JP2003159069A - 異なる２つの選択マーカーからなる融合タンパク質 - Google Patents
異なる２つの選択マーカーからなる融合タンパク質Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 異なる２つの選択マーカーからなる融合タン
パク質を発現させ、目的とするタンパク質をコードする
遺伝子の発現の同定の精度を向上させた組換えタンパク
質の製造方法を提供すること。 【解決手段】 薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子との
異なる２つの選択マーカーを結合して、これを目的とす
るタンパク質をコードする遺伝子に結合して、融合タン
パク質を含む組換えタンパク質として発現することによ
り、目的とするタンパク質をコードする遺伝子の発現の
同定の精度を向上させ、更に薬剤耐性遺伝子とレポータ
ー遺伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列
を介して結合することにより、該薬剤耐性遺伝子やレポ
ーター遺伝子の、宿主細胞に対する細胞毒性の発現やレ
ポーター機能の発現を調整して、有効な選択マーカーと
しての使用を可能とする。
パク質を発現させ、目的とするタンパク質をコードする
遺伝子の発現の同定の精度を向上させた組換えタンパク
質の製造方法を提供すること。 【解決手段】 薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子との
異なる２つの選択マーカーを結合して、これを目的とす
るタンパク質をコードする遺伝子に結合して、融合タン
パク質を含む組換えタンパク質として発現することによ
り、目的とするタンパク質をコードする遺伝子の発現の
同定の精度を向上させ、更に薬剤耐性遺伝子とレポータ
ー遺伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列
を介して結合することにより、該薬剤耐性遺伝子やレポ
ーター遺伝子の、宿主細胞に対する細胞毒性の発現やレ
ポーター機能の発現を調整して、有効な選択マーカーと
しての使用を可能とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、異なる２つの選択
マーカーを使用した組換えタンパク質の製造方法、特に
異なる２つの選択マーカーからなる融合タンパク質を発
現させ、目的とするタンパク質をコードする遺伝子の発
現の同定の精度を向上させた組換えタンパク質の製造方
法に関する。
マーカーを使用した組換えタンパク質の製造方法、特に
異なる２つの選択マーカーからなる融合タンパク質を発
現させ、目的とするタンパク質をコードする遺伝子の発
現の同定の精度を向上させた組換えタンパク質の製造方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子産物の機能や局在の解析を行うた
めには、目的遺伝子を標的細胞に導入し、一過性あるい
は安定にある形質を発現させることが必要となる。この
際の遺伝子導入法としては、エレクトロポレーションな
どの物理的方法や、リン酸カルシウムやリポソームを用
いる化学的手段が用いられるが、その導入効率は１００
％ではないため、目的遺伝子産物の機能の詳細な検討の
ためには、目的遺伝子が導入された細胞を選択すること
が必要となる場合がある。一般に、目的遺伝子発現細胞
の選択を行うためには、薬剤耐性遺伝子や蛍光タンパク
質などのマーカー遺伝子をｃｏ-ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉ
ｏｎやInternal Ribosome Entry Site(ＩＲＥＳ)を含む
ベクターを用いて目的遺伝子とともに発現させ、そのマ
ーカー遺伝子発現を指標として用いる。前者は、適当な
選択薬剤を使用することにより、目的遺伝子を導入され
た細胞のみを選択的に回収できる利点を持つ。後者は、
目的遺伝子を可視的に同定できる利点があり、導入細胞
の選択的採取にはフローサイトメトリー等を用いること
ができる。両者のうち、特殊な機器を必要としないこと
などから、薬剤耐性遺伝子を共発現させる前者の方法が
広く行われている。
めには、目的遺伝子を標的細胞に導入し、一過性あるい
は安定にある形質を発現させることが必要となる。この
際の遺伝子導入法としては、エレクトロポレーションな
どの物理的方法や、リン酸カルシウムやリポソームを用
いる化学的手段が用いられるが、その導入効率は１００
％ではないため、目的遺伝子産物の機能の詳細な検討の
ためには、目的遺伝子が導入された細胞を選択すること
が必要となる場合がある。一般に、目的遺伝子発現細胞
の選択を行うためには、薬剤耐性遺伝子や蛍光タンパク
質などのマーカー遺伝子をｃｏ-ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉ
ｏｎやInternal Ribosome Entry Site(ＩＲＥＳ)を含む
ベクターを用いて目的遺伝子とともに発現させ、そのマ
ーカー遺伝子発現を指標として用いる。前者は、適当な
選択薬剤を使用することにより、目的遺伝子を導入され
た細胞のみを選択的に回収できる利点を持つ。後者は、
目的遺伝子を可視的に同定できる利点があり、導入細胞
の選択的採取にはフローサイトメトリー等を用いること
ができる。両者のうち、特殊な機器を必要としないこと
などから、薬剤耐性遺伝子を共発現させる前者の方法が
広く行われている。
【０００３】抗生物質による選択のために、これまで、
種々の薬剤耐性遺伝子- 選択薬剤の組み合わせが用いら
れてきた。しかしながら、どの薬剤を用いても、細胞の
中には、耐性遺伝子が導入されていなくても自然に耐性
を示すものがあり、選択後の細胞がかならずしも目的遺
伝子を発現しているとは限らない、いわゆる擬陽性細胞
の問題があった。選択用のベクターで薬剤耐性に加えて
新たなマーカーを同時に発現させ、薬剤耐性以外の指標
を併せて目的遺伝子導入細胞を同定できれば、目的遺伝
子導入細胞の選択作業の著しい効率の改善が期待できる
と考えられる。この目的のために、ＩＲＥＳを利用して
異なる選択遺伝子を発現させることが可能であるが、同
一遺伝子上で発現されるのではないことから、擬陽性の
問題は解決されない。ＩＲＥＳを利用して異なる遺伝子
を発現させた場合、継代を重ねると、特に遺伝子産物が
宿主細胞に対して細胞毒性を有する場合にはその発現が
消失することがあるとの報告もなされている。従って、
異なる２つの選択マーカーを融合タンパク質のかたちで
発現させることが望ましいと考えられる。
種々の薬剤耐性遺伝子- 選択薬剤の組み合わせが用いら
れてきた。しかしながら、どの薬剤を用いても、細胞の
中には、耐性遺伝子が導入されていなくても自然に耐性
を示すものがあり、選択後の細胞がかならずしも目的遺
伝子を発現しているとは限らない、いわゆる擬陽性細胞
の問題があった。選択用のベクターで薬剤耐性に加えて
新たなマーカーを同時に発現させ、薬剤耐性以外の指標
を併せて目的遺伝子導入細胞を同定できれば、目的遺伝
子導入細胞の選択作業の著しい効率の改善が期待できる
と考えられる。この目的のために、ＩＲＥＳを利用して
異なる選択遺伝子を発現させることが可能であるが、同
一遺伝子上で発現されるのではないことから、擬陽性の
問題は解決されない。ＩＲＥＳを利用して異なる遺伝子
を発現させた場合、継代を重ねると、特に遺伝子産物が
宿主細胞に対して細胞毒性を有する場合にはその発現が
消失することがあるとの報告もなされている。従って、
異なる２つの選択マーカーを融合タンパク質のかたちで
発現させることが望ましいと考えられる。
【０００４】これまでに、種々の薬剤耐性マーカーが用
いられてきたが、比較的よく用いられているものには、
ｎｅｏｍｙｃｉｎ,ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ,ｐｕｒｏｍｙ
ｃｉｎ耐性遺伝子などがある。Ｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺
伝子は歴史的に古くその使用頻度は高い。しかし、必要
とされる選択薬剤濃度が高く選択期間も長い傾向があ
る。Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子もｎｅｏｍｙｃｉ
ｎ耐性遺伝子と似たような傾向を示す。一方、ｐｕｒｏ
ｍｙｃｉｎ耐性遺伝子( puromycin N-acetyltaransfera
se, pac )を用いた場合、選択薬剤濃度が低く選択期間
も数日で済む利点がある。
いられてきたが、比較的よく用いられているものには、
ｎｅｏｍｙｃｉｎ,ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ,ｐｕｒｏｍｙ
ｃｉｎ耐性遺伝子などがある。Ｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺
伝子は歴史的に古くその使用頻度は高い。しかし、必要
とされる選択薬剤濃度が高く選択期間も長い傾向があ
る。Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子もｎｅｏｍｙｃｉ
ｎ耐性遺伝子と似たような傾向を示す。一方、ｐｕｒｏ
ｍｙｃｉｎ耐性遺伝子( puromycin N-acetyltaransfera
se, pac )を用いた場合、選択薬剤濃度が低く選択期間
も数日で済む利点がある。
【０００５】一方で、マーカー遺伝子及びレポーター遺
伝子を、発現を目的とする遺伝子の下流に挿入して置く
ことも提示されている（特開平１１−２５３１６５号公
報）。しかしながら、これらの遺伝子を同時に挿入した
場合、マーカー遺伝子とレポーター遺伝子双方の遺伝子
の機能を保持して発現することが難しいという問題点が
あった。
伝子を、発現を目的とする遺伝子の下流に挿入して置く
ことも提示されている（特開平１１−２５３１６５号公
報）。しかしながら、これらの遺伝子を同時に挿入した
場合、マーカー遺伝子とレポーター遺伝子双方の遺伝子
の機能を保持して発現することが難しいという問題点が
あった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、遺伝
子組換えを用いたタンパク質の製造方法において、目的
とするタンパク質をコードする遺伝子の発現の同定の精
度を向上させた組換えタンパク質の製造方法を提供する
こと、特に異なる２つの選択マーカーからなる融合タン
パク質を発現させ、目的とするタンパク質をコードする
遺伝子の発現の同定の精度を向上させた組換えタンパク
質の製造方法を提供することにある。
子組換えを用いたタンパク質の製造方法において、目的
とするタンパク質をコードする遺伝子の発現の同定の精
度を向上させた組換えタンパク質の製造方法を提供する
こと、特に異なる２つの選択マーカーからなる融合タン
パク質を発現させ、目的とするタンパク質をコードする
遺伝子の発現の同定の精度を向上させた組換えタンパク
質の製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決すべく鋭意研究した結果、薬剤耐性遺伝子とレポー
ター遺伝子との異なる２つの選択マーカーを結合して、
これを目的とするタンパク質をコードする遺伝子に結合
して、融合タンパク質を含む組換えタンパク質として発
現することにより、目的とするタンパク質をコードする
遺伝子の発現の同定の精度を向上させることができ、し
かも該薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子とを、介在ア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を介して結合すること
により、該薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子の、宿主
細胞に対する細胞毒性の発現やレポーター機能の発現を
調整して選択マーカーとしての使用を可能とすることを
見い出し、本発明を完成するに至った。本発明における
該薬剤耐性遺伝子としては、ピューロマイシン（ｐｕｒ
ｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子（ｐａｃ）等が、レポーター
遺伝子としては、蛍光シグナルを発するタンパク質の遺
伝子である、ＥＧＦＰ又はＲＦＰ等が使用される。ま
た、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、
ＹＳＤＬＱＳからなるアミノ酸配列をコードする塩基配
列のような塩基配列が使用される。
解決すべく鋭意研究した結果、薬剤耐性遺伝子とレポー
ター遺伝子との異なる２つの選択マーカーを結合して、
これを目的とするタンパク質をコードする遺伝子に結合
して、融合タンパク質を含む組換えタンパク質として発
現することにより、目的とするタンパク質をコードする
遺伝子の発現の同定の精度を向上させることができ、し
かも該薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子とを、介在ア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を介して結合すること
により、該薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子の、宿主
細胞に対する細胞毒性の発現やレポーター機能の発現を
調整して選択マーカーとしての使用を可能とすることを
見い出し、本発明を完成するに至った。本発明における
該薬剤耐性遺伝子としては、ピューロマイシン（ｐｕｒ
ｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子（ｐａｃ）等が、レポーター
遺伝子としては、蛍光シグナルを発するタンパク質の遺
伝子である、ＥＧＦＰ又はＲＦＰ等が使用される。ま
た、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列としては、
ＹＳＤＬＱＳからなるアミノ酸配列をコードする塩基配
列のような塩基配列が使用される。
【０００８】すなわち本発明は、薬剤耐性遺伝子とレポ
ーター遺伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩基
配列を介して結合したことを特徴とする融合選択マーカ
ー遺伝子（請求項１）や、薬剤耐性遺伝子とレポーター
遺伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を
介して結合することにより、薬剤耐性遺伝子とレポータ
ー遺伝子による、宿主細胞に対する細胞毒性の発現とレ
ポーター機能の発現とを調整したことを特徴とする請求
項１記載の融合選択マーカー遺伝子（請求項２）や、介
在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して、薬剤耐
性遺伝子のＣ末端にレポーター遺伝子のＮ末端を結合す
るか、又はレポーター遺伝子のＣ末端に薬剤耐性遺伝子
のＮ末端を結合することを特徴とする請求項１又は２記
載の融合選択マーカー遺伝子（請求項３）や、薬剤耐性
遺伝子が、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐
性遺伝子（ｐａｃ）であることを特徴とする請求項１か
ら３のいずれか記載の融合選択マーカー遺伝子（請求項
４）や、レポーター遺伝子が、蛍光シグナルを発するタ
ンパク質の遺伝子であることを特徴とする請求項１〜４
のいずれか記載の融合選択マーカー遺伝子（請求項５）
や、蛍光シグナルを発するタンパク質の遺伝子が、ＥＧ
ＦＰ又はＲＦＰであることを特徴とする請求項５記載の
融合選択マーカー遺伝子（請求項６）や、薬剤耐性遺伝
子が、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺
伝子（ｐａｃ）であり、レポーター遺伝子がＥＧＦＰで
あることを特徴とする請求項４〜６のいずれか記載の融
合選択マーカー遺伝子（請求項７）や、介在アミノ酸配
列をコードする塩基配列が、ＹＳＤＬＱＳからなるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列であることを特徴とする
請求項１〜７のいずれか記載の融合選択マーカー遺伝子
（請求項８）からなる。
ーター遺伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩基
配列を介して結合したことを特徴とする融合選択マーカ
ー遺伝子（請求項１）や、薬剤耐性遺伝子とレポーター
遺伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を
介して結合することにより、薬剤耐性遺伝子とレポータ
ー遺伝子による、宿主細胞に対する細胞毒性の発現とレ
ポーター機能の発現とを調整したことを特徴とする請求
項１記載の融合選択マーカー遺伝子（請求項２）や、介
在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して、薬剤耐
性遺伝子のＣ末端にレポーター遺伝子のＮ末端を結合す
るか、又はレポーター遺伝子のＣ末端に薬剤耐性遺伝子
のＮ末端を結合することを特徴とする請求項１又は２記
載の融合選択マーカー遺伝子（請求項３）や、薬剤耐性
遺伝子が、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐
性遺伝子（ｐａｃ）であることを特徴とする請求項１か
ら３のいずれか記載の融合選択マーカー遺伝子（請求項
４）や、レポーター遺伝子が、蛍光シグナルを発するタ
ンパク質の遺伝子であることを特徴とする請求項１〜４
のいずれか記載の融合選択マーカー遺伝子（請求項５）
や、蛍光シグナルを発するタンパク質の遺伝子が、ＥＧ
ＦＰ又はＲＦＰであることを特徴とする請求項５記載の
融合選択マーカー遺伝子（請求項６）や、薬剤耐性遺伝
子が、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺
伝子（ｐａｃ）であり、レポーター遺伝子がＥＧＦＰで
あることを特徴とする請求項４〜６のいずれか記載の融
合選択マーカー遺伝子（請求項７）や、介在アミノ酸配
列をコードする塩基配列が、ＹＳＤＬＱＳからなるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列であることを特徴とする
請求項１〜７のいずれか記載の融合選択マーカー遺伝子
（請求項８）からなる。
【０００９】また本発明は、請求項１〜８のいずれか記
載の融合選択マーカー遺伝子によってコードされる融合
タンパク質（請求項９）や、請求項１〜８のいずれか記
載の融合選択マーカー遺伝子を含有する発現ベクター
（請求項１０）や、請求項１０記載の発現ベクターに、
目的とするタンパク質をコードする遺伝子を組込み、宿
主に導入し、発現させて該タンパク質と選択マーカータ
ンパク質との融合タンパク質を生成させ、該選択マーカ
ータンパク質により目的とするタンパク質の発現の同定
を行うことを特徴とする組換えタンパク質の製造方法
（請求項１１）からなる。
載の融合選択マーカー遺伝子によってコードされる融合
タンパク質（請求項９）や、請求項１〜８のいずれか記
載の融合選択マーカー遺伝子を含有する発現ベクター
（請求項１０）や、請求項１０記載の発現ベクターに、
目的とするタンパク質をコードする遺伝子を組込み、宿
主に導入し、発現させて該タンパク質と選択マーカータ
ンパク質との融合タンパク質を生成させ、該選択マーカ
ータンパク質により目的とするタンパク質の発現の同定
を行うことを特徴とする組換えタンパク質の製造方法
（請求項１１）からなる。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明は、薬剤耐性遺伝子とレポ
ーター遺伝子との異なる２つの選択マーカーを結合し
て、これを目的とするタンパク質をコードする遺伝子に
結合して、２つの選択マーカーの融合タンパク質を含む
組換えタンパク質として発現することにより、目的とす
るタンパク質をコードする遺伝子の発現の同定の精度を
向上させることができる。しかも該薬剤耐性遺伝子とレ
ポーター遺伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩
基配列を介して結合することにより、薬剤耐性遺伝子と
レポーター遺伝子の選択マーカーとしての機能を効果的
に発現させて、選択マーカーとしての使用を可能とす
る。すなわち、本発明においては、薬剤耐性遺伝子やレ
ポーター遺伝子を結合して用いる場合に生じる、宿主細
胞に対する細胞毒性の発現やレポーター機能の発現の減
少の問題を解消して、有効な選択マーカーとしての使用
を可能とする。
ーター遺伝子との異なる２つの選択マーカーを結合し
て、これを目的とするタンパク質をコードする遺伝子に
結合して、２つの選択マーカーの融合タンパク質を含む
組換えタンパク質として発現することにより、目的とす
るタンパク質をコードする遺伝子の発現の同定の精度を
向上させることができる。しかも該薬剤耐性遺伝子とレ
ポーター遺伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩
基配列を介して結合することにより、薬剤耐性遺伝子と
レポーター遺伝子の選択マーカーとしての機能を効果的
に発現させて、選択マーカーとしての使用を可能とす
る。すなわち、本発明においては、薬剤耐性遺伝子やレ
ポーター遺伝子を結合して用いる場合に生じる、宿主細
胞に対する細胞毒性の発現やレポーター機能の発現の減
少の問題を解消して、有効な選択マーカーとしての使用
を可能とする。
【００１１】（異なる２つの選択マーカーからなる融合
選択マーカーの構築）本発明においては、選択マーカー
として、遺伝子の発現の同定の精度を向上させるため
に、異なる２つの選択マーカーからなる融合選択マーカ
ー遺伝子を採用した。異なる２つの選択マーカーの一方
として、薬剤耐性遺伝子を選択した。薬剤耐性遺伝子の
中で、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子(puromycin N-ace
tyltaransferase：ｐａｃ)は、選択薬剤濃度が低く選択
期間も数日で済むという利点があるので、ｐａｃの持つ
こういった利点に注目し、薬剤耐性遺伝子の材料として
ｐａｃを採用し、他のマーカー遺伝子の融合遺伝子の作
成の可能性について検討した。融合遺伝子を用いること
の主な利点をまとめると、以下の３点が挙げられる。 １）レポーター遺伝子と薬剤選択遺伝子が同一遺伝子上
にあるため、安定形質導入細胞を選択する過程で、レポ
ーターと選択遺伝子の組み換えにより両遺伝子が分断さ
れる可能性が低くなる。 ２）ＥＧＦＰなどの特別な前処理を行うことなくｉｎ
ｓｉｔｕで発現の確認可能なレポーター遺伝子を融合タ
ンパク質の相手として選んだ場合、遺伝子導入細胞を生
きた状態で識別することが可能となる。たとえばフロー
サイトメトリーを用いた細胞のソーティングなどを利用
することにより、遺伝子導入細胞を効率良く選択するこ
とができる。 ３）２）のようにＥＧＦＰを融合遺伝子とした場合に
は、融合遺伝子の蛍光シグナルが同時に耐性遺伝子の発
現を意味するため、薬剤による細胞の選択後、擬陽性細
胞（選択薬剤に耐性であるが遺伝子導入されていない細
胞）の識別を容易に行うことができる。
選択マーカーの構築）本発明においては、選択マーカー
として、遺伝子の発現の同定の精度を向上させるため
に、異なる２つの選択マーカーからなる融合選択マーカ
ー遺伝子を採用した。異なる２つの選択マーカーの一方
として、薬剤耐性遺伝子を選択した。薬剤耐性遺伝子の
中で、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子(puromycin N-ace
tyltaransferase：ｐａｃ)は、選択薬剤濃度が低く選択
期間も数日で済むという利点があるので、ｐａｃの持つ
こういった利点に注目し、薬剤耐性遺伝子の材料として
ｐａｃを採用し、他のマーカー遺伝子の融合遺伝子の作
成の可能性について検討した。融合遺伝子を用いること
の主な利点をまとめると、以下の３点が挙げられる。 １）レポーター遺伝子と薬剤選択遺伝子が同一遺伝子上
にあるため、安定形質導入細胞を選択する過程で、レポ
ーターと選択遺伝子の組み換えにより両遺伝子が分断さ
れる可能性が低くなる。 ２）ＥＧＦＰなどの特別な前処理を行うことなくｉｎ
ｓｉｔｕで発現の確認可能なレポーター遺伝子を融合タ
ンパク質の相手として選んだ場合、遺伝子導入細胞を生
きた状態で識別することが可能となる。たとえばフロー
サイトメトリーを用いた細胞のソーティングなどを利用
することにより、遺伝子導入細胞を効率良く選択するこ
とができる。 ３）２）のようにＥＧＦＰを融合遺伝子とした場合に
は、融合遺伝子の蛍光シグナルが同時に耐性遺伝子の発
現を意味するため、薬剤による細胞の選択後、擬陽性細
胞（選択薬剤に耐性であるが遺伝子導入されていない細
胞）の識別を容易に行うことができる。
【００１２】本発明者は、ｐａｃとＥＧＦＰ（enhanced
green fluorescent protein）（Biochem. Biophys. Re
s. Commun. 227, 707-711, 1996）,ＲＦＰ（red fluore
scent protein）（Nat. Biotechnol. 17, 969-973, 199
9、Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 98, 462-467, 2001）
との融合遺伝子の可能性について検討した。本発明者
は、ＥＧＦＰ,ＲＦＰをｐａｃのＮ末端、Ｃ末端に融合
させ、ＣＭＶプロモーター下にＣＯＳ７細胞に発現させ
た。ＥＧＦＰ,ＲＦＰをｐａｃのＮ末端、Ｃ末端どちら
に融合させた場合にも、遺伝子導入されたＣＯＳ７細胞
はｐｕｒｏｍｙｃｉｎに耐性を示し、同時に細胞の胞体
全体にＥＧＦＰ,ＲＦＰの発現が蛍光顕微鏡下に確認さ
れた。ＧＦＰやＲＦＰは共に蛍光タンパク質ではある
が、その構造は全く異なる異種のタンパク質である。こ
の両者で目的とする形質が保持されたことは、今回選択
した遺伝子以外を用いてもｐａｃと他の様々な他のマー
カー遺伝子の融合遺伝子の作製の可能性があることを強
く示している。しかしながら、ｐａｃとＥＧＦＰ,ＲＦ
Ｐ融合タンパク質が細胞毒性を示すという問題があっ
た。
green fluorescent protein）（Biochem. Biophys. Re
s. Commun. 227, 707-711, 1996）,ＲＦＰ（red fluore
scent protein）（Nat. Biotechnol. 17, 969-973, 199
9、Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 98, 462-467, 2001）
との融合遺伝子の可能性について検討した。本発明者
は、ＥＧＦＰ,ＲＦＰをｐａｃのＮ末端、Ｃ末端に融合
させ、ＣＭＶプロモーター下にＣＯＳ７細胞に発現させ
た。ＥＧＦＰ,ＲＦＰをｐａｃのＮ末端、Ｃ末端どちら
に融合させた場合にも、遺伝子導入されたＣＯＳ７細胞
はｐｕｒｏｍｙｃｉｎに耐性を示し、同時に細胞の胞体
全体にＥＧＦＰ,ＲＦＰの発現が蛍光顕微鏡下に確認さ
れた。ＧＦＰやＲＦＰは共に蛍光タンパク質ではある
が、その構造は全く異なる異種のタンパク質である。こ
の両者で目的とする形質が保持されたことは、今回選択
した遺伝子以外を用いてもｐａｃと他の様々な他のマー
カー遺伝子の融合遺伝子の作製の可能性があることを強
く示している。しかしながら、ｐａｃとＥＧＦＰ,ＲＦ
Ｐ融合タンパク質が細胞毒性を示すという問題があっ
た。
【００１３】今回Ｐａｃに融合させたＥＧＦＰはコドン
使用頻度を最適化することにより真核細胞での発現を増
強したものであり、その高発現によって細胞毒性を呈す
ることがあることが記載されている。そこで、本発明者
は、まず融合タンパク質の発現量を調節することによっ
て細胞毒性を減弱させることを試みた。ＥＧＦＰ, ｐａ
ｃ融合遺伝子の発現プロモーターをＣＭＶからＣＭＶプ
ロモモーターに比してプロモーター活性の低いｔｋプロ
モーターに変えると、発現量が低下することにより細胞
の生存期間の延長を認めた。しかしながら、発現量低下
によって視認性とｐｕｒｏｍｙｃｉｎに対する抵抗性が
低下した。また、培養を継続するとＣＭＶプロモーター
で発現させた場合と同様に、融合タンパク質の不適切な
蓄積による細胞毒性が認められた。
使用頻度を最適化することにより真核細胞での発現を増
強したものであり、その高発現によって細胞毒性を呈す
ることがあることが記載されている。そこで、本発明者
は、まず融合タンパク質の発現量を調節することによっ
て細胞毒性を減弱させることを試みた。ＥＧＦＰ, ｐａ
ｃ融合遺伝子の発現プロモーターをＣＭＶからＣＭＶプ
ロモモーターに比してプロモーター活性の低いｔｋプロ
モーターに変えると、発現量が低下することにより細胞
の生存期間の延長を認めた。しかしながら、発現量低下
によって視認性とｐｕｒｏｍｙｃｉｎに対する抵抗性が
低下した。また、培養を継続するとＣＭＶプロモーター
で発現させた場合と同様に、融合タンパク質の不適切な
蓄積による細胞毒性が認められた。
【００１４】そこで次に介在アミノ酸配列について検討
を行った。その結果、ＥＧＦＰとｐａｃとを結ぶ介在ア
ミノ酸配列の差異により細胞毒性に変化が見られること
が判明した。その介在アミノ酸配列の差異による毒性変
化の詳細な機構は不明であるが、介在アミノ酸配列によ
って生成融合タンパク質の細胞内分布、蛍光強度等に影
響がみられ、それらの要因の相互作用によって細胞毒性
が規定される可能性があることが明らかになった。実際
に、ある介在配列が存在する場合、融合タンパク質が細
胞内の不適切な位置に蓄積し、極めて強い細胞毒性が認
められた。これらの現象は、ＣＯＳ７細胞ばかりでな
く、ＣＶ−１、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＨｅＬａａ細胞でも認
められた。そして、検討を重ねた結果、適当な介在アミ
ノ酸配列に変えることにより、ＣＭＶプロモーター下で
も細胞毒性が少ないＥＧＦＰ−ｐａｃ融合遺伝子Ｇｐａ
ｃの作製に成功した。この融合遺伝子から発現されるタ
ンパク質はＥＧＦＰによる十分な視認性を有し、かつｐ
ｕｒｏｍｙｃｉｎによる薬剤選択を可能とするものであ
った。
を行った。その結果、ＥＧＦＰとｐａｃとを結ぶ介在ア
ミノ酸配列の差異により細胞毒性に変化が見られること
が判明した。その介在アミノ酸配列の差異による毒性変
化の詳細な機構は不明であるが、介在アミノ酸配列によ
って生成融合タンパク質の細胞内分布、蛍光強度等に影
響がみられ、それらの要因の相互作用によって細胞毒性
が規定される可能性があることが明らかになった。実際
に、ある介在配列が存在する場合、融合タンパク質が細
胞内の不適切な位置に蓄積し、極めて強い細胞毒性が認
められた。これらの現象は、ＣＯＳ７細胞ばかりでな
く、ＣＶ−１、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＨｅＬａａ細胞でも認
められた。そして、検討を重ねた結果、適当な介在アミ
ノ酸配列に変えることにより、ＣＭＶプロモーター下で
も細胞毒性が少ないＥＧＦＰ−ｐａｃ融合遺伝子Ｇｐａ
ｃの作製に成功した。この融合遺伝子から発現されるタ
ンパク質はＥＧＦＰによる十分な視認性を有し、かつｐ
ｕｒｏｍｙｃｉｎによる薬剤選択を可能とするものであ
った。
【００１５】さらに本発明者は、今回作製したＧｐａｃ
発現ベクターを用いてＣＯＳ７細胞においてＧｐａｃの
安定形質発現細胞を確立することに成功した。この細胞
は、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによる解析で融
合タンパク質の発現が確認され、高濃度のｐｕｒｏｍｙ
ｃｉｎ存在下で増殖することが確認された。ついで、Ｇ
ｐａｃをＨＩＶ−１ｇｅｎｏｍｅに組み込み、これをＶ
ＳＰ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇの手法によりＴ細胞株
であるＨ９ならびにＥＢ ｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｅｄＢ ｃｅｌｌ(Ｂ−ＬＣＬ)に導入し、ＨＩＶ−
１タンパク質を安定に発現する細胞の作製に成功した。
発現ベクターを用いてＣＯＳ７細胞においてＧｐａｃの
安定形質発現細胞を確立することに成功した。この細胞
は、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによる解析で融
合タンパク質の発現が確認され、高濃度のｐｕｒｏｍｙ
ｃｉｎ存在下で増殖することが確認された。ついで、Ｇ
ｐａｃをＨＩＶ−１ｇｅｎｏｍｅに組み込み、これをＶ
ＳＰ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇの手法によりＴ細胞株
であるＨ９ならびにＥＢ ｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｅｄＢ ｃｅｌｌ(Ｂ−ＬＣＬ)に導入し、ＨＩＶ−
１タンパク質を安定に発現する細胞の作製に成功した。
【００１６】（異なる２つの融合選択マーカーの実施の
態様）本発明は、薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子と
を、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して結
合し、融合選択マーカー遺伝子として使用することから
なる。本発明で用いる薬剤耐性遺伝子としては、ｎｅｏ
ｍｙｃｉｎ、ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ、ｐｕｒｏｍｙｃｉ
ｎ等既知の薬剤耐性遺伝子を用いることができるが、選
択薬剤濃度が低く選択期間も数日で済むという利点を有
するｐｕｒｏｍｙｃｉｎが有利に利用できる。また、本
発明で用いるレポーター遺伝子としては、既知のレポー
ター遺伝子を用いることができるが、ＥＧＦＰ,ＲＦＰ
等の蛍光タンパク質を発現する遺伝子が特に有利に利用
できる。本発明においては、薬剤耐性遺伝子とレポータ
ー遺伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列
を介して結合するが、該介在アミノ酸配列としては、薬
剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子のマーカー機能の発現
をみて、好ましいアミノ酸配列のものを、適宜選択する
ことができる。好ましい配列として、ＹＳＤＬＱＳから
なるアミノ酸配列を挙げることができる。薬剤耐性遺伝
子とレポーター遺伝子との結合は、介在アミノ酸配列を
コードする塩基配列を介して、薬剤耐性遺伝子のＣ末端
にレポーター遺伝子のＮ末端を結合しても良いし、又は
レポーター遺伝子のＣ末端に薬剤耐性遺伝子のＮ末端を
結合しても良い。
態様）本発明は、薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子と
を、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して結
合し、融合選択マーカー遺伝子として使用することから
なる。本発明で用いる薬剤耐性遺伝子としては、ｎｅｏ
ｍｙｃｉｎ、ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ、ｐｕｒｏｍｙｃｉ
ｎ等既知の薬剤耐性遺伝子を用いることができるが、選
択薬剤濃度が低く選択期間も数日で済むという利点を有
するｐｕｒｏｍｙｃｉｎが有利に利用できる。また、本
発明で用いるレポーター遺伝子としては、既知のレポー
ター遺伝子を用いることができるが、ＥＧＦＰ,ＲＦＰ
等の蛍光タンパク質を発現する遺伝子が特に有利に利用
できる。本発明においては、薬剤耐性遺伝子とレポータ
ー遺伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列
を介して結合するが、該介在アミノ酸配列としては、薬
剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子のマーカー機能の発現
をみて、好ましいアミノ酸配列のものを、適宜選択する
ことができる。好ましい配列として、ＹＳＤＬＱＳから
なるアミノ酸配列を挙げることができる。薬剤耐性遺伝
子とレポーター遺伝子との結合は、介在アミノ酸配列を
コードする塩基配列を介して、薬剤耐性遺伝子のＣ末端
にレポーター遺伝子のＮ末端を結合しても良いし、又は
レポーター遺伝子のＣ末端に薬剤耐性遺伝子のＮ末端を
結合しても良い。
【００１７】本発明の融合選択マーカー遺伝子は、発現
ベクターに挿入して利用される。すなわち、本発明の融
合選択マーカー遺伝子を含有する発現ベクターに、目的
とするタンパク質をコードする遺伝子を組込み、宿主に
導入し、発現させて該タンパク質と選択マーカータンパ
ク質とを融合した組換えタンパク質を生成させ、該選択
マーカータンパク質により目的とするタンパク質の発現
の同定を行う。本発明の融合選択マーカー遺伝子を用い
ることにより、目的とするタンパク質をコードする遺伝
子の発現の同定の精度を向上させると共に、薬剤耐性遺
伝子とレポーター遺伝子の選択マーカーとしての機能を
効果的に発現させて、優れた選択マーカーとしての使用
を可能とする。
ベクターに挿入して利用される。すなわち、本発明の融
合選択マーカー遺伝子を含有する発現ベクターに、目的
とするタンパク質をコードする遺伝子を組込み、宿主に
導入し、発現させて該タンパク質と選択マーカータンパ
ク質とを融合した組換えタンパク質を生成させ、該選択
マーカータンパク質により目的とするタンパク質の発現
の同定を行う。本発明の融合選択マーカー遺伝子を用い
ることにより、目的とするタンパク質をコードする遺伝
子の発現の同定の精度を向上させると共に、薬剤耐性遺
伝子とレポーター遺伝子の選択マーカーとしての機能を
効果的に発現させて、優れた選択マーカーとしての使用
を可能とする。
【００１８】
【実施例】以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体
的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定
されるものではない。 ［方法と材料］ （ベクター）この実施例で、用いたベクターは、以下の
様にして作製した。 （１）ｐＧｐａｃ（図２） pPUR(CLONTECH)をｔｅｍｐｌａｔｅにして、以下に示す
５′、３′末端それぞれに、ClaI site,XhoI siteを付
加したｐｒｉｍｅｒを用いて、ＰＣＲ法をもちいてＰａ
ｃ遺伝子を増幅し、pCR-BluntII TOPO vector (Invitro
gen) にｃｌｏｎｉｎｇし(pTOPO-pac)、sequenceを確認
した。 forward primer :CATCGATGACCGAGTACAAGCCCA（配列番号
１：Ｐ１） reverse primer : CTCGAGTCAGGCACCGGGCTTGCGGG（配列
番号２：Ｐ２） ここから、Ｐａｃ遺伝子を含む形で、ClaI site からBa
mHI siteまでを切り出し、pEGFP-C3 (CLONTECH )のAccI
siteからBamHI siteに組み込んだ。こうしてできたpla
smidがpG-MCS-pacでＥＧＦＰとＰａｃを結ぶ介在配列を
図１に示す。pG-MCS-pacのBglII siteからPstI site間
をａｄａｐｔｅｒで置き換え介在配列を変化させたもの
がpGpacでその配列は、図１に示す通りである。参考に
もとのベクターpEGFP-C3についても示した。図２にpGpa
c plasmidの構造を示す。図に示すように、５′末端に
は、NheI,AgeI,Eco47III site 、３′末端にはXhoI,Eco
RI,SpeI,BamHIをユニークな制限酵素部位として付加
し、この融合遺伝子を切り出すことができるように設計
した。
的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定
されるものではない。 ［方法と材料］ （ベクター）この実施例で、用いたベクターは、以下の
様にして作製した。 （１）ｐＧｐａｃ（図２） pPUR(CLONTECH)をｔｅｍｐｌａｔｅにして、以下に示す
５′、３′末端それぞれに、ClaI site,XhoI siteを付
加したｐｒｉｍｅｒを用いて、ＰＣＲ法をもちいてＰａ
ｃ遺伝子を増幅し、pCR-BluntII TOPO vector (Invitro
gen) にｃｌｏｎｉｎｇし(pTOPO-pac)、sequenceを確認
した。 forward primer :CATCGATGACCGAGTACAAGCCCA（配列番号
１：Ｐ１） reverse primer : CTCGAGTCAGGCACCGGGCTTGCGGG（配列
番号２：Ｐ２） ここから、Ｐａｃ遺伝子を含む形で、ClaI site からBa
mHI siteまでを切り出し、pEGFP-C3 (CLONTECH )のAccI
siteからBamHI siteに組み込んだ。こうしてできたpla
smidがpG-MCS-pacでＥＧＦＰとＰａｃを結ぶ介在配列を
図１に示す。pG-MCS-pacのBglII siteからPstI site間
をａｄａｐｔｅｒで置き換え介在配列を変化させたもの
がpGpacでその配列は、図１に示す通りである。参考に
もとのベクターpEGFP-C3についても示した。図２にpGpa
c plasmidの構造を示す。図に示すように、５′末端に
は、NheI,AgeI,Eco47III site 、３′末端にはXhoI,Eco
RI,SpeI,BamHIをユニークな制限酵素部位として付加
し、この融合遺伝子を切り出すことができるように設計
した。
【００１９】（２）ｐＦＬＡＧ−ｐａｃ
Ｐａｃの局在と分子量を確認するために、pTOPO-pac の
ClaI site からXhoI siteまでのＰａｃを含む領域を制
限酵素を用いて切り出し、pFLAG CMV-2 ( Sigma) のCla
I siteからSalI siteに組み込んだベクターを作製し( p
FLAG- pac )、ＰａｃのN末端にFLAG epitopeを付加した
形でＰａｃ遺伝子が発現されるようにした。ＦＬＡＧと
ｐａｃの間の介在アミノ酸配列を図３に示した。
ClaI site からXhoI siteまでのＰａｃを含む領域を制
限酵素を用いて切り出し、pFLAG CMV-2 ( Sigma) のCla
I siteからSalI siteに組み込んだベクターを作製し( p
FLAG- pac )、ＰａｃのN末端にFLAG epitopeを付加した
形でＰａｃ遺伝子が発現されるようにした。ＦＬＡＧと
ｐａｃの間の介在アミノ酸配列を図３に示した。
【００２０】（３）ｐＨＸＢ２ Ｇｐａｃ（図４−
（１）） ＨＩＶ−１にＧｐａｃ発現遺伝子を組み込んだｐＣＴＬ
Ｇｐａｃは以下のように作製した。ＨＩＶ−１の感染製
分子クローンであるpSP65HXB2Ecogptをもとに作製し
た。Vesicular stomatitis virus のenvelope protein
(VSV-G)を用いてpseudotypingを行うために、以下の様
にしてenv geneを欠損させた。まず、ＨＩＶ−１の感染
製分子クローンであるNL4-3のenv geneのAflIII siteか
らMfeI siteまでの約１．５ｋｂｐｓを切り出し、XbaI
linkerを組み込んだ。この欠損したenvを含むSalI site
からBamHI siteまでの領域を、HXB2のSalI siteからBam
HI siteに組み込んだ。Gpac geneは、pGpacからＰＣＲ
を用いて、５′endに ClaI site、３′endにXhoI site
を付けて増幅し、HXB2の nef 領域のClaIとXhoIに組み
込んだ。VSV-G発現ベクターは、CLONTECH社から販売さ
れているpVSV-Gを購入して用いた（図４−（２））。
（１）） ＨＩＶ−１にＧｐａｃ発現遺伝子を組み込んだｐＣＴＬ
Ｇｐａｃは以下のように作製した。ＨＩＶ−１の感染製
分子クローンであるpSP65HXB2Ecogptをもとに作製し
た。Vesicular stomatitis virus のenvelope protein
(VSV-G)を用いてpseudotypingを行うために、以下の様
にしてenv geneを欠損させた。まず、ＨＩＶ−１の感染
製分子クローンであるNL4-3のenv geneのAflIII siteか
らMfeI siteまでの約１．５ｋｂｐｓを切り出し、XbaI
linkerを組み込んだ。この欠損したenvを含むSalI site
からBamHI siteまでの領域を、HXB2のSalI siteからBam
HI siteに組み込んだ。Gpac geneは、pGpacからＰＣＲ
を用いて、５′endに ClaI site、３′endにXhoI site
を付けて増幅し、HXB2の nef 領域のClaIとXhoIに組み
込んだ。VSV-G発現ベクターは、CLONTECH社から販売さ
れているpVSV-Gを購入して用いた（図４−（２））。
【００２１】（Ｐａｃの分子量と局在の確認）５×１０
5のＣＯＳ７細胞を６０ｍｍシャーレにまき、１２時間
後、それぞれ０．５μｇのpFLAG-pacをFuGENE6(Roche)
を用いてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。１２時間後、
細胞を剥がし、ＰＢＳで２回洗浄後、１００μｌのRIPA
lysisbufferで溶解し、遠心したのち上清を回収しSDS
PAGEを行った。その後、anti-FLAGM2 monoclonal antib
ody (Sigma)を用いてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎ
ｇを行った。同じｖｅｃｔｏｒをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉ
ｏｎされたＣＯＳ７細胞を４％ paraformaldehydeで固
定し、０．５％Triton X-100で処理した。Ｐａｃの局在
を調べるため、一次抗体にanti-FLAGM2 monoclonal ant
ibody、二次抗体にFITC conjugated anti-mouse IgG an
tibodyを用いた間接蛍光抗体法を行った。同時に、ＰＥ
で核染色をおこなった。
5のＣＯＳ７細胞を６０ｍｍシャーレにまき、１２時間
後、それぞれ０．５μｇのpFLAG-pacをFuGENE6(Roche)
を用いてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。１２時間後、
細胞を剥がし、ＰＢＳで２回洗浄後、１００μｌのRIPA
lysisbufferで溶解し、遠心したのち上清を回収しSDS
PAGEを行った。その後、anti-FLAGM2 monoclonal antib
ody (Sigma)を用いてＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎ
ｇを行った。同じｖｅｃｔｏｒをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉ
ｏｎされたＣＯＳ７細胞を４％ paraformaldehydeで固
定し、０．５％Triton X-100で処理した。Ｐａｃの局在
を調べるため、一次抗体にanti-FLAGM2 monoclonal ant
ibody、二次抗体にFITC conjugated anti-mouse IgG an
tibodyを用いた間接蛍光抗体法を行った。同時に、ＰＥ
で核染色をおこなった。
【００２２】（Ｇｐａｃ発現ＣＯＳ７細胞株の樹立）５
×１０6のＣＯＳ７細胞に、１０μｇのpGpacをエレクト
ロポレーションによって遺伝子導入した。４８時間培養
後、１０μｇ/ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含む培養液
中でさらに培養を継続した。選択開始から４８時間後に
一度限界希釈法によるｃｌｏｎｉｎｇを行ったのち、さ
らに１０μｇ/ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含む培養液
中でさらに培養を継続した。
×１０6のＣＯＳ７細胞に、１０μｇのpGpacをエレクト
ロポレーションによって遺伝子導入した。４８時間培養
後、１０μｇ/ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含む培養液
中でさらに培養を継続した。選択開始から４８時間後に
一度限界希釈法によるｃｌｏｎｉｎｇを行ったのち、さ
らに１０μｇ/ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含む培養液
中でさらに培養を継続した。
【００２３】（ＨＩＶ−タンパク質、Ｇｐａｃ発現Ｈ９
細胞株の樹立）ＣＯＳ７細胞に、HXB2GpacとpVSV-G (CL
ONTECH)をFugene6 (Roche)を用いてｃｏｔｒａｎｓｆｅ
ｃｔｉｏｎした。４８時間後、pseudotype vurusを含む
上清を回収し、０．４５μｍのフィルターを通した後、
１ｍｌの上清を１×１０6個のＨ９およびＢ−ＬＣＬに
加えることにより感染させた。６時時間後、一度ｍｅｄ
ｉｕｍで洗ったのち、さらに４８時間培養を行った。そ
の後、培養液中に０．５μｇ／ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉ
ｎを加え、２日ごとにｍｅｄｉｕｍを交換した。選択開
始４日後、細胞を４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄ
ｅで固定し、FACS (FACS Calibur, BECTON DICKINSON)
による解析を行った。
細胞株の樹立）ＣＯＳ７細胞に、HXB2GpacとpVSV-G (CL
ONTECH)をFugene6 (Roche)を用いてｃｏｔｒａｎｓｆｅ
ｃｔｉｏｎした。４８時間後、pseudotype vurusを含む
上清を回収し、０．４５μｍのフィルターを通した後、
１ｍｌの上清を１×１０6個のＨ９およびＢ−ＬＣＬに
加えることにより感染させた。６時時間後、一度ｍｅｄ
ｉｕｍで洗ったのち、さらに４８時間培養を行った。そ
の後、培養液中に０．５μｇ／ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉ
ｎを加え、２日ごとにｍｅｄｉｕｍを交換した。選択開
始４日後、細胞を４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄ
ｅで固定し、FACS (FACS Calibur, BECTON DICKINSON)
による解析を行った。
【００２４】（Ｇｐａｃ、ＨＩＶ−１タンパク質の発現
の確認）５×１０5のＣＯＳ７細胞を６０ｍｍシャーレ
にまき、１２時間後、０．５μｇのpEGFP-C3をFuGENE6
(Roche)を用いてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。１２
時間後、細胞を剥がし、ＰＢＳで２回洗浄後、１００μ
ｌのRIPA lysis bufferで溶解し、遠心したのち上清を
回収した。また、今回樹立した１×１０6のＧｐａｃ安
定発現ＣＯＳ７細胞ならびにＨＩＶ−１タンパク質とＧ
ｐａｃを安定発現している１×１０7のＨ９、Ｂ−ＬＣ
Ｌから、同様の方法で細胞溶解液を調製した。これらの
細胞溶解液を用いてSDS PAGEを行い、Ｇｐａｃはanti-E
GFP monoclonal antibody (CLONTECH)、ＨＩＶ−１タン
パク質についてはＨＩＶ−１感染者血清 を用いてＷｅ
ｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。
の確認）５×１０5のＣＯＳ７細胞を６０ｍｍシャーレ
にまき、１２時間後、０．５μｇのpEGFP-C3をFuGENE6
(Roche)を用いてｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。１２
時間後、細胞を剥がし、ＰＢＳで２回洗浄後、１００μ
ｌのRIPA lysis bufferで溶解し、遠心したのち上清を
回収した。また、今回樹立した１×１０6のＧｐａｃ安
定発現ＣＯＳ７細胞ならびにＨＩＶ−１タンパク質とＧ
ｐａｃを安定発現している１×１０7のＨ９、Ｂ−ＬＣ
Ｌから、同様の方法で細胞溶解液を調製した。これらの
細胞溶解液を用いてSDS PAGEを行い、Ｇｐａｃはanti-E
GFP monoclonal antibody (CLONTECH)、ＨＩＶ−１タン
パク質についてはＨＩＶ−１感染者血清 を用いてＷｅ
ｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。
【００２５】［結果］
（介在配列が融合タンパクの機能に与える影響）ｐＥＧ
ＦＰＣ３のＥＧＦＰのＣ末端にあるmultiple cloning
siteにあるClaIならびにBamHI siteにＰａｃ遺伝子を組
み込み、pG-MCS-pacを作製した。その結果、図２に示す
ように、ＥＧＦＰとＰａｃの融合タンパク質にYSDLELKL
RILQSという介在配列が存在することとなった。これを
ＣＯＳ７細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、２４時間
後に蛍光顕微鏡で観察すると、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏ
ｎされた細胞の核周囲に蛍光物質の著明な蓄積を認めた
(図５−（１）)。 ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎされた細
胞で４８時間以上生き残ったものは稀であった。元のベ
クターであるＥＧＦＰＣ３をｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
した場合、この現象は認められなかった（図５−２
（２））。また、pFLAGpacをＣＯＳ７細胞にｔｒａｎｓ
ｆｅｃｔｉｏｎし間接蛍光抗体法で局在を調べたが、細
胞全体に分布していることが確認された。
ＦＰＣ３のＥＧＦＰのＣ末端にあるmultiple cloning
siteにあるClaIならびにBamHI siteにＰａｃ遺伝子を組
み込み、pG-MCS-pacを作製した。その結果、図２に示す
ように、ＥＧＦＰとＰａｃの融合タンパク質にYSDLELKL
RILQSという介在配列が存在することとなった。これを
ＣＯＳ７細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、２４時間
後に蛍光顕微鏡で観察すると、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏ
ｎされた細胞の核周囲に蛍光物質の著明な蓄積を認めた
(図５−（１）)。 ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎされた細
胞で４８時間以上生き残ったものは稀であった。元のベ
クターであるＥＧＦＰＣ３をｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
した場合、この現象は認められなかった（図５−２
（２））。また、pFLAGpacをＣＯＳ７細胞にｔｒａｎｓ
ｆｅｃｔｉｏｎし間接蛍光抗体法で局在を調べたが、細
胞全体に分布していることが確認された。
【００２６】原因について検討した結果、本発明者は、
ＥＧＦＰのＣ末端に存在している時には問題にならなか
ったが、Ｐａｃを融合させた結果、介在配列がそれ自身
もしくは全体の構造の変化をもたらすことなどにより、
細胞毒性を増強している可能性があると考えた。そこ
で、介在配列からELKLRILを除いた融合タンパク質を発
現するベクター (pGpac ; 図２)を作製した。これを、p
G-MCS-pacと同様の方法で表現型を調べたところ、強発
現している細胞でも蛍光物質の不適当な蓄積が無く(図
５−（３）)、細胞毒性も大幅に減弱した。また、優れ
た視認性を有すると共に、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎに対して
選択に十分な耐性を示した。以下に、ｐＧｐａｃを用い
て、その有用性の検討を進めた。
ＥＧＦＰのＣ末端に存在している時には問題にならなか
ったが、Ｐａｃを融合させた結果、介在配列がそれ自身
もしくは全体の構造の変化をもたらすことなどにより、
細胞毒性を増強している可能性があると考えた。そこ
で、介在配列からELKLRILを除いた融合タンパク質を発
現するベクター (pGpac ; 図２)を作製した。これを、p
G-MCS-pacと同様の方法で表現型を調べたところ、強発
現している細胞でも蛍光物質の不適当な蓄積が無く(図
５−（３）)、細胞毒性も大幅に減弱した。また、優れ
た視認性を有すると共に、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎに対して
選択に十分な耐性を示した。以下に、ｐＧｐａｃを用い
て、その有用性の検討を進めた。
【００２７】（Ｇｐａｃ発現ＣＯＳ７細胞株の樹立）図
６に、ｐＧｐａｃをエレクトロポレーションによって遺
伝子導入後、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる選択を開始して
２ヶ月を経過したＣＯＳ７細胞の写真を示す。（Ａ）は
可視光下、（Ｂ）はＵＶ照射下で観察した場合を示す。
ほとんどすべての細胞でＥＧＦＰの十分な発現が認めら
れた。この細胞は、１０μｇ/ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉ
ｎの存在下でも非形質転換細胞とほぼ同様の増殖を示
し、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ抵抗性を獲得していることが明
らかになった。今回、遺伝子導入後ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ
による選択を開始して４８時間で、生存する細胞のほと
んどはＥＧＦＰ発現細胞となり、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎに
より、迅速な遺伝子導入細胞の選択が可能であることが
明らかになった。今回は限界希釈法にｐｕｒｏｍｙｃｉ
ｎによる選択を組み合わせて、迅速にｃｌｏｎｉｎｇを
行うことができたが、セルソーターなどを組み合わせる
ことにより、発現細胞の選択がより簡便になると考えら
れた。
６に、ｐＧｐａｃをエレクトロポレーションによって遺
伝子導入後、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる選択を開始して
２ヶ月を経過したＣＯＳ７細胞の写真を示す。（Ａ）は
可視光下、（Ｂ）はＵＶ照射下で観察した場合を示す。
ほとんどすべての細胞でＥＧＦＰの十分な発現が認めら
れた。この細胞は、１０μｇ/ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉ
ｎの存在下でも非形質転換細胞とほぼ同様の増殖を示
し、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ抵抗性を獲得していることが明
らかになった。今回、遺伝子導入後ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ
による選択を開始して４８時間で、生存する細胞のほと
んどはＥＧＦＰ発現細胞となり、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎに
より、迅速な遺伝子導入細胞の選択が可能であることが
明らかになった。今回は限界希釈法にｐｕｒｏｍｙｃｉ
ｎによる選択を組み合わせて、迅速にｃｌｏｎｉｎｇを
行うことができたが、セルソーターなどを組み合わせる
ことにより、発現細胞の選択がより簡便になると考えら
れた。
【００２８】（Ｇｐａｃの発現）樹立したＧｐａｃ安定
発現ＣＯＳ７細胞において、Ｇｐａｃの発現をＷｅｓｔ
ｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより確認した。まずＰａｃ
の分子量を確認した。図７−（Ａ）に、ＣＯＳ７細胞に
FLAG-pacを一過性に発現させ、その細胞溶解液をanti-F
LAGM2 monoclonal antibody ( Sigma ) を用いたＷｅｓ
ｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇで解析した結果を示す。Ｐ
ａｃはアミノ酸配列に基づくと予想分子量２２ｋＤａの
タンパク質であるが、FLAG epitopeが付与されたことに
より若干の分子量の増加が認められた。図７−（Ｂ）
に、ＥＧＦＰ一過性に発現させたＣＯＳ７細胞と、今回
作製したＧｐａｃ安定発現ＣＯＳ７細胞の細胞溶解液
を、anti-EGFP monoclonal antibody (CLONTECH) を用
いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇで解析した結果
を示す。ＥＧＦＰは２７ｋＤａの分子量をもつが、pEGF
P-C3で発現させた場合はＣ末端に付加されたマルチクロ
ーニングサイトのために約３１ｋＤａの分子量を示し
た。今回作成したＧｐａｃ安定発現ＣＯＳ７細胞におい
ては、図７−（Ｂ）のＧｐａｃのｌａｎｅに示されるよ
うに、ＰａｃとＥＧＦＰ両者の分子量の和に相当する約
５２ｋＤａの分子量を持つ融合タンパク質が生成されて
いることが明らかになった。遺伝子導入されたＣＯＳ７
細胞の表現型から、ＥＧＦＰ／Ｐａｃ融合タンパク質で
あるＧｐａｃが生成されていると考えられた。
発現ＣＯＳ７細胞において、Ｇｐａｃの発現をＷｅｓｔ
ｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより確認した。まずＰａｃ
の分子量を確認した。図７−（Ａ）に、ＣＯＳ７細胞に
FLAG-pacを一過性に発現させ、その細胞溶解液をanti-F
LAGM2 monoclonal antibody ( Sigma ) を用いたＷｅｓ
ｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇで解析した結果を示す。Ｐ
ａｃはアミノ酸配列に基づくと予想分子量２２ｋＤａの
タンパク質であるが、FLAG epitopeが付与されたことに
より若干の分子量の増加が認められた。図７−（Ｂ）
に、ＥＧＦＰ一過性に発現させたＣＯＳ７細胞と、今回
作製したＧｐａｃ安定発現ＣＯＳ７細胞の細胞溶解液
を、anti-EGFP monoclonal antibody (CLONTECH) を用
いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇで解析した結果
を示す。ＥＧＦＰは２７ｋＤａの分子量をもつが、pEGF
P-C3で発現させた場合はＣ末端に付加されたマルチクロ
ーニングサイトのために約３１ｋＤａの分子量を示し
た。今回作成したＧｐａｃ安定発現ＣＯＳ７細胞におい
ては、図７−（Ｂ）のＧｐａｃのｌａｎｅに示されるよ
うに、ＰａｃとＥＧＦＰ両者の分子量の和に相当する約
５２ｋＤａの分子量を持つ融合タンパク質が生成されて
いることが明らかになった。遺伝子導入されたＣＯＳ７
細胞の表現型から、ＥＧＦＰ／Ｐａｃ融合タンパク質で
あるＧｐａｃが生成されていると考えられた。
【００２９】（ＨＩＶ−１タンパク質の発現Ｈ９、Ｂ−
ＬＣＬの作製）様々なｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎの手法
や組み換えウイルスベクターを用いても、外来遺伝子導
入効率が極めて低いことが報告されているものに、Ｔ細
胞株の一つであるＨ９や、ＥＢ virus transformed B c
ell (Ｂ−ＬＣＬ)がある。Ｈ９は、ＨＩＶ−１の標的細
胞の一つであるＴ細胞由来の細胞株であり、ＨＩＶ−１
増殖機構の解析などに有用である。また、Ｂ−ＬＣＬ
は、抗原提示細胞として、細胞障害性Ｔ細胞の機能解析
をはじめとする免疫学の実験に広く用いられている。様
々なｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎの手法や組み換えウイル
スベクターを用いることにより、目的タンパク質をコー
ドする外来遺伝子をこれらの細胞に導入し発現させるこ
とが可能であることが報告されている。また、例えば、
組み換えワクシニアウイルスベクターを用いることによ
り、一過性に高効率に目的タンパク質を発現させること
が可能である。しかしながら、ほぼすべての細胞に目的
タンパク質を安定に発現させるためには、遺伝子導入
後、なんらかの方法により遺伝子導入細胞を選択する必
要がある。
ＬＣＬの作製）様々なｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎの手法
や組み換えウイルスベクターを用いても、外来遺伝子導
入効率が極めて低いことが報告されているものに、Ｔ細
胞株の一つであるＨ９や、ＥＢ virus transformed B c
ell (Ｂ−ＬＣＬ)がある。Ｈ９は、ＨＩＶ−１の標的細
胞の一つであるＴ細胞由来の細胞株であり、ＨＩＶ−１
増殖機構の解析などに有用である。また、Ｂ−ＬＣＬ
は、抗原提示細胞として、細胞障害性Ｔ細胞の機能解析
をはじめとする免疫学の実験に広く用いられている。様
々なｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎの手法や組み換えウイル
スベクターを用いることにより、目的タンパク質をコー
ドする外来遺伝子をこれらの細胞に導入し発現させるこ
とが可能であることが報告されている。また、例えば、
組み換えワクシニアウイルスベクターを用いることによ
り、一過性に高効率に目的タンパク質を発現させること
が可能である。しかしながら、ほぼすべての細胞に目的
タンパク質を安定に発現させるためには、遺伝子導入
後、なんらかの方法により遺伝子導入細胞を選択する必
要がある。
【００３０】本発明者は、ＧｐａｃをＨＩＶ−１ｇｅｎ
ｏｍｅに組み込み、Ｈ９とＢ−ＬＣＬに導入後ｐｕｒｏ
ｍｙｃｉｎで選択を行うことにより、ＨＩＶ−１のタン
パク質を安定に発現する細胞の作製を試みた。図４に示
すように、ＨＸＢ２のnef領域にＧｐａｃを組み込んだ
ベクターpHXB2Gpacを作製した。これをpVSV-Gとともに
ＣＯＳ７細胞にｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、ＶＳ
Ｖ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ ウイルスを作製した。これ
をＨ９とＢ−ＬＣＬに感染させ、４８時間後から、０．
５ｕｇ/ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むで培養を行っ
た。４日間ｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる選択を行った遺伝
子導入細胞を蛍光顕微鏡によって観察すると、肉眼的に
十分視認可能なＥＧＦＰの発現を認め、その後、培養を
継続しても強い細胞毒性は認められなかった。ｐｕｒｏ
ｍｙｃｉｎによる選択開始後4日目にＨ９細胞をｐａｒ
ａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定したのち、ＦＡＣＳ
による解析を行い、非遺伝子導入細胞と遺伝子導入細胞
と比較した。図８−（Ａ）（Ｂ）のドットプロットの図
を比較すると、（Ｂ）のウイルス感染後にｐｕｒｏｍｙ
ｃｉｎで選択を行ったものでは多くの死んだ細胞の集族
があることがわかる。次に生細胞を示すＲ１のｇａｔｅ
を用いて、細胞の蛍光強度の測定を行った。結果を図８
−（Ｃ）のヒストグラムに示す。ヒストグラム上、０．
５μｇ/ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる４日間の選択
によって、Ｍ２に示すように、感染Ｈ９細胞の生き残っ
たものの９３．４％が非感染Ｈ９細胞に比べて明らかに
強い蛍光強度示しており、ＥＧＦＰを発現していること
がわかった。
ｏｍｅに組み込み、Ｈ９とＢ−ＬＣＬに導入後ｐｕｒｏ
ｍｙｃｉｎで選択を行うことにより、ＨＩＶ−１のタン
パク質を安定に発現する細胞の作製を試みた。図４に示
すように、ＨＸＢ２のnef領域にＧｐａｃを組み込んだ
ベクターpHXB2Gpacを作製した。これをpVSV-Gとともに
ＣＯＳ７細胞にｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、ＶＳ
Ｖ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ ウイルスを作製した。これ
をＨ９とＢ−ＬＣＬに感染させ、４８時間後から、０．
５ｕｇ/ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含むで培養を行っ
た。４日間ｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる選択を行った遺伝
子導入細胞を蛍光顕微鏡によって観察すると、肉眼的に
十分視認可能なＥＧＦＰの発現を認め、その後、培養を
継続しても強い細胞毒性は認められなかった。ｐｕｒｏ
ｍｙｃｉｎによる選択開始後4日目にＨ９細胞をｐａｒ
ａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定したのち、ＦＡＣＳ
による解析を行い、非遺伝子導入細胞と遺伝子導入細胞
と比較した。図８−（Ａ）（Ｂ）のドットプロットの図
を比較すると、（Ｂ）のウイルス感染後にｐｕｒｏｍｙ
ｃｉｎで選択を行ったものでは多くの死んだ細胞の集族
があることがわかる。次に生細胞を示すＲ１のｇａｔｅ
を用いて、細胞の蛍光強度の測定を行った。結果を図８
−（Ｃ）のヒストグラムに示す。ヒストグラム上、０．
５μｇ/ｍｌのｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる４日間の選択
によって、Ｍ２に示すように、感染Ｈ９細胞の生き残っ
たものの９３．４％が非感染Ｈ９細胞に比べて明らかに
強い蛍光強度示しており、ＥＧＦＰを発現していること
がわかった。
【００３１】さらに、これらのＨ９細胞の細胞溶解液を
調製して、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った
結果を図９に示す。（Ａ）は抗ＥＧＦＰモノクローナル
抗体、（Ｂ）はＨＩＶ−１感染者の血清でＷｅｓｔｅｒ
ｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った結果である。（Ａ）では
ＣＯＳ７細胞にＧｐａｃを発現させた場合と同じ分子量
が約５２ｋＤａのＥＧＦＰ−Ｐａｃ融合タンパク質の発
現が認められた。ＦＡＣＳによる解析から、これらのＨ
９細胞はｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性を有すると同時に蛍光
タンパク質を発現することが明らかになっており、分子
量からＥＧＦＰとＰａｃの融合タンパク質が発現されて
いることが示された。（Ｂ）では構造タンパク質p24な
どのＨＩＶ−１タンパク質の発現が確認された。Ｇｐａ
ｃをＨＩＶ−１ｇｅｎｏｍｅ上で発現させ、ｐｕｒｏｍ
ｙｃｉｎによる選択を行うことにより極めて短期間にＨ
ＩＶ−１タンパク質を安定に発現するＨ９を得ることが
できた。同様の実験をＢ−ＬＣＬにおいても行ったとこ
ろ、Ｈ９の場合と同様にｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性でＥＧ
ＦＰを発現する細胞が得られ、ＨＩＶ−１感染者の血清
を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによりＨＩ
Ｖ−１タンパク質を安定に発現している事が確認された
(図８−（Ｃ）)。
調製して、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った
結果を図９に示す。（Ａ）は抗ＥＧＦＰモノクローナル
抗体、（Ｂ）はＨＩＶ−１感染者の血清でＷｅｓｔｅｒ
ｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った結果である。（Ａ）では
ＣＯＳ７細胞にＧｐａｃを発現させた場合と同じ分子量
が約５２ｋＤａのＥＧＦＰ−Ｐａｃ融合タンパク質の発
現が認められた。ＦＡＣＳによる解析から、これらのＨ
９細胞はｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性を有すると同時に蛍光
タンパク質を発現することが明らかになっており、分子
量からＥＧＦＰとＰａｃの融合タンパク質が発現されて
いることが示された。（Ｂ）では構造タンパク質p24な
どのＨＩＶ−１タンパク質の発現が確認された。Ｇｐａ
ｃをＨＩＶ−１ｇｅｎｏｍｅ上で発現させ、ｐｕｒｏｍ
ｙｃｉｎによる選択を行うことにより極めて短期間にＨ
ＩＶ−１タンパク質を安定に発現するＨ９を得ることが
できた。同様の実験をＢ−ＬＣＬにおいても行ったとこ
ろ、Ｈ９の場合と同様にｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性でＥＧ
ＦＰを発現する細胞が得られ、ＨＩＶ−１感染者の血清
を用いたＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇによりＨＩ
Ｖ−１タンパク質を安定に発現している事が確認された
(図８−（Ｃ）)。
【００３２】Ｇｐａｃを用いることにより、ウイルス粒
子を得るためにＣＯＳ７細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏ
ｎをした際にも、ＥＧＦＰの発現によりその成否や効率
が確認でき、また、標的細胞への感染の成否、効率、選
択の成否をｉｎ ｓｉｔｕで確認できる。また、選択薬
剤としてｐｕｒｏｍｙｃｉｎを使用することによりｎｅ
ｏｍｙｃｉｎ、ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎにくらべ短時間で
選択が終了する。さらに、ＦＡＣＳ解析やＣｅｌｌ ｓ
ｏｒｔｅｒによるさらに効率的な遺伝子導入細胞の選択
を可能にすることも明らかになった。以上の結果によ
り、Ｇｐａｃは極めて有用な選択マーカーであると考え
られる。ここでは、一例として、ＥＧＦＰをＰａｃのＮ
末端に融合させた場合を述べたが、同様にして、薬剤耐
性遺伝子とレポーター遺伝子とを、結合して融合選択マ
ーカーを作製することができる。
子を得るためにＣＯＳ７細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏ
ｎをした際にも、ＥＧＦＰの発現によりその成否や効率
が確認でき、また、標的細胞への感染の成否、効率、選
択の成否をｉｎ ｓｉｔｕで確認できる。また、選択薬
剤としてｐｕｒｏｍｙｃｉｎを使用することによりｎｅ
ｏｍｙｃｉｎ、ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎにくらべ短時間で
選択が終了する。さらに、ＦＡＣＳ解析やＣｅｌｌ ｓ
ｏｒｔｅｒによるさらに効率的な遺伝子導入細胞の選択
を可能にすることも明らかになった。以上の結果によ
り、Ｇｐａｃは極めて有用な選択マーカーであると考え
られる。ここでは、一例として、ＥＧＦＰをＰａｃのＮ
末端に融合させた場合を述べたが、同様にして、薬剤耐
性遺伝子とレポーター遺伝子とを、結合して融合選択マ
ーカーを作製することができる。
【００３３】
【発明の効果】本発明の融合選択マーカー遺伝子は、レ
ポーター遺伝子と薬剤選択遺伝子が同一遺伝子上にある
ため、安定形質導入細胞を選択する過程で、レポーター
と選択遺伝子の組み換えにより両遺伝子が分断される可
能性が低くなり、目的とするタンパク質をコードする遺
伝子の発現の同定の精度を向上させることができる。ま
た、本発明においては、薬剤選択遺伝子とレポーター遺
伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介
して結合することにより、薬剤耐性遺伝子とレポーター
遺伝子を結合する場合に生じる宿主細胞に対する細胞毒
性の発現とマーカー機能の低減の問題を解消し、選択マ
ーカーとしての機能を効果的に発現させて、有効な選択
マーカーとしての使用を可能とする。更に、本発明にお
いては、融合選択マーカー遺伝子の相手として、レポー
ター遺伝子を選定したことにより、特別な前処理を行う
ことなく、遺伝子導入細胞をｉｎ ｓｉｔｕで、生きた
状態で発現の確認が可能であり、また、融合遺伝子の蛍
光シグナルが同時に耐性遺伝子の発現を意味するため、
薬剤による細胞の選択後、擬陽性細胞（選択薬剤に耐性
であるが遺伝子導入されていない細胞）の識別を容易に
行うことができる。
ポーター遺伝子と薬剤選択遺伝子が同一遺伝子上にある
ため、安定形質導入細胞を選択する過程で、レポーター
と選択遺伝子の組み換えにより両遺伝子が分断される可
能性が低くなり、目的とするタンパク質をコードする遺
伝子の発現の同定の精度を向上させることができる。ま
た、本発明においては、薬剤選択遺伝子とレポーター遺
伝子とを、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介
して結合することにより、薬剤耐性遺伝子とレポーター
遺伝子を結合する場合に生じる宿主細胞に対する細胞毒
性の発現とマーカー機能の低減の問題を解消し、選択マ
ーカーとしての機能を効果的に発現させて、有効な選択
マーカーとしての使用を可能とする。更に、本発明にお
いては、融合選択マーカー遺伝子の相手として、レポー
ター遺伝子を選定したことにより、特別な前処理を行う
ことなく、遺伝子導入細胞をｉｎ ｓｉｔｕで、生きた
状態で発現の確認が可能であり、また、融合遺伝子の蛍
光シグナルが同時に耐性遺伝子の発現を意味するため、
薬剤による細胞の選択後、擬陽性細胞（選択薬剤に耐性
であるが遺伝子導入されていない細胞）の識別を容易に
行うことができる。
【００３４】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION
NATIONAL INSTITUTE OF INFECTIOUS DISEASES PRESIDENT
<120> Fusion protein consisting of different two selective
markers
<130> 13-206
<140>
<141>
<160> 2
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:P1
<400> 1
catcgatgac cgagtacaag ccca 24
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:P2
<400> 2
ctcgagtcag gcaccgggct tgcggg 26
【図１】本発明の実施例で用いた、ＥＧＦＰとｐａｃを
結合する結合配列の構造を示す図である。
結合する結合配列の構造を示す図である。
【図２】本発明の実施例で用いた、ｐＧｐａｃベクター
の構造を示す図である。
の構造を示す図である。
【図３】本発明の実施例で用いた、ＦＬＡＧとｐａｃの
間の介在アミノ酸配列を示す図である。
間の介在アミノ酸配列を示す図である。
【図４】本発明の実施例で用いた、ｐＨＸＢ２Ｇｐａｃ
及びｐＶＳＶ−Ｇの構造を示すずである。
及びｐＶＳＶ−Ｇの構造を示すずである。
【図５】本発明の実施例において、ＥＧＦＰとＰａｃの
遺伝子を介在配列を介して結合し、該遺伝子をＣＯＳ７
にトランスフエクションした結果の蓄積の結果の蛍光顕
微鏡写真を示す図である。
遺伝子を介在配列を介して結合し、該遺伝子をＣＯＳ７
にトランスフエクションした結果の蓄積の結果の蛍光顕
微鏡写真を示す図である。
【図６】本発明の実施例において、ｐＧｐａｃをエレク
トロポレーションによって遺伝子を導入した後、ｐｕｒ
ｏｍｙｃｉｎによる選択を開始して２ヶ月を経過したＣ
ＯＳ７細胞の写真を示す図である。
トロポレーションによって遺伝子を導入した後、ｐｕｒ
ｏｍｙｃｉｎによる選択を開始して２ヶ月を経過したＣ
ＯＳ７細胞の写真を示す図である。
【図７】本発明の実施例において、ＣＯＳ７細胞にＦＬ
ＡＧ−ｐａｃを一過性に発現させ、その細胞溶液をウエ
スタンブロティング解析した結果（Ａ）、及びＥＧＦＰ
を一過性に発現させたＣＯＳ７細胞と、Ｇｐａｃ安定発
現ＣＯＳ７細胞の細胞溶液を、ウエスタンブロティング
解析した結果（Ｂ）、を示す図である。
ＡＧ−ｐａｃを一過性に発現させ、その細胞溶液をウエ
スタンブロティング解析した結果（Ａ）、及びＥＧＦＰ
を一過性に発現させたＣＯＳ７細胞と、Ｇｐａｃ安定発
現ＣＯＳ７細胞の細胞溶液を、ウエスタンブロティング
解析した結果（Ｂ）、を示す図である。
【図８】本発明の実施例において、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ
による選択を行った遺伝子導入細胞を、ｐａｒａｆｏｒ
ｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定した後、ＦＡＣＳによる解析
を行い、非遺伝子導入細胞と遺伝子導入細胞とを比較し
た結果の、ドットプロットの図（Ａ）、（Ｂ）、及び生
細胞を示すＲ１のｇａｔｅを用いて，細胞の蛍光強度の
測定を行った結果（Ｃ）を示す図である。
による選択を行った遺伝子導入細胞を、ｐａｒａｆｏｒ
ｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定した後、ＦＡＣＳによる解析
を行い、非遺伝子導入細胞と遺伝子導入細胞とを比較し
た結果の、ドットプロットの図（Ａ）、（Ｂ）、及び生
細胞を示すＲ１のｇａｔｅを用いて，細胞の蛍光強度の
測定を行った結果（Ｃ）を示す図である。
【図９】本発明の実施例において、ＧｐａｃをＨＩＶ
ｇｅｎｏｍｅに組み込み、Ｈ９に導入後、Ｈ９細胞の細
胞溶液を調製して、ウエスタンブロティング解析した結
果を示す図である。
ｇｅｎｏｍｅに組み込み、Ｈ９に導入後、Ｈ９細胞の細
胞溶液を調製して、ウエスタンブロティング解析した結
果を示す図である。
フロントページの続き
(72)発明者 杉浦 亙
東京都練馬区関町北４−31―８
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA80 CA04 CA05
DA02 EA04 FA02 GA14 HA01
4H045 AA10 BA10 BA41 EA61 FA74
Claims (11)
- 【請求項１】 薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子と
を、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して結
合したことを特徴とする融合選択マーカー遺伝子。 - 【請求項２】 薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子と
を、介在アミノ酸配列をコードする塩基配列を介して結
合することにより、薬剤耐性遺伝子とレポーター遺伝子
による、宿主細胞に対する細胞毒性の発現とレポーター
機能の発現とを調整したことを特徴とする請求項１記載
の融合選択マーカー遺伝子。 - 【請求項３】 介在アミノ酸配列をコードする塩基配列
を介して、薬剤耐性遺伝子のＣ末端にレポーター遺伝子
のＮ末端を結合するか、又はレポーター遺伝子のＣ末端
に薬剤耐性遺伝子のＮ末端を結合することを特徴とする
請求項１又は２記載の融合選択マーカー遺伝子。 - 【請求項４】 薬剤耐性遺伝子が、ピューロマイシン
（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子（ｐａｃ）であるこ
とを特徴とする請求項１から３のいずれか記載の融合選
択マーカー遺伝子。 - 【請求項５】 レポーター遺伝子が、蛍光シグナルを発
するタンパク質の遺伝子であることを特徴とする請求項
１〜４のいずれか記載の融合選択マーカー遺伝子 - 【請求項６】 蛍光シグナルを発するタンパク質の遺伝
子が、ＥＧＦＰ又はＲＦＰであることを特徴とする請求
項５記載の融合選択マーカー遺伝子。 - 【請求項７】 薬剤耐性遺伝子が、ピューロマイシン
（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子（ｐａｃ）であり、
レポーター遺伝子がＥＧＦＰであることを特徴とする請
求項４〜６のいずれか記載の融合選択マーカー遺伝子。 - 【請求項８】 介在アミノ酸配列をコードする塩基配列
が、ＹＳＤＬＱＳからなるアミノ酸配列をコードする塩
基配列であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか
記載の融合選択マーカー遺伝子。 - 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか記載の融合選択
マーカー遺伝子によってコードされる融合タンパク質。 - 【請求項１０】 請求項１〜８のいずれか記載の融合選
択マーカー遺伝子を含有する発現ベクター。 - 【請求項１１】 請求項１０記載の発現ベクターに、目
的とするタンパク質をコードする遺伝子を組込み、宿主
に導入し、発現させて該タンパク質と選択マーカータン
パク質との融合タンパク質を生成させ、該選択マーカー
タンパク質により目的とするタンパク質の発現の同定を
行うことを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001356652A JP4024525B2 (ja) | 2001-11-21 | 2001-11-21 | 異なる２つの選択マーカーからなる融合タンパク質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001356652A JP4024525B2 (ja) | 2001-11-21 | 2001-11-21 | 異なる２つの選択マーカーからなる融合タンパク質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003159069A true JP2003159069A (ja) | 2003-06-03 |
| JP4024525B2 JP4024525B2 (ja) | 2007-12-19 |
Family
ID=19168139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001356652A Expired - Fee Related JP4024525B2 (ja) | 2001-11-21 | 2001-11-21 | 異なる２つの選択マーカーからなる融合タンパク質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4024525B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007202490A (ja) * | 2006-02-02 | 2007-08-16 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 動物細胞用新規発現ベクター |
| JP2012508004A (ja) * | 2008-11-11 | 2012-04-05 | ロンドン スクール オブ ハイジーン アンド トロピカル メディシン | ベクター |
| JP2012095674A (ja) * | 2012-02-20 | 2012-05-24 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | 動物細胞用新規発現ベクター |
-
2001
- 2001-11-21 JP JP2001356652A patent/JP4024525B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007202490A (ja) * | 2006-02-02 | 2007-08-16 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 動物細胞用新規発現ベクター |
| JP2012508004A (ja) * | 2008-11-11 | 2012-04-05 | ロンドン スクール オブ ハイジーン アンド トロピカル メディシン | ベクター |
| JP2012095674A (ja) * | 2012-02-20 | 2012-05-24 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | 動物細胞用新規発現ベクター |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4024525B2 (ja) | 2007-12-19 |
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