KR100577512B1 - 녹색 형광 단백질과 Ｂｆｌ-1의 융합단백질 또는 이를코딩하는 유전자를 포함하는 세포사멸을 유도하기 위한약학 조성물 - Google Patents
녹색 형광 단백질과 Ｂｆｌ-1의 융합단백질 또는 이를코딩하는 유전자를 포함하는 세포사멸을 유도하기 위한약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP)과 항-세포사멸 단백질 Bfl-1의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 세포사멸을 유도하기 위한 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 약학 조성물은 항암제 또는 기타 세포 증식증의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
Bfl-1, 녹색 형광 단백질, 세포사멸, 항암제
Description
도 1은 HEK 293T 세포를 (a) GFP와 Bcl-xL 발현벡터; (b) GFP와 Bfl-1 발현벡터; (c) GFP-Bcl-xL 발현벡터; 및 (d) GFP-Bfl-1 발현벡터 각각으로 형질감염 (transfection)시키고 24시간 경과 후에 세포를 형광현미경으로 관찰한 것이고,
도 2는 HEK 293T 세포를 GFP와 Bfl-1 발현벡터; GFP-Bcl-xL 발현벡터; 및 GFP-Bfl-1 발현벡터 각각으로 형질감염시키고 48시간 경과 후에 세포 추출물을 아가로스 겔에 전기영동한 결과이고,
도 3은 GFP 발현벡터; Bfl-1과 GFP 발현벡터; Bcl-xL과 GFP 발현벡터; GFP-Bcl-xL 발현벡터; 및 GFP-Bfl-1 발현벡터 각각으로 형질감염시킨 HEK 293T 세포에서 형질감염 후 시간의 경과에 따른 세포사멸 정도를 나타낸 그래프이고,
도 4는 GFP 발현벡터; Bfl-1의 N-말단에 GFP를 융합시킨 GFP-Bfl-1 발현벡터; 및 Bfl-1의 C-말단에 GFP를 융합시킨 Bfl-1-GFP 발현벡터 각각으로 형질감염시킨 HEK 293T 세포에서 유도된 세포사멸 정도를 비교한 것이고,
도 5는 GFP 발현벡터; Bfl-1의 N-말단에 GFP를 융합시킨 GFP-Bfl-1 발현벡터; β-갈락토시다제 발현벡터; 및 Bfl-1의 N-말단에 β-갈락토시다제를 융합시킨 GalF-Bfl-1 발현벡터 각각으로 형질감염시킨 HEK 293T 세포에서 유도된 세포사멸 정도를 비교한 것이고,
도 6은 GFP-Bfl-1 융합단백질에서 Bfl-1의 일부 도메인이 제거된 결실 돌연변이들과 Bfl-1의 N-말단에 β-갈락토시다제를 융합시킨 GalF-Bfl-1의 모식도를 나타낸 것이고,
도 7은 GFP, GFP-Bcl-xL, GFP-Bax, GFP-Bfl-1 및 이의 결실 돌연변이 발현벡터 각각으로 형질감염된 HEK 293T 세포에서 유도된 세포사멸 정도를 나타낸 것이고,
도 8은 GFP, GFP-Bcl-xL, GFP-Bax, GFP-Bfl-1 및 GFP-BC 발현벡터 각각으로 HEK 293T 세포를 형질감염시키고 48시간 경과 후에 세포 추출물을 아가로스 겔에 전기영동한 결과이다.
본 발명은 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP)과 항-세포사멸 단백질 Bfl-1의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 세포사멸을 유도하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.
Bcl-2 상동성 (Bcl-2 homology, BH) 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는 Bcl-2 패밀리 (family)에 속하는 단백질들은 세포사멸의 중심적인 조절인자로 널리 알려져 있다 (Adams JM, et al., Science 281(5381): 1322-1326, 1998).
Bcl-2 패밀리에 속하는 단백질들은 세포의 생존에 관여하는 효과에 따라 세포사멸을 촉진하는 단백질과 세포사멸을 억제하는 단백질로 나눌 수 있다. 세포사멸을 촉진하는 친-세포사멸 단백질 (pro-apoptotic protein)로는 Bax, Bak, Bok, Bcl-Xs, Bid, Bad, Bik 등이 있고, 세포사멸을 억제하는 항-세포사멸 단백질 (anti-apoptotic protein)로는 Bcl-2, Bcl-xL, Bfl-1, Bcl-w, Mcl-1, E1B-19K, Ced-9 등이 있다.
세포사멸을 억제하는 단백질인 Bfl-1은 다양한 사멸 신호에 대하여 항-세포사멸 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 특히, Bfl-1은 Reh 인간 B 림프구 세포 및 몰트-4 인간 T 림프구 세포에서 스타우로스포린에 의해 유도되는 세포사멸을 억제하였다 (Ko JK, et al., Oncogene 22(16): 2457-2465, 2003; 및 Shim YH, et al., Int. J. Hematol. 72(4): 484-490, 2000). 이 경우에, Bfl-1은 Bid, 캐스페이즈 3, 캐스페이즈 8 및 캐스페이즈 9의 절단을 억제하고, 미토콘드리아의 막횡단 전위가 감소되는 것을 방지함으로써 세포사멸을 억제하는 것으로 알려져 있다 (Shim YH, et al., Int. J. Hematol. 72(4): 484-490, 2000).
그러나, 세포사멸을 억제하는 항-세포사멸 단백질이라도 단백질 분해효소 (proteinase)에 의한 절단 등에 의해서 그 활성이 전환되어 세포사멸을 유도하는 경우가 있다. 예를 들어, 항-세포사멸 단백질인 Bcl-2 및 Bcl-xL은 세포사멸이 일어나는 환경에서 캐스페이즈-3에 의해 절단된다. 캐스페이즈-3에 의해 절단된 Bcl-2 및 Bcl-xL은 캐스페이즈들을 활성화시키고 시토크롬 c의 방출을 촉진시켜 세포사멸 활성을 나타내는 친-세포사멸 단백질로 전환된다 (Heng EH, et al., Science 278(5345): 1966-1968, 1997; 및 Clem RJ, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 554-559, 1998).
최근의 보고에 따르면, Bcl-2 패밀리에 속하는 항-세포사멸 단백질과 친-세포사멸 단백질은 그들의 3차원 구조가 유사하다는 것이 발견되었다 (Schendel SL, et al., Cell Death Differ. 5(5): 372-80, 1998). 그러나, 구조적인 유사성에도 불구하고 이들이 어떻게 서로 다른 방식으로 세포사멸을 조절할 수 있는지에 대해서는 아직까지 명확하게 밝혀져 있지 않다.
본 발명자들은 Bcl-2 패밀리에 속하는 항-세포사멸 단백질인 Bfl-1이 GFP에 융합되어 항암활성을 나타내고 세포사멸을 효과적으로 유도하는 친-세포사멸 활성을 갖게 됨을 발견하고 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 하는 약학 조성물이 암 및 세포 증식증의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 GFP와 Bfl-1의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 세포사멸을 유도하기 위한 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명은 GFP와 Bfl-1의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 세포사멸을 유도하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 GFP와 Bfl-1의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 하는 항암제를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
Bfl-1은 Bcl-2 패밀리에 속하며 세포사멸을 억제하는 항-세포사멸 단백질로서 서열번호: 1로 기재되는 737개의 염기서열을 갖는 유전자에 의해 코딩된다 (GenBank 등재번호 U27467). 상기 서열번호: 1의 유전자로부터 코딩되는 Bfl-1 단백질은 서열번호: 2로 기재되는 175개의 아미노산 서열을 가지며, Bcl-2 상동성 (Bcl-2 homology, BH) 도메인으로 아미노산 서열 71 내지 90에 해당하는 BH1 도메인 및 아미노산 서열 133 내지 145에 해당하는 BH2 도메인을 포함하고 있다. 또한, 서열번호: 2의 아미노산 147 내지 175에 해당하는 Bfl-1의 C-말단 부위는 막관통 도메인 (transmembrane domain)을 포함하고 있다.
본 발명의 융합단백질에서 Bfl-1 단백질의 서열번호: 2의 전장 Bfl-1 단백질 또는 서열번호: 2의 147 내지 175번 아미노산을 포함하는 그의 단편일 수 있다. 또한, 본 발명의 융합단백질에서 GFP는 Bfl-1의 N-말단 또는 C-말단에 결합될 수 있으며, 바람직하게는 N-말단에 결합된다.
GFP 단백질은 해파리에서 발견된 단백질로서 야생종 GFP 단백질이 클로닝된 이후 세포 배양 시스템에서 리포터 단백질로서 많이 이용되고 있다 (Inouye S, et al., FEBS Letters, 351(2): 211-4, 1994). 본원에서는 GFP 발현벡터로서 상업적으로 입수가 용이한 벡터, 바람직하게는 pEGFP-C1 (Clontech사)을 사용한다. pEGFP-C1이 코딩하는 GFP 단백질은 야생종 GFP의 돌연변이체로서 녹색 형광을 더욱 강하게 발현하도록 변형된 것이다. 또한, pEGFP-C1 벡터의 다중 클로닝 부위 (multiple cloning site)에 외래 유전자를 삽입하면 삽입된 외래 유전자는 GFP 단백질과 융합된 형태로 발현된다.
본 발명자들은 GFP가 항-세포사멸 단백질인 Bfl-1에 융합되는 경우 Bfl-1의 활성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해, GFP 발현벡터와 Bcl-xL 발현벡터; GFP 발현벡터와 Bfl-1 발현벡터; Bcl-xL의 N-말단에 GFP가 융합된 GFP-Bcl-xL 발현벡터; 및 Bfl-1의 N-말단에 GFP가 융합된 GFP-Bfl-1 발현벡터로 각각 HEK 293T 세포를 형질감염시킨 후 세포사멸 유도 여부를 조사하기 위하여 세포의 형태를 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과, GFP-Bfl-1 발현벡터로 형질감염된 세포에서만 세포사멸의 형태학적인 특징인 세포 찌그러짐, 세포질의 기포 형성, 세포판으로부터의 분리 등이 관찰되었다. 그러나, 상기 GFP 발현벡터와 Bcl-xL 발현벡터; GFP 발현벡터와 Bfl-1 발현벡터; 및 GFP-Bcl-xL 발현벡터로 각각 형질감염된 세포에서는 세포사멸이 거의 유도되지 않았다 (도 1 참조).
또한, 상기와 같이 형질감염된 세포로부터 48시간 경과 후에 세포 추출물을 분리하여 아가로스 겔에 전기영동한 결과, GFP-Bfl-1 발현벡터로 형질감염된 세포에서 염색체 분절이 관찰되었다. 이는 세포의 죽음이 세포괴사 (necrosis)가 아니라 세포사멸 (apoptosis)에 의한 것임을 증명하는 것이다 (도 2 참조).
또한, 상기와 같이 세포를 형질감염시키고 12, 24, 36 및 48시간 경과 후에 세포사멸 정도를 측정한 결과, GFP-Bfl-1 발현벡터로 형질감염된 세포에서는 24시간 경과 후에 50％ 이상, 48시간 경과 후에는 90％ 이상의 세포사멸이 이루어진 반면, GFP 발현벡터; GFP 발현벡터와 Bfl-1 발현벡터; GFP 발현벡터와 Bcl-xL 발현벡터; 및 GFP-Bcl-xL 발현벡터로 형질감염된 세포에서는 시간의 경과에도 불구하고 세포사멸이 거의 일어나지 않았다 (도 3 참조).
Bfl-1에 융합되는 GFP의 위치가 세포사멸 유도에 미치는 영향을 알아보기 위하여, GFP가 Bfl-1의 N-말단에 융합된 GFP-Bfl-1 발현벡터, 및 GFP가 Bfl-1의 C-말단에 융합된 Bfl-1-GFP 발현벡터를 제조한 후 각각을 세포에 형질감염시키고 세포사멸 여부를 관찰하였다. 그 결과, GFP-Bfl-1 발현벡터가 형질감염된 세포에서 Bfl-1-GFP 발현벡터가 형질감염된 세포에 비해 약 1.7배정도 높은 비율로 세포사멸이 유도되는 것을 관찰하였다 (도 4 참조). 따라서, 더욱 효율적인 세포사멸을 유도하기 위해서는 GFP를 Bfl-1의 N-말단에 융합시키는 것이 바람직하다.
또한, GFP가 아닌 다른 단백질이 Bfl-1에 융합된 경우에도 세포사멸을 효율적으로 유도하는지 알아보기 위해, β-갈락토시다제의 일부 단편 (1 내지 147) (MacGregor GR, et al., Nucleic Acids Res. 17:2365, 1989)이 N-말단에 융합된 Bfl-1 발현벡터를 제조하여 상기와 같이 세포사멸 정도를 측정한 결과, GFP가 융합 된 경우가 β-갈락토시다제가 융합된 경우에 비해 8배정도 높은 비율로 세포사멸을 유도함을 확인하였다 (도 5 참조). 이러한 결과는 Bfl-1의 N-말단에 임의의 단백질을 융합시키는 경우에 항상 세포사멸이 유도되는 것이 아니라, 특정 단백질인 GFP를 융합시키는 경우에만 세포사멸이 유도됨을 나타내는 것이다.
한편, 본 발명의 GFP-Bfl-1 융합단백질에서 Bfl-1은 이를 구성하는 도메인 중 일부가 결실된, 예컨대 Bfl-1의 N-말단 부위, BH1 도메인 및/또는 BH2 도메인이 결실된 단백질일 수 있다.
본 발명에서는 Bfl-1을 구성하는 N-말단 부위, BH1, BH2 도메인 및 C-말단 부위 중 어떤 도메인이 세포사멸에 중요한 역할을 담당하는지 알아보기 위하여, GFP-Bfl-1의 융합단백질에서 상기 각 도메인이 제거된 결실 돌연변이의 발현벡터를 제조한 후 이를 세포에 형질감염시켜 세포사멸에 미치는 영향을 살펴보았다. 우선, 서열번호: 1의 Bfl-1 염기서열에서 1 내지 61에 해당하는 N-말단 부위가 결실된 GFPΔN; 1 내지 97에 해당하는 N-말단 부위 및 BH1 도메인이 결실된 GFPΔN1; 1 내지 146에 해당하는 N-말단 부위, BH1 및 BH2 도메인이 결실된 GFP-BC; 159 내지 175에 해당하는 C-말단 부위가 결실된 GFPΔBC; 119 내지 175에 해당하는 C-말단 부위 및 BH2 도메인이 결실된 GFPΔ2BC; 68 내지 175에 해당하는 C-말단 부위, BH1 및 BH2 도메인이 결실된 GFPΔ12BC 발현벡터들을 제조하였다 (도 6 참조)
이와 같이 제조된 각각의 결실 돌연변이 발현벡터를 상기와 동일한 방법으로 세포에 형질감염시켜 세포사멸 유도 정도를 조사하였다. 그 결과, GFPΔBC, GFPΔ2BC 및 GFPΔ12BC 발현벡터로 형질감염된 HEK 293T 세포에서는 세포사멸이 유 도되지 않았으나, GFPΔN, GFPΔN1 및 GFP-BC 발현벡터로 형질감염시킨 세포의 경우에는 결실이 일어나지 않은 GFP-Bfl-1 발현벡터로 형질감염시킨 세포에 비해서 월등하게 세포사멸이 유도되는 것을 확인하였다. 특히, N-말단 부위, BH1 및 BH2 도메인이 결실된 GFP-BC 발현벡터가 형질감염된 세포에서는 90％ 이상의 세포사멸이 유도되었는데, 이는 친-세포사멸 단백질로 알려진 GFP-Bax (Li X, et al., Cancer Res. 61(1): 186-191, 2001)보다 더욱 높은 것이다 (도 7 참조). 이로부터, Bfl-1의 C-말단 부위는 GFP-Bfl-1 융합단백질의 친-세포사멸 활성에 필수적임을 알 수 있다.
또한, 상기 Bfl-1 결실 돌연변이 발현벡터 각각으로 형질감염시킨 HEK 293T 세포 추출물을 전기영동한 결과, GFP-Bfl-1, GFP-BC 및 GFP-Bax 발현벡터로 형질감염시킨 세포의 경우에는 유사한 염색체 분절이 관찰되었는데 (도 8 참조), 이는 상기 세포의 죽음이 괴사 (necrosis)가 아니라 세포사멸 (apoptosis)에 의한 것임을 입증하는 것이다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 GFP와 Bfl-1의 융합단백질은 친-세포사멸 활성을 가지며, 특히 GFP가 Bfl-1의 C-말단에 결합하는 경우보다 N-말단에 융합된 경우에 더욱 높은 친-세포사멸 활성을 갖는다. 또한, GFP-Bfl-1 융합단백질의 친-세포사멸 활성을 위해서 Bfl-1의 C-말단 부위가 필수적임을 알 수 있었다.
상기 GFP와 Bfl-1의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 세포사멸을 유도하기 위하여, 단독으로 투여되거나, 약학적 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 약학 조성물로서 투여될 수 있다. 특히, 상기 유전자는 유전자 운반체에 삽입된 형 태로 투여될 수 있으며, 유전자 운반체로서는 아데노바이러스가 바람직하다.
일반적으로 유전자 치료의 목적으로 사용되는 아데노바이러스는 높은 역가 (약 109 cfu/㎖)를 얻기가 용이하고, 감염시킬 수 있는 세포에 제한이 없으며, 바이러스 게놈이 세포의 염색체에 삽입되지 않고 목적하는 유전자를 발현하기 때문에 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물에서 GFP와 Bfl-1 융합단백질을 코딩하는 유전자는 바람직하게는 서열번호: 23으로 기재되는 염기서열을 가지며, 상기 Bfl-1의 N-말단 부위가 결실된 서열번호: 24로 기재되는 염기서열, Bfl-1의 N-말단 부위와 BH1 도메인이 결실된 서열번호: 25로 기재되는 염기서열, Bfl-1의 N-말단, BH1 및 BH2 도메인이 결실된 서열번호: 26으로 기재되는 염기서열을 가질 수도 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 서열번호: 23 내지 26으로 기재되는 염기서열을 갖는 유전자로부터 코딩되는 단백질을 유효성분으로 함유할 수 있는데, 이들은 각각 서열번호: 27 내지 30으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다.
상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 캅셀제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제 (예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제 (예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스 트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다.
상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 정맥내, 근육내 등의 경로를 통해 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 상기 융합단백질 또는 유전자는 하루에 체중 1 ㎏당 0.01 내지 100 ㎎, 바람직하게는 0.1 내지 50 ㎎의 양을 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법 및 배설, 그리고 약제 혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화시킬 수 있다. 상기의 투여량은 평균적인 경우의 예시로서, 물론 더 높거나 또는 더 낮은 투여량 범위를 갖는 개별적인 예도 있을 수 있으며, 이러한 경우도 본 발명의 보호 범위에 포함된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
<실시예 1> GFP 융합 발현벡터의 제조
<1-1> GFP-Bfl-1 발현벡터 및 Bfl-1-GFP 발현벡터의 제조
인간의 혈액 시료 (서울대 병원으로부터 입수)에서 전체 RNA를 분리한 후, 서열번호: 3 및 4의 올리고뉴클레오티드를 시발체 쌍으로 이용하여 RT-PCR 반응을 수행하였다. RT-PCR 반응은 원-스텝 RT-PCT 킷트 (one-step RT-PCR kit, Promega사)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였는데, RT 반응조건은 48℃에서 45분간이고, PCR 반응조건은 94℃ 30초, 60℃ 1분 및 68℃ 2분간 40회 반응시키고 68℃에서 7분간 연장 (extension)시켜서 반응을 종결하였다. 그 결과 생성된 양쪽 말단에 염기 A를 갖는 증폭된 Bfl-1 유전자 산물을 제한효소 처리 없이 벡터 TOPO 2.1 T (Invitrogen사)에 클로닝하였다. 상기 벡터를 제한효소 EcoRI/BamHI으로 절단한 후, 잘려져 나온 Bfl-1 유전자 절편 570 bp를 상기와 동일한 제한효소로 절단된 발현벡터 pcDNA3.1myc/his(-)B (Invitrogen사)에 클로닝하여 Bfl-1 발현벡터를 제조하였다.
Bfl-1 유전자를 증폭하기 위하여, 서열번호: 3 및 4의 올리고뉴클레오티드를 시발체 쌍으로, 상기에서 제조된 Bfl-1 발현벡터를 주형으로 하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응조건은, DNA 중합효소 (Taq polymerase, Takara사)를 사용하여 상기에 기재된 시발체 쌍과 주형을 94℃에서 5분 동안 변성시키고, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분간 30회 반응시키고, 72℃에서 10분간 연장시켜 반응 을 종결하였다. 상기에서 수득된 PCR 반응물을 제한효소 EcoRI/BamHI으로 절단한 후, 이를 전기영동하여 525 bp 크기의 절편을 분리하였고, 이를 상기와 동일한 제한효소로 절단된 벡터 pEGFP-C1 및 pEGFP-N1 (Clontech사)에 각각 클로닝하여 Bfl-1의 C-말단에 GFP가 융합된 Bfl-1-GFP 발현벡터 및 Bfl-1의 N-말단에 GFP가 융합된 GFP-Bfl-1 발현벡터를 제조하였다.
염기서열 분석 결과, GFP-Bfl-1 발현벡터는 GFP가 Bfl-1의 N-말단에 융합되어 있는 서열번호: 23으로 기재되는 염기서열을 갖는 유전자를 포함하고 있음을 확인하였다.
<1-2> GFP-Bcl-xL 발현벡터의 제조
한편, GFP에 Bcl-xL 유전자가 융합된 융합단백질 발현벡터를 제조하기 위하여, 서열번호: 5 및 6의 올리고뉴클레오티드를 시발체 쌍으로 하고, Bcl-xL 유전자를 포함하는 발현벡터 pcDNA3-Bcl-xL (카톨릭 의대 김 홍태 박사로부터 입수)를 주형으로 한 PCR 반응을 통해 Bcl-xL 유전자를 증폭하였다. 이때, PCR 반응조건은, DNA 중합효소 (Takara사)를 사용하여 상기에 기재된 시발체 쌍과 주형을 94℃에서 5분 동안 변성시키고, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분간 30회 반응시키고, 72℃에서 10분간 연장시켜 반응을 종결하였다. 상기에서 수득된 PCR 반응물을 제한효소 XhoI/EcoRI으로 절단한 후, 이를 전기영동하여 700 bp 크기의 절편을 분리하였고 이를 상기와 동일한 제한효소로 절단된 벡터 pEGFP-C1 (Clontech사)에 클로닝하여 GFP-Bcl-xL 발현벡터를 제조하였다.
<실시예 2> GFP-Bfl-1 융합단백질의 세포사멸 활성
먼저, 아데노바이러스 단백질과 SV40 거대 T 항원으로 형질전환시킨 인간 태아 신장 (Human embryonic kidney, HEK) 293T 세포 (한국세포주은행)를 10％ 소 태아 혈청, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎎/㎖ 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM/F-12 배지 (Life Technology사)에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 이를 랩 테크 Ⅱ 챔버 슬라이드 (Nalge Nunc International Naperville, IL)에 깔고 한 웰당 5 × 104의 밀도로 도말하였다. 그런 다음, 리포펙타민 방법 (Life Technology사)을 사용하여 실시예 1에서 제조된 Bfl-1, GFP-Bfl-1 및 GFP-Bcl-xL 발현벡터 각각으로 HEK 293T 세포를 형질감염시켰다.
구체적으로, GFP 발현벡터와 Bcl-xL 발현벡터; GFP 발현벡터와 Bfl-1 발현벡터; GFP-Bcl-xL 발현벡터; 및 GFP-Bfl-1 발현벡터 1 ㎍씩을 각각 HEK 293T 세포에 형질감염시켰다. 형질감염시키고 18시간 경과 후에 세포를 PBS로 세척하고 4％ 포름알데히드로 고정한 후, 악시오베르트 100 역 에피 형광 현미경 (Carl Zeiss사)으로 세포의 형태를 관찰하였다 (도 1).
그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, GFP-Bfl-1 발현벡터로 형질감염시킨 세포의 경우에만 세포사멸을 겪는 세포에서 나타나는 여러 형태학적인 특징, 즉 세포 찌그러짐, 세포질의 응축, 세포질에 기포 형성, 세포판으로부터의 분리가 관찰되었다 (도 1의 d). 그러나, GFP 발현벡터와 Bcl-xL 발현벡터; GFP 발현벡터와 Bfl-1 발현벡터; 및 GFP-Bcl-xL 발현벡터로 각각 형질감염된 경우에는 이러한 세포사멸의 형태학적인 특징이 관찰되지 않았다 (도 1의 a 내지 c). 따라서, 상기 결과로부터 Bfl-1에 GFP가 융합된 GFP-Bfl-1 융합단백질이 발현된 경우에만 세포사멸 활성이 나타나는 것임을 확인하였다.
또한, 형질감염시키고 48시간 경과 후에 세포를 긁어낸 후, 원심분리에 의해 세포 침전물을 분리한 후 이를 0.2 ㎎/㎖의 단백질 분해효소 K (Gibco BRL사)가 포함된 완충용액 (100 mM Tris-Cl, pH 8.5, 5 mM EDTA, 200 mM NaCl, 0.2％ SDS) 500 ㎕에 넣어 55℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 이로부터 추출된 DNA를 동일한 부피의 이소프레놀로 침전시키고, 그 침전물을 0.1 ㎎/㎖의 RNase A로 처리한 후, 2％ 아가로스 겔에 전기영동하고 브롬화에티듐으로 염색하여 관찰하였다 (도 2). 그 결과, GFP-Bfl-1 발현벡터로 형질감염된 세포의 추출물을 로딩한 레인에서만 세포사멸 (apoptosis)의 증거인 염색체 분절 현상이 관찰되었다.
한편, GFP 발현벡터; GFP 발현벡터와 Bcl-xL 발현벡터; GFP 발현벡터와 Bfl-1 발현벡터; GFP-Bcl-xL 발현벡터; 및 GFP-Bfl-1 발현벡터로 HEK 293T 세포를 각각 형질감염시키고 12, 24, 36 및 48시간이 경과한 때, 각각의 세포를 PBS로 세척하고 4％ 포름알데히드로 고정하였다. 각각의 세포를 1 ㎍/㎖의 DAPI (4'6-Diamidino-2-Phenylindole, Carl Biochem사)를 포함하는 용액으로 염색한 후, 물결 모양과 응축된 염색질을 나타내는 세포의 사멸된 핵의 수를 세었다 (도 3). 그 결과, GFP-Bfl-1 발현벡터로 형질감염된 경우에만 현저한 세포사멸 효과를 나타내었는데, 이 경우에는 형질감염 24시간 후에 50％ 이상, 48시간 후에 90％ 이상의 세포가 사멸 하였다. 그러나, GFP 발현벡터; GFP 발현벡터와 Bcl-xL 발현벡터; GFP 발현벡터와 Bfl-1 발현벡터; 및 GFP-Bcl-xL 발현벡터 각각으로 형질감염된 경우에는 시간이 지나도 세포사멸이 거의 일어나지 않았다.
<실시예 3> Bfl-1에 융합되는 GFP의 위치에 따른 세포사멸 활성의 변화
GFP가 Bfl-1에 융합되는 위치에 따라 세포사멸에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, GFP를 Bfl-1의 C-말단 및 N-말단에 융합시켜 세포사멸을 관찰하였다.
상기 실시예 1에서 제조된 Bfl-1의 C-말단에 GFP가 융합된 Bfl-1-GFP 발현벡터 및 Bfl-1의 N-말단에 GFP가 융합된 GFP-Bfl-1의 발현벡터 각각 1 ㎍씩을 실시예 2와 동일한 방법으로 HEK 293T 세포에 형질감염시켰다.
형질감염시키고 12시간이 경과한 때, 각각의 세포를 PBS로 세척하고 4％ 포름알데히드로 고정하였다. 각각의 세포를 1 ㎍/㎖의 DAPI (Carl Biochem사)를 포함하는 용액으로 염색한 후, 물결 모양과 응축된 염색질을 나타내는 세포의 사멸된 핵의 수를 세어서 세포사멸 정도를 측정하였다. 그 결과, GFP가 Bfl-1의 N-말단에 융합된 GFP-Bfl-1 융합단백질이 GFP가 Bfl-1의 C-말단에 융합된 경우에 비해 약 2.5배 높은 비율로 세포사멸을 유도하는 것이 확인되었다 (도 4).
<실시예 4> Bfl-1에 융합되는 단백질의 종류에 따른 세포사멸 활성의 변화
Bfl-1의 N-말단에 GFP가 아닌 다른 단백질이 융합되는 경우에도 Bfl-1이 친- 세포사멸 활성을 나타내는지 알아보기 위하여, GFP 대신 β-갈락토시다제 (β-galactosidase, Gal)를 이용하여 Bfl-1 융합단백질 발현벡터를 제조하였다.
먼저 Gal 유전자를 증폭하기 위하여, 서열번호: 7 및 8의 올리고뉴클레오티드를 시발체 쌍으로 하고, pCMV beta-Gal 벡터 (Invitrogen사)를 주형으로 PCR 반응을 수행하여 β-갈락토시다제의 1 내지 147 아미노산 서열을 갖는 단편을 증폭하였다. 이때, PCR 반응조건은, DNA 중합효소 (Takara사)를 사용하여 상기에 기재된 시발체 쌍과 주형을 94℃에서 5분 동안 변성시키고, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분간 30회 반응시키고, 72℃에서 10분간 연장시켜 반응을 종결하였다. 상기에서 수득된 PCR 반응물을 제한효소 XhoI/EcoRI으로 절단한 후, 이를 전기영동하여 441 bp 크기의 절편을 분리하였고 이를 상기와 동일한 제한효소로 절단된 벡터 pcDNA3.1myc/his(-)B에 클로닝하여 GalF-Bfl-1 발현벡터를 제조하였다.
GFP 발현벡터, GFP-Bfl-1 발현벡터; β-갈락토시다제 발현벡터; 및 GalF-Bfl-1 발현벡터 1.0 ㎍을 각각 HEK 293T 세포에 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 형질감염시킨 후 세포사멸 여부를 조사하였다. 그 결과, β-갈락토시다제가 융합된 Bfl-1이 발현된 세포에서는 GFP가 융합된 Bfl-1이 발현된 세포에서 유도된 세포사멸 활성의 5％ 수준에 미치는 세포사멸 활성만이 유도되었다. (도 5).
이로부터, 다른 단백질이 융합된 경우에 비해 GFP가 Bfl-1에 융합된 경우에 Bfl-1의 친-세포사멸 활성이 현저하게 증가함을 확인하였다.
<실시예 5> Bfl-1의 일부 도메인이 결실된 GFP-Bfl-1 융합단백질에서의 세포사멸 활성의 변화
<5-1> Bfl-1의 일부 도메인이 결실된 GFP-Bfl-1 융합단백질 발현벡터의 제조
Bfl-1의 일부 도메인이 결실되어도 GFP-Bfl-1 융합단백질의 세포사멸 유도 활성이 나타나는지 알아보기 위해, Bfl-1의 일부분이 제거된 결실 돌연변이를 포함하는 융합단백질 발현벡터를 제조하였다.
구체적으로, Bfl-1의 N-말단 부위가 결실된 발현벡터 (GFPΔN), N-말단 부위 및 BH1 도메인이 결실된 발현벡터 (GFPΔN1), 및 N-말단 부위, BH1 및 BH2 도메인이 결실된 발현벡터 (GFP-BC)를 제조하기 위하여, 각각 서열번호: 9 및 10, 서열번호: 11 및 12, 및 서열번호: 13 및 14의 올리고뉴클레오티드를 시발체 쌍으로 하고, 실시예 1에서 제조된 Bfl-1 발현벡터를 주형으로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응조건은, DNA 중합효소 (Takara사)를 사용하여 상기에 기재된 시발체 쌍과 주형을 94℃에서 5분 동안 변성시키고, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분간 30회 반응시키고, 72℃에서 10분간 연장시켜 반응을 종결하였다. 상기에서 수득된 PCR 반응물을 각각 제한효소 EcoRI/BamHI으로 절단한 후, 이를 전기영동하여 각각 330, 231 및 90 bp 크기의 절편을 분리하였고 이를 상기와 동일한 제한효소로 절단된 벡터 pEGFP-C1에 클로닝하여 GFPΔN, GFPΔN1 및 GFP-BC 발현벡터를 제조하였다 (도 6).
또한, Bfl-1의 C-말단 부위가 결실된 발현벡터 (GFPΔBC), C-말단 부위 및 BH2 도메인이 결실된 발현벡터 (GFPΔ2BC), 및 C-말단 부위, BH1 및 BH2 도메인이 결실된 발현벡터 (GFPΔ12BC)를 제조하기 위하여, 각각 서열번호: 15 및 16, 서열 번호: 17 및 18, 및 서열번호: 19 및 20의 올리고뉴클레오티드를 시발체 쌍으로 하고 실시예 1에서 제조된 Bfl-1 발현벡터를 주형으로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응조건은, DNA 중합효소 (Takara사)를 사용하여 상기에 기재된 시발체 쌍과 주형을 94℃에서 5분 동안 변성시키고, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분간 30회 반응시키고, 72℃에서 10분간 연장시켜 반응을 종결하였다. 상기에서 수득된 PCR 반응물 각각을 제한효소 EcoRI/XbaI으로 절단한 후, 이를 전기영동하여 각각 474, 354 및 288 bp 크기의 절편을 분리하였고 이를 상기와 동일한 제한효소로 절단된 벡터 pEGFP-C1에 클로닝하여 GFPΔBC, GFPΔ2BC 및 GFPΔ12BC 발현벡터를 제조하였다 (도 6).
도 6은 상기와 같이 제조된 Bfl-1의 일부 도메인이 제거된 결실 돌연변이들의 모식도를 나타낸 것으로, 1은 BH1 도메인을, 2는 BH2 도메인을, BC는 Bfl-1의 C-말단 부위를 나타내는 것이다.
한편, 양성 대조군으로 친-세포사멸 단백질로 알려진 Bax 유전자의 GFP 융합단백질 발현벡터를 제조하였다. 먼저, Bax 유전자를 증폭하기 위하여, 서열번호: 21 및 22의 올리고뉴클레오티드를 시발체 쌍으로 하고, Bax 유전자를 포함하는 발현벡터 pcDNA3-Bax (카톨릭 의대 김 홍태 박사로부터 입수)를 주형으로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응조건은, DNA 중합효소 (Takara사)를 사용하여 상기에 기재된 시발체 쌍과 주형을 94℃에서 5분 동안 변성시키고, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분간 30회 반응시키고, 72℃에서 10분간 연장시켜 반응을 종결하였다. 상기에서 수득된 PCR 반응물을 제한효소 BglⅡ/HindⅢ로 절단하여 분리한 후, 이를 상기와 동일한 제한효소로 절단된 벡터 pEGFP-C1 (Clontech사)에 클로닝하여 GFP-Bax 발현벡터를 제조하였다.
<5-2> GFP-Bfl-1 결실 돌연변이 발현벡터의 세포사멸 활성의 변화
상기 실시예 <5-1>에서 제조된 GFPΔBC, GFPΔ2BC, GFPΔ12BC, GFPΔN, GFPΔN1, 및 GFP-BC 결실 돌연변이 발현벡터, 실시예 1에서 제조된 GFP-Bcl-xL 및 GFP-Bfl-1 발현벡터, 및 양성 대조군인 GFP-Bax 발현벡터와 음성 대조군인 GFP 발현벡터 각각을 1.0 ㎍씩 실시예 2와 동일한 방법으로 HEK 293T 세포에 형질감염시켰다.
형질감염시키고 12시간 경과 후에 각각의 세포를 PBS로 세척하고 4％ 포름알데히드로 고정하였다. 각각의 세포를 1 ㎍/㎖의 DAPI (Carl Biochem사)를 포함하는 용액으로 염색한 후 물결 모양과 응축된 염색질을 나타내는 세포의 사멸된 핵의 수를 세어서 세포사멸 정도를 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
형질감염시키고 24시간 경과 후에 형광현미경으로 관찰한 결과, GFP 발현벡터는 5％, GFP-Bcl-xL 발현벡터는 3％, GFP-Bfl-1 발현벡터는 45％, GFPΔBC 발현벡터는 5％, GFPΔ2BC 발현벡터는 6％, GFPΔ12BC 발현벡터는 8％, GFPΔN 발현벡터는 91％, GFPΔN1 발현벡터는 83％, GFP-BC 발현벡터는 93％, 및 GFP-Bax 발현벡터는 85％의 세포사멸을 유도하는 것으로 나타났다.
따라서, GFPΔN, GFPΔN1 및 GFP-BC 결실 돌연변이 발현벡터는 GFP-Bfl-1 발현벡터에 비해서 월등하게 세포사멸을 향상시키지만, GFPΔBC, GFPΔ2BC 및 GFPΔ12BC 결실 돌연변이 발현벡터는 HEK 239T 세포상에서 세포사멸 정도가 미미한 것으로 나타났다. 이로부터, N-말단 부위, BH1 및/또는 BH2와 같이 Bfl-1의 일부 도메인이 결실된 경우에도 세포사멸 활성이 유도되지만, GFP-Bfl-1 융합단백질이 친-세포사멸 활성을 나타내기 위해서는 Bfl-1의 C-말단 도메인을 필수적으로 포함해야 함을 알 수 있다.
또한, 실시예 2에 기재된 방법으로 상기 결실 돌연변이 발현벡터로 형질감염된 HEK 293T 세포로부터 추출한 각각의 세포 추출물을 아가로스 겔에 전기영동한 결과, GFP-Bfl-1 및 GFP-BC 발현벡터로 형질감염시킨 세포에서 GFP-Bax 발현벡터로 형질감염시킨 세포와 유사한 염색체 분절 현상이 관찰됨을 확인하였고, 이는 상기 세포의 죽음이 괴사가 아니라 세포사멸에 의한 것임을 입증하는 것이다.
친-세포사멸 활성을 나타내는 결실 돌연변이 발현벡터 GFPΔN, GFPΔN1 및 GFP-BC는 염기서열 분석 결과, 각각 서열번호: 24 내지 26으로 기재되는 염기서열을 갖는 GFP-Bfl-1 결실 돌연변이 유전자를 포함하고 있음을 확인하였다.
상기에서 전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 GFP가 융합된 Bfl-1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 세포사멸을 효율적으로 유도할 수 있으므로 항암제 또는 세포 증식증의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (6)
- 서열번호: 2의 Bfl-1 단백질 또는 서열번호: 2의 147 내지 175번 아미노산을 포함하는 Bfl-1 단백질의 단편에 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP)이 융합된 융합단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암 치료용 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서,녹색 형광 단백질이 Bfl-1 단백질 또는 그의 단편의 N-말단에 융합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항에 있어서,Bfl-1 단백질의 단편이 서열번호: 2의 62번 내지 175번 아미노산; 서열번호: 2의 98번 내지 175번 아미노산; 및 서열번호: 2의 147번 내지 175번 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드들로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항에 있어서,융합단백질이 서열번호: 27 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드들로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항에 있어서,유전자가 서열번호: 23 내지 26 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
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