DE202008001277U1

DE202008001277U1 - Mobiles Microarray-Messgerät mit automatischer Reagenzienzufuhr und Chemilumineszenz-Ausleseeinheit

Info

Publication number: DE202008001277U1
Application number: DE200820001277
Authority: DE
Original assignee: KLOTH KATRIN; Kloth Katrin Dipl-Chem
Current assignee: KLOTH KATRIN; Kloth Katrin Dipl-Chem
Priority date: 2008-01-29
Filing date: 2008-01-29
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2018-01-30

Abstract

mobiles Microarray-Messgerät zur automatischen Bestimmung mehrerer Konzentrationen in Flüssigkeiten dadurch gekennzeichnet, dass das Messgerät (1) aus 3 nicht-temperierten Spritzenpumpen (2–4) mit jeweils einem 6-Wege-Drehventil (8–10), einem 6-Wege-Drehventil (11) für die Probenpumpe (7), eine temperierte Spritzenpumpe (6) für den primären Antikörper und eine temperierte Spritzenpumpe für den sekundären Antikörper (5), einem 4-Port-2-Wege-Drehventil (14), einem 6-Wege-Drehventil (13), einem 4-Port-T-Ventil (12), Schläuche mit Verbindern (26) inklusive einer Inkubationsschleife (25), die an die Ventile geschraubt werden, einer temperierten Messzelle (18) mit 2 Messkanälen (38) und einer CCD-Kamera (15) mit einem Objektiv (16) besteht.

Description

1 Einordnung
Die Erfindung bezieht sich auf einen mobilen, elektronischen Analyse-Automaten zur parallelen und ortsaufgelösten Detektion multipler Analyte über Chemilumineszenz auf einem planaren Microarray-Durchflusschip. Das Microarray-Messgerät kann in allen Bereichen der Analytik und Bioanalytik zum Einsatz kommen. Es kann sowohl im Labor als auch davon außerhalb in nichtklimatisierten Räumen oder auch auf dem Feld mehrere Kalibrierungen und Messzyklen absolvieren, ohne dass der Microarray-Durchflusschip oder die zugehörigen Reaktions- und Systemflüssigkeiten gewechselt werden müssen.
Microarrays werden seit 20 Jahren für verschiedenste Anwendungen eingesetzt, bei denen eine Vielzahl an Analyten in einer Probe gleichzeitig detektieren werden. Hierbei ist insbesondere die Genexpressionsanalytik mit DNA-Microarrays zu nennen. Mittlerweile sind eine Vielzahl unterschiedlichster Microarray-Formate entwickelt worden wie zum Beispiel DNA, Enzym, Antikörper, Hapten, Rezeptor, Aptamer, Zell, etc. – Microarrays. Microarrays nützen die spezifischen chemischen und biochemischen Bindungsreaktionen an der Oberfläche eines Spots des Microarrays (DNA-Hybridisierung, Antikörper-Antigen-Affinitätsreaktion, Enzymatische Spaltung etc.) um ein analytabhängiges Signal zu generieren. Die Signale können ortsaufgelöst mittels Fluoreszenz, Chemilumineszenz, Elektrochemie, Reflektrometrie, Oberflächenplasmonresonanz oder anderer Methoden detektiert werden. Oftmals sind es Laborgeräte ohne eine fluidische Anbindung oder mit fluidischer Anbindung, aber ohne integrierten Vorrat an Reagenzien und ohne Temperierung der Messzelle und der Reagenzien (z.B. Antikörper). Die Microarrays können oftmals nur einmalig verwendet werden, was ein hohen Kostenaufwand bedeutet und sie sind nicht sehr gut kalibrierbar, was den Einsatz bei quantitative Messungen stark einschränkt. Analytische Microarray-Messgeräte beinhalten teilweise eine automatische Reagenzienzufuhr über fluidische Systeme, eine integrierte Detektionseinheit und einen fluidisch gekapselten Microarray-Durchflusschip. Die dazugehörigen Reagenzien stehen meist außerhalb vom Gerät auf einem Labortisch, so dass die meisten Microarray-Messgeräte nicht mobil einsetzbar sind. Quantitative Messergebnisse werden durch Kalibrierung erreicht, indem unterschiedliche Standardanalytkonzentrationen durch den Microarray-Durchflusschip geleitet werden und je Messzyklus die Microarray-Oberfläche regeneriert wird. Messungen außerhalb eines Labors sind nur erschwert möglich, weil die Microarray-Messgeräte keine Temperierung der Messzelle und der Reagenzien beinhalten. Elektrochemische Microarray-Messgeräte haben nur eine begrenzte Anzahl an Sensorfelder auf einem Microarray, so dass nur eine geringe Anzahl an Analyte parallel gemessen werden kann. Microarray-Messgeräte, die eine Lichtquelle benötigen (z.B. fluoreszenz-basierte Microarrayauslesegeräte, haben den Nachteil, dass diese Lichtquelle und die dazugehörige Optik aufwendig integriert werden muss. Dies entfällt bei einem Microarray-Ausleseverfahren, das auf einer ortsaufgelösten Chemilumineszenz-Reaktion beruht.
Ziel der Neuerung ist ein mobiles Analyse-Gerät für Multianalyt-Messungen (1), das sowohl im Labor als auch davon außerhalb betrieben werden kann und über mehrere Messzyklen autark ohne Wechsel des Durchfluss-Microarrays oder der Lösungen arbeiten kann (1). Das Detektionsprinzip beruht auf einer oberflächennahen Chemilumineszenzreaktion (29) an den jeweiligen Spots eines Microarrays (39).
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht der Microarray-Durchflusschip (2) aus 3 Schichten: einem handelsübliche Mikroskop-Glasobjektträger (20), einer beidseitig klebenden Kunststofffolie (21), in die zwei Kanäle ausgeschnitten sind (38) und einem Kunststoffdeckel (22) mit zwei Ein- (23) und Auslässen (24). Erfindungsgemäß wird der Microarray-Durchflusschip über die Ein- und Auslässe fluidisch an das Pumpen- und Ventil, und Schlauchsystem angeschlossen. Dazu dient die temperierte Trägerplatte (19) mit Anschlüssen für Schläuche und Passstücke (27). Die Passstücke zum Microarray-Durchflusschip werden vorzugsweise über O-Ringe (28) und einem Anpressdruck abgedichtet. Es sind aber auch andere abdichtende Verfahren wie z.B. Septen möglich.
Zur parallelen Detektion der oberflächennahen Chemilumineszenz wird vorzugsweise eine CCD-Kamera (15) mit einem vorgeschalteten Objektiv (16) verwendet. Es können auch andere bildgebende Verfahren wie zum Beispiel Photodiodenarrays oder CMOS-Chips eingesetzt werden. Auch die direkte Aufbringung photonenaktiver Materialien auf dem Träger oder dem Deckel in Streifen oder Kreisen entlang der Kanäle ist möglich.
Für die Multianalytmessung werden Microarrays (39) verwendet, indem auf dem oben beschriebenen Glasträger bindungsaktive Mikrostrukturen aufgebracht werden. Die Neuerung beinhaltet einen unbehandelten Mikoskopierglas-Objektträger, bei dem nach bekannten Silanisierungsverfahren zunächst eine oder mehrere Polymerschicht flächig aufgetragen werden, auf die vorzugsweise kovalent aber auch adsorptiv Proteine (Antikörper, Protein-Antigen-Konjugate, Enzyme), Nukleinsäuren, Zellen oder kleine chemische Moleküle immobilisiert werden. Diese bindungsaktiven Mikrostrukturen werden in einer Matrix angeordnet und entstehen durch bekannte (Mikro-)Dosierverfahren (z.B. Kontaktdrucken, Ink-Jet, Bubble Jet, TopSpot) oder photochemische Mikrostrukturverfahren. Jede individuelle bindungsaktive Mikrostruktur kann eine (bio-)chemische Reaktion ausführen. Dies können bei Nukleinsäuren, Proteinen, Zellen oder artifiziellen Polymerstrukturen Affinitätsreaktionen oder enzymatische Reaktionen sein.
Zu einer Oberflächenreaktion an der bindungsaktiven Mikrostruktur kommt es, wenn die Analyte entweder mit dem Bindungspartner (z.B. primäre Antikörper, DNA, RNA, Enzym) in einem vorgeschalteten Schlauch vorinkubiert (25) werden oder zunächst Analyt und anschließend der Bindungspartner durch den Microarray-Durchflusschip gepumpt werden. Die Oberflächenreaktion wird über Markersubstanzen detektiert, die beim Pumpen durch den Kanal sowohl den Bindungskomplex an der Oberfläche erkennen als auch eine Chemilumineszenzreaktion ausführen können. Dies können zum Beispiel sekundäre Antikörper sein, an die kovalent oder über Affinität Enzyme wie die Meerrettich-Peroxidase oder Alkalische Phosphatase gekoppelt sind. Nach dem selben Prinzip können aber auch andere Detektionsmoleküle verwendet werden, wie zum Beispiel Nukleinsäuren, Aptamere, oder andere Rezeptoren. Zwischen den einzelnen Reaktionsschritten werden die Kanäle gespült. Die ortsnahe Chemilumineszenzreaktion entsteht, indem die Kanäle mit dem Chemilumineszenzsubstrat (35, 36) gefüllt werden. Die entstehenden Photonen werden durch das ortsaufgelöste Detektionsverfahren, wie oben beschrieben, gezählt und daraus ein Bild mit Signalintensitäten generiert. Die Signalintensitäten hängen von der Konzentration an Analyt ab, so dass direkt eine quantitative Aussage getroffen werden kann, wenn zuvor mit dem selben Microarray-Durchflusschip mit Standardlösungen kalibriert wird und nachfolgend die Proben durch den Chip gepumpt werden. Zwischen den einzelnen Messzyklen muss die Bindungsreaktion aufgelöst werden. Dazu wird durch den Microarray-Durchflusschip Regenerationslösungen (33) gepumpt. Mit dem erfindungsgemäßen Microarray-Messgerät sind aber auch Messungen mit einmalig verwendbaren Microarrays möglich. Hier erfolgt nur eine indirekte Kalibrierung mit positiven und negativen Kontrollen. Damit das Messgerät automatisch in die fluidischen Komponenten reinigen kann, ist eine Reinigungslösung (33) fester Bestandteil des Gerätes, genauso wie eine Standlösung (34), die verwendet wird, wenn das Gerät längere Zeit nicht verwendet wird.
Ausführungsbeispiel
Mit dem erfindungsgemäßen Microarray-Messgerät (1) können unterschiedliche Analyten wie zum Beispiel kleinere Moleküle (Hormone, Pharmaka, Pestizide, Mykotoxine, Vitamine, Nukleinsäuren und andere Moleküle und Molekülstrukturen), Polymerstrukturen wie toxische Proteine, Enzyme, Antikörper, sowie komplexe Polymerverbände wie Bakterien, Viren, Pilze und andere Zellen quantifiziert werden. Die Proben können verschiedenste Flüssigkeiten enthalten, in die der Analyt verteilt vorliegt. Die Proben können aus den verschiedensten Quellen entstammen und enthalten die Analyte und die entsprechende Matrix. Beispiele hierfür sind Milch- und Milchprodukte, Fruchtsäfte, Urin, Blut, Blutplasma, Blutserum, Trinkwasser, Oberflächenwasser, Prozesswasser, Fermentationsmedien und andere Medien. Für jede konkrete Anwendung muss ein passender Rezeptor und Ligand gewählt werden, der einen spezifischen Komplex an der Oberfläche ausbildet und konzentrationsabhängig über die oberflächennahe Chemilumineszenz detektiert wird.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird anhand der 1–3 erläutert. Es zeigen:
1 das portable Microarray-Messgerät
2 der Durchfluss-Microarraychip
3 der Fluidische Aufbau
Die Neuerung wird durch das erfindungsgemäße portable Microarray-Messgerät (1) erreicht, das eine automatische Reagenzienzufuhr, eine CCD-Kamera (15) mit abbildender Optik (16) zur ortsaufgelösten Detektion der Chemilumineszenz an der Microarray-Chipoberfläche, eine temperierte Messzelle, alle notwendigen in Flaschen abgefüllten Reagenzien, beinhaltet. Die automatische Reagenzien und Pufferzufuhr wird über computergesteuerte Spritzenpumpe (2–7) und Drehventile (8–14) erreicht, die fluidisch über Schläuche (26) mit einander verbunden sind.
Die Bindungsreagenzien werden insbesondere bei Biomolekülen wie Antikörper oder anderen Proteinen gekühlt gelagert (4–10 °C). Der Microarray-Durchflusschip wird bei einer definierten Temperatur (vorzugsweise 21 ± 3 °C) konstant gehalten, damit die Enzymaktivität der Meerrettichperoxidase, die an den sekundären Antikörper gekoppelt ist, und damit das Chemilumineszenz-Messignal konstant ist. Als besonders vorteilhafte Lösung für Messungen besonders auch außerhalb klimatisierter Räume ist vorgesehen, dass eine Temperierung der Messzelle und der Reagenzien über Peltierelemente und Temperaturfühler erfolgt (19), die am Boden der Messzelle (18) und hinter der Spritzenpumpen (30) angebracht sind.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht der Microarray-Durchflusschip aus 3 Schichten (2): einem handelsübliche Mikroskop-Glasobjektträger (20) im Format 75 ± 2 mm × 25 ± 2 mm, einer beidseitig klebenden Kunststofffolie (21), in die zwei Kanäle (38) ausgeschnitten sind und einem Kunststoffdeckel (22). Die Kunststofffolie definiert über ihre Dicke die Höhe und durch den Ausschnitt die Kanalbreite. Vorzugsweise wird eine beidseitig klebende Kunststofffolie mit einer Dicke von 250 μm verwendet. Die Kanalhöhe kann aber auch zwischen 100 μm und 3 mm variieren. Die Kanalführung wird durch ausschneidende Verfahren wie zum Beispiel Laserschneiden, Fräsen oder ähnliches erzeugt. Jeder Kanal enthält mindestens einen Ein (23)- und einen Auslass (24), damit Flüssigkeiten durch den Kanal fließen können. Die Ein- und Auslässe werden als Löcher mit einem Innendurchmesser von 0,5 mm bzw. 1,6 mm ausgeführt, die im Kunststoffdeckel liegen. Der Kunststoffdeckel ist vorzugsweise aus schwarzem Polycarbonat, aber auch andere Kunststoffe sind möglich.
Die Verschließung der 3 Schichten erfolgt vorzugsweise über Klebstoffe, aber auch verschmelzende oder andere abdichtende Verfahren sind möglich.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführung ist vorgesehen, dass das Messgerät mindestens ein Messtag arbeiten kann, ohne dass die Antikörper-Reagenzien (primärer Antikörper (40) sekundärer Antikörper (41) und andere Flüssigkeiten (31–36), so wie der Microarray-Durchflusschip, gewechselt werden müssen. Damit das Messgerät über mehrere Messzyklen autark arbeiten kann, sind Spritzenpumpen mit ein Fassungsvolumen von vorzugsweise 25 mL (6) und 50 mL (5) vorgesehen, die Bindungsreaktanten (z.B. Antikörper) zum Analyten und zur Bindung an den einzelnen Spots (z.B. sekundärer Antikörper an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt) enthalten. Es sind aber auch andere Volumina möglich. Das Fassungsvolumen und die Konzentration der Bindungsreaktanden definiert, wie viele Messungen pro Tag ohne Wechsel der Lösungen und des Microarray-Durchflusschips getätigt werden kann. Der Bindungsreaktion an den einzelnen Spots des Microarrays ist auflösbar, indem mit sauren Puffer der Chip regeneriert wird. Die Übersicht über den fluidischen Aufbau ist in 3 dargestellt.
Also besonders vorteilhafte Lösung ist vorgesehen, die Behälter für Systemlösung (31), Reinigungsslösung (32), Regenerationslösung (33), Lagerungslösung (34), Chemilumineszenzreagenz (z.B. Luminol (35) und Wasserstoffperoxid (36)) sowie den Abfallbehälter (37) in eine Schublade, die im erfindungsgemäße Microarray-Messgerät integriert ist, zu stellen. Damit ist das Messgerät mobil und jederzeit messbereit.

Claims

mobiles Microarray-Messgerät zur automatischen Bestimmung mehrerer Konzentrationen in Flüssigkeiten dadurch gekennzeichnet, dass das Messgerät (1) aus 3 nicht-temperierten Spritzenpumpen (2–4) mit jeweils einem 6-Wege-Drehventil (8–10), einem 6-Wege-Drehventil (11) für die Probenpumpe (7), eine temperierte Spritzenpumpe (6) für den primären Antikörper und eine temperierte Spritzenpumpe für den sekundären Antikörper (5), einem 4-Port-2-Wege-Drehventil (14), einem 6-Wege-Drehventil (13), einem 4-Port-T-Ventil (12), Schläuche mit Verbindern (26) inklusive einer Inkubationsschleife (25), die an die Ventile geschraubt werden, einer temperierten Messzelle (18) mit 2 Messkanälen (38) und einer CCD-Kamera (15) mit einem Objektiv (16) besteht.
mobiles Microarray-Messgerät nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Spritzenpumpen und Ventile über Motoren angetrieben und über einen Computer gesteuert werden.
mobiles Microarray-Messgerät nach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, dass die Spritzenpumpe für die Proben eine Kunststoffspritze mit Luer-Anschluss enthält.
mobiles Microarray-Messgerät nach Anspruch 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass an das 6-Wege-Ventil der Spritzenpumpe für die Proben eine Schlauchverbindung zu einem Autosampler (39) angeschlossen werden, damit automatisch eine Vielzahl an Proben analysiert werden können.
mobiles Microarray-Messgerät nach Anspruch 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass die CCD-Kamera oberhalb des Durchfluss-Microarraychips angebracht ist, zur Verhinderung des Lichteinfalls verkapselt ist, von einem Computer angesteuert und die Bilder ausgelesen werden können.
mobiles Microarray-Messgerät nach zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchfluss-Microarraychip aus 2 parallel angeordneten Messkanälen besteht, die sequentiell arbeiten.
mobiles Microarray-Messgerät nach zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchfluss-Microarraychip (2) aus einem handelsübliche Mikroskop-Glasobjektträger (20) im Format 75 ± 2 mm × 25 ± 2 mm, einer beidseitig klebenden Kunststofffolie (21, Höhe 250 ± 100 μm), in die zwei Kanäle (38) ausgeschnitten sind und einem Kunststoffdeckel (22) mit zwei Einlässen (23, Durchmesser 0,5 ± 0,2 μm) und zwei Auslässen (24, Durchmesser 1,6 ± 0,2 μm) besteht.
mobiles Microarray-Messgerät nach zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchfluss-Microarraychip auf 21 ± 3 °C temperiert wird, indem an der Messzelle Peltierelement und Temperaturmessfühler (19) angebracht sind.
mobiles Microarray-Messgerät nach zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die temperierten Spritzenpumpen (5, 6) mit Peltierelementen (30) und Temperaturmessfühlern auf 4–10 °C gekühlt werden.
mobiles Microarray-Messgerät nach zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Behälter mit den nicht-temperierten System- und Reaktionsflüssigkeiten (Systemlösung (31), Regenerationslösung (32), Reinigungslösung (33), Standflüssigkeit (34), luminolhaltiger Chemilumineszenzreagenz (35) und Wasserstoffperoxid (36)), so wie der Abfallbehälter (37) im Messgerät in eine Schublade (17) gestellt werden.