CN110579442B - 一种适配微流控-光片成像的折射率匹配方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适配微流控‑光片成像的折射率匹配方法及其应用，包括：采用碘克沙醇，调节生物样品光片成像的成像环境，使得成像环境中的相邻介质之间的折射率匹配；其中，相邻介质分别为用于固定生物样品的微流控芯片和内含生物样品的成像液，或者，相邻介质分别为由微流控芯片形成的内含生物样品的油包水液滴上的油和水。本发明引入碘克沙醇溶液，通过改变碘克沙醇浓度来调节成像环境的折射率，调节范围广，使成像环境中相邻介质的折射率得到匹配，消除了照明光在油相与水相界面、PDMS‑溶液的固液界面散射现象，解决了成像的散射与像差问题，同时碘克沙醇具有生物相容性，能够实时成像，有效提高了成像质量。
Description
技术领域
本发明属于生物医学显微成像领域，更具体地，涉及一种适配微流控-光片成像的折射率匹配方法及其应用。
背景技术
光片成像是利用微米级的激发光薄片照射到样品上侧面激发荧光，并在与激发方向垂直的方向上通过CCD或CMOS进行成像的方式，相比于传统的共聚焦成像方式，其不存在离焦激发，从而将光毒性降至最低。微流控技术是指在几十到几百微米尺度的管道内，对纳升或皮升量级的微流体进行高通量、系统的处理或控制的科学与技术。微流控技术结合光片成像，主要有两方面的应用：一方面，利用微流控技术产生大规模的油包水液滴，并用光片对液滴进行扫描，能够实现对大规模液滴样品的高通量、高分辨率成像；另一方面，利用微流控技术易于操控的优势，可将在自由空间内因样品易活动而较难观察的生物样品(如线虫、果蝇幼虫、斑马鱼胚胎)，固定在微流控芯片的预制作的小腔室内，将光片成像用于微流控芯片内的样品成像，具有高通量、高分辨率、低光毒性等优势。
然而，将光片成像应用于微流控领域时经常会遇到折射率失配的问题。在微流控技术产生的大规模油包水液滴中，水相与油相之间存在明显的折射率差，导致光经过油、水到达生物样品的过程中成像质量差；而当生物样品在微流控芯片内进行成像时，微流控芯片、生物样品与成像液之间也有明显的折射率差。折射率失配会在成像过程中产生严重的色散与像差，降低成像质量，这也限制了微流控结合光片成像技术的发展。
目前，为了改善成像质量而促使各种不同界面之间的折射率匹配，已有一些方法。例如，在尺寸较大的生物组织样品成像时，为了使高散射组织内各组分的折射率匹配，一种方法是利用大量的物理化学方法(脱水，凝固，紫外照射，低温暴露，化学溶剂浸渍等等)来控制光学散射性质；另一种方法是改善成像装置，利用多光子激发显微镜可以增加强散射样品的穿透深度以产生数百微米深的图像。再者，在对于系统内部折射率和固体装置界面出现的折射率不匹配的现象，这很大程度上影响成像质量，有报道可以采用在原本作为工作介质的水溶液中加入高折射率的盐溶液(CaCl2,KCl,NaCl等)可能使其折射率与固体界面相匹配，然而，盐溶液没有生物相容性且折射率调节范围较窄；也有采用折射率与固体装置界面相近的有机溶液作为水溶液的替代品的方法，但是有机溶液因其一般有毒性而不被考虑在生物成像的运用中。
另外，折射率不匹配所造成的严重后果不仅仅体现在生物成像领域，在激光多普勒测速(LDA)、粒子图像测速(PIV)、粒子跟踪测速(PTV)、平面激光诱导荧光(PLIF)等激光诊断技术中，激光在通过实验装置壁面与界面时的折射也是影响这些光学诊断方法的效果的一个主要因素。
因此，如何有效解决微流控-光片成像中折射率失配导致成像质量差的问题，是目前亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明提供一种适配微流控-光片成像的折射率匹配方法及其应用，用以解决现有适配微流控-光片成像的折射率匹配方法因采用盐溶液或有机溶剂调节成像环境的折射率导致生物样品受损且折射率调节范围窄而存在成像质量差的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种适配微流控-光片成像的折射率匹配方法，包括：
采用碘克沙醇，调节生物样品光片成像的成像环境，使得成像环境中的相邻介质之间的折射率匹配；
其中，所述相邻介质分别为用于固定所述生物样品的微流控芯片和内含所述生物样品的成像液，或者，所述相邻介质分别为由微流控芯片形成的内含所述生物样品的油包水液滴上的油和水。
本发明的有益效果是：本发明将碘克沙醇应用于微流控-光片成像领域，利用碘克沙醇来匹配成像液和微流控芯片材料PDMS之间以及水油环境下的水相和油相之间的折射率，使得光顺利打到生物样品上同时荧光能顺利被探测；同时，由于生物样品(如细胞)对于碘克沙醇有选择透过性而不予吸收，对生物样品本身机能影响很小；另外，碘克沙醇可溶，且可通过改变碘克沙醇浓度来改变生物样品的外部介质的折射率，因此，使用碘克沙醇来匹配成像液和微流控芯片材料PDMS之间的毛糙固液界面折射率以及水油环境下的水相和油相之间折射率，在保证生物相容性、水溶性、低毒害的前提下，增加了成像的深度，保证了生物样品的正常机能，能够实现实时成像兼容性，同时能够实现较宽的折射率调节范围和较高的调节精度，极大提高了折射率匹配的灵活性以及成像质量。另一方面，由于在微流控-光片成像领域，成像样品往往尺寸较小且其折射率与PDMS折射率相近，因此，生物样品和成像液的折射率失配时，在向成像液中加入碘克沙醇后，对成像质量造成的影响不大，或者小到可以适当调整成像装置就能解决的程度。因此，本发明只考虑生物样品以外的相邻介质之间的折射率匹配，提高匹配效率。本发明提出的折射率匹配方法在解决成像质量问题的同时可实现光片成像在微流控技术领域的进一步应用，进一步可实现微流控-光片成像在生物医学领域中的进一步应用。
上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，具体包括：
测试碘克沙醇原溶液的第一折射率以及成像光片照射生物样品时光所要前后穿过的相邻的目标匹配介质和待调整介质的第二折射率；
基于所述第一折射率和所有所述第二折射率之间的大小关系，采用所述碘克沙醇原溶液或者其结晶后的碘克沙醇晶体，调节所述待调整介质的第二折射率，以与所述目标匹配介质的第二折射率相等，完成折射率匹配。
本发明的进一步有益效果是：通过折射率测试，选择合适的碘克沙醇形态，对待调整介质的折射率进行调整，可提高折射率匹配效率和精度。
进一步，所述目标匹配介质为所述微流控芯片或所述油，所述待调整介质为所述成像液或所述水。
本发明的进一步有益效果是：由于碘克沙醇具有水溶性和生物相容性，对生物样品机能无影响，因此通过碘克沙醇调节最靠近生物样品的成像液或水的折射率，操作简单方便(液体成像液比固体PDMS的折射率易于调节，水比油的折射率易于调节)。
进一步，所述采用所述碘克沙醇原溶液或者其结晶后的碘克沙醇晶体，具体为：
当所述目标匹配介质的所述第二折射率小于所述第一折射率且大于所述待调整介质的所述第二折射率时，采用所述碘克沙醇原溶液；
当所述目标匹配介质的所述第二折射率均大于所述第一折射率和所述待调整介质的所述第二折射率时，采用所述碘克沙醇原溶液结晶后的碘克沙醇晶体。
本发明的进一步有益效果是：本方法能够极大拓宽折射率调节范围，以精确使得待调整介质的折射率达到需要的折射率值，灵活性强。其中，为了快速使得待调整介质的折射率能够与目标匹配介质的折射率相等，当目标匹配介质的第二折射率均大于第一折射率和待调整介质的第二折射率时，将碘克沙醇原溶液结晶并用结晶的沙醇调整待调整介质的折射率，方便快捷，实用性强。
进一步，所述调节所述待调整介质的第二折射率，具体为：
分多次向所述待调整介质中添加所述碘克沙醇原溶液或所述碘克沙醇晶体，并在每次所述添加后，测试所述待调整介质的第二折射率，拟合得到碘克沙醇浓度和所述待调整介质的第二折射率之间的关系曲线；
从所述关系曲线中，确定所述目标匹配介质的第二折射率大小对应的碘克沙醇浓度，并制备碘克沙醇含量为所述浓度的新的待调整介质，完成所述待调整介质的第二折射率的调节。
本发明的进一步有益效果是：基于关系曲线，确定碘克沙醇浓度，方便快捷，精度高。
进一步，所述制备碘克沙醇含量为所述浓度的新的待调整介质，之后还包括：
若所述新的待调整介质的第二折射率与所述目标匹配介质的第二折射率不同，调节所述浓度大小，重新制备待调整介质，直至相等。
本发明的进一步有益效果是：由于基于通过关系曲线确定的碘克沙醇浓度，配置新的待调整介质时，由于操作误差等因素，可能会使得新的待调整介质的折射率与实际需要的折射率的大小有偏差，此时，可微调碘克沙醇浓度，再次重制，以提高匹配精度。
进一步，所有所述折射率由阿贝折射仪测得。
进一步，根据所述生物样品及其成像用途的不同，制作具有不同管道形态的微流控芯片，以生成所述生物样品的成像环境。
本发明的进一步有益效果是：例如当生物样品为易于活动的线虫时，需要在微流控芯片中设计腔室，将线虫放置在该腔室内以固定线虫，因此，根据实际生物样品及其成像用途，制作具有不同管道形态的微流控芯片。本发明提出的折射率匹配方法在解决成像质量问题(本发明由于碘克沙醇具有生物相容性，对生物样品机能无影响，因而可根据需要，实时地进行光片成像，避免长时间对生物样品机能损害导致实时成像无法应用的问题，本发明也将这归属于成像质量问题，因此说本发明解决的是提高成像质量的问题)的同时也实现了光片成像在微流控技术领域的进一步应用。
本发明还提供一种基于微流控-光片成像的生物样品成像方法，包括：
基于微流控芯片，采用如上所述的折射率匹配方法，匹配生物样品的成像环境中相邻介质间的折射率并搭建待成像对象；
采用成像光片向所述成像对象发射激光，实现生物样品成像。
本发明的有益效果是：采用上述的折射率匹配方法，可根据实际需要，对特定生物样品制备或确定微流控芯片，并将生物样品固定在微流控芯片中加入成像液，或者通过微流控芯片制作油包水液滴，水内含有生物样品，然后通过光片将光穿过微流控芯片材料、成像液到达生物样品，或者穿过油、水到达生物样品，实现光片成像，本发明在制作成像对象后，由于碘克沙醇具有生物相容性，可实时进行光片成像，避免了生物样品机能受损导致实时成像无法应用于生物研究的问题。本发明提出的成像方法实现了光片成像在微流控技术领域的进一步应用，并进一步实现了微流控-光片成像在生物医学领域中的进一步应用。
进一步，所述成像对象包括微流控芯片、成像液和所述生物样品；或者，包括微流控芯片形成的内含所述生物样品的油包水液滴。
附图说明
图1为本发明实施例提供的一种适配微流控-光片成像的折射率匹配方法的流程框图；
图2为本发明实施例提供的碘克沙醇溶液在用PBS缓冲液稀释时不同稀释比例下的稀释比例与折射率的关系曲线；
图3为本发明实施例提供的在线虫样品固定在微流控芯片内进行光片扫描成像时未做折射率匹配与经过折射率匹配的成像结果对比图；
图4为本发明实施例提供的在油包水环境下对包裹有荧光素的液滴进行光片扫描成像时未做折射率匹配与经过折射率匹配的成像结果对比图；
图5为本发明实施例提供的微流控-光片成像领域的两种成像对象示意图；
在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或者结构，其中：
1为微流控芯片，2为微流控芯片固定的生物样品，3为在微流控芯片内填充的成像液，4为油包水液滴环境中的油相，5为油包水液滴环境中的水相。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例一
一种适配微流控-光片成像的折射率匹配方法，包括：
采用碘克沙醇，调节生物样品光片成像的成像环境，使得成像环境中的相邻介质之间的折射率匹配；
其中，相邻介质分别为用于固定生物样品的微流控芯片和内含生物样品的成像液，或者，相邻介质分别为由微流控芯片形成的内含生物样品的油包水液滴上的油和水。
需要说明的是，光片成像还具有高通量、高分辨率、等优势，进而使得对生物体的三维、动态全景观察成为可能。光片成像技术已在生物成像领域得到了广泛的关注与应用。微流控技术以微流控芯片作为工作单元，利用CAD软件设计、掩膜制作、光刻、PDMS芯片制作等步骤后，可以在微流控芯片内制作出多种多样的管道结构来实现不同的功能。目前微流控已经有了广泛的应用，尤其是在生物医学领域，微流控技术因其高通量、易操控等优势，正在发挥着越来越重要的作用。
碘克沙醇是一种注射用造影剂，适用于锥管内造影、静脉内的尿路造影，其作用原理是改变血管或组织的密度。另外，碘克沙醇还有调节折射率的作用，碘克沙醇的浓度与其折射率呈线性关系，因此，碘克沙醇可用于光学成像中的折射率调整，而由于碘克沙醇无法渗透进入组织细胞中，碘克沙醇的组织透明化(组织里面，细胞和细胞之间也存在物质，不同的细胞折射率也不一样，因此组织其实是一个折射率分布不均匀的物体，那么如果组织折射率均一的话，就对成像有很大的好处，这就是组织透明化)效果不好，因此具体通过调节成像溶液的折射率，使成像溶液与样品折射率相同，这导致成像质量改善有限。
而在微流控-光片成像领域，关于成像的折射率失配，通常利用改变激发波长或更换物镜来减弱折射率失配的影响，但是，例如硬件限制，折射率调节范围小且不能精确调节，成像质量依然不佳。另外一种方式是直接通过向特定介质添加不同浓度盐溶液或有机溶剂来调节成像环境的折射率，该方法较为简单且实用性较强，但盐溶液对折射率调节范围较窄，当利用盐溶液条件成像液的折射率以达到微流控芯片PDMS的折射率时，需要较高的盐浓度，此时成像液较粘稠，不利于成像，另外，盐溶液没有生物相容性会导致生物样品死亡，而有机溶剂有毒，对生物样品不利。因此，现有提高成像质量的方法存在对不同生物样品的成像环境折射率调节能力差、调节范围小且对会生物样品机能带来损害等的问题。
本方法面向生物样品，生物样品要求添加的物质要具有生物相容性、水溶性、低毒害以保证生物样品的正常机能，现有方法采用盐溶液或有机溶液，均不能很好的满足上述条件。创新性的将碘克沙醇应用于微流控-光片成像领域，利用碘克沙醇来匹配成像液和微流控芯片材料PDMS之间以及水油环境下的水相和油相之间的折射率，使得光顺利打到生物样品上同时荧光能顺利被探测；又由于生物样品(如细胞)对于碘克沙醇有选择透过性而不予吸收，对生物样品本身机能影响很小，同时碘克沙醇可溶，且可通过改变浓度来改变介质的折射率，因此使用碘克沙醇来匹配成像液和微流控芯片材料PDMS之间的毛糙固液界面折射率以及水油环境下的水相和油相之间折射率，在保证生物相容性、水溶性、低毒害的前提下，增加了成像的深度，保证了生物样品的正常机能，能够实现实时成像兼容性，同时能够实现较宽的折射率调节范围，极大提高了折射率匹配的灵活性以及成像质量。本方法提出的折射率匹配方法在解决成像质量问题的同时也实现了光片成像在微流控技术领域的进一步应用，实现了微流控-光片成像在生物医学领域的进一步应用。
另一方面，由于在微流控-光片成像领域，成像样品往往是细胞球、线虫、DNA引物等，尺寸较小，且折射率与PDMS折射率相近，因此，生物样品和成像液的折射率失配时，在向成像液中加入碘克沙醇后，对成像质量造成的影响不大，或者小到可以适当调整成像装置就能解决的程度。因此，本方法只考虑相邻介质之间的折射率匹配，也即成像液与微流控芯片材料之间的折射率匹配或者油包水液滴中的油和水之间的折射率匹配，相邻介质均为生物样品的外部介质。
优选的，如图1所示，适配微流控-光片成像的折射率匹配方法具体包括：
测试碘克沙醇原溶液的第一折射率以及成像光片照射生物样品时光所要前后穿过的相邻的目标匹配介质和待调整介质的第二折射率；
基于所述第一折射率和所有第二折射率之间的大小关系，采用碘克沙醇原溶液或者其结晶后的碘克沙醇晶体，调节待调整介质的第二折射率，以与目标匹配介质的第二折射率相等，完成折射率匹配。
通过折射率测试，选择合适的碘克沙醇形态，对待调整介质的折射率进行调整，可提高折射率匹配效率和精度。
优选的，目标匹配介质为微流控芯片或油，待调整介质为成像液或水。
由于碘克沙醇具有水溶性和生物相容性，对生物样品机能无影响，因此通过碘克沙醇调节最靠近生物样品的成像液或水的折射率，操作简单方便(液体成像液比固体PDMS的折射率易于调节，水比油的折射率易于调节)。
优选的，上述采用碘克沙醇原溶液或者其结晶后的碘克沙醇晶体，具体为：
当目标匹配介质的第二折射率小于第一折射率且大于待调整介质的第二折射率时，采用碘克沙醇原溶液；当目标匹配介质的第二折射率均大于第一折射率和待调整介质的第二折射率时，采用碘克沙醇原溶液结晶后的碘克沙醇晶体。
本方法能够极大拓宽折射率调节范围，以精确使得待调整介质的折射率达到需要的折射率值，灵活性强。其中，为了快速使得待调整介质的折射率能够与目标匹配介质的折射率相等，当目标匹配介质的第二折射率均大于第一折射率和待调整介质的第二折射率时，将碘克沙醇原溶液结晶并用结晶的沙醇调整待调整介质的折射率，方便快捷，实用性强。
优选的，上述调节待调整介质的第二折射率，具体为：
分多次向待调整介质中添加碘克沙醇原溶液或碘克沙醇晶体，并在每次添加后，测试待调整介质的第二折射率，拟合得到碘克沙醇浓度和待调整介质的第二折射率之间的关系曲线；从关系曲线中，确定目标匹配介质的第二折射率大小对应的碘克沙醇浓度，并制备碘克沙醇含量为上述浓度的新的待调整介质，完成待调整介质的第二折射率的调节。
基于关系曲线，确定碘克沙醇浓度，方便快捷，精度高。
优选的，制备碘克沙醇含量为上述浓度的新的待调整介质，之后还包括：若新的待调整介质的第二折射率与目标匹配介质的第二折射率不同，调节所述浓度大小，重新制备待调整介质，直至相等。
由于基于通过关系曲线确定的碘克沙醇浓度，配置新的待调整介质时，由于操作误差等因素，可能会使得新的待调整介质的折射率与实际需要的折射率的大小有偏差，此时，可微调碘克沙醇浓度，再次重制，以提高匹配精度。
优选的，所有折射率由阿贝折射仪测得。
优选的，根据生物样品及其成像用途的不同，制作具有不同管道形态的微流控芯片，以生成生物样品的成像环境。
例如当生物样品为易于活动的线虫时，需要在微流控芯片中设计腔室，将线虫放置在该腔室内以固定线虫，因此，根据实际生物样品及其成像用途，制作具有不同管道形态的微流控芯片。本方法提出的折射率匹配方法在解决成像质量问题(本方法由于碘克沙醇具有生物相容性，对生物样品机能无影响，因而可根据需要，实时地进行光片成像，避免长时间对生物样品机能损害导致实时成像无法应用的问题，本方法也将这归属于成像质量问题，因此说本方法解决的是提高成像质量的问题)的同时也实现了光片成像在微流控技术领域的进一步应用。
为了更好的说明本发明，现以具体示例，对匹配方法进行如下详细说明：
1、取一定量的碘克沙醇溶液，滴在阿贝折射仪上，用阿贝折射仪测试碘克沙醇原溶液的折射率，记为n0；根据生物样品，选择以下不同的折射率匹配方案。
2、对于样品固定在微流控芯片内的光片扫描成像：
(1)测量微流控芯片材料PDMS所对应的折射率，将作为微流控芯片材料的PDMS切成薄片，放在阿贝折射仪上测试其折射率，记为n1；
(2)在对置于微流控芯片内的样品成像时，为了避免芯片内存在气泡对成像产生影响，通常会在微流控芯片内注入成像液来填充微流控芯片与芯片内成像样品之间的空间，成像液的选择与成像样品相关，一般以PBS(磷酸缓冲盐液)或者样品对应的培养液作为成像液；
(3)取一定量的成像液，滴在阿贝折射仪上，用阿贝折射仪测成像液的折射率，记为n2；当n1＝n2时，微流控芯片与成像液折射率天然地匹配；由于PDMS的折射率较高，高于绝大部分成像液折射率，因此仅考虑n1>n2的情况：
当n0>n1时：
1)将成像液与碘克沙醇原溶液按照一定比例混合，将一定量的混合溶液滴在阿贝折射仪上，用阿贝折射仪测试混合溶液的折射率，混合液的折射率与碘克沙醇浓度呈线性关系，碘克沙醇浓度越高，混合液折射率越高，测试在不同稀释比例下的碘克沙醇混合液折射率，绘制碘克沙醇稀释比例-折射率曲线；
2)根据测得的PDMS折射率n1，查看碘克沙醇浓度-折射率曲线上对应的碘克沙醇稀释比例；
3)按照对应的稀释比例，配置碘克沙醇与成像液的混合液，将一定量的混合溶液滴在阿贝折射仪上，用阿贝折射仪测试混合溶液的折射率；
4)若测得的混合液折射率与PDMS折射率n1存在偏差，根据两个折射率的大小，适当提高或降低碘克沙醇的稀释浓度，直到混合液折射率与PDMS折射率完全匹配，完全匹配下的碘克沙醇稀释比例即为成像所需的碘克沙醇稀释比例；
5)按照上述的稀释比例配置碘克沙醇与成像液的混合液，在进行成像时，将混合液注入微流控芯片中，检查芯片内无气泡后，对芯片内样品进行光片扫描。
当n0<n1时:
取一定量的碘克沙醇原溶液，置于离心管中，离心管开盖静置1-2天，使碘克沙醇充分结晶成晶体；
1)待碘克沙醇结晶成晶体后，加入一定量的成像液溶解碘克沙醇晶体；
2)将用成像液溶解的碘克沙醇溶液在阿贝折射仪上，用阿贝折射仪测试溶液的折射率，溶液的折射率与碘克沙醇浓度呈线性关系，碘克沙醇浓度越高，混合液折射率越高，测试在不同浓度下的碘克沙醇溶液折射率，绘制碘克沙醇浓度-折射率曲线；
3)若测得的溶液折射率与PDMS折射率n1存在偏差，根据两个折射率的大小，适当提高或降低碘克沙醇的浓度，直到溶液折射率与PDMS折射率完全匹配；
4)在进行成像时，将配制好的溶液注入微流控芯片中，检查芯片内无气泡后，对芯片内样品进行光片扫描；
3、对于液滴微流控的油包水环境光片扫描成像：
(1)取一定量的油相液体，滴在阿贝折射仪上，用阿贝折射仪测油相液体的折射率，记为n3；
(2)将水相与碘克沙醇原溶液按照一定比例混合，将一定量的混合溶液滴在阿贝折射仪上，用阿贝折射仪测试混合溶液的折射率，混合液的折射率与碘克沙醇浓度呈线性关系，碘克沙醇浓度越高，混合液折射率越高，测试在不同稀释比例下的碘克沙醇混合液折射率，绘制碘克沙醇稀释(名称前后不一致)比例-折射率曲线；
(3)根据测得的油相折射率n3，查看碘克沙醇浓度-折射率曲线上对应的碘克沙醇稀释比例；
(4)按照对应的稀释比例，配置碘克沙醇与成像液的混合液，将一定量的混合溶液滴在阿贝折射仪上，用阿贝折射仪测试混合溶液的折射率；
(5)若测得的混合液折射率与油相折射率n3存在偏差，根据两个折射率的大小，适当提高或降低碘克沙醇的稀释浓度，直到混合液折射率与油相折射率完全匹配。
在生成油包水环境时，用含有上述浓度碘克沙醇的水相产生油包水环境，然后用光片对其进行扫描成像。
示例1：利用CAD软件设计、掩膜制作、光刻、PDMS芯片制作等操作，设计制作出合适固定线虫生物样品的微流控芯片。用阿贝折射仪测试PDMS芯片的折射率；线虫实验中，线虫常浸泡在特定的PBS缓冲液中，用阿贝折射仪测试PBS缓冲液的折射率；PBS缓冲液折射率与PDMS折射率之间存在差值，需要进行折射率匹配；测试用PBS缓冲液按不同比例稀释的碘克沙醇溶液的折射率，绘制折射率-稀释比例曲线(如图2所示)，找出对应PDMS折射率的碘克沙醇稀释比例；配置对应比例的碘克沙醇的PBS缓冲液稀释溶液，用阿贝折射仪测试其折射率；若测试的折射率与PDMS折射率存在偏差，根据两个折射率的大小，适当提高或降低碘克沙醇的稀释浓度，直到混合液折射率与PDMS折射率完全匹配，然后用光片对其进行扫描成像。如图3所示，用该方法匹配后的成像更清晰。
示例2：用CAD软件设计、掩膜制作、光刻、PDMS芯片制作等操作，设计制作出用于产生大规模油包水液滴的微流控芯片；用阿贝折射仪分别测试水相与油相的折射率，两者具有折射率差，需要进行折射率匹配；根据油包水液滴中包裹的不同生物样品来选择水相溶液，测试用该种水相溶液按不同比例稀释的碘克沙醇溶液的折射率，绘制折射率-稀释比例曲线，找出对应油相折射率的碘克沙醇稀释比例；配置对应比例的碘克沙醇的水相稀释溶液，用阿贝折射仪测试其折射率；若测试的折射率与油相折射率存在偏差，根据两个折射率的大小，适当提高或降低碘克沙醇的稀释浓度，直到混合液折射率与油相折射率完全匹配；利用制作好的微流控芯片产生大规模油包水液滴，然后对这些包裹有荧光素的液滴进行光片扫描成像，如图4所示，用该方法匹配后的成像更清晰。
实施例二
一种基于微流控-光片成像的生物样品成像方法，包括：
基于微流控芯片，采用如上实施例一所述的折射率匹配方法，匹配生物样品的成像环境中相邻介质间的折射率并搭建待成像对象；采用成像光片向成像对象发射激光，实现生物样品成像。
采用上述的折射率匹配方法，如图5所示，可根据实际需要，对特定生物样品制备或确定微流控芯片1，并将生物样品2固定在微流控芯片中加入成像液3，或者通过微流控芯片制作油包水液滴，水内含有生物样品，然后通过光片将光穿过微流控芯片材料、成像液到达生物样品，或者穿过油4、水5到达生物样品，实现光片成像，本方法在制作成像对象后，由于碘克沙醇具有生物相容性，可实时进行光片成像，避免了生物样品机能受损导致实时成像无法应用于生物研究的问题。本方法提出的成像方法实现了光片成像在微流控技术领域的进一步应用，并进一步实现了微流控-光片成像在生物医学领域中的进一步应用。
相关技术方案同实施例一，在此不再赘述。
优选的，成像对象包括微流控芯片、成像液和生物样品；或者，包括微流控芯片形成的内含生物样品的油包水液滴。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种适配微流控-光片成像的折射率匹配方法，其特征在于，包括：
采用碘克沙醇原溶液或者其结晶后的碘克沙醇晶体，调节活体模式生物样品光片成像的成像环境，使得成像环境中的相邻介质之间的折射率匹配；
其中，所述相邻介质分别为用于固定所述生物样品的微流控芯片和内含所述生物样品的成像液，或者，所述相邻介质分别为由微流控芯片形成的内含所述生物样品的油包水液滴上的油和水。
2.根据权利要求1所述的一种适配微流控-光片成像的折射率匹配方法，其特征在于，具体包括：
测试碘克沙醇原溶液的第一折射率以及成像光片照射生物样品时光所要前后穿过的相邻的目标匹配介质和待调整介质的第二折射率；
基于所述第一折射率和所有所述第二折射率之间的大小关系，采用所述碘克沙醇原溶液或者其结晶后的碘克沙醇晶体，调节所述待调整介质的第二折射率，以与所述目标匹配介质的第二折射率相等，完成折射率匹配。
3.根据权利要求2所述的一种适配微流控-光片成像的折射率匹配方法，其特征在于，所述目标匹配介质为所述微流控芯片或所述油，所述待调整介质为所述成像液或所述水。
4.根据权利要求2所述的一种适配微流控-光片成像的折射率匹配方法，其特征在于，所述采用所述碘克沙醇原溶液或者其结晶后的碘克沙醇晶体，具体为：
当所述目标匹配介质的所述第二折射率小于所述第一折射率且大于所述待调整介质的所述第二折射率时，采用所述碘克沙醇原溶液；
当所述目标匹配介质的所述第二折射率均大于所述第一折射率和所述待调整介质的所述第二折射率时，采用所述碘克沙醇原溶液结晶后的碘克沙醇晶体。
5.根据权利要求2所述的一种适配微流控-光片成像的折射率匹配方法，其特征在于，所述调节所述待调整介质的第二折射率，具体为：
分多次向所述待调整介质中添加所述碘克沙醇原溶液或所述碘克沙醇晶体，并在每次所述添加后，测试所述待调整介质的第二折射率，拟合得到碘克沙醇浓度和所述待调整介质的第二折射率之间的关系曲线；
从所述关系曲线中，确定所述目标匹配介质的第二折射率大小对应的碘克沙醇浓度，并制备碘克沙醇含量为所述浓度的新的待调整介质，完成所述待调整介质的第二折射率的调节。
6.根据权利要求5所述的一种适配微流控-光片成像的折射率匹配方法，其特征在于，所述制备碘克沙醇含量为所述浓度的新的待调整介质，之后还包括：
若所述新的待调整介质的第二折射率与所述目标匹配介质的第二折射率不同，调节所述浓度大小，重新制备待调整介质，直至相等。
7.根据权利要求1至6任一项所述的一种适配微流控-光片成像的折射率匹配方法，其特征在于，所有所述折射率由阿贝折射仪测得。
8.根据权利要求1至6任一项所述的一种适配微流控-光片成像的折射率匹配方法，其特征在于，根据所述生物样品及其成像用途的不同，制作具有不同管道形态的微流控芯片，以生成所述生物样品的成像环境。
9.一种基于微流控-光片成像的生物样品成像方法，其特征在于，包括：
基于微流控芯片，采用如权利要求1至8任一项所述的折射率匹配方法，匹配生物样品的成像环境中相邻介质间的折射率并搭建待成像对象；
采用成像光片向所述成像对象发射激光，实现生物样品成像。
10.根据权利要求9所述的一种基于微流控-光片成像的生物样品成像方法，其特征在于，所述成像对象包括微流控芯片、成像液和所述生物样品；或者，包括微流控芯片形成的内含所述生物样品的油包水液滴。
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