JP2008086327A - ヒト化グリーン蛍光タンパク質遺伝子および方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】好ましいDNAコドンを使用することにより、哺乳動物における発現のために適合されたグリーン蛍光タンパク質(gfp)遺伝子、およびヒト細胞における発現のために適合されたヒト化グリーン蛍光タンパク質(gfp)遺伝子、ならびにその構築物および使用方法。
【選択図】なし
Description
1.発明の分野
本発明は、一般に、レポーター遺伝子の分野に関し、特に改善されたグリーン蛍光タンパク質(GFP)遺伝子、構築物、および使用方法を提供する。本明細書中に開示されるgfp遺伝子は、好ましいDNAコドンを使用することにより、哺乳動物およびヒト細胞における発現のために適合されたヒト化gfp遺伝子である。
レポーター分子は、遺伝子発現をモニターするために、生物学的な系において頻繁に使用される。一般的に使用されるレポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)およびβ−グルクロニダーゼ(GUS)が挙げられる。しかし、利用可能なレポーター遺伝子は、それらの使用を制限する特定の欠点を有する。頻繁に遭遇する制限は、マトリックスの導入が必要とされることである。他の欠点としては、例えば、特定のタンパク質の大きさが挙げられ、これはレポーター−融合タンパク質の発現が困難であり得ることを意味する。
本発明は、従来技術に固有のこれらおよびその他の欠点を、哺乳動物およびヒト細胞における発現のために適合されたヒト化グリーン蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を提供することにより、克服しようとする。本発明のヒト化gfp遺伝子は、ヒト遺伝子における使用のために好ましいコドンをDNA配列中に組み込むことにより調製される。ヒト化gfp発現構築物ならびにヒト化遺伝子およびベクターの種々の使用方法もまた提供される。
(a)ヒト化GFP遺伝子が哺乳動物またはヒト細胞内で操作的なプロモーターの制御下で位置される、組換えベクターを調製する工程;
(b)組み換えベクターを哺乳動物またはヒト宿主細胞に導入する工程;
(c)コード化グリーン蛍光タンパク質(GFP)の発現を可能にするために有効な条件下および十分な期間で宿主細胞を培養する工程;および
(d)その発現されたGFPを回収する工程、および、好ましくは、他の細胞性タンパク質の十分な量を有さないGFPを精製する工程。
・本発明はさらに、以下を提供する:
・(項目1)ヒト化グリーン蛍光タンパク質(GFP)遺伝子。
・(項目2)上記遺伝子が、配列番号2のアミノ酸配列を有するグリーン蛍光タンパク質をコードする、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目3)上記遺伝子が、配列番号2のアミノ酸配列を有するグリーン蛍光タンパク質をコードし、65位のセリンをトレオニンに置換した、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目4)上記遺伝子が、配列番号2のアミノ酸配列を有するグリーン蛍光タンパク質をコードする遺伝子であって、66位のチロシンをヒスチジンに置換した、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目5)上記遺伝子が、配列番号2のアミノ酸配列を有するグリーン蛍光タンパク質をコードする遺伝子であって、64位と69位との間の発色団配列Phe Ser Tyr Gly Val Gln(配列番号4)を配列Met Gly Tyr Gly Val Leu(配列番号5)に置換した、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目6)上記コドン位置の少なくとも約10%がヒト化コドンを含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目7)上記コドン位置の少なくとも約15%がヒト化コドンを含む、項目6に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目8)上記コドン位置の少なくとも約20%がヒト化コドンを含む、項目7に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目9)上記コドン位置の少なくとも約25%がヒト化コドンを含む、項目8に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目10)上記コドン位置の少なくとも約30%がヒト化コドンを含む、項目9に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目11)上記コドン位置の少なくとも約35%がヒト化コドンを含む、項目10に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目12)上記コドン位置の少なくとも約50%がヒト化コドンを含む、項目11に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目13)上記遺伝子が、GFP遺伝子配列のコドン位置18、53、93、125、150、178、195、208、236、および224に位置する10個のコドンからの少なくとも7個のヒト化コドンを含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目14)上記遺伝子が、GFP遺伝子配列のコドン位置18、53、93、125、150、178、195、208、236、および224に位置する10個のコドンからの少なくとも8個のヒト化コドンを含む、項目13に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目15)上記遺伝子が、GFP遺伝子配列のコドン位置18、53、93、125、150、178、195、208、236、および224に位置する10個のコドンからの少なくとも9個のヒト化コドンを含む、項目14に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目16)上記遺伝子が、GFP遺伝子配列のコドン位置18、53、93、125、150、178、195、208、236、および224の各々で1個のヒト化コドンを含む、項目15に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目17)上記遺伝子が、GFP遺伝子配列のコドン位置18、53、125、178、195、および236でヒト化ロイシンコドンCTG、CTC、またはTTGのいずれか1つを含む、項目13に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目18)上記遺伝子が、GFP遺伝子配列のコドン位置93、150、および224でヒト化バリンコドンGTGを含む、項目13に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目19)上記遺伝子が、GFP遺伝子配列のコドン位置208でヒト化セリンコドンTCTを含む、項目13に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目20)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数の増加した数のGCCまたはGCTアラニンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目21)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数のTGCシステインコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目22)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数のGACアスパラギン酸コードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目23)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数のGAGグルタミン酸コードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目24)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数のTTCフェニルアラニンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目25)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数のGGCグリシンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目26)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数のCACヒスチジンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目27)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数のATCイソロイシンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目28)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数のAAGリジンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目29)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数のCTGまたはCTCロイシンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目30)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数のAACアスパラギンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目31)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数のCCCまたはCCTプロリンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目32)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数のCAGグルタミンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目33)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数のCGC、AGG、またはCGGアルギニンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目34)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数のAGCまたはTCCセリンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目35)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数のACCトレオニンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目36)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数のGTGまたはGTCバリンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目37)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、増加した数のTACチロシンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目38)上記遺伝子が、TGA終止コドンを含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目39)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、減少した数のGCAアラニンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目40)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、減少した数のGGUグリシンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目41)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、減少した数のCTT、CTA、またはTTAロイシンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目42)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、減少した数のAGAアルギニンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目43)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、減少した数のAGT、TCA、またはTCGセリンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目44)上記遺伝子が、配列番号1の野生型クラゲ遺伝子配列に比較して、減少した数のGTTまたはGTAバリンコードコドンをコード領域内に含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目45)上記遺伝子が、Kozakコンセンサス配列の下流に作動可能に位置する、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目46)上記遺伝子が、配列番号3の核酸配列を含む、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目47)上記遺伝子が、タンパク質コード核酸配列に作動可能に連結する、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目48)上記遺伝子が、哺乳動物細胞において操作的なプロモーターの転写制御下に位置する、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目49)組換えベクターとしてさらに規定される、項目48に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目50)プロモーターの下流に作動可能に位置するヒト化GFPレポーター遺伝子を包含し、上記プロモーターが哺乳動物細胞においてヒト化GFP遺伝子の発現を指向する、発現ベクター。
・(項目51)上記プロモーターが構成プロモーターである、項目50に記載の発現ベクター。
・(項目52)上記プロモーターがウイルスプロモーターである、項目50に記載の発現ベクター。
・(項目53)上記プロモーターが、HSV、TK、RSV、SV40、CMV、またはβアクチンプロモーターである、項目50に記載の発現ベクター。
・(項目54)上記プロモーターがCMVプロモーターである、項目53に記載の発現ベクター。
・(項目55)上記プロモーターが、誘導プロモーターである、項目50に記載の発現ベクター。
・(項目56)上記プロモーターが、チトクロムP450、熱ショックタンパク質、メタロチオネインまたはエストロゲン遺伝子プロモーター、放射線誘導(radiation−inducible)プロモーター、またはtetVP16プロモーターである、項目55に記載の発現ベクター。
・(項目57)上記プロモーターが、組織特異的プロモーターである、項目50に記載の発現ベクター。
・(項目58)上記プロモーターが、FAB、インスリン、トランスフィレチン、α1−抗トリプシン、PAI−1、アポリポタンパク質AI、LDLレセプター、MBP、GFAP、OPSIN、またはNSE遺伝子プロモーターである、項目57に記載の発現ベクター。
・(項目59)上記発現ベクターが、複数のクローニング部位をさらに含む、項目50に記載の発現ベクター。
・(項目60)上記発現ベクターが、上記プロモーターと上記ヒト化GFP遺伝子との間に作動可能に位置された複数のクローニング部位を含む、項目59に記載の発現ベクター。
・(項目61)上記発現ベクターが、上記ヒト化GFP遺伝子の下流に作動可能に位置された複数のクローニング部位を含む、項目59に記載の発現ベクター。
・(項目62)上記発現ベクターが、IRESエレメントをさらに含む、項目50に記載の発現ベクター。
・(項目63)上記発現ベクターが、第2レポーター遺伝子をさらに含む、項目50に記載の発現ベクター。
・(項目64)上記第2レポーター遺伝子が、第2転写単位内に含まれる、項目63に記載の発現ベクター。
・(項目65)上記第2レポーター遺伝子が、ネオマイシン、ヒグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸、ヒスチジノール、またはメトトレキセートに対する耐性を付与する、項目63に記載の発現ベクター。
・(項目66)上記発現ベクターが、ポリアデニル化シグナルをさらに含む、項目50に記載の発現ベクター。
・(項目67)上記発現ベクターが、組換えアデノウイルスベクターである、項目50に記載の発現ベクター。
・(項目68)上記発現ベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、項目50に記載の発現ベクター。
・(項目69)上記発現ベクターが、組換えレトロウイルスベクターである、項目50に記載の発現ベクター。
・(項目70)上記発現ベクターが、配列番号3の核酸配列を有するヒト化GFPレポーター遺伝子を含む、項目50に記載の発現ベクター。
・(項目71)上記発現ベクターが、増強されたグリーンまたは増強されたブルー蛍光タンパク質を発現する、項目50に記載の発現ベクター。
・(項目72)ヒト化GFP遺伝子を含む、組換え宿主細胞。
・(項目73)上記ヒト化GFP遺伝子が、組換えベクターを用いて上記細胞に導入される、項目72に記載の組換え宿主細胞。
・(項目74)上記細胞が、上記ヒト化GFP遺伝子を発現し、コード化GFPタンパク質を産生する、項目73に記載の組換え宿主細胞。
・(項目75)上記細胞が、哺乳動物細胞である、項目72に記載の組換え宿主細胞。
・(項目76)上記細胞が、ヒト細胞である、項目72に記載の組換え宿主細胞。
・(項目77)上記細胞が、VERO、HeLa、CHO、COS、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、または293細胞である、項目72に記載の組換え宿主細胞。
・(項目78)上記細胞が、一次細胞株の細胞である、項目72に記載の組換え宿主細胞。
・(項目79)上記細胞が、哺乳動物内に位置される、項目72に記載の組換え宿主細胞。
・(項目80)上記細胞が、配列番号3の核酸配列を含むヒト化GFP遺伝子を含む、項目72に記載の組換え宿主細胞。
・(項目81)上記細胞が、所望のタンパク質を発現する組換え遺伝子をさらに含む、項目72に記載の組換え宿主細胞。
・(項目82)適切な容器手段中に、ヒト化GFP遺伝子を含む発現ベクターを含む、レポーター遺伝子発現キット。
・(項目83)哺乳動物細胞を標識するための方法であって、ヒト化GFP遺伝子を上記細胞において発現する工程を包含する、方法。
・(項目84)細胞の集団内の哺乳動物細胞を同定するための方法であって、以下の工程:
(a)上記細胞において、ヒト化GFP遺伝子を発現する工程;
(b)GFPを発現しない細胞の集団と上記細胞を混合する工程;および
(c)GFP蛍光細胞を同定することによって上記細胞を同定する工程、
を包含する、方法。
・(項目85)外因性DNAセグメントを含む哺乳動物細胞を同定する方法であって、以下の工程:
(a)外因性DNAセグメントに作動可能に連結されるヒト化GFP遺伝子を含む発現ベクターを、上記細胞に導入する工程;および
(b)GFP蛍光細胞を同定することによって、上記外因性DNAセグメントを含む細胞を同定する工程、
を包含する、方法。
・(項目86)上記発現ベクターが、GFPをコードする第1コード領域および上記外因性DNAセグメントを含む第2コード領域を含む、項目85に記載の方法。
・(項目87)上記外因性DNAセグメントが、非翻訳産物をコードする、項目85に記載の方法。
・(項目88)上記外因性DNAセグメントが、選択されたタンパク質またはペプチドをコードする、項目85に記載の方法。
・(項目89)上記発現ベクターが、上記選択されたタンパク質またはペプチドに作動可能に連結されたGFPを含む融合タンパク質をコードする第1コード領域を含む、項目88に記載の方法。
・(項目90)上記融合タンパク質が、細胞下の局在化シグナルを含むペプチドに作動可能に連結されたGFPを含む、項目89に記載の方法。
・(項目91)上記融合タンパク質が、細胞下の局在化シグナルを含む選択されたタンパク質およびペプチドに作動可能に連結されたGFPを含む、項目90に記載の方法。
・(項目92)上記融合タンパク質が、核標的化ペプチドに連結されたGFPを含む、項目90に記載の方法。
・(項目93)上記融合タンパク質が、ミトコンドリア標的化ペプチドに連結されたGFPを含む、項目90に記載の方法。
・(項目94)上記細胞が、異なるスペクトル特性を有するGFPタンパク質を各々発現する、第1および第2ヒト化GFP遺伝子を含む、項目85に記載の方法。
・(項目95)上記細胞が、ヒト細胞である、項目85に記載の方法。
・(項目96)上記GFP蛍光細胞が、蛍光活性化セルソーティングによって同定される、項目85に記載の方法。
・(項目97)上記細胞が、哺乳動物内に位置する、項目85に記載の方法。
・(項目98)哺乳動物細胞内の選択されたタンパク質の位置を測定するための方法であって、以下の工程:
(a)上記選択されたタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されたヒト化GFP遺伝子を含む連続したDNA配列を含む発現ベクターを、上記細胞に導入する工程;および
(b)GFP蛍光の位置を同定することにより上記細胞内の上記選択されたタンパク質の位置を同定する工程、
を包含する、方法。
・(項目99)上記細胞内の上記選択されたタンパク質の上記位置が、外部刺激に依存する、項目98に記載の方法。
・(項目100)上記細胞内の上記選択されたタンパク質の上記位置が、細胞周期に依存する、項目98に記載の方法。
・(項目101)哺乳動物細胞内の選択された位置にタンパク質を標的化する方法であって、以下の工程:
(a)ヒト化GFP遺伝子およびタンパク質コード遺伝子に作動可能に連結された標的化ペプチドをコードする配列を含む連続したDNA配列を含む発現ベクターを、上記細胞に導入する工程;および
(b)GFP蛍光の位置を同定することにより、上記細胞内の上記タンパク質の上記選択された位置を確認する工程、
を包含する、方法。
・(項目102)哺乳動物細胞における候補プロモーターを試験する方法であって、以下の工程:
(a)上記候補プロモーターの制御下でヒト化GFP遺伝子を含む発現ベクターを、上記細胞に導入する工程;
(b)上記候補プロモーターによって上記ヒト化GFP遺伝子の発現を可能にするのに効果的な条件下および十分な期間、上記細胞を維持する工程;および
(c)GFP蛍光細胞を同定する工程であって、GFP蛍光細胞の存在が、活性プロモーターを示す、工程、
を包含する、方法。
・(項目103)上記候補プロモーターが、候補的組織特異的プロモーターである、項目102に記載の方法。
・(項目104)上記候補プロモーターが、候補的誘導プロモーターである、項目102に記載の方法。
・(項目105)上記候補プロモーターが、哺乳動物細胞における発現について試験される候補的遺伝子と天然に会合する、項目102に記載の方法。
・(項目106)上記細胞が、哺乳動物内に位置する、項目102に記載の方法。
・(項目107)哺乳動物細胞において、選択されたプロモーターからの転写を刺激する物質を検出する方法であって、以下の工程:
(a)上記選択されたプロモーターの制御下で、ヒト化GFP遺伝子を含む発現ベクターを、哺乳動物細胞に導入する工程;
(b)上記物質を含むと思われる組成物を、上記細胞に曝露する工程;および
(c)GFP蛍光細胞を同定する工程であって、GFP蛍光細胞の存在が、上記選択されたプロモーターからの転写を刺激する物質の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
・(項目108)上記物質が、毒素または汚染物質である、項目107に記載の方法。
・(項目109)哺乳動物において、選択された遺伝子の発現レベルを測定するための方法であって、以下の工程:
(a)選択された遺伝子に作動可能に連結されたヒト化GFP遺伝子を含む発現ベクターを、上記哺乳動物の細胞において発現する工程;および
(b)上記哺乳動物の細胞においてGFP蛍光を測定する工程であって、GFP蛍光のレベルが、上記選択された遺伝子の発現レベルを示す、工程、
を包含する、方法。
・(項目110)哺乳動物の異なる組織における選択された遺伝子の発現を分析するための方法であって、以下の工程:
(a)天然の遺伝子プロモーターの制御下で上記選択された遺伝子を含む発現ベクターを、上記哺乳動物の細胞に導入する工程であって、上記遺伝子は、ヒト化GFP遺伝子に作動可能に連結した、工程;
(b)上記遺伝子の発現を可能にするのに効果的な条件下および十分な期間、上記哺乳動物を維持する工程;および
(c)上記哺乳動物の組織の細胞を分析する工程であって、所与の組織におけるGFP蛍光細胞の存在が、上記組織における遺伝子発現を示す、工程、
を包含する、方法。
・(項目111)ヒト化GFP遺伝子を用いる方法であって、哺乳動物宿主細胞においてヒト化GFP遺伝子を発現する工程、および上記細胞によって発現される上記GFPを回収する工程を包含する、方法。
・(項目112)上記ヒト化GFP遺伝子が、既知の分子量のタンパク質またはペプチドをコードするDNA配列と融合し、そしてここで上記宿主細胞が、GFP融合タンパク質を発現する、項目111に記載の方法。
・(項目113)上記遺伝子が、145位のチロシンがフェニルアラニンで置換された配列番号2のアミノ酸配列を有するブルー蛍光タンパク質をコードする、項目4に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目114)配列番号2のアミノ酸配列の66位のチロシンをコードするTATが、CATで置換され、そして配列番号2のアミノ酸の145位のチロシンをコードするTATが、TTCで置換されている、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目115)上記遺伝子が、64位のフェニルアラニンがロイシンで置換され、そして65位のセリンがトレオニンで置換された配列番号2のアミノ酸配列を有するグリーン蛍光タンパク質をコードする、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
・(項目116)配列番号2のアミノ酸配列の64位のフェニルアラニンをコードするTTCが、CTGで置換され、そして65位のセリンをコードするTCTが、ACCで置換されている、項目1に記載のヒト化GFP遺伝子。
クラゲグリーン蛍光タンパク質(GFP)は、レポーター遺伝子としての使用のための有望な候補として提唱されている。しかし、gfp遺伝子の顕著な限界は、それが哺乳動物細胞系で十分な発現を生じないことである。実際に、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)によりヒト細胞に送達されたクラゲGFPレポーター遺伝子を発現するような本発明者らの最初の試みは、失敗した。
1.グリーン蛍光タンパク質(GFP)遺伝子
グリーン蛍光タンパク質遺伝子および機能的なタンパク質は、表1に示されるように、種々の生物体において、存在していると考えられる。このような遺伝子を発現する任意の生物発光刺胞動物および有櫛動物由来のgfp遺伝子は、本発明に従って、ヒト化gfp遺伝子を調製するための出発点として使用され得る。
AequoreaGFPは、238アミノ酸残基のタンパク質である。その最大の吸光ピークは、475nmでのより小さなピークを有する395nmである。これらのピークの増幅(すなわち、吸光係数)は、それぞれ21〜30および7〜15mM−1cm−1と見積もられている(Moriseら、1974)。395nmでの励起は、508nmにおいて最大発光を生じる。量子収率または光子の再発光の確率は、一旦分子が励起されると、0.72−0.85(Moriseら1974)であり、そして励起状態の持続時間は3.25nsである(Perozzoら、1988)。
本来A.victoriaからクローン化されるGFPは、上述のような低い明るさ、タンパク質合成と蛍光現像と複合体光異性化との間の顕著な遅滞を含むいくつかの最適ではない特性を有する。しかし、GFPは、これらの欠損を軽減するか克服するため、および励起および発光波長がシフトされ、異なる色および新しい適用を作製するための、第二世代の化合物を提供する目的のために再操作され得る。
Aequorea由来のGFPおよび海シイタケRenilla reniformisのGFPは、同一の発色団を共有し、さらにAequorea GFPは395nmおよび475nmに2つの吸収ピークを有するが、Renilla GFPは、498nmにおける単一の吸収ピークのみを、Aequoreaタンパク質の主な395nmピークよりも約5.5倍強いモノマー吸光係数で、有する。多数の実際の適用について、Renilla GFPのスペクトルは、AequoreaのGFPよりも好ましくあり得る。というのは、異なる蛍光と共鳴エネルギー移動の検出との間の波長の差異は、構成スペクトルが、低くかつ広いよりはむしろ高く低い場合、より簡単であるからである。
RenillaのGFPにはるかに近いスペクトルを有するGFP改変体を作製する所望はまた、Heimら、(1995)の研究を動機づけた。AequoreaGFPのアミノ酸配列のセリン65は、 0 p−ヒドロキシベンジリデンイミダゾリノン発色団の部分となる。Ser65がビニル側鎖を形成するためのさらなる脱水素化を実施するという仮説を検証するために、Heimら、(1995)この残基をAla、Leu、CysまたはThrに変異させた。ビニル基がH2OまたはH2Sの除去により形成される場合、SerおよびCysは、除去が不可能なAlaおよびLeuとは非常に異なる同一のスペクトルを与えるはずである。
Delagraveら、(1995)はまた、GFP残基64〜69の拡張ランダム変異誘発を実施し、そしてスペクトルが上記のSer65変異体に質的に類似する6つの変異体を単離した。そのうち4つは、上記の列挙した65位で同じ置換基(Leu、CysまたはAla)を有した。
野生型GFPの特性が変異体において、上記のように改善されるにも関わらず、野生型GFPは、各々のタンパク質分子が数千の発色団または蛍光分子を生成し得る真の酵素的レポーター系に組み入れられる増幅の1つの段階を欠損している。各々のGFPが、GFP発現の比較的高レベルな1つの蛍光団を表すため、細胞当たり106もの分子が、明るいシグナルを与えるのに必要であり得る(Rizzutoら、1995)。
レポーター分子としてのGFPの可能性は、迅速な検出(グリーン蛍光タンパク質は、標準的な長波長UV光源を使用する照射で検出され得る);インビボでのリアルタイム検出の可能性;マトリックスの導入を必要としない事実;および相対的に小さな大きさ(26.9kD)および単量体の性質(これは、タンパク質融合を扱いやすくする)のような特性から生じる。
上記のように、異なる呈色形態を生成するヒト化GFPにおけるアミノ酸置換は、複数のレポーター遺伝子の同時使用を可能にする。異なる呈色化ヒト化GFPは、混合細胞培養物において複数の細胞集団を同定するために、または複数の細胞型を追跡するために簡単に使用され得、これはさらなる試薬を添加するかまたは細胞を固定するかもしくは細胞を傷害する必要を伴わずにリアルタイムおいて可視化される細胞変動または細胞移動における差異を可能にする。
ヒト化gfpが使用され得る多くの技術は、特定の広い領域に分類され得る。まず細胞を簡単に同定すること。これらの方法において、ヒト化gfpは、細胞においてGFPを発現するために単独で使用される。この方法についての一つの使用は、細胞を異なる細胞型の存在する環境に曝露する前の予め標識した単離細胞または類似の細胞の集団における使用である。元の細胞のみでのGFPの検出によって、このような細胞の位置を決定し、そして全集団と比較することが可能になる。
本発明のヒト化遺伝子はまた、哺乳動物細胞におけるプロモーターの解析に別の次元を提供する。gfpは今や、哺乳動物細胞およびヒト細胞において発現され得、そして容易に検出され得るので、ある範囲のプロモーターが、所定の遺伝子、細胞、または系を用いる使用のためのそれらの適合性について試験され得る。これは、インビトロ使用に(例えば、組換え発現および高レベルタンパク質産生における使用に適切なプロモーターを同定するにおいて)適合し、そしてインビボ使用に(例えば、前臨床試験においてまたはヒト被験体での遺伝子治療において)もまた適合する。
本発明のヒト化gfpとともにプロモーターを使用することのさらなる開発は、スクリーニングプロトコルにおけるその使用である。これらの実施態様(これらは、一般的にインビトロで行われる)において、遺伝子操作された細胞は組成物おける特定の化合物または因子の存在を同定するために使用される。
多くの慣習的なFACS法は、精製抗体に結合した蛍光色素の使用を必要とする。蛍光標識でタグ化されたタンパク質は、FACS適用における抗体に対して好ましい。なぜなら、細胞は蛍光タグ化試薬とインキュベートする必要がなく、そして抗体結合物の非特異的結合によるバックグランドがないからである。蛍光は安定であり、そして種非依存性であり、いかなるマトリックスも補因子も必要としないので、GFPはFACSにおける使用に特に適切である。
6.GFP融合タンパク質
ヒト化gfp遺伝子は、融合タンパク質の一部として使用され得、これはタンパク質の位置を同定することを可能にする。「外因性」タンパク質とのGFPの融合物は、GFPの蛍光および宿主タンパク質の機能(例えば、生理学的機能および/または標的化機能)の両方を保持するべきである。
局在化研究は、細胞下分画によっておよび免疫蛍光によって以前に行われてきた。しかし、これらの技術は、細胞周期におけるある瞬間でのタンパク質の位置の「スナップショット」のみを与え得る。さらに、人工産物が、細胞が免疫蛍光のために固定される場合、導入され得る。生存細胞においてタンパク質を可視化するためにGFPを使用することは、個々の細胞中で細胞周期を通してタンパク質を追跡することを可能にし、従って重要な技術である。
GFP融合タンパク質の別の使用は、タンパク質の天然の行き先であるけれどもタンパク質が特定の細胞区画への輸送に適応された後の標的化タンパク質の特定の場所での検出においてである。これを達成するために、標的化配列(例えば、核またはミトコンドリア標的化配列)は、GFP配列とともに所望のタンパク質に融合される。これは、タンパク質の天然の位置がGFPを用いて決定される上記したばかりの方法とは対照的である。
首尾良い遺伝子治療は、一般に、遺伝的障害を矯正し得る遺伝子の宿主ゲノムへの組込みを必要とする。宿主ゲノムにおいて、この遺伝子は、宿主DNAと共存し、そして複製し、そして欠損遺伝子を補償するレベルで発現される。理想的には、疾患は、1つまたはいくつかの処置によって重篤な副作用なしに治癒される。現在までに提唱された遺伝子治療に対するいくつかのアプローチがあった。これらの各々は、本発明のヒト化gfpとの組合せから恩恵を受け得る。
先に述べたように、改変および変更がGFPの構造においてなされ得、そしてなお同様のまたはそうでなければ所望の特徴を有する分子を得る。例えば、タンパク質構造における特定のアミノ酸が、感知し得るほどの機能の損失なしに他のアミノ酸で置換され得る。従って、種々の変更が、ヒト化gfpタンパク質の配列において、基礎となるDNAを変更することによって、それらの生物学的有用性または活性の感知し得るほどの損失なしになされ得ることが意図される。
部位特異的変異誘発は、ヒト化gfp遺伝子のさらなる改変体を調製するために用いられ得る。部位特異的変異誘発は、基礎となるDNAの特定の変異誘発を通した、個々のペプチド、または生物学的に機能的等価なタンパク質もしくはペプチドの調製において有用な技術である。この技術は、1つ以上のヌクレオチド配列変更をDNAに導入することによって変異体を調製し、そして配列決定する準備ができた能力をさらに提供する。
広範な種々の組換えプラスミドおよびベクターがヒト化gfp遺伝子を発現するために操作され、それにより細胞にGFPを送達するために使用され得る。
発現ベクターは、1つ以上のプロモーターの制御下のタンパク質コード核酸セグメントを含む。コード配列をプロモーターの「制御下」におくために、一般に選択したプロモーターの約1と約50ヌクレオチドとの間の「下流」(すなわち、3’)に転写リーディングフレームの転写開始部位の5’末端を位置させる。「上流」プロモーターは、DNAの転写を刺激し、そしてコードされた組換えタンパク質の発現を促進する。
内部リボソーム結合部位(IRES)エレメントは、複遺伝子性またはポリシストロン性メッセージを作製するために使用される。IRESエレメントは、5’メチル化Cap依存翻訳のリボソームスキャニング機構をバイパスし得、そして内部部位で翻訳を開始し得る(PelletierおよびSonenberg 1988)。ピカノウイルス(picanovirus)ファミリー(ポリオおよび脳心筋炎)の2つのメンバー由来のIRESエレメント(PelletierおよびSonenberg,1988)、ならびに哺乳動物メッセージ由来のIRES(MacejakおよびSarnow,1991)が記載されている。上記の任意のものが本発明に従うヒト化gfpベクターにおいて使用され得る。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、ヒトに対して非病原性で、高頻度の組込みを有し、そして非分裂細胞に感染し得るので、ヒト遺伝子療法のために魅力的なベクター系である。従って、AAVは、組織培養および動物全体の両方の哺乳動物細胞に遺伝子を送達するために有用である(Muzyczka,1992)。最近の研究は、AAVが遺伝子送達のために潜在的に良好なベクターであることを実証している(LaFaceら、m 1988;Zhouら、1993;Flotteら、1993;Walshら、1994)。組換えAAVベクターは、マーカー遺伝子(Kaplittら、1994;Lebkowskiら、1988;Samulskiら、1989;ShellingおよびSmith,1994;Yoderら、1994;Zhouら、1994;HermonatおよびMuzyczka,1984;Tratschinら、1985;McLaughlinら、1988)およびヒト疾患に関与する遺伝子(Flotteら、1992;Luoら、1994;Ohiら、1990;Walshら、1992;Weiら、1994)のインビトロおよびインビボ形質導入のために首尾よく使用されている。最近、AAVベクターは嚢胞性線維症の処置のための第1相ヒト試験のために認可されている。
アデノウイルスベクター、および好ましくは複製欠損ベクターは、本発明の情況において使用され得る。例えば、ウイルスが、細胞性ゲノムからアデノウイルス初期領域1遺伝子を発現する細胞(例えば、ヒト293細胞)においてのみ複製コンピテントであるようなウイルス初期領域1(E1A)領域の欠失により達成される。従って、ウイルスは初期遺伝子産物を発現しない正常細胞を殺傷しないので、これは重要である。複製欠損アデノウイルスを調製するための技術は、Ghosh−ChoudhuryおよびGraham (1987);McGroryら、(1988);ならびにGluzmanら、(1982)により例示されるように、当該分野で周知である。Rosenfeldら、(1991;1992)およびStratford−Perricaudetら、(1990;1992)はまたアデノウイルスの使用を記載する。
ヒト化gfp遺伝子を含む発現キットが、本発明の別の局面を形成する。このようなキットは一般に、適切な容器手段において、ヒト化gfp遺伝子またはヒト化gfp遺伝子を発現し得るベクターの処方物を含む。遺伝子またはベクターは、薬学的に受容可能な処方物において提供され得る。
所望のクローンは、組換え発現のためにヒト化gfpと発現系に取り込まれ得る。実質的に任意の真核生物発現系がこの様式において用いられ得ると考えられる。宿主細胞の選択されたタンパク質およびヒト化gfpをコードするDNAセグメントでの形質転換は、発現をモニターする便利な手段を提供する。宿主細胞が一般にタンパク質への翻訳のための機能的mRNAを得るためにゲノム転写物をプロセスするので、cDNAおよびゲノム配列の両方が真核生物発現に適切である。
用語「操作」および「組換え」細胞は、ヒト化gfp遺伝子配列を含む外因性DNAセグメントまたは遺伝子が導入されている細胞をいうことが意図される。従って、操作細胞は、組換え的に導入された外因性DNAセグメントまたは遺伝子を含まない天然に存在する細胞と区別され得る。従って、操作細胞は、人の手によって導入された遺伝子を有する細胞である。
他の生物からのgfp遺伝子がクローン化され得ることがまた意図される。これらは、改善されまたはそうでなければ所望の実体のない特性を有し得、次いで本発明に従いヒト化され得る。
293細胞におけるクラゲGFPの低発現
本実施例は、293細胞におけるトランスフェクションおよび発現においてクラゲgfp10レポーター遺伝子を発現する組換えAAV(rAAV)を使用する試みを記載する。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、現在、異なる細胞型に遺伝子を送達するベクターとして広範に用いられている。AAVの使用には多くの利点が存在し、例えば、明白な病原性の非存在、ビリオンの高生存度、部位特異的組込み、送達遺伝子の長期発現、ならびに宿主染色体複製および細胞周期への比較的な非依存が挙げられる。
pTRBS−UFプラスミドDNAを293細胞にトランスフェクトさせた場合、GFPを発現する細胞の平均数は通常5%未満であった(図3)。さらに、組換えAAVを感染させた293細胞(同一のGFP発現カセットを保有する)を、GFP陰性であると反復して評価した。これらの2つの研究間の唯一の差異は、外見上は、各細胞に送達されたGFP cDNAの数であった。トランスフェクションの間、数百またはさらに数千のプラスミドコピーが送達され、一方、低m.o.i.(1未満)の条件下での感染は、単一コピーのみの遺伝子を送達する。
ヒト細胞においてGFP発現を増大させる試み
本実施例は、哺乳動物およびヒト細胞においてgpf10の発現を増大させる試みに使用し得る種々の方法を記載する。
ヒト化GFPの設計
哺乳動物細胞におけるGFP発現を改善する前述のよく用いられる技術の失敗に照らしてみて、本発明者らは、このような細胞におけるGFPの低発現の重要な理由の1つが細胞環境におけるmRNAの乏しい翻訳効率であると仮定した。本実施例は、哺乳動物およびヒト細胞における増大したGFP発現を得ることに使用するためのヒト化GFPの設計を記載する。
ヒト化GFP遺伝子およびベクターの構築
本実施例は、実施例IIIに記載される分析の結果を用いて、哺乳動物細胞およびヒト細胞での増大した発現において使用するためのヒト化GFPの生成を記載する。
5’−TGCTCTAGAGCGGCCGCCGCCACCATGAGCAAGGGCGAGGAACTG−3’(配列番号9)
5’−CGGAAGCTTGCGGCCGCTCACTTGTACAGCTCGTCCAT−3’(配列番号10)。
ヒト化GFP改変体およびrAAVベクターの構築
本実施例は、野生型タンパク質と異なる特性を有するGFPタンパク質改変体をコードする、さらなるヒト化GFP配列の生成を記載する。改変体はまた、哺乳動物細胞およびヒト細胞において発現が増大される。
GFP2について:
#1:上流プライマー;実施例IVに記載;
#2:5’−GCTTCATATGGTCTGGGTATCTGGAAAAGCACTGCACGCCATACCAGAAGGTAG−3’(配列番号11);
GFPBについて:
#1:上流プライマー;実施例IVに記載;
#2:5’−GCTTCATATGGTCTGGGTATCTGGAAAAGCACTGCACGCCATGAGAGAAGGTAG−3’(配列番号12)。
ヒト化GFPの増大した発現
この実施例は、293細胞におけるヒト化GFPの発現により生じた、GFPの増大した発現を記載する。
ヒト化ブルーGFP変異体の発現
この実施例は、293細胞内における、ヒト化ブルーGFP変異体であるpTRBS−UFBの発現を記載する。
#1:5’−TGCTCTAGAGCGGCCGCCGCCACCATGGTGCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGATGAGCAAGGGCGAG−3’;(配列番号13);
#2:プライマー#2は先に記載したGFPB PCRTMの通り。
IRES−GFPカセットAAVベクターの構築
この実施例は、IRES−GFPカセットAAVベクターの構築を記載し、ここで、GFPの翻訳は1型ポリオウイルス由来のIRESエレメントによって制御される。
組換えGFPアデノウイルスの構築および使用
この実施例は、組換えアデノウイルスシャトルプラスミドの構築、およびヒト化gfp遺伝子を発現する組換えアデノウイルスの構築を記載する。ここでは、ヒト化GFP発現における異なるベクター系の使用を例示する。
モルモットの光レセプター細胞の感染
この実施例は、ヒト化、gfph、cDNAの発現、および分化した哺乳動物細胞におけるレポーター遺伝子としてのその使用を記載する。
pGREENLANTERNTMベクター
この実施例は、pGREENLANTERNTMと呼ばれる特に有用なベクターの作製を記載する。
本明細書中に示されるものに対して、例示の手順的なまたは他の詳細な補追を提供する程度まで、以下の参考文献が本明細書中に参考として詳細に援用される。
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