JP2008278898A - 糖化蛋白質測定用組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、1)グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響回避、2)プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化、3)正確にアルブミンを測定、4)糖化ヘモグロビンの影響回避を行うことにより、糖化蛋白質を正確に測定するための組成物、測定方法を提供する。
【選択図】なし
Description
しかしながら、真に糖化蛋白質を正確に測定する組成物を提供するには、1)グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響回避、2)プロテアーゼ、少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化が必須であり、さらに糖化蛋白質が糖化アルブミンである場合には、3)正確にアルブミンを測定する方法、4)糖化ヘモグロビンの影響回避を行うことも重要である。
糖尿病患者ではグロブリン蛋白質量が変化しFRAの値に影響を及ぼすことが知られてい
る(例えば、非特許文献1参照。)。そこで本発明者らはプロテアーゼ反応液にある種の金属イオンやプロテインA若しくはGを添加することによりプロテアーゼのグロブリン成分への作用を選択的に阻害する方法(例えば、特許文献7参照。)を開発してきた。この発明ではグロブリン成分の影響を受けることなく糖化蛋白質を測定することが出来るが、そこで用いられるグロブリン選択的なプロテアーゼ阻害剤としては、金属、プロテインA、Gが記載されている。しかし、ここで示されている特定の金属のうち、効果が強い金属は重金属であり、環境安全上の問題がないとは言えず、また効果の弱い金属は他の試薬成分(他の組成物)と組み合わせると試薬溶液に濁りが生じることがあった。またプロテインA、Gは非常に高価である。
検体中のアスコルビン酸の影響を回避する方法としては化学的な方法やアスコルビン酸オキシダーゼを用いた酵素的な方法を用いて検体中のアスコルビン酸を消去する方法が知られている。プロテアーゼを用いて糖化蛋白質を断片化し、次いで少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて生じた糖化アミノ酸を測定する場合、プロテアーゼ反応と同時にアスコルビン酸オキシダーゼ(ASOx)を作用させ、前もってアスコルビン酸を消去する方法が発色系への影響が小さく好ましい。
しかし、本発明者らの検討ではHEPES緩衝液pH8.0、プロテアーゼ及びASOxが共存した場合のアスコルビン酸処理能は37℃-1日若しくは10℃-2週間の保存でほとんど消失した。
糖化蛋白質の臨床的な測定には他の分野、例えば食品分野等では考えられない程高濃度のプロテアーゼが水溶液の状態で使用される。プロテアーゼは水溶液中では自己消化がおこることが知られており、この様な高濃度の水溶液中で安定に存在するとは考えにくい。よってこれまでの糖化蛋白測定用組成物に用いられるプロテアーゼは凍結乾燥品で供給されている。
糖化蛋白測定用組成物、測定方法に関し液状で長期に保存出来るレベルまでプロテアーゼの安定化を行った例はない。同様に糖化蛋白測定用組成物、測定方法に関し液状で長期に保存出来るレベルまで少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化を行った例はない。
アルブミン測定法には抗アルブミン抗体を用いた免疫法、ブロモクレゾールグリーン(BCG)、ブロモクレゾールパープル(BCP)等を用いた色素法等がある。操作が簡便でかつコストが安いことから、日常検査では色素法が広く用いられているが、BCG法はグロブリン成分に作用が確認されておりアルブミンに対する特異性が低いという欠点がある。
一方BCP法はアルブミンに対する特異性は高いものの、共存物質の影響を受けやすく、
またSH化合物の影響を受けることからアルブミンの酸化還元状態により値が変化するという問題があった。この問題を解決する方法としては蛋白質変性剤及び/またはSH試薬の存在下BCPの反応を行った例(例えば、特許文献9参照。)が知られている。しかし、GAと
非糖化アルブミン(NGA)に対するBCP反応性の検討を行った例はこれまでなかった。
前述のようにGAはアルブミンのεアミノ基が糖化されており、一方GHbはヘモグロビン
中のβ鎖N末端バリンのαアミノ基が糖化されている。よってGAを測定対象とする場合にはεアミノ基が糖化されたアミノ酸のみを測定できれば好ましい。
応性が確認されており、特異性の点で満足いくものではなかった。
本発明者らは鋭意検討の結果、プロテアーゼ反応液にデオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤、コンカナバリンA、オクチルグルコシドまたはベタインから選択される1種以上を添加することによりプロテアーゼのグロブリン成分への作用を選択的に阻害できること、またこの反応液に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を直接作用させても酵素作用が阻害されることなく、再現性良く、精度良くかつ簡便に糖化蛋白質が測定できることを見出した。しかも、これらの化合物は、経済的に有利で、かつ従来の技術を用いたときに比べて環境安全上問題がなく、検体と混合された場合に濁りを生じることもないものである。
ところが本発明者らは鋭意検討の結果、意外にも緩衝液の種類によってASOxの安定性が飛躍的に向上することを見出した。
糖化蛋白質の臨床的な測定には前述のように高濃度のプロテアーゼが水溶液の状態で使用され、基本的にプロテアーゼ自体が不安定になる。ところが、本発明者らは鋭意検討の結果、ジメチルスルホオキシド、アルコール、水溶性カルシウム塩、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤を添加することにより、プロテアーゼの安定性が飛躍的に向上し、液状かつ高濃度の条件でも長期間保存が可能であることを見出した。
本発明者らの検討により意外なことにBCPの反応性がGAとNGAで異なり、NGAが大量に混
入すると値が負の影響を受けることが判明した。そこで本発明者らは鋭意検討の結果、アルブミン測定の前、若しくは同時に蛋白質変性剤及び/又はS−S結合を有する化合物にて試料を処理することにより良好にNGAを大量に含むアルブミンを正確に測定できること
を見出した。
本発明者らは、上記問題点に関し鋭意研究の結果、フザリウム・オキシスポルムIFO-9972株由来FODの遺伝子を改変して、変異FODを作成し、その性状を測定することによってN末端より372番目のリジンを他のアミノ酸に置換することによって基質特異性が顕著に変化することを見出し、糖化バリンへの反応性が著しく低く、ほぼ糖化リジンに特異的に作用する改変FODを複数作成した。
本変異FODは、上記の知見に基づいてなされたもので、FODについて配列表配列番号1のアミノ酸配列372番のリジンを別のアミノ酸に置換することにより糖化バリン反応性が消
失した変異型FODである。配列表配列番号1のアミノ酸配列372番のリジンがトリプトファン、メチオニンまたはバリンに置換された請求項1記載の変異型FODである。
最後に、本発明者らはこれらの発明を総合して正確に糖化蛋白質を測定する組成物、測定方法を完成するに至った。
本発明に使用しうるプロテアーゼは、被検液に含まれる糖化蛋白質に有効に作用し、かつ当該蛋白質由来の糖化アミノ酸及び/若しくは糖化ペプチドを有効に生成するものであればいかなるものを用いても良く、例えば動物、植物、バチルス(Bacillus)属、アスペルギルス(Aspergillus)、リゾパス(Rhizopus)、ペニシリウム(Penicillium)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、クロストリジウム(Clostridium)、リソバクター(Lysobacter)、グリフォラ(Glifila)、酵母(Yeast)、トリチラチウム(Tritirachium)、サーマス(Thermus)、シュードモナス(Pseudomonus)、アクロモバクター(Achromobacter)等の微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
。また測定対象である糖化蛋白質がGHbである場合にはバチルス属、アスペルギルス属、
ストレプトマイセス属、トリチラチウム属由来のプロテアーゼがヒトヘモグロビン(Hb)に対する作用が大きい為により好ましい。
本発明に用いることの出来るプロテアーゼの活性測定法を下記に示す。
下記の測定条件で30℃、1 分間に1μgのチロシンに相当する呈色を示すプロテアーゼ活性度を1PU(proteolytic Unit)と表示する。
<基質> 0.6% ミルクカゼイン(メルク社製)
<酵素溶液> 10PU〜20PU に希釈
<酵素希釈溶液> 20mM 酢酸緩衝液 pH 7.5
1mM 酢酸カルシウム
100mM 塩化ナトリウム
<反応停止液> 0.11M トリクロル酢酸
0.22M 酢酸ナトリウム
0.33M 酢酸
<操作>
プロテアーゼ溶液を10〜20PU/mlになるように酵素希釈溶液にて溶解し、この液1ml を
試験管に取り30℃に加温する。あらかじめ30℃に加温しておいた基質溶液5ml を加え正確に10分後反応停止液5ml を添加し反応を停止する。そのまま30℃、30分加温を続け沈殿を凝集させ、東洋ろ紙N0.131(9cm) で濾過を行い、濾液を得る。ブランク測定はプロテアーゼ溶液1ml を試験管に取り30℃に加温し、まず反応停止液5ml を添加し続いて基質溶液5ml を添加後同様に凝集、濾過を行う。濾液2ml を0.55M 炭酸ナトリウム溶液5ml 、3 倍希釈フォリン試薬1ml を加え30℃、30分反応後660nm の吸光度を測定する。酵素作用を行った吸光度からブランク測定の吸光度を差し引いた吸光度変化を求め、別に作成した作用標準曲線より酵素活性を求める。
約50PU/ml に調整した酵素溶液を希釈し2〜50PU/ml の一連の希釈倍率を持った酵素溶
液を作成し上記操作を行い、得られた吸光度変化を縦軸に希釈倍数を横軸にプロットする。一方L-チロシンを0.2N塩酸に0.01% の濃度に溶解しその1ml に0.2N塩酸10ml加えたものを標準チロシン溶液とする(チロシン濃度9.09μg /ml)。標準チロシン溶液2ml と0.2N塩酸2ml についてそれぞれ上記測定操作を行い、得られた吸光度変化がチロシン18.2μgに相当する。この吸光度変化を前記グラフ上にとり、その点から横軸に垂線を下ろし横軸との交点が10PU/ml に相当する。
本発明に使用しうる少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素としては、前記プロテアーゼの作用により、被検液に含まれる糖化蛋白質から生成される糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドに有効に作用し、実質的に糖化蛋白質が測定できる酵素であれば如何なるものを用いても良いが、αアミノ基が糖化されたアミノ酸によく作用する少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素、εアミノ基が糖化されたアミノ酸によく作用する少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素等が挙げられる。
εアミノ基が糖化されたアミノ酸によく作用する少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の例としては、ギベレラ(Gibberella)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、カン
ジダ(Candida)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フサリウム(Fusarium)属、アクレモニウム(Acremonium)属又はデバリオマイゼス(Debaryomyces)属由来のFOD等が挙
げられる。
αアミノ基が糖化されたアミノ酸によく作用する少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の例としては、コリネバクテリウム(Corynebacterium)由来の酵素が挙げられる。
よび加えて糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型FOD(R-FOD-II;旭化成社製)が
挙げられる。
R-FOD-IIのもととなるフザリウム・オキシスポルムIFO-9972株由来のFOD蛋白質をコー
ドするDNAは、フザリウム・オキシスポルムIFO-9972株から常法により染色体DNAを抽出し、PCR法やハイブリダイゼーション法などで分離して得られる。
得られた該FOD遺伝子への変異の導入は、DNAに直接変異を加えるならPCR法を応用して
もよいし部位特異的変異法を使用してもよい。また偶発変異によるならば、DNA修復能力
の低下した大腸菌宿主を使用しても良いし、あるいはDNA変異源を添加した培地でFOD遺伝子を導入した宿主生物を培養することもできる。
し、発現ベクターのマーカーと、FODの活性発現若しくはDNAプローブを指標としてスクリーニングを行い、FOD遺伝子を含有する組換えDNAプラスミドを保持する微生物を分離し、該遺伝子組換え微生物を培養し、該培養菌体から組換え蛋白を抽出精製することで変異FODを得ることができる。
法とされるものは、例えばマニアティスらの方法(Maniatis,T., et al. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory 1982, 1989)や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。
分離したFOD遺伝子に変異を導入するにはマンガンイオン添加条件下に於けるTaqポリメラーゼを始めとする3'→5'修復能欠損型ポリメラーゼを使用したPCR法や、DNA修復能を欠損した大腸菌宿主にFOD遺伝子を導入しジアニシジンなどの変異源を添加した培地で培養
することにより遺伝子変異を誘発し、作成した変異候補株群より目的の基質特異性を獲得した変異体を分離すればよい。
上述の方法によって導入されたFODの変異は、ジデオキシ法(Sangar,F.(1981)Science, 214, 1205-1210)で変異を導入した遺伝子の塩基配列を確認することにより決定できる。
また一度変異が決定した後はゾラーらの方法(Zoller, M. J. and Smith, M. (1983)Methods in Enzymology,154, 367)による部位特異変異法で特定の変異を導入することもできる。
決定できる。以上の方法で得られた変異FODは変異FOD遺伝子を適当な宿主−ベクター系に組み込むことにより組換え体として生産できる。
変異FOD遺伝子を組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるフ
ァージ又はプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、E. coliに属する微生物を宿主微生物とする場合にはλgt
・λC、λgt・λBなどが使用できる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、E. coliを宿主微生物とする場合にはプラスミドpBR322、pBR325、pACYC184、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pIN I、BluescriptKS+、枯草菌を宿主とする場合にはpUB110、pKH300PLK、放線菌を宿主とする場合にはpIJ680、pIJ702、酵母特にサッカロマイセス・セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を宿主とする場合にはYrp7、pYC1、Yep13などが使用できる。
このようなベクターに変異FOD遺伝子を組み込むには、双方を同じ末端を生成する適当
な制限酵素で切断し、変異FOD遺伝子を含むDNAフラグメントとベクター断片とを、DNAリ
ガーゼ酵素により常法に従って結合させればよい。
、E. coli DH1、E. coli JM109、E. coli W3110、E. coli C600などが利用できる。また
、微生物宿主が枯草菌に属する微生物の場合、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)ISW1214など、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)TK24など、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエINVSC1などが使用できる。
変異FODを生産するためには、変異FOD遺伝子を導入した宿主を適切な培地で培養し、培養した菌体を集菌後、適当な緩衝液中にて超音波破砕やリゾチーム処理などにより菌体を破壊し、菌体抽出液を調製すればよい。また、シグナル配列を付加することによる分泌発現により、培養溶液中に変異FODを蓄積させても良い。
かようにして生産された変異FODは、通常の硫安沈殿、ゲル濾過、カラム精製などによ
って分離精製され、酵素標品として供給される。
ーDNAを0.1〜10μgに対し、制限酵素を約1〜10U、リガーゼ約300U、その他の酵素約1〜10U、程度が例示される。
変異FOD遺伝子を含み、変異FODを産生し得る形質転換微生物の具体的な例示としては、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物とし、その内部に変異FOD遺伝子を含有
するプラスミドpcmFOD3を保有する形質転換微生物、エシェリヒア・コリJM109・pcmFOD3
(FERM BP-7847)、およびpcmFOD4を保有する形質転換微生物、エシェリヒア・コリJM109・pcmFOD4、およびpcmFOD5を保有する形質転換微生物、エシェリヒア・コリJM109・pcmFOD5(FERM BP-7848)が挙げられる。これらの構造を図7に示した。
なお、前記エシェリヒア・コリJM109・pcmFOD3及びエシェリヒア・コリJM109・pcmFOD5は、共に平成13年1月16日に日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6の独立行政法人
産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、それぞれ受託番号FERM BP-7847及びFERM BP-7848を付与された。
で培養して菌体内又は培養液中に該変異FODを産生せしめ、培養終了後、得られた培養物
を濾過又は遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてEDTA及び/又は適当な界面活性剤などを添加して該変異FODの水溶液を濃縮するか、又は濃縮する事なく硫安分画、ゲル濾
過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理して、純度のよい該変異FODを得ることができる。
炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが使用される。
その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
が最高終了に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、E. coliの場
合、通常は12〜48時間程度である。培地pHは菌が発育し、変異FODを生産する範囲で適宜
変更し得るが、E. coliの場合、好ましくはpH6〜8程度である。
、一般には常法に従って、変異FODが培養液中に存在する場合には、濾過、遠心分離など
により変異FOD含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。変異FODが菌体内に存在する場合には、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段により、菌体を採取し、次いでこの菌体を必要に応じて機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、またEDTAなどのキレート剤及び/又は界面活性剤を添加して変異FODを可溶化し水溶液とし
て分離採取する。
この様にして得られた変異FOD含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、
硫酸ナトリウムなどの塩析処理などによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。
燥等の処理により精製された変異FODが得られる。
糖化アミノ酸に作用する酵素の活性は下記の方法にて測定した。
<反応液の組成>
50mM トリス緩衝液 pH7.5
0.03% 4アミノアンチピリン(4-AA)(和光純薬社製)
0.02% フェノール(和光純薬社製)
4.5U/ml パーオキシダーゼ(POD)(シグマ社製)
1.0mM α-カルボベンズオキシ-ε-D-フルクトシル-L-リジン若しくはフルクト
シルバリン(ハシバらの方法に基づき合成、精製した。Hashiba H、
J.Agric.Food Chem.24:70、1976 以下ZFL、FVと略す。)
上記の反応液1mlを小試験管に入れ、37℃-5分間予備加温した後、適当に希釈した酵素
液0.02mlを添加して攪拌し、反応を開始する。正確に10分間反応の後に0.5%のSDSを2ml
添加して反応を停止し、波長500nmの吸光度を測定する(As)。またブランクとして酵素液
のかわりに蒸留水0.02mlを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する(Ab)。この酵素作用の吸光度(As)と盲検の吸光度(Ab)の吸光度差(As-Ab)より酵素活性を求める。別にあら
かじめ過酸化水素の標準溶液を用いて吸光度と生成した過酸化水素との関係を調べ、37℃-1 分間に1 μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1Uと定義する。計算式を下記に示す。
3.02 : 総反応液量(ml)
0.02 : 酵素溶液量(ml)
10 : 反応時間
2 : 過酸化水素2 分子から4-AA、フェノールが縮合した色素1
分子を生じることによる係数
12.0 : 4-AA-フェノールのミリモル吸光係数
B : 酵素液の希釈倍率
以上の方法によって得られる変異FODのうち、配列表配列番号1のアミノ酸配列372番のリジンがトリプトファンに置換された変異FODの酵素学的性質は以下のようである。
ZFL 100%
FV 0%
(2)酵素作用
下記に示すように、少なくともα-アミノ酸、ε-アミノ酸のアマドリ化合物を分解して、グルコソンと過酸化水素および対応するα-アミノ酸、ε-アミノ酸を生成する反応を触媒する。
(3)分子量
本酵素の分子量はSephadex・G-100を用いたカラムゲル濾過法で、0.2MのNaCl含有0.1M
のリン酸緩衝液(pH7.0)を溶出液として測定した結果、48000±2000、SDS-PAGEでは47000±2000であった。
(4)等電点
キャリアアンフォライトを用いる焦点電気泳動法によって4℃、700Vの定電圧で40時間通電した後、分画し、各画分の酵素活性を測定した結果、pH4.3±0.2であった。
(5)Km値
50mMのトリス塩酸緩衝液(pH7.5)
0.03%の4-AA
0.02%のフェノール
4.5U/mlのパーオキシダーゼ
を含む反応液中で合成基質ZFLの濃度を変化させて、ZFLに対するKm値を測定した結果、3.4mMの値を示した。
(6)至適pH
前記の酵素活性測定法に従い、反応液中の50mMのトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)に代え
て100mMの酢酸緩衝液(pH4.4-5.4)、リン酸緩衝液(pH5.6-7.9)、トリス−塩酸緩衝液
(pH7.3-8.5)、およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液(pH8.0-10.3)の各緩衝液を
用いて測定した。この結果、pH7.5で最大の活性を示した。
(7)pH安定性
本酵素0.5Uを含有する0.5Mの至適pHを測定するときに用いた各種緩衝液0.5mlを40℃、10分間処理した後、その残存活性を後記の活性測定法に従って測定した。この結果、pH7.0-9.0の範囲で80%以上の活性を保持していた。
(8)熱安定性
本酵素0.5Uを0.2Mのトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)で調製し、10分間加熱処理後、その
残存活性を活性測定法に従って測定した。この結果、40℃までは残存活性として95%以上を保持した。
(9)至適温度
40mMのトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)を用い、活性測定法に従い、各温度で10分間反応
後、0.5%のラウリル硫酸ナトリウム(以下SDSと略称する)溶液2mlで反応を停止し、波
長500nmで吸光度を測定した。この結果、50℃で最大の活性を示した。
化リジンを消去した後に、糖化バリンに反応性を有するFODを用いて被検液中の糖化バリ
ンを測定する方法について述べる。
被検液中の糖化リジンを消去するFODは糖化バリンに作用しないFODであればなんら限定されるものではないが、例えばFODについて配列表配列番号1のアミノ酸配列372番のリジンを他のアミノ酸に置換することにより糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型FOD
が用いられ、さらに好適には変異FODのうち、配列表配列番号1のアミノ酸配列372番のリジンがトリプトファン、メチオニン、バリンのいずれかに置換された変異FODを用いれば
良い。このとき反応液に添加する酵素量は被検液中の糖化リジンを消去するのに十分な量であればよく、例えば、0.5〜200U/ml、好適には1〜50U/mlである。
また、糖化バリンを測定するFODについては糖化バリンに反応性を持つFODであれば何ら限定されるものではなく、例えば、フザリウム・オキシスポルムIFO-9972株由来FODを用
いれば良い。このとき反応液に添加する酵素量は被検液中の糖化バリンを測定するのに十分な量であればよく、例えば、0.5〜200U/ml、好適には1〜50U/mlである。
等によって分解させ、第二反応にて、被検液中の糖化バリンにFODを作用させ生成する過
酸化水素を4−アミノアンチピリン(4-AA)およびトリンダー試薬と反応させ、生成する色素を比色測定すればよい。また、第二反応液中にカタラーゼの阻害剤であるアジ化ナトリウムを添加してもよい。
デオキシコール酸アミドとしては、例えばビスグルコナミドプロピルデオキシコーラミド(N,N-Bis(3-D-gluconamidopropyl)deoxycholamido)等が好ましく、コール酸アミドとしては、例えば、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxypropanesulfonicacid)、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキシ-1-プロパン(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid)若しくはビスグルコナミドプロピルコーラミド(N,N-Bis(3-D-gluconamido propyl)cholamido)等が好ましい。
第四級アンモニウム塩としては、例えば塩化ベンジルトリエチルアンモニウム、塩化ベンジルトリ-n-ブチルアンモニウム等が好ましく、第四級アンモニウム塩型陽イオン界面
活性剤としては、例えば塩化ラウリルトリメチルアンモニウム若しくはラウリルジメチルアミンオキサイド等が好ましい。
これらのグロブリン成分選択的な阻害剤は単独若しくは組み合わせて用いても良い。
また同様に例えばコンカナバリンA、オクチルグルコシドもしくはベタインを用いる場合にはそれぞれ0.01〜10mg/ml、0.005〜5%の濃度で使用することが出来、またそれぞれ0.02〜2mg/ml、0.01〜2%の濃度で使用することが好ましくこれ以外の濃度を用いることもできる。
1例に過ぎず、なんら限定されるものではない。
植物由来のASOxの例としては、キュウリ由来(アマノ社製、東洋紡社製)およびカボチャ由来(ロシュ社製、東洋紡社製)が挙げられる。
微生物由来のASOxの例としてはアクレモニウム(Acremonium)由来(旭化成社製)、微生物由来(アマノ社製)が挙げられる。
ASOxの活性は下記の方法にて測定した。
<保存基質溶液>
Lアスコルビン酸(和光純薬社製)176mgとEDTA(第一化学薬品社製)37mgを1mM塩酸100mlで溶解する。
<反応試薬混合液>
上記の保存基質溶液を0.45mMのEDTAを含む90mM 燐酸2カリ−5mM燐酸1ナト緩衝液で20
倍に希釈する。
<操作>
上記の反応試薬混合液1mlを小試験管に入れ、30℃-5分間予備加温した後、適当に希釈
した酵素液0.10mlを添加して攪拌し、反応を開始する。正確に5分間反応の後に0.2N塩酸
水溶液3.0mlを添加して反応を停止し、波長245nmの吸光度を測定する(As)。またブランクとして上記の反応液1mlを小試験管に入れ、30℃-5分間予備加温した後、0.2N塩酸水溶液3.0mlを添加して反応を停止する。適当に希釈した酵素液0.10mlを添加して攪拌し、波長245nmの吸光度を測定する(Ab)。この酵素作用の吸光度(As)と盲検の吸光度(Ab)の吸光度差(Ab-As)より酵素活性を求める。30℃-1 分間に1μmolのアスコルビン酸をデヒドロアスコルビン酸に酸化する酵素量を1Uと定義する。計算式を下記に示す。
10.0:pH1.0の条件でアスコルビン酸の245nmに於けるミリモル分子吸光係数
5:反応時間(min)
4.10:反応液総量(ml)
0.10:反応に供した酵素試料液量
B:酵素液の希釈倍率
また、これらのASOxの使用濃度としては、プロテアーゼとASOxを共存させ保存する場合に、試薬使用時でも十分なアスコルビン酸の消去が可能な量であれば良く、例えば通常0.1U/ml〜100U/ml、好ましくは1U/ml〜50U/mlの濃度で用いればよい。
ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持たない緩衝剤としては、プロテアーゼとASOxを共存させた状態で、ASOxが安定である緩衝剤であればいかなるものを用いても良いが、例えば3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸(EPPS)、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES)及び2-ヒドロキシ-3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸(HEPPSO)等の4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持つ緩衝剤以外の緩衝剤であればいかなる緩衝剤を用いても良い。
さらに、好ましい緩衝剤の例としては、例えばN-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンス
ルホン酸(ACES)、N-(2-アセトアミド)イミノジ酢酸(ADA)、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸(BES)、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン(Bicine)、ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン(Bis-Tris)、N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPS)、N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸(CAPSO)、N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸(CHES)、3-[N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、2-モルフィリノエタンスルホン酸(MES)、3-モルフィリノプロパンスルホン酸(MOPS)、2-ヒドロキシ-3-モルフィリノプロパンスルホン酸(MOPSO)、ピペラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸(PIPES)、ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸)(POPSO)、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、2-ハイドロキシ-N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノプロパンスルホン酸(TES)、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン(Tricine)およびトリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)等があげられる。
最も好ましい緩衝剤の例としては例えばトリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)及びピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸)(POPSO)が挙げられる
。
これらのASOxと共に使用する緩衝剤の使用濃度としては、プロテアーゼ共存下でもASOxが安定である濃度であり、かつプロテアーゼ及びASOxの反応に影響を及ぼさない濃度であればいかなる量用いても良く、例えば通常1mM〜1M、好ましくは5mM〜500mMの濃度で用い
ればよい。
好ましい蛋白質変性剤の例としては、例えば、尿素、グアニジン化合物、陰イオン界面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム(SDS)、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエ
ーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩が挙げられ、これらは単独若しくは組み合わせて用いることが出来る。また、これらの蛋白質変性剤の使用濃度としては、BCPのアルブミンに対する反応性
がGA及びNGAで一致する濃度であれば良く、例えば通常0.01%〜10%、好ましくは0.05%
〜5%の濃度で用いればよい。
好ましいS−S結合を有する化合物としては6,6'-ジチオジニコチン酸(6,6'-dithiodinicotinic acid)、3,3'-ジチオジプロピオン酸(3,3'-dithiodipropionic acid)、2,2'-ジチオジサリチル酸(2,2'-dithiodibenzoicacid)、4,4'-ジチオジモルホリン(4,4'-dithiodimorpholine)、2,2'-ジヒドロキシ-6,6'-ジナフチルジスルフィド(2.2'-dihydroxy-6,6'-dinaphthyl disulfide;DDD)、2,2'-ジチオジピリジン(2,2'-dithiopyridine;2-PDS)、4,4'-ジチオジピリジン(4,4'-dithiopyridine;4-PDS)、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid);DTNB)、2,2'-ジチオビス(5-ニトロピリジン)(2,2'-dithiobis-(5-nitropyridine))等があげられる。
また、これらのS−S結合を有する化合物の使用濃度としては、BCPのアルブミンに対
する反応性がGA及びNGAで一致する濃度であれば良く、例えば通常1μM〜10mM、好ましく
は10μM〜5mMの濃度で用いればよく、これ以外の濃度で用いても良い。
好ましい安定化剤の例としてはジメチルスルホオキシド、アルコール、水溶性カルシウム塩、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤があげられる。アルコールの例としては、エタノール、プロパノール、エチレングリコール、グリセリン等が、第四級アンモニウム塩第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤の例としてはラウリル硫酸トリエタノールアミン、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム等があげられる。
また、これらのプロテアーゼ安定化剤の使用濃度としては、試薬保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える物質であればいかなる濃度で用いても良く、特に試薬を液体の状態で保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える濃度であれば好ましい。好ましい濃度の例としては、例えば通常0.01%〜30%、好ましくは0.1%〜20%の濃度で用いればよく、これ以
外の濃度で用いても良い。
好ましい安定化剤の例としては糖アルコール、スクロース、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンがあげられる。糖アルコールの例としては、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、グリセリン等が、アミノ酸としては全てのアミノ酸に強い安定化効果があるが中でもより好ましくは、プロリン、グルタミン酸、アラニン、バリン、グリシン、リジン等があげられる。
また、これらの少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化剤の使用濃度としては、試薬保存中に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の活性低下を抑える物質であればいかなる濃度で用いても良く、特に試薬を液体の状態で保存中に少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の活性低下を抑える濃度であれば好ましい。好ましい濃度の例としては、例えば糖アルコール、スクロース、アミノ酸、ザルコシンの場合、通常0.01%〜30%、好ましくは0.1%〜20%の濃度で用いればよく、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安の場合、通常1mM〜1M、好ましくは10mM〜500mMの濃度で用いればよく、これ以外の濃度で用いても良い。
本発明に使用しうる蛋白質分解試薬組成としては、蛋白質分解反応が効率よく進行するようにpH、緩衝剤及びプロテアーゼ濃度を決定し、その後グロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤、ASOx、プロテアーゼ安定化剤を前述の有効な濃度になるよう適宜調製して添加すればよい。
例えばプロテアーゼタイプXXIV(シグマ社製)を用いる場合にはpHが7 〜10付近で蛋白質分解活性が強く、反応のpHは7 〜10を選択できる。緩衝液としては4-(2-ヒドロキシエ
チル)-1-ピペラジニル基を持たない緩衝剤である例えばpH7.2〜8.5に緩衝作用のあるPOPSO緩衝液を使用することが出来、POPSOの濃度は1〜100mMの濃度、好ましくは10〜500mMで使用すればよい。
またプロテアーゼ添加濃度は実際に使用される反応時間中に被検液中の糖化蛋白質を十分に分解し得る濃度で有れば良く、100 〜50万PU/ml が好ましく、500〜10万PU/ml がよ
り好ましい。
グロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤、ASOx、プロテアーゼ安定化剤との組み合わせとしては、例えばグロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害剤として硫酸-3-[(コー
ルアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン、0.01%〜20%、好ましくは0.05%
〜10%、カボチャ由来アスコルビン酸オキシダーゼ(東洋紡社製)、0.1U/ml〜100U/ml、好ましくは1U/ml〜50U/ml、プロテアーゼ安定化剤としてジメチルスルホオキシド0.01%
〜30%、好ましくは0.1%〜20%等を用いることができる。
例えばR-FOD 若しくはR-FOD-II(旭化成社製)を使用する場合、最大活性の50% 以上
の活性を示す領域がpH6.5 〜10と広く、反応のpHは6.5 〜10を選択できる。また酵素添加濃度は、使用される反応液中で糖化アミノ酸を十分に検出し得る濃度で有れば良く、0.5
〜200U/mlが好ましく、1〜50U/ml がより好ましい。
少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化剤としては、例えばグルタミン酸を用いることができ、0.01%〜30%、好ましくは0.1%〜20%の濃度で用いればよい。
例えばR-FOD、プロテアーゼタイプXXIVを使用する場合には、それぞれpH6
.5〜10、7〜10で酵素が良く作用することから第1試薬はpH7〜10を選択し比較的高濃度の例えば20〜1000mMの緩衝剤濃度を選択すればよい。一方本プロテアーゼはpH7以下で安定であることから、第2試薬のpHは7以下を選択し第1試薬よりも比較的低濃度の例えば1〜50mM緩衝剤濃度を選択し、加えて例えばジメチルスルホオキシド1〜50%程度のプロテアーゼ安定化剤を添加すると好ましい。この場合第1試薬と第2試薬の混合の割合を例えば4:1と第1試薬を多くすればさらに高濃度の安定化剤や第1試薬からかけ離れたpH等が選択可能である。
界面活性剤としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ポリビニルアルコール等の0.01〜10%、好適には0.05〜5%、
各種金属塩類、例えば塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マンガン、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化カルシウム等の1mM〜5M、好適には10mM〜1M、各種緩衝液、
例えばトリス−塩酸緩衝液、グリシン−NaOH緩衝液、燐酸緩衝液、グッドの緩衝液等の10mM〜2M、好適には20mM〜1M、各種防腐剤、例えばアジ化ナトリウムの0.01〜10%、好適には0.05〜1%を適宜添加すれば良い。
また例えばオキシダーゼを用いた場合には、酸素の消費量または反応生成物の量を測定することが好ましい。反応生成物として、例えばR-FODを用いた場合には反応により過酸
化水素及びグルコソンが生成し、過酸化水素及びグルコソン共に公知の方法により直接、間接的に測定する事が出来る。
上記過酸化水素の量は、例えばパーオキシダーゼ等を用いて色素等を生成し、発色、発光、蛍光等により測定しても良く、また電気化学的手法によって測定しても良く、カタラーゼ等を用いてアルコールからアルデヒドを生成せしめて、生じたアルデヒドの量を測定しても良い。
チアゾリノンヒドラゾン(MBTH)等のカップラーとフェノール等の色原体との酸化縮合により色素を生成するトリンダー試薬、パーオキシダーゼの存在下で直接酸化、呈色するロイコ型試薬等を用いることが出来る。
トリンダー型試薬の色原体としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等が使用可能であり、具体例として、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジン(TOOS)、N,Nビス(4−スルホプロピル)-3-メチルアニリン2ナトリウム(TODB)(以上同人化学研究所社製)等が挙げられる。
またロイコ型試薬の具体例としては、N-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-4,4- ビス(ジメチルアミノ)ビフェニルアミン(DA64)、10-(カルボキシメチルアミノカル
ボニル)-3,7- ビス(ジメチルアミノ)フェノチアジン(DA67)(以上和光純薬社製)等が挙げられる。
蛍光法には、酸化によって蛍光を発する化合物、例えばホモバニリン酸、4-ヒドロキシフェニル酢酸等を、化学発光法には、触媒としてルミノール、ルシゲニン、イソルミノール等を用いることが出来る。
を用いても良い。
例えば蛋白質変性剤及び/またはS−S結合を有する化合物としてラウリル硫酸ナトリウム及び5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)を用いる場合には、BCPの発色に影響を与えないように低濃度の緩衝液例えば1〜20mMを用い、ラウリル硫酸ナトリウム0.01%〜10%、好ましくは0.05%〜5%及び5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)1μM〜10mM、好ましくは10μM〜5mMの濃度で用いれば良い。またBCPは中性以上で激しく着色することからpH4.5〜7.5で使用すると良い。
のアルブミンを用いて測定した場合の吸光度及び水のブランクと比較すれば被検液中のアルブミンの量を求めることができる。
本発明の糖化蛋白質測定組成物及び測定方法に於ける測定対象である糖化蛋白質としては、例えばGAまたはGHbが挙げられるが、測定対象となる糖化蛋白質は何らこれらに限定
されるものではなく、何れの糖化蛋白質を測定しても良い。
ついで、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。
<基質溶液>
1; HSA基質溶液; Albumin Human; Essencially Globulin Free; 25mg/ml、GA%=31.9%、フルクトサミン(FRA)値=256μmol/L [シグマ社製; 基質溶液中のアルブミン濃度はアルブミン測定キット(アルブミンII-HAテストワコー; 和光純薬社製)にて測定、GA%は糖化アルブミン測定計(GAA-2000; 京都第一科学社製)にて測定した。
2; G-II,III基質溶液、FRA値48μmol/L[Globulins Human Cohn Fraction II,III; 16.9mg/ml(シグマ社製)]
3; G-IV基質溶液、FRA値26μmol/L[Globulins Human Cohn Fraction IV;6mg/ml(シグマ社製)]
4; G-I基質溶液、FRA値77μmol/L[グロベニンI;glovenin-I;免疫グロブリン製剤(武
田薬品社製)]
5; Hb基質溶液; Hemoglobin Human; 55mg/ml、糖化へモグロビン率;HbA1c=4.5%[シグマ社製;HbA1c値は糖化へモグロビン計(ハイオートエーワンシーHA-8150 ;京都第一科学社製)にて測定した。]
なお基質溶液のフルクトサミン値はフルクトサミン測定キット(オートワコーフルクトサミン、和光純薬社製)にて測定した。
<プロテアーゼ反応試料作成>
Hb以外の基質溶液200μl、プロテアーゼ溶液100mg/ml(この濃度が作成できない場合は
可能な限り濃い濃度、また溶液状のものはそのままの濃度)40μl、及び1Mトリス緩衝液(pH8)10μlを良く混合し37℃-30分反応させ、1万膜(ウルトラフリーMC; ミリポア社製)で濾過し、濾液をプロテアーゼ反応試料とした。また、基質の代わりに蒸留水を用い同様の操作を行い、ブランク試料とした。
一方Hb基質溶液の場合は基質溶液150μl、プロテアーゼ溶液200mg/ml(この濃度が作成
できない場合は可能な限り濃い濃度、また溶液状のものはそのままの濃度)を60μl及び1Mトリス緩衝液(pH8)5μlを良く混合し37℃-60分反応させ、1万膜(ウルトラフリーMC;ミリポア社製)で濾過し、濾液をプロテアーゼ反応試料とした。また、基質の代わりに蒸留水を用い同様の操作を行い、ブランク試料とした。
<反応液組成>
50mM トリス緩衝液 pH8.0
0.02% 4-AA(和光純薬社製)
0.02% N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジン
(TOOS)(同人化学研究所社製)
2U/ml R-FOD(旭化成社製)
5U/ml POD(シグマ社製)
<反応手順>
上記糖化アミノ酸測定反応液300μlをセルに分注し37℃-3分間インキュベーションし555nmを測光する(A0)。続いてプロテアーゼ反応試料30μlを添加し37℃-5分間インキュベーションし555nmを測光する(A1)。またプロテアーゼ反応試料の代わりにブランク試料を用い同様の操作を行いA0ブランク、A1ブランクを測定する。プロテアーゼの糖化蛋白質への作用を吸光度変化で示すと下式となる。
ΔA=(A1-A0)-(A1ブランク-A0ブランク)
pH8.0における代表的なプロテアーゼのアルブミン、グロブリン、ヘモグロビンへの作
用(ΔA)を表1に示す。
ったため、またG-II、-III基質溶液の測定値とG-I基質溶液の測定値がほぼ同じであった
ために表1にはグロブリン成分についてG-I基質溶液の結果のみを記載した。表1から分
かるようにアスペルギルス(Aspergillus)属由来のプロテアーゼ、及びプロテアーゼタイ
プXIVはグロブリン成分中の糖化グロブリンにも良く作用している。
しかしながらアルブミン中のGA及びヘモグロビン中のGHbに作用するエンド型、エキソ
型プロテアーゼは共にグロブリン成分中の糖化グロブリンに作用を示した。よって血清又は血漿中のGA若しくは全血及び血球中のGHbを測定する場合にプロテアーゼの選択のみで
はグロブリン成分の影響を回避できないと考えられた。
前記HSA基質溶液に高い作用を示すプロテアーゼタイプXXIV(シグマ社製)を用いて、HSA基質溶液を基準に、前記各種グロブリン基質溶液へのプロテアーゼ作用を低下させる物質をスクリーニングした。
<反応液組成>
R-1 蛋白質分解試薬
150mM トリシン緩衝液(和光純薬社製)pH8.5
2500U/ml プロテアーゼタイプXXIV(シグマ社製 + グロブリン選択的なプロテアーゼ阻害剤(デオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、第四級アンモニ
ウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤;1%、コンカナバリンA;0.21mg/ml、ベタイン;0.1%、オクチルグルコシド;1%;同人化学研究所社製)
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
150mM トリシン緩衝液(和光純薬社製)pH8.5
0.12% 4-AA(和光純薬社製)
0.08% TOOS(同人化学研究所社製)
24U/ml R-FOD(旭化成工業社製)
20U/ml POD(シグマ社製)
R-1 蛋白質分解試薬中のデオキシコール酸アミドとしては、ビスグルコナミドプロピルデオキシコーラミドを、コール酸アミドとしては硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキシ-1-プロパン若しくはビスグルコナミドプロピルコーラミド、第四級アンモニ
ウム塩としては塩化ベンジルトリエチルアンモニウム、塩化ベンジルトリ-n-ブチルアン
モニウム、第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤としては、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム及びラウリルジメチルアミンオキサイドを使用した。
<基質溶液>
1; HSA基質溶液; Albumin Human; 40mg/ml、GA%=10.5%[和光純薬社製; 基質溶液中のアルブミン濃度はアルブミン測定キット(アルブミンII-HAテストワコー; 和光純薬社製)に
て測定し、GA%は糖化アルブミン測定計(GAA-2000;京都第一科学社製)にて測定した。]
2;γグロブリン添加基質溶液;上記HSA基質溶液にγグロブリン [γGlobulin s Human (シグマ社製) フルクトサミン値34μM] 17.0mg/mlを添加した。
<反応手順>
37℃にインキュベートされたR-1;240μlに基質溶液(HSA基質溶液、G-I基質溶液)8μlを添加し、37℃で反応を開始し、正確に5分後にR-2;80μlを添加した。R-2添加前後の546nmの吸光度を測定し、その差を吸光度変化とした。また基質の代わりに蒸留水を用い同様の操作を行い、ブランク試料とし、さらにグロブリン選択的なプロテアーゼ阻害剤を添加しない反応液をコントロールとした。
HSA基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いたΔA(HSA)及びγグロブリン添加基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いたΔA(+γグロブリン)を算出し、
γグロブリン添加の影響
=(ΔA(+γグロブリン) -ΔA(HSA))/ΔA(HSA)×100(%)
様々な候補物質の共存下及び非共存下(コントロール試料)にて比較した。その結果を表2に示す。
さらにHSA基質溶液の代わりにHb基質溶液を用い同様の測定を行った。但しHb基質溶液
を用いた場合にはR-1反応終了後、トリクロル酢酸にて除蛋白、中和後R-2を添加し評価を行った。Hb基質溶液を用いた場合にもデオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤、コンカナバリンA及びベタインにグロブリンへのプロテアーゼ作用を阻害する効果が確認された。
様々なプロテアーゼを用い、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンのグロブリン成分選択的なプロテアーゼ阻害効果を確認した。
R-1 蛋白質分解試薬
150mM トリシン緩衝液(和光純薬社製)pH8.5
2500U/ml プロテアーゼ*
1% 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン
* プロテアーゼはオリエンターゼ22BF(阪急バイオインダストリー社製)、プロテ アーゼタイプVIII、プロテアーゼタイプXIV、プロテアーゼタイプXXVII(以上 シグマ社製)を使用した。
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
実施例2に同じ
<基質溶液>
実施例2に同じ。
<反応手順>
実施例2に同じ手順でγグロブリン添加の影響を硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンの共存下及び非共存下(コントロール試料)にて比較した。その結果を表3に示す。なお、判定の欄について、γグロブリンの添加の影響が有意に低下した場合に○とした。
さらに同様にGHbを測定する場合にも本発明を用いることにより、グロブリン成分の影
響を回避できた。
R-1 蛋白質分解試薬
150mM トリシン緩衝液(和光純薬社製)pH8.5
2500U/ml プロテアーゼタイプXXVII(シグマ社製)
1% 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキシ-1-
プロパン(シグマ社製)
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
実施例2に同じ
<基質溶液>
1:HSA基質溶液;実施例1と同じ。但し濃度は4.0g/dlで用いた。
2:γグロブリン基質溶液;実施例2と同じ。
3: グロブリンIV基質溶液;実施例1と同じ。
<操作>
HSA基質溶液(4g/dl)、γグロブリン(γG)及びグロブリンIV(GIV)基質溶液1.7g/dl)の0.0、0.5、1.0、1.5、2.0倍濃度の試料を調製し希釈直線性を確認した。操作は実施例
3に同じ。但しHSA1.0倍濃度は10回測定しCV値を計算した。その結果を図1に示す。
グロブリン成分の影響を実質的に受けずに糖化アルブミンが測定されていることが明白である。またHSA1.0倍濃度ではCV値=0.9%と良好な再現性が確認されており、本発明の
測定系を用いて10分の反応時間で糖化アルブミンが選択的に、感度良く、また再現良く測定されていることが明らかとなった。
R-1 蛋白質分解試薬
77mM トリス緩衝液 pH8.0
2500U/ml プロテアーゼタイプXIV(シグマ社製)
1% 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキ
シ-1-プロパン(シグマ社製)
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
実施例2に同じ。
<基質溶液>
実施例1と同一のHb基質溶液及び実施例4と同じγグロブリン及びグロブリンIV基質溶液を使用した。
<操作>
Hb基質溶液(4g/dl)、γグロブリン及びグロブリンIV基質溶液(1.7g/dl)の0.0、0.5、1.0、1.5、2.0倍濃度の試料を調製し希釈直線性を確認した。操作は実施例1に同じ。但しHb1.0倍濃度は10回測定しCV値を計算した。その結果を図2に示す。
R-1 蛋白質分解試薬 実施例4に同じ。
R-2 糖化アミノ酸測定試薬 実施例4に同じ。
<基質溶液>
血清A)* 糖尿病患者血清 GA%=32.9%;アルブミン濃度 4.3g/dl
血清B)* 健常者血清 GA%=16.4%;アルブミン濃度 4.1g/dl
* 上記血清A)とB)とを10:0、8:2、6:4、4:6、2:8、0:10の割合で混合し試 料とした。
<操作> 実施例3に同じ。
結果を図3に示す。
R-1 蛋白質分解試薬 実施例4に同じ。
R-2 糖化アミノ酸測定試薬 実施例4に同じ。
<基質溶液> 糖尿病患者血清 14検体
健常者血清 25検体
<操作> 操作は実施例2に同じ。
糖尿病患者血清14検体を用い本発明に基づく酵素法と、公知のHPLC法の相関を確認した。尚HPLC法の測定は、糖化アルブミン計(GAA-2000;アークレイ社製)にて糖化アルブミン率を測定した。本発明に基づく測定方法から得られる吸光度変化は糖化アルブミン率と、相関係数r=0.991と非常によい相関を示し、本発明に基づく測定方法は糖化アルブミンを正確に測定していることが明らかとなった。
<反応液組成>
150mM 各種緩衝液 pH8.0
2500U/ml プロテアーゼタイプXXIV(シグマ社製)若しくはプロナーゼ(シグマ社
製)
10U/ml アスコルビン酸オキシダーゼ(ASO-311;東洋紡社製)若しくは熱安定
型アスコルビン酸オキシダーゼ(ASO-312;東洋紡社製)
R-1 蛋白質分解試薬中の緩衝剤としては3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]
プロパンスルホン酸(EPPS)、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスル
ホン酸(HEPES)、2-ヒドロキシ-3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパン
スルホン酸(HEPPSO)、トリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)、ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸)(POPSO) (以上同人化学研究所社製)及び燐酸(和光純薬社製)を用いた。
<操作手順>
上記反応液を各種緩衝剤を用いて作成し、その一部をとり、試薬中のアスコルビン酸オキシダーゼ活性を測定しコントロールとした。活性測定方法は前述の<<アスコルビン酸オキシダーゼ(ASOx)の活性測定法>>を用いた。残りの反応液は室温にて2日間保存後同様に活性を測定した。コントロールの活性に対する、室温−2日間保存後の活性の割合を計算しアスコルビン酸オキシダーゼの安定性を比較した。結果を表4に示す。
ロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸(EPPS)、2-[4-(2-ヒドロキシエチ
ル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES)及び2-ヒドロキシ-3-[4-(2-ヒドロキシ
エチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸(HEPPSO)を緩衝剤に用いた場合よりも、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持たないトリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)、ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸)(POPSO)及び燐酸を緩衝剤に用いた場合、プロテアーゼの共存下に於いてアスコルビン酸オキシダーゼがより安定に存在していることが明白であった。
またアスコルビン酸オキシダーゼ、プロテアーゼの種類に係わらず同様の効果が確認されていることも明白である。
<反応液組成>
R-1 蛋白質分解試薬
150mM 各種緩衝液 pH8.0
2500U/ml プロテアーゼタイプXXIV(シグマ社製)
2.0mM 4-アミノアンチピリン(和光純薬社製)
10U/ml アスコルビン酸オキシダーゼ(東洋紡社製)
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
150mM HEPES緩衝液(和光純薬社製)pH7.5
6.0mM TOOS(同人化学研究所社製)
24U/ml R-FOD(旭化成社製)
20U/ml POD(シグマ社製)
R-1 蛋白質分解試薬中の緩衝剤としてはEPPS、HEPES、HEPPSO、Tris及びPOPSOを用いた。
<コントロール基質溶液、アスコルビン酸添加基質溶液>
ヒトプール血清9容に1容のアスコルビン酸(国産化学社製)1g/dlを添加しアスコルビ
ン酸添加基質溶液とした。アスコルビン酸の代わりに蒸留水を添加したものをコントロール基質溶液とした。
<反応手順>
37℃にインキュベートされたR-1;240μlにコントロール基質溶液若しくはアスコルビン酸添加基質溶液8μlを添加し、37℃で反応を開始し、正確に5分後にR-2;80μlを添加した。R-2添加前及び添加5分後の555nmの吸光度を測定した。また基質溶液の代わりに蒸留水を用いた測定をブランクとし、コントロール基質溶液、アスコルビン酸添加基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いたΔA0を算出した。一方同じ反応液R-1を室温にて24時間保存し同様の測定を行いΔA24を算出した。コントロール基質溶液から得られた吸光度変化を100としてアスコルビン酸添加基質溶液から得られたΔA0及びΔA24の割合を計算した。結果を図4に示す。
たないTris及びPOPSOにおいて室温-24時間保存後にも変化なく、一方EPPS、HEPES及びHEPPSOを用いた4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持つ緩衝剤の系ではアスコルビン酸処理能が室温-24時間保存後にはほとんど観察されなかった。以上の結果からプロテアーゼとアスコルビン酸オキシダーゼが共存する糖化蛋白質測定試薬に於いても4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持つ緩衝剤に用いた場合よりも、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持たない緩衝剤に用いた場合アスコルビン酸オキシダーゼがより安定に存在していることが明白であった。
また本結果から糖化アルブミン、フルクトサミン及び糖化へモグロビンの測定に関し本発明が有用であることも明白である。
<反応液組成>
R-1 前処理試薬
10mM Tris-HCl緩衝液 pH8.0 + 各濃度の蛋白質変性剤及び/または、S-S 結合を有する化合物、対照としては蒸留水を添加した。
R-2 アルブミン発色試薬
200mM コハク酸緩衝液(和光純薬社製)pH5.5
0.15mM ブロモクレゾールパープル(和光純薬社製)
0.3% Tx-100(和光純薬社製)
R-1 前処理試薬中の蛋白質変性剤及び/または、S-S結合を有する化合物として以下
の1)〜9)を用いた。
1) 6,6'-ジチオジニコチン酸(6,6'-dithiodinicotinic acid;100mM)
2) 3,3'-ジチオジプロピオン酸(3,3'-dithiodipropionic acid;100mM)
3) 2,2'-ジチオジサリチル酸(2,2'-dithiodibenzoicacid;100mM)
4) 4,4'-ジチオジモルホリン(4,4'-dithiodimorpholine;100mM)
5) DTNB(50mM)
6) DDD(33mM)
7) 2-PDS(25mM)
8) 4-PDS(50mM)
9) SDS(0.3%)
1)〜5)和光純薬社製、6)〜9) 同人化学研究所社製
<試料>
グリコアルブミン、ノングリコアルブミン、健常者血清、患者血清を試料として、ブランクとしては蒸留水を用いた。グリコアルブミン、ノングリコアルブミンはヒト血清よりアルブミンを公知の方法で精製し、ホウ酸固定化樹脂を用いて精製した。
<反応手順>
37℃にインキュベートされた前処理試薬;160μlに試料2μlを添加し、37℃で反応を開
始し、正確に5分後にアルブミン発色試薬;160μlを添加した。アルブミン発色試薬添加前及び添加5分後の600nmの吸光度を測定した。また試料の代わりに蒸留水及びアルブミン濃度が既知である試料から検量線を作成しアルブミン測定値を求めた。またラテックス試薬を用いた免疫法(LX試薬、栄研社製、Alb-II)を別途測定し、コントロールとした。結果を表5に示す。
。また、蛋白質変性剤及び/または、S-S結合を持つ化合物にて前処理することにより
免疫法との乖離は有意に小さくなった。なかでも2,2'-ジチオサリチル酸、4,4'-ジチオジモルホリン、DDD、2-PDS、4-PDS、DTNB及びラウリル硫酸ナトリウムの効果が顕著であっ
た。このことから、糖化アルブミン割合を測定する際に使用するアルブミン試薬として、蛋白質変性剤及び/または、S-S結合を持つ化合物にて前処理し、続いて若しくは同時
にBCPを作用させてアルブミンを測定する方法を用いることにより、NGAにより負の誤差を与える現象が回避され、正確に糖化アルブミン割合が測定できることが明白となった。
<反応液組成>
R-1 蛋白質分解試薬
150mM Tris-HCl緩衝液 pH8.5
5000PU/ml プロテアーゼタイプXXIV(シグマ社製)
8mM 4-アミノアンチピリン(同人化学研究所社製)
15U/ml パーオキシダーゼ
1.0% 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキ
シ-1-プロパン(シグマ社製)+ 各濃度のプロテアーゼ安定化剤、対照 としては蒸留水を添加した。
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
150mM Tris-HCl緩衝液 pH8.5
24U/ml R-FOD-II(旭化成社製)
12mM TOOS(同人化学研究所社製)
前処理試薬中のプロテアーゼ安定化剤として以下の1)〜7)を用いた。
1) 0.5mM 塩化マグネシウム
2) 10mM 塩化カルシウム
3) 100mM 塩化ナトリウム
4) 0.1% エチレングリコール(EtGly)
5) 10% ジメチルスルホオキシド(DMSO)
6) 1% エタノール(EtOH)
7) 0.1% ラウリル硫酸トリアタノールアミン(TEALS)
1)〜7)和光純薬社製
<試料>
5g/dl HSA(シグマ社製;LOT38H7601)
<反応手順>
37℃にインキュベートされた蛋白質分解試薬;240μlに試料8μlを添加し、37℃で反応
を開始し、正確に5分後に糖化アミノ酸測定試薬;80μlを添加した。糖化アミノ酸測定試
薬添加前及び添加5分後の546nmの吸光度を測定した。また基質溶液の代わりに蒸留水を用いた測定をブランクとし、基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いたΔA0を算出した。一方同じ反応液蛋白質分解試薬を37℃にて24時間保存し同様の測定を行いΔA24を算出した。安定化剤なしで、かつ保存なしの場合のΔA0を100%として、安定化剤有り、無しの場合の相対感度を算出した。結果を図5に示す。
してはほとんど性能低下は観察されなかった。さらにDMSO及び塩化カルシウムは安定性試験を継続した結果、37℃−4週間保存でも性能低下が観察されず、液状、冷蔵で1年以上の保存安定性を有することが明らかとなった。
<反応液組成>
R-1 蛋白質分解試薬
150mM Tris-HCl緩衝液 pH8.5
8mM 4-アミノアンチピリン(同人化学研究所社製)
15U/ml パーオキシダーゼ
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
150mM Tris-HCl緩衝液 pH8.5
24U/ml R-FOD-II(旭化成社製)
12mM TODB(同人化学研究所社製) + 各濃度のプロテアーゼ安定化剤、対照 としては蒸留水を添加した。
糖化アミノ酸測定試薬中の少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の定化剤として以下の1)〜15)を用いた。
1) 5% マンニトール
2) 5% ソルビトール
3) 5% スクロース
4) 5% トレハロース
5) 0.5mM 塩化カルシウム
6) 0.5mM 塩化マグネシウム
7) 3% L-グルタミン酸(Glu)
8) 3% L-グルタミン(Gln)
9) 3% L-プロリン(Pro)
10) 3% L-アラニン(Ala)
11) 3% L-バリン(Val)
12) 3% グリシン(Gly)
13) 3% L-リジン(Lys)
14) 3% ザルコシン
15) 100mM 硫安
1)〜14)和光純薬社製
<試料>
0.5mM FZL
<反応手順>
37℃にインキュベートされた蛋白質分解試薬;240μlに試料8μlを添加し、37℃で反応
を開始し、正確に5分後に糖化アミノ酸測定試薬;80μlを添加した。糖化アミノ酸測定試
薬添加前及び添加5分後の546nmの吸光度を測定した。また基質溶液の代わりに蒸留水を用いた測定をブランクとし、基質溶液から得られた吸光度変化からブランク試料の吸光度変化を差し引いたΔA0を算出した。一方同じ反応液糖化アミノ酸測定試薬を37℃にて2日間保存し同様の測定を行いΔA24を算出した。安定化剤なしで、かつ保存なしの場合のΔA0
を100%として、安定化剤有り、無しの場合の相対感度を算出した。結果を図6に示す。
配列表配列番号5の塩基配列の1から30の配列を有するオリゴヌクレオチドと配列表配
列番号6の塩基配列の1から30の配列を有するオリゴヌクレオチドの合成を外部委託(BEX社)し、さらにフザリウム・オキシスポルムIFO-9972株由来のFOD蛋白質をコードするDNAを鋳型にして、Taqポリメラーゼキット(宝酒造社製)を用いて添付のマニュアルに従っ
てPCRを実施し、FOD構造遺伝子を増幅した。この際、反応液中に最終濃度0.5mM相当の2
価マンガンイオンを添加し、塩基をdATP:0.51mM、dCTP:0.20mM、dGTP:1.15mM、dTTP:3.76mMと濃度を偏在させて反応を実施し、変異導入効率を高めた。
実施例13により増幅したFOD遺伝子含有DNAフラグメントを制限酵素NcoIとEcoRIで消
化し、同じ制限酵素で処理したプラスミドoTV119N(宝酒造社製)に組み込み、エシェリ
ヒア・コリJM109株(東洋紡績社製)に導入し、100μg/mlアンピシリン含有LB寒天平板培地(DIFCO社製)上、37℃で一晩培養して形質転換体のコロニーを形成させた。
実施例14で用意したライブラリーのコロニーを2枚の100μg/mlアンピシリンと1mMのIPTG(和光純薬社製)を含有するLB寒天平板培地にレプリカし、それぞれの培地上に5U/mlのパーオキシダーゼ(旭化成社製)、0.02%のオルトジアニシジン(和光純薬社製)、2.0mMの糖化バリンまたは糖化リジン(ハシバらの方法(Hashiba,H.(1976) J.Agric.Food Chem., 24, 70)により調製)を含有するLB寒天(0.3%)培地を重層し、37℃で8時間培養して糖化アミノ酸のFODによる酸化で発生する酸素ラジカルとジアニシジンによるコロニーの発色を観察した。これにより糖化リジンで暗紫色に発色し、糖化バリンで発色しないコロニーをスクリーニングし、該当するコロニーを164株得た。
実施例15で得た変異体コロニー164株を50μg/mlのアンピシリンと1mMのIPTGを含有する3.7%のBHI(DIFCO社製)液体培地1.5mlで30℃、16時間培養し、そのうち1mlを遠心分
離(15,000G、1分、4℃)により集菌し、200μlの10mMのトリス塩酸緩衝液(pH8.0)を加え、超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離(14,000G、5分、4℃)し、上清
を取得して細胞抽出液とした。
実施例16で調製した細胞抽出液について、含有するFOD変異組換え体の糖化アミノ酸
基質特異性を、前述のFOD酵素活性測定法によって測定した。その結果、候補株の中に糖
化バリンへの活性が糖化リジンの活性の1000分の1未満となっている変異体を2つ確認し、目的の変異体とした。
実施例17で選ばれた変異体を50μg/mlのアンピシリン含有LB液体培地1.5mlに植菌し37℃で16時間振盪培養した後、常法に従ってプラスミドを抽出した。このプラスミドをpcmFOD1及びpcmFOD2と命名した。
実施例18で得られた変異FOD遺伝子についてジデオキシ法により塩基配列を決定した
。その結果、2つの変異体は同じ構造を有し、配列表配列番号1の塩基配列1115のAがGに
変換され、コードされる組換え変異FODのアミノ酸配列が配列表配列番号1のアミノ酸配
列372番のリジンがアルギニンに変換されていることを確認した。
実施例19で確認されたアミノ酸変異箇所について、他のアミノ酸への置換の効果を観察するためにKunkelらの部位特異的変異法を行った。配列表配列番号7記載の塩基配列の1から27までの配列を有するオリゴヌクレオチドの合成を外部に委託(BEX社)し、さらにMutan-Kキット(宝酒造社製)を使用して、添付されたマニュアルに従って部位特異変異
を行った。取得した変異遺伝子は再び発現プラスミドpTV119Nに組み込み、大腸菌宿主に
導入して50μg/mlのアンピシリンと1mMのIPTGを含有する3.7%のBHI液体培地で30℃、16
時間培養し、変異FOD蛋白を生産させた。以上のようにして得られた複数の変異体につい
て実施例16、17と同様の方法で基質特異性を測定したところ、アルギニン以外にトリプトファン、メチオニン、スレオニン、バリン、アラニン、セリン、システイン、グリシンに変換した変異体がアルギニンに変換した変異体と同様の糖化リジン特異的な基質特異性を有していることを確認した。この結果を表6に示す。
スミドをpcmFOD4、バリンへの変異体をFOD-V、FOD-Vを生産する発現プラスミドをpcmFOD5と命名した。図7に各プラスミドの共通構造を示す。
反応液1
50mMのトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)
10U/mlのFOD-V
5U/mlのカタラーゼ
反応液2
50mMのトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)
10U/mlのFOD
20U/mlのペルオキシダーゼ
0.05%のアジ化ナトリウム
0.04%の4−アミノアンチピリン
0.04%のTOOS
被検液:0.3mMのZFL溶液に終濃度が0、0.1、0.2、0.3mMとなるようにFVを添加したもの。
0.5mlの反応液1を37℃、5分間、予備加温した後、0.05mlの上記被検液を添加して、37
℃、5分間反応させ、0.5mlの反応液2を添加し、5分後に555nmにおける吸光度を測定する
。ブランクには被検液の変わりに蒸留水を使用する。また対照として、反応液1のFOD-Vを添加していない反応液を用いて同様に操作した。
図8の白丸はFOD-V無添加を、白四角はFOD-Vを添加した場合の測定値をそれぞれ示す。
のZFLを消去した後に、FVを定量的に測定することができた。
なお、配列表配列番号1のアミノ酸配列372番目のリジンをトリプトファン、メチオニン及びバリンに変換した配列をそれぞれ配列表配列番号2、3及び4に示す。
R-1 蛋白質分解試薬
50mM POPSO酸緩衝液(和光純薬社製)pH7.5
2500U/ml プロテアーゼタイプXXIV(シグマ社製)
1% 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキシ- 1-プロパン(シグマ社製)
5U/ml アスコルビン酸オキシダーゼ(ロシュ社製)
5% DMSO
5mM 4-アミノアンチピリン
R-2 糖化アミノ酸測定試薬
150mM HEPES酸緩衝液(和光純薬社製)pH7.5
5mM TODB
10U/ml POD
20U/ml R-FOD-II
3% グルタミン酸
R-3 アルブミン前処理試薬
10mM Tris-HCl緩衝液 pH8.0
0.3% ラウリル硫酸ナトリウム
R-4 アルブミン発色試薬
200mM コハク酸緩衝液(和光純薬社製)pH5.5
0.15mM ブロモクレゾールパープル(和光純薬社製)
0.3% Tx-100(和光純薬社製)
<試料>
1:健常者及び糖尿病患者血清各35検体
2:キャリブレーターは管理血清H(ビー・エム・エル社製)を用いた。
キャリブレーターのグリコアルブミン濃度は臨床検体のHPLC法測定値 と酵素
法の測定値が一致するようにあらかじめ設定した。アルブミン値はCRM4 70の値を移した。
<反応手順>
37℃にインキュベートされたR-1;240μlに試料8μlを添加し、37℃で反応を開始し、正確に5分後にR-2;80μlを添加した。R-2添加前及び添加5分後の555nmの吸光度変化を測定
した。別途管理血清H、蒸留水を測定し検量線を作成し、検体中の糖化アルブミン濃度を算出した。
一方37℃にインキュベートされたR-3;アルブミン前処理試薬;160μlに試料2μlを添加
し、37℃で反応を開始し、正確に5分後にR-4;アルブミン発色試薬;160μlを添加した。アルブミン発色試薬添加前及び添加5分後の600nmの吸光度を測定した。また試料の代わりに蒸留水及びアルブミン濃度が既知である試料から検量線を作成しアルブミン測定値を求めた。
酵素法によるGA%はGA%=GA濃度/アルブミン濃度×100より求めた。またHPLC法測定値はハイオートジー・エイ・エイ2000(アークレイ社製)を用いて測定した。結果を図9に示す。
薬全てを液状で37℃-2週間保存しても性能に変化はなかった。この事から1)グロブリン成分及びアスコルビン酸の影響回避、2)プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化、3)正確にアルブミンを測定、4)糖化ヘモグロビンの影響回避を行うことにより正確に糖化アルブミンを測定していること及び糖化アルブミン割合を測定していることが明らかであった。
R-1
200mM POPSO 緩衝液 pH7.5
5mM 4‐アミノアンチピリン
10 U/ml POD
20 U/ml R‐FOD
5 U/ml アスコルビン酸オキシダーゼ
3% グルタミン酸
R-2
20mM ピベラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸)緩衝液 pH6.5
20% DMSO
8000 U/ml プロテアーゼタイプXXIV
4% 硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2ハイドロキシ-
1-プロパン
5 mM TODB
R-3,4 実施例22に同じ
<試料>実施例22に同じ試料及び10−200μMのFZL
<反応手順>実施例22に同じ
結果を図10に示す。
また本試薬とHPLC法との相関は、
酵素法GA%=1.03*HPLC法GA%−0.3 R=0.99と良好な相関を示し、正確に糖化蛋白質が測定されていることも明らかであった。さらに本試薬は液状で37℃−3週間若しくは冷蔵15ケ月保存しても性能の低下はなかった。
[寄託生物材料への言及]
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵便番号305-8566)
ロ イの機関に寄託について付した日付(原寄託日)
平成13年1月16日
ハ イの機関に寄託について付した受託番号
FERM BP-7847
(2)イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵便番号305-8566)
ロ イの機関に寄託について付した日付(原寄託日)
平成13年1月16日
ハ イの機関に寄託について付した受託番号
FERM BP−7848
Claims (39)
- プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する組成物において、プロテアーゼと
1) デオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、オクチルグルコ
シド、第四級アンモニウム塩、第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤、コンカナバリンA若しくはベタインのなかから選択される1種以上、
及び/または
2) アスコルビン酸オキシダーゼ及び4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持たない緩衝剤、
を共存させることを特徴とする糖化蛋白質を測定するための組成物。 - デオキシコール酸アミドがビスグルコナミドプロピルデオキシコーラミドであり、コール酸アミドが硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキシ-1-プロパン若しくはビ
スグルコナミドプロピルコーラミドである請求の範囲第1項に記載の組成物。 - 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持たない緩衝剤がトリスヒドロキシメチ
ルアミノメタン若しくはピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸)である請求の範囲第1項に記載の組成物。 - 糖化蛋白質が糖化アルブミンであり、別途アルブミンを測定する組成物を含み、アルブミンに対する糖化アルブミンの糖化割合を測定する組成物において、アルブミン測定用組成物が、蛋白質変性剤及び/またはS−S結合を有する化合物及びブロムクレゾ−ルパープルを含有する請求の範囲第1〜3項のいずれかに記載の組成物。
- プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化アルブミンを測定し、別途アルブミンを測定しアルブミンに対する糖化アルブミンの糖化割合を算出するための組成物において、アルブミン測定用組成物が、蛋白質変性剤及び/または、S−S結合を有する化合物びブロムクレゾ−ルパープルを含有することを特徴とする組成物。
- 蛋白質変性剤及び/またはS−S結合を有する化合物が、2,2'-ジチオジサリチル酸(2,2'-dithiodibenzoicacid)、4,4'-ジチオジモルホリン(4,4'-dithiodimorpholine)、2,2'-ジヒドロキシ-6,6'-ジナフチルジスルフィド(2.2'-dihydroxy-6,6'-dinaphthyl disulfide; DDD)、2,2'-ジチオジピリジン(2,2'-dithiopyridine; 2-PDS)、4,4'-ジチオジピリジ
ン(4,4'-dithiopyridine; 4-PDS)、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid); DTNB)若しくはラウリル硫酸ナトリウムである請求の範囲第4
項または第5項に記載の組成物。 - プロテアーゼにジメチルスルホオキシド、アルコール、水溶性カルシウム塩、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤より選ばれるプロテアーゼ安定化剤を添加する請求の範囲第1〜6項のいずれかに記載の組成物。
- プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する組成物であって、ジメチルスルホオキシド、アルコール、水溶性カルシウム塩、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤より選ばれるプロテアーゼ安定化剤を含有することを特徴とする糖化蛋白質を測定するための組成物。
- 少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素に糖アルコール、スクロース、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンより選ばれる少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化剤を添加する請求の範囲第1〜8項のいずれかに記載の組成物。
- プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する組成物であって、糖アルコール、スクロース、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンより選ばれる少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化剤を含有することを特徴とする糖化蛋白質を測定するための組成物。
- プロテアーゼがバチルス属由来のプロテアーゼである請求の範囲第1〜10項のいずれかに記載の組成物。
- 少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素が配列表配列番号1のアミノ酸配列の372番目のリジンを他のアミノ酸に置換することにより糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼである請求の範囲第1〜11項のいずれかに記載の組成物。
- 他のアミノ酸としてトリプトファン、メチオニン若しくはバリンに置換された変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いる請求の範囲第12項に記載の組成物。
- 組成物が液状品である請求の範囲第1〜13項のいずれかに記載の組成物。
- プロテアーゼ及び少なくともと糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する組成物であって、第1試薬に少なくともと糖化アミノ酸に作用する酵素、第2試薬にプロテアーゼを含有することを特徴とする組成物。
- 組成物が液状品である請求の範囲第15項に記載の組成物。
- 配列表配列番号1のアミノ酸配列の372番目のリジンを他のアミノ酸に置換することにより糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
- 他のアミノ酸がトリプトファン、メチオニン若しくはバリンである請求の範囲第17項に記載の変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
- プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する方法において、プロテアーゼ反応時に、
1) デオキシコール酸、デオキシコール酸アミド、コール酸アミド、第四級アンモニ
ウム塩、第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤、コンカナバリンA、オクチルグルコシド若しくはベタインから選択される1種以上を共存させることにより、プロテアーゼのグロブリン成分への作用を低下し、
及び/若しくは
2) アスコルビン酸オキシダーゼを4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持たない緩衝剤中で作用させ、アスコルビン酸の消去及び蛋白質の断片化を同時に行い、
糖化蛋白質を測定する方法。 - デオキシコール酸アミドがビスグルコナミドプロピルデオキシコーラミドであり、コール酸アミドが、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン、硫酸-3-[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ハイドロキシ-1-プロパン若しくは
ビスグルコナミドプロピルコーラミドである請求の範囲第19項に記載の方法。 - 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル基を持たない緩衝剤がトリスヒドロキシメチ
ルアミノメタン若しくはピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸)である請求の範囲第19項に記載の方法。 - 糖化蛋白質がアルブミンであり、別途アルブミンを測定し、アルブミンに対する糖化アルブミンの糖化割合を算出する糖化アルブミン測定方法において、アルブミン測定のさい、被検液を、蛋白質変性剤及び/またはS−S結合を有する化合物にて前処理を行い、同時若しくは続いてブロモクレゾ−ルパープルを用いてアルブミンを測定する請求の範囲第19〜21項のいずれかに記載の方法。
- 被検液に、プロテアーゼを作用させアルブミンの断片化を行い、次いで少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化アルブミンを測定し、この値を別途ブロモクレゾールパープルを用い測定したアルブミンで除しアルブミンに対する糖化アルブミン割合を算出する方法において、蛋白質変性剤又は/及びS−S結合を有する化合物にて前処理を行い、同時若しくは続いてアルブミンを測定することを特徴とする方法。
- 蛋白質変性剤又は/及びS−S結合を有する化合物が、2,2'-ジチオジサリチル酸(2,2'-dithiodibenzoicacid)、4,4'-ジチオジモルホリン(4,4'-dithiodimorpholine)、2,2'-ジヒドロキシ-6,6'-ジナフチルジスルフィド(2.2'-dihydroxy-6,6'-dinaphthyl disulfide; DDD)、2,2'-ジチオジピリジン(2,2'-dithiopyridine; 2-PDS)、4,4'-ジチオジピリジン(4,4'-dithiopyridine; 4-PDS)、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid); DTNB)若しくはラウリル硫酸ナトリウムである請求の範囲第22項または第23項に記載の方法。
- プロテアーゼにジメチルスルホオキシド、アルコール、水溶性カルシウム塩、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤より選ばれるプロテアーゼ安定化剤を添加する請求の範囲第19〜23項のいずれかに記載の方法。
- プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する方法に於いて、プロテアーゼにジメチルスルホオキシド、アルコール、水溶性カルシウム塩、食塩、第四級アンモニウム塩若しくは第四級アンモニウム塩型陽イオン界面活性剤より選ばれるプロテアーゼ安定化剤を添加することを特徴とする、糖化蛋白質を測定する方法。
- 少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素に、糖アルコール、スクロース、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンより選ばれる安定化剤を添加する請求の範囲第19〜26項のいずれかに記載の方法。
- プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する方法に於いて、少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素に糖アルコール、スクロース、水溶性マグネシウム塩、水溶性カルシウム塩、硫安、アミノ酸、ザルコシンより選ばれる糖化アミノ酸に作用する酵素の安定化剤を添加することを特徴とする、糖化蛋白質を測定する方法。
- プロテアーゼがバチルス属由来のプロテアーゼである請求の範囲第19〜28項のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素が配列表配列番号1のアミノ酸配列372番目のリジンを他のアミノ酸に置換することにより糖化バリン反応性を著しく低下させた変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼである請求の範囲第19〜29項のいずれかに記載の方法。
- 他のアミノ酸としてトリプトファン、メチオニン若しくはバリンを用いて置換した変異型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いる請求の範囲第30項に記載の方法。
- 組成物が液状品である請求の範囲第19〜31項のいずれかに記載の方法。
- 試料に、少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素、次いでプロテアーゼを作用させ、糖化蛋白質を測定する請求の範囲第32項に記載の方法。
- プロテアーゼ及び少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素を用いて糖化蛋白質を測定する方法において、少なくとも糖化アミノ酸に作用する酵素、次いでプロテアーゼを作用させることを特徴とする糖化蛋白質を測定する方法。
- 第1試薬にε−フルクトシルリジンに作用する酵素、第2試薬にフルクトシルバリンに作用する酵素を含有する、糖化リジンと糖化バリンを含有する試料中の糖化バリンを測定する組成物であって、第1試薬に用いる酵素が糖化バリンと反応しないフルクトシルアミノ酸オキシダーゼで、第2試薬に用いる酵素が糖化バリンと反応するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする組成物。
- フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが配列番号1のアミノ酸配列の372番目のリジンを他のアミノ酸で置換することにより糖化バリンの反応性を著しく低下させたものである、請求項35に記載の組成物。
- 糖化リジンと糖化バリンを含有する試料中の糖化バリンを測定する方法であって、
1)ε−フルクトシルリジンを消去するために糖化バリンと反応しないフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと試料中の糖化リジンを反応させる第1反応、
2)糖化バリンと反応するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼと試料中の糖化バリンを反応させ、それによって試料中のフルクトシルバリンを定量する第2反応
を含む方法。 - さらに糖化リジンとフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの反応中に生成した過酸化水素の分解反応を含む請求項37の方法。
- 分解反応がカタラーゼによって達成される請求項38に記載の方法であって、さらに第2反応にカタラーゼ阻害剤を添加することを特徴とする糖化リジンと糖化バリンを含有する試料中の糖化バリンを測定する方法。
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