CN102337325A

CN102337325A - 测定糖化蛋白质的组合物

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Publication number: CN102337325A
Application number: CN201110324349.7A
Authority: CN
Inventors: 高妻卓司; 芳陵一生; 荒井基夫; 炭谷顺一; 今村茂行
Original assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Current assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Priority date: 2001-01-31
Filing date: 2002-01-30
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2022-01-30
Also published as: ES2502481T3; US7250269B2; HK1132329A1; EP2107376B1; US8105800B2; EP2107376A3; CN102899388B; CN100430488C; JP2009034110A; EP1362925B1; JP5187692B2; CN102505042A; EP2107123A3; CN1501981A; EP2107376A2; JP4278066B2; JP5036753B2; JP2009000128A; WO2002061119A1; US20110312009A1

Abstract

本发明提供用于精确测定糖化蛋白质的组合物，该组合物可：1)消除球蛋白和抗坏血酸组分的影响；2)使蛋白酶和能够至少与糖化氨基酸反应的酶保持稳定；3)精确测定清蛋白；和4)测定糖化清蛋白并同时消除糖化血红蛋白的影响，本发明还提供了测定方法。因此，能够更精确地确定糖化蛋白质和糖化清蛋白的含量。

Description

测定糖化蛋白质的组合物

本申请是中国专利申请02806704.5(其分案申请的申请号200810144943.6)的分案申请，原申请的申请日是2002年1月30日，发明名称是“测定糖化蛋白质的组合物”。

发明领域

本发明涉及一种用于测定糖化蛋白质的组合物和一种测定糖化蛋白质的方法。可将本发明用于测定糖化蛋白质的组合物和方法应用于临床检查，其能够精确地测定糖化蛋白质。

发明背景

在糖尿病的诊断和控制中测定糖化蛋白质是非常重要的。对能够反应过去约1至2个月的平均血糖值的糖化血红蛋白(GHb)，能反应过去约2周的平均血糖值的糖化清蛋白(GA)，一般地指示血清中具有还原能力的糖化蛋白的果糖胺(FRA)等可每天进行测定。GHb是血红蛋白的糖化产物，即在血红蛋白β-链上N-末端缬氨酸的α-氨基基团被糖化。GA和FRA分别是清蛋白和血清蛋白的糖化产物，即清蛋白或血清蛋白的赖氨酸残基上的ε-氨基基团被糖化。

酶学方法是一种简易且便宜的精确测定糖化蛋白质的方法。日本专利申请公开No.6-46846，No.5-192193，No.2-195900和No.2-195899，以及国际专利申请公布号WO98/48043和WO97/13872是公开此酶学方法的文献实例。

然而，为提供一种精确测定糖化蛋白质的组合物，有必要1)消除球蛋白组分和抗坏血酸的影响以及2)使蛋白酶和能够至少与糖化氨基酸反应的酶保持稳定。此外，如果糖化蛋白是糖化清蛋白，则3)精确测定清蛋白和4)消除糖化血红蛋白的影响也很重要。

1)消除球蛋白组分和抗坏血酸的影响的常规方法

已知糖尿病患者的球蛋白的量能够改变和影响FRA的值[Rodrigues，S.等，临床化学(Clin.Chem.)35：134-138(1989)]。本发明人研发了一种方法，其中通过向蛋白酶反应液中加入特定金属离子和蛋白质A或G可选择性地抑制蛋白酶对球蛋白组分的作用(日本专利申请No.11-231259)。利用此发明的方法，可以测定糖化蛋白而不会受到球蛋白组分的影响。应用于此方法中的球蛋白选择性蛋白酶抑制剂可提及的有金属、蛋白A和蛋白G。在此专利申请所述的金属中，强效金属是那些可能会导致环境安全问题的重金属。而弱效金属如果与其它试剂(或组合物)结合可能导致试剂溶液浑浊。另外，蛋白A和蛋白G都是非常昂贵的试剂。

作为选择性吸附血液中球蛋白的方法，已知血液处理剂利用色谱学原理以及具有类固醇骨架的引入了配体的乙烯共聚物可对血液中的内毒素和球蛋白进行吸附(日本专利申请公开No.61-94663)。然而，在日本专利申请公开No.61-94663的实施例中附表1所示的结果表明只有α1-球蛋白和α2-球蛋白被证明可被吸附，而占球蛋白组分70％或更多的γ-球蛋白不能被吸附。假设γ-球蛋白被吸附，则不会期望血液处理试剂具有抑制蛋白酶对γ-球蛋白的作用的能力。

近年来，大量抗坏血酸作为增补物被摄取的情况越来越多。含有高浓度抗坏血酸的临床样品也在增加。抗坏血酸由于具有强还原性而对临床检查造成多种影响。

作为消除抗坏血酸影响的方法，已知可通过化学或利用抗坏血酸氧化酶的酶学方法去除样品中的抗坏血酸。从对显色系统引起较小影响来考虑，当利用至少与糖化氨基酸反应的酶对利用蛋白酶断裂糖化蛋白质所产生的糖化氨基酸进行检测时，优选预先地在与蛋白酶反应时利用抗坏血酸氧化酶(ASOx)去除抗坏血酸的方法。

作为蛋白酶存在时利用ASOx去除样品中抗坏血酸的实例，对在pH8.0的2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸(HEPES)缓冲液中使ASOx与样品溶液反应的实验已有报道(Clinical Chemistry(临床化学)，27：99-106，1998)。文献报道经过两周的冷藏后处理抗坏血酸的能力没有变化。

然而，本发明人的研究表明当HEPES缓冲液(pH8.0)、蛋白酶和ASOx存在时，在37℃下贮藏一天或在10℃下贮藏两周后抗坏血酸处理能力已经几乎完全丧失。

2)用于稳定蛋白酶和至少与糖化氨基酸反应的酶的现有技术

用于糖化蛋白质的临床检测的蛋白酶溶液具有在其它领域如食品业中无法见到的极高浓度。已知蛋白酶在水溶液中能进行自消化。难以想象蛋白酶能以如此高浓度在水溶液中保持稳定。因此，在用于鉴定糖化蛋白的组合物中使用的蛋白酶以冻干产物形式提供。

目前尚没有用于测定糖化蛋白质的组合物及测定糖化蛋白质的方法能使其中的蛋白酶以液态形式保持稳定并可长期贮藏。目前也没有测定糖化蛋白质的组合物以及测定糖化蛋白质的方法能使其中的至少与糖化氨基酸反应的酶以液态形式保持稳定并可长期贮藏。

3)有关精确测定清蛋白的方法的现有技术

抗清蛋白抗体免疫和利用溴甲酚绿(BCG)、溴甲酚紫(BCP)的染色法等是测定清蛋白的方法。染色法由于操作简便成本低廉而被广泛用于每日检测中。虽然已经证实BCG对球蛋白组分的作用，但BCG的缺点是对清蛋白的专一性低。

另一方面，BCP尽管对清蛋白具有高专一性但易受到共存物质的影响。尤其是，BCP受到SH化合物的影响，从而导致测定结果依据清蛋白的氧化还原状态出现差异的问题。为解决这一问题，提出了在蛋白质变性剂和/或SH试剂存在时反应BCP的方法(日本专利申请公开No.10-232233)。然而，还没有关于BCP对GA和非糖化清蛋白(NGA)的反应性的研究实例。

4)消除糖化血红蛋白影响的现有技术

如上所述，GA是从清蛋白经ε-氨基的糖化衍生得到，而GHb是经糖化血红蛋白β-链上的N-末端缬氨酸的α-氨基得到。因此，如果GA作为测量对象，可能期望只测定ε-氨基被糖化的氨基酸。虽然已知有几种酶显示出对ε-氨基的高度专一性而且对糖化缬氨酸没有作用(日本专利申请公开No.11-243950)，但是没有一种酶的成本足够低廉以致可作为实际应用中的酶。其中，来自尖镰孢(Fusarium oxysporm)的果糖基氨基酸氧化酶(FOD)具有高反应性，是有用的。本发明人单独报道了FOD的基因(日本专利申请公开No.10-201473)。虽然利用此基因的方法产率高且能够以低成本生产FOD，但本发明人证实，其与α-氨基被糖化的糖化缬氨酸的反应性没有显示出令人满意的专一性。

发明详述

本发明的目的是为精确测定糖化蛋白质提供一种组合物，该组合物1)能够消除球蛋白组分和抗坏血酸的影响以及2)使蛋白酶和至少与糖化氨基酸反应的酶保持稳定，并提供一种稳定方法。本发明的另一目的是在糖化蛋白质是糖化清蛋白的情况下提供一种3)能够精确测定清蛋白并且4)能够消除糖化血红蛋白的影响的组合物，及提供一种消除糖化血红蛋白的影响的方法。

为精确测定糖化蛋白质，有必要1)消除球蛋白组分和抗坏血酸的影响以及2)使蛋白酶和至少与糖化氨基酸反应的酶保持稳定。此外，如果糖化蛋白是糖化清蛋白，则有必要3)准确测定清蛋白和4)消除糖化血红蛋白的影响。

1)消除球蛋白组分和抗坏血酸的影响的方法

本发明人经过广泛研究发现如果将选自脱氧胆酸，脱氧胆酰胺，胆酰胺，季铵盐，季铵盐类阳离子表面活性剂，伴刀豆凝集素A，辛基葡糖苷，和甜菜碱的一种或多种组分添加到蛋白酶反应溶液中，则可以选择性地抑制蛋白酶对球蛋白组分的作用，而且即使使至少与糖化氨基酸反应的酶直接与此反应溶液反应，也不会抑制此酶促作用而能简单且重复性极好地精确测定糖化蛋白。这些化合物具有经济方面的优点，与利用常规技术的方法相比没有环境和安全的问题，且与样品混合时不会产生混浊。

ASOx能有效除去抗坏血酸。然而，通常很难假定ASOx在含有大量蛋白酶的反应液中能保持稳定。实际上，根据本发明人对各种蛋白酶、蛋白酶抑制剂和各种ASOx的研究，尚未发现存在能使ASOx在含有大量蛋白酶的反应液中保持稳定的条件。

然而经过潜心研究，本发明人惊奇地发现ASOx的稳定性依据缓冲液的类型可以显著增加。

2)蛋白酶和至少与糖化氨基酸反应的酶的稳定

如上所述，在糖化蛋白的临床测定中使用的是高蛋白酶浓度的蛋白酶溶液。原则上，蛋白酶本身在这样的溶液中是不稳定的。然而，经过广泛研究，本发明人发现如果添加二甲基亚砜，醇，水溶性钙盐，氯化钠，季铵盐或季铵盐类阳离子表面活性剂，则蛋白酶的稳定性可以显著增加且蛋白酶能以高浓度溶液形式长期贮藏。

至少与糖化氨基酸反应的酶是不稳定的，因为如果以液态形式在37℃贮藏4天，酶活力将减少到初始活力的约10％。然而，经过广泛研究，本发明人发现如果将选自糖醇，蔗糖，水溶性镁盐，水溶性钙盐，硫酸铵，氨基酸和肌氨酸的稳定剂添加到至少与糖化氨基酸反应的酶中，则能够产生令人吃惊地高稳定作用以致酶以液态形式在37℃贮藏4天后酶活力几乎没有可见的减少。

此外，虽然蛋白酶在接近最适pH时显示出高的蛋白水解活力，但是同时发生的自体消化反应使得难于尤其以液态形式贮藏蛋白酶。然而，经过广泛研究，本发明人发现通过提供第一试剂(其被配制成能适当引起蛋白酶的反应)以及第二试剂(其被配制成能稳定液态蛋白酶)，蛋白酶可以稳定地贮藏且不受检测时条件的影响。本发明人还发现即使将用于预反应的酶掺入到第二试剂中，也可以进行精确测定而不影响测量结果。另外，如果将至少与糖化氨基酸反应的酶添加到第一试剂中，则可预先除去样品中的糖化氨基酸并选择性地测定糖化蛋白质。

3)精确测定清蛋白的方法

经本发明人的研究意外发现BCP与GA的反应性不同于BCP与NGA的反应性，而且如果有大量NGA存在，分析值会受到负面影响。经过广泛研究，本发明人发现可通过在测定清蛋白之前或同时以蛋白质变性剂和/或具有S-S键的化合物处理样品，实现对含有大量NGA的样品中的清蛋白的精确测定。

4)消除糖化血红蛋白的影响

基于对上述问题的大量研究，本发明人通过对来自尖镰孢IFO-9972菌株的FOD基因进行修饰制备出突变FOD并测定了突变FOD的性质，结果发现通过以另一个氨基酸替代从N-端算起的第372位赖氨酸可以使底物特异性发生明显改变。而且，本发明人还制备了几种对糖化缬氨酸仅显示出极低的反应性并几乎专一地与糖化赖氨酸进行反应的经修饰FOD。

根据上述结果发现的这些突变FOD由于以另一氨基酸替代SEQ IDNo.1所示氨基酸序列中的第372位赖氨酸，已经丧失了与糖化缬氨酸的反应性。具体来说，这些突变FOD为权利要求1所述的突变FOD，其是以色氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸替代SEQ ID No.1所示氨基酸序列中的第372位赖氨酸而得到的。

最后，综合上述发现，本发明人完成了用于精确测定糖化蛋白质的组合物和方法。

本发明的构成和优选实施方案将在下文进行详述。

任何蛋白酶都可应用于本发明，只要该蛋白酶能够有效地与包含在样品中的糖化蛋白质反应并有效地从糖化蛋白质产生糖化氨基酸和/或糖化肽即可。实例包括来源于动物，植物，和微生物如芽孢杆菌属(Bacillus)，曲霉属(Aspergillus)，青霉属(Penicillium)，链霉菌属(Streptomyces)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，梭菌属(Clostridium)，Lysobacter，Glifila，酵母属(Yeast)，麦轴梗霉属(Tritirachium)，栖热菌属(Thermus)，假单胞菌属(Pseudomonus)和无色杆菌属(Achromobacter)等的蛋白酶。

如果待测定的糖化蛋白是GA，则优选对人类清蛋白(Alb)具有高反应性的芽孢杆菌属或链霉菌属的微生物蛋白酶。如果待测定的糖化蛋白是GHb，则优选对人类血红蛋白(Hb)具有高反应性的芽孢杆菌属、曲霉属、链霉菌属或麦轴梗霉属的微生物蛋白酶。

本发明中对蛋白酶活性的测定如下。

《测定蛋白酶活性的方法》

在下列条件下，30℃一分钟给出相应于1μg酪氨酸的颜色改变的蛋白酶活性被指定为1PU(蛋白水解单位)。

<底物>0.6％乳酪蛋白(由Merck&Co.，Inc.生产)

<酶溶液>稀释至10-20PU

<酶稀释溶液>20mM乙酸缓冲液(pH 7.5)，1mM醋酸钙，100mM氯化钠

<反应终止溶液>0.11M三氯乙酸，0.22M醋酸钠，0.33M乙酸

<步骤>

将蛋白酶溶液溶解于酶稀释溶液中使其浓度为10-20PU/ml。取1ml此溶液置于试管中并加热到30℃。然后加入预热至30℃的5ml底物溶液。正好10分钟之后加入5ml反应终止溶液以终止反应。将混合物加热到30℃维持30分钟以使沉淀物沉积。通过Toyo滤器No.131(9cm)过滤混合物得到滤液。对于空白实验，在试管中将1ml蛋白酶溶液加热到30℃，加入5ml反应终止溶液，然后再加入5ml底物溶液，之后以同样的方法对沉淀物进行沉积和过滤。向2ml滤出液中加入5ml的0.55M碳酸钠溶液和1ml稀释3倍的福林试剂。30℃反应30分钟后，测定660nm的吸光度。通过从与酶反应的样品的吸光度中减去空白吸光度确定吸光度变化。然后利用单独绘制的标准活性曲线确定酶活性。

<标准活性曲线的绘制>

将浓度调节成约50PU/ml的酶溶液进行稀释以制备系列放大稀释的几个酶溶液，浓度在2-50PU/ml。对每一种酶溶液执行上述操作。沿纵轴绘制所得的吸光度变化，沿水平轴绘制稀释倍数。另一方面，标准酪氨酸溶液(酪氨酸浓度：9.09μg/ml)的制备是将L-酪氨酸溶于0.2N盐酸溶液使其浓度为0.01％再将10ml的0.2N盐酸溶液加入到1ml的L-酪氨酸溶液中得到。对2ml标准酪氨酸溶液和2ml的0.2N盐酸溶液执行上述测量操作。所得的吸光度变化对应于18.2μg的酪氨酸。将吸光度变化在上图中绘出。从绘制点引出的垂直线与水平轴的交点对应10PU/ml。

这些蛋白酶可以以在规定时段能够有效消化靶蛋白的任意浓度使用，例如通常为1-100,000PU/ml，优选10-10,000PU/ml。

对于可应用于本发明中至少与糖化氨基酸反应的酶，可选用能够同含在样品溶液中的糖化蛋白质所产生的糖化氨基酸或糖化肽进行有效反应并能够通过蛋白酶的作用实质上测定糖化蛋白质的任何酶。举例来说，至少与糖化氨基酸反应的酶可以是能够与α-氨基被糖化的氨基酸进行有效反应的酶，及能够与ε-氨基被糖化的氨基酸进行有效反应的酶，等等。

作为能够与ε-氨基被糖化的氨基酸进行有效反应的所述至少与糖化氨基酸反应的酶的实例，有来自赤霉属(Gibberella)，曲霉属，假丝酵母属(Candida)，青霉属，镰孢霉属(Fusarium)，顶孢霉属(Acremonium)或德巴利酵母属(Debaryomyces)的微生物的FOD。

作为能够与α-氨基被糖化的氨基酸进行有效反应的所述至少与糖化氨基酸反应的酶的实例，有来自棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物的酶。

另外，作为在蛋白酶存在时活性充足并且制备成本低的酶的实例，可提及通过基因重组产生的酮胺氧化酶(R-FOD，由Asahi Kasei公司生产)和与糖化缬氨酸的反应性极大降低的突变FOD(R-FOR-II，由Asahi kasei公司生产)。

编码来自尖镰孢IFO-9972菌株(其能产生R-FOD-II)的FOD蛋白的DNA，可利用常规方法从尖镰孢IFO-9972菌株中提取染色体DNA并利用PCR或杂交法分离出编码FOD蛋白的DNA来获得。

为了将突变引进所得的FOD基因中，可利用PCR法或定点诱变直接使DNA突变。如果利用随机诱变，则可以将DNA修复缺陷型大肠杆菌用作宿主，也可以对引入了FOD基因的宿主微生物在含有DNA诱变源的培养基中进行培养。

由此方法获得的突变FOD基因可利用合适的宿主-载体系统引入宿主微生物。利用表达载体的标记和FOD活性的表达或DNA探针作为指示对具有含FOD基因的重组DNA质粒的微生物进行筛选分离。通过培养基因重组微生物，从微生物中提取重组蛋白质，并纯化蛋白质而获得突变FOD。

获得突变FOD的一个具体方法如下所述。在以下步骤中，常规方法包括，例如，Maniatis等的方法(Maniatis，T.，等Molecular Cloning(分子克隆)。Cold Spring Harbor Labortory(冷泉港实验室)1982，1989)或在各种商品酶和试剂盒所附手册中描述的方法。

为了将突变引入分离出的FOD基因中，可在添加锰离子的条件下使用3′→5′修复缺陷聚合酶如Taq聚合酶进行PCR。或者，可以使用如下方法，即，将此FOD基因引入DNA修复缺陷的大肠杆菌宿主，在含有能引起基因突变的诱变源如联二茴香胺的培养基中培养宿主微生物，从产生的候选突变菌株中分离出获得靶底物专一性的突变体。

可通过双脱氧法(Sangar，F.(1981)Science(科学)，214，1205-1210)测定引入突变的基因的碱基序列，对由上述方法引进的FOD突变进行验证。

一旦突变已确定，还可以利用Zoller等的方法(Zoller，M.J.和Smith，M.(1983)，Methods in Enzymology(酶学方法)，154，367)通过定向诱变引进特异突变。

从突变基因的碱基序列可确定形成突变FOD的多肽的氨基酸序列突变。可通过将突变FOD基因加到适当宿主-载体系统中重组产生由上述方法获得的突变FOD。

对于突变FOD基因所掺入的载体，为基因重组用途从噬菌体或质粒构建出的能在宿主微生物中自主生长的载体是适用的。对于噬菌体载体，如以大肠杆菌微生物作为宿主微生物时，可利用如λgt·λC，λgt·λB等。对于质粒载体，如以大肠杆菌作为宿主微生物，优选利用如质粒pBR322，pBR325，pACYC184，pUC12，pUC13，pUC18，pUC19，pUC118，pIN I和Bluescript KS+；以枯草芽孢杆菌作为宿主微生物时，可利用pUB110和pKH300PLK；以放线菌(Actinomyces)作为宿主微生物时，可利用pIJ680和pIJ702；以酵母，尤其酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为宿主微生物时，可利用Yrp7，pYC1和Yep3。

为了将突变FOD基因掺入如此获得的载体中，载体和突变FOD基因都以适当的限制性内切酶进行消化以便产生出相同末端，然后按照常规方法利用DNA连接酶使含有突变FOD基因的DNA片断和载体片断进行连接。

任何微生物都可以作为宿主微生物向其中转入结合有突变FOD基因的载体，只要重组DNA能稳定自主地生长即可。当宿主微生物是属于大肠杆菌的微生物时，可使用如大肠杆菌DH1，大肠杆菌JM109，大肠杆菌W3110，大肠杆菌C600等。当宿主微生物是属于枯草芽孢杆菌的微生物时，可使用枯草芽孢杆菌ISW1214等。当宿主微生物是属于放线菌的微生物时，可使用铅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)TK24等。当宿主微生物是属于酿酒酵母的微生物时，可使用酿酒酵母INVSC1等。

对于将重组DNA掺入宿主微生物的方法，如宿主微生物属于大肠杆菌、酿酒酵母或铅青紫链霉菌，可例如按照常规方法将重组DNA转入已转变成感受态细胞的宿主微生物中。根据不同菌株类型可使用电穿孔。

为产生突变FOD，可在适当的培养基中对已经引入突变FOD基因的宿主微生物进行培养，收集培养细胞，通过在适当的缓冲液中超声粉碎或通过溶菌酶处理使细胞破碎以制备细胞提取物。可以添加信号序列以引起分泌表达，这样突变FOD将在培养液中积聚。

可通过常规的硫酸铵沉淀，凝胶过滤，柱纯化等方法分离纯化由此产生的突变FOD并作为一种酶制品提供。

在上述基因操作技术中一般按比例使用各组分，例如，对于源自微生物的0.1-10μg的DNA和载体DNA，使用约1-10U的限制性内切酶，约300U的连接酶，以及约1-10U其它酶。

作为包含突变FOD基因并能够产生突变FOD的转基因微生物的具体实例，有大肠杆菌JM109·pcmFOD3(FERM BP-7847)，即一种以大肠杆菌作为宿主微生物并具有包含突变FOD基因的质粒pcmFOD3的转基因微生物；大肠杆菌JM109·pcmFOD4，一种包含pcmFOD4的转基因微生物；以及大肠杆菌JM109·pcmFOD5(FERM BP-7848)，一种包含pcmFOD5的转基因微生物。这些质粒的结构如附图7所示。

2001年1月16日大肠杆菌JM109·pcmFOD3和大肠杆菌JM109·pcmFOD5由独立行政法人产业技术综合研究所国际专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，an IndependentAdministrative Institution)(日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，邮编305-8566(Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本))保藏，保藏号分别是FERM BP-7847和FERM BP-7848。

在从转基因微生物生产突变FOD时，在营养培养基中培养转基因微生物，以便在细胞或培养液中产生突变FOD，培养结束后通过过滤或离心培养液来收集细胞，经过机械法或利用溶菌酶的酶法等破碎细胞，任选地通过加入EDTA和/或适当表面活性剂对突变FOD的水溶液进行浓缩，然后利用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤、吸附层析如亲和层析或离子交换层析对浓缩物或非浓缩水溶液进行纯化，由此获得高纯度的突变FOD。

对转基因微生物的培养条件的选择要考虑微生物的营养和生理特点。通常，液体培养条件可在许多情况下应用。不过，深通气搅拌有利于工业生产。就培养基中的营养源来说，可利用常规应用于微生物培养的营养源。

任何可利用的碳氢化合物如葡萄糖，蔗糖，乳糖，麦芽糖，果糖和糖蜜都可作为碳源。任何可利用的氮化合物如蛋白胨，肉膏，酵母提取物和酪蛋白水解物都可作为氮源。

如需要，还可加入其它组分包括盐类如磷酸，碳酸，硫酸的盐，镁盐，钙盐，钾盐，铁盐，锰盐和锌盐，特定氨基酸和特定维生素。

培养温度可在微生物能进行生长和产生突变FOD的范围内适当变化。对大肠杆菌来说，优选温度范围是大约20-42℃。虽然根据培养条件培养时间可稍有差异，但可在突变FOD产量达到最大值的适当时间终止培养。对大肠杆菌来说，培养时间通常是12-48小时。培养基的pH可在微生物能进行生长和产生突变FOD的范围内适当变化。对大肠杆菌来说，优选pH范围是大约6-8。

培养基中的突变FOD可通过收集含有细胞的培养基就此进行利用。然而一般来说，如果突变FOD存在于培养液中，则利用从微生物细胞中经过滤或离心分离出的含突变FOD的溶液。如果突变FOD存在于细胞中，则通过过滤、离心或其它方法从所得培养液中收集细胞，然后任选地用机械法或利用溶菌酶的酶法等破碎细胞，再将突变FOD溶解于添加了螯合剂如EDTA和/或表面活性剂的水中以选择和收集突变FOD的水溶液。

可以通过减压或膜过滤浓缩这样获得的含突变FOD的溶液，进而通过硫酸铵，硫酸钠等作盐析处理以分级沉淀突变FOD。

然后可将沉淀物溶于水中并用半透膜透析以去除低分子量的杂质。或者，可通过利用吸附剂、凝胶过滤剂等的凝胶过滤、吸附层析如亲和层析或离子交换层析对含突变FOD的溶液进行纯化。可对经这些方法得到的含突变FOD的溶液进行减压浓缩，冷冻干燥或其它加工以提供纯化的突变FOD。

利用如下方法测定与糖化氨基酸反应的酶的活性。

《测定与糖化氨基酸反应的酶的活性的方法》

<反应溶液的组成>

50mM Tris缓冲液(pH 7.5)

0.03％4-氨基安替比林(4-AA)(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产)

0.02％苯酚(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产)

4.5U/ml过氧化物酶(POD)(由Sigma-Aldrich公司生产)

1.0mM α-苄酯基-ε-D-1-脱氧-果糖基赖氨酸或1-脱氧-果糖基缬氨酸(根据Hashiba等的方法(Hashiba，H.等，J.Agric.FoodChem.，24；70，1976)进行合成和纯化。以下分别简称“ZFL”和“FV”)。

将1ml上述反应溶液置于一个小试管中37℃预热5分钟，然后加入0.02ml适当稀释的酶溶液。搅拌混合物以引发反应。反应正好10分钟之后，加入2ml的0.5％SDS以终止反应。测定500nm波长下的吸光度(As)。作为空白实验，用0.02ml蒸馏水代替酶溶液进行同样操作以测定吸光度(Ab)。从酶反应后的吸光度(As)和空白实验的吸光度(Ab)的差值(As-Ab)确定酶活性。预先可利用过氧化氢的标准溶液确定吸光度和所产生的过氧化氢的相关性。在37℃一分钟内能产生1μmol过氧化氢的酶量被定义为1U。

计算表达式如下所示。

酶活性(U/ml)＝[(As-Ab)/12.0]×[3.02/0.02]×[1/10]×[2/B]

3.02：反应溶液总量(ml)

0.02：酶溶液总量(ml)

10：反应时间

2：表示从两个过氧化氢分子使4-AA和苯酚缩和产生1分子有色物质的系数

12.0：4-AA-苯酚的毫摩尔吸光系数

B：酶溶液的稀释放大倍数

经上述方法得到的突变FOD中，其中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第372位赖氨酸被色氨酸替代的突变FOD具有下列酶学性质。

(1)底物专一性

ZFL 100％

FV 0％

(2)酶反应

该酶反应至少催化α-氨基酸或ε-氨基酸的阿马多瑞氏(amadori)化合物分解以产生葡糖醛酮、过氧化氢以及相应的α-氨基酸或ε-氨基酸，如下列反应式所示。

(3)分子量

利用Sephadex G-100和含有0.2M NaCl的0.1M磷酸缓冲液(pH 7.0)洗脱液通过柱凝胶过滤法测定的酶分子量是48,000±2,000。利用SDS-PAGE所得的结果是47,000±2,000。

(4)等电点

在以两性电解质为载体的聚焦电泳中4℃下加载700V衡压保持40小时对酶进行分级分离，然后测定每一级分的酶活性，由此确定的等电点是pH 4.3±0.2。

(5)Km值

通过在含有50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，0.03％的4-AA，0.02％苯酚和4.5U/ml过氧化物酶的反应溶液中改变ZFL浓度而测定的合成底物ZFL的Km值是3.4mM。

(6)最适pH值

按照上述测定酶活性的方法，但将100mM乙酸缓冲液(pH 4.4-5.4)、磷酸缓冲液(pH 5.6-7.9)Tris-Hcl缓冲液(pH 7.3-8.5)或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 8.0-10.3)替代50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)用于反应溶液以测定酶活性。结果，酶在pH 7.5显示出最大活性。

(7)pH稳定性

将0.5ml含0.5U酶的以0.5M浓度用于测定最适pH的各种缓冲液，在40℃下孵育10分钟，然后按照下面说明的活性测定方法测定残余活性。结果，发现在pH 7.0-9.0酶保持了80％或更多活性。

(8)热稳定性

利用0.2M tris-HCl缓冲液(pH 7.5)制备0.5U酶溶液并加热10分钟，然后按照活性测定方法测定残余活性。结果，发现不超过40℃酶保持95％或更多活性。

(9)最适温度

按照活性测定方法利用40mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)在不同温度下对酶进行反应。反应10分钟之后，加入2ml的0.5％十二烷基硫酸钠(此下称为“SDS”)以终止反应。测定500nm下的吸光度(As)。结果，酶在50℃下显示出最大活性。

接下来，将讨论在用与糖化缬氨酸反应性明显减少的突变FOD消除样品溶液中的糖化赖氨酸之后，利用与糖化缬氨酸具有反应性的FOD测定样品中糖化缬氨酸的方法，所述突变FOD通过用另一个氨基酸替代SEQID No.1所示氨基酸序列中的第372位赖氨酸获得。

任何与糖化缬氨酸不具有反应性的FOD都可以用于消除样品溶液中的糖化赖氨酸。例如，可利用通过以另一个氨基酸替代SEQ ID No.1所示氨基酸序列中的第372位赖氨酸所获得的、与糖化缬氨酸反应性明显减少的突变FOD。在突变FOD中，优选使用SEQ ID No.1所示氨基酸序列中第372位赖氨酸被色氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸中的任一个所替代的突变FOD。添加到反应溶液中的酶量可以是足够消除样品溶液中糖化赖氨酸的量，如0.5-200U/ml，更优选1-50U/ml。

对用于测定糖化缬氨酸的FOD没有限制，只要此FOD能与糖化缬氨酸进行反应即可。例如，可利用尖镰孢IFO-9972菌株的FOD。添加到反应溶液中的酶量可以是足够测定样品溶液中糖化缬氨酸的量，如0.5-200U/ml，更优选1-50U/ml。

一个具体的测定方法包括在第一反应中使含糖化赖氨酸和糖化缬氨酸的样品溶液中的糖化赖氨酸与突变FOD进行反应，以过氧化氢酶等分解在反应中产生的过氧化氢，使在第二反应中通过样品溶液内的糖化缬氨酸与FOD的反应产生的过氧化氢与4-氨基安替比林(4-AA)和Trinder试剂反应，并用比色法测定产生的颜色。可以在第二反应溶液中加入过氧化氢酶抑制剂叠氮化钠。

对于可用于本发明中精确测定糖化蛋白质的对球蛋白组分具有选择性的蛋白酶抑制剂，任何对球蛋白组分具有选择性的抑制剂都可利用，只要在此球蛋白组分选择性蛋白酶抑制剂存在下，当样品溶液与蛋白酶反应时此抑制剂能够引起主要对非球蛋白组分的其它蛋白质的消化即可。优选的实例有脱氧胆酸，脱氧胆酰胺，胆酰胺，季铵盐，季铵盐型阳离子表面活性剂，伴刀豆凝集素A，辛基葡糖苷和甜菜碱。

作为脱氧胆酰胺，举例来说，优选N，N-二(3-D-葡糖酰氨基丙基)脱氧胆酰胺。作为胆酰胺，举例来说，优选3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]-2-羟基丙磺酸，3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]丙磺酸，N，N-二(3-D-葡糖酰氨基丙基)胆酰胺等。

作为季铵盐，举例来说，优选氯化苄基三乙基铵和氯化苄基三正丁基铵。作为季铵盐型阳离子表面活性剂，举例来说，优选氯化月桂基三甲基铵和月桂基二甲基胺氧化物。

这些具有球蛋白组分选择性的抑制剂既可以单独使用，也可以两种或多种联合使用。

这些具有球蛋白组分选择性的抑制剂可以以能够在反应中充分抑制蛋白酶与球蛋白组分的反应的量使用。如果利用脱氧胆酸，脱氧胆酰胺，胆酰胺，辛基葡糖苷，季铵盐或季铵盐型阳离子表面活性剂，优选的浓度为大约0.01-20％，更优选的浓度范围为0.05-10％。浓度也可在这些范围之外。

如果使用伴刀豆凝集素A，辛基葡糖苷或甜菜碱，例如，可应用的浓度分别为大约0.01-10mg/ml或0.005-5％，优选浓度范围分别为0.02-2mg/ml或0.05-10％。此范围外的浓度也可使用。

就用于本发明中精确测定糖化蛋白质的ASOx来说，任何能够有效地与包含在样品溶液中的抗坏血酸进行反应的酶都可利用。实例有来自植物或微生物等的ASOx。下文给出具体实例，但是这些实例并不表示限定可用于本发明的酶。

植物来源的ASOx有例如，黄瓜来源的ASOx(由Amano Enzyme Inc.或Toyobo Co.，Ltd.生产)和南瓜来源的ASOx(由Roche Co.或ToyoboCo.，Ltd.生产)

微生物来源的ASOx有例如，顶孢霉属(Acremonium)来源的ASOx(由Asahi Kasei公司生产)和源于一种微生物的ASOx(由Amano Enzyme Inc.生产)。

通过以下方法测定ASOx酶活性。

《测定ASOx酶活性的方法》

<贮存底物溶液>

将176mg的L-抗坏血酸(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产)和37mg EDTA(由Daiichi Pure Chemicals Co.Ltd.生产)溶解于100ml的1mM盐酸中。

<混合反应试剂>

利用包含0.45mM EDTA的90mM磷酸氢二钾-5mM磷酸二氢钠缓冲液将上述贮存底物溶液稀释20倍。

<步骤>

将1ml上述混合反应试剂置于一个小试管中30℃预热5分钟，然后加入0.10ml适当稀释的酶溶液。搅拌混合物以起始反应。反应正好5分钟后，加入3.0ml的0.2N盐酸水溶液以终止反应。测定245nm波长下的吸光度(As)。对于空白实验，将1ml上述反应溶液置于一个小试管中30℃预热5分钟，然后加入3.0ml的0.2N盐酸水溶液以终止反应。加入0.10ml适当稀释的酶溶液并对混合物进行搅拌以测定245nm波长下的吸光度(Ab)。从酶反应之后的吸光度(As)和空白实验的吸光度(Ab)之间的差值(As-Ab)确定酶活性。30℃下一分钟将1μmol抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸的酶量被定义为1U。计算表达示如下所示。

活性(U/ml)＝[(As-Ab)/10.0]×[1/5]×[4.10/0.10]×[1/B]

10.0：在pH 1.0的条件下抗坏血酸的245nm分子吸光系数(mM)。

5：反应时间(min)

4.10：反应溶液总量(ml)

0.10：用于反应的酶样品溶液的量

B：酶溶液的稀释放大倍数。

可以使用任何浓度的ASOx，只要在此浓度下当蛋白酶和ASOx同时存在时可使用试剂将足够量的抗坏血酸去除即可，例如通常为0.1-100U/ml，优选1-50U/ml的浓度。

对于能够与ASOx组合用于根据本发明精确测定糖化蛋白质的不具有4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基基团的缓冲试剂，可使用任何能在ASOx与蛋白酶共存时使ASOx保持稳定的缓冲试剂。除那些具有4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基的缓冲试剂如3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)，2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)，和2-羟基-3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)之外的任何缓冲试剂都可使用。

其它优选的缓冲试剂的实例包括：N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)，N-(2-乙酰胺)亚氨二乙酸(ADA)，N，N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)，N，N-二(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)，二(2-羟乙基)亚氨三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)，N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)，N-环己基-2-羟基-3-氨基丙磺酸(CAPSO)，N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)，3-[N，N-二(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)，2-吗啉代乙磺酸(MES)，3-吗啉代丙磺酸(MOPS)，2-羟基-3-吗啉代丙磺酸(MOPSO)，哌嗪-1，4-二(2-乙磺酸)(PIPES)，哌嗪-1，4-二(2-羟基-3-丙磺酸)(POPSO)，N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)，2-羟基-N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)，N-三(羟甲基)甲基-2-氨基丙磺酸(TES)，N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)，和三羟甲基氨基甲烷(Tris)。

最优选的缓冲剂有例如，三羟甲基氨基甲烷(Tris)和哌嗪-1，4-二(2-羟基-3-丙磺酸)(POPSO)。

对于这些能够与ASOx组合使用的缓冲试剂，可以以在蛋白酶存在时能保持ASOx稳定并且不影响蛋白酶和ASOx的反应的任意浓度进行利用，例如，通常为1mM至1M，优选5mM至500mM。

对于本发明用于精确测定糖化蛋白质的清蛋白变性剂和/或具有S-S键的化合物，可使用任何一种使BCP对GA和NGA的反应性相同的化合物。

蛋白质变性剂的实例有尿素，胍类化合物和阴离子表面活性剂如十二烷基硫酸钠(SDS)，聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸盐，聚氧乙烯烷基醚硫酸盐，和烷基苯磺酸盐。这些蛋白质变性剂既可以单独使用也可以两种或多种联合使用。对于这些蛋白质变性剂，可利用能使BCP等同地与GA和NGA反应的任意浓度，例如通常为0.01-10％，优选0.05-5％。

优选的具有S-S键的化合物的实例有6，6′-二硫代二烟酸，3，3′-二硫代二丙酸，2，2′-二硫代二安息香酸，4，4′-二硫代二吗啉，2，2′-二羟基-6，6′-二萘二硫(DDD)，2，2′-二硫代吡啶(2-PDS)，4，4′-二硫代吡啶(4-PDS)，5，5′-二硫代二-(2-硝基安息香酸)(DTNB)，和2，2′-二硫代二-(5-硝基吡啶)。

对于具有S-S键的这些化合物，可利用能使BCP等同地与GA和NGA反应的任意浓度，例如，通常为1μM至10mM，优选10μM至5mM。决不排除此范围之外的浓度。

对于本发明用于精确测定糖化蛋白质的蛋白酶稳定剂，可利用在贮藏试剂时能够抑制蛋白酶活性减少的任何化合物。特别优选的是在液态试剂贮藏过程中能够抑制蛋白酶活性减少的化合物。

优选的稳定剂的实例有，例如二甲基亚砜，醇类，水溶性钙盐，氯化钠，季铵盐，季铵盐型阳离子表面活性剂。醇类的实例有乙醇，丙醇，乙二醇和甘油。季铵盐及季铵盐型阳离子表面活性剂的实例有十二烷基硫酸三乙醇胺，氯化十二烷基三甲基铵等。

这些蛋白酶稳定剂可以以任何浓度进行使用，只要在试剂贮存过程中其能够抑制蛋白酶活性减少即可，尤其是在液态试剂贮藏中能够抑制蛋白酶活性减少的浓度。通常利用0.01-30％的浓度，优选0.1-20％的浓度。不排除此范围之外的浓度。

对于本发明用于精确测定糖化蛋白质的至少与糖化氨基酸反应的酶的稳定剂，可利用在试剂贮藏中能够抑制此至少与糖化氨基酸反应的酶的活性减少的任何化合物。特别优选的是在液态试剂贮藏中能够抑制该酶活性减少的化合物。

优选的此类稳定剂有例如，糖醇，蔗糖，水溶性镁盐，水溶性钙盐，硫酸铵，氨基酸和肌氨酸。糖醇的实例有山梨糖醇，甘露醇，海藻糖和甘油。虽然所有氨基酸都显示出强稳定效果，但优选的氨基酸是脯氨酸，谷氨酸，丙氨酸，缬氨酸，甘氨基，赖氨酸等。

这些至少与糖化氨基酸反应的酶的稳定剂可以以任何浓度进行使用，只要在试剂贮藏中能够抑制此至少与糖化氨基酸反应的酶的活性减少即可。特别优选的是在液态试剂贮藏中能够抑制该酶活性减少的浓度。稳定剂如果是糖醇，蔗糖，氨基酸或肌氨酸，则通常使用0.01-30％的浓度，优选0.1-20％的浓度。稳定剂如果是水溶性镁盐，水溶性钙盐或硫酸铵，则使用1mM到1M的浓度，优选10mM到500mM的浓度。不排除这些范围外的浓度。

在制备用于测定糖化蛋白质的本发明组合物时，可将蛋白水解试剂(包括蛋白酶)和用于测定所产生的糖化氨基酸或肽的糖化氨基酸检测试剂适当组合以便使这些试剂可在同一反应容器中使用。这些试剂可以以液态产品，冰冻产品或冷冻干燥产品形式提供。

在制备用于本发明的蛋白水解试剂时，对pH、缓冲剂以及蛋白酶浓度进行确定以便使蛋白水解反应能够有效进行。然后，适当地制备具有球蛋白组分选择性的蛋白酶抑制剂、ASOx和蛋白酶稳定剂并加到上述的有效浓度。

举例来说，如果使用XXIV-型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生产)，由于蛋白酶在pH 7-10附近显示出强的蛋白水解活性所以可选择在pH 7-10反应。就缓冲液来说，可利用不具有4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基的缓冲剂的溶液，例如，在pH 7.2-8.5范围内具有缓冲作用的POPSO缓冲液，POPSO的浓度可为1-100mM，优选10-500mM。

可利用的蛋白酶浓度是能够在实际应用的反应时间内使样品中的糖化蛋白质充分分解的浓度，优选100-500,000PU/ml，更优选500-100,000PU/ml。

对于具有球蛋白组分选择性的蛋白酶抑制剂、ASOx和蛋白酶稳定剂的组合，例如可利用由0.01-20％并优选0.05-10％的3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]丙磺酸作为球蛋白组分选择性蛋白酶抑制剂、0.1-100U/ml并优选1-50U/ml的南瓜抗坏血酸氧化酶(由Toyobo Co.Ltd.生产)、以及0.01-30％，优选0.1-20％的二甲基亚砜作为蛋白酶稳定剂所形成的组合。

为了配制用于本发明测定糖化氨基酸的试剂，可从确保所利用的至少与糖化氨基酸反应的酶能进行有效反应的最适pH出发选择适当的pH，并确定与糖化氨基酸反应的酶量，然后加入至少与糖化氨基酸反应的酶的稳定剂。

举例来说，如果利用R-FOD或R-FOD-II(由Asahi Kasei公司生产)，由于这些蛋白酶在pH 6.5-10的宽范围内显示出其最大活性的50％或更多，所以可选在pH 6.5-10进行反应。酶的使用浓度可为能够充分检测出所用反应溶液中的糖化氨基酸的浓度，优选0.5-200U/ml的浓度，并更优选1-50U/ml的浓度。

举例来说，谷氨酸可在0.01-30％并优选0.1-20％浓度下用作至少与糖化氨基酸反应的酶的稳定剂。

在配制包含至少与糖化氨基酸反应的酶(作为第一试剂)和蛋白酶(作为第二试剂)的组合物时，可利用任何条件，但第一试剂中的条件如pH，盐浓度等需使蛋白酶和至少与糖化氨基酸反应的酶可显示出活性，而第二试剂中的条件应适宜蛋白酶的贮藏。

例如，当利用R-FOD和XXIV型蛋白酶时，由于这些酶具有的特定活性pH范围分别为6.5-10和7-10，所以第一试剂选择pH 7-10，并选择具有相对高浓度如20-1,000mM的缓冲剂。另一方面，由于此蛋白酶在pH7或更低时是稳定的，因此第二试剂选择的pH是7或更低，同时选择浓度相对低于第一试剂所用浓度的缓冲剂，如在1-50mM范围。此外，还优选加入蛋白酶稳定剂，如大约1-50％二甲基亚砜。在此情况下，如果第一试剂的使用量大于第二试剂，例如第一试剂对第二试剂的比率为4∶1，则可将较高浓度的稳定剂加到第二试剂中，并且对于其它条件如pH，第二个试剂可选用大幅度偏离第一试剂的条件的条件。

在配制根据本发明测定糖化蛋白质的酶反应组合物时，可适当地选择和添加表面活性剂，盐类，缓冲剂，pH调节剂，防腐剂等。

作为表面活性剂，如聚氧乙烯烷基醚，聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，聚乙烯醇等可加入0.01-10％，优选0.05-5％的量。作为盐类，如氯化锂，氯化钠，氯化钾，氯化锰，氯化钴，氯化锌，氯化钙等可加入1mM到5M，优选10mM到1M的量。各种缓冲液如Tris-HCl缓冲液，甘氨酸-NaOH缓冲液，磷酸缓冲液，良好(Good)缓冲液等可加入10mM到2M，优选20mM到1M的量。各种防腐剂如叠氮化钠可适当地加入0.01-10％，优选0.05-1％的量。

在利用本发明方法测定糖化蛋白质时，将0.001-0.5ml的样品加到用于测定糖化蛋白质的本发明组合物中并在37℃下进行反应。如果使用速率测定技术，可直接或间接地利用上述方法在反应开始后两个指定时间点间的几分钟到几十分钟的一个时段内，例如在反应开始三分钟后和四分钟后之间的一分钟，或在反应开始三分钟后和八分钟后之间的五分钟内对辅酶、溶解氧、过氧化氢或其它反应产物的量的变化进行测定。如果使用终点测定技术，可利用同种方式在反应开始后某个时段内对辅酶、溶解氧、过氧化氢或其它反应产物的量的变化进行测定。在此时，可通过将吸光度等的变化与所测定的具已知糖化蛋白质浓度的样品的值进行比较，确定样品中糖化蛋白质的量。

可以对应用于本发明的能至少与糖化氨基酸反应的酶所进行的反应进行检测，举例来说，如果使用脱氢酶，可直接测定辅酶量的变化或通过利用电子载体如各种硫辛酰胺脱氢酶或吩嗪硫酸甲酯及还原型显色剂如以硝基四唑，WST-1或WST-8为代表的四唑盐(由Dojindo实验室生产)间接测定所形成的还原性辅酶。还可利用其它已知的直接或间接测定方法。

如果使用氧化酶，举例来说，优选测定氧消耗量或反应产物的量。例如，如果使用R-FOD，产生过氧化氢和葡糖醛酮作为反应产物。可通过已知方法对过氧化氢和葡糖醛酮进行直接或间接地分析。

过氧化氢量可以，例如，通过利用过氧化物酶等产生显色物质并测定颜色、发射光或荧光强度，通过电化学技术，或通过利用过氧化氢酶从醇产生醛并测定所产生的醛的量进行确定。

对于从过氧化氢产生显色物质来说，可利用能够在过氧化物酶存在时通过偶合剂如4-AA或3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)和生色原如苯酚的氧化缩合产生显色物质的Trinder试剂，能够在过氧化物酶存在时直接被氧化并产生颜色的Leuko-型试剂，等。

作为Trinder试剂的生色原，可利用苯酚衍生物，苯胺衍生物，甲苯胺衍生物等。具体来说，有N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-间-甲苯胺(TOOS)，N，N-二(4-磺丙基)-3-甲基苯胺二钠(TODB)(二者皆由Dojindo实验室生产)，等。

Leuko-型试剂的具体实例有N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(二甲基氨基)-联苯胺(DA64)，10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-二(二甲基氨基)吩噻嗪(DA67)(二者皆由Wako Pure chemical Industries有限公司生产)，等。

经氧化发射荧光的化合物如高香草酸和4-羟基苯乙酸可用于荧光方法。对于化学发光方法来说，鲁米诺、光泽精，异鲁米诺等可用作催化剂。

如果利用电极测定过氧化氢，对所用电极没有特殊限制只要电极是由能与过氧化氢交换电子的材料制成即可，例如铂，金和银。可利用常规电极方法如电流测定法，电势测定法和电量分析法。可以在电极和氧化酶或底物之间提供电子载体以便测定所产生的氧化或还原电流或电量。任何可表现出电子转移功能的材料都可作为电子载体，举例来说有二茂铁衍生物和醌衍生物。还可以在电极和经氧化反应产生的过氧化氢之间提供电子载体以便测定所产生的氧化或还原电流或电量。

当糖化蛋白是糖化清蛋白并且必须精确测定出糖化清蛋白的量时，任何含有蛋白质变性剂和/或具有S-S键化合物和溴甲酚紫的清蛋白检测试剂都能用于本发明，只要此试剂在GA和NGA之间不产生偏差。

例如，如果十二烷基硫酸钠和5，5′-二硫代二(2-硝基安息香酸)被用作蛋白质变性剂和/或具有S-S键的化合物，则使用不影响BPC显色的低浓度如1-20mM的缓冲液，其中十二烷基硫酸钠所用的浓度为0.01-10％，优选0.05-5％，5，5′-二硫代二(2-硝基安息香酸)所用的浓度为1μM到10mM，优选10μM到5mM。由于BCP在高于中性的pH明显地发生显色，所以在pH 4.5-7.5下利用BCP。

在利用本发明的方法测定清蛋白中，将0.001-0.5ml的样品加到用于测定清蛋白的本发明组合物中并在37℃进行反应。在反应开始后的一段指定时间内显色物质的量可通过一点分析(one point assay)的方法进行测定。由于清蛋白-BCP在600nm附近具有最大吸光度，所以测定550-630nm附近的吸光度。在此情况下，样品中清蛋白的量还可通过与使用具已知清蛋白浓度的样品测定的吸光度和空白(水)的吸光度进行比较来确定。

任何含有至少糖化蛋白的样品都可作为本发明的检测对象。优选的样品包括血液组分如血清，血浆，血细胞，和全血。此外，分离出的红细胞也可用作优选样品，因为根据不同分离条件，分离出的红细胞样品可能含有能影响检测结果的球蛋白组分。

可利用本发明测定糖化蛋白的组合物和方法进行测定的糖化蛋白包括GA和GHb，但不限于这些蛋白，任何糖化蛋白都可进行测定。

附图简述

图1表示的是本发明实施例4中HSA底物溶液(4g/dl)，γ-球蛋白底物溶液，和球蛋白IV底物溶液的测量曲线和再现性。

图2表示的是本发明实施例5中Hb底物溶液(4g/dl)，γ-球蛋白底物溶液，和球蛋白IV底物溶液的测量曲线和再现性。

图3表示的是经本发明实施例6中的实验得到的糖化清蛋白的测量曲线。

图4表示的是本发明实施例9中不同类型缓冲剂对用于测定糖化蛋白质的组合物中的抗坏血酸氧化酶的稳定作用。

图5表示的是本发明实施例11中不同类型稳定剂对蛋白酶的稳定作用。

图6表示的是本发明实施例12中不同类型稳定剂对至少与糖化氨基酸反应的酶的稳定作用。

图7表示本发明实施例20中质粒pcmFOD1到pcmFOD5的共有结构。

图8表示的是本发明实施例21中对被突变果糖基氨基酸氧化酶除去糖化赖氨酸的反应液和未进行去除处理的反应液中的糖化缬氨酸浓度进行测量时在波长555nm下的吸光度测量结果。

图9表示的是本发明实施例22中酶学方法和HPLC方法在糖化清蛋白测量结果上的相关性。

图10表示的是本发明实施例23中糖化蛋白测定试剂的反应曲线。

实施本发明的最佳方式

本发明将通过下列实施例进行阐述，但不意谓限制本发明。

实施例1

为筛选出不与球蛋白组分反应的蛋白酶，利用R-FOD(由Asahi Kasei公司生产)对由蛋白酶与清蛋白、球蛋白组分以及血红蛋白反应所产生的糖化氨基酸或糖化肽进行测定。

<底物溶液>

1、HSA底物溶液；人清蛋白；基本无球蛋白；25mg/ml，GA％＝31.9％，果糖胺(FRA)值＝256μmol/l(由Sigma-Aldrich公司生产)；底物溶液中的清蛋白浓度利用清蛋白检测试剂盒(清蛋白II-HA检测盒Wako；由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产)进行测定。GA％利用糖化清蛋白分析仪(GAA-2000，由ARKRAY公司生产)进行测定。

2、G-II和III底物溶液，FRA值＝48μmol/l[人球蛋白Cohn级分II和III；16.9mg/ml(由Sigma-Aldrich公司生产)]。

3、G-IV底物溶液，FRA值＝26μmol/l[人球蛋白Cohn级分IV；6mg/ml(由Sigma-Aldrich公司生产)]。

4、G-I底物溶液，FRA值＝77μmol/l[Glovenin I：免疫球蛋白制品(由Takeda Chemical Industries有限公司生产)]。

5、Hb底物溶液：人血红蛋白；55mg/ml，糖化血红蛋白比率：HbAlc＝4.5％[由Sigma-Aldrich公司生产，HbAlc值利用糖化血红蛋白分析仪(Hi-AUTO A1C HA-8150，由ARKRAY公司生产)测定]。

底物溶液的果糖胺值利用果糖胺分析盒(Autowako果糖胺，由WakoPure Chemical Industries有限公司生产)进行测定。

<制备蛋白酶反应溶液>

将200μl非Hb的底物溶液、40μl的100mg/ml蛋白酶溶液(如果不能制备出浓度100mg/ml的溶液，溶液浓度尽可能接近100mg/ml，或者如果其是液体则使用原样浓度)和10μl的1M Tris缓冲液(pH 8)充分混合并在37℃反应30分钟。反应溶液经10,000NMWL膜(Ultrafree MC，由Millipore公司生产)进行过滤。将滤液作为蛋白酶反应样品。利用蒸馏水替代底物执行同样操作以制备空白样品。

对Hb底物溶液来说，150μl的底物溶液、60μl的200mg/ml蛋白酶溶液(如果不能制备出浓度200mg/ml的溶液，溶液浓度尽可能接近200mg/ml，或者如果其是液体则使用原样浓度)和5μl的1M Tris缓冲液(pH8)充分混合并在37℃反应60分钟。反应溶液经10,000NMWL膜(Ultrafree MC，由Millipore公司生产)进行过滤。将滤液作为蛋白酶反应样品。利用蒸馏水替代底物执行同样操作以制备空白样品。

<测定蛋白酶反应样品中的糖化氨基酸和糖化肽>

<反应溶液组成>

50mM Tris缓冲液(pH 8.0)

0.02％4-AA(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产)

0.02％N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-间-甲苯胺(TOOS)(由Dojindo实验室生产)

2U/ml R-FOD(由Asahi Kasei公司生产)

5U/ml POD(由Sigma-Aldrich公司生产)

<反应步骤>

将300μl上述用于测定糖化氨基酸的反应溶液加到测定池中并在37℃保温3分钟。测定555nm的吸光度(A₀)。然后将30μl蛋白酶反应样品加进测定池并在37℃保温5分钟。测定555nm的吸光度(A₁)。利用空白样品替代蛋白酶反应样品对其执行同样操作。测定吸光度(A₀空白和A₁空白)。蛋白酶与糖化蛋白质的反应由下列吸光度变化指示。

ΔA＝(A₁-A₀)-(A₁空白-A₀空白)

在pH 8.0典型蛋白酶与清蛋白、球蛋白和血红蛋白的反应性(ΔA)

如表1所示。

表1各种蛋白酶作用于各种蛋白的活性(单位：mAb)

在球蛋白组分中，表1记述的只是G-I底物溶液的结果，这是因为所有蛋白酶与G-IV底物溶液中的糖化蛋白质没有反应或只有极小反应，并且G-II和G-III底物溶液的测定值与G-I底物溶液的测定值几乎相同。从表1中可明确看出，源自曲霉属的蛋白酶和XIV型蛋白酶对球蛋白组分中的糖化球蛋白显示出良好的反应性。

然而，能够与清蛋白中的GA和血红蛋白中的GHb反应的内切蛋白酶和外切蛋白酶对球蛋白组分中的糖化球蛋白也具有反应性。这些结果表明如果对血清或血浆中的GA或全血或血细胞中的GHb进行测定，仅选择蛋白酶的类型不可避免球蛋白组分的影响。

实施例2

<球蛋白组分选择性蛋白酶抑制剂的筛选>

利用与HSA底物溶液具有高反应性的XXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生产)，在HSA底物溶液基础上筛选出能够减少蛋白酶与上述球蛋白底物溶液的反应的组分。

<反应溶液组成>

R-1蛋白水解试剂

150mM Tricine缓冲液(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产)pH 8.5，

2,500U/ml XXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生产)+球蛋白组分选择性蛋白酶抑制剂(脱氧胆酸，脱氧胆酰胺，胆酰胺，季铵盐，或季铵盐型阳离子表面活性剂：1％，伴刀凝集素A：0.21mg/ml，甜菜碱：0.1％，辛基葡糖苷：1％，由Dojindo实验室生产)

R-2糖化氨基酸检测试剂

0.12％4-AA(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产)

0.08％TOOS(由Dojindo实验室生产)

24U/ml R-FOD(由Asahi Kasei公司生产)

20U/ml POD(由Sigma-Aldrich公司生产)

在R-1蛋白水解试剂中，作为脱氧胆酰胺，利用双葡糖酰胺基丙基脱氧胆酰胺；作为胆酰胺，利用3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]丙磺酸，3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]-2-羟基丙磺酸，或双葡糖酰胺基丙基胆酰胺；作为季铵盐，利用氯化苄基三乙基铵或氯化苄基三正丁基铵；作为季铵盐型阳离子表面活性剂，利用氯化十二烷基三甲基铵或十二烷基二甲基胺氧化物。

<底物溶液>

1、HSA底物溶液；人清蛋白：40mg/ml，GA％＝10.5％(由WakoPure Chemical Industries有限公司生产，底物溶液中的清蛋白浓度利用清蛋白检测试剂盒(清蛋白II-HA检测盒Wako；由Wako Pure ChemicalIndustries有限公司生产)进行测定。GA％利用糖化清蛋白分析仪(GAA-2000，由ARKRAY公司生产)进行测定。

2、γ-球蛋白添加底物溶液，将17.0mg/ml的γ-球蛋白[人γ-球蛋白(由Sigma-Aldrich公司生产)，果糖胺值＝34μM]添加到上述HSA底物溶液中。

<反应步骤>

将8μl的每种底物溶液(HSA底物溶液，G-I底物溶液)加到在37℃下保温的240μl R-1中。在37℃下引发反应并在正好反应5分钟之后加入80μl的R-2。在添加R-2之前和之后测定546nm波长下的吸光度。两个测量结果的差作为吸光度变化。利用水替代底物执行同样操作以制备空白样品。此外，以未添加球蛋白选择性蛋白酶抑制剂的反应溶液作为对照。

ΔA(HSA)的计算是从HSA底物溶液所得的吸光度变化中减去空白样品的吸光度变化。ΔA(+γ-球蛋白)的计算是从添加γ-球蛋白的底物溶液所得的吸光度变化中减去空白样品的吸光度变化。

γ-球蛋白添加的效应＝(ΔA(+γ-球蛋白)-ΔA(HSA))/ΔA(HSA)×100(％)

比较各种候选化合物存在和不存在(对照)时所得的值。结果如表2所示。

表2筛选球蛋白选择性蛋白酶抑制剂

从表2可看出，在脱氧胆酸，脱氧胆酰胺，胆酰胺，季铵盐，或季铵盐型阳离子表面活性剂，伴刀豆凝集素A，辛基葡糖苷，甜菜碱中鉴定到对蛋白酶与球蛋白反应的抑制作用，证实了如果利用这些球蛋白组分选择性蛋白酶抑制剂和蛋白酶，则可主要地对球蛋白以外的蛋白质进行消化。

利用Hb底物溶液替代HSA底物溶液执行同样的测量，前提是如果利用Hb底物溶液，则在与R-1反应之后利用三氯乙酸除去蛋白质，然后对残余物进行中和并加入R-2。在利用Hb底物溶液的情况下，同样证实脱氧胆酸，脱氧胆酰胺，胆酰胺，季铵盐或季铵盐型阳离子表面活性剂，伴刀豆凝集素A，甜菜碱具有抑制蛋白酶与球蛋白反应的作用。

实施例3

<3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]丙磺酸的球蛋白组分选择性蛋白酶抑制作用>

利用各种蛋白酶验证了3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]丙磺酸的球蛋白组分选择性蛋白酶抑制作用。

R-1蛋白水解试剂

150mM Tricine缓冲液(由Wako Pure Chemical Industrials有限公司生产)pH 8.5，

2,500U/ml蛋白酶＊

1％3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]丙磺酸

＊Orientase 22BF(由HBI酶公司生产)，VIII型蛋白酶，XIV型蛋白酶，和XXVII型蛋白酶(以上由Sigma-Aldrich公司生产)用作蛋白酶。

R-2糖化氨基酸检测试剂

同实施例2。

<底物溶液>

同实施例2。

<反应步骤>

利用如实施例2中的相同方式比较3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]丙磺酸存在和不存在(对照)时γ-球蛋白添加的效应。结果如表3所示。在判断一栏中，添加γ-球蛋白的效应被明显减少的情况以O来表示。

表3：3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]丙磺酸的球蛋白组分选择性蛋白酶抑制作用

从表3可看出，有3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]丙磺酸存在时，Orientase 22BF，VIII型蛋白酶，XIV型蛋白酶，和XXVII型蛋白酶减少了与γ-球蛋白底物的蛋白酶反应，但所有这些蛋白酶都保持了与HSA底物的反应性。这些结果说明不论蛋白酶是何类型，本发明的球蛋白组分选择性蛋白酶抑制剂都是有效的。

此外，甚至在测定GHb时，利用本发明也可以消除球蛋白组分的影响。

实施例4

<糖化清蛋白的稀释线性>

R-1蛋白水解试剂

2,500U/ml XXVII型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生产)

1％3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]-2-羟基丙磺酸(由Sigma-Aldrich公司生产)

R-2糖化氨基酸检测试剂

同实施例2。

<底物溶液>

1、HSA底物溶液：同实施例1，但使用的溶液浓度为4.0g/dl。

2、γ-球蛋白底物溶液：同实施例2。

3、球蛋白IV底物溶液：同实施例1。

<步骤>

将HSA底物溶液(4g/dl)，γ-球蛋白(γG)底物溶液(1.7g/dl)，以及球蛋白IV(GIV)底物溶液(1.7g/dl)进行稀释放大0.0、0.5、1.0、1.5和2.0倍以验证稀释线性。接着执行与实施例3相同的操作，但将HSA的1.0倍稀释样品测定10次以计算CV值。结果如图1所示。

从图1可看出，改变γ-球蛋白底物溶液或球蛋白IV(GIV)底物溶液的浓度，吸光度没有变化。另一方面，HSA底物溶液相应于浓度显示出良好的线性，这表明对糖化清蛋白的测定可以实质上不受球蛋白组分的影响。已经用HSA的1.0倍浓度证实CV值＝0.9％具有极好的重复性，这表明，如果利用本发明的测定方法，在10分钟反应时间内能够以良好的灵敏性和极好的重复性对糖化清蛋白进行选择性地测定。

实施例5

<糖化血红蛋白的稀释线性>

R-1蛋白水解试剂

77mM Tris缓冲液(pH 8.0)

2,500U/ml XIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生产)

R-2糖化氨基酸检测试剂

同实施例2。

<底物溶液>

利用与实施例1中相同的Hb底物溶液和与实施例4中相同的γ-球蛋白底物溶液和球蛋白IV底物溶液。

<步骤>

制备Hb底物溶液(4g/dl)，γ-球蛋白(γG)底物溶液(1.7g/dl)，以及球蛋白IV(GIV)底物溶液(1.7g/dl)的0.0、0.5、1.0、1.5和2.0倍浓度样品以验证稀释线性。接着执行与实施例1相同的操作，但将Hb的1.0倍稀释样品测定10次以计算CV值。结果如图2所示。

从图2可看出，改变γ-球蛋白底物溶液或球蛋白IV(GIV)底物溶液的浓度，吸光度没有变化。另一方面，Hb底物溶液相应于浓度显示出良好的线性，这表明对糖化血红蛋白的测定实质上不受球蛋白组分的影响。已经用HSA的1.0倍浓度证实CV值＝2.0％具有极好的重复性，这表明，如果利用本发明的测定方法，在10分钟反应时间内能够以良好的灵敏性和极好的重复性对糖化血红蛋白进行选择性地测定。

实施例6

<糖化清蛋白的线性>

R-1蛋白水解试剂

同实施例4。

R-2糖化氨基酸检测试剂

同实施例4。

<底物溶液>

血清A)＊糖尿病患者的血清GA％＝32.9％；清蛋白浓度：4.3g/dl

血清B)＊健康人的血清GA％＝16.4％；清蛋白浓度：4.1g/dl

＊将上述血清A)和血清B)以10∶0，8∶2，6∶4，4∶6，2∶8和0∶10的比率进行混合得到混合样品。

<步骤>

同实施例3。

结果如图3所示。

从图3可看出，利用具有相同清蛋白浓度和不同糖化清蛋白比率的样品获得极好的线性。因此，证明本发明用于测定糖化蛋白质的方法能够实际地定量分析血清和血浆中的糖化清蛋白。此外，由于证明用溶解红细胞制备的血红蛋白底物溶液替代血清具有相同线性，所以证明本发明用于测定糖化蛋白质的方法也能够定量分析糖化血红蛋白。

实施例7

<糖化清蛋白的HPLC和酶学方法(本发明)之间的相关性>

R-1蛋白水解试剂

同实施例4。

R-2糖化氨基酸检测试剂

同实施例4。

<底物溶液>

糖尿病患者的血清14个样品

健康人的血清25个样品

<步骤>

执行与实施例2相同的步骤。

本发明的酶学方法和已知的HPLC法之间的相关性利用14个糖尿病患者血清样品进行确定。利用糖化清蛋白分析仪(GAA-2000，由ARKRAY公司生产)通过HPLC法测定糖化清蛋白的比率。由本发明方法得到的吸光度变化与此糖化清蛋白比率具有相当高的相关性(相关系数r＝0.991)，这证明本发明的测定方法能够精确测定糖化清蛋白。

实施例8

<缓冲剂的类型对抗坏血酸氧化酶的稳定作用>

<反应溶液组成>

150mM各种缓冲液(pH 8.0)

2,500U/ml XXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生产)或链霉蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生产)

10U/ml抗坏血酸氧化酶(ASO-311，由Toyobo Co.，Ltd.生产)或热稳定型抗坏血酸氧化酶(ASO-312，由Toyobo Co.，Ltd.生产)

R-1：作为蛋白水解试剂中的缓冲剂，利用3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)，2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)，2-羟基-3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，哌嗪-1，4-二(2-羟基-3-丙磺酸)(POPSO)(上述化合物：由Dojindo实验室生产)和磷酸(由Wako Pure Chemical Industrials有限公司生产)。

<步骤>

利用各种缓冲剂制备上述反应溶液。测定抗坏血酸氧化酶活性后，将每种溶液的一部分用作对照。利用上述《测定抗坏血酸氧化酶(ASOx)活性的方法》进行活性测量。将剩余反应溶液在室温下贮存2天，再以同样的方法测量活性。计算在室温下贮存2天后的活性与对照活性的比例以比较抗坏血酸氧化酶的稳定性。结果如表4所示。

表4缓冲剂类型对抗坏血酸氧化酶的稳定作用

从表4可看出，蛋白酶存在时抗坏血酸氧化酶明显在利用不具4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，哌嗪-1，4-二(2-羟基-3-丙磺酸)(POPSO)或磷酸作为缓冲剂的情况下比在利用具4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基的3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPS)，2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)或2-羟基-3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPSO)作为缓冲剂的情况下更稳定。

而且明显地，不论抗坏血酸氧化酶和蛋白酶为何种类型，都证实了具有同样的作用。

实施例9

<用于测定糖化蛋白质的组合物中缓冲剂类型对抗坏血酸氧化酶的稳定作用>

<反应溶液组成>

R-1蛋白水解试剂

150mM各种缓冲液(pH 8.0)

2,500U/ml XXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生产)

2.0mM 4-氨基安替比林(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产)

10U/ml抗坏血酸氧化酶(由Toyobo Co.，Ltd.生产)

R-2糖化氨基酸检测试剂

150mM HEPES缓冲液(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产)pH 7.5

6.0mM TOOS(由Dojindo实验室生产)

24U/ml R-FOD(由Asahi Kasei公司生产)

20U/ml POD(由Sigma-Aldrich公司生产)

EPPS，HEPES，HEPPSO，Tris和POPSO用作R-1蛋白水解试剂中的缓冲剂。

<对照底物溶液和抗坏血酸添加底物溶液>

抗坏血酸添加底物溶液通过将1体积的抗坏血酸(1g/dl)(由KokusanChemical Co.Ltd.生产)加到9体积的人类库(pool)血清中进行制备。由添加蒸馏水替代抗坏血酸所制备的溶液作为对照底物溶液。

<反应步骤>

将8μl的对照底物溶液或抗坏血酸添加底物溶液加到240μl的37℃保温的R-1中。在37℃引发反应并在正好5分钟之后加入80μl的R-2。在添加R-2之前和添加R-2之后5分钟测定555nm的吸光度。ΔA₀的计算是通过从对照底物溶液和抗坏血酸添加底物溶液吸光度测量所得的吸光度变化中减去利用蒸馏水替代底物溶液的空白样品所得的吸光度变化来进行。将同样R-1反应溶液在室温下贮存24小时，之后以同样方法测定吸光度计算出ΔA₂₄。将从对照底物溶液所得的吸光度变化设定为100，计算从抗坏血酸添加底物溶液所得的ΔA₀和ΔA₂₄的比例。结果如图4所示。

由于抗坏血酸对测量系统具有显著地负面影响，如果利用100mg/dl的浓度，则将清除反应省略就不能观察到糖化蛋白质的信号。从图4可看出，利用不含4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基的Tris或POPSO的糖化蛋白质检测系统在室温下贮存24小时之后，其在抗坏血酸去除能力上没有变化。另一方面，利用含4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基的EPPS，HEPES或HEPPSO作为缓冲剂的系统在室温下贮存24小时之后，几乎没有抗坏血酸去除能力。根据上述结果，发现在蛋白酶和抗坏血酸氧化酶共同存在的糖化蛋白质检测试剂中，抗坏血酸氧化酶在利用不具4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基的缓冲剂的系统中比在利用具4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基的缓冲剂的检测系统中更稳定。

此外，上述结果明显地证明本发明可用于测定糖化清蛋白、果糖胺和糖化血红蛋白。

实施例10

<溴甲酚紫对糖化清蛋白和非糖化清蛋白的反应性差异，及蛋白质变性剂和/或具S-S键的化合物的作用>

<反应溶液组成>

R-1预处理试剂

10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)+各种浓度的蛋白质变性剂和/或具S-S键的化合物；加入蒸馏水作为对照

R-2清蛋白显色剂

200mM琥珀酸缓冲液(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产)pH 5.5

0.15mM溴甲酚紫(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产)

0.3％Tx-100(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产)

下列化合物1)-9)用作R-1预处理试剂中的蛋白质变性剂和/或具S-S键的化合物。

1)6，6′-二硫代二烟酸：100mM

2)3，3′-二硫代二丙酸：100mM

3)2，2′-二硫代二安息香酸：100mM

4)4，4′-二硫代二吗啉：100mM

5)DTNB(50mM)

6)DDD(33mM)

7)2-PDS(25mM)

8)4-PDS(50mM)

9)SDS(0.3％)

1)-5)由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产

6)-9)由Dojindo实验室生产

<样品>

将糖化清蛋白，非糖化清蛋白，健康人血清和患者血清用作样品，并将蒸馏水作为空白样。糖化清蛋白和非糖化清蛋白是从人血清得到，通过已知方法利用硼酸-固定化树脂进行纯化。

<反应步骤>

将2μl样品加入到160μl在37℃保温的预处理试剂中。在37℃引发反应并在正好5分钟之后加入160μl的清蛋白显色剂。在添加清蛋白显色剂前和添加清蛋白显色剂之后5分钟测量600nm的吸光度。标准曲线利用蒸馏水和具有已知清蛋白浓度的样品替代上述样品进行制作。通过免疫方法以胶乳试剂(LX试剂，Alb-II，由Eiken Chemical Co.Ltd生产)作为对照对样品分别进行测定。结果如表5所示。

表5

表5(续)

从表5可看出，在BCP法中未进行预处理而测定的针对NGA的值出乎意料地低。同样，在含少量NGA的患者样品中免疫法和BCP法的偏差小于在含大量NGA的健康人样品中的免疫法和BCP法的偏差。通过蛋白质变性剂和/或具S-S键的化合物的预处理，与免疫法的偏差明显减少。其中，2，2′-二硫代二安息香酸和4，4′-二硫代二吗啉，DDD，2-PDS，4-PDS，DTNB以及十二烷基硫酸钠的作用尤其显著。结果，证明如果在测定糖化清蛋白的比率时样品以蛋白质变性剂和/或具S-S键的化合物进行预处理，并且在预处理同时和之后进行BCP反应，则可消除由NGA引起的负面误差，确保糖化清蛋白比率的精确测定。

实施例11

<蛋白酶的稳定>

<反应溶液组成>

R-1蛋白水解试剂

150mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)

5,000PU/ml XXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生产)

8mM 4-氨基安替比林(由Dojindo实验室生产)

15U/ml过氧化物酶

1.0％3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]-2-羟基丙磺酸(由Sigma-Aldrich公司生产)+各种浓度的蛋白酶稳定剂(加入蒸馏水作为对照)

R-2糖化氨基酸检测试剂

150mMTris-HCl缓冲液(pH 8.5)

24U/ml R-FOD-II(由Asahi Kasei公司生产)

12mM TOOS(由Dojindo实验室生产)

下列化合物1)-7)用作预处理试剂中的蛋白酶稳定剂。

1)0.5mM 氯化镁

2)10mM 氯化钙

3)100mM 氯化钠

4)0.1％乙二醇(EtGly)

5)10％二甲基亚砜(DMSO)

6)1％乙醇(EtOH)

7)0.1％十二烷基硫酸三乙醇胺(TEALS)

1)-7)由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产

<样品>

5g/dl HSA(LOT38H7601；由Sigma-Aldrich公司生产)

<反应步骤>

将8μl样品加入到240μl在37℃保温的蛋白水解试剂中。在37℃引发反应并在正好5分钟之后加入80μl的糖化氨基酸检测试剂。在添加糖化氨基酸检测试剂前和添加糖化氨基酸检测试剂之后5分钟测量546nm的吸光度。ΔA₀的计算是通过从底物溶液吸光度测量所得的吸光度变化中减去利用蒸馏水替代底物溶液的空白样品所得的吸光度变化来进行。将同样反应溶液蛋白水解试剂在37℃下贮存24小时，并以同样方法测定吸光度。根据吸光度测量结果计算出ΔA₂₄。对利用含稳定剂的试剂的实验到利用不含稳定剂的试剂的实验，计算出相对灵敏度，其中将利用不含稳定剂并未经贮存的试剂时所测得的ΔA₀设定为100％。结果如图5所示。

从图5可看出，如果不使用稳定剂则相对灵敏度减少到60％，这表明蛋白水解试剂具有稳定作用。在添加稳定剂的实验中，观察到添加氯化钙，氯化钠，DMSO，EtOH或TEALS的稳定作用。其中氯化钙和DMSO的性能几乎没有减少。继续利用DMSO和氯化钙进行的稳定性实验，发现在37℃贮存4周仍可看到其性能几乎没有减少。此外，证明如果在冰箱中以液态贮存，这些化合物则具有一年或更长时间的贮存稳定作用。

实施例12

<至少与糖化氨基酸反应的酶的稳定>

<反应溶液组成>

R-1蛋白水解试剂

150mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)

8mM 4-氨基安替比林(由Dojindo实验室生产)

15U/ml 过氧化物酶

R-2 糖化氨基酸检测试剂

150mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)

24U/ml R-FOD-II(由Asahi Kasei公司生产)

12mM TODB(由Dojindo实验室生产)+各种浓度的蛋白酶

稳定剂(加入蒸馏水作为对照)

下列化合物1)-15)用作糖化氨基酸检测试剂中至少与糖化氨基酸反应的酶的稳定剂。

1)5％甘露醇

2)5％山梨糖醇

3)5％蔗糖

4)5％海藻糖

5)0.5mM 氯化钙

6)0.5mM 氯化镁

7)3％ L-谷氨酸(Glu)

8)3％ L-谷氨酰胺(Gln)

9)3％ L-脯氨酸(Pro)

10)3％ L-丙氨酸(Ala)

11)3％ L-缬氨酸(Val)

12)3％甘氨酸(Gly)

13)3％ L-赖氨酸(Lys)

14)3％肌氨酸

15)100mM 硫酸铵

1)-14)由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产

<样品>

0.5mM FZL

<反应步骤>

将8μl样品加入到240μl在37℃保温的蛋白水解试剂中。在37℃引发反应并在正好5分钟之后加入80μl的糖化氨基酸检测试剂。在添加糖化氨基酸检测试剂前和添加糖化氨基酸检测试剂之后5分钟测量546nm的吸光度。ΔA₀的计算通过从底物溶液吸光度测量所得的吸光度变化中减去利用蒸馏水替代底物溶液的空白样品所得的吸光度变化来进行。将同样反应溶液糖化氨基酸检测试剂在37℃下贮存2天，并以同样方法测定吸光度。根据吸光度测量结果计算出ΔA₂₄。对利用含稳定剂的试剂的实验到利用不含稳定剂的试剂的实验，计算出相对灵敏度，其中将利用不含稳定剂并未经贮存的试剂时所测得的ΔA₀设定为100％。结果如图6所示。

从图6可看出，如果不使用稳定剂则相对灵敏度减少到30％，这表明糖化氨基酸检测试剂具有稳定作用。在添加稳定剂的实验中，观察到添加甘露醇，山梨糖醇，蔗糖，海藻糖，氯化钙，氯化镁，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-脯氨酸，L-丙氨酸，L-缬氨酸，甘氨酸，L-赖氨酸，肌氨酸和硫酸铵的稳定作用。其中，糖醇，氨基酸和肌氨酸显示出尤其强的稳定作用。继续利用L-丙氨酸，甘氨酸或肌氨酸进行的稳定性实验，发现在37℃贮存4周仍看到性能几乎没有减少。此外，证明如果在冰箱中以液态贮存时，这些化合物具有一年或更长时间的贮存稳定作用。

实施例13

<制备含有突变FOD基因的DNA片断文库>

将具有序列表SEQ ID No.5所示碱基序列中第1-30位的碱基序列的寡核苷酸以及具有序列表SEQ ID No.6所示碱基序列中第1-30位的碱基序列的寡核苷酸的合成委托给BEX有限公司来完成。利用Taq聚合酶试剂盒(由Takara Shuzo Co.Ltd.生产)，根据试剂盒所附的说明书以来自尖镰孢IFO-9972的能够编码FOD蛋白的DNA为模板进行PCR反应，从而扩增FOD结构基因。反应是在反应液中加入Mg⁺⁺离子使其终浓度为0.5mM的情况下以不均衡分布的碱基浓度(dATP：0.51mM，dCTP：0.20mM，dGTP：1.15mM和dTTP：3.76mM)进行的，以便提高诱变效率。

实施例14

<制备突变FOD重组文库>

将在实施例13中所得的含有扩增的FOD基因的DNA片断以限制性内切酶NcoI和EcoRI进行消化，然后与由同种限制性内切酶处理的质粒oTV119N(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)连接，再引入大肠杆菌JM109菌株(由Toyobo Co.Ltd.生产)中。将细胞在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基(由DIFCO公司生产)上37℃下过夜培养，形成转化体菌落。

实施例15

<筛选赖氨酸特异性的突变FOD>

将在实施例14中制备的菌落文库在两块LB琼脂平板培养基上进行复制，每一块平板含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG(由Wako PureChemical Industries有限公司生产)。每块培养基上平铺一层含有5U/ml过氧化酶(由Asahi Kasei公司生产)，0.02％邻联茴香胺(由Wako PureChemical Industries有限公司生产)，2.0mM糖化缬氨酸或糖化赖氨酸(通过Hashiba等的方法制备。Hashiba，H.(1976)J.Agric.Food Chem.，24，70)的LB琼脂(0.3％)培养基。37℃培养8小时后，观察到由FOD氧化糖化氨基酸所形成的氧自由基和由邻联茴香胺引起的菌落显色。这样就筛选出被糖化赖氨酸染成黑紫色且未被糖化缬氨酸染色的菌落，并获得相应菌落的164个菌株。

实施例16

<制备突变FOD候选菌株的细胞提取液>

将实施例15中得到的164个突变菌株在1.5ml含有50μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的3.7％BHI液体培养基(由DIFCO公司生产)中30℃培养16小时。对1ml培养液进行离心(15,000G，4℃离心1分钟)以收集细胞。向收集的细胞中加入200μl的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。利用超声粉碎仪将细胞粉碎之后，对混合物进行离心(14,000G，4℃离心5分钟)获得作为上清液的细胞提取物。

实施例17

<突变FOD的底物专一性验证>

利用上述的FOD酶活性测量方法对包含在实施例16制备的细胞提取物中的FOD突变重组体的糖化氨基酸底物专一性进行测量。结果，在候选菌株中鉴定出两个突变体，其与糖化缬氨酸的反应性小于与糖化赖氨酸的反应性的1/1,000。这两个突变体被作为靶突变体。

实施例18

<重组质粒的提取>

将实施例17中挑选出的突变体接种在1.5ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中并在37℃振荡培养16小时。按照常规方法提取质粒。将这些质粒命名为pcmFOD1和pcmFOD2。

实施例19

<确定突变FOD基因的碱基序列>

按照双脱氧法对实施例18中得到的突变FOD基因的碱基序列进行测定。结果，发现这两个突变体具有相同结构，即在序列表SEQ ID No.1所示的碱基序列中第1115位A被G替代，并且对于编码的重组突变FOD，在序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第372位赖氨酸被精氨酸替代。

实施例20

<每个突变体的底物专一性的验证>

为了观察在实施例19鉴定的突变氨基酸位点以其他氨基酸进行替代的效果，按照Kunkel等的方法进行定点诱变。将具有序列表SEQ ID No.7所示序列中第1-27位碱基序列的寡核苷酸的合成委托给外源(BEX有限公司)完成。利用Mutan-K试剂盒(由Takara Shuzo Co.Ltd.生产)按照试剂盒所附的说明书对寡核苷酸进行定点诱变。将所得的突变基因再次连入表达质粒pTV119N中，然后引入大肠杆菌宿主，并在含有50μg/ml氨苄青霉素和1mM的IPTG的3.7％BHI液体培养基中30℃下培养16小时，产生突变FOD蛋白质。利用经上述实验产生的多种突变体按照实施例16和17中的同样方法测定底物专一性，以发现具有除精氨酸外的色氨酸，甲硫氨酸，苏氨酸，缬氨酸，丙氨酸，丝氨酸，半胱氨酸或甘氨酸替代的突变体是否显示出与具精氨酸替代的突变体相同的糖化赖氨酸特异性的底物专一性。结果显示在表6中。

表6

在此表中，“低于界限”表示“低于检测界限”，“N.D.”表示“没有数据”。上述结果证明如果序列表SEQ ID No.1的氨基酸序列中的第372位赖氨酸被其它氨基酸替代，FOD与糖化赖氨酸的反应性同与糖化缬氨酸的反应性相比可以被相对减少。尤其，发现色氨酸，甲硫氨酸或缬氨酸替代赖氨酸所得的突变体具有高度的糖化缬氨酸特异性和优良的酶性能。用色氨酸替代赖氨酸所得的突变体命名为FOD-W，产生FOD-W的表达质粒命名为pcmFOD3，甲硫氨酸替代赖氨酸所得的突变体命名为FOD-M，产生FOD-M的表达质粒命名为pcmFOD4，缬氨酸替代赖氨酸所得的突变体命名为FOD-V，产生FOD-V的表达质粒命名为pcmFOD5。图7表示质粒的共同结构。

实施例21

<测定样品中去除ε-果糖基-L-赖氨酸(ZFL)后的果糖基-L-缬氨酸(FV)>

反应试剂1

50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)

10U/ml FOD-V

5U/ml 过氧化氢酶

反应试剂2

样品溶液：添加有终浓度为0，0.1，0.2或0.3mM的FV的0.3mM ZFL溶液。

0.5ml的反应溶液1在37℃预热5分钟后，加入0.05ml的上述样品溶液并在37℃反应5分钟。然后，加入0.5ml的反应溶液2，5分钟后测定555nm下的吸光度。以蒸馏水替代样品溶液作为空白实验。作为对照，以同样方法对未添加FOD-V的反应溶液1进行处理。

在图8中，空心圆形表示未添加FOD-V所得的结果，空心方形表示添加FOD-V所得的结果。

从图8可看出，FOD-V和FOD的组合使用确保了在去除样品溶液中的ZFL后对FV的定量测定。

以色氨酸，甲硫氨酸和缬氨酸替代序列表SEQ ID No.1氨基酸序列中第372位赖氨酸所得的氨基酸序列分别显示在序列表SEQ ID No.2，3和4中。

实施例22

<糖化清蛋白的比率测定>

R-1蛋白水解试剂

50mM POPSO酸缓冲液(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产)pH 7.5

2,500U/ml XXIV型蛋白酶(由Sigma-Aldrich公司生产)

5U/ml抗坏血酸氧化酶(由F.Hoffmann-La Roche有限公司生产)

5％DMSO

5mM 4-氨基安替比林

R-2糖化氨基酸检测试剂

150mM HEPES酸缓冲溶液(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产)pH 7.5

5mM TODB

10U/ml POD

20U/ml R-FOD-II

3％谷氨酸

R-3清蛋白预处理试剂

10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)

0.3％十二烷基硫酸钠

R-4清蛋白显色试剂

0.15mM溴甲酚紫(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产)

0.3％Tx-100(由Wako Pure Chemical Industries有限公司生产)

<样品>

1.健康人和糖尿病患者血清，每种35个样品

2.对照血清H(由BML公司生产)作为校准物

预先对校准物的糖化清蛋白浓度进行校准以便使通过HPLC方法和酶学方法得到的临床样品检测结果能相符合。CRM470值用作清蛋白值。

<反应步骤>

将8μl样品加入到240μl在37℃保温的R-1中。在37℃引发反应并在正好5分钟之后加入80μl的R-2。在添加R-2前和添加R-2之后5分钟测量555nm的吸光度。分别测量对照血清H和蒸馏水以制备标准曲线，根据标准曲线对样品中的糖化清蛋白的浓度进行确定。

将2μl样品加入到160μl在37℃保温的R-3清蛋白预处理试剂中。在37℃引发反应并在正好5分钟之后加入160μl的清蛋白显色试剂R-4。在添加清蛋白显色试剂前和添加清蛋白显色试剂之后5分钟测量600nm的吸光度。

利用蒸馏水和具有已知清蛋白浓度的样品替代清蛋白浓度待测样品制备标准曲线。

酶学方法的GA％以如下公式进行确定

GA％＝(GA浓度/清蛋白浓度)×100。

利用Hi-AUTO GAA-2000(由ARKRAY公司生产)测得根据HPLC方法的值，结果如图9所示。

从图9可看出，酶学方法和HPLC方法显示出极好的相关性r＝0.998。所有这些试剂以液态在37℃贮存2周后在性能上没有变化。根据这些实验，清楚地证明这些试剂能够精确测定糖化清蛋白和确定糖化清蛋白比率，这是因为它们能

1)消除球蛋白组分和抗坏血酸的影响

2)使蛋白酶和至少与糖化氨基酸反应的酶保持稳定

3)精确测定清蛋白，以及

4)消除糖化血红蛋白的影响

实施例23

<将至少与糖化氨基酸反应的酶用于第一试剂及将含蛋白酶的组合物用于第二试剂>

R-1

R-2

R-3，R-4同实施例22

<样品>

同实施例22的样品和10-200μM的FZL

<反应步骤>

同实施例22。

结果如图10所示。

从图10可看出，即使在将至少与糖化氨基酸反应的酶加入第一个试剂，将蛋白酶加入第二个试剂的情况下，也在10分钟的短反应时间内对糖化蛋白质进行了极好测定。此外，即使样品中有糖化氨基酸，样品中的糖化氨基酸也可被配制在R-1中的至少与糖化氨基酸反应的酶去除，这样就能对糖化蛋白质进行精确测定。

本发明试剂与HPLC方法具有良好相关性(R＝0.99)即：

酶学方法GA％＝1.03×HPLC方法GA％-0.3

这表明本发明试剂能够精确测定糖化蛋白质。本发明试剂在37℃贮存3周或在冰箱中贮存15个月后，性能没有降低。

工业实用性

通过本发明可以对样品中的糖化蛋白质和糖化清蛋白的比率进行精确测定。因此，本发明的组合物可有效地用作临床检测试剂。有关生物材料保藏的附注

(1)(a)保藏生物材料的机构名称和地址：

名称：独立行政法人产业技术综合研究所国际专利生物保藏中心

地址：日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，邮编305-8566

(b)送交保藏机构(a)保藏的日期：2001年1月16日

(c)保藏机构(a)给予的保藏号：FERM BP-7847

(2)(a)保藏生物材料的机构名称和地址：

地址：日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，邮编305-8566

(b)送交保藏机构(a)保藏的日期：2001年1月16日

(c)保藏机构(a)给予的保藏号：FERM BP-7848

Claims

1.用于测定糖化蛋白质的组合物，其包含蛋白酶、至少与糖化氨基酸反应的酶和选自二甲基亚砜、醇、氯化钠、季铵盐和季铵盐型阳离子表面活性剂的蛋白酶稳定剂。

2.权利要求1所述的组合物，其中将选自糖醇、蔗糖、水溶性镁盐、水溶性钙盐、硫酸铵、氨基酸和肌氨酸的用于至少与糖化氨基酸反应的酶的稳定剂添加到所述至少与糖化氨基酸反应的酶中。

3.权利要求1或2所述的组合物，其中蛋白酶来自芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物。

4.权利要求1-3之任一项所述的组合物，其中至少与糖化氨基酸反应的酶是通过将序列表SEQ ID No.1氨基酸序列中的第372位赖氨酸替代为另一氨基酸而与糖化缬氨酸的反应性显著减小的突变果糖基氨基酸氧化酶。

5.权利要求4所述的组合物，其中利用的是以色氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸作为所述另一氨基酸进行替代的突变果糖基氨基酸氧化酶。

6.权利要求1-5之任一项所述的组合物，其中所述组合物是液体产品。

7.权利要求1-6之任一项所述的组合物，其中所述组合物包含含有至少与糖化氨基酸反应的酶的第一试剂和含有蛋白酶的第二试剂。

8.利用蛋白酶和至少与糖化氨基酸反应的酶测定糖化蛋白质的方法，特征在于所述方法通过使用权利要求1-7之任一项所述的组合物实施。

9.权利要求8所述的方法，特征在于，使样品和至少与糖化氨基酸反应的酶进行反应，然后与蛋白酶进行反应，来测定糖化蛋白质。