 nm +/- 10 nm and / or 1550 nm +/- 10 nm), 1900 nm to 2000 nm (preferably 1930 nm +/- 10 nm).
  • the transparent material may comprise, for example, glass and / or a polymer.
  • Possible materials are borosilicate or borosilicate glass such as Brosilikatglas 3.3 (for example DURAN glass), quartz glass, such as Suprasil, Infrasil, Synthetic quartz glass or silica glass, soda lime glass, Bk-7, ASTM Type 1 Class A glass, ASTM type 1 Class B glass.
  • the polymer may be PTFE, PMMA, Zeonor TM, Zeonex TM, Teflon AF, PC, PE, PET, PP (polypropylene), PPS, PVDF, PFA, FEP, and / or acrylic glass].
  • the disclosed method can also be used with pipette tips, in particular with at least partially transparent pipette tips, for example made of polypropylene.
  • the process according to the invention can also be used with reaction vessels, for example reaction vessels made of glass or plastic ("Eppis"), preferably transparent glass and plastic.
  • reaction vessels for the "Realtime PCR (Polymerase Chain Reaction)" for example, with reaction vessels for the "Realtime PCR (Polymerase Chain Reaction)".
  • the method according to the invention can also be used with chambers / capillaries for electrophoresis, preferably capillary electrophoresis.
  • the method according to the invention can also be used in the detection range of HPLC / UHPLC (High Performance Liquid Chromatography (HPLC).)
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • the disclosed method can also be used with microfluidic chambers / microfluidic chips
  • the method according to the invention can be used with sealed / sealed multititre plates (multiwell plates).
  • the disclosed method can be used in sealed / sealed ampoules, for example glass ampoules or plastic ampoules, preferably transparent ampoules, for example substances in the ampoules for forensic or diagnostic tests be enclosed, which must not be contaminated and therefore preferably should not be opened.
  • the inventive method can also be done with multi-well plates (multiwell plates) which have a non-transparent bottom.
  • multititer plates (multiwell plates) for filling with pipettes or pipetting robots are open, preferably open at the top.
  • the process according to the invention can also be used everywhere, for example, where mixing / flow generation by means of external flow (pumping) and / or mechanical shaking is not possible (for example all closed reaction vessels / microcavities) or useful, but the aqueous solution is optically accessible.
  • the method according to the invention can be used in diagnostics, also for mixing in ELISA plates. Another exemplary application is quality control.
  • the mixing method according to the invention can be combined with a multiplicity of different known measuring and reading techniques, in particular for measuring specific and unspecific interactions of particles at surfaces / interfaces.
  • the following typical surface techniques are mentioned by way of example: For measurement, methods such as reflectometric interference spectroscopy (RlfS), Bio-Layer Interferometry (BLI), the surface plasmon resonance (English Surface Plasmon Resonance, SPR), the quartz crystal microbalances (English Quartz Crystal Microbalance, QCM), surface acoustic wave (SAW), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or nanopores or transistors (Next Generation Sequencing). For example, these measuring methods may be performed by a combination of e.g.
  • Glass capillaries of certain diameter as a sample chamber of the aqueous solution with the particles, IR laser / LED for generating a thermal convection in the aqueous solution in the glass capillaries and a corresponding measurement or experimental arrangement can be improved.
  • the disclosed method for mixing liquids or particles with a liquid relates to the steps of providing a volume of liquid and generating a thermal convection flow on at least one surface / interface of the liquid volume by irradiating electromagnetic radiation into the liquid volume.
  • the liquid volume may be provided, for example, in a sample chamber that is open or closed.
  • a microcavity may serve as the sample chamber, more preferably a capillary or a pipette tip.
  • a sample chamber should have at least one region that is at least partially transparent.
  • the sample chamber has a thickness of 0.01 mm to 25 mm, preferably 0.05 mm to 12 mm, preferably 0.05 mm to 1 mm.
  • capillaries have an inner diameter of 0.01 mm to 3 mm, preferably 0.05 mm to 0.8 mm, wherein the capillaries are preferably at least partially made of glass or other at least partially transparent materials.
  • the volume of liquid may also be provided as drops on a slide.
  • the sample chamber has a volume of 0.001 ⁇ l to 1000 ⁇ l, preferably from 0.1 ⁇ l to 200 ⁇ l, preferably from 1 ⁇ l to 10 ⁇ l, preferably from 1 ⁇ l to 6 ⁇ l.
  • the surface of the liquid volume is preferably formed by the interface between liquid volume and a surface of the sample chamber or, for example, by the interface between liquid volume and a surface of the slide.
  • the liquid used is preferably an aqueous solution, but is not limited thereto.
  • the electromagnetic radiation preferably has IR radiation or only wavelengths in the IR range and is preferably generated by a laser and / or an LED.
  • the incident radiation may be parallel and / or anti-parallel to gravity and / or may include a component oriented perpendicular to gravity.
  • the temperature gradient is generated in a small range, preferably in a range of 0.00001 mm 2 to 1 cm 2 , preferably generated in a range of 0.0001 mm 2 to 12 mm 2 .
  • a detection area for measuring properties of the liquid or particles in the liquid may be spaced from the area in which the radiation is irradiated.
  • the detection area may be spaced at least 0.01 mm from the incident beam, the distance preferably being measured perpendicular to the direction of irradiation.
  • the detection area and the irradiation area may also overlap.
  • the detection surface is often larger than a well-focused laser beam (for example, 2 ⁇ m diameter can be achieved with IR). Therefore, in this embodiment, preferably the entire detection surface is swept by the convection flow.
  • the overlap of the detection area and the irradiation area is, for example, in the structures Fig. 5 or Fig. 6 applicable. Since everything is focused by the same optics, the heating focus of the IR radiation is preferably within the detection range
  • Preferred flow velocities of the convection flow are in the range of 0.0001 mm / s to 10 mm / s, preferably 0.0005 mm / s to 2 mm / s.
  • the mixing method according to the invention is particularly advantageous when it is combined with additional measuring methods.
  • the present invention also relates to a method for investigating molecular interactions on and / or in a thin layer in a liquid volume according to claim 7.
  • a sample chamber is provided for carrying out such a measurement in the form of a capillary, pipette tip, multiwell plate or a microfluidic chip.
  • the interaction is preferably measured by means of reflectometric interference spectroscopy (RlfS), surface plasmon resonance (SPR), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), quartz crystal microbalances (QCM), and / or surface acoustic wave, (surface acoustic wave; SAW).
  • the measurement of the interaction may be at least one method from the group: Reflectometric Interference Spectroscopy (RlfS), Bio-Layer Interferometry (BLI), Surface Plasmon Resonance (SPR), Quartz Crystal Microbalance (QCM), Surface Acoustic Wave, SAW, Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), nanopores or transistors (Next Generation Sequencing).
  • the present invention also relates to a device for mixing liquids or particles with a liquid, in particular for carrying out a method described above, according to claim 9.
  • a system with a device for mixing and a device for measuring is disclosed, wherein the Measuring device preferably for measuring a specific or nonspecific interaction of the particles with a surface / interface of a sample chamber or a slide is used.
  • FIG. 3 shows by way of example the detection area 80 for measurements of the specific and unspecific interaction of particles.
  • the sample chamber 45 shown is an example of a capillary.
  • the detection area 80 is preferably located at the surface / interface of the measurement volume within the capillary 45, i. on the inside of the sample chamber 45.
  • the detection area 80 can be selected around the area of an irradiated IR radiation 30 such that it is smaller, larger or the same size as the area swept by the thermal convection 90.
  • the detection region 80 may be, for example, a thin layer and contain, for example, antibodies for the specific detection of antigens. In other words, the detection region is located on the surface of the liquid or the surface of the capillary 45.
  • the detection region 80 may, for example, also be composed of several different thin layers, which differ, for example, in their refractive index, polarizability or their fluorescence.
  • the convection is preferably adjusted so that no depletion layer or enrichment layer is formed in the detection area.
  • the thermal convection can be adjusted so that it particles from far outside the Detection area, for example, a few millimeters away, transported into the detection area.
  • Order can be varied, but it is crucial that there is a certain distance between IR laser focus (determines the "convection rollers") and the place where the interaction is detected on the surface. The distance between them is important as the IR laser produces different thermal convection currents depending on the power and chamber thickness and chamber geometry. You have to set it all up so that you have the right thermal convection currents at the interaction site (to avoid the depletion layer of the molecules).
  • FIG. 4 shows an exemplary arrangement in which the inventive method is applied.
  • Infrared laser radiation 30 is radiated from below into a sample chamber 45 having a liquid volume, here an aqueous solution with particles 50, and generates a thermal convection 90 in the sample chamber 45.
  • the flow velocities in the liquid are represented by corresponding vectors.
  • a symmetrical convection around the irradiated laser beam 30 can be seen.
  • the reflectometric interference spectroscopy (RIfS) method is used as a detection method for measuring the interaction of the particles 105 dissolved in the liquid with a thin layer (shown hatched) of functionally immobilized molecules / particles 103.
  • RIfS is a physical method based on the interference of white light on thin layers. This method is used in practice, for example, to investigate molecular interactions.
  • the basic measuring principle corresponds to the Fabry-Perot interferometer.
  • RIfS is mainly used as a detection method in chemo- and biosensors.
  • As sensitive layers mostly non-selective measuring polymers are used, which sort analytes either by their size (so-called molecular sieve effect in microporous polymers) or due to different polarities (eg functionalized polydimethylsiloxanes).
  • polymers such as polyethylene glycols or dextranes are applied to the layer system and immobilized thereon recognition structures for biomolecules.
  • all substance classes can be used as recognition structures (proteins such as antibodies, DNA / RNA such as aptamers, small organic molecules such as estrone, but also lipids such as phospholipid membranes).
  • a carrier 46 which may be part of the sample chamber 45.
  • the sample to be examined is provided as a drop or liquid layer on the carrier.
  • the carrier 46 may be made of glass or plastic, for example.
  • the thin layer to be examined comprising a layer 103 of functionally immobilized molecules and another layer 102 of molecules, which is arranged between the layer 103 and the carrier 46, is shown schematically.
  • the layer 102 serves, in particular, for better adhesion of the thin layer on the carrier 46.
  • the layer / layer 102 of molecules (eg PEG or dextran, etc.) which is arranged between the layer 103 and the carrier 46 (illustrated schematically) can be referred to, for example Spacer and / or serve as immobilization aid for the functional molecules of layer 103.
  • the layer 102 also serves in particular for better adhesion of the layer / thin layer 103 on the carrier.
  • sample particles 105 can bind.
  • the thickness of the thin layer increases, the distance of its upper boundary surface 104 to the phase boundary between the thin layer and the support (or the lower boundary surface of the thin layer) is larger.
  • irradiated light 31 which is used for the measurement, we now also reflected at the boundary surface 104 after connection of the sample particles 105.
  • the boundary surface 104 is formed opposite to the solution with particles 50, for example, when the particles from the aqueous solution bind to the functionally immobilized molecules in the thin layer 103.
  • the reflected beam 113 at this boundary surface 104 is shown schematically.
  • the reflected beams 112, 111a, 111b and 110 are also shown, which are reflected at interfaces that lie below the boundary surface 104. Since the incident light has to cover a greater path length up to the boundary surface 104, a shift of the interferogram, which is produced by the superimposition of the reflected electromagnetic radiation 110, 111 a, 111 b, 112 and 113, results. This shift can be measured with time resolution, which allows conclusions about the change in layer thickness and thus the interaction of the dissolved particles 105 with the functionally immobilized particles 103.
  • the particles 105 in the aqueous solution are biomolecules such as DNA, RNA, proteins, antibodies, antigens, etc. Small molecules, nanoparticles, polymers, peptides, PNA, etc. or even cells, viruses, bacteria, vesicles, Liposomes, microbeads, nanobeads, nanodiscs, etc.
  • FIG. 5 shows by way of example the application of the method in a concrete experimental arrangement, but without being limited thereto.
  • the reference numeral 1 denotes a light source used for the measurement.
  • the light source 1 may be one or more LEDs, one or more lasers and / or one or more SLEDs (superluminescent LED).
  • the light of the light source 1 serves primarily to irradiate a sample 50 to be examined, preferably to irradiate it vertically.
  • the light emitted by the light source 1 can be changed by means of known optical means, for example by means of a diffuser 4 and / or a lens system (not shown).
  • a diffuser 4 can be used to evenly distribute the light and a lens system can be used to focus the light as desired.
  • the light passes through a polarizer 5, for example for producing linearly polarized light.
  • the light can also pass through a filter 14, so that a light beam 31 with defined properties is irradiated onto the sample 50.
  • the filter 14 may, for example, be a wavelength filter, for example a bandpass filter, or a longpass filter or a shortpass filter.
  • the beam splitter 7 is used to divide the light beam into a measuring beam or measuring beam path 9 and a reference beam or reference beam path 11, the measuring beam path being shown at the bottom and the reference beam path 11 pointing to the left to the reference beam.
  • Detector assembly 19 ' is shown.
  • the beam splitter 7 preferably has a polarizing property. However, the beam splitter 7 may also be omitted in certain embodiments. Then also eliminates the reference beam path 11, or the whole reference branch of reference beam path 11, reference lens system 17 ', reference detector filter 23' and reference detector 19 '.
  • the reference detector array 19 ' may be, for example, a photodiode, a photomultiplier (photomultiplier, photomultiplier tube, PMT), a charge coupled device (CCD) camera, a complementary metal (CMOS) CMOS Oxide Semiconductor; complementary metal oxide semiconductor), a diode array, or an avalanche photodiode.
  • the reference branch may have a reference lens system 17 'in front of the reference detector arrangement 19' for imaging / focusing on the reference detector arrangement 19 'and / or a reference detector filter 23', for example a bandpass filter, or a longpass filter or a short-pass filter.
  • the measuring beam path 9 can, before it hits the sample 50, be changed with additional optical means, which are arranged after the beam splitter 7.
  • additional optical means which are arranged after the beam splitter 7.
  • a second optical correction element 36 is shown, which can optionally be extended with a lens or a lens / lens system, for example, the phase shift, polarization change and / or optical path change may be accompanied by the (second) beam splitter 34 for coupling the infrared laser radiation, to compensate / correct.
  • the second optical correction element 36 and / or the optional lens or the optional lens system can also serve to focus the beam paths on the sample 50.
  • the sample 50 may be deposited on a carrier 46 as a droplet or in a sample chamber 45, as in FIGS FIGS. 2 to 4 shown provided.
  • a sample chamber may be a capillary, a microcavity, a reaction vessel ("Eppi"), a microfluidic device, or a pipette tip without being limited thereto.
  • the sample 50 to be investigated is preferably a liquid, preferably an aqueous solution, with particles 105 present therein (see US Pat Fig. 4 ), which may be in dissolved or undissolved form.
  • the support 46 is preferably at least partially transparent, with the illustrated support 46 being a slide glass formed from a glass on which a thin layer 103 is formed.
  • the thin layer 103 to be examined comprises, for example, a layer of functionally immobilized molecules.
  • the thin layer 103 is influenced by the sample 50 to be examined. For example, interaction of the molecules on the thin layer 103 with the corresponding particles 105 in the sample leads to a layer thickness change (see Fig. 4 ). This change in layer thickness influences the light conducted via the measuring beam path 9 onto the carrier 46 and reflected on the surface of the thin layer, which light is deflected by the beam splitter 7 and imaged on a detector arrangement 19.
  • the measuring branch (to the right of the beam splitter 7) is preferably similar to the detector arrangement 19 or even identical to the reference branch (to the right of the beam splitter 7).
  • the detector assembly 19 for example, a Photodiode, a photomultiplier (photomultiplier tube, photomultiplier tube, PMT), a CCD camera (Charge-Coupled Device), a complementary metal oxide semiconductor (CMOS), a diode array or an avalanche Be photodiode.
  • the measuring branch may have a lens system 17 in front of the detector arrangement 19 for imaging / focusing on the detector arrangement 19 and / or a detector filter 23, for example a bandpass filter, or a longpass filter or a shortpass filter.
  • the multiple reflection is preferably used at the interfaces of the thin layer for the measurement, wherein the reflected steel with the two detector arrays 19, 19 'are detected.
  • the second beam splitter 34 is arranged below the first beam splitter 7.
  • the second beam splitter 34 is shown above the first beam splitter 7 by way of example.
  • the infrared laser radiation 30, which is emitted by the laser 32 and optionally with an optical means 33, for example lenses, or lens system, for example, collimator for parallelization and / or focusing of the infrared laser radiation is changed, in the measuring beam path 9 coupled.
  • the beam splitter 34 may be similar to the beam splitter 7, be the same, or have other properties.
  • the beam splitter 34 may be a dichroic mirror or a "hot mirror". It is again explicitly emphasized here that the irradiated electromagnetic radiation 31 is used for the measurement, whereas the irradiated electromagnetic radiation 30 serves to generate a convection.
  • the experimental arrangement described above is only one of many examples according to the invention and the invention is by no means restricted to a specific arrangement of the optical means described above.
  • the experimental setup is not limited to the orientation shown. So the light can come from the bottom left or right instead of from above and the corresponding optical Means be moved or rotated accordingly.
  • the order of the optical means is not limited to the illustrated embodiment and can be changed according to the desired irradiation and measurement characteristics.
  • a transmission can also be measured according to the invention.
  • the convection generation method of the present invention can be easily implemented even in such a transmission test setup.
  • the one to Fig. 5 shows very similar experimental arrangement, but irradiates the light of the IR laser at a different location.
  • FIGS. 2A and 2B show by way of example the influence of the orientation of an irradiated IR laser beam 30 relative to gravity on the thermal convection within a sample chamber 45, in which an aqueous solution 50 with particles dissolved therein (not shown) is located. Also marked are the velocity vectors (arrows) and the flow lines (lines) of the thermal convection 90.
  • FIGS. 7A and 7B show by way of example the irradiation of radiation, preferably IR radiation, for example of laser radiation 30 in the filled with an aqueous solution 50 "well" 45 a multiwell plate, such as a 96, 384 or 1536 well multiwell plate.
  • the irradiated IR radiation 30 generates a thermal convection 90 in the irradiated sample chamber "well" 45.
  • the IR radiation 30 is irradiated through a transparent bottom 47 of a multiwell plate.
  • this multiwell plate may have a non-transparent bottom 48, but also, for example, a transparent bottom or even a partially transparent bottom.
  • FIG. 8 shows by way of example the application of the disclosed method in a concrete experimental arrangement, but without being limited thereto.
  • the reference numeral 1a denotes a light source used for the measurement.
  • the light source 1a may be one or more LEDs, one or more lasers, and / or one or more SLEDs (Super Luminescent LED).
  • Reference numeral 1b denotes a light source used for the measurement.
  • the light source 1b may be one or more LEDs, one or more lasers, and / or one or more SLEDs (Super Luminescent LED).
  • the light source 1b has a different wavelength or a different wavelength range than the light source 1a.
  • the light of the light source 1a and / or 1b is preferably used to irradiate a sample 50 to be examined.
  • the light emitted by the light sources 1a and / or 1b can be changed by means of known optical means, for example by means of a lens 26 and / or a lens system (not shown) or an aperture (not shown) or a polarizing filter.
  • the light of the light source 1a preferably passes through an excitation filter 25, preferably a bandpass filter
  • the light of the light source 1b preferably passes through an excitation filter 24, preferably a bandpass filter.
  • the excitation filter 24 has a different transmission range than the excitation filter 25.
  • Reference numeral 23 refers to an optional detector filter, for example a bandpass filter or a longpass filter or a shortpass filter or a dualpass or multipass filter. In the case of fluorescence, the filter 23 may also be referred to as an emission filter.
  • the light of the two excitation light sources is preferably combined, for example, reflected by the dichroic mirror 28 and then preferably by another dichroic mirror 29 in the direction of the object lens system 38.
  • the dichroic mirror 29 is also preferably used to separate the excitation light from the detection light.
  • the excitation light preferably passes through another dichroic mirror 34 ("hot mirror") and is then preferably from the object lens system 38 through the transparent bottom 47 of the multiwell plate into the aqueous solution 50, in the sample chamber 45, preferably a " Well "a multiwell plate, focused.
  • the excitation light excites the fluorescence of fluorescent particles 105, for example proteins with intrinsic fluorescence and / or fluorescence-labeled biomolecules or other fluorescent substances.
  • the fluorescent light is collected by the object lens system 38, preferably a lens, a combination of lenses or a microscope objective, then passes through the dichroic mirrors 34 and 29, then the detection filter 23, preferably an emission filter, for example a bandpass filter, dual pass filter or multipass filter, and is then focused by a lens 17, for example an asphere, onto the detector 19, for example a photodiode, a PMT, a CCD camera, a CMOS camera, a diode array, an avalanche photodiode.
  • the detection filter 23 preferably an emission filter, for example a bandpass filter, dual pass filter or multipass filter, and is then focused by a lens 17, for example an asphere, onto the detector 19, for example a photodiode, a PMT, a CCD camera, a CMOS camera, a diode array, an avalanche photodiode.
  • the infrared radiation for generating the thermal convection is preferably generated by means of a fiber-coupled infrared laser 32.
  • the fiber of the laser is coupled, for example by means of a fiber coupling 27, preferably with collimating functionality, in the optics or the optical system.
  • the infrared radiation may be changed by known optical means, for example by means of a lens 26 and / or a lens system (not shown) or an aperture (not shown) or a polarizing filter. For example, it may be parallelized or focused by the lens 26, for example an asphere.
  • the infrared radiation is mirrored by the dichroic mirror 34 ("hot mirror") in the object lens system 38.
  • the object lens system 38 then focuses the infrared radiation 30 through the transparent bottom 47 of the multiwell plate into the aqueous solution 50 of the sample chamber 45, preferably a "well" of a multiwell plate.
  • the multiwell plate is preferably a 96 well plate or 384 well plate or 1536 well plate.
  • the infrared radiation 30 generates a defined thermal convection 90 there for the mixing of the particles 105 in the aqueous solution 50.
  • the particles are, for example, biomolecules such as DNA, RNA, PNA, proteins, antibodies, antigens or small molecules, cells, viruses, bacteria, microbeads, nanobeads, nanoparticles, polymers, peptides.
  • the device can also be used for the detection and quantification of biomolecule aggregation, for example, the aggregation of proteins or therapeutic Antiköprern.

Landscapes

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Description

  • Die Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren und eine Vorrichtung zum berührungslosen Durchmischen von Flüssigkeiten bzw. zum Durchmischen von Partikeln in einer Flüssigkeit und insbesondere zum Durchmischen von wässrigen Lösungen. Erfindungsgemäß wird durch gezieltes Einstrahlen elektromagnetischer Strahlung in die Flüssigkeit eine gerichtete Flüssigkeitsbewegung erzeugt, um beispielsweise Partikel, vorzugsweise in der Flüssigkeit gelöste Partikel, zu einer Oberfläche bzw. Grenzfläche einer Probenkammer bzw. einer Oberfläche eines Flüssigkeitsvolumens zu transportieren, um für eine Durchmischung der Partikel mit der Flüssigkeit, insbesondere an der Oberfläche/Grenzfläche zu sorgen. Die Erfindung ist dahingehend vorteilhaft, dass eine "Verarmungsschicht" oder eine "Anreicherungsschicht" mit einer verminderten bzw. erhöhten Partikel-Konzentration an der Oberfläche/Grenzfläche vermieden wird, sodass Oberflächen bzw. Grenzflächen basierte Messverfahren verbessert werden können.
  • Die Erfindung ist auch dahingehend vorteilshaft, dass sie erlaubt kleine Volumina (Mikro-Volumina), die sich beispielsweise durch mechanische Einwirkungen wie schütteln oder rütteln schlecht durchmischen lassen, zu durchmischen.
  • Speziell betrifft die Erfindung auch ein Verfahren bzw. eine Vorrichtung zur Untersuchung spezifischer und unspezifischer Interaktionen bzw. Wechselwirkungen von Partikeln, die vorzugsweise in einer Flüssigkeit gelöst sind, mit Oberflächen bzw. Grenzflächen.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Messung physikalischer, chemischer, biochemischer und/oder biologischer Vorgänge, wie Reaktionen, Bindungs- und Anlagerungsvorgänge und sonstige Wechselwirkungen von Partikeln mit Oberflächen sind von großem Interesse in den Bereichen der Qualitätskontrolle, Wirkstoffforschung, Medizin, Grundlagenforschung und molekularen Diagnostik. Zur Untersuchung dieser Vorgänge werden Methoden wie die Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RlfS), Bio-Layer Interferometry (BLI), die Oberflächen Plasmonen Resonanz (Surface Plasmone Resonance, SPR), die Quarzkristall-Mikrowaagen (Quartz Crystal Microbalance, QCM), akustische Oberflächenwelle, kurz AOW, (engl. SAW für surface acoustic wave), Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), oder auch Nanoporen oder Transistoren (Next Generation Sequencing) eingesetzt.
  • Weitere beispielhafte Methoden sind Fluoreszenzmessungen, Fluoreszenz Anisotropie Messungen, Förster-Resonanz-Energie-Transfer Messungen (FRET), Interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (englisch total internal reflection fluorescence microscopy, TIRFM), Backscattering Interferometrie Messungen (BSI), Absorptionsmessungen, Spektroskopische Messungen, AlphaScreen® Assays, MicroScale Thermophoresis Messungen (MST), Patch Clamp Messungen.
  • Vorzugsweise werden die zu untersuchenden Partikel in einer Flüssigkeit, vorzugsweise einer wässrigen Lösung, bereitgestellt. Oberflächen basierende Verfahren sind generell darauf angewiesen, dass die zu untersuchenden Partikel die Oberfläche der Flüssigkeit bzw. die Oberfläche einer Probenkammer über einen längeren Zeitraum, der Messzeit bzw. Inkubations- oder Verfahrenszeit, hinweg erreichen können. Aufgrund der endlichen Konzentration der Partikel in der Flüssigkeit als auch aufgrund der begrenzten Diffusionskonstante (Diffusionsgeschwindigkeit) der Partikel, bildet sich häufig eine sogenannte "Verarmungsschicht" (englisch "Depletionlayer", siehe beispielsweise J. Mol. Recognit. 1999;12:293-299) an der Oberfläche bzw. Grenzfläche. Diese Verarmungsschicht kann zu einer Verfälschung der Messergebnisse bzw. zu einer Verlangsamung der Reaktion bzw. Untersuchung an der Oberfläche führen. Entsprechend kann sich bei bestimmten Anwendungen, z.B. bei der Messung der koff-Rate (Dissoziationsrate), bei der gemessen wird wie und wie schnell sich vormals an die Oberfläche gebundene Partikel (z.B. Antikörper) wieder von dieser lösen, eine "Anreicherungsschicht" der sich lösenden Partikel bilden. Diese Anreicherungsschicht kann zu einem unerwünschten sog. "Re-binding" /Rückbindung/Wiederbindung der sich lösenden Partikel führen. Sowohl die Verarmungsschicht als auch die Anreicherungsschicht können aus folgenden Gründen zu einer Verfälschung der Messergebnisse führen:
    1. a) Bindung (Messung der Bindungsrate/Bindungskinetik), Verarmungsschicht stört. Hier gibt man eine Lösung in die Probenkammer bestehend aus Puffer und gelösten zu untersuchenden Partikeln A der Konzentration [A]. Die Bindungskinetik wird beschrieben durch die Rate gamma: γ=kon * [A] + koff d.h. die Bindungsrate (Assoziationsrate) kon kann bei Zugabe des Puffers mit Partikel A nicht unabhängig von der Dissoziationsrate koff gemessen werden. Man kann nur eine apparente Rate gamma messen die aber von der Konzentration [A] abhängt. Man will aber oft die Konzentrationsunabhängigen Raten kon und koff bestimmen. Deshalb ist auch b) nötig.
      Bei a) stört die Verarmungsschicht (Anbindung, Assoziation) bei b) stört die Anreicherungsschicht (Dissoziation).
    2. b) Messung der Dissoziation/Dissoziationsrate koff, Anreicherungsschicht stört (siehe bsp. auch "Blocking rebinding with soluble receptor" in J. Mol. Recognit. 1999;12:293-299).
  • Da man, wie in a) beschrieben die kon und koff nicht unabhängig messen kann ist ein zweites Experiment notwendig mit dem man koff alleine bestimmen und dann zusammen mit a) bzw. einer wiederholten Messung von a) bei jeweils unterschiedlichen Konzentrationen [A], die kon bestimmen kann:
    Hier gibt man nur den Puffer, ohne Partikel A, in die Probenkammer in der zuvor die Bindung von A gemessen wurde. In der Probenkammer liegt A gebunden an die Oberfläche vor, man versucht ihn dann mit dem Puffer "wegzuspülen" bzw. abzulösen, um die reine koff von A messen zu können. Gibt man also reinen Puffer zu einer Probenkammer in der A an die Oberfläche gebunden ist (bzw. an die dort immobilisierten Moleküle B gebunden ist), dann muss sich ein neues chemisches Gleichgewicht einstellen (das zuvor eingestellte chemische Gleichgewicht hat sich für einen Puffer der A enthält eingestellt), das führt dazu dass sich die Moleküle A lösen. Transportiert man das sich lösende Molekül A schnell genug weg, dann kann es nicht wieder an die Oberfläche binden (das würde dazu führen dass man wieder gamma, also kon und koff gleichzeitig misst) und man kann so die reine koff Rate messen. Wird A nicht schnell genug abtransportiert bildet sich die Anreicherungsschicht. Die kon bzw. koff werden üblicherweise in den Einheiten: kon: 1/([s]*[M]) bzw. koff: 1/[s] angegeben.
  • In bekannten Verfahren wird versucht, diese Verarmungsschicht bzw. Anreicherungsschicht durch einen konstanten Flüssigkeitsstrom, der beispielsweise durch äußere Pumpen erzeugt wird, zu verringern. Dieser Ansatz hat den großen Nachteil, dass durch die äußeren Pumpen, Ventile und/oder Schläuche ein großes Totvolumen entsteht und das ganze System sehr fehleranfällig ist. Zudem sind Lecks, Verschmutzung der Schläuche und Ventile, Kreuzkontamination durch alte Proben die nicht vollständig entfernt werden konnten, Ursache für weitere Messfehler. Da bei den Nutzern oft nur sehr wenig oder sehr teures Probenmaterial vorhanden ist, sind die oben diskutierten Totvolumina ein großer wirtschaftlicher Nachteil. Zudem sind meist sehr große/voluminöse, schwer zu transportierende Gerätschaften zur Steuerung und Regelung der Pumpen und Ventile und damit des Flüssigkeitsstromes vorteilhaft. Das kann unter anderem deren Einsatz in der "point of care" / "point-of-need" Diagnostik verhindern.
  • Ein anderes Verfahren mit dem die Verarmungsschicht vermieden werden soll bewegt bzw. "rüttelt" die Probenkammer makroskopisch gegenüber einem Oberflächensensor. Ein Problem dieses Verfahrens besteht jedoch darin, dass die Probenkammer nach außen offen sein muss und so die wässrige Lösung verdampfen kann und/oder durch äußere Einflüsse verschmutzt werden kann. Das mechanische "Rütteln" der offenen Probenkammer ist zudem problematisch, da durch das Rütteln Flüssigkeiten überlaufen/"überschwappen" und so in benachbarte offene Probenkammern eindringen können.
  • Daneben wird auf die Patentschrift DE 103 25 307 B3 verwiesen, in der ein Verfahren zur Durchmischung von Flüssigkeiten in einer Mikrokavität unter Ausnutzung schallinduzierte Strömungen beschrieben wird. Dokumente US-A-5 823 676 , EMIR VELA ET AL: "Non-contact mesoscale manipulation using laser induced convection flows",INTELLIGENT ROBOTS AND SYSTEMS, 2008. IROS 2008. IEEE/RSJ INTERNATIONAL CONFERENCE ON, IEEE, PISCATAWAY, NJ, USA, 22. September 2008 (2008-09-22), Seiten 913-918, und DUHR S ET AL: "Thermophoresis of DNA determined by microfluidic fluorescence",EUROPEAN PHYSICAL JOURNAL E. SOFT MATTER, EDP SCIENCES, IT, Bd. 15, Nr. 3, 1. November 2004 (2004-11-01), Seiten 277-286 offenbaren die Durchmischung von Flüssigkeiten durch die Erzeugung einer thermischen Konvektions-Strömung.
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung insbesondere die oben genannten Nachteile aus dem Stand der Technik zur reduzieren bzw. zu überwinden und ein neues, vorzugsweise vorteilhafteres Verfahren sowie eine entsprechende Vorrichtung und System bereitzustellen.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Aufgabe wird durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche gelöst. Weitere bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen und den folgenden Aspekten bzw. Ausführungsbeispielen.
  • Die Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zur Durchmischung von Fluiden, vorzugsweise Flüssigkeiten bzw. zur Durchmischen von Partikeln in einem Fluid bzw. einer Flüssigkeit. Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Durchmischung von in der Flüssigkeit gelösten und/oder ungelösten Partikeln. Generell betrifft die vorliegende Erfindung die Durchmischung jeglicher Art von Partikeln bzw. Teilchen wie beispielsweise (Bio)Moleküle, (Nano)Partikel, (Mikro)beads, (Bio)Polymere, Lacke, Emulgatoren, Zellen (biologischen Zellen), Viren, Bakterien, Lipiden, Vesikel, Liposomen, Nanodiscs, Pigmente, Dispergieradditive, Pasten.
  • Vorzugsweise wird die Flüssigkeit als Flüssigkeitsvolumen in zumindest einer Probenkammer bereitgestellt, wobei die Probenkammer offen oder verschlossen sein kann. Alternativ zu einer Probenkammer kann die Flüssigkeit auch in Form eines Tropfens bereitgestellt werden, wobei erfindungsgemäß eine thermischer Konvektions-Strömungen innerhalb des Tropfens erzeugt wird. Beispielsweise kann der Flüssigkeitstropfen auf einem geeigneten Objektträger (siehe Diskussion unten) bereitgestellt werden und beispielsweise von einer Ölschicht umgeben sein, um eine Verdunstung zu verhindern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform reicht bereits die Bereitstellung sehr kleiner Flüssigkeitsvolumina in Glaskapillaren.
  • Unabhängig davon, ob die Flüssigkeit mit darin vorhandenen (gelösten oder ungelösten) Partikeln innerhalb einer Probenkammer oder innerhalb eines Tropfens für eine Messung bereitgestellt wird, wird eine Konvektions-Strömung in dem Flüssigkeitsvolumen durch Einstrahlung von elektromagnetischer Strahlung in das Flüssigkeitsvolumen erreicht und insbesondere eine Durchmischung der Flüssigkeit mit den darin vorhandenen Partikeln an einer Oberfläche des Flüssigkeitsvolumens bzw. an einer Grenzfläche bzw. Grenzschicht zwischen dem Flüssigkeitsvolumen und einer Materialschicht der Probenkammer erreicht. Das erfindungsgemäße Verfahren sowie die dazugehörige Vorrichtung ist somit für Messverfahren anwendbar, bei denen vorzugsweise an der Oberfläche bzw. Grenzfläche einer Flüssigkeit gemessen wird, da erfindungsgemäß eine Verarmungszone, Verarmungschicht, Anreicherungszone, Anreicherungsschicht bzw. eine Konzentrationsverschiebung an der Oberfläche bzw. Grenzfläche vermieden wird.
  • Erfindungsgemäß soll insbesondere eine gute Durchmischung in Kontaktflächen zwischen Festkörper (z.B. innere Oberfläche einer Probenkammer bzw. von Glaskapillaren) und der Flüssigkeit erreicht werden. Eine erfindungsgemäße Oberfläche bzw. Kontaktfläche ist jedoch nicht auf eine ebene Fläche beschränk, sondern kann auch dreidimensional bzw. fraktal sein, z.B. wenn Dextran oder Dendrimer beschichtete Glassubstrate verwendet werden und die Interaktion zwischen z.B. Antikörper und Antigen an/in der Dextran-Schicht stattfindet.
  • Vorzugsweise wird die thermische Konvektions-Strömung mit Hilfe zumindest einer elektromagnetischen Strahlungsquelle, vorzugsweise eine Lichtquelle erzeugt. Erfindungsgemäß wird die thermische Konvektions-Strömung mit Hilfe einer infraroten (IR-)Strahlenquelle erzeugt. Beispielsweise kann IR-Strahlung mit bekannten IR-Strahlungsquellen erzeugt werden und vorzugsweise durch ein optisches Mittel (beispielsweise Linse und/oder Spiegel/Reflektor) in der Flüssigkeit lokal positioniert und auch fokussiert werden. Abhängig von dem erfindungsgemäßen Versuchsaufbau bzw. der Anwendung kann es auch vorteilhaft sein, wenn der IR-Strahl parallelisiert wird oder sogar defokussiert wird (divergent). Erfindungsgemäß werden IR-LEDs als Strahlungsquelle verwendet.
  • Insbesondere wird die Flüssigkeit vorzugsweise lokal am Ort des eingestrahlten Strahls erwärmt und so die thermische Konvektions-Strömung erzeugt. Mit anderen Worten, die vorliegende Erfindung erzeugt Flüssigkeitsströme vorzugsweise direkt, und vorzugsweise rein optisch und insbesondere völlig berührungslos direkt in der Flüssigkeit/Lösung mit den Partikeln. Da es sich bei zu untersuchenden Flüssigkeiten häufig um wässrige Lösungen handelt, ist es in diesen Fällen besonders vorteilhaft, die elektromagnetische Strahlung im Infraroten Wellenlängenbereich auszuwählen, aufgrund des vorteilhaften Absorptionsverhaltens.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben zudem erkannt, dass eine wässrige Lösung nicht nur die Energie der IR-Laserstrahlung absorbiert, sondern auch der Impuls der Photonen der IR-Laserstrahlung (Lichtdruck) einen Einfluss auf das Konvektionsverhalten hat (siehe Figuren 2A, 2B). Durch die Energieabsorption wird lokal am Ort, an dem die IR-Laserstrahlung in die wässrige Lösung eingestrahlt wird, die wässrige Lösung erwärmt was zu der thermischen Konvektion führt. Zusätzlich wird bei der Absorption auch der Impuls der Photonen der IR-Laserstrahlung auf die wässrige Lösung übertragen. Durch diesen Lichtdruck (bzw. Strahlendruck) kann die Strömungsgeschwindigkeit der thermischen Konvektion, je nach Ausrichtung der IR-Laserstrahlung relativ zum Vektor der Gravitation, verstärkt (antiparallel zur Gravitation) oder abgeschwächt (parallel zur Gravitation) werden. Die Laserstrahlung kann auch senkrecht, bzw. schräg zur Gravitation ausgerichtet werden.
  • Die Wellenlänge der bevorzugten IR-Strahlung liegt vorzugsweise im Bereich 1200 nm bis 2000 nm. Weiter bevorzugt sind die speziellen IR-Laserwellenlängen: 980 nm (+/- 10 nm); 1450 nm (+/- 20 nm); 1480 nm (+/- 20 nm); 1550 nm (+/- 20 nm) und 1920 nm (+/- 20 nm).
  • Die Erfindung betrifft zudem eine Vorrichtung, um das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen. Insbesondere wird das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise in Kombination mit Oberflächen/Grenzflächen basierten Messverfahren/Messvorrichtungen eingesetzt. Dadurch können beispielsweise spezifische chemische, biochemische Interaktionen an Grenzflächen sicher und zuverlässig untersucht werden, vorzugsweise in extrem kleinen Volumina. Neben spezifischen Interaktionen von Partikeln mit Grenzflächen können auch unspezifische Effekte, wie beispielsweise "Kleben", Physisorption, Chemisorption, Sorption ,Adsorption, Absorption, elektrochemische Prozesse, katalytische Prozesse usw. untersucht werden
  • So kann das erfindungsgemäße Durchmischungsverfahren beispielsweise in Kombination mit Messvorrichtung zur Bestimmung von optischen Eigenschaften an einer dünnen Schicht verwendet werden, wodurch beispielsweise chemische, biochemische, medizinische und/oder physikalische Reaktionen, Bindungs- und/oder Anlagerungsvorgänge sowie sonstige Wechselwirkungen an der dünnen Schicht nachgewiesen werden können. Bei bekannten Messverfahren wird beispielsweise Licht, vorzugsweise Licht einer bestimmten Wellenlänge, auf eine zu untersuchende Probe eingestrahlt, wobei die Probe an eine dünne Schicht gebunden ist. Änderungen in der optischen Schichtdicke werden beispielsweise mittels Interferenzerscheinungen detektiert bzw. gemessen, woraus sich Rückschlüsse auf Reaktionen der untersuchten Probe mit einer entsprechend vorbehandelten dünnen Schicht ergeben.
  • Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht beispielsweise auch darin, dass es kein Totvolumen gibt. Erfindungsgemäß kann der Volumenverbrauch von einigen 100 Mikrolitern bis einigen Milliliter auf einige Nanoliter bis einige Mikroliter reduziert werden. Vorzugsweise werden als erfindungsgemäßes Volumen Volumina von 1 Mikroliter bis 10 Mikroliter eingesetzt. Aufwändige Flusszellen, Mikrofluidiken, Pumpen, Ventile und Schläuche entfallen vorzugsweise, wodurch eine erfindungsgemäße Vorrichtung sehr robust ist und vorzugsweise nicht durch etwaige Rückstände in Schläuchen und/oder Ventilen verschmutzt werden kann und es verhindert auch den Verlust der Probe/der Partikel in der Probe durch Kleben (Adsorption/Chemsorption/Physorption) der Partikel an den Oberflächen der Schläuche und Ventile (allgemeiner: an den Oberflächen der Totvolumina).
  • Da die Flüssigkeitsströme vorzugsweise völlig berührungslos, rein optisch erzeugt werden, kann eine Kreuzkontamination und/oder Verschmutzung der Proben vermindert und vorzugsweise sogar ausgeschlossen werden. Erfindungsgemäß können sowohl offene als abgeschlossene Probenkammern verwenden werden, wobei durch geschlossene Probenkammern zudem eine Verdampfung/Verdunstung der (wässrigen) Lösung vermieden werden kann. Dies ist beispielsweise dahingehend vorteilhaft, dass damit deutlich längere Messzeiten möglich sind.
  • Generell wird Konvektion wird durch eine Strömung hervorgerufen, die Partikel befördern kann. Ursache für die transportierende Strömung können grundsätzlich unterschiedliche Kräfte sein, wie z. B. Gewichtskraft oder Kräfte, die von Druck-, Dichte-, Temperatur- oder Konzentrationsunterschieden herrühren. Man unterscheidet dabei die erzwungene Konvektion, bei der der Teilchentransport durch äußere Einwirkung, zum Beispiel ein Gebläse oder eine Pumpe, hervorgerufen wird, und freie oder natürliche Konvektion, bei der der Teilchentransport vorzugsweise ausschließlich durch Auswirkungen des Temperaturgradienten hervorgerufen wird. Das erfindungsgemäße Verfahren erzeugt vorzugsweise eine freie bzw. natürliche Konvention, d.h., Konvektion die durch einen Temperaturgradienten hervorgerufen wird. Die Temperaturerhöhung ist dabei vorzugsweise so gering, dass die Partikel bzw. die Probe nicht beschädigt und/oder negativ beeinflusst werden.
  • Eine freie Konvektion aufgrund thermischer Dichteunterschiede kann beispielsweise wie folgt beschrieben werden: Bei Erwärmung dehnen sich Stoffe in der Regel aus (Ausnahme z.B. die Dichteanomalie des Wassers). Unter Einwirkung der Gravitationskraft steigen innerhalb einer Flüssigkeit Bereiche mit geringerer Dichte gegen das Gravitationsfeld auf (Auftrieb), während Bereiche mit höherer Dichte darin absinken. Wenn beispielsweise an der Unterseite einer Probenkammer Wärme zugeführt wird und an der Oberseite die Möglichkeit zur Abkühlung besteht, so entsteht eine kontinuierliche Strömung: Die Flüssigkeit wird erwärmt, dehnt sich dabei aus und steigt nach oben. Dort angelangt kühlt die Flüssigkeit ab, zieht sich dabei wieder zusammen und sinkt ab, um unten erneut erwärmt zu werden.
  • Die Geschwindigkeit der Flüssigkeitsströme der erfindungsgemäßen thermischen Konvektion kann vorzugsweise mittels Variation der optischen Energie bzw. Leistung, der Fokussierung oder Defokussierung, der Intensität, der Richtung, der Parallelität (bzw. auch Konvergenz und Divergenz) und/oder der Lage des Fokus relativ zur zu untersuchenden Oberfläche/dünnen Schicht, der Anzahl der Strahlen (Laserstrahl kann aufgespalten werden um mehrere Orte gleichzeitig zu heizen), der Einstrahldauer, der Pulsweitenmodulation (Pulshöhe, Pulsdauer, Wiederholrate), der Wellenlänge, der Geschwindigkeit des bewegten Strahls, der eingestrahlten Strahlung und/oder abhängig von der Einstrahlrichtung relativ zur Gravitation verändert bzw. kontrolliert werden. Die Position der eingestrahlten Strahlung (z.B. Position des Fokus der eingestrahlten Strahlung) kann variieren, beispielsweise kann der Fokus mittels Spiegelsystemen (vgl. Laserscanner) in allen drei Raumrichtungen positioniert und mit verschiedenen Geschwindigkeiten bewegt werden. Da die vorliegende Erfindung mittels optisch erzeugter thermischer Konvektion auch Flüssigkeitsströme senkrecht zu den Oberflächen von Probenkammern erzeugen kann (im Gegensatz zu Flüssigkeitsströmen die von äußeren Pumpen erzeugt werden), ist die Durchmischung der Flüssigkeit und die Reduzierung einer Verarmungsschicht sehr effizient.
  • Die Geschwindigkeit der thermischen Konvektion ist unter anderem von der Kammerdicke (Höhe in Richtung Gravitation) der Probenkammer und insbesondere von der Kammergeometrie abhängig. Insbesondere können Randflächen einer Probenkammer die Geschwindigkeit der thermischen Konvektion signifikant beeinflussen. Bevorzugt sind Probenkammern die dick genug sind (beispielsweise > 0,05mm), um eine gewünschte schnelle Strömungsgeschwindigkeit der thermischen Konvektion zu erreichen, um den "Depletionlayer" (die Verarmungsschicht) bzw. eine Anreicherungsschicht zu vermeiden.
  • Insbesondere ist es bevorzugt, erfindungsgemäß eine thermische Konvektion so zu erreichen, dass vorzugsweise eine laminare Strömung, vorzugsweise bei kleinen Reynolds-Zahlen erzeugt (Reynolds-Zahl Re< 1000) wird. Vorzugsweise setzt man Probenkammern (auch Flüssigkeitstropfen bzw. Wassertropfen) mit einem Volumen von <= 200µl (Mikrokavität) ein. Zudem ist eine Schichtdicke von mindestens 0,05mm bevorzugt, da bei geringeren Schichtdicken bzw. geringeren Dicken der Probenkammer der Konvektionseffekt zu schwach ist, um eine gewünschte Durchmischung zu erreichen. Auch ist es bevorzugt, Schichtdicken der Flüssigkeit bzw. Dicken der Probenkammer nicht größer als 11,5 mm (Well-Tiefe bei Multiwellplatten) zu verwenden.
  • Eine beispielhafte Konvektionsgeschwindigkeiten bei einer Probenkammer, die als Scheibe mit 1 mm Höhe und 5 mm Durchmesser, einem Volumen von 20 µl, einer Kammertemperatur von 52°C, einem IR-Laser mit 1480 nm bei eingestrahlter Lichtleistung von 75 mW liegt bei einer mittleren Geschwindigkeit von ca. 0,4 mm/s. Eine typische bzw. mittlere Ausdehnung der Konvektionsströmungslinien in diesem Beispiel liegt bei ca. 2 mm Durchmesser.
  • Bei der folgenden Probenkammer-Geometrie: Scheibe mit 0,05 mm Höhe und 5 mm Durchmesser; Kammertemperatur: 20°C; IR-Laser: 1480 nm; Temperaturerhöhung durch IR-Laserstrahlung: 1,25 K; liegt die typische/mittlere Geschwindigkeit der Konvektion bei ca. 0,0005 mm/s wenn die IR-Laserstrahlung antiparallel zur Gravitation ausgerichtet ist, die thermische Konvektion also unterstützt.
  • Im Folgenden wird ein Vergleich der Konvektionsgeschwindigkeit mit der DiffusionsGeschwindigkeit der Partikel diskutiert. Dieser Vergleich zeigt beispielsweise, dass die endliche, und daher zu langsame, Diffusion zum Problem der Verarmungs- bzw. Anreicherungsschicht führen kann. Beispielhafte Diffusionskonstanten D von Biomolekülen liegen zwischen 1 µm2/s und 400 µm2/s.
  • Vorzugsweise erfolgt die Bewegung/Verschiebung/Durchmischung der Partikel aufgrund der Konvektionsströmung angepasst an die Bewegung der Partikel (Brownsche Bewegung) aufgrund ihrer Diffusion (Diffusionskonstante D). Je nach Diffusionskonstante der zu untersuchenden Partikel gibt es eine bevorzugte einzusetzende mittlere Strömungsgeschwindigkeit der thermischen Konvektion und damit beispielsweise auch vorzugsweise einzusetzende Strahlungsintensitäten bzw. Konfigurationen für die Einstrahlung der Strahlung. Aufgrund des erfindungsgemäßen sehr flexiblen und gut variierbaren und vorzugsweise rein optischen Aufbaus kann die Konvektionsströmung und damit die Vermischung bevorzugt auf die zu untersuchenden Partikel eingestellt werden, ohne dass ein neuer Aufbau speziell für jeden Partikel gebaut werden muss.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur Durchmischung von Flüssigkeiten kann besonders vorteilhaft in der Analytik angewendet werden, insbesondere in Analytikverfahren bei denen die Bindungskinetik von Biomolekülen (beispielsweise Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten; kon, koff, auch Raten für die Hin (kon)- und Rückreaktion (koff) genannt) und die Bindungsaffinität, beschrieben beispielsweise durch die Dissoziationskonstante Kd=koff/kon, von Bedeutung sein können. Diese Ratenkonstanten können beispielhaft wie folgt beschrieben werden. Angenommen sei eine chemische Reaktion von Molekül A der Konzentration [A] mit Molekül B der Konzentration/Oberflächendichte [B] zum Komplex D der Konzentration [D]. Die Kinetik dieser Reaktion, also die Kinetik der Komplexbildung, kann mit folgender Gleichung beschrieben werden, die somit auch die Bedeutung der Ratenkonstanten zeigt: d dt D t = k on ∗ A t ∗ B t − k off ∗ D t
    Figure imgb0001
  • Weitere Beispiele für die Anwendung des erfindungsgemäßen Durchmischens ist die "Diagnostik" (Durchmischen auch bei ELISA wichtig), der Bereich der Elektrochemie, der Bereich der Katalysatoren, oder der Bereich der Qualitätskontrolle ("Kleben" an Oberflächen detektieren um es zu vermeiden). Zudem können Raten von "Kleben" von Partikeln bzw. Messen der Stärke des "Klebens" ("Kleben", Physorption, Chemsorption, Adsorption, Absorption) gemessen werden.
  • Auch bei Multiwellplatten (Einsatzort: ELISA) ist das Durchmischen mittels optisch erzeugter thermischer Konvektion vorteilshaft. Bei 384 Well Platten und/oder 1536 Well Platten sind die Haftkräfte der Flüssigkeit an den Oberflächen der Wells (Mikrokavitäten) so groß, dass die Flüssigkeit in den Wells auf einem Schüttler/Rüttler nicht mehr richtig durchgemischt wird. Durchmischen mittels optisch erzeugter thermischer Konvektion kann auch bei 96 Well Platten oder auch anderen Reaktionsgefäßen vorteilshaft sein, beispielsweise wenn mechanische Schüttler oder andere Mischvorrichtungen wie z.B. magnetische Rührfische aus Gründen wie z.B. der Vermeidung von Kontaminationen nicht verwendet werden können. Mittels IR-Laser der für z.B. auch nur für jeweils einige Sekunden in jedem Well eingesetzt wird, kann eine bessere Durchmischung im Well (Volumen < 200 µl) erreicht werden. Erfindungsgemäß ist auch, speziell bei dieser Anwendung, die thermische Konvektion zur Durchmischung mittels IR-LEDs zu erzeugen. IR-LEDs sind günstig; man kann z.B. 384 LEDs oder 96, oder 24 oder 16 einsetzen, um viele Wells gleichzeitig zu durchmischen. IR-LEDs haben typischerweise weniger Lichtleistung als IR-Laser, da die Schichtdicke der wässrigen Lösung in den Wells aber sehr groß ist (typischerweise > 1 mm) wird die IR-Strahlung sehr gut absorbiert (Gesetz von Beer-Lambert) und damit sind auch IR-LEDs leistungsstark genug.
  • Allgemein ist das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft für Reaktionskinetik Messungen bzw. Biomolekül Analytik. Insbesondere kann das Verfahren mit NanoTemper® Kapillaren (beispielsweise Glaskapillaren mit Innendurchmesser von 0,05mm bis 0,8mm) eingesetzt werden, vorzugsweise mit Innendurchmessern von 0,2 mm, 0,35 mm, 0,5 mm und 0,8 mm und Außendurchmessern kleiner gleich 1,0 mm.. Vorzugsweise sind keine Flusszellen nötig und eine Befüllung der Kapillaren kann rein passiv durch Kapillarkräfte erfolgen. Die innere Oberfläche der Glaskapillare kann unbehandelt oder zumindest teilweise spezifisch beschichtet/modifiziert sein (z.B. mit Antikörper, Antigen, DNA, RNA, PNA, TNA, Proteinen, Peptiden, Zellen, Polymere etc.) oder auch nicht.
  • Das offenbarte Verfahren kann allgemein mit Probenkammern bzw. Objektträgern durchgeführt werden, die zumindest einen Bereich aufweisen, der transparent ist. Transparenz ist in der Physik die Fähigkeit von Materie, elektromagnetische Wellen hindurch zulassen (Transmission). Im Alltag wird der Begriff meist auf Licht, also auf den für den Menschen sichtbare Spektralbereich elektromagnetischer Strahlung, bezogen. Erfindungsgemäß ist das transparente Material vorzugsweise in einem Wellenlängenbereich zwischen 200 nm bis 2000 nm durchlässig, d.h. vorzugsweise auch für infrarotes Licht und/oder UV Licht. Vorzugsweise ist das transparente Material für Licht im Bereich von 200 nm bis 900 nm, vorzugsweise 250 nm bis 900 nm, vorzugsweise 275 nm bis 850 nm transparent. Vorzugsweise ist das transparente Material auch für Licht der folgenden Wellenlänge transparent: 940 nm bis 1040 nm (vorzugsweise 980 nm +/- 10 nm), 1150 nm bis 1210nm, 1380 nm bis 1600 nm (vorzugsweise 1450 nm +/- 10 nm and/or 1480 nm +/- 10 nm und/oder 1550 nm +/- 10 nm), 1900 nm bis 2000 nm (vorzugsweise 1930 nm +/- 10 nm). Zudem kann es bereits ausreichen, wenn lediglich 10% des eingestrahlten Lichts durch das transparente Material durchgelassen werden, vorzugsweise mindestens 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oder mindestens 90% oder mehr.
  • Das transparente Material kann beispielsweise Glas und/oder eine Polymer aufweisen. Mögliche Materialien sind auch Borosilikate bzw. Borosilikatglas wie Brosilikatglas 3.3 (beispielsweise DURAN-Glas), Quarz Glas, wie Suprasil, Infrasil, Synthetisches Quarzglas bzw. Kieselglas, Kalk-Natron Glas, Bk-7, ASTM Type 1 Class A Glas, ASTM Type 1 Class B Glas. Das Polymer kann PTFE, PMMA, Zeonor™, Zeonex™, Teflon AF, PC, PE, PET, PP (Polypropylen), PPS, PVDF, PFA, FEP, und/oder Acrylglas aufweisen].
  • Das offenbarte Verfahren kann auch mit Pipettenspitzen, insbesondere mit zumindest teilweise transparenten Pipettenspitzen, beispielsweise aus Polypropylen, eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch mit Reaktionsgefäßen, z.B. Reaktionsgefäßen aus Glas oder Kunststoff ("Eppis"), vorzugsweise transparentem Glas und Kunststoff, eingesetzt werden. Beispielsweise mit Reaktionsgefäßen für die "Realtime PCR (Polymerase Kettenreaktion)". Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch mit Kammern/Kapillaren für die Elektrophorese, vorzugesweise der Kapillarelektrophorese eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch im Detektionsbereich einer HPLC/UHPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl. high performance liquid chromatography, HPLC) eingesetzt werden. Das offenbarte Verfahren kann auch mit Mikrofluidikkammern/Mikrofluidikchips eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit verschlossenen/versiegelten Multititerplatten (Multiwellplatten) die einen transparenten Boden und/oder Deckel haben eingesetzt werden. Das offenbarte Verfahren kann in verschweissten/versiegelten Ampullen, beispielsweise Glasampullen oder Kunststoffampullen, vorzugsweise transparenten Ampullen, eingesetzt werden. In den Ampullen können beispielsweise Stoffe für forensische oder diagnostische Tests eingeschlossen sein, die nicht verunreinigt werden dürfen und deshalb vorzugsweise nicht geöffnet werden sollen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch mit Multititerplatten (Multiwellplatten) die einen nicht-transparenten Boden haben erfolgen. Vorzugsweise sind Multititerplatten (Multiwellplatten) zum Befüllen mit Pipetten bzw. Pipetierrobotern jedoch offen, vorzugsweise oben offen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise auch überalldort eingesetzt werden, wo ein Durchmischen / eine Strömungserzeugung mittels externem Fluss (Pumpen) und/oder mechanischem Rütteln nicht möglich (beispielsweise alle abgeschlossenen Reaktionsgefaße/Mikrokavitäten) oder sinnvoll ist, aber die wässrige Lösung optisch zugänglich ist.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann in der Diagnostik, auch zur Durchmischung bei ELISA Platten angewendet werden. Ein weiteres beispielhaftes Anwendungsgebiet ist die Qualitätskontrolle.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zum Durchmischen kann mit einer Vielzahl verschiedener bekannter Mess- und Auslesetechniken kombiniert werden, insbesondere zur Messung spezifischer und unspezifischer Interaktionen von Partikeln an Oberflächen/Grenzflächen. Folgende typische Oberflächentechniken seien beispielhaft erwähnt: Zur Messung werden Methoden wie die Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RlfS), Bio-Layer Interferometry (BLI), die Oberflächen Plasmonen Resonanz (englisch Surface Plasmone Resonance, SPR), die Quarzkristall-Mikrowaagen (englisch Quartz Crystal Microbalance, QCM), akustische Oberflächenwelle, kurz AOW, (engl. SAW für surface acoustic wave), Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), oder auch Nanoporen oder Transistoren (Next Generation Sequencing) eingesetzt. Beispielsweise können diese Messverfahren durch eine Kombination aus z.B. Glaskapillaren bestimmter Durchmessers als Probenkammer der wässrigen Lösung mit den Partikeln, IR-Laser/LED zur Erzeugung einer thermischen Konvektion in der wässrigen Lösung in der Glaskapillaren und einer entsprechenden Mess- bzw. Versuchsanordnung verbessert werden.
  • Generell betrifft das offenbarte Verfahren zum Durchmischen von Flüssigkeiten bzw. Partikeln mit einer Flüssigkeit die Schritten: Bereitstellen eines Flüssigkeitsvolumens und Erzeugen einer thermischen Konvektions-Strömung an zumindest einer Oberfläche/Grenzfläche des Flüssigkeitsvolumens durch Einstrahlen von elektromagnetischer Strahlung in das Flüssigkeitsvolumen.
  • Das Flüssigkeitsvolumen kann beispielsweise in einer Probenkammer bereitgestellt wird, die offen oder geschlossen ist. Vorzugsweise kann als Probenkammer eine Mikrokavität dienen, weiter bevorzugt eine Kapillare oder eine Pipettenspitze. Bevorzugt sollte eine Probenkammer zumindest einen Bereich aufweisen, der zumindest teilweise transparent ist. Vorzugsweise hat die Probenkammer eine Dicke von 0,01 mm bis 25 mm, vorzugsweise 0,05 mm bis 12 mm, vorzugsweise 0,05 mm bis 1 mm. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform haben Kapillare einem Innendurchmesser von 0,01 mm bis 3 mm, vorzugsweise 0,05 mm bis 0,8 mm wobei die Kapillare vorzugsweise zumindest teilweise aus Glas oder sonstigen zumindest teilweise transparenten Materialen hergestellt sind. Das Flüssigkeitsvolumen kann auch als Tropfen auf einem Objektträger bereitgestellt werden.
  • Vorzugsweise hat die Probenkammer ein Volumen von 0,001 µl bis 1000 µl, vorzugsweise von 0,1 µl bis 200µl, vorzugsweise von 1µl bis 10µl, vorzugsweise von 1µl bis 6µl.
  • Die die Oberfläche des Flüssigkeitsvolumens wird vorzugsweise durch die Grenzschicht zwischen Flüssigkeitsvolumen und einer Fläche der Probenkammer gebildet oder beispielsweise durch die Grenzschicht zwischen Flüssigkeitsvolumen und einer Fläche des Objektträgers.
  • Bei der verwendeten Flüssigkeit handelt es sich vorzugsweise um eine wässrige Lösung, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
  • Die elektromagnetische Strahlung weist vorzugsweise IR-Strahlung auf bzw. nur Wellenlängen im IR Bereich und wird vorzugsweise von einem Laser und/oder einer LED erzeugt.
  • Die eingestrahlte Strahlung kann parallel und/oder antiparallel zur Gravitation gerichtet sein und/oder eine Komponente enthalten die senkrecht zur Gravitation ausgerichtet ist.
  • Vorzugsweise erzeugt die eingestrahlten Strahlung ein Temperaturgradient von 0,001 K/µm (=1 K/mm) bis 5 K/µm (=5000 K/mm), vorzugsweise von 0,001 K/µm (=1 K/mm) bis 2 K/µm (=2000 K/mm).
  • Weiter bevorzugt wird der Temperaturgradient in einem kleinen Bereich, vorzugsweise in einem Bereich von 0,00001 mm2 bis 1 cm2 erzeugt, vorzugsweise in einem Bereich von 0,0001 mm2 bis 12 mm2 erzeugt.
  • Ein Detektionsbereich zur Messung von Eigenschaften der Flüssigkeit bzw. der Partikeln in der Flüssigkeit kann von dem Bereich beabstandet sein, in dem die Strahlung eingestrahlt wird. Beispielsweise kann der Detektionsbereich mindestens 0.01 mm von dem eingestrahlten Strahl beabstandet sein, wobei der Abstand vorzugsweise senkrecht zur Einstrahlrichtung gemessen wird.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform können der Detektionsbereich und der Einstrahlbereich auch überlappen. So ist die Detektionsfläche oft größer als ein gut fokussierter Laserstrahl (beispielsweise sind 2µm Durchmesser bei IR erreichbar). Daher wird in dieser Ausführungsform vorzugsweise die gesamte Detektionsfläche von der Konvektionsströmung überstrichen. Der Überlapp von Detektionsbereich und Einstrahlbereich ist beispielsweise in den Aufbauten aus Fig. 5 oder Fig. 6 anwendbar. Da alles durch die gleiche Optik fokussiert wird, liegt der Heizfokus der IR Strahlung vorzugsweise innerhalb des Detektionsbereichs
  • Bevorzugte Strömungsgeschwindigkeiten der der Konvektions-Strömung liegen im Bereich von 0,0001 mm/s bis 10mm/s, vorzugsweise 0,0005 mm/s bis 2mm/s.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur Durchmischung ist insbesondere vorteilhaft, wenn es mit zusätzlichen Messverfahren kombiniert wird. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen an und/oder in einer dünnen Schicht in einem Flüssigkeitsvolumen gemäß Anspruch 7. Vorzugsweise wird eine Probenkammer zur Durchführung einer derartigen Messung in Form einer Kapillare, Pipettenspitze, Multiwellplatte bzw. eines Mikrofluidikchip bereitgestellt.
  • Die Messung der Wechselwirkung erfolgt vorzugsweise mittels Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RlfS), Oberflächen Plasmonen Resonanz (englisch Surface Plasmone Resonance, SPR), Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Quarzkristall-Mikrowaagen (Quartz Crystal Microbalance; QCM), und/oder akustischer Oberflächenwelle, (surface acoustic wave; SAW). Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen kann die die Messung der Wechselwirkung mindestens ein Verfahren sein aus der Gruppe: Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RlfS), Bio-Layer Interferometry (BLI), Oberflächen Plasmonen Resonanz (Surface Plasmone Resonance; SPR), Quarzkristall-Mikrowaagen (Quartz Crystal Microbalance; QCM), akustische Oberflächenwelle, kurz AOW, (surface acoustic wave; SAW), Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Nanoporen oder Transistoren (Next Generation Sequencing).
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Vorrichtung zum Durchmischen von Flüssigkeiten bzw. Partikeln mit einer Flüssigkeit, insbesondere zur Durchführung eines oben beschriebenen Verfahrens, gemäß Anspruch 9. Schließlich wird ein System mit einer Vorrichtung zur Durchmischung und einer Vorrichtung zur Messung offenbart, wobei die Messeinrichtung vorzugsweise zum Messen einer spezifischen oder unspezifischen Wechselwirkung der Partikel mit einer Oberfläche/Grenzfläche einer Probenkammer bzw. eines Objektträgers dient.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Im Folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die Figuren ausführlich beschrieben. Es zeigen:
    • Fig. 1
    ein beispielhaftes IR-Absorptionsspektrum von Wasser bzw. einer wässrigen Lösung mit eingezeichneten Absorptionsmaxima;
    Fig. 2A & 2B
    schematisch den Einfluss der Orientierung eines eingestrahlten IR-Laserstrahls relativ zur Gravitation auf die erzeugten thermischen Konvektionen;
    Fig. 3
    eine schematische Darstellung des bevorzugten Detektionsbereichs zur Messungen der spezifischen und unspezifischen Wechselwirkung von Partikeln innerhalb einer Probenkammer;
    Fig. 4
    eine weitere Ausführungsform einer Anordnung für das offenbarte Verfahren bei der insbesondere der Strahlenverlauf beteiligter Lichtstrahlen schematisch eingezeichnet ist;
    Fig. 5
    eine schematische Darstellung einer Versuchsanordnung zur Messung von spezifischen bzw. unspezifischen Wechselwirkungen von Partikeln mit einer Oberfläche;
    Fig. 6
    eine ähnliche schematische Darstellung wie in Fig. 5, jedoch mit einer weiter oben angeordneten Einrichtung zum Einkoppeln eines Laserstrahls zum Erzeugen der Konvektion in der Messzelle;
    Fig. 7A & 7B
    zeigt schematische Darstellungen des Einstrahlens von IR-Strahlung in Multiwellplatten; and
    Fig. 8
    zeigt eine schematische Darstellung einer beispielhaften erfindungsgemäßen Versuchsanordnung zur Messung von mehrfarbiger (Multiplexing) Fluoreszenz in einer Multiwellplatte bei der sowohl Fluoreszenzanregung, Fluoreszenzdetektion als auch die Fokussierung der IR-Strahlung durch das gleiche Optische System erfolgt.
    DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Figur 3 zeigt beispielhaft den Detektionsbereich 80 zur Messungen der spezifischen und unspezifischen Wechselwirkung von Partikeln. Bei der dargestellten Probenkammer 45 handelt es sich beispielhaft um eine Kapillare.
  • Der Detektionsbereich 80 befindet sich vorzugsweise an der Oberfläche/Grenzfläche des Messvolumens innerhalb der Kapillare 45, d.h. an der Innenseite der Probenkammer 45. Der Detektionsbereich 80 kann beispielsweise so um den Bereich einer eingestrahlten IR-Strahlung 30 gewählt werden, dass er kleiner, größer oder gleich groß wie die von der thermischen Konvektion 90 überstrichene Fläche ist.
  • Der Detektionsbereich 80 kann beispielsweise eine dünne Schicht sein und beispielsweise Antikörper zum spezifischen Nachweis von Antigenen enthalten. Mit anderen Worten, der Detektionsbereich befindet sich an der Oberfläche der Flüssigkeit bzw. der Oberfläche der Kapillare 45. Der Detektionsbereich 80 kann beispielsweise auch aus mehreren unterschiedlichen dünnen Schichten zusammengesetzt sein, die sich beispielsweise in ihrem Brechungsindex, Polarisierbarkeit oder ihrer Fluoreszenz unterscheiden. Die Konvektion wird vorzugsweise so eingestellt, dass es im Detektionsbereich nicht zum Aufbau einer Verarmungsschicht bzw. einer Anreicherungsschicht kommt. Beispielsweise kann die thermische Konvektion so eingestellt werden, dass sie Partikel von weit außerhalb des Detektionsbereichs, beispielsweise einige Millimeter entfernt, in den Detektionsbereich transportiert.
  • Reihenfolge kann variiert werden, entscheidend ist, dass es einen bestimmten Abstand zwischen IR-Laser Fokus (bestimmt die "Konvektions-Walzen") und dem Ort gibt, an dem die Wechselwirkung an der Oberfläche detektiert wird. Der Abstand zwischen beiden ist wichtig, da der IR-Laser je nach Leistung und Kammerdicke und Kammergeometrie unterschiedliche thermische Konvektionsströmungen erzeugt. Man muss das Ganze so einstellen, dass man am Beobachtungsort für die Wechselwirkung die richtigen thermischen Konvektionsströmungen hat (um die Verarmungsschicht der Moleküle zu vermeiden).
  • Figur 4 zeigt eine beispielhafte Anordnung in der das erfindungsgemäße Verfahren Anwendung findet. Infrarote Laserstrahlung 30 wird hier von unten in eine Probenkammer 45 mit einem Flüssigkeitsvolumen, hier einer wässrigen Lösung mit Partikeln 50, eingestrahlt und erzeugt in der Probenkammer 45 eine thermische Konvektion 90. Die Strömungsgeschwindigkeiten in der Flüssigkeit sind durch entsprechende Vektoren dargestellt. Zudem ist in diesem Beispiel eine symmetrische Konvektion um den eingestrahlten Laserstrahl 30 erkennbar. Als Detektionsmethode für die Messung der Wechselwirkung der in der Flüssigkeit gelösten Partikel 105 mit einer dünnen Schicht (schraffiert dargestellt) funktional immobilisierter Moleküle/Partikel 103 wird die reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) Methode verwendet.
  • Kurz zusammengefasst handelt es sich bei RIfS um eine physikalische Methode, die auf der Interferenz von Weißlicht an dünnen Schichten beruht. Diese Methode wird in der Praxis beispielsweise dazu eingesetzt, um molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen. Das grundlegende Messprinzip entspricht dem Fabry-Perot-Interferometer. RIfS findet vor allem als Detektionsmethode in Chemo- und Biosensoren Anwendung. Als sensitive Schichten werden meist nicht selektiv messende Polymere verwendet, die Analyten entweder anhand ihrer Größe (sog. Molekularsiebeffekt bei mikroporösen Polymeren) oder auf Grund unterschiedlicher Polaritäten (z. B. funktionalisierte Polydimethylsiloxane) sortieren. Im Bereich der Biosensoren werden beispielsweise Polymere wie Polyethylenglykole oder Dextrane auf das Schichtsystem aufgebracht und darauf Erkennungsstrukturen für Biomoleküle immobilisiert. Als Erkennungsstrukturen sind prinzipiell alle Stoffklassen verwendbar (Proteine wie z. B. Antikörper, DNA/RNA wie z. B. Aptamere, kleine organische Moleküle wie z. B. Estron, aber auch Lipide wie z. B. Phospholipid-Membranen).
  • In Fig. 4 ist zudem ein Träger 46 dargestellt, der Bestandteil der Probenkammer 45 sein kann. Es ist jedoch auch möglich, dass die zu untersuchende Probe als Tropfen bzw. Flüssigkeitsschicht auf dem Träger bereitgestellt wird. Der Träger 46 kann beispielsweise aus Glas oder Kunststoff hergestellt sein. Auf diesem Träger 46 ist die zu untersuchende dünne Schicht, umfassend eine Lage 103 aus funktional immobilisierten Molekülen und eine weitere Lage 102 aus Molekülen, die zwischen der Lage 103 und dem Träger 46 angeordnet ist, schematisch dargestellt. Die Lage 102 dient insbesondere der besseren Haftung der dünnen Schicht auf dem Träger 46. Die Schicht/Lage 102 aus Molekülen (z.B. PEG oder Dextran, etc.) die zwischen der Lage 103 und dem Träger 46 angeordnet ist (schematisch dargestellt) kann beispielsweise als Abstandshalter und/oder als Immobilisierungshilfe für die funktionalen Moleküle aus Schicht 103 dienen. Die Lage 102 dient insbesondere auch der besseren Haftung der Lage/dünnen Schicht 103 auf dem Träger.
  • An die funktional immobilisierten Moleküle/Partikel der Lage 103 können Proben-Partikel 105 anbinden. In der Folge wächst die Dicke der dünnen Schicht an, der Abstand ihrer oberen Begrenzungsfläche 104 zur Phasengrenze zwischen dünner Schicht und Träger (bzw. zur unteren Begrenzungsfläche der dünnen Schicht) wird größer. Von unten eingestrahltes Licht 31, das zur Messung dient, wir nach Anbindung der Proben-Partikel 105 nunmehr auch an der Begrenzungsfläche 104 reflektiert. Die Begrenzungsfläche 104 entsteht gegenüber der Lösung mit Partikeln 50 beispielsweise, wenn die Partikel aus der wässrigen Lösung an die funktional immobilisierten Moleküle in der dünnen Schicht 103 binden. Der reflektierte Strahl 113 an dieser Begrenzungsfläche 104 ist schematisch eingezeichnet. Zudem sind auch noch die reflektierten Strahlen 112, 111a, 111b und 110 dargestellt, die an Grenzflächen reflektiert werden, die unter der Begrenzungsfläche 104 liegen. Da das eingestrahlte Licht bis zur Begrenzungsfläche 104 eine größere Weglänge zurücklegen muss, resultiert eine Verschiebung des Interferogramms, das durch die Überlagerung der reflektieren elektromagnetischen Strahlung 110, 111a, 111b, 112 und 113 erzeugt wird. Diese Verschiebung kann zeitaufgelöst gemessen werden, was genau Rückschlüsse auf die Schichtdickenänderung und damit auf die Wechselwirkung der gelösten Partikel 105 mit den funktional immobilisierten Partikeln 103 zulässt.
  • Beispielsweise handelt es sich bei den Partikeln 105 in der wässrigen Lösung um Biomoleküle wie DNA, RNA, Proteine, Antikörper, Antigene, etc. Small Molecules, Nanopartikel, Polymere, Peptide, PNA, etc. oder auch Zellen, Viren, Bakterien, Vesikel, Liposomen, Mikrobeads, Nanobeads, Nanodiscs, etc.
  • Figur 5 zeigt beispielhaft die Anwendung des Verfahrens in einer konkreten Versuchsanordnung, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Die Bezugsziffer 1 bezeichnet eine Lichtquelle die für die Messung verwendet wird. Beispielsweise kann es sich bei der Lichtquelle 1 um eine oder mehrere LED(s) handeln, ein oder mehrere Laser und/oder eine oder mehrere SLED(s) (superlumineszente LED). Das Licht der Lichtquelle 1 dient primär dazu, eine zu untersuchende Probe 50 zu bestrahlen, vorzugsweise senkrecht zu bestrahlen. Das von der Lichtquelle 1 abgestrahlte Licht kann mittels bekannter optischer Mittel verändert werden, beispielsweise mittels eines Diffusors 4 und/oder eines (nicht dargestellten) Linsensystems. Beispielsweise kann eine Diffusors 4 dazu verwendet werden, das Licht gleichmäßig zu verteilen und ein Linsensystem dazu verwendet werden, das Licht in gewünschter Weise zu bündeln. Anschließend passiert das Licht in diese Ausführungsform einen Polarisator 5, beispielsweise zur Erzeugung von linear polarisiertem Licht. Zusätzlich kann das Licht auch noch einen Filter 14 durchqueren, sodass ein Lichtstrahl 31 mit definierten Eigenschaften auf die Probe 50 gestrahlt wird. Das Filter 14 kann beispielsweise ein Wellenlängenfilter sein, beispielsweise ein Bandpassfilter, oder ein Langpassfilter oder ein Kurzpassfilter.
  • Der Strahlteiler 7 dient in der dargestellten Ausführungsform dazu, den Lichtstrahl in einen Messstrahl bzw. Messstrahlengang 9 und einen Referenz-Strahl bzw. Referenz-Strahlengang 11 aufzuteilen, wobei der Messstrahlengang nach unten dargestellt ist und der Referenz-Strahlengang 11 nach links zur Referenz-Detektoranordnung 19' dargestellt ist. Der Strahlenteiler 7 hat vorzugsweise eine polarisierende Eigenschaft. Der Strahlenteiler 7 kann in bestimmten Ausführungsformen jedoch auch weggelassen werden. Dann entfällt auch der Referenz-Strahlengang 11, bzw. der ganze Referenzzweig aus Referenz-Strahlengang 11, Referenz-Linsensystem 17', Referenz-Detektorfilter 23' und Referenz-Detektor 19'.
  • In der dargestellten Ausführungsform mit Referenz-Zweig kann die Referenz-Detektoranordnung 19' beispielsweise eine Photodiode, ein Photomultiplier (Photoelektronenvervielfacher, kurz Photovervielfacher, engl. photomultiplier tube, PMT), eine CCD Kamera (Charge-Coupled Device), eine CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor; komplementärer Metall-Oxid-Halbleiter), ein Diodenarray oder eine Avalanche-Photodiode sein. Der Referenz-Zweig kann vor der Referenz-Detektoranordnung 19' ein Referenz-Linsensystem 17' für die Abbildung/Fokussierung auf die Referenz-Detektoranordnung 19' aufweisen und/oder einen Referenz-Detektorfilter 23', beispielsweise ein Bandpassfilter, oder ein Langpassfilter oder ein Kurzpassfilter.
  • Der Messstrahlengang 9 kann, bevor er auf die Probe 50 trifft, mit zusätzlichen optischen Mitteln, die nach dem Strahlenteiler 7 angeordnet sind, verändert werden. Dargestellt ist beispielhaft ein Spotfilter 21 sowie ein (erstes) optisches Korrekturelement 35, um beispielsweise die Phasenverschiebung, Polarisationsänderung und/oder Strahlengangsänderung die durch den zweiten Strahlteiler 34 zum Einkoppeln der infraroten Laserstrahlung möglicherweise erzeugt wird, zu kompensieren/korrigieren. Zudem ist auch ein zweites optisches Korrekturelement 36 dargestellt, das optional mit einer Linse oder einem Linse/Linsensystem erweitert werden kann, um beispielsweise die Phasenverschiebung, Polarisationsänderung und/oder Strahlengangsänderung die durch den (zweiten) Strahlteiler 34 zum Einkoppeln der infraroten Laserstrahlung einhergehen können, zu kompensieren/korrigieren. Das zweites optisches Korrekturelement 36 und oder die optionale Linse bzw. das optionale Linsensystem kann auch dazu dienen, die Strahlengänge auf die Probe 50 zu fokussieren.
  • Die Probe 50 kann auf einem Träger 46 als Tropfen bzw. in einer Probenkammer 45, wie in den Figuren 2 bis 4 dargestellt, bereitgestellt werden. Insbesondere kann eine Probenkammer eine Kapillare, eine Mikrokavität, ein Reaktionsgefäß ("Eppi"), eine Mikrofluidik, oder eine Pipettenspitze sein ohne darauf beschränkt zu sein. Bei der zu untersuchenden Probe 50 handelt es sich vorzugsweise um eine Flüssigkeit, vorzugsweise eine wässrige Lösung, mit darin vorhandenen Partikeln 105 (siehe Fig. 4), die in gelöster oder ungelöster Form vorliegen können.
  • Der Träger 46 ist vorzugsweise zumindest teilweise transparent, wobei der dargestellte Träger 46 ein aus einem Glas geformtes Objektträgerglas ist, auf dem eine dünne Schicht 103 ausgebildet ist. Die zu untersuchende dünne Schicht 103 umfasst beispielsweise eine Lage aus funktional immobilisierten Molekülen.
  • Die dünne Schicht 103 wird durch die zu untersuchende Probe 50 beeinflusst. Beispielsweise führt eine Wechselwirkung der Moleküle auf der dünnen Schicht 103 mit den entsprechenden Partikeln 105 in der Probe zu einer Schichtdickenänderung (siehe Fig. 4). Diese Schichtdickenänderung beeinflusst das über den Messstrahlengang 9 auf den Träger 46 geleitete und an der Oberfläche der dünnen Schicht reflektierte Licht, das durch den Strahlenteiler 7 umgelenkt und auf einer Detektoranordnung 19 abgebildet wird. Vorzugsweise ist der Messzweig (rechts vom Strahlteiler 7) mit der Detektoranordnung 19 ähnlich oder sogar identisch wie der Referenzzweig (rechts vom Strahlteiler 7) gestaltet. In der dargestellten Ausführungsform kann die Detektoranordnung 19 beispielsweise eine Photodiode, ein Photomultiplier (Photoelektronenvervielfacher, kurz Photovervielfacher, engl. photomultiplier tube, PMT), eine CCD Kamera (Charge-Coupled Device), eine CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor; komplementärer Metall-Oxid-Halbleiter), ein Diodenarray oder eine Avalanche-Photodiode sein. Der Messzweig kann vor der Detektoranordnung 19 ein Linsensystem 17 für die Abbildung/Fokussierung auf die Detektoranordnung 19 und/oder einen Detektorfilter 23, beispielsweise ein Bandpassfilter, oder ein Langpassfilter oder ein Kurzpassfilter aufweisen.
  • Wie bereits in Bezug auf die Figur 4 beschrieben, wird vorzugsweise die Mehrfachreflexion an den Grenzflächen der dünnen Schicht für die Messung verwendet, wobei die reflektierten Stahlen mit den beiden Detektoranordnungen 19, 19' detektiert werden. Die beiden Detektoranordnungen 19, 19' sind mit einer Auswerteeinheit verbunden die hier nicht näher beschrieben wird.
  • Um in der dünnen Schicht 103 eine gute Durchmischung zu gewährleisten und eine Verarmungsschicht zu vermeiden wird erfindungsgemäß Licht eines Laser 32 in die Probe 50 eingestrahlt. Zur Einstrahlung des Laserlichts wird in Figur 5 der bereits oben erwähnte zweite Strahlteiler 34 unterhalb des ersten Strahlteilers 7 angeordnet. In einer weiteren Ausführungsform gemäß Figur 6, in der gleiche Bezugszeichen auf gleiche Komponenten verweisen, ist beispielhaft der zweite Strahlteiler 34 oberhalb des ersten Strahlteilers 7 dargestellt. Mit Hilfe des zweiten Strahlteilers 34 kann die infrarote Laserstrahlung 30, die vom Laser 32 emittiert wird und optional mit einem optischen Mittel 33, beispielsweise Linsen, bzw. Linsensystem beispielsweise Kollimator für Parallelisierung und/oder Fokussierung der infraroten Laserstrahlung, verändert wird, in den Messstrahlengang 9 eingekoppelt. Der Strahlteiler 34 kann dem Strahlteiler 7 ähneln, gleich sein, oder auch andere Eigenschaften aufweisen. Beispielsweise kann der Strahlteiler 34 ein dichroidischer Spiegel sein bzw. ein "Hot Mirror". Es wird hier nochmals explizit hervorgehoben, dass die eingestrahlte elektromagnetische Strahlung 31 zur Messung dient, wohingegen die eingestrahlte elektromagnetische Strahlung 30 zur Erzeugung einer Konvenktion dient.
  • Auch wird hier explizit betont, dass die oben beschriebene Versuchsanordnung nur eines vieler erfindungsgemäßen Beispiele ist und die Erfindung keinesfalls auf eine spezielle Anordnung der oben beschrieben optischen Mittel beschränkt ist. Insbesondere ist die Versuchsanordnung nicht auf die dargestellte Ausrichtung beschränkt. So kann das Licht anstelle von oben auch von unten links oder rechts kommen und die entsprechenden optischen Mittel entsprechend verschoben bzw. rotiert werden. Zudem ist die Reihenfolge der optischen Mittel nicht auf die dargestellte Ausführungsform beschränkt und kann entsprechend den gewünschten Eigenschaften zur Einstrahlung und Messung verändert werden. Anstelle der dargestellten Reflexion kann erfindungsgemäß auch eine Transmission gemessen werden. Ein Fachmann wird jedoch leicht erkennen, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Erzeugung von Konvektionen auch in einer solchen Transmissionsversuchsanordnung leicht implementiert werden kann. Auch wird in diesem Zusammenhang auf die Fig. 6 verwiesen, die eine zur Fig. 5 sehr ähnliche Versuchsanordnung zeigt, jedoch das Licht des IR-Lasers an einer anderen Stelle einstrahlt.
  • Figuren 2A und 2B zeigen beispielhaft den Einfluss der Orientierung eines eingestrahlten IR-Laserstrahls 30 relativ zur Gravitation auf die thermische Konvektion innerhalb einer Probenkammer 45, in der sich eine wässrige Lösung 50 mit darin gelösten Partikeln (nicht dargestellt) befindet. Eingezeichnet sind zudem die Geschwindigkeitsvektoren (Pfeile) und die Strömungslinien (Linien) der thermischen Konvektion 90.
  • Ist die Laserstrahlung wie in Fig. 2A dargestellt antiparallel zur Gravitation ausgerichtet, so verstärkt der Strahlendruck/Lichtdruck die thermische Konvektion, d.h. die Strömungsgeschwindigkeit ist höher als wenn die Laserstrahlung parallel oder senkrecht zur Gravitation ausgerichtet ist.
  • Ist die Laserstrahlung wie in Fig. 2B dargestellt parallel zur Gravitation ausgerichtet, so schwächt der Strahlendruck/Lichtdruck die thermische Konvektion ab, die Strömungsgeschwindigkeit ist geringer als wenn die Laserstrahlung antiparallel oder senkrecht zur Gravitation ausgerichtet ist.
  • Figuren 7A und 7B zeigen beispielhaft das Einstrahlen von Strahlung, vorzugsweise IR-Strahlung, beispielsweise von Laserstrahlung 30 in das mit einer wässrigen Lösung 50 gefüllte "Well" 45 einer Multiwellplatte, beispielsweise einer 96er, 384er oder 1536er Well Multiwellplatte. Die eingestrahlte IR-Strahlung 30 erzeugt in der bestrahlten Probenkammer "Well" 45 eine thermische Konvektion 90.
  • In der Fig. 7A wird die IR-Strahlung 30 durch einen transparenten Boden 47 einer Multiwellplatte eingestrahlt.
  • In der Fig. 7B wird die IR-Strahlung 30 nicht durch den Boden, sondern direkt in die wässrige Lösung 50 in der Probenkammer "Well" 45 eingestrahlt, hier von oben. Beispielsweise kann diese Multiwellplatte einen nicht-transparenten Boden 48 haben, aber beispielsweise auch einen transparenten Boden oder auch einen teil-transparenten Boden.
  • Figur 8 zeigt beispielhaft die Anwendung des offenbarten Verfahrens in einer konkreten Versuchsanordnung, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Wiederum sollen gleiche Bezugsziffern auf gleiche bzw. ähnliche Teile verweisen. Die Bezugsziffer 1a bezeichnet eine Lichtquelle die für die Messung verwendet wird. Beispielsweise kann es sich bei der Lichtquelle 1a um eine oder mehrere LED(s), um einen oder mehrere Laser und/oder um eine oder mehrere SLED(s) (superlumineszente LED) handeln. Die Bezugsziffer 1b bezeichnet eine Lichtquelle die für die Messung verwendet wird. Beispielsweise kann es sich bei der Lichtquelle 1b um eine oder mehrere LED(s), um einen oder mehrere Laser und/oder um eine oder mehrere SLED(s) (superlumineszente LED) handeln. Vorzugsweise hat die Lichtquelle 1b eine andere Wellenlänge bzw. einen anderen Wellenlängenbereich als die Lichtquelle 1a. Das Licht der Lichtquelle 1a und/oder 1b dient vorzugsweise dazu, eine zu untersuchende Probe 50 zu bestrahlen. Das von den Lichtquellen 1a und/oder 1b abgestrahlte Licht kann mittels bekannter optischer Mittel verändert werden, beispielsweise mittels einer Linse 26 und/oder eines (nicht dargestellten) Linsensystems oder einer (nicht dargestellten) Apertur oder eines Polarisationsfilters. Anschließend passiert das Licht der Lichtquelle 1a vorzugsweise einen Anregungsfilter 25, vorzugsweise ein Bandpassfilter, und das Licht der Lichtquelle 1b passiert vorzugsweise einen Anregungsfilter 24, vorzugsweise ein Bandpassfilter. Vorzugsweise hat der Anregungsfilter 24 einen anderen Transmissionsbereich als der Anregungsfilter 25. Bezugszeichen 23 verweist auf einen optionalen Detektorfilter, beispielsweise einen Bandpassfilter oder einen Langpassfilter oder einen Kurzpassfilter oder einen Dualpass oder Multipassfilter. Im Falle von Fluoreszenz kann der Filter 23 auch als Emissionsfilter bezeichnet werden.
  • Das Licht der beiden Anregungslichtquellen wird vorzugsweise kombiniert, beispielsweise mittels des Dichroidischen Spiegels 28 und anschließend vorzugsweise von einem weiteren Dichroidischen Spiegel 29 in Richtung Objektlinsensystem 38 reflektiert. Der Dichroidische Spiegel 29 wird vorzugsweise auch dazu verwendet das Anregungslicht vom Detektionslicht zu trennen. Nach der Reflektion am Dichroidischen Spiegel 29 passiert das Anregungslicht vorzugsweise einen weiteren Dichroidischen Spiegel 34 ("Hot Mirror") und wird anschließend vorzugsweise vom Objektlinsensystem 38 durch den transparenten Boden 47 der Multiwellplatte in die wässrige Lösung 50, in der Probenkammer 45, vorzugsweise ein "Well" einer Multiwellplatte, fokussiert. Dort regt das Anregungslicht die Fluoreszenz von fluoreszierenden Partikeln 105, beispielsweise Proteine mit intrinsischer Fluoreszenz und/oder fluoreszenzmarkierte Biomoleküle oder andere fluoreszierende Substanzen, an. Das Fluoreszenzlicht wird durch das Objektlinsensystem 38, vorzugsweise eine Linse, eine Kombination aus Linsen oder ein Mikroskopobjektiv, eingesammelt, passiert anschließend die Dichroidischen Spiegel 34 und 29, dann den Detektionsfilter 23, vorzugsweise eine Emissionsfilter, beispielweise eine Bandpassfilter, Dualpassfilter oder Multipassfilter, und wird dann von einer Linse 17, beispielsweise eine Asphäre, auf den Detektor 19, , beispielsweise eine Photodiode, ein PMT, eine CCD Kamera, eine CMOS Kamera, ein Diodenarray, eine Avalanche-Photodiode, fokussiert.
  • Mittels dieses Detektors können Intensität und/oder Phase und/oder zeitlicher Ablauf der Fluoreszenzintensität gemessen und dann elektronisch verarbeitet und abgespeichert werde.
  • Die infrarote Strahlung zur Erzeugung der thermischen Konvektion wird vorzugsweise mittels eine fasergekoppelten Infrarot-Lasers 32 erzeugt. Die Faser des Lasers wird beispielsweise mittels einer Fasereinkopplung 27, vorzugsweise mit kollimierender Funktionalität, in die Optik bzw. das Optische System eingekoppelt. Die infrarote Strahlung kann mittels bekannter optischer Mittel verändert werden, beispielsweise mittels einer Linse 26 und/oder eines (nicht dargestellten) Linsensystems oder einer (nicht dargestellten) Apertur oder eines Polarisationsfilters. Beispielsweise kann es durch die Linse 26, beispielsweise eine Asphäre, parallelisiert oder fokussiert werden. Anschließend wird die infrarote Strahlung durch den Dichroidischen Spiegel 34 ("Hot Mirror") in das Objektlinsensystem 38 gespiegelt. Das Objektlinsensystem 38 fokussiert dann die infrarote Strahlung 30 durch den transparenten Boden 47 der Multiwellplatte in die wässrige Lösung 50 der Probenkammer 45, vorzugsweise ein "Well" einer Multiwellplatte. Die Multiwellplatte ist vorzugsweise eine 96 Well Platte oder 384 Well Platte oder 1536 Well Platte. Dort erzeugt die infrarote Strahlung 30 je nach Fokussierung eine definierte thermische Konvektion 90 zur Durchmischung der Partikel 105 in der wässrigen Lösung 50.
  • Die Partikel sind beispielsweise Biomoleküle wie DNA, RNA, PNA, Proteine, Antikörper, Antigene, oder Small Molecules, Zellen, Viren, Bakterien, Mikrobeads, Nanobeads, Nanopartikel, Polymere, Peptide. Beispielsweise kann die Vorrichtung auch zur Detektion und Quantifizierung von Biomolekülaggregation beispielsweise der Aggregation von Proteinen oder therapeutischen Antiköprern eingesetzt werden.

Claims (9)

  1. Verfahren zum Durchmischen von Flüssigkeiten (50) bzw. Partikeln mit einer Flüssigkeit (50) mit den Schritten:
    a. Bereitstellen eines Flüssigkeitsvolumens (50) in einer Mikrokavität einer 384 bzw. einer 1536 Mikrowellplatte;
    b. Bereitstellen mehrerer IR-LEDs
    c. Erzeugen einer thermischen Konvektions-Strömung an zumindest einer Grenzfläche zwischen dem Flüssigkeitsvolumen und der Mikrokavität durch gleichzeitiges Einstrahlen von IR-Strahlung (30) der mehreren LEDs in mehrere der Kavitäten,
    wobei durch die Konvektions-Strömung eine Verarmungsschicht an der Grenzfläche vermindert wird oder eine Anreicherungsschicht an der Grenzfläche erhöht wird, sodass Grenzflächen basierte Messverfahren verbessert werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Flüssigkeit (50) eine wässrige Lösung ist.
  3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Strahlung (30) parallel und/oder antiparallel zur Gravitation gerichtet ist und/oder eine Komponente enthält die senkrecht zur Gravitation ausgerichtet ist.
  4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mit der eingestrahlten Strahlung (30) ein Temperaturgradient von 0,001 K/µm (=1 K/mm) bis 2 K/µm (=2000 K/mm) erzeugt wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei ein Detektionsbereich (80) zur Messung von Eigenschaften der Flüssigkeit bzw. der Partikeln in der Flüssigkeit von dem Bereich beabstandet ist, in dem die Strahlung (30) eingestrahlt wird.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Strömungsgeschwindigkeiten innerhalb der Konvektions-Strömung von 0,0005 mm/s bis 2mm/s erzeugt werden.
  7. Verfahren zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen an und/oder in einer dünnen Schicht (80) in einem Flüssigkeitsvolumen mittels eines Grenzflächen basierten Messverfahrens mit den Schritten:
    - Bereitstellen mindestens eines Flüssigkeitsvolumens (50) mit darin vorhandenen Partikeln in einer Mikrokavität einer 384 bzw. einer 1536 Mikrowellplatte;
    - Bereitstellen mehrere IR-LEDs;
    - Einstrahlen von IR-Strahlung der mehreren IR-LEDs in Flüssigkeitsvolumina (50) der mehreren Miktrokavitäten der Multiwellplatte zur Erzeugung der thermischen Konvektions-Strömung,
    - Messen einer spezifischen oder unspezifischen Wechselwirkung der Partikel mit einer Grenzfläche der Mikrokavität mit Hilfe des Grenzflächen basierten Messverfahrens,
    - Charakterisierung der Wechselwirkung der Partikel anhand der Messung.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei
    i) die Messung der Wechselwirkung mittels Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RlfS) erfolgt;
    ii) die Messung der Wechselwirkung mittels Oberflächen Plasmonen Resonanz (englisch Surface Plasmone Resonance, SPR) erfolgt;
    iii) die Messung der Wechselwirkung mittels Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) erfolgt;
    iv) die Messung der Wechselwirkung mittels Quarzkristall-Mikrowaagen (Quartz Crystal Microbalance; QCM) erfolgt;
    v) die Messung der Wechselwirkung mittels akustischer Oberflächenwelle, (surface acoustic wave; SAW) erfolgt; oder
    vi) die Messung der Wechselwirkung mindestens ein Verfahren ist aus der Gruppe: Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RlfS), Bio-Layer Interferometry (BLI), Oberflächen Plasmonen Resonanz (Surface Plasmone Resonance; SPR), Quarzkristall-Mikrowaagen (Quartz Crystal Microbalance; QCM), akustische Oberflächenwelle, kurz AOW, (surface acoustic wave; SAW), Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Nanoporen oder Transistoren (Next Generation Sequencing).
  9. Vorrichtung zum Durchmischen von Flüssigkeiten (50) bzw. Partikeln mit einer Flüssigkeit (50), zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 mit:
    a. einer 384 bzw. einer 1536 Mikrowellplatte zur Aufnahme eines Flüssigkeitsvolumens (50); und
    b. mehreren IR-LEDs zum Emittieren von IR-Strahlung (30);
    c. einer Einrichtung zum Einstrahlern der IR- Strahlung (30) in mehrere Flüssigkeitsvolumina der Mikrowellplatte.
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